JP6165727B2 - 新規il−17r−ecd変異体 - Google Patents
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Description
以下の定義は、かかる用語に与えられる範囲を含む本明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するのに役立つ。
本明細書に記載のペプチドは、化学合成によって調製することができるか、または組換えDNA技術を用いて製造してもよい。化学合成によって本明細書に記載のペプチドを調製するために、公知の方法を用いてもよく、例えば、本明細書に記載のペプチドは、アジド、酸塩化物、酸無水物、化合物の酸無水物、DCC、活性化エステル、ウッドワード試薬K、カルボニルイミダゾール、脱酸素、DCC/HONB、BOP試薬(例えば、Bozanszky,M and M.A.Ondetti,Peptide Synthesis,Interscience Publishers,New York(1966);Schroeder and Luebke,The Peptide,Academic Press,New York(1965);F.M.Finn and K.Hofinann,The Proteins、2巻、H.Nenrath,R.L.Hill(編)、Academic Press Inc.,New York(1976);Nobuo Izumiya et al.,Peptide Gosei no Kiso to Jikken(Basics and experiments of peptide synthesis),Maruzen Co.(1985);Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara et al.,Seikagaku Jikken Koza(Biochemical Experiment)1,Japanese Biochemical Society(編)、Tokyo Kagaku Dojin Co.(1977);Toshiya Kimura,Zoku Seikagaku Jikken Koza(Sequel to Biochemical Experiment)2,Japanese Biochemical Society ed.,Tokyo Kagaku Dojin Co.(1987)参照)を用いる方法によって得ることができる。さらに、本明細書に記載のペプチドは、自動ペプチド合成機(例えば、PE Applied Bio Systems Co.)を用いて化学合成によって調製することができる。Bulaj G.,et al.(2006)Biochemistry 45,7404に記載の方法などの方法は、本明細書に記載のペプチドの合成およびリフォールディング手順にも使用することができる。
従来の分析化学が関与する方法、分子生物学的および細胞生物学的技術を本明細書に記載する。このような技術は、当技術分野で一般に知られており、Classics in Total Synthesis,Targets,Strategies,Methods,K.C.Nicolaou and E.J.Sorensen,VCH,New York,1996;The Logic of Chemical Synthesis,E.J.Coney and Xue−Min Cheng,Wiley & Sons,NY,1989;およびNMR of Proteins and Nucleic Acids,Wuthnch,K.,Wiley & Sons,New York,1986などの方法論の論文に詳細に記載されている。分子生物学的および細胞生物学的方法については、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、1〜3巻、Sambrookら(編)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら(編)、Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York,1992(定期的に更新されている)などの専門書に記載されている。
製剤
本明細書に記載の医薬組成物は、全身的または局所的に投与することができる。本明細書に記載の医薬組成物は、各投与経路に適した形態で与えることができる。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、静脈内および皮下を含む注入または注射によって投与することができる。
