KR101371773B1 - 암 치료를 위한, 안지오포이에틴-2 길항자와 ｖｅｇｆ-ａ,ｋｄｒ 및/또는 ｆｌｔ1 길항자의 조합물 - Google Patents

암 치료를 위한, 안지오포이에틴-2 길항자와 ｖｅｇｆ-ａ,ｋｄｒ 및/또는 ｆｌｔ1 길항자의 조합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-혈관신생 활성을 보유하며, 이에 따라 동물 또는 인간 신체 내 혈관신생과 관련된 질병 상태의 치료 방법에 유용한 작용제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물, 및 이와 같은 길항자들의 용도에 관한 것이다.
혈관신생, 안지오포이에틴, VEGF-A, KDR, Flt1

Description

암 치료를 위한, 안지오포이에틴-2 길항자와 ＶＥＧＦ-Ａ, ＫＤＲ 및/또는 ＦＬＴ1 길항자의 조합물{COMBINATION OF ANGIOPOIETIN-2 ANTAGONIST AND OF VEGF-A, KDR AND/OR FLT1 ANTAGONIST FOR TREATING CANCER}
본 발명은 항-혈관신생 활성을 가지고, 이에 따라 동물 또는 인간 신체 내 혈관신생과 관련된 질병 상태를 치료하는 방법에 유용한 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물, 및 이와 같은 길항자들의 용도에 관한 것이다. 그러한 조합물은 또한 안지오포이에틴-2와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 활성과 관련된 질병의 치료에 유용하다.
기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정인 혈관신생(angiogenesis)은, 실질적으로 모든 기관의 형성 및 생리학적 기능에 필요한 복잡한 생물학적 공정이다. 이는 배발생, 정상 생리학적 성장, 수복 및 병리학적 공정, 예컨대 종양 확장의 필수 요소이다. 정상적으로, 혈관신생은 혈관 발아(vessel sprouting), 분지화(branching) 및 내피 세포에 의한 세뇨관(tubule) 형성(내피 세포(EC)의 활성화, 혈관 탈안정화, 분해 효소의 합성 및 방출, EC 이동, EC 증식, EC 조직화 및 분화, 및 혈관 성숙과 같은 공정 포함)을 포함한 다단계 공정에서의 혈관신생 및 혈관정지 인자의 국소적 균형에 의해 밀접히 제어된다.
성체(adult)에 있어, 생리학적 혈관신생은 대체로 상처 치료, 및 여성 생식 기능과 배 발달의 몇가지 요소로 국한된다. 임의의 비정상적이거나 바람직하지 못하거나 병리학적인 혈관신생을 포함하는 질병 관련 혈관신생에서, 혈관신생 및 혈관정지 인자 간의 국소 균형이 올바로 제어되지 않아, 부적절하고/하거나 구조적으로 비정상적 혈관 형성을 초래한다. 병리학적 혈관신생은 당뇨성 망막병증, 건선, 암, 류마티스성 관절염, 죽종, 카포시 육종 및 혈관종을 비롯한 질병 상태들과 관련되어 왔다(Fan et al, 1995, Trends Pharmacology. Science. 16: 57-66; Folkman, 1995, Nature Medicine 1: 27-31). 암에서, 1 내지 2 mm3 초과의 1차 및 2차 종양의 성장은 혈관신생을 필요로 한다(Folkman, J. New England Journal of Medicine 1995; 33, 1757-1763).
많은 신호유도 체계가 혈관신생의 제어와 관련되어 왔고, 수많은 인자들이 시험관내 EC 반응 및 생체내 혈관 신생의 공지된 조절자이다. 수용체 티로신 키나제(RTK)는 세포의 형질막을 통한 생화학 신호의 중요 전달자이다. 이 막 통과 분자는 특징적으로 세포내 티로신 키나제 도메인으로 형질막 내 구획을 통해 연결된 세포외 리간드-결합 도메인으로 구성된다. 리간드의 수용체로의 결합은 수용체-관련 티로신 키나제 활성의 자극을 초래하고, 이는 수용체 및 다른 세포내 분자 모두에 있는 티로신 잔기가 인산화되도록 한다. 티로신 인산화의 이러한 변화는 신호전달 캐스케이드를 개시하고, 이는 다양한 세포성 반응을 야기한다. 지금까지, 아미노산 서열 상동성에 의해 정의되는, 적어도 19가지의 구별된 RTK 하위부류가 동정되었다.
VEGF는 정상 및 질병 관련 혈관신생(Jakeman, et al. 1993 Endocrinology: 133, 848-859; Kolch, et al. 1995 Breast Cancer Research and Treatment: 36, 139-155) 및 혈관 투과능(Connolly, et al. 1989 J. Biol. Chem: 264, 20017-20024) 모두의 중요 자극자인 것으로 판단된다. 항체를 이용한 VEGF의 봉착에 의한 VEGF 작용의 길항작용은 종양 성장의 억제를 초래할 수 있다(Kim, et al. 1993 Nature: 362, 841-844). VEGF 유전자의 이종접합성 붕괴는 혈관형성의 치명적 결손을 초래하였다(Carmeliet, et al. 1996 Nature 380: 435-439; Ferrara, et al. 1996 Nature 380: 439-442).
VEGF는 공지되어 있는 가장 강하고 편재하는 혈관 성장 인자이다. VEGF의 역할이 내피 세포에 대한 분비 미토겐임을 확인하기 전에, 그것은 혈관 투과능 인자인 것으로 확인되었고, 이는 증식, 이동, 분화 및 생존을 비롯한, 내피 세포의 많은 구별된 측면들을 조절하는 VEGF의 능력을 나타낸다(Ruhrberg, 2003 BioEssays 25: 1052-1060). VEGF-A로도 알려진 VEGF는 동정되는 혈소판-유래 성장 인자에 속하는 구조적으로 관련된 당단백질의 VEGF 부류의 한 구성원이었다. 창립 구성원 외에, VEGF 부류에는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, 태반 성장 인자(PIGF) 및 내분비선-유래 VEGF(EG-VEGF)가 포함된다. VEGF의 활성 형태는 다른 VEGF 부류 구성원과 동종이량체 또는 이종이량체로서 합성된다. VEGF-A는 대안적 스플라이싱에 의해 발생되는 6가지 이소형태, 즉 VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 및 VEGF206으로 존재한다. 이 이소형태는 일차적으로 자체의 생체이용효율이 상이하고, VEGF165가 주된 이소형태이다(Podar, et al. 2005 Blood 105(4): 1383-1395). 각종 이소형태의 단계-특이적 및 조직-특이적 비를 산출하기 위한 배발생 동안 스플라이싱을 제어함으로써, VEGF에 대한 반응으로 내피 세포의 구별되고 영역 의존적 거동에 대한 강한 잠재능이 생긴다.
VEGF 부류의 구성원은 3가지 관련 수용체 티로신 키나제, 즉 VEGFR1(fms-유사 티로신 키나제 수용체, Flt 또는 Flt1), VEGFR2(키나제 삽입 도메인-함유 수용체, KDR(Flk-1로도 칭해짐)), 및 VEGFR3(또 다른 fms-유사 티로신 키나제 수용체, Flt4)에 대해 상이한 친화도로 결합하는 것으로 알려져 있다. 이 관련 RTK들 중 2가지, 즉 Flt1 및 KDR은 높은 친화도로 VEGF에 결합하는 것으로 나타났다(De Vries et al, 1992, Science 255: 989-991; Terman et al, 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992, 187: 1579-1586). 이종성 세포에서 발현되는 이 수용체에 대한 VEGF의 결합은 세포 단백질 및 칼슘 플럭스의 티로신 인산화 상태의 변화와 관련되었다.
넉-아웃(Knock-out) 마우스 연구는, Flt1 또는 KDR에서의 붕괴가 급성 혈관 결함으로 인한 중간-잉태(mid-gestation)를 유발함을 보여주었다. 그러나, 표현형이 구별되고; KDR의 결핍은 EC 및 발달 중인 조혈계 모두의 결여를 초래하고(Shalaby, et al. 1995 Nature 376: 62-66), Flt1의 결핍은 조혈 선조세포 및 EC 모두에 영향을 미치지 않으나, 이들은 기능적 혈관으로 조립되지 못한다(Fong, et al. 1995 Nature 376: 66-70). Flt4는 성체 내 림프성 혈관으로 제한되기 전에 배에서 심층 발현된다. Flt4 넉-아웃 마우스는 심혈관계의 조기 발달, 일차 혈관 네트워크의 보다 큰 혈관으로의 리모델링 및 성숙에 있어 Flt4를 위해 필수적 역할을 나타냈다(Dumont, et al. 1998 Science 282: 946-949).
VEGF 부류에 부가하여, 안지오포이에틴은 혈관 발달 및 출생후 혈관신생에 관여하는 것으로 사료된다. 안지오포이에틴에는 천연 발생 작용자, 안지오포이에틴-1뿐만 아니라, 천연 발생 길항자, 안지오포이에틴-2가 포함된다. 안지오포이에틴-1의 역할은, 성체 내에서 보존되는 것으로 사료되며, 그 안에서 널리 또한 구성적으로 발현된다(Hanahan, Science 277: 48-50(1997); Zagzag et al., Exp Neurology 159: 391-400(1999)). 그와 반대로, 안지오포이에틴-2의 발현은 주로 혈관 리모델링의 부위에 국한되며, 여기에서 그것은 안지오포이에틴-1의 구성적 안정화 또는 성숙 기능을 차단하여, 혈관이 발아 신호에 좀 더 반응하도록 할 수 있는 유연한 상태로 복귀시키고 유지시키는 것으로 사료된다(Hanahan, 1997; Holash et al., Oncogene 18: 5356-62(1999); Maisonpierre, 1997). 질병 관련 혈관신생에서의 안지오포이에틴-2 발현에 관한 연구들을 통해, 많은 종양 유형이 혈관성 안지오포이에틴-2의 발현을 나타낸다는 것을 밝혀내었다(Maisonpierre et al., Science 277: 55-60(1997)). 기능평가 연구에서도, 안지오포이에틴-2가 종양의 혈관신생에 관여하고 안지오포이에틴-2의 과발현이 종양의 성장 증진과 관련있음을 마우스 이종이식 모델에서 제시하였다(Ahmad et al., Cancer Res 61: 1255-1259(2001)). 안지오포이에틴-2 과발현이 종양의 과도한 혈관형성과 관련있다는 점에 대한 다른 연구들 도 있다(Etoh et al., Cancer Res 61: 2145-53(2001); Tanaka et al., Cancer Res 62: 7124-29(2002)).
상동성을 기초로 하는 클로닝 접근법으로, Valenzuela 등(1999)은 2가지 신규 안지오포이에틴, 즉 마우스 내 안지오포이에틴-3, 및 인간 내 안지오포이에틴-4를 동정하였다. 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4는 안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2의 마우스 버전 및 인간 버전보다 더 구조적으로 상호로부터 갈라져 나온 것이나, 이들은 동일한 유전자 좌의 마우스 및 인간의 대응물(counterpart)을 나타내는 것으로 보인다. 안지오포이에틴 부류의 이 구성원의 생물학에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 예를 들어, 안지오포이에틴-4는 폐에서만 높은 수준으로 발현되나, 안지오포이에틴-4에 의해 활성화되는 생물학적 작용 또는 신호전달 경로는 모두 문헌에서 찾아볼 수 없다(Tsigkos, et al., Expert Opin. Investig. Drugs 12(6): 933-941(2003); Valenzuela, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 1904-1909(1999)). 안지오포이에틴-4 발현 수준은 저산소증에 대한 반응으로 증가하는 것으로 알려져 있고, 내피 세포 성장 인자는 신경교아세포종 세포주 및 내피 세포 내 안지오포이에틴-4 발현의 수준 증가를 초래한다. 그러나, 발현 제어 메커니즘, 및 생리학적 및 질병 관련 혈관신생에 대한 결과적 영향은 알려져 있지 않다(Lee, et al., FASEB J. 18: 1200-1208(2004)).
안지오포이에틴은 혈관 내피에서 선택적으로 발현되는 Tie 수용체 티로신 키나제 부류의 리간드로 처음 발견되었다(Yancopoulos et al., Nature 407: 242-48(2000)). 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및 안지오포이 에틴-4는 주로 Tie-2 수용체에 결합하여, Tie-2 리간드로도 알려져 있다. 안지오포이에틴-1의 Tie-2로의 결합은 자가인산화 및 이에 후속하는 신호유도를 통한 신호전달 경로의 활성화를 통해 수용체의 티로신 인산화를 유도한다(Maisonpierre P. et al. 1997. Science 277: 55-60). 안지오포이에틴-2는 Tie-2 수용체의 안지오포이에틴-1-유도 키나제 활성화의 경쟁적 억제를 통해 작용하는 안지오포이에틴-1에 대한 천연 발생 길항자이다(Hanahan, 1997; Davis et al., Cell 87: 1161-69(1996); Maisonpierre et al., Science 277: 55-60(1997)).
Tie-2와 안지오포이에틴-1의 넉-아웃 마우스 연구는 유사한 표현형을 나타냈고, 안지오포이에틴-1 자극 Tie-2 인산화는 발생 중인 혈관의 리모델링과 안정화를 매개하며, 혈관신생 중의 혈관의 성숙 및 내피세포와 지지세포 간의 유착의 유지가 제시되었다(Dumont et al, Genes & Development, 8: 1897-1909(1994); Sato, Nature, 376: 70-74(1995); (Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-463)).
