UA120029C2 - Спосіб зниження в'язкості біспецифічного антитіла до vegf/ang-2 та застосування такого антитіла для лікування судинних очних захворювань - Google Patents

Спосіб зниження в'язкості біспецифічного антитіла до vegf/ang-2 та застосування такого антитіла для лікування судинних очних захворювань Download PDF

Info

Publication number
UA120029C2
UA120029C2 UAA201501008A UAA201501008A UA120029C2 UA 120029 C2 UA120029 C2 UA 120029C2 UA A201501008 A UAA201501008 A UA A201501008A UA A201501008 A UAA201501008 A UA A201501008A UA 120029 C2 UA120029 C2 UA 120029C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
bek
uvi
mutations
human
Prior art date
Application number
UAA201501008A
Other languages
English (en)
Inventor
Харальд ДЮРР
Франк Хертінг
Франк ХЕРТИНГ
Крістіан Кляйн
Кристиан КЛЯЙН
Йорг Томас РЕГУЛА
Йорг Томас Рэгула
Маттіас Рют
Маттиас РЮТ
Кай-Гуннар ШТУБЕНРАУХ
Кай-Гуннар Штубэнраух
Original Assignee
Рош Глікарт Аг
Рош Гликарт Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48783248&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA120029(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Рош Глікарт Аг, Рош Гликарт Аг filed Critical Рош Глікарт Аг
Publication of UA120029C2 publication Critical patent/UA120029C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Винахід належить до способу зниження в’язкості біспецифічного антитіла, яке специфічно зв’язується з людським судинним ендотеліальним фактором росту (VEGF/VEGF-A) і людським ангіопоетином-2 (ANG-2) людського підкласу IgG1 або IgG4 з мутаціями 1253А, Н310А і Н435А, способу одержання такого антитіла, фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло, та його застосування.

Description

ангіопоетином-2 (АМа-2) людського підкласу ІДС або Ідс4 з мутаціями 1253А, НЗ1ТОА ї НАЗ5А, способу одержання такого антитіла, фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло, та його застосування.
Даний винахід належить до способу зниження в'язкості антитіла (включаючи біспецифічне антитіло), такого як людське антитіло підкласу (91 або людське антитіло підкласу Ідс4, до біспецифічних антитіл до людського судинного ендотеліального фактору росту (МЕСЕ/Л/ЕСБ-А) і до людського ангіопоетину-2 (АМОИ-2), способів їх одержання, фармацевтичних композицій, що містять зазначені антитіла, і їх застосувань.
Передумови створення винаходу
Ангіогенез бере участь у патогенезі різних порушень, включаючи солідні пухлини, внутріочні неоваскулярні синдроми, такі як проліферативні ретинопатії або вікова дегенерація жовтої плями (АМО), ревматоїдний артрит і псоріаз (боЇКтап та ін., У. Віої. Спет. 267, 1992, со. 10931-10934; Кіадзбгип М. та ін., Аппи. Кем. Рпузіої. 53, 1991, сс. 217-239 і Сагпег А., Мазсшаг діхеазев5, в: РашШйобіоіоду ої осціаг аізеазе, А аупатіс арргсаси, під ред. Сагпег А. і Кіїпімогій о.
К., 2-е вид., вид-во Магсе! ОекКег, Мем/ УогК, 1994, сс. 1625-1710).
Ранібізумаб (товарний знак І исепіїє?Ф) являє собою фрагмент моноклонального антитіла, виведений з того ж самого батьківського мишачого антитіла, що і бевацизумаб (авастін). Однак його піддавали процедурі дозрівання афінності для досягнення більш сильного зв'язування з
МЕСБ-А (МО 98/45331). Відомо, що блокада МЕСБЕ-А може бути пов'язана з деякими симптомами системної токсичності, з цієї причини ранібізумаб позбавлений Ес-ділянки для зменшення часу напівжиття в сироватці і, отже, системної токсичності. Він являє собою антиангіогенний агент, який дозволений для лікування вікової дегенерації жовтої плями "вологого типу" (АКМО), звичайної форми пов'язаної з віком втрати зору.
Аналізи ангіогенезу в рогівці продемонстрували, що АМО-1 і АМО-2 чинять подібні дії, і мають синергетичну активність при спільній дії з МЕСЕ, відносно прискорення росту нових кровоносних судин (Азапйага Т. та ін., Сіго. Ке5. 83, 1998, сс. 233-240). Можливість того, мала місце залежна від дози ендотеліальна відповідь, випливала з даних про те, що іп міго АМО-2 у високій концентрації може також мати проангіогенну дію (Кіт І. та ін., Опсодепе 19, 2000, сс. 4549-52). У високій концентрації АМ(О-2 діє в якості фактора виживання при апоптозу ендотеліальних клітин в процесі виснаження в сироватці факторів апоптозу в результаті активації Тіе2 за допомогою шляху Рі-З-кінази і АКІ (Кіт І. та ін., Опсодепе 19, 2000, сс. 4549-4552).
У УМО 2010/040508 А9 і УМО 2011/117329 описані біспецифічні антитіла до МЕСР/АМО-2. У
УМО 2008/132568 описані злиті білки, що зв'язуються з факторами росту. У УМО 2009/136352 описані антиангіогенні сполуки. У М/О 2009/080253 і УМО 2011/117330 описані біспецифічні двовалентні формати антитіл. У М/О 2010/069532 описані антитіла до Апд2.
Судинні очні захворювання, такі як вікова дегенерація жовтої плями (АКМО) і діабетична ретинопатія (ОК), є результатом аномальної хороїдальної або ретинальної неоваскуляризації відповідно. Вони є основними причинами втрати зору у жителів промислово розвинених країн.
Оскільки сітківка складається з добре оформлених шарів нейронних, гліальних і судинних елементів, відносно невеликі порушення, такі, які мають місце при проліферації судин або набряку, можуть призводити до значного зниження зорової функції. Спадкові дегенерації сітківки, такі як пігментний ретиніт (КР), асоційовані також із судинними порушеннями, такими як звуження артеріол і судинна атрофія. Вони вражають 1 з 3500 індивідуумів і характеризуються прогресуючою нічною сліпотою, зменшенням поля зору, атрофією зорового нерва, ослабленням артеріол і зниженням центрального зору, часто прогресуючим аж до повної сліпоти.
Ішемічні ретинопатії характеризуються зниженням або дисфункцією судинної мережі сітківки, що призводить до зниження потоку крові і гіпоксії. Сітківка реагує на гіпоксію генеруванням сигналів зростання нових кровоносних судин, однак ці нові судини, як правило, є ламкими і неупорядкованими. Так, зростання цих аномальних нових судин може створювати загрозу зору, оскільки вони можуть витікати, кровоточити або приводити до рубцювання, що, зрештою, може закінчуватися відшаруванням сітківки. Сучасні шляхи лікування ішемічних ретінопатій спрямовані на зупинку зростання патологічних судин, але вони не впливають на лежачу в їх основі ішемію, яка запускає їх зростання. Крім того, стандартне лікування діабетичної ретинопатії, ішемічної ретинопатії, яка вражає мільйони людей, включає руйнування частини сітківки лазером з метою припинення зростання нових судин і збереження центрального зору. Відомо застосування стратегій для блокади функції судинного ендотеліального фактора росту (МЕСЕ), основного активатора росту судин. Короткочасна анти-
МЕСЕ терапія може покращувати зір, але вона не спрямована на лежачу в основі захворювання ішемію і фактично може загострювати цей стан, оскільки інгібує зростання всіх сусідів, включаючи такі, що чинять сприятливу дію колатералі. Існує також серйозна проблема, пов'язана з системною експозицією цих лікарських засобів в організмі людей похилого віку 10) та/або пацієнтів, які страждають на діабет, для яких може вимагатися зростання нових судин при ішемії головного мозку, серця або кінцівок.
Як правило, при очних хворобах часто застосовують введення в склоподібне тіло більш дрібних фрагментів антитіл типу Раб ог Раб (2), оскільки вони мають короткий час напівжиття в сироватці і низький ризик системної токсичності. Однак зазначені більш дрібні фрагменти, як правило, мають також і більш короткий час напівжиття в склоподібному тілі (наприклад, через більш швидку дифузію в сироватку) і, як правило, їх необхідно частіше дозувати.
У Кіт та ін., МоІесшаг Міб5іоп, 15, 2009, сс. 2803-2812 описані повнорозмірні антитіла, які вводять такі, що вводяться всередину скловидного тіла (інтравітреально) в око, для яких встановлено, що до, що зв'язуються з ЕсКп, елімінувалися в кров у мишей дикого типу, в той час як ІДУ, що не зв'язуються з ЕсКп, що не елімінувалися в кровоносну систему. Крім того, до, що зв'язуються з ЕсКп, не елімінувалися в кровоносну систему у мишей з "вимкненим" ЕсКп.
Таким чином, в даній області існує необхідність у створенні поліпшених засобів для лікування та попередження різних судинних очних захворювань, таких як ішемічні ретинопатії.
Короткий виклад суті винаходу
Одним з об'єктів винаходу є спосіб зниження в'язкості антитіла, де антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу 91 або людського підкласу досі (виведену з людського антитіла) і де спосіб полягає в тому, що модифікують константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу (901 або людського підкласу Ідс4 за допомогою мутації
І253А, НЗ1ТОА і Н4З5А (нумерація згідно ЕЮ-індексу Кебота).
В одному з варіантів здійснення винаходу вказаний спосіб відрізняється тим, що антитіло являє собою біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським УЕСЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, в якому
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 1, СОК2Н-ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 2, і СОК1ТН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 3, і в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 4, СОКОІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮО МО: 5, і СОКТІ - ділянку, що має БЕО ІЮО МО: 6; і
ІЇ) зазначений другий антигензв'язуючий центр, специфічно зв'язується з АМО-2, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має ЗЕО І МО: 9, СОК2Н-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 10, ії СОМК1ТН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 11, і в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 12, СОК2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 13, і СОЇ -ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 14, і де
І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу 391 або людського підкласу 954 (виведену з людського антитіла) і містить мутації І253А,
НЗ1ТОА і Н4ІЗ5А (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота).
В одному з варіантів здійснення винаходу вказаний спосіб відрізняється тим, що вказане описане вище біспецифічне антитіло містить константну ділянку людського підкласу Ідс1 (виведену з людського антитіла) і таку, що містить мутації І253А, НЗ10А ї Н4З5А, (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота), а також містить мутації І 234А, І 235А і РЗ329С (нумерація згідно ЕЮ- індексу Кебота).
Одним з варіантів здійснення винаходу є антитіло, отримане зазначеним способом.
Одним з варіантів здійснення винаходу є застосування мутацій І253А, НЗІОА і Н4іЗ5А (нумерація згідно ЕЮО-індексу Кебота) для зниження в'язкості антитіла, де антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу (351 або людського підкласу Ідс4 (виведену з людського антитіла).
В одному з варіантів здійснення винаходу вказане застосування відрізняється тим, що антитіло являє собою біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕСЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, в якому
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 1, СОВ2Н-ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 2, і СОК1ТН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 3, і в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 4, СОКОІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮО МО: 5, і СОКТІ - ділянку, що має БЕО ІЮО МО: 6; і
ІЇ) зазначений другий антигензв'язуючий центр, що специфічно зв'язується з АМО-2, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОМЗН-ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 9, СОК2Н- ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 10, і СОКІ1ТН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 11, ії в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 12, СОК2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ 10) МО: 13, ї СОКТІ -ділянку, що має 5ЕО ІО МО: 14, і в якому
І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу 901 або людського підкласу Ід4 (виведену з людського антитіла) і що містить мутації І253А,
НЗ1ТОА і Н4ІЗ5А (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота).
В одному з варіантів здійснення винаходу вказане конкретне застосування відрізняється тим, що біспецифічне антитіло містить константну ділянку людського підкласу Їдс1 (виведену з людського антитіла) і що містить мутації І253А, НЗ1ОА ї Н4іЗ5А (нумерація згідно ЕО-індексу
Кебота), а також що містить мутації І 2344А, І 235А і РЗ290О (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота).
Винахід належить також до біспецифічному двовалентному антитілу, яке містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, в якому
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, що специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОМЗН-ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 1, СОК2Н- ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 2, і СОМК1Н-ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 3, і в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО І МО: 4, СОВ2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 5, їі
СОНВТІ -ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 6; і
ІЇ) зазначений другий антигензв'язуючий центр, що специфічно зв'язується з АМО-2, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОМЗН-ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 9, СОВа2Н- ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 10, і СОКІ1ТН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 11, ії в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 12, СОК2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ
МО: 13, ї СОКТІ -ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 14, і де
І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу 901 або людського підкласу Ідс4 (виведену з людського антитіла) і що містить мутації І253А,
НЗ1ТОА і Н4ІЗ5А (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота).
В одному з варіантів здійснення винаходу вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, що специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга МН амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 7 і в якості варіабельного домену легкого ланцюга МІ. амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 8 і
І) зазначений другий антигензв'язуючий центр, що специфічно зв'язується з АМО-2, містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга МН амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 15 і в якості варіабельного домену легкого ланцюга Мі. амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 16.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга, зазначена у підпункті ІІ), являє собою константну ділянку людського підкласу 901. В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло підкласу ІДС1 відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга підкласу ІдДс1 містить також мутації І 234А, І 235А і РЗ290О (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота).
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга, зазначена у підпункті Ії), являє собою константну ділянку людського підкласу ІД54. В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло підкласу дося відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга підкласу Ідс4 містить також мутації 5228Р і І235Е (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота). В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло підкласу Ідс4 відрізняється тим, що константна ділянка важкого ланцюга підкласу Ідс4 містить також мутації 5228Р, І 235Е і РЗ290О (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота).
Наступними об'єктами винаходу є фармацевтична композиція, що містить вказане біспецифічне антитіло, зазначена фармацевтична композиція, призначена для застосування для лікування судинних очних захворювань, застосування вказанного біспецифічного антитіла для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування судинних очних захворювань, спосіб лікування паціента, що страждає судинними очними захворюваннями, шляхом запровадження зазначеного біспецифічного антитіла пацієнту, який потребує зазначеного лікування. В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло або фармацевтичну композицію, що містить вказане біспецифічне антитіло, застосовують шляхом інтравітреального введення.
Наступним об'єктом винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, що кодує важкий і/або легкий ланцюг біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході.
У винаході запропоновані також експресійні вектори, що містять зазначену нуклеїнову кислоту, пропоновану у винаході, які можуть експресувати зазначену нуклеїнову кислоту в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні, і клітини-хазяїні, що містять зазначені вектори, (610) які містять зазначені вектори, призначені для рекомбінантного одержання біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході.
Винахід належить також до прокаріотів або еукаріотичних клітин-хазяїнів, які містять вектор, запропонований у винаході.
Винахід належить також до способу одержання біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході, що відрізняється тим, що експресують нуклеїнову кислоту, запропоновану у винаході, в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні і виділяють вказане біспецифічне антитіло із зазначеної клітини або супернатанта клітинної культури. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб отримання біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході, що полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких а) трансформують клітину-хазяїна векторами, що містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіло; б) культивують клітину-хазяїна в умовах, які забезпечують синтез зазначеної молекули антитіла; і в) виділяють зазначену молекулу антитіла із зазначеної культури.
Винахід належить також до антитіла, отриманого за допомогою зазначеного способу одержання біспецифічного антитіла.
Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕСРЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 22, 5ЕО
ІО МО: 23 і ЗЕО ІЮ МО: 24.
Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО ІЮ МО: 26, ЗЕО
ІО МО: 27 і ЗЕО ІЮ МО: 28.
Антитіла, запропоновані у винаході, мають дуже цінні властивості, пов'язаними зі специфічними модифікаціями в Ес-ділянки/константної ділянки, що забезпечує сприятливу дію на пацієнта, що страждає судинними очними захворюваннями. Вони відрізняються високою стабільністю в середовищі склоподібного тіла, і повільною дифузією з ока (порівняно з фрагментами антитіл меншого розміру, що не містять константну ділянку важкого ланцюга), при цьому фактичне захворювання локалізується і лікується (таким чином, схему лікування потенційно можна покращувати в порівнянні зі схемою, в якій застосовують не-Ідс-подібні антитіла, наприклад, типу Раб- і (Раб) 2-фрагментів). При створенні винаходу неочікувано було встановлено, що в порівнянні з немодифікованими антитілами ІдС-типу час напівжиття в оці після інтравітреального введення антитіл з мутаціями І253А, НЗ10А ї Н4іЗ5А в константній ділянці (які не мають більше здатність до зв'язування ЕсКп) виявилося схожим (лише незначно знижувався) (таблиці 17а і 18а і фіг. 7Г і 7Д), в той час як дифузія з ока в сироватку крові була подібною (таблиця 15 і фіг. 7Б). Це є дуже цінним, оскільки для лікування судинних очних захворювань, пов'язаних з АМО2 та/або МЕСЕ, потрібно елімінувати МЕСЕ і Апд2 з ока (наприклад, за допомогою транспортування в сироватку крові у вигляді комплексу антитіло до
АМО2/АМО2 або комплексу антитіло до МЕСЕЛ/ЕСЕ). З іншого боку, для антитіл, запропонованих у винаході, характерний досить швидкий кліренс із сироватки в порівнянні з немодифікованими антитілами ІдбС-типу (що є дуже бажаним для зниження потенційних побічних дій, пов'язаних з системною експозицією).
При створенні винаходу також неочікувано було встановлено, що зазначені антитіла мають низьку в'язкість (див. фіг. 2) (порівняно з версіями, що не мають мутацій І253А, НЗІ1ТОА ї Н4З5А в константній ділянці), і, отже, найбільш придатні для введення в склоподібне тіло за допомогою тонких голок в процесі лікування очних хвороб (для зазначеного застосування, як правило, використовують тонкі голки і висока в'язкість дуже ускладнює вказане введення). Більш низька в'язкість дозволяє також використовувати більш концентровані композиції.
При створенні винаходу також неочікувано була виявлена менша тенденція до агрегації (фіг. 4) в процесі зберігання (у порівнянні з версіями без мутацій І253А, НЗІ10А і Н4іЗ5А в Ес- ділянці), що має вирішальне значення для введення в склоподібне тіло ока (оскільки агрегація в оці може призводити до ускладнень в процесі такого лікування). Біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, мають високу ефективність щодо придушення судинних захворювань.
У деяких варіантах здійснення винаходу біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, завдяки їх специфічним модифікаціям в константній ділянці (наприклад, РЗ290 ГАГА), (610) відрізняються цінними властивостями, такими як відсутність зв'язування з Есгамма-
рецепторами, що знижує ризик побічних дій, таких як тромбоз і/або небажана клітинна загибель (пов'язана, наприклад, з АОСС).
Опис креслень
На кресленнях показано: на фіг. 1 - схема, що ілюструє концепцію та переваги антитіл до МЕСЕ-АМа-2 («МЕСЕ-АМа- 2») ІДа1- або Ідс4-типу з мутаціями ААА (мутації І253А, НЗІ1ТОА їі Н4З5А - нумерація згідно ЕЮ- індексу Кебота); на фіг. 2 - результати вимірювань в'язкості в лабораторних умовах на основі 0 5 (динамічне розсіювання світла). Представлені дані про отриману шляхом екстраполяції в'язкість при 150 мг/мл в 200мМ аргініні/сукцинаті, рН 5,5 (порівняння антитіл «МЕСЕ-АМа-2», запропонованих у винаході, МЕсРапд2-0016 (з ААА-мутаціями) з референс-антитілом МЕСЕапод2-0015 (без ААДА- мутацій)); на фіг. З - отримані за допомогою 0 5 дані про агрегації в залежності від температури (які включають отримані за допомогою 05 дані про температуру початку агрегації) в 20мМ Нів, 140мМ Масі, рн 6,05 (порівняння антитіл «МЕСЕ-АМО-2», запропонованих у винаході,
МЕС апд2г-0016 (з ААА-мутаціями) з референс-антитілом МЕсСЕапд2-0015 (без ААА-мутацій); на фіг. 4 - дані про зберігання протягом 7 днів при 40 "С в концентрації 100 мг/мл (зниження основного піку і підвищення піку, відповідного високомолекулярним (НМУМ) видам (порівняння антитіл «МЕСЕ-АМО-2», запропонованих у винаході, МЕсСРапд2-0016 (з ААА-мутаціями), для яких характерна більш низька агрегація, з референс-антитілом МЕсСЕапд2-0015 (без ААА- мутацій); на фіг. 5А - дані про афінність до БсКп в стабільному стані МЕсРапд2-0015 (без ААДА- мутацій): накладення Віасоге-сенсограмм, отриманих при різних концентраціях, демонструє залежне від концентрації зв'язування МЕсРапд2-0015 (без ААА-мутацій) з Ес; на фіг. 5Б - дані про афінність до ЕсКп в стабільному стані антитіла, представленого на фіг.
БА: МЕС;Рапда-0015 (без АдА-мутацій): крива залежності зв'язування від концентрації
МЕС Рапд2г-0015 (без ААА-мутацій), що описує зв'язування з ЕсКп; на фіг. 5В - дані про афінність до БсКп в стабільному стані МЕсСРапд2-0016 (з ААА- мутаціями): накладення Віасоге-сенсограмм, отриманих при різних концентраціях, демонструє відсутність зв'язування з ЕсКп при всіх концентраціях; на фіг. 5Г - дані про афінність до БсКп в стабільному стані МЕсОГБапд2-0016 (з ААДА- мутаціями): крива залежності зв'язування від концентрації МЕсЕРапд2-0016 (з ААА-мутаціями, демонструє відсутність зв'язування з ЕсКп; на фіг. 5Д - дані про афінність до БсКп в стабільному стані МЕсРапд2-0016 (з ААА- мутаціями): крива залежності зв'язування від концентрації МЕсРапд2-0016 (з ААА-мутаціями), демонструє відсутність зв'язування з ЕсКп (діапазон відповіді від -0О,6 до 0, 2 КО/діапазони концентрацій від 0 до 0,35М); на фіг. 6 - результати кількісної оцінки взаємодії ЕсгаммакЦШа з МЕсЕРапд2-0015 без АдДА- мутацій і МЕсСЕРапд2-0016 з ААА-мутаціями (обидва у вигляді антитіл ЇІдсе1-підкласу з мутаціями
РЗ290 ГАГА; в якості контролю застосовували антитіло до ід Ідс1-підклассу і антитіло, основою якого був досі); на фіг. 7А - схема, що ілюструє принцип застосовуваного для вивчення ФК ЕГІЗА-аналізу, призначеного для визначення концентрацій біспецифічних антитіл «МЕСЕ/Апд2» в сироватці і лізату всього ока; на фіг. 7Б - концентрація в сироватці після внутрішньовенного введення: порівняння сполук
МЕС апд2г-0015 без АДА-мутацій і МЕсСГРапд2-0016 з ААА-мутаціями; на фіг. 7В - концентрація в сироватці після інтравітреального введення: порівняння сполук
МЕС апд2г-0015 з ДАА-мутаціями та МЕСЕапда2г-0016 без ААА-мутацій; на фіг. 7Г - концентрація в очних лізата МЕсРапд2-0016 (з ААА-мутаціями) у правому та лівому оці (після інтравітреального введення тільки в праве око в порівнянні з внутрішньовенним введенням): після інтравітреального введення значні концентрації вдалося виявити тільки в правому оці. Після внутрішньовенного введення в лізатах очей не вдалося виявити ніяких концентрацій через невеликий час напівжиття в сироватці МЕсСЕРапд2-0016 (з
ААА-мутацією); на фіг. 7Д - концентрація очних в лізатах МЕСЕРапд2-0015 (без ААА-мутації) правого і лівого ока (після інтравітреального введення тільки в праве око в порівнянні з внутрішньовенним введенням): в правому оці (і в деякій мірі в лівому оці) після інтравітреального введення вдалося виявити концентрації МЕсЕРапд2-0015. Це свідчить про дифузію з правого ока в сироватку і з неї в ліве око, що можна пояснити тривалим часом напіввиведення МЕСЕапдаг- (610) 0015 (без ААА-мутації). Після внутрішньовенного введення вдалося також виявити значні концентрації в лізатах обох очей в результаті дифузії в ока, що зберігає стабільність в сироватці
МЕС апд2-0015 (без ААА-мутації).
Детальний опис винаходу
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло, пропоноване у винаході, є двовалентним.
В одному з об'єктів винаходу вказане біспецифічне двовалентне антитіло, пропоноване у винаході, відрізняється тим, що містить а) важкий ланцюг і легсий ланцюг першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з МЕОЕ; б) модифікований важкий ланцюг і модифікований легкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з АМО-2, в якому константні домени СІ. і СНІ замінені один на одного.
Зазначений формат біспецифічного двовалентного антитіла в якості біспецифічного антитіла, що специфічно зв'язується з людським судинним ендотеліальним фактором росту (МЕСЕ) і людським ангіопоетіном-2 (АМО-2), описаний у УМО 2009/080253 (включаючи модифіковані за допомогою технології "Кпор5-іпіо-поЇїе5" (забезпечення взаємодії по типу "виступи-у западини") СНЗ-домени). Антитіла, основою яких є зазначений формат біспецифічного двовалентного антитіла, позначають як Сто55Маб.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двовалентне антитіло відрізняється тим, що містить а) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 25 ї в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 27, і б) в якості модифікованої важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 26 і в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 28.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двовалентне антитіло відрізняється тим, що містить а) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 21 ї в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23, і б) в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 22 і в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 24.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двовалентне антитіло відрізняється тим, що містить а) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 29 ї в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 31, і б) в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 30 ї в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 32.
Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМоО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО
ІО МО: 27 ї БЕО ІО МО: 28.
Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕСРЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 22, 5ЕО
ІО МО: 23 ї БЕО ІО МО: 24.
Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ФЕО ІЮ МО: 29, 5ЕО ІЮ МО: 30, 5ЕО
ІО МО: 31 ї БЕО ІО МО: 32.
Іншим об'єктом винаходу є біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, що відрізняється тим, що містить (610) а) важкий ланцюг і легсий ланцюг першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з МЕОЕ; б) важкий ланцюг і легкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з АМО-2, в якому М-кінець важкого ланцюга з'єднаний з С-кінцем легкого ланцюга через пептидний лінкер.
Зазначений формат біспецифічного двовалентного антитіла в якості біспецифічного антитіла, що специфічно зв'язується з людським судинним ендотеліальним фактором росту (МЕСЕ) і людським ангіопоетином-2 (АМО-2), описаний в УМО 2011/117330, включаючи модифіковані за допомогою технології "Кпоб5-іпіо-поЇе5" СНЗ-домени. Антитіла, основою яких є зазначений формат біспецифічного двовалентного антитіла, позначають як ОА5сЕар.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двовалентне антитіло відрізняється тим, що містить а) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 33 ї в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 35, і б) в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, поєднаного з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла через опептидний лінкер, амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 34.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двовалентне антитіло відрізняється тим, що містить а) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 36 їі в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 38, і б) в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, поєднаного з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла через опептидний лінкер, амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 37.
В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельний домен важкого ланцюга антитіла (МН) і варіабельний домен легкого ланцюга антитіла (МІ) важкого та легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла стабілізують дисульфідом шляхом інтродукції дисульфідного зв'язку між наступними положеннями: становище 44 в варіабельному домені важкого ланцюга і положення 100 в варіабельному домені легкого ланцюга (нумерація у всіх випадках згідно ЄО- індексу Кебота (Кабраї ЕА та ін., Зедоепсе5 ої Ргоїеїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегевбі, п'ятий вид.,
Рибіїс Неайй Зегмісе, Мабопаї Іпзійшев5 ої Неацй, Веїпезаа, МО, 1991). Зазначеною додатковою стабілізацією дисульфідом досягають шляхом інтродукції дисульфідного зв'язку між варіабельними доменами МН і Мі. важкого та легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла.
Методики інтродукції дисульфідних містків для стабілізації, що не зустрічаються в природних умовах, описані, наприклад, у УМО 94/029350, у Ка|адораї М. та ін., Ргої. Епдіп. 10, 1997, сс. 1453-1459; Кобрауабвпі та ін., Мисієаг Меадісіпе 8. Віоіоду 25, 1998, сс. 387-393 або 5сптіаї М. та ін., Опсодепе 18, 1999, сс. 1711-1721.
Одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕСОБЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІО МО: 33, 5ЕО ІЮО МО: 34 і БЕО ІО МО: 35.
Одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО МО: 36, 5ЕО ІЮО МО: 37 и БЕО ІЮО МО: 38.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу СНЗ-домени біспецифічного двовалентного антитіла, запропонованого у винаході, змінюють за допомогою технології "КпоБ- іпіо-поЇїе5", яка описана детально за допомогою декількох прикладів, наприклад, у УМО 96/027011, у Кіддулау 9.В. та ін., Ргоївіп Епд 9, 1996, сс. 617-621 і Мегопапі А.М. та ін., Маї
Віотесппої 16, 1998, сс. 677-681. При здійсненні цього методу поверхні взаємодії двох СНЗ- доменів змінюють з метою підвищення гетеродимерізації обох важких ланцюгів, що містять два зазначених СНЗ-домена. Кожен з двох СНЗ-доменів (двох важких ланцюгів) може являти собою "виступ", а інший являти собою "западину". Інтродукція дисульфідного містка стабілізує гетеродимери (Мегспапі АМ та ін., Майшге Віоїесп 16, 1998, сс. 677-681; Аїмм'еї| 5. та ін., у). Мої.
Віої. 270, 1997, сс. 26-35) і підвищує вихід.
В кращому об'єкті винаходу все біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, відрізняються тим, що
СНЗ-домен одного важкого ланцюга і СНЗ-домен іншого важкого ланцюга кожен вступає в (610) контакт на поверхні розділу, яка представляє собою вихідну поверхню розділу між СНЗ-
доменами антитіла, де зазначену поверхню змінюють так, щоб сприяти утворенню біспецифічного антитіла, де зміна відрізняється тим, що а) змінюють СНЗ-домен одного важкого ланцюга, так, що у вихідній поверхні розділу СНЗ-домену одного важкого ланцюга, яка контактує з вихідною поверхнею розділу СНЗ-домену іншого важкого ланцюга в біспецифічному антитілі, амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, який має більший обсяг бічного ланцюга, створюючи тим самим опуклість на поверхні розділу СНЗ-домену одного важкого ланцюга, що може поміщатися в порожнину в поверхні розділу СНЗ-домену іншого важкого ланцюга, і б) змінюють СНЗ-домен іншого важкого ланцюга, так, що у вихідній поверхні розділу другого СНЗ-домена, яка контактує з вихідною поверхнею розділу першого СНЗ-домена в біспецифічеому антитілі, амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, який має менший обсяг бічного ланцюга, створюючи тим самим порожнину в поверхні розділу другого СНЗ-домену, в яку може поміщатися опуклість на поверхні розділу першого СНЗ-домена.
Таким чином, антитіло, запропоноване у винаході, відрізняється тим, що
СНЗ-домен першого важкого ланцюга повнорозмірного антитіла, зазначеного в підпункті а), і
СНЗ-домен другого важкого ланцюга повнорозмірного антитіла, зазначеного в підпункті б), кожен вступає в контакт на поверхні розділу, яка має зміну у вихідній поверхні розділу між СНЗ- доменами антитіла, де І) в СНЗ-домені одного важкого ланцюга амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, який має більший обсяг бічного ланцюга, створюючи тим самим опуклість на поверхні розділу СНЗ-домену одного важкого ланцюга, що може поміщатися в порожнину в поверхні розділу СНЗ-домену іншого важкого ланцюга, і де ІЇ) в СНЗ-домені другого важкого ланцюга амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, який має менший обсяг бічного ланцюга, створюючи тим самим порожнину в поверхні розділу другого СНЗ-домену, в яку може поміщатися опуклість на поверхні розділу першого СНЗ-домена.
Краще амінокислотний залишок, який має більший обсяг бічного ланцюга, вибирають з групи, що складається з аргініну (К), фенілаланіну (Р), тирозину (СУ), триптофану (Л/).
Краще амінокислотний залишок, який має менший обсяг бічного ланцюга, вибирають з групи, що складається з аланіну (А), серину (5), треоніну (Т), валіну (М).
В одному з об'єктів винаходу обидва СНЗ-домени додатково змінюють шляхом інтродукції амінокислоти цистеїну (С) у відповідні положення кожного СНЗ-домена, так, щоб міг утворюватися дисульфідний місток між обома СНЗ-доменами.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить мутацію Т36бУМ в
СНЗ-домені "ланцюга з виступами" і мутації 73665, І 368А, М407М в СНЗ-домені "ланцюга з западиною". Можна застосовувати також додатковий міжланцюговий дисульфідний місток між
СНЗ-доменами (Мегспапі А.М та ін., Маїиге Віоїесіп 16, 1998, сс. 677-681), наприклад, шляхом інтродукції мутації У349С в СНЗ-домен "ланцюга з виступами" і мутації ЕЗ56С або мутації з354С в СНЗ-домен "ланцюга з западиною".
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить мутації У349С, Т366УУ в одному з двох СНЗ-доменів і мутації ЕЗ5б6С, 73665, І 368А, у407М у другому з двох СНЗ- доменів. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить мутації
У349С, Т366УУ в одному з двох СНЗ-доменів і мутації 5354С, 73665, І З368А, у407М у другому з двох СНЗ-доменів (додаткова мутація У349С в одному з СНЗ-доменів і додаткова мутація
ЕЗ56С або 5354С в іншому СНЗ-домені призводить до утворення міжланцюгового дисульфідного містка) (нумерація у всіх випадках згідно ЕО-індексу Кебота (Кабаї та ін., зедцепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипо!одісаї Іпіегеві, п'ятий вид., вид-во Рибіїс Неакй 5егмісе, Майопаї!
Іпвійшевз ої Неапйй, Веїйезаа, МО, 1991)). В альтернативному або додатковому варіанті можна застосовувати також інші варіанти технології "КпоБр5-іп-поЇе5", представлені в ЕР 1870459 А1.
Так, іншим прикладом мутацій для біспецифічного антитіла є мутації 4090; КЗ7ОЕ в СНЗ- домені "ланцюга з виступами" і мутації 0О399К; ЕЗ57К в СНЗ-домені "ланцюга з западиною" (нумерація у всіх випадках згідно ЕЮО-індексу Кебота (Кабаї та ін., Зедоепсе5 ої Ргоївїіп5 ої
Ітітипоїодіса! Іпієте5і, 5-е вид., вид-во Рибіс Неакй Зегмісе, Майопа! Іпзійшще5 ої Неак,
Веїпезаа, МО, 1991)). (610) В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить мутацію Т36бУМ в СНЗ-
домені "ланцюга з виступами" і мутації 73665, І 368А, У407М в СНЗ-домені "ланцюга з западиною" і додатково мутації К4090; КЗ7ОЕ в СНЗ-домені "ланцюга з виступами" і мутації
О0399К; ЕЗ357К в СНЗ-домені "ланцюга з западиною".
В іншому варіанті здійснення винаходу біспецифічне антитіло містить мутації У349С, Т36буУУ в одному з двох СНЗ-доменів і мутації 5354, 73665, І 368А, у407М у другому з двох СНЗ- доменів або зазначене трьохвалентне біспецифічне антитіло містить мутації У349С, Т366УМ в одному з двох СНЗ-доменів і мутації 5354С, 73665, І З368А, 407 у другому з двох СНЗ-доменів і додатково мутації К4090; КЗ70Е в СНЗ-домені "ланцюга з виступами" і мутації О399К; ЕЗ57К в
СНЗ-домені "ланцюга з западиною".
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, відрізняється наявністю одного або декількох наступних властивостей (для визначення яких застосовують аналізи, описані в прикладі 6) - характеризується більш низькою концентрацією в сироватці порівняно з відповідним біспецифічним антитілом без мутацій, зазначених у підпункті Ії) (через 96 годин після введення в склоподібне тіло у мишей, які мають дефіцит мишачого ЕсКп, але являються гемізиготними трансгенними за людським ЕскКп); - характеризується подібною (фактор 0,8-1,2) концентрацією в лізатах всього правого ока порівняно з відповідним біспецифічним антитілом без мутацій, зазначених у підпункті І) «у мишей, які мають дефіцит мишачого ЕсКп, але є гемізиготними трансгенними за людським
ЕсКп, через 96 годин після введення в склоподібне тіло правого ока).
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двухвалентноеє антитіло відрізняється тим, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським
АМас-2, що відрізняються тим, що
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (МН) 5ЕО ІО МО: 7 і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) ЗЕО
ІО МО: 8; і
І) зазначений другий антигензв'язуючий центр містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (МН) ЗЕО ІЮ МО: 15 і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) ЗЕО зо ІО МО: 16, ї
І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга підкласу ДС або 904 (виведену з людського антитіла) і містить мутації І253А, НЗ10А ї Н4іЗ5А (нумерація згідно
Еи-індексу Кебота), і відрізняється наявністю одного або декількох наступних властивостей (для визначення яких застосовують аналізи, описані в прикладі б) - характеризується більш низькою концентрацією в сироватці порівняно з відповідним біспецифічним антитілом без мутацій, зазначених у підпункті І) (через 9б годин після інтравітреального введення мишам, які мають дефіцит мишачого ЕсКп, але є гемізиготними трансгенними за людським ЕскКп); - характеризується подібною (відрізняються в 0,8-1,2 рази) концентрацією в лізатах всього правого ока порівняно з відповідним біспецифічним антитілом без мутацій, зазначених у підпункті І) (у мишей, які мають дефіцит мишачого ЕсКп, але є гемізиготними трансгенними за людським ЕсКп, через 96 годин після інтравітреального введення в праве око).
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне двовалентне антитіло відрізняється тим, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським
МЕСРЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняються тим, що
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (МН) ЗЕО ІЮО МО: 7 з 1, 2 або 3 амінокислотними замінами і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) ЗЕО ІЮ МО: 8 з 1, 2 або 3 амінокислотними замінами; і
І) зазначений другий антигензв'язуючий центр містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (МН) ЗЕО ІЮ МО: 15 з 1, 2 або 3 амінокислотними замінами і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (М) ЗЕО ІЮ МО: 16 з 1, 2 або 3 амінокислотними замінами, і
І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга підкласу ДС або 904 (виведену з людського антитіла) і містить мутації І253А, НЗ10А ї Н4іЗ5А (нумерація згідно
Еи-індексу Кебота), і відрізняється наявністю одного або декількох наступних властивостей (для визначення яких (610) застосовують аналізи, описані в прикладі б)
- характеризується більш низькою концентрацією в сироватці порівняно з відповідним біспецифічним антитілом без мутацій, зазначених у підпункті І) (через 9б годин після інтравітреального введення мишам, які мають дефіцит мишачого ЕсКп, але є гемізиготними трансгенними за людським ЕскКп); - характеризується подібною (відрізняються в 0,8-1,2 рази) концентрацією в лізатах всього правого ока порівняно з відповідним біспецифічним антитілом без мутацій, зазначених у підпункті ІІ) "у мишей, які мають дефіцит мишачого ЕсКп, але є гемізиготними трансгенними по людському ЕсКп, через 96 годин після інтравітреального введення в праве око).
У контексті даного опису поняття "антитіло" належить до зв'язуючого білку, який містить антигензв'язуючі центри (сайти). Поняття "зв'язуючий сайт" або "антигензв'язуючий центр" в контексті даного опису означає область (ї) молекули антитіла, в якій (ими) фактично пов'язується ліганд. "Антигензв'язуючий центр" містить варіабельні домени важкого ланцюга антитіла (МН) і варіабельні домени легкого ланцюга антитіла (МІ) (пара МН/Л).
Поняття "специфічність антитіла" належить до виборчого розпізнавання антитілом конкретного епітопу антигену. Антитіла, що зустрічаються в природних умовах, є, наприклад, моноспецифічними.
Згідно винаходу "біспецифічні антитіла" представляють собою антитіла, які мають дві різні антигензв'язуючі специфічності. Антитіла, пропоновані в даному винаході, є специфічними відносно двох різних антигенів, МЕСЕ в якості першого антигену і АМО-2 в якості другого антигену.
У контексті даного опису поняття "моноспецифічне" антитіло означає антитіло, яке має один або декілька зв'язуючих сайтів, кожен з яких зв'язується з одним і тим же епітопом одного і того ж антигену.
У контексті даного опису поняття "валентний" означає присутність конкретної кількості зв'язуючих сайтів в молекулі антитіла. Так, поняття "двовалентний", "чотирьохвалентний" і "шестивалентний" означає присутність двох зв'язуючих сайтів, чотирьох зв'язуючих сайтів і шести зв'язуючих сайтів відповідно в молекулі антитіла. Біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, краще є "двовалентними".
