DE102018120016B4

DE102018120016B4 - Modulatoren der Funktion von Faktor H-verwandtem Protein 1 und deren Verwendungen in der Kontrolle von Entzündung

Info

Publication number: DE102018120016B4
Application number: DE102018120016.1A
Authority: DE
Inventors: Peter F. Zipfel; Christine Skerka; Sarah Irmscher
Original assignee: Leibniz-Institut fur Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Ev -Hans-Knoll-Institut-; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Current assignee: MEDIZINISCHE HOCHSCHULE HANNOVER, KOERPERSCHAF, DE
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2020-09-03
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: DE102018120016A1; EP3837551B1; WO2020035603A1; EP3837551A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die eine sterile Entzündung durch die Modulation von mindestens einem der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle moduliert, umfassend die Schritte von a) In-Kontakt-Bringen von mindestens einem von FHR1, einem EMR2/ADGRE2 bindenden Fragment von FHR1, einer Zelle, die FHR1 exprimiert, und/oder einer Zelle, die ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment von FHR1 exprimiert, mit mindestens einer Verbindung, die als mindestens eines der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle modulierend identifiziert werden soll, b) Identifizieren einer Modulation von mindestens einem der biologischen Aktivität, der Expression und/oder der Bindung von FHR1 oder des Fragments an EMR2/ADGRE2 in der Anwesenheit der mindestens einen Verbindung und c) Identifizieren einer Verbindung wie in Schritt b) identifiziert als spezifisch die sterile Entzündung modulierend.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Modulatoren der Funktion von Faktor H-verwandtem Protein 1 (FHR1) und deren Verwendungen in der Kontrolle und Therapie von Zuständen, die entzündliche Prozesse beinhalten.
Hintergrund der Erfindung
Zellulärer Stress ist ein spontanes Ereignis, das durch eine Verletzung oder Infektion ausgelöst wird, und ist ein Merkmal von entzündlichen Erkrankungen wie zum Beispiel der mit anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern assoziierten Vaskulitis (AAV) (1) und Arteriosklerose (AS) (2,3). Nekrotische Zellen wirken als unmodifizierte, mit Gefahren verbundene molekulare Muster (DAMP), die die angeborene Immunität aktivieren und, zusammen mit membranverankerten Molekülen, das Inflammasom in Immunzellen wie Monozyten oder Neutrophilen rekrutieren und aktivieren (4). Die Sekretion der proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-8 und TNFa rekrutiert phagozytotische Leukozyten und aktiviert Stammzellen, um so tote Zellen zu ersetzen (5). Eine anhaltende Immunantwort kann jedoch Wirtsgewebe ernsthaft schädigen und somit verschiedene Krankheiten verursachen.
Sterile Entzündungen tritt bei akuten Erkrankungen wie Ischämie-Reperfusionsschäden und kristallinduzierter Arthritis und auch bei chronischen Erkrankungen wie Partikel-induzierten Lungenerkrankungen und Arteriosklerose auf. Obwohl die Einzelheiten nicht vollständig verstanden sind, lösen nicht-mikrobielle Aktivatoren im Allgemeinen solche Entzündung aus.
AAV ist eine systemische Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper charakterisiert ist, die für Proteinase 3 (PR3) und Myeloperoxidase (MPO) spezifisch sind die von Neutrophilen exprimiert werden. Die Pathophysiologie zeigt häufig eine sichelförmige Pauci-Immun-Glomerulonephritis (1). Die Aktivierung des alternativen Komplementweges verstärkt die Rekrutierung, das Priming und die Aktivierung von Neutrophilen, wodurch eine selbstverstärkende Entzündungsschleife erzeugt wird, die zu destruktiven und nekrotisierenden Gefäßverletzungen führt. Bei der AAV werden kleine und mittlere Blutgefäße wie die der Niere und der Lunge von Immunzellen infiltriert und schließlich zerstört (6).
AS ist eine chronische Gefäßerkrankung und ihre Ausprägung als Coronary Artery Disease (CAP) die häufigste Todesursache in Industrieländern. In Bereichen von Arterien mit gestörter Durchblutung bilden sich Lipidablagerungen, die zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques mit nekrotischen Zellen führen, die eine sterile Entzündung auslösen. Ein Aufbrechen der Plaques kann zu Schlaganfall oder Myokardinfarkt führen. Patienten mit AS zeigen eine hohe Aktivierung des Inflammasoms 3 (NLRP3) in der Aorta (2,3).
Das Komplement erkennt DAMPs und Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs). Die Komplementaktivierung zerstört Mikroben und induziert Phagozytose- und Clearance-Mechanismen auch von beschädigten, toten menschlichen Zellen. Faktor H (FH), der Hauptregulator des alternativen Komplementwegs, ist entscheidend für den Schutz von Selbst-Oberflächen vor den schädlichen Auswirkungen des Komplements (7).
US 2009-0215895 A1 betrifft Verbindungen, die nützliche therapeutische und prophylaktische Moleküle sind und nützlich bei der Behandlung und Prophylaxe einer Reihe von Zuständen sind, einschließlich Krebs, Proteinkinase C (PKC) - oder NFkB-verwandten oder -assoziierten Zuständen, Herz-Kreislauf-Zuständen, Schmerzen. Entzündungszuständen, vaskulären oder immunologischen Zuständen wie Diabetes, neurologischen Zuständen und Infektion durch eine Reihe von Viren oder prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen. Eines der zahlreichen genannten Moleküle ist FHR1.
WO 2008/008986 offenbart Verfahren zur Bestimmung der Neigung eines Menschen, therapeutische oder prophylaktische Verbindungen zur Behandlung einer Gefäßerkrankung und/oder einer altersbedingten Makuladegeneration (AMD) oder zur Hemmung ihrer Entwicklung zu entwickeln, und Verfahren zur Behandlung von Patienten, um Symptome der Krankheit zu lindern, zu verhindern oder ihren Beginn zu verzögern oder ihr Fortschreiten zu hemmen. Die Verfahren beruhen auf der Entdeckung, dass Personen mit einem Genom mit einer Deletion des CFHR-1- und/oder CFHR-3-Gens, das normalerweise auf dem menschlichen Chromosom 1 zwischen für CFH und CFHR-4 kodierender DNA liegt, ein geringeres Risiko aufweisen AMD zu entwickeln AMD, und ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Gefäßerkrankungen wie Aneurysma aufweisen.
WO 2012/112955 A2 offenbart Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an CFHR1 oder CFHR3 binden und die Expression oder biologische Aktivität von entweder einem oder beiden reduzieren.
WO 2014/118552 A1 offenbart Mittel und Verbindungen, die verwendet werden können, um die Aktivität des Komplementsystems zu modulieren, neue biologische Ziele, die mit einer solchen Modulation verbunden sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen, Medikamente und Behandlungsverfahren zur Verwendung bei der Prävention, Linderung oder Behandlung von Krankheiten, die durch unangemessene Komplementaktivität charakterisiert sind. Zu diesen Erkrankungen zählen die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Meningitis, Nierenerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Entzündungen. Therapeutische Antikörper und Screeningtests zur Identifizierung von Wirkstoffen, die bei der Behandlung dieser Krankheiten nützlich sind, werden offenbart.
Kuan-Yu et al. (in: Activation of Adhesion GPCR EMR2/ADGRE2 Induces Macrophage Differentiation and Inflammatory Responses via Gα16/Akt/MAPK/NF-κB Signaling Pathways. Frontiers in Immunology (2017) Vol. 8, S. 373-387) beschreiben EMR2/ADGRE2 als einen Myeloidrestringierten Adhäsions G Protein-gekoppelten Rezeptor, aber nicht im Kontext von FHR1.
Die zentrale Funktion des Faktor H-verwandten Proteins FHR1 bleibt bislang unklar. Wünschenswert sind neue Strategien zur Behandlung und Bekämpfung von Erkrankungen, an denen FHR1 und seine Signalkaskade beteiligt sind. Andere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden.
Gemäß eines ersten Aspekts davon wird die oben genannte Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung gelöst, die eine Entzündung moduliert, die nicht durch Infektion verursacht wird (sterile Entzündung), durch die Modulation von mindestens einem der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle, umfassend die Schritte von a) In Kontakt bringen von mindestens einem von FHR1, einem EMR2/ADGRE2 bindenden Fragment von FHR1, einer Zelle, die FHR1 exprimiert, und/oder einer Zelle, die ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment von FHR1 exprimiert, mit mindestens einer Verbindung, die als mindestens eines der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle modulierend identifiziert werden soll, b) Identifizieren einer Modulation von mindestens einem der biologischen Aktivität, der Expression und/oder der Bindung von FHR1 oder des Fragments an EMR2/ADGRE2 in der Anwesenheit der mindestens einen Verbindung und c) Identifizieren einer Verbindung wie in Schritt b) identifiziert als spezifisch die sterile Entzündung modulierend, die nicht durch Infektion verursacht wird (sterile Entzündung).
Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Modulation ausgewählt ist aus einer Abnahme oder einer Zunahme der biologischen Aktivität, wie zum Beispiel der Wechselwirkung von FHR1 mit der nekrotischen Zelle/zellulären Ablagerung und/oder Dimerisierung von FHR1,der Expression und/oder der Bindung von FHR1 an EMR2/ADGRE2
Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass das humane Serumprotein „Faktor H-verwandtes Protein 1“ (FHR1) an nekrotische Zellen bindet, um Monozyten stark zu induzieren und zu aktivieren. Diese Wechselwirkung von FHR1 mit den nekrotischen Zellen wird durch den N-Terminus des FHR1-Moleküls vermittelt. Daher wurde diese Region als Target identifiziert, um Inhibitoren dieser Funktion zu entwickeln (z.B. Fab-Fragmente, wie unten beschrieben). Die Bindung von FHR1 scheint nach einer Dimerisierung des Moleküls zu erfolgen.
Diese Monozyten produzieren und sezernieren pro-inflammatorische Cytokine, um zusätzliche Immunzellen anzulocken und lösen so eine Entzündungsreaktion aus. Sobald der Schaden behoben ist, hört die Entzündung normalerweise auf und Homöostase tritt auf. Trotzdem kann bei einer Reihe von auto-inflammatorischen Zuständen eine permanente Stimulation beobachtet werden, die zu einem sogenannten Training der Immunzellen führt. Dieses Training bewirkt eine trainierte Immunität der Immunzellen, was zu einer viel stärkeren Entzündung führt. Diese Entzündung kann Organschäden und -versagen verursachen, insbesondere bei Erkrankungen mit bleibenden Zellschäden wie Arteriosklerose und Vaskulitis, aber auch Zirrhose. Das identifizierte Protein stellt eine Verbindung zwischen Zellschäden und der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer sterilen Entzündung zur Verfügung.
Daher bietet FHR1 selbst und seine identifizierte Signalkaskade, einschließlich des Rezeptors, die Möglichkeit, diesen Prozess noch weiter zu induzieren (Krebszellen) oder zu hemmen (Arteriosklerose, Vaskulitis, Zirrhose, Trauma usw.). In in-vitro-Experimenten wurden bereits drei Inhibitorklassen getestet: a) ein natürlicher Kompetitor von FHR1, insbesondere im Rahmen der Dimerisierung, FHR2, b) ein monoklonaler Antikörper gegen FHR1 und c) ein FHR1-Rezeptorblocker.
Im Gegensatz zu den gut untersuchten Vitalfunktionen von FH bleibt die zentrale Funktion des Faktor H-verwandten Proteins FHR1 bislang unklar FHR1 umfasst fünf kurze Konsenswiederholungen (Short Consensus Repeats, SCRs), es fehlen jedoch die regulatorischen Domänen, die in FH zu finden sind. In-vitro-Tests ergaben, dass FHR1 den terminalen Komplementweg in Abwesenheit von FH hemmt (8). Zusätzlich konkurriert FHR1 mit FH, um die inhibitorische Aktivität von FH zu regulieren (9,10). Die Zusammensetzung und Konzentration von FHR1 legen jedoch eine spezifischere Rolle bei der Immunität nahe. Die N-terminalen Short Consensus Repeats (SCRs) mit der Bezeichnung SCR1-2 innerhalb von FHR1 sind zu 36% und zu 45% zu FH/SCR6-7 homolog und enthalten eine Hybridisierungsdomäne (10,11). Die C-terminalen SCR3-5-Domänen sind jeweils zu 100/97%, 100% und 98% identisch mit FH/SCR (18-20) und binden C3b, C3d und Heparin (8). FHR1 zirkuliert als Homodimere im Serum und bildet mit FHR2 (11) Heterodimere, die in sogenannten FHR1-verwandten Protein-Lipoprotein-Partikeln (FALPs) enthalten sind (12). Die genetische Deletion eines chromosomalen Fragments umfassend CFHR3-CFHR1-Gene (ΔFHR1/3) verleiht Schutz gegen IgAN (13) und AMD (14), aber Anfälligkeit für systemischen Lupus erythematodes (SLE) (15) und HUS (16). Der Grund für diese gegensätzlichen Assoziationen zwischen FHR1 und verschiedenen Krankheiten ist noch unklar, obwohl dies wahrscheinlich auf eine bisher unbekannte Funktion von FHR1 zurückzuführen ist. Vorliegend identifizierten die Erfinder eine neue Rolle für FHR1 bei der sterilen Entzündung.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Modulation ausgewählt ist aus einer Abnahme oder einer Zunahme der biologischen Aktivität, der Expression und/oder der Bindung von FHR1 an EMR2/ADGRE2. Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus Wirkstoffen mit kleinem Molekulargewicht.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend den Schritt/die Schritte von Testen der Verbindung wie identifiziert auf ihre Aktivität sterile entzündliche Antworten zu induzieren oder zu reduzieren, zum Beispiel durch Nachweisen von Cytokin IL-1β, IL-6, IL-18, C-reaktivem Protein (CRP) und/oder TNFa.
Noch weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das weiter eine computergestützte Analyse von und Optimierung von der Verbindung basierend auf der Struktur, insbesondere der dreidimensionalen und/oder Kristallstruktur von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 umfasst.
Gemäß eines zweiten Aspekts davon wird die oben genannte Aufgabe der Erfindung durch ein Screening Tool zum Screenen auf eine Verbindung gelöst, , welche die Expression, die biologische Aktivität und/oder die Interaktion von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle moduliert, umfassend eine isolierte Zelle, die FHR1 exprimiert und/oder ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment davon exprimiert, wobei die Zelle gegebenenfalls EMR2/ADGRE2 und/oder ein FHR1 bindendes Fragment davon exprimiert.
Gemäß eines zweiten Aspekts davon wird die oben genannte Aufgabe der Erfindung gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder der Prävention einer Erkrankung oder eines Zustandes gekennzeichnet durch Nekrose und eine Freisetzung der pro-entzündlichen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, nicht durch Infektion verursachte Entzündung (sterile Entzündung), Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie zum Beispiel Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsverletzung, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration, erhalten durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung oder umfassend eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Gemäß eines vierten Aspekts davon wird die oben genannte Aufgabe der Erfindung gelöst durch die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung zur Behandlung oder der Prävention einer Erkrankung oder eines Zustandes gekennzeichnet durch eine Freisetzung der pro-entzündlichen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, nicht durch Infektion verursachte Entzündung (sterile Entzündung), Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie zum Beispiel Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsverletzung, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration.
Beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, gekennzeichnet durch eine Freisetzung der pro-entzündlichen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, nicht durch Infektion verursachte Entzündung (sterile Entzündung), Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie zum Beispiel Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsverletzung, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration, in einem Individuum, umfassend Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung an das Individuum.
Daher wurde ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die eine sterile Entzündung durch die Modulation von mindestens einem der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle moduliert erstellt. Das Verfahren umfasst die Schritte von:

1. In Kontakt bringen von mindestens einem von FHR1, einem EMR2/ADGRE2 bindenden Fragment von FHR1, einer Zelle, die FHR1 exprimiert, und/oder einer Zelle, die ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment von FHR1 exprimiert, mit mindestens einer Verbindung, die potentiell mindestens eines der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle moduliert. Dieser Teil des Tests screent allgemein auf Verbindungen, die mit FHR1 oder einem EMR2/ADGRE2 bindenden Fragment von FHR1 wechselwirken.
2. In Kontakt bringen von mindestens einem von EMR2/ADGRE2, einem FHR1 bindenden Fragment von EMR2/ADGRE2, einer Zelle, die EMR2/ADGRE2 exprimiert, und/oder eine Zelle, die ein FHR1 bindendes Fragment davon exprimiert mit mindestens einer Verbindung, die potentiell die Wechselwirkung von EMR2/ADGRE2 mit FHR1 in einer Zelle moduliert. Dieser Teil des Tests screent allgemein auf Verbindungen, die mit EMR2/ADGRE2 oder einem FHR1 bindenden Fragment von EMR2/ADGRE2 wechselwirken.
3. In Kontakt bringen von mindestens einem Komplexes von FHR1 mit EMR2/ADGRE2, einem Komplex von mindestens einem Bindungsfragment von FHR1 oder EMR2/ADGRE2 mit EMR2/ADGRE2 bzw. FHR1 und/oder einer Zelle, die mindestens eines von einem Komplex von FHR1 mit EMR2/ADGRE2, einem Komplex von mindestens einem Bindungsfragment von FHR1 oder EMR2/ADGRE2, mit EMR2/ADGRE2 bzw. FHR1 exprimiert, mit mindestens einer Verbindung, die potentiell die Wechselwirkung des Fragments/der Fragmente in einer Zelle moduliert. Dieser Teil des Tests screent allgemein nach Verbindungen, die mit dem Komplex von FHR1/EMR2/ADGRE2 interagieren.

Im nächsten Schritt umfasst das Verfahren dann ein Identifizieren einer Modulation der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung (Bindung) von FHR1 oder des Fragments an EMR2/ADGRE2 oder der Bindung von EMR2/ADGRE2 oder des Fragments an FHR1 in Gegenwart der mindestens einen Verbindung. Die Modulation ist ausgewählt aus a) einer Zunahme der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung (Bindung) und/oder b) einer Stabilisierung der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung (Bindung) und c) einer Abnahme der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung (Bindung) von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 in der Zelle, wie hier offenbart.
In einem nächsten Schritt wird eine Verbindung, wie in Schritt b) identifiziert, weiter als spezifisch sterile Entzündung modulierend identifiziert, wie hierin offenbart.
Bevorzugt ist ein Screening-Assay, der nach Verbindungen screent, die für FHR1 spezifisch sind und dessen Aktivität in der spezifischen Bindung an EMR2/ADGRE2 induziert und/oder erhöht/verstärkt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise herausgefunden, dass das Bindungspaar FHR1-EMR2/ADGRE2 oder Fragmente oder deren Komponenten davon, d.h. FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2, wertvolle Werkzeuge für therapeutische Ansätze zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands darstellen, gekennzeichnet durch eine Freisetzung der proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, sterile Entzündung, Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsschäden, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA-Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration. Die Erfinder haben es für denkbar gehalten, diese Komponenten bei Erkrankungen des Menschen gezielt einzusetzen, ohne die Vitalfunktionen zu beeinträchtigen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „FHR1“ als auch das Säugetier- (insbesondere Maus) Ortholog/Homolog des humanen FHR1 Gens und/oder Proteins und/oder die mRNA anzeigend/repräsentierend verstanden werden. Auch soll der Ausdruck das vollständige FHR1 Polypeptid oder Fragment(e) wir hier beschrieben umfassen, wie zum Beispiel den C-Terminus von FHR1/SCR3-5 oder N-Terminus FHR1/SCR1-2 des FHR1 Polypeptids. Der Ausdruck deckt auch FHR1 in seiner dimeren Form, in seiner Form dimerisiert mit FHR2 Polypeptid und in verschiedenen Präparationen, wie zum Beispiel im zellulären Kontext, gereinigt aus der Zelle, ab. Die Aminosäuresequenz von CHFR (Aliase: HFL1, HFL2, CFHL, FHR1, H36, Komplement Faktor H-verwandtes Protein 1, Komplement Faktor H-verwandt 1, H36-1 und H36-2) können z.B. unter UNIPROT Q03591 gefunden werden.
Ähnlich soll „EMR2/ADGRE2“ als auch das Säugetier- (falls vorhanden, identifiziert) Ortholog/Homolog des humanen EMR2/ADGRE2 Gens und/oder Proteins und/oder die mRNA anzeigend/repräsentierend verstanden werden. Auch soll der Ausdruck das vollständige EMR2/ADGRE2 Polypeptid oder Fragment(e) wir hier beschrieben umfassen, wie zum Beispiel das FHR1-bindende Fragment. Der Ausdruck deckt auch EMR2/ADGRE2 in verschiedenen Präparationen, wie zum Beispiel im zellulären Kontext, gereinigt aus der Zelle, ab. Die Aminosäuresequenz von EMR2 (Aliase: ADGRE2 und CD132) kann z.B. unter UNIPROT Q9UHX3 gefunden werden.
Der Ausdruck „in Kontakt bringen“ in der vorliegenden Erfindung bedeutet jede Wechselwirkung zwischen der potentiell bindenden Substanz (den potentiell bindenden Substanzen) mit FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2, wobei jede der Komponenten unabhängig voneinander in einer flüssigen Phase, beispielsweise in Lösung oder in Suspension vorliegen kann oder an eine feste Phase gebunden sein kann, beispielsweise in Form einer im wesentlichen ebenen Oberfläche oder in Form von Partikeln, Perlen oder dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vielzahl verschiedener potentiell bindender Substanzen auf einer festen Oberfläche wie beispielsweise einem Verbindungsbibliotheks-Chip immobilisiert und anschließend FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 (oder ein funktioneller Teil davon) oder der gebundene Komplex davon werden mit einem solchen Chip in Kontakt gebracht.
Bevorzugt ist die Modulation ausgewählt aus einer Abnahme oder einer Zunahme der biologischen Aktivität, der Expression und/oder der Bindung von FHR1 an EMR2/ADGRE2.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „biologische Aktivität“ bevorzugt die zellulären Funktionen von FHR1, EMR2/ADGRE2, dem Komplex von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente davon in der Zelle in dem Prozess der sterilen Entzündung einschließen, zum Beispiel ihre Funktion(en) in der Signalkaskade und/oder oder andere Faktoren zu induzieren. Ein spezielles bevorzugtes Beispiel ist die Dimerisierung von FHR1, die anscheinend durch dessen N-terminale Region vermittelt wird.
Weiter bevorzugt umfasst das Identifizieren ein Verfahren ausgewählt aus rtPCR, Immunpräzipitation und/oder ein Messen der Induktion oder Reduktion von Entzündung in der Zelle umfasst, zum Beispiel durch Nachweis von Cytokin IL-1β. Andere Cytokine, die nachgewiesen werden sollen, können IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa sein. Entsprechende Tests sind auch dem Fachmann bekannt und unten offenbart.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Peptidbibliothek, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, einem „Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht“, einem antisense-Oligonukleotid, einer siRNA und einem Antikörper, insbesondere einem Antikörper gegen FHR1 oder ein Fragment davon, das spezifisch mit der Bindung von FHR1 an EMR2/ADGRE2, FHR2 oder eines Bindungsfragments davon interferiert, und einem Rezeptorblocker, wie zum Beispiel einem NLRP3 Inhibitor. Besonders bevorzugt sind Antikörperfragmente gegen FHR1, die Entzündung reduzieren (siehe 5). Die Erfinder schließen daraus, dass diese F(ab)2-Fragmente die Bindung von FHR1 an nekrotische Zellen verhindern und daher vor einer durch FHR1 induzierten Entzündungsreaktion schützen. Folglich könnten monoklonale Antikörper gegen FHR1 ein vielversprechender therapeutischer Ansatz sein.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein „Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht“ oder „kleines Molekül“ ist einer/s, der/das ein Molekulargewicht von unterhalb von 2000 Da, bevorzugt von unterhalb von 1000 Da, optimal im Bereich von zwischen 600 und 200 Da.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das FHR1 und/oder das EMR2/ADGRE2 immobilisiert ist, wie zum Beispiel auf einer Mikrotiterplatte, Perlen oder einem Chip, wie etwa ein Glasträger.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren die Verwendung von humanen peripheren Blutmonozyten, normalem humanem Serum (NHS) und/oder Lipopolysaccharid (LPS) umfasst. Diese Bedingungen werden für alle hierin offenbarten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (z.B. auch die nachstehend offenbarten evolutionären Verfahren) bevorzugt/vorgesehen.
Gemäß der Erfindung ist die Zelle ausgewählt aus der Gruppe von rekombinanten Wirtszellen, die FHR1 oder das EMR2/ADGRE2 bindende Fragment davon exprimieren, wobei die rekombinanten Wirtszellen gegebenenfalls EMR2/ADGRE2 exprimieren, Hefezellen und rekombinante bakterielle Zellen.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das EMR2/ADGRE2 bindende Fragment von FHR1 den C-Terminus FHR1/SCR3-5 oder den N-Terminus FHR1/SCR1-2 des FHR1 Polypeptids umfasst. Das FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 oder das/die bindende/n Fragment/e davon, die in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden, kann eine Volllängenprotein oder ein Fragment mit N/C-terminalen und/oder internen Deletionen sein.
Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend ein Testen der Verbindung/en wie identifiziert auf ihre/deren Aktivität/en, sterile entzündliche Antworten zu induzieren oder zu reduzieren. Entsprechende Assays sind dem Fachmann bekannt und können der jeweiligen Literatur entnommen werden.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente davon geeignet markiert sind. Das Messen der Bindung der Verbindung an FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder deren Fragmente kann entweder durch Messen eines Markers durchgeführt werden, der entweder an das Protein oder an die potentiell wechselwirkende Verbindung gebunden sein kann. Geeignete Marker sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Fluoreszenz- oder radioaktive Marker. Die Bindung der beiden Komponenten kann jedoch auch durch die Änderung eines elektrochemischen Parameters der Bindungsverbindung oder des Proteins, z.B. eine Änderung der Redoxeigenschaften von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder dessen Fragmenten oder der Bindungsverbindung bei Bindung nachgewiesen werden. Geeignete Verfahren zum Erfassen solcher Änderungen umfassen beispielsweise potentiometrische Verfahren. Weitere Verfahren zum Nachweisen und/oder Messen der Bindung der beiden Komponenten aneinander sind im Stand der Technik bekannt und können ohne Einschränkung auch zum Messen der Bindung der potentiell wechselwirkenden Verbindung an FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder den Fragmenten davon verwendet werden. Die Wirkung auf die Bindung der Verbindung oder die Aktivität von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder deren Fragmente kann auch indirekt gemessen werden, beispielsweise durch Testen einer enzymatischen Aktivität von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder der Fragmente davon nach dem Binden.
Als einen weiteren Schritt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren weiterhin eine computergestützte Optimierung basierend auf der Struktur des Bindungspaares FHR1-EMR2/ADGRE2 umfassen. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Als ein weiterer Schritt nach dem Messen der Binding einer potentiell wechselwirkenden Verbindung und nach der Messung von mindestens zwei verschiedenen potentiell wechselwirkenden Verbindungen kann mindestens eine Verbindung ausgewählt werden, zum Beispiel, aus Gründen der gemessenen Bindungsaktivität oder aus Gründen der nachgewiesenen Zunahme der FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 (Bindungs-) Aktivität und/oder der Expression.
Die so ausgewählte Bindungsverbindung kann dann in einer bevorzugten Ausführungsform in einem weiteren Schritt modifiziert werden. Die Modifizierung kann nach einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Methoden erfolgen die ohne Einschränkung die Einführung neuer Seitenketten oder den Austausch funktioneller Gruppen wie beispielsweise die Einführung von Halogenen, insbesondere F, Cl oder Br, einschließen die Einführung von Niederalkylgruppen, vorzugsweise mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl- oder Isopentylgruppen, Niederalkenylgruppen, vorzugsweise mit zwei bis fünf Kohlenstoffatomen, Niederalkinylgruppen, vorzugsweise mit zwei bis fünf Kohlenstoffatomen oder durch Einführung von beispielsweise einer Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NH₂, NO₂, OH, SH, NH, CN, Aryl-, Heteroaryl-, COH- oder COOH-Gruppe.
Die so modifizierten bindenden Substanzen werden dann mit einem erfindungsgemäßen Verfahren einzeln getestet, d.h. sie werden mit FHR1, dimerem FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder dessen Fragmenten in Kontakt gebracht und anschließend wird eine Bindung der modifizierten Verbindungen an das FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder an die Fragmente davon gemessen. In diesem Schritt kann sowohl die Bindung an sich gemessen werden als auch/oder die Wirkung der Funktion des FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder der Fragmenten davon, wie z.B. die Bindung an FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder den Fragmenten davon und/oder die enzymatische Aktivität des oder der Polypeptide kann gemessen werden. Falls erforderlich, können die Schritte des Auswählens der bindenden Verbindung, des Modifizierens der bindenden Verbindung, des in Kontakt bringens der bindenden Verbindung mit FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder den Fragmenten davon und des Messens der Bindung der modifizierten Verbindungen an das Protein (die Proteine) nach Bedarf ein drittes Mal oder eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt werden. Das oben beschriebene Verfahren wird auch als „gerichtete Evolution“ bezeichnet, da es eine Vielzahl von Schritten einschließlich Modifikation und Selektion beinhaltet, wobei bindende Verbindungen in einem „evolutionären“ Prozess ausgewählt werden, der seine Fähigkeiten in Bezug auf eine bestimmte Eigenschaft optimiert, z.B. ihre Bindungsaktivität, ihre Fähigkeit, die Aktivität des Polypeptids (der Polypeptide) von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder deren Fragmente zu aktivieren oder zu modulieren.