근년, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2 및/또는 Tie-2가 가능한 항암치료 표적으로 제안되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6166185호, 제5650490호, 제5814464호는 각기 Tie-2 리간드와 수용체 항체를 개시한다. 가용성 Tie-2를 이용한 연구는 설치류에서 이것이 종양의 수와 크기를 감소시킨다고 보고하였다(Lin, 1997; Lin, 1998). Siemeister 등(1999)은 Tie-2의 세포외 도메인을 발현하는 인간 흑색종 세포주를 만들고, 이를 누드마우스에 주입하였으며, 가용성 Tie-2에 의해 종양 성장 및 종양 혈관신생이 상당히 억제된다고 보고하였다. 안지오포이에틴-1과 안지오포이에틴-2 모두 Tie-2에 결합한다 하더라도, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2 또는 Tie-2가 항암 치료법에 관심 표적이 될지는 불분명하다. 그러나, 효과적인 항-안지오포이에틴-2 치료법은, 진행이 이상 혈관신생에 의존적인, 암과 같은 질병 치료로서, 그 과정을 막아 질병의 진전을 방지할 수 있는 치료에 이득이 될 것으로 사료된다(Folkman J, Nature Medicine 1:27-31(1995)). 게다가, 일부 단체들은 안지오포이에틴-2에 결합하는 항체의 용도를 보고하였다. 이에 대해, 미국 특허 제6,166,185호 및 미국 특허 출원 제2003/0124129 A1호를 참조한다. 안지오포이에틴-2의 초점 발현 효과에 관한 연구에서는, 안지오포이에틴-1/Tie-2 신호전달을 길항함으로써, 단단한 혈관구조를 느슨하게 하고, 이로써 EC를 VEGF(혈관 내피 성장 인자) 등의 혈관신생 유도자로부터의 활성화 신호에 노출시킨다는 것을 보여주었다(Hanahan, 1997). 안지오포이에틴-1의 억제로 인한 이 전-혈관신생 효과는, 항-안지오포이에틴-1 요법이 효과적인 항암 치료법이 아님을 가리킨다.
국제 출원 공보 번호 WO200197850은 혈관형성의 억제 및 종양 성장의 억제를 위한 VEGF/VEGF 수용체 시스템 및 안지오포이에틴/Tie 수용체 시스템의 기능적 간섭의 조합을 기재한다. 넓은 범주는, VEGF/VEGF 수용체 시스템 및 안지오포이에틴/Tie 수용체 시스템의 임의의 성분의 기능적 간섭의 임의의 구상가능한 조합; 즉 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3, 안지오포이에틴-4 또는 Tie-2 중 임의의 하나의 기능적 간섭과 조합되는, Flt1, KDR, Flt4, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PIGF 또는 EG-VEGF 중 임의의 하나를 포함한다.
그 출원은, 기능적 간섭이
i) 수용체 티로신 키나제 활성을 억제하는 화합물,
ii) 수용체로의 리간드 결합을 억제하는 화합물,
iii) 수용체의 세포내 경로의 활성화를 억제하는 화합물,
iv) VEGF 또는 Tie 수용체 시스템의 수용체 또는 리간드의 발현을 억제하거나 활성화하는 화합물,
v) VEGF/VEGF 수용체 또는 안지오포이에틴/Tie 수용체 시스템의 인식을 통해 내피세포로 세포독성제 또는 응집유도제를 표적화하는 항체, 리간드, 고친화도 결합 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩티드, 또는 리포좀과 같은 전달 시스템, 또는
vi) 내피세포로 표적화되고, 세포괴사(necrosis) 또는 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 항체, 리간드, 고친화도 결합 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩티드, 또는 리포좀과 같은 전달 시스템
에 의해 달성될 수 있음을 제안한다.
그 출원의 청구 범위를 확대해 볼 때, 그 출원은 본 발명의 조합물에 의해 포함되는 화합물이 저분자량 물질, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 재조합 단백질, 항체, 또는 이들의 접합체 또는 융합 단백질임을 추가로 기술한다. 다수의 임의적 조합의 포함이 특별한 조합의 유용성/선택을 교시하지는 않는다.
WO200197850이 매우 넓은 범위를 청구하나, 그 발명의 예시는, 인간 Tie-2 수용체 티로신 키나제(sTie-2)의 세포외 리간드-중화 도메인과 A 또는 B의 조합에 국한된다. 후자는 하기의 것일 수 있다:
A. VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제(4-클로로페닐)[4-(4-피리딜메틸)-프탈 라진-1-일] 암모늄 수소 숙시네이트(Wood et al., Cancer Res. 60 2178-2189, 2000), 또는
B. 항-VEGF 항체; VEGF-A-중화 단클론성 항체 4301-42-35(Schlaeppi et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, 336-342, 1999), 또는 인간 VEGF-A/VEGF 수용체 I 착체를 특이적으로 인식하는 단쇄 항체(scFv)(WO9919361).
그 출원의 넓은 범주의 나머지에 대한 예시는 없다. 특히, 안지오포이에틴/Tie 수용체 시스템의 기능적 간섭을 달성하기 위한 sTie-2의 용도 외에 다른 예시가 없다. 그러므로, 매우 광범위한 가능한 순열들로부터, 어떠한 다른 조합이 치료 유효성이 있는지는 당업자에게 명료하지 않다.
본 발명은 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물, 또는 그러한 조합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에 따라, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자, 및
i. VEGF-A 및/또는
ii. KDR 및/또는
iii. Flt1
의 생물학적 활성의 길항자의 조합물이 제공된다.
한 실시양태에서, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자가 항체인, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다. 바람직하게, 안지오포이에틴-2의 길항자는 단클론성 항체이다. 더욱 바람직하게는, 안지오포이에틴-2의 길항자는 완전한 인간 단클론성 항체이다. 더욱 바람직하게는, 완전한 인간 단클론성 항체는 완전한 인간 단클론성 항체, 3.31.2, 5.16.3, 5.86.1, 5.88.3, 3.3.2, 5.103.1, 5.101.1, 3.19.3, 5.28.1, 5.78.3 중 임의의 하나와 동일한 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게, 완전한 인간 단클론성 항체는 3.31.2, 또는 5.16.3, 또는 5.86.1, 또는 5.88.3, 또는 3.3.2, 또는 5.103.1, 또는 5.101.1, 또는 3.19.3, 또는 5.28.1, 또는 5.78.3 중 어느 하나로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자는 Tie-2의 ATP-결합 부위에 결합하지 않을 수 있는 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자가 sTie-2가 아닌, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, KDR의 생물학적 활성의 길항자가 항체인, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다. 바람직하게, 길항자는 단클론성 항체이다. 더욱 바람직하게, 길항자는 완전한 인간 단클론성 항체이다.
또 다른 실시양태에서, Flt1의 생물학적 활성의 길항자가 항체인, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다. 바람직하게, 길항자는 단클론성 항체이다. 더욱 바람직하게, 길항자는 완전한 인간 단클론성 항체이다.
또 다른 실시양태에서, VEGF-A의 생물학적 활성의 길항자가 항체인, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다. 바람직하게, 길항자는 단클론성 항체이다. 단클론성 항체는 DC101일 수 있다(임클론(Imclone)). 더욱 바람직하게, 길항자는 완전한 인간 단클론성 항체이다. 가장 바람직하게, VEGF-A의 생물학적 활성의 길항자는 아바스틴(베바시주맙(bevacizumab))(Rosen LS., Cancer Control 9(추록 2): 36-44, 2002), CDP791(셀테크) 또는 IMC1121b(임클론)이다.
또 다른 실시양태에서, KDR의 생물학적 활성의 길항자가 화합물인, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다. 한 대안적 실시양태에서, Flt1의 생물학적 활성의 길항자가 화합물인, 상기 기재된 바와 같은 조합물이 제공된다. 바람직하게, 길항자는 티로신 키나제 억제제이다. 더욱 바람직하게, 티로신 키나제 억제제는 작티마(Zactima)TM ZD6474(Wedge SR et al. ZD6474는 경구 투여 후, VEGF 신호전달, 혈관신생 및 종양 성장을 억제함. Cancer Research 2002; 62: 4645-4655)), AZD2171(Wedge SR et al. AZD2171: 암 치료용의 매우 강한, 경구 생체이용효율성의 혈관 내피 성장 인자 수용체-2 티로신 키나제 억제제. Cancer Research 2005; 65: 4389-4400), SU11248(수텐트(Sutent), 화이자), SU14813(화이자), 바탈라닙(Vatalanib)(노바르티스), BAY43-9006(소라페닙(sorafenib), 바이에르), XL-647(엑셀릭시스), XL-999(엑셀릭시스), AG-013736(화이자), AMG706(암겐(Amgen)), BIBF1120(베링거), TSU68(타이호(Taiho)), GW786034, AEE788(노바르티스), CP-547632(화이자), KRN 951(키린(Kirin)), CHIR258(카이론(Chiron)), CEP-7055(세팔론), OSI-930(OSI 파마슈티칼즈), ABT-869(아보트(Abbott)), E7080(에이사이), ZK-304709(쉐링), BAY57-9352(바이에르), L-21649(머크), BMS582664(BMS), XL-880(엑셀릭시스), XL-184(엑셀릭시스) 또는 XL-820(엑셀릭시스)로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 티로신 키나제 억제제는 작티마TM 또는 AZD2171로부터 선택된다.
보다 명료히 하고자, KDR의 생물학적 활성의 길항자는 KDR 외의 다른 티로신 키나제, 예를 들어 Flt1, EGFR 또는 PDGFR을 억제할 수 있다. 한 실시양태에서, KDR의 생물학적 활성의 길항자는 KDR 신호전달 억제제이다. 또 다른 실시양태에서, KDR의 생물학적 활성의 길항자는 KDR 신호전달의 억제제이나, EGFR의 억제제는 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 기재된 바와 같은 조합물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 기재된 바와 같은 조합물의 질병 관련 혈관신생 치료용 의약을 제조하기 위한 용도가 제공된다.
안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물은 단독으로 투여되거나, 부가적 항체 또는 화학요법 약물 또는 방사선요법과 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성 및 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1 중 임의의 하나의 생물학적 활성을 길항하는 방법으로서, 상기 기재된 바와 같은 조합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 바람직하게, 방법은 질병 관련 혈관신생에 대한 치료가 필요한 동물을 선택하는 단계, 및 상기 동물에게 치료 유효 용량의, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 포유동물에서의 질병 관련 혈관신생을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 상기 기재된 바와 같은 조합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 바람직하게, 방법은 질병 관련 혈관신생에 대한 치료가 필요한 동물을 선택하는 단계, 및 상기 동물에게 치료 유효 용량의, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 포유동물에서의 암을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 상기 기재된 바와 같은 조합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 바람직하게, 방법은 질병 관련 혈관신생에 대한 치료가 필요한 포유동물을 선택하는 단계, 및 상기 포유동물에게 치료 유효 용량의, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물을 투여하는 단계를 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단독으로 또는 부분적으로 안지오포이에틴-2와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1 의존성 종양을 갖는 환자에게 있어, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성, 및 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성을 길항하는 데 사용하기에 특히 적당하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 의료 종양약학에 사용되는 항증식/항신생물 약물 및 이들의 조합물, 예컨대 알킬화제(예를 들어 시스-플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 메팔란, 클로르암부실, 부술판 및 니트로소우레아); 항대사제(예를 들어 항엽산제, 예컨대 플루오로피리미딘류, 예를 들어 5-플루오로우라실 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 젬시타빈, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 사이토신 아라비노시드 및 히드록시우레아, 또는 예를 들어, 유럽 특허출원 제562734호에 개시된 바람직한 항대사제들 중 하나, 예컨대 (2S)-2-{o-플루오로-p-[N-{2,7-디메틸-4-옥소-3,4-디히드로퀴나졸린-6-일메틸)-N-(프로프-2-이닐)아미노]벤즈아미도}-4-(테트라졸-5-일)부티르산); 알킬화제 및 항대사제를 포함하는 조합물(예를 들어 플루오로우라실, 류코보린 및 옥살리플라틴을 포함하는 폴폭스(Folfox)); 항종양 항생제(예를 들어 안트라사이클린류, 예컨대 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항유사분열제(예를 들어 빈카 알칼로이드류, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈, 및 탁소이드류, 예컨대 탁솔 및 탁소테르); 및 토포이소머라제 억제제(예를 들어 에피포도필로톡신류, 예컨대 에토포시드 및 테니포시드, 이리노테칸, 암사크린, 토포테칸 및 캄프토테신)을 부가적으로 포함하는 본 발명의 조합물이 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 폴폭스를 부가적으로 포함하는 본 발명의 조합물이 제공된다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조합물은 보조제, 예를 들어 빈혈을 예방하거나, 항증식/항신생물 약물의 부작용을 감소시키는 작용을 하는 작용제를 추가로 포함한다. 바람직하게, 보호제는 환원형의 엽산, 바람직하게는 류코보린이다.
본 발명의 조합물은 질병 관련 혈관신생을 억제함으로써, 각종 혈관신생-관련 질병들의 강력한 요법으로 작용할 것으로 예상된다.
항체를 포함하는 본 발명의 실시양태에서, 조합물을 환자에게 투여한 후, 소거제(clearing agent)를 투여할 수 있다. 바람직하게, 소거제는 혈액으로부터 과량의 순환 항체를 제거할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조합물의 제조 방법을 추가로 포함한다.
본 발명의 한 추가 측면에 따라, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 한 추가 측면에 따라,
a) 제1 단위 투약 형태 내의 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자;
b) 제2 단위 투약 형태 내의 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자; 및
c) 상기 제1 및 제2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단
을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 한 추가 측면에 따라,
a) 제1 단위 투약 형태 내의, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자;
b) 제2 단위 투약 형태 내의, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께, VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자; 및
c) 상기 제1 및 제2 투약 형태를 함유하기 위한 용기 수단
을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 용기를 포함하는 제조 용품을 제공한다. 용기는 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물, 및 조합물이 안지오포이에틴-2와 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 활성 및/또는 과발현과 관련된 혈관신생-관련 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 팩키지 삽입물 또는 표지를 포함한다.
본 발명의 한 추가 측면에 따라, 본 요법적 치료가 필요한 인간과 같은 온혈 동물에게, 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께, 유효량의 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 길항자 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하고, 이와 동시에, 순차적으로 또는 별도로 유효량의 VEGF-A 및/또는 KDR 및/또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계(여기에서, 후자는 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 투여될 수 있음)를 포함하는 요법적 조합 치료가 제공된다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 조합 치료는, 상기 치료의 개별 성분의 동시적, 순차적 또는 별도의 투여에 의해 달성될 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 조합 치료는 단독 요법으로 적용되거나, 본 발명의 조합 치료에 부가하여 부가적 수술 또는 방사선요법 또는 부가적 화학요법제를 포함할 수 있다.
소정의 환자를 위한 조합 제형물의 투약량은, 질병의 중도 및 유형, 체중, 성별, 식이법, 투여 시간 및 경로, 기타 의약 및 기타 관련 임상적 인자를 포함한, 약물의 작용을 변형시키는 것으로 알려진 각종 인자들을 고려하여 담당의에 의해 결정될 것이다. 치료 유효 투약량은 시험관내 또는 생체내 방법으로 결정될 수 있다.
