JP2020097567A - 抗体製剤 - Google Patents

Abstract

【課題】二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の医薬製剤、ならびにこの製剤の調製及び使用のためのプロセスを提供する。【解決手段】以下を含む液体医薬製剤：ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む２０〜１５０mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体、１５〜３５mMのナトリウム、１５〜２５mMの酢酸ヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５±０．５；それにおいて、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）−２及びヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ）に対する二重特異性抗体（二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体）の液体医薬製剤ならびに製剤の調製及び使用のためのプロセスに関する。

背景
アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）−２及びヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ）に対する二重特異性抗体（二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体）は、特に血管疾患（眼血管疾患を含む）の処置及び予防処置のための医薬として治療上の関心となっている。二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、例えばＷＯ２０１００４０５０８、ＷＯ２０１１／１１７３２９、又はＷＯ２０１４／００９４６５に記載されている。これらの抗体は、ＶＥＧＦ受容体へのＶｅｇｆ結合及び同時にＴｉｅ２へのＡＮＧ−２結合を阻害する。

抗体分子は、タンパク質医薬品のグループの一部として、物理的及び化学的分解に非常に感受性である。化学的分解には、結合の形成又は切断を介したタンパク質の修飾を含む任意のプロセスが含まれ、新たな化学物質をもたらす。種々の化学反応がタンパク質に影響を及ぼすことが公知である。これらの反応には、ペプチド結合の切断を含む加水分解ならびに脱アミド、異性化、酸化、及び分解が含まれる。物理的分解は高次構造における変化を指し、変性、表面への吸着、凝集、及び沈殿を含む。タンパク質の安定性は、タンパク質自体の特徴（例、アミノ酸配列、グリコシル化パターン）による、及び外部の影響（例えば温度、溶剤のｐＨ、賦形剤、界面、又は剪断速度など）による影響を受ける。そのため、製造、保存、及び投与の間での分解反応に対してタンパク質を保護するための最適な製剤条件を定義することが重要である。（Manning, M. C., et al. (1989), “Stability of protein pharmaceuticals”, Pharm Res 6(11), 903-918;Zheng, J. Y., Janis, L. J. (2005), “Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298”, Int. J. Pharmaceutics 308, 46-51）。治療用抗体の安定な液体製剤は、製剤に高濃度で抗体を含める必要がある場合には特に得るのが困難である。

従って、本発明の目的は、液体、特に必要最小限の賦形剤を伴う二重特異性ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の高濃度製剤を提供することであり、それによって、所望の投薬が可能になり、細い針を通じた患者への二重特異性抗体の便利な硝子体内投与が可能になる。

概要
本発明は、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の液体医薬製剤、製剤の調製及び使用のための方法に関する。特に、本発明の医薬製剤は、ＡＭＤ及びＤＭＥなどの眼科疾患の処置用の硝子体内投与における使用のためである。

一態様では、本発明は、以下を含む液体医薬製剤に関する：
−ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む２０〜１５０mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体
−１５〜３５mMの塩化ナトリウム
−１５〜２５mMの酢酸ヒスチジン緩衝液
ｐＨ５．５±０．５；それにおいて
二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含み、それにおいて
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａならびに変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む。

一実施形態では、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価であり、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体はファリシマブである。

一実施形態では、製剤はさらに以下を含む：
−１〜２０mMの少なくとも１つの安定剤。

一実施形態では、製剤はさらに以下を含む：
−７．０mM±２．０mMメチオニン。

一実施形態では、製剤はさらに以下を含む：
−０．０１〜０．０７%（ｗ／ｖ）の界面活性剤。

一実施形態では、製剤はさらに以下を含む：
−０．０４%（ｗ／ｖ）±０．０２%（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０。

一実施形態では、製剤はさらに以下を含む：
−５０−２５０mMの等張化剤。

一実施形態では、製剤はさらに以下を含む：
−１６０mM±２４mMスクロース。

一実施形態では、製剤は可視粒子を本質的に含まない。

一実施形態では、製剤は安定な製剤である。

一実施形態では、製剤のオスモル濃度は３００±１００mOsm/kgである。

一実施形態では、製剤は硝子体内投与用である。

一態様では、製剤は眼血管疾患の処置における使用のためである。

一実施形態では、眼血管疾患は、糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性からなる群より 、特に糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）からなる群より選択する。

本発明の一態様は、本発明に従った医薬製剤の調製のための方法である。

本発明の一態様は、本発明に従った医薬製剤を含むバイアルである。

本発明の一態様は、本発明に従った医薬製剤を含む充填済みシリンジである。

本発明の一態様は、本発明に従った液体医薬製剤の凍結乾燥形態である。

本発明は、眼科用途及び硝子体内適用のために有用な価値のある特性を有する二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（ＩｇＧ１定常領域を伴う）の液体医薬製剤を提供する：製剤は（例えば、約１２０mg/lの高濃度でも）低粘度及び低濁度を有し、製剤は安定で等張である。これは、特に、本明細書中に記載するヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む２０〜１５０mg/ml（特に１００〜１４０mg/ml）の二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体、１５〜３５mM塩化ナトリウム、及び１５〜２５mMヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．５±０．５）の組み合わせにより達成される。

図１．ｐＨ／緩衝液スクリーンパートＩからの製剤の濁度（図１Ａ）及び粘度（図１Ｂ）の結果。図１は、ｐＨ／緩衝液スクリーンＩからの製剤の濁度及び粘度の結果を比較する（バーの下：第１列：製剤サンプルの番号；第２列：ｐＨ値；第３列：緩衝液系；第４列：イオン強度）。 図１．ｐＨ／緩衝液スクリーンパートＩからの製剤の濁度（図１Ａ）及び粘度（図１Ｂ）の結果。図１は、ｐＨ／緩衝液スクリーンＩからの製剤の濁度及び粘度の結果を比較する（バーの下：第１列：製剤サンプルの番号；第２列：ｐＨ値；第３列：緩衝液系；第４列：イオン強度）。 図２．ｐＨ／緩衝液スクリーンパートＩＩからの製剤の濁度（図２Ａ）及び粘度（図２Ｂ）の結果（バーの下：第１列：製剤サンプルの番号；第２列ｐＨ値；第３列；粘度低下剤なし−、ＮａＣｌ 又はＣａＣｌ２；第４列：イオン強度）。 図２．ｐＨ／緩衝液スクリーンパートＩＩからの製剤の濁度（図２Ａ）及び粘度（図２Ｂ）の結果（バーの下：第１列：製剤サンプルの番号；第２列ｐＨ値；第３列；粘度低下剤なし−、ＮａＣｌ 又はＣａＣｌ２；第４列：イオン強度）。 図３．開始時ならびに５℃及び２５℃での８週間の保存後のｐＨ／緩衝液スクリーンパートＩＩからの製剤の高分子量種（ＨＭＷ）（バーの下：第１列：製剤サンプルの番号；第２列ｐＨ値；第３列：粘度低下剤なし−、ＮａＣｌ又はＣａＣｌ２；第４列：イオン強度）。 図４．初期及び物理的ストレス後の高分子量種（ＨＭＷ）のレベル（バーの下：第１列：物理的ストレスの種類；第２列：界面活性剤（%）；第３列：製剤サンプルの番号）。 図５．賦形剤スクリーンＩからの製剤の濁度（図５Ａ）及び粘度（図５Ｂ）（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列： 製剤サンプルの番号）。 図５．賦形剤スクリーンＩからの製剤の濁度（図５Ａ）及び粘度（図５Ｂ）（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列： 製剤サンプルの番号）。 図６．初期及び５℃での保存の間での高分子量種（ＨＭＷ）のレベル（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列： 製剤サンプルの番号）。 図７．初期及び２５℃での保存の間での高分子量種（ＨＭＷ）のレベル（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図８．初期及び５℃での保存の間での荷電種のレベル（主ピーク（図８Ａ）、酸性ピーク（図８Ｂ）、及び塩基性ピーク（図８Ｃ））（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図８．初期及び５℃での保存の間での荷電種のレベル（主ピーク（図８Ａ）、酸性ピーク（図８Ｂ）、及び塩基性ピーク（図８Ｃ））（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図８．初期及び５℃での保存の間での荷電種のレベル（主ピーク（図８Ａ）、酸性ピーク（図８Ｂ）、及び塩基性ピーク（図８Ｃ））（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図９．初期及び２５℃での保存の間での荷電種のレベル（主ピーク（図９Ａ）、酸性ピーク（図９Ｂ）、及び塩基性ピーク（図９Ｃ））（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図９．初期及び２５℃での保存の間での荷電種のレベル（主ピーク（図９Ａ）、酸性ピーク（図９Ｂ）、及び塩基性ピーク（図９Ｃ））（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図９．初期及び２５℃での保存の間での荷電種のレベル（主ピーク（図９Ａ）、酸性ピーク（図９Ｂ）、及び塩基性ピーク（図９Ｃ））（バーの下：第１列：粘度低下剤としてのＮａＣｌを伴うｐＨ値、安定剤としてのメチオニンの非存在（−）又は存在（＋）；第２列：製剤サンプルの番号）。 図１０．賦形剤スクリーンＩＩからのタンパク質濃度１２０mg/mLを伴う最適化製剤及び参照製剤の濁度（図１０Ａ）及び粘度（図１０Ｂ）。 図１０．賦形剤スクリーンＩＩからのタンパク質濃度１２０mg/mLを伴う最適化製剤及び参照製剤の濁度（図１０Ａ）及び粘度（図１０Ｂ）。 図１１．賦形剤スクリーンＩＩからのタンパク質濃度３０mg/mLを伴う最適化製剤及び参照製剤の濁度（図１１Ａ）及び粘度（図１１Ｂ）。 図１１．賦形剤スクリーンＩＩからのタンパク質濃度３０mg/mLを伴う最適化製剤及び参照製剤の濁度（図１１Ａ）及び粘度（図１１Ｂ）。 図１２．タンパク質濃度１２０mg/mLを伴う最適化製剤及び参照製剤の初期（左棒）ならびに５（中央バー）及び２５℃（右バー）での１３週間の保存後の高分子量種（ＨＭＷ）のレベル。 図１３．タンパク質濃度３０mg/mLを伴う最適化製剤及び参照製剤の初期（左バー）ならびに５（中央バー）及び２５℃（右バー）での１３週間の保存後の高分子量種（ＨＭＷ）のレベル。 図１４．最適化製剤及び参照製剤の初期（左バー）ならびに５（中央バー）及び２５℃（右バー）での１３週間の保存後の荷電種のレベル（主ピーク（図１４Ａ）、酸性ピーク（図１４Ｂ）、及び塩基性ピーク（図１４Ｃ））。 図１４．最適化製剤及び参照製剤の初期（左バー）ならびに５（中央バー）及び２５℃（右バー）での１３週間の保存後の荷電種のレベル（主ピーク（図１４Ａ）、酸性ピーク（図１４Ｂ）、及び塩基性ピーク（図１４Ｃ））。 図１４．最適化製剤及び参照製剤の初期（左バー）ならびに５（中央バー）及び２５℃（右バー）での１３週間の保存後の荷電種のレベル（主ピーク（図１４Ａ）、酸性ピーク（図１４Ｂ）、及び塩基性ピーク（図１４Ｃ））。

発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２を含む液体医薬製剤に関する。

用語「医薬製剤」は、有効成分の生物学的活性を明確に有効にするような形態であり、製剤が投与される被験者に毒性である追加成分を含まない調製物を指す。

本発明に従った製剤に関連して本明細書中で使用する用語「液体」は、大気圧下で少なくとも約２℃〜約３５℃の間（一実施形態では約２℃〜約２５℃の間）の温度で液体である製剤を表示する。

医薬製剤中に含まれる二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の濃度は、約２０mg/ml〜約１５０mg/mlの範囲中にあり、特に濃度１２０mg/ml±１８mg/ml、さらに特に濃度は１２０mg/ml±１２mg/mlである。別の実施形態では、濃度は３０mg/ml±４．５mg/mlでありうる。

本明細書中で使用する「抗体」は、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。本明細書中で使用する用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、リガンドが実際に結合する抗体分子の領域を表示する。用語「抗原結合部位」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む（ＶＨ／ＶＬの対）。

抗体特異性は、抗原の特定のエピトープについての抗体の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。

本発明に従った「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、２つの異なる抗原、第１の抗原としてのＶＥＧＦ及び第２の抗原としてのＡＮＧ２について特異的である。

本明細書中で使用する用語「単一特異性」抗体は、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を表示する。

本願内で使用する用語「価」は、抗体分子中の特定数の結合部位の存在を表示する。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗体分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表示する。本発明に従った二重特異性抗体は、好ましくは「二価」である。

本明細書中で使用する用語「ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）に結合する二重特異性抗体」、「二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体及び二重特異性＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体」は互換的であり、少なくとも２つの異なる抗原結合部位（ＶＥＧＦに結合する第１の部位及びＡＮＧ２に結合する第２の部位）を有する抗体を指す。

二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、例えば ＷＯ２０１０／０４０５０８、ＷＯ２０１１／１１７３２９、ＷＯ２０１２／１３１０７８、ＷＯ２０１５／０８３９７８、ＷＯ２０１７／１９７１９９、及びＷＯ２０１４／００９４６５において記載されている。ＷＯ２０１４／００９４６５には、特に眼血管疾患の処置用に設計された二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が記載されている。ＷＯ２０１４／００９４６５の二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（その全体を本明細書中に組み入れる）は、本明細書中に記載する眼血管疾患の処置及び処置スケジュールにおいて特に有用である。特に、ファリシマブとしても記載されている、ＷＯ２０１４／００９４６５に記載されている抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（World Health Organization(2017)において“International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN). Proposed INN: List 118” WHO Drug Information. 31 (4)）は、本発明の好ましい二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体である。

一実施形態では、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に及びヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）に結合する二重特異性抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体であり、それにおいて
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び、それにおいて
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａならびに変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む。