У контексті даного опису поняття "МЕСЕ" належить до людського судинного ендотеліального фактора росту (МЕСЕ/Л/ЕСБЕ-А), тобто такому, що складається з 165 амінокислот, фактору росту людських ендотеліальних клітин судин (амінокислоти 27-191 послідовності-попередника людського МЕСЕ165: 5ЕО ІЮО МО: 17; амінокислоти 1-26 позначають сигнальний пептид), і до споріднених ізоформ 121, 189 ії 206 фактора росту ендотеліальних клітин судин, які описані у
Гейпд ОМ. та ін., зсіепсе 246, 1989, сс. 1306-1309; НоискК та ін., Мої. Епдосгіп. 5, 1991, сс. 1806- 1814; Кеск Р.). та ін., Зсіепсе 246, 1989, сс. 1309-1312 ії СоппоїПу О.Т. та ін., У. ВіоЇ. Спет. 264, 1989, сс. 20017-20024; а також до таких, що зустрічаються в природних умовах алельних і процесованих форм зазначених факторів росту. МЕСЕ бере участь у регуляції нормального і аномального ангіогенезу і неоваскуляризації, асоційованої з пухлинами та внутрішньоочними хворобами (Регїтага М. та ін., Епдаосг. Кем. 18, 1997, сс. 4-25; ВегКтап Е.А. та ін., 9У. Сііп. Іпмеві. 91, 1993, сс. 153-159; Вгом/п І.Г. та ін., Нитап Раїйої. 26, 1995, сс. 86-91; Вгомуп І.Р. та ін.,
Сапсег Ке5. 53, 1993, сс. 4727-4735; Мацегп 9. та ін., Вгй. У. Сапсег. 73, 1996, сс. 931-934 і
Омогак Н.Р. та ін., Ат. 9. Раїйої. 146, 1995, сс. 1029-1039). МЕСЕ являє собою гомодимерний глікопротеїн, який був виділений з декількох джерел і включає кілька ізоформ. Для МЕСЕ характерна висока специфічна мітогенна активність щодо ендотеліальних клітин.
У контексті даного опису поняття "АМО-2" належить до людського ангіопоетину-2 (АМа-2) (який скороченого позначають як АМОРТ2 або АМО2) (5БО ІЮ МО: 18), який описаний, наприклад, у Маїізопріегте РС та ін., Зсіепсе 277,1997, сб. 55-60 і Спешипод А.Н. та ін., вепотіс5 48, 1998, сс. 389-391. Ангіопоетини-1 (ЗЕО ІО МО: 19) і -2 описані в якості лігандів Тіє, сімейства тирозинкіназ, які вибірково експресуються в судинному ендотелії (Уапсорошо5 СО та ін., Маїиге 407, 2000, 242-248). В даний час відомо чотири певних представника сімейства ангіопоетину.
Ангіопоетин-3 і -4 (Апд-3 і Апд-4) можуть являти собою відмінні широким розмаїттям копії одного і того ж генного локусу у мишей і людини (Кіт І. та ін., РЕВ5З І єї, 443, 1999, сс. 353-356; Кіт І. та ін. У Віої Спет 274, 1999, сс. 26523-26528). АМО-1 і АМО-2 вперше ідентифіковані в експериментах, проведених на культурах тканини, в якості агоніста і антагоніста відповідно (див. стосовно АМО-1: Юамі5 5. та ін., Се 87, 1996, сс. 1161-1169; і стосовно АМО-2:
Маїізопріеге Р.С. та ін., Зсіепсе 277, 1997, сс. 55-60). Всі відомі ангіопоетини зв'язуються, насамперед, з Тіе2 (ЗЕО ІЮ МО: 20), а афінність зв'язування обох Апод-1 і -2 з Тіе2 становить
ЗНМ (Ка) (Маїізопріеє!їте Р.С. та ін., Зсіепсе 277, 1997, со. 55-60).
Антигензв'язуючі центри біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході, містять шість (610) гіперваріабельних ділянок (СОК), які обумовлюють різні рівні афінності зв'язуючого антиген центру. Присутні три СОЕ в варіабельному домені важкого ланцюга (СОКНІ, СОН? і СОКНУЗ) і три СОК в варіабельному домені легкого ланцюга (СОКІ 1, СОКІ2 і СОМ 3). Протяжність СОК і каркасних ділянок (ЕК) визначають шляхом порівняння з компільованою базою даних амінокислотних послідовностей, в яких ці області визначені на основі варіабельності між послідовностями.
Антитіла, запропоновані у винаході, містять константні області імуноглобулінів, одержані з людських імуноглобулінів одного або декількох класів, де зазначені класи імуноглобулінів включають класи Ідс, ІМ, ІдА, дО і дЧЕ і у випадку Ідо і ІдДА їх підкласи, насамперед Ідс1 і дстсаі.
У контексті даного описі поняття "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла" належать до препарату молекул антитіл з однаковим амінокислотним складом.
Поняття "химерне антитіло" належить до антитіла, що містить варіабельну ділянку, тобто зв'язуючу ділянку, з одного джерела або виду і щонайменше частину константної області, виведену з іншого джерела або виду, як правило, отриманому за допомогою методів рекомбінантної ДНК. Кращими є химерні антитіла, що містять мишачу варіабельну ділянку і людську константну ділянку. Іншими кращими формами "химерних антитіл", що підпадають під обсяг винаходу, є антитіла, константна ділянка яких модифікована або змінена в порівнянні з вихідним антитілом для створення властивостей, запропонованих у винаході, насамперед які стосуються С1д-зв'язування і/або зв'язування Ес-рецептора (ГСК). Зазначені химерні антитіла позначають також як "антитіла перемикання класу". Химерні антитіла є продуктом експресованих генів імуноглобулінів, що містять ДНК-сегменти, які кодують варіабельні ділянки імуноглобуліну, і ДНК-сегменти, які кодують константні ділянки імуноглобуліну. Методи створення химерних антитіл включають загальноприйняті методи рекомбінантної ДНК і генної трансфекції, які добре відомі в цій галузі (див., наприклад, Могтізоп 5... та ін., Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОБА 81, 1984, сс. 6851-6855; 05 5202238 і 05 5204244.
Поняття "гуманізоване антитіло" належить до антитіл, в яких каркасна ділянка або гіперваріабельні ділянки ("такі, що визначають компліментарність ділянки" (СОК)) модифіковані так, що містять СОК імуноглобуліну іншої специфічності відносно батьківського імуноглобуліну.
У кращому варіанті здійснення винаходу мишачий СОК трансплантують в каркасну ділянку людського антитіла для одержання "гуманізованого антитіла" (див., наприклад, Кіесптапп Г. та ін., Майиге 332, 1988, сс. 323-327 і Меибегдег М.5. та ін., Майиге 314, 1985, сс. 268-270). Найбільш кращі СОК відповідають ділянкам, які представлені послідовностями, що розпізнають антигени, зазначеним вище для химерних антитіл. Іншими формами "гуманізованих антитіл", що підпадають під обсяг винаходу, є антитіла, константна ділянка яких додатково модифікована або змінена в порівнянні з вихідним антитілом для створення властивостей, запропонованих у винаході, насамперед які стосуються С1д-зв'язування і/або зв'язування Ес-рецептора (ГСК).
У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "людське антитіло" належить до антитіл, які мають варіабельні і константні ділянки, виведені з послідовностей імуноглобулінів людської зародкової лінії. Людські антитіла добре відомі в даній області (мап Бі)К М.А. і мап де
Уміпкеї! 9У.., Сип. Оріп. Спет. Віої. 5, 2001, сс. 368-374). Людські антитіла можна одержувати також у трансгенних тваринах (наприклад, мишах), які можуть після імунізації продукувати весь спектр людських антитіл або відібрані людські антитіла у відсутності ендогенного виробництва імуноглобулінів. Перенесення масиву генів імуноглобулінів людської зародків лінії в таких несучих мутант зародковій лінії мишей може призводити до виробництва людських антитіл після контрольного зараження антигеном (див., наприклад, ЧакКобомії5 А. та ін., Ргос. Май. Асай. 5бі.
БА 90, 1993, сб. 2551-2555; дакоромії5 А. та ін., Маїиге 362, 1993, сс. 255-258; Вппеддетапп М. та ін., Меаг Іттипої. 7, 1993, сс. 33-40). Людські антитіла можна одержувати також у фагових дисплейних бібліотеках (Ноодепроот Н.М. і ММіпіег ., У. Мої. Віої. 227, 1992, сс. 381-388; Магїк5
У.О. та ін., У. Мої. Віої. 222, 1991, сс. 581-597). Для одержання людських моноклональних антитіл можна застосовувати також методики, розроблені СоІе А. зі співавторами і Воегпег Р. зі співавторами (Соїе А. та ін., Мопосіопа! Апіїбодієх апа Сапсег ТПпегару, вид-во І і55 А.Г.., 1985, с. 77 і Воепег Р. та ін., У. Іттипої. 147, 1991, сс. 86-95). Як уже вказувалося для химерних і гуманізованих антитіл, запропонованих у винаході, в контексті даного опису поняття "людське антитіло" належить також до антитіл, константна ділянка яких модифікована для створення властивостей, запропонованих у винаході, насамперед які стосуються С1д-зв'язування і/або зв'язування Ес-рецептора (БСК), наприклад, шляхом "перемикання класу", тобто зміни або мутації Ес-ділянок (наприклад, з ІДС1 на Ідс4 і/або мутація І(ДС1/дої).
У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "рекомбінантне антитіло" включає всі людські антитіла, які одержані, експресувати, створені або виділені методами рекомбінації, 10) наприклад, антитіла, виділені з клітини-хазяїна, такий як М50- або СНоО-клітина або з тваринного (наприклад, миші), трансгенного по генам людського імуноглобуліну, або антитіла, експресовані за допомогою рекомбінантного експресійного вектора, яким трансфектована клітина-хазяїн. Зазначені рекомбінантні антитіла мають варіабельні і константні ділянки в перетвореній формі. Рекомбінантні антитіла, запропоновані у винаході, піддавалися соматичній гіпермутації іп мімо. Так, амінокислотні послідовності УН- і МІ -областей рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча виведені і споріднені послідовностям МН і МІ. людській зародковій лінії можуть не існувати в природних умовах в популяції антитіл людської зародкової лінії іп мімо.
У контексті даного опису "варіабельний домен" (варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), варіабельний домен важкого ланцюга (УН)) позначає кожну з пари з легких і важких ланцюгів, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Домени варіабельних людських легких і важких ланцюгів мають однакову загальну структуру, і кожен домен містить чотири каркасних ділянки (ЕК), послідовності яких мають виражений консерватизм, з'єднані трьома "гіперваріабельними ділянками" (або такими, що визначають комплементарність ділянками, СОК). Каркасні ділянки адаптовані до р-складчастої конформації, а СОК можуть утворювати петлі, що з'єднують р-складчасту структуру. СОК в кожному ланцюзі зберігають свою тривимірну структуру за допомогою каркасних ділянок і утворюють разом з СОК з іншого ланцюга антигензв'язуючий центр. СОКЗ- ділянки важкого і легкого ланцюга антитіла відіграють найбільш важливу роль в специфічності/"афінності зв'язування антитіл, запропонованих у винаході, і тому є додатковим об'єктом винаходу.
У контексті даного опису поняття "гіперваріабельна ділянку" або "антигензв'язуюча ділянка антитіла" належить до амінокислотних залишків, які відповідальні за зв'язування антигену.
Гіперваріабельна ділянка містить амінокислотні залишки з "визначальних комплементарність ділянок" або "СОМ". "Каркасні ділянки" або "ГК"-ділянки являють собою ділянки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельних ділянок, зазначених у цьому описі. Таким чином, легкі і важкі ланцюги антитіла містять в напрямку від М- до С-кінця домени ЕК, СОК'І,
ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕК4. СОК на кожному ланцюзі розділені зазначеними амінокислотами каркасної ділянки. СОКЗ важкого ланцюга являє собою ділянку, яка вносить основний вклад в зв'язування антигену. СОК- і ЕК-ділянки визначають згідно стандартному визначенню Кабвраї ЕА та ін., зЗедцепсев5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегеб5і, 5-е вид., вид-во Рибріїс Неакй зегмісе,
Маїогпаї Іпбійшез ої Неац, ВеїПезаа, МО, 1991.
У контексті даного опису поняття "зв'язування" або "специфічне зв'язування" належить до зв'язування антитіла з епітопом антигену (або людського МЕСЕ, або людського АМО-2), встановленому в аналізі іп міго, краще аналізі на основі поверхневого плазмонного резонансу (ВІАсоге, фірма СЕ-Неайпсаге Упсалла, Швеція), з очищеним антигеном дикого типу. Афінність зв'язування оцінюють в поняттях Ка (константа швидкості асоціації антитіла/(антигену в комплекс), Ко (константа дисоціації) і Ко (Ко/ка). В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язування або специфічне зв'язування характеризується афінністю зв'язування (Ко), що становить 102 моля/л або менше, в одному з варіантів здійснення від 1029М до 10-13 моля/л.
Поняття "епітоп" належить до будь-якої поліпептидної детермінанти, що має здатність специфічно зв'язуватися з антитілом. У деяких варіантах здійснення винаходу епітопна детермінанта хімічно включає активні розташовані на поверхні групи молекул, таких як амінокислоти, бічні ланцюги амінокислот, фофоріл або сульфоніл, і в деяких варіантах здійснення винаходу, може мати специфічні характеристики тривимірної структури і/або специфічні характеристики заряду. Епітоп являє собою ділянку антигену, яка зв'язується з антитілом.
У деяких варіантах здійснення винаходу вважається, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли воно вибірково розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків і/або макромолекул.
Поняття "повнорозмірне антитіло" належить до антитіла, що складається з двох "важких ланцюгів повнорозмірного антитіла" і двох "легких ланцюгів повнорозмірного антитіла". "Важкий ланцюг повнорозмірного антитіла" являє собою поліпептид, що містить в напрямку від М-кінця до С-кінця важкого ланцюга антитіла варіабельний домен (МН), домен 1 константної ділянки важкого ланцюга антитіла (СНІ), шарнірну ділянку антитіла (НЕ), домен 2 константної ділянки важкого ланцюга антитіла (СН) і домен З константної ділянки важкого ланцюга антитіла (СНЗ), що скорочено позначають як МН-СНІ-НА-СН2-СНЗ; і необов'язково домен 4 константної ділянки важкого ланцюга антитіла (СН4) у разі антитіла підкласу ІДЕ. Краще "важкий ланцюг повнорозмірного антитіла" являє собою поліпептид, що містить в напрямку від М-кінця до С- кінця МН, СНІ, НК, СН2 ї СНЗ. "Легкий ланцюг повнорозмірного антитіла" являє собою (610) поліпептид, що містить в напрямку від М-кінця до С-кінця легкого ланцюга антитіла варіабельний домен легкого ланцюга антитіла (МІ) ії константний домен легкого ланцюга антитіла (СІ), що скорочено позначають як МІ-С. Константний домен легкого ланцюга антитіла (СУ) може бути к-(каппа) або А-(лямбда) типу. Два ланцюги повнорозмірного антитіла пов'язані один з одним через межполіпептидні дисульфідні зв'язки між Сі -доменом і СН1-доменом і між шарнірними областями важких ланцюгів повнорозмірного антитіла. Прикладами типових повнорозмірних антитіл є такі, що зустрічаються в природних умовах антитіла типу се (наприклад, ІДдС1 і Ід2), І9М, ІдЧА, ІдО і ЧЕ. Повнорозмірні антитіла, запропоновані у винаході, можуть мати походження з одного виду, наприклад, людини, або вони можуть являти собою химерні або гуманізовані антитіла. Повнорозмірні антитіла, запропоновані у винаході, містять два антигензв'язуючих центри, кожний утворено парою МН і Мі, які обидва специфічно зв'язуються з одним і тим же антигеном. Під С-кінцем важкого або легкого ланцюга зазначеного повнорозмірного антитіла розуміють останню амінокислоту на С-кінці зазначеного важкого або легкого ланцюга. Під М-кінцем важкої або легкого ланцюга зазначеного повнорозмірного антитіла розуміють останню амінокислоту на М-кінці зазначеного важкого або легкого ланцюга.
У контексті винаходу під "пептидним лінкером" розуміють пептид, що містить амінокислотні послідовності, який краще має синтетичне походження. Зазначені пептиди, запропоновані у винаході, застосовують для з'єднання С-кінця легкого ланцюга з М-кінцем важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла (яке специфічно зв'язується з другим антигеном) через пептидний лінкер. Пептидний лінкер в важкому і легсому ланцюзі другого повнорозмірного антитіла являє собою пептид, амінокислотна послідовність якого складається щонайменше з 30 амінокислот, краще з 32-50 амінокислот. В одному з варіантів здійснення винаходу пептидний лінкер являє собою пептид, амінокислотна послідовність якого складається з 32-40 амінокислот.
В одному з варіантів здійснення винаходу вказаний пептидний лінкер являє собою (сх5)п, де
С-гліцин, 5-:серин, (х-3, п-8, 9 або 10 їі т-0, 1, 2 або 3) або (х-4 і п-6, 7 або 8 і т-0,1, 2 або 3), краще х-4, п-б або 7, і т-0, 1, 2 або 3, більш краще х-4, п-7 і т-2. В одному з варіантів здійснення винаходу вказаний лінкер являє собою ((545)6О2.
У контексті даного опису поняття "константна ділянка" означає суму доменів антитіла, відмінних від варіабельної ділянки. Константна ділянка не бере участі безпосередньо у зв'язуванні антигену, але забезпечує різні ефекторні функції. Залежно від амінокислотної послідовності константної області їх важких ланцюгів антитіла поділяють на класи: ІдА, дО, ІдЧЕ,
ІЧО і ДМ, а деякі з них можна додатково поділяти на підкласи, такі як ДС1, Ідс2, доз і дя,
ІЗА1 і ІдДА2. Константні ділянки важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобуліну, позначають як а, б, є, у і н відповідно. Константні ділянки легкого ланцюга антитіла, які можуть бути присутніми у всіх п'яти класах антитіл, позначають як каппа (к) і лямбда (А).
У контексті даного опису поняття "константна ділянка, виведена з людського джерела" або "людська константна ділянка" означають константну ділянку важкого ланцюга людського антитіла підкласу ІДде1, Ідс2, ДОЗ або Ідс4 і/або константну ділянку легкого каппа- або лямбда- ланцюга. Зазначені константні ділянки добре відомі в даній області і описані, наприклад, у Кабаї
Е.А. та ін., зедпепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодісаї! Іпіегеві, 5-е вид., вид-во, Рибіїс Неакй зЗегмісе,
Маїййопаї! Інзійшев ої Неайй, ВемШезаа, МО, 1991 (див., наприклад, також ЧУопп5оп о. і УМи Т.Т.,
Мисівїс Асіах Кев. 28, 2000, сс. 214-218; Кабаї Е.А. та ін., Ргос. Ма). Асай. сі. ОБА 72, 1975, сс. 2785-2788). У контексті даного опису для нумерації положень і мутацій застосовують систему нумерації БО (ЕЮО-індекс) згідно Кабаї Е.А. та ін., зхедоепсез ої Ргоїеіп5 ої Іттипоїодісаї! Іптегеві,
Б-е вид., вид-во Рибіс Неанййт Зегмісе, Майопа! Іпбзійшев5 ої Неан, ВеїШезада, МО, 1991 і позначають як "нумерація відповідно до ЕЮ-індексу Кебота!".
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, мають константну ділянку людського підкласу Ідо1 (виведену з людського підкласу ІдС1).
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, мають константну ділянку людського підкласу Ід04 (виведену з людського підкласу Ід).
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, являє собою людське антитіло підкласу ЇДС1 з мутаціями І 234А (І ей235АЇїа), І 235А (І еи234Аїа) і РЗ29О (Рго32901у). Зазначене антитіло має знижену здатність зв'язуватися з ЕСК (насамперед вони більше не можуть зв'язуватися з ЕсКгаммаї, ЕсКгаммаїй! і ЕсКгаммаїй І). Це, насамперед, цінно для зниження потенційних побічних дій типу, наприклад, тромбозу (Меуєег Т. та ін., 5.
Тпготр. Наетозві. 7, 2009, сс. 171-181). В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, являє собою людське антитіло підкласу Ідс4 з мутаціями
З228Р (5Зег228Рго), І235Е (І ен23501ц) і РЗ290 (Рго32901у). Зазначене антитіло має знижену описану вище здатність зв'язуватися з БСК. Хоча вже описана раніше мутація Рго329Аїа видаляє тільки дві третини взаємодії при оцінці з використанням ЕсгаммакКІПа-сендвіча, (610) РгоЗз29а1у в антитілах, запропонованих у винаході, повністю порушує зв'язування Ес-ділянки з
ЕсгаммакКі. Це є особливо цінним, оскільки зв'язування з Есгаммакі!Ї бере участь у АОСС (антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність), яка призводить до загибелі клітин, що може бути корисним при лікуванні ракових захворювань, але може викликати серйозні побічні дії при лікуванні з використанням антитіл інших судинних або імунологічних захворювань. Тому пропоновані у винаході антитіла Ідс1-підкласу з мутаціями Г234А, І235А і РЗ290 і Ідса- підкласу з мутаціями 5228Р, І 235Е і РЗ329СО є найбільш цінними, оскільки вони обидва більше не можуть зв'язуватися з ЕсКгаммаї!, ЕсКгаммаї! і ЕсКгамман.
У контексті даного опису поняття "з ААА-мутаціями" належить до мутацій І253А (Пе253А|йа),
НЗІ1ТОА (НіззЗтолА|а) і Н4З5А (Нізх435Айа) в константній ділянці важкого ланцюга Ідс1 або Ідс4, де нумерація відповідає ЕО-індексу Кебота.
У контексті даного опису поняття "з РЗ3290 І АГА-мутаціями" належить до мутацій І 234А (Ген235АЇа), І 235А (І ен234АЇа) і РЗ29О (Рго32901у) в константній ділянці важкого ланцюга Ідс1- підкласу, де нумерація відповідає ЕО-індексу Кебота. У контексті даного опису поняття "з ЗРІ Е- мутаціями" належить до мутацій 5228Р (5ег228Рго) і І235Е (І ени2350|І0) в константній ділянці важкого ланцюга Ідс4-підкласу, де нумерація відповідає ЕО-індексу Кебота. У контексті даного опису поняття "з 5РІЕ і Р239б-мутаціями" належить до мутацій 5228Р (5ег228Рго), 1235Е (Геи2350|0) ії РЗ290 (Рго32901Іу) в константній ділянці важкого ланцюга Ідс4-підкласу, де нумерація відповідає ЕЮ-індексу Кебота.
Антитіло, запропоноване у винаході, отримують за допомогою методів рекомбінації. Так, одним з об'єктів винаходу є нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло, запропоноване у винаході, а іншим об'єктом винаходу є клітина, яка містить зазначену нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, запропоноване у винаході. Методи рекомбінантного одержання широко відомі в даній області і полягають в тому, що експресують білок в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах з подальшим виділенням антитіла і, як правило, очищенням до фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії антитіл у вищевказаних клітинах-хазяїнах нуклеїнову кислоту, що кодує відповідні модифіковані легкі і важкі ланцюги, вбудовують в експресійні вектори за допомогою стандартних методів. Експресію здійснюють у придатних прокаріотичних і еукаріотичних клітинах-хазяїнах типу СНоО-клітин, М5О-клітин, 5Р2/0-клітин, НЕК293-клітин, СО5-клітин,
РЕН.Сб-клітин, дріжджів або клітин Е.соїї, ї антитіло виділяють з клітин (з супернатанта або клітин після лізису). Загальні методи рекомбінантного одержання антитіл добре відомі в даній області і описані, наприклад, в оглядових статтях МакКгідев 5.С., Ргоївіп Ехрг. Ригії. 17, 1999, сс. 183-202; Сеїів55е 5. та ін., Ргоївіп Ехрг. Ригії. 8, 1996, сс. 271-282; Кашїтап В.)., Мої. Віотесппо). 16, 2000, сс. 151-160; МУегпег К.О., Огид Кев. 48, 1998, сс. 870-880.
Таким чином, одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб отримання біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході, що полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких а) трансформують клітину-хазяїна векторами, що містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують вказане антитіло; б) культивують клітину-хазяїна в умовах, що забезпечують синтез зазначеної молекули антитіла; і в) виділяють зазначену молекулу антитіла із зазначеної культури.
В одному з варіантів здійснення винаходу стадія виділення, зазначена у підпункті в), включає застосування специфічного "захоплюючого" реагенту для константної ділянка легкого ланцюга (який, наприклад, є специфічним для константної ділянки легкого каппа- або лямбда- ланцюга, залежно від того, легкий каппа- або лямбда ланцюг застосовується в біспецифічному антитілі, запропонованому у винаході). В одному з варіантів здійснення винаходу вказаний специфічно "захоплюючий" легкий ланцюг реагент застосовують в режимі зв'язування-і-елюції).
Прикладами зазначених специфічних для константної ділянки легкого ланцюга "захоплюючих" реагентів є, наприклад, Карразеїесі м і | апрааБарзеїесі м фірми СЕ Неайсаге/ВАС, основою яких є дуже жорсткий матрикс на основі агарози, який забезпечує високі швидкості потоку і низький зворотний тиск при великомасштабному аналізі. Їх особливістю є ліганд, який зв'язується з константною областю легкого каппа- або лямбда-ланцюга відповідно (тобто фрагменти, позбавлені константної ділянки легкого ланцюга не зв'язуються; фіг. 1). Таким чином, обидва реагенти мають здатність зв'язуватися з іншими молекулами-мішенями, які містять константну ділянку легкого ланцюга, наприклад, Ідс, ІдА і ІМ. Ліганди приєднують до матриксу через плече довгого гідрофільного спейсера, що робить їх легко доступними для зв'язування з молекулою-мішенню. Вони знаходяться на одноланцюговому фрагменті антитіла, який піддають скринінгу щодо каппа- або лямбда-ланцюга людського Ід.
Біспецифічні антитіла можна відокремлювати від культурального середовища за допомогою загальноприйнятих процедур очищення імуноглобулінів, таких, наприклад, як хроматографія на (610) білок А-сефарозі, хроматографія на гідроксилапатиті, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК і РНК, що кодують моноклональні антитіла, легко виділяти і секвенувати за допомогою загальноприйнятих процедур. Клітини гібридоми можуть слугувати в якості джерела таких ДНК і РНК. Після виділення ДНК можна вбудовувати в експресійні вектори, якими потім трансфектують клітини-хазяї, такі як НЕК 293-клітини, СНО-клітини або клітини мієломи, які в іншому випадку не можуть продукувати білок імуноглобуліну, з одержанням в результаті синтезу рекомбінантних моноклональних антитіл в клітинах-хазяїнах.
Варіанти (або мутанти) амінокислотної послідовності біспецифічного антитіла отримують шляхом інтродукції відповідних нуклеотидних замін в ДНК антитіла або шляхом синтезу нуклеотидів. Однак зазначені модифікації можна здійснювати тільки в дуже обмеженому діапазоні. Наприклад, модифікації не повинні змінювати зазначені вище характеристики антитіла, такі як Ідс-підклас і зв'язування антигену, але можуть підвищувати вихід рекомбінантного виробництва, стабільність білка або полегшувати очистку.
У контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн" означає будь-який тип клітинної системи, який можна створювати для одержання антитіл, запропонованих в цьому винаході. В одному з варіантів здійснення винаходу в якості клітин-хазяїнів застосовують НЕК293-клітини і СНО- клітини.
У контексті даного опису поняття "клітина", "клітинна лінія" і "клітинна культура" використовуються взаємозамінно, і вони всі включають потомство зазначених клітин. Так, поняття ""рансформанти" і "трансформовані клітини" включають первинно трансформовану клітину і виведені з неї культури безвідносно до кількості пересівань. Слід розуміти також, що потомство може не бути повністю ідентичним за складом ДНК через довільних або навмисних мутацій. Під обсяг винаходу підпадає варіант потомства, який має таку ж функцію або біологічну активність, яка виявлена в результаті скринінгу або відібрана у вихідній трансформованій клітини.
Експресія в М5О0-клітинах описана, наприклад, у Вагпез І М та ін., СуїоїесппоЇоду 32, 2000, сс. 109-123; Вагтпез І.М. та ін., Віоїесп. Віоепод. 73, 2001, сс. 261-270. Короткочасна експресія описана, наприклад, у Юигоспег МУ. та ін., Мисі. Асій5. Кеб5. 30, 2002, Е9У. Клонування варіабельних доменів описано у Огіапаї ЕК. та ін., Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 86, 1989, сс. 3833- 3837; Сапег Р. та ін., Ргос. Маїй!. Асад. Зсі. ОА 89, 1992, сс. 4285-4289 і у Могаегпацоа Г. та ін., чу).
Ітітипої. Меїпод5 204, 1997, сс. 77-87. Бажана система короткочасної експресії (НЕК 293) описана у 5спіаєдег Е.-у. і Спгізтепзеп К., Суїоїтесппоїоду 30, 1999, сс. 71-83 і у 5спІаєдег БЕ.-у., у.
Іттипої. Меїпоа» 194, 1996, сс. 191-199.
Контролюючі послідовності, які можна застосовувати для прокаріотів, включають, наприклад, промотор, необов'язково послідовність оператора і сайт зв'язування рибосом.
Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, енхансери і сигнали поліаденілювання.
Нуклеїнова кислота є "функціонально пов'язаною", коли вона знаходиться у функціональному взаємозв'язку 3 іншою нуклеїновою кислотою. Наприклад, ДНК передпослідовності або секреторного лідера функціонально пов'язана з ДНК поліпептиду, якщо вона експресується у вигляді передбілку, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосом функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташований так, щоб полегшувати трансляцію. Як правило, "функціонально пов'язані" означає, що послідовності ДНК, що підлягають скріпленню, є суміжними, а в випадку секреторного лідера, суміжними і перебувати в рамці зчитування.
Однак не є обов'язковим, щоб енхансери були суміжними. Зв'язування здійснюють шляхом лігування в прийнятних сайтах рестрикції. Якщо зазначені сайти не існують, то згідно з прийнятою практикою використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери.
Очистку антитіл здійснюють для того, щоб елімінувати клітинні компоненти або інші забруднювачі, наприклад, інші клітинні нуклеїнові кислоти або білки, з використанням стандартних методик, включаючи обробку лугом/ДСН, С5СіІ- бендінг, хроматографію на колонках, електрофорез в агарозному гелі й інші методи, добре відомі в цій галузі (див. в
Сигтепі Ргоїосої!5 іп МоїІесшіаг ВіоІоду, під ред. А!йзибеї Р. та ін., вид-во Сгеепе Рибіїєпіпу апа
УМіеу Іпіегзсіепсе, Мем ХоїК, 1987). Для очищення білків детально розроблені і знайшли широке застосування різні методи, такі як афінна хроматографія з використанням білків мікроорганізмів (наприклад, афінна хроматографія на білку А або білку С), іонообмінна хроматографія (наприклад, катіонообмінна (карбоксиметільні смоли), аніонообмінна (аміноетильні смоли) і хроматографія на основі обміну змішаного типу), тіофільна адсорбція (наприклад, з бета- меркаптоетанолом та іншими лігандами 5Н), хроматографія гідрофобної взаємодії або (610) ароматичної адсорбції (наприклад, з феніл-сефарозою, аза-аренофільними смолами або м-
амінофенілборною кислотою), метал-хелатна афінна хроматографія (наприклад, з Мі (ІІ) - ї Си (І) - афінним матеріалом), гель-фільтрація та електрофоретичні методи (такі як гель- електрофорез, капілярний електрофорез) (мідауаіакхпті М.А., Аррі. Віоспет. Віотесп. 75, 1998, со. 93-102).
Біспецифічні двовалентні антитіла, запропоновані у винаході, сприятливо впливають на хворих людей, які потребують МЕСЕ- і АМО-2-спрямованої терапії.
Двовалентні біспецифічні антитіла до людського МЕСЕ і людському АМО-2, запропоновані в даному винаході, можуть мати цінний профіль ефективності/безпеки і можуть сприятливо впливати на пацієнта, який потребує анти-МЕаБ- і анти-АМа-2-терапії.
Одним з об'єктів винаходу є фармацевтична композиція, яка містить антитіло, запропоноване у винаході. Іншим об'єктом винаходу є застосування антитіла, запропонованого у винаході, для приготування фармацевтичної композиції. Наступним об'єктом винаходу є спосіб приготування фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, запропоноване у винаході. Ще одним об'єктом винаходу є композиція, наприклад, фармацевтична композиція, яка містить антитіло, запропоноване в даному винаході, приготована в поєднанні з фармацевтичним носієм.
У контексті даного опису поняття "фармацевтичний носій" включає будь-який і всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові агенти, що надають ізотонічність і сповільнюють абсорбцію агенти і т. п., які є фізіологічно сумісними.
Краще носій можна застосовувати для введення індивідууму, що підлягає лікуванню, місцевим шляхом. Наприклад, антитіло або композицію, що містить його, можна вводити індивідууму шляхом внутрішньоочного застосування, наприклад, шляхом внутрішньоочної ін'єкції, такий як інтравітреальна ін'єкція. Це можна здійснювати за допомогою стандартних процедур, відомих у цій галузі (див., наприклад, ЕЩег та ін., 9. Сііп. Іпмеві. 116, 2006, сс. 3266-76; НКивзеїЇакіз-Сагпвіго та ін., Меигораїйої. Аррі. Мешгобіої. 25, 1999, сс. 196-206 і Му/гау та ін., Агсп. Меигої. 33, 1976, сс. 183-185).
Композицію, запропоновану в даному винаході, можна вводити за допомогою різних методів, відомих в даній області. Як має бути очевидно спеціалісту в даній області, шлях і/або форму введення можна варіювати залежно від необхідних результатів. Для введення сполуки, запропонованої у винаході, за допомогою певних шляхів введення може виявитися необхідним наносити на сполуку покриття з матеріалу, що перешкоджає його інактивації, або здійснювати введення сполуки спільно з таким матеріалом. Наприклад, сполуку можна вводити індивідууму у відповідному носії, наприклад, в ліпосомах або в розчиннику. До фармацевтично прийнятних розріджувачів належать фізіологічний розчин і водні забуферюючі розчини. До фармацевтично прийнятних носіїв належать стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій безпосередньо перед введенням.
Застосування таких середовищ і агентів для таких, які мають фармацевтичну активність субстанцій, відомо в даній області.
Можна застосовувати цілий ряд можливих шляхів введення, включаючи (але не обмежуючись лише ними) внутрішньоочне застосування або місцеве нанесення. В одному з варіантів здійснення винаходу застосування є внутрішньоочним і включає (але, не обмежуючись ними) підкон'юнктивально ін'єкцію, внутрічерепну ін'єкцію, ін'єкцію в передню камеру через темпоральний лімб, інтрастромальну ін'єкцію, ін'єкцію в рогівку, ін'єкцію сітківку, ін'єкцію в водянисту вологу ока, ін'єкцію в субтеновий простір ока або введення за допомогою пристрою з уповільненим вивільненням, інтравітреальну ін'єкцію (наприклад, ін'єкцію в передню, серединну або задню ділянку скловидного тіла). В одному з варіантів здійснення винаходу застосування є місцевим і включає (але, не обмежуючись лише ними) нанесення очних крапель на рогівку.
В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло або фармацевтичну композицію, запропоноване/пропоновану у винаході, застосовують шляхом інтравітреального введення, наприклад, шляхом ін'єкції в склоподібне тіло. Це можна здійснювати за допомогою стандартних процедур, відомих у цій галузі (див., наприклад, КЩШег та ін., У. Сііп. Іпмев5і. 116, 2006, сс. 3266-76; НКиззеїакібз-Сагпеїго та ін., Меигораїйої. Аррі. Меигобіої. 25, 1999, сс. 196-206 і
Уумгау та ін., Агоп. Менигої. 33, 1976, сс. 183-185).
У деяких варіантах здійснення винаходу терапевтичні набори, запропоновані у винаході, можуть містити одну або декілька доз біспецифічного антитіла у фармацевтичній композиції, зазначеній в цьому описі, прийнятний пристрій для ін'єкції в склоподібне тіло фармацевтичної композиції та інструкцію, що деталізує показання для застосування індивідуумам і протоколи здійснення ін'єкції. У цих варіантах здійснення винаходу композиції, як правило, вводять індивідууму, який потребує лікування, шляхом ін'єкції в скловидне тіло. Це можна здійснювати 10) за допомогою стандартних процедур, відомих у цій галузі (див., наприклад, КЩег та ін., 9. Сііп.
Іпме5і. 116, 2006, сс. 3266-3276; Вивзеїакіз-Сагпеїго та ін., Меигораїйої!. Аррі. Менигобіої. 25, 1999, со. 196-206 і МуУгау та ін., Агоп. Меигої. 33, 1976, сс. 183-185).
Композиції можуть містити також ад'юванти, такі як консерванти, змочувальні речовини, емульгатори і диспергуючі агенти. Відсутність мікроорганізмів можна забезпечувати як за допомогою процедур стерилізації (див. вище), так і шляхом включення різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, таких, наприклад, як парабени, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота і т. п. Може виявитися доцільним включати в композиції агенти для додання ізотонічності, такі як цукри, хлорид натрію і т. п. Крім того, можна пролонгувати абсорбцію ін'єкційної фармацевтичної форми шляхом включення речовин, які сповільнюють абсорбцію, таких як моностеарат алюмінію і желатин.
Незалежно від обраного шляху введення сполуки, запропоновані в даному винаході, які можна застосовувати в придатній гідратованій формі, і/або фармацевтичні композиції, запропоновані в даному винаході, готують у вигляді фармацевтично прийнятних форм лікарського засобу за допомогою загальноприйнятих методів, відомих фахівцям у даній галузі.
Фактичні рівні доз діючих речовин у фармацевтичних композиціях, запропонованих в даному винаході, можна варіювати для одержання кількості діючої речовини, яке є ефективним для досягнення необхідного терапевтичного відповіді у конкретного пацієнта при використанні конкретної композиції і шляху введення, але яке не є токсичним для пацієнта. Вибраний рівень доз повинен залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи активність конкретних застосовуваних композицій, запропонованих в даному винаході, шлях введення, тривалість введення, швидкість екскреції конкретної застосовуваної сполуки, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки і/або матеріали, які використовують у поєднанні з конкретними застосовуваними композиціями, вік, стать, вага, стан, загальний стан здоров'я і попередня історія хвороби пацієнта, що підлягає лікуванню, та інші подібні фактори, добре відомі в галузі медицини.
Композиція повинна бути стерильною і текучою в тій мірі, щоб композицію можна було вводити за допомогою шприца. Крім води кращим носієм є ізотонічний забуферений фізіологічний розчин.
Відповідну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, шляхом підтримання необхідного розміру часток у разі дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках краще включати в композицію агенти для додання ізотонічності, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт або сорбіт, і хлорид натрію.
Композиція може являти собою офтальмічну композицію у формі депо, що містить діючу речовину для субкон'юнктивального введення. Офтальмічна композиція у формі депо містить мікрочастинки практично чистої діючої речовини, наприклад, біспецифічного антитіла, запропонованого у винаході. Мікрочастинки, що містять біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, можуть бути занурені в біосумісний фармацевтично прийнятний полімер або ліпідний капсулюючий агент. Композиції у формі депо можна адаптувати для вивільнення всієї або практично всієї діючої речовини протягом подовженого періоду часу. Полімерний або ліпідний матрикс, якщо він присутній, може бути адаптований до розщеплення, достатнього для того, щоб транспортуватися від місця введення після вивільнення всієї або практичного всієї діючої речовини. Композиція у формі депо може являти собою рідку композицію, що містить фармацевтично прийнятний полімер і розчинену або дисперговану діючу речовину. Після ін'єкції полімер утворює депо в місці ін'єкції, наприклад, шляхом утворення гелю або осадження.
Іншим об'єктом винаходу є біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, призначене для застосування для лікування судинних очних захворювань.
Одним з варіантів здійснення винаходу є біспецифічне антитіло, запропоноване у винаході, призначене для застосування для лікування судинних очних захворювань.
Іншим об'єктом винаходу є зазначена фармацевтична композиція, призначена для застосування для лікування судинних очних захворювань.
Іншим об'єктом винаходу є застосування антитіла, запропонованого у винаході, для приготування лікарського засобу призначеного для лікування судинних очних захворювань.
Іншим об'єктом винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає судинними очними захворюваннями, що полягає в тому, що вводять антитіло, запропоноване у винаході, пацієнту, який потребує такого лікування.
Поняття "судинне очне захворювання" і "судинне захворювання очей" в контексті даного опису застосовують взаємозамінно, і вони включають (але, не обмежуючись лише ними) синдроми внутрішньоочної неоваскуляризації, такі як діабетична ретинопатія, діабетичний (610) набряк жовтої плями, ретролетальна фіброплазія, неоваскулярна глаукома, оклюзії вен сітківки,
оклюзії центральної вени сітківки, дегенерація жовтої плями, вікова дегенерація жовтої плями, пігментний ретиніт, ретинальна ангіоматозних проліферація, телеангіектазія жовтої плями, ішемічна ретинопатія, неоваскуляризація райдужної оболонки, внутрішньоочна неоваскуляризація, неоваскуляризація рогівки, неоваскуляризація сітківки, хороідальна неоваскуляризація і дегенерація сітківки (Сагпег А., Мазсціаг аіїзеазев5, в: Раїйобіоіоду ої осшаг діхеазе, А дупатіс арргоасі, під ред. Сагпег А. и Кііпім'огій О.К., 2-ое изд., изд-во Магсеї! ОеккКег,
Мем УогК, 1994, сс. 1625-1710). У контексті даного опису судинне очне захворювання включає будь-які патологічні стани, що відрізняються зміненою чи нерегульованою проліферацією і інвазією нових кровоносних судин в структури тканин ока, таких як сітківка або рогівка. В одному з варіантів здійснення винаходу судинне очне захворювання вибирають з групи, що включає: вологу вікову дегенерацію жовтої плями (волога форма АМО), суху вікову дегенерацію жовтої плями (суха форма АМО), діабетичний набряк жовтої плями (ОМЕ), цістоїдний набряк жовтої плями (СМЕ), непроліферативну діабетичну ретинопатію (МРОК), проліферативну діабетичну ретинопатію (РОК), цістоїдний набряк жовтої плями, васкуліт (наприклад, оклюзія центральної вени сітківки) папіллоедему (набряк диска зорового нерва), ретиніт, кон'юнктивіт, увеїт, хороідіт, мультифокальний хороїдіт, гітоплазмоз ока, блефарит, "сухе око" (хвороба Шегрена) та інші офтальмічні захворювання, при яких очне захворювання або порушення асоційоване з неоваскуляризацією ока, просочуванням з судин і/або набряком сітківки. Таким чином, біспецифічні антитіла, запропоновані у винаході, можна застосовувати для попередження і лікування вологої форми АМО, сухої форми АМО, СМЕ, ОМЕ, МРОК, РОК, блефариту, "сухого ока" і увеїта, краще також вологої форми АМО, сухої форми АМО, блефариту і "сухого ока", краще також СМЕ, ОМЕ, МРОК і РОК, краще також блефарити і "сухого ока", зокрема вологої форми АМО і сухий форми АМО, а також найбільш краще важливої форми АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу очне захворювання вибирають з групи, що включає вологу вікову дегенерацію жовтої плями (волога форма АМО), набряк сітківки, оклюзії вен сітківки, ретролетальну фіброплазію і діабетичну ретинопатію.