치료적으로 사용되는, 본원에 기재된 조합물의 유효량은 예를 들어, 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 따라서, 치료사는 최적의 치료 효과를 수득하는데 필요한 대로 투약량을 적정하고 투여 경로를 변형하는 것이 바람직하다. 전형적 일일 투약량은, 상기 언급된 인자들에 따라, 약 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위 또는 그 이상일 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투약량이 도달될 때까지 치료 항체를 투여할 것이다. 이 요법의 진행은, 통상적 검정에 의해 또는 본원에 기재된 바대로 용이하게 모니터링된다.
항체의 투여 경로는 공지된 방법에 따라, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 지주막하강내, 흡입 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기술되는 서방성 시스템에 따라 이루어진다. 항체는 바람직하게 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속 투여된다.
치료적으로 이용되는 항체의 유효량은 예를 들어 치료 목적, 투여 경로, 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 따라서, 치료사는 최적의 치료 효과를 수득하는데 필요한 대로 투약량을 적정하고 투여 경로를 변형하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투약량이 도달될 때까지 치료 항체를 투여할 것이다. 이 요법의 진행은, 통상적 검정에 의해 또는 본원에 기재된 바대로 용이하게 모니터링된다.
본원에 기재된 바와 같은 조합물은 경구 투여에 적당한 형태, 예를 들어 정제 또는 캡슐; 비강 투여 또는 흡입에 의한 투여에 적당한 형태, 예를 들어 분말 또는 용액; 비경구 주사(정맥내, 피하, 근육내, 혈관내 또는 주입)에 적당한 형태, 예를 들어 무균 용액, 현탁액 또는 유화액; 국소 투여에 적당한 형태, 예를 들어 연고 또는 크림; 직장 투여에 적당한 형태, 예를 들어 좌약제의 형태일 수 있거나, 투여 경로는 종양으로 직접 주사하거나, 영역 전달 또는 국소 전달에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태들에서, 조합 치료는 내시경, 기관내, 병변내, 경피내, 정맥내, 피하, 복강내 또는 종양내 전달될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 조합물은 경구 투여된다. 일반적으로, 본원에 기재된 조합물은 통상적 부형제를 이용하여 통상적 방식으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조합물은 유리하게 단위 투약 형태로 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 항체는, 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어 제조될 수 있다. 이 치료적 조성물은 정맥내 또는 코나 폐를 통해, 바람직하게 액체 또는 분말 에어로졸(동결건조)로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 원할 경우 비경구 또는 피하 투여될 수 있다. 전신 투여 시에, 치료적 조성물은 무균이고, 발열물질이 없으며, pH, 등장성 및 안정성을 고려하여 정의된 비경구적으로 허용가능한 용액 내 있어야 한다. 이 상태는 당업자에게 알려져 있다. 간략히, 본원에 기재된 화합물의 투약 제형물은, 원하는 순도를 갖는 화합물을 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써, 저장 또는 투여를 위해 제조된다. 그러한 물질은 이용되는 투약량 및 농도에서 수령자에게 비독성이고, 이 물질에는 완충제, 예컨대 트리스(TRIS) HCl, 인산염, 시트르산염, 아세트산염 및 기타 유기산 염; 항산화제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 펩티드, 예컨대 폴리아르기닌, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리디논; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌; 단당류, 이당류, 및 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 짝이온, 예컨대 나트륨 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN), 플루로닉스(PLURONICS) 또는 폴리에틸렌글리콜이 포함된다.
본 발명의 실시양태에는 질병의 치료에 유용한 항체의 무균 약학적 제형물이 포함된다. 그러한 제형물은 항원의 생물학적 활성을 억제함으로써 질병 상태를 효과적으로 치료하게 되고, 여기에서 예를 들어 혈청 또는 조직 항원은 비정상적으로 상승된다. 항체는 바람직하게 항원을 강하게 중화하기에 적당한 친화도를 가지고, 바람직하게 적당한 작용 기간을 가져, 인간에게 빈번하지 않은 투약을 허용한다. 연장된 작용 기간은, 피하 또는 근육내 주사와 같은 대안적 비경구 경로에 의해 덜 빈번하고 더 편리한 투약 스케줄을 허용할 것이다.
무균 제형물은 항체의 동결건조 및 재구성의 전 또는 후에 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 생성될 수 있다. 항체는 일반적으로 동결건조 형태로 또는 용액 내에서 저장될 것이다. 치료적 항체 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 스타퍼와 같은, 제형물의 복귀를 허용하는 어댑터를 갖는 바이얼에 넣을 수 있다.
주사용 무균 조성물은 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy(20th ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003))]에 기재된 바와 같은 통상적 약학적 실무에 따라 제형될 수 있다. 예를 들어, 물 또는 천연 발생 식물유, 예를 들어 참깨유, 땅콩유 또는 면실유와 같은 비히클, 또는 올레산에틸 등과 같은 합성 비히클 내 활성 화합물의 용해 또는 현탁이 요망될 수 있다. 완충제, 보존제, 항산화제 등이 허용되는 약학 실무에 따라 혼입될 수 있다.
본 발명의 조합물은 서방성 제형물로서 전달될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예에는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 형상화 물품, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 문헌 [Langer et al, J. Biomed Mater. Res.(1981) 15: 167-277], 및 [Langer, Chem. Tech.,(1982) 12: 98-105]에 기재된 바와 같은 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호, EP 58,481), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al, Biopolymers,(1983) 22: 547-556), 비분해성 에틸렌-아세트산비닐(Langer et al., 이하 동일), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론(LUPRON) 데포(Depot)TM(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세트산염으로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)이 포함된다.
에틸렌-아세트산비닐 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있도록 하는 반면, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화 단백질이 장시간 신체내 남을 때, 그것은 37℃에서 수분에 노출됨으로 인해 변성 또는 응집될 수 있고, 이로써 생물학적 활성이 소실되고, 면역원성이 변화될 수 있다. 관련 메커니즘에 따라 단백질 안정화를 위한 합리적 방안이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 디술피드 상호교환을 통해 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 조절하며, 적절한 첨가제를 이용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
서방성 조성물은 또한 결정을 현탁 상태로 유지시킬 수 있는 적당한 제형물 내 현탁된 항체의 결정의 제제를 포함한다. 이 제제는, 피하 또는 복강내 주사될 때, 서방성 효과를 생성시킬 수 있다. 다른 조성물은 또한 리포좀내 포획된 항체를 포함한다. 그러한 항체를 포함하는 리포좀은 미국 특허 No. DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA(1985) 82: 3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77: 4030-4034; EP 52,332; EP 36,676, EP 88,046; EP 143,949; 142,641; 일본 특허출원 83-118008; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및, EP 102,324 등에 따른 공지 방법에 의해 제조된다.
본원의 조성물과 방법에 따른 치료 실체(entity)의 투여는 적당한 담체, 부형제 및 기타 다른 물질과 함께 제형물 내에 혼입되어, 증진된 이동, 전달, 내인성 등을 제공하도록 해야 함이 인지될 것이다. 이러한 제형물에는 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 기름, 지질, (양이온 또는 음이온) 지질 함유 소포(vesicle)(예컨대, 리포펙틴(Lipofectin)TM), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 유화액, 유화액 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜류), 반고형겔, 및 카르보왁스를 포함하는 반고형의 혼합물이 포함된다. 상술한 혼합물 중 임의의 것은, 제형물 내의 활성 성분이 제형물에 의해 비활성화되지 않고, 생리학적으로 적합하고 투여경로에 문제가 없다면, 본 발명에 따른 치료 및 요법에 적절할 수 있다. 또한, 약학 화학자들에게 공지되어 있는 제형물, 부형제 및 담체에 관한 추가 정보는, 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul . Toxicol . Pharmacol . 32(2): 210-8(2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm . 2039(1-2): 1-60(2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J. Pharm . Sci ., 89(8): 967-978(2000), Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J. Pharm . Sci . Technol . 52: 238-311(1998)], 및 그 안에 인용된 인용문헌을 참조한다.
영구 조직 배양 세포주에 의한 소정의 특이성의 단클론성 항체의 제조가 1975년에 처음으로 기재되었다(Kohler, G., & Milstein, C., Nature 256, 495-497, 1975). 면역화 도너로부터의 마우스 골수종 및 마우스 비장 세포의 융합은 항-양 적혈 세포(SRBC) 항체를 분비하는 세포주를 생성시켰다. 후속 개발은, 이제 시험관내 방법에 의해 인간 항체를 유도하는 것이 가능하다는 것을 의미한다. 적당한 예에는 파지 디스플레이(CAT, 모르포시스(Morphosys), 다이액스(Dyax), 바이오사이트(Biosite)/메다렉스(Medarex), 조마(Xoma), 심포젠(Symphogen), 알렉시온(Alexion)(구: 프롤리페론(Proliferon)), 아피메드(Affimed)) 리보솜 디스플레이(CAT), 효모 디스플레이 등이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 항체는 이후 기재되는 바와 같은 제노마우스(XenoMouse)
Figure 112008046490870-pct00001
기술의 이용을 통해 제조되었다. 이에, 그러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생성시킬 수 있고, 쥐 면역글로불린 분자 및 항체의 생성에 있어 결핍된다. 이의 달성을 위해 이용되는 기술은 특허, 공보 및 이들 내에 인용된 참조문헌에 개시되어 있다. 그러나, 특히, 이로부터의 마우스 및 항체의 유전자도입 생성의 한 바람직한 실시양태가 미국 특허출원 일련번호 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원), 및 국제 특허출원 번호 WO 98/24893(1998년 6월 11일 공개), 및 WO 00/76310(2000년 12월 21일 공개)에 개시되어 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다. 또한, 문헌 [Mendez et al . Nature Genetics 15: 146-156(1997)]을 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.
그러한 기술의 이용을 통해, 다양한 항원들에 대한 완전한 인간 단클론성 항체가 생성되었다. 본질적으로, 마우스의 제노마우스
Figure 112008046490870-pct00002
세포주를 관심 항원으로 면역화하고, 림프구 세포(예컨대 B-세포)는 과면역화된 마우스로부터 회수하여, 회수된 림프구를 골수성-형태의 세포와 융합하여, 불멸의 하이브리도마 세포주를 제조한다. 상기 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여, 관심 항원에 대해 특이적인 항체를 생성한 하이브리도마 세포주를 동정한다. 항체를 생성하는 다수의 하이브리도마 세포주의 생성 방법이 본원에 제공된다. 또한, 상기와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열분석을 포함한, 상기와 같은 세포주에 의해 생성되는 항체의 특징화가 본원에 제공된다.
대안적으로, 하이브리도마를 생성하기 위하여 골수종 세포에 융합하는 대신에, B 세포가 직접적으로 검정될 수 있다. 예를 들어, CD19+ B 세포를 과면역 제노마우스
Figure 112008046490870-pct00003
마우스로부터 단리하고, 항체-분비 형질 세포로 분화시킬 수 있다. 이어서, 상기 세포 상등액으로부터의 항체를, 면역원에 대한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝한다. 상등액을 또한 면역원의 단편에 대한 면역반응성에 대해 스크리닝하여, 면역원 상의 기능적 관심 도메인에 결합하는 상이한 항체를 추가로 매핑할 수 있다. 항체를 또한 다른 관련 인간 단백질, 및 래트, 마우스, 및 시노몰거스(Cynomolgus) 원숭이 등의 인간외 영장류, 면역원의 상동유전자에 대하여 스크리닝하여, 종간 교차 반응성을 결정할 수 있다. 관심 항체를 함유하고 있는 웰로부터의 B 세포는 개별 웰 또는 풀링된 웰로부터 하이브리도마를 제조하는 융합을 비롯한 각종 방법에 의해, 또는 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus)에 의한 감염 또는 공지된 불멸화(immortalizing) 유전자에 의한 트렌스펙션 후, 적절한 배지 내 도포에 의해 불멸화될 수 있다. 대안적으로, 원하는 특이성을 가지는 항체를 분비하는 단일 형질 세포를, 항원-특이적 용혈 플라크 검정(hemolytic plaque assay)을 이용하여 분리한다(예를 들어, 문헌 [Babcook et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 7843-7848(1996)] 참조). 세포용해를 위해 표적화된 세포는 바람직하게는 항원으로 코팅된 양 적혈 세포(SRBC)이다.
관심 면역글로불린과 보체를 분비하는 형질 세포를 포함하는 B-세포 배양물의 존재 하에서, 플라크의 형성은 관심 형질 세포 주변의 양 적혈 세포의 항원-매개 용해를 지시한다. 상기 플라크 내의 단일 항원-특이적 형질 세포가 단리될 수 있고, 항체의 특이성을 코딩하는 유전정보를 단일 형질 세포로부터 단리한다. 중합 효소 사슬 반응이 이어지는 역전사(RT-PCR)를 이용하여, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있다. 이러한 클로닝 DNA는 이어서, 추가로 적절한 발현 벡터, 바람직하게는 pcDNA와 같은 벡터 카세트, 보다 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 포함하는 pcDNA 벡터에 삽입될 수 있다. 이어서, 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 HEK293 세포, CHO 세포 등의 숙주세포에 트랜스펙션되어, 전사를 유도하고, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기에 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.
일반적으로, 융합 하이브리도마에 의해 생성된 항체는 완전한 인간 카파 또는 람다 경쇄를 가진 인간 IgG2 중쇄였다. 본원에 기재된 항체는 IgG2 중쇄뿐만 아니라 인간 IgG4 중쇄를 가진다. 항체는 또한 IgG1을 포함한, 다른 인간의 이소형(isotype)의 것일 수 있다. 항체는 높은 친화도를 가졌고, 전형적으로 고체상 및 액체상 기법에 의해 측정 시에, 약 10-6 내지 약 10-12 M 또는 그 이하의 Kd를 가진다.
마이크로셀 융합, 염색체 대형 단편, 또는 전체 염색체를 통해 도입된 마우스로부터의 인간 항체의 생성이 유럽 특허출원 제773 288호 및 제843 961호에 기재되어 있고, 이의 개시 내용은 본원에 참조 인용된다. 부가적으로, 키린(Kirin)의 Tc 마우스와 메다렉스 미니로커스(minilocus)(Humab)TM 마우스의 교배의 결과물인 KMTM 마우스를 생성시켰다. 이 마우스는 키린 마우스의 인간 IgH 도입염색체(transchromosome) 및 젠팜(Genpharm) 마우스의 카파 사슬 도입유전자(transgene)를 가진다(Ishida et al., Cloning Stem Cells,(2002)4: 91-102).
