JP2017502025A - 肉腫を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、肉腫を治療するための組成物および方法を提供する。その組成物は、IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに結合する抗体ならびにmTOR阻害剤を含む。mTOR阻害剤は、AZD2014またはラパマイシンであってもよい。【選択図】図1
Description
配列表
本願は、アスキーフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。2014年12月16日に作製された前記アスキーコピーは、IGF−110WO1_SL.txtと命名され、サイズが9,921バイトである。
本願は、アスキーフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。2014年12月16日に作製された前記アスキーコピーは、IGF−110WO1_SL.txtと命名され、サイズが9,921バイトである。
肉腫は、骨肉腫および軟部組織肉腫を含む、間葉起源の形質転換細胞に由来する腫瘍である。軟部組織肉腫は20歳未満の小児で5番目に一般的な固形腫瘍であり、横紋筋肉腫が最も一般的なタイプである。骨肉腫は青年期での3番目に一般的ながんであり、その2つの一般的なタイプが骨肉腫およびユーイング肉腫である。肉腫は成人も発症するが、頻度は低めである。
肉腫は、多種多様な組織型を呈し、体内の随所で発生し得る。現在、治療選択肢は手術であり、加えて補助放射線療法が高グレードの不完全に切除された病変に対して選択的に用いられる。化学療法は、利点が限定的であり、再発までの時間を遅延させるが全生存に影響しないことが示されている。
化学療法、手術、および放射線の併用における進歩により、限局性疾患を有する横紋筋肉腫患者の生存が改善されている。1975〜2002年の間での5年生存率は、15歳未満の小児で53%から65%に、また15〜19歳の青年で30%から47%に増加している。しかし、横紋筋肉腫患者では、転移性疾患の転帰不良の予測因子が不明なままであり、併用療法による影響を有意に受けていない。
骨肉腫患者においては、現在の治療選択肢には、診断時に大部分の患者で存在するが検出不能である微小転移疾患に対する手術および化学療法がある。放射線療法は軟部組織肉腫に対する重要な治療であるが、骨肉腫は放射線に対して一様に耐性を示す。併用療法を用いての限局性骨肉腫における治癒率は60〜70%の範囲内であるが、転移性または多巣性疾患を呈する患者は不良な予後を有する。長期生存率が25%未満であることで、骨肉腫は小児がんにおける最も低い生存率のうちの1つを示す。
したがって、肉腫細胞の増殖および生存を低下させ、また肉腫を治療するための組成物および方法が緊急に必要とされている。
下記のように、本発明は、肉腫、特に肉腫内部の増殖する腫瘍細胞(例えばIGF−1/−2によって誘導される)を治療するための組成物および方法を特徴とする。本組成物は、mTOR阻害剤、ならびにIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体を含む。
一実施形態では、本発明は、有効量のmTOR阻害剤、ならびにインスリン様成長因子1(IGF−1)およびインスリン様成長因子2(IGF−2)の少なくとも1つに特異的に結合する有効量の抗体を含む、肉腫を治療するための医薬組成物を示す。一部の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つを中和する。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)を含む。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、配列番号7および配列番号8で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む1つ以上の可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、ハイブリドーマ細胞株7.159.2(ATCC受託番号PTA−7424)によって産生される抗体のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるmTOR阻害剤を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中のmTOR阻害剤はラパマイシンを含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中のmTOR阻害剤はAZD2014を含む。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫からなる群から選択される肉腫を治療するために用いられる。
一実施形態では、本発明は、肉腫細胞の生存または増殖を低下させるための方法を指す。本方法は、少なくとも1つの肉腫細胞を、mTOR阻害剤ならびにIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物に接触させるステップと;医薬組成物と接触した肉腫細胞の生存または増殖および医薬組成物と接触していない肉腫細胞の生存または増殖を測定するステップと;医薬組成物と接触した肉腫細胞の生存または増殖を医薬組成物と接触していない肉腫細胞の生存または増殖と比較するステップとを含み、医薬組成物で治療された肉腫細胞の生存または増殖は、医薬組成物で治療されていない肉腫細胞の生存または増殖と比べて低下する。
一実施形態では、本発明は、被験体における肉腫を治療するための方法であって、mTOR阻害剤ならびにIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、方法に関する。本発明の特定の実施形態では、IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体は、IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つを中和する。
特定の実施形態では、肉腫を治療するための本方法で用いられる抗体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDR1);配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)を含む。本発明の特定の実施形態では、IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体は、配列番号7および配列番号8で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む1つ以上の可変領域を含む。
特定の実施形態では、肉腫を治療するための本方法で用いられるmTOR阻害剤は、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムスのうちの少なくとも1つである。
特定の実施形態では、本発明の方法によって治療される肉腫は、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫のうちの1つ以上である。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、10mg/kg、30mg/kg、または60mg/kgで投与される。一部の実施形態では、本発明の肉腫を治療する方法は、被験体における腫瘍成長を参照に対して少なくとも約10%、25%、50%、75%、またはそれを超えて阻害する。特定の実施形態では、本発明の肉腫を治療する方法は、肉腫細胞の増殖を阻害する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、静脈注射または経口投与によって施される。特定の実施形態では、本発明の治療方法では、抗体およびmTOR阻害剤は、約1時間〜約24時間以内、または約1日〜約3日以内に同時投与される。
一実施形態では、本発明は、ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を有する被験体を治療するための方法を指す。特定の実施形態では、本方法は、有効量のMEDI−573およびラパマイシンを被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本方法は、有効量のMEDI−573およびAZD2014を被験体に投与するステップを含む。
一実施形態では、本発明は、肉腫を治療するためのキットに関する。キットは、有効量のmTOR阻害剤と、IGF−1および/またはIGF−2に特異的に結合する抗体と、肉腫を治療するためのキットを用いるための使用説明書とを含む。本発明の特定の実施形態では、キットは、MEDI−573抗体およびラパマイシンを含む。本発明の特定の実施形態では、キットは、MEDI−573抗体およびAZD2014を含む。
配列表の簡単な説明
配列番号1は、MEDI−573重鎖相補性決定領域1のアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を示す。
配列番号1は、MEDI−573重鎖相補性決定領域1のアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を示す。
配列番号2は、MEDI−573重鎖相補性決定領域2のアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を示す。
配列番号3は、MEDI−573重鎖相補性決定領域3のアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を示す。
配列番号4は、MEDI−573軽鎖相補性決定領域1のアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を示す。
配列番号5は、MEDI−573軽鎖相補性決定領域2のアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を示す。
配列番号6は、MEDI−573軽鎖相補性決定領域3のアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を示す。
本発明は、肉腫を治療し、予防するのに有用な医薬組成物および方法を特徴とする。本発明の肉腫を治療するための医薬組成物は、有効量のmTOR阻害剤ならびにインスリン様成長因子1(IGF−1)およびインスリン様成長因子2(IGF2)の少なくとも1つに特異的に結合する有効量の抗体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つを中和する。本発明はまた、肉腫を有する患者を監視(モニタリング)するための組成物および方法を提供する。
本発明は、少なくとも部分的には、mTOR阻害剤(例えば、AZD2014、ラパマイシン)を組み合わせる場合にIGF−1および/またはIGF−2を中和する抗体が、IGF−1および/またはIGF−2を自己分泌的に分泌する細胞を含むIGF応答性肉腫細胞の増殖、生存を低下させ、ならびに/あるいは細胞死を増加させるのに有用であるという発見に基づく。
MEDI−573は、IGF−1に対する交差反応を伴う、IGF−2に結合する完全ヒトモノクローナル抗体である。MEDI−573は、IGF−1およびIGF−2を中和し、IGF−1RおよびIR−A経路の両方を介したシグナル伝達を阻害する。MEDI−573を発現するハイブリドーマ細胞株(7.159.2)は、2006年3月7日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託され、特許寄託指定番号(Patent Deposit Designation No.)PTA−7424を受けた。本抗体およびその調製物に関する説明は、2011年5月10日に発行された米国特許第7,939,637号明細書(その全体が参照により本明細書に援用される)中に見出される。
他の箇所で説明されるように、大部分の肉腫細胞株がIGF−1RおよびIGF−1を発現するが、IGF−2を分泌するのは、骨肉腫細胞株といくつかの横紋筋肉腫細胞株にすぎない。MEDI−573は、多数の肉腫細胞株のインビトロ増殖を阻害し、ユーイング肉腫細胞株が最も感受性が高い。ここで提示されるデータは、肉腫細胞が分泌型IGF−1およびIGF−2による自己分泌またはパラ分泌成長刺激に応答することを示す。さらに、MEDI−573は、IGF−1およびIGF−2誘導性の肉腫細胞の成長を阻害し、IGF−1およびIGF−2誘導性のIGF−1RおよびAKT経路の活性化を有意に遮断した。MEDI−573による肉腫異種移植片の成長阻害は、IGF−1およびIGF−2リガンドの中和と相関した。
本明細書に記載の通り、MEDI−573はまた、ラパマイシン誘導性のAKT活性化を阻害した。MEDI−573とmTOR阻害剤とを組み合わせた結果、インビボでの抗腫瘍活性が有意に高まった。要するに、そのデータは、mTOR阻害剤(ラパマイシンまたはAZD2014)と組み合わせたMEDI−573によりIGF−1およびIGF−2を阻害した結果、様々な肉腫に対して強力な抗腫瘍活性がもたらされたことを示している。有利には、IGF−1および/またはIGF−2を標的化することは、インスリン機能を撹乱する可能性を有するIGF受容体を標的化することと異なり、mTOR阻害剤と組み合わせて肉腫を治療するのに有用であることが見出されている。したがって、本発明は、肉腫を有するか、あるいは肉腫を発生する、肉腫の再発をきたす、および/または転移性肉腫を発生する傾向を有するような被験体を治療するのに有用である医薬組成物および方法を提供する。特に、本発明の医薬組成物は、ユーイング肉腫および一部の横紋筋肉腫を治療するのに有用である。
インスリン様成長因子(IGF) − IGF−1およびIGF−2