Інші хвороби, асоційовані з неоваскуляризацією рогівки, включають (але, не обмежуючись лише ними) епідемічний кератокон'юнктивіт, дефіцит вітаміну А, переношення відведеного часу контактних лінз, атопічний кератит, верхній лімбічний кератит, птеригій, сухий кератит, хвороба
Шегрена, рожеві вугри, філектенулоз, сифіліс, інфекції, викликані мікобактеріями, ліпідні дегенерації, хімічні опіки, бактеріальні виразки, грибкові виразки, інфекції, викликані вірусом герпесу простого, інфекції, викликані вірусом оперізуючого лишаю, протозойні інфекції, саркому
Капоші, виразку Мурена, крайову дегенерацію Террієна, крайовий кератолізіс, ревматоїдний артрит, системну червону волчанку, поліартрит, травму, саркоїдоз Вегенера, склерит, хвороба
Стівена-Джонсона, періфігоїдну радіальну кератотомію і відторгнення трансплантата рогівки.
Захворювання, асоційовані з ретинальною/хороїідальною неоваскуляризацією, включають (але, не обмежуючись лише ними) діабетичну ретинопатію, дегенерацію жовтої плями, серповидноклітинну анемію, саркоїд, сифіліс, псевдоксантому еластичну, хворобу Педжета, оклюзію вен, оклюзію артерій, обструктивне захворювання сонної артерії, хронічний увеїт/вітрит, інфекції, викликані мікобактеріями, хворобу Лайма, системну червону волчанку, ретролетальну фіброплазію, пігментний ретиніт, набряк сітківки (включаючи набряк жовтої плями), хворобу Ізла, хворобу Бехчета, інфекції, що викликають ретиніт або хороїдіт, синдром передбачуваного очного гістоплазмозу, хворобу Беста, міопію, ямки диска зорового нерва, хворобу Штаргардта, туберкульоз судинної оболонки очного яблука (туберкулезньй увеїт), хронічне відшарування сітківки, синдром гіпервязкості, токсоплазмоз, ускладнення, пов'язані з травмою і впливом лазера. Інші хвороби включають (але, не обмежуючись лише ними) хвороби, асоційовані з почервонінням (неоваскуляризація кута), і хвороби, що викликаються аномальною проліферацією фіброваскулярною або фіброзної тканини, включаючи всі форми проліферативної вітріоретінопатії.
Ретролетальна фіброплазія (КОР) являє собою захворювання ока, яке вражає передчасно народжених дітей. Ймовірно, воно викликається дезорганізованим зростанням кровоносних судин сітківки, що може призводити до рубцювання і відшарування сітківки. КОР може бути слабкою і може спонтанно усуватися, але може в серйозних випадках приводити до сліпоти. В цілому, всі недоношені діти мають ризик КОР, а дуже низька вага при народженні є додатковим чинником ризику. Як токсичність кисню, так і відносно гіпоксія можуть брати участь у розвитку
ВОР.
Дегенерація жовтої плями являє собою медичний стан, що зустрічається головним чином у престарілих людей, при якому центр внутрішньої вистилки очі, відомий як жовта пляма (макула) сітківки, стоншується, атрофується і в деяких випадках кровоточить. Це може призводити до (610) зниження центрального зору, що тягне за собою відсутність можливості бачити дрібні деталі,
читати чи розрізняти обличчя. Згідно Американської академії офтальмології в Сполучених
Штатах це є причиною втрати центрального зору (сліпоти) у людей віком старше 50 років. Хоча деякі дистрофії жовтої плями, які вражають більш молодих індивідуумів, іноді позначають як дегенерація жовтої плями, поняття, як правило, належить до вікової дегенерації жовтої плями (АМО або АКМО).
Вікова дегенерація жовтої плями починається з характерних відкладень жовтого кольору, які називаються друзами, в макулі (центральна ділянка сітківки, яка забезпечує деталізований центральний зір, називається ямкою), між пігментним епітелієм сітківки та низлежачою власне судинною оболонкою ока. Більшість людей із зазначеними ранніми змінами (які називають віковою макулопатією) мають хороший зір. У людей з друзами може розвиватися запущена форма АМО. Ризик значно зростає, коли друзи стають великими і численними і пов'язаними з порушенням в шарі пігментованих клітин під жовтою плямою. Великі і м'які друзи пов'язані з підвищеними відкладеннями холестерину і можуть реагувати на лікування засобами, що знижують холестерин, або Рео-процедуру.
Запущена форма АМО, відповідальна за глибоку (повну) втрату зору, має дві форми: суху і вологу. Географічна атрофія, що зачіпає центральну ямку, суха форма запущеної АМО, є результатом атрофії шару пігментного епітелію сітківки, розташованого під сітківкою, що призводить до втрати зору в результаті втрати фоторецепторів (паличок і колбочок) в центральній області ока. Хоча для цього стану відсутнє лікування, Національним інститутом ока та іншими організаціями продемонстровано, що вітамінні добавки з високими дозами антиоксидантів, лютеїн і зеаксантин сповільнюють розвиток сухої форми дегенерації жовтої плями у деяких пацієнтів, покращуючи візуальну активність.
Ретиніт пігментний (КР) являє собою групу генетичних станів ока. При прогресуванні симптомів КР, як правило, нічна сліпота передує тунельному зору протягом ряду років або навіть десятиліть. Багато людей з КР не стають формально сліпими до 40 або 50 років і зберігають деякий зір протягом усього життя. У інших в результаті КР розвивається повна сліпота, в деяких випадках навіть уже в дитинстві. Розвиток КР в кожному випадку є різним. КР є типом спадкової дистрофії сітківки, тобто належить до групи спадкових порушень, при яких аномалії фоторецепторів (палички і колбочки) або ретинального пігментного епітелію (КРЕ) сітківки призводять до прогресуючої втрати зору. Уражені індивідууми спочатку страждають порушеною адаптацією до темряви або ніктолопією (куряча (нічна) сліпота), потім зниженням периферичного поля зору (так званим тунельним зором) і іноді пізніше в процесі розвитку хвороби зниженням центрального зору.
Макулярний набряк (набряк жовтої плями) має місце, коли рідина і білкові відкладення збираються на макулі або під макулою ока, центральною областю жовтого кольору сітківки, викликаючи потовщення і набухання. Набухання може спотворювати центральний зір людини, оскільки жовта пляма знаходиться поблизу центру сітківки на задній стінці очного яблука. Ця область містить щільно упаковані колбочки, що забезпечує гострий, ясний центральний зір, що дозволяє людині бачити форму, колір і деталі, які знаходяться безпосередньо на лінії погляду.
Цістоїдний макулярний набряк є типом макулярного набряку, який включає утворення цист.
Комбіновані терапії: Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу біспецифічне антитіло або фармацевтичну композицію, запропоноване/запропоновану у винаході, застосовують індивідуально (без додаткового терапевтичного засобу) для лікування одного або декількох очних захворювань, зазначених у даному описі.
Згідно інших варіантів здійснення винаходу біспецифічне антитіло або фармацевтичну композицію, запропоноване/запропоновану у винаході, застосовують у поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами або методами для лікування одного або декілька очних захворювань, зазначених у даному описі.
В інших варіантах здійснення винаходу біспецифічне антитіло або фармацевтичну композицію, запропоноване/(запропоновану у винаході готують у поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами і застосовують для лікування одного або декілька очних захворювань, зазначених у цьому описі.
У деяких варіантах здійснення винаходу комбіновані терапії, представлені в даному описі, передбачають введення біспецифічного антитіла або фармацевтичної композиції, запропонованого/запропонованої у винаході, послідовно з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами для лікування одного або декілька очних захворювань, зазначених у цьому описі.
Додаткові терапевтичні засоби включають (але, не обмежуючись лише ними) триптофаніл-
ТРНК-синтетазу (ТтркК5), ЕуебОї (пегільованний анти-МЕСЕ аптамер), скваламін, КЕТААМЕ "М (610) (анекортава ацетат у вигляді депо-суспензії; фірма АїЇсоп, Іпс.), проліки комбретастатіну А4
(СА4Р), МАСОСЕМ "М, МІРЕРКЕХ М (міфепристон-ги486), субтенон, тріамцинолону ацетонід, інтравітреальний кристалічний тріамцинолону ацетонід, пріномастат (АС3340-синтетичний інгібітор матричних металопротеїназ, фірма Ріїгег), флуцінолону ацетонід (включаючи внутрішньоочний імплантат флуцінолона, фірма Ваибзсп й Готр/Сопіго! ОеєїЇїмегу зузіетв), інгібітори МЕСЕК (фірма бБидеп), МЕСЕ-Ттар (фірма Кедепегоп/Амепії5), інгібітори тирозинкіназного рецептора МЕСЕ, такі як о 4-(4-бром-2-фтораніліно)-6-метокси-7-(І- метилпіперидин-4-ілметокси)хіназолін. (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-6-метокси-7- (З-піролідин-1-ілпропокси)хіназолін (А2О2171), ваталаніб (РТК787) і 501 1248 (сунітиніб), ліномід та інгібітори функції інтегрину бета-3, і ангіостатин.
Інші фармацевтичні терапії, які можна застосовувати в поєднанні з біспецифічним антитілом або фармацевтичною композицією, запропонованим/запропонованої у винаході, включають (але, не обмежуючись лише ними), МІЗОШЮОММЕ "М, застосовуваний разом з нетермічним лазером, РКС 412, ендовіон (фірма МеигозЗеагсп А/5), нейротрофічні фактори, включаючи в якості прикладу гліальний нейротрофічний фактор і циліарний нейротрофічний фактор, діатазем, дорзоламід, фототроп (Рпоїоїгор), 9-цис-ретиналь, очні лікарські засоби (включаючи ехо-терапію (Еспо Тпегару), включаючи фосфоліну йодид або ехотіофат, або інгібітори вугільної ангідрази, АЕ-941 (фірма АЕКіегпа І арогаїогіев, Іпс.), зігпа-027 (фірма 5ігпа Тпегарешісв, Іпс.), пегаптаніб (фірма МехХзіаг РпагтасешісаІ5/зйеай Зсіепсе5), нейротрофіни (включаючи тільки в якості прикладу, МТ-4/5, фірма Сепепіесі), Сапаб5 (фірма Ас!ийу РІагтасешісаї!в5), ІМ5-37217 (фірма Іпзріге Рпаптасеціїса!5), антагоністи інтегрину (включаючи препарати фірм «егіпі АС і
Аррой Іарогаюгев), ЕС-3306 (фірма Аг Тпегарешісх 43, ВОМ-Е (фірма Віобівет Ца., талідомід (застосовуваний, наприклад, фірмою ЕпігеМей, Іпс.), кардіотрофін-1ї (фірма
Сепепіесі), 2-метоксиестрадіол (фірма АПегдап/Осшіех), 0І -8234 (фірма Тогау Іпаивігіев), МТС- 200 (фірма Мешгоїесі)), тетратіомолібдат (Мічиганський Університет (Опімегейу ої Міспідап)),
ГММ-002 (фірма ГупКкеиз Віоїесі), сполука з мікроводоростей (фірма Адиазеагсп/АІрапу, Мега
РіпаптасеціїсаІв), 0-9120 (фірма СеШесії Сгошр ріс), АТХ-510 (Нататаївзи Рпоюпісв), ТаЕ-бета 2 (фірма Сеплуте/Сенйгіх), інгібітори тирозинкіназ (фірми АПегдап, ЗОСЕМ, Ріїгег), МХ-278-Ї (фірма МехХвеїаг РНаптасеціїсаІ5/бНіеай бсіепсе5), Орі-24 (фірма ОРТІ5 Егапсе 5А), нейропротектори гангліїв клітин сітківки (фірма Содепі Меиго5сіепсев5), М-нітропіразольні похідні (фірма Техаз АЗМ Опімегзйу Зузіет), КР-102 (фірма КгепіїзКу Рпагтасеціїса!І5), циклоспорин А, "обмежену транслокацию сітківки", фотодинамічну терапію (РОТ) (включаючи (тільки в якості прикладу) рецепторнаправлену РОТ, фірма ВгізіоІ-Муег5 Запцірб, Со.; порфімер натрію для ін'єкції спільно з РОТ; вертепорфін, фірма ОТ Іпс.; ростапорфін, застосовуваний спільно з РОТ, фірма Мігамепі Меаїса! ТесппоїІодіе5; талапорфін натрію застосовуваний спільно з РОТ, фірма
Мірроп Реїгоїемт; мотексафін лютецію, фірма РІагтасусіїс5, Іпс.), антисмислові олігонуклеотиди (включаючи лише в якості прикладу, продукти, протестовані фірмою Момадаїї
Рпапгта 5А і І5І5З-13650, фірма Іб5і5 РпагтасеціїсаІ5), лазерну фотокоагуляцію, обробку друз лазером, хірургію макулярних розривів сітківки, хірургічну транслокацію макули, імплантовані мініатюрні телескопи, ангіографію РПі-руху (відому також як мікролазерна терапія або ангіографія фідерних судин), бомбардування протонним пучком, мікростимулюючу терапію, хірургію з приводу відшарування сітківки та операцію на склоподібному тілі, операцію вдавлення сфери, операцію в субмакулярній області, транспупіллярну термотерапію, терапію фотосистеми І, застосування РНК-інтерференції (РНКІ), екстракорпоральний реоферез (відомий також як мембранна диференціальна фільтрація і реотерапія), імплантацію мікрочіпів, терапію стовбуровими клітинами, генну замісну терапію, генну терапію на основі рибозимів (включаючи генну терапію з використанням елемента відповіді на гіпоксію, фірми Охоога Віотеадіса; І епіірак,
Сепеїїх; генна терапія РОЕЕ, фірма Сепмес), трансплантацію фоторецепторних/ретінальних клітин (включаючи епітеліальні клітини сітківки, що трансплантуються, фірма Оіасгіп, Іпс.; трансплантат клітин сітківки, фірма СеїІ Сепевзув, Іпс.) і акупунктуру.
Будь-який антиангіогенний засіб можна застосовувати в поєднанні з біспецифічним антитілом або фармацевтичною композицією, запропонованим/запропонованою у винаході, включаючи (але не обмежуючись лише ними) зазначені у Саптеїїеї і даїп, Майиге 407, 2000, сс. 249-257. У деяких варіантах здійснення винаходу антиангіогенний засіб являє собою інший антагоніст МЕСЕ або антагоніст рецептора МЕСЕ, такий як варіанти МЕСЕ, фрагменти розчинного рецептора МЕСЕ, аптамери, що мають здатність блокувати МЕСЕ або МЕСЕРК, нейтралізуючі антитіла до МЕСЕК, низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ МЕСЕК і будь-які їх комбінації і вони включають анти-МЕСЕ аптамери (наприклад, пегаптаніб), розчинні рекомбінантні рецептори-пастки (наприклад, МЕСЕ Тгар). У деяких варіантах здійснення винаходу антиангіогенний засіб включає кортикостероїди, ангіостатичні стероїди, анекортава (610) ацетат, ангіостатін, ендостатін, малі інтерферуючі РНК, що знижують експресію МЕСЕК або ліганда МЕСЕ, засоби пост-МЕСЕВ-блокади на основі інгібіторів тирозинкіназ, інгібітори ММР,
ІСЕВРЗ, блокатори 5ОБ-1, РЕОЕ, гамма-секретази, дельта-подібний ліганд 4, антагоністи інтегрину, блокатор НІЕ-1-альфа, блокатор протеїнкінази СК2 і інгібітор хомінгу стовбурової клітини (тобто клітини- попередника ендотеліальних клітин) до ділянки неоваскуляризації з використанням ендотеліального кадхеріна (СО-144) і антитіл до стромального фактору (5ОР)-І.
Можна застосовувати також низькомолекулярні інгібітори КТК, мішенню яких є МЕСБ- рецептори, включаючи РТК787. Можна застосовувати також агенти, що мають активність відносно неоваскуляризації, які не обов'язково являють собою анти-МЕСтКЕ-сполуки, і вони включають протизапальні лікарські засоби, інгібітори т-Тог, рапаміцин, еверолімус, темсіролімус, ціклоспон, анти-ТМЕ-агенти, агенти, мішенню яких є комплемент, і нестероїдні протизапальні засоби. Можна застосовувати також агенти, що мають нейрозахисну дію, і які можуть потенційно знижувати розвиток сухої форми дегенерації жовтої плями, наприклад, клас лікарських засобів, званих "нейростероїдів". Вони включають такі лікарські засоби, як дегідроепіандростерон (ОНЕА) (товарні знаки: РгазіегаФ і РідеїйпФ), дегідроепіандростерону сульфат і прегненолону сульфат. Будь-який призначений для лікування АМО (вікова дегенерація жовтої плями) терапевтичний засіб можна застосовувати в поєднанні з біспецифічним антитілом або фармацевтичною композицією, запропонованим/запропонованою у винаході, включаючи (але не обмежуючись лише ними) вертепорфін в поєднанні з РОТ, пегаптаніб натрію, цинк або антиоксидант (и), індивідуально або в будь-якій комбінації.
Поняття "індивідуум" і "пацієнт" застосовують взаємозамінно, і вони відносяться до ссавців, таких як хворі люди і примати крім людини, а також до експериментальних тварин, таким як кролики, щури та миші, а також інші тварини. Тварини включають всіх хребетних тварин, наприклад, ссавців і тварин, що не відносяться до ссавців, таких як собаки, кішки, вівці, свині, кролики, кури і т. д. Кращими індивідуумами для втілення на практиці терапевтичних способів, запропонованих в даному винаході, є люди. Індивідууми, які потребують лікування, включають пацієнтів, які вже страждають очним захворюванням або порушенням, а також схильних до розвитку порушення.
У контексті даного опису поняття "клітина", "клітинна лінія" і "клітинна культура" використовуються взаємозамінно, і вони всі включають потомство. Так, поняття "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають первинно трансформовану клітину і виведені з неї культури безвідносно до кількості пересівань. Слід розуміти також, що потомство може не бути повністю ідентичним за складом ДНК через довільні або навмисні мутації. Під обсяг винаходу підпадає варіант потомства, який має таку ж функцію або біологічну активність, яка виявлена в результаті скринінгу у вихідній трансформованій клітини. У тих випадках, коли слід застосовувати інші позначення, це має бути очевидно з контексту.
У контексті даного опису поняття "трансформація" належить до процесу переносу векторів/нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна Якщо в якості клітин-хазяїнів застосовують клітини, оболонки яких не являють собою важкопереборні бар'єри, то трансфекцію здійснюють, наприклад, методом, заснованим на осадженні фосфатом кальцію, описаним у Сгапбат і Мап дег ЕВ, Мігоїосду 52, 1973, сс. 546-567. Однак можна застосовувати також і інші методи інтродукції ДНК в клітини, такі як ін'єкція в ядра або злиття протопластів. Якщо використовують прокаріотичні клітини або клітини, що мають значні клітинні оболонки, то в якості методу трансфекції можна застосовувати обробку кальцієм з використанням хлориду кальцію, описану у Сопеп 5М та ін., РМАЗ 69, 1972, сс. 2110-2114.
У контексті даного опису поняття "експресія" належить до процесу, за допомогою якого здійснюється транскрипція нуклеїнової кислоти в мРНК, і/або до процесу, за допомогою якого транскрибована мРНК (яку називають також транскриптом) згодом транслюється з утворенням пептидів, поліпептидів або білків. Транскрипти і поліпептиди, що кодуються, в цілому називають генним продуктом. Якщо полінуклеотид виводять з геномної ДНК, то експресія в еукаріотичній клітині може включати сплайсинг мРНК. "Вектор" являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, зокрема самореплікуючу молекулу, яка переносить вбудовану молекулу нуклеїнової кислоти в клітини-хазяїни і/або між клітинами- хазяїнами. Поняття включає вектори, функція яких полягає, насамперед, у вбудовуванні ДНК або РНК в клітину (наприклад, хромосомна інтеграція). Реплікаційні вектори, функція яких полягає насамперед у реплікації ДНК або РНК, їі в експресійні вектори, функція яких полягає насамперед у транскрипції і/або трансляції ДНК або РНК. Під поняття підпадають також вектори, які мають кількома зазначеними функціями. "Експресійний вектор" являє собою полінуклеотид, який при інтродукції у відповідну клітину- хазяїна може транскрибуватися і транслюватиметься в поліпептид. Поняття "експресійна 10) система" належить, як правило, до прийнятної клітини-хазяїна, що містить експресійний вектор,
функцією якої може бути вихід необхідного продукту експресії.
Наступні приклади, перелік послідовностей і креслення подані з метою кращого розуміння цього винаходу, повний обсяг якого представлений у наведеній нижче формулі винаходу.
Очевидно, що у викладених процедурах можуть бути зроблені модифікації без відхилення від суті винаходу.
Опис переліку послідовностей (амінокислотні послідовності)
ЗЕСОІЮ МО: |6|СОВІ легкоголанцюга, «МЕС» ранібізумаб.їд/ -:/ (б б Ф «МЕСЕ» ранібізумаб
Бі сх кн піні «МЕСЕ» ранібізумаб
ЗЕСОІЮ МО: |9|СОВЗНважкоголанцюга, хАМО-2» варіантАпагі ГС1ТО Г-/:/ г б варіант Апог2і ГС10 варіант Апог2і ГС10 послідовність- попередник людського МЕСЕ165 з ААА-мутаціями (МЕСЕапд2-0012 з ААА-мутаціями (МЕСЕапд2-0012 з ААА-мутаціями (МЕСЕапд2-0012 з ААА-мутаціями (МЕСЕ-Апд2-0012 з ААА-мутаціями і РЗ290 Г АГ А-мутаціями (МЕСЕРапд2-0016 з ААА-мутаціями і РЗ290 Г АГ А-мутаціями (МЕСЕРапд2-0016 з ААА-мутаціями і РЗ290 Г АГ А-мутаціями (МЕСЕапд2-0016 з ААА-мутаціями і РЗ290 Г АГ А-мутаціями (МЕСЕапд2-0016 з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями (без ААА-мутацій) (МЕСЕапод2-0201 (без ААА-мутацій) (МЕСЕапод2-0201 (без ААА-мутацій) (МЕСЕапод2-0201 (без ААА-мутацій) (МЕСЕапод2-0201 тільки з РЗ29С І АГ А-мутаціями (без ААА-мутацій) (МЕСЕРапд2-0015 тільки з РЗ29С І АГ А-мутаціями (без ААА-мутацій) (МЕСЕРапд2-0015 тільки з РЗ29С І АГ А-мутаціями (без ААА-мутацій) (МЕСЕРапд2-0015 тільки з РЗ29С І АГ А-мутаціями (без ААА-мутацій) (МЕСЕРапд2-0015
Нижче перераховані такі варіанти здійснення винаходу: 1. Біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, в якому
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОМЗН-ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 1, СОК2Н- ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 2, і СОВІН- ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 3, і в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮО МО: 4, СОК2І -ділянку, що має ЗЕО ІЮ
МО: 5, і СОЇ -ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 6; і
І) зазначений другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з АМО-2, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОРЗН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 9,
СОВ2Н-ділянку, що має 5ЕБЕО ІЮ МО: 10, ії СОМКТН-ділянку, що має 5ЕБО ІЮО МО: 11, їі в варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 12, СОРВ2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 13, і СОКТІ -ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 14, і в якому
І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу
Ід9091 або людського підкласу Ідс4 (виведену з людського антитіла), що містить мутації І253А,
НЗ1ТОА і Н4ІЗ5А (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота). 2. Біспецифічне антитіло за варіантом здійснення винаходу 1, в якому
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга МН амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 7 і в якості варіабельного домену легкого ланцюга Мі. амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 8 і
І) зазначений другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з АМО-2, містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга УН амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 15 і в якості варіабельного домену легкого ланцюга Мі. амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 16. 3. Біспецифічне антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 1-2, в якому константна ділянка важкого ланцюга, зазначена у підпункті ІП), належить до Ідс1 -підкласу. 4. Біспецифічне антитіло за варіантом здійснення винаходу 3, в якому константна ділянка важкого ланцюга Ідс1-підкласу містить також мутації І234А, І 235А і РЗ290 (нумерація згідно
Еи-індексу Кебота). 5. Біспецифічне антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 1-2, в якому константна ділянка важкого ланцюга, зазначена у підпункті ІП), належить до Ідс4-підкласу. 6. Біспецифічне антитіло за варіантом здійснення винаходу 5, в якому константна ділянка важкого ланцюга Ідс4-підкласу містить також мутації 5228Р і 1235Е (нумерація згідно ЕО- індексу Кебота). 7. Біспецифічне антитіло за варіантом здійснення винаходу 5, в якому константна ділянка важкого ланцюга Ідс4-підкласу містить також мутації 5228Р, 1235Е і РЗ3295 (нумерація згідно
Еи-індексу Кебота). 8. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 1-7. 9. Біспецифічне антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 1-7, призначене для застосування для лікування судинних очних захворювань. 10. Застосування біспецифічного антитіла за одним з варіантів здійснення винаходу 1-7 для приготування лікарського засобу для лікування судинних захворювань очей. 11. Біспецифічне антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 9 або 10, де антитіло застосовують шляхом інтравітреального введення. 12. Спосіб лікування пацієнта, що страждає судинними захворюваннями очей, що полягає в тому, що вводять антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 1-7 пацієнту, який потребує такого лікування. 13. Нуклеїнова кислота, що кодує біспецифічне антитіло за одним з варіантів здійснення винаходу 1-7. 14. Експресійний вектор, що містить зазначену нуклеїнову кислоту за варіантом здійснення винаходу 13, який має здатність експресувати зазначену нуклеїнову кислоту в прокариотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні. 15. Прокаріотична або еукаріотична клітина-хазяїн, що містить вектор за варіантом здійснення винаходу 14. 16. Спосіб одержання біспецифічного антитіла за варіантами здійснення винаходу 1-7, що полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких а) трансформують клітину-хазяїна векторами, що містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують вказане антитіло; б) культивують клітину-хазяїна в умовах, що забезпечують синтез зазначеного молекули антитіла; і в) виділяють зазначену молекулу антитіла із зазначеної культури. 17. Біспецифічне антитіло, одержане способом за варіантом здійснення винаходу 16. 18. Біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕСРЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 25, БЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІО МО: 27 і ЗЕО ІО МО: 28. 19. Біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським УЕСЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 21, ЗЕО ІО МО: 22, 5БЕО ІЮО МО: 23 і ЗЕО ІЮ МО: 24. 20. Біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, що відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 29, ЗЕО ІЮ МО: 30, 5ЕО ІЮО МО: 31 і ЗЕО ІЮ МО: 32.
Експериментальні процедури
Таблиця 1
Біспецифічні антитіла і відповідні їм послідовності позначення «МЕСЕ-АМО-2» Сгто55МАБ ІдСї з| МЕсСЕапа2-0012 ЗЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІО МО: 22,
ААА-мутаціями ЗЕО ІЮ МО: 23, 5ЕО І МО: 24 дикого типу (без ААА-мутацій) ЗЕО ІО МО: 41, 5ЕО І МО: 42 «МЕСЕ-АМО-2» Сгто55МАБ ІдСї з| МЕсСЕРапа2-0016 ЗЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО ІЮО МО: 26,
АдДА-мутаціями і РЗ295 ІАГА- ЗЕО ІЮ МО: 27, 5ЕО ІЮ МО: 28 мутаціями «МЕСЕ-АМО-2» Сто55МАБ дае | МЕсСЕапа2-0015 ЗЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО ІО МО: 44, тільки з РЗ290 І АГ А-мутаціями (без ЗЕО ІО МО: 45, 5ЕО І МО: 46
ААА-мутацій) пасутрившнни асо
ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями ЗЕО ПО МО: 31, 5ЕО І МО: 32
Ес ані НН НА іній
ААА-мутаціями ЗЕО ІО МО: 35 осн рксевв НО НИ Я іній
ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями ЗЕО ІЮ МО: 38
Слід мати на увазі, що в контексті даного опису поняття "з ААА-мутаціями" належить до мутацій І253А (Пе253Аїа), НЗ1ТОА (НіззЗ10А|їа) і Н4З5А (Ніз435АЇїа) в константній ділянці важкого ланцюга Ідс!і або Ідс4 (нумерація згідно ЕО-індексу Кебота), поняття "з РЗ290 ІАЇГА- мутаціями" в контексті даного опису належить до мутацій І 234А (І е235А|а), І 235А (І ен234АЇїа) і РЗ290 (Рго32901у) в константній ділянці важкого ланцюга Ідс1-підкласу (нумерація згідно ЕО- індексу Кебота), а поняття "з 5РІ Е-мутаціями" в контексті даного опису належить до мутацій з228Р (5ег228Рго) і Г235Е (І е2350С1м) в константній ділянці важкого ланцюга Ідса4-підкласу (нумерація згідно ЕЮ-індексу Кебота).
Приклади
Матеріали та загальні методи
Загальна інформація, що стосується нуклеотидних послідовностей легких і важких ланцюгів людського імуноглобуліну, представлена у Кабраї Е.А. та ін., Зедцепсе5 ої Ргоївіп5 ої
Ітітипоїодіса! Іпієте5і, 5-е вид., вид-во Рибіс Неакй Зегмісе, Майопа! Іпзійшще5 ої Неак,
Веїйезаа, МО, 1991. Амінокислоти ланцюгів антитіла пронумеровані і позначені згідно ЕО- нумерації (ЕдеІтап О.М. та ін., Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 63, 1969, сс. 78-85; Кабаї Е.А. та ін.,
Зедиєпсев ої Ргоївіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегевзі, 5-е вид., вид-во Риріїс Неайй Зегмісе, Майіопаї
Іпвійшез ої Неанй, Веїпезаа, МО, 1991.
Методи рекомбінантної ДНК
Для маніпуляцій з ДНК застосовували стандартні методи, описані у затюогоок 4. та ін.,
МоїІесшіаг Сіопіпд: А Іарогафогу тапиаї!; вид-во Соїй Бргіпд Нагбог І абогаїгу Ргез5, Соїй 5ргіпд
Нагбог, Мем МогК, 1989. Всі застосовувані в молекулярній біології реагенти застосовували згідно з інструкціями виробників.
Синтез генів
Необхідні сегменти генів замовляли відповідно до представлених специфікацій на фірмі
Сепеаїгї (Регенсбург, Німеччина).
Визначення послідовності ДНК
Послідовності ДНК визначали шляхом секвенування двох ланцюгів, яке здійснювали на фірмі Меадібепотіх ЗтрН (Мартінсрід, Німеччина) або бедиіїзегме СтрЬН (Фатерштеттен,
Німеччина).
Аналіз послідовностей ДНК і білків і оцінка даних про послідовності
Для створення, картування, аналізу, анотації та ілюстрації послідовностей застосовували пакет програм фірми СО (Сепеїйс5 Сотршиег Сгоир, Медісон, шт. Вісконсін), версія 10.2 і вдосконалений набір програм Іпіотах5 Месіог МТ, версія 8.0.
Експресійні вектори
Для експресії описаних антитіл застосовували варіанти експресійних плазмід для короткочасної експресії в клітинах (наприклад, в НЕК293-Р-клітинах), заснованих або на кДНК- організації з інтроном А промотора СММ або без нього, або на геномній організації з промотором СММ.
Крім касети експресії антитіла вектори включали: - сайт ініціації реплікації, який забезпечує реплікацію цієї плазміди в Е. соїї, - ген В-лактамази, який надає стійкість Е. соїї до ампіцилліну, і - ген дигідрофолатредуктази із Ми5 тизсиціи5 в якості маркера, що селектується, в клітині.
Транскрипційна одиниця гена антитіла складалася з наступних елементів: - унікальний (ії) сайт (и) рестрикції на 5'-кінці, - негайно-ранній енхансер і промотор з людського цитомегаловірусу, - розташована за нею послідовність інтрону А в разі організації на основі кДНК, - Б-'етрансльована ділянка гена людського антитіла, - сигнальна послідовність важкого ланцюга імуноглобуліну, - ланцюг людського антитіла (дикого типу або із заміною доменів) або з організацією на основі КДНК, або з геномною організацією з екзон-інтронною організацією імуноглобуліну, - 3- нетрансльована ділянка з послідовністю сигналу поліаденілювання і - унікальний (ії) сайт (и) рестрикції на 3'-кінці.
Злиті гени, що містять ланцюги антитіла, описані нижче, створювали за допомогою ПЛР і або синтезу генів і збирали за допомогою відомих методів і технологій рекомбінації шляхом з'єднання відповідних сегментів нуклеїнових кислот, наприклад, з використанням унікальних сайтів рестрикції у відповідних векторах. Субклоновані нуклеотидні послідовності підтверджували секвенуванням ДНК. Для короткочасних трансфекцій одержували більші кількості плазмід шляхом отримання плазмід з трансформованих культур Е. соїї (фірма
МисіІеоропа АХ, фірма Маспегеу-Маде!).
Методики культивування клітин
Застосовували стандартні методики культивування клітин, описані в Ситепі Ргоїосої!5 іп СеїЇ
Віоіоду, під ред. Вопіїасіпо -).5., Оаз5о М., Нагпога .В., Гірріпсой-Зспугагія, у ії Матада К.М, вид- во Уопп Уміеу 5 оп, Іпс, 2000.
Біспецифічні антитіла експресували шляхом короткочасної котрансфекції відповідними плазмідами експресії клітин НЕК29-Е, вирощених в суспензії, згідно описаного нижче методу.
Приклад 1
Експресія та очистка
Короткочасні трансфекції в НЕК293-Р-системі
Біспецифічні антитіла створювали шляхом короткочасної трансфекції за допомогою відповідних плазмід (наприклад, що кодують важкий ланцюг і модифікований важкий ланцюг, а також відповідний легкий ланцюг і модифікований легкий ланцюг), використовуючи НЕК293-БЕ- систему (фірма Іпмігодеп), відповідно до інструкції виробника. В цілому, метод полягав у наступному: клітини НЕК293-Е (фірма Іпмігодеп), що ростуть в суспензії або під струшують колбі, або в ферментері із пристроєм, в бессироватковому середовищі для експресії Егеезіуїе "М 293 (фірма Іпмігодеп), трансфектували сумішшю з чотирьох експресійних плазмід і 293тесііп "М або фектіну (фірма Іпмігодеп). У 2-літрову колбу, яку струшують (фірма Согпіпд) НЕК293-Б- клітини висівали із щільністю 1,0х105 клітин/мл в 600 мл і інкубували при 120 об./хв., 8 95 СО».
Через день клітини трансфектували при клітинній щільності приблизно 1,5х105 клітин/мл, використовуючи приблизно 42 мл суміші, що містить А) 20 мл середовища Оріїі-МЕМ (фірма
Іпмігодеп) з 600 мкг загальної плазмідної ДНК (1 мкг/мл), що кодує важкий або модифікований важкий ланцюг відповідно, і відповідний легкий ланцюг в еквімолярному співвідношенні, і Б) 20 мл Оріі-МЕМА1,2 мл 293Тесіїп"М або фектіну (2 мкл/мл). Залежно від поглинання глюкози в процесі ферментації додавали розчин глюкози. Супернатант, що містить секретувати антитіло, збирали через 5-10 днів і антитіла або очищали безпосередньо з супернатанта або супернатант заморожували і поміщали на зберігання.
Очистка
Біспецифічні антитіла очищали з супернатантів клітинних культур за допомогою афінної хроматографії, використовуючи МабзеїесіЗиге-Зерпагозе"М (для не ААА-мутантів) (фірма СЕ
Неайсаге, Швеція) або КарразеїІесі-агарозу (для ААА-мутантів) (фірма СЕ Неайсаге, Швеція), хроматографії гідрофобних взаємодій з використанням бутил-сефарози (фірма СЕ Неайсаге,
Швеція), і гель-фільтрації на смолі супердекс 200 (фірма СЕ Неайпсаге, Швеція).
В цілому, метод полягав у наступному: одержані після стерилізації фільтрацією (610) супернатанти клітинних культур "захоплювали" за допомогою смоли Марзеїесі зЗике,
врівноваженої ЗФР-буфером (10мМ МагНРО», їмМ КНегРО», 137мМ Масі ії 2,7мМ КСІ, рН 74), промивали буфером для врівноваження і елюювали 25мММ цитратом натрію, рН 3,0. ААА- мутанти "захоплювали" за допомогою смоли Карразеїесі, врівноваженої 25мМ Тріс, 50мМм масі, рН 7,2, відмивали буфером для врівноваження і елюювали 25мМ цитратом натрію, рн 2,9.
Елюйовані білкові фракції об'єднували і нейтралізували 2М Тріс, рН 9,0. Пули антитіл готували для хроматографії гідрофобних взаємодій, додаючи 1,6М розчин сульфату амонію до кінцевої концентрації 0,8М сульфат амонію і значення рН доводили до 5,0 за допомогою оцтової кислоти. Після врівноваження бутил-сефарозної смоли З35мМ ацетатом натрію, 0,8М сульфату амонію, рН 5,0 антитіла наносили на смолу, промивали буфером для врівноваження і елюювали лінійним градієнтом до З5мММ ацетату натрію, рН 5,0. Фракції, що містять біспецифічне антитіло, об'єднували і додатково очищали за допомогою гель-фільтрації, використовуючи колонку, заповнену смолою супердекс 200 26/60 СІ (фірма СЕ Неайсаге,
Швеція), врівноважену 20мМ гістидином, 140мМ Масі, рН 6,0. Фракції, що містять біспецифічне антитіло, об'єднували, концентрували до необхідної концентрації, використовуючи пристрої для ультрафільтрації Мімазріп (фірма Загіогіи5 5іедіт Віоїесі ЗА, Франція), і зберігали при -80 "С.
Таблиця 2
Виходи біспецифічних антитіл «МЕСЕ-АМО-2»
МЕС апд2г-0015 МЕСсРапд2г-0016 (без ААА-мутації) (с ААА-мутацією) титр супернатанту 64 мкг/мл, (2 л відповідає 128 | п.а. (масштаб 2 л) мг) білок А (Марзеїесівиге) 118 мг (- 70 95 мономеру)
Карразе!їесі 117 мг (- 83 95 мономеру) бутил-сефароза
ЗЕС (гель-фільтрація) 35 мг (295 95 мономеру) 38 мг (295 95 мономеру)
Чистоту і цілісність антитіла аналізували після стадії очищення за допомогою капілярного електрофорезу у присутності ДСН (КЕ-ДСН), використовуючи технологію мікропотоків І арспір (фірма Саїїрег І їе бсіепсе, США). 5 мкл білкового розчину готували для КЕ-ДСН-аналізу, використовуючи набір НТ Ргоївїіп Ехрге55 Кеадепі згідно з інструкціями виробника, і аналізували за допомогою системи І арспір ОХІЇ, використовуючи чіп НТ Ргоїєеїп Ехрге55. Дані аналізували за допомогою програми І арспір ОХ.
Таблиця З
Видалення типових побічних продуктів за допомогою різних послідовних стадій очищення за даними КЕ-ДСН
МЕСЕапд2-0015 МЕСЕапд2-0016 пн 95 площі піку 7" " аналіз: КЕ-ДСН (Саїїрег Гарспір СХІЇ)
Мар зЗеїесі 55,7| 19 |) 10,6 3,5 зЗиге ше 00001005 ТеТеря зЗеїесі бутил-сефарозу
Супердекс200 ЗЕС /|924|1,8| 26 | 14| 0,5 |0,5| 99 | 1,1 |п.а. па. |па. | па.
Вміст агрегатів в зразках антитіл аналізували за допомогою високоефективної ЗЕС на аналітичній колонці для гель-фільтрації, заповненої супердексом 200 (фірма СЕ Неайвсаге,
Швеція), застосовуючи 2х3ФР (20мМ МагНРО», 2мММ КНгРО», 274мМ Масі і 5,4мМ КСІ, рН 7,4) в якості рухомого буфера, при 25 "С. 25 мкг білка ін'єктували в колонку зі швидкістю потоку 0,75 мл/хв і піддавали ізократичному елююванню протягом 50 хв.
Аналогічно цьому одержували і очищали біспецифічні антитіла «МЕСЕ-АМОа-2» МЕСРапда- 0012 ї МЕсРапд2-0201, досягаючи наступних виходів:
сте | Не |, не (з ААА-мутацією) (без ААА-мутації) отитр/кількість 77717171 |Збмк/мл//омі/////////-С селення 00. (Моне (вміст мономерів --95 95 зн Пюеенсьюо шк 2222 (вміст мономерів -- 65 95 бутил-сефароза.ї//-/:// | 77777771 |45мсССсС (вміст мономерів » 98 95 пенянення шенню | ев (вміст мономерів » 98 95
Біспецифічні антитіла «МЕСЕ-АМ(О-2», такі як «МЕСЕ-АМО-2» Сто55МАБ Ід54 з ААА- мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями (ЗЕО І МО: 29, 5ЕО ІО МО: 30, 5ЕО ІЮО МО: 31, 5ЕО ІО МО: 32), «МЕСЕ-АМОИ-2» ОА5ЗСсгаь Ідс1 з ААА-мутаціями (ЗЕО ІЮ МО: 33, ЗЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІО МО: 35) и «МЕСЕ-АМО-2» ОА5сегар Ідс4 з ААА-мутаціями і з 5РІ Е-мутаціями (ЗЕО ІО МО: 36, 5ЕО ІЮ
МО: 37, 5ЕО ІО МО: 38), також можна отримувати і очищати аналогічними методами.