인지되는 바와 같이, 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 서열은 적당한 포유동물 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 형질전환은 숙주세포에의 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 임의의 공지된 방법, 예를 들어 바이러스 (또는 바이러스성 벡터) 내의 폴리뉴클레오티드의 팩키징(packaging), 및 바이러스 (또는 벡터)를 이용한 숙주세포에의 형질도입, 또는 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호(이들 특허는 본원에 참조 인용됨)에 예시된 바와 같은 당 분야에 공지된 트랜스펙션 절차에 의해 수행될 수 있다. 사용된 형질전환 절차는, 형질전환하고자 하는 숙주에 대해 의존적이다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에 도입하는 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 이에는 덱스트란-매개 트랜스펙션, 인산칼슘 석출, 폴리브렌(ploybrene)-매개 트랜스펙션, 원형질체 융합(protoplast fusion), 전기천공법(electrophoration), 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀 내로의 캡슐화, 핵으로의 직접적 DNA 미세주사(microinjection)가 포함된다.
발현을 위한 숙주로 이용가능한 포유동물류 세포주는 당 분야에 잘 알려져 있고, 이에는 미국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수 가능한 많은 불멸화 세포주, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장세포(COS), 인간 간세포성 암종 세포(예를 들어, Hep G2), 인간 신장 상피 293 세포, 및 수많은 다른 세포를 포함하나, 이에 국한되지 않는 각종 불멸화 세포를 포함한다. 특히 선호되는 세포주는, 높은 발현 수준을 가지고, 구성적 항원 결합 성질을 갖는 항체를 생성하는 세포주가 어떤 것인지를 결정함을 통해서 선택된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 과학용어 및 기술용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 더욱이, 문맥상 달리 규정되지 않는 한, 단수 단어는 복수를 포함할 것이고 복수 단어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포와 조직배양, 분자 생물학, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리 뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 전문용어, 및 그와 관련된 기술은 당업계에 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성 및 조직배양 형질전환(예를 들면, 전기천공법, 리포펙틴)에 대해 표준 기법이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조의 설명서에 따르거나, 당업계에 통상적으로 달성되거나, 본원에 기술한 대로 수행된다. 상술한 기법 및 절차는 당업계에 공지되어 있는 통상적 방법에 따라, 또한 본원을 통해 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 더욱 구체적인 참조문헌에 기술된 대로 수행된다. 예를 들어, 본원에서 참조 인용되는 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Mannual(3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001))]을 참조한다. 본원에 기재된 분석화학, 합성 유기화학, 및 의약/약학 화학 관련의 실험실 절차 및 기법과 관련하여 이용되는 전문용어가 당업계에 공지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학합성, 화학분석, 약학적 제제, 제형물 및 전달과 환자의 치료에 대해 표준 기법을 사용한다.
하기 용어들은, 달리 지시되지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다:
길항자는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 저분자량의 화합물, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, RNA 간섭(RNAi), 안티센스(antisense), 재조합 단백질, 항체, 또는 이의 접합체 또는 융합 단백질일 수 있다. RNAi의 검토를 위해, 밀하벳(Milhavet O), 그래이(Gray DS), 맷슨(Mattson MP)(Pharmacol. Rev., 2003 Dec; 55(4): 629-48. Review.)를 참조하고, 안티센스에 대해서는 오팔린스카(Opalinska JB), (Gewirtz AM)(Sci STKE. 2003 Oct 28; 2003(206): pe47)를 참조한다.
안지오포이에틴-2의 길항자는, 안지오포이에틴-2, 및 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-3 및/또는 안지오포이에틴-4을 포함한 기타 안지오포이에틴의 생물학적 활성을 길항하는 길항자를 비롯하여, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 임의의 길항자일 수 있다. 안지오포이에틴-2 길항자는 리간드 단독에, 또는 리간드가 수용체에 결합될 때에는 리간드에 결합할 수 있다.
VEGF-A의 길항자는 VEGF-A의 생물학적 활성의 임의의 길항자일 수 있고, 여기에서 길항자는 리간드 단독에, 또는 리간드가 수용체에 결합될 때에는 리간드에 결합할 수 있다. 길항자는 VEGF-A 매개 Flt1 또는 KDR 신호유도를 방지함으로써, 혈관신생을 억제할 수 있다. 이 억제 작용의 메커니즘은 VEGF-A에 길항자를 결합시키고, VEGF-A를 그것의 수용체인 Flt1 또는 KDR에 결합하는 것을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 길항자는 VEGF-A가 수용체인 Flt1 또는 KDR에 결합할 때 VEGF-A에 결합함으로써, VEGF-A 매개 Flt1 또는 KDR 신호유도를 방지할 수 있다. 대안적으로, 길항자는 그 안의 VEGF-A의 소거를 증진시킬 수 있고, 이에 Flt1 또는 KDR에 대한 결합을 위한 VEGF-A의 유효 농도를 저하시킬 수 있다.
조성물은 바람직하게 하나 이상의 길항자를 포함하는 약학적 조성물이다. 조성물의 길항자는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
질병 관련 혈관신생은 비정상적이고, 바람직하지 않거나 병리적인 혈관신생, 예를 들면 암-관련 혈관신생일 수 있다. 혈관신생-관련 질병에는 백혈병, 다양한 골수종, 또는 림프종 등의 비-고형 종양, 및 흑색종, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 신경교아세포종, 흉선, 담관, 뼈, 위, 뇌/CNS, 두경부, 간, 위, 전립선, 유방, 신장, 정소, 난소, 피부, 자궁경부, 폐, 근육, 신경, 식도, 방광, 폐, 자궁, 음문, 자궁내막, 신장, 결장직장, 췌장, 흉막/복막, 침샘 및 표피 종양 등의 고형 종양, 및 이의 전이를 포함한다.
과도한 혈관 성장은 또한 수많은 비신생물성 장애에 기여한다. 이 비신생물성의 혈관신생-관련 질병에는, 죽상동맥경화증, 혈관종, 혈관내피종, 혈관섬유종, 혈관 기형(예를 들어, 유전성 출혈 모세혈관확장증(HHT) 또는 오슬러-웨버 증후군(Osler-Weber syndrome)), 사마귀, 화농성 육아종, 과다 모발 성장증, 카포시 육종, 켈로이드 반흔, 알레르기성 부종, 건선, 기능부전 자궁 출혈, 난포낭, 난소 과자극, 자궁내막증, 호흡 곤란, 복수(ascites), 투석환자의 복막경화증, 복부 수술 유래의 유착 형성, 비만증, 류마티스 관절염, 윤활막염, 골수염, 판누스 성장증, 골증식체, 혈우병 관절, 염증 및 감염 과정(예를 들어, 간염, 폐렴, 사구체신염, 천식, 비강폴립, 간 재생, 폐동맥 고혈압, 미숙아 망막병증, 당뇨성 망막병증, 연령 관련황반 변성, 백색 연화증, 신생혈관 녹내장, 각막이식성 혈관 증식, 트라코마, 갑상샘염, 흉선 비대증 및 림프세포증식성 장애가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
화합물은 2000 달톤 미만의 분자량을 갖는 임의의 저분자량 화합물을 지칭한다.
"항체(antibody)"라는 용어는 항원의 항원 결정자의 특징에 상응하는 전하 분포 및 내부 표면 모양의 3차원 결합 공간을 갖는 폴리펩티드 사슬의 접힘에 의해 형성된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 군을 의미한다. 항체는 전형적으로 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 4량체성 형태를 가지고, 이 때 각 쌍은 하나의 "경"쇄 및 하나의 "중"쇄로 구성된다. 각각의 경/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 항체는 올리고클론성, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 키메라 항체, CDR-그라프트 항체, 다중 특이적 항체, 이중 특이적 항체, 촉매적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 항체, 항-유전자형 항체, 및 가용성이거나 결합된 형태로 표지될 수 있는 항체뿐만 아니라, 이의 단편, 변이체 또는 유도체일 수 있는데, 이들은 단독이거나 공지된 기술에 의해 제공될 수 있는 다른 아미노산 서열과 조합될 수 있다. 항체는 임의의 종에서 유래할 수 있다. 항체란 용어는 또한 본 발명의 항체의 결합 단편을 포함하고; 이 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', 단일 나선 항체(svFC), 이량체성 가변 영역(Diabody) 및 디술피드 안정화 가변 영역(dsFV)이 포함된다.
항체와 관련하여 지칭되는 "중화(neutralizing)"라는 용어는, 항체가 표적 항원의 활성을 제거허가나 상당히 감소시키는 능력과 관련된다. 따라서, 항-안지오포이에틴-2 항체의 "중화"는 안지오포이에틴-2의 활성을 제거하거나 상당히 감소시킬 수 있다. 안지오포이에틴-2 항체의 중화는 예를 들어, 안지오포이에틴-2의 그의 수용체인 Tie-2에의 결합을 차단함으로써 작용할 수 있다. 이러한 결합의 차단에 의해, Tie-2 매개 신호유도는 상당히 또는 완전히 제거된다. 이상적으로는, 안지오포이에틴-2에 대한 항체의 중화는 혈관신생을 억제한다.
"폴리펩티드(polypeptide)"란 용어는, 본연의 단백질, 단편, 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 의미하는 포괄적인 용어로서 본원에 사용된다. 따라서, 본연의 단백질, 단편 및 유사체는 일종의 폴리펩티드의 종이다. 본 발명에 따라 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로불린 분자 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 카파 또는 람다 경쇄 면역글로불린 분자와 같은 경쇄 면역글로불린과 함께 중쇄 면역글로불린을 포함하는 조합, 및 이의 역의 조합에 의해 형성되는 항체 분자, 및 이의 절편 및 유사체를 포함한다. 본 발명에 따라 바람직한 폴리펩티드는 또한 단독으로 인간 중쇄 면역글로불린 분자 또는 이의 단편을 포함할 수도 있다.
대상과 관련하여 본원에 사용되는 "천연 발생(naturally occurring)"이라는 용어는, 그 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연 상태의 공급원으로부터 단리될 수 있고, 인간에 의해 실험실에서 의도적으로 변형되지 않거나, 다른 방식으로 변형되지 않은 생물체(바이러스를 포함)내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생적이다.
본원에 지칭되는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"란 용어는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드, 또는 변형 형태의 뉴클레오티드 또는 RNA-DNA 이형접합체(hetero-duplex)를 포함하는, 10개 이상의 염기 길이를 갖는 뉴클레오티드로 형성된 고분자 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일 나선 형태의 DNA 및 이중 나선 형태의 DNA를 포함한다.
본원에서 지칭되는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"란 용어는 천연 발생적 뉴클레오티드, 및 천연 발생 연결기 및 비천연 발생 연결기에 의해 함께 연결된 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 염기 또는 그 이하의 길이로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 부분집합(subset)이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드가 10 내지 60개의 염기 길이를 가지고, 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 내지 40개의 염기 길이를 가진다. 올리고뉴클레오티드는 통상, 예를 들어 프로브의 경우, 단일 나선이고; 다만 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 유전자 돌연변이체의 구성에 사용되는 경우에는 이중 나선일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
두 아미노산 서열이, 이들 서열 간에 부분적 또는 완전 동일성이 있는 경우, "상동적(homologous)"이다. 예를 들면, 85% 상동성은 두 서열이 최대 매칭으로 정렬되었을 때 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 갭(gap)(매칭되는 2개의 서열 중 어느 하나에서의 갭)은 최대 매칭에 허용되고; 바람직하게는 갭 길이는 5 이하, 더욱 바람직하게는 2 이하이다. 선택적으로, 또한 바람직하게, 두 단백질 서열 (또는 최소 약 30개 아미노산 길이의 것에서 유래된 폴리펩티드 서열)은, 이의 배열 점수가 ALIGN 프로그램과 돌연변이 데이타 매트릭스(matrix)를 이용하여 5 초과이고, 갭 패널티가 6 이상이면, 상동적(homologous)이라고 본원에 사용된다. 문헌[Dayhoff, M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure 내, pp. 101-110(제5권, National Biomedical Research Foundation(1972)), 및 이 권 내의 추록 2, pp. 1-10]를 참조한다. ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 정렬되었을때, 이들 아미노산이 50% 이상으로 동일하다면, 두 서열 또는 그것의 부분이 보다 바람직하게 상동적이다. 상동 유전자 서열 내의 상동성의 다른 부분이 있을 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들면, 마우스 및 인간 상동 유전자(orthologue)의 기능적 영역은 비기능적 영역보다 더 높은 상동성 정도를 가질 수 있다.
본원에 사용되는 통상의 20개 아미노산과 이의 약어들은 통상적인 용법을 따른다. 본원에 참조로 인용되는 문헌 [Immunology -A Synthesis(제2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991))]을 참조한다. 상기 통상적인 20개 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산), α-, α-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 등의 비천연 아미노산, 및 다른 비통상적 아미노산은 본 발명의 폴리펩티드의 적절한 구성성분일 수 있다. 비통상적 아미노산의 예에는, 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루탐산, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, δ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드의 명명법에서는, 표준 용법과 협정에 따라, 왼손 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른손 방향은 카르복시 말단 방향이다.
마찬가지로, 달리 특정하지 않는 한, 단일 나선 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 말단은 5' 말단이고; 이중 나선 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 미성숙(nascent) RNA 전사체의 5'에서 3' 방향으로의 부가는 전사 방향을 나타내고; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 나선 상의 5' 말단에서 RNA 전사체의 5' 말단까지의 서열 영역은 "업스트림(upstream) 서열"을 나타내며; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 나선 상의, 3' 말단에서 RNA 전사체의 3' 말단까지의 서열 영역은 "다운스트림(downstream) 서열)"을 나타낸다.