インスリン様成長因子IGF−1およびIGF−2は、細胞増殖、生存、分化、および形質転換の調節に関与する成長因子である。両方のリガンドは、広範に発現され、内分泌、パラ分泌、および自己分泌成長因子として作用する(Pollak,Nat Rev Cancer.2008,8(12):915−28;DeMeyts,BioEssays 2004,26(12):1351−1362,2004;Tao et al.,2007,Nat Clin Pract Oncol.4(10):591−602.;Ryan and Goss,Oncologist.2008,13(1):16−24)。インスリン様成長因子−1およびIGF−2は、インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)およびインスリン受容体Aアイソフォーム(IR−A)への結合を介してそれらの様々な作用を発揮し、IRSタンパク質、Akt、およびMAPK経路を含む複数の細胞内シグナルカスケードを活性化する(Sciacca et al.,Oncogene.1999,18(15):2471−9;Chitnis et al.Clin Cancer Res.2008,14(20):6364−70;Belfiore et al.,Endocr.Rev.2009,30,586−623;Baserga,Future Oncol.2009,5(1):43−50)。IGFリガンドに対する受容体は、IGF受容体1型および2型(IGF−1RおよびIGF−2R)、インスリン受容体AおよびB(IR−AおよびIR−B)、およびハイブリッド受容体(IGF−1R/IR−AおよびIGF−1R/IR−B)を含む。IGF−2RはIGF−2に優先的に結合する。しかし、IGF−2Rは、細胞内キナーゼドメインを欠損しており、細胞シグナル伝達を媒介しない。特定の理論に拘束されないが、IGF−2Rの欠損の結果、おそらくはIGF−1Rに結合するIGF−2の利用性が高まることにより、腫瘍形成能が増大する。IGF−1およびIGF−2の両方は、6つのIGF結合タンパク質(IGFBP−1〜IGFBP−6)のうちの1つに結合された、循環系内の複合体として存在する。第3の分子である酸不安定サブユニットと連結されたIGFBP−3は、循環IGFの大部分を占める複合体を形成する。IGFBPは、IGFに対してその同種受容体よりも高い親和性を有し、IGFを受容体から隔離する力を有する。しかし、他のモデルによると、その結合タンパク質は、循環系内でのその半減期を延長するかまたは細胞表面上の特定の分子に結合するかのいずれかによりIGF活性を増強することができ、したがって、細胞に対して利用可能なIGFの貯蔵所(reservoir)を提供することが示されている。
インスリン様成長因子IGF−1およびIGF−2は、細胞増殖、生存、分化、および形質転換の調節に関与する成長因子である。両方のリガンドは、広範に発現され、内分泌、パラ分泌、および自己分泌成長因子として作用する(Pollak,Nat Rev Cancer.2008,8(12):915−28;DeMeyts,BioEssays 2004,26(12):1351−1362,2004;Tao et al.,2007,Nat Clin Pract Oncol.4(10):591−602.;Ryan and Goss,Oncologist.2008,13(1):16−24)。インスリン様成長因子−1およびIGF−2は、インスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)およびインスリン受容体Aアイソフォーム(IR−A)への結合を介してそれらの様々な作用を発揮し、IRSタンパク質、Akt、およびMAPK経路を含む複数の細胞内シグナルカスケードを活性化する(Sciacca et al.,Oncogene.1999,18(15):2471−9;Chitnis et al.Clin Cancer Res.2008,14(20):6364−70;Belfiore et al.,Endocr.Rev.2009,30,586−623;Baserga,Future Oncol.2009,5(1):43−50)。IGFリガンドに対する受容体は、IGF受容体1型および2型(IGF−1RおよびIGF−2R)、インスリン受容体AおよびB(IR−AおよびIR−B)、およびハイブリッド受容体(IGF−1R/IR−AおよびIGF−1R/IR−B)を含む。IGF−2RはIGF−2に優先的に結合する。しかし、IGF−2Rは、細胞内キナーゼドメインを欠損しており、細胞シグナル伝達を媒介しない。特定の理論に拘束されないが、IGF−2Rの欠損の結果、おそらくはIGF−1Rに結合するIGF−2の利用性が高まることにより、腫瘍形成能が増大する。IGF−1およびIGF−2の両方は、6つのIGF結合タンパク質(IGFBP−1〜IGFBP−6)のうちの1つに結合された、循環系内の複合体として存在する。第3の分子である酸不安定サブユニットと連結されたIGFBP−3は、循環IGFの大部分を占める複合体を形成する。IGFBPは、IGFに対してその同種受容体よりも高い親和性を有し、IGFを受容体から隔離する力を有する。しかし、他のモデルによると、その結合タンパク質は、循環系内でのその半減期を延長するかまたは細胞表面上の特定の分子に結合するかのいずれかによりIGF活性を増強することができ、したがって、細胞に対して利用可能なIGFの貯蔵所(reservoir)を提供することが示されている。
高レベルの循環IGF−1およびIGF−2は、乳がん、前立腺がん、膵臓がんおよび結腸直腸がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、肝細胞がん(HCC)、および肉腫を含む数種の一般的ながんの発生におけるリスクの増大に関連している(Renehan et al.,Lancet.2004,363(9418):1346−53)。またIR−AおよびIGF−2の過剰発現が、IGF−1Rに向けられた治療法に対する耐性を誘導し得る潜在的な機構として提示されている(Hendrickson and Haluska,Curr Opin Investig Drugs.2009,10(10):1032−40;Zhang et al.,2007 Cancer Res.67:391−397)。極めて多数の前臨床試験が、IGF−1R発現の下方制御またはシグナル伝達の遮断がインビトロおよびインビボの両方で腫瘍成長の阻害を誘導することを報告している(Ryan and Goss,Oncologist.2008,13(1):16−24;Sachdev and Yee,Mol Cancer Ther.2007,6(1):1−12;Baserga,Expert Opin Ther Targets.2005,9(4):753−68)。また、IGFシグナル伝達の阻害が、インビボで腫瘍細胞の化学療法剤に対する感受性を増加させることが示されている(Tao et al.,2007 Nat.Clin.Pract.Oncol.4:591−602;Chitnis et al.,2008,Clin.Cancer Res.14:6364−6370;Ryan and Goss,2008 Oncologist 13:16−24;Yuen and Macaulay,2008 Expert Opin.Ther.Targets 12:589−603)。IR−AおよびIGF−1R受容体の両方の二重阻害は、IGF駆動型のがんに対する治療有効性を増強し得る(Sachdev and Yee,Mol Cancer Ther.2007,6(1):1−12)。
肉腫
肉腫は、骨から発生する骨肉腫、および脂肪、筋肉、神経、線維組織、血管、または深部皮膚組織のような軟部組織から発生する軟部組織肉腫を含む、間葉起源の形質転換細胞に由来する腫瘍である。肉腫は、最も酷似する組織のタイプに基づいて命名される場合がある。例えば、骨肉腫は骨に類似し、軟骨肉腫は軟骨に類似し、脂肪肉腫は脂肪に類似し、また平滑筋肉腫は平滑筋に類似する。肉腫は、限定はされないが、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫を含む。
肉腫は、骨から発生する骨肉腫、および脂肪、筋肉、神経、線維組織、血管、または深部皮膚組織のような軟部組織から発生する軟部組織肉腫を含む、間葉起源の形質転換細胞に由来する腫瘍である。肉腫は、最も酷似する組織のタイプに基づいて命名される場合がある。例えば、骨肉腫は骨に類似し、軟骨肉腫は軟骨に類似し、脂肪肉腫は脂肪に類似し、また平滑筋肉腫は平滑筋に類似する。肉腫は、限定はされないが、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫を含む。
IGF−1RおよびそのリガンドIGF−1およびIGF−2の両方を含む自己分泌ループは、肉腫細胞の増殖および生存を駆動する主要な機構として実証されている(Kim et al.,2009 Bull.Cancer 96(7):52−60)。IGF−1R、IGF−1、またはIGF−2の高発現は、大部分のユーイング肉腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫において示されている。ユーイング肉腫はより多くのIGF−1を分泌し、一方、横紋筋肉腫はより多くのIGF−2を分泌する。IGF−1は、高度に発現され、骨肉腫細胞の成長を刺激する。IGF経路内での遺伝子変異もまた、多数の肉腫腫瘍内で蔓延している。IGF−2遺伝子座でのインプリンティングの消失は一般に胚性RMS内で検出され、キメラ転写因子(PAX3−FKHRまたはPAX7−FKHR)を誘導する遺伝子変化は、肺胞型の横紋筋肉腫におけるIGF−1Rの発現の増大を引き起こす。逆に、IGF−1シグナル伝達のリプレッサーであるインスリン成長因子結合タンパク質3(IGFBP3)を上方制御するEWS−FLI1遺伝子変化を有するユーイング肉腫患者においては、これらの患者は改善された予後を有する。IGFシグナル伝達経路と疾患との関連が強いとの仮定の下、MAbを用いてIGF−1R受容体を阻害する標的化治療アプローチがいくつかのタイプの肉腫において探求されている。これらのIGF−1Rを標的化したMAbは、IGF1Rおよびヘテロ二量体IGF−1R/IRを介したIGF−1およびIGF−2シグナル伝達を阻害するが、IR−Aを介したIGF−2シグナル伝達を阻害しないことから、制限され得る。
ユーイング肉腫
ユーイング肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、およびアスキン腫瘍は、集合的に腫瘍のユーイング肉腫ファミリー(ESFT)と称される腫瘍のグループを形成する。これらの腫瘍は、RNA結合タンパク質EWSのN末端と転写因子のETSファミリーの1つのメンバー、最も一般的にはフレンド白血病インテグレーション1(Friend leukemia integration 1)転写因子(FLI1)のC末端との融合を引き起こす特定の染色体転座によって特徴づけられる。融合産物の発現は、発がんに関与している。
ユーイング肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、およびアスキン腫瘍は、集合的に腫瘍のユーイング肉腫ファミリー(ESFT)と称される腫瘍のグループを形成する。これらの腫瘍は、RNA結合タンパク質EWSのN末端と転写因子のETSファミリーの1つのメンバー、最も一般的にはフレンド白血病インテグレーション1(Friend leukemia integration 1)転写因子(FLI1)のC末端との融合を引き起こす特定の染色体転座によって特徴づけられる。融合産物の発現は、発がんに関与している。
EFST細胞株は、IGF−1Rを発現し、自己分泌ループ内でIGF−1を分泌する。EFST内でのIGF−1R発現の普及度は極めて高く、大部分の細胞株および臨床試料は発現が陽性である。マウス線維芽細胞内では、EWS−FLI1腫瘍性タンパク質は、形質転換のためにIGF−1Rを必要とする。いくつかの証拠によると、無再発生存が血清IGFBP−3対IGF−1の比と相関し得ることが示される。この理論の裏付けとして、EWS−FLI1はIGFBP−3の発現および分泌を直接的に低下させ、外来性IGFBP−3はESFT細胞の成長を阻害する。PI3K/AktおよびMAPKを含む、IGF−1Rの下流経路は、活性化され、ESFT細胞の生存にとって重要である。PI3KおよびMAPKの両方の阻害剤は、ESFT細胞における成長停止を引き起こす。
横紋筋肉腫
横紋筋肉腫は、横紋筋を形成する発生する細胞に起因する、最も一般的な小児の軟部組織肉腫である。IGF−2は正常な筋肉成長に関与し、横紋筋肉腫を有する患者由来の腫瘍生検標本の分析により、高レベルのIGF−2 mRNAの発現が示された。特定の理論に拘束されないが、IGF−2の上方制御は、潜在的にはこれらの腫瘍の制御されない成長における役割を果たす。加えて、横紋筋肉腫細胞株から分泌されるIGF−1RおよびIGF−2の結合が自己分泌成長・増殖および細胞運動性の増大をもたらしたことが観察されている。
横紋筋肉腫は、横紋筋を形成する発生する細胞に起因する、最も一般的な小児の軟部組織肉腫である。IGF−2は正常な筋肉成長に関与し、横紋筋肉腫を有する患者由来の腫瘍生検標本の分析により、高レベルのIGF−2 mRNAの発現が示された。特定の理論に拘束されないが、IGF−2の上方制御は、潜在的にはこれらの腫瘍の制御されない成長における役割を果たす。加えて、横紋筋肉腫細胞株から分泌されるIGF−1RおよびIGF−2の結合が自己分泌成長・増殖および細胞運動性の増大をもたらしたことが観察されている。
IGF−2の過剰発現を生じる、IGF−2遺伝子座のインプリンティングの消失(LOI)を引き起こすエピジェネティック変化が同定されている。さらに、特定の横紋筋肉腫を特徴づけるPAX3−FKHR転座はIGF−1Rプロモーターをトランス活性化し、したがってそれは、IGF経路が横紋筋肉腫の進行において重要な役割を果たすというさらなる証拠を提供する。すべての横紋筋肉腫細胞株は、ある程度のIGF−1Rの発現を示すが、定量的タンパク質分析に基づくと30倍程度の差が生じる場合がある。
骨肉腫
骨肉腫の最高発生率は、青年期の間に生じ、循環GHおよびIGF−1の成長期および最高濃度の両方に対応する。高レベルのIGF−1は、骨肉腫の病因において重要な役割を果たすと思われる。前臨床データは、骨肉腫におけるIGF−1の役割を示している。骨肉腫細胞は細胞表面に機能的IGF−1Rを発現し、また骨肉腫患者試料の大部分がIGFリガンドを発現し、45%がIGF−1Rを発現する。外来性IGF−1が骨肉腫細胞の増殖を刺激し、またIGF−1依存性成長がIGF−1Rに対するモノクローナル抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻害され得る。さらに、ヒト化抗IGF−1R抗体を用いたマウスの処置により、2つの骨肉腫異種移植片モデルにおいて腫瘍縮小が生じた。
骨肉腫の最高発生率は、青年期の間に生じ、循環GHおよびIGF−1の成長期および最高濃度の両方に対応する。高レベルのIGF−1は、骨肉腫の病因において重要な役割を果たすと思われる。前臨床データは、骨肉腫におけるIGF−1の役割を示している。骨肉腫細胞は細胞表面に機能的IGF−1Rを発現し、また骨肉腫患者試料の大部分がIGFリガンドを発現し、45%がIGF−1Rを発現する。外来性IGF−1が骨肉腫細胞の増殖を刺激し、またIGF−1依存性成長がIGF−1Rに対するモノクローナル抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻害され得る。さらに、ヒト化抗IGF−1R抗体を用いたマウスの処置により、2つの骨肉腫異種移植片モデルにおいて腫瘍縮小が生じた。
ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)
ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)は、細胞の成長、増殖、および生存の調節に重要な役割を果たすセリン/トレオニンタンパク質キナーゼである。mTORは、インスリン、成長因子(IGF−1およびIGF−2など)、およびアミノ酸を含む、上流経路からの入力を統合する。mTORはまた、細胞内栄養、酸素、およびエネルギーレベルを感知する。mTOR経路は、ヒト疾患、例えば糖尿病、肥満、抑うつ、および特定のがんにおいて調節不全になる。mTORは、抗真菌剤のラパマイシンに感受性を示すものとして同定された。ラパマイシンは、その細胞内受容体FKBP12と会合することによってmTORを阻害し得る細菌産物である。FKBP12−ラパマイシン複合体は、mTORのFKBP12−ラパマイシン結合(FRB)ドメインに直接結合し、その活性を阻害する。
ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)は、細胞の成長、増殖、および生存の調節に重要な役割を果たすセリン/トレオニンタンパク質キナーゼである。mTORは、インスリン、成長因子(IGF−1およびIGF−2など)、およびアミノ酸を含む、上流経路からの入力を統合する。mTORはまた、細胞内栄養、酸素、およびエネルギーレベルを感知する。mTOR経路は、ヒト疾患、例えば糖尿病、肥満、抑うつ、および特定のがんにおいて調節不全になる。mTORは、抗真菌剤のラパマイシンに感受性を示すものとして同定された。ラパマイシンは、その細胞内受容体FKBP12と会合することによってmTORを阻害し得る細菌産物である。FKBP12−ラパマイシン複合体は、mTORのFKBP12−ラパマイシン結合(FRB)ドメインに直接結合し、その活性を阻害する。
mTORの活性化は、下流のリボソームタンパク質S6キナーゼβ−1(S6K)および真核翻訳開始因子4E−結合タンパク質1(4E−BP1)のリン酸化を誘導する。mTORシグナル伝達は、がん治療法にとって魅力的な治療標的であり続けている。mTOR阻害剤のテムシロリムスおよびエベロリムスは各々、転移性腎細胞がんおよび膵神経内分泌腫瘍の治療用に認可されている。リダフォロリムスは現在、肉腫患者における第III相試験の段階である。しかし、ラパマイシンおよびその誘導体は、S6KとIRS/PI3Kとの間に負のフィードバックを放出することによってAkt活性化を誘導し、結果的にIGF−1Rシグナル伝達を再活性化する。これは、mTOR阻害剤に対する考えられる耐性機構に寄与し、またラパマイシンとIGF経路を標的化する作用物質とを組み合わせることの潜在的利益を示唆している。数種のIGF−1R標的化剤と異なるラパマイシン類似体との組み合わせは、初期相臨床試験の段階である。第1世代のmTOR阻害剤として、限定はされないが、ラパマイシン、テムシロリムス(CCI−779)、エベロリムス(RAD001)、リダフォロリムス(AP−23573)が挙げられる。第2世代のmTOR阻害剤は、mTORの触媒部位においてATPと競合するように設計される。かかるATPと競合的なmTORキナーゼ阻害剤として、限定はされないが、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587が挙げられる。mTOR阻害剤のAZD2014およびラパマイシンの構造は、次のように示される。
抗体
IGF−1/−2に選択的に結合し、かつIGF−1/−2に対する受容体の結合または活性化を阻害する抗体は、本発明の方法において有用である。特定の実施形態では、IGF−1/−2に対する抗体は、インスリンに結合しないかまたはインスリンの生物学的活性を阻害する。
IGF−1/−2に選択的に結合し、かつIGF−1/−2に対する受容体の結合または活性化を阻害する抗体は、本発明の方法において有用である。特定の実施形態では、IGF−1/−2に対する抗体は、インスリンに結合しないかまたはインスリンの生物学的活性を阻害する。
一実施形態では、抗体は組換えモノクローナル抗体である。組換えモノクローナル抗体は、限定はされないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む宿主細胞から調製される。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、組換えモノクローナル抗体はヒト抗体である。さらに別の実施形態では、モノクローナル抗体は、IgA、IgE、IgD、IgE、またはIgG抗体である。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、限定はされないが、IgG1またはIgG2抗体を含むIgG抗体である。
別の実施形態では、抗体は、抗体のFc領域上に少なくとも1つのN−結合グリコシル化部位および抗体のFab領域上に少なくとも1つのN−結合グリコシル化部位を含む。別の実施形態では、抗体は、抗体のFc領域上に1つのみのN−結合グリコシル化部位および抗体のFab領域上に1つのみのN−結合グリコシル化部位(すなわち全部で3つのN−結合グリコシル化部位)を有する。
抗体は、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって作製することができる。
次に、当該技術分野で公知の任意の方法によって作製された抗体は、宿主から精製することができる。抗体精製方法は、塩沈殿(例えば硫酸アンモニウムを用いる)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、好ましくは中性pHで動作し、階段状勾配で増加するイオン強度で溶離する陽イオンまたは陰イオン交換カラム上)、ゲル濾過クロマトグラフィー(ゲル濾過HPLCを含む)、ならびにプロテインA、プロテインG、ヒドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリンなどの親和性樹脂上でのクロマトグラフィーを含んでもよい。
抗体は、抗体を発現するように操作されたハイブリドーマ細胞から好都合に産生することができる。ハイブリドーマを作製する方法は、当該技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞は好適な培地中で培養することができ、また使用済みの培地は抗体供給源として用いることができる。ここで目的の抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、次に抗体はこれらのDNA配列から合成的または組換え的に産生することができる。大量の抗体の産生には、腹水を得ることが一般により便利である。腹水を産生する方法は、一般にハイブリドーマ細胞を免疫学的にナイーブな組織適合性または免疫寛容性のある哺乳動物、特にマウスに注射することを含む。その哺乳動物は、腹水生成のため、好適な組成物(例えばプリスタン)の事前投与により予備刺激してもよい。
本発明の方法によって産生されるモノクローナル抗体(Mab)は、当該技術分野で公知の方法によって「ヒト化」することができる。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリンにより類似するように、その初期形態から改変されている抗体である。抗体をヒト化するための技術は、非ヒト動物(例えばマウス)抗体が作製される場合、特に有用である。マウス抗体をヒト化するための方法の例が、米国特許第4,816,567号明細書、米国特許第5,530,101号明細書、米国特許第5,225,539号明細書、米国特許第5,585,089号明細書、米国特許第5,693,762号明細書および米国特許第5,859,205号明細書に提示されている。
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および/または定常領域を有する抗体に関連する問題の一部を回避する。かかるマウスまたはラット誘導タンパク質の存在は、抗体の急速な排除を引き起こすか、または患者による抗体に対する免疫応答の生成を引き起こし得る。マウスまたはラットに由来する抗体の利用を回避するため、齧歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するように、機能的なヒト抗体遺伝子座の齧歯類、他の哺乳動物または動物への導入を介して完全ヒト抗体を作製することができる。
完全ヒト抗体を作製するための一方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の1000kbサイズ未満の生殖系列で構成される断片を含むように操作されているマウスのXenoMouse(登録商標)株の使用を介するものである。Mendez et al.Nature Genetics 15:146−156(1997)およびGreen and Jakobovits J.Exp.Med.188:483−495(1998)を参照のこと。XenoMouse(登録商標)株は、Abgenix,Inc.(Fremont、CA)から入手可能である。
マウスのXenoMouse(登録商標)株の作製は、1990年1月12日に出願された米国特許出願第07/466,008号明細書、1990年11月8日に出願された米国特許出願第07/610,515号明細書、1992年7月24日に出願された米国特許出願第07/919,297号明細書、1992年7月30日に出願された米国特許出願第07/922,649号明細書、1993年3月15日に出願された米国特許出願第08/031,801号明細書、1993年8月27日に出願された米国特許出願第08/112,848号明細書、1994年4月28日に出願された米国特許出願第08/234,145号明細書、1995年1月20日に出願された米国特許出願第08/376,279号明細書、1995年4月27日に出願された米国特許出願第08/430,938号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,584号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,582号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/463,191号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,837号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,853号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,857号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,859号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,513号明細書、1996年10月2日に出願された米国特許出願第08/724,752号明細書、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号明細書、2001年11月30日に出願された米国特許出願公開第2003/0093820号明細書、ならびに米国特許第6,162,963号明細書、米国特許第6,150,584号明細書、米国特許第6,114,598号明細書、米国特許第6,075,181号明細書、および米国特許第5,939,598号明細書、ならびに日本特許第3068180B2号公報、日本特許第3068506B2号公報、および日本特許第3068507B2号公報にさらに考察され、詳述されている。また、1996年6月12日に付与公開された欧州特許第0463151B1号明細書、1994年2月3日に公開された国際公開第94/02602号パンフレット、1996年10月31日に公開された国際公開第96/34096号パンフレット、1998年6月11日に公開された国際公開第98/24893号パンフレット、2000年12月21日に公開された国際公開第00/76310号パンフレットを参照のこと。上で引用された特許、出願、および参考文献の各々の開示内容は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
他の手法では、GenPharm International,Inc.を含む他社は、「ミニ遺伝子座(minilocus)」手法を利用している。ミニ遺伝子座の手法では、外来性Ig遺伝子座は、Ig遺伝子座由来の断片(個々の遺伝子)の組込みにより模倣される。したがって、1つ以上のVH遺伝子、1つ以上のDH遺伝子、1つ以上のJH遺伝子、μ定常領域、および通常は第2の定常領域(好ましくはγ定常領域)を、動物への挿入のための構築物へと形成する。この手法は、米国特許第5,545,807号明細書(Suraniらに交付)、ならびに米国特許第5,545,806号明細書、米国特許第5,625,825号明細書、米国特許第5,625,126号明細書、米国特許第5,633,425号明細書、米国特許第5,661,016号明細書、米国特許第5,770,429号明細書、米国特許第5,789,650号明細書、米国特許第5,814,318号明細書、米国特許第5,877,397号明細書、米国特許第5,874,299号明細書、および米国特許第6,255,458号明細書(各々、LonbergおよびKayに交付)、米国特許第5,591,669号明細書および米国特許第6,023.010号明細書(KrimpenfortおよびBernsに交付)、米国特許第5,612,205号明細書、米国特許第5,721,367号明細書、および米国特許第5,789,215号明細書(Bernsらに交付)、ならびに米国特許第5,643,763(ChoiおよびDunnに交付)、ならびにGenPharm Internationalの1990年8月29日に出願された米国特許出願第07/574,748号明細書、1990年8月31日に出願された米国特許出願第07/575,962号明細書、1991年12月17日に出願された米国特許出願第07/810,279号明細書、1992年3月18日に出願された米国特許出願第07/853,408号明細書、1992年6月23日に出願された米国特許出願第07/904,068号明細書、1992年12月16日に出願された米国特許出願第07/990,860号明細書、1993年4月26日に出願された米国特許出願第08/053,131号明細書、1993年7月22日に出願された米国特許出願第08/096,762号明細書、1993年11月18日に出願された米国特許出願第08/155,301号明細書、1993年12月3日に出願された米国特許出願第08/161,739号明細書、1993年12月10日に出願された米国特許出願第08/165,699号明細書、1994年3月9日に出願された米国特許出願第08/209,741号明細書(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。また、欧州特許第0546073B1号明細書、国際公開第92/03918号パンフレット、国際公開第92/22645号パンフレット、国際公開第92/22647号パンフレット、国際公開第92/22670号パンフレット、国際公開第93/12227号パンフレット、国際公開第94/00569号パンフレット、国際公開第94/25585号パンフレット、国際公開第96/14436号パンフレット、国際公開第97/13852号パンフレット、および国際公開第98/24884号パンフレット、ならびに米国特許第5,981,175号明細書(これらの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用される)も参照のこと。さらに、Taylor et al.,1992、Chen et al.,1993、Tuaillon et al.,1993、Choi et al.,1993、Lonberg et al.(1994)、Taylor et al.(1994)、およびTuaillon et al.(1995)、Fishwild et al.(1996)(これらの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用される)も参照のこと。