Приклад 2
Аналітичний аналіз і можливість виявлення
Засноване на 0 5 вимірювання в'язкості в лабораторних умовах
Вимірювання в'язкості здійснювали в цілому згідно з відомим методом (Не ЕК. та ін., Апапуїісаї
Віоспетізігу 399, 2009, сс. 141-143). В цілому, метод полягав у наступному: зразки концентрували до одержання різних концентрацій білка в 200мМ сукцинаті аргініну, РН 5,5 перед додаванням гранул з полістирольного латексу (діаметром 300 нм) і полісорбату 20 (0,02 об. 95). Зразки переносили в оптичний 384-лунковий планшет допомогою центрифугування через 0,4-мікрометрового фільтрувальну пластину і покривали парафіновим маслом. Уявний діаметр гранул латексу визначали шляхом динамічного розсіювання світла при 25 "С. В'язкість розчину можна розраховувати за формулою п - пО(гп/г, 0) (п: в'язкість; ПО: в'язкість води; гі: удаваний гідродинамічний радіус гранул латексу; г, 0: гідродинамічний діаметр гранул латексу у воді.
Для того щоб можна було здійснювати порівняння різних зразків при одній і тій же концентрації, дані про в'язкості залежно від концентрації апроксимували за допомогою рівняння
Муні (рівняння 1) (Моопеу, СоїПоїа 5сі, 1951; МопкКо5, Віоспет. Віорпуз. Асіа, 1997) і здійснювали інтерполяцію даних за допомогою наступного рівняння: т-лен( гі тлтю
І-КФ рівняння 1 (5: параметр гідродинамічної взаємодії білка; К: коефіцієнт самостиску; Ф: обсяг фракції розчиненого білка).
Результати представлені на фіг. 2: встановлено, що МЕСЕРапд2-0016 з ААА-мутаціями в Ес- ділянки має більш низьку в'язкість при всіх температурах, при яких здійснювали вимірювання, порівняно з МЕСЕРапд2-0015 без ААА-мутацій в Ес-ділянки.
Температура початку агрегації за даними ОІ 5
Зразки готували в концентрації 1 мг/мл у 20мМ гістидином/хлориді гістидину, 140мМ масі, рН 6,0, переносили в оптичний 384-лунковий планшет за допомогою центрифугування через 0,4-мікрометрового фільтрувальну пластину і покривали парафіновим маслом. Гідродинамічний радіус і в цьому випадку вимірювали за допомогою динамічного розсіювання світла, при цьому зразки нагрівали зі швидкістю 0,05 "С/хв. з 25 "С до 80 "С. Температуру початку агрегації визначали як температуру, при якій гідродинамічний радіус починав зростати. Результати представлені на фіг. 3. На фіг. З представлені дані про агрегації МЕсЕРапд2-0015 без ААдДА- мутацій у порівнянні з МЕсСЕРапд2-0016 з ААА-мутаціями в Ес-ділянки. Встановлено, що для
МЕС апд2г-0016 температура початку агрегації становила 61 "С, в той час як у МЕсРапд2-0015 без ААА-мутацій температура початку агрегації становила 60 "С.
РІ 5- аналіз в залежності від часу
Зразки готували в концентрації 1 мг/мл у 20мМ гістидином/хлориді гістидину, 140мМ масі, рН 6,0, переносили в оптичний 384-лунковий планшет за допомогою центрифугування через
0,4-мікрометрового фільтрувальну пластину і покривали парафіновим маслом. Гідродинамічний радіус і в цьому випадку вимірювали за допомогою динамічного розсіювання світла, при цьому зразки витримували при постійній температурі 50 "С аж до 145 год. В цьому експерименті тенденція до агрегації нативного неуложеного білка при підвищеній температурі може призводити до збільшення середнього діаметра частинок з плином часу. Зазначений метод на основі ОБ! 5 є дуже чутливим щодо агрегатів, оскільки їх утворення призводить до надпропорціональної зміни інтенсивності розсіювання світла. Навіть після витримування протягом 145 год. при 50 "С (температура, близька до температурі початку агрегації) середній діаметр частинок як МЕСГРапд2-0015, так ії МЕсЕРапд2-0016 збільшувався менш ніж на 0,5 нм.
Зберігання протягом 7 днів при 40 "С в концентрації 100 мг/мл (підвищення рівня НМУУ)
Зразки концентрували до кінцевої концентрації 100 мг/мл в 200мМ сукцинаті аргініну, рН 5,5, стерилізували фільтрацією і зберігали в спокої при 40 "С протягом 7 днів. До і після зберігання визначали вміст високо- і низькомолекулярних видів (НМУМ і ММ відповідно) за допомогою гель-фільтрації. Різниця у вмісті НММУ ії ГМУМ між зразками після зберігання та зразками, в яких вимірювання здійснювали відразу після приготування, позначали як "підвищення НММУ" і "підвищення І ММУУ" відповідно. Результати, представлені в таблиці 4 і на фіг. 4, продемонстрували, що для МЕсСЕРапд2-0015 (без ААА-мутації) характерно більш виражене зниження основного піку і більш виражене підвищення НМУУ в порівнянні з МЕСЕ Апд2-0016 (з
ААДА-мутацією). При створенні винаходу неочікувано було встановлено, що для МЕСЕ Апд2- 0016 (з ААА-мутацією) характерна менша тенденція до агрегації у порівнянні з МЕСРапд2-0015 (без ААА-мутації).
Таблиця 4
Зміна основного піку і піків, відповідних НММУ і СМУМ, після зберігання протягом 7д при 40 С пннн"'ІІИШШВВВВНИ Зміна площі (965)(40 "С-(-80 "С)) 01111111 | Основнийпк | НМУ | мМ
Функціональний аналіз біспецифічних антитіл до МЕСЕ і Апд2 здійснювали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРЕ), використовуючи пристрій ВіІАсогефФ Т100 або Т200 (фірма СЕ Неайпсаге), при 25 "С. Система ВіАсоге?» добре підходить для вивчення молекулярних взаємодій. ЗРЕ-технологія заснована на вимірюванні коефіцієнта заломлення поблизу поверхні покритого золотом біосенсорного чіпа. Зміни коефіцієнта заломлення свідчать про зміни маси на поверхні, що викликаються взаємодією іммобілізованого ліганда з аналізованою речовиною, ін'єктованою в розчині. Маса зростає, якщо молекули зв'язуються з іммобілізованими лігандами на поверхні, і навпаки маса знижується в випадку дисоціації аналізованої речовини від іммобілізованого ліганда (відображаючи дисоціацію комплексу). ЗРК дозволяє здійснювати безперервний моніторинг в реальному часі зв'язування ліганда/аналізованої речовини і таким чином визначати константу швидкості асоціації (Ка), константу швидкості дисоціації (Ка) і константу рівноваги (КО).
Приклад З
Зв'язування з МЕСЕ, Апд2, Есгаммак і ЕсКп
Оцінка кінетики афінності до ізоформ МЕСЕ, включаючи оцінку видової перехресної реактивності
Приблизно 12000 резонансних одиниць (КІ) системи для "захоплення" (10 мкг/мл козячого антилюдського Е(аб)2; код замовлення: 28958325; фірма СЕ Неайпсаге Віо-бсієпсе5з АВ,
Швеція) зшивали з СМ5-чіпом (фірма ЗЕ Неайсаге, ВК-1005-30) при рН 5,0, застосовуючи набір для амінного поєднання, що поставляється фірмою СЕ Неаййсаге. Буфер для системи і зразка являв собою ЗФР-Т (10 мМ забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05595 Твін 20), рН 7,4. Температуру проточної осередки встановлювали на 25 "С, а температуру блоку для зразка встановлювали на 12 "С і примірували двічі, використовуючи рухливий буфер. Біспецифічне антитіло "захоплювали" шляхом ін'єкції 50 нМ розчину протягом 30 с при швидкості потоку 5 мкл/хв. Асоціацію вимірювали шляхом ін'єкції людського ПМЕСЕ121, мишачого туУЕСЕ120 або щурячого ГМЕСЕ164 в різних концентраціях в розчині протягом 300 с при швидкості потоку 30 мкл/хв., починаючи з концентрації 300 нм, застосовуючи розведення 1: 3. Здійснювали моніторинг фази дисоціації протягом періоду часу аж до 1200 с і запускали шляхом заміни розчину зразка на рухливий буфер. Поверхню регенерували шляхом 60-
секундного відмивання за допомогою розчину гліцину, рН 2, при швидкості потоку 30 мкл/хв. Всі відмінності в коефіцієнтах заломлення коректували шляхом вирахування відповіді, отриманої від поверхні, покритої козячим антилюдським Е(ар')». Вичитали також дані, отримані при здійсненні контрольних "порожніх" ін'єкцій (подвійний контроль). Для розрахунку уявної величини КО та інших кінетичних параметрів застосовували модель 1: 1 Ленгмюра. Результати представлені в таблиці 5.
Афінність до Апд2 в розчині, включаючи оцінку видової перехресної реактивності
Оцінка афінності в розчині дозволяє вимірювати афінність взаємодії шляхом визначення концентрації вільних взаємодіючих партнерів у врівноваженій суміші. Аналіз афінності у розчині включає змішання біспецифічного антитіла «МЕСЕ-АМО-2», зберігаючи його постійну концентрацію, з лігандом (тобто Апдг) у різних концентраціях. Максимальну можливу кількість резонансних одиниць (наприклад, 17000 резонансних одиниць (КО)) антитіла іммобілізували на поверхні СМ5-чіпа (фірма СЕ Неайсаге, ВК-1005-30) при рН 5,0, використовуючи набір для амінного поєднання, що постачається фірмою СЕ НеайвВсаге. Буфер для системи і зразка являв собою НВ5Б-Р, рН 7,4. Температуру проточної осередки встановлювали на 25 "С, а температуру блоку для зразка встановлювали на 12 "С і примірували двічі, використовуючи рухливий буфер.
Для одержання калібрувальної кривої Апд2 у зростаючих концентраціях ін'єктували у проточний осередок пристрою ВіАсоге, що містить іммобілізоване біспецифічне антитіло до МЕСЕ-АМСО-2.
Кількість зв'язаного Апд2 оцінювали у резонансних одиницях (КИ) і будували графік залежності від концентрації. Розчини кожного ліганда (11 концентрацій у діапазоні від 0 до 200Нм біспецифічного антитіла до МЕСЕ-АМОИ-2) інкубували з 1О0нНМ Апо?2 і давали досягати рівноваги при кімнатній температурі. Концентрації вільного Апд2 визначали з використанням калібрувальної кривої, створеної до і після вимірювання відповіді в розчинах з відомими кількостями Апд2. 4-параметричну підгонку здійснювали за допомогою ХІїй4 (програма фірми
ІОВ5) з моделлю 201, відкладаючи концентрацію вільного АМО-2 на у-осі і концентрацію інгібуючого антитіла на х-осі. Афінність розраховували, визначаючи точку вигину цієї кривої.
Поверхню регенерували шляхом одноразового відмивання протягом 30 з 0,85 95- ним розчином
НЗРОЯ при швидкості потоку 30 мкл/хв. Всі відмінності в коефіцієнтах заломлення коректували шляхом вирахування відповіді, отриманої від поверхні, покритої "порожнім" контролем.
Результати представлені в таблиці 6.
Афінність до ЕсКп у стабільному стані
Для порівняння біспецифічних антитіл один з одним визначали афінність до ЕсКп у стабільному стані. Людський ЕсКп розводили у буфері для поєднання (10 мкг/мл Ма-ацетату, рН 5,0) та іммобілізували на С1-чіпі (фірма СЕ Неаййсаге, ВА-1005-35), використовуючи процедуру спрямованої іммобілізації, застосовуючи пристрій ВіАсоге, до досягнення кінцевої відповіді 200
КИ. Температуру проточної осередки встановлювали на 25 "С, а температуру блоку для зразка встановлювали на 12 "С і двічі примірували, використовуючи рухливий буфер. Буфер для системи і зразка являв собою ЗФР-Т (10мМ забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,0595 Твін 20) рН 6,0. Для дослідження кожного антитіла застосовували різні концентрації до, що становлять 62,5, 125, 250 і 500нМ. Швидкість потоку становила 30 мкл/хв. і різні зразки ін'єктували послідовно на поверхню чіпа, при цьому в якості періоду асоціації був вибраний проміжок часу, що становить 180 с. Поверхню регенерували шляхом ін'єкції ЗФР-Т, рН 8 протягом 60 с при швидкості потоку 30 мкл/хв. Всі відмінності в коефіцієнтах заломлення коректували шляхом вирахування відповіді, отриманої від "порожній" поверхні. Вичитали також результати, отримані при ін'єкціях буфера (тобто застосовували подвійний контроль). Для розрахунку афінності у стабільному стані застосовували метод, що входить у програму Віа-
ЕмаїІчайоп. В цілому, метод полягав у наступному: будували графік залежності величини КО (КШ тах) від аналізованих концентрацій, отримуючи криву дозової залежності. На основі 2- параметричної підгонки розраховували верхню асимптоту, що дозволяло визначати величину
КИ, що становить половину від максимальної, і таким чином визначати афінність. Результати представлені на фіг. 5 і у таблиці 7. Аналогічним чином визначав афінність до ЕсКп мавп ціномолгус (супо), мишей і кроликів.
Оцінка зв'язування ЕсгаммакШа
Для вимірювання афінності до ЕсгаммакЦШа застосовували прямий аналіз зв'язування.
Систему для "захоплення" (1 мкг/мл пента-Ніє; фірма Оціадеп) (приблизно 3000 резонансних одиниць (КО)) зшивали з СМбоб-чіпом (фірма СЕ Неакрсаге, ВК-1005-30) при рН 5,0, використовуючи набір для амінного поєднання, що постачається фірмою СЕ Неаййсаге. Буфер для системи і зразка являв собою НВ5З-Р, рН 7,4. Температуру проточної осередки встановлювали на 25 "С, а температуру блоку для зразка встановлювали на 12 "С і (610) примірували двічі, використовуючи рухливий буфер. ЕсгаммакПШа-Ніз-рецептор "захоплювали"
Зо шляхом ін'єкції 100нМ розчину протягом 60 с при швидкості потоку 5 мкл/хв. Зв'язування оцінювали шляхом ін'єкції 100нМ біспецифічного антитіла або моноспецифічних контрольних антитіл (анти-Оід для антитіла Ідс1-підкласу та Ідс4-підкласу) протягом 180 с при швидкості потоку 30 мкл/хв. Поверхню регенерували шляхом відмивання протягом 120 з розчином гліцину, рН 2,5 при швидкості потоку 30 мкл/хв. Оскільки зв'язування ЕсгаммакКІПа відрізняється від моделі зв'язування 1: 1 Ленгмюра, у цьому аналізі визначали тільки наявність зв'язування/відсутність зв'язування. Аналогічним чином можна визначати зв'язування
Есгаммакіа і ЕсгаммакКІа. З результатів, представлених на фіг. б, випливає, що після інтродукції мутацій РЗ3290 І АГА не вдалося виявити зв'язування з ЕсгаммакіПа.
Оцінка незалежного зв'язування УЕСЕ і Апд2 з біспецифічними антитілами «МЕСЕ-АМа-2»
Приблизно 3500 резонансних одиниць (К) системи для "захоплення" (10 мкг/мл козячого антилюдського до; фірма СЕ Неайвсаге Віо-5сіепсе5 АВ, Швеція) зшивали з СМ4-чіпом (фірма
СЕ Неайнсаге ВА-1005-34) при рН 5, 0, використовуючи набір для амінного поєднання, що постачається фірмою СЕ Неайпсаге. Буфер для системи і зразка являв собою ЗФР-Т (10мММ забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05 95 Твін 20) рН 7,4. Температуру проточної осередки встановлювали на 25 "С, а температуру блоку для зразка встановлювали на 12 "С. Перед "захопленням" проточний осередок двічі примірували, використовуючи рухливий буфер.
Біспецифічне антитіло "захоплювали" шляхом ін'єкції їОнМ розчину протягом 60 с зі швидкістю 5 мкл/хв. Незалежне зв'язування кожного ліганда з біспецифічним антитілом аналізували, визначаючи здатність активного зв'язування для кожного ліганда, які додавали або послідовно, або одночасно (швидкість 30 мкл/хв.), згідно з описаними нижче варіантами: 1. Ін єкція людського МЕСЕ у концентрації 200нНМ протягом 180 с (демонструє індивідуальне зв'язування антигену). 2. Ін'єкція людського Апд2 у концентрації 100нМ протягом 180 с (демонструє індивідуальне зв'язування антигену). 3. Ін'єкція людського МЕСЕ у концентрації 200нМ протягом 180 с з наступною додатковою ін'єкцією людського Апд2 у концентрації 100нНМ протягом 180 с (демонструє зв'язування Апд2 у присутності МЕСРЕ). 4. Ін'єкція людського Апд2 у концентрації 100нМ протягом 180 с з наступною додатковою ін'єкцією людського МЕСЕ у концентрації 200нМ (демонструє зв'язування МЕСЕ у присутності
Апаг). 5. Спільна ін'єкція людського МЕСЕ у концентрації 200нМ і людського Апд2 у концентрації 100нНМ протягом 180 с (демонструє одночасне зв'язування МЕСБЕ і Апог2).
Поверхню регенерували в допомогою відмивання протягом 60 с З мм розчином МаосСіг при швидкості потоку 30 мкл/хв. Всі відмінності в коефіцієнтах заломлення коректували шляхом вирахування відповіді, отриманої від поверхні, сенсибілізованої антилюдським да.
Вважається, що біспецифічне антитіло має здатність зв'язуватися з обома антигенами незалежно один від одного, якщо утворюється кінцевий сигнал, отриманий при застосуванні підходів 3, 4 і 5, дорівнює або близький до суми індивідуальних кінцевих сигналів, отриманих при застосуванні підходів 1 і 2. Результати, представлені у таблиці 9, демонструють, що обидва антитіла МЕСЕапо2-0016, МЕСЕапд2-0012 мали здатність незалежно один від одного зв'язуватися з МЕСЕ і АМО2.
Оцінка одночасного зв'язування ЕСЕ і Апд2 з біспецифічними антитілами «МЕСЕ-АМаИ-2»
По-перше, зшивали приблизно 1600 резонансних одиниць (КО) МЕСЕ (20 мкг/мл) з СМ4- чіпом (фірма СЕ Неайрсаге, ВК-1005-34) при рН 5,0, використовуючи набір для амінного поєднання, що постачається фірмою СЕ Неаййсаге. Буфер для системи і зразка представляв собою ЗФР-Т (10мМ забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05 95 Твін 20), рН 7,4. Температуру проточної осередки встановлювали на 25 "С, а температуру блоку для зразка встановлювали на 12 "С і примірували двічі, використовуючи рухливий буфер. По-друге,
Б5ОНМ розчин біспецифічного антитіла ін'єктували протягом 180 с зі швидкістю 30 мкл/хв. По- третє, пАпод-2 ін'єктували протягом 180 с зі швидкістю 30 мкл/хв. Відповідь у вигляді зв'язування пАпо-2 залежала від кількості біспецифічного антитіла, пов'язаного з МЕСБЕ, і вона свідчила про одночасне зв'язування. Поверхню регенерували шляхом відмивання протягом 60 с за допомогою 0,85 95-ного розчину НЗРО4 при швидкості потоку 30 мкл/хв. Про наявність одночасного зв'язування свідчить додатковий специфічний сигнал зв'язування пАпда2 відносно попереднього сигналу зв'язування МЕСЕ з біспецифічними антитілами «МЕСЕ-АМО-2». Для обох біспецифічних антитіл МЕсРапд2-0015 і МЕсСРапдо2-0016 вдалося виявити одночасне зв'язування МЕСЕ і Апд2 з біспецифічними антитілами «МЕСЕ-АМа-2» (дані не представлені). бо
Таблиця 5
Результати: Кінетики афінності до ізоформ УЕСЕ з різних видів
МЕС апд2-0015- | МЕСЕапд2-0016- | МЕСТЕапа2-0012- | МЕСРапаг2-0201 - уявна афінність уявна афінність уявна афінність уявна афінність людський «1пМ (за Віасоге- | «1пМ (за Віасоге- | «1пМ (за Віасоге- | «1пМ (за Віасоге-
МЕСЕ 121 специфікацією) специфікацією) специфікацією) специфікацією) мишачий немає зв'язування | немає зв'язування | немає зв'язування | немає зв'язування
МЕСЕ 120 щурячий 1з3нМ 148М 248М Зз5нМ
МЕСЕ 164
Таблиця 6
Результати: Афінність до Апд2 у розчині
МЕС Рапд2г-0015, | МЕСТЕапд2а-0016, | МЕСЕапа2-0012, | МЕСЕапд2а--0201,
КО (нМі КО (нМмі| КО (нМі КО (нМмі людський 20 20 тра (підлягає
Апагд2 визначенню) супо Апа2 мишачий 13 тра
Апаг кролячий 4 11 тра
Апаг
Таблиця 7
Результати: Афінність до ЕсКп біспецифічних антитіл «МЕСЕ-АМОа-2»
МЕС апд2-0015 МЕС Рапд2г-0016 МЕС апд2г-0012 МЕС Рапд2г--0201
І(афінність | Іафінність) Іафінність) Іафінність) людський немає зв'язування | немає зв'язування
ЕсВп осупогскп | б,мкМ |немаєзв'язування | немаєзв'язування / Т0мкМ мишачий 0 2мМкМ немає зв'язування | немає зв'язування 0 2мМкМ
ЕсВп
Таблиця 8
Результать!: Связьівание с ЕсгаммакКіІ-Ша 01 МЕСЕапдо-0015 МЕСЕапд2-0016 МЕСЕапд2-0012. МЕСЕапд2-0201
Есувіа
Рсувіта
Рсувйа
Таблиця 9
Результати: Незалежне зв'язування УЕСЕ і Апд2 з біспецифічними антитілами «МЕСЕ-АМО-2» 1) Апд2 2) МЕП 3) спочатку 4) спочатку Апд2, | 5) Спільна ін'єкція
ІВШтах)| | (ВНШтах)| МЕСРЕ, потім потім МЕСЕ Апд2г-Мватг
Апд2 | Штах АВтах АВШтах 0016 0012
Приклад 4
Мас-спектрометрія
У даному розділі описана характеризация біспецифічних антитіл «МЕСЕ-АМО-2» відносно правильної збірки. Передбачувані первинні структури підтверджували за допомогою мас- спектрометрії з іонізацією електроспреем (Е5БІ-МС) деглікозильованих та інтактних або розщеплених за допомогою Ідеб5 (розщеплюючий ІдсС фермент з 5. руодепе5з) біспецифічних антитіл «МЕСЕ-АМО-2». Розщеплення за допомогою Іде5 здійснювали з використанням 100 мкг очищеного антитіла, яке інкубували з 2 мкг Іде5-протеази (фірма Коспе) у буфері, що містить 100 ммолей/л МанНнегРОз/Ма»НРО», рН 7,1, при 37 "С протягом 5 год. Потім антитіла деглікозилювали за допомогою М-глікозідази Е, нейрамінідази і О-глікозідази (фірма Коспе) у буфері, що містить 100 ммолей/л МангРОз/МагНРО»х, рн 7,1, при 37 "С протягом аж до 16 год., використовуючи білок у концентрації 1 мг/мл, і потім здійснювали знесолення за допомогою
РХВР на колонці сефадекс 525 (фірма СЕ НеайПсаге). Загальну масу визначали за допомогою
ЕБІ-МС, застосовуючи МОС-систему тахіх5х 45 ОНЕ-ОТОЕ (фірма ВгиКег Баопік), забезпечену джерелом ТгімМегза МапоМаїгїе (фірма Ааміоп).
Маси, встановлені для розщеплених Ідеб5, деглікозильованих (таблиця 10) або інтактних деглікозильованих (таблиця 11) молекул, відповідали передбаченим масам, які виводили на основі амінокислотних послідовностей біспецифічних антитіл «МЕОЕ-АМОИ-2», що складаються з двох різних легких ланцюгів І Сдпд2 і ЇСлуцентис (ранібізумаб) і ДВОХ різних важких ланцюгів НСдпо? і
НСлуцентис.
Таблиця 10
Маси деглікозильованих і розщеплених за допомогою Ідез біспецифічних антитіл «МЕСР/АМО2», таких як МЕсЕРапд2-0201 (без ААА-мутації) і МЕсСРапд2-0012 (з ААА-мутацією) «МЕСЕ-АМО-2» антитіла «МЕСЕ-АМаОа-2»
Передбачена Виявлена Передбачена Виявлена середня маса |Да| середня маса середня маса |Да| середня маса
ІДаї ІДаї 0201 0012
Таблиця 11
Маси деглікозильованих біспецифічних антитіл «МЕСР/АМО2», таких як МЕСЕРапд2-0016 (з ААА-мутацією) і МЕсЕРапд2-0015 (без ААА-мутації) 11111111 | 1 Деглікозильованебіспецифічнеантитіло «МЕСЕ-АМО-2».-:-:/ З 7111111... | Передбаченасереднямаса|Да; | Виявлена середня маса|Да
Приклад 5
Хроматографія для оцінки зв'язування Ес-Нп
Поєднання зі стрептавідин-сефарозою:
Додавали 1 г стрептавідин-сефарози (фірма СЕ Неайпсаге) до біотінільованого і підданого діалізу рецептору і інкубували протягом 2 год. при струшуванні. Деріватизованою рецептором сефарозою заповнювали 1-мілілітрову ХК-колонку (фірма СЕ Неайвсаге).
Хроматографія із застосуванням афінної ЕсКп-колонки:
Умови: розміри колонки: 50 мм х 5 мм, висота шару: 5 см, завантаження: 50 мкг зразка, буфер для врівноваження: 20мММ МЕ5 с 150мМ Масі, регулюючий значення рН до 5,5, буфер для елюції: 20мМ Тріс/НСІ с 150мМ Масі, регулюючий значення рн до 8,8, елюція: 7,5 СМ (обсяг колонки) буфера для врівноваження у від 30 СМ до 100 95 буфера для елюції, 10 СМ буфера для елюції.
Колонкова хроматографія на основі афінності до пиЕсКп
У наведеній нижче таблиці представлені дані про часи утримування біспецифічних антитіл «МЕСЕ-АМО-2» на колонках для афінної хроматографії, що містять людський ЕсКп. Дані одержували з використанням зазначених вище умов. У наведеній нижче таблиці представлені дані про часи утримування біспецифічних антитіл «МЕСЕ-АМа-2» на людському ЕсКп.
Таблиця 12
Результати: Часи утримування біспецифічних антитілеМЕСЕ-АМ(И-2»
Приклад 6
Фармакокінетичні (ФК) властивості
ФК дані відносно Ес-Кп, одержані на мишах, трансгенних за людським ЕсКп
Фаза прижиттєвих досліджень
Дослідження проводили на самках мишей С57ВІ /6У (фон); мишей з дефіцитом ЕсКп, але гемізиготних трансгенних за людським РеКп (писк, лінія 276 -Ла)
Частина 1
Всім мишам ін'єктували одноразово інтравітреально у праве око 2 мкл/тварина відповідного розчину (тобто 21 мкг сполуки/тгварина (МЕСЕАпд2-0015 (без ААА-мутації) або 23,6 мкг сполуки/тварина (МЕСЕАпд2-0016 (з ААА-мутацією).
Мишей підрозділяли на 2 групи по 6 тварин у кожній. Одержували зразки крові у тварин групи 1 через 2, 24 і 96 год., а у тварин групи 2 через 7, 48 і 168 год. після дозування.
Здійснювали ін'єкцію у склоподібне тіло правого ока мишей за допомогою системи, що включає мікрошприц МапорРії, для нанолітрових ін'єкцій фірми Умогій Ргесізіоп Іпзігитепів, Іпс.,
Берлін, Німеччина. Мишей анестезували за допомогою 2,5 95 ізофлурану і для візуалізації ока мишей застосовували мікроскоп І еіса МАР. З з 40-кратним збільшенням і джерелом кільцевого світла ГІ еіса КІ 2500 І СО. Потім 2 мкл сполуки ін'єктували за допомогою голки 35-розміру.
Кров збирали з ретробульбарного венозного сплетення контралатерального ока кожної тварини для визначення рівнів сполуки у сироватці.
Зразки сироватки обсягом щонайменше 50 мкл одержували з крові після витримування протягом 1 год. при КТ шляхом центрифугування (9300х9) при 4 "С протягом З хв. Зразки сироватки заморожували безпосередньо після центрифугування і зберігали у замороженому стані при -80 "С до аналізу. Оброблені очі тварин з групи 1 виділяли через 96 годин після обробки, у тварин з групи 2 - через 168 годин після обробки. Зразки зберігали в замороженому стані при -80 "С до аналізу.
Частина 2
Всім мишам ін'єктували одноразово внутрішньовенно через хвостову вену по 200 мкл/тварина відповідного розчину (тобто 21 мкг сполуки/тварина (МЕСЕРАпд2-0015 (без ААДА- мутації) або 23,6 мкг сполуки/тварина (МЕСЕБАпд2-0016 (з ААА мутації).
Мишей підрозділяли на 2 групи по 5 тварин у кожній. Одержували зразки крові у тварин групи 1 через 1, 24 і 96 год., а у тварин групи 2 через 7, 48 і 168 год. після дозування. Кров збирали з ретробульбарного венозного сплетення кожної тварини для визначення рівнів сполуки у сироватці.
Зразки сироватки обсягом щонайменше 50 мкл одержували з крові після витримування протягом 1 год. при КТ шляхом центрифугування (9300 х 9) при 4 "С протягом З хв. Зразки сироватки заморожували безпосередньо після центрифугування і зберігали у замороженому стані при -80 "С до аналізу.
Одержання лізатів всього ока (мишей)
Лізати очей одержували шляхом фізико-хімічного розщеплення всього ока лабораторних тварин. Для механічного руйнування кожне око переносили у мікропробірку з конічним дном об'ємом 1,5 мл. Після заморожування-відтавання ока промивали одноразово промивальним буфером (фірма Віо-Кай, набір для лізису клітин Віо-Ріех, каталожний Ме 171-304011). На наступній стадії додавали 500 мкл свіжоприготованого буфера для лізису клітин і очі подрібнювали за допомогою 1,5-мілілітрового пестика для подрібнення тканин (фірма Кітрбіе
Спазе, 1,5-мілілітровий пестик, артикул Мо 749521-1500). Потім суміш 5 разів піддавали заморожуванню і відтаванню і знову подрібнювали. Для відділення лізату від решти тканини зразки центрифугували протягом 4 хв. при 4500 х д. Після центрифугування супернатант збирали і зберігали при -20 "С для додаткового аналізу за допомогою кількісного ЕГГІ5А.
Аналіз
Концентрації антитіл «МЕСР/АМО2» у сироватці і лізатах очей мишей визначали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА).
Для кількісної оцінки антитіл «МЕСР/АМО2» у зразках сироватки і лізатах очей мишей здійснювали стандартний твердофазний серійний сендвіч-іммуноаналіз із застосуванням біотінільованого і дігокігенірованого моноклональних антитіл в якості іммобілізованого ("захоплюючого") і ідентифікуючого антитіл. Підтвердженням збереження біспеціфічності аналізованої сполуки повинно бути те, що біотінільоване "захоплююче" антитіло розпізнає анти-
МЕРЕ -зв'язуючий сайт, у той час як дигоксигеноване ідентифікуюче антитіло зв'язується з анти-
Апдаг-зв'язуючим сайтом аналізованої сполуки. Зв'язаний імунний комплекс, що включає "захоплююче" антитіло, аналізовану сполуку і ідентифікуюче антитіло, на твердій фазі сенсибілізованого стрептавідином тітраційного мікропланшету (5А-МТР) потім виявляли за допомогою зшитого з пероксидазою із хрону антитіла до дигоксигеніну. Після відмивання незв'язаного матеріалу з ЗА-МТР і додавання АВТ5-субстрату одержаний сигнал пропорційний кількості аналізованої сполуки, пов'язаної з твердою фазою 5А-МТР. Потім здійснювали кількісну оцінку шляхом перетворення виміряних сигналів зразків у концентрації, визначені відносно калібраторів, аналізованих паралельно.
На першій стадії ЗА-МТР сенсибілізували, використовуючи 100 мкл/лунку розчину біотінільованого "захоплюючого" антитіла (МАт«Ід«МЕСЕ»»М-2.45.51-ІД2-В(ОО5)) у концентрації 1 мкг/мл протягом 1 год. при 500 об./хв. на МТР-шейкері. Тим часом готували калібратори, ОС-зразки (зразки для контролю якості) і зразки. Калібратори і ОС-зразки розводили до 295 сироватковою основою; зразки розводили до тих пір, поки сигнали не потрапляли у лінійну ділянку калібраторів.
Після сенсибілізації 5А-МТР "захоплюючим" антитілом планшет промивали тричі промивальним буфером, використовуючи 300 мкл/лунку. Потім за допомогою піпетки вносили по 100 мкл/лунку калібраторів, ОС-зразків і зразків у БА-МТР і знову інкубували протягом 1 год. при 500 об./хв. При цьому аналізована сполука пов'язувалося з допомогою її анти-МЕСЕ- зв'язуючого сайту через "захоплююче" антитіло з твердою фазою 5А-МТР. Після інкубації і (610) видалення непов'язаної аналізованої сполуки шляхом промивання планшета у 5А-МТР додавали по 100 мкл/лунку першого ідентифікуючого антитіла (МАт«Іа-«Апд2»»М-2.6.81-ІДИ- рідхо5и)) в концентрації 250 нг/мл. І в цьому випадку планшет інкубували протягом 1 год. при 500 об./хв. на шейкері. Після промивання у лунки БА-МТР додавали по 100 мкл/лунку другого ідентифікуючого антитіла (ПАТ «дигоксігенін» 5-Бар-РоОО (поли)) у концентрації 50 мед./мл і планшет знову інкубували протягом 1 год. при 500 об./хв. Після кінцевої стадії промивки для видалення ідентифікуючого антитіла додавали по 100 мкл/лунку субстрату (АВТ5). Кон'югат антитіло-фермент каталізував кольорову реакцію АВТЗФ-субстрату. Потім сигнал вимірювали за допомогою рідера для ЕГІЗА при довжині хвилі 405 нм (довжина референс-хвилі: 490 нм (4405/4901 нм)).
Оцінка фармакокінетики
Фармакокінетичні параметри розраховували за допомогою некомпартментального аналізу, використовуючи програму для оцінки фармакокінетичних параметрів ММіпМопіїп"м (фірма
РіпагзіднпО, версія 5.2.1.
Результати: А) Концентрації у сироватці
Результати визначення концентрацій у сироватці представлені в таблицях 13-16 і на фіг. 7Б- тв.
Таблиця 13
МЕСЕАпаг-0015 (без ААА-мутації): порівняння концентрацій в сироватці після інтравітреального і внутрішньовенного введення і тен | нн інтравітреального введення внутрішньовенного введення и 29811111 спинити: нишшш
Таблиця 14
МЕСЕАпаг-0016 (з ААА-мутацією): порівняння концентрацій у сироватці після інтравітреального і внутрішньовенного введення і тен | нн інтравітреального введення внутрішньовенного введення 11111111 спихинининининннннннннншн в8гЇ 11111110011111111111111111116б011
Таблиця 15
МЕС Рапдаг-0015 (без ААА-мутації) і МЕсЕапд2-0016 (з ААА-мутацією): порівняння концентрацій у сироватці після інтравітреального введення) ші МЕС Еапад2-0015 (без ААА-мутації) МЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутацією)
Середня конц. Імкг/мл| Середня конц. Імкг/млі 2 1777777711111111719811111111111111711111111111111111и7011
ВЕСТ ПО: ПОН КОН Ж ОО
Таблиця 16
МЕС Рапдаг-0015 (без ААА-мутації) і МЕсЕапд2-0016 (з ААА-мутацією): порівняння концентрацій у сироватці після внутрішньовенного) ші МЕСІЕапд2г-0015 (без ААА-мутації МЕСІЕапд2-0016 (з ААА-мутацією сшиЕинининихжжиннишиннниксннншшшшн
ВЕСТ ПО т ННЯ КОН Ж ОН
Результати: Б) Концентрації в очних лізатах лівих і правих очей
Результати визначення концентрацій в очних лізатах представлені в таблицях 17-18 і на фіг. 7Г-7Д.
Таблиця 17а
Концентрації МЕсСРапд2-0015 (без ААА-мутації) в очних лізатах після інтравітреального введення в праве око
Середні величини конц. для п-6 мишей
Середня конц. |нг/млі 96 г 168 г
Таблиця 176
Концентрації МЕсСРапд2-0015 (без ААА-мутації) в очних лізатах після внутрішньовенного введення
Таблиця 1ва
Концентрації МЕСЕапд2-0016 (з ААА-мутаціями) в очних лізатах після інтравітреального введення в праве око (правеокої////Ї 77777779
Таблиця 186
Концентрації МЕСЕапд2-0016 (з ААА-мутаціями) в очних лізатах після внутрішньовенного введення обо рвоюШЗН- С С - - Ж 4 - - - 5: Я «- - оборот « « 5 - « - -х5 5 - - - - л -
Узагальнення результатів:
Після інтравітреального введення біспецифічного антитіла «МЕСР/АМО2», запропонованого у винаході, такого як МЕсСРапд2-0016 (з ААА-мутацією), в очних лізатах виявлені його концентрації (через 96 і 168 ч), близькі до концентраціями біспецифічного антитіла «МЕСР/АМО2 » без ААА-мутації, такого як МЕсСГРапд2-0015.
Крім того, після інтравітреального введення біспецифічного антитіла «МЕСР/АМОег», запропонованого у винаході, такого як МЕсГРапд2-0016 (з ААА-мутацією), виявлені також більш швидкий кліренс і більш короткий час напівжиття в сироватці в порівнянні з біспецифічним антитілом «МЕСР/АМО2» без ААА-мутації, таким як МЕСРапд2-0015.
Приклад 7
Аналіз ангіогенезу в мікрокишені рогівки мишей
Для оцінки антиангіогенної дії біспецифічного антитіла «МЕСОРБ/АМО2» з відповідними послідовностями анти-МЕСЕ МН і МІ 5ЕО ІО МО: 7 та 8 і анти-АМО2 МН і МІ 5ЕО ІЮО МО: 15 і 16 щодо індукованого МЕСЕ ангіогенезу іп мімо, при створенні винаходу здійснювали аналіз ангіогенезу в рогівці мишей. При здійсненні цього аналізу насичений МЕСЕ Муапйо-диск імплантували в кишеню з безсудинної рогівки на фіксованій відстані від судин лімба. У відповідь на створення градієнта МЕСЕ в рогівці відразу починався ріст судин. Дослідження проводили на самках мишей лінії Ваї!р/с віком 8-10 тижнів, яких купували у фірми СПагіе5 Кімег, Сульцфельд,
Німеччина. Протокол модифікували згідно методу, описаного у Кодег5 М5 та ін., Маї. Ргоїос. 2, 2007, сс. 2545-2550. В цілому, метод полягав у наступному: у анестезованих мишей створювали під мікроскопом мікрокишені глибиною приблизно 500 мкм на відстані приблизно 1 мм від лімба до верхньої частини рогівки, використовуючи хірургічне лезо і гострі пінцети. Імплантували диск (МуїайоФ), фірма Раї! Согрогайоп, шт. Мічиган) діаметром 0,6 мм і поверхню ділянки імплантації вирівнювали. Диски інкубували у відповідному факторі зростання або наповнювачі протягом щонайменше 30 хв. Через 3, 5 і 7 днів (або в іншому варіанті тільки після 3, 5 або 7 днів) очі фотографували і оцінювали судинну відповідь. Результати аналізу висловлювали кількісно, розраховуючи відсоток ділянки нових судин щодо загальної площі рогівки.
Диски просочували 300 нг МЕСЕ або ЗФР в якості контролю та імплантували на 7 днів.
Вирости судин з лімба в диск оцінювали в день 3, 5 і/або 7. За 1 день до імплантації диска внутрішньовенно вводили антитіло в дозі 10 мг/кг (завдяки тому, що при внутрішньовенному застосуванні стабільне в сироватці антитіло МЕсСРапд2-0015 (без ААА-мутації), яке відрізнялося від МЕСгапд2-0016 тільки ААА-мутацією і мало такі ж анти-МЕСЕ і анти-АМС2 МН- і МіІ--ділянки, що опосередковують ефективність, його застосовували в якості замісника зазначеного антитіла) для тестування антиангіогенної дії відносно індукованого МЕСЕ ангіогенезу іп мімо. Тварин у контрольній групі обробляли наповнювачем. Застосовуваний обсяг становив 10 мл/кг.