Gemäß eines weiteren Aspekts davon wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch zur Verfügung stellen eines Screening-Tool auf eine Verbindung gelöst, welche die Expression, die biologische Aktivität und/oder die Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle moduliert, umfassend eine isolierte Zelle, die FHR1 exprimiert, und/oder ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment davon exprimiert, wobei die Zelle gegebenenfalls EMR2/ADGRE2 und/oder ein FHR1 bindendes Fragment davon exprimiert.
Die Zelle kann eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle sein, und beliebige genetische Expressionskonstrukte können extrachromosomal vorliegen oder in das Chromosom integriert sein. Die Polypeptide können in Form eines Fusionsproteins, beispielsweise zusammen mit einer enzymatisch aktiven Einheit als Reporterkonstrukt, exprimiert werden, um das Expressionsprodukt nachweisen zu können. Bevorzugte Wirtszellen stammen von Zellen, die aus Skelettmuskel, Leber, Fettgewebe, Herz, Pankreas, Niere, Brustgewebe, Eierstockgewebe und/oder Hypothalamus ausgewählt sind. Daher ist ein Screening Tool gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wobei die Zelle ausgewählt ist aus nekrotischen Zellen, Krebszellen; rekombinanten Wirtszellen, die FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder bindende Fragmente davon exprimieren; Hefezellen; und (rekombinanten) Bakterienzellen.
Bevorzugt ist ein Screening Tool gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente davon immobilisiert und/oder markiert sind, wie auch oben beschrieben.
Weiter bevorzugt ist ein Screening Tool gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das EMR2/ADGRE2 bindende Fragment von FHR1 den C-Terminus von FHR1/SCR3-5 oder N-Terminus FHR1/SCR1-2 des FHR1 Polypeptids umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt davon wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch zur Verfügung stellen eines Screening-Tool für ein Mittel zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands gelöst, gekennzeichnet durch eine Freisetzung der proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6, TNFa, z.B. Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose oder Trauma, insbesondere ein Screening Tool zum Screening auf eine Verbindung, die die Expression, die biologische Aktivität und/oder die Wechselwirkung von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder den Fragmenten davon in einer Zelle, wobei die Zelle wie oben Teil eines nicht-menschlichen transgenen Säugetiers ist, die bevorzugt FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente überexprimiert, gegebenenfalls als ein genetisches Reporterkonstrukt. Bevorzugt ist eine transgene Maus, Ratte, Schwein, Ziege oder Schaf, wobei das Reporterkonstrukt vorzugsweise in Zellen exprimiert wird, die ausgewählt sind aus Skelettmuskel, Leber, Fettgewebe, Herz, Bauchspeicheldrüse, Niere und/oder Hypothalamus des Tieres. Verfahren zur Herstellung dieses nichthumanen transgenen Säugetieres, das FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente davon überexprimiert und/oder ein genetisches Reporterkonstrukt von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente davon trägt sind dem Fachmann gut bekannt. Bevorzugt sind auch transgene nichtmenschliche Säugetiere, bei denen das zu FHR1 und / oder EMR2 / ADGRE2 und / oder dessen Fragmenten homologe Gen durch Gene mit einer modifizierten Funktion (z.B. Knockout oder Knock-In-Tier) ausgetauscht sind.
Ähnlich wie bei den Strategien zur Identifizierung von Verbindungen, die mit FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder deren Fragmenten interagieren, können Verbindungen identifiziert werden, die die Expression von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 in einer Zelle modulieren. In bevorzugten Strategien kann die Expression von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 unter Verwendung eines genetischen Reporterkonstrukts für FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 überwacht werden (um die Translationseffizienz und/oder Stabilität von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2-Polypeptid zu analysieren), zum Beispiel ein Fusionsprotein, das ein nachweisbares Fusionselement (wie eine enzymatische oder fluorophore Gruppe oder GFP) umfasst, oder die Menge an mRNA, wie sie in einer Zelle vorhanden ist, kann zum Beispiel durch Northern Blot gemessen werden. Die Expression kann auch unter Verwendung von Chip-Analyse oder rtPCR analysiert und überwacht werden. Bevorzugte Verbindungen, die die Expression von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 in einer Zelle modulieren, sind ausgewählt aus spezifischen Antisense-Oligonukleotiden, siRNAs oder anderen vorzugsweise mutierten Nukleinsäuren, die für FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 oder deren bindenden Fragmenten davon kodieren. Diese genetischen Elemente können verwendet werden, um den Funktionsverlust (z.B. durch die identifizierten Verkürzungen) von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 oder den Bindungsfragmenten davon in der Zelle bereitzustellen/aufrechtzuerhalten. Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist die Übertragung der genetischen Elemente unter Verwendung von Gentherapie. Weiterhin umfasst sind virale Konstrukte zur Einführung der genetischen Elemente in die Zellen. Alternativ kann auch die „nackte“ Nukleinsäure in die Zelle(n) eingeführt werden, z.B. durch den Einsatz von Partikel-vermittelten Technologien. Entsprechende Methoden sind in der Literatur gut beschrieben und dem Fachmann bekannt.
Beschrieben wird die Verwendung der hierin beschriebenen Tools gemäß der vorliegenden Erfindung zum Screenen auf eine Verbindung, die die Expression, die biologische Aktivität und/oder die Wechselwirkung von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 moduliert in einer Zelle wie hierin beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands, gekennzeichnet durch eine Freisetzung des entzündungsfördernden Cytokins IL-1β, Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Leberzirrhose oder Trauma, umfassend die Schritte des Ausführens des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung und des Formulierens der Verbindung wie identifiziert zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird die wie oben beschriebene identifizierte wechselwirkende Verbindung, die zusätzliche Modifizierungs- und Selektionsrunden durchlaufen haben kann oder nicht, mit geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoffen versetzt. Solche Substanzen umfassen pharmakologisch akzeptable Substanzen, die die Stabilität, Löslichkeit, Biokompatibilität oder biologische Halbwertszeit der wechselwirkenden Verbindung erhöhen, oder umfassen Substanzen oder Materialien, die für bestimmte Anwendungswege enthalten sein müssen, wie zum Beispiel intravenöse Lösung, Sprays, Pflaster oder Pillen.
Träger, Arzneimittelträger und Strategien zur Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, zum Beispiel um systemisch oder topisch verabreicht zu werden, auf irgendeinem herkömmlichen Weg, insbesondere enteral, z.B. oral, z.B. in Form von Tabletten oder Kapseln, parenteral, z.B. in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen, topisch, z.B. in Form von Lotionen, Gelen, Salben oder Cremes oder in Nasen- oder Zäpfchenform sind dem Fachmann bekannt und in der jeweiligen Literatur beschrieben.
Beschrieben wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands gekennzeichnet durch eine Freisetzung der proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, einer sterilen Entzündung, Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsschaden, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA-Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration, erhalten durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, oder umfassend eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Die Verabreichung eines Mittels, z.B. einer Verbindung, gegebenenfalls in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, kann durch jedes Verfahren erreicht werden, das es dem Mittel ermöglicht, die Zielzellen zu erreichen. Diese Verfahren umfassen beispielsweise Injektion, Ablagerung, Implantation, Suppositorien, orale Aufnahme, Inhalation, topische Verabreichung oder jedes andere Verabreichungsverfahren, bei dem der Wirkstoff Zugang zu den Zielzellen erhält. Injektionen können z.B. intravenös, intradermal, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal sein. Die Implantation umfasst das Einsetzen implantierbarer Arzneimittelabgabesysteme, z.B. von Mikrokugeln, Hydrogelen, Polymerreservoiren, Cholesterinmatrices, Polymersystemen, z.B. Matrixerosions- und/oder -diffusionssystemen und nichtpolymeren Systeme, z.B. komprimierten, verschmolzenen oder teilweise verschmolzenen Pellets. Zäpfchen umfassen Glycerin-Zäpfchen. Orale Einnahmedosen können enterisch beschichtet werden. Inhalation beinhaltet die Verabreichung des Mittels mit einem Aerosol in einem Inhalator, entweder allein oder an einen Träger gebunden, der absorbiert werden kann. Das Mittel kann in einer Flüssigkeit suspendiert sein, z.B. in gelöster oder kolloidaler Form. Die Flüssigkeit kann ein Lösungsmittel, ein Teillösungsmittel oder ein Nichtlösungsmittel sein. In vielen Fällen kann Wasser oder eine organische Flüssigkeit verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die pharmazeutische Zusammensetzung wie hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die pharmazeutische Zusammensetzung wie hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Induktion von Entzündung in einer Zelle, insbesondere einer Krebszelle. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Vorbeugung oder Behandlung in einem Patienten einer Krankheit oder eines Zustands gekennzeichnet durch eine Freisetzung der proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, einer sterilen Entzündung, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsschaden, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA-Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration.
Vorzugsweise ist der Krebs ausgewählt aus Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Niere, Lymphknoten, Dünndarm, Bauchspeicheldrüse, Blutzelle, Knochen, Dickdarm, Magen, Brust, Gebärmutterschleimhaut, Prostata, Hoden, Eierstock, Zentralnervensystem, Haut, Kopf und Hals, Speiseröhrenkrebs oder Knochenmarkkrebs.
Beschrieben wird dann ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder eines Zustands in einem Patienten gekennzeichnet durch eine Freisetzung der proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFa, sterile Entzündung, Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsschaden, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA-Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladeration, umfassend Verabreichung an den Patienten einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung wie oben. Im Allgemeinen wird der behandelnde Arzt eine Behandlung auf der identifizierten Verbindung und optional auch auf anderen individuellen Patientendaten (klinische Daten, Familienanamnese, DNA usw.) aufbauen, und eine Behandlung kann auch basierend auf der Kombination dieser Faktoren durchgeführt werden. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet beispielsweise das Integrieren individueller diagnostischer Krebsdaten oder anderer Daten mit klinischen Patienteninformationen und allgemeinen Gesundheitsstatistiken, um beispielsweise die Anwendung einer personalisierten Medizin an den Patienten zu ermöglichen. Signifikante Informationen die über die Wirksamkeit von Arzneimitteln, Arzneimittelwechselwirkungen und andere Zustände des Patientenstatus verwendet werden.
Bevorzugt ist ein therapeutisches Verfahren wie beschrieben, wobei das zu behandelnde Säugetier eine Maus, Ratte oder Mensch ist. Weiter bevorzugt ist der zu behandelnde Krebs beispielsweise ausgewählt aus Brust-, Knochen-, Eierstock-, Blut- (z.B. Leukämien), Nieren- und Lungenkrebs.
Vorzugsweise wird ein Wirkstoff in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, wie beispielsweise ein Antikörper, Nukleotid oder eine aktivierende oder inhibierende bindende Verbindung für die FHR1-EMR2/ADGRE2-Bindung. Vorzugsweise ist der Patient ein Mensch. Die Behandlung soll beispielsweise das Verhindern, Behandeln, Verringern der Symptome oder das Heilen der Krankheit oder des Zustands, d.h. Krebs, einschließen.
Mit dem EMR2/ADGRE2 oder FHR1 oder Komplex-bindenden Verbindung gemäß der Erfindung kann ein optionales Chemotherapeutikum gleichzeitig, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird das EMR2/ADGRE2 oder FHR1 oder die komplexbindende Verbindung vor dem Chemotherapeutikum verabreicht.
Bevorzugt ist ein Verfahren wie beschrieben, wobei der zu behandelnde Krebs ausgewählt ist aus Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Niere, Lymphknoten, Dünndarm, Pankreas, Blutzelle, Knochen, Dickdarm, Magen, Brust, Endometrium, Prostata , Hoden, Eierstock, Zentralnervensystem, Haut, Kopf und Hals, Speiseröhre und Knochenmarkkrebs.
Entzündung ist eine grundlegende zelluläre Reaktion auf schädliche Reize wie Krankheitserreger, Trauma und Nekrose. In diesen Fällen führt eine vorübergehende Entzündung zur Beseitigung und Heilung, wodurch die zelluläre Homöostase aufrechterhalten wird. Anhaltende Immunantworten können jedoch eine Autoinflammation verursachen, bei der angeborene Immunantworten die primäre pathophysiologische Rolle spielen (28). Hier identifizierten die Erfinder einen neuen menschlichen Entzündungsinduktor, FHR1, der bevorzugt an oxidiertes LDL auf nekrotischen menschlichen Zellen bindet und das NLRP3-Inflammasom in Monozyten über GPCR EMR2, das NHS ausgesetzt ist, stark induziert (4j). Ein FHR1-Mangel, der bei 4-7% der Kaukasier auftritt (27), führt zu einer erheblichen Verringerung der IL-1β-Sekretion (ca. 50%) als Reaktion auf Nekrose. In ähnlicher Weise weisen AAV-Patienten, die ΔFHR1/3 enthalten, niedrige Serumkonzentrationen von IL-1β sowie CRP auf. Diese Daten zeigen eine neue und dominante Funktion von FHR1 bei durch Nekrose ausgelösten Entzündungen, was möglicherweise erklärt, warum ΔFHR1/3 vor autoinflammatorischen Erkrankungen wie IgAN (13) und AMD (14) schützt. Beide Erkrankungen sind durch Zellstress und pathologischen Entzündungsprozess unter Beteiligung des NLRP3-Inflammasoms gekennzeichnet (29).
Immobilisiertes FHR1 (sowie das Maus-Homolog FHRB), jedoch nicht FHR2, FHR3, FH oder die gespleißte Variante von FH, FHL-1, induziert das NLRP3-Inflammasom in Monozyten, die anschließend entzündungsfördernde Cytokine ausscheiden. IL-1β und TNFa sind zentrale Cytokine bei der Kommunikation und Aktivierung von Immunzellen und rekrutieren als solche angeborene Immunzellen an den Ort der Infektion und der Zellschädigung. IL-6 löst die CRP-Freisetzung aus und IL-18 ist für die Erzeugung von Interferon-y (IFN-y) und für die Erhöhung der zytolytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen und T-Zellen verantwortlich. Um IL-1β zu induzieren, bindet FHR1 über seine N-terminale Domäne an oxidierte Lipide auf nekrotischen Zellen und verbindet so die entzündungsfördernden Eigenschaften oxidierter Lipide (30,31) mit der NLRP3-Aktivierung. Bei der Bindung ändert FHR1 wahrscheinlich seine Konformation, so dass der C-Terminus freigelegt wird und die Entzündungsreaktion vermittelt. Da sowohl die C-terminalen Domänen von FHR1 (SCR3-5) als auch FH (SCR19-20) die IL-1β-Sekretion durch Monozyten induzieren, lässt dies darauf schließen, dass die C-terminalen Domänen beider Proteine im menschlichen Blutkreislauf verborgen oder geschützt sind, wenn sie im Plasma zirkulieren. In der Tat ist FHR1 hauptsächlich in sogenannten FALPs (12) vorhanden, die die entzündliche Aktivität von FHR1 abschirmen können. In ähnlicher Weise wurde zuvor FH mit einer kreisförmigen Struktur beschrieben, bei der der C-Terminus zurückgefaltet ist (32). Wie FH kann FHR1 über die C-terminalen SCR-Domänen an die TED-Domäne in C3b binden (33). Wenn FHR1 an C3b gebunden ist, fehlt ihm die entzündungsfördernde Aktivität, was bestätigt, dass der C-Terminus der wichtigste entzündungsfördernde Teil in FHR1 ist. Zusammenfassend kann FHR1 das NLRP3-Inflammasom in Immunzellen aktivieren, in dem es direkt über seinen N-Terminus an oxidierte Lipide auf nekrotischen Zellen bindet. FHR1 konkurriert auch mit FH, wenn es an C3b gebunden ist. FHR1 aktiviert das NLRP3-Inflammasom in Monozyten über die PLC- und Ca2+ - Aktivierungswege. Von FHR1-induzierten Monozyten abgeleitete RNAseq-Daten zeigten eine Hochregulation des G-Protein-gekoppelten Rezeptors EMR2/ADGRE2, der Entzündungsreaktionen in Makrophagen induziert (21,34), und legen eine Beteiligung dieses Rezeptors an der FHR1-Funktion nahe. Die spezifische Hemmung von EMR2 blockierte die durch FHR1 induzierte IL-1β-Freisetzung von Monozyten. Die EMR2-Aktivität in der FHR1-Funktion wird durch die Tatsache gestützt, dass EMR2 in schaumigen Makrophagen bei Arteriosklerose stark exprimiert wird (35).