またKirinは、微小核融合(microcell fusion)により、染色体の大型断片、または全染色体が導入されているマウスからのヒト抗体の産生を実証している。欧州特許出願欧州特許第773288号明細書および欧州特許第843961号明細書(これらの開示は参照により本明細書に援用される)を参照のこと。加えて、KirinのTcマウスとMedarexのミニ遺伝子座(Humab)マウスとの交雑育種の結果としてのKM(商標)−マウスが作製されている。これらのマウスは、KirinマウスのヒトIgH導入染色体およびGenpharmマウスのκ鎖導入遺伝子を有する(Ishida et al.,Cloning Stem Cells,(2002)4:91−102)。
ヒト抗体はまた、インビトロな方法によって誘導することができる。好適な例として、限定はされないが、ファージディスプレイ(CAT,Morphosys,Dyax,Biosite/Medarex,Xoma,Symphogen,Alexion(前Proliferon)、Affimed)リボソームディスプレイ(CAT)、酵母ディスプレイなどが挙げられる。
抗体は、本明細書に記載される場合、下記のように、XenoMouse(登録商標)技術の利用により調製された。次に、かかるマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することが可能であり、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生能が欠如している。それを得るために利用される技術は、本明細書の背景セクションに開示される特許、出願、および参考文献に開示されている。しかし、特に、トランスジェニックマウスの作製およびそれに由来する抗体の好ましい実施形態は、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号明細書、および1998年6月11日に公開された国際公開第98/24893号パンフレットおよび2000年12月21日に公開された国際公開第00/76310号パンフレット(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に開示されている。また、Mendez et al.Nature Genetics 15:146−156(1997)(その開示は参照により本明細書に援用される)を参照のこと。
かかる技術を用いることにより、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が作製されている。本質的に、マウスのXenoMouse(登録商標)株は目的の抗原(例えばIGF−17II)で免疫され、リンパ管細胞(B細胞など)は過免疫マウスから回収され、また回収されたリンパ球は、不死ハイブリドーマ細胞株を調製するため、脊髄型細胞株と融合される。これらのハイブリドーマ細胞株は、目的の抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞株を同定するため、スクリーニングされ、選択される。本明細書で提供されるのは、IGF−1/−2に特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を作製するための方法である。さらに、本明細書で提供されるのは、かかる抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、かかる細胞株によって産生される抗体の特徴づけである。
あるいは、B細胞は、ハイブリドーマを作製するために骨髄腫細胞に融合される代わりに、直接的にアッセイすることができる。例えば、CD19+B細胞は、過免疫XenoMouse(登録商標)マウスから単離することができ、また増殖して抗体分泌形質細胞に分化することが可能であり得る。次に、同細胞上清由来の抗体は、IGF−1/−2免疫原に対する反応性についてELISAによりスクリーニングされる。上清はまた、異なる抗体をIGF−17II上の機能的対象ドメインへの結合についてさらにマッピングする場合、IGF−1/−2の断片に対する免疫反応性についてスクリーニングしてもよい。抗体はまた、他の関連のヒトケモカインに対して、またラット、マウス、および非ヒト霊長類、例えばカニクイザルにおいて、種交差反応性を測定するのではなく、IGF−1/−2の相同分子種に対してスクリーニングしてもよい。目的の抗体を含有するウェル由来のB細胞は、ハイブリドーマを個別のウェルまたはプールしたウェルのいずれかから作製することを意図した、融合を含む様々な方法により、あるいはEBVの感染または公知の不死化遺伝子によるトランスフェクションとそれに続く好適な培地へのプレーティングにより、不死化してもよい。あるいは、次に所望される特異性を有する抗体を分泌する単一の形質細胞がIGF−1/−2に特異的な溶血性プラークアッセイを用いて単離される(Babcook et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843−48(1996))。溶解用に標的化される細胞は、好ましくはIGF−1/−2抗原でコーティングされたヒツジ赤血球(SRBC)である。
目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するB細胞培養液の存在下で、プラークの形成は、目的の形質細胞を取り囲むヒツジ赤血球の特異的IGF−1/−2媒介性溶解を示す。プラーク中央部の単一の抗原に特異的な形質細胞は単離することができ、抗体の特異性をコードする遺伝子情報は単一の形質細胞から単離される。逆転写とそれに続くPCR(RT−PCR)を用いて、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするDNAはクローン化することができる。次に、かかるクローン化DNAは、好適な発現ベクター、好ましくはpcDNAなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを有するようなpcDNAベクターにさらに挿入することができる。次に、作製されたベクターは、宿主細胞、例えば、HEK293細胞、CHO細胞にトランスフェクトし、転写を誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地で培養することができる。
一般に、融合されたハイブリドーマによって産生される抗体は、完全ヒトκまたはλ軽鎖を伴うヒトIgG2重鎖であった。本明細書に記載の抗体は、ヒトIgG4重鎖およびIgG2重鎖を有する。抗体はまた、IgGlを含む他のヒトアイソタイプであり得る。抗体は高親和性を有し、固相および液相技術によって測定される場合、典型的には約106〜約1012M以下のKdを有した。少なくとも1011MのKDを有する抗体が、IGF−1/−2の活性を阻害するのに望ましい。
容易に理解されるように、抗IGF−1/−2抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現され得る。特定の抗体をコードする配列用いて、好適な哺乳動物宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、例えばウイルスへの(またはウイルスベクターへの)ポリヌクレオチドのパッケージングおよびウイルス(またはベクター)の宿主細胞への形質導入を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法により、あるいは当該技術分野で公知のトランスフェクション法により、行うことができ、それは米国特許第4,399,216号明細書、米国特許第4,912,040号明細書、米国特許第4,740,461号明細書、および米国特許第4,959,455号明細書(これら特許は参照により本明細書に援用される)で例示される。用いられる形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、原形質融合、電気穿孔、リポソームへの1つもしくは複数のポリヌクレオチドの封入、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを含む。
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で周知であり、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えばHepG2)、ヒト上皮腎臓293細胞、および多数の他の細胞株を含む、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手可能な多数の不死化細胞株を含む。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、構成的IGF−1/−2結合特性を有する抗体を産生するかを判定することにより選択される。
他の実施形態では、本発明は「非従来型抗体(unconventional antibodies)」を提供する。非従来型抗体は、限定はされないが、ナノボディ、線状抗体(Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057−1062,1995)、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、および複数価を有する抗体(例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および五重特異性抗体)を含む。ナノボディは、軽鎖の不在下で完全に機能的であるように進化している天然の重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、従来の抗体の親和性および特異性を有するが、サイズが一本鎖Fv断片の半分にすぎない。その極端な安定性およびヒト抗体フレームワークとの高度な相同性と組み合わされたこの独特の構造の結果は、ナノボディが従来の抗体に接近不能な治療標的に結合できることである。複数価を有する組換え抗体断片は、がん細胞に対する高結合活性および独特の標的化特異性をもたらす。サイズが約60〜100kDaの小分子はより迅速な血中クリアランスおよび急速な組織内取り込みをもたらすことから、これらの多量体scFv(例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体)は、親抗体を超える改善をもたらす。Power et al.(Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy.Methods Mol Biol,207,335−50,2003);およびWu et al.(Anti−carcinoembryonic antigen(CEA) diabody for rapid tumor targeting and imaging.Tumor Targetin、4,47−58,1999)を参照のこと。
非従来型抗体を作製するための様々な技術については記載がなされている。ロイシンジッパーを用いて産生される二重特異性抗体は、Kostelnyらにより記載がなされている(J.Immunol.148(5):1547−1553,1992)。二重特異性抗体技術は、Hollingerらにより記載がなされている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444−6448,1993)。一本鎖Fv(sFv)二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の方法は、Gruberらにより記載がなされている(J.Immunol.152:5368,1994)。三重特異性抗体は、Tuttらにより記載がなされている(J.Immunol.147:60,1991)。一本鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonらによって記載のように(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879−5883,1988)、直接連結されるかまたはペプチドをコードするリンカーにより連結された、VHおよびVLをコードする配列を含む核酸から発現され得る共有結合されたVH::VLヘテロ二量体を含む。また、米国特許第5,091,513号明細書、米国特許第5,132,405号明細書および米国特許第4,956,778号明細書;ならびに米国特許出願公開第20050196754号明細書および米国特許出願公開第20050196754号明細書も参照のこと。
一実施形態では、抗体、例えば米国特許第7,939,637号明細書(その全体が参照により本明細書に援用される)に開示される抗体は、インスリン様成長因子1(IGF−1)との交差反応を伴い、インスリン様成長因子2(IGF−2)に結合する。特定の実施形態では、抗体は、IGF−1との交差反応を伴い、IGF−2に結合し、mAb7.251.3(ATCC受託番号PTA−7422)、mAb7.34.1(ATCC受託番号PTA−7423)、およびmAb7.159.2/MEDI−573(ATCC受託番号PTA−7424)からなる群から選択されるヒトモノクローナル抗体である。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物中の抗体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)を含む。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、配列番号7および配列番号8で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む1つ以上の可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物中の抗体は、ハイブリドーマ細胞株7.159.2(ATCC受託番号PTA−7424)によって産生される抗体のアミノ酸配列を有する。