пЕвЕепТІК ПпОосСлЛІДОВНОСТЯИ «10» Бощше Глікарт АГ «ій» БіспецифФічні вагитіпа до УКОБи до АМО-- та їх звстосування що ї кування спУидим них сла м са З кв сл» «Бза» зЗ105и Фо сів» шВРіКА Бе, «кіз вена -ї3 «зей 50 «Мій» Расепсітіо, верскбя 3.5 «еїйх 1 чЕіт 15 карих ВЕК «зм ШеуУчв
КЕ
«иа» СБОКЗК ваежково ланцюєа, «Утотгранійізумає капи» ї
ХЕ о Бтсо ЖЕК оТую Бек оБІЮ вх хек Нив Тко Туєк бе АБ о Уді 1 5 ТО каїйв У «КО «кій ВБЕтТ «ЕІ15 Шеучна «их кигаМ шИщеН важкихо пава, «УББ» ранієкі чума «Ой
Тв 16 Аж ТВ тую ТБк 5і1у Сіб Рко їн Тук Віа Аза Авр вва Був 1 5 19 15
Авц
«Ек З кеїіт 5 «шій вЕт каМах Шеучна «ие «йЖиї3» СпОВ1Б ввжкето панцюга, сУБакУзанівквумав «ап» 5
Нівз Тук сіу Меб Ап 1 її «кі» в «Її» й с миль Ту. п «їз РЕ рр ее МШееледу гг «жі ШеУчна «ЙО» «шт35 сПпЕ3Ь певкосо ланцюга, счЕсЕзрванібічумай «асо 4
Зі о яжши тек дак Тих Мві ско терте 1 З «ві» 5 дея «их 1. д Н стиїд вах сера Црибена ей «3 спі парковтО паниоми чтстЕсЕзранівх мм «ал В вне ТВвВш ядег беж пе ів пек я В
І З
«їх 6 сеї» її кій РЕт кїйУ Штучна
«ивох о ре то 1 ях. серии ет не АННКЯ пу ту У ит, в ЯОЖУО пкуєк сеаймМ СОК1Б леркосо лавмюга, сУКБК»ваІНЬМІі ЗУМмай вам в й ся - аж мя то, ен шк т хо я йек ліва Бак ів АВЗЕв о їлЛле Ззеї йех лук мам о АВО 1 З 12 кі 7 сг яз
КД оо «ві ЕНЕ шолвср таня Яр я - не шНея ШтТУЧН «и» сиеіїм варіабепвний домен важкого ленцюта М, «МЕспЕзвавньзі зма шал т меня дж туя ста а дез Ж їж фло ОБ три г пу и ха піл маї бій мем Уа зр Беж 51у чі БіУ Гей Уаї сій ва бі ш1у ї ге 10 Ен бю яю т зя Стнжи Жктиї пов я ОКО о и НХ Жоштує. Ер; тсска ні ША НН НН н
Беж Бен дже цей бек ув Аа дід сеї 51 Тух вБЮ Бе Та Кіт Тух шо рак зо хі ку ря Б і: ч Й З зе ит п т -х і; х ток сх и к шт ел - ЕН пі Мер АВ Ттр Уві Аг бів пів ВЖжОо бі Беж Сім цево щіл тер Ма
Ко: 4 35 пі їв о біш Аве рт тує Тву бі З1і1й Без ТВ Тк Ата АлЛа ле вве ик А гам
В) же ол току доз Ку коту при Ухующі:. Кт Жоета Тв фо жди боках бах фу ВО гро бух
МПУув Ат Дкдо Ре Теж рве Бк їв дзр Тк Бей Па пе ТпкКоАТівя ТУ 05 то 5 во ; Ло шуй мух 7 Ж дя Мних - За т тку я їн Пі ік бен біб МеЄє АДшай дех Геб Ака Аіз Біб Аве ТвпЕ о длів Уві Тух ТтТук сук йо за 95
В троктах :3, до о. с ва ржун ух ЧУ кує де Пе Фк тич ее Жошня хка
Аіївн ие Туює БЕЄ ТУЮ Тує Тух біу Тип бек Нзя ТЕ ОТїТУух не АБО Уаї тп Ох 1 їхр аіУу бів б5іу Таж Бей Чаї ТП: Уаї Бек Бек
Тї5 1955 «У» В «їх 1 «итоз РЕТ «ав швУЧНА ж чай ваваріасшльний домен леркозуко ланицюке пд, «УК ванійізумає -08 В взороЇіе піп без їбївх бів бек о вВко бек бЗет Гей бшпх вів ВегтгоЗві б15 ї 5 та 5 ав оАст омаї Тип Ті ТБ оСує бек Аза дей бій вве тб об ав дух є ге їх туї
Ак 2 4
Без Ав о тТтЮ туУух Пій сій Був Бео піу їв Аа вкОо фу Уді пву ті 45 тув Брпя ТЕ бвег обдвр о рен нів бек пі Уві Рто Веб АкУб Бе бек осбаУ щи 5 ви дою дю а й поет п т . шу ває ОБОХ пово дю Ті г Я вро Є х дек бі шек лу ТК Аве о рпе ТВБх бед Тр о бІе баг озек гемо 51п Бго па та 15 В ій азр Овна Аів Тих тек Тухк СсСух Бій Зій Ту бек тп Мі Бго тео ні - як ху х око ха ЗК чат Так те ве Зі бій 5-щУ Та ув УВІ БУ щ1іе пуд х ик о 95 чиїх З . ся щи «аз М, «рат СВТ «ВІЗ» Щтучна кажйх 3» СОВаВ важкого двчнцюгра, «АМО-о» вартхавт ВцЯві Бс16 ше п
Бек Висс б бБко Ту Тух ТУє Аню Бет бек 5іу Тук ТУухХ ТУухк Вта БіУ 1 5 15 5 ків Впе Аврої1є о вхо» 15 а ИН «київ КЕТ «їв» дтУЧчНа «лез «8й3з СОБЕН вожкоро ланцюви, «АМЩО-г» варіднт йицзві БОС1О «3002 10
Тк 16 дво Рхо Кай оБес б1Уу Бі РВЕ Ап тю АтТа бік бо Бе пім
Н 5 19 15 шоу «фе кві 5 «їв БВ «вій Преучищ й «то» «во» СОКінН оважкосго ланцюга, «АМЩЦОзе» варіант дай ПСО «Ох т пі ук тую мер НЕВ ї 5) холу й я гу о Й 10» дл «112 11 еле я пуер хіт ЕТ «135 Штучна стул сих жидене Геще туда тек сті с ОдОКтЕт ШТ ве д же «гий» пОВЗЬ легкого ланцюга, «аМ5-2?» варьамт Апсюй БІО «по» 15 яти хр т дош, фей! жо пре сдошує Я сте пасує Зк зів Уаї Тр Аве оБек Звху ех Ар о Нів тКроУві1 1 р: 16 «дій» 18 квїїх 7 ср піт «ка ЕХ «2132 Штучна ке калу ли Кя ее с ще ви я Хоч пух Мт З тк то г «шт І вео деткого ланнинюга, «АМО-яи» варіант Аль ТЕТ
Доу - «ах 015
Авр вро Баг Ав овкКа Бо 5ег х їх «їй» її «їх 41 сш ОСИ
І» стгкучна «ЕД отр ЗІ: комин ож мя варт оди с горі і: поко нн ша я «ої СПОВМ левпкого павниюсєсв, «АМО-йх варівнв бзейЬ ТО «ах 714
М - шко жк 14; ба моє дже фі жк ві 51Уу йвп оди ТЕ бЗіУ бах Пууз ак Ууаї НІВ. 1 У Та «102 15 ж тб «11» 159 сла А се «ши ек «13 Штучна дув «я?
Слон д Я дюбудм тої. Ко - К соту пух я біжи З ен АКенеЙ зх сити яти пюре. ван оважкосго Нє ге хатах варати «вЕЗ2 варізбелиний домен важкого лпаншюта ЗН, «АМО- а ввраеант
Апицгл. СТО «00 15 зів чаї біз Без Маї бі йех зіу вів біз Маї бу Пуз Вко йпіУ Аза 1 Ж 15 ТУ
Шек Маї Ппуй Мам пек Сув Ццуд віза бе БУ теє ТИЖ вне ТВ ОСІіУ Тує я зІ и За туж Мек нів ТгтроМас Акц біб Атїа Бжо птУу БІБ бі Без січ ТЕЙ Мек
Коди п я З зу. тд Е -щно тд прє Я ж й хо ОТ я гри зу ДТ з Фожку шк со тТкр тіж вво ко беп о Зек бі СКУ ТАх дво Тук вів піп Муз рве
БО й БО м со дюн тру ою ди сеух о Пор дя б та я фо до я Гук сіп сім дк ові ТБ Ме: Те бек Авр о Так бет Їїіє бек ТВкК Аза Тух
БУ То т Є
Мкаї біз пес Бех АБ беО Ак бек Дар о АвроТапт ді Заї Тує Тук Суз вх Зо 5 пів Аа Бек овкоа дя БЖо тук тую Тух йврБ Бек бек БР тує ТУЮ ТУК 105 195 1159
РЕ ЧУ дів вва двр оті тТкро Зі біл о біу Так Меє Маі ТБЕ Уві Бах яв сколи є Є 115 180 125
Е шою ку т. «их Ії сФет1з 110 та де «іа ВНТ «ЕМ» Швучна «их оку - пи ЧА ге сви змсуч я ї гак К з. с ик КЕ меч «вка вавіасельний помен леккого ланцюга Мі, ЄАМеачи ваюан квплх ОО спо 16 7. с. тк Кк ся тм у о - Пеучув вка -2 сети пт хх ях сек Тук Уві пез ТЕ обі ко БККо Зеє У) Баг Мах ів Ро пі сіп вч я ТУ т 1 о 15 15 пер Вр яо ри д кв ую рих ня дао т вк т ух колою спору С
Так ові йдка тів тТвх був осіу пі Авб Аве тїіе біу Бек о пуз ех Ул бу, якою. пе о 5 Же тя бен Пед пет ж зожу Кк пд Дт коник ен ее ак ря нів стю Ту Бій біп цуз РК Бі ХПП обі Бесоо Жаї Пец Уві Уві ТУух 4 ай
Жееюяно Ждан ЖЖ ирдя Жоден Жан т ло ас я току Жири бл я ст
АБробпво беж Аво АКкоа ко пек обту 116 Рг обід Ася Бе Зех піуУу Бех ще Ох що
З ск 5
Авиодек бі Азап Твх Аза тт Си Тв Кіз Бак ху Уві Зі Атїа пу ков 7 та аг 05 ТО ї ща
Тк ок 1 ше Е джут я те КЕ " Е пон ДУ Ср даже Є сп Же вро пів дво Тук Тух Сук бІп Уві ТІр олвр Бех беж бер Авш пів я що 5 хуя тиж стару Ех же ьо У кт г зі ож идоО то й-х то їхв Хаї Ве зі пу сіу ТЕ лЗув дви Тх Мі Хе оспьу сів
Ши і я 195 105 їт9 -810х 17 «ЕВ кві «й БЕХ «пі» їощо варів ета и - Ще х у І та де ОСТ, у Ями Я: лУдрє то ді яті Жов токхх мес дав о РВЕ палої пек тер о УВІ Ні Теродеж бец Аза Бей о Бей Мей 1 5 19 ї5 у - їх тях Код Ї х тю Те яд бю ОР Тула щої у учню ТМ 1 ге у пул ях тиж й нів Бі Ав о пух Тр беж Хв о йіа вія Ре Ме Аів піз су 28 25 БІ и ин ма допі кан нн а щооя яігио с/в зі сіУу піп Аза Ніз пів біз баз Ууаї пух РБя Меж Авв узі тую Фів 3 ДАХ 25 вт Бей Тут Су Кія Бо ІЛе ій Тк Ген; Маї вв» Ті РБРле бів бі щі х5 БО
Туш ко оАвОо іє Ті піл тую Її Рис Муз Бгто бек Сув Уаї рЕС Беч па та те за меї воза Суз пу піУу Су сСУув АВ Ав ов ші во бів Св Уві ВЕ
Зо 5
Таж спідя біз ошех Аа їі ТЬБкоМеб шій 16 МОБ Аха 31 цу Рг нів 120 105 116 я кю СолКя ДЯ кт в ит м . М- Кк хи й щі ж Ето ГО Д - У шк є шт піп БУ ів нія Ті ТУ Зі) Мек 5вж Ме Ге бій нія Ай Буд бук 115 та 25 піз суб Акс орто Був пу ав Аха Аза Ве Бий віз АВ ра Сує 01 У зи кас ха га Сув Баж сту дк Ако пух мів бен виш Уа: сій Дяю Вже сви о твЕ - ч Е ся ходи 145 ТБ 55 Оля був гУув ств Бех Суя Пух Ав о Твх АвроБес веч Су бух АТа Ак пів 1е5 175 175
Баем оСіюсіїзні АВ сів й Тс був дкц Суж Ар опув Бо Ака Деу 185 ї85 190 «ей? 18 «її» 48 чаійжт ВНІ ит т пох 4 того «Іі» Мото зарівпаз «ап І
4 кл та м золю Мо тля З тв АТЗ
Майї ТкКв о Біб Ті ал бе спе Тпх Пес; Бах Сув Аве лез о Маї пек Аа.
Е з 15
І с 10 ен чу - я х 5: Ко д- шо ую В Де оре юж Те 1 Зо були,
Аза Аїа ТУх Азв оДап о Ре АудЯд Буд пек Маеї Ар Зек 118 бі Пуя Бук 25 хо ч тре г 2 хї. лу из жохх лов ці тм: ха Лад ді Ж т ТЗ сан біп Тух сіп Уві бій БББ Бу йек осув дек ТУую ТВЕ Бе бе пер РЕб й ще же: 45
Е дош сл пани чи а дія сля доро дящО о бек пт вт пів Мес Явв одна Су Ак бек бек ек бек Вк тую Уі веж Авб ода.
Зо ех о 4 Я 7 з дол жи ШИШКУ 1 дужок до Сезю х пот ре Тож
Зв зів ата Авводта Бжко дей біз ТуУук йзр Аво бех Уві бій о Длоа пев хр як «че ва 65 му си Ге гом г ли ож ще 733 дет де при 13 о рок ато
С-а Ма Без бі Аклоїіе Мас б5ІіЗМ Аза Ай тв бів тТЕр о Ббейп Ме груз я зо 5 т п : х т т їх оку ко и наш ШУ МЕ Кутя хх
Беч сій Ка тТУЄ Біє біб двб два Ме ев бух СІ) Меб Узі сі ї1ї8 дов але до їде 105 її по х1 ту 1 їх з ж С не Ата ту Мак тій бла) тів дію божа Бі вп овіа Уві сій Аа ба Те Аїа Уві Меє тів пл те бу чЕ 4-57 пк 115 125 155 ї х х І к Ге Со у дою шо бек ов у ет тв Авил фей о іївц о йеап біб ТП вів пів СТВ Їй о Асу ГУБ о бей ТвКопврЕ 130 135 148 тоотлітоя мя ку во сут фах спи жищо тні й Ту ія їв
Чаї піч Ат сій Заї Без Ави лай Тв ТАЖ Ака бем біб Іяе біт Деу ; 15 щк 150
ВАВ ї150 155 НИК - ж ; : ота нич пен біз Тра й тю їцат; Доу їшча біс Нів бек бе» ес ота Ази Був демо бід Був віп Біб без Аве а дх зе че ще 5
Ав 170 175 зт ж : ; - я че Ток хх ває фею ові 314 сі) бах бек біз їі АБйи Був без сіб Ав осСув Ав век Бме фо 1 1850 т85 То
ПУ обу о Маі йем Вів Мек бі дав ру Нха їзе їХМе біп;рорзвиа аа пе
ТУ р: 2п8 їЗе Був вій піц Бу Ав бій Бей оспій Майї без Уві беж пув сіп Ада 219 жа ит лек тї1е тів біз бій Бей біс Буш Був Ті шаії ТЕХ Аа ТЕ ЧА Ахи та жо 238 249 йно Зек о аї рев біФф пув баб 51 вів дви рез Ме бій Те Уві дзи 745 в ша
Авпопцей мезо ТБкх Мет Мет бек Тай бек Ап о бек АтТа Гу Аврорко Так во п85 вла
Увь Кіа був 510 Бім о її ЗК Бе Ако дар Су Айва бій уві вне кан! во я був бе Бі ців Тк Так оАво 51У Те бує Тве о Бемд ТЕ ра Рута Ди ява аа 305
Щек Тр січ січ Т1іє Бу Аіа Тух Су йшр Меб сів лів слу 0їу ТУ вжВКІ 15 15 ЗО
З1іУу Тке ТаАе Тіє їте бій Ак Ажо сід) Ар о п1іу бет чаї АВо вве сіл
ЗИ за 355 ви так те ому щі Теж ПУ Уді БІіу Ра пі Аве о БргОо зе бі ЗІ 340 зах ЗО їУут ТЕ їй бі Ав біз РКе Чаї бек піп Зев о ТЕ о Азв Бій Бій дха 355 За веб
Б п 1-5 . си терв о Ки ше Я ск й т. т. сх З я ке ану г Х Є з
Тк чаї еп обув їі Ні Бемй Бої Ар о тТтр бів піУу Азпо шал АЛ тТУх
375 Я5 зо зе сей бук о ЗІш піз їЖБеа Туєк Без бек бек віч пі рей вва Тук дЕч
ТЯ В ї - з лава 355 55 їМе Нїх бемобув су їва ТЕ б3у ТЕЖ вів бі Був її ВЕах беж її ап А ГУ взає піп ро п1у Ав до Бл Явек їТвк о Був Ави Бі Авр одвп о Два Був о В 458
Сув тів бу Був Су Бек ба оМех бе» Твх о біу Зі Та Тез Бе Аве
Ах 445 445 аама су зу жо бей АП Бема ЗУ Ме Тух Тук вже сів АкУу сів ї5и ща ча
АВвп отак в зу пе дво ЗзІУ фіФе му ТЕЮБ Тух Тух ТрБ був Біт Бех «Ва ти а 158
ПлУу ТжЖжк бек обей Був Азід Тс отих Мет Меї їіев вх ке Аїв Авро те то З У : а : кН КЕ ї55 о 55 «йї1бУ 19 «иа» АВ срійУ ВЕ кевайя Мом. вада капс то
Меї її Ма пе Пез ек Впе Аїа Рая Пцейп ліз Віа БІ ме ТБгоніВ 1 ви 19 ке їїв Зху Се Беж дз сій Ако дп) Бат БО ба вав овес зму АхчЯ дич о ше Кун: тУуЕ Ан два їле пат нів Оху бій Сув Аза Тух ТЛАХ вве о тіє Мем ра
4 Е 35 о 45 и на ША аю Зоні йти Оу о щу пі щи к, 5 Кк ше ож пій пу Аве Бу Айва о Сув Ака пі Бех о ТВх ТВх о Авв Зі ТУук Ав тах 5О 55 во
Ап о Аха Ммец вій АкКке о Ави вів ко Мі Маї 51в ВЕБ Ав рьш бек бек та 5 ЕК шин нен х Га біос Толя, 1155 нео в жу ї т Аді ох гаки Як пи паб бує Бе Бій іш Бена бле Вйля М81 Ме біз два Ту ТВХ Бі тео)
БЕ ву щук я ЗИ У "их її ше з не шНх т ж тт кН сту З Я ока і я ху т
Без Біб Був Брав 5ів авп оТух тт Уві біб Ап о Мес пув Зек піз Мех що то5 119 ке ур (Я Е є і Ге че с В щ ж ох пер ту зе пише тре, а Е -х ще
Аза віп їжа пйхв о бій дЕподів Хві Бій Авповзв ТЕ Аза Тпє Мей Бей 315 1о 15 зх ім Я Ток ту - Гм ж пугх гола що Я лов тя т то з гл з м с 17 51 Ті ку Так обет їй Тецо бек сів ТнЕ дів біс Зі свпЕ Аке бух 4 з лях їз 135 145
Гез тах дав о Уді зм тк сій Уві Пец; одяй бій тТвЕ БЕК Ах емо опо
ТЯ А 15 Ей їТе дій йдем Мем о біч АБиі бек Гей бак ТВх Тух Пув беш Зі жав пів
Тел їта ї7а
Му ви 5-10 си Тих Ав шва їі Бей БУ дїз біз іш Був два дет
У У їй ї55 то
К Н І. т ті Ще щ- ше жо п шу СТЬ Я ле т т ще ПОТ ес ск до Ся їх ве сів нія Буш о їЇ3Зіз без біз Ме: спав Зіу душ о Ніє Був БЗіш І 1855 оо 205 щи з п у х . У зи ж - пи у ї г посил сел ШИН ще я Гь хоче йей йо Твжх о йей був бі Би Су СІ Авпобеб іт Сі ви Уві ТЕ гу я -2 яХи 15 дя ко АН ел юку З ів нн о ян подія 3 мем Техах о Мем я і: дЕч біп тах тухХ Ібе їде вів біб без біч бує 51 їз йо Дко Лід
З з я ва
ТвкеотТБЕ Авй Ав ше Ма їв)» чів БУуЗ бі бі Бви обйла пед Ме бю го ц Б ке 43 ко «туя
Тк ові нів дяй ЗО Маї Ав без Су Так обуз бім Бі мвь їж Теи тд ок сх «У іа о же пі ЗіУ був Аже бів ОТ зів Гуз БЕш БНе дха Кар осСух Аха Ав яке свт яке
ОМ М вве нн чІ люто чн же ДЯ т Ток М дя Жах сою пом й -- їх я ув си Тв ла чаї їж біз пів СіУу Вце Ав» їв дех Фіу Ххе Тух тв їхе тую ів ази Ме 30 й я -. пет. удо сту соя одн А сяк
Ази йно Мел вже 0І1хм вЕб мує пух Майї пе ств вай Мед о Аве» Уаходви з05 315 зі ЗО сіуУ У Тжю бне Уві іє бів нів ЛУуФ ія Авв о ш1Уу Баеє во Авр
Ба 330 З55 ваз бій Аго біу Тер був шій Тук у Мекї бі Рпев сі Авй БЕЗ Бе
ЗО 355 ай їх ті ТЕ Пе тет алі; й щ ЯК. же ТЗ бах Тов бе би пе Зі ТУ Ткв о із 515 Авп опа Бе Тїіє Рйе дів ТТГ ТБ Вес бло ї55 360 365
Акта бій Тує Мак Габ Ахч Тіє біз Ппео Мес вяр Тк б бІіУ Авап о дЕЧ за з75 за
ЦЕХ МЕЖ) ши
Вів Тую ес біб Тек Аа Аху рн Піа сіе СТУ Авй осі» Був сіб вза
Мих ст вх а зЗа5 Зп 35 що
Тук Акч Бен ТУх пем Був БУ Пов ТА с1у Тк Аїва сту Буз СіпоБеж 405. що 315 сви 2 Тік ту чи МУ НМ ВН к ве Соду т Й - дз Зх ме що пеЕ Бем с(1іе Пец Пів о шіу 5іа дав Бе Бек ТНХ Був лаб дія йв Ач по ай 35
Яну жрин стій Кот тує иа що подих: Ме Я впору Кк й ПА слежу
Акор Ажії був Меб СУБ Був Св Аза Пед мех ев ТБЕ о біч сту ТЕ оТтЕв доль гу пе 95 о за
СКруда с ті будо КТ хх Уеуч дим ОО Тори ож жо КИ ея ее терки пУроуя ЩО я
БЕпе Аж діа СуУуУї5 БІіУ КтЄ БЕег овдви рео Ав пі Меї Ве Тує Тах діа 50 8 у5 469
Зі іх Ав о Ні бі Гу бев о Ав опіуУ сіє Пух Ткв Бі о Тую Бра Гуд яз. адта и 488 сім Вк бек Тухє бек їз АкЗ ех ТИ Те Меє Ме ЇІЗе Аєф о Бузу їни 155 во 5 трепуж ля. зе: «10» 0 «ЇХ» 1155 «ї1йз вит «213: Нове хавівпа «по» 59 ее Пуск з Ток х та Сг Тез г тут п Ля ее и Ше ко тот пі мас Ар обЗех Мей Аза йпеж Бей Уві спем був їі у Маї бехоїмжи Лема Ти 1 5 19 15
Сов Кт ря ух дж их ем 73 кх 7 г. ТЯ. я й К їх х. га Ж по 5 р са зек біу ТАЖ Уа бій пі дДтія Мет дес фей ле Пебй бліє дв деж Бе ди я яечо;
Бо вес Уві Бех да вій СТИ ТАХ бет озео; ТТ СУБ їі Аза швх ОБУ
Ех
Ткв о Ажа бо НЕв бій бо Кі ТЕ ті зі АжЯ Авшокпе Бім Аїа ФМ в чув 5О
- шо ЙО Сех 1 Та У шт и МТ ТУ дог чн вух я
Мекї дзп зі Чів 15 АзвоБко ви біч Уді Тих бів Аве Уві ТвЕ Ак
ЩЕ та 75 Зо
Бій тЕр АтТа бує пух Уві УВІ тка обу Ак іч Гуз Аза пет Був ТІ ; во бли тд ті ее спа СВ ут їж що Я кі кю Р т ор ние щи деп 51 У Ата ї школа Фбущ шику ск те дж Я Уві А Ка Бі сооп Аа ліє Ака тав 705 Б с х с он п о ни я НАШ под ВИЦОю піт А Я тео її6 Бк ТпромМеж буз Меї Ах сіпозЗій ія Бех Бне Бем РУ0 Втїа ТВ їхО 125 тодхл пЖоряє дю М вче К-Т и НА х пог ст Ту ют Чоок о Сбдчи У Ток ївиа ТАї Мех Тай Уві вве Гуз о бзіу дво бзп о т7Тазї пев оїїе бек Впе був чт я ле Ах 1359 ХУ 45 з 7-3 пох ї кож Соя т ре ло тв пт кю Як Жорж пр Шлахх пуб Мі Бей Тіє Бу сЩа біс дев віз Узі ті ТУук був Бап осі сах ї55 5 БО чн х што хи Гак уж Щі що их - т с: дл Же тя 2 у х
Бпе їхме Ні вве чаї Око Аку пі За уві Ро дво ТІ беу піц Уді ув Уут5 щі Тавії дфювив МА дід Ше Дн дід пі ді сек ба діа А
Вів без Бр нів діа біп орко бів Ав вія біУ Уві Тук бек Аа Акад сх и су: обу то 185 т55;
Ту їїє сі 0іУу дело без Ре Тк дек Аза Рава Тих деп обесп Ті Уві
Ж ї ї Я зт птн триєт ї55 х бо жи т І т ї: я с дон ні Се У го. с Ки ож и ІНК я ох ле ня хін пт тч Аси Су зі Аза пів пу Тв сіуУ БЕОб обі Суб вв вав зем Суд
АК лу туби
ЕЛ 5 ши «п че К. м х- в ор ож аж йхаїке Же у третя ТА ий . й
Тіт Атїа Св Мек о Лвп о Ази йду Чаї Су Ні би АБО Тис бі біз Сук ши а я яко ї Ку и шк ою тре зн ме Ух се 0 нен ШИ
ЇІЧ1е Сув Вхо кс бі не Меб зЗгу Акл ТБеЕ Сувз стоп о Пув Аза Су Зав 245 25 Б
Не щас тех Знр йз1х» в ту о зу ОЙ 7 дич уже . пі хи ие пев в о ТАх РП сію Деу тк Сув Сузв щі вка Се Зей БІіу 6015 Б рад те доц пут лу ох ил
Ту бю тухка т рови тх К-Є їж вяя о Хокуя лу ж А се Мак 1 лу сттху тку зЗіФт су дув бек Тух уві ве Ппує ем вхо сдвев РКО тТух 1 був о бвк
ТЕ о «Не бут Ат Тр; УТ тя уже У к ву йду кт м ут т и ї чн я сСув ха лк оіУу Тжр о бух Бі дви Бі Су Дав біс Вітя Сув Яів вБко хе 5 5 тут ши 295 305 сту Впестук Бі РЕо АзроСув їув йеч о дка був беж Оу див дей СЕУ
Ву 315 15 зго
Зьа Меб був Авр ока ВВЕ бій пу СУув ої був бек ко бе ле лі
ТЕ зи прото зи З За су бецй шоп сСуз під, тв тв пі Кі БкЗ Ак Мох Тнх о вхо був 1Щїе джу зе аа 2-3 Том Лот ХУ мну 0 Мат меш чну ен ше не ее тод - ще Ж ві Ар їн ро Азр піз 11в йщ1ів Узі Ав» бет С1у був Бк ВАвп ри 355 Я 365 її бу Був вів бек шу ЕВ о БжОо Бей око ТБ Ап Сі бла мес тв зо 375 збо ї- х - о с ке ж лож що 7 з В жи т ост 13 Е Те ет Щосжо ме о Маї Бує рЕжо Ав обіу тво чаї Тез Назв вка Бу Авро впе лап ЕЕ за а 355 90
Твг двр о Нід Бпе Бех ві АХв тів БМНе Тих їїе Ах да Її дей БВко 205 215 МЕ ко Вар бБеї Зі Мах Ткр о узі Су беж Уді Ава тах Уві йїв бі Мех
ОК) аж 433 х я ит т жде зчеле ща з . т ше ХЕ а, тк Як ЖК кжа ож « й т
Уаі бій Буд Ко Епа йвп її Зекс Маї Бу Уві їжа БІО Був хо мех аа БЕ 445
Ав оАїа Бо дв) о Уві І1е дврв оте сбіУ Ні Аг ББе Ді чаї Ті Ав енд ще її два 155 450 чо ох Є жд т бою х г. ї Ох до т х пл, т с под М ра г: ву, є
Аж век шек Бій Вр Ту РКе пу АвО бі ВБКОо Ті був зе йУуз У
Ав ато 5 Ав ат оеу зо Ложки 1-3 3 ож А дО з пи чя ток тов 15 1 се з гі ще йез ем ту МУЗ БЕб Узі Авт пів о тУЖ ЗБК Бій теж СА Бі ї1Зе Бу - -Х 2 Я
Та 49 185 тах тп ваза ші 11а Хаї Тахо бео би бек Ббвиа пій Ржа джу тре піц
БО 5о5 510 пада СИ та Е зе ід На ях ща до бо ларі із ша, т МЕ яд зем С Хе чаї Гоа Уві де У АЕЧ І мовам з У їз І У ср б У 5І5 Бий 5 пі вхо піУу Рхтб УВ1і1 АкЯа дк пе Тек о тТвт Аій беж Її 5іУ Бей во 5-0 вия ЗАЗ вхо ре дя бі цей вза пе бБео со пев веж бЕ Так Тв о Оза Ав ві 55 Бе во
Му ЩЕ о жсов 5А0 го Кф Бе Бжо беж бек Ома вав Аве Бе То Уві
Бе й БУ спа ув чі Ак йха дек Зам оз цу бек бвзро бій АВ Ав їЩ185 пу
Я 280
Узі бко бі йо Беу Те бек Уві Без Бей о Ажи депо дпем НК Бжое Лео 5 о БО ів біп їТукюк чаї Чаї вч Аза йкч аж Ав тах ув віз сій біУ Ба їй 5 ве тТжр Бех бів АЮ Бей Тв АвБа Ткр оте Бес йех Вар о її1в Пец; Рко Вкео 25 830 ехВ аа бСія Бво бій вл те Бжже ТХМе дет два Тіє тТвх Нів бек бек Хв оМаї 85 го; ЗІЗ іє Бзж Тхв ТИХ Тзіе ба Аз слу Тухк Бех їі бе Бех ТБ тАХ І1Іі15 во ве ВУ дра тую Буд Уві сіп с ту мМув дай біб Азропій ів Уві Авромаї Був во 85 їіє цув йве Віа ТВЖж тТіє ТВж о Зіп тую бів Гей буд СКу Бембі: вка
Бо З а зьи тах діа Тк ій Узі дар тів вре бтіа біз Ай о Авп о їіє Сіу Бех та т т ти зек яп РКО йпіа вне хе Ні 534 Мед Уве ТЕ ец вБеї біюш пес сіл тих 73 т
Аід Вго віз Авро По йпіу сз1У 1 бу Маї Гей рей) ГТ1іє дів К1іе бе 749 ав ТО піу Век Ача бі Мет Тс Сув ПУ ТвкоУаї Пежо рев йТтТа рве во лів тв т й
ХІІ Пец бій Бе; БУ Ако Аза дви Маі біп йо Вк Мек Азї85 бів Аа тя 75 ї8о пе ій дво Ма) дха Зіч піч Рез Аза аі сій ре Два беж Сіу Тджи ї85 7 тТ95 оо ївч Віа збе Ав вхо пу Маї Бу Авуу Аа Ехо дер вхо тах Яїів тут 505 ВІЗ 515
Бршеа Мах ви АЮ о тТІр дво о Авроїів був Бе біз дар оМаї лі сім бі що ду 3 о) и 220 - - пезодю що лк ов чия ЦЕН ст дО То сь лок нот 519 Ави Бпе Зк біп уві пеб бе Аза Ак її БУ Ппув АворозіУу Бем аа вав; 845 ахч Мас азо вів КАТЯ ТІїв пув Аа мес Був ОБО Тух Аз Баг був дер 50 БЕ во
Азр вує дк Авв ОН АТ Сіу сів Сем бід ві ей сСуз уз без бі 855 ЗИ 75 ня
Ні пів око дви ше ІїІ1е Авп о бец пев бі лАаішк Су Сів нів Ако бТту 255 яз ах
ТУух пев о Тух Бей АБЯ фе сій ТУук він РЕЗ Ні 5іУ Ай Пе обер дво чо Зо 5 з те Гей дхкз був веж Ажхщ Уді ей біш Тв Ази Вк Атя ре дів тів як прес дл за 325 дів йвп о бек ТБЕх Ага бас Ти Бей беж Ба піп бі рей оБе) Мів врБе зза ах зас
АТа ліз Ашю Уаї Аїз Ак біУу Меї Аве оТтТУує Ппей йек біб був бій Бе за 355 м час їсте Ні дтч Аве о геподів лів Аж Авт їхе о бБед Уві бпіУ би дек ту за яо ть хх 2 як т я т Аїд 2 ето очах я де ки ря ту Поу т тв
Уаї 818 цу Тіе Аплв двзр Бе пу їі) бек Ауу біс 5ізп бім Узі Тух 380 зо а чі Бе Був Тпх Меб обіУу Аха їйвб Бе Уві Ак Те Меб о Ата 1382 51
За 1 вв ву еп о вав оТУух век оуві тує о тк Тих два дек дао уві Ти дву 1 ТЗ 105п
Лікзіяя г я соч. дя я до дю пдочи В оку АННИ рою чл
ТУ пс Уа1ї бев обзез Тхв о біз ї11е Уві беж Пец бі сСіУу Тс вЕе суті ік я 1930 1235 тух Суа бі Мек Таж сСув дів бій без Тук Зі Був їв бро Зіп тади 1045 ї959 зі ТУк ДЕ пев; оБій дув БЖО бе Ав Суб Бе Ав» са Уаї ТУ їаи5 То5и 05 хво) бем Меб Ах сбіп Су Се Акеа біт БУБ5 Вка тую бі Аха Без житт я и, я ср тато НЕО 08 бек Впе АлЛа бі їла їєз МУ бер бей два Ак Мес бец бів осів 5085 ї05о 195 дк Був ТтпЕ ТУК Чаї дам Тв тв Бей тую піл був Вп Тв отує хи я меч 1305 1195 1515 ду лю зов ушодч ност зії жі я
Аїа зіу їі азБ Су Бак віє БІ МО Аза Аа для лях 115 Тк «віп хі «ії чу сів» БАХ с13» Штучна тейих «тки важкий павцює 1 «УБОо-АМО-и» СкоБЗМАВ їсбб1 з АдА-мутеаціями скани Оу
Файл» 23 7 їв слот гі; т ст Мт лює Ж кт хІ- 1 ке х ххх бішмаї бій бе Уві пі бет С1уУу Ч1іУ Сі Без Маї біп бко біу біу
Її 5 10 15 ех н оч кожух ут ті Я іп 1 "чи що Ох жи р зів м ке Я я ля ле зежх Без ЗкКа пей бБеє Сузх Аа Аза Бех зіу ТУук дар Рре Тех Вів тут ст тк 7
А З ха троє м Кожеть руту в 1 ож є. З У Хииу 1 жу т ках 01 Ті го То оте гаї
О-еку мшЕ т Ко чава мив зам ска Ко см мшВвосау мак Кр жах
Зх 50 5
ЗМУ Тер їі вп о тах Тух тах піу бін БКо бпг о Тук Аїа АТа Авті Бе и 55 ВО
ТУ ААУ дЕЧ пе Тв пе йех Теля йзиа ТКЕ дек зму дек тва о Ава тУх о У зо їі сій Ме дал Веє Пево дхо Аза п) Ар отну Аїа Маї ТУукюк ТуУужЖ Суд 85 зо аз
Кіа буяє Тук Бк Тує Туд Тужю Сту їБПЕ Бак Нів Тер оТух ЕВе двр о Уві 109 105 119 їїв о зіУу сін бі ТП бас Маї ТвЕ Узї бе беж Ака Бех Тк Був шКУ 115 120 її го бек УВІ рве вра Бей дів Бо Зек Бе Був Бах ТЕ о бБшя сі сту 130 155 142
Тих віх АТа без біб Сув о тома Уві Пух вав ЗуєЄ Вив ока пі ВЕо Узі 145 МВ ах 150
ТнЕ чаї бес о трго деп Шеюк Ппіу Атіа їжи ЖБгобех бФіу чаї й Тих не 195 то 175 вхо діа Уві Бей бій бек Бей Б5І1Уу Сем о Тес Зак цей бех бек Уві Уді 80. 1 ву 15о
Тк чаї ко бої Беж бБає Пен бі Тс о бзів Тахо тує їіє був Ави Уві
135 225 «05
Мо лот й Я Зв Ів Сости хе Токктх 7 М! Буг ожив, Таж пе ет ча ше мавп Ома їх Екс йшЕ два СТВО міх Ма. ВАлре пух лк Чай 5 рЕо це г ті: т а люткт 2718 яв 2 ЕХУ беют сСув во бу твК ойіз ТЕ о Сув Рха ба Сук Вже Аза бро бім Бех жк серію к док ех я В ра, тп по - пом ич пухку я з. СТА їж хіжтих о фол Туя сани от зи й цез зу пі БЕ беж Уві Б; Цец Бе Бко Бкс Бу РЕо ГУ Авро ТЕ 245 МІК а5й тосух 1. т - я. т ки Зм ях мя гом пт СИ же пл щі т Кене нене чия і сля хг ва Ме Ат хек дку ТЕ БЕ бі уві бВк о Суз Уві сві Уві дар маї зт жк ке ше 7 йпвж Нтя пій Аврвробко Ст Уві пу РБе дя БЮ тут маї дав о піУ Хай ке Ви ши т т фс хо ІД я боки ді Ел Товука т щи я ок де Язик г» . піз тУві Бав Ав Ат а оУувз ТВ о Пув ко во З бах лі о їв ТЕ да ща 250 из Зп їв Тук дек Уві Уат беж я цей те о Уаї бе дів Піп ойввоТтЕр о пей з05 16 315 зо дамо у муж Бім Теж пуз був ув уУвж Бек дя БУ йіа гво ра АЛ
За За Ух вх г бів СЕ Тих ї118з Бех був Віа (ув ді бік ВкКо вхо) бід Вго 345 355 за
Сів ув дує уп о дей жо Рхс сув вкч Ав бі огрей таж Оу Аать бів
ЗУ зво зев я чи - ня, на з и а ШИ Я я інте ху буку є жу У ж За
Уві вак рен о ттр сСув їємі Уві Був ПТУ Ре Лук Кко бек ливо Тхє Аза
Ук 375 зво й Кт У МЛ ож. з Шелак А Ся що з. Тех стяги ОТ. У Ач ИНЬнІ
Уаї ів ТЕв о бРГо Бех Ап обу бат БКо бій Аж Авап о Тук був Хе ТВх -уу огій пад ди г
ЕКне: зво за5 Ве
Вго Бо Уаї Без йо бе Авробіу бБесє Гпе ББе це Тує беж Пух Гео т З зак 41їа 55 пи пр схо й др сте щі потр т же ШК пове тршо Хр тв очні дав» мує БІ АсЯЧ Ттквосів бій біу АвгпоМаЗ ВБКе бек бує Бжвх ої п їла 29 475 30 ск ман мат ЗВТ ду «т Мово Я щу Мід щи и ож Суху пери Соєві аж
Уві Має нів зізч діа пев Вів двп лів ТтТук ТВК о сЗзій Був бат Кей; век ща СЯ тав
Ох ее -
Тіязтв Сш я Крути Ся ст злу іївц о зехї Ко се пуд