例えば、硬膜外領域との接触を長引かせるために、例えば、ボーラス注射、連続注入、または他の既知の方法によって、本明細書に記載の組成物、突然変異体、変異体およびペプチドを投与することができる。組成物、突然変異体、変異体またはペプチドは、任意の時間の間に注入することができる。投与量および投与のタイミングは、例えば、疼痛を治療するための標準的な臨床プロトコルのフレームワーク内で、特定の対象のニーズに応じて変更することができる。組成物、突然変異体、変異体またはペプチドは、髄腔内経路で、血流に送達することもできる。さらに、移植可能なポンプまたはボディ着脱ポンプを用いて、制御された速度で本明細書に記載の組成物、突然変異体、変異体またはペプチドを送達することができる。あるいは、長期の投与は、当技術分野で公知のデポーまたは持続放出製剤によって達成することができる。
治療のための適切な投与量を決定しなければならない。本明細書に記載の組成物、突然変異体、変異体またはペプチドの有効量は、対象における症状を改善するために必要な量または用量である。個々の対象を治療するのに必要な量または用量の決定は、当業者、例えば、医師、薬剤師、または研究者にとって日常的なことである。
材料および方法
プラスミド
hIL−17RA ESTクローンは、Open Biosystems社から購入した。大腸菌での発現のために、遺伝子のECDを、pET32プラスミド(Novagen社)にクローニングした。このタンパク質のチオレドキシン(Trx)−6×ヒスチジンタグ付きバージョンを作製するために、NcoIおよびNotI部位を用いてクローニングを行った。大腸菌Clooni株(Lucigen社)を、クローニングおよびプラスミド抽出のために使用した。酵母表面ディスプレイのために、変異体を、NheIおよびBamHI部位を用いてpCTCONプラスミドにクローニングした(Chao,G.et al.Nat.Protocols 1,755−768(2006))。哺乳動物細胞での発現のために、pFUSE(Invivogen社)、pFW02(CrownBio社)およびpYDII(CrownBio社)のベクターを用いて、Fcを遺伝子工学処理して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)が大幅に減少したヒトIgGIと結合したhIL17RA−ECD変異体を作製した。クローニングおよびライブラリー構築に用いたプライマーを表1に示す。
hIL17RA−ECD変異体を、本質的には、Chao,G.ら(2006)によって記載されるとおりに、EBY100株細胞の酵母細胞表面上に提示し(遺伝子型についてはChao,G.et al.(2006)を参照)、フローサイトメトリーによって分析した。簡単に説明すると、所望のクローンを含むプラスミドpCTCONで形質転換したEBY100を、SDCAA培地(スクロース20g、酵母窒素ベース6.7g、カザミノ酸5g、Na2HPO4 5.4gおよびNaH2PO4*H2O 8.56g)中で対数増殖期まで増殖させ、次いで、2×106個の細胞を洗浄し、SGCAA誘導培地(SDCAAに類似しているが、スクロースの代わりにガラクトースを含む)に再懸濁し、さらに18時間振とうしながら37℃で増殖させた。誘発された細胞(1×106個)を遠心分離により収集し、PBSF(PBS+1g/LのBSA)で洗浄し、0.2μΜのhIL−17A(R&D Systems社)と25℃で1時間インキュベートした。次いで、これら細胞を洗浄し、マウスα−Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology社、1μl/PBSF50μl)、およびビオチン化ヤギα−hIL−17A(R&D Systems社、0.25μl/PBSF50μl)と25℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合α−マウスIgG(シグマ社、1μl/PBSF50μl)およびアロフィコシアニン(APC)結合ストレプトアビジン(Jackson Immunoresearch社、1μl/PBSF50μl)と頻繁に混合しながら氷上でさらに1時間インキュベートした。標識細胞を洗浄し、PBSFに再懸濁し、蛍光活性化細胞選別(FACS Calibur,BD)によって分析した。陽性対照の増殖細胞核抗原(PCNA)遺伝子を同一の条件下で発現させ、酵母細胞表面上に提示した。