一実施形態では、そのような二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価である。

一実施形態では、そのような二重特異性の二価抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、以下を特徴とする：
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号７のアミノ酸配列を、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号１５のアミノ酸配列を、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号１６のアミノ酸配列を含む。

本発明の一態様では、本発明に従ったそのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖、それにおいて定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている。

ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）に特異的に結合する二重特異性抗体のこの二重特異性の二価抗体形式は、ＷＯ２００９／０８０２５３に記載されている（Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ修飾ＣＨ３ドメインを含む）。この二重特異性の二価抗体形式に基づく抗体をＣｒｏｓｓＭＡｂｓと名付ける。

一実施形態では、そのような二重特異性の二価抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）第１の全長抗体の重鎖としての配列番号１７のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖としての配列番号１８のアミノ酸配列、及び
ｂ）第２の全長抗体の修飾重鎖としての配列番号１９のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の修飾軽鎖としての配列番号２０のアミノ酸配列。

一実施形態では、そのような二重特異性の二価抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

したがって、本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性の二価抗体であり、配列番号１７の、配列番号１８の、配列番号１９の、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二重特異性の二価抗体のＣＨ３ドメインを「ノブ・イン・トゥ・ホールズ」技術により変えて、これは、いくつかの例を用いて、例えばＷＯ９６／０２７０１１、Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681において詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変えて、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々が「ノブ」になることができ、他方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体が安定化され（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量が増加する。

本発明の好ましい態様では、本発明に従った二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、以下を特徴とする：
１つの重鎖のＣＨ３ドメイン及び他の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体ＣＨ３ドメイン間の元の界面を含む界面で会い；
それにおいて前記界面を二重特異性抗体の形成を促進するように変えて、それにおいて変化は以下を特徴とする：
ａ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインを変えており、
元のインターフェース内で、１つの重鎖のＣＨ３ドメインが、二重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面に会うようにし、
アミノ酸残基を、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換し、それにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞に配置可能である１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に隆起を生成し、
及び
ｂ）他の重鎖のＣＨ３ドメインを変えて、
二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面に会う第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で
アミノ酸残基を、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換し、それにより、第１のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を配置可能である第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞を生成する。

このように、本明細書中に記載する使用のための二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、好ましくは、以下である：
ａ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体ＣＨ３ドメイン間の元の界面の変化を含む界面で会い；
それにおいてｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて
アミノ酸残基を、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換し、それにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞中に配置可能である１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に隆起を生成し、
及び、それにおいて
ｉｉ）他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて
アミノ酸残基を、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置換し、それにより、第１のＣＨ３ドメインの界面内の隆起を配置可能である第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞を生成する。

好ましくは、より大きな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択する。

好ましくは、より小さな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択する。

本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメインを、各々のＣＨ３ドメインの対応する位置においてアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによりさらに変えて、両方のＣＨ３ドメイン間のジスルフィド架橋を形成できるようにする。

一実施形態では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ変異を、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば、１つのＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ変異を、他のＣＨ３ドメイン中にＹ３４９Ｃ変異を導入することにより使用することができる（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）。

別の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他においてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。別の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（１つのＣＨ３ドメインにおける追加のＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ変異及び鎖間ジスルフィド架橋を形成する他のＣＨ３ドメインにおける追加のＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃ変異）（常にＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。

ヘテロ二量体化を実行するためのＣＨ３−修飾のための他の技術を、本発明の代替として熟慮し、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、及びＷＯ２０１３／０９６２９１において記載されている。

一実施形態では、ＥＰ１ ８７０ ４５９Ａ１に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。このアプローチは、両方の重鎖間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置に反対荷電を伴う荷電アミノ酸の置換／変異の導入に基づく。前記多重特異性抗体についての１つの好ましい実施形態は、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ変異ならびに多重特異性抗体の他の重鎖のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ変異である（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従った番号付け） 。

別の実施形態では、前記多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｔ３６６Ｗ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含み；加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ変異を含む。

一実施形態では、ＷＯ２０１３／１５７９５３に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｋ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｌ３５１Ｄ変異を含む。さらなる実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｌ３５１Ｋ変異をさらに含む。さらなる実施形態では、他の重鎖のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、及びＬ３６８Ｅ（一実施形態ではＬ３６８Ｅ）より選択されるアミノ酸変異をさらに含む。

一実施形態では、ＷＯ２０１２／０５８７６８に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆ変異を含む。さらなる実施形態では、他の重鎖のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２にアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態では、前記アミノ酸変異は、以下からなる群より選択する：
ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、及びＴ４１１Ｗ、
ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、及びＤ３９９Ｋ、
ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、及びＳ４００Ｋ、
ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、及びＦ４０５Ｗ、
ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、及びＮ３９０Ｄ、
ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、及びＫ３９２Ｅ。

さらなる実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｆ変異を含む。さらなる実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ａ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆ変異を含む。さらなる実施形態において、他の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒ変異をさらに含む。

一実施形態では、ＷＯ２０１１／１４３５４５に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。一実施形態では、ＷＯ２０１１／１４３５４５に従ったアミノ酸修飾を、３６８及び４０９からなる群より選択される位置で重鎖のＣＨ３ドメイン中に導入する。

一実施形態では、上に記載するノブイントゥホール技術も使用する国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ａ変異を含む。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｙ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ｔ変異を含む。

一実施形態では、多重特異性抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものであり、ＷＯ２０１０／１２９３０４に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。

一実施形態では、ＷＯ２００９／０８９００４に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（一実施形態ではグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）；さらなる実施形態ではＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ変異）でのＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み、及び他の重鎖のＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸（一実施形態ではリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、さらなる実施形態ではＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ変異）でのＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７のアミノ酸置換を含む。さらなる実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（一実施形態ではグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）；さらなる実施形態ではＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ変異）でのＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換をさらに含む。さらなる実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインは、さらに又は代わりに、負荷電アミノ酸（一実施形態ではグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））でのＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を含む。

一実施形態では、ＷＯ２００７／１４７９０１に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。一実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄ変異を含み、他の重鎖のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄ変異を含む。

一実施形態では、ＷＯ２００７／１１０２０５に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用する。

１つの好ましい実施形態では、そのような二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価である。

一実施形態では、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）に結合する二重特異性の二価抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体であり、それにおいて
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及びそれにおいて
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａならびに変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含み；及び
ｉｖ）定常重鎖領域において、Ｔ３６６Ｗ変異は１つのＣＨ３ドメイン中に含まれ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異は他のＣＨ３ドメイン中に含まれる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）。

一実施形態では、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）に結合する二重特異性の二価抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体であり、それにおいて
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及びそれにおいて、
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａならびに変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含み；及び
ｉｖ）定常重鎖領域において、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異が１つのＣＨ３ドメイン中に含まれ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異が他のＣＨ３ドメイン中に含まれる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）。

一実施形態では、そのような二重特異性の二価抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

したがって、本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性の二価抗体であって、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

１つの好ましい実施形態では、そのような二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体はファリシマブである。

本明細書中で使用する用語「ＶＥＧＦ」は、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−Ａ）、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子（ヒトＶＥＧＦ１６５の前駆体配列のアミノ酸２７〜１９１：配列番号 ：２５；アミノ酸１〜２６はシグナルペプチドを表す）、及び関連する１２１、１８９、及び２０６血管内皮細胞成長因子アイソフォームを指し、Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9；Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806 -1814；Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12、及びConnolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24により記載されている通りである（それらの成長因子の天然に生じる対立遺伝子形態及び処理形態と一緒に）。ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内障害に関連付けられる正常及び異常な血管形成ならびに血管新生の調節に含まれる（Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25；Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159；Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91；Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735；Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934；及びDvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039）。ＶＥＧＦは、いくつかの供給源から単離されたホモ二量体糖タンパク質であり、いくつかのアイソフォームを含む。ＶＥＧＦは、内皮細胞について非常に特異的な分裂促進活性を示す。ＶＥＧＦアンタゴニスト／阻害剤により、受容体ＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合が阻害される。公知のＶＥＧＦアンタゴニスト／阻害剤は、ＷＯ２０１４／００９４６５に記載されているような二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体を含む。

本明細書中で使用する用語「ＡＮＧ−２」は、ヒトアンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）（あるいはＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と省略する）（配列番号２４）を指し、例えば、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60及びCheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91において記載されている。アンジオポエチン−１及び２は、血管内皮内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるＴｉｅｓのためのリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48）。現在、アンジオポエチンファミリーの４つの決定的なメンバーがある。アンジオポエチン−３及び４（Ａｎｇ−３及びＡｎｇ−４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐した対応物を表しうる（Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56；Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28）。ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２は本来、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして組織培養実験において同定された（ＡＮＧ−１については：Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69；及びＡＮＧ−２については：Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。公知のアンジオポエチンの全てが、主にその受容体ＴＩＥ２に結合し、Ａｎｇ−１及び−２の両方が３nM（Ｋｄ）の親和性を伴いＴＩＥ２に結合する（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。ＡＮＧ２アンタゴニスト／阻害剤により、受容体ＴＩＥ２へのＡＮＧ２の結合が阻害される。公知のＡＮＧ２アンタゴニスト／阻害剤は、ＷＯ２０１４／００９４６５に記載されているような二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体を含む。

本発明の二重特異性抗体の抗原結合部位は、抗原についての結合部位の親和性に種々の程度で寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、それらの領域が配列間の変動性に従って定義されているアミノ酸配列の編集データベースとの比較により決定する。

本発明の抗体は、免疫グロブリンクラスＩｇＧ１のヒト起源から由来する免疫グロブリン定常領域を含む。

本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

用語「キメラ抗体」は、１つの供給源又は種からの可変領域（即ち、結合領域）及び通常は組換えＤＮＡ技術により調製された異なる供給源又は種から由来する定常領域の少なくとも一部を含む抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に興味深い。本発明により包含される「キメラ抗体」の他の形態は、定常領域が本来の抗体の定常領域から修飾又は変化されて、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明に従った所望の特性を生成するものである。そのようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」として言及する。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生するための方法は従来の組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野において周知である。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許５，２０２，２３８及び５，２０４，２４４を参照のこと。

用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのそれと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾されている抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域中に移植して「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327；及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上記の抗原を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が本来の抗体の定常領域から追加的に修飾又は変化されて、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明に従った特性を生成するものである。

本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は最新技術において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、免疫化時に、内因性免疫グロブリン産生の非存在において完全なレパートリー又は一連のヒト抗体を産生することが可能であるトランスジェニック動物（例、マウス）において産生することができる。そのような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入により、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生がもたらされる（例、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555；Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258；Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生することができる（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388；Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本発明に従ったキメラ抗体及びヒト化抗体について既に述べたように、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」はまた、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチング」、即ち、Ｆｃ部分の変化又は変異（例、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）により、本発明に従った特性を生成するために定常領域において修飾される抗体を含む。

用語「組換えヒト抗体」は、本明細書中で使用するように、組換え手段により調製、発現、作製、又は単離された全てのヒト抗体、例えば宿主細胞（例えばＮＳ０又はＣＨＯ細胞など）から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子もしくは抗体についてトランスジェニックである動物（例、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体などを含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、再配列された形態の可変領域及び定常領域を有する。本発明に従った組換えヒト抗体は、インビボでの体細胞超変異に供されている。このように、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列から由来及び関連するが、インビボではヒト抗体生殖系レパートリー内で天然に存在しない配列である。

本明細書中で使用する「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））又は「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に直接的に含まれる軽鎖及び重鎖ドメインの対の各々を表示する。可変軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各々のドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続された、配列が広く保存された４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造を採用し、ＣＤＲはβシート構造を接続するループを形成しうる。各々の鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により３次元構造中に保持され、他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に従った抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たす。用語「抗体の抗原結合部分」は、本明細書中で使用する場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書中で定義する超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端までドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を定義する領域である。ＣＤＲ領域及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定する、及び／又は「超可変ループ」からのそれらの残基である。

用語「エピトープ」は、抗体への特異的結合が可能な任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、分子（例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなど）の化学的に活性な表面基を含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の荷電特性を有しうる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。

用語「全長抗体」は、２つの「全長抗体重鎖」及び２つの「全長抗体軽鎖」からなる抗体を表示する。「全長抗体重鎖」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨＩ）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）のＮ末端からＣ末端方向にあるポリペプチドであり、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と省略し；場合により、サブクラスＩｇＥの抗体の場合において抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）。好ましくは、「全長抗体重鎖」は、ＶＨ、ＣＨＩ、ＨＲ、ＣＨ２、及びＣＨ３のＮ末端からＣ末端の方向にあるポリペプチドである。「全長抗体軽鎖」は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）のＮ末端からＣ末端方向にあるポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと省略する。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はカッパ又はラムダである。２つの全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨＩドメインの間、及び全長抗体重鎖のヒンジ領域間で、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結される。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥなどの天然抗体である。本発明に従った全長抗体は単一種（例、ヒト）からでありうる、又はそれらはキメラ化もしくはヒト化抗体である。本発明に従った全長抗体は、各々が同じ抗原に特異的に結合する一対のＶＨ及びＶＬにより形成される２つの抗原結合部位を含む。前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端での最後のアミノ酸を表示する。前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＮ末端での最後のアミノ酸を表示する。

本出願内で使用する用語「定常領域」又は「定常ドメイン」は、可変領域以外の抗体のドメインの総和を表示する。定常領域は、抗原の結合には直接的に含まれないが、しかし、種々のエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体はクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類され、これらのいくつかはさらにサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ならびにＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びマイクロと呼ばれる。全ての５つの抗体クラスにおいて見出すことができる軽鎖定常領域は、カッパ及びラムダと呼ばれる。

本願中で使用する用語「ヒト起源から由来する定常領域」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパもしくはラムダ領域を表示する。そのような定常領域は、最新技術において周知であり、例えば。Kabat, E. A.により記載されている（例、Johnson, G., and Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218；Kabat, E. A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788を参照のこと）。

本明細書中で使用する用語「定常重鎖ドメイン（又は領域）」は、定常重鎖領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。