Nekrose spielt eine wichtige Rolle bei der AAV, und die Behandlung von Entzündungen durch aggressive Immunsuppression ist die etablierte Therapie (36,37). Auch jüngste AS Studien folgen einer Entzündungshemmung (38). ΔFHR1/3 wurde in 3,5% der AAV-Fälle nachgewiesen. IL-1β-Konzentrationen waren bei ΔFHR1/3-AAV-Patienten nicht erhöht; in der Tat waren die Konzentrationen niedrig und vergleichbar mit denen, die bei gesunden Kontrollen gemessen wurden. Darüber hinaus war auch das Akutphasenprotein- und Entzündungsmarker-CRP, das als Reaktion auf IL-6 ansteigt, in ΔFHR1/3-AAV-Proben signifikant niedriger (p <0,001) als bei Patienten mit FHR1. Diese Ergebnisse bestätigen die proinflammatorische Funktion von FHR1 und zeigen eine fundamentale Rolle bei der sterilen Entzündung. ΔFHR1/3 wurde in 2,8% der akuten AS-Fälle nachgewiesen (n = 141). Die CRP-Konzentrationen waren bei ΔFHR1/3-AS-Patienten viel niedriger als bei AS-Patienten mit FHR1. Beide Krankheiten sind durch Nekrose und Entzündung gekennzeichnet, einschließlich NLRP3-Aktivierung und erhöhten IL-1 β-Serumkonzentrationen (24), jedoch sind die anfänglichen Auslöser bei AAV und AS unterschiedlich.
ΔFHR1/3 schützt genetisch vor IgA-Nephropathie (13) und AMD (39,40) und ist ein Risiko für atypisches hämolytisch-urämisches Syndrom (aHUS) (41) und SLE (27), sowie rheumatoide Arthritis (42) (alle davon im Zusammenhang mit Entzündungen). Es ist daher verlockend zu spekulieren, dass FHR1 bei AMD und IgAN der Haupttreiber für Entzündungen ist und dass ΔFHR1/3 vor diesen Krankheiten schützt. Die diesen Erkrankungen zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen sind jedoch komplexer. Das gesagt müssen Patienten mit diesen chronischen Krankheiten untersucht werden, um die entzündungsfördernde Rolle von FHR1 zu unterstützen und dass Symptome von etablierten Läsionen ausgehen.
Am wichtigsten ist, dass die Daten der Erfinder eine direkte Intervention mit der FHR1-Funktion unterstützen, um Entzündungen bei menschlichen Krankheiten wie AAV und AS zu hemmen, das Fortschreiten zu verringern und sogar eine Regression zu induzieren. Daher bietet sich die gezielte Bekämpfung von FHR1 oder Mitgliedern des FHR1-Signalwegs zur Bekämpfung von Entzündungen bei diesen (und anderen) autoinflammatorischen Erkrankungen als vielversprechender therapeutischer Ansatz für zukünftige Interventionen an.
Entzündungen sind ein Kennzeichen vieler menschlicher Erkrankungen, einschließlich der mit anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern assoziierten Vaskulitis (AAV) und Arteriosklerose (AS). Hier beschreiben die Erfinder einen neuen und dominanten Auslöser von Entzündung: das humane Serumfaktor H-verwandte Protein FHR1. In vitro bindet dieses Protein über seinen N-Terminus selektiv an nekrotische Zellen; Darüber hinaus bindet es an nekrotische glomeruläre Zellen von AAV-Patienten und an nekrotische Bereiche in AS-Plaques. FHR1, aber nicht Faktor H, FHR2, FHR3 oder FHL-1 induzieren stark das Inflammasom 3 in aus Blut stammenden menschlichen Monozyten, die anschließend IL-1β, TNFa, IL-18 und IL-6 sezernieren. FHR1 löst den Phospholipase C-Weg über den komplementunabhängigen G-Protein-gekoppelten Rezeptor EMR2 aus. Darüber hinaus zeigen FHR1-defiziente AAV (11/314)-Patienten niedrige IL-1 β-Serumkonzentrationen und sowohl defiziente AAV- als auch AS (3/124)-Patienten niedriges C-reaktives Protein. Diese neuen Daten unterstreichen eine unerwartete Rolle von FHR1 bei sterilen Entzündungen und erklären möglicherweise, warum FHR1-Mangel vor bestimmten Krankheiten schützt. Die Studie identifiziert auch potenzielle neue Ziele für die Behandlung von autoinflammatorischen Erkrankungen.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren weiter beschrieben, jedoch ohne sie darauf beschränken zu wollen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle zitierten Referenzen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen. In den Figuren:

1 zeigt, dass immobilisiertes FHR1 Entzündung induziert. (a) Immobilisiertes FHR1 induziert die IL-1 β-Sekretion von Monozyten und erhöht die IL-1β-Produktion durch LPS-stimulierte Monozyten in Gegenwart von NHS. (b) Im Gegensatz zu immobilisiertem FHR1 induzieren FHR2, FHL-1, FH und BSA keine IL-1 β-Sekretion. (c) Immobilisiertes FHR1 löst die IL-1 β-Freisetzung aus Monozyten bereits 3 h nach Inkubationsbeginn aus. (d) FHR1 SCR3-5 und FH SCR19-20, jedoch nicht FHR1 SCR1-2 lösen die IL-1β-Freisetzung durch Monozyten aus, die ΔFHR1/3 NHS ausgesetzt wurden, (e) Immobilisiertes FHR1 induziert die Sekretion von IL-18, (f) TNFα und (g) IL-6. (h) Immobilisiertes FHR1 hemmt die Sekretion von IL-10 durch LPS-stimulierte Monozyten. (i) Ungebundenes FHR1 kann die Sekretion von IL-1β durch Monozyten nicht erhöhen. (j) In Abwesenheit von NHS oder in Gegenwart von hitzeinaktiviertem (h.i.) und EDTA-inaktiviertem NHS induziert immobilisiertes FHR1 keine IL-1 β-Sekretion. (k) FHR1 induziert die Sekretion von IL-1β nach Aussetzen gegenüber 0,25% NHS. Ein Erhöhen der NHS-Konzentration erhöht die IL-1 β-Freisetzung. Die Daten in a-k stellen den Mittelwert ± SEM von drei bis fünf unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Donorzellen dar. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 (ungepaarter zweiseitiger t-Test).
2 zeigt, dass FHR1 das NLRP3-Inflammasom in Monozyten über den PLC-Weg aktiviert. (a) Immobilisiertes FHR1 erhöht die Sekretion von IL-1β in LPS-behandelten Monozyten, die C3-depletiertem, C3-inhibiertem (Compstatin) oder C5-inhibiertem (Eculizumab) NHS gegenüber ausgesetzt wurden. (b) FHR1 stimuliert die Sekretion von IL-1β durch EGTA-behandeltes oder C1q-abgereichertem NHS, wodurch die Aktivierung der klassischen (CP) und LectinWege (LP) sowie in (c) Faktor B (FB) und Faktor P (FP)-abgereichertes NHS (in dem der alternative Weg (AP) gehemmt ist) blockiert wird. (d) Die IL-1β-Induktion durch FHR1 wird blockiert, wenn NF-KB durch BAY 11-7085 inhibiert wird. (e) Die IL-1β-Sekretion wird durch einen Caspase-1-Inhibitor (VX-765), (f) durch einen NLRP3 Inhibitor (MCC950) oder (g) durch einen PLC Inhibitor (U73122) blockiert. (h) Das Blockieren der Gβγ-Untereinheit von GPCRs mit Gallein verringert die IL-1 β-Induktion durch FHR1 nach 4-stündiger Inkubation um etwa 65%. (i) Gene, die in Monozyten differentiell exprimiert wurden, die 4 Stunden lang FHR1 in NHS ausgesetzt waren. (j) Biologische Prozesse, die an der Induktion von FHR1 beteiligt sind (GO-Klassifizierung). (k) Entzündungsgene und (I) Signalwege, die in Monozyten durch FHR1 induziert werden. (m) IL-1β-Induktion durch FHR1 nach 4 Stunden wird durch die Inhibition von EMR2 (αEMR2) blockiert. (n) Schematischer Überblick über die FHR1-induzierte IL-1β-Sekretion durch Monozyten. Die Daten in a-m stellen den Mittelwert ± SEM von drei bis fünf unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Donorzellen dar. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 (ungepaarter zweiseitiger t-Test).
3 zeigt, dass FHR1 die Freisetzung von IL-1β, IL-6, TNFa durch Monozyten auslöst. (a) FHR1, aber nicht FH, bindet an nekrotische HUVECs, wie durch Durchflusszytometrie gezeigt. (b) FHR1 (grün) bindet an spezifische Stellen in Abwesenheit einer Membranfärbung durch WGA (Texas Red) auf nekrotischen Zellen. DNA (blau) wird mit DAPI gefärbt. Maßstab = 10 µm. (c) FHR1 und FH aus NHS binden an nekrotische, aber nicht gesunde Zellen. Ein repräsentativer Western-Blot von dreien ist gezeigt. (d) An C3b gebundenes FHR1 induziert keine IL-1 β-Freisetzung durch Monozyten. (e) An nekrotische HUVECs gebundenes FHR1 löst die IL-1β-Freisetzung durch Monozyten aus. (f) Die IL-1 β-Freisetzung als Reaktion auf nekrotische HUVECs ist bei Exposition gegenüber ΔFHR1 / 3-NHS um etwa 60% geringer als bei Exposition gegenüber NHS. (g) Die Rekonstitution von FHR1 in ΔFHR1/3 NHS führt zu einer erhöhten Bindung von FHR1 an nekrotische Zellen und einer erhöhten IL-1 β-Freisetzung durch Monozyten. FH hat keine Wirkung. (h) FHR1 bindet an MDA-LDL, jedoch nicht an LDL oder BSA. (i) FHR1 bindet an MDA-Epitope auf nekrotischen Zellen, wie durch einen Proximity Ligation Assay (PLA) gezeigt. Rote Punkte kennzeichnen FHR1-MDA-Komplexe. DNA wird mit DAPI (blau) gefärbt. (j) FHR1 bindet mit seinem N-Terminus FHR1 SCR1-2 an MDA-LDL. (k) FHR1, gebunden an MDA-LDL, aber nicht an LDL, erhöht die IL-1β-Freisetzung durch Monozyten. Die Daten in a und d-k stellen den Mittelwert ± SEM von drei bis vier unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Zellspendern dar. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 (ungepaarter zweiseitiger t-Test).
4 zeigt die in vivo-Funktionen von FHR1. (a) FHR1 (rot) bindet an arteriosklerotische Plaques in der menschlichen Herzklappe und (b) an menschliche Arterien bei AS-Patienten. FHR2 ist in der Intima von Arterien vorhanden. Es werden geringe Mengen an C3 nachgewiesen. *p≤0,0>5,**p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 (c) Bei AAV tritt die FHR1-Färbung bei fibrinöser Nekrose im Glomerulus (Sternchen) auf, umgeben von nekrotischen Zellen. Gesundes Gewebe (Pfeil) und nicht betroffene Zellen (unterbrochener Pfeil) binden kein FHR1. Glomeruli bei ΔFHR1/3 AAV-Patienten sind FHR1-negativ. Die statistische Analyse erfolgt mit dem Wilcoxon Signed Rank Test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 (d) IL-1β- und (e) CRP-Konzentrationen in Seren von AAV-Patienten oder (f) AS-Patienten mit FHR1/3 sind signifikant höher als in ΔFHR1/3 AAV-Patienten oder gesunde Personen (ungepaarter zweiseitiger t-Test mit Welch-Korrektur). *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 (g) FHR1 aus NHS bindet an immobilisiertes FHR1 SCR1-2 und wird dosisabhängig durch FHR2 ersetzt, jedoch (h) nicht durch die Dimerisierungsmutante FHR2DM. (i) Zu nekrotischen Zellen hinzugefügtes FHR1 erhöht die IL-1 β-Freisetzung durch Monozyten, die ΔFHR1/3 NHS gegenüber ausgesetzt sind, was sich um etwa 50% verringert, wenn die gleiche Konzentration an FHR2 hinzugefügt wird, jedoch nicht, wenn (j) die Dimerisierungsmutante FHR2DM hinzugefügt wird. Die Daten in g-j stellen den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten mit drei verschiedenen Zellspendern dar. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 (ungepaarter zweiseitiger t-Test).
5 zeigt, dass die variable Kette F(ab)2 des monoklonalen FHR1-Antikörpers die Entzündung reduziert. Die Inkubation nekrotischer Zellen mit Monozyten in Gegenwart von NHS führt zu einer starken Freisetzung von IL-1β, die in ΔFHR1/3-NHS um etwa 50% verringert ist. Monoklonaler Antikörper (erzeugte F(ab)2-Fragmente dieses Antikörpers, die die variablen, aber nicht die konstanten Ketten des Antikörpers enthalten) gegen den N-Terminus von FHR1 (Bindungsregion an nekrotische Zellen) reduzierte die IL 1 β-Freisetzung von Monozyten in Reaktion auf nekrotische Zellen in NHS um 50%. Die Inhibition erreichte den gleichen IL-β-Wert, wie ΔFHR1/3 NHS.