hIL17RA−ECD「バックトゥコンセンサス(back to consensus)」ライブラリーを、ファミリーのコンセンサスから外れた特定の残基を標的化することにより作製した。他の哺乳動物のIL17RA−ECDとhIL17RA−ECDのアラインメントに基づいて、発明者らは、コンセンサス配列から外れた18箇所を発見した。Stemmer,W.P.(1994)に記載のとおり、hIL17RA−ECD遺伝子をPCRにより増幅し、約10μgをDNaseIで消化して、50〜125bpの断片を得た。これらの断片を、DNAシャッフリング(Aharoni,A.et al.2004)のように、18種類の短いオリゴ(各々4〜6nM、表1)の混合物の存在下で再構築し、各遺伝子に2〜6個の変異を含むライブラリーを得た(Stemmer,W.P.1994)。Chao,G.ら(2006)に記載のとおり、反応混合物をさらにネステッドPCRによって増幅した。構築したライブラリーを、大腸菌発現用のpET32ベクターと酵母表面ディスプレイ用のpCTCONベクターに連結した。この未処理の変異ライブラリーを酵母に形質転換し、酵母表面上に提示した(Chao,G.et al.2006)。上記のとおり、同じライブラリーを、直接、pET32プラスミドにもクローニングし、大腸菌で発現させ、元のクローンよりも高い発現レベルを有する変異体についてスクリーニングした。
未処理のライブラリーを、上記のとおり誘導して、c−mycおよびhIL−17Aで標識した。hIL−17RAライブラリーを提示するEBY100細胞(1×107個)を標識し、分析し、FACS(Vantage、BD)を用いて選別した。濃縮の2〜3回の反復ラウンドを行った。各ラウンドにおいて、緑色および赤色の蛍光強度領域の上位1〜2%内に見られる細胞に相当する複数の「陽性」事象(3〜5×104個)を増殖培地に収集し、濃縮の新規ラウンド用の寒天上にプレーティングした。未処理のライブラリーの初期選別については、蛍光細胞の上位5%のソートゲートを使用した。それ以上の濃縮が得られなくなるまで選択ラウンドを継続した。
FACS濃縮の最終ラウンドのプラスミドプールをPCRで増幅し、プラスミドpET32にクローニングし、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen社)に形質転換した。もう1つの方法として、未処理のライブラリーのプラスミドをBL21大腸菌細胞に形質転換した。形質転換後、単一のコロニーを100μg/mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地に接種し、OD600が0.6になるまで増殖させ、30℃で一晩1mMのIPTG(Calbiochem社)で誘導した。次いで、これらの細胞を収集し、0.2%トリトン、200μg/mlのリゾチーム(Calbiochem社)、および10mMのβ−メルカプトエタノールを補充したPBSに溶解し、遠心分離し、透明な上清を収集して、ELISAにより分析した(下記参照)。選択の各ラウンドでは、140〜200個の変異体をスクリーニングし、WTタンパク質と比較して活性が改善されたクローンを同定した。
hIL17RA−ECD変異体の大規模精製のために、1μg/mlのDNA投与量で、1:3または1:4のDNA/PEI比で、HEK293F細胞を一過的に形質転換し、6〜7日後に収集した。組換えタンパク質を、結合緩衝液として20mMのリン酸ナトリウムpH7.0を、溶出緩衝液として100mMのクエン酸ナトリウムpH3.0を用いて、HiTrapプロテインA HPカラムで精製した。次いで、これらのタンパク質を、Fcに対する特異的な抗体を用いて銀染色およびウェスタンブロットにより分析した。エンドトキシン濃度も測定した。精製タンパク質を、さらなる分析のために、50mMのトリス、200mMのNaCl pH7.5の中で、−80℃で保存した。
ELISAプレート(Griener Microlon 96W)を、0.5μg/mlのヤギα−hIL−17A抗体(R&D Systems社)100μlと1時間インキュベートし、0.05%のTween−80を補充したPBS(PBST)で洗浄し、さらに1時間、0.35μg/mlのhIL−17A(R&D Systems社またはProSpec Tany TechnoGene Ltd.)100μlをプレートに添加した。次いで、これらのプレートをPBSTで洗浄し、3%スキムミルクを補充したPBS100μlと1時間インキュベーションすることによりブロッキングした。ブロッキング後、これらのプレートを洗浄し、清澄化溶解物、細胞培地または(上述の)生成した精製タンパク質100μlと適切な希釈でインキュベートし、1時間振とうした。hIL−17RA(R&D Systems社)を陽性対照として6.25μg/mlの濃度で適用し、1%のBSAを補充したPBSを陰性対照として適用した。次いで、プレートをPBSTで洗浄し、0.05μg/mlのヤギα−hIL−17RA抗体(R&D Systems社)100μlとインキュベートし、その後、二次ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Jackson社、1:10000希釈)とインキュベートした。最後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)発色性3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液(Dako社)100μlを加えた。反応を1M硫酸の添加により停止し、Tecan Infinite M200プレートリーダーを用いて450nmで記録した。