この用語には、定常重鎖ドメイン及び変異体定常重鎖ドメインの天然配列が含まれる。変異体定常重鎖ドメインには、例えば、上に記載するように、ノブ・インツー・ホール（ｋｎｏｂｓｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）技術のためのヘテロ二量体化を促進するために使用される、定常（ｃｏｓｔａｎｔ）ドメインにおける変異が含まれる。また、例えば Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）などの他の変異を含めることができる。なぜなら、そのような変異を伴う定常ドメインは、低下したＦｃＲ結合を有するからである（特に、それらはＦｃＲｇａｍｍａＩ、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩ、及びＦｃＲｇａｍｍａＩＩＩへの結合をもはや示さない）。これは、例えば、血栓症（Meyer, T., et al., J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81）などの潜在的な副作用を低下させるために有用である。また、例えば 、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）も定常ドメイン中に含めることができる。なぜなら、そのような変異を伴う定常ドメインは、低下したＦｃＲｎ（１つもしくは２つの変異）結合、又は排除されたＦｃＲｎ結合（３つ全ての変異）を有するためである。

一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、アラニン１１８（Ａ１１８）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）から重鎖のカルボキシル末端まで及ぶ。しかし、宿主細胞により産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けうる。従って、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞により産生された抗体は、全長重鎖を含んでもよく、又は全長重鎖の切断された変異体を含んでもよい。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、ＥＵインデックスに従った番号付け）の場合でありうる。従って、定常重鎖ドメインのＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しうる、又は存在しないであろう。定常重鎖ドメインを含む重鎖のアミノ酸配列は、他に示さない場合、本明細書においてＣ末端グリシン−リジンジペプチドを用いて表示する。

「安定な」製剤は、その中のタンパク質（例、抗体）が、本質的にその物理的及び化学的安定性を保持し、このように保存時にその生物学的活性を保持するものであり；例えば、それにおいて、医薬製剤中の二重特異性抗体の高分子量含量（ＨＭＷ）は、２５℃で８週間後に１０%未満である（一実施形態では５%未満、一実施形態では２．５%未満）。一実施形態では、医薬製剤中の二重特異性抗体の高分子量含量（ＨＭＷ）は、２５℃で５２週間後に１０%未満である（一実施形態では５%未満）。

一実施形態では、「安定な液体医薬製剤」は、冷蔵温度（２〜８℃）で少なくとも１２ヶ月間、特に２年間、さらに特に３年間にわたり有意な変化が観察されない液体製剤である。安定性についての基準は以下の通りである：抗体単量体の１０%以下、特に５%が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により測定した場合に分解される。さらに、溶液は視覚分析により無色又は透明からわずかに乳白色である。製剤のタンパク質濃度は＋／−１０%以下の変化を有する。１０%以下、特に５%の凝集が形成される。安定性は、当技術分野において公知の方法、例えばＵＶ分光法、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）、比濁法、及び目視検査などにより測定する。

濁度（ＦＴＵ（＝ホルマジン濁度単位））
医薬製剤の濁度を濁度計（例、Ｐｈ． Ｅｕｒ． ２．２．１（液体の透明度及び乳光度）に従ったHach 2100 AN濁度計）で測定することができる。約２mLのサンプル溶液のサンプル容量を内径１１mmのガラスキュベット中に移す。ガラスキュベットを濁度計中に置き、濁度を、参照懸濁液１ＦＴＵ、３ＦＴＵ、１０ＦＴＵ、２０ＦＴＵ、及び１００ＦＴＵの検量線に対して測定する。

粘度（ｍＰａ）
医薬品製剤の製剤サンプルの粘度をレオメーター（例、剪断速度１０００／秒、温度２０℃で２５mm−０．５°コーンを伴うAnton Paar Physica MCR 301回転レオメーター）で測定することができる。

可視粒子
バイアルサンプルをそれぞれの検査機（例えば、２×拡大鏡レンズを備えたSeidenader検査機V90-T）で視覚的に検査する。照明光源Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を設定５に調整した。バイアルサンプルを、粒子の存在についての回転運動の間に検査した。可視粒子の形成は、可視粒子を本質的に含まないＵＳＰ−ＮＦ＜７９０＞の要件に従い、硝子体内注射用には許容可能ではない。ＵＳＰ−ＮＦ＜７９０＞により、「本質的に含まない」の標準が、非経口薬物を検査し、指定数以下の単位を観察して可視粒子を含む場合に達成されることが提供される。より具体的には、１００%検査の対象となる非経口物薬について、「本質的に含まない」の標準は、バッチが０．６５%又はそれ以下の許容品質レベル（ＡＱＬ）を満たす場合に満たされる。及び、顧客に出荷された製品の評価が必要になった場合（例、苦情又は規制上の懸念のため）、企業は２０単位をサンプリングして検査することができる。粒子がサンプル中に観察されない場合、バッチは可視粒子を「本質的に含まない」と考える。

タンパク質濃度（mg/ml）。
製剤サンプルのタンパク質濃度を、Perkin ElmerからのUV/Vis Photometer Lambda 35での紫外線（ＵＶ）吸収により測定した。製剤サンプルを２０mM Ｌ−ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）でタンパク質濃度約０．５mg/mLに希釈し、厚さ１cmを伴う測定キュベット中に充填した。測定キュベットのＵＶ吸収を２８０及び３２０nmの波長で測定した。

タンパク質濃度を、２８０（Ａ２８０）及び３２０nm（Ａ３２０）での測定ＵＶ光吸収、１．７０mL/(mg×cm)の吸光係数（Ｅ）、１cmの厚さ（ｄ）、及び以下の式に従った実際の希釈に対応する希釈係数（ＤＦ）から算出した：

ｐＨ
製剤サンプルのｐＨを、ガラス電極を伴う電位差測定により決定した。

イオン強度
製剤の無次元イオン強度Ｉを、式１に従って算出する：

この式では、ｚはイオンＩの荷電数（陽イオンについて正、陰イオンについて負）ｂ_ｉはそのモル濃度である。ｂ^θは１mol/kgに相当し、Ｉを無次元にするために要求される（Physical Chemistry, P. Atkins, J. de Paula, Oxford Press Nineth edition, p. 194）。

荷電緩衝液種のモル濃度を、Henderson-Hasselbalch式を使用して算出した（Methods in Enzymology- Guide to Protein Purification, Volume 182, M.P. Deutscher, Academic Press, Inc., 1990, p.24ff）。

オスモル濃度
製剤サンプルのオスモル濃度を、凝固点降下の原理に従って、GonotecからのOsmomat 030 3P浸透圧計で測定した。

界面活性剤
本発明の医薬製剤は、抗体の凝集及び粒子形成を低下させるための界面活性剤を含む。本明細書中で使用する用語「界面活性剤」は、撹拌及び剪断などの機械的ストレスに対してタンパク質製剤を保護するために使用される医薬的に許容可能な賦形剤を表示する。医薬的に許容可能な界面活性剤の例は、ポリオキシエチルソルビタン脂肪酸エステル（ツイーン）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、Brij（商標）の商品名の下で販売されているもの）及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロクサマー、プルロニック）を含む。

好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又はポリキサマーである。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Tween20（商標）の商標で販売）及びポリソルベート８０（Tween80（商標）の商品名の下で販売されている）である。好ましいポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸はポリソルベート２０である。

上記の界面活性剤は、一般的に、０．０１%（ｗ／ｖ）又はそれ以上（例、０．０１〜約０．０９%（ｗ／ｖ））の濃度で使用される。本発明の医薬組成物中の界面活性剤は、特に、約０．０２%〜約０．０６%（ｗ／ｖ）の範囲で、さらに特に約０．０３%〜約０．０５%（ｗ／ｖ）の範囲で、さらに特に約０．０４%（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。

本明細書中で使用する用語「ポロキサマー」は、ＢＡＳＦ（ニュージャージー州パーシッパニー）によりPLURONIC（登録商標）Ｆ６８の商品名の下で販売されているポロキサマー１８８として公知のポリオキシエチレンの２つの親水性鎖により隣接されたポリオキシプロピレンの中心疎水性鎖で構成されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーを含む 。本発明の製剤中で利用できる他のポロキサマーは、ポロキサマー４０３（PLURONIC（登録商標）Ｐ１２３として販売されている）、ポロキサマー４０７（PLURONIC（登録商標）Ｐ１２７として販売されている）、ポロキサマー４０２（PLURONIC（登録商標）Ｐ１２２として販売されている）、ポロキサマー１８１（PLURONIC（登録商標）Ｌ６１として販売されている）、ポロキサマー４０１（PLURONIC（登録商標）Ｌ１２１として販売されている）、ポロキサマー１８５（PLURONIC（登録商標）Ｐ６５として販売されている）、及びポロキサマー３３８（PLURONIC（登録商標）Ｆ１０８として販売されている）を含む。

緩衝液
本明細書中で使用する用語「緩衝液」は、医薬調製物のｐＨを安定化させる医薬的に許容可能な賦形剤を表示する。適切な緩衝液は当技術分野において周知であり、文献において見出すことができる。硝子体内投与のための典型的な医薬的に許容可能な緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。これに関連して、特に目的とする緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（「ヒスチジン緩衝液」）又はＬ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジン塩酸塩の混合物を含み、当技術分野において公知の酸又は塩基でのｐＨ調整を伴う。特に目的とする緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（「ヒスチジン緩衝液」）、特に酢酸（例、３０%）又は塩酸塩でのｐＨ調整を伴うＬ−ヒスチジンを含む。上記の緩衝液は一般的に、約２mM〜約２００mM又は約５mM〜約１００mMの濃度で、特に約１０mM〜約３０mM又は約１５mM〜約２０mMの濃度で、さらに特に 約２０mMで使用する。使用する緩衝液に非依存的に、ｐＨは４．５〜７．０の範囲の値、特に５．０〜６．０の範囲の値、最も特にｐＨ５．５±０．２に、当技術分野において公知の酸又は塩基（例、酢酸、塩酸、リン酸、硫酸及びクエン酸、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウム）で、特に酢酸で調整することができる。特に目的とする緩衝液は、５．５±０．５のｐＨで（一実施形態では５．５±０．３のｐＨで；特に５．５±０．２のｐＨで）１５〜２５mM（一実施形態では２０mM±３mM、特に２０mM±２mM）の濃度の酢酸ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン）緩衝液である。

安定剤
用語「安定剤」は、製造、保存、及び適用の間での化学的及び／又は物理的劣化から活性医薬成分及び／又は製剤を保護する、医薬的に許容可能な賦形剤を表示する。タンパク質医薬品の化学的及び物理的分解経路は、Cleland et al. (1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77、Wang (1999) Int J Pharm 185(2):129-88、Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2):1-60、及びChi et al. (2003) Pharm Res 20(9):1325-36により概説されている。安定剤は、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート剤、例えば、以下に定義されるＥＤＴＡなどを含むが、これらに限定しない。本発明において特に使用する安定剤は、糖、ポリオール、及びアミノ酸からなる群より選択する。さらに特に、安定剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、及びメチオニンからなる群より選択する。

より好ましくは、安定剤はメチオニンである。メチオニンは、眼適用における使用のために、本明細書中に記載する製剤において初めて使用された。前臨床安全性試験は、メチオニンが、例えば硝子体内に投与された場合、眼疾患における使用についての良好な安全性プロファイルを示すことを示した。

安定剤は約２mM〜約６００mMの濃度で、特に安定剤がメチオニンである場合、約２mM〜約１５mM又は５〜１２mMの濃度；さらに特に約５〜９mM又は約７mMの濃度で製剤中に存在しうる。

好ましい一実施形態では、安定剤は７．０mM±２．０mMメチオニンの濃度のメチオニンである（一実施形態では７．０mM±１．０mMのメチオニン；一実施形態では７．０mM±０．７mMのメチオニン）。安定剤としてのメチオニンはまた、注射溶液又は包装済みの充填済みシリンジの滅菌のために使用される過酸化水素用のスカベンジャー剤として機能することができるため、特に有用である。

一部の実施形態では、本発明の液体医薬製剤は第２の安定剤として抗酸化剤を含む。「抗酸化剤」は、医薬品有効成分の酸化を防止する、医薬的に許容可能な賦形剤である。酸化防止剤は、キレート剤（例えばＥＤＴＡなど）、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノール、ベンジルアルコール、及びｎ−アセチルシステインを含むが、これらに限定しない。抗酸化剤は、約０．０１〜約１００mMの濃度で、特に約５〜約５０mMの濃度で、さらに特に約５〜約２５mMの濃度で使用することができる。特に、メチオニンは、特に約５〜約２５mMの濃度で、さらに特に約１０mMの濃度で、第２の安定剤として選ぶ。

本明細書中で使用する用語「糖」は単糖又はオリゴ糖を表示する。単糖は、単糖及びそれらの誘導体（例、アミノ糖）を含む、酸により加水分解されない単量体の糖である。単糖類の例は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、ノイラミン酸を含む。オリゴ糖は、分岐又は鎖中のいずれかのグリコシド結合を介して接続された１を上回る単量体の糖単位からなる糖である。オリゴ糖内の単量体の糖単位は同一でも異なっていてもよい。単量体の糖単位の数に依存して、オリゴ糖は二糖、三糖、四糖、五糖などの糖などである。多糖とは対照的に、単糖及びオリゴ糖は水溶性である。オリゴ糖の例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、及びラフィノースを含む。特に、糖はスクロース及びトレハロースより選択され、特にスクロースである。

本明細書中で使用する用語「アミノ酸」は、一般的に、カルボキシル基のα位に位置するアミノ部分を持つ医薬的に許容可能な有機分子を表示する。アミノ酸の例は、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、特にメチオニンを含む。

本明細書中で使用する用語「ポリオール」は、１を上回るヒドロキシ基を伴う医薬的に許容可能なアルコールを表示する。適切なポリオールは、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定しない。ポリオールは、約１０mM〜約５００mMの濃度、特に約１０mM〜約２５０mMの濃度、さらに特に約２００mM〜約２５０mMの濃度で使用することができる。