ЕН кипах о шх тло кт «ее Б «війт БЕХ «іа ще УчиВ «р «иа» Взвжмий лазіющй ях «КУКОаКеАНОоМИ» СтвяБМАВ їі з АКА-мутаціЯями ж Кех им иа а шо сУушсеваилциОчІ Я «адаж дк яти я ст ли ее пою 1 чи ві хг спожи що юю БИ ше запо очаї біб реч Уді би бек бі дів бій Уві ру був Ржео БА Кіа 1 В 10 15 се ТЕ Пе тк т рату - цк рі г и ання КН ся ся ге; пове рух тах
Зек Уві бує Маї ву Суя Бов о АтТа дес 5іу тую ТЕ РН Тис осі у ту ре г вх 2 я БЕЗ,
Тук Меж Нтяє Ткр Уві Ака бів Аїд бко біУу біп щіУу бе 51 то Мет «й ее: ие г щ кое ко троса с ях а фу я свя дує тощо тод От КК іч Тк лі Авп орто АБп бек пі зІіУ ТвЕ АБО Тує Лін бів ру о Бле
ЗЕ жу их 56 55 Бо
- от я . еЖ. су. ХК ти я - Тоеєж Ку В сема щи ях ри - ри
БЕЗ Зі ву Чаї ТВвжЖ Меж Тв Вт Ав оте век о їле бе ТВ АТ тує во т т я
Мат вів цев Бех Ас Бем АхЯ ех Азр о Авзв лк вів Уді Тук Тих СУ 85 зи З5 вів Ака БТ ско Ав о Бке ТУук ТУ Тух Ар бех беж 5ІТУу Тук Тут ТУух лк ее св
То 105 ї115 гже бі віз вве Аз ге Ткр опіу сій сіУу ТВБжЖ мМек Уві тах Уві век 115 155. не
Ппех Аа ет Таі Аза Аїв Роо бВех Уаї ББе Ті Рьа ро Бго бек Ар
М 135 140 іш сит Ту Бут ех сіу Тк Аа бек Хаїі Зах Суб Бей мету Азп вв 145 МБО 55 169 їеррдх зак Ж вл ще З --о Лот їх п Теж 7. г лу Поке тов ж К х ті
ЕКБе Ту Бк ДкЗ січ Аза Був Уві біа Тв обув Маї вир Аа пів Без
Ме за ї7т5 іп обжк о щі дат бек сій пи Ват о мМаї ТЕ о пів біл одер ек Гуз дно
КВ 185 їщо
Хек ТВх Тужє вер Гео бек бею Ту Без ТВкК бе); бах Був дів Мер тує чав Зп тт, 155 що є х сій був нів Бу Уйі тужк Аа Сув слі Уві ЛЕ Яка шоп ЗІ пед ех гій пі ат паж рев Уах їй ГПуя Бет БОЄ йавп о АКа піу сін Су Аве Був Тк нах
В 230 235 в тних був Рхе Рта ув Рго Аїа жо 51 Бей без -1У бю яко чав Уаї
А5 250 255
Ж з х зок
Без Ппрк з Ме Мі бах Ах сне г Був Ве БУ бух ув о вЕвоОТвт Пе) Ме Зі Зах Ах
ВНе Пцецй Бе ка Же був о кхо Пув вв Сті ь
З таль прищ КЕ РН я 255 доки : 31 Жак вра піч дяв вка ТВ й ї Уа пе о сУвБ Уа Маї Улі двюочаії ща Ні Січ Вар КЕ без бі уві Тс СУБ Уві Маї чаї Авр ок дж ї во 2 й 25 В 1 7. ї 1 5. йоаоя про оку
В я тка Туз паї вв біУу Уві св Уві Нів Аа Абя був чаї був Ра лип тк тТух Маї Ав бі Уві с : ; ту мае 235 Кл 2 спо Фет одне УхтІі Маї Як
Ж і іі т я ЖИ я лякає М Ки В го чі й а. па
ТК о Суя Бко вата щі Зі Зі тує дяп бех ТиЕ Ту 1 п ік ЖЕ 320 зов не) . : їх Тляжшо ар бік Тен се ша туя 1 я хо Фтиз о тац;ц дет САУ ПУБ о біц Тух ГПУ тді бен Та Уві Пед діа Пій йвю Тв о ви дво остіу шу
З ЗЕ и зва 235 ;. - поз я п я тов Таж 1
Ї М пк до Те с йдта Во Їта с-г оМУуБ тах 185 суб був чаї Бах Аве Був йів Гей БКо дів го у ; че й керня 5е
КУ 315 35 . - пед щ Іл СВ був ТЕ тей Вке т - г. пох т ско т х ки ЄМ укскн т се й и фік її І : чаї ЛУ НЕ НЯ же пет оуУВ діа пу сі Зі Бо Аша пай о БкКо ЗУ з зт тк 355 ЗБ вис г се мех ша жоя порок пд Ше и йвк сук ДІВ - Ї Ат дво жін єм Тв Ппув Аяа біб Уві Бех дез вк су
Вко пес Ах Аве піз ГБО ТБ Му Ат б й хех зав ув 375 зно ее : діа УЗ Бін тез бів важ Авт їз У Теж Рко Бак Азротке діа ві бін ото бів бе
Чаї п5воб1іУ впЄе ТеЕЖ гко БВж АЗротке Аїа аз Ї що 385 395 зх АВ
За ко - шою От ову, ві ще ; я зп оТУую ПУув о ТВ Тв Бе Бус Уаї Пей дров сі І о бхо піч Аз бво Тух БуУво ТАЄ Тв Бео і р й до
Зі5 11 вола
У 41 к перо кн дзе У дек Ака - рух щ Жов ХР дулю ке а жів Чі Ввю УББ ек с вза Зі бет ВБе рез Бемй Ха бек уз ей Жьг Чаї Аве У
Й й Оле зе ал 430 ке 125 й - що ні Меж Ні біб Від цей ї р Ма зі ех Су бек оУві Меб5 Ні БЕ ОМ А ско біл біб спа У й зі вне бе Суд о бдаг - їв
ТЕЮ тАЛІ хх А ОМ МИ Со я ОЄ й: ії:
Ка ла ах
А ас т з В п х -х " - ж - - соя нти. ЖИ Код ожжаж нив Аа Аза тек Тк о біп Був Вег део бек Бешф век хо щі Був 455 455 ЕЕ «10» 83 «м А їз вже «кїі1йм РН
Фиїйт Шевучна
СЯ
«х2й3» Легкий лданцюю ї «УОЗ АкМаниз СовВвМАЮ тТЯбі з Адве-муУФтвліями сСУБотапое ЗО сапою ши
Ар їм сій Бей тп сів йех Вр ойес Вес ва Бек Ата беж Ма1ї біУу х З їз ї5 вза» йдхх чаї та Ті ТПУ Суд беж кіш дек о біп Аз о Зі1їє Бек дзп о тТуг 2 28 ке іїви АвпоТЕр о їУує був піп Буш Бо бу хв Аза Вис 0»Ув МВ Ле її пе
За Б 5 пух пери бошевяо Кк Е БЖ шов ОМ тої о ще Ж жи пі вих
Тух Рие Рнж бак бек Гезц Нія бек Бі Маїз РКО бе Акоа Ве беж с3у зи З І тоди ЕЕ ери Ж у по т Бр тва їди тв ттш ся - тоді стер стих деї БІ Бак С1у Таж Аве БПе твк опей тах ліє бек беж да 530; Еко а та т йо
Зла Аве Бе вів Тпк о Тує Тут Сув біп піп ТУ бжше ТНК Уві ВБко люкр
Я за 5
ТВх Бвеоблу сій 5іУу ТВ пу Уаї бі ГТТїе тв дру тнс Узі Ата іа і 55 115 рт дек УЗ СвВйЕ її Ре ва вка бек Азвозіз Бій Пез пу пес БУ
ІЗ ра 155 ї т Я 5. 7 ч ;. ої а ку ту й у пу гам т. -
Тих дів бек Уві чаї пув Бей пей Аза де Бе ТУх рко вжа біла діа
МО 155 т4о : АЛЛО - СЕМ хо Ге Ех ра ше тою Тк січ СТ ховав сю СК їТУув Ул бів тю обов МаА Ав одай А1З бен ПТМ меж 518 Ав бЗех сім гг «вд яко: яд
Іїч У 159 55 ко ли бек Ува ТнЕ під бій йно о бЕ Ж був Аво Бех ТйпХ Ту Бей пе ше
ТЕ 170 х шок ПИ -рїх їж гу С х ж Жоал т х 4 хостах ж їз ту щ пас Тдж Би Так оБвево йех Був Аза зво Тух 030 ПУ нів Був Уа тує їв 155 1 5 вд тки ЖИ тк, ух яд ят паю Ж Й кю я ян гуд чини тк Зх аа Не м у АЛ осв Нів 5іюж щу У цес щек шах Мб МА їі пк в ХЕ хорд пе гу п ін ОО З мо сво доку й ит
РиЕ я Ася ду хів бух
Трах ке ДИ тай» й чи «ах Бех «штам ВВЕ «й 3м Штучна «ЖИККУ рот т птжд лет 7 МЕ т я У убито аМмт Же Код хіт ред, тра» дПегкий лайцюкр й «УБЦЕ-ДМО-У СуоввМмАВ тб з АдАеМмУтацьКМИ ее Не НОЯ
УВО АлОААЧИ 152 «ап» к4 я що Ух с не і лк з Е й вих, гх вх ге Кон реж БВ Юлю свя ке я. т. ї: бек бук ві ей Тих Сів Бк Бко бБег Уа Беж Уві йів Ро біу БІВ 1 5 ТО Тх
У акт - вк п) стаз «хі з х се, Моє те кує зн и НА НН тв ВЕв Ах їі ТтТБЕ Сов біу 03 Аяз два тів бБаіУу беб му зех ува пт як ча 729 ж 30 -4 т с с оку Фоніх ших з шен а я НЯ Н я ж ня треки,
Нів Тв оТуУук Бів Біо МПув Рго шіУу біз Ата бго Мах Бей; ві Уйщі Тус о а
Авродвр бех Ар Атса Бо бех спіу Її Рко біб Ака Ве бек буіу ек за хо БО х К ох у ей щ сб пл кі р яки К т сднинь т а Хом тр квт ожЖек обу АВ оте Аїа ТБж Бей ТЕ Ії» Зв вка Узі біб дів сію то т я де жі із ви отУКЮ ТУуЄ Су біп о Уаї ТЕро Ар о мех шет шву авр НІВ
БЕ зо че
Тв маю Бве Сіу Єву біу ТВх ев Бей Ти Уяі Гезобеж ше Ада вес іч 05 119
Тв ув біу Бхо деж Уві БА Бу це) під бо Зек бек був бек Та пос пт довж 115 ї2И 195 пер бі 5ТУ ТЕкК АЇш Аза Без бі Су й» Уві Був Аве туго кла ско 135 ІЗ5 145 дж в тд жу А пе пл же пишна и піз їхо Май Тиг оУві бег ТЕв о Авло бек біт Аїв о МвОі їх бек сі Уві 155 150 155 150
Нів тик спиш бркО Аїа Уві ей біл ех бех бу Пер жумЕ пек бвево Заве 65 ї7о 7 дек уза чаї Жипк о Маї бе Бек беж шеї ід Зіу Ти Біл ТБе Тук 118
То І5У 150 сув йзп чУві дя нів їуєв Вко Беж дев Тв Був Мн) Авопб обу Був'Ува
Аа 200 5 пів РЕо Був Беж Сув «ЕП Як ки1ї» яЯла «па» вих 3 Штучна «ев «ий» баеажкий панцюю 3 Чи как-АМИНЕЗ СховаМАє Бебі з пАд-мутаці ями ї ОБІЗ29ЗО БАБдемутаціями (СМЕОЕдпуй сп ві фа яв пот дк пестощі їх 13 ки жук дж дя порухи - пе трож Уеду АЛ юю піль МаЗ бій їз Уах зХю вех ку ші Му ви Уві Бій Ехо біУ Сьу 1 й 15 в бер бої дж тов -т-еї пев іа дів о бвуи ці Тук вві рце тих Нів ТУш ж о зшх хм ше УК ла В ОшАК сх у ОЖЕ БЮ Е ЛЯ дих ОМВО Т1ух й 5 2 ліУу Меє двпотТкЮ Чаї Акцосів й5тКа Ро бзїу Був пі Бе) Бін Тер ві 2 ах пу ля я ре я Б п ря: ї ти пре евх тя Е чення зло сіУу ТЕжрої1іє йо ТВх о Тук Так о біу бій ВЕФ ТВж ТУук А13з Аза дер о Вре зо 55 що їв о Ако ве Бе Лак Рреобех їви Ав о тТВвЕ Мет Бу бек ТВкЕ вів Ту 5 то 75 що т рел як Де я то лог рози оо ж т-во З Фежічю т є, дей співа шес Ази зе рей деч АтТа бій деротТнЕ Дів баз ЖУЄ Тук сСуз 85 що 5
Мія пу тТух Бко тек отух ту СтУ Твж о 5Же НОВ СЕК ТуУух Ба Аве мя
ОВ їх 119 тевобіу бів БЩіУу Тв бе; ах тТвкомаї бек ех Аіа бек тТвЕ Був БІ1У 155 ї20 125
Ріо век Уаїх Ре Его без Лія Вко ех ек бу Бек тик пак йпім с с1уУ 130 135 ї4о
Тв Віа їі злеш сі був резо Уаї Му Адо о тТух ре Ро Бім Бко Маї
145 15 ї55 Убо тиж тат Беж Тк Мав Бек о Бі Аза рей Тк бек обі щі ів твж Біне т ащ тр ше ее 155 АТО ку ко діз Узі їжи бід Бек дет бі Бе»; Тух бе ви Зак дет Узі Уал їв ща 0
Тих Узі жо Вес обех ек Бей 51 ТВ пла Тв отУК фе Су Авпочаї 155 Ов 205
Ази вів ЗУув о бко шехт Ап Твк оп таї Авр буз Був чаї біб те Був дж пк сет кій ув ше пек Су ви вуз Теж Ні Тв Сую Рео рко Сув Руб йія ко сім АТа
ЕЕ за 235 ай
Аза біу сіу хо бех Маї Ре бе) Ре Рко Бтб бух Сто ПЗ Авротнх
Во 25
Без Меї вів двхк Ага Трх Ехе біз Маї твер оСуа чаї Чаї Маї Авюро ві
Ба 55 вл
Зеж Нів Біо Авровжеа ЗМ» Маї Муз ре Ави Тер оТук Уві Аврвосіє Майї сіткк св шк т ВИ 255 іч Увїь Мін Ап Аг пуш Тих Був Бо дк ск Бій сію ТуК о Азп она о 255 зво
ТІ ТуУх Аз Маії баї бе Ущі Бей ТВЕ Узі бев два бій дБе о ТЕр бе 05 16 35 зва
Ач сту був ЗТ тує Був Сув Му Укі Бех АВ Був Аза вед сбіУ Віа зах за 335 га тів сь) пує ТВЕ їж Зегобувх іа Мув 01 бі Ро Аро Бій Бо 40 345 З5е діп Уві ТУє ТАЖ Бец рго ВЕ Сує АКУу Авробіє цей отркопцув Ав бак зв ЗО 3655 чаї дек Ба; ТЕ був о йеа Уві Був БіУ Бе Тук Бо дех дев ТТ Аква ту ех пох ух
УК аа БО он: Пе го г АшИ сх - Га - дея а: дя Тех сто м, ік ж ясвоєн т. т Б аї січ їкрюобіз бек дзп о біу біб РБро біз Аап Ава тую Ббув ТЕ ТВЕ
Зо Зо 395 по вко Вго Уві цей бер ек Аво о спіу бЗеє РВе Не пем отТухк бек був Бей зо 318 АКЕ що нк поет тожк де каре нн - тк Зодех ке ке а шк ач тя з яд а с тнх Уваї Авр о мув Вех два ТЕр біз Зі сі Ап таз пе Яекс сСув Бек о ані Зо 7аї Мас нів бів Аія ев о Нтя дп Дія тує ТОК оФфіп був ЯеЕ Гей ЗЕ «зе зх 48 455
Гоше пою Пи, ОК ди Ток жкх перо век же зм ісух с; «10 6 «АїМ ча хата ВИТ к«йїаМ щЩеУчКа «ВШ» «га» Важкий памцюг о бо «чЕСЕК-АМО-и» СсоввМмАБ табі З йАА-мутаці ями ії ваш ГБдіАйемутаціяйми (ЇУБсСтапчинов1 Б) касою 26 не птио ко ух яд ж сбдеує Мк лом жа р сухе Тен ад. пу ів Уді с1іп бейп Заї біб бек бі діа піс чаї Буг Був Рхо біу лів 1 й ТО 15 ваг о Уаї пу Заї ех бух Був Аза Бех б3іу Тух Таж Вре Твкобіу Тухк 2 75 35
Тк Меб Чі Ткрочаї Аку Біб Аа бо Зіу бів біу пей біб Тхрв о Мат ще яв е а що 45 біу тро Щї16 двп Бк лап вет біУ ЗБ тВк Ав» Тут діа Зіп Був Бре
У Бе ай бій біу го Уві Тл Меж Тр о Ат дво Тв вак Тіє бек ТБ Аа ТУ ши у З ш 2 екс віч бе бвкх Ак оієа йо беж дво вро ТВ Аів о Уі Ту Те бу
З за яз
А1вз ко дек Рез Аза бро ТУх Тк Тух Аво век бет Бу Туї ТУЮ ТУК іп за 119 вже бі» Ата Бе одзо» ліве тка біу бів сіу ТБх Меб Маха) дБ Уві ках
ТЕ 185 вис ше вла бек таз Аза Аіа ке Бак увазі РБе сіє Ве Бго Бба дек о Авр хз 135 145 сів бів Ту Беш о бет Сіу ТК Ата беж Уві ві буй Без Го Ав одаВ 148 15 155 Ще спе Тух Вже Асе біч Вія Муз Уві бл о тТжро був Ма1 Аво Ап Аїв пе» 185 ї7о 175 тп бек піУ дви бе Зі біс; яве Уві Та бій біп дво Ееї Бу де 159 5 150 дже ТЕ отУхю ех Сей бБеб СЕК тах Пе) Ттйжх Бей ода зу Ав оАВроОтУЄ
ТКУ 20 2705
Же іт Фр ту ху вче чо у ст тр тен іо дя ща ше вій пув Чів дув чаї Тут Ат Сув зі Уаї Тек НУв бБіп блу Ге Зек дат яв пре ж 23 шко бат бо Мі Тк оЗуз бек Бах бай Ах пу бл сук Аве о був Тв Ні рожні 285 255 ай
Кам со гЕж и тер, рхвке ох, ЙО Н нон а С МЛ ою бу ек Пощокю хо тв су вх г Сув Во Аза ко ЗзАЯ Аза дів піУу слу БО век Уві
Я В БО не впв Бей; вЕпа рхо рт Був РЕ їв АБв тТцх цЕч Меї діа мех Ахсе Те я ге ИН) жк, вік, г ту У т. я У чт Се бодок; Мт х С каси хв ї М Тра них ет Ех я
Ккз іш Мах Тих Суз Уві Чаї Уві лАвр оУМаї беж Ні ель Аве Рхо біх
Те ВО 25 хе. Жов я ех ща у СК ах яки КТ ух дю пі допо Хол тотгш
Майї бує Вій лмних: Ткр оТУух Маї вро аїу щі бій Уаї Нів дві дів Пув дня зле дат
ЗО 785 зай тТвпк Мув Ро Аха пд слй Зі ТУук Аво 5ек Тв Ту дКЯ Мал Меї ЗБЕ
З05 зо 15 а зи яру у их опек 7 До У у дере ут свою пек пс ШО фо так пед тис Узі Без вата іп дзр Тв цез Ави о біу Був 51 тує пух ха 330. Зх
Су о пув о Маі ех вв Був діа рей Бі Аза ко Її па) ба Твжо Те о 345 435
Ветопуш Дія Гу ЗКУ п ро Джиз Зі ре пів удо СУв уВЕ Гей РЕхо зх ле зах зд и З се и Не 7 дв М дж Ток й х їв ке. дя СК з ст ще реє дет Агоа Аве Зі Гез Тахо Гуз ап о бій удо Беж Ппеч зек Сувз дій не зе «А 3 ав Зо
Уві пу Пі Ве отую Бко Беж АБО Іїе Аза Уаї ста Тсросіб зве лави 380 ї58 450 су піп Рхо біз Аза дви о Тух пу Тк тв о бко ко Уаі Ппез Аж йег 408 410 ВН
Дар сту Єву Ре Вве Га Уві Вест Буш Мей Тах Уві Вр Був Важ Де го аз 439
Їїжв 5 біз о БіУу Ел Улі врЕ Беж Су ех Уві МЕ Взяв біл дта Без
Є Шскноч КУ Ки 135 440 КУ
Ту 2 х ї ке що СМ дате пат ше Жокавуї щедрі ох ск нів АвБиах вів ТУуб ТЕ Зі СУБ оїшекК їв Зек ззевз вех Бе саю пуд ни 55 зай діт ту та «ие я «кі? ЖІ «туш РА «и» ручна «ТВ пт тайаР дЕКЕИЙ павнцнюг Ії «УКшШЕЗАМО-й» тоБЕМАВ їчбі з АВАаемутнціями ї взиЗс бдавБа-мутаційми СУЕОокКатлстйеООї «чо и
Ак о сіє дЕв їец тье бів бет Рко Беж бат цей ех АТа БЕЖ УЮ БІ 1 5 15 15 зх В - товщу Ж ми. пон ин а и Али щи КІ тоди кое тру вв» о АхЯ маі тах ії ТрЕ Сем бБет Аїа Зеж біп дер о їів'бЗзек Бо Тук за 25 35 ; : ще ми ня ті пра аа нин и ни меч АВ ТЕ отУк БІЙ пів орух ко біуУу пу Віз Ехо МПув'бві ев ТЕ з5 г: Ед
ТУк Бра тс беж бБег Пец Ніз Зак 51Уу Маї ко Бе Ако Бпе Бек БІ о 5 ся я й рр од ж ка ней годе по СТ Сх ШК ож ух дек бі Бек бі ТНж дво бе тТрЕ Бей ТЕ ів веж бе оби бій хо ве о т що дя ряше - ь ї гео бух Я іл т оду Дт меч ся
Зі АвроБае Аз18 ТБх о Тух Ту Сук бів біп ТУух ех ТВх Майї Ржко Тер в: Зо 95 тТвВжгоБрпе 51у Зі 5іу тажї був Уя1 Біч ї3е Був Ак ТтбЕ Уві! АБх АїВ ке 15 110 ро Бах ав вне 116 рпе рЕз Рез ше Ве сі: 5із Бебо Бу ех біу
І їі їй
Те оАїа бех Укі уві був зей бео Азп о Аза Ре Тух Вс Ак ри Аїа ї5о 135 жо хів . поши и нн І и
ГПув о уаї бів тїхроБулоМаї йзю дей іа Пес пе ех сі АвпоБекх іп 145 150 15 МО сів шек ча) ТтТпх біз сів зво ба Був Авнр о важ БЕ ТУЮ ШОЖ ГБшш БЕЖ 15 іо 5 бШех Тпх Бпво тах їжа бек буд о Аїа Авротує піц бу Вів був ува тує 189 18 5 діа був Тв Уві Твж віз бій бі» Пе бек Зет Рко Уві тп о Ббув БВ 195. еп 9
Ре Ав Дт ЗіЖж бів Сув «шо яв «-1ї15 813 сиїйз» вт «ЕІ х Штучна «як» «дз» перкий павцюв й ЯМБОЕ-АКО-аз СеОовБМАЮ їабі З даАлАемутац ями он : ня орерідалид дну тв ї В3295 дБА -мутацуядми (УЕсЕавчс МВ)
«пох Я ваг Тух УВА Гїеєш Твт ОІВ РКО ко бЗеж уві Зах Маї АТївовко с1у суп ї 5 19 ї5
ТтВЕ дів дз її ТБ Сук сіу сім АБО дет 05е пу Бек оцув ЗеЕ Мак й 2 за нов обгро тую щі сій мув Бко Бу іп діа бко Уаї Бей Уді Уві Ттух в) за 45
Атройзв о Зек Ар Ага Бо ех 4АУ бі Бо СТІ до ре бек Сб)Уу Ве 5о 55 5 й секунд Зоря ет чу я Ох по є - ж у діе п ме кН т, "7 х йвпобеє пу Авп о тТик дів фас іа. Так їз Зак АкФ Уві б лля Аа хау о 5 в
Тра, я Вл лав фу ує ях, іх пт до хе баку ее щі щу Ід
АвроЗіє Аіа Ав Тух ТУК Су біп Уя1ї Ткр обро Бех Беж Бех Ар Біз ва за 3 где їк- швея око с у де жокж Зі пп щока киш шани сх -
Тв о Хаї вра пі спі сіу Та був Ше тпж Заї цес Зежх Беж Ата Бех лох пре 1по 305 119
Тк йпУуз січ Еко взає Уві Рпє Ехо Мей йБка то йех бек дув пе же 115 150 т28
Я о: дин и и п Че НН ст пн у ан НЯ Фк с: ее зу для їек бі БУ тах лів Аза Ге бі Суз Мем Ма1ї буз пер Туш рве рхо о 145 40 21 т і З во ще те Ван «и ух я лад й хм са те ї і В чі вкОо Маї Тих ТВі бек Тв) Ай йдех піу Аха Ом таж пеї сьУу ді 145 189 пе ї85
Ків Та РБе вхо Ата УдК о Ппей біб век о бет біу ей тух Щех йеу бек я рих ЗЕ 165 17 175 х іа ее іо те Фк ща й є "ой ге пз ж поля м А Бк я, т. «вт Маії Уаї тТВх о баї ко бет йВех Шев бея 51 ТЕ 51 ТлюЕ ТУук тв їяо 145 і559
Сув ап Уві Аз Ніб5 Був Ехо» Яет йо ТВйк Був Уві йво був Був Ул тях о 25 біб Рко Буш о йерв Сув речия «А «10з 25 «їз «ПО чеїійж БТ «213 ЩеУучна чеше «ва» Важкий лавцюг 1 «тво к-АМОо-2з СЕ аМАБ гЧЧпа з ААд-мутаціями їі з БвБЕЕ-мутацінми «10» 28 біб ха) біз без уа1ї біз їех бі Бі біу бевоУах бій Рхо сті піу 1 ї 15 І
Зах без Аг Пец беє Су Аія віза бек о бтіу Тук Авроббе ТвВк о НіІЗ тТук жо 25 їй біт Мер АЛЕ: Тр оУві Аа сві Віз о вгоа Бі Був Сі бев їв Тур Уяї де я к ах о о піу тжр ї1е Аза ТтВж Тукю ТпЖ о 5іУ Бій рев ота Тут Аїа вів АВО впе ща Ба Б ув вка йхяЯа Ве ТВПх ББе бек о бео йвр Ту Бех рбуз Бех ТЕ Аїа тує 55 та Ту ча раз бів Меб др; обех рей Ака лів січ Ар тах Алла Уаї ТУуг ТУЮ Су ча ЗЕ вів Бу Тухк Ро Тук Туж Тук Б1у ТлЛЕ Бак Нів ТЕр тує РБе Авшо уві ї00 тп о їтв Бі сп шоу ТВ ГПез Маї ТВ Маї 5Зек Зеатодівз ех ТНх ГУБ БУ то іи5 хо Бек уаї Бе Вко Гяез Аза вБсо бук Бес Ар ес Тк Бех піц беж ти 1.5 КВИЧН і54 иа 149 тик ойіа АТа мем бі був пва ві Був дар тую ВБвВе ржо Ти Бк Уаї їв 150 Ту ї69 так Маї Вет Тжхр о дзм бек «і Аїв йцец ТАх Чех Шіу Уаії Нів Ти» РЕ тк те СЕ 155 го ОКО і; ке Нм КТ ж що к пром 1 С пок боях ці й НІ Ь с С жур тих Кк т
Бго Ата Ууаї рев біл о ЗеК о бе сі зе ТУ хек сви бе Бех щі Уві
ІВ 15 159 ід. сдтмх ду з ТА оду мя дочеї вехх Кк з ту «свої --кео плюс я г дошоуу 37 тих Уві ко ех бву Бек о бейб біу ТВж Був Так тУук ТПІт був Ав» Уві я в пт дк
Тк ав 205 сек. Мао Та Вл век с тру а ни ША доші г ік й КК
АдроВів будо вкго бек АвпотТвЕ Без Уві Аве ГУБ Аєу Узі біс Зек був
А з г ра гі5 КВ! ге т. гі га с е тс ер ті Сл тьия луг рю, р сту 2 ї туу ля хх з. «13 їх тут Б1Уу хо Бо Сув Бо ге сбуз Бко Аді ко бів Бпе бій БУ 515 жен: КЗ 235 ЗИ гже бек чаї РБе Пец; рив Ро Бо вуз ВТО Був дво ТВвХ їм: Меї А1та
Даля 25 ДОЮ дсї уч Тв Вжо ЩщіЗ Маї Тпе Сув Узі Маз1і Маі Ввр Уві бек обі 53 за ти рРЛеКИ -о о я г
Ав Бто спіл ві Ма вве Авя ТЕО ТуУукК Узі ДАво бі Узі бій мні нів тулиц талу За
ТЕ ав 5
АзподАіа гув ТВвкК о був Сбко Аа біз МО зп Бпз Ази Хех ТАх Тук лев ук есть 2 гу запо "аї ві дек Уаї Баїт Твг о Маі пев Аза бів Вес ТЕрогжем Ава о Зі У Буд 305 31 315 за
Зіч тук уз СУБ БУ ді ек Аз ув пу Ге БО ЗевЕ о шекК їде Бін зи 33 ї35
Ппуз тиж тів Бех пух вів Ппуз 51 ба же Аха біч Бк Зіз Маї Ух зах 45 о
Тк еф ВЕЮ Рус Бек біб бі бій Меїх Тв Бе дав обої Уві беж Ме 355 зву З5З с - о Якшо я зу ХЛ тот вишок хх рю ди дух --о кое ЛЬ я Фіви вет Сув Аа Уві СПув пам ВКаеа тТук бко бех яз 1165 Азії Маї сій тЕе ат за зва сь Бех дво блу біпобксо біз Ап о АБа уж ре ТАх ТВ те Ро Уді зах За 85 105 пев Аврошех Азо і дек сце Ре Ге; Хві бет АФ Сем твхоУві Авр 405 415 55
Пув ЕЕ Ака Тир о бій обі йПіу Ав! Уві рве Шек був бек Уві Меж нія ся де 3350 с-м Віа Бей Нів зп о Ар БУК Та Зіп оПуз шШеб меш озежшж Мам ожекє ей 435 44. 45 сСіу Буд 459 210» 3 «й» ї5О «війМ вит шт прі «шій ШеУчна «ваш «223 Важкий лавцюю о 0 хУЕСр-АМЕ-2» СковиМАВ тЗоЯ з ААй-мутхмнми ї - жо спот соту Б ляв жі ї з БЕББЕ-ШУуТа КВ ЕНМИ т служ «800» 39 й ета зд в Р лі Б ча е мив пре Ге Аа ства Маі біп оЗез Уві бів бек бшіу Аїз віч Уаї пуз Буз Бко БІ Аїа 1 5 19 15 бука т Н - кет, Фр тд рок ? щ хід ОТ тх ние у чи в нн они Я
Бек Чаї дув Уаі йБеї сСтв ПУув вів ви Бі Тух ТЕХ рве Ти біб Ту м) -5 Кв)
Тукх Мет піз Тир Чаї Акш о біп йіа сбео бі біб бі Грей сій Тв о мМеб
Зо 40. а оон ше нн шк вч У «Хр ле Толя І Моно то пах я щ те тлу 3
ТУ Тех Ті Авп Бо Ази Бек бі ЗіУу ТЕ Ава тТУук Атя бів був о Рле
Б во піп біт дх3 Уаї ТЕЖ о МебЄ Тпк Аку АвротТвВкЕ Бек Т1е дех ТВ одів Лу
То 75 по
Мек бів їв3и бек о Акб Бей йкЯ бах яр о Авзв о Тве вів Узі Ту тм спУє в Зо 25 8 1-х КЕ о щу МД ок пт с Малих ж ТУ їх ах ве» ся ЩІ 2 рен тк пи джни:
Аів АК пек Бе Ажух вк о КУх ТУук ТОЖ Азрошжей бпех бу Тух Ту тих
ЕКО їх 116
Шанси Й З з що Жовті СК ду т до п нач под ин нн АН шо
Рто сі Аза пе Ар ої1і8в о Ткросіу бів бі Твх Мес Уві тк Уві Бех 115 я. 125 бах дів бБет чаї Аія дів кхо двх Уві вве її вде орко РКО ет Авр
Зо 135 150 під пій ей пух бек о 01у Лвк дів Зако ооа1ї Уві Сух ем бе йзб дав 145 159 їз То го руку шу учи т хо ее ша не о НН НЯ шо йоду ДОР ово стлх це тує Вго вже бі Ара Гув МаЗ пал ТЕроїбув Уа Ар о АвЕвВ Аїд овБем ї25 їй 175 я Сядь Ч жк можх Спас Ек Ба Сбдюян х. Ну а З 4 а и уих ер НК и А НН,
Зм зек йпіу дз пек бій ошійя пет УВІ тах пі бій Авро беж БУ йо зад сш - 185 185 155 ач ур ТО «од и ра - «в; яку ту ше ЇХ ная 7 шу то От ті іх вк тТпЕ Тк пет пе бех бек ТВ бе) Тато бео» обах пу Аїчїа Авор ТУ 19з5 я 05
Є и пух чт те тп ве шия то ІЗ щи ра вн шк : ке ча пух Ків Гуз чаї ТУ Атїа Су дій Уаї Те йа бСіп бі Шецооех гр: шк сю 21 ІЗ ОК но 2 маше нях - гг гу ть. то шо Ж дов о хну АННИ ех 3 Шкло ік На це розчи -ВЕ БЕ Хв. ТаЕ о йух Бех рпеа Ав о АвУ зІУу біб бу РЕЄ Сто бУуВвоОБКоО тяг пе туї ой дев Мав! а канав)
Сун тв си ща Бк 153: ще о хро дя Хати Зйджує їжа не їж
Вкз був о Бк Ат Во сліз Ба бій п1у бі срко Шах Уаї Бе ам пе ва пкт де ко о БВ
Шу Те ті ту што Ту шк еко те водія ко довуг прово бнлу (ст щі хо» РКО МПув Рхо Му Авр ТП Тем Меї Аїа озЗек ко ТВ Ро бій вх прик прик, зуейня ке У КО
Пере о тк З АЛ й Дози та бум у кл ку ту т удень МИ пЕ СУ А і Узт Уві мпжрохУа ж жаФк па ОО Да р'єека си малу їй не рт -вх З ші їЕ ще 285 поши ех яка ше ся жк па. з я Тв вк т -5, кути СТЕ, Ток фу до ТЕ Тук ві дво слу Ущі 5Іб Уві Ні Ай АтаА Був Тек був БО а 295 запо йка 5із Бій біз РНа авв о шек ТАК о тУуг Ака чаї Чаї Зак Уві без Тв
ЗО али ЗЕ ве) її тоди СТ лиха тн Гог ул. ода Клод тет Фі ук се нинь ши у ШИШАЯНІ
Уаї Мтз Аза охо Азротсро гео Авт о бСіу пух 10 Тук бух Сув Був Уві
За 330 3535 « Я я това «735 дух Іхде ил. бою що сет ше ТИ очі пен у ши бБЗеб дат був ПІ пев оржоа Єву дек їі 5315 Бу ТВ о бфе бек Мув віз зай А зо т з ще ух пу 7.х Шум БУй жов чик ДЕ я Мн Еко Ге їтв БУ бів Ркб Аа бі БЕ бїівя У Тує ТЕ о беб вка Ртс Сувовіть 355 зей за5
Сл Я Еш тА же Жоокикю з вк по й я т я шт Ек І: 1 в ие січ біФ Же Твк о Був Ази Бій аї БВ Їїеш ТЕО оСув ви Маї Мувосіу я 375 380
Уа талих ШК ох х пк ї ви й Боже Уют дев Соуизр М ану хх а Ж вБие тує Рко Бек Ази» о бзіе Аза Уаї бів Тв осі бек Ав сту Бівовко ие д За да коре зав за 395 ай
Із вап ой ТУ бух ТП тп Бгто Ро Уві пз йджо Беї Авробіу Бех 40У 412 415 вра вва ГПемйп ТтТук пек Акйш Сей ТтвЕ Заї вро обув Бек ка ТЕО озіМйМ о шахо
Но щи а3о ях сон - ака ЗА ; У шт х В зош - т от ие пл сту дж Уа) пе яву Сув Бех Уаї Ме Бі сти діва Бей нів АБ Ага 135 ва ах яте сан, рос гам к. . м Го Кл юту ї що КА й пк вк гУуг ТЕ Бій був Бех пе Бек без бек о цеу ЗІ БУВ ау «55 35 ян
Жим З али ШК то «21їз 9814 «рій» рЕТ ч«шїй» Штучна ке у «ра» Паркий ланиюй 1 суУвКЕ-АКс-І СтевВМАВ Тап4 з АВА-мМУузаціяМи ії з ері - мутаціями «пз 31 - п о вна чини ча чн чаш ще ки мч ХЕ ,
Авв тів Пій Їво Тбх бів дес Бсо бек Бех Бсо бек Міа Бех Май біу - АС . я 1 З 15 15
Їх М ки і-ї прищ - 3 Фу ду ет у ще СКЗ до я фу ких Туя
Ав оАжКо Уаї ТИК ті ТЕЖ СУ Бек о Аза щел БІЙ двротіє зе вва тТУх є се з 2 ШУ за т. ук З Ух Хо Жедхик Ем з й у ше ут ее я і-ї Тс З їв) бе ТтроТук Іі ій пев Во Бі був Ага бо був Уаї Бен Т3зае є к ах їх КО 55
Ту пе ТИЖ бак Бех ши Кіл бек 5іу Маі Бхо сеєбє дхя Ба дек піу
БЕ) 5 во
Зек піу Бек піУу Тв Аве обБе Те бер; тик о ї4е бек бек їм СЛ ко ех т Ех щі чі АврорРКе діа ТвЕ ТЕ Бух Шуз Бій бів тує аж Ти»квк о Уві рЕб Тв
М За 35 пуре рів ші в Беру НАВС Зв З от саї дія дія
Тпв вве цію бів БІГУ Тв о Був Чаї бів їі Гуз Ат Твт о Уді Аїв А1в іа Та 110 тТко Бех Маї Ре Тїе Рупе Бко Ро зек йвробіз бів Без Був цею ціу 115 ї2о 125 те Ака бек Уві Узі Сув Мей бе) бий даз Бе їук хо вка шов Ай 139 135 140 зу Уаі піт ТЕроЗуз Мала дер Ав о Аіа бев 53 Бек бу вва содек па 145 ї5 ТУ 1650 сіб зве Маї тТьгобЗіч біб Аво чЗеж Був вве о деж ТВ тує беЄє бен овех 165 УТо 175
Зехкх ТВ о бва тТвВке о Ббей о беї Був втіа ве» тує П1Я ув Нів Був Уаї ТУХ 180 ї85 ї8а
Аїв о пуУув біз УвЕ ТЕХ Нів сів б1Уу Себ Мас бех БЕ тах ТЕ Був вет 955 аи го
Бав Авт вх 5іУ бів Су ва «ва» 32 2 дух
ДІВИ» р «ет РЕ ч13» ШшеУучнЯ. ча «ша» пеквИий панцює й сур АМО-йз СуЗзаМмАю ТФб83 8 ААА-мутачінми її в ' Бе Е-ДшУТтаМцІлюСЕ «По» 37 пн Тк її ля м УЗ З и Ку - -о хв бік а СН -б жі ке
Ве тую Уді МЗен Твх Бій Ро Бо Бежт Уаіїі бек Уві Аїа Ро бі Сів 1 5 то ї5
ТУ дав вжи Ті Тпе ЄСУув піу сі Ав дату Ме бію век Пуз ек У ря; «лох ек о 25 зе щі пн Церю их пом Тука ді пейжу т жу й д туз хр ахоя 1 м спяу
ПУ ТЕС ТУ їв Із Пух Ежо бу віч В іа хо Мах їла Ук ді У 35 Ай 45 йош Дах с йо печі Кк у пе ен Зичу Мт Да не зх. за ср лавр о Азв бек Авр Ага Бко Бек о біуУу ї16 БЕо біц Агу Бе Бек зіу бе: 8 5О і : я Же, ТЛ ух Її: ре ру же т У ще. 1 Сея Є з т са Тк У хх дах пех піУу двзотвк ів Таж опей ТВ Тіє Бек Ака Уві сів Та БУ поп -кх ту її 63 ко 5 що
Мен ї у Тра Ті хв сих их з т ких з я ж рег ге -а щ дво ніє йів йо туї Тух пу бБія Уві Тк; Авр Бех беж Бак Авр о нія в зо ЗВ їхв о бвї ЕнНе ЗТу сіу Бу Твх Був Ме) Тв Уаї Бе бвх бву Аів Бек той їі та
Таж о йпув сту Вже Веб о ма1ї вве Рко їі Аїв Реє був Бех вк Вас тис 1ї5 158 ж:
Звт БІЗз бер ТвЖ о АТа діа Без о бію бує ви УЗ Був ДБЮ ТУук Бпв ро
138 115 Тай 4 Е - яю й семя СВ тя з к кошті чн є 4 гео ди іч ко чаї Те Уаї Зек тир Авт Бек піу Авіа Девз ХБк деко бік кА 145 1552 у уко
ЧівБ їж Ре Бро віз Ууаї бБви бів Же бек бу Без тує бек іще ВВ 179 ІТ
Ф. Как т -х св цем й а му пт их сухо со и ШИ Е.