ELISAプレート(Griener Microlon 96 W)を、0.2μgストレプトアビジン(Pierce社)100μlおよび0.05μg/mlのヤギα−hIL−17RA抗体(R&D Systems社)100μlでコーティングした。次いで、これらのプレートを、3%スキムミルクを補充したPBSと1時間インキュベーションすることによりブロッキングした。次に、清澄下溶解物100μlを各ウェルに添加し、これらのプレートを室温で1時間振盪しながらインキュベートした。PBSTでこれらのプレートを洗浄後、これらのプレートをマウスα−6×Hisタグ抗体(Santa−Cruz Biotechnology社、1:2000希釈)100μlとインキュベートし、PBSTで洗浄し、さらに二次HRP結合ヤギα−マウス抗体(Jackson社、1:5000希釈)と1時間インキュベートした。最後に、HRP発色性TMB基質溶液(Dako社)を添加し、反応を1Mの硫酸100μLの添加により停止し、Tecan Infinite M200プレートリーダーを用いて450nmで記録した。
タンパク質の熱安定性試験のために、精製タンパク質および市販のhIL−17RAを、5μg/mlの最終濃度まで1%BSAを含むPBSで希釈した。次いで、変異体を、異なる温度(37〜70℃までの範囲)で30分間インキュベートした。液体窒素にタンパク質を移すことによって反応を終了させ、タンパク質を−80℃で保持し、次いで、それらのhIL−17A結合活性について室温でELISAによって試験した。
hIL17RA−ECD変異体に対するhIL−17Aの結合親和性を、ProteOn XPR36(Bio−Rad)装置でSPR測定により決定した。全ての試料は、HBST緩衝液(0.15MのNaCl、3.4mMのEDTAおよび0.005%のTween−20、pH7.2を有する10mMのHEPES)中に存在した。GLCチップを、エアイニシャライズ(air initialize)し、EDC/S−NHSで活性化し、hIL17RA−ECD変異体のそれぞれ4μgを酢酸緩衝液pH5.5で希釈し、チップ上に固定化した。WT hIL17RA−ECD、V3およびV10について測定された結合レベルは、それぞれ、約5300RU、6700RUおよび7400RUであった。エタノールアミンでチップ上の未結合サイトをブロッキングした後、このチップをHBST緩衝液で洗い流し、回転させた。hIL−17Aを、300秒間25μl/分で、様々な濃度(50、25、12.5、6.25および3.125nM)で流し、その後、解離工程を10分行った。結合パラメータを、Bio−Rad社のproteOn ManagerソフトウェアV2.1.2.05を使用するLangmuir単一結合部位モデル(single binding site model)を使用して決定した。
アッセイに使用した細胞株は、正常ヒト皮膚線維芽細胞株のATCC CRL2091である。細胞を、日常的に完全MEM培地中で37℃、5%CO2で維持した。各実験のための細胞培養物を95〜100%コンフルエンスに到達させ、0.5%のトリパンブルー溶液(Biological Industries社)を用いて生存率についてチェックした。次いで、細胞を105細胞/mlの密度に達するまで希釈し、細胞懸濁液100μlを96ウェルプレート(Nunc社)の各ウェルに添加し、1ウェルあたり104細胞を得た。これらのプレートを、95〜100%コンフルエンスに達するまで24時間、5%CO2中37℃でインキュベートし、次いで、異なる量のhIL17RA−ECD変異体の存在下または非存在下で、10ng/mlのhIL−17Aでさらに24時間刺激した。これらの細胞株のhIL−17Aに対する用量反応を、各実験で異なる量のhIL−17A(0〜20ng/ml)を添加することにより試験した。次いで、細胞培養上清を収集し、さらなる解析のために−20℃で保存した。
培養上清中のhIL−6およびhCXCLlの測定を、製造業者の説明に従ってELISAキット(R&D Systems社またはPeproTech社)を利用して実施した。細胞上清の代わりに異なる量のこれらのサイトカイン(キットに付属)を添加することにより、IL−6およびGro−αの標準曲線を各ELISAで作成した。PeproTech社のELISAキットは、いくつかの変更を加えて使用した:簡単に説明すると、ブロッキング緩衝液は、3%スキムミルクを補充したPBSであり、1%BSAを補充したPBSを希釈剤として使用した。細胞上清を1:5〜1:10に希釈し、サイトカイン検出のために使用した。得られた結果を、それぞれの標準曲線にしたがって、IL−6またはCXCL1(pg/ml)に変換した。