用語「安定剤」はまた、凍結保護剤を含む。用語「凍結保護剤」は、凍結乾燥プロセス、その後の保存、及び再構成の間での不安定化状態に対して不安定な活性成分（例、タンパク質）を保護する医薬的に許容可能な賦形剤を表示する。凍結保護剤は、糖、ポリオール（例えば糖アルコールなど）、及びアミノ酸からなる群を含むが、これらに限定しない。特に、凍結保護剤は、糖（例えばスクロース、トレハロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノースなど）、ノイラミン酸、アミノ糖（例えばグルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−メチルグルコサミン（「メグルミン」）など）、ポリオール（例えばマンニトール及びソルビトールなど）、及びアミノ酸（例えばメチオニン又はグリシンなど）からなる群より選択することができる。凍結保護剤は一般的に、約１０〜約６００mMの濃度で、特に約１０〜約２５０mMの濃度で、さらに特に約１００〜約２５０mMの濃度で使用される。

等張化剤
医薬製剤は等張化剤も含みうる。本明細書中で使用する「等張化剤」は、製剤の等張性を調節するために使用される医薬的に許容可能な等張化剤を表示する。製剤は、低張性、等張性、又は高張性でありうる。等張性は、一般的に、通常はヒト血清の浸透圧に対する溶液の浸透圧に関連する。本発明に従った製剤は、低張性、等張性、又は高張性でありうるが、好ましくは、医薬製剤は等張性である。等張製剤は、液体、又は固体形態から（例、凍結乾燥形態から）再構成された液体であり、比較される一部の他の溶液（例えば生理的食塩水及び血清など）と同様の等張性を有する溶液を表示する。適切な等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、及びアミノ酸、糖、特にスクロースの群からの任意の成分を含むが、これらに限定しない。本発明の一実施形態では、好ましい等張化剤はスクロースである。等張化剤は一般的に、約５mM〜約１０００mM、特に約３０mM〜約５００mM、さらに特に約１２０mM〜約２００mMの濃度で使用する。本発明の等張製剤用の等張化剤は、一般的に、約５０mM〜約２５０mM、特に約１２０mM〜約２００mMの濃度で使用する。さらに特に、等張製剤用の等張化剤は、１３０mM〜１９０mMの濃度で、さらにさらに特に、スクロースを等張化剤として使用する場合には約１６０mM±２４mMの濃度で使用する。等張化剤及びその濃度は、３００±１００mOsm/kgの目標オスモル濃度を伴う（特に３００±５０mOsm/kgの目標オスモル濃度を伴う）等張製剤を可能にするように選ぶ。

安定剤及び等張化剤内には、両方の方法で機能することができる化合物の群があり、即ち、それらは同時に安定剤及び等張化剤になることができる。それらの例は、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、及び塩の群において見出すことができる。同時に安定剤及び等張化剤でありうる糖の例は、スクロース及びトレハロース、特にスクロースである。

粘度低下剤
医薬製剤はまた、粘度低下剤を含んでもよい。本明細書中で使用する用語「粘度低下剤」は、製剤の粘度を低下させるために使用される医薬的に許容可能なイオン強度調整剤を表示し、これは、眼疾患の処置において高濃度製剤及び細い針を通して眼中に硝子体内投与されると予想される製剤用に重要である（注射のために高圧を必要とせず、比較的迅速に適用可能にする）。典型的な粘度低下剤の例は、例えば、塩化カルシウム又は塩化ナトリウムである。

アジュバント
医薬製剤はまた、アジュバント（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤など）を含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順により、ならびに抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）を含めることにより確実にしうる。保存剤は一般的に、約０．００１〜約２%（ｗ／ｖ）の濃度で使用する。保存剤は、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロル−ｍ−クレゾール、メチル又はプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムを含むが、これらに限定しない。

医薬製剤はまた、上記の異なる薬剤（例えば緩衝剤、界面活性剤、安定剤、イオン強度調整剤など）の量を、本発明の医薬製剤の技術的特色（例、２０mPas又はそれ以下（好ましくは１５mPas又はそれ以下）の粘度、３０ＦＴＵ又はそれ以下（好ましくは２５ＦＴＵ又はそれ以下）の濁度、３００±５０mOsm/kgのオスモル濃度、可視粒子が本質的にない）を本質的に変化させない少量で含んでもよい。

使用
本発明に従った二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の医薬製剤は、眼血管疾患の予防又は処置において使用することができる。この目的のために、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の医薬製剤は、２０mPas又はそれ以下（好ましくは１５mPas又はそれ以下）の粘度、３０ＦＴＵ又はそれ以下（好ましくは２５ＦＴＵ又はそれ以下）の濁度、３００±５０mOsm/kgのオスモル濃度を伴い、可視粒子の本質的にない液体等張製剤として硝子体内投与用に提供する。この目的のための二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の液体等張性医薬製剤は、ガラスバイアル中で、又は充填済みシリンジの形態で、特に充填済みガラスシリンジの形態で提供することができる。

例えば、眼に硝子体内投与されるそのような製剤について、賦形剤（例、アルギニン）は避けるべきである。なぜなら、網膜及び網膜色素上皮への組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）用の担体としてのアルギニンの毒性が記載されているためである（例：Benner J D, Morse LS, Toth CA et al Arch Ophthalmol 19911091731-1736.1736；Johnson MW, Olsen KR. Hernandez E. et al, Arch Ophthalmool 1990108259-263.263、Irvine W D, Johnson MW, Heinandez E. et al,. Arch Ophthalmol 1991109718-722.722、Johnson MW, Olsen KR. Heinandez E., Retina 199111250-258.258）。従って、本発明の液体医薬製剤は、アルギニンを本質的に含まない（これは、アルギニンを含まない、又は（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のための担体としてのそれらの機能を介して）有毒でありうる濃度／レベルを下回る量のアルギニンを含むことを意味する）又はアルギニンを含まない。低粘度はまた、商業規模の産生プロセス（限外濾過による濃縮）を可能にし、簡単で便利な硝子体内注射（２０N未満、特に１５N未満の射出（滑走）力、５０mm/分の射出速度）を確実にするために不可欠である。１５mPas未満の粘度を伴う本発明の液体医薬製剤は、５Ｎ未満の射出力での５秒の射出時間で３０Ｇ注射針を通して注射することができることが実証された。この目的のために、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の医薬製剤は、１５mPas又はそれ以下の粘度、２５ＦＴＵ又はそれ以下の濁度、３００±５０mOsm/kgのオスモル濃度を伴う液体等張製剤であり、可視粒子を本質的に含まない。可視粒子を避けるために、本発明の液体医薬製剤は塩化カルシウムを本質的に含まない（これは、製剤が塩化カルシウムを含まない、又は可視粒子の形成に寄与することができる濃度／レベルを下回る量の塩化カルシウムを含み、製剤が可視粒子を本質的に含まないままである／含まないようにすることを意味する）、又は塩化カルシウムを含まない。

用語「眼血管疾患」及び「血管眼疾患」は、本明細書において互換的に使用し、眼内血管新生症候群、例えば糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性を含むが、これらに限定しない（Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A.、及びKlintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710）。本明細書中で使用する眼血管障害は、眼組織の構造（例えば網膜又は角膜など）中への新たな血管の変化した又は無秩序な増殖及び浸潤により特徴付けられる任意の病理学的状態を指す。一実施形態では、眼血管疾患は、以下からなる群より選択する：滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）（血管新生型加齢黄斑変性（ｎＡＭＤ）とも呼ばれる）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病網膜症（ＤＲ） ）、非増殖糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、血管炎（例、網膜中心静脈閉塞症）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）など滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）（血管新生型加齢黄斑変性（ｎＡＭＤ）とも呼ばれます）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）、非増殖糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、血管炎（例：網膜中心静脈閉塞症）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）。そのため、使用のための抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体及び本明細書に記載する方法は、滲出型ＡＭＤ（新血管性加齢黄斑変性（ｎＡＭＤ）とも呼ぶ）、ＤＭＥ、ＤＲ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、滲出型ＡＭＤ、ＤＭＥ、及びＲＶＯ、また好ましくは滲出型ＡＭＤ滲出型ＡＭＤの予防及び処置において有用である。一部の実施形態では、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）、及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群より選択する。

角膜血管新生に関連付けられる他の疾患は、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズのオーバーウェア、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、乾燥翼状片角膜炎、シェーグレン、酒土性座瘡、フィクテヌローシス、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、周辺角質溶解、リウマチ性関節炎、全身性ループス、多発性関節炎、外傷、ウェゲナー肉芽腫症、強膜炎、スティーブ・ジョンソン病、ペリフィゴイド放射状角膜切開、及び角膜移植拒絶を含むが、これらに限定しない。

網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患は、糖尿病網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞症、動脈閉塞症、頚動脈閉塞症、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、エールズ病、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔｓ）病、網膜炎又は脈絡膜炎を起こす感染症、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭小窩（ｏｐｔｉｃ ｄｉｓｃ ｐｉｔ）、スターガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、及びレーザー後合併症を含むが、これらに限定しない。他の疾患は、ルベオーシス（隅角の血管新生）に関連付けられる疾患及び線維血管又は線維組織の異常増殖（全ての形態の増殖性硝子体網膜症を含む）により起こされる疾患を含むが、これらに限定しない。

未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児に影響を及ぼす眼の疾患である。それは、瘢痕化及び網膜剥離を招きうる網膜血管の無秩序な成長により起こされると考えられている。ＲＯＰは軽度で、自然に解消しうるが、重篤な場合では失明に導きうる。そのようなものとして、全ての早産児はＲＯＰのリスクがあり、非常に低い出生時体重は追加の危険因子である。酸素毒性及び相対的低酸素の両方が、ＲＯＰの発生に寄与しうる。

黄斑変性は、高齢者に主に見出される医学的状態であり、そこでは網膜の黄斑部として公知である、眼の内層の中心が薄くなり、萎縮し、一部の場合において出血する。これによって、中心視力の喪失を招く可能性があり、それによって、細かい詳細を見る、読む、又は顔の認識することができなくなる。米国眼科学会によると、それは、５０歳を上回る人々にとって今日の米国における中心視力喪失（失明）の主な原因である。より若い個人に影響を及ぼす一部の黄斑ジストロフィーを時折黄斑変性として言及するが、この用語は一般的に加齢黄斑変性（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）を指す。

本明細書中で使用する「加齢黄斑変性（ＡＭＤ）」は、黄斑として公知である、網膜の小さな中心部分が悪化する際での重篤な眼の状態を指す。ＡＭＤの滲出型（滲出型ＡＭＤ（ｗＡＭＤ）、新生血管ＡＭＤ（ｎＡＭＤ）とも呼ぶ）は、進行型ＡＭＤの一種であり、黄斑下の脈絡膜からの異常な血管の成長により特徴付けられる。これを脈絡膜血管新生と呼ぶ。これらの血管は網膜中に血液及び体液を漏出させ、直線が波状に見える視覚の歪み、ならびに盲点及び中心視力の喪失を起こす。これらの異常な血管は、最終的に瘢痕化し、中心視力の永久的な喪失に導く。ＡＭＤの症状は、視覚の中心における暗いぼやけた領域；及び色覚の低下又は変化を含む。ＡＭＤは、日常の眼検査において検出することができる。黄斑変性の最も一般的な初期兆候の１つは、網膜下のドルーゼンの小さな黄色沈着物又は色素凝集塊の存在である。

網膜色素変性症（ＲＰ）は一群の遺伝性眼疾患である。ＲＰについての症状の進行において、夜盲症は一般的に、数年又はさらに数十年でトンネル状視野に先行する。ＲＰを伴う多くの人々は、４０代又は５０代まで法的に盲目にならず、一生ずっと一定の視力を保持する。他は、ＲＰから完全に盲目になり、一部の場合においては小児期という早期からである。ＲＰの進行は各々の場合において異なっている。ＲＰは遺伝性網膜ジストロフィーの一種で、光受容器（杆体及び錐体）又は網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常が進行性の視力喪失に導く一群の遺伝性疾患である。罹患した個人は、最初に暗順応不全又は夜間視（夜間失明）、それに続く周辺視野の低下（トンネル視力として公知である）を、及び時折、疾患の経過において後期に中心視力の喪失を経験する。

黄斑浮腫は、体液及びタンパク質の沈着物が網膜の黄色の中心領域である眼の黄斑の上又は下に集まり、網膜が厚くなり腫れる際に生じる。腫脹は、黄斑が眼球後部の網膜の中心近くにあるため、人の中心視力を歪めることがある。この領域には、人が直接的に視線にある形態、色、及び詳細を見ることができるように、鋭く明確な中心視力を提供する密集した円錐が保持される。嚢胞様黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の一種である。