MEDI−573は、Xenomouse(登録商標)技術を用いて作製され、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞内で作製される完全ヒト免疫グロブリンG2ラムダ(IgG2)抗体である。MEDI−573は、ヒトインスリン様成長因子hIGF−1およびhIGF−2に選択的に結合し、腫瘍細胞内でのインスリン様成長因子IGF−1およびIGF−2媒介性のシグナル伝達を阻害し、それにより腫瘍成長を阻害する。同抗体は、米国特許第7,939,637号明細書(その全体が参照により本明細書に援用される)に記載のように、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合させた可溶性組換えヒトhIGF−1およびhIGF−2で交互に免疫されたマウスから単離された。MEDI−573は2つの軽鎖および2つの重鎖から構成され、全分子量は約151キロダルトンである。
MEDI573は、ヒトインスリン様成長因子(hIGF)−1およびhIGF−2に選択的に結合し、IGF−1およびIGF−2はヒト腫瘍細胞内でのシグナル伝達および増殖を媒介する。MEDI−573は、IGF−1およびIGF−2リガンドを標的にし、それによりIGF媒介性シグナル伝達を阻害する。ヒトがん細胞における非臨床試験によると、MEDI573は、IGF−1RおよびIR−A経路の両方を阻害するその能力のために、広範な抗腫瘍有効性を達成する可能性を有することが示唆される。さらに、MEDI−573は、IGF−1Rを標的にする治験薬で認められる有害な効果であるグルコース恒常性の撹乱を伴うことなく、これを達成する潜在力を有する。インビトロ試験の結果によると、MEDI−573が、ヒトIGF−1RおよびヒトIGF−1/−2のいずれかを発現するようにトランスフェクトされたいくつかの操作されたマウス胚性線維芽細胞NIH−3T3細胞株において、IGF−1およびIGF−2刺激性のIGF−1Rのリン酸化ならびにAktおよびMAPKを含む下流シグナル伝達タンパク質のリン酸化の両方を阻害したことが示されている。さらに、MEDI−573は、これらのシグナル伝達分子の自己分泌リン酸化を阻害した。機能的には、MEDI−573は、いくつもの操作されたNIH3T3およびヒト腫瘍細胞株の成長をインビトロで有効に阻害した。MEDI−573を用いた腫瘍担持マウスのインビボ処置により、hIGFIIおよびヒトインスリン様成長因子1受容体(hIGF−1R)ならびにhIGF−1およびhIGF−1Rを各々過剰発現する、移植されたクローン32(C32)およびクローンP12(P12)腫瘍の成長が有意に阻害された。
治療
がん治療が在宅、診療所、クリニック、病院の外来部門、または病院で実施される場合には常に、治療を提供してもよい。一実施形態では、本発明は、治療としてmTOR阻害剤と組み合わされた抗IGF−1/−2抗体(例えばMEDI−573)の使用を提供する。
がん治療が在宅、診療所、クリニック、病院の外来部門、または病院で実施される場合には常に、治療を提供してもよい。一実施形態では、本発明は、治療としてmTOR阻害剤と組み合わされた抗IGF−1/−2抗体(例えばMEDI−573)の使用を提供する。
医師が治療の効果を精密に観察し、必要とされるあらゆる調整を行うことができるように、治療は一般に病院で開始される。治療期間は、治療中のがんの種類、患者の年齢および状態、患者の疾患のステージおよびタイプ、ならびに患者の身体が治療にいかに応答するかに依存する。薬剤投与は、異なる間隔で(例えば、毎日、毎週、または毎月)実施される場合がある。治療は、患者の身体が健常な新たな細胞を構築し、その力を回復する機会を有するように、休息時間を含む断続的周期でなされる場合がある。
がんの拡散を遅らせるか、がんの成長を遅延させるか、元の腫瘍から身体の他の部分まで拡散している可能性があるがん細胞を殺滅するかまたは停止させるか、がんによって引き起こされる症状を緩和させるか、あるいはがんを初期段階で予防するため、がんのタイプおよびその発生ステージに応じて治療を用いることができる。がんの成長は、制御されることなく進行性があり、正常細胞の増殖を誘発することがないか、または正常細胞の休止を引き起こすことになる条件下で生じる。
上記のように、必要に応じて、本発明の組成物を用いる処置は、増殖性疾患の処置のための治療法(例えば、放射線療法、手術、または化学療法)と組み合わせてもよい。
医薬組成物の製剤化
肉腫を治療するための本発明の組み合わせ(例えば、IGF−1/−2に結合する抗体とmTOR阻害剤)の投与は、他の構成成分と組み合わせて、肉腫の予防、寛解、または低減に有効である治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段によるものでもよい。化合物は、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有されてもよく、また一般に組成物の全重量の1〜95重量%の量で存在する。組成物は、非経口的(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内)投与経路に適した剤形で提供してもよい。医薬組成物は、従来の薬務に従って製剤化してもよい(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)、ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988−1999,Marcel Dekker,New Yorkを参照)。
肉腫を治療するための本発明の組み合わせ(例えば、IGF−1/−2に結合する抗体とmTOR阻害剤)の投与は、他の構成成分と組み合わせて、肉腫の予防、寛解、または低減に有効である治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段によるものでもよい。化合物は、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有されてもよく、また一般に組成物の全重量の1〜95重量%の量で存在する。組成物は、非経口的(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内)投与経路に適した剤形で提供してもよい。医薬組成物は、従来の薬務に従って製剤化してもよい(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)、ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988−1999,Marcel Dekker,New Yorkを参照)。
本発明に記載の医薬組成物は、実質的に投与直後または投与後の任意の所定時刻もしくは期間に活性化合物を放出するように製剤化してもよい。後者のタイプの組成物は、一般に徐放製剤として公知であり、(i)体内で長期間にわたって薬剤の実質的に一定の濃度をもたらす製剤;(ii)所定の遅延時間後、体内で長期間にわたって薬剤の実質的に一定の濃度をもたらす製剤;(iii)所定の期間中、活性物質の血漿レベル中での変動(のこぎり歯状の動力学的パターン)に関連した付随する望ましくない副作用の極小化とともに体内で比較的一定の有効レベルを維持することにより作用を維持する製剤;(iv)例えば肉腫近辺または肉腫内での徐放組成物の空間的配置により作用を局在化する製剤;(v)用量が例えば1週間毎または2週間毎に1回投与されるように便宜的投与を可能にする製剤;ならびに(vi)治療薬を肉腫細胞に送達するような担体または化学的誘導体を用いることにより、増殖性腫瘍細胞を標的化する製剤を含む。一部の用途において、徐放製剤は、日中での頻回投与の必要性を失くし、治療レベルでの血漿レベルを維持する。
対象の化合物の放出速度が代謝速度を上回るような徐放性を得るため、いくつかの方法のいずれも探求可能である。一例では、徐放性は、例えば様々なタイプの徐放組成物およびコーティング剤を含む、様々な製剤パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、投与時、制御された方法で治療薬を放出する医薬組成物中に適切な賦形剤と製剤化される。例として、単回または複数回単位の錠剤またはカプセル組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
本発明の組成物は、薬学的に許容できる希釈剤、担体、または賦形剤中に単位剤形で含まれるように投与してもよい。従来の薬務は、化合物を過剰な細胞増殖によって誘発される疾患を患う患者に投与するのに適した製剤または組成物を提供するように用いてもよい。投与は、患者が症候性である前に開始してもよい。
任意の適切な投与経路を用いてもよく、例えば、投与は、非経口投与、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、点眼、脳室内、肝内、関節内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐剤、または経口投与であってもよい。例えば、治療製剤は、溶液または懸濁剤の形態で経口投与用であってもよく、製剤は、錠剤またはカプセル剤の形態;および鼻腔内製剤用で散剤、点鼻薬、またはエアロゾルの形態であってもよい。上記の任意の適用方法おいて、本発明の組成物は、望ましくは静脈内に投与されるかまたは必要とされるアポトーシス事象の部位に(例えば注射により)適用される。
製剤を作製するための当該技術分野で周知の方法は、例えば、「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」Ed.A.R.Gennaro,Lippincourt Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,2000に見出される。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含有してもよい。化合物の放出を制御するため、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。作用物質を送達するための他の潜在的に有用な非経口送達系は、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームを含む。吸入用製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、あるいは例えば、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、あるいは点鼻の形態でまたはゲルとして投与するための油性溶液であってもよい。
製剤は、疾患または状態に対して治療を施すため、治療有効量(例えば、病的状態を予防するか、排除するか、または低下させる量)でヒト患者に投与することができる。本発明の組成物の好ましい用量は、障害のタイプおよび程度、特定の患者の健康状態全般、賦形剤化合物の配合、およびその投与経路のような変数に依存する可能性が高い。
本明細書に記載の任意の治療におけるヒト用量は、ヒトにおける用量を動物モデルと比べて変更することが当該技術分野で一般的なものであることを当業者が理解している通り、マウスで用いられる化合物の量から外挿することにより、最初に決定することができる。特定の実施形態では、約1mg化合物/Kg体重〜約5000mg化合物/Kg体重;または約5mg/Kg体重〜約4000mg/Kg体重または約10mg/Kg体重〜約3000mg/Kg体重;または約50mg/Kg体重〜約2000mg/Kg体重;または約100mg/Kg体重〜約1000mg/Kg体重;または約150mg/Kg体重〜約500mg/Kg体重で用量が変化し得ることは想定される。他の実施形態では、この用量は、約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000mg/Kg体重であってもよい。他の実施形態では、より高用量を用いてもよく、かかる用量が約5mg化合物/Kg体重〜約20mg化合物/Kg体重の範囲内であってもよいことは想定される。他の実施形態では、用量は、約8、10、12、14、16または18mg/Kg体重であってもよい。当然ながら、用量は、かかる治療プロトコルでは初期臨床試験の結果および特定の患者の必要性に応じて一般的に行われるように、高くまたは低く調節してもよい。
特定の実施形態では、用量は、IGF−1および/またはIGF−2に結合する抗体の少なくとも2回用量を含む。用量は、約1週毎、または約3週毎に分割され、また各用量は、約0.5mg/kg患者体重を上回る抗体量および約50mg kgの患者体重を下回る抗体量を含む。MEDI−573に関する投与は、例えば国際公開第2012068148号パンフレット(その全体が本明細書に援用される)に記載されている。
キット
本発明は、肉腫を治療または予防するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、有効量の抗体および1つ以上のmTOR阻害剤を含有する治療用または予防用組成物を含む。抗体抗体は、IGF−1および/またはIGF−2に特異的に結合することができ、またそれらの活性を阻害し得る。一実施形態では、抗体はMEDI−573であってもよい。一実施形態では、mTOR阻害剤は、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上であってもよい。特定の実施形態では、mTOR阻害剤はラパマイシンである。特定の実施形態では、mTOR阻害剤はAZD2014である。特定の実施形態では、キットは、有効量のMEDI−573およびラパマイシンを単位剤形で含有する治療用または予防用組成物を含む。特定の実施形態では、キットは、有効量のMEDI−573およびAZD2014を単位剤形で含有する治療用または予防用組成物を含む。
本発明は、肉腫を治療または予防するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、有効量の抗体および1つ以上のmTOR阻害剤を含有する治療用または予防用組成物を含む。抗体抗体は、IGF−1および/またはIGF−2に特異的に結合することができ、またそれらの活性を阻害し得る。一実施形態では、抗体はMEDI−573であってもよい。一実施形態では、mTOR阻害剤は、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上であってもよい。特定の実施形態では、mTOR阻害剤はラパマイシンである。特定の実施形態では、mTOR阻害剤はAZD2014である。特定の実施形態では、キットは、有効量のMEDI−573およびラパマイシンを単位剤形で含有する治療用または予防用組成物を含む。特定の実施形態では、キットは、有効量のMEDI−573およびAZD2014を単位剤形で含有する治療用または予防用組成物を含む。