본원에 논의된 바와 같이, 항체와 면역글로불린 분자의 아미노산 서열 내의 작은 변동은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 구상되고, 단 아미노산 서열 내의 상기 변동은 본원에 기재된 항체 또는 면역글로불린에 대해 최소 75%, 바람직하게는 최소 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%의 서열 동일성을 유지한다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 구상된다. 보존적 치환은, 관련 측쇄를 가지는 아미노산의 부류 내에서 일어나는 치환이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 하기 부류들로 나뉜다: (1) 산성=아스파르트산, 글루탐산; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성=알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 보다 바람직한 부류는 다음과 같다: 세린과 트레오닌은 지방족 히드록시 부류이고; 아스파라긴과 글루타민은 아미드-함유 부류이고; 알라닌, 발린, 루이신, 및 이소루이신은 지방족 부류이며; 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 방향족 부류이다. 예를 들어, 루이신은 이소루이신이나 발린으로, 아스파르트산은 글루탐산으로, 트레오닌은 세린으로 치환되거나, 혹은 아미노산이 구조적으로 연관이 있는 아미노산으로 유사하게 치환되는 것이 생성되는 분자의 결합기능 또는 성질에 주요한 영향을 주지 않을 것이며, 특히 치환이 프레임워크(framework) 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는다면 더욱 그러할 것이라고 합당히 예상된다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 야기하는지의 여부는, 폴리펩티드 유도체의 비활성을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 검정법은 본원에 상세히 기재되어 있다. 항체나 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편과 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시-말단은 기능 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 공공 또는 자산의 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게, 컴퓨터 이용 비교 방법을, 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프(motif) 또는 예상된 단백질 형태 부위를 확인하는데 사용한다. 공지된 3차원 구조로 접힌 단백질 서열을 확인하는 방법이 알려져 있다(Bowie et al., Science 253:164(1991)). 따라서, 전술한 예들은, 당업자라면 본원에 기재된 항체에 따라, 구조적 및 기능적 부위를 정의하는 데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있다는 것을 입증한다.
바람직한 아미노산의 치환은 하기와 같은 치환들이다: (1) 단백질 분해에의 민감성 감소, (2) 산화에의 민감성 감소, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화도 변경, (4) 결합 친화도 변경, 및 (4) 상기와 같은 유사체의 물리화학적 또는 기능적 성질 부여 또는 변경. 유사체는 천연 발생 펩티드 서열 이외의 각종 돌연변이 단백질(mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 또는 다수의 아미노산의 치환(바람직하게는, 보존적 아미노산 치환)은 천연 발생 서열에서 일어날 수 있다(바람직하게, 분자내 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드에서 일어날 수 있다). 보존적 아미노산 치환은 모체(parent) 서열의 구조적 특징을 실질적으로 바꾸지 않아야 한다(예를 들어, 치환 아미노산은 모체 서열 내에 일어나는 나선을 파괴하거나, 모체 서열을 특징화하는 다른 유형의 이차 구조를 붕괴하지 않는 경향이 있어야 한다). 당업계에 인식되는, 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예가 본원에 참조로 인용되는 문헌 [Proteins , Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984))]; [Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991))]; 및 [Thornton et al., Nature 354: 105(1991)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 "폴리펩티드 단편"이라는 용어는 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실이 있는 폴리펩티드로서, 남아 있는 아미노산 서열이, 예를 들어 전장 cDNA 서열에서 유추되는 천연 발생 서열에서 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 전형적으로 최소 5, 6, 8, 또는 10개 아미노산 길이, 바람직하게는 최소 14개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 최소 20개 아미노산 길이, 통상적으로는 최소 50개 아미노산 길이, 가장 바람직하게는 최소 70개 아미노산 길이를 가진다. 본원에 사용된 "유사체(analog)"라는 용어는 최소 25개 아미노산의 단편으로 이루어진 폴리펩티드로서, 추론된 아미노산 서열의 부분에 대해 실질적 동일성을 가지고 하기 특징들 중 하나 이상을 가지는 폴리펩티드를 의미한다: (1) 적당한 결합 조건 하에서의 안지오포이에틴-2에 대한 특이적 결합, (2) 적절한 안지오포이에틴-2 결합 차단 능력, 또는 (3) 안지오포이에틴-2 활성 억제 차단. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연 발생 서열에 대하여 보존적 아미노산 치환 (혹은 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 최소 20개 아미노산 길이, 바람직하게는 최소 50개 아미노산 길이 이상을 가지고, 종종 전장 천연 발생 폴리펩티드 정도의 길이를 가질 수 있다.
펩티드 유사체는 통상적으로 제약 산업에서 흔히 주형 펩티드의 성질과 유사한 성질을 갖는 비펩티드 약물로 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물은 "펩티드 모방체(peptide mimetic)" 또는 "펩티도모방체(peptidomimetic)"라 불리운다. 본원에 참조로 인용되는 문헌 [Fauchere, J. Adv . Drug Res . 15:29(1986)]; [Veber and Freidinger TINS p. 392(1985)]; 및 [Evan et al. J. Med . Chem . 30:1229(1987)]을 참조한다. 그러한 화합물은 종종 컴퓨터 이용 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동일한 치료적 또는 질병 예방적 효과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(paradigm polypeptide)(즉, 생화학적 성질 또는 약학적 활성을 가지는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하나, 당 분야에 공지된 방법에 의해, 하기의 것들로 구성된 군으로부터 선택되는 연결기에 의해 임의적으로 치환된 하나 이상의 펩티드 연결기를 가진다: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CH2SO--. 동일 유형의 D-아미노산으로 일치 서열의 하나 이상의 아미노산을 계통적으로 치환(예를 들어, L-리신 대신 D-리신을 치환함)은, 보다 안정적인 펩티드 생성에 사용될 수 있다. 또한, 일치 서열 또는 충분하게 동일한 일치 서열 변동을 포함하는 구속적 펩티드(constrained peptide)는 당 분야의 공지된 방법에 의해, 생성될 것이고(본원에 참조로 인용되는 문헌 [Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387(1992)] 참조); 예를 들어, 내부의 시스테인 잔기의 부가에 의해, 펩티드를 고리화하는 분자 내에 디술피드 가교를 형성할 수 있다.
항체의 "결합 단편(binding fragment)" 은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 비변형 항체의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성된다. 결합 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 단쇄 항체가 포함된다. "이중 특이적(bispecific)" 또는 "이중 기능적(bifunctional)"항체가 아닌 항체는 각각의 동일한 결합 부위를 가지고 있는 것으로 이해된다. 항체는, 과다 항체가 상대-수용체(counter-receptor)에 결합하는 수용체의 양을 최소 약 20%, 40%, 60%, 또는 80%, 보다 통상적으로는 약 85% 초과만큼 감소시킬 때(시험관내 경쟁적 결합 검정법으로 측정), 수용체의 상대-수용체에의 결합을 실질적으로 억제한다.
"에피토프(epitope)"라는 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정자(determinant)를 포함한다. 에피토프성 결정자는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성을 가지는 표면 그루핑(grouping)으로 이루어지고, 항상은 아닐지라도 특정 3차원 구조적 특성뿐만 아니라, 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 항체는 해리 상수(dissociation constant)가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤100 nM, 가장 바람직하게는 ≤10 nM일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 언급된다.
"작용제(agent)"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터의 추출물을 의미하기 위해 본원에 사용된다.
안지오포이에틴-1 또는 안지오포이에틴-2 폴리펩티드와 관련한, "활성의(active)" 또는 "활성(activity)"이라는 용어는 본연의 폴리펩티드에 따른 생물학적 또는 면역학적 활성을 가지는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 본원에서 사용되는 "생물학적(biological)"이란 용어는 본연의 폴리펩티드의 활성으로부터 비롯되는 생물학적 기능을 의미한다. 예를 들어, 바람직한 안지오포이에틴-2 생물학적 활성은 안지오포이에틴-2 유도 혈관신생을 포함한다.
"포유동물(mammal)"이란 모든 포유동물들을 지칭하나, 바람직하게는 포유동물은 인간이다.
파파인 효소에 의한 항체의 분해는, 항원-결합 활성을 가지지 않지만, 결정화할 수 있는 능력은 가지고 있는 "Fab" 단편 및 "Fc" 단편으로도 알려진 두 개의 동일한 항원-결합 단편을 초래한다. 펩신 효소에 의한 항체의 분해는 항체 분자의 두 팔이 연결된 채로 남아 있고, 두-항원 결합 부위를 포함하는 F(ab')2 단편을 초래한다. F(ab')2 단편은 항원을 가교하는 능력을 가진다.
본원에 사용되는 "Fv"란, 항원-인식 및 항원-결합 부위 모두를 보유하는 항체의 최소 단편을 의미한다.
본원에 사용되는 "Fab"란, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 의미한다.
"mAb"라는 용어는 단클론성 항체를 의미한다.
본원에 사용되는 "리포좀(liposome)"이라는 용어는 본 발명의 안지오포이에틴-2 폴리펩티드, 또는 안지오포이에틴-2 폴리펩티드에 대한 항체를 포함할 수 있는 약물의 포유동물로의 전달에 유용한 작은 소포를 의미한다.
본원에 사용되는 "표지(label)" 또는 "표지된(labeled)"이라는 용어는, 폴리펩티드에 검출가능한 부분, 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 화학발광 표지 또는 비오티닐기를 부가함을 의미한다. 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종은 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 131I를 포함할 수 있고, 형광 표지는 로다민, 란탄족 형광체 또는 FITC를 포함할 수 있으며, 효소 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 "약학적 작용제 또는 약물"이라는 용어는, 환자에 적절히 투여하였을 때, 원하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물, 조합물 또는 조성물을 의미한다. (본원에 참조 인용되는) 문헌 [The McGraw - Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985))]에 예시된 바와 같은 다른 화학적 용어들이 이 분야의 통상적인 용법에 따라 본원에 사용된다.
"환자(patient)"라는 용어는 인간 및 수의학적 대상을 포함한다.
이제 본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 설명될 것이며, 이 실시예는 단지 설명하기 위한 목적으로만 제공된 것으로, 하기와 같은 본원의 교시 내용을 제한하고자 함은 아니다.
도 1a는 A431 이종이식편(xenograft) 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 VTKI(VEGF 티로신 키나제 억제제(4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린))을 이용한 처리 후의 조합 효능을 나타낸다.
도 1b는 A431 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 VTKI(VEGF 티로신 키나제 억제제(4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린))을 이용한 조합 처리 후의 숙주 체중 변화에 대 한 영향을 나타낸다.
도 2a는 Colo205 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 VTKI(VEGF 티로신 키나제 억제제(4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린))을 이용한 처리 후의 조합 효능을 나타낸다.
도 2b는 Colo205 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 VTKI(VEGF 티로신 키나제 억제제(4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린))을 이용한 조합 처리 후의 숙주 체중 변화에 대한 영향을 나타낸다.
도 3a은 HT29 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 AZD2171을 이용한 처리 후의 조합 효능을 나타낸다.
도 3b는 HT29 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 AZD2171을 이용한 조합 처리 후의 숙주 체중 변화에 대한 영향을 나타낸다.
도 4a는 LoVo 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 작티마TM를 이용한 처리 후의 조합 효능을 나타낸다.
도 4b는 LoVo 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 작티마TM를 이용한 조합 처리 후의 숙주 체중 변화에 대한 영향을 나타낸다.
도 5a는 SW620 결장 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 mAb DC101을 이용한 처리 후의 조합 효능을 나타낸다.
도 5b는 SW620 결장 이종이식편 종양을 갖는 마우스에 있어서, mAb 3.19.3 및 mAb DC101을 이용한 조합 처리 후의 숙주 체중 변화에 대한 영향을 나타낸다.
실시예 1: 항체 생성
면역화
R&D 시스템즈(R&D Systems)로부터 입수한 재조합 인간 안지오포이에틴-2(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, 카탈로그 No. 623-AM/CF)을 항원으로 사용하였다. 제노마우스
Figure 112008046490870-pct00004
마우스(제노마우스 균주 XMG2 및 XMG4(3C-1 균주), 아브제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재))를 순차적으로 면역화하여, 안지오포이에틴-2에 대한 단클론 항체를 개발하였다. 제노마우스 동물을, 모든 주입을 위해 발바닥(footpad) 경로를 통해 면역화하였다. 각 주입의 총 체적은 마우스 마리당 50 ㎕, 즉, 발바닥당 25 ㎕이었다. 첫 주입은 마우스 마리당, 발열 물질 불포함 둘베코 PBS(DPBS)에 용해시킨 2.35 μg의 재조합 인간 안지오포이에틴-2(rh안지오포이에틴-2, 카탈로그# 623-AM/CF; 로트# BN023202A)로 이루어졌고, 이는 10 ㎕의 CpG(15 ㎕의 이뮨이지 마우스 어쥬번트(ImmunEasy Mouse Adjuvant)(카탈로그# 303101; 로트 #11553042; 키아겐(Qiagen))와 1:1 체적으로 혼합하여 사용하였다. 발열 물질 불포함 DPBS 내 2.35 μg의 rh안지오포이에틴-2를, 25 ㎕의 Adju-Phos(인산알루미늄 젤, 카탈로그# 1452-250, 배치 #8937, HCI 바이오섹터(Biosector)) 및 10 μg의 CpG를 혼합하여, 후속하는 6회 부스트(boost)를 행하였고, 이어서 어쥬번트 없이 발열 물질 불포함 DPBS 내 2.35 ㎕의 rh안지오포이에틴-2만의 최종 부스트를 행하였다. 이 프로토콜을 위해 제노마우스 마우스를 0, 3, 6, 10, 13, 17, 20 및 24일에 면역화하였고, 융합은 29일에 행해졌다.
적정에 의한 수확을 위한 동물의 선택
면역화된 제노마우스 마우스로부터의 혈청 내 항-안지오포이에틴-2 항체의 적정은 ELISA에 의해 결정되었다. 간단히 설명하면, 항원 코팅 완충액(0.1 M 탄산 완충액, pH 9.6 NaHCO3 8.4 g/l)에서, 재조합 안지오포이에틴-2(1 μg/ml)로 코스타르 랩코트 유니버셜 바인딩 폴리스티렌(Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene) 96웰 플레이트(코닝(Corning)(미국 메사츄세츠주 액톤 소재))를 4℃에서 하룻밤 동안 도포하였다. 다음 날, 플레이트를 바이오텍(Biotek) 플레이트 세정기를 이용하여 세정 완충액(1×PBS 내 0.05% 트윈-20)으로 3회 세정하였다. 이어서, 플레이트를 웰 당 200 ㎕의 차단 완충액(1×PBS 내 0.5% BSA, 0.1% 트윈-20, 0.1% 티메로살(Thimerosal))로 차단(blocking)하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 동안 차단(blocking)한 후, 바이오텍 플레이트 세정기를 이용하여 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 안지오포이에틴-2 면역화 제노마우스 마우스 또는 나이브 제노마우스로부터의 혈청을, 1:100의 희석으로부터 2회 반복 실험으로 1:3 희석으로 하여, 0.5% BSA/PBS 완충액에서 역가를 측정하였다. 마지막 웰은 블랭크(blank)로 남겨두었다. 이 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 바이오텍 플레이트 세정기를 이용하여 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(피어스(Pierce)(미국 일리노이주 록포드 소재))가 접합되어 있는 항체를 최종 농도 1 μg/ml로 가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 바이오텍 플레이트 세정기를 이용하여 세정 완충액으로 3회 세정하였다.