hIL−17Aに対して高い親和性を有する水溶性hIL−17Rを作製するために、hIL−17Aに結合することが知られているhIL−17RA受容体の細胞外ドメイン(ECD)に焦点を置いた。hIL17RA−ECDの安定性および結合親和性の向上について、hIL−17Rの定向進化を利用した。最初に、hIL17RA−ECDの「バックトゥコンセンサス」ライブラリーを作製し、次いで、酵母細胞表面上に提示した。このライブラリーを、フローサイトメトリーを使用して、hIL−17Aに結合することができるクローンについて濃縮した。濃縮ライブラリーの個々のクローンを、ELISAを用いてスクリーニングし、選択したいくつかのhIL−17R変異体を過剰発現させ、さらなる特徴付けのために、哺乳動物細胞から大量に精製した。最後に、純粋なhIL17RA−ECD変異体を、線維芽細胞株におけるhIL−17Aへの結合およびhIL−17Aに誘発されるIL−6およびCXCL1の分泌阻害について試験した。
多数のhIL17RA−ECD変異体の迅速かつ高感度なスクリーニングを容易にするために、hIL−17RA−hIL−17の相互作用のためのELISAアッセイを開発した。このアッセイは、ELISAプレート上にhIL−17Aを固定化し、特異的抗体を用いてhIL17RA−ECD結合を検出することに基づく。hIL−17RA−hIL17A相互作用の検出のためのダイナミックレンジを調べるために、様々な量のWT hIL17RA−ECDをこのプレートに添加した。0.1〜10μg/mlの範囲の異なるhIL17RA−ECDの濃度を調べ、ELISAの感度およびダイナミックレンジを決定した。0.35μg/mlのhIL−17A溶液をプレートコーティングに用い、大腸菌またはHEK293T細胞のいずれかにおける発現後のhIL17RA−ECD結合を検出し、5〜10μg/mlのWT hIL17RA−ECDを陽性対照として用いた(図1)。hIL17RA−ECD濃度に対するシグナルの依存性は直線的であり、このアッセイは非常に高感度で、かつ低量の受容体の検出が可能であることが判明した(図1)。さらに、hIL−17R特異的抗体を用いて、hIL17RA−ECDの発現レベルを直接監視するためのELISAアッセイを開発した(図1)。このELISAアッセイは、大腸菌においてhIL17RA−ECDの発現レベルを推定するための追加のツールとして、hIL−17A結合ELISAと同時に使用した。
酵母表面ディスプレイ(YSD)アプローチを利用して、酵母細胞表面上にhIL17RA−ECDを提示した。hIL−17RAの酵母表面提示ならびに発現およびhIL−17Aへの結合の検出の模式図を図2Aに示す。hIL17RA−ECDの提示レベルを、hIL17RA−ECDのC末端のc−mycタグに対するFITC抗体を用いて監視した。hIL−17Aへの結合を、ビオチン化α−hIL−17A抗体、その後、ストレプトアビジン−APC抗体によって監視した。酵母表面上に提示されたWT hIL17RA−ECDは、非常に低レベルの発現およびhIL−17A結合を示すことが判明した(図2B)。同一の条件下で発現させたサッカロミセス・セレビシエの増殖性細胞核抗原(PCNA)遺伝子(Fridman,Y.et al.PLoS Biol.2010)を、これらの実験における陽性対照として用いた(図2B)。
大腸菌におけるhIL−17Rの発現レベルおよびhIL−17Aリガンドに対するその親和性を向上させるために、IL−17RAファミリーコンセンサスから外れたhIL17RA−ECDの残基をそのファミリーコンセンサスに復帰突然変異させることにより「バックトゥコンセンサス」ライブラリーを作製した。表2にまとめたアラインメントに基づき、コンセンサス配列から外れた18個の関連する位置を同定し、変異オリゴヌクレオチドのスパイキングによりこれらの残基を野生型遺伝子に変異させた(Herman,A.&Tawfik,D.S.2007)Incorporating Synthetic Oligonucleotides via Gene Reassembly(ISOR):a versatile tool for generating targeted libraries.Protein Eng Des Sel 20,219−26.)この未処理の「バックトゥコンセンサス」ライブラリーを酵母に形質転換し、酵母表面上に提示させた(Chao,G.et al.Nat.Protocols 1,755−768(2006))。