「糖尿病黄斑浮腫」（ＤＭＥ）は、本明細書中で使用するように、糖尿病（１型又は２型）の人々に影響を及ぼす重篤な眼の状態を指す。黄斑浮腫は、網膜中の血管が黄斑中に漏出し、液体及びタンパク質の沈着物が眼の黄斑（網膜の黄色の中心領域）の上又は下に集まり、網膜を肥厚及び腫脹（浮腫）させる際に生じる。腫脹によって人の中心視力が歪むことがある。なぜなら、黄斑が眼球後部の網膜の中心近くにあるためである。ＤＭＥの主な症状は、ぼやけた視力、飛蚊症、コントラストの喪失、複視、及び最終的な失明を含むが、これらに限定しない。ＤＭＥの病態は、通常は網膜中の水の動きを防止する血液網膜関門の破壊により特徴付けられ、このように、網膜組織中に体液が貯留し、網膜肥厚が存在するようになる。ＤＭＥは現在、視力検査（人が標準化チャートで読むことができる最小文字を決定する）、疾患の兆候を確認するための拡張眼検査、画像検査（例えば光干渉断層法（ＯＣＴ）又はフルオレセイン血管造影（ＦＡ）及び眼圧測定など）、眼内の圧力を測定する器具からなる眼科検査の間に診断する。以下の試験も実施して処置を決定する：光干渉断層法（ＯＣＴ）、フルオレセイン血管造影、及びカラーステレオ眼底写真。ＤＭＥは、２つの主なカテゴリーである焦点及び拡散に広く特徴付けられる。限局性ＤＭＥは、黄斑内の別々の異なる漏出の特定の領域により特徴付けられ、十分な黄斑血流を伴う。びまん性ＤＭＥは、眼の内側の血液網膜関門の破壊から生じる、黄斑周囲の毛細血管床全体の漏れから生じる。焦点及びびまん性に加えて、ＤＭＥはまた、臨床検査の所見に基づき、臨床的に有意な黄斑浮腫（ＣＳＭＥ）、非ＣＳＭＥ、及び中心性病変を伴うＣＳＭＥ（ＣＳＭＥ−ＣＩ）に分類される。本発明は、上記のカテゴリーのＤＭＥを処置する方法を含む。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）、非増殖糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、血管炎（例、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）及び網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ））からなる群より選択する。

一実施形態では、眼血管疾患は、糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性からなる群より、特に糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）からなる群より選択する。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は糖尿病網膜症（ＤＲ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は黄斑変性である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）である。

本発明の一実施形態では、眼血管疾患は脈絡膜血管新生である。

投与
本発明に従った液体医薬製剤は、硝子体内（ＩＶＴ）手段、例えば医薬分野において公知の手段（例、適当な注射器）により投与することができる。硝子体内注射のために、典型的には、注射容量は５０〜１００μLである。硝子体内注射は、使い捨て注射器及び３０Ｇ（２５Ｇ〜３０Ｇ）の注射針、又は適当な注射針を伴う充填済み注射器の使用により実施する。液体製剤は、孔径５μmを伴うフィルター針の使用により、製剤を含むバイアルから取り除くことができる。硝子体内注射技術は、例えば、D.Yorston, Community Eye Health. 2014; 27(87): 47において記載されている。

この目的のために、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の医薬製剤は、１５mPas又はそれ以下の粘度、２５ＦＴＵ又はそれ以下の濁度、３００±５０mOsm/kgのオスモル濃度を伴う液体等張製剤であり、可視粒子を本質的に含まない。

インビボ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過及び無菌製造の実践により容易に達成される。

製剤の調製方法
本発明に従った医薬製剤は、当技術分野において公知の方法又はプロセス（例、限外濾過‐ダイアフィルトレーション、透析、添加及び混合、凍結乾燥、再構成、及びそれらの組み合わせ）により調製することができる。本発明に従った製剤の調製の例は、本明細書中の以下に見出すことができる。

本発明の一実施形態では、医薬製剤は、以下の工程を含む以下の製造方法又はプロセスにより調製することができる：
１．５〜８０kD（３０〜５０kD）（３０kD）の間のＭＷＣＯ（分子量カットオフ）を伴う半透膜を使用した限外濾過及びダイアフィルトレーションによる、ヒスチジン−酢酸緩衝液もしくはヒスチジン−酢酸緩衝液及び塩化ナトリウム、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム、及びメチオニン、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム、メチオニン、及びスクロースを含むダイアフィルトレーションに対する緩衝液交換。典型的には、ダイアフィルトレーション緩衝液とバルク溶液の比率は５〜２０（５〜１０）である。
２．１の代わりに、緩衝液交換は、ヒスチジン−酢酸緩衝液もしくはヒスチジン−酢酸緩衝液及び塩化ナトリウム、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム、及びメチオニン、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム、メチオニン、及びスクロースを含む透析緩衝液及び５〜８０kD（３０〜５０kD）（３０kD）の間のＭＷＣＯを伴う透析膜を使用した透析により達成することができる。典型的には、透析緩衝液とバルク溶液の比率は５〜２０（５〜１０）である。
３．緩衝液交換バルク溶液は、５〜８０kD（３０〜５０kD）（３０kD）の間のＭＷＣＯ（分子量カットオフ）を伴うダイアフィルトレーション膜を使用した限外濾過により、１２０mg/mLを上回る（１２０〜１６０mg/mL）（１２０〜２００mg/mL）タンパク質濃度に濃縮する。
４．医薬製剤の最終組成は、それぞれの賦形剤の原液の添加により又は適当な調整緩衝液により調整する。溶液を混合により均質化する。
さらに、製造方法又はプロセスは、以下の工程を含むことができる。
５．最終的な製剤化溶液は、−２０℃未満（−４０℃未満）の温度で凍結保存することができる。
６．最終の一次容器中に充填する前に、溶液を融解する。
７．医薬製剤のいくつかの容器又はバッチを混合し、攪拌により均質化する。
８．均質化された医薬品製剤は、少なくとも０．２又は０．２２μmの孔径を伴ういくつか（少なくとも２つ）の無菌グレードフィルターを通して濾過する。
９．無菌濾過した溶液を無菌条件下で無菌バイアル又は予め充填可能なシリンジに充填し、それぞれエラストマーストッパー、プランジャーストッパー、及びチップキャップを用いて閉じる。
１０．充填した一次容器を、欠陥及び可視粒子について検査する。
１１．充填済みシリンジは、それぞれのデバイスコンポーネントと組み立て、無菌バリアシステム中に包装し、外面で滅菌する。
１２．バイアル及び無菌シリンジを、最終的な二次包装中に包装する。

本発明に従った医薬製剤はまた、凍結乾燥形態又は凍結乾燥形態から再構成された液体形態でありうる。「凍結乾燥形態」は、当技術分野において公知の凍結乾燥方法により製造する。凍結乾燥物は通常、約０．１〜５%（ｗ／ｗ）の残留水分含量を有し、粉末又は物理的に安定なケーキとして存在する。「再構成形態」は、再構成培地の添加後の迅速な溶解により凍結乾燥物から得ることができる。適切な再構成培地は、注射用水（ＷＦＩ）、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例、０．９%（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、及びグルコース溶液（例、５%（ｗ／ｖ）グルコース）を含むが、これらに限定しない。

抗体の産生
本発明のために特に有用な抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は、組換え手段により産生する。組換え産生のための方法は、最新技術において広く公知であり、原核細胞及び真核細胞中でのタンパク質発現、その後の抗体の単離及び通常は、医薬的に許容可能な純度までの精製を含む。宿主細胞中での前記の抗体の発現のために、それぞれの修飾された軽鎖及び重鎖をコードする核酸を、標準的な方法により発現ベクター中に挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又は大腸菌細胞などの適当な原核又は真核宿主細胞中で実施し、抗体を細胞から回収する（ 溶解後の上清又は細胞）。抗体の組換え産生のための一般的な方法は、最新技術において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202；Geisse, S., et al, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol 16 (2000) 151-160；Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文において記載されている。本発明において有用な抗体の調製方法は、以下の工程を含む：ａ）前記抗体をコードする核酸分子を含むベクターを用いて宿主細胞を形質転換すること；ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること；及びｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収すること。

抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーなど）により培養培地から適切に分離する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての役割を果たす。一度単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入してもよく、それを次に、宿主細胞（例えばＨＥＫ ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞など）中にトランスフェクトし、宿主細胞中での組換えモノクローナル抗体の合成を得る。

二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアント（又は変異体）は、抗体ＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はヌクレオチド合成により調製する。そのような修飾は、しかし、非常に限られた範囲でのみ実施することができる。例えば、修飾により、上記の抗体特性（例えばＩｇＧアイソタイプや抗原結合など）は変わらないが、しかし、組換え産生の収率、タンパク質安定性が改善されうる、又は精製が促進されうる。

本願中で使用する用語「宿主細胞」は、本発明の製剤中に含まれる抗体を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を表示する。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する。

本明細書中で使用する表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」は互換的に使用し、全てのそのような命名は後代を含む。このように、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、初代被験細胞及び移入数に関係なくそこから由来する培養物を含む。また、計画的な又は偶発的な変異のために、全ての後代がＤＮＡ含量において正確に同一ではないかもしれないことが理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有するバリアント後代が含まれる。

ＮＳ０細胞中での発現は、例えば、Barnes, L.M., et al, Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.M., et al, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, P., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及び Norderhaug, L., et al, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Cytotechnology 30 (1999) 71-83においてSchlaeger, E.-J．及びChristensen, K.により、ならびにJ. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199においてSchlaeger, E.-J.より記載されている。

原核生物のために適切な制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダー用のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチド用のＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が連続的であること、及び分泌リーダーの場合では、連続的でリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成する。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の慣例に従って使用する。

抗体の精製は、細胞成分又は他の混入物（例、他の細胞核酸又はタンパク質）を標準的な技術（アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野において周知の他のものを含む）により排除するために実施する。Ausubel, F., et al, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。様々な方法が十分に確立され、タンパク質精製のために広く使用されている（例えば微生物タンパク質を用いたアフィニティクロマトグラフィー（例、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）、及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例：ベータメルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例：フェニルセファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー（例：Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）アフィニティ材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。

以下では、本発明の実施形態を列挙する：
１．以下を含む液体医薬製剤：
−ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む２０〜１５０mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（一実施形態では３０mg/ml±４．５mg/ml又は１２０mg/ml±１８mg/ml） 、
−１５〜３５mMの塩化ナトリウム（一実施形態では２５mM±５mM、一実施形態では２５mM±３．７５mMの塩化ナトリウム、特に２５mM±２．５mMの塩化ナトリウム）、
−１５〜２５mMの酢酸ヒスチジン緩衝液（一実施形態では２０mM±３mMの酢酸ヒスチジン緩衝液；一実施形態では２０mM±２mMの酢酸ヒスチジン緩衝液）、
ｐＨ５．５±０．５で（一実施形態ではｐＨ５．５±０．３で；特にｐＨ５．５±０．２で）。
それにおいて、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含み、それにおいて
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及びそれにおいて
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａならびに変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む。
２．二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、実施形態１に記載の医薬製剤であって、それにおいて
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号７のアミノ酸配列を、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号１５のアミノ酸配列を、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
３．二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、実施形態２に記載の医薬製剤であって、それにおいて
それにおいて
ｉｖ）定常重鎖領域において、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異が１つのＣＨ３ドメイン中に含まれ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異が他のＣＨ３ドメイン中に含まれる（ＥＵインデックスのＫａｂａｔに従った番号付け）。
４．二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が二価であり、配列番号１７の、配列番号１８の、配列番号１９の、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の医薬製剤。
５．二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体がファリシマブである、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の医薬製剤。
６．製剤が以下を含む、実施形態１に記載の医薬製剤：
−１２０mg/ml±１８mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（特に１２０mg/ml±１２mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体）。
７．硝子体内投与のための請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
８．製剤が可視粒子を本質的に含まない、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の医薬製剤。
９．製剤がさらに以下を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の医薬製剤：
−１〜２０mMの少なくとも１つの安定剤（一実施形態では、糖、ポリオール、及びアミノ酸より選択する）。
１０．製剤がさらに以下を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の医薬製剤：
−７．０mM±２．０mMメチオニン（一実施形態では７．０mM±１．０mMメチオニン；一実施形態では７．０mM±０．７mMメチオニン）。
１１．製剤がさらに以下を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の医薬製剤。
−０．０１〜０．０７%の界面活性剤（一実施形態では、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はポロキサマーより選択する）。
１２．製剤がさらに以下を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の医薬製剤：
−０．０４%（ｗ／ｖ）±０．０２（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（一実施形態では０．０３%（ｗ／ｖ）〜０．０７%（ｗ／ｖ））；一実施形態では、０．０４%（ｗ／ｖ）±０．０１（ｗ／ｖ）；一実施形態では、約０．０４%（ｗ／ｖ））
１３．製剤がさらに以下を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の医薬製剤：
− ５０〜２５０mMの等張化剤（一実施形態では、等張化剤をスクロース、トレハロース、及びソルビトールより選択する）。
１４．製剤がさらに以下を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の医薬製剤：
−１６０mM±２４mMスクロース（一実施形態では１６０mM±１６mM、一実施形態では約１６０mM）。
１５．製剤が２０mPas又はそれ以下（一実施形態では１７mPas又はそれ以下；一実施形態では１６mPas又はそれ以下、一実施形態では約１５mPas又はそれ以下；一実施形態では１５mPas又はそれ以下））の粘度を有する、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の医薬製剤。
１６．製剤が３０ＦＴＵ又はそれ以下（一実施形態では２７ＦＴＵ又はそれ以下；一実施形態では２６ＦＴＵ又はそれ以下；一実施形態では約２５ＦＴＵ又はそれ以下；一実施形態では２５ＦＴＵ又はそれ以下）の濁度を有する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の医薬製剤。
１７．製剤が２０〜５０の間のイオン強度（一実施形態では３０〜５０の間のイオン強度（一実施形態では３０〜４５の間のイオン強度；一実施形態では３０±１０のイオン強度）である、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の医薬製剤。
１８．製剤が塩化カルシウムを本質的に含まない（又は塩化カルシウムを含まない）、硝子体内投与のための実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の医薬製剤。
１９．製剤がアルギニンを本質的に含まない（又はアルギニンを含まない）、硝子体内投与のための実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２０．製剤がアルギニン及び塩化カルシウムを本質的に含まない（又はアルギニン及び塩化カルシウムを含まない）、硝子体内投与のための実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２１．製剤が以下の成分を含む、又は（少なくとも）それからなる、実施形態１〜５及び７〜２０のいずれか１つに記載の医薬製剤：
−２０〜１５０mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（一実施形態では３０mg/ml±４．５mg/ml又は１２０mg/ml±１８mg/ml、特に１２０mg/ml±１２mg/ml）；
−１５〜３５mMの塩化ナトリウム（一実施形態では２５mM±５mM；一実施形態では２５mM±３．７５mMの塩化ナトリウム；特に２５mM±２．５mMの塩化ナトリウム）；
−１５〜２５mMの酢酸ヒスチジン緩衝液（一実施形態では２０mM±３mMの酢酸ヒスチジン緩衝液；一実施形態では２０mM±２mMの酢酸ヒスチジン緩衝液）；
−７．０mM±２．０mMメチオニン（一実施形態では７．０mM±１．０mMメチオニン；一実施形態では７．０mM±０．７mMメチオニン）
−０．０３%（ｗ／ｖ）〜０．０７%（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（一実施形態では０．０４%（ｗ／ｖ）±０．０２（ｗ／ｖ）；一実施形態では０．０４%（ｗ／ｖ）±０．０１（ｗ／ｖ）；一実施形態では約０．０４%（ｗ／ｖ））；
−１６０mM±２４mMスクロース（一実施形態では１６０mM±１６mM；一実施形態では約１６０mM）；
−水（（眼科）注射用）；
ｐＨ５．５±０．５で（一実施形態ではｐＨ５．５±０．３で；特にｐＨ５．５±０．２で）。
２２．製剤が安定な製剤である、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２３．医薬製剤中の二重特異性抗体の高分子量種（ＨＭＷ）含量が、２５℃で８週間後又は２５℃で５２週間後に１０%を下回る（一実施形態では５%を下回る）、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２４．医薬製剤中の二重特異性抗体の主ピークが５０%を上回り、医薬製剤中の二重特異性抗体の高分子量種（ＨＭＷ）含量が２〜８℃で２年後（又は２〜８℃で３年後）に１０%を下回る（医薬製剤中の二重特異性抗体の主ピークが５５%を上回り、医薬製剤中の二重特異性抗体の高分子量種（ＨＭＷ）含量が２〜８℃で２年後（又は２〜８℃で３年後）に７%を下回る）、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２５．製剤のオスモル濃度が３００±１００mOsm/kg（一実施形態では３００±５０mOsm/kg）である、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２６．眼血管疾患の処置における使用のための、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の医薬製剤。
２７．眼血管疾患が、糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性からなる群より 、特に糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）からなる群より選択される、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
２８．眼血管疾患が糖尿病網膜症である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
２９．眼血管疾患が糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３０．眼血管疾患が網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３１．網膜静脈閉塞症が網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３２．眼血管疾患が黄斑変性である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３３．黄斑変性が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３４．黄斑変性が滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）（血管新生加齢黄斑変性（ｎＡＭＤ）とも呼ぶ）である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３５．眼血管疾患が脈絡膜血管新生である、実施形態２６に従った使用のための医薬製剤。
３６．実施形態１〜２５のいずれか１つの医薬製剤の調製方法であって、
方法は以下の工程を含む：
−ａ）限外濾過及びダイアフィルトレーションによるダイアフィルトレーション緩衝液に対する、又はｂ）透析緩衝液を使用した透析による二重特異性抗体バルク溶液の緩衝液交換（緩衝液はヒスチジン−酢酸緩衝液もしくはヒスチジン−酢酸緩衝液及び塩化ナトリウム、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム及びメチオニン、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム、メチオニン、及びスクロースを含む）
−限外濾過による緩衝液交換バルク溶液の濃縮
−それぞれの賦形剤の原液の添加による又は適当な調整緩衝液による医薬製剤の最終組成の調整及び液体医薬製剤の均質化は、混合により均質化される。
３７．実施形態１〜２５のいずれか１つの医薬製剤を含むバイアル。
３８．実施形態１〜２５のいずれか１つの医薬製剤を含む充填済みシリンジ。
３９．実施形態１〜２５のいずれか１つの液体医薬製剤の凍結乾燥形態。