세정 후, 플레이트를 TMB 발색기질(BioFx BSTP-0100-01)을 가하여, 10 내지 20분 동안, 또는 음성 대조군 웰이 발색을 나타내기 시작할 때까지 발색시켰다. 이어서, 중지 용액(병 당, 100 ml H2O로 재구성된 TMB(BioFx BSTP-0100-01)에 대한 650 nM 중지 시약)을 첨가하여 ELISA를 중지시켰다. 각 제노마우스 동물의 특징적 역가를 650 nm에서의 광학 밀도로부터 결정하였다.
림프구의 회수, B-세포의 단리, 융합, 하이브리도마의 생성
면역화 마우스를 경추분리법에 의해 사망시키고, 배수 림프절을 수집하고, 각 코호트(cohort)로부터 풀링하였다. 림프양 세포들을, DMEM에서 분쇄하여 조직으로부터 세포를 방출시킴으로써 분리시키고, 세포를 DMEM에 현탁시켰다. 세포를 계수하고, 세포 펠렛에 부가된 1억개 림프구 당 0.9 ml의 DMEM을 가하여, 세포를 완만히, 단 완전히 재현탁시켰다. 1억개의 세포 당 100 ㎕의 CD90+의 자기 비드를 이용하여, 세포를 자기 비드와 함께 4℃에서 15분간 인큐베이션함으로써, 세포를 표지화하였다. 108개 이하의 양성 세포(또는 2×109개 이하의 총 세포)를 포함하는 자기 표지 세포 현탁액을 LS+ 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 DMEM으로 세정하였다. 총 유출물을 CD90-음성 분획으로서 수집하였다(이 세포들 대부분은 B 세포인 것으로 예상되었다).
상기로부터의 세정된 풍부한 수의 B 세포와 ATCC로부터 구매한 비분비성 흑 색종 P3X63Ag8.653 세포(카탈로그# CRL-1580)(Kearney et al., J. Immunol. 123:1548-1550, 1979)를 1:1의 비로 혼합함으로써 융합을 수행하였다. 세포 혼합물을 800×g로 원심분리하여 완만히 펠렛화하였다. 상등액을 완전히 제거한 후, 세포를 2 내지 4 ml의 프로나제 용액(Pronase solution)(칼바이오켐(CalBiochem), 카탈로그# 53702; PBS 내 0.5 mg/ml)으로 2분 이하 동안 처리하였다. 이어서, 3 내지 5 ml의 우태아 혈청(FBS)을 가하여 효소의 활성을 중지하고, 현탁액을 전기세포융합 용액(electro cell fusion solution)(ECFS, 0.3 M 수크로즈, 시그마(Sigma), 카탈로그# S7903, 0.1 mM 아세트산마그네슘, 시그마, 카탈로그# M2545, 0.1 mM 아세트산칼슘, 시그마, 카탈로그# C4705)을 이용하여 총 40 ml의 체적으로 조정하였다. 원심분리 후에 상등액을 제거하고, 40 ml의 ECFS 내에 세포를 재현탁시켰다. 상기 세정 단계를 반복하였고, 세포를 다시 2×106 세포/ml의 농도로 ECFS에 재현탁시켰다.
융합 생성기(fusion generator)(모델 ECM2001, 제네트로닉 인코포레이티드(Genetronic, Inc.)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재))를 이용하여 전기세포융합을 행하였다. 융합 체임버의 크기는 2.0 ml이고, 하기의 기기 설정을 이용하였다:
정렬 조건: 전압: 50 V, 시간: 50초
막 파괴 조건: 전압: 3000 V, 시간: 30μ초
융합후 유지 시간(Post-fusion holding time): 3초
ECF 후, 무균 조건 하에서 세포 현탁액을 조심스럽게 융합 체임버에서 제거하여, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep), OPI(옥살로아세트산염, 피루브산염, 소 알부민)(이 모두 시그마 제품임), 및 IL-6(베링거 만하임(Boehringer Mannheim))으로 보충된 동일 체적의 하이브리도마 배지(DMEM, JRH 바이오사이언시스(JRH Biosciences)), 15% FBS(하이클론(Hyclone))이 담긴 무균관에 옮겼다. 세포를 37℃에서 15분 내지 30분 동안 인큐베이션한 후, 400×g(1000 rpm)으로 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 적은 체적의 하이브리도마 선택 배지(0.5× HA(시그마, 카탈로그# A9666)로 보충된 하이브리도마 배지에 완전히 재현탁하였고, 96웰 플레이트당 총 5×106개 B 세포로, 웰당 200 ㎕의 양으로 최종 플레이팅함을 기준으로 하여, 더욱 많은 하이브리도마 선택 배지를 가하여 체적을 조정하였다. 세포를 조심스럽게 혼합하고, 96웰 플레이트에 분주하여, 성장하도록 하였다. 7 또는 10일째에, 배지의 절반을 제거하고, 세포에 새로운 하이브리도마 선택 배지로 다시 공급하였다.
ELISA 에 의한 후보 항체의 선택
14일간의 배양 후, 안지오포이에틴-2-특이적 단클론 항체에 대해 하이브리도마 상등액을 스크리닝하였다. ELISA 플레이트(피셔(Fisher), 카탈로그 No. 12-565-136)를 웰당 50ml의 도포 완충액(0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.6, NaHCO3 8.4 g/dl) 내의 인간 안지오포이에틴-2(2 μg/ml)으로 도포한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세정 완충액(PBS 내 0.05% 트윈-20)으로 3회 세정하였다. 웰당 200 ㎕의 차단 완충액(1×PBS 내 0.5% BSA, 0.1% 트윈 20, 0.01% 티메로살)을 가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 웰당 50 ㎕의 하이브리도마 상등액, 및 양성 대조군 및 음성 대조군을 첨가하여, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 전반에 걸쳐 사용된 양성 대조군은 안지오포이에틴-2로 면역화된 제노마우스 마우스로부터의 혈청(XMG2 안지오포이에틴-2 1군, 발바닥(fp)L160-7)이었고, 음성 대조군은 KLH로 면역화된 제노마우스 마우스의 혈청(XMG2 KLH 1군, 발바닥(fp)L627-6)이었다.
인큐베이션 후, 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 웰당 100 ㎕의 검출 항체 염소 항-huIgGFc-HRP(카탈로그 No. H10507)를 가해, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 두 번째 스크리닝에서는, 첫 번째 스크리닝에서 양성을 나타낸 것들을 두 세트로 스크리닝하였는데, 첫 번째는 hIgG의 검출을 위한 것이고, 두 번째는 인간 Ig 카파 경쇄 검출을 위한 것으로(염소 항-hIG 카파-HRP(서던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology), 카탈로그 No. 2060-05)), 이로써 IgG와 Ig 카파 모두에 대한 완전한 인간 조성임을 입증하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 웰당 100 ㎕의 TMB(BioFX Lab. 카탈로그 No. TMSK-0100-01)를 첨가하여, 플레이트가 (음성 대조군의 웰이 겨우 발색하기 시작할 때까지) 약 10분 동안 발색하도록 하였다. 이어서, 웰당 50 ㎕의 정지 용액(TMB 정지 용액, BioFX Lab. 카탈로그 No. STPR-0100-01)을 첨가하여, 플레트를 ELISA 플레이트 리더에서 450 nm 파장에서 판독하였다. 안지오포이에틴-2에 대한 185개의 완전한 인간 IgG 카파 항체가 있었다.
ELISA 검정법에서 결합된 모든 항체는 안지오포이에틴-1과의 교차 반응하는 것들을 확인하기 위하여, ELISA를 이용하여 안지오포이에틴-1에 대한 역스크리닝(counter screen)할 수 있다. ELISA 플레이트(피셔(Fisher), 카탈로그 No. 12-5650136)를 웰당 50 ㎕의 도포용 완충액(0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.6, NaHCO3 8.4 g/L) 내 재조합 안지오포이에틴-1(2 ㎍/ml, R&D 시스템즈에서 입수, 카탈로그# 293-AN-025/CF)로 도포한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.
항체 식별 번호 및 서열 번호
하기 표 1은 항-안지오포이에틴-2 항체의 식별 번호와 그에 상응하는 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열 번호를 보고한다.
mAb 식별 번호 서열 서열 번호
3.3.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 1
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 2
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 3
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 4
3.19.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 5
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 6
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 7
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 8
3.31.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 9
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 10
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 11
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 12
5.16.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 13
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 14
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 15
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 16
5.28.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 17
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 18
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 19
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 20
5.78.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 21
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 22
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 23
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 24
5.86.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 25
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 26
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 27
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 28
5.88.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 29
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 30
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 31
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 32
5.101.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 33
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 34
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 35
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 36
5.103.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 37
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 38
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 39
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 40
Tie -2에의 안지오포이에틴 -2 결합 억제
상기 논의된 바와 같이, 안지오포이에틴-2는 Tie-2 수용체에 결합함으로써, 그의 생물학적 효과를 발휘한다. 안지오포이에틴-2/Tie-2 결합을 억제한 단클론 항체는 변형 ELISA를 이용한 경쟁 결합 검정법에 의해 확인되었다. 사용된 mAb는 안지오포이에틴-2에 특이적인 하이브리도마 풀의 완전(exhaustive) 상등액 50 ml에서 미세정제(micropurification)하여 수득된 생성물이었다(상기 참조). 96웰 Nunc 임플레이츠(Nunc Immplates)TM를 100 ㎕의 재조합 인간 Tie-2/Fc 융합 단백질(R&D 시스템즈 인코포레이티드, 카탈로그 No. 313-TI-100)로 4 ㎕/ml로 도포하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 스캔(Skan)TM 워셔 300 스테이션(Washer 300 station)(스캐트론(SKATRON))을 이용하여 인산염 완충 염액(PBS)으로 4회 세정하였다. 웰을 100 ㎕의 ABX-차단 완충액(PBS 내 0.5% BSA, 0.1% 트윈, 0.01% 티메로살)으로 1시간 동안 차단하였다.
비오티닐화 재조합 인간 안지오포이에틴-2(R&D 시스템즈 인코포레이티드, 카탈로그 No. BT623)을 100 ng/ml로 각 웰에 100 ㎕/ml의 항 안지오포이에틴-2 mAb의 존재 또는 부재 하에 가하였다. 플레이트를 결합되지 않은 분자들을 세정해 내기 전에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 결합된 비오티닐화 안지오포이에틴-2를, 실온에서 30분 동안 인큐베이션함으로써, 웰당 100 ㎕의 1:200의 비의 스트렙타비딘-HRP 접합체를 이용하여 검출하였다. 2회 세정 후에, 결합된 스트렙타비딘을 HRP 기질(R&D 시스템즈, 카탈로그 No. DY998)에 의해 검출하였다. 플레이트를 30분 동안 인큐베이션한 후, 450 차단 용액(100 ㎕/웰, BioFX, 카탈로그# BSTP-0100-01)을 가하여, 반응을 종료하였다. 450 nm에서의 광 흡광도를 스펙트라맥스 플러스(Spectramax Plus) 판독기로 결정하였다.
안지오포이에틴-2의 10배 몰 과량의 가용성 재조합 Tie-2/Fc 융합 단백질을 양성 대조군으로 사용하였다. 이 농도에서, Tie-2/Fc는 고정화 Tie-2에 대한 안지오포이에틴-2의 결합을 80% 억제하였다. 이를 임의 기준(arbitrary criterion)으로 하여, 175개의 안지오포이에틴-2 결합 mAb 중 74개가 억제 활성을 보였다.
각 하이브리도마는 하기 표준 절차에 의해 제한된 희석 방법을 이용하여 클로닝되었다. 세 개의 시스터 클론(sister clone)이 각 하이브리도마로부터 수집되었다. 각각의 클론에 대해, 상등액을 상술한 바와 같이, ELISA를 이용하여 인간 안지오포이에틴-2에 대한 결합 및 안지오포이에틴-1에 대한 역결합을 시험하여, 각 항체가 안지오포이에틴-2에 대해서만 특이적이라는 것을 확실히 하였다. 완전 상등액 내 IgG의 농도를 결정하고, 각 하이브리도마로부터의 3개의 시스터 클론 중 가장 높은 수율을 가지는 하나의 클론을 IgG 정제를 위하여 스크리닝하였다. 추가 특징화를 위하여, 각 상등액으로부터 0.5 내지 1mg의 IgG를 정제하였다.
안지오포이에틴-2의 Tie-2에 대한 결합에 대한 mAb의 억제 활성을 정량하기 위하여, 상위 후보자로부터 정제된 mAb의 적정량을 경쟁 결합 검정법을 이용하여 결정하였다. mAb의 각각의 농도를 2회 반복 실험하였다. 농도-반응 관계는, 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)TM 그래픽 소프트웨어(비선형, S자형 곡선)를 이용한 곡선 피팅에 의해 확인하였다. 최대 억제(효능; efficacy)와 IC50(강도; potency)를 그 소프트웨어에 의해 계산하였다. 높은 효능 및 강도를 모두 나타내는 10개의 단클론 항체로 선택하였고; 이 mAb들의 효능 및 강도가 표 2에 나와 있다.
항-안지오포이에틴-l/안지오포이에틴-2 mAb의 효능 및 강도
클론 효능* EC50(㎍/ml)
3.31.2 0.3751 0.04169
5.16.3 0.3279 0.08532
5.86.1 0.3844 0.1331
5.88.3 0.4032 0.1557
3.3.2 0.3881 0.1684
5.103.1 0.2317 0.3643
5.101.1 0.3639 0.3762
3.19.3 0.3945 0.7976
5.28.1 0.3892 2.698
5.78.3 0.2621 5.969
* 효능은 mAb(30 ㎍/ml)가 결합한 안지오포이에틴-2와 mAb가 결합하지 않은 안지오포이에틴-2의 비로 나타내었다.