大腸菌で発現させ、精製したタンパク質は、哺乳動物発現系で利用可能な翻訳後修飾を欠いており(Durocher,Y.,Perret,S.&Kamen,A.NucleiC Acids Research 30,e9(2002))、哺乳動物細胞株の成長および機能に影響を与えることが知られている高レベルのLPS、細菌内毒素を含む。市販のWT hIL17RA−ECD(表4)と似ている変異体V1〜V10を哺乳動物細胞で発現させ、精製した。産生した組換えタンパク質は高純度であり(>95〜98%)、ヒト細胞での試験に適した低量のLPSを含んでいた(表5)。
hIL−17Aに結合する哺乳動物細胞から精製した異なる変異体の能力を特徴づけるために、hIL17RA−hIL−17Aの相互作用をELISAにより調べた。10種類の変異体のV1〜V10、およびWT IL17RAを、IL17Aプレコーティングプレートに3種類の異なる濃度で添加し、ELISAシグナルの差を調べた(図5)。変異体V3およびV10が、同じ条件下で発現させ、精製したWT hIL17RA−ECD、または市販のIL17RA−ECDよりも高い結合レベルを示すことが判明した(図5)。
WT hIL17RA−ECDと比較して、V3およびV10変異体の熱安定性をさらに特徴づけるために、様々なタンパク質を、48℃〜70℃の範囲の異なる温度で30分間インキュベートした。次いで、熱不活性化試料を、hIL−17Aに対する各変異体の残留結合活性を測定するためにELISAを用いて試験した。WT IL17RAは、48℃〜50℃の間の温度でインキュベートした後に、結合シグナルが減少しないことを示すことが判明した(図6)。しかし、約60℃でのWT hIL17RA−ECDのインキュベーション後に、室温でインキュベートした同じ試料と比較して、hIL17Aへの著しく低い残留結合が観察された。これに対し、V3およびV10変異体の両方は、60℃でのインキュベーション後に非常に活性があり、WT hIL17RA−ECDと比較して、それらの熱不活性化温度に約5℃のシフトを示すことが判明した(図6)。具体的に、図6にWT IL−17RA(三角形)、V3変異体(黒丸)およびV10変異体(白丸)の熱不活性化を示す。IL−17RA変異体を、30分間、異なる温度でインキュベートし、IL−17Aへの残留IL−17RA結合を、ELISAを用いて室温で監視した。これらの結果を、50℃でのインキュベーション後の変異体結合に対して標準化した。WT、V3およびV10についてのフィットから派生した熱不活性化温度は、それぞれ、57.1±0.6、63.8±1.2および63.9±0.5である。各データポイントは、2つの独立した実験の平均である。
hIL−17Aが線維芽細胞へ結合するのを阻害する組換えhIL−17RA変異体の能力を調べるために、細胞ベースアッセイを確立した。このアッセイは、線維芽細胞へのhIL−17Aの添加後に、Gro−αおよびIL−6分泌を測定することに基づく。hIL−17Aと共に可溶性hIL17RA−ECDを添加すると、内因性hIL−17RA受容体へのhIL−17Aの結合が阻まれるので、IL−6およびGro−α分泌の減少がもたらされる。線維芽細胞に10ng/mlのhIL−17Aと共に0.5μg/mlの市販のhIL17RA−ECDを添加することは、Gro−αとIL−6の両方の分泌を阻害するのに十分であることが判明した(それぞれ図7Aおよび図7B)。Gro−αの阻害はIL−6の阻害と一致し、内因性受容体へのhIL−17A結合の効率的な阻害を示した。
V10ランダム変異体ライブラリーのスクリーニング
エラープローンライブラリーの作製
前記のとおり、変異原性のdNTP類似体、8−オキソdGおよびdPTPを用いてライブラリーを作製した(Aharoni et al.,2004,Harel et al,2004)。
V10およびV3変異体ライブラリーのスクリーニング
表8に示すように、変異体V10N1〜V10N8およびV3N2が、それぞれ、V23〜V35で同定された変異(表7)の付加を有するV10およびV3に由来し、これらは、細胞ベースアッセイにおける安定性および/または結合および/または活性について有益である。全てのこれらの変異体を、目下CrowBioによって作製し、HEK293で発現させ、ELISAおよび細胞ベースアッセイを用いた次の分析のための純粋なタンパク質を得る。
サイトカインレベルに対するV3およびV10の効果
例えば、自己免疫炎症性疾患において分泌されるIL−17の効果を模倣するために、wt−ECDまたはECD変異体のうちの1つの存在下または非存在下で、IL−17をマウスに注入し、様々なサイトカインレベルを測定した。
マウスにおけるV3変異体の薬物動態学的解析