実施例
本発明に従った硝子体内（ＩＶＴ）投与用の液体医薬品製剤を、以下の通りに開発した。

実施例１：材料及び方法
ＷＯ２０１４／００９４６５に記載するように調製及び精製した二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）は、２０mMヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．５）中で、最初に約１３０〜１４０mg/mLの濃度でさらなる実験のために提供した。

製剤の調製の間に使用する材料（供給元を含む）及びそれらの一次包装の概要を表１及び表２に与える。

容器閉鎖システム
ゴム製ストッパー（Ｄ７７７−１、１３mm）及びフリップオフキャップを伴うアルミニウムオーバーシールにより閉鎖された無色の２mL又は６mLガラスバイアル（１型ガラス）。

Gerresheimer Buende TELCチップキャップ及びWest 4023/50プランジャーストッパーにより閉鎖されたルアーコーンを伴う無色の１．０mL予め充填可能なシリンジ（１型ガラス）。

Vetter OVS Tipキャップ及びWest 4023/50プランジャーストッパーにより閉鎖されたルアーコーンを伴う無色の０．５mL予め充填可能なシリンジ（１型ガラス）。Vetter OVS Tipキャップは、West 4023/50エラストマーからなる。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用し、製剤中の可溶性高分子量種（凝集体）及び低分子量加水分解産物（ＬＭＷ）を検出した。この方法は、TSK-Gel G3000SWXL、７．８×３００mm、５μm（Tosoh Bioscience、カタログ番号０８５４１）又はBioSuite 250、７．８×３００mm、又は５μm（Waters、カタログ番号１８６００２１６５）を用いて実施した。インタクトな単量体、凝集体、及びフラグメントを、移動相として０．２Mリン酸カリウム、０．２５M ＫＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した均一濃度の溶出プロファイルにより分離し、２８０nmの波長で検出した。

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ））
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を、製剤中のテスト抗体の正味荷電を変える化学分解産物を検出するために実施した。この方法は、YMC BioPro SP-F、１００×４．６mm、５μmカラム（ＹＭＣ、カタログ番号ＳＦ００Ｓ０５−１０４６ＷＰ）を用いて実施した。２０mM ＢＥＳ（Ｎ、Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．８）を溶離液Ａとして、及び２０mM ＢＥＳ、４８８mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）を溶離液Ｂとしてそれぞれ流速 ０．８ml/分で使用した。サンプルを、カラムに注入する前に、溶離液Ａで３mg/mLに希釈した。

濁度（ＦＴＵ（＝ホルマジン濁度単位））
製剤サンプルの濁度を、Ｐｈ． Ｅｕｒ． ２．２．１（液体の透明度と乳光度）に従ってHach 2100 AN濁度計で測定した。約２mLのサンプル溶液のサンプル容量を内径１１mmのガラスキュベット中に移した。ガラス製キュベットを濁度計中に置き、濁度を参照懸濁液１ＦＴＵ、３ＦＴＵ、１０ＦＴＵ、２０ＦＴＵ、及び１００ＦＴＵの検量線に対して測定する。

粘度（ｍＰａ）
製剤サンプルの粘度を、剪断速度１０００／秒及び温度２０℃で、２５mm−０．５°コーンを伴うAnton Paar Physica MCR 301回転レオメーターで測定した。

可視粒子
バイアルサンプルは、２×拡大鏡レンズを用いて、Sidenader検査機V90-Tで視覚的に検査した。照明光源Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を設定５に調整した。バイアルサンプルを、回転運動の間に粒子の存在について検査した。

タンパク質濃度（mg/ml）
製剤サンプルのタンパク質濃度を、Perkin ElmerからのUV/Vis Photometer Lambda 35での紫外線（ＵＶ）吸収により測定した。製剤サンプルを２０mM Ｌ−ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）でタンパク質濃度約０．５mg/mLに希釈し、厚さ１cmを伴う測定キュベットに充填した。測定キュベットのＵＶ吸収を、２８０及び３２０nmの波長で測定した。

タンパク質濃度は、２８０（Ａ２８０）及び３２０nm（Ａ３２０）での測定ＵＶ光吸収、１．７０mL/(mg×cm)の吸光係数（Ｅ）、１cmの厚さ（ｄ）、及び以下の式に従った実際の希釈に対応する希釈係数（ＤＦ）から算出した：

オスモル濃度
製剤サンプルのオスモル濃度を、凝固点降下の原理に従って、GonotecからのOsmomat 030 3P浸透圧計で測定した。

ｐＨ
製剤サンプルのｐＨを、ガラス電極を伴う電位差測定により決定した。

実施例２：ｐＨ／緩衝液スクリーンＩ
設定
ｐＨ／緩衝液スクリーンの範囲は、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の市販製剤のための最適なｐＨ及び緩衝液を選択し、可溶性凝集体及び荷電バリアントの低形成をもたらす低い粘度、低下した濁度、及び良好な安定性挙動を伴う製剤を選択するためであった。

ｐＨ／緩衝液スクリーンの第１のパートは、３つの緩衝液系、Ｌ−ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ（Ｈｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ）、Ｌ−ヒスチジン−酢酸（Ｈｉｓ／酢酸）、及び酢酸ナトリウム（Ｎａ／酢酸）、５．３〜６．５の間のｐＨ範囲、７〜３００mMの間の緩衝液強度、及び５〜８６の間のイオン強度範囲を含んだ。活性製剤の設定を表３に示す。

材料及び方法
製剤の調製の間に使用する材料及びその一次包装の概要を表１及び表２に示す。

原薬は、表３中に列挙する緩衝液系に対して１０kDの分子量カットオフを伴うSlide-A-Lyzer G2（Thermo Scientific）を使用した透析により緩衝液交換した。これにより、４２mLの原薬を透析デバイス中に充填し、５Lの透析緩衝液に対して３回緩衝液交換した。

場合により、タンパク質濃度が透析後に１２０mg/mLを下回った場合、原薬を、Amicon Ultra 15、Ultracel 10K（Millipore）デバイス（２０℃、４０００rpm）を使用した遠心分離により濃縮した。

その後、透析し、場合により濃縮した原薬をそれぞれの透析緩衝液で目標タンパク質濃度１２０mg/mLに希釈し、最終的な薬物産物溶液をもたらした。

各々の薬物産物を０．２２μm Sterivex GV（Millipore）フィルターを通じて濾過し、充填容量２．７mLを伴う清潔な無菌６mLバイアル中に充填する。バイアルに栓をして圧着した。

分析方法
分析テスト方法の濁度及び粘度を例１に記載する。

結果
図１は、ｐＨ／緩衝液スクリーンＩからの製剤の濁度及び粘度の結果を比較している。

一般的に、高いイオン強度（例、４、１４、１０、３、８、及び１８）を伴う製剤は、高い濁度（３０ＦＴＵ超）及び低い粘度（約１０mPas）を示す。代わりに、低いイオン強度を伴う製剤は、高い粘度（約２５〜４０mPas）及び低い濁度（１０ＦＴＵ未満）を有する。驚くべきことに、緩衝液系ヒスチジン−酢酸塩（１３、６、４、１４）を伴う製剤は、約１０mPasの低い粘度及び２５ＦＴＵ未満の濁度で同定することができた。

結論
ｐＨ／緩衝液スクリーンＩからの製剤を、粘度及び濁度について測定した。驚くべきことに、４５．５又はそれより高いイオン強度を伴うヒスチジン−酢酸緩衝系の製剤は、低い粘度及び低下した濁度値を示した。

実施例３：ｐＨ／緩衝液スクリーンＩＩ
設定
ｐＨ／緩衝液スクリーニングの範囲は、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体の製剤のための最適なｐＨ及び緩衝液を選択し、可溶性凝集体及び荷電バリアントの低い形成をもたらす低い粘度、低下した濁度、及び良好な安定性挙動を伴う製剤を選択することであった。

ｐＨ／緩衝液スクリーンの第２のパートは、ｐＨ／緩衝液スクリーンＩの結果に基づいて設計し、緩衝液系Ｌ−ヒスチジン−酢酸（Ｈｉｓ／酢酸）、５．５〜６．０の間のｐＨ範囲を含み、１４〜５９mMの間の緩衝液強度範囲を伴う。製剤のイオン強度は、緩衝液強度を増加させる、又は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）もしくは塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の添加により修飾し、１０〜５０の間のイオン強度範囲をもたらす。活性製剤の設定を表４に示す。

材料及び方法
製剤の調製の間に使用する材料及びその一次包装の概要を表１及び表２に示す。

原薬は、表４中に列挙する緩衝系に対して３０kDの分子量カットオフ半透膜を伴うLabscale TTF（Millipore）を使用した限外濾過−ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。それにより、１２０mLの原薬を、Labscaleシステム中に充填し、１０５０mLのダイアフィルトレーション緩衝液に対して緩衝液交換した。

緩衝液交換後、原薬をLabscaleシステム中で約１５０mg/mLのタンパク質濃度に濃縮した。

その後、濃縮した原薬をそれぞれの緩衝液及び塩溶液の原液で目標タンパク質濃度１２０mg/mLに希釈し、表４に従った最終的な薬物産物溶液をもたらした。

各々の薬物産物を０．２２μm Sterivex GV（Millipore）フィルターを通して濾過し、充填容量２．７mLを伴う清潔な無菌６mLバイアル中に充填する。バイアルに栓をして圧着した。

分析方法
分析テスト方法、濁度、粘度、及びＳＥ−ＨＰＬＣを実施例Ｉに記載する。

安定プログラム
製剤は、２〜８℃及び２５で８週間にわたり安定性を保った。サンプルを、安定性試験の開始時及び８週間の保管後に採取して分析した。

結果
図２は、ｐＨ／緩衝液スクリーンの第２のパートの濁度及び粘度の結果を比較している。一般的に、濁度は、イオン強度の増加に伴い、ｐＨ５．５と比較してｐＨ６．０に増加している。また、塩化ナトリウムの存在はまた、より高い濁度に導く。ｐＨ５．５はまた、ｐＨ６と比較して粘度を低下させる。さらに、少なくとも３０のイオン強度は、粘度を約１５mPasのレベルに低下させるのに役立つ。粘度に対する異なる塩の効果を比較した場合、塩化カルシウム又はより高い緩衝強度が、塩化ナトリウムよりも、粘度を低下させるためにより効率的である。