Чек Зах Уві тТвх Уві Рез Бех ех ех Пев біу ТЕ був ТЕ тує ТЕ з їх не тат і5а 85 ЗО
А х я с . «7 - т же ЩЕ Тех ян Ач
Су дей Уні Ввр о Нв Буг рхо беж Аз о тп Був оуУаї двр Пух Ак Уві 135 299 205 сід аю був Тухк сіє її «А. «аїйз 33 «15 453 сві» КВТ «ду» Штучні «йр3» ВБажеий чанцюкюк ої «УВСЕ-АМс-яо ОАнсваю 05 з ДаА-мутаціями «00 33 зі УА сій БехлоМаї сів ВеБг осі йпіу 01У Мвз Мві бів вто ші бе 1 5 я 18 вай Бей вра їм Беж СУБ Віа Аїа Бек зіу Тух дно РБе тТвЕ Ні Тус
КЗ: 25 Зо
Зі Мек Авип ото Уві ака біп Аза» Бк біу був Зі пев ЗІЗ Тер Уві
ЖЕ ЕН 5 да г тт а х А вищ сн хг по - з що Ван Ж куєх сі Тхрої1ї8 АБа ТвВІ Туш Тих бу біб о Бко ТВе ТУК Аза А1т1а вро ве 5 55 іхно;
т з тів ФІ лю чия 7 -еооо Ж Донні я Чохкх Ж тя А тав
Куз Агу Аус рве пк о Бпє бек о сео Авр оТвпг обер буз Бех Тато вАіа Тук в за 75 щИ
Гощі поки Кг с чн х коше ео Н е НН Н Гі же я
Без сть Мет Ада бек сей оАкУ Аів 5 Ав ТВ о Діа ча) Ту ТМ Суз яв З з5
Мовою тофу з. у» т пох су КЕ Горох 0 буку А еко тя бля Ту кю лох ти
Аді Був тує вкОо тек Тук Тук БіуУу ЖкКк дек Ні Тв тТук пе одяю Уві яти є я оо 125 о 7 ет ж ви ще х . 1 ,. я х дя Оле С яні ста ще В я сви С То - ч
Тктр бі Біл 015 Упр обев Уві ТБж Уаї бак о 5етх Аіава 5ев Тає бук СТУ я ра - ії 1й5 ж Зк. ви 1 сне порі А у т Софа ес Жожує дю т ле ож ше о М хз ВекочМа3 Ббе Бо мезо йіа вко бек Бек Бук ех ТВЗЕобев Бу бМіу 130 Що 142 тає діз дів Ппем бі Шев Моз; УВІ ПуБ авре ТУук Ве БЕЖ буд БКОо тд а ї15О0 ї55 155 хи АТ ен тіж ї; щ- и оку її я тях рве сок м Я т- ціх сен Ое нь же тпж ові БЕК ТЕО Авпосаек о зі дія Пвиа ТВ о ше 5іУу Уяї Я тах Ре як св че 165 170 155 пишне: ие Шк Ди Ше я ост дус жк ; Чім ще жовт и Фк щі хз
Ехо Аів о Уаї бе сій Зек бек піу Пез Тук бе Бей бек беж Уві Уві 155 АВ і85о оре Ше «о око то п кю А Яку Фа Тож досту шо
Так оМві Вже Хех Бек Бек інша бі ТВжоЗів ТВ тує ів о був Ав Уді за 225 От
Мк ха се ке спро ато не «яв ж ек х шк 5 ру. Кузь Е - йаволів був Рхуо Зетг Аво ТБт Бббв о чаї Авквобув цув Уаї сіб Ро Кух сх рек тую
А 15 Ки ня
Фу ї- сх Ж тих оди, 54 Пе гоже Сех де га жи га - тет 1 т ж ше сСув дво; пу ТЕ нів Твк о Сув ко рго був кб вів Буре сід дей шк 3 235 гай
Жоціх її ЗСЖ т. ск Жду. с то За жи» деки Ток р То до ср пев обі ПУ Бко ех Уа Ве без Ре Бге Бко руш рРхо Му ово ТА
АХ 5 а
Бей Маї дід бек Акз Так о Ргос бі Уа1ї ТЕ Суд Уаіїі Ув)| Заї двроУві тва 25 ат дес нНіаз бій Азов орре бів Уві 3 пса дай о тТкО Ту Мі Азвр спі чвІ
Я ве пак щів Хай нія дей діа Гуз ТНК о Був ркОо Акт сів 515 бі тую йви пет 75 За зх БІ
Тит тує Ат Уві Узі век Уа3ї це їпж о Мві без Аг сій Авро тво пе зп» Ів І зе два пі Бук БІ Тужю пу се іМув Уві дес дп о Був Аба Мей Еко Аїа пр зт ки
Іо 30 Зав
Вже Бі бів Пух Твк о ліє йеж Вуз Аїз Був БЕУ бі» Рус га мів Во
ЗАЙ У З5й зіп Уві Сух ТВк оПеч ВКО бкоОо Бек Аку АЮ біз Беб оті цу Авпобій
ЗО зав - я Себе Боужх но бю т, тт х а х то «хи ож Ту ра чуаї Бех цез бек СбУюш йАТа Уві був 5 Ве ТУук га бе Вар о їла Ага
Зо 5 зво
Уа від тТЕрв біс бах дапобпіУу Бія вк біб Ав Авпотек був Ту ТЕ тр жк ах я т
За5 За 35 15о вхо Вк маї зе) вар дви дви піу Зех Бе рай Бе Уві Чет опув бе 05 418 415
Тнк чаї Дер осув бЗех Акт ТкЕробів біб біу дво я) Бе бет Суз ВБЕ 80 а 3 ув Мес Баів осі Аів бев Бів о Ава АТа тТУК о їпйрозій Був Зеб Бебозак ле т чі а йо ах вав бек Рхо щ5І1іУ Був 459 «2105 3 «ак ша «ій» вв «213 Перу сна я «їй Важхий панцюг й «УКСЕ-АМа-й» ОАзсЕавВ їабі з АдДАсмутвнівмии «по» 34 зо «тяжче сл 1, Тож ту я МІ сних Км іно х ик ї 3 ток. Тк ь поши у й км чек тує Увх Бей Тс біп ро со Бе Уаї щакК ув Ада рю ЗіУу шій. « з г 1 5 хо їх тТвЕ ві Аа гїе ТЕ о Сув бБіу СіУу Ав Ав тів біу йех Буд мех Удії а 28 Зо їла т пт сн ей і сакт З -рожт х 1 шо НЕ ЕНН ди тка пу
Нізо'їбко бує бів біб бю око зіУу бо о Аі Во Уві мем ті Уях Тух
БВ! 45
Дар о двробех Аво бе Бкоз дат Ту т1е Бус пі) йко Ре дет спіу пек зо Зо 5 4 о прі жор ту Од сф тоді тло но дя со хуя що кв жк,
Аво Зак бі дела їж дія тиж Бецд тв їі бе АхУ Уві бів лів ху 83 7 а що
Аж віз Аїв взов тТУух Тух Спув Зіп ді ТхроАвродпекх бек Бокх дво пів ще зи 5 тке о маі пе бБіу сіє сі ТвВт пу Пес тв Ух пем піуУ біг Все Був по иа З т
МОЮ їх ще
ЛЬ ОО, х - пах Беше ле БВ ло, в Ух дк, «дол жи ФЛоок С ЩУуХ о Ж тату
Аза пів ко пек ма тнЕ беБб ЗБе БЕЗ БО веж шеж Зам обБім фемл бли
175 їй 1955 ї х т т вою Ті вне . тещі т НИ пк СУ, 0 СТ ж ях удятх з
Аіїз бен пуф Аза Так Пе Уайї був Мен бів бек йвВю ве тТух БЕжоа ху їі55 ТЗ ї4о ше рх тм сх т х пи в ни щен Фо бом Тоня -з ток то ма ж
Аів Мві ТЕ УВІ Аза ТВ БУ пів Авр беж Зву Ето Уві цу Аїва щі 145 155 В 5 на тон ту г р-х «що чину ся жк зо з Пошек г їні Я Зав Вк 7 -
ТтаАї біз тТвх о тваЕ Тв око Бек був піп бек Ану Авпо був ТУє Мта дів 185 195 РТ ска їх - їх Хома тую пвх а га но В мух, збою Я А ау ду пек о бех Тук Мем дек Ге) Тв Бко Біо бій Твору пек йхЗ8 дка бек 189 185 155
Нр щу с - Му реко дови дов их с яні яд Р. м ШИНИ сов ха дю ск ук беж Сув 5 Уві Хвж о НЕв їм біу бек Тк Мві ст Бу Тлк Уді
ЗЕ а 2О5 ж с жнту є а и НО їх Я ук я осами не І рю сл: ля 33 сх 2. МОЄ дів ББО ТтвЖж щі Сов деку БЗіу бу піаУ ВЕК сл ау БІУу віУ век : Я жо Асу В Ь - зх ВУ ів 5 Же тра МІХ наш ох ба як її як бе 13, 211 хх Лк ил ко піу БУ піу пі Зв бі ДУ о1у сіу бех БіУ сіу біУ зіу сек 51у пе гул де зле шо 230 Кк 35 ай и з ак у а ВЕ НАНУ п НЕАН КІ Топ Я Й 7 ша ЕТ хо Те га сту пі Зіу Бек піжш Бі біб Уві Бій Бал чаї біз Бех бу Аг бай и «5 2шВ к- т. ї т 7 сх нн кл тоди Ки - шо сума Ж ок ОК оди ис
ЧвВі Був руш ко Сі Азїа беж Уві Був Уві век Су Був Ав бек о Ззіу лей дах то
Ту Твх рРне Тс о бІіУ тек тТУукє Меї нев Ткр»роМаї Акту біп вів Блео ЗіУ
Кв ва З - т 1. щ-е Й з гу 1. ат ния Ах Пат т Ге жк - сіо бі це; 0100 Тео» Меб СТу Тер Т125 Аза осо Авп Бех бтіу єду тах 255 зоб
ТЛ огдовя Стук Ж ря поь ча ТУ полою й коти 17 У січлих Ж Чех А. ж тих зва ТУух АЗіа бій Буз Ве біп піу джа Уа) Тс Меє Тих АхЯ АвроТиє зЗа5 зі 315 го
Шеє Ті Бек ТЕ АТа Тухк Ме піз ЇГец бер Ага бем Ар бебсв Ар о Авр з 335
Тпк Аза Маї Тук Тут сСув АТїа Аг Хек рко АвповкОо Ту Тух Тук Ар зо 545 ВО
БВевж йак обі теє ТУук ТУую хе бі» зів Ре о АвВо Їїле Трю сту БТ БТ 355 зво за5 в - и -о од Ек - З МЕ бе Жот ул з дя ач хи А
Теж о Мес уУі Тк Уа! беж бет Аїа Бек ТБК Був сіу ко бех Маїі Ре
ЗО 375 но т же ол не пря рук еще суще з кю пе - ря дя Св с ш о Я вхо меч діа Вжо Зек бег Буш бек Тих дев озку б53Уу ТпкК а с Аха цей пиУ Сув Беш Уві пуб дав БУК Бе гро зі ехо Хваі ТВЖ Уві Беж ТКр за 210 15
Жов пе зв та ГА Ло ті и їх. є ад У еж Ор те кое фжмит ме і-ї вас
Авип пах з1У Аза Бей Бв»с бек п1у Мві Нів ТВ Бра Бе Ага Заї Гей ; що шк 122 Я 450 ів бек ошеєсє Біу бе Тут Бек Вес зву Бек Чаї Уді Тйх таї ржо ше щл5 С: 445 сяк мує я сих Я - су лютує поши не к ши я: пр ша зе ве пеж Бек мем ці Так осі Тчк Ту 15 Су дв Уві вва НЕ Пуш Во
ТЗ 155 «ва ке Ава тТнж був Узі дв; о Був Бу Майї біш БкОо БПУує ЗБежЖ оту Ер Був 465 70 АЛ Є тих нів тах Сув Вхо Бко сСув бко Аіва бо Бім пеп о Їїву сі біу Во 435 4 55 бек УВІ В їні Бпе Ба БО Був о БЕо бук ДзротТтик ве Меї Акта чек
БЛОК 5а5 56
Ако Тих Вк сви Уді Тк оСуз Маі таї Маїі зв УА Бех Нів іч Ав 2 ; є 315 пас вай я сел и тяг ще Воєюжх с - Подача я пкодячня М дж тд св гоНЯ 7 -
Бо біл Уві пу Бне Аню ТкроїУук Маї АвробБіУ Чаї б1: Ма1! Кз Ав
Я ІЙ пао
М В оч оса З - ду пох х 13 кт ійплочя сш - т ш пу Тброжхр тал
Аза пув ТЕЖ о Мух БтО ау Бі» віч БІБ Те Ава БОож ТВ тУкК Акт Ма
ЗА ВО 55 зай їі Бек Уві Гез ТВжІ Маї Бей віа бра АввотТїтв Бела йяв ші БУВ зи
За Зо. 715 поет спини Ж кет х зе Ич г стоку хе й и СНИ пул т тя З КЕ М тую Буж ув пу Уаї йек вАзп Був Дів Пен Руб Лід Бкоа Тіє Зв оБух вно Бере) 58о гію Ол нене шу нн ни жу і юку ях ті Ха т- у щї ср рук тик їїе Зк був Аів Пув о б5іУ іп Бко АгЗ5 Зі ро біп Уві Ту ТБх
БУ поо Б
Кей вВгша Бге був Ажа Аве осі Бей ТЇВпЕ був Ав Біп УМ Бек Ббем тер 6 65 БИВ й, іщрота р -- щі К нон тих Сітах ц; Олю Й с 1 дини м ЩЕ джу ча пув це Уві Буз Сіу Рпе Ту БкО 5еїг Аво її діз чаї бі Тгр ві
БЕ 635 і ща ж Я дя гої їхає пев й гла скуті ле талу А КУ Й дек оАят сбіуУу сів Бк буБ дж Ані Туд очвБ ТАК Тих Вкеа ко Уві Мем о Кв! а5О зв обек Аяр бі ек вне рве Бей Тує дек Пує зей ТЕ Хаї др о ГУБ
БИ вай аа и до, т очи АЛЬ і кл пия ре Га бот З уки Ж Міуї Є БЖ
Зв Аа Тко біт зі з1У дзи Уві ре бек бух бек Уві Меб Нів щі
БЖ ВИ ЕВ аза дес нів Ав дій Тук ТеьжЕ обі Гу ще збебв Явс дви ет вКО опіУ
Зо 535 тай
Туз то5 «тій» 35 211 214 «их РА шити з те ау «ії штучна «Ех ле вити вче те зо ежю на НО т ху Ток ое п дом Хоч ке Ки сх ся я «ее ЛерЕнИй панвшг 1 «УБаЕ-АМа-не ОдАвсБар Ті з ААА-мутаці ями «ап 55 дев Іі сій ї-вм о ТтькК пу бех бо бах ек цей вес Мі Бех Маї ці 1 У ІЗ 15
Азв о Акч Уаї ТЕ Тіз тис оСув бее Лія Зех бій Авю Їїя беї два оТтуг бр Зх ше рек 2 У
Гоа тя ко Вч Не ана ШК Ка лож кро, Лов Ж ск ря ще годе тя оче лет їжи вва тр отТую ЗіБ бів Муз РЕ біУ Був ВМїйа Рхе Був Уві Пеп їТе 35 о 5
Тук Ре Тис бек бек Пемй Яів бекКкозіу «і Ро бек дк Кпе бак біу 5о 55 Би беж бі беж БУ ТЕЖ вар БвВе Так Пейп Тс ї1їе беж бЧех Без бій БЕо 7 75 о и Ту сл ГУ св: ОС я У КУН че оче їх ою ї а се й, 1, ДАЧУ ТИ же их
Сіз йвр Бе Ака ТЕ Ту Тук Су бів с5ів Тук щеї ТНт о Уаї вхо Тер хх, г Її 85 за з ту шк . т кі ко тк я боях ох З од Фе т омизк Ло фу ко лет л/т З Ї
Трж о ВНе біу зі йплу ТБх Був УВІ бі Ії Був вка Тївх Чаї Ава Ата пз: їа5 119 ко беж уві БНе ї1іе Рпе Рго ко Бек Аз біс бій Їїва Був Беж БУ 115 Мио їх
Тих Ата бшт о Хаі Мн3і Су цем ойеч Ап Ан Ве ТУЮ Бко Ага сій вів 1535 35 148
Вуз Уаї сій тер Був Уві Аве Вл Аіа Пе) сії бжеж сїУу Аво дак пів
МЕ тав тай біс бек Уаї Тк о Сув зіп Бер бех Пує двр Бак тах Тух БеЕ Пец сбею 155 ЕК 115
Бах Тк цем о ТтТВУ То беж Був Ада Авр оТук бів Пуя Ні Муз Маії Тут дів б І Маї Тв Ніщо біс і тех сив Ша лляне ді Фо їли Ши вав сн Ім ах де зв ОТ ку ем шаек зас ие мас бІК за сх 95 хо 205 фа КА р У ; ак їх я
Внае дзп ода БІУ ща Сук 2190 кій» аб «15 ях «спі» рат «та» УЧНІ ня «рий» Важкий лавндюв о 1 «УБСЕ-ВМС-уЗ Одеса ї504 з АдА-мутаціями їі в ЗЕПЦіЕ-мУутацінкн сасйпох 56 тал ха Утлов то я ла Кочан їз шоу т щ чн СІ я пси дош-т- к пін Уаї Біг цем Увь пі Бак бпьУу 0ІТУ БІіУу ії Уак бів вЕО бБіу ску 1 5 То ї5 век Без га Бей беж Суз Аза Аїя Зек о біу бук АЮ Бе Твх Біз тує а З 35 сі мекв Вал ТкоОо уаї дко зів віз Бк ші вуз бі без біо тер У« у в: Б «5 сту Тс бів дви Твх Тує ТПУ БІУ бів Кб Тйх Тук Азія Аів о Авр ба во 5я що
Гу Аке хо Бпе ТВ Бе бек Меч двроТвх Вех муз ває ТВ Айва Тує
БО 76 75 Во втикая тя кі Мк о йшов сто паз що тк ж ть то тако тая дея
Меч біс Меї Ав Звх Пеза вкУу Аза сів взр тиж Ада У) ТУує Жег бук пк За 5
Аза був Тук Ева Тук Ту Ту 5Ех тТвЕ беж нів Тхю о оток ввв о две о уУді 100 тах 110
ТЕр З1Уу ЗЬпобліУ ТНкЕ о Пец Узі Тк Уві бах бек Аіа бек Тпсг був о бІУ 115 122 УЖ ко ву Уаї Бе Бко Бей віз рхо був Бек Ак Бек Так обек Бі) дек 155 135 145
ТтвЕ ОАЯв Ав дви сім був Меч Ууаї Муз Авротук вве БО січ БК Уві 1 и дк зт по 159 ха5 159 тн Узі бет Тр Авпо о бег б1у Аїа ес ТВ бе сіу Уві ія Тпк вве 175 175 пвасАва Мак Темі бів ех Беж ббу Мей бук йех Печ беї бек уві уді їв 18583 5 тр де ря як нн жня се ма У У г Ух Бу «ка ЕЕ НН сиди У єв М тис Уві РЕ Зет веб Бек пе пьу Тл Був тах тУЖК ТЯХх СУБ Ави Уді ще за за їх 290 па
Аерв Ні Пух Бка бак дви ТвВУу був ові Аво о Гу вка ЗМа1ї бів шех Буд 21 І то спУуК сіу БкЕо Буш був РО Рко Суд Бо Кі Реб сіб Ре сів зу пу рн 230 вх во
Во щшеат УАЗ ке Бе) БВБе о Брое го Пмя Бо Бує вою Тих о пем Мас діа вах о і жа беж Аха Тпкорко біб Маї ТБЕ Сув узі уї Уах дво Уві Беж сьп бій во о
Адзвр вхо бів Ма1і бій о РКе АвпоТтТЕр обек там пав осі Уві сій Маї Нав ші 2 285 вАвпоАТа бує Тв Був Бко Ага бі піз Зів Бме дв бек Так Тує ду
Ка 25 ЗО
Уаї Ул век бак цей тик о Уак цей АТ сін Авр о тТтв без Авв оду бує зав ЗО 35 зо чиї уже й жу У ххх ої утлюжю Жов лозу ? ж СТ ля то я 2 в ТУ пух був Пуз там Ззек йвий Му бБрУ Цей бео Бек дес Г1е бів 325 330 за5
Був Тк Тіє чЧаеЕ ув Ав Бу СУ сіб БюЗ Акодоспім ба Бі Уж Сук
Зо 345 Зло
Тих Бас Во Бо Беж йіпй ЗіБ Оки Меї Таке мує двп обі Уві Беж пе ї58 ЕКЗ) зе пекеює о гу тро, з я ОТ х свв їу ек се же пт: дод ї то вт СеУув АтТа УВІ БУ о БІуУ Епе Тух вхо век вЕжВ Ті Аа Укі бій то ко 375 ЗВО сіб баг АвапобЗіУу піп ко зів Аза Авп о Туює цуз Тих Таж о бко Бко Уві 385 390 395 «оо
Ган дво пес о взр о б1іу бек Ре БВ пам Уві бех Ак бе ТБ Уаї Авр
155 315 15
Ба Бек о Акя ТкоОо віп Бів сі Ах Уві Ре бек Сб о Векоуаії Мет нів
КЕ да, їз ий заго о - я ше дк ч канон І ня нах З я т до тою зЗім Ака цей Пів Ава Аза Туюк Тв бів зУу5 Бех о Беб щеж гей беж цех ке ля кс 835 450 да піуУ жк 50 «вій» 7 «ік Та чай РК
Ли тр, пвх я сшЕвїх бузина як ж ж,
М
«23» Важкий данвннцют о й «ЧУКшШЕ-АМЕ-аУ ЗАвВстаю їщбЯ з ААд-мутаціями ї з ВЕС мутаціями «ад» 37 не - ку я с я ше с - «АХ Ек Гн МТ по
Ше ТУук Уві Пед Так біп о Бко Бо бек Узі Ббеї Чаї Аіїа Бо бі Я кея їх І - ї 5 19 х5 ї у, т ша йх Зх 2 ч якос зок : з се я
ТЕ Ліва АкЯч тів ТЕ був 51 пі Ай вай ї1іе 01 Бек вуз Беж Уа
КИ пл о у Зо
ГО пост за Жені В со ; що Тк ух то хз ху те
НшЕ Ту тую біг бін Був Кко о йіу бій Ата Бе Маї ви Заї Уалотух ко 8 за з т-ї хлоїх ще пт щ «5 буд, лав Ар обеє АвроАко БЕб йех йпім Зів рРео біб Агу Бпе Шех бу Ве я з, Е є з У тро ФК учиє Сини Мт У їх чт г. дчп ек осіу вва ТБЕ дІз ТБ Бе) ТИХ Тіз бех АкЗ Узі жів Ві оту кої тк шк ке та а во я - З з - пПеютє бле х ни ї- У уча їх ех йбяжею Єжова ла. ол
Ав Зі: Аза Ар о Тухє Тут Сув бів МХві Ттгр овйвзр дах Бекс бек дввочІз а 35
Ткв о Уві бе сі біт сіу Сх їув Мем» ТвкоУуві Пес сбіу ів ко Суз щи 15 1
Аза вів Рко чек Заі Так орец бе РЕ Рко беж Бах бїз бла кез шій 115 їла 125 діа Ав пув вій хпЕЖ Бех Маії Су Пе Ті бев Дер о впе Тує Бо ку ї32 135 150 аїа уві Жвр о УйІ АБа ТЕ Су Аіїа АБО Зеж ек рЕО УА БУВ Аза шу 155 ї15 155 160
Уві бі ТвЕ Тс тру Рко бек Був 510 дев Ав о Авц Був Тух Ага під
ТБ уто ї75
ІЗ ока зу ук Хе Фоми стаю пу па г. еко жи Со 15 г я я
Бекобет ТУЄ Без ойжж Пас: Таж ВКко піз бі Тхр був бах Нівз АхУ Бек 18 їв ї80 стук отв хз з пед ідо в ос год х ил сх х "жи ах Ал
Тухк Бех сСув шок Узі ТВЕ НІВ бі ц5іУ бетс Тьк ода) біш Пух ХП Уві 95 2 Ох ліф Еко Тв бів Су Бех біу віу Бі БіУу дек сіу пу біУу СТУ БУ о 215 аа порів піч г сх дівка отак р кро тля я тт Як туту дбав їх соту плу 019 21Уу церк З1у сті щі біу бек аіУ бі БУ біс бек щБіу тр перекия пок у па5 КеднВ! ах о кет ні шк г - тер ж ши А Ка: фо сті ши ту в офрю йяя
Бі біу шіу пек бі пі Сіп ді біп о пам Улью пом осех плу літа сла 285 шва ша
Уаї ув був ржш біу дїа Бек Уяї Зув чаї Бек Сук був йта векосшує пив шк щи жк Же вла
Тук ТБ рпе Тахо сі Тук Тук Меб Ніз Ткр о Уві Аху сій вів ко Сх 28 еВ Мк бій о сІуУу пе бін Ттр»р Має піу ТкбБ ї1в Ав» о Вухо Ап о деж о біу ШІіу Тих хай 595 запо ше тик че кож т поле ше ОК кох г ти т г о я се стю Ся
Ав; отТук йха зп ух Рпе біп бі Абта Заї ТБ МеЄ ТВвХ Аа Акро тах 305 за 35 80 веж Тіє Беж ТБЕ Аїв Ук Меб Бій Бей бек Ах Грец дк Зех Авр Аве тиж дів йЖвь бук тус Сув о вів Ака бек о РКО йзп о Бо теп тую Жук ад х є ПА Похж блаюжо Тр бе блю ді рве дос Фото бен В котла ї ;
Зек Бек б5БіУу їЇУт ТуУуюк Тух Бхо сіУу дід БлЗе дво Ті Ткропіу бйвфпобХу дж др ше
Зх ви зп5 «т ; Ки и тору г ї ще й що що току жк Школу ЖК З Їх в
ТЕ Мех Уві тв Чаї ек зЗек АТ о ЗеК ТВкЕ Мпув Ту Ехо дек Уаї ве алла 35 ЗО и туя че кат, джу ож и и НО дуди 0 шим. Кх зи ДОК Тієї вра па ДЕЙ БЕ СУує чЗвк АК Бах Так Беж бтч дес жк дів Аїяа пе
Зв зво 35 іс
БіуУ шШУВ їні Уві Су дн Тук Ре рко пай Бко Маї Тс Уві бЗех Тер 4835. СК я шк зе ру Ся І й ях бно не ок я Клен з як ж З ХК ше
Зап о шШех Плу Аза еп Тлс дек бі Ма1ї МЧів ТБ Ббео Ру Аіз Уві Бец
Са ее и в; З ав біп обвту Бех ПіУу ДдеЕМ ТУук БЕК ем дек Жек У8і таз Тис Хаї о бБОо бе 115 40 83 дет Вет ем Зі ТЕХ цуз тях тує тв Суз Адм уві Ввр Пов БУ о вее
Зеш Ак лЛаж був Уві дар Був Ахоа Уві Січ Бк Су ТУук йпау КО БЕ я кц іх Й й ЛЕ
ВЕ Аа 15 159
Су вхо Еко дух вк дій РКО ші ре сів щу П1у Еко Зек Уаї рБе
Мей бре БО бо Був вхо Був Ав тає бе Ме Ав бевеЕ АК Тве Ро зай за Зі
Зіш Уві Таж Сувобв1і Уві тав Азвоуді бах бів о біц сдает БКо бій Уа ві5 па 525 пл : е луг ту Падає лящ вх т» дк ана Ще з що усе ях хто т кум, по пік вне два ТЕв о ТУЄ Маї Авор сої Зв) сла Уві Кі дей біта Був ТНХх
БО вв зай
Бе Ко АК о шТв Бі о Зіпй Ба Авей бак о Ти ТК Ака Маї Уві пе Ук я зва ах Зає
ІТ Таж Ул Тед дів біп двБроТкрорей Ап ПОТу Ду бід Теж Був ув о вів
Був Уві Бет Авбйї Був Пііу це РЕ каї бет ч1їе сів Пув ТВЕЖ 115 бе
Зо ЗВ що тую ТО Фк їх ЕХ кн Жочн у. че ши СИН кул ка МИ Гек ж був дів цуж хі М озхАЙ По дк Сів го співу За т Ух ЇпЕЖ Сеи Бк ро
БО БО 5
Сув сс сі ЗЕ МЕС ТвЕ був Аво бів Уазо бек їм) Тсро Сун Бео Уві о З: вий т Оу ще бдіння бущею 0 ож ох : К ву ЗОН сх з: кт ді 1; пуз СТУ Бипе Тук Вже Бек Ав Ге А1з Уві бБів ТЕр обід Бек Ап оіу ви за 5 аа цЗіб Бка біс Ап дав Тух пу Твж тТнЕ БеЗ Бо Маї пей дав шеж Аво я 559 35 су шах Ре Ве Сем Тук Щек Ака пев) ТК У Ер Му Бат Акп їЮр 5ео п РК вів 51 З1Уу два Уві ва бек Сук бек оХаії Мес піз ШІ діа сво хв 67 БО вк
Уше То рювю Лю рт щ вт гоже и Фо ж «тю що ев тує
Авт Але Тук тих зів Мув беєс Гей Бек бецч бежє Бе БіУу був в 695 ре «Оз В «Е1їт 14 «212зЗ вит «Кіз Шеучна ситу ких шах Петский лачнпюг 1 «УКОКЗАКЕ-х бАвстаю ТС с АНА шутанійми ї - БРІВ мМутаті ями: «поп ле
Аввоїіе іє Пе ТпжЖ біз йеє Бкс бек бек рей 5ех дів йет Уві З19 1 5 її 15
Ззровху Уві ТВ ЇЇ ТЕ Суз бек Азія шек спів Аве гіе зе Аз оТую ад сю З о -5 о пай дви тер отус бів бів Му РЕв бі Муш біз бкеа зув уді Гей зів к х : 42 Щщ5
Тук о Рне Тро бех беж Ге віб5 беж бі Мах бко Звх дж вве дек оту й Б бо
Свт бі Бевт бім ТВ Ашро вне ТБ обеф ЖБК Г3Зе ояех бшж Сем бАю о гпих
У то 5 Зо я є є т й .. ти Ех. я соби М о іх у г нч
Пій Ар вве Азії Тк о ТУк ТУук Сув бів бів о Тукє бе їйкх Узі Ехо Тео
ТЯ 5 ав повно ху У ані у в Т ах т я вище мч Фон Ті ую що хт- кох
Тьб Бе Пі бій Бу Твх Пув Уві 515 ЇТТе Буд бе жк еї АТа Лів по 155 її
РЕко бах Маї Бе (12 кпе Бо реко Бех Ав; бів бів Бей зу пек бїх - ї лук -Е
І115 ї2и 125 пу ме з Ли ої З дж ї: яка Її ення вия хи ж ик ПА, т тах
Тпх Дін бех Уві Мві Сув без цей Ав Ай ББе Тук Вкго дДха сла ліз їз МУ То вУув Хв ось Тк о Мув УМ Аве ов: Алла ем оззіо ше пу АвпоБакє бів 150 155 їБИ я Фу лег т пота Я т Фе тур с пог спіл тях пояю Ко б пав» їехг Уві тик баз бій Аврошех пу Анри тих Тек Бех Бем бе пдв пов -Е 155 178 175 зЗек їБЕ Пем лиж Бей бах був Аза взо тут бій цу НКів пуд Уві тТух ід дк я де їв їй5 189
Вів Сув Біз Уві Тв ВіБ СсС1в пі Бей Бек дело Бі) Уві ТВх мує бек сек, бр пра
КВ о 2505
Бе Адй два сіу бі Су рез іо «ев10 09 «її» аа кЕзв? РЕТ «шо Штучна «их стук я кхсдотети Ві тки Воля В нт С рук Же Я шику пи «232 Важенй паенцют Б о«чЕСЕ АНУ нНИг СроваМАюЮ їЇЗхі дижОоКО тидУ - кл рн сце да без йдА-мутацій) (МКОогайпсв- пок) «айпад» ла ре ще жди -- К У ція щи ся Фо шия Ж ще гелю сежя суклю и тк код г хи ст ах пи Меі бій бец Маїссбма Бех БіУ Ту лу Гм Зваі жй Бе о сфу лагу - Іа ле в 1. ро 10 Я
Зек Мем дво Їй о шег Сув Кіа Віа Бек БУ Тек АвОо Бе тТвиЕ нія ТК зх «т - о ша За сі. Меб дви ТкЮЕ Уві дДкЯа бій Аїа Ре пБу Гув іш Бе Іс ТтІв ді 3 50 а
Сі ткв ї1Те Ап тах жек Тв біУу ій бро Тв тую йіва Аїя др ге 5 ВО ув дк Ахб Б Тв вве деж бец Аве о так Бак о Був о зех Тпх лів тує
З Кн; К во
Мен біл Мек о йвоп зек їмва дже Аза із дар о Тлсе Аза Уві ТК о Тух Сук 55 Зо З пів муз Ту бо Тук Тук рук Сіу ТвВжЕ бек Пів Тр о Тух Бе Ар Уа їсО Ко 19 тТкв іу ЗіБ щі Твжх Бей У«Ї Тк Мак бет бек діа ек тп пПуз Ту 115. ї-о 185 тих, -ч Я у о пк дкаюь Ще Гя - Пп хуя ке - З тт. Ж. іо ся ни Сад я як пт те
Бк пек Уа Бе ЗЕо Мен Вів о Бкб Сех пех Гуз Щек ТВ бах бу м 155 ї«й
ЖвВЕ вів Вів їв Бі Сух Меч Уві Бу Авро тує пе ко сів вхо Чаї 155 155 ще 165 тах Уаї бах тжр Ап бак бі Віа тео ТБ кет сту Уві Не ТБЕ БІВ пеЕБ те 15
Руб АтТя ат Бе бій Бек Бек Бі пеу Ту Бах ти беж Бек Уді Хай її 185 190
Тне Уві, Мко Зек Бек бух Без сбТу Тих бів ТБ Тух Ті Су Дап Ха їзЗУ рес 205 дви оБів був ро дек Аза ТвжЖ Був Маї во був о Мув Уві сід реко Був ек Сув Аво пу тк Міз їпЕ оСув реа вка су Вт дів РкО Зк гей
В 25 238 25О ши бі Сіу Ва Бек Заї Ре Гши Ре Еш Ва зУув РкО Су Ар Твх ах аск 255
Без Меї Ії6 дет йо ТБк орто «13 Чаї ТВж о Сув Уві Маї Уві Ар Уву ей ЕВ йо
Щеж Віз бі о йзв Ро бі Узі Був Рпе мап Тв ТУує Маї дво 5іУу Уда ат5 ей Ва біз уві Ніш дат А1іа ув ТЕЖ Був Рв джу бі бі Зівпв Туш бявп ее ва 235 Зоо
ТИЖ ТУую АБО Уаї ві ба Учі Бей ТЕЖ Уві пет о йів сей Ав Жгжх без 05 31 315 350 р пл Холм 1 ок охо жд г гу ее Ач як Я. Ки тора Бк щу ввповіу Муз січ Теж був Су о Зуз маї бек йзп був АТа пе; бує від 425 З50 135 руш Не шк Жзих ек ол У пов У т їх ле с Ган У
Бро жів п15 фу Тах тре беж був дів пув піу сів Бко Або Бій БЖ 380 345 за сів мМаї ТУухХ Тв дзид БЕ Бжео СУБ дка дробів ей тв бує Два іп 355 зб лев пи я сті зм ру Ж ту тут У т поих юю ТЕ ше, т Яд Ж
Уві Вех ем Тер о був Пед Уві Гуз 0Гбу БвВае Тїюж ВКЖо Хек АЗе Ті Аза да ачЕ ще 375 Зо во ак сім Ткребіч Зак Ап о піУ біб Бо бьс о Аво Аз бук пу Тв ТЕ зв Б 395 оо
Ркоа Ехо Уві бвиа Ав дек Ар о Су Бек Кйпе бе ви Тую вах зуух ГПев 340 15 тв Уві Ар цу бек одтсо Тв оС піт б1Уу ба Ма ВКо Зах Пух век 425 155 аЗо
У-і Меж Ків Біо) ві без; Нів Авб ния Ту ТВвЖж бій пух ЗЕйК бец оВвЕ 530 а пе овех вБжо зіУу Бу «107 45 си1ї1» 45 кві РЕ «238 Штучня «ий «рак Важкий лавцюю 92 «УБОК-АМИ-й» СтовеМАБ їасї дико тиху іїбез АдДА-мутацімМмі (УБКСКяицинИ КО, . «а Иих «ка б5Ій Уві бій ес Уві іп о Вак о біу Аа біз ува Був Бу ско о зіУ АТа 1 5 ва ї5
Зек Уві був Ууаї Бек суз Бу Аза бе б1у Тух ТОК вк Тпх бі Тук о Ж Ко
Ту: Маеї Нів Тер Уві Хо біп Аа18 Бо б1іу піп Бі Беб ств Ткр Ме хо 45 4-х віуУу Тхв ї1е Авй овко два обвк біу бл ТВ АБИ ТАТ ОБп о Був БНе й У ви
Кая в НВ А а х , х т уж 7, т - ба СТ у ня с ОВ беруть бі бі Ахоб о Уаї ТВ Меб Те ДАхш Ар отв Бе Ті бех ТВк Аїв Ту
Бе о 75 ВО
Мех сам одну ше Акб Сей АФ вет вАвр Айю св свіа Майї ТУ Був сСхув
Ва за
Ум ше А ся ї кі пре куліш З Пкоух ем бок т п я «із тут кю дід АкЯ бек Бк ай ско ТУХ тус тк дв бек цеж дбіу Чую Тук Тук лоти ап ве 105 ї05 Іо ше тя Мп вик луки ТТ подих о М оь я. - М, че тіки оди вхо 51 м ваг Бе да ша їв ї сш осліу сли БАхУ Тих Мек Уа Її тку Уді беж дя т чи «ах 115 150 із
Її Мін Жак ли лозу Зло лю хтах ск ТЗ У др. пек Жака дик Сорок звк кра Зв Уау АТїв Аа Ру Беж Маї РББе Ті ре ру Бо Яцет Дар 130 ї55 14о
Коси ни ШК У Ток ак т ій ре Ор и чи Ш ена Ш Я т вд х вів Біп цес їхав Век сої» ТВх Аїава Бех Уві Уа) Суч« ву Май Ав Ат їА5 150 155 5 емо Мтдяює ЖЕ; Б осую и от 2 я У ше Кн з ШИ ух. пок т шо Лог т - но ве жук БІО Ака біз віз Буш о Уді вітай ТЕО обу маї дБ Ав оАТа тей птх но де 1 жо КЕ; т з тож ст в Фора ах ст 3 чн не і й а с и Ше п
ОЗій ем і м о ЯкВт БОМ ОБАЙ 5 ех УуУщА ТП оби Мп А зш ОгЕ ї ух 150 ї85 158 - не 7 я ФУ долю - - и т тА рі лиж точи ВІ шо кот чек Твт ТУукК беж пер» дек пех Ти Бей Тс Бе дек бив ліва бею тик ща РІВ: ОО Е ше ши с БЕХ и нн о и НК Ат ша жа 124 Му я А й дк тою МО - жі мУвВ Пів ув хві ПУєЄє йів сСУв о біз Уді бак Нів осів бі Бех Бек же хр ач о РАН ше содою з в а о о о шт тА ово б продо ів
Бек Его Заї Тьк Буш бек Бл Ап одуУ Бі біз пув двр обов Тв НІВ тю су В туту г - ри ху 285 я 3 235 ск ть ге лк по боже ще ОК що ж пи до т зна г от
Тахо Ств Бто Бк осув Вко Аза гро бій Без пеа пі біУу ко -хек Узі да ЗО ша ги Е гля ТУ шк ту Ан чн туш Й фея р їв - про
Рпе о Бе) Ре овко Ро Буш Вко Був др о їТвх Без МеЄ хтїе бес Аке Так пд ск сутнр жа 273 тях о, ку нн ння и ШО ЧІ й ді о щої блсеюю Та 1 ре пух Н га бій ді Тк оСуз Узі Уві чаї АЗзр Уві ех Ніз біз Аврорсо То яТУ на; 95 тв іУув Бйє дво Тхр отТук Таї Дай сі Узі біо Укі Ні еп оАзЗа СУД 2 5О я Зо
Таж су ко Аку пли бів бів о Тух Ав Бек ТВ Тух Ак аж Уві бвЕ 305 318 315 зо ати тож Х не У ШИ Р оіхя І га род С ян -У ї, Я з яхт нн оние Зич х
Уві їн Тих Уяї Бен нів сії АБроТтгр о Іза дя піу Суд бів тую Буд 328 зай зи
Суд Був Уві Щек Ай Гуз Атя рен БгО АТ око Іїе 55 Бу тн дже
За 345 ЗО дек Бу із Муз 03 СЬв о Рро дк Бій) ро слів Уві був Тип бео рес 355 зва База
Ргоз Беж ку вро обім Перо тТйх дув вп Бій Уві век цем бжшт Су лій з зл за 379 8 385 гоже и АНЯ си х же бр се ье р ча хх. Фан рр Мне Аме
Уві ев о зіУ Впе ТУухк БІС дек Аворо Її Лів Узі 53 тв обів дет дав
ЗБ 20 ЗВ Ой аку піп овко Бі Авц о АБО ОТУуЄ Був Тк ТЕ вро Ро Узі Гецч вер нею 405 15 415 х коожлочсх Хухуа у това хи голе ч жо тТіхржю Ж оду лабо хх Уся тож ке дети ваврозіу йет Зпе ге Гей Маеї 5ек Пух Бем ТВ Уві АвБюж їв бест Яка о 123 430 тТЕв Чіп бів б1іу йап ай РБе дек сСуя бек уві Мет бів сів о Аїа пей 135 340 ХА подо свт ЕІ до у п тя зо бува Ся вії шк бо ве Дт КУ а
Нія Авиа нів тУХ ТЕЖ пік Був вик бе Бак їі век бо ЗУ ДУВ 450 455 во «Кіз 1 «ват» 18 «кій». ВУХ с«еїлз Шеучна «рах. се» Дешкий ланцюг 1 «УЕСЕ-вМО-8х СковБаМАв ТЯсі дикокОао типу їбез АйА-мутеацій); СУКОкарЧи ОТ сао 41
АзЕ ої1е сій без ХЕ осв» веж ко 5ек Бек пеш Бех АТа бЗвУ Уві алу 1 Кк та в 4 о щу ї5
Аню Ага Уві Тв тк ТАК о Сув ек ва Бех злі Або їїе Бех Аж Бук по 25 зи пен ойво їв ТУ бір Бі Буш бтоа бпіУ БУВ АтТа Бк Бую ві ем їле 10 15
Тує Бе ТВ бЗеє Бек цей о Ніш ех бі ча) ко бе Аєу Ре Чех бІТУ
ЗО 23 Бо дах пі Яеє 539 Те ойвро ве Тк Бей ТВ Тїо бе дет Бей бій Его
ВЕ то 75 Б їх : вч - - "п ОС ки їй нн о ЛЬ и На в г ОВ скх поль Тон уя
Пій ар ле АТ Тк о Тух тує СУ Біб Бій Тух бек ТК УВА Ко те в За За
ТпІ БВе Бі біз бі ТЕ Гм Уді бі її іїувз Ака ТЕ Узі Ада віта аз ОВ Во вто Бах Уаї вне жі Бе Бко БЕ Бех Ар ост біт бе цу бе ху дол рок і: Ше 115 ї8о 125
У : У т т . щи от пох г скро- пухуею проь жк ке тиж дія бек Маї Уа1і Су пей пес ДБ оАвоп о КБо Тух Бжо Ак пін Аїа 139 ІВ їв
Хоякк Кох пт «Тен тех дощ тек - и гр КІ лу ях дод ач
Ппуш Уві біп Тв ому Уві Ана Ав А18 Бпей зів дек оЗіу Ап дек бій х з ххх Ск - ЗІ ож Моя я Ше жо гео Ще ле ЕК я перо САТ т. за сіш бек Маі)і ТБ Зіч бів Аво беж ув Ар о бек тп бек о 5ек цей ах ї85 ти 175 кю 3 у Св з н о ТУ: ду т ах пох на и Нр Яккує
Зв пт пем Тих По ех пув вла Ав Е т уко лі М у Езия У ах її УХ 185 135 уза 1 беккию в. жд ж р до т пе т о. що шко х я др чих як р
Аіз Су шім Мак тн Мів пів бі пед дек Бех Бхб чаї тс був Бек 155 ай 205 тпле Ав Ахеа спіУ зі був ся т
М
«вій «й «ії» ММЗ «їі БЖ «13 Штмчве кйеОг єю ух оту зез руч я ЕЛ ря тую гак ІТ При іт ми еру «-2233 ДЛевикий панцюк ее «УБОЕ-АМОЗа» СкоевБМАЮ Бозі цпикото тилу
Кф ік те ВАХ авеню я і тд Кр ттич ит, ун екиня ся ібаез АВАА-мутацій) сУБОКапеа- пет «ОО ай
Іль Тхояє їящ грати ПЛОВ т Талеу ТЕ Б з Хто ред ак ТІ я я а но ше вес ТУЄ ві Бей ТЕО біп рео Еге Шев Маї бек Чаї Аза Бро су бі 1 5 18 15
ТЕ Аїа Акб їі Твх Су пшіу сі вав да Ї16 ЗУ бет ЗОВ Бек в 2 ав Зо
Нжв о тов о ТУєЄ бів біз був БкКОо біт 5уз вія Бо Маї мен тв Тв тує
З 40 а