体重が24〜26gの24匹の雄のC57BL/6マウス群を研究のために使用した。これらのマウスを12匹のマウスの2群に分け、hIL17R−V3を、15mg/kgまたは30mg/kgの濃度で皮下注射により投与した(表9)。このマウスに、水や食料を自由に摂取させた。このマウスの血液を、注射後の10個の異なる時点で収集した。採血は、イソフルランの麻酔後に行った。約110μlの血液/時点を、後眼窩または心臓穿刺を介してチューブに収集した。室温で30分以内に血清試料得るために、血液試料を遠心分離した(2000g、5分間、4℃下)。血清試料を、ELISAを用いた分析まで−70℃で保存した。マウス血清中のV3の安定性が非常に高く、半減期(T1/2)は最高で99.4時間であった(表10および表11)。さらに、マウス血清において最高で4.85mg/mLの高濃度のV3が観察された(図12)。
異なる変異のIL−17A活性および熱安定性への寄与
V3およびV10において同定されたバックトゥコンセンサス変異の、タンパク質の活性および熱安定性への寄与を調べるために、一連の部位特異的変異体を作製し、調べた。V3およびV10のそれぞれで見られる変異の大部分を、WT残基に復帰突然変異させた。これらの変異体を、翻訳後修飾を維持するために哺乳動物細胞で発現させ、ELISAを用いてIL−17Aへの結合について調べた。
bWTへの様々な復帰突然変異後の各変異体における変異のリスト
cUL−17RA変異体の結合をELISAによって測定した。
d様々な温度でのインキュベーション後の残留結合レベルによって決定される不活性化の温度
ND−決定されず
乾癬マウスモデルにおけるV3のインビボ解析
乾癬病変の回復におけるV3変異体の治療可能性を評価するために、乾癬病変を含むマウスモデルでのV3の治療効果を調べた。乾癬患者からの皮膚試料をマウスに移植し、皮膚移植後28日目に、4週間、週に2回、V3を皮下注射により投与した。3.5mg/kg、7mg/kg、14mg/kgおよび28mg/kgを含む異なる濃度のV3を調べた。最初の皮膚移植後56日目に、マウスを屠殺し、組織学分析を用いて乾癬病変からの回復を評価した。回復レベルを1から4でスコア化し、1が病気、2が部分的回復、3が顕著な回復、4が完全回復である(表13)。以下(図13および表13)に見られるように、疾患は、PBSで処置したマウスの6/8匹に存在した。デキサメタゾンによる治療は、6/8匹のマウスの疾病を抑制し、このモデルの歴史的データと同様であった。sV3Rを4種類の異なる用量でマウスに与えると、7mg/kgが6/8匹のマウスの疾病を顕著に抑制し、デキサメタゾンで観察された効果と同様であった。より高いV3濃度での応答の減衰が見られ、これは、投与前のタンパク質凝集によるものと思われる(図13)。
Claims (32)
- hIL17RA−ECDに対して少なくとも97%の同一性を有し、123位がグリシンであり、かつ156位がアスパラギン酸である、hIL17RA−ECD変異体。
- 10位がプロリンである、請求項1に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 109位がリジンである、請求項1に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 123位がグリシンである、請求項1に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 156位がアスパラギン酸である、請求項1に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 244位がトリプトファンである、請求項1に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 268位がバリンである、請求項1に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- hIL17RA−ECDに対して少なくとも97%の同一性を有し、60位がバリンであり、123位がグリシンであり、かつ109位がリジンである、hIL17RA−ECD変異体。
- 10位がプロリンである、請求項8に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 157位がプロリンである、請求項8に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 7つ以下の置換を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 10位がプロリンであり、109位がリジンであり、123位がグリシンであり、156位がアスパラギン酸であり、244位がトリプトファンであり、かつ268位がバリンである、hIL17RA−ECD変異体。