BEISPIELE
Material und Methoden
Zellwachstumsbedingungen
Humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC, ATCC CRL-1730) wurden in DMEM (Lonza) mit FBS (10%, PAA), Ultraglutamin (1%, Lonza) und Gentamicinsulfat (Lonza) bei 37°C und CO₂ (5%) gezüchtet. Maus alveolare MH-S Makrophagen (ATCC CRL-2019) wurden in RPMI 1640 (Lonza) gezüchtet, ergänzt mit hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (10% FBS, ATCC), Natriumpyruvat (1 mM, Lonza), Ultraglutamin (1%) und Gentamicinsulfat (50 mg/ml) bei 37°C und CO₂ (5%) gezüchtet. Die Zellen wurden jeden zweiten Tag bis zur Passage 30 passagiert. Die Zellen wurden mit Trypsin (0.25%)/EDTA (0.02%) (Biochrome) abgelöst. Die Nekrose wurde durch Inkubation der Zellen für 30 bis 35 Minuten bei 63°C induziert. Normales Humanserum (NHS) wurde aus FHR1/3-ausreichendem sowie FHR1/3-defizientem (ΔFHR1/3 NHS) Blut von gesunden Freiwilligen hergestellt, wie durch PCR (Lo, H.J. et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell 90, 939-949 (1997)) und Westernblot-Analyse bestimmt. Nach der Koagulation wurde das Blut zentrifugiert (10 min, 2.000 × g, 4°C), und NHS in Aliquots bei -80°C eingefroren gehalten. C. albicans cph1Δ/efg1Δ (Lo, H.J. et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell 90, 939-949 (1997); Wartenberg, A. et al. Microevolution of Candida albicans in macrophages restores filamentation in a nonfilamentous mutant. PLoS genetics 10, e1004824 (2014)), die keine Hyphen bilden können, wurde über Nacht in YPD-Medium (D-Glucose (2%), Pepton (1%), Hefeextrakt in H₂O (5%) bei Raumtemperatur gezüchtet.
Isolierung von menschlichen Monozyten
Bicoll (14 ml, Biochrom) wurde mit einer Mischung aus DPBS (5 ml, Lonza) und Buffy Coat (30 ml) überzogen, die von gesunden männlichen Spendern stammten. Nach der Zentrifugation. (20 min, 550 × g) wurde die PBMC-Schicht mit DPBS (5 min, 160 × g) gewaschen. Die Bicoll- und Waschschritte wurden zweimal wiederholt. Anschließend wurde das Pellet in IMDM (25 ml, Thermo Scientific) resuspendiert und zur Beschichtung von Percoll (46%) (GE Healthcare Life Sciences) in IMDM verwendet. Nach der Zentrifugation (20 min, 550 × g) wurde die PBMC-Schicht mit DPBS gewaschen. Monozyten wurden gemäß dem Protokoll des Human Monocyte Isolation Kit II (MiltenyiBiotec) selektiert. Monozytenexperimente wurden in Vollmedium durchgeführt, das aus 10% FBS und Gentamicinsulfat in IMDM (Thermo Fisher Scientific) bestand.
Isolierung von Maus-Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen Alle Tierversuche wurden von den zuständigen Institutions- und Regierungskomitees für Tierschutz genehmigt. Knochenmarkszellen wurden aus 10 bis 19 Wochen alten männlichen Mäusen (C57BL/6) isoliert und nach dem Protokoll von Francke et al. (Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R.H. & Braun-Dullaeus, R.C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society 59, 813-825 (2011)) mit Modifikationen in Monozyten differenziert. Kurz wurden Oberschenkelknochen und Schienbein der Mäuse durch Einstechen mit Nadeln (Größe 14) unter Verwendung von RPMI 1640 gespült, das mit hitzeinaktiviertem FCS (10%), Ultraglutamin (2 mM) und Gentamicinsulfat (25 µg/ml, Lonza) ergänzt war. Nach vorsichtigem Pipettieren und Sieben durch 70 µm Nylon wurden Zellen von jeder Maus in 75 cm² Ultra-Low-Attachment-Kolben (Corning) mit Wachstumsmedium (20 ml) ergänzt mit rekombinantem M-CSF der Maus M-CSF (25 ng/ml, Biolegend) für 5 Tage bei 37°C mit 5% CO₂ ausgesät. Anhaftende Zellen wurden geerntet und in DPBS gewaschen. Blut wurde von 10 bis 25 Wochen alten Mäusen (C57BL/6) durch Herzpunktion in eine Hirudin S-Monovette (Sarstedt) entnommen. Das Serum wurde durch Zentrifugation (2000 × g, 10 min, 4°C) gesammelt und bei -20°C gelagert.
Proteine
Rekombinantes FHR1, FHR1 SCR1-2, FHR1 SCR3-5 und FHR2 wurden in Pichia pastoris exprimiert und wie zuvor beschrieben gereinigt (Heinen, S. et al. Factor H-related protein 1 (CFHR-1) inhibits complement C5 convertase activity and terminal complex formation. Blood 114, 2439-2447 (2009). Siegel, C. et al. Complement factor H-related proteins CFHR2 and CFHR5 represent novel ligands for the infection-associated CRASP proteins of Borrelia burgdorferi. PIoS one 5, e13519 (2010)). Rekombinantes FHL1, FHR3 und FH SCR19-20 wurden im Baculovirus-Expressionssystem wie zuvor beschrieben exprimiert (Kühn, S. & Zipfel, P.F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine tagged proteins. Gene 162, 225-229 (1995). Hellwage, J. et al. Functional properties of complement factor H-related proteins FHR-3 and FHR-4: binding to the C3d region of C3b and differential regulation by heparin. FEBS letters 462, 345-352 (1999). Hellwage, J., Skerka, C. & Zipfel, P.F. Biochemical and functional characterization of the factor-H related protein 4 (FHR-4). Immunopharmacology 38, 149-157 (1997)). BSA wurde von AppliChem und Faktor H (FH) von Complement Technology gekauft. FHRB voller Länge (pCMV3-Insert-Myc) wurde von Sino Biological Inc. gekauft und die codierenden Sequenzen durch Kpn1/53 Xba1 geschnitten, in den Expressionsvektor piCZaB (Invitrogen) kloniert und in P. pastoris exprimiert. Polyklonales FHRB-Antiserum wurde durch Immunisieren von Kaninchen mit rekombinantem FHRB (Davids Biotechnologie GmbH) erzeugt. Eine Dimerisierungsmutante von FHR2 wurde durch In-vitro-Mutagenese des CFHR2 enthaltenden piCZα Expressionsvektors (Eberhardt, H.U. et al. Human factor H-related protein 2 (CFHR2) regulates complement activation. PIoS one 8, e78617 (2013)) unter Verwendung von Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) und dem Primer CAAGTTCCTACAGGGGAAGTTTTCTCTTACTACTGTGAGAGAATTTTGTGT CTCCTTCAAAATCCT (SEQ ID NO: 1) (Mutationen fett und unterstrichen) erzeugt. Die Mutagenese wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das Hismarkierte Protein wurde im P. pastoris-Stamm X33 exprimiert und durch Nickelchelat-Affinitätschromatographie gereinigt. Alle Proteine wurden durch Silbergel- und Western-Blot-Analysen evaluiert.
Cytokinexperimente
FHR1, FHR2, FHR3, FHL1, FH und BSA (jeweils 50 µl von 5 µg/ml) wurden 1 h bei 37°C auf eine hochbindende ELISA-Platte (Sarstedt) aufgetragen. Anschließend wurden die Proteine mit 1 × 10⁵ Monozyten/Well in Vollmedium mit oder ohne 10% NHS und mit oder ohne Stimulation mit 5 ng/ml LPS inkubiert. Nach 20 h Inkubation bei 37°C und CO₂ (5%) wurden die Cytokine im Überstand gemäß dem Protokoll der humanen Cytokin-ELISA-Kits gemessen: IL-1β, IL-6 und IL-10 (ThermoFisherScientific), IL-18 (Peprotech), IL-18 (R&D Systems) und TNFa (BioLegend). Die Extinktion wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (TECAN, Safire) gemessen. Für dosisabhängige Studien wurden 50 µl von 0,6, 1,25, 2,5 und 5 µg/ml FHR1 FHR1 für die Beschichtung verwendet. Für zeitabhängige Studien wurden FHR1 oder BSA für 0, 15, 30, 60, 90, 120, 180 und 240 Minuten mit Monozyten inkubiert.
Die Fragmente FHR1 SCR1-2, FHR1 SCR3-5 oder FH SCR19-20 (jeweils 50 µl von 5 µg/ml) wurden aufgetragen und mit Monozyten in ΔFHR1/3 NHS (10%) oder mit LPS behandelten Monozyten in NHS (10%) inkubiert. FHRB (5 µg/ml) oder DPBS wurden auf eine Mikrotiterplatte aufgetragen und mit Maus-Monozyten (1 × 10⁵) in normalem Mausserum (10%) und 5% CO₂ mit oder ohne MCC950 (10 µM, InvivoGen) für 20 h bei 37°C inkubiert. IL-1β wurde im Überstand unter Verwendung eines Maus-IL-1β-Kits (BioLegend) gemessen.
Beim Testen der FHR1-Aktivität im Serum wurden die Platten vor der Inkubation von Monozyten mit FHR1 (5 µg/ml) oder BSA im Serum mit oder ohne LPS mit BSA blockiert.
In einem anderen Assay wurde NHS 30 min bei 56°C hitzeinaktiviert oder durch Zugabe von EDTA (10 mM, Roth) inaktiviert. Zur Messung der Dosisabhängigkeit wurden Monozyten in 0, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2,5, 5, 7,5, 10% NHS mit IMDM ohne FBS inkubiert. Für Inhibitionsstudien: C1q, C3, Faktor B (FB) und Faktor D (FD) abgereichertes NHS wurden von Complement Technology gekauft. Die C3-Hemmung wurde mit Compstatin (15 µM, Tocris Bioscience), C5 mit Eculizumab (50 nM, Alexion Pharmaceuticals), CR3 durch Simvastatin (20 µM, Sigma-Aldrich) und C3aR durch Trifluoracetat-Salz (TAS) (200 nM, Sigma-Acetat) durchgeführt. Klassische und Lectinwege wurden mit EGTA (10 mM, Sigma-Aldrich) inhibiert. NF-_KB wurde mit BAY 11-7085 (30 µM, Sigma-Aldrich), TLR2 mit pAb hTLR-2 (10µg/ml, InvivoGen), TLR4 mit LPS-RS Ultrapure (22.2 µg/ml, InvivoGen), TLR6 mit pAb hTLR-6 (10 µg/ml, InvivoGen), Dectin 1 mit WGP-löslich (1 µg/ml, InvivoGen), FcR mit FcR-Blockierungsreagenz (2 µl/ml, MiltenyiBiotec), CD14 mit FITC hCD14 Antikörper (10µg/ml, BioLegend), CD36 mit mAb hCD36 (5 µg/ml, Hycultec) und der humanen RAGE-Rezeptor mit RAGE-Maus-Anti-Human-Klon 176902 (10 µg/ml, R&D Systems) inhibiert.
Das NLRP3-Inflammasom wurde durch Zugabe von MCC950 (10 µM, Invivogen), Caspase-1 durch VX-765 (50 µg/ml, InvivoGen), K+ Efflux durch Glybenclamide (25 µg/ml, InvivoGen), Cathepsin B durch Cathepsin B Inhibitor (1µM, Santa Cruz Biotechnology) und PLC durch U73122 (10 µM, Abcam) oder 1,10-Phenanthrolinmonohydrat (200 µM, AppliChem) inhibiert. Die Gßy Untereinheit von GPCR wurde mit Gallein Gallein (10 µM, Tocris) und der EMR2 Rezeptor durch αEMR2 (10 µg/ml, R&D Systems) blockiert, und IL-1β wurde nach 4-stündiger Inkubation gemessen. Die IL-1β Antwort auf an C3b gebundenes FHR1 wurde bestimmt, nach dem C3b (5 µg/ml) 1 Stunde lang bei 37°C aufgetragen worden war. C3b wurde mit Blockierungspuffer I (200 µl) für 1 Stunde bei 37°C blockiert und mit FHR1 (10 µg/ml) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Jedem Schritt folgte ein Waschen (4 x) mit PBST. Anschließend wurden Monozyten (1 × 10⁵) zugegeben und 20 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Gesunde und nekrotische (35 min bei 63°C behandelte) HUVECs (jeweils 1 × 10⁵) wurden 20 min bei 37°C mit FHR1 oder BSA (jeweils 10 µg) inkubiert. Nach dem Waschen mit DPBS (1% BSA) wurden HUVEC (1,5 × 10⁴) -Zellen mit Monozyten (6 × 10⁴) in CM mit NHS (10%) für 20 Stunden bei 37°C und CO₂ (5%) inkubiert. Der Überstand wurde zur IL-1 β-Messung gesammelt. Zusätzlich wurden Monozyten (1 × 10⁵) mit nekrotischen HUVECs (5 × 10⁴) in NHS oder ΔFHR1/3 NHS (jeweils 10%) in CM inkubiert. Danach wurde ΔFHR1/3 NHS mit FHR1 (0, 5, 10, 50, 75 oder 100 µg/ml) oder FH (10 oder 100 µg/ml) rekonstituiert.
Zur Untersuchung des Einflusses von FHR2 wurden Monozyten (1 × 10⁵) mit nekrotischen HUVECs (5 × 10⁴) in ΔFHR1/3 NHS (5%) in CM unter Zusatz von BSA (3 µg) oder FHR1 (3 µg) mit oder ohne FHR2 oder FHR2DM (jeweils 3 µg) inkubiert. Die Bindung von FHR1 an Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) und Malondialdehyd-modifiziertes LDL (MDA-LDL) (Cell Biolabs) wurde durch Beschichten von LDL (Cell Biolabs) oder MDA-LDL (jeweils 5 µg/ml) für 1 Stunde bei 37°C durchgeführt, mit Blockierungspuffer I (200 µl, AppliChem) für 1 Stunde bei 37°C blockiert und mit FHR1 (10 µg/ml) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Inkubation mit Monozyten wurde wie oben beschrieben durch Zytokinmessung verfolgt.
RNA Reinigung, PCR und RNA Sequenzierung
FHR1 (50 µl von 5 µg/ml) oder BSA wurden immobilisiert und mit Monozyten (1 × 10⁵) in CM mit oder ohne NHS (10%) für 4 h bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde mit dem Total RNA Purification Kit (NORGEN) extrahiert und mit dem High Capacity RNA6 to-cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific) in cDNA umgewandelt. Quantitative PCR (StepOnePlus™ Real-Time PCR System, Thermo Fisher Scientific) wurde mit cDNA, die aus Gesamt-RNA (0,25 ng gemäß NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer (peqlab Biotechnologie) abgeleitet war, PerfeCTA SYBR Green Fast mix Low Rox (Quanta Bio) und den Primern

ACTB forward 5'GCTAAGTCCTGCCCTCATTT'3, (SEQ ID NO: 2);
ACTB reverse 5'GTACAGGTCTTTGCGGATGT'3, (SEQ ID NO: 3);
IL-1β forward CTCTCACCTCTCCTACTCACTT`3, (SEQ ID NO: 4);
IL-1β reverse TCAGAATGTGGGAGCGAATG`3, (SEQ ID NO: 5); und
TNFa forward 5'CCAGGGACCTCTCTCTAATCA'3, (SEQ ID NO: 6); und
TNFa reverse 5'TCAGCTTGAGGGTTTGCTAC'3, (SEQ ID NO: 7)

LDH Messung
FHR1 (50 µl von 5 µg/ml) oder BSA oder DPBS wurden 1 Stunde lang bei 37°C auf eine Mikrotiterplatte aufgetragen. Danach wurden die Proteine mit Monozyten (10⁵) in IMDM mit NHS (0,25%) für 20 Stunden bei 37°C in CO² (5%) inkubiert. Nach 19 h wurde Lysispuffer (10 µl) in drei Vertiefungen (dreifach) gegeben und die LDH-Freisetzung nach 45-minütiger Inkubation bei 37°C gemessen. Überstände (50 µl) wurden mit dem Reaktionsgemisch des Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit (50 µl, Thermo Scientific) 30 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Stopplösung (50 µl) gestoppt und die Extinktion bei 490 nm gemessen.