이어서, mAb의 안지오포이에틴-1에 대한 친화도를 측정함으로써, mAb 3.19.3의 안지오포이에틴-1에 대한 교차 반응성을 조사하였다.
비아코어 ( Biacore ) 분석을 이용한 항- 안지오포이에틴 -1 항체 친화도의 결정
mAb의 안지오포이에틴-1에 대한 친화도를 측정함으로써, 항체의 안지오포이에틴-1에 대한 교차 반응성을 추가로 조사하였다. ELISA-이용 역결합에 기재된 바와 같이, 안지오포이에틴-1을 고정화하는 것 대신에, mAb를 CM5 비아코어 칩에 고정하고, 용액 내 안지오포이에틴-1을 주입하여, 온-레이트(on-rate) 및 오프-레이트(off-rate)를 결정하였다. 6가지 mAb, 즉 3.3.2, 3.31.2, 5.16.3. 5.86.1, 5.88.3 및 3.19.3을 시험하였다.
배지 해상 스크린( Medium Resolution Screen )
표지가 없는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR), 바이어코어 2000 기기를 이용하여, 안지오포이에틴-1에 대한 항체 친화도를 측정하였다. 이 목적을 위해, CM5 바이어코어 칩 상의 고밀도 염소 α-인간 항체 표면을 통상의 아민 커플링을 이용하여 제조하였다. 발달 실험을 위하여, 정제된 mAb 클론(3.3.2, 3.31.2, 5.16.3. 5.86.1, 5.88.3 및 3.19.3)을, 100 ㎕/ml BSA를 포함하는 HBS-P 영동 완충액 내 약 2.5 내지 3.5 ㎕/ml로 희석하였다. 각 mAb의 포획 수준은 약 150 RU이었다. 각 포획 주기마다 5분의 세정 과정을 거쳐, mAb 기준선(baseline)을 안정화하였다. 전기영동 완충액에 87.4 nM로 희석된 단일 안지오포이에틴-1 샘플을 모든 포획 표면 상에 1분간 주입하였다. 안지오포이에틴-1이 mAb 3.19.3에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이 실험은 mAb의 포획 수준을 500-600 RU를 족히 넘도록 증가시키고, 380 nM 안지오포이에틴-1을 1분간 주입함으로써 반복하였다. 이 역시 mAb 3.19.3에 안지오포이에틴-1이 결합함이 밝혀졌다.
실시예 2: 조합 연구
소분자 VEGF 티로신 키나제 억제제와 조합된 mAb 3.19.3의 활성을 평가하였다.
A431 및 Colo205 이종이식편 모델에 있어 4-(4- 플루오로 -2- 메틸인돌 -5- 일옥시 )-6- 메톡시 -7-(3- 피페리디노프로폭시 ) 퀴나졸린과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
VTKI 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린과 조합되는 단클론성 항체 3.19.3의 항종양 활성을, A431 및 Colo205 세포주를 각기 이용하여, 인간 피부 편평세포 암종의 이종이식편 모델(연구 A) 및 대장암의 모델(연구 B)에서 평가하였다.
A431 및 Colo205 세포를, 그 세포가 서브-컨플루언스(sub-confluence) 상태에 도달할 때까지, 통상적 방식으로 플라스크에서 배양하였다. 6 내지 8주령 면역결핍 암컷 마우스(Ncr/nu/nu)를 사용하였다. 세포를 수확하여 마트리젤(Matrigel)에 현탁시켰다. 1 내지 5×106개 세포를 함유한 세포 현탁액을 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 마우스를 10 내지 15마리로 각기 구성된 상이한 군들로 무작위 분류하였다. 종양 체적이 200 mm3에 도달할 때, 마우스를 각 군으로 무작위 분류하고, 처리를 개시하였다. 염액 내 mAb 3.19.3 10 mg/kg을 2주 동안 주당 2회 복강내 주사하였다. 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린을 1% 트윈 80을 함유하는 물 내 1.5 내지 6 mg/kg 범위의 용량으로 매일 경구 처리하였다. 각 종양의 치수를 주당 2회 측정하였다. 종양의 체적을 하기와 같이 계산하였다: 체적=길이×(폭)2×0.5(cm3).
연구 A: A431 인간 종양 이종이식편에 있어 4-(4- 플루오로 -2- 메틸인돌 -5- 일옥시 )-6-메 톡 시-7-(3- 피페리디노프로폭시 ) 퀴나졸린과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
A431 조합물 이종이식편 효능 연구의 결과가 도 1a에 나와 있고, 이는 조합물이 단일 작용제 단독보다 유의하게 더 큰 활성을 생성시킴을 도시한다. 달성되는 % 종양 성장 억제율은 하기와 같다:
3.19.3(10 mg/kg2×주) = 46%; (p<0.01)
4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린(3 mg/kg/일) = 69%; (p<0.0O1)
조합물 3.19.3 + 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린 = 89% 억제율(조합물 대 단일 작용제에 대해, p<0.001).
체중 변화에 의해 결정되는 바, 단일 작용제의 단독 처리에 비해 조합물의 경우에 부가적 독성이 관찰되지 않았다(도 1b). 이 결과는, 항-Ang2 mAb 3.19.3 및 VTKI 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린의 조합 치료가 임상전 모델에 있어 부가적 독성을 나타내지 않으면서 효능의 향상을 가져옴을 입증하고, 이 조합물의 추가 임상 조사를 위한 기초를 제공한다.
연구 B: 인간 Colo205 결장 종양 이종이식편에 있어 4-(4- 플루오로 -2- 메틸인돌 -5- 일옥시 )-6- 메톡시 -7-(3- 피페리디노프로폭시 ) 퀴나졸린과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
Colo205 조합물 이종이식편 효능 연구의 결과가 도 2a에 나와 있고, 이는 조합물이 단일 작용제 단독보다 유의하게 더 큰 활성을 생성시킴을 도시한다. 달성되는 % 종양 성장 억제율은 하기와 같다:
3.19.3(10 mg/kg2×주) = 35%; (p<0.05)
4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린(6 mg/kg/일) = 57%; (p<0.0O1)
조합물 3.19.3 + 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린 = 87% 억제율(조합물 대 단일 작용제에 대해, p<0.001).
체중 변화에 의해 결정되는 바, 단일 작용제의 단독 처리에 비해 조합물의 경우에 부가적 독성이 관찰되지 않았다(도 2b). 이 결과는, 항-Ang2 mAb 3.19.3 및 VTKI 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피페리디노프로폭시)퀴나졸린의 조합 치료가 임상전 모델에 있어 부가적 독성을 나타내지 않으면서 효능의 향상을 가져옴을 입증하고, 이 조합물의 추가 임상 조사를 위한 기초를 제공한다.
인간 HT29 결장 종양 이종이식편에 있어 AZD2171 과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
AZD2171과 조합되는 mAb 3.19.3의 효능을 인간 HT29 이종이식편에서 평가하였다. 간략히, 0.1 ml의 무혈청 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)-1640 배지 내 5×106개 HT29 종양 세포를 60마리의 비흉선(nu / nu 유전자형) 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양의 체적이 200 내지 400 mm3(9-10 일)에 도달할 때, 마우스를 군으로 무작위 분류하였고(군당 8마리), 처리를 개시하였다(0일).
대조군(군 1)에 연속 28일 동안(0일부터 27일까지), 단지 비히클만 매일 경구(p.o.) 투여하였다. 2군 처리는 연속 28일 동안(0일부터 27일까지), 단독 AZD2171을 각 투여당 1.5 mg/kg로 하여 매일 p.o. 투여하는 것으로 이루어졌다. AZD2171을, 1% 폴리소르베이트 80(즉, 탈이온수 내 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트의 1%(v/v) 용액) 내 현탁액으로서 제조하였다. 3군에는, 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 각 주사당 1O mg/kg으로 하여 mAb 3.19.3을 8회 복강내 (i.p) 주사하였다. 4군에는, 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 각 주사당 1O mg/kg으로 하여 mAb 3.19.3을 8회 i.p. 투여함과 더불어, 연속 28일 동안(0일부터 27일까지), 각 투여당 1.5 mg/kg으로 AZD2171을 매일 p.o 투여하였다. AZD2171의 투여 체적은 10.0 ml/kg(즉, 20 g 마우스에 대해 200 ㎕)이었다. mAb 3.19.3의 주사액 체적은 10.0 ml/kg(즉, 20 g 마우스에 대해 200 ㎕)이었다.
투약 스케줄
군 처리 조합 약물 용량
(기재 mg/kg/주사)		 투여 경로 처리 회수 처리 회수/일 처리 간격
일수(일)
1 AZD2171의 비히클 0.0 AZD2171 비히클에 대해서는 p.o. 28 p.o. 1 p.o. p.o.에
대해서는 1
2 AZD2171 1.5 AZD2171에 대해서는 p.o. 28 p.o. 1 p.o. p.o.에 대해서는 1
3 3.19.3 10 3.19.3에 대해서는 i.p. 8 i.p. i.p.에 대해서는 3 또는 4
4 AZD2171
+3.19.3		 AZD2171에 대해서는 1.5,
3.19.3에 대해서는 10		 AZD2171에 대해서는 p.o., 3.19.3에 대해서는 i.p. 28 p.o.
8 i.p.		 1 p.o. p.o.에 대해서는 1, i.p.에 대해서는 3 또는 4
좌우양측 베니어 칼리퍼(bilateral Vernier caliper) 측정에 의해 주당 2회 이상 종양 체적(mm3)을 평가하였고, 길이는 종양 횡단의 최장 직경으로 취했고, 폭은 이에 상응하는 수직 길이로 하였으며, 식(π/6)×(길이×폭)×√(길이×폭)을 이용하여 계산하였다. 처리 개시로부터의 성장 억제율은, 대조군과 처리군 간의 종양 체적의 차이를 비교함으로써 평가하였다. 모든 마우스들에 대해, 28일 후에 연구를 중지하였다. 모든 마우스들에 대해, 종양을 절제하여, 연구 종료 시 체중을 기록하였다.
종양 성장에 대한 처리의 영향
처리 28일
대조군 종양 성장 억제율		 P 값
(단측꼬리 2개 샘플 t검정)
AZD2171
(1.5 mg/kg/일 p.o., 0-27일)		 55% 0.0006
3.19.3
(10 mg/kg/일 i.p., 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일)		 40% 0.0001
AZD2171 + 3.19.3 81% <0.0001
도 3a 및 표 4에 설명된 바와 같이, mAb 3.19.3의 AZD2171과의 조합물은, 3.19.3 단독보다 보다 유의하게 큰 종양 성장 억제율을 생성시켰다(단일 작용제 대 조합물에 대해 P<0.0001: 동등한 분산을 가정하는 단측꼬리 2개 샘플 t검정에 의해 유도된 P 값). 체중 변화에 의해 결정되는 바, 단일 작용제의 단독 처리에 비해 조합물의 경우에 부가적 독성이 관찰되지 않았다(도 3b). 이 결과는, 항-Ang2 mAb 3.19.3 및 VEGF 억제제 AZD2171의 조합 치료가 임상전 모델에 있어 부가적 독성을 나타내지 않으면서 효능의 향상을 가져옴을 입증하고, 이 조합물의 추가 임상 조사를 위한 기초를 제공한다.
인간 LoVo 결장 종양 이종이식편에 있어 작티마 TM 와 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
단클론성 항체 3.19.3의 항종양 활성을 결장 직장암의 LoVo 이종이식편에서 평가하였다. 간략히, LoVo 세포를, 그 세포가 서브-컨플루언스 상태에 도달할 때까지, 통상적 방식으로 플라스크에서 배양하였다. 8주령 면역결핍 수컷 NCr 누드 마우스를 사용하였다. 3×106개 세포를 함유한 세포 현탁액을 마우스의 옆구리에 피하 주사하였고, 종양 체적이 200 mm3에 도달한 후, 마우스를 각 군으로 무작위 분류하고, 처리를 개시하였다. 염액 내 mAb 3.19.3 10 mg/kg을 2주 동안 주당 2회 복강내 주사하였다. 작티마TM를 1% 트윈 80을 함유하는 물 내 25 내지 50 mg/kg 범위의 용량으로 매일 경구 처리하였다. 각 종양의 치수를 주당 2회 측정하였다. 종양의 체적을 하기와 같이 계산하였다: 체적=길이×(폭)2×0.5(cm3). 도 4a에 도시된 바와 같이, mAb 3.19.3 및 작티마TM는 단일 작용제로서 LoVo 종양의 성장을 상당히 지연시켰다. 그러나, mAb 3.19.3 및 ZD6474의 조합물은, 종양 억제율로부터의 하기 값에 의해 설명되는 바, 단일 작용제 단독보다 유의적으로 더 큰 효과를 가졌다:
3.19.3(10 mg/kg2×주) = 48%; (p<0.001)
작티마TM(50 mg/kg/일) = 46%; (p<0.001)
조합물 3.19.3 + 작티마TM = 83% 억제율(조합물 대 단일 작용제에 대해 p<0.001).
체중 변화에 의해 결정되는 바, 단일 작용제의 단독 처리에 비해 조합물의 경우에 부가적 독성이 관찰되지 않았다(도 4b). 이 결과는, 항-Ang2 mAb 3.19.3 및 VEGF 억제제 작티마TM의 조합 치료가 임상전 모델에 있어 부가적 독성을 나타내지 않으면서 효능의 향상을 가져옴을 입증하고, 이 조합물의 추가 임상 조사를 위한 기초를 제공한다.