一部の実施形態では、キットは治療用または予防用組成物を含有する無菌容器を含み;かかる容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスター包装、または当該技術分野で公知の他の好適な容器形態であり得る。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または薬剤の保持に適した他の材料で作ることができる。
本発明の抗体は、抗体およびmTOR阻害剤を、肉腫を有するかまたは発生リスクがある被験体に投与するための使用説明書とともに提供してもよい。使用説明書は、一般に肉腫の治療用または予防用組成物の使用についての情報を含んでもよい。他の実施形態では、使用説明書は、以下、すなわち、治療薬の説明;肉腫またはその症状を治療または予防するための投与計画および投与;注意事項;警告;効能;禁忌;過量投与情報;有害反応;動物薬理学;臨床試験;および/または参考文献のうちの少なくとも1つを含む。使用説明書は、容器上に直接印刷するか(存在する場合)、またはラベルとして容器に貼付するか、あるいは別紙、パンフレット、カード、またはフォルダとして容器内にまたは容器とともに供してもよい。
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法を構築し、使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するように示され、また本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
実施例1 肉腫の異種移植片および細胞におけるIGF−1、IGF−2、およびIGF−1RレベルならびにIR−A:IR−B比
小児肉腫(年齢:6か月〜25年)由来の23個の異種移植片中のインスリン様成長因子1(IGF−1)、インスリン様成長因子2(IGF−2)、およびインスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)のmRNAレベルをqRT−PCRにより測定した。これらの分析結果を図1A〜図1Dに示す。図1Aに見られるように、IGF−1のmRNAレベルは、ユーイング肉腫では骨肉腫(p=0.029)および横紋筋肉腫(p=0.0024)よりも有意に高いことが見出された。それに対し、図1Bに見られるように、IGF−2のmRNAレベルは、横紋筋肉腫ではユーイング肉腫(p=0.0005)および骨肉腫(p=0.0066)よりも有意に高いことが見出された。図1Cに示すように、肉腫の3つのサブタイプ全部がIGF−1RのmRNAを高レベルで発現した。アッセイ対象の肉腫異種移植片試料の大部分が、インスリン受容体Aアイソフォーム 対 インスリン受容体Bアイソフォームの比(IR−A:IR−B)で高いサイクル閾値(ΔCt)差を有し(ΔCt<−4)、横紋筋肉腫が最高であった(図1D)。
小児肉腫(年齢:6か月〜25年)由来の23個の異種移植片中のインスリン様成長因子1(IGF−1)、インスリン様成長因子2(IGF−2)、およびインスリン様成長因子1受容体(IGF−1R)のmRNAレベルをqRT−PCRにより測定した。これらの分析結果を図1A〜図1Dに示す。図1Aに見られるように、IGF−1のmRNAレベルは、ユーイング肉腫では骨肉腫(p=0.029)および横紋筋肉腫(p=0.0024)よりも有意に高いことが見出された。それに対し、図1Bに見られるように、IGF−2のmRNAレベルは、横紋筋肉腫ではユーイング肉腫(p=0.0005)および骨肉腫(p=0.0066)よりも有意に高いことが見出された。図1Cに示すように、肉腫の3つのサブタイプ全部がIGF−1RのmRNAを高レベルで発現した。アッセイ対象の肉腫異種移植片試料の大部分が、インスリン受容体Aアイソフォーム 対 インスリン受容体Bアイソフォームの比(IR−A:IR−B)で高いサイクル閾値(ΔCt)差を有し(ΔCt<−4)、横紋筋肉腫が最高であった(図1D)。
またqRT−PCRを用いて、IGFリガンドおよび受容体のmRNAレベルを、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含むいくつかの肉腫細胞株において測定した。結果を下の表1に示す。異種移植片試料における結果と一致し、ユーイング肉腫細胞が最高のIGF−1レベルを有する一方、横紋筋肉腫細胞は最高レベルのIGF−2を発現した。IGF−1、IGF−1R、IGF−2、およびIGF2Rについて算出したΔCtを表すグラフを図2Aに示す。IR−A:IR−B比に対して算出したΔCtを図2Bに示す。
IGF−1、IGF−2、およびIGF−1Rのタンパク質レベルを、同一肉腫細胞株においてELISAにより測定した。これらの結果を図3A〜図3Cに示す。結果によると、大部分の肉腫細胞株がIGF−1RおよびIGF−1タンパク質を発現することが示された(図3Aおよび図3C)。骨肉腫細胞株およびいくつかの横紋筋肉腫細胞株のみがIGF−2を分泌した(図3B)。ユーイング肉腫細胞株はいずれも、検出可能な量のIGF−2を発現しなかった。
実施例2 MEDI−573は自己分泌またはパラ分泌IGFリガンドによって駆動される肉腫細胞の成長および増殖を阻害した
腫瘍細胞の成長に対するMEDI−573抗体を用いる処置の効果を判定するため、3つの横紋筋肉腫細胞株(RD、SJCRH30、およびHs729)、3つのユーイング肉腫細胞株(RD−ES、TC−71、およびSK−ES−1)、および4つの骨肉腫細胞株(SJSA−1、KHOS、MG−63、およびSAOS2)を、外来性IGF−1またはIGF−2の不在下で抗IGF抗体MEDI−573で処置した。
腫瘍細胞の成長に対するMEDI−573抗体を用いる処置の効果を判定するため、3つの横紋筋肉腫細胞株(RD、SJCRH30、およびHs729)、3つのユーイング肉腫細胞株(RD−ES、TC−71、およびSK−ES−1)、および4つの骨肉腫細胞株(SJSA−1、KHOS、MG−63、およびSAOS2)を、外来性IGF−1またはIGF−2の不在下で抗IGF抗体MEDI−573で処置した。
3つのユーイング肉腫細胞株全て(RD−ES、TC−71、およびSK−ES−1)および1つの横紋筋肉腫細胞株(SJCRH30)の成長は、外来性IGF−1またはIGF−2の不在下でMEDI−573抗体により阻害された。特定の理論に拘束されないが、この結果によると、これらの株が内因性IGF−1またはIGF−2を分泌してそれらの成長を駆動する(自己分泌駆動型)ことが示される。RDおよびSJSA−1細胞において、中等度の成長阻害(試験した最高用量で約30%)があった。結果を下の表2、および図4A〜図4Fに示し、ここで、図4AはMEDI−573で処置したRD−ES細胞の細胞生存度のグラフを示し;図4BはMEDI−573で処置したTC−71細胞の細胞生存度のグラフを示し;図4CはMEDI−573で処置したSJCRH30細胞の細胞生存度のグラフを示し;図4DはMEDI−573で処置したSK−ES−1細胞の細胞生存度のグラフを示し;図4EはMEDI−573で処置したSJSA−1細胞の細胞生存度のグラフを示し;また図4FはMEDI−573で処置したRD細胞の細胞生存度のグラフを示す。
IGFの添加がMEDI−573の抗増殖活性に対する効果を有するか否かを判定するため、アッセイを、外来的に添加したIGFで刺激されたいくつかの肉腫細胞株において繰り返した。これらのアッセイの結果を下の表3に示す。
表3からのデータを、図5A〜図5Fおよび図6A〜図6Dに示す。この表および図によると、IGF−1の添加が、ユーイング肉腫細胞株のRD−ES(図5A)、TC−71(図5E)、およびSK−ES−1(図5C)における細胞増殖を約2倍誘導したことが示される。同様に、IGF−2の添加は、ユーイング肉腫細胞株のRD−ES(図5B)、TC−71(図5F)、およびSK−ES−1(図5D)における細胞増殖を約2倍誘導した。IGF−1の添加は、骨肉腫細胞株MG−63(図6C)およびSAOS−2(図6A)における細胞増殖を誘導した。MEDI−573は、IGF−1およびIGF−2刺激性の細胞成長を強力に阻害した。相対的比較では、MEDI−573は、IGF−2刺激性の増殖に対して、IGF−1刺激性の増殖に対する(IC50は20〜223μMの範囲であった)よりも大きな効果(IC50は2〜20μMの範囲であった)を示した。一部の細胞株、例えばKHOSおよびRD細胞は、IGF−1またはIGF−2刺激に対して応答しなかった。MEDI−573は、IGF刺激の有無にかかわらず、KHOSおよびRD細胞の成長を調節する上で有意な効果を全く有しなかった。特定の理論に拘束されないが、これによると、IGFシグナル伝達がこれらの非応答性株における成長または生存を駆動しないことが示される。
RD−ES、TC−71、SJSA−1、およびKHOS細胞に対するMEDI−573の細胞傷害性効果についての基礎を評価するため、細胞を、漸増濃度のMEDI−573で48時間処置し、カスパーゼ−3およびカスパーゼ−7の活性化を測定することにより分析した。RD−ES、TC−71、およびSJSA−1細胞では、MEDI−573による処置が、アイソタイプ対照と比べて、カスパーゼ−3/−7の活性を用量依存性に増強した。カスパーゼ−3/−7の活性化はKHOS細胞内で検出されなかった(データは示さず)。
実施例3 MEDI−573は肉腫異種移植片モデルにおける腫瘍成長を阻害した
RD−ES(ユーイング肉腫)異種移植片を有するマウスに対するMEDI−573を用いた週2回の処置により、10mg/kgで25%、30mg/kgで44%、および60mg/kgで52%の腫瘍成長阻害が生じた(図7A)。同様の効果が、TC−71異種移植片を有するマウス(別のユーイング肉腫モデル)を同様に処置したとき見られた。同等の結果が、SJSA−1(骨肉腫モデル)異種移植片を有するマウスをMEDI−573で処置したときに得られた(図7B)。SK−ES−1およびSJCRH30細胞の増殖が、外来性IGFの不在下、インビトロでMEDI−573により阻害されたが、これら2つのモデルのインビボでの成長は、MEDI−573処置による影響を受けなかった。インビトロでの知見に一致して、KHOS細胞は、インビボでMEDI−573に対していずれも応答しなかった(図7C)。体重減少は認められなかったことから、MEDI−573処置は、マウスにおいて耐容性は良好であった。
RD−ES(ユーイング肉腫)異種移植片を有するマウスに対するMEDI−573を用いた週2回の処置により、10mg/kgで25%、30mg/kgで44%、および60mg/kgで52%の腫瘍成長阻害が生じた(図7A)。同様の効果が、TC−71異種移植片を有するマウス(別のユーイング肉腫モデル)を同様に処置したとき見られた。同等の結果が、SJSA−1(骨肉腫モデル)異種移植片を有するマウスをMEDI−573で処置したときに得られた(図7B)。SK−ES−1およびSJCRH30細胞の増殖が、外来性IGFの不在下、インビトロでMEDI−573により阻害されたが、これら2つのモデルのインビボでの成長は、MEDI−573処置による影響を受けなかった。インビトロでの知見に一致して、KHOS細胞は、インビボでMEDI−573に対していずれも応答しなかった(図7C)。体重減少は認められなかったことから、MEDI−573処置は、マウスにおいて耐容性は良好であった。
未処置のマウスおよび異なる量のMEDI−573で処置したマウスにおける異種移植片腫瘍内の遊離IGFリガンドを測定した。RD−ES腫瘍では、MEDI−573用量依存性のIGF−1抑制が存在し(図8A)、IGF−2のレベルは検出するには低すぎた。それに対し、SJSA−1腫瘍は、検出可能なレベルのIGF−2を示したが(図8B)、IGF−1は示さなかった(データは示さず)。SJSA−1腫瘍内の遊離IGF−2は、MEDI−573により、10mg/kgの最低用量であってもほぼ完全に中和された。これは、MEDI−573のIGF−2に対する結合親和性(Kd=2pmol/L)が、IGF−1(Kd=294pmol/L)と比べて高いことを反映している可能性がある。KHOS細胞がIGF−1および/またはIGF−2刺激に対して非応答的であるにもかかわらず、IGF−2レベルをKHOS/NPモデルで試験した。KHOS/NPモデルにおけるヒトIGF−2レベルの用量依存性阻害が認められたが、遊離IGF−2のいくらかのレベルが60mg/kgの最高用量で検出可能であり、それはSJSA−1腫瘍内のベースラインIGF−2レベルと同等であった(図8C)。
実施例4 MEDI−573は肉腫細胞内のIGFシグナル伝達を阻害した
MEDI−573は、RD−ES、TC−71、SK−ES−1、およびSJSA−1細胞内でのIGF−1R、IR−A、およびタンパク質キナーゼB(Akt)の自己リン酸化を阻害したが、KHOS細胞内では阻害しなかった(図9A〜図9C)。
MEDI−573は、RD−ES、TC−71、SK−ES−1、およびSJSA−1細胞内でのIGF−1R、IR−A、およびタンパク質キナーゼB(Akt)の自己リン酸化を阻害したが、KHOS細胞内では阻害しなかった(図9A〜図9C)。
外来性IGF−1またはIGF−2を細胞に添加したとき、試験対象の全細胞内でIGF−1RおよびIR−Aのリン酸化が誘導された。図10〜図10Cに見られるように、MEDI−573での前処理により、IGF−1/−2誘導性のIGF−1RおよびIR−Aの活性化が阻害された。IGF−1およびIGF−2はまた、RD−ES、TC−71、SK−ES−1、およびSJSA−1細胞内でのAktのリン酸化を刺激した。MEDI−573はこの効果を遮断する。しかし、KHOS細胞内では、受容体のリン酸化がIGF−1/−2刺激とともに認められたが、Aktの誘導はなかった。
IGFシグナル伝達に対するMEDI−573のインビボでの効果についても、肉腫異種移植片において試験した。インビトロ実験に一致するように、インビボでの薬力学的試験を2つの方法で実施した。第1に、自己分泌的に腫瘍により分泌されるIGFリガンドによって誘導されるシグナル伝達に対するMEDI−573の効果を試験した。単回用量のMEDI−573を、約400mm3のRD−ES、SJSA−1、またはKHOS/NP腫瘍を有するマウスに与えた。MEDI−573の投与により、pAKTの自己リン酸化およびリン酸化p4EBP1がRD−ES腫瘍内では阻害されたが、KHOS/NP腫瘍内では阻害されなかった。RD−ES腫瘍を有するマウス由来の試料でのイムノブロットの画像を図11に示す。
成体マウスはマウスIGF−2を生成せず、またMEDI−573はマウスIGF−1に対して低い結合親和性を有する。したがって、内分泌またはパラ分泌での分泌によって送達される場合に腫瘍成長を駆動するときのIGFリガンドの役割、およびこの機能の阻害におけるMEDI−573の効果の理解を試みるべく、ヒトIGF−1およびIGF−2(IGF−1/−2)をマウスに注射した。IGF−1またはIGF−2の注射から15分後、高レベルのIGF−1またはIGF−2がRD−ES腫瘍および血漿の両方で検出された。腹腔内へのMEDI−573での6時間の前処理により、腫瘍ライセートおよび血漿中のIGF−1レベルが約50%低下し(図12Aおよび図12Bを参照)、IGF−2レベルはほぼ完全に低下した(図12Cおよび図12Dを参照)。