Авройхзрв Бех Аврв АкКаЯ Рсо бек ЗІУ Ті8 о Бко ба Аж бле бек 51У йде я 25 бо ту що ах пт зт п хо « сви С са пад зх г Е я ух ввпоїах Зі вва Тв Аіїяз Тьх о Бех о фнЕ 118 бдех Ажпе чві піз лів йп1х
БЕ ТО 75 о авросіз); вів Авр о Туює ТУК Суз бів Уді3і Ткр Азов бек Хек Бесє Авр Ка й Зо 55 тр чаї ве бю біУу йім Тк Був во» Твж За) бе бак Беве Аїв пве їо8 195 15
Тк о бУув спЕу ко бех уаї бве вВко ТЗ Ата Рхо беж бек їувз БЕК отТпю я дткв ок щі КО 125 вв БіУу Зі Те діа від йдем біу Сря пев Уві ув Авр отТух впе Вжє 135 13 153 сід Бо Уві Тк Узі бех Ткр ой йек бі від без ТБ дек б1УЖ Уві 135 1509 155 їБо піз тв вне огко віз Ова1 Мецо бів дек бе сію Бей Тує бек Гей ак 155 їтО 175 п ТАЗ луд Як ця їв 5 ш сою їй: ою т ться сп деж мМаї Маї ТЕ мні Бо беж бер бек гий ЗАМ ТАху бі ТЕХ ТЕ Т1е 180 185 1850: був дей Узі Авй нів був Бко бшсб Або ТпЕ о лу Уді дЕр Му пуд У ї55 208 205
Ж Те т Фа її ім ко був овев ств
Ії «віз. 43
«11» аа си Ще ВЕБ «аж Штучна же «ва Важкий панвннют ої сук Е- АК СЕМА ТЗсл о тіцьки з Би
БАрА- мутаціями сШез Адад-мутаціюй)» ЗУ шкзпое- па) «аОщИх Аз сі Чай ій Гей Уві б3ч Бек п)» бі бі вза Уаїі Був ро бі бі 1 5 та 5 бБев цвои Ака феї Сех був АтТа Аїа беб біб Тк АБю бБе ТЕХ БТя тує 29 5 за о ЧИ же Ж пове хгжї ке ПАХ ТУ ж п же фе в пе стр їх сі Ме два Тр Уві Ака ЗУ Аза Кко біУу пув жу пФ бі Тв очах 15 яв; 45 т рухи Ше - ті ух т ма МІК и єю вит. ух: п р; Е кох Кодеия пні сту Тер Ті Ази твх тує тн бі шій Ба ЖЖ о тТУух Ала Аза АнвоББе
У о) со пору яри ня СТ хо іа оре рот пошту де тео пд щ що фур їУ5 АК дку БНПе ТБге В дах пай Авротинж Бак буя ек о тТВх Ків ЖуХ
У То в З пец піп Меї Ази беж рем Асго Вів біб Ав) Тех Аїа Заї тут ТУук Суд 5 аа З діа цув бук ВКо тТук Тух Тук біу ТвжЕ бек Ні Ткр Тук Ре двр о Уаї - лк -
МО 155 її пох ги перу ук зе Ід слу Кри г т тож тк,
ТюЕр бу Бій Ку Ти Пей За1 Те чаї бек ов Аіа пек тв о Зув о сіу 115 1755 ї2х5 ху ; у Ту. бач СА : Звук Тон ду пу І РЕ
Бхо ех Заві Ве Ре лев Аза Бгто бек бек омцув Бах тв дес біу сту 135 135 145
Ух г. - Ок вч еру -к ї полу сова шк й Н ях ко се их ях у ех ївЕ Аза Атїа фви осі був о їец Уа пу йвротую Ре рЕб ЗІ ко Уді 45 55 іх 160 ил ж аж поле ре, чн жк т. є - з ях з Уже я г 17-х екон пгт оУаї Бехб ТЕО ввлп бек Ятїу Ава цер Тву ех сбпіу У Віз Тк вне іб5 Іо Ти ща у чи А А АН : Фіг бно я хг ч хо іа Уаї бе)» біо дек Бех зу Бен о Тує Бех Гец Бек Бех Мві Мах ї80 Ін учи
Уу, ж и си Жбдю то бкую іх ранчо НН чеше уч тов іш їх їй оУдА БЕо бек бех пек Пец Бі ТпПх зап ТВх Тут (їі ув лвпо Уа 155 а 205
Ач окаів Буя ркс бек дна ТТН був Уві Аве Був Сув чаї бі Бо Був пух су Кк - 1 215 З пах Сув дар вух ТтТНж Нія ТНК Су БкО ко Су кб свіа хо сій ді 225 23 а ба а коса че на М НКАУ С свух чн п тож Ч ух чи ях пе т - ще сук . я
АївБ ові сі Бко бех Уві Ве Сем ЕБе Бо Бо Буш Рсо У АвротТвх жа о 25
Тс Янв то су Й ц ах к ІННИ чн й тушу т Й тт з под їеу о Мав о ті6 Бек о Ако Тк оВхо бів Заї Тих Суз Чаї Узі Уві Акр о Уаї тих сви жк нт ви а ло паз: Ні із Аве охо тю» Ма1ї Був Бе двоп о ТК оте уві Азроску Маї 28 яв сії Маї ніч Аеповій Був Те бує гко Аха оба ба бій тТЖж дет век 28 Ви 0 твготТук да Маї Мі Бех зі Гей о ТАх чаї їв» Ніж бій Ав Тгш Ше зо зі З15 зап ав ЗУ пу біб тук зу був о зув Узі вк оАзи цу Аза Бем ОТ діа 325 зо 335 зи тіє бі їуа тТвротТїв шШет пуй Аїво дев о ую тео лек я
Рхо їіє с3м4 Був Тако Тле бек БУ Атїв бе 51 іп Бо Аку бій Ко ме й їх :. Зах 4 аб 35 біп Ущі ТМ Тпх Бво ко Бко Сух Аку Ав о Зіє Бецш о твє Поу; обві За пох щу ї будов, 355 ЗИ 36У уві шщех Бес Тер обу пед уві був Бі Ре Тух Еко Бек Авр о Ттв АТ зт т зво
Мах сі Тер Бех Авчя Бі сСіп рко бів дей Ав о Тує Був ТНЕ ТБЕ
Зо 50 55 ато кхо» РЕШ Уаї без Азрв о шеХ Азробіу Бех РБАе Ре озен Тук бек Бу Тец 305 418 315
ТтКх Уаї Ар Був ЯЗас Ако Тжо Біб бів Сі вв о Удаі ВББе бвк сСхив БЕ їга 125 135
Ууаї мес піз біз вія без Ні АзпоНів ТУк Та бів дув Бех Гею дер з 45 а Ах
Меп о5ек Рхо пім був
Ка «вій» 48 «2115 453 спо умах «иа ект «2132 Щеучна «и» «З» Важкий панцют й «чУЕЕЕ-АМОочаМ СооваМАВ лава тіквки Зо газо ьвід- мутаціями (без АдДАсмутвційу СУшОкапуй- йОт5 «Ой 45 біб Мні БІБ Бей ві бій дек З1іУу А1іа сія Уві був'зУуЄ Вко сі іа і 5 10 І5
Бек Уві Пузв Уві Бек Су Був Ата бек ЗіУу Тур ТВпЕ Впе тик біу Тух ра й Зо
Тух Мех нів Ткр УВІ Ака біп Аіа хо зі Бій БІ Пес о б5ів; ТКе Мех зк 48 45 пли ШУ ок, то Я т ж шт сю ох. х Я чу хе. Тосох. гоже ке шо. в я яко піу Ткр бів Ав Кко АБО бек бі в1ІУ ТЕЖ Ана тує Афба 531 Був Ва 5 сів бІУу вка Маї Так оМеб ТВЖ Ак о Авр тп обех ТІЇ деєЄ Тв АТа тує є жо у 5
Мас біз Без беє Акса Без АтЯ Вес Азродарв Тв Аїд Уві тую Тух Сук 5 Зо За
АТа Ага бах Бхо Ази РБко Тут Тук Тук Дар ойех Бех піу Ту Тух Тут 120 125 119
Вко пі Аїа Бе Азв» от1їів Тїв; піу ів біу Ти Мак Уаї ТОкоУаї ев
Ту: 18 їй р - Де ГАже хх З я КУН т. ту Кк зате з щі СК т, тк лак, ток морю
Хек іа дет Уді діа ді БЕЖБОо Беж Ма Бе ІТ ке вто жо дах двр 130 5 1435 зів о сіпо Пец мух пе Зі Ти Аїа бЕех чаї Майї Сув Мем рей Ав Як її ї-Оо ї55 155
Бе Тук Вто Аже бій Аза було ові біт оїкрогзуз Зві йво о йзв о АТа Пец 155 Її 175 піп Бех піу Авт обох су3в ту) беж мМаї Таж Бо сЗб взр Вех Бу Авр їва 185 що
Хек Те о Тук Бек Мед) шек беж Ту Без Ліх рвиа о5зех ув А1а вро тує
195 а зав га чи «к г е 1 х тд б а ваза її з с мч - сі пе о Нів Був Уві Ттухк Ді Су Бі Уві ТВх із сів аїу Ббеш Кекх
Пет ро ві Тйж Буз Бех Ре дз» Акт ЗКУ Січ був Авр оМуз тТвЕ Ні 255 и З жо
Тих Су ко Бко Су Ре Аза рго бій АтТа Аїа сту БТ Бгто Бех У. ка БИ що вне йеш впе ко кс мух жо був Вию ТЕ дес Ме? іс беж дк тТвЕ я ах 270 хе біз Хаї тв Сув Ма1 Уві Уві зр о Ууаї бек Нів 51 вар оБро си дв о 25 чаї рша Бце зо ТкКо Ту ві Ар піУу Уаї Ба Уві піз Ап віа пу деко й да о За зо
ТЕ ПУБ Бко йкоа си ба іп Тук Дб беї Тк Тут Ако Уві Уві Беж тиж, а з ц поле за5 зі 15 35
Ов Бей їни А Бем Бів сій вав о Тев лей Ал 55 Був хі ту був 385 аа дах зад о стохріх хв 1 Се пошу Ток ді мо оторах пу дО їв ех т 1-е а киш ти Ж
ПУЩА пек Авто ПУ вів пем'чгУ длт мо ж Ох пу Тл о ує
За : зав зо
Бех Пув Ава Туш пі піп о Бко дга сій рРжо піп Уах був ТБЕЖ бе БКо ув ще як ав5 ЗО 35 ка Зек дДко взр бів пей Тих ув дв йіп МВіІ веж о Бев бек був Ах др ср З ет іо З15 зви вч хат тако Пазли хе ва о ши ВШ анни - бін о с ощак "аї Був Бу Ре Ту Еко бек Ав Ті Аза чаї ср то сід бех Ази 3855 459 95 06 плу ста вже біл лап дво Тух мув Тахо ТвЕж рка оБко Уа Кпеб дво» бдег
З С Аг
АвзрозТіу Шех Рпє пе Би У«ї 5ег БУЗ Пей Тбх Уві Ар о Гу бек Ак ау ух кр ке по та 430
Ткбв зЗЇб о взув БЗішж Ап о Чаї ве беж сує дей Уві Ме: Нв Фе Мі о ї45 АВ пів Ави НіБ Тут їйпх пів Му йеж їм йеб ши Зах обме пу Був
А ее дов 450 35 5 попу, Я со М 43 «ії 514 сеїйх ВЕЖ «213» о пПрручмна «ай» «З» Перший данцют Ї ЖУЕСЕ-АМО-и» СховаМАВ їФбі тідьки а вда БАБА жтепостьсгї Хдполкєт А заст Я ХХ хто и о а з мутаціими сбежв вАА-мутацій! (УБсСтасахи- 0918) «4055 55
Ар о їїе бій бем твк Бій бек Рхо Бах йеж гео бек Аа Шек Уві біх
З 5 19 То
Вр Атя Уаї тпЕ Бі Твт оСув бек діа ау біп Аа 118 бек вапотТух мя па й пеац два Тр тут Зі Зіз Му Еко бім пу Аза Вго був Уві Бе) Же
БВ! С
Фін во ву бар біде то Мі бек Сл й 1 ж іх де риє Же ря
ГУК гне тв йеж бек Бей Ні бек сб Ма бро беж Аа рИпЄє Бех ау ши я ди о 55 55 ук У Ше ія Тр де дк те СТЬ ЯК цк М ши Федя СВ. . вел ух. бек з1іу беж Сіу Тк одДяр о РБе Тис Гео Тк ї3З3е бек бек беи бий Ро 85 то та ви
Січ йзр ве АтТа Те Тух Тк був бій бла тТук Веж Тйх Маї Бжо Тер я З За
Твк ваз шіу бів щу Тр Бу Узі піс 11е Був Акад Так Уві Ата АТ 100 125 119 - ПА не я вн чан и нн А а и и и ни
Ето 5БвЕ Уаї Ре біс ВБе Бк Ехо Зеж АБО бал о бія Бей Ба Бах бгу 115 еЯ Ти тпм. я яд У 2-7 зуєх з - Ж ж: ос Ле ох буд іжих фе У лот їй діа беж Уві Учзі Су цес дей ей Ази пе Тух ро вра п1з Ада з 3 5Е тай 125 і 18
Сіда хи З. йху Не ж ВН КИ Мт АХ кА те с о ПТ ки Е ях
Їїжз Маї сів їх дув аї Аввоавп Атїа Гви БІВ бег бі ям ше біг 145 і150 155 159 зв беж узі Тпж спів біз Аше пек Бук ДВО Зк ТАК Тут дах бе; ех і55 170 їта шк м ть МЕТ. ня ЖИ ре тк й яКОАСИ МЕ г хо ІГЯ ох Тохясх кщц з вк Твх пез те пеб» Зевс Був А1ївовзр тує бу Був Ніз Гу Уа ТУуЖ їв 15 156
Аліа шу біц о туаї Тс ніз біт сіу дев дек бек ко Заї тТпЕ Був ех жо ОЗ ві з пан о АН
Ре двп ака пі сію су їй ктудотя ня «ет 45 «ші 813 «ее ВК «ДМ Штучна
Мееенняя ко ше гтх віск я В па чн Ач А дини г. дося тд жо. «пої» Петкий пвнцют 2 «УКОЕК-дМсИа-и» СеоваМАЮ Табі тільки - ВЕ ТаАБА мутаціями ібез Ада мутацій) (сЕскапао Оу Е «асп» 45 хек тук Уві пев тате сій ко хай Чек Маї бек Уаї Лів РЕ бу піп 1 З 19 8
Тих Аїа Аха тіє Тр Суз бі сіу Ав Авз їі Сі бБет Муз Зех Уа 2о 5 зо
Нів ТЕр о Тук бів бій Гру Рко 0)1Уу іп АТа Бо Ма1і Сей Уві Уаї Тук 4 45
Ар вв Вес Ар; о ако Рко Беж о біУу ів Бко бів йо ве ЗеБосбгу дес но я «В
Авй обег су во тах АтТа Тк оїбео тВвх Те бек Ату Ууаї б Аза пі та ТЕ що
Ав піз оАїв Ав тут Ту уз бій Уа! Тер Ав8р бек дек пек дви Ніз 85 30 ЗЕ -е да іч й 1 т, М круте, Да НН т тод тя Ян М роми
ТкЕв аж вве Бу іу Б1Уу Тв ім Ббец Тбх чаї дез йбет Зет дів Шех тва 105 11
Те жхуе Її ро ких Уж ИН т В - че Шіято ЩЕ ук пкож оз
ТЕ обу біу Бко бвг Уа ре око Те) Аїв Рго бек ех ув бек ТЕ 115 вай ї25 дек лу 515 ЖЕ Аїв Ача Бец ові Сев о їз аж дує Аж ТУє Ре ра 138 135 145 свіч Бге Уві ТВ Уві Бех то дар о зек біс Ада Бе Тк Звх Бім Чаї 145 ї5БО 55 1650 нів Тих бле РКО Акха Уа) бе б1в бек веж бКУ Бе Тк бес Геи БЕ ї85 то 75
Жех уві хаії Трт Уаі бко ех бех бак без біу Тих о біп Те тк 112 189 і85 155
Оуе Двоп о Уві в-во Пів Буз РБго бек о Авя ТВк о буз Уаії дврогУуз Пуз Уві. 185 оо 5 сі еко уз 8еЖ бух еру «1 «Ії ОО сій» ЕКТ «812» щото зарієцв «АК. - «Ох А зха їв Уаї ліш Ака гкО бе уві рпе ї1е рве ро Рез Бек дв пд кА ле 1 В 16 15 ій цем об ек зі Те бів бек Маї Уаї Сув Мец Бей вв вав вне
У ши за «кхле тож У Я я (тд ок -ї з дві десху біт дл ох . У тІук Бко деко бів Аза бує Уа біп ТК о пух Уді Аж ва о йів Гем зів 35 У) 5 зах щіу Аяп беж 0іпо сі) Жах о уві ТвЖж бло бій дар пек Був Ар оБах
БО а во тТв;е теЕ Бех їТвп бах двт ТЕ бен ТУ без бех Був Ада вар тую Сі
Бо то Бе 80 : її 5 йо які ЖК ен чн я чи
Був Ні Мув Уаї Тук АІа Св Бій баї ТТН НОВ сів бТіу ем беє бет за У ко Уві ТВ пу век Бпе Ав дку сту Бім був
Та 155 слони сет Я «ек 195 п ай «іх ЕТ «еаМ пешо аарІівгл «апп» 48 біїя Вко Був Аза Аді БкКо ЗвкКк ші Так о де) Раеб Бо бко беж бек 4 ї З о ї5 іх тихі На Яощо ох тх ее сто Ти Зоахе гаї вк - т по дет те іч Бев ЗійоАїа дв пуд АкГа о ожфчжх Зез Уві Суш о дев їі ак доро бле а па 20 5 за ї Ю еще Сх, їй - 1-1 т ск дл пох Токяа т Ав с ех шо КД тую рЕЗ сіУ діз таї тТпе обаії дів Тр о Був'йїав Аве бес Зевс РЕОо Уулі1 -е я к 35 Я З
Муз Аїа зіУу шаі сіл ТЕ Тис о тТВж ржо Бву пув біт Бах АЗзпоА5 був т же хх
Же Мо 3 тух Ага вія шес дек Тух Пен бек бе» ТВ Ех біб ців Тер обу Беж ок, З а п
ХХ за о нен) ли ще з я и ож в Я їх хх ті ие 1 -2 ее із пк шах тує бек Сук пі а ЮК тв Бі сл біт деж ТЕ Уві Зі 85 що ЗЕ
Пув Тк Уві Аів хо тп бів був яеух т З І «чиїй» я «115 за «из ЕТ «іх нолнх зврієюве ке Бе «100 5 . - що щоку пе бо хто туя рр: ОН ЧНО год тохгю діа дек ТЕ Був О1у РКО бе Зві пе вхо без АТа Рус дек Бек Кпув - 2-5 ох ня 1 у п Т5
Как Три о йаек осі ціу вк Аїа діа пям оіу бу сви Уві Був Ар отух о ша зо па рко піц жо чаї Тв Уді 5вж Тв оАвп бек бі1Уу Азїв Мео ТБЕ Бах ле Що 45 спі ча» бів ТЕк Вк Руо діа Уві ген бій Бех вес біУу ем Тук Бех 58 С)
Пева» оЗек Бек Узі Заї ТЕ ові РЕо Беї Бех бвж о Бецд спі Так ОБУ; ТЕ а та 78 ва ко пік тат г: Тс шк е З не Дж во Жожкек сю пух яку тус Г1іе був вв о Уа1і йвлйє Ні Пух РІО Бах ши Тв обу Уш1 Авр о пув 85 50 З поху Зю ще т боки бок г? 4 зе: щі тах йтлсу щ-е не пе пу Уві біз Во ГБуш пек Сев Аве Ббує ТБх бів ТОК осСУув Ро Бхо сут иКекв) 125 115 вхо віз БЕ біц їм беш пл» бі Ре бет Уаї ВнНе пеу бе КО рух з хе дк з 120 ка пу Бо Був дер їБ»кЕ о БамоМеб ГГе Бек аку так о рко сізя баз ТБ Сув 130 їі35 140 чав чаї зві дврв чаї беж НЕБ сів жав бжо бід чаї був ро вай Тер ї55 155 155 165
Тут Уві Азр біу ві бі Мі Нжв Аа йтш був Тк Су Ртго Да пі їз 175 ТЕ піш чіп ТУЮ Ан бек ТЕ тТУК БЖ Уві) УК Зек Маз їй Твк Уді БИ тва 185 150 нів Зів Аве» Тхрореь дяв пЗу буз бів ТУ Був був був Маї 5еЕ вал 185 в еЯ БЕ тув й1а Гей Бо Аза Рез Ве біб був Твх Хі Бек був Дія був пу не в з 510 2 й мпоВже дЕЧч ЗАВ БЕ сдіп УМаї Ту ТАЖ о бец Бо РІЗ бек АкЯ Ар оій ія 24 2535 со г т Як я росу 7 ща жо ІП, біжу то СУМИ й мо бори ОМ
Пам тиж ЗУ Ази бі Мазі йехк Бей тТвЕобуз баз Уаї Був піУу вве ТУух жах аз 25 шо ; ця потяг тя я - а чн -
Бто Жех Авю бів А1з ЧУаї 519 Ткр обі йек Авв обі пів оББоО щі Али хво БЕ то
Ав ОТ рух ТВКЕ ТБу Бе Вкб Хв) їв) Дар обЗек дввойшіу ВЕК оБне рее 75 28О рас ем тує бек Був Гей Так чаї вар опув вЕЖ Ага ТІВ бій бБ1іпо 19 Адп «0 28 00 чаї впе ех Сув ек Усі Ме нія ЗІЗ Ада бо нів АБО Мів тую ТКУ ака Зо 315 30 сій Бжв пеж Спец бБет о пец беж Ре сАУу БУВ
КЕ 3 «вії» 5 «1 їх 397 кіз БКЕ кгї3» нсїва варзейе «пох Уй віз бек ТЕ Був о сіу Бко бек Ма1 Бе Бре без Ав Бо був пек Ат 1 ві 10 18
Бек ТНж Беж під Бе тиж Атїа дій Бай ТУ Сув о йей Уя1ї пу двне о тЖЕ й У Кй
Зва бесід: Шео!;; Ма ее Хді Фев отрвоа бля Єва бло йтя їі три дет впш Еко бід бсе Ма1 ТБкоМа1 Хет Тбкробви беж біЖ Аів Бей Тих бе 35 0 45 іш Уаії нів ТБгобрае Бкеб діа Заг опо біб ек бек СБу Баиа Тук вег
З І що
Бей; ойех Шеї бТаї Уві т» Уві кб беж Бек беє ем бі рвЕ був ТВХ то У я
Тук ЇвІ Сов Дзп оЗві дар нів Був ха Беж Аа Тк о МУ Ма АвроКПЦув 55 зо 5
Акц Уаії Бі Зег обу Тук і рко Рро Су Руб Зах Су Бжо Аїв Бко 100 15 її сх вла це) суу спіу рко Хек Узі рве зей РБе Ех РЕб мух Вго їе5 1270 тав двроТАХ Гей мех тів Бе АкаЯа ТЕЕ Бо бі Маї Тв о ОСОУуз Хві Уві Уві
Т55 135 КО
Аве Уві Зек бІп сій АвроБро бій Узі бЇв ББе Ава о ТЕротус Уа) о Авкр пе) 155 55 во біУу Уаї пій Укі Ні дзо Азії ЗУ Ток Муз хо вка спів бів бів рве 1655 170 МВ бетон ім. йони ха її ек тА тод - Р ї ча й Ви
Авипомек тТр;к о ТУукК о Ако Чаї Чаї бек УВІї Ппемя ТВЖ Уві без ж БО Ав їкО 185 150 х Й що я : й я мя году ж Кожух с. г до її з
Ттр цей) АзпозіЖ Гу бли ТУ Буш Су МуУувБ аз БВ о АВвп о спуз шім Пе ак Ре ка 135 ща ж пес Ват о бек лі. пів Буд ТтЕУ Ті Шк мая Аза ЇЇ зв бі пі ВкКо; До:
ЕЖШЖОС ЗзЕшт беж і АВ МУЗ їли вв они пу лав ув щІМ салюЕ бо Ка 215 І г)
іа Вхо Бій бах ТукК ТВ Бей РКО Ргро бек біз бій сіб Меє Тик був
Авпопій Уді беж Гей Тк Су йет Уяі Бу пі Бе тую Бо Бек Ар
І1їз 18 Уаї БІ Ткробівї Чех Авп обі» б1п Рхо 51 Ап Ав ТУЮ Куд во зе 27 тв тах Его РБжо У8і рез Азов баг Ав йпіу дек рив Ре рей Тук ще акФт ем тах уз Авроцув ек Акса Ттробів сів бі дво Уві Бе бек
ЗО 285 м суй бек Уві Мес Ні зій Аза беч Ні Акп о нів Тук ТБ пів буд Бек 135 31 ЗЕ 320 печ бак бец Бех еп біу Був
ЗЕ ка)

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб зниження в'язкості антитіла, в якому антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу ЇдДсС1, де цей спосіб включає модифікацію константної ділянки важкого ланцюга людського підкласу ДО1 за допомогою мутацій І253А, НЗІТОА і НаЗ5БА, нумерація згідно ЕО-індексу Кебота, і де антитіло являє собою біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, в якому: І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 1, СОК2Н-ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 2, і СОК1ТН-ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 3, і у варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 4, СОК2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮО МО: 5, і СОКТІ - ділянку, що має БЕО ІЮО МО: 6; і ІЇ) зазначений другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з АМО-2, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має ЗЕО І МО: 9, СОК2Н-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 10, ії СОК1Н-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 11, ії у варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 12, СОК2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 13, і СОЇ -ділянку, що має ЗЕО ІЮО МО: 14.
2. Спосіб за п. 1, в якому біспецифічне антитіло додатково модифікують за допомогою мутацій І 234А, І 235А і РЗ3290, нумерація згідно з ЕЮО-індексу Кебота.
З. Біспецифічне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським МЕС, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, в якому:
І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить у варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 1, СОК2Н-ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 2, і СОК1ТН-ділянку, що має ЗЕО ІО МО: 3, і у варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 4, СОКОІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮО МО: 5, і СОКТІ - ділянку, що має БЕО ІЮО МО: 6; і ІЇ) зазначений другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з АМО-2, містить в варіабельному домені важкого ланцюга СОКЗН-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 9, СОК2Н-ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 10, ії СОК1Н-ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 11, і у варіабельному домені легкого ланцюга СОКЗІ -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 12, СОК2І -ділянку, що має 5ЕО ІЮ МО: 13, і СОКІТ ділянку, що має ЗЕО ІЮ МО: 14, і де І) біспецифічне антитіло містить константну ділянку важкого ланцюга людського підкласу Ідс1, що містить мутації І253А, НЗ1ОА і Н435А, нумерація згідно з ЕО-індексу Кебота.
4. Біспецифічне антитіло, за п. З, в якому: І) зазначений перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з МЕСЕ, містить як варіабельний домен важкого ланцюга МН амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 7 і в як варіабельний домен легкого ланцюга Мі. амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 8 і ІЇ) зазначений другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з АМО-2, містить як варіабельний домен важкого ланцюга МН амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15 ї як варіабельний домен легкого ланцюга Мі. амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 16.
5. Біспецифічне антитіло за п. 3, в якому константна ділянка важкого ланцюга Ідс1-підкласу додатково містить мутації І 234А, І 235А і РЗ29С, нумерація згідно ЄЮ-індексу Кебота.
6. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за одним з пп. 3-5.
7. Біспецифічне антитіло за одним з пп. 3-5, для застосування для лікування судинних захворювань очей.
8. Біспецифічне антитіло для застосування за п. 7, де антитіло застосовують за допомогою інтравітреального введення.
9. Нуклеїнова кислота, що кодує біспецифічне антитіло за одним з пп. 3-5.
10. Експресійний вектор, що містить зазначену нуклеїнову кислоту за п. 9, який має здатність експресувати зазначену нуклеїнову кислоту в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазятїні.
11. Прокаріотична або еукаріотична клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 10.
12. Спосіб отримання біспецифічного антитіла за одним з пп. 3-5, що включає 10 стадій, на яких: а) трансформують клітину-хазяїна векторами, що містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують вказане антитіло; б) культивують клітину-хазяїна в умовах, що забезпечують синтез зазначеної молекули антитіла; і в) виділяють зазначену молекулу антитіла із зазначеної культури.
13. Біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським УЕСЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, яке відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25, ЗЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮО МО: 27 і ЗЕО ІЮ МО: 28.
14. Біспецифічне двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським УЕСЕ, і другий антигензв'язуючий центр, який специфічно зв'язується з людським АМО-2, яке відрізняється тим, що містить амінокислотні послідовності ЗЕО І МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 22, 5ЕО ІО МО: 23 ії БЕО І МО: 24.
15. Біспецифічне антитіло за п. 13 або 14 для застосування для лікування судинних очних захворювань.
16. Біспецифічне антитіло для застосування за п. 15, де антитіло застосовують за допомогою інтравітреального введення.
Ічтравітреальна ін'єкція - триваляй Час нанівжиття У сюлоподіоному тілі т- й - Ко з се соб Мет ж свой «БЕ г В о -- й екон. ОМ ща ; Мо сних плути. ВМВОНОВЯ І Мо шина не нн шо ще крововилив усклоподібне ШЕ ЕНН НН У 53 о тло ше 000» 55 пен Бе а С а як ! шо в ОО до судинна мережа спи І ьо о КЗ їх БК ою и о м Ще : сш ЕН Ше це 5 щш ші 011111111зюмальна В по ша о жи В кровоносна. да
; о. ЗМО ек Я - -щк р ШО НВ ИЙ ях Б в є в с с ИЙ рес Ця хоріоїдальна судинна. бе Її Й , БИ мережа
Фіг. 1 ! В'язкість при 150 мг/мл ! і : Й Я Н : й Н ОВ яфдд юн Твою Щ | м -ще УБОБанд?- 0015 І СН : ГААдУмутаціїу Е бід осонні ненні же осноро 077 УБОБалюб 0016: Її У : . хе ї : : СКААА-МутТац): : : 400 шт птититиТКЯ дя тет ен нітрит т ди дусжр ин Тчкм ТИ Ті і : ій 15 20 25 за 35 10 ; : температура С)
Фіг. 2
Температура агрегації за даними ПІ. 5-аналізу : : й : ГЕС НА : і Б м СААЛА-мутицї) : ОТ аа пд МБО ЙМапро-00Ї6 ; 8 5 рр рев ні кузні сновок Кк ння (КААА-мутації) й ніс сннавнк в ЕІ вн ет жені ї 30 45 5 5 5О 65 70 і температура4("Є)
Фіг. З і Результати ВЕЄ аналізу нісля зберігання висококонцентрованого ! нрепарату протягом: 7 днів при 40С ї
: А. : ше | : Н х й В ме ГГ. А : Я де : в !
і. 1 : ДАК : ши шк І сотня жна о ще з м - зо ШИ о Ї Ох шин ощ 58 пе шо де 000 ше ї ше БЕ ко Аж о Ше я ! і : 7 ож ' Е од о зменшення основного жіку : і : и рабільшення НИМ Я ! я сзбільнісяня СМ :
Фіг. 4 ву що в. долити д ШИ ! - | й ! ше Не : по і 2 цу ше ши ни ! : їх СКК пен тот ль Р Ан нн НН ная НИК и -5 о то 2по Зоо 400 500 00 час (0- вихідний рівень)
Фіг. ЗА ку
Во. шк
90. рт й 40, А 2 ; он нн нн 0 1е-7 2е-7 Зе-7 де-7 Бе-7 концентрація М
Фіг. 56 но пити 10 Н Е і Е і
ОБ. г КЕ те і 4 304 г Її кої ! пен пон нн нн нн нн ЯКІ р в нн роко полон прі 00 о. 108 200 300 400 бо Боб й час (0 вихільна рівейо) с
Фіг. 56
І пинншиилилшлшл шли типо пове пріо попе ви то в. Бо 49- ко в. 5 є « ж | Е -10 па Ге їв? ее? Й зе 4е-ї Бе концецтрація.
Фіг. 5Г Ві
03.
м
М. 8033 8034
:
А. 053 І; Ме 0 015 02 025 0 0:35 концентрація.
Фіг. 5Д во Е-Я ун -к т-- автизіло до Від Е БЕ. і антитіло до Піх юя Е ти | х ---- МЕОКапоа-одт5-005 к й пеннкн МЕКапцл Орів об Бе ч лу ж Е о СИ ж Є ве Я - х та "я в хо в. Он і х в й же щ Шо : : лине кни их нин пн в ни -4о: 5 зга 235 заз «аз 293 222 789 ов то час (0 - іммобілізапія, зихідний рівень) з
Фіг. 6 інкубація інкубація: інкубація інкубація 1кпри кт, г пря КТ, іїспри КТ, 1 при КТ. ЗОбоб/хи ЗО0об/ха: З00авхв З0бовхк І: --Я З Но х З , ЗК - «А Кк я г р у жк пря З пет, Хе : у Ес нив відмиокА у й увідМиВКа мивка Х ох що ділмидки п ше | ху ОЩ; їх | арки ще не з пе ще Зобмки й | Задмкл. / ще 7 фраки ок Зйбмкл и - І: Ж сіті бинт й ото й ен В МАТЛаУвОВУМ. «МОРГ Андах НВО МАтеаАврІи М: акеиліло до КС» 4531. ВИРОБ І Бала Ови) РОЮ
Фіг. ТА т ї Ех м КОТСЕНІ З ЄОБИЕ 8 12,0 ни в ня ЗК КО нанні вин сн нн сн нн ни Е ОК ше ОЇ: г во ТЕО рот
В. ОЕМ ОБО х т їж 50 Яна шт наве НИ п ЕВ те М феунеттттямня их ви в п а ни ШЕ о ее п ! ее не о нини с пи о дн нд ння й СО ро БОБ ще ще ло ЗО АЕС рин ПЕНЯ о ши сонне НН НИК МИ ИВЕ НИ а НИ т їх ах 8 г 96 165 Кк час в У БОТтаве2-9015 (без ААА-мутаній) 9 УЕОГапе2- 0016 (З АА А смутаціями)
Фіг. 76 ше пісня ся во Арт - кн п п аа Ек ОБ ше т 7 «17 иа ен ів рев Сл і. і г во ЕТО ДЦ рення ши: ші шо ше й ОЯЕЕЧО ОО ГОСЕНУ х ке "ть РОриГЕе ТТ МОЯ Но Мк ми и РОовО ОБПЕБЗ ВІН 5 го ї пт г Ж вт де 1бХ с время в УБОЕапе2-0015 (без ЛА А-мутацій) а УЕСтапр2-0НЬ (з ААА-мутаціями)
Фіг. 7В я кни нн кни нн п в НЕ В щ : Кенаийї : в БО нив оя ання Едді дінки НАМИ оту сі іежмтетчтнтя Не І - : я : я 4 Кран ех ех ння кн ПК в : о ' ЕЕ С --- а | -- ШЕ БЕН с х С - : БЕ с : ення ' ше пер і лівий ої 0 правий 000 лівий с вравий 96 г : Ібв г: : Еінтравітр, йувкутрішньовенно
Фіг. 7Г
СЯ : о : 8 Е ож нн нн нн нн нн в. '
2. ї БЕ Щодо Бе В З кон не вин ЕЕ І1 Іі іже нічні ЕО я В я ї- : Е : Есе зла 0 пет и и МОН ЕК валася ЗОНИ ооо ви оно Бен и а. зо нівий 50 правий 0 лівий 000 правий З ї об 168 г ' швтравітр. фівнутрішньовенно
Фіг. 7Д
UAA201501008A 2012-07-13 2013-07-11 Спосіб зниження в'язкості біспецифічного антитіла до vegf/ang-2 та застосування такого антитіла для лікування судинних очних захворювань UA120029C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12176299 2012-07-13
PCT/EP2013/064672 WO2014009465A1 (en) 2012-07-13 2013-07-11 Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120029C2 true UA120029C2 (uk) 2019-09-25

Family

ID=48783248

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201501008A UA120029C2 (uk) 2012-07-13 2013-07-11 Спосіб зниження в'язкості біспецифічного антитіла до vegf/ang-2 та застосування такого антитіла для лікування судинних очних захворювань

Country Status (40)

Country Link
US (4) US9695233B2 (uk)
EP (2) EP2872534B1 (uk)
JP (5) JP6154900B2 (uk)
KR (1) KR101774121B1 (uk)
CN (1) CN104428315B (uk)
AR (2) AR092027A1 (uk)
AU (1) AU2013288641B2 (uk)
CA (1) CA2874554C (uk)
CL (2) CL2015000061A1 (uk)
CO (1) CO7151542A2 (uk)
CR (1) CR20140542A (uk)
CY (1) CY1124681T1 (uk)
DK (2) DK2872534T3 (uk)
EA (1) EA032192B1 (uk)
ES (2) ES2896493T3 (uk)
FI (1) FIC20230011I1 (uk)
FR (1) FR23C1010I2 (uk)
HK (1) HK1206365A1 (uk)
HR (2) HRP20211641T1 (uk)
HU (2) HUE056217T2 (uk)
IL (1) IL236292B (uk)
IN (1) IN2014DN11157A (uk)
LT (3) LT2872534T (uk)
MA (1) MA37794B1 (uk)
MX (1) MX361337B (uk)
MY (1) MY183712A (uk)
NL (1) NL301218I2 (uk)
NO (1) NO2023009I1 (uk)
NZ (1) NZ702201A (uk)
PE (1) PE20150361A1 (uk)
PH (1) PH12014502713B1 (uk)
PL (2) PL3495387T3 (uk)
PT (1) PT2872534T (uk)
RS (2) RS62509B1 (uk)
SG (1) SG11201408538PA (uk)
SI (2) SI3495387T1 (uk)
TW (1) TWI506036B (uk)
UA (1) UA120029C2 (uk)
WO (1) WO2014009465A1 (uk)
ZA (1) ZA201408969B (uk)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2004697A2 (en) 2006-04-07 2008-12-24 The Procter & Gamble Company Antibodies that bind human protein tyrosine phosphatase beta (hptpbeta) and uses thereof
US8133979B2 (en) * 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
PE20141537A1 (es) 2011-09-23 2014-11-17 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dll4) y usos de los mismos
RU2624128C2 (ru) 2012-02-15 2017-06-30 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Аффинная хроматография с применением fc-рецепторов
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
SG11201502876RA (en) 2012-11-08 2015-06-29 Eleven Biotherapeutics Inc Il-6 antagonists and uses thereof
US20150050277A1 (en) 2013-03-15 2015-02-19 Aerpio Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating ocular diseases
ES2746136T3 (es) 2013-04-29 2020-03-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos modificados de unión