인간 SW620 결장 종양 이종이식편에 있어 mAb DC101 과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
mAb 3.19.3의 항종양 활성을, SW620 대장암 이종이식편 모델에서 VEGFR-2/KDR에 대해 지정된 단클론성 항체 DC101와 조합하여 평가하였다. 간략히, SW620 세포를, 그 세포가 서브-컨플루언스 상태에 도달할 때까지, 통상적 조직 배양 조건 하에서 배양하였다. 8 내지 10주령 면역결핍 수컷 NCr 누드 마우스를 사용하였다. 대략 1×106개 세포를 함유한 세포 현탁액을 마우스의 옆구리에 피하 주사하였고, 종양 체적이 100 mm3에 도달한 후, 마우스를 각 군으로 무작위 분류하고, 처리를 개시하였다. 염액 내 mAb 3.19.3 10 mg/kg을 3주 동안 주당 2회 복강내 주사하였다. 염액 내 mAb DC101 15 mg/kg을 복강내 주사한 후, 3주 동안 주당 2회 동일 스케줄을 적용하였다. 각 종양의 치수를 주당 2회 측정하였다. 종양의 체적을 하기와 같이 계산하였다: 체적=길이×(폭)2×0.5(cm3). 도 5a에 도시된 바와 같이, mAb 3.19.3 및 DC101의 조합물은 단일 작용제 단독보다 유의적으로 더 큰 활성을 나타낸다. 이는 또한 종양 억제율로부터의 하기 값에 의해 설명된다:
3.19.3(10 mg/kg2×주) = 48%; (p<0.03)
DC101(15 mg/kg2×주) = 66%; (p<0.01)
조합물 3.19.3 + DC101 = 93% 억제율(조합물 대 단일 작용제에 대해 p<0.001).
체중 변화에 의해 결정되는 바, 단일 작용제의 단독 처리에 비해 조합물의 경우에 부가적 독성이 관찰되지 않았다(도 5b). 이 결과는, 항-Ang2 mAb 3.19.3 및 항-VEGFR-2 항체 DC101의 조합 치료가 임상전 모델에 있어 부가적 독성을 나타내지 않으면서 효능의 향상을 가져옴을 입증한다. 이 데이터는 아바스틴TM을 포함한 다른 항혈관신생 항체 조합물과 함께 항-Ang2 mAb 3.19.3 처리의 추가 임상 조사를 위한 기초를 제공한다.
인간 종양 이종이식편에 있어 아바스틴 TM 과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
아바스틴TM과 조합되는 단클론성 항체 3.19.3의 항종양 활성을 인간 종양의 이종이식편 모델에서 평가할 수 있다. A431, Colo205, LoVo 또는 기타 세포를, 그 세포가 서브-컨플루언스 상태에 도달할 때까지, 통상적 방식으로 플라스크에서 배양할 수 있다. 모델 개발을 위해 7 내지 10주령 면역결핍 수컷 또는 암컷 NCR 누드 마우스를 사용할 수 있다. 세포를 수확하여 마트리젤에 현탁시킨 후, 각 마우스에 피하 주사할 수 있다. 이어서, 마우스를 8 내지 10마리 마우스를 포함하는 코호트로 무작위 분류할 수 있다. 아바스틴TM 및 mAb 3.19.3을 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다. 각 종양의 치수를 주당 2회 측정할 수 있다. 종양의 체적을, 체적=길이×(폭)2×0.5(cm3)으로, 또는 좌우양측 베니어 칼리퍼 측정에 의해 계산할 수 있고, 길이는 종양 횡단의 최장 직경으로 취했고, 폭은 이에 상응하는 수직 길이로 하였으며, 식(π/6)×(길이×폭)×√(길이×폭)을 이용하여 계산할 수 있다. 처리 개시로부터의 성장 억제율은, 대조군과 처리군 간의 종양 체적의 차이를 비교함으로써 평가할 수 있다.
아바스틴TM 처리와 조합되는 mAb 3.19.3의 조합물은, 단일 작용제 단독보다 유의적으로 보다 큰 종양 성장 억제율을 생성시킬 것으로 예상된다(단일 작용제 대 조합물에 대해 P<0.01: 동등한 분산을 가정하는 단측꼬리 2개 샘플 t검정에 의해 유도된 P 값).
인간 종양 이종이식편에 있어 SU11248 ( 수텐트 ( Sutent )) 또는 BAY43 -9006(소라피닙( Sorafinib ))과 조합되는 mAb 3.19.3의 치료 효능 결정
수텐트 또는 소라피닙과 조합되는 단클론성 항체 3.19.3의 항종양 활성을 인간 종양의 이종이식편 모델에서 평가할 수 있다. HT29, A431, Colo205, LoVo 또는 기타 세포를, 그 세포가 서브-컨플루언스 상태에 도달할 때까지, 통상적 방식으로 플라스크에서 배양할 수 있다. 모델 개발을 위해 7 내지 10주령 면역결핍 수컷 또는 암컷 NCR 누드 마우스를 사용할 수 있다. 세포를 수확하여 마트리젤에 현탁시킨 후, 각 마우스에 피하 주사할 수 있다. 이어서, 마우스를 8 내지 10마리 마우스를 포함하는 코호트로 무작위 분류할 수 있다. 수텐트 및 mAb 3.19.3을 하기 표에 따라 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다.
군 화합물 스케줄 용량(mg/kg) 동물 수
1 비히클 b.i.d.×21 10
2 3.19.3 3주간 2×/주 10 9
3 수텐트 b.i.d.×21 40 9
4 수텐트 b.i.d.×21 80 9
5 수텐트
3.19.3		 b.i.d.×21
3주간 2×/주		 40
10		 9
6 수텐트
3.19.3		 b.i.d.×21
3주간 2×/주		 80
10		 9
각 종양의 치수를 주당 2회 측정할 수 있다. 종양의 체적을, 체적=길이×(폭)2×0.5(cm3)으로, 또는 좌우양측 베니어 칼리퍼 측정에 의해 계산할 수 있고, 길이는 종양 횡단의 최장 직경으로 취했고, 폭은 이에 상응하는 수직 길이로 하였으며, 식(π/6)×(길이×폭)×√(길이×폭)을 이용하여 계산할 수 있다. 처리 개시로부터의 성장 억제율은, 대조군과 처리군 간의 종양 체적의 차이를 비교함으로써 평가할 수 있다.
수텐트 또는 로라피닙과 조합되는 mAb 3.19.3의 조합물은 단일 작용제 단독보다 유의적으로 보다 큰 종양 성장 억제율을 생성시킬 것으로 예상된다(단일 작용제 대 조합물에 대해 P<0.01: 동등한 분산을 가정하는 단측꼬리 2개 샘플 t검정에 의해 유도된 P 값).
표 1에 열거된 단클론성 항체의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 하기에 나와 있다.
항- Ang -2 단클론성 항체 3.3.2
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAAGGTATAGCAGTGGCTGGGCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCC(서열번호 1)
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGIAVAGPFDYWGQGTLVTVSSA(서열번호 2)
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGACTGTTAGCAGCGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCATTAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTCCTGTCAGCAGTATTATAACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA(서열번호 3)
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQTVSSDLAWYQQKPGQAPRLLIYGASIRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYSCQQYYNWWTFGQGTKVEIKR(서열번호 4)
항- 안지오포이에틴 -2 단클론성 항체 3.19.3
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCACTAACTATGGCATGCACTGGGGCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCACATGATGGAAATAATAAGTATTATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAATCGATTTTTGGAGTGGCCTCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCC(서열번호 5)
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTNYGMHWGRQAPGKGLEWVAVISHDGNNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIDFWSGLNWFDPWGQGTLVTVSSA(서열번호 6)
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTACCGGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTGTGGTGCATCCAGCTGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGTAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGTTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGA(서열번호 7)
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSITGSYLAWYQQKPGQAPRLLICGASSWATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSSSPITFGQGTRLEIKR(서열번호 8)
항- Ang -2 단클론성 항체 3.31.2
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGACAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCGAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTTTTACTGTGCGAGAGATATGGGCAGTGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCC(서열번호 9)
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSDKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLRMNSLRAEDTAVFYCARDMGSGWFDYWGQGTLVTVSSA(서열번호 10)
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAAGTAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGCTGTCAGCAGTATAATCACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA(서열번호 11)
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EVVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYCCQQYNHWWTFGQGTKVEIKR(서열번호 12)
항- Ang -2 단클론성 항체 5.16.3
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
CAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTTCTATATGTACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTAGTGGCACAAACCATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGATATAGCAACAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC(서열번호 13)
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGFYMYWVRQAPGQGLEWMGWINPNSSGTNHAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDQDIATAGPFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 14)
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCACCCGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGTGGACGTTCGGCCGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA(서열번호 15)
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWWTFGRGTKVEIKR(서열번호 16)
항- Ang -2 단클론성 항체 5.28.1
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
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항- Ang -2 단클론성 항체 5.78.3
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항- Ang -2 단클론성 항체 5.86.1
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항- Ang -2 단클론성 항체 5.88.3
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항- Ang -2 단클론성 항체 5.101.1
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항- Ang -2 단클론성 항체 5.103.1
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특허, 특허출원, 논문, 교과서 등, 및 이들 내에 인용되는 참고문헌을 비롯한, 본원에 인용되는 모든 참조문헌은, 이미 유효하지 않은 정도로 전체적으로 본원에 참조로 인용된다.
상술된 본 명세서는 당업자들이 본 발명을 수행하기에 충분한 것으로 간주된다. 상술된 발명의 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 소정의 바람직한 실시양태를 구체적으로 설명하고, 본 발명자들이 구상한 최량의 방식을 기술한다. 그러나, 본 명세서에 얼마나 상세히 설명되었는지에 관계없이, 본 발명은 여러 가지 방식으로 수행될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 동등물에 따라서 간주되어야 함이 인지될 것이다.
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Homo sapiens <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ile Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Asp Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe Asp His Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 19 <211> 324 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 19 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc agcaacctag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcattaatta gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcaa tataataact ggccattcac tttcggccct 300 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ggctggaact acgcagacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcagct 378 <210> 22 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Trp Asn Tyr Ala Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 <210> 23 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagttcca acaatcagaa cttcttagct 120 tggtatcagc agaaaccagg acagcctcct aaactgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccaata ttatagtact 300 ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaac ga 342 <210> 24 <211> 114 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Gln Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 25 <211> 366 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 25 caggtgcagc tggtgcagtc cggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctaccata tgtactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gctgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgt gagagatcag 300 ggtatagcag cagctggtcc ctttgactac tggtgccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcagct 366 <210> 26 <211> 122 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 His Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Gln Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Cys 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 27 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gacatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcgcattagc acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagttcct gatctatgct gcatctagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacacta ccccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa acga 324 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 29 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 29 gaggtgcaga tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttaaga agctactgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaggaag acggaagtga gaaataccat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagaa ctcactgttt 240 ctgcaaatga gcagcctgcg agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatatg 300 gaagcatcag ctggcctctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gct 363 <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Glu Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr His Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Glu Ala Ser Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 31 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaaatagtga tgacgcagtc cccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccatc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataattact ggtggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaacg a 321 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 32 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Ile Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 33 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gccacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcttac 240 atggagctga ggaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 ggtagtatac cagtgtctgg tcactttgac tactgggggc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagct 369 <210> 34 <211> 123 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Ser Ile Pro Val Ser Gly His Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 35 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 35 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtcttatc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctttggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcatcag tataataact ggtggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaacg a 321 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ile Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 37 <211> 366 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 37 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaaaaagc ctggggcctc agtcaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactatt tgtactgggt gccacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcag 300 gtcatagcag tagctggtcc ctttgactac tgggcccaag gaaccctggt caccgtctcc 360 tcagct 366 <210> 38 <211> 122 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gln Val Ile Ala Val Ala Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Ala 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 39 gaaacagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagtcacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttatc agcagcttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataatt ggtggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaacg a 321 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (19)

  1. Ang-2/Tie-2 결합을 억제하는, 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성의 항체 길항자와 (i) VEGF-A, 및/또는 (ii) KDR, 및/또는 (iii) Flt1의 생물학적 활성의 길항자의 조합물로서,
    안지오포이에틴-2의 항체 길항자가
    (a) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상 동일성을 갖는 VH 영역, 및
    (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상 동일성을 갖는 VL 영역
    을 포함하는 항체인 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 안지오포이에틴-2의 항체 길항자가
    (a) 서열 번호 6의 아미노산 서열에 대하여 99% 이상 동일성을 갖는 VH 영역, 및
    (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열에 대하여 99% 이상 동일성을 갖는 VL 영역
    을 포함하는 항체인 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 안지오포이에틴-2의 항체 길항자는 보존적 아미노산 치환을 함유하는 것인 조합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 안지오포이에틴-2의 항체 길항자는 오직 CDR 영역 외부에서 보존적 아미노산 치환을 함유하는 것인 조합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 안지오포이에틴-2의 길항자가 완전한 인간 단클론성 항체인 조합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체는
    (a) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및
    (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL 영역
    을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것인 조합물.
  7. 제6항에 있어서, 항체는
    (a) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및
    (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL 영역
    을 포함하는 것인 조합물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, KDR 또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자가 항체인 조합물.
  9. 제8항에 있어서, KDR의 생물학적 활성의 길항자가 DC101인 조합물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, VEGF-A의 생물학적 활성의 길항자가 항체인 조합물.
  11. 제10항에 있어서, VEGF-A의 생물학적 활성의 길항자가 아바스틴(Avastin)인 조합물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, KDR 또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자가 티로신 키나제 억제제인 조합물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, KDR 또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자는 작티마(Zactima)TM, AZD2171, SU11248, SU14813, 바탈라닙(Vatalanib), BAY43-9006, XL-647, XL-999, AG-013736, AMG706, BIBF1120, TSU68, GW786034, AEE788, CP-547632, KRN 951, CHIR258, CEP-7055, OSI-930, ABT-869, E7080, ZK-304709, BAY57-9352, L-21649, BMS582664, XL-880, XL-184 또는 XL-820로부터 선택되는 것인 조합물.
  14. 제13항에 있어서, KDR 또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자는 작티마TM, AZD2171, SU11248 또는 BAY43-9006으로부터 선택되는 것인 조합물.
  15. 제14항에 있어서, KDR 또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자가 작티마TM인 조합물.
  16. 제14항에 있어서, KDR 또는 Flt1의 생물학적 활성의 길항자가 AZD2171인 조합물.
  17. 안지오포이에틴-2의 생물학적 활성, 및 (i) VEGF-A, 및/또는 (ii) KDR, 및/또는 (iii) Flt1 중 어느 하나의 생물학적 활성을 길항하는 데 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항의 조합물을 포함하는 약학 조성물.
  18. 포유 동물에서 혈관신생과 관련된 질환을 치료하기 위한, 제1항 또는 제2항의 조합물의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물.
  19. 포유 동물에서 암을 치료하기 위한, 제1항 또는 제2항의 조합물의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물.
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