同様に、Aktおよびリボソームタンパク質S6キナーゼβ−1(S6K)のリン酸化が、IGF−1/−2を受けなかったマウスと比べて増強された(図13)。MEDI−573での前処理は、特にIGF−2の注射に対し、IGF誘導性のpAKTおよびpS6Kの激減を引き起こした。IGF−1/−2の注射により、p4EBP−1のベースラインレベルが明らかに変化した。MEDI−573処置により、ベースラインレベル未満であってもp4EBP−1が阻害された。
実施例5 mTORiと組み合わされたMEDI−573がインビトロで肉腫細胞成長を阻害した
mTOR阻害剤のラパマイシンおよびAZD2014と組み合わせたMEDI−573の効果を、細胞傷害性アッセイにおいて評価した。RD−ES細胞は、MEDI−573およびラパマイシン、またはMEDI−573およびAZD2014で処置した。図14に見られるように、MEDI−573単独での処置により細胞生存度の56%の低下が引き起こされ、またラパマイシン単独での処置により細胞生存度の34%の低下が引き起こされた。MEDI−573とラパマイシンとの組み合わせにより生存度の80%の低下が得られた(P<0.01)。mTOR阻害剤AZD2014単独での処置により細胞生存度が55%低下し、またAZD2014とMEDI−573との組み合わせにより細胞生存度の85%の低下が引き起こされた(P<0.01)。上で示した結果に一致して、それはMEDI−573がKHOS細胞の増殖に対する効果を有しないことを示し(表3)、MEDI−573といずれかのmTORiとの組み合わせは、いずれのKHOS細胞においても活性の増強を全く示さなかった。
mTOR阻害剤のラパマイシンおよびAZD2014と組み合わせたMEDI−573の効果を、細胞傷害性アッセイにおいて評価した。RD−ES細胞は、MEDI−573およびラパマイシン、またはMEDI−573およびAZD2014で処置した。図14に見られるように、MEDI−573単独での処置により細胞生存度の56%の低下が引き起こされ、またラパマイシン単独での処置により細胞生存度の34%の低下が引き起こされた。MEDI−573とラパマイシンとの組み合わせにより生存度の80%の低下が得られた(P<0.01)。mTOR阻害剤AZD2014単独での処置により細胞生存度が55%低下し、またAZD2014とMEDI−573との組み合わせにより細胞生存度の85%の低下が引き起こされた(P<0.01)。上で示した結果に一致して、それはMEDI−573がKHOS細胞の増殖に対する効果を有しないことを示し(表3)、MEDI−573といずれかのmTORiとの組み合わせは、いずれのKHOS細胞においても活性の増強を全く示さなかった。
IGFシグナル伝達に対するMEDI−573、mTORi、および両方の組み合わせの効果を試験するため、RD−ES、SJSA−1、およびKHOS細胞をこれらの作用物質で4時間処置した。ゲル電気泳動による細胞溶解物の分離後、免疫ブロットによりタンパク質を検出した。図15は、MEDI−573がRD−ESおよびSJSA−1細胞内でのS6Kのリン酸化を阻害したが、KHOS細胞内では阻害しなかったことを示す。ラパマイシン単独およびMEDI−573との組み合わせは、3つの細胞株全部でpS6Kを完全に阻害した。MEDI−573単独またはラパマイシン単独は、4EBP1のリン酸化に対する効果を有しなかった。両方での併用処置は、2つの応答性のある株(RD−ESおよびTC−71)においてp4EBP1の低下をもたらしたが、非応答性の株(KHOS)では効果を全く有しなかった。ラパマイシン処置により、3つの細胞株全部でAKTのリン酸化が誘導された。MEDI−573の存在下で、ラパマイシン誘導性のAKT活性化は、RD−ESおよびTC−71細胞内で未処置対照において認められたレベルまで有意に阻害されたが、KHOS細胞内では阻害されなかった(図15)。
AZD2014での処置によりRD−ES内でのpS6Kのリン酸化が阻害された一方、AZD2014は、SJSA−1またはKHOS細胞内でpS6Kのリン酸化を阻害しなかった。MEDI−573とAZD2014との組み合わせにより、SJSA−1細胞内でのpS6Kのリン酸化が阻害された。pAKTのリン酸化に対する効果は、MEDI−573をAZD2014と組み合わせるとき、MEDI−573をラパマイシンと組み合わせるときよりも顕著であるように思われた(図15)。
実施例6 mTORiと組み合わせたMEDI−573はRD−ES腫瘍異種移植片における肉腫細胞成長を阻害する
MEDI−573単独でのRD−ES異種移植片モデルの処置により、52%の腫瘍成長阻害が生じた。AZD2014単独でのRD−ES異種移植片モデルの処置により、51%の腫瘍成長阻害が生じた。MEDI−573とAZD2014との組み合わせでのRD−ES異種移植片モデルの処置により、96%の腫瘍成長阻害がもたらされ、それはいずれの作用物質単独よりも有意に優れていた(p<0.001)(図16A)。体重に対する処置の効果を図16Bに示す。腫瘍成長阻害に対する同様の効果が、SJSA−1異種移植片モデルにおいて認められた。MEDI−573とAZD2014との組み合わせでのKHOS異種移植片モデルの処置により、それら作用物質単独での処置と比べての腫瘍成長阻害の増大は生じなかった。
MEDI−573単独でのRD−ES異種移植片モデルの処置により、52%の腫瘍成長阻害が生じた。AZD2014単独でのRD−ES異種移植片モデルの処置により、51%の腫瘍成長阻害が生じた。MEDI−573とAZD2014との組み合わせでのRD−ES異種移植片モデルの処置により、96%の腫瘍成長阻害がもたらされ、それはいずれの作用物質単独よりも有意に優れていた(p<0.001)(図16A)。体重に対する処置の効果を図16Bに示す。腫瘍成長阻害に対する同様の効果が、SJSA−1異種移植片モデルにおいて認められた。MEDI−573とAZD2014との組み合わせでのKHOS異種移植片モデルの処置により、それら作用物質単独での処置と比べての腫瘍成長阻害の増大は生じなかった。
MEDI−573とラパマイシンとの組み合わせについてもRD−ES異種移植片モデルで試験し、その結果を図17Aに示す。MEDI−573とラパマイシンとの組み合わせの効果はMEDI−573とAZD2014との組み合わせの場合よりやや低かったが、併用処置により、いずれかの作用物質単独(MEDI−573では59%、またラパマイシンでは44%)と比べて、抗腫瘍活性が増強された(79%の腫瘍成長阻害)(図17A)。有意な体重減少は認められなかったことから、併用処置は耐容性があった(図17B)。
本明細書に記載の結果は、以下の材料および方法を用いて得られた。
細胞および試薬
肉腫細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(マナッサス、バージニア州)から購入した。CellTiter−Glo試薬はPromega(マディソン、ウィスコンシン州)から入手した。pIGF−1R、pIR−A、およびpAKT用の全細胞溶解物キットはMeso Scale Discovery(MSD;ロックビル、メリーランド州)から購入した。全IGF−1およびIGF−1R用のELISAキットはR&D Systems(ミネアポリス、ミネソタ州)から購入した。全IGF−2用のELISAキットはInsight Genomics(フォールズチャーチ、バージニア州)から購入した。遊離IGF−1およびIGF−2を検出するためのELISAキットは社内で開発した。ヒトIGF−1およびIGF−2はR&D Systems(ミネアポリス、ミネソタ州)から入手した。ホスホ−AKT、ホスホ−4EBP1、ホスホ−S6K、およびGAPDHを検出するための抗体はCell Signaling Technology(ベバリー、マサチューセッツ州)から得た。
肉腫細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(マナッサス、バージニア州)から購入した。CellTiter−Glo試薬はPromega(マディソン、ウィスコンシン州)から入手した。pIGF−1R、pIR−A、およびpAKT用の全細胞溶解物キットはMeso Scale Discovery(MSD;ロックビル、メリーランド州)から購入した。全IGF−1およびIGF−1R用のELISAキットはR&D Systems(ミネアポリス、ミネソタ州)から購入した。全IGF−2用のELISAキットはInsight Genomics(フォールズチャーチ、バージニア州)から購入した。遊離IGF−1およびIGF−2を検出するためのELISAキットは社内で開発した。ヒトIGF−1およびIGF−2はR&D Systems(ミネアポリス、ミネソタ州)から入手した。ホスホ−AKT、ホスホ−4EBP1、ホスホ−S6K、およびGAPDHを検出するための抗体はCell Signaling Technology(ベバリー、マサチューセッツ州)から得た。
IGF−1/−2、IGF−1R、IR−A、IR−BのmRNAレベルを測定するためのRT−PCRアッセイ
全RNAを、ZR RNA MicroPrepキット(Zymo Research、アーバイン、カリフォルニア州)を用いて製造業者のプロトコルに従って精製した。
全RNAを、ZR RNA MicroPrepキット(Zymo Research、アーバイン、カリフォルニア州)を用いて製造業者のプロトコルに従って精製した。
一本鎖cDNAは、SuperScript(登録商標)III First−Strand Synthesis SuperMix(Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州)を用いて全RNAから作製した。cDNAの試料を、TaqMan Pre−Amp Master Mixを用いて製造業者の使用説明書に従って予備増殖した。反応物は、20μLの最終反応体積で、5μLのcDNA、10μLのPre−Amp Master Mix、および(アッセイ対象の全プライマー/プローブからなる)5μLの0.2×遺伝子発現アッセイミックスを含有した。反応物を推奨される14サイクルプログラムで循環させ、次にTE緩衝液で1:5に希釈した。予備増殖したcDNAは、直ちに用いるか、または処理まで摂氏−20度(−20℃)で貯蔵した。
試料を調製するための反応ミックスは、48×48ダイナミックアレイチップに負荷し、2.5μLの2×ユニバーサルマスターミックス、0.25μLのサンプルローディングバッファー、および2.25μLの予備増幅cDNAを含有した。プライマー/プローブ用の反応ミックスは、2.5μLの20×TaqMan遺伝子発現アッセイおよび2.5μLのアッセイローディングバッファーを含有した。試料およびアッセイ試薬を入口に負荷する前に、チップをIFC Controllerで予備刺激した。試料(5μL)をダイナミックアレイチップの各試料入口に負荷し、5μLの10×TaqMan遺伝子発現アッセイミックスを各検出器入口に負荷した。チップを、負荷および混合のためにIFC Controller上に置いた。IFCプライミングステップの完了時、チップをBioMark RT−PCRシステムに熱サイクル期間(摂氏95度で10分間、摂氏95度で15秒間を40サイクル、摂氏60度で1分間)負荷した。試料の反復数および組成物は、特定の実験に応じて変化したが、測定が3通りより少ないことは決してなかった。平均サイクル閾値(Ct)値を用いて設計したプローブを定量した。ΔCtの算出用に、試料中のすべての利用可能な参照遺伝子アッセイの平均Ct値を用いた。
IGF−1、IGF−2、IGF−1R、IR−AおよびIR−Bのレベルを試験した。IR−AおよびIR−BのTaqMan遺伝子発現アッセイは、Huang et al.,2011(PLoS One.2011;6(10):e26177)に記載されている。この方法は、IR−AおよびIR−Bを互いに独立に特異的増幅することを可能にする。他のTaqMan遺伝子発現アッセイは、Applied Biosystemsから購入した。
インビトロ細胞増殖アッセイ
肉腫細胞株は、通常の成長培地中で一晩培養した。翌日、0.1%チャコール処理(charcoal stripped)ウシ胎仔血清(FBS)を含有する培地を添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な量のMEDI−573で処置し、培養液を3日間インキュベートした。増殖を、CellTiter−Glo(CTG)試薬(Promega、マディソン、ウィスコンシン州)を用いて定量化した。
肉腫細胞株は、通常の成長培地中で一晩培養した。翌日、0.1%チャコール処理(charcoal stripped)ウシ胎仔血清(FBS)を含有する培地を添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な量のMEDI−573で処置し、培養液を3日間インキュベートした。増殖を、CellTiter−Glo(CTG)試薬(Promega、マディソン、ウィスコンシン州)を用いて定量化した。
IGF誘導性の増殖に対するMEDI−573の効果を評価するため、MEDI−573またはアイソタイプ対照を、細胞に摂氏37度で30分間添加した。次に、IGF−1またはIGF−2を適切なウェルに添加し、3日間インキュベートした。CTG試薬を用いて増殖を定量化した。
pIGF−1R、pIR−A、およびpAKT用アッセイ
肉腫株を完全培地中で一晩培養した。翌日、0.1%チャコール処理(charcoal stripped)ウシ胎仔血清(FBS)を含有する培地を培養液に添加し、培養液を一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な治療薬で5分間処置した。培地を除去し、細胞を洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有する1.0%Triton X溶解用緩衝液で溶解した。約8〜20μgの総タンパク質を、MSD 96−Well MULTI−SPOTプレート上に負荷し、IGF−1R、IR−AおよびIRS−1の総タンパク質およびリン酸化タンパク質のレベルを、Insulin Signaling Panel(総タンパク質)およびInsulin Signaling Panel(リン酸化タンパク質)Whole Cell Lysateキットを用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。総AKTおよびリン酸化AKTのレベルを、Phospho(Ser473)/Total AKT Assay Whole Cell Lysateキットを用いて、製造業者の標準プロトコルに従って測定した。