濁度及び粘度を低下させるという両方の目標を考慮すると、少なくとも３０のイオン強度及びｐＨ５．５を伴う製剤は、約２０ＦＴＵの低下した濁度レベル及び粘度約１５mPasを示す。

図３は、開始時（＝０）のｐＨ／緩衝液スクリーンＩＩ製剤の凝集レベル（ＨＭＷＳ）を、５℃及び２５℃で８週間後のレベルと比較している。一般的に、ＨＭＷレベルはイオン強度の増加に伴い増加する。様々な塩の効果を比較すると、高い緩衝強度又は塩化ナトリウムの存在は、塩化ナトリウムの存在よりも低い凝集体の増加に導く。より低いｐＨ５．５は、凝集体形成の低下に小さな影響を及ぼす。

結論
ｐＨ５．５及びイオン強度３０を伴う製剤は、低下した濁度、低い粘度、及び低下した凝集体形成を伴う最適さを提供する。イオン強度は、より高い緩衝液強度、又は塩（塩化ナトリウム及び塩化カルシウム）の添加で調整することができる。一般的に、より高い緩衝強度又は塩化カルシウムの存在は、好ましい濁度及び粘度の挙動を示す。

実施例４：界面活性剤スクリーン
設定
界面活性剤スクリーニングの範囲は、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）の製剤用の最適な界面活性剤の種類及び界面活性剤濃度を選択することである。

ｐＨ／緩衝液スクリーンＩ及びＩＩの結果に基づき、目標オスモル濃度３００±５０mOsm/kgの等張製剤を可能にする、１２０mg/mL ＶＥＧＦ／ＡＮＧ−２抗体、２０mM Ｌ−ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２５mM塩化ナトリウム、及び１８０mMスクロースの製剤マトリックス。

界面活性剤スクリーンでは、ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体に対して、０．０１〜０．０７%の異なる界面活性剤濃度で、界面活性剤ポリソルベート２０及びポロキサマー１８８の安定化効果をテストした。また、界面活性剤を含まない製剤をテストした。

表５には、界面活性剤スクリーンのテスト製剤をまとめている。

材料及び方法
製剤の調製の間に使用する材料及びその一次包装の概要を表１及び表２中に示す。

原薬を、２０mMヒスチジン−酢酸ｐＨ５．３ダイアフィルトレーション緩衝液に対する３０kD分子量カットオフ半透膜を伴うLabscale TTF（Millipore）を使用した限外濾過−ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。これにより、２５０mLの原薬をLabscaleシステム中に充填し、１７００mLのダイアフィルトレーション緩衝液に対して緩衝液交換した。

緩衝液交換後、原薬をLabscaleシステム中で約１７０mg/mLのタンパク質濃度（ｐＨ約５．５）に濃縮した。

その後、濃縮した原薬をそれぞれの緩衝液及び塩溶液の原液で目標タンパク質濃度１２０mg/mLに希釈し、表５に従った最終的な薬物産物溶液をもたらした。

各々の薬物産物溶液を０．２２μm Sterivex GV（Millipore）フィルターを通して濾過し、充填容量２．７mLを伴う清潔な無菌６mLバイアル中に充填する。バイアルに栓をして圧着した。

分析方法
分析テスト方法、タンパク質濃度、ｐＨ、オスモル濃度、濁度、粘度、可視粒子、及びＳＥ−ＨＰＬＣを実施例Ｉに記載する。

安定性プログラム
界面活性剤スクリーンの間に、２〜８℃（２００rpm）での１週間の水平振動、２５℃（２００rpm）での１週間の水平振動、及び５サイクルの凍結／融解（−４０℃／５℃）の機械的ストレステスト条件 を適用した。

結果
表６には、界面活性剤スクリーンサンプルでの初期結果をまとめている。全ての製剤がタンパク質濃度約１２０mg/mL（ｐＨ５．５±０．１）を有した。測定されたオスモル濃度は３３５〜３５０mOsm/kgであり、それにより目標の３１１mOsm/kgよりわずかに高くなった。２０mMヒスチジン酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）＋２５mM塩化ナトリウム及び１８０mMスクロースを伴う１２０mg/mL ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２の選択された製剤マトリックスは、約１５mPasの低粘度及び２０ＦＴＵの濁度低下をもたらした。

界面活性剤スクリーン製剤を、５℃及び２５℃の振盪ストレスならびに凍結融解ストレス（５回の凍結融解サイクル）に曝露し、可視粒子及び可溶性凝集体（ＨＭＷＳ）について分析した。

表７には、初期及び物理的ストレス後の可視粒子の結果をまとめている。全ての製剤サンプルに最初は、粒子は含まれなかった。様々な物理的ストレスへの曝露後、界面活性剤を伴わない製剤ＧＲＭ００７１−０１は常に多くの粒子を示した。少なくとも０．０１%ポリソルベート２０の添加によって、３つの物理的ストレス方法への曝露の間での可視粒子の形成が防止された。

驚くべきことに、ポロキサマーの添加によって、５℃で１週間の振盪への曝露後、可視粒子の形成を防止することができなかったのに対し、それによって、２５℃での振盪及び凍結融解ストレスに対してタンパク質を保護することができた。

図４は、初期サンプル及びストレスサンプルの可溶性凝集レベル（ＨＭＷＳ）を示す。界面活性剤を伴わない製剤ＧＲＭ００７１−０１（１）は、振盪ストレスに感受性であり、５℃及び２５℃での１週間の振盪後、凝集体レベルが１０%まで増加した。０．０１%ポリソルベート２０の存在は、２５%で１週間の振盪し後に可溶性凝集体の増加を完全に防止するには不十分であった。なぜなら、凝集体レベルが３%から３．８%に増加したためである。驚くべきことに、０．０３%以上のポリソルベート２０レベルが、２５℃で１週間の振盪後の可溶性凝集体の増加を防止するために要求された。

結論
少なくとも０．０３%のポリソルベート２０の添加が、振盪及び凍結融解ストレスに対して濃度１２０mg/mLで抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体を完全に安定化するために要求される。

界面活性剤ポロキサマーによって、５℃での振盪ストレスに対して濃度１２０mg/mLの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体を保護することはできない。

２０mMヒスチジン酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２５mM塩化ナトリウム、及び１８０mMスクロースを伴う製剤マトリックスによって、１２０mg/mL抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体製剤に対して許容可能な濁度（約２０ＦＴＵ）及び粘度の結果（約１５mPas）が提供される。

実施例５：賦形剤スクリーンＩ
設定
賦形剤スクリーンの範囲は、抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）の市販製剤の最終組成を選択することである。

以前のｐＨ／緩衝液スクリーンＩ及びＩＩならびに界面活性剤スクリーンの結果に基づき、１２０mg/mL ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体、２０mMヒスチジン酢酸緩衝液系、１６０mMスクロース、及び０．０４%ポリソルベート２０からなる製剤マトリックスを選択した。製剤マトリックスにおいて、ｐＨ（５．５対５．８）、塩（２５mM塩化ナトリウム対８mM塩化カルシウム）、及びメチオニン（０対７mM）の効果をテストした。イオン強度を、緩衝液及び塩濃度からの寄与に基づいて４０に調整した。

表８には、賦形剤スクリーンＩの製剤をまとめている。

材料及び方法
製剤の調製の間に使用する材料及びその一次包装の概要を表１及び表２中に示す。

原薬は、２０mMヒスチジン−酢酸ｐＨ５．３ダイアフィルトレーション緩衝液又は２０mMヒスチジン−酢酸ｐＨ５．６に対する３０kD分子量カットオフ半透膜を伴うLabscale TTF（Millipore）を使用した限外濾過−ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。それにより、４１０mLの原薬をLabscaleシステム中に充填し、３０００mLのダイアフィルトレーション緩衝液に対して緩衝液交換した。

緩衝液交換後、原薬をLabscaleシステムにおいてタンパク質濃度約１６５mg/mL（ｐＨ約５．５又はｐＨ５．８）に濃縮した。

その後、濃縮した原薬をそれぞれの緩衝液及び塩溶液の原液で目標タンパク質濃度１２０mg/mLに希釈し、表８に従った最終的な薬物産物溶液をもたらした。

各々の薬物産物溶液を、０．２２μm Sterivex GV（Millipore）フィルターを通して濾過し、清潔な無菌６mLバイアル中に充填し、充填容量２．７mLを伴った。バイアルに栓をして圧着した。

分析方法
分析テスト方法、タンパク質濃度、ｐＨ、オスモル濃度、濁度、粘度、可視粒子、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及びＩＥ−ＨＰＬＣを実施例Ｉに記載する。

安定性プログラム
製剤を、２〜８℃で２０週間まで、及び２５℃で１３週間まで安定性を維持した。また、サンプルを、２〜８℃（２００rpm）での１週間の水平振動、２５℃（２００rpm）での１週間の水平振動、及び５サイクルの凍結／融解（−４０℃／５℃）に曝露した。

結果
表９には、賦形剤スクリーンＩの初期結果をまとめている。全ての製剤が１２５〜１３０mg/mLの間のタンパク質濃度を有した。目標ｐＨ５．５を伴う製剤ＧＲＭ００７３−０１から−０４が約５．６の測定ｐＨ値を有したのに対し、５．８の目標ｐＨを伴う製剤ＧＲＭ００７３−０５から−０８は約５．９の測定ｐＨ値を有した。２５mM塩化ナトリウムを含む製剤（ＧＲＭ００７３−０１、−０２、−０５、及び−０６）のオスモル濃度は、８mM塩化カルシウムを伴う製剤（ＧＲＭ００７３− ０３、−０４、−０７、及び−０８）との比較において、より高いオスモル濃度の結果（２７３〜２８８mOsm/kgの間）を有した。

表１０には、初期、物理的ストレス後、ならびに５℃及び２５℃での１３週間の保存後の可視粒子の結果をまとめている。製造後及び物理的ストレスへの曝露後（５°Ｃ又は２５℃で１週間の振盪、又は５回の凍結融解サイクル）、全ての製剤は粒子を含まなかった。驚くべきことに、８mM塩化カルシウムを含む全ての製剤が、５℃及び２５℃での１３週間の保存後に可視粒子を示したのに対し、２５mM塩化ナトリウムを含む全ての製剤が粒子を含まなかった。

図５は、２５mM塩化ナトリウムを含む製剤の濁度及び粘度の結果を比較している。それにより、ｐＨ５．５を伴う製剤は、より低い濁度（２１ＦＴＵ対２５ＦＴＵ）及びより低い粘度（１７mPas対２１mPas）を示した。

図６及び７は、それぞれ５℃で２０週間の保存、２５℃で１３週間の保存の間での可溶性凝集体（ＨＭＷＳ）の増加を示す。ｐＨ５．８を伴う製剤は、ｐＨ５．５での製剤との比較において、可溶性凝集体におけるわずかに低い増加を示した。驚くべきことに、メチオニンの添加によって、可溶性凝集体の形成が低下し、凝集に対するより低いｐＨの影響が補われうる。

図８及び９は、それぞれ５℃で２０週間の保存後、２５℃で１３週間の保存後にＩＥＣにより測定された荷電バリアントの変化を比較している。全ての製剤が、５℃での１３週間の保存後、主ピーク面積の約１%のわずかな下落を示した。これは、酸性バリアントにおける約０．２%の増加及び塩基性ピーク面積における約１%の増加を伴った。異なるｐＨ又はメチオニンの存在により起こる明確な差はなかった。主ピークにおける下落はずっと強いが（約１８%）、２５℃での１３週間の保存後、ｐＨ及びメチオニンに基づく明確な差はなかった。２５℃での保存の間での主ピークにおける減少は、主に酸性バリアントにおける増加により起こされる。

結論
塩化カルシウムの存在によって、塩化ナトリウムを伴う製剤との比較において、より低い粘度及び濁度レベルに導かれるが（例２及び３を参照のこと）、驚くべきことに、可視粒子の形成も起こされた。可視粒子の形成は、ＵＳＰ−ＮＦ＜７９０＞の要件に従い、硝子体内注射については許容可能ではない。従って、粘度の低下のためのイオン強度調整剤としての塩化ナトリウムの添加は、塩化カルシウムの使用よりも好まれる。

さらに、ｐＨ５．５の製剤は、ｐＨ５．８の製剤との比較において、より低い濁度及びより低い粘度を示す。しかし、ｐＨ５．８の製剤は、ｐＨ５．５の製剤よりも可溶性凝集体のわずかに低い形成を示したが、しかし、この効果は７mMメチオニンの添加により補うことができる。従って、メチオニンの添加によって、ｐＨ５．５での可溶性凝集体の形成を低下させつつ、さらに低い粘度及び濁度レベルを実現することができる。

ｐＨにおける差（ｐＨ５．５対５．８）又はメチオニンの存在は、荷電バリアントの形成に対する影響を有さない。

まとめると、８mM塩化カルシウムの代わりの２５mM塩化ナトリウム、ならびに７mMメチオニン及び１６０mMスクロースを伴う２０mMヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、及び０．０４%ポリソルベート２０を伴う製剤によって、低い濁度及び粘度ならびに改善された安定性挙動を伴う粒子不含製剤が可能になる。

実施例６：賦形剤スクリーンＩＩ
設定
賦形剤スクリーンの第２のパートでは、安定性の挙動を、充填済みシリンジ中で、タンパク質濃度３０mg/mLでさらに特徴付ける。

賦形剤スクリーンＩによって、１２０mg/mL抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）、２０mMヒスチジン−酢酸（ｐＨ５．５）、２５mM塩化ナトリウム、１６０mMスクロース、７mMメチオニン、及び０．０４%ポリソルベート２０からなる最適化された製剤がもたらされ、それをガラスバイアル中に充填した（製剤ＧＲＭ００７３−０２に対応）。