ROS Messung
FHR1 (50 µl von 5 µg/ml), BSA oder DPBS wurden 1 Stunde lang bei 37°C auf eine Mikrotiterplatte beschichtet. Die Proteine wurden mit Monozyten (10⁵) in CM mit oder ohne 10% NHS inkubiert. Als positive Kontrolle wurden Monozyten (10⁵) mit C. albicans cph1Δ/efg1Δ (5 × 10⁴) inkubiert. Nach 20-stündiger Inkubation bei 37°C und CO₂ (5%) wurde CellROX™ Deep Red Reagenz (2 µl/ml, Thermo Scientific)zugegeben und die Extinktion bei Ex/Em480/515-550 nm gemessen.
Proteinbindung an HUVEC
Die Bindung von FHR1 an gesunde und nekrotische HUVEC (jeweils 3 × 10⁵) wurde durch Inkubation mit FHR1, FH or BSA (jeweils 10 µg) für 20 min bei 37°C in DPBS (1% BSA) bestimmt. Die Zellen wurden mit mAbCO2 (1:500) (Oppermann, M. et al. The C-terminus of complement regulator Factor H mediates target recognition: evidence for a compact conformation of the native protein. Clinical and experimental immunology 144, 342-352 (2006) und Alexa Fluor 488 donkey anti mouse IgG (1:500, Invitrogen) mit Viability Dye eFluor® 780 (1:10000, eBioscience) jeweils für 20 min bei 4°C in DPBS (1% BSA) markiert. Zwischen jedem Schritt wurden die Zellen zweimal mit DPBS (1% BSA) gewaschen und die Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie gemessen.
Die FHR1-Fragmente SCR1-2 und SCR 3-5 (jeweils 50 µl von 60 µg/ml) wurden 30 Minuten bei 37°C in DPBS (1% BSA) mit nekrotischen Zellen (5 × 10⁵) inkubiert. Die Zellen wurden mit Penta His-Antikörper (1: 500, QUIAGEN) und Alexa 488-Esel α-Maus (1:500), Viability Dye eFluor® 780 (1:10.000) jeweils 20 min bei 4°C in DPBS (1% BSA) gefärbt. Zwischen jedem Schritt wurden die Zellen zweimal mit DPBS (1% BSA) gewaschen und die Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie gemessen.
Die Bindung von FHR1 und FH aus NHS wurde bewertet, in dem gesunde oder nekrotische HUVECs (jeweils 1 × 10⁶) in 50% NHS (verdünnt in DPBS) 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Nach ausgiebigem Waschen wurden die Zellen 30 min auf Eis in Lysepuffer (70 µl), pH 7,4, mit Triton X-100 (1 vol.-%) (Sigma) und Protease Inhibitor 185 Cocktail (Roche) in DPBS lysiert. Zu jeder Probe (40 µl) wurden Roti®-Load 2 (Roth) 13,5 µl hinzugefügt und 10 min auf 95°C erhitzt. Proben (40 µl) wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und unter Verwendung von polyklonalem FHR1-Antiserum (1:1000) und HRP-konjugiertem α-Kaninchen-Antikörper (1:1000, Dako) immungeblottet. FHR1 (10 µg/ml) wurde erneut 30 Minuten bei 37°C an nekrotische HUVECs (45 Minuten bei 65°C) gebunden, und die Zellen wurden mit polyklonalem FHR1-Antiserum (Skerka, C. & Zipfel, PF Complement Factor H related proteins in immune diseases. Vaccine 26, l9-l14 (2008) (1:1.000) für 30 Minuten bei RT gefärbt. Die Zellen wurden mit Alexa Fluor™ 488-Esel-Anti-Kaninchen-IgG (1: 500, Invitrogen), DAPI (10 µg/ml, Sigma) und WGA Texas Red (1:100, Invitrogen) 30 Minuten bei RT inkubiert. Zwischen jedem Schritt wurden die Zellen zweimal mit 1% BSA in DPBS gewaschen. Die Bilder wurden mit LSM 710 (Zeiss) mit ZEN 2009-Software aufgenommen.
Proximity-Ligationstest
FHR1 (20 µg/ml) wurde mit nekrotischen HUVECs (45 min bei 65°C) bei 37°C für 60 min unter Schütteln bei 700 U/min inkubiert. Gewaschene Zellen (5 × 10⁵) wurden auf mit Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) beschichtete diagnostische Objektträger vom Typ PTFE (Carl Roth) ausgesät und mit polyklonalem Kaninchen-FHR1-Antiserum (11) (1:500) und monoklonalem Maus-MDA-LDL-Antikörper E014 (Tsiantoulas, D. et al. Circulating microparticles carry oxidation-specific epitopes and are recognized by natural IgM antibodies. Journal of lipid research 56, 440-448 (2015)) (1: 100) inkubiert. Kontrollzellen wurden mit polyklonalem Kaninchen-FHR1-Antiserum (11) (1:500) und Maus-IgM-lsotyp-Ctrl-Antikörper (Biolegend) (1:50) inkubiert. Der PLAassay wurde gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt, das mit der Duolink In Situ Red Starter Kit Maus/Kaninchen (Sigma-Aldrich) geliefert wurde. Die Bilder wurden mit LSM 710 mit ZEN 2011 aufgenommen.
FHRB Bindung an Maus alveolare Makrophagen
Gesunde sowie nekrotische (30 min bei 63°C) Maus alveolare Makrophagen (jeweils 0,5 × 10⁵) wurden mit FHRB oder BSA (jeweils 10 ug) für 20 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von Kaninchen-FHRB-Antiserum, das gegen das rekombinante Protein 211 (1:500) erzeugt wurde und Alexa 488-Esel-α-Kaninchen (1:500, Invitrogen) zusammen mit Viability Dye eFluor® 780 (1:10.000) jeweils 20 min bei 4°C. Zwischen jedem Schritt wurden die Zellen zweimal in DPBS mit 1% BSA gewaschen. Die FHRB-Bindung wurde durch Durchflusszytometrie analysiert.
Proteinbindung an LDL/ MDA-LDL und C3b
5 µg/ml LDL, MDA-LDL (beide Cell Biolabs) oder BSA wurden 1 h bei 37°C aufgetragen, mit 200 µl Blockierungspuffer I 1 h bei 37°C blockiert und mit 30 µg/ml FHR1 2 h bei RT polyklonalem FHR1-Antikörper (4) (1:1000) in Cross-Down-Puffer (AppliChem) 1 h bei RT sowie mit HRP-markierten polyklonalen Anti-Kaninchen-IgGs (Dako) 1 h bei RT inkubiert. Alle Schritte umfassten 3-5 Waschschritte mit DPBS 0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Anschließend wurde TMB (50 µl, eBioScience) zugegeben und die Reaktion mit H₂SO₄ (2 M, Roth) gestoppt. Die Extinktion wurde mit einem Mikroplattenlesegerät bei 450 nm gemessen. Für die dosisabhängige Bindung wurden MDA-LDL (5 µg/ml) aufgebracht und nach Blockierung 0, 1, 2,5, 5, 10 µg / ml FHR1 für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Kinetik der Bindung von FHR1 an MDA-LDL wurde mittels Oberflächenplasmonresonanztechnik unter Verwendung eines Biacore 3000-Instruments (Biacore) gemessen. MDA-LDL wurde unter Verwendung eines Standard-Amin-Kopplungsverfahrens an Durchflusszellen eines Sensorchips (CM5) immobilisiert. Verschiedene Konzentrationen von FHR1 (250-2000 nM), verdünnt in PBS oder PBS ohne Protein als Kontrolle wurden in die Durchflusszellen mit MDA-LDL oder Blindkontrolle mit einer Durchflussrate von 5 µl/min bei 25°C injiziert. Für Fragmentbindungsstudien wurden 5 µg/ml MDA-LDL über Nacht bei 4°C immobilisiert. Nach dem Blockieren wurden 5 5 µg/ml FHR1 oder 10 µg/ml FHR1 SCR 1-2 oder SCR 3-5 2 Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von Inkubation mit Penta His-Antikörper (1:1000) und polyklonalem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:1000), jeweils 1 h bei RT. Danach wurde TMB zugegeben und die Reaktion mit H₂SO₄ (2 M) gestoppt.
Um die FHR1-Bindung an C3b zu zeigen, wurden 5 µg/ml C3b oder FHR1 1 Stunde bei 37°C aufgetragen, mit Blockierungspuffer I (200 µl) für 1 Stunde bei 37°C blockiert und 2 Stunden mit FHR1 (10 µg/ml) bei 37°C inkubiert. Der ELISA wurde wie für MDA-LDL beschrieben fortgesetzt.
Ersatz von FHR1 durch FHR2 oder FHR2DM
FHR1 SCR 1-2 (5 µg/ml) wurde über Nacht bei 4°C auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert, mit NHS (5%) in DPBS für 1 h bei 37°C inkubiert, und FHR2 oder FHR2DM (0, 1, 5, oder 15 µg/ml) wurde zu jeder Probe hinzugefügt. FHR1 wurde durch Inkubation mit monoklonalem Antikörper C1810 (1:1000) für 1 h bei RT (zwischen 20°C und 25°C) und FHR2DM mit monoklonalem FHR2 Antikörper (9) und sekundärem α-Maus (1:1000) nachgweisen. Alle Schritte schlossen 3 - 5 Waschschritte mit DPBS 0,05% Tween 20 ein.
Immunhistochemie
FFPE-Gewebeschnitte wurden auf Anwesenheit von FHR1 (Leibniz-Institut, Jena, Deutschland) gefärbt, in dem die Schnitte mit einer Protease-Lösung für 30 Minuten bei 40°C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei 4°C mit FHR1-Antikörpern (1:40 000) inkubiert und unter Verwendung von POLAP-AP (Zytomed, Berlin, Deutschland) entwickelt.
Analyse von Patienten-Serumproben
Nach informierter Aufklärung wurden Serumproben entnommen. Die Serumspiegel von hochempfindlichem IL-1β (Thermo Fisher Scientific), Anti-MPO-Antikörpern (ORG 519 Orgentec) und Anti-PR3-Antikörpern (ORG 618, Orgentec) wurden durch ELISA gemäß dem von den Herstellern bereitgestellten Protokoll bestimmt. Die CRP-Werte wurden mit Modul C701 (Cobas8000) gemessen.
Das Vorhandensein von FHR1 in NHS-Proben wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Roti ® -Load 2 (2,5 µl, Roth) wurde zu in DPBS (10 µl) verdünntem NHS (1 µl) gegeben und die Proben über SDS-PAGE aufgetrennt. Immunblotting wurde mit polyklonalem FH-Antiserum (1: 7500, CompTech) und HRP-konjugiertem Ziegenantikörper (1:2500, Dako) durchgeführt.
Statistische Analyse
Signifikante Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests analysiert. AAV-Patienten wurden unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen t-Tests mit Welch`s Korrektur analysiert. Die Immunhistochemie wurde unter Verwendung des Wilcoxon Signed Rank-Tests analysiert. Die Korrelation zwischen IL-1β/CRP und ANCA wurde unter Verwendung eines Spearman-Korrelationstests analysiert. Werte von *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 wurden als statistisch signifikant angesehen.
FHR1 induziert pro-inflammatoriche Cytokinsekretion durch Monocyten
In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass FH an oxidierte Lipidablagerungen bindet und die Komplementaktivierung und Entzündungsreaktionen hemmt (17). Um zu untersuchen, ob FHR1 auch die Entzündung moduliert, beschichteten die Erfinder Mikrotiterplatten mit FHR1 und inkubierten es mit frisch isolierten humanen peripheren Blutmonozyten in normalem Humanserum (NHS) mit oder ohne Lipopolysaccharid (LPS). Die Cytokinkonzentrationen im Überstand wurden nach 20 Stunden gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass FHR1 allein die Freisetzung des entzündungsfördernden Cytokins IL-1β aus Monozyten stark induzierte und die durch LPS ausgelöste Sekretion von IL-1β erhöhte ( 1a). Im Gegensatz dazu induzierten immobilisiertes FHR2, FHR3, FHL-1, FH und BSA keine IL-1 β-Produktion (1b). FHR1 induzierte IL-1β in einer dosisabhängigen Weise (Konzentrationen im Bereich von 0,6 bis 5 µg/ml) bereits 3 h nach dem Beginn der Co-Inkubation (1c). Entzündungsreaktionen wurden durch die C-Termini von FHR1/SCR3-5 und auch FH/SCR19-20 ausgelöst, wie in einem ähnlichen Assay gezeigt wurde. Der N-Terminus (SCR1-2) von FHR1 konnte IL-1β nicht induzieren (1d). Da ein hohes Maß an IL-1 β-Sekretion durch Monozyten einen entzündungsfördernden Zelltod auslösen kann, der als Pyroptose bezeichnet wird (18), ermittelten die Erfinder die Freisetzung des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH; Marker für Zelltod) im Zellüberstand. Als Reaktion auf immobilisiertes FHR1 wurden sehr niedrige Konzentrationen von LDH freigesetzt. Somit zeigten Monozyten keine Pyroptose. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass rekombinantes menschliches FHR1 unspezifisch wirkt, exprimierten die Erfinder auch das Maushomolog von FHR1, genannt FHRB, und testeten dieses Protein in den gleichen Aktivierungsassays unter Verwendung von isolierten Mausmonozyten und Mausserum. Ähnlich wie FHR1 induzierte immobilisiertes FHRB die IL-1β-Sekretion durch Maus-Monozyten. Parallel zur IL-1 β-Induktion löste FHR1 die Sekretion der proinflammatorischen Cytokine IL-18, TNFα und IL-6 (1e-g) aus, jedoch nicht IL-18. Es inhibierte auch die Sekretion des entzündungshemmenden Cytokins IL-10 durch LPS-stimulierte Monozyten (1h). Ähnlich wie IL-1β wurde TNFa von Monozyten nach 3 h Co-Inkubation mit immobilisiertem FHR1 freigesetzt.