肉腫株を完全培地中で一晩培養した。翌日、0.1%チャコール処理(charcoal stripped)ウシ胎仔血清(FBS)を含有する培地を培養液に添加し、培養液を一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な治療薬で5分間処置した。培地を除去し、細胞を洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有する1.0%Triton X溶解用緩衝液で溶解した。約8〜20μgの総タンパク質を、MSD 96−Well MULTI−SPOTプレート上に負荷し、IGF−1R、IR−AおよびIRS−1の総タンパク質およびリン酸化タンパク質のレベルを、Insulin Signaling Panel(総タンパク質)およびInsulin Signaling Panel(リン酸化タンパク質)Whole Cell Lysateキットを用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。総AKTおよびリン酸化AKTのレベルを、Phospho(Ser473)/Total AKT Assay Whole Cell Lysateキットを用いて、製造業者の標準プロトコルに従って測定した。
マウスにおける異種移植片試験
インビボ有効性試験においては、50%マトリゲル中の500万の肉腫細胞を、雌胸腺欠損ヌードマウスの各々に皮下接種した。腫瘍が約150〜200mm3に達するときに、マウスを無作為に数群に割り当てた(1群あたりマウス10匹)。MEDI−573を、指定用量で週2回、腹腔内に投与した。AZD2014についての用量レジメンは1日1回の経口投与であり、ラパマイシンについては3日毎の腹腔内注射であった。腫瘍体積をノギスで週2回測定した。腫瘍成長阻害は、試験の最終日に、対照群の初日および最終日の平均腫瘍体積と比較して算出した。
インビボ有効性試験においては、50%マトリゲル中の500万の肉腫細胞を、雌胸腺欠損ヌードマウスの各々に皮下接種した。腫瘍が約150〜200mm3に達するときに、マウスを無作為に数群に割り当てた(1群あたりマウス10匹)。MEDI−573を、指定用量で週2回、腹腔内に投与した。AZD2014についての用量レジメンは1日1回の経口投与であり、ラパマイシンについては3日毎の腹腔内注射であった。腫瘍体積をノギスで週2回測定した。腫瘍成長阻害は、試験の最終日に、対照群の初日および最終日の平均腫瘍体積と比較して算出した。
インビボでの作用機序(MOA)試験については、腫瘍が約400mm3に達したとき、単回用量のMEDI−573を投与した。MEDI−573の自己分泌IGFシグナル伝達に対する効果を評価するため、腫瘍および血漿試料を投与から4時間後に採取した。別のマウスセットでは、MEDI−573の投与から6時間後、ヒトIGF−1またはIGF−2を尾静脈に注射した。MEDI−573のIGF−1/−2誘導性シグナル伝達に対する効果を評価するため、腫瘍および血漿試料をIGFの注射から15分後に採取した。
他の実施形態
前述の説明から、様々な利用および条件に対して採用するために、本明細書に記載の本発明に対する改変形態および修飾形態をなし得ることが明らかになるであろう。かかる実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
前述の説明から、様々な利用および条件に対して採用するために、本明細書に記載の本発明に対する改変形態および修飾形態をなし得ることが明らかになるであろう。かかる実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
本明細書中の変数の任意の定義における要素の列挙に関する記述は、その変数の列挙される要素の任意の単一の要素または組み合わせ(またはサブコンビネーション)としての定義を含む。本明細書中の実施形態に関する記述は、任意の単一の実施形態あるいは任意の他の実施形態またはその一部との組み合わせとしての実施形態を含む。
本明細書中に記述されるすべての特許、刊行物、CAS、および受託番号は、あたかも各々の独立した特許、刊行物、および受託番号が詳細かつ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
Claims (25)
- 肉腫を治療するための医薬組成物であって、有効量のmTOR阻害剤、ならびにインスリン様成長因子1(IGF−1)およびインスリン様成長因子2(IGF2)の少なくとも1つに特異的に結合する有効量の抗体を含む、医薬組成物。
- 前記抗体がIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つを中和する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、
配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);
配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);
配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);
配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);
配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および
配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)
を含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。 - IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する前記抗体が、配列番号7および配列番号8で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む1つ以上の可変領域を含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株7.159.2(ATCC受託番号PTA−7424)によって産生される抗体のアミノ酸配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記mTOR阻害剤が、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記mTOR阻害剤がラパマイシンである、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記mTOR阻害剤がAZD2014である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫からなる群から選択される肉腫を治療するために用いられる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 肉腫細胞の生存または増殖を低下させるための方法であって、
少なくとも1つの肉腫細胞を、mTOR阻害剤ならびにIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物に接触させるステップ
を含み、前記肉腫細胞の生存または増殖が低下する、方法。 - 被験体における肉腫を治療するための方法であって、mTOR阻害剤ならびにIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する抗体を含む医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
- 前記抗体がIGF−1およびIGF−2の少なくとも1つを中和する、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体が、
配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);
配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);
配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);
配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);
配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および
配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)
を含む、請求項11または12に記載の方法。 - IGF−1およびIGF−2の少なくとも1つに特異的に結合する前記抗体が、配列番号7および配列番号8で示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む1つ以上の可変領域を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記mTOR阻害剤が、AZD2014、INK128、AZD8055、NVP−BEZ235、BGT226、SF1126、PKI−587、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムスのうちの少なくとも1つである、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記肉腫が、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、軟部組織肉腫、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫、神経線維肉腫、滑膜肉腫、および未分化多形性肉腫のうちの1つ以上である、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記医薬組成物が、10mg/kg、30mg/kg、または60mg/kgで投与される、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体における腫瘍成長を参照に対して少なくとも約10%、25%、50%、75%、またはそれを超えて阻害する、請求項11〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 肉腫細胞の増殖を阻害する、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップが静脈注射または経口投与によるものである、請求項11〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体および前記mTOR阻害剤が、約1時間〜約24時間以内、または約1日〜約3日以内に同時投与される、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。
- ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を有する被験体を治療するための方法であって、前記被験体に有効量の抗体およびラパマイシンを投与し、それにより前記被験体における前記ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を治療するステップを含み、前記抗体は、
配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);
配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);
配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);
配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);
配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および
配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)
を含む、方法。 - ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を有する被験体を治療するための方法であって、前記被験体に有効量の抗体およびAZD2014を投与し、それにより前記被験体における前記ユーイング肉腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫を治療するステップを含み、前記抗体は、
配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);
配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);
配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);
配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);
配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および
配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)
を含む、方法。 - 肉腫を治療するためのキットであって、有効量のmTOR阻害剤と、IGF−1および/またはIGF−2に特異的に結合する抗体と、肉腫を治療するための前記キットを用いるための使用説明書とを含む、キット。
- 前記mTOR阻害剤がラパマイシンまたはAZD2014であり、かつ前記抗体が、
配列番号1で示されるアミノ酸配列(Ser Tyr Asp Ile Asn)を含む重鎖相補性決定領域1(CDRl);
配列番号2で示されるアミノ酸配列(Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly)を含む重鎖相補性決定領域2(CDR2);
配列番号3で示されるアミノ酸配列(Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val)を含む重鎖相補性決定領域3(CDR3);
配列番号4で示されるアミノ酸配列(Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Val Ser)を含む軽鎖相補性決定領域1(CDR1);
配列番号5で示されるアミノ酸配列(Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser)を含む軽鎖相補性決定領域2(CDR2);および
配列番号6で示されるアミノ酸配列(Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Val)を含む軽鎖相補性決定領域3(CDR3)
を含む、請求項24に記載のキット。
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