この製剤をまた、充填済みシリンジ（ＧＲＭ００７６−０２）中に充填した。また、この製剤マトリックスの安定性挙動をタンパク質濃度３０mg/mLでテストし、充填済みシリンジ（ＧＲＭ００７７−０２）中又はガラスバイアル（ＧＲＭ００７７−０６）中のいずれかに充填した。

比較のために、ガラスバイアル中に充填した参照製剤の安定性を３０mg/mL（ＧＲＭ００７７−０９）及び１２０mg/ml（ＧＲＭ００７６−０５）でテストした。

表１１には、賦形剤スクリーンＩＩの製剤をまとめている。

材料及び方法
製剤の調製の間に使用する材料及びその一次包装の概要を表１及び表２中に示す。

原薬を、３０kD分子量カットオフ半透膜を伴うLabscale TTF（Millipore）を使用した限外濾過−ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。

２０mMヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中での抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）の調製については、約３４０mLの原薬をLabscaleシステム中に充填し、２４００mLの２０mMヒスチジン−酢酸（ｐＨ５．２）ダイアフィルトレーション緩衝液に対して緩衝液交換した。

２０mMのヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）中の抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）を、約２００mLの原薬を使用して調製した。これをLabscaleシステム中に充填し、１４００mLの２０mMヒスチジン−ＨＣｌ（ｐＨ５．８５）ダイアフィルトレーション緩衝液に対して緩衝液交換した。

緩衝液交換後、それぞれの原薬をLabscaleシステム中でタンパク質濃度約１６５mg/mL（ｐＨ約５．５の又はｐＨ６．０のいずれか）に濃縮した。

その後、濃縮した原薬を、それぞれの緩衝液及び塩溶液の原液で目標タンパク質濃度３０又は１２０mg/mLに希釈し、表８に従った最終的な薬物産物溶液をもたらした。

各々の薬物産物溶液を０．２２μm Sterivex GV（Millipore）フィルターを通して濾過し、充填容量２．７mLの清潔な無菌６mLバイアル、又は充填容量１mLの清潔な無菌１mLの充填済みシリンジ中に充填した。バイアルに栓をして圧着したのに対し、シリンジはプランジャーストッパーで閉じた。

分析方法
分析試験方法、タンパク質濃度、ｐＨ、オスモル濃度、濁度、粘度、可視粒子、及びＳＥ−ＨＰＬＣを実施例Ｉに記載する。

安定性プログラム
製剤は、２〜８℃及び２４℃で１３週間まで安定性を保った。また、サンプルを、２〜８℃（２００rpm）での１週間の水平振動、２５℃（２００rpm）での１週間の水平振動、及び５サイクルの凍結／融解（−４０℃／５℃）に曝露させた。

結果
表１２には、賦形剤スクリーンＩＩの初期結果をまとめている。ＧＲＭ００７６−０２（ＰＦＳにおける最適化製剤）及びＧＲＭ００７６−０５（参照製剤）の両方が、目標タンパク質濃度１２０mg/mLと、それぞれの測定値１１９又は１２３mg/mLに一致した。ＧＲＭ００７７−０２（ＰＦＳにおける最適化製剤）、ＧＲＭ００７７−０６（バイアル中の最適化製剤）、及びＧＲＭ００７６−０５（参照製剤）を目標タンパク質濃度３０mg/mLで調製した。実際のタンパク質（ｒｐｔｏｅｉｎ）濃度は３０〜３１mg/mLの範囲にあった。

全ての製剤のｐＨは目標ｐＨに近く、ちょうど０．１ ｐＨ単位の最大偏差を伴った。

１２０mg/mLでの製剤のオスモル濃度はわずかに高く、３１０〜３２０mOsm/kgの間であったのに対し、３０mg/mL製剤は２７８〜３９４mOsm/kgの間であった。

表１３には、初期、物理的ストレス後、ならびに５℃及び２５℃での１３週間の保存後の可視粒子の結果をまとめている。製造後及び物理的ストレスへの曝露（５°Ｃ又は２５℃で１週間の振盪、又は５回の凍結融解サイクル）後、全ての製剤は粒子を含まなかった。驚くべきことに、参照製剤は、５と２５℃での１３週間の保存後に多くの粒子を示した。全ての他の製剤は粒子を含まなかった。

図１０は、タンパク質濃度１２０mg/mLでの最適化製剤と参照製剤の濁度及び粘度の結果を比較している。最適化製剤は、約２３ＦＴＵの明らかに低下した濁度を示したのに対し、臨床サービス製剤は４５ＦＴＵを上回る濁度を示した。興味深いことに、両方の製剤の粘度は両方とも１４mPasを下回った。

図１１は、３０mg/ml製剤の濁度及び粘度を示す。ここで、濁度における差は、製剤ＧＲＭ００７２−０２とＧＲＭ００７７−０９の間では小さいが、しかし、それにもかかわらず、最適化製剤は低い濁度を示した。両方の３０mg/mL製剤についての粘度が、１２０mg/mL製剤と比較して非常に低く、２mPasを下回る。

図１２及び図１３は、５℃と２５℃での１３週間の保存後のＨＭＷ種の増加を示す。最適化製剤は、１２０mg/mL及び３０mg/mLの両方で、参照製剤よりもＨＭＷ種のより少ない増加を示した。安定化効果は２５℃で１３週間の保存後に最も顕著であり、そこではＨＭＷが最適化製剤ＧＲＭ００７６−０２において２．４%だけ増加したのに対し、製剤ＧＲＭ００７６−０５は２．９%までの増加を示した。同じ傾向が３０mg/mL製剤についても観察され、最適化製剤での１．０%までの低い増加、及び参照形態での１．３%までの増加を伴う。

図１４は、５℃及び２５℃での１３週間の保存後、ＩＥＣにより測定した荷電バリアントの変化を比較している。全ての製剤が、５℃での１３週間の保存後、主ピーク面積の約１%のわずかな下落を示した。これは、塩基性ピーク面積における対応する増加を伴うのに対し、酸性ピーク面積は一定のままである。主ピークにおける下落はずっと強いが（約１０%）、２５℃での１３週間の保存後、製剤間に明らかな差はない。２５℃での保存の間での主ピークにおける減少は、主に酸性バリアントにおける増加（約８%）及び塩基性バリアントにおけるわずかな増加（１〜２%）により起こされる。２５℃で１３週間後の塩基性バリアントの増加は、最適化製剤（約２%の増加）との比較において、参照製剤（ｐＨ６．０で製剤化）でわずかに低い（約１%）。より低いタンパク質濃度及び一次容器は、荷電バリアントに対する影響を有さない。

結論
賦形剤スクリーンＩＩの結果によって、最適化製剤が参照製剤よりも優れていることが確認された。１２０mg/mLでの最適化製剤の濁度は、４５ＦＴＵ超から２５ＦＴＵ未満に低下しつつ、粘度を１５mPas未満に維持した。低粘度は、商業規模の産生プロセス（限外濾過による濃縮）を可能にし、簡単で便利な硝子体内注射（２０N未満、特に１５N未満の射出力）を確実にするために不可欠である。１５mPas未満の粘度を伴う最適化製剤は、５Ｎ未満の射出力で５秒の注射時間を伴い３０Ｇの注射針を通して注射することができることが実証された。

さらに、３０mg/mLの最適化製剤は粒子を含まないままであったのに対し、参照製剤は、５℃及び２５℃での１３週間の保存後、可視粒子を示した。また、ＨＭＷ種の増加は最適化製剤においてより低かった。

最適化製剤の改善された安定性挙動が、３０及び１２０mg/mLのタンパク質濃度で、バイアル及び充填済みシリンジ中で観察された。

まとめると、ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２５mM塩化ナトリウム、７mMメチオニン、１６０mMスクロース、及び０．０４%ポリソルベート２０を含む３０〜１２０mg/mLの間のタンパク質濃度を伴う最適化製剤によって、バイアル及び充填済みシリンジ中での低い濁度及び粘度、ならびに改善した安定性を伴う粒子不含製剤が可能になる。

実施例７：眼適応における使用のためのメチオニンの安全性（硝子体内適用のための製剤）。
Ｌ−メチオニンを用いた非臨床毒性試験の概観。
カニクイザルにおける毒性試験を行い、メチオニン（１０mM）が溶媒及び製剤化されたテスト品ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）の成分であった。この試験では、合計１２匹の動物（オス６匹／メス６匹）を、１４日間隔で５０μL／眼で２回硝子体内投与した。左眼を溶媒（１０mMメチオニンを含む）で処置し、右眼を１０mMメチオニンも含む製剤化されたテスト品ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２−００１６（ファリシマブ）で処置した。この試験では、メチオニンの眼への影響はカニクイザルにおいて見られなかった。

３つの試験（カニクイザル及びニュージーランド白ウサギ）を実施し、そこではメチオニン（５〜２５mM）が溶媒の成分であり、１４日間隔で６回まで硝子体内投与（５０μL／眼）した。これらの試験では、メチオニンの眼への影響は、メチオニン含有溶媒で処置した動物のいずれにおいても観察されなかった。

非臨床毒性試験の概観を表１４に示す。

実施例８：安定性
２０mM Ｌ−ヒスチジン−酢酸（ｐＨ５．５）、１６０mMスクロース、２５mM塩化ナトリウム、７mM Ｌ−メチオニン、０．０４%ポリソルベート２０中の薬物産物バッチ（１２０mg/mL ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体（ファリシマブ）を、０．２２μm無菌フィルターを通して濾過し、０．２４mLの充填容量を伴う清潔な無菌２mLガラスバイアル中に充填した。

製造後、ｐＨは５．６であり、オスモル濃度は３２０mOsm/kg、タンパク質濃度は１２０mg/mLであった。

表１５に、５℃での保存の間での薬物産物バッチＧＬＩ０２１９−０１の安定性データを提示する。表１６に、２５℃での保存の間での安定性を示す。

Claims (30)

1. 以下を含む液体医薬製剤：
   −ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む２０〜１５０mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体、
   −１５〜３５mMのナトリウム、
   −１５〜２５mMの酢酸ヒスチジン緩衝液、
   ｐＨ５．５±０．５；
   それにおいて、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含み、それにおいて
   ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
   ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域を、ならびに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
   ｉｉｉ）二重特異性抗体は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａならびに変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域を含む。
2. 二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体は二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む請求項１記載の医薬製剤であって、それにおいて：
   ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号７のアミノ酸配列を、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び
   ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号１５のアミノ酸配列を、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
3. 二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が二価であり、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、請求項２記載の医薬製剤であって、それにおいて
   ｉｖ）定常重鎖領域において、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異が１つのＣＨ３ドメイン中に含まれ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異が他のＣＨ３ドメイン中に含まれる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）。
4. 二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体が二価であり、配列番号１７の、配列番号１８の、配列番号１９の、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
5. 二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体がファリシマブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
6. 製剤が以下を含む、請求項１に記載の医薬製剤
   −１２０mg/ml±１８mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２。
7. 硝子体内投与のための請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
8. 製剤が本質的に可視粒子を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
9. 製剤がさらに以下を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬製剤
   −１〜２０mMの少なくとも１つの安定剤。
10. 製剤がさらに以下を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬製剤
    −７．０mM±２．０mMメチオニン。
11. 製剤がさらに以下を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬製剤
    −０．０１〜０．０７%（ｗ／ｖ）の界面活性剤。
12. 製剤がさらに以下を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬製剤
    −０．０３%〜０．０７%（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０。
13. 製剤がさらに以下を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤
    −５０〜２５０mMの等張化剤。
14. 製剤がさらに以下を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬製剤
    −１６０mM±２４mMスクロース。
15. 製剤が２０mPas又はそれ以下の粘度を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
16. 製剤が３０ＦＴＵ又はそれ以下の濁度を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
17. 製剤が２０〜５０の間のイオン強度を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
18. 製剤が塩化カルシウムを本質的に含まない、硝子体内投与のための請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
19. 製剤がアルギニンを本質的に含まない、硝子体内投与のための請求項１から１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
20. 製剤がアルギニン及び塩化カルシウムを本質的に含まない、硝子体内投与のための請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
21. 製剤が以下の成分を含む又はそれからなる、請求項１〜５及び７〜２０のいずれか一項に記載の医薬製剤
    −２０〜１５０mg/mlの二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２抗体；
    −１５〜３５mMの塩化ナトリウム；
    −１５〜２５mMの酢酸ヒスチジン緩衝液；
    −７．０mM±２．０mM；
    −０．０３%（ｗ／ｖ）〜０．０７（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０；
    −１６０mM±２４mMスクロース；
    −水；
    ｐＨ５．５±０．５。
22. 製剤が安定な製剤である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
23. 医薬製剤中の二重特異性抗体の高分子量種（ＨＭＷ）含量が、２５℃で８週間後又は２５℃で５２週間後に１０%を下回る、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
24. 製剤のオスモル濃度が３００±１００mOsm/kgである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
25. 眼血管疾患の処置における使用のための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
26. 眼血管疾患が、糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性からなる群より、特に糖尿病網膜症（ＤＲ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、滲出型加齢黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）からなる群より選択される、請求項２６に記載の使用のための医薬製剤。
27. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬製剤の調製方法であって、
    方法は以下の工程を含む：
    −ａ）限外濾過及びダイアフィルトレーションによるダイアフィルトレーション緩衝液に対する、又はｂ）透析緩衝液を使用した透析による二重特異性抗体バルク溶液の緩衝液交換、緩衝液はヒスチジン−酢酸緩衝液もしくはヒスチジン−酢酸緩衝液及び塩化ナトリウム、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム及びメチオニン、又はヒスチジン−酢酸緩衝液、塩化ナトリウム、メチオニン、及びスクロースを含む、
    −限外濾過による緩衝液交換バルク溶液の濃縮
    −それぞれの賦形剤の原液の添加による又は適当な調整緩衝液による医薬製剤の最終組成の調整及び液体医薬製剤の均質化は、混合により均質化される。
28. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬製剤を含むバイアル。
29. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬製剤を含む充填済みシリンジ。
30. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の液体医薬製剤の凍結乾燥形態。