Da FHR1 im menschlichen Serum zirkuliert, ermittelten die Erfinder als nächstes seine entzündungsfördernde Funktion in einer flüssigen Phase. Zunächst wurde die Oberfläche der Mikrotiterplatte mit BSA blockiert. Monozyten wurden zugegeben, gefolgt von FHR1 und NHS. In diesem Ansatz hatte FHR1 keinen Effekt auf die IL-1β (1i) oder IL-10 Produktion. Daher war eine Immobilisierung von FHR1 erforderlich, um die entzündungsfördernde Reaktion auszulösen. Darüber hinaus ging die FHR1-Funktion hinsichtlich der Auslösung der Sekretion von IL-1β und IL-10 ohne NHS verloren, wenn das NHS hitzeinaktiviert war oder EDTA enthielt (1j). FHR1 induzierte die IL-1β-Freisetzung bei niedrigen NHS-Konzentrationen (0,25%); Die IL-1 β-Freisetzung nahm bei höheren NHS-Konzentrationen zu (1k). Zusammenfassend induziert oberflächengebundenes (nicht freies) FHR1 die Sekretion von IL-1β und hemmt die IL-10-Freisetzung durch Monozyten in Gegenwart von aktivem NHS.
Die pro-inflammatorische Funktion von FHR1 ist unabhängig von den Komplementkaskaden
Nachdem gezeigt wurde war, dass FHR1 aktives NHS benötigt, um die Sekretion von IL-1 IL-1β auszulösen und die IL-10-Produktion durch Monozyten zu hemmen, untersuchten die Erfinder, ob das Komplementsystem für seine proinflammatorische Funktion wesentlich ist. Die Erfinder fanden heraus, dass FHR1 die Sekretion von IL-1β erhöhte und die IL-10-Freisetzung in Gegenwart von C3-abgereichertem oder-inhibiertem NHS blockierte (2a). In ähnlicher Weise vermochte die Blockierung von CR3, C3aR und C5 die FHR1-vermittelte IL-1 β-Freisetzung nicht zu verringern (2a). Weder C3 noch C5 waren an der FHR1-Funktion beteiligt. Das Blockieren des klassischen und des Lectininduzierten Komplementwegs unter Verwendung von EGTA-behandeltem oder C1q-abgereichertem NHS inhibierte die FHR1-Aktivität nicht (2b). In ähnlicher Weise hatte die Blockierung des alternativen Weges (Faktor B- oder P-abgereichertes NHS) keinen Einfluss auf die FHR1-Funktion (2c). Daher ist die FHR1-vermittelte Induktion von IL-1β und die Hemmung der IL-10-Sekretion durch Monozyten unabhängig von den Komplementwegen.
FHR1 aktiviert NLRP3 via EMR2
Zwei Signale induzieren die Sekretion von IL-1β durch Monozyten. Das erste wird durch DAMPs und PAMPs ausgelöst und wird zum Beispiel durch Toll-like-Rezeptoren vermittelt. Signal 1 aktiviert NF-_KB, das dann die Transkription von Pro-IL-1β induziert. Anschließend wird Pro-IL-1β durch Caspase 1 gespalten, die über Signal-2-induzierte Mustererkennungsrezeptoren (NLRs) aktiviert wird; das Ergebnis ist die Freisetzung von IL-1β19. Um herauszufinden, ob die FHR1-induzierte Produktion von IL-1β beide Signale erfordert, inhibierten die Erfinder zuerst NF-_KB und stellten fest, dass die FHR1-vermittelte Freisetzung von IL-1β vollständig blockiert war (2d). FHR1 induzierte die Transkription von pro-IL-1β und TNFa ausschließlich in Gegenwart von NHS, wie durch eine erhöhte RNA-Transkription in Monozyten gezeigt. Ähnlich wie NF-κB blockierte die Hemmung von Caspase-1 auch die IL-1 β-Freisetzung (2e). Die Hemmung der Rezeptoren TLR2, TLR4, TLR6, CD14, CD36, RAGE, Dectin 1 oder Fc interferierte jedoch nicht mit der FHR1-induzierten IL-1β-Sekretion. Daher schlussfolgerten die Erfinder dass FHR1, zusammen mit einem zweiten Signal, das von aktiviertem NHS abgeleitet ist, das Inflammasom über einen spezifischen Rezeptor-vermittelten Signalweg induziert.
Caspase-1 wird durch NLRP1, NLRP3, NLRC4 oder AIM220 aktiviert. Die Inkubation von Monozyten mit einem spezifischen NLRP3-Inhibitor inhibierte die FHR1- und FHRB-vermittelte IL-1β-Freisetzung vollständig und bestätigte dadurch die Beteiligung von NLRP3 am Aktivierungsprozess (2f). In Lysosomen vorkommende Moleküle, wie zum Beispiel teilchenförmige Substanzen oder Kristalle der Harnsäure, induzieren die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder Cathepsin B, die dann die Bildung des NLRP3-Inflammasoms auslösen. In ähnlicher Weise aktiviert die Öffnung des P2X7-Rezeptors durch externes ATP, die zu Kalium (K+) Efflux und erhöhten intrazellulären Ca2₊ -Konzentrationen führt, auch das NLRP3-Inflammasom (20). Um den durch FHR1 ausgelösten Weg zu identifizieren, haben die Erfinder die ROS-Freisetzung gemessen. FHR1 konnte die Freisetzung von ROS durch Monozyten nicht induzieren (obwohl C. albicans die Freisetzung von ROS auslöst). Die Hemmung des K + -Ausflusses und von Cathepsin B beeinflusste die FHR1-induzierte IL-1β-Produktion nicht. Die IL-1 β-Freisetzung wurde jedoch durch Phospholipase C (PLC) -Hemmer blockiert (2g), und die Hemmung von Gßy, der Untereinheit des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR), reduzierte die FHR1-induzierte IL-1β-Freisetzung um 65% (2h).
Da viele proinflammatorische Rezeptoren PLC und Ca2 + induzieren, untersuchten die Erfinder die Signalwege durch RNA-Sequenzierung, um beteiligte Rezeptoren besser zu identifizieren. FHR1-induzierte Gene wurden in Monozyten von vier verschiedenen Spendern nach Inkubation mit NHS für 4 Stunden identifiziert. Die Erfinder identifizierten monozytische Gene, die als Reaktion auf FHR1 hochreguliert wurden (Genontologie-Anreicherungsanalyse: „Immunantwort“, „Zellantwort auf TNF“, „Neutrophil-Chemotaxis“, „Zellantwort auf IL-1“ und „Signaltransduktion und Entzündungsantwort“ (2i, j)). 35 hochregulierte Gene (7,3%) waren entzündungsbedingt, einschließlich NF-kB, NLRP3 und Calcium-Signalwege (KEGG) (2k, I). Die Analyse der Genassoziierten Krankheit (GAD) bestätigte, dass Muster von durch FHR1 hochregulierten Genen bei chronischem Nierenversagen, Bluthochdruck, Myokardinfarkt, Arteriosklerose, Schlaganfall und Blutdruck gefunden werden. Weiterhin regulierte FHR1 den G-Protein-gekoppelten Rezeptor EMR2 / ADGRE2 hoch, von dem zuvor beschrieben wurde, dass er eine Entzündungsreaktion in Makrophagen über PLC und intrazelluläre Ca2⁺ - Freisetzung induziert (21). Die Inhibierung des EMR2-Rezeptors blockierte tatsächlich die durch FHR1 induzierte IL-1β-Freisetzung (2m). Somit induziert FHR1 zusammen mit einem Serumfaktor NF-κB-abhängige Transkription von Pro-IL-1β. Über GPCR aktiviert EMR2 FHR1 PLC, was Phosphatidylinositol (PPI) zu Inositoltriphosphat (IP3) spaltet und dadurch die Ca2 + -Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum stimuliert, das NLRP3 aktiviert, gefolgt von der Aktivierung von Caspase-1, das dann pro-IL-1β zu IL-1β spaltet (22) (2n).
FHR1 bindet an nekrotische Zellen und induziert die Sekretion von IL-1β durch Monozyten
Nachdem die Erfinder gezeigt hatten, dass oberflächenbeschichtetes FHR1 das NLRP3-Inflammasom induziert, fragten sie, ob FHR1 diese Funktion auch durch natürliche Bindung an Zelloberflächen vermittelt. Humane gesunde oder nekrotische Endothelzellen (HUVECs) wurden mit FHR1 oder gereinigtem FH inkubiert und die Bindung durch Durchflusszytometrie analysiert. FHR1, jedoch nicht FH, wurde an nekrotische HUVECs gebunden, und keines der Moleküle wurde von gesunden Zellen and gebunden (3a). Ähnlich zu menschliches FHR1 band FHRB an nekrotische Maus alveolare Makrophagen, jedoch nicht an gesunde Zellen. Die Bindung von FHR1 an nekrotische Zellen wurde bestätigt, in dem nekrotische HUVECs mit FHR1 inkubiert und mit einem für FHR1 spezifischen monoklonalen Antikörper zusammen mit Weizenkeimagglutinin (WGA Texas Red) gefärbt wurden, um die Zelloberfläche aufzuhellen. FHR1 band an verschiedene Stellen auf nekrotischen Zellen, die an Zelloberflächenintegrität verloren hatten (wie durch verringerte WGA-Färbung ersichtlich) (3b). Wenn nekrotische HUVECs in NHS inkubiert wurden, banden sowohl FH als auch FHR1 von NHS an nekrotische, aber nicht an lebende Zellen (3c). In diesem Fall wurde die Bindung von FH durch seine Wechselwirkung mit C3b an der Oberfläche erklärt; im Gegensatz dazu band FHR1 in Gegenwart/Abwesenheit von C3b an Zellen. Mit der Bindung an C3b über SCR3-58 verlor FHR1 die Fähigkeit, die Freisetzung von IL-1β zu induzieren (3d). FHR1 allein band jedoch über die N-terminalen SCR1-2-Domänen an nekrotische Zellen, wie durch Durchflusszytometrie gezeigt wurde. Daher lösen die FHR1-Domänen SCR3-5 die Entzündungsreaktion aus, wenn FHR1 an nekrotische Zellen gebunden ist.
Um zu untersuchen, ob an die Oberfläche von nekrotischen Zellen gebundenes FHR1 auch die Cytokinantworten von Monozyten moduliert, inkubierten die Erfinder nekrotische HUVECs mit FHR1 (10 µg). Nach ausgiebigem Waschen wurden diese Zellen 20 h in Gegenwart von NHS mit Monozyten inkubiert. FHR1 band an nekrotische Zellen und löste einen > 4-fachen Anstieg der IL-1β-Freisetzung durch Monozyten im Vergleich zu unbehandelten nekrotischen Zellen aus (3e). Wie erwartet löste die Inkubation nekrotischer Zellen mit Monozyten in NHS, das FHR1 enthielt, die IL-1 β-Freisetzung aus. Der IL-1β-Spiegel fiel um etwa 60%, wenn Monozyten mit FHR1-defizientem (ΔFHR1/3) NHS inkubiert wurden (3f). Die Rekonstitution von ΔFHR1/3-Serum mit FHR1 führte zur Anlagerung von FHR1 an die nekrotischen Zellen und zu einer starken Freisetzung von IL-1β durch Monozyten; Dies war bei FH nicht der Fall (3g).
FHR1 bindet an MDA-LDL und erhöht die Freisetzung von IL-1β durch Monocyten
Malondialdehyd-modifizierte Lipoproteine niedriger Dichte (MDA-LDL) sind ein Marker für oxidativen Stress und werden von geschädigten und nekrotischen Zellen produziert (23). FHR1 bindet dosisabhängig an MDA-LDL, jedoch nicht an LDL oder BSA (3h). Die Bindung von FHR1 an MDA-Epitope, die durch nekrotische HUVECs exprimiert wurden, wurde unter Verwendung eines Proximity-Ligationstests bestätigt (3i). Ähnlich wie bei nekrotischen Zellen bindet FHR1 auch über SCR1-2 an MDA-LDL (3j). MDA-LDL-gebundenes FHR1 erhöhte die Sekretion von IL-1β durch Monozyten um etwa 40% (3k). Somit ist FHR1 ein Sensor für nekrotische Zelloberflächen und induziert eine Entzündung.
FHR1 bindet an nekrotische Zellen in vivo
Die Erfinder fragten als nächstes, ob FHR1 in vivo gegen spezifische nekrotische Zellen gerichtet ist. Nekrose und Entzündung sind Kennzeichen von AAV und AS (24,25). Daher wurde die Bindung von FHR1 an atherosklerotische Plaques bei AS und an Glomeruli bei AAV-Patienten durch Immunhistochemie (IHC) untersucht. Plaques auf Oberflächen werden durch Lipidakkumulation und Oxidation gebildet; Diese Plaques enthalten nekrotische Zellen. Die Färbung menschlicher Plaques in der menschlichen Arterie und Herzklappe mit einem für FHR1 spezifischen monoklonalen Antikörper, der FH nicht erkennt, ergab eine spezifische Bindung von FHR1 an die Plaques, aber nicht an gesunde Zellen in der Nähe der Plaques (4a, b). Im Gegensatz zu FHR1 zeigte FHR2 eine geringe Bindung an die Herzklappe und kommt überwiegend in der Intima der Arterie vor (4a, b).
In AAV führt eine nekrotisierende Vaskulitis zu einer Schädigung der Endothelzellen, und nekrotische Zellen sind insbesondere in kleinen Blutgefäßen in den Glomeruli vorhanden, die eine sichelförmige Glomerulonephritis verursachen (26). Daher wurden Nierengewebeschnitte von Patienten, bei denen AAV und Nephritis diagnostiziert worden waren, auf FHR1 gefärbt. FHR1 war auf aus nekrotischen Zellen bestehenden glomerulären Halbmonden vorhanden, aber wiederum nicht auf gesundem Gewebe (4c).
Serumkonzentrationen von IL-1β in Patienten mit Vaskulitis
FHR1 bindet an nekrotische Zellen und induziert Entzündungen. Um die Relevanz dieses Prozesses zu bestimmen, massen die Erfinder die IL-1β-Konzentrationen bei Patienten mit AAV und teilten diese nach der Anwesenheit oder Abwesenheit von FHR1 in zwei Gruppen auf. In einer Kohorte von 314 AAV-Patienten hatten 11 einen ΔFHR1/3-Mangel, was mit der Häufigkeit in der normalen gesunden kaukasischen Bevölkerung übereinstimmt (27). AAV-Patienten mit FHR1/3 oder ΔFHR1/3 haben ein ähnliches Alter und Geschlecht. Als die Erfinder die IL-1β-Serumkonzentrationen gemäß der Anwesenheit/Abwesenheit von FHR1 verglichen, stellten die Erfinder bei AAV-Patienten mit ΔFHR1/3 (0,6 ± 0,1 pg / ml) sehr geringe Mengen an IL-1β fest, ähnlich wie bei gesunden Kontrollen (0,4 ± 0,1 pg/ml). Im Gegensatz dazu wurden bei Patienten mit aktivem FHR1 signifikant höhere IL-1β-Konzentrationen festgestellt (1,4 ± 0,3 pg/ml, p <0,05) als bei ΔFHR1/3-Patienten (4d). Um die FHR1-abhängige Regulation von IL-1β zu bestätigen, wurden Serumproben von AS-Patienten entnommen. 3 von 124 Patienten in dieser Kohorte hatten ΔFHR1/3 (2,4%). Beide Gruppen hatten ein ähnliches Alter und Geschlecht. Der IL-1 β-Spiegel in AS-Proben war im Allgemeinen nicht signifikant höher als in den gesunden Kontrollen und ermöglichte keinen Vergleich zwischen Patienten mit oder ohne FHR1. IL-1β-Serumkonzentrationen korrelierten im Gegensatz zu C-reaktivem Protein (CRP) nicht direkt mit ANCA-Antikörpern. Daher wurden die CRP-Konzentrationen im Serum, die als Reaktion auf IL-6 erheblich ansteigen können, in Serumproben von AAV-Patienten analysiert, und diese zeigten signifikant geringere Mengen in Proben von Patienten mit ΔFHR1/3 (2,8 mg/dl ± 0,8 mg/dl) in Vergleich zu Patienten mit FHR1/3 (36 mg/dl ± 3,5 mg/dl, p < 0,001) (4e). In ähnlicher Weise zeigten AS-Patienten mit ΔFHR1/3 geringe CRP-Mengen (4f). Insgesamt zeigen die Daten einen in vivo Einfluss von FHR1 auf die Entzündung.
FHR2 inhibiert FHR1
FHR1 bildet mit FHR2 Homodimere und Heterodimere; Auch FHR1 ist sehr flexibel bei der Bildung von Homo- und Heterodimeren (10). Wenn SCR1-2 von FHR1 immobilisiert und mit NHS inkubiert wurde, stellten die Erfinder fest, dass von Serum abgeleitetes FHR1 an FHR1 SCR1-2 gebunden war. Zugabe von zunehmenden Mengen an FHR2 verdrängte serumgebundenes FHR1 kompetitiv (4g). Im Gegensatz dazu wurde kein Austausch von FHR1 beobachtet, wenn das Dimerisierungsmotiv von FHR2 mutiert war (FHR2DM) (4h). Die Erfinder untersuchten als nächstes, ob FHR2 auch die entzündungsfördernde Aktivität von an nekrotische Zellen gebundenem FHR1 hemmt, indem FHR2 zusammen mit Monozyten zu ΔFHR1/3-Serum gegeben wurde. Wie erwartet verringerte die Zugabe von FHR2, jedoch nicht von FHR2DM, zum Serum die Konzentration von IL-1β um etwa 50% (4i, j). Diese Ergebnisse zeigen, dass FHR2 die FHR1-Aktivität durch Bildung von Heterodimeren hemmt und dass FHR2 die FHR1-vermittelte Entzündung einschränken kann.
Referenzen wie zitiert

1. Chen, M. et al. Antineutrophil cytoplasmic autoantibody - negative Pauciimmune crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 18, 599-605 (2007).
2. Zheng, F., Xing, S., Gong, Z. & Xing, Q. NLRP3 inflammasomes show high expression in aorta of patients with atherosclerosis. Heart, lung & circulation 22, 746-750 (2013).
3. Baldrighi, M., Mallat, Z. & Li, X. NLRP3 inflammasome pathways in atherosclerosis. Atherosclerosis 267, 127-138 (2017).
4. Lotze, M.T. et al. The grateful dead: damage-associated molecular pattern molecules and reduction/oxidation regulate immunity. Immunological reviews 220, 60-81 (2007).
5. Bosurgi, L., Manfredi, A.A. & Rovere-Querini, P. Macrophages in injured skeletal muscle: a perpetuum mobile causing and limiting fibrosis, prompting or restricting resolution and regeneration. Frontiers in immunology 2, 62 (2011).
6. Jennette, J.C. et al. 2012 revised International Chapel Hill Consensus Conference Nomenclature of Vasculitides. Arthritis and rheumatism 65, 1-11 (2013).
7. Zipfel, P.F. & Skerka, C. Complement regulators and inhibitory proteins. Nature reviews. Immunology9, 729-740 (2009).
8. Heinen, S. et al. Factor H-related protein 1 (CFHR-1) inhibits complement C5 convertase activity and terminal complex formation. Blood 114, 2439-2447 (2009).
9. Skerka, C., Horstmann, R.D. & Zipfel, P.F. Molecular cloning of a human serum protein structurally related to complement factor H. The Journal of biological chemistry 266, 12015-12020 (1991).
10. van Beek, A.E. et al. Factor H-Related (FHR)-1 and FHR-2 Form Homoand Heterodimers, while FHR-5 Circulates Only As Homodimer in Human Plasma. Frontiers in immunology 8, 1328 (2017).
11. Goicoechea de Jorge, E. et al. Dimerization of complement factor H-related proteins modulates complement activation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 4685-4690 (2013).
12. Park, C.T. & Wright, S.D. Plasma lipopolysaccharide-binding protein is found associated with a particle containing apolipoprotein A-I, phospholipid, and factor H-related proteins. The Journal of biological chemistry 271, 18054-18060 416 (1996).
13. Gharavi, A.G. et al. Genome-wide association study identifies susceptibility loci for IgA nephropathy. Nature genetics 43, 321-327 (2011).
14. Hughes, A.E. et al. A common CFH haplotype, with deletion of CFHR1 and CFHR3, is associated with lower risk of age-related macular degeneration. Nature genetics 38, 1173-1177 (2006).
15. Zhao, J. et al. Association of genetic variants in complement factor H and factor H-related genes with systemic lupus erythematosus susceptibility. PLoS genetics 7, e1002079 (2011).
16. Zipfel, P.F. et al. Deletion of complement factor H-related genes CFHR1 and CFHR3 is associated with atypical hemolytic uremic syndrome. PLoS genetics 3, e41 (2007).
17. Weismann, D. et al. Complement factor H binds malondialdehyde epitopes and protects from oxidative stress. Nature 478, 76-81 (2011).
18. Fink, S.L. & Cookson, B.T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular microbiology 8, 1812-1825 (2006).
19. Thornberry, N.A. et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1 beta processing in monocytes. Nature 356, 768-774 (1992).
20. Aziz, M., Jacob, A. & Wang, P. Revisiting caspases in sepsis. Cell death & disease 5, e1526 (2014).
21. I, K.-Y. et al. Activation of Adhesion GPCR EMR2/ADGRE2 Induces Macrophage Differentiation and Inflammatory Responses via Gα16/Akt/MAPK/NF-κB Signaling Pathways. Frontiers in immunology 8, 373 (2017).
22. Lee, G.-S. et al. The calcium-sensing receptor regulates the NLRP3 inflammasome through Ca2₊ and cAMP. Nature 492, 123-127 (2012).
23. Chang, M.K. et al. Monoclonal antibodies against oxidized low-density lipoprotein bind to apoptotic cells and inhibit their phagocytosis by elicited macrophages: evidence that oxidation-specific epitopes mediate macrophage recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96, 6353-6358 (1999).
24. Yates, M. & Watts, R. ANCA-associated vasculitis. Clinical medicine (London, England) 17, 60-64 (2017).
25. Martinet, W., Schrijvers, D.M. & De Meyer, Guido R Y. Necrotic cell death in atherosclerosis. Basic research in cardiology 106, 749-760 (2011).
26. Jennette, J.C., Falk, R.J. & Gasim, A.H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody vasculitis. Current opinion in nephrology and hypertension 20, 263-270 (2011).
27. Holmes, L.V. et al. Determining the population frequency of the CFHR3/CFHR1 456 deletion at 1q32. PIoS one 8, e60352 (2013).
28. Manthiram, K., Zhou, Q., Aksentijevich, I. & Kastner, D.L. The monogenic autoinflammatory diseases define new pathways in human innate immunity and inflammation. Nature immunology 18, 832-842 (2017).
29. Celkova, L., Doyle, S.L. & Campbell, M. NLRP3 Inflammasome and Pathobiology in AMD. Journal of clinical medicine 4, 172-192 (2015).
30. Binder, C.J., Papac-Milicevic, N. & Witztum, J.L. Innate sensing of oxidation-specific epitopes in health and disease. Nature reviews. Immunology 16, 485-464 497 (2016).
31. Obermayer, G., Afonyushkin, T. & Binder, C.J. Oxidized low-density lipoprotein in inflammation-driven thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH 16, 418-428 (2018).
32. Okemefuna, A.I., Nan, R., Gor, J. & Perkins, S.J. Electrostatic interactions contribute to the folded-back conformation of wild type human factor H. Journal of molecular biology 391, 98-118 (2009).
33. Hannan, J.P., Laskowski, J., Thurman, J.M., Hageman, G.S. & Holers, V.M. Mapping the Complement Factor H-Related Protein 1 (CFHR1):C3b/C3d Interactions. PIoS one 11, e0166200 (2016).
34. Huang, C.-H. et al. Increased EMR2 expression on neutrophils correlates with disease severity and predicts overall mortality in cirrhotic patients. Scientific reports 6, 38250 (2016).
35. van Eijk, M. et al. Differential expression of the EGF-TM7 family members CD97 478 and EMR2 in lipid-laden macrophages in atherosclerosis, multiple sclerosis and 479 Gaucher disease. Immunology letters 129, 64-71 (2010).
36. Stone, J.H. et al. Rituximab versus cyclophosphamide for ANCA-associated vasculitis. The New England journal of medicine 363, 221-232 (2010).
37. Yates, M. et al. EULAR/ERA-EDTA recommendations for the management of ANCA-associated vasculitis. Annals of the rheumatic diseases 75, 1583-1594 (2016).
38. Ridker, P.M. et al. Antiinflammatory Therapy with Canakinumab for Atherosclerotic Disease. The New England journal of medicine 377, 1119-1131 (2017).
39. Fritsche, L.G. et al. An imbalance of human complement regulatory proteins 489 CFHR1, CFHR3 and factor H influences risk for age-related macular degeneration (AMD). Human molecular genetics 19, 4694-4704 (2010).
40. Hageman, G.S. et al. Extended haplotypes in the complement factor H (CFH) and CFH-related (CFHR) family of genes protect against age-related macular degeneration: characterization, ethnic distribution and evolutionary implications. Annals of medicine 38, 592-604 (2006).
41. Józsi, M. et al. Factor H autoantibodies in atypical hemolytic uremic syndrome correlate with CFHR1/CFHR3 deficiency. Blood 111, 1512-1514 (2008).
42. Foltyn Zadura, A. et al. Factor H autoantibodies and deletion of Complement Factor H-Related protein-1 in rheumatic diseases in comparison to atypical hemolytic uremic syndrome. Arthritis research & therapy 14, R185 (2012).

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die eine sterile Entzündung durch die Modulation von mindestens einem der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle moduliert, umfassend die Schritte von a) In-Kontakt-Bringen von mindestens einem von FHR1, einem EMR2/ADGRE2 bindenden Fragment von FHR1, einer Zelle, die FHR1 exprimiert, und/oder einer Zelle, die ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment von FHR1 exprimiert, mit mindestens einer Verbindung, die als mindestens eines der Expression, der biologischen Aktivität und/oder der Wechselwirkung von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 in einer Zelle modulierend identifiziert werden soll, b) Identifizieren einer Modulation von mindestens einem der biologischen Aktivität, der Expression und/oder der Bindung von FHR1 oder des Fragments an EMR2/ADGRE2 in der Anwesenheit der mindestens einen Verbindung und c) Identifizieren einer Verbindung wie in Schritt b) identifiziert als spezifisch die sterile Entzündung modulierend.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Modulation ausgewählt ist aus einer Abnahme oder einer Zunahme der biologischen Aktivität, der Expression und/oder der Bindung von FHR1 an EMR2/ADGRE2.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Identifizieren ein Verfahren ausgewählt aus rtPCR, Immunpräzipitation und/oder ein Messen der Induktion oder Reduktion von Entzündung in der Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren den Nachweis von Cytokin IL-1β, IL-6, IL-18, C-reaktivem Protein (CRP) und/oder TNFa umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Peptidbibliothek, einer kombinatorischen Bibliothek, einem Zellextrakt, einem „Wirkstoff mit kleinem Molekulargewicht“, einem antisense-Oligonukleotid, einer siRNA und einem Antikörper, insbesondere einem Antikörper gegen FHR1 oder Fragment davon insbesondere einem F(ab)₂-Fragment, das spezifisch mit der Bindung von FHR1 an EMR2/ADGRE2, FHR2 oder eines Bindungsfragments davon interferiert, und einem Rezeptorblocker, wie zum Beispiel einem NLRP3 Inhibitor.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die Verwendung von humanen peripheren Blutmonozyten, normalem humanem Serum (NHS) und/oder Lipopolysaccharid (LPS) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das EMR2/ADGRE2 bindende Fragment von FHR1 den C-Terminus FHR1/SCR3-5 oder den N-Terminus FHR1/SCR1-2 des FHR1 Polypeptids des FHR1 Polypeptids umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, weiter umfassend ein Testen der Verbindung wie identifiziert auf ihre Aktivität sterile entzündliche Antworten zu induzieren oder zu reduzieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend eine computergestützte Analyse von und Optimierung von der Verbindung basierend auf der Struktur, insbesondere der dreidimensionalen und/oder Kristallstruktur von FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2.
Screening Tool zum Screenen auf eine Verbindung, welche die Expression, die biologische Aktivität und/oder die Interaktion von FHR1 mit EMR2/ADGRE2 auf/in einer Zelle moduliert, umfassend eine isolierte Zelle, die FHR1 exprimiert und/oder ein EMR2/ADGRE2 bindendes Fragment davon exprimiert.
Screening Tool nach Anspruch 10, wobei das FHR1 und/oder EMR2/ADGRE2 und/oder die Fragmente davon immobilisiert und/oder markiert sind.
Screening Tool nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei das EMR2/ADGRE2 bindende Fragment von FHR1 den C-Terminus von FHR1/SCR3-5 oder den N-Terminus FHR1/SCR1-2 des FHR1 Polypeptids umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder der Prävention einer Erkrankung oder eines Zustandes gekennzeichnet durch eine Freisetzung der pro-entzündlichen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFα, sterile Entzündung, Krebs, Arteriosklerose, Vaskulitis, wie zum Beispiel Antikörper-assoziierte Vaskulitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsverletzung, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration, umfassend die Schritte von Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und Formulieren der Verbindung wie identifiziert in eine pharmazeutische Zusammensetzung.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung wie erhalten durch ein Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder eines Zustandes gekennzeichnet durch eine Freisetzung der pro-entzündlichen Cytokine IL-1β, IL-6, IL-18, CRP und/oder TNFα, sterile Entzündung, Krebs, Arteriosklerose, Vasculitis, wie zum Beispiel Antikörper-assoziierte Vasculitis (AAV), Zirrhose, Trauma, Reperfusionsverletzung, Transplantation, Diabetes, Morbus Alzheimer, Multiple Sklerose, IgA Nephropathie, C3-Glomerulopathie, IgA Nephropathie, C3-Glomerulopathie und altersbedingte Makuladegeneration.