- 10位がプロリンであり、60位がバリンであり、109位がリジンであり、123位がグリシンであり、かつ157位がプロリンである、hIL17RA−ECD変異体。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載のhIL17RA−ECD変異体を含む単離ペプチド。
- hIL17RA−ECDのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項14に記載の単離ペプチド。
- hIL17RA−ECDのアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、請求項14に記載の単離ペプチド。
- hIL17RA−ECDのアミノ酸配列と少なくとも99%の同一性を有する、請求項14に記載の単離ペプチド。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載のhIL17RA−ECD変異体をコードする単離核酸分子。
- 請求項18に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 宿主細胞にhIL17RA−ECD変異体を発現させることを可能にする、請求項19に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした単離宿主細胞。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項20に記載の単離宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれかに記載のhIL17RA−ECD変異体と、
薬学的に許容される担体または希釈剤と、
を含む医薬組成物。 - 静脈内投薬形態および皮下投薬形態からなる群から選択される投薬形態で製剤化された、請求項22に記載の医薬組成物。
- さらに、少なくとも1つの抗炎症剤を含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 対象の炎症性疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項1〜13のいずれか一項に記載のhIL17RA−ECD変異体の使用。
- 前記治療がさらに、治療有効量の少なくとも1つの抗炎症剤の投与を含む、請求項25に記載の使用。
- 前記少なくとも1つの抗炎症剤が、コルチコステロイド、コルチゾール、アルドステロン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ピバリン酸チキソコルトール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、フルコルトロン、ヒドロコルチゾン−17−ブチレート、ヒドロコルチゾン−17−バレレート、ジプロピオン酸アクロメタゾン、ベタメタゾンバレレート、ジプロピオン酸ベタメタゾン、プレドニカルベート、クロベタゾン−17−ブチレート、クロベタゾール−17−プロピオン酸、カプロン酸フルオコルトロン、フルオコルトロンピバレート、酢酸フルプレドニデン、非ステロイド性抗炎症剤、cox−2阻害剤、ニメスリド、ジクロフェナク、リコフェロン、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、免疫選択的な抗炎症性誘導体、フェニルアラニン−グルタミン−グリシン、ハーブ、ハルパゴフィツム属、ヒソップ、ショウガ、ウコン、アルニカ、柳の樹皮、大麻、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の使用。
- 対象の炎症性疾患の治療における使用のための、請求項22、23、または24のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞内でCXCL1およびIL−6のうちの1つまたは複数のhIL−17Aに誘導される分泌の阻害における使用のための請求項1〜13のいずれか一項に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項29に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項30に記載のhIL17RA−ECD変異体。
- 前記hIL17RA−ECD変異体が、野生型hIL17RA−ECDと比べて増加したhIL17Aに対する結合親和性を示す、請求項1〜10のいずれか一項に記載のhIL17RA−ECD変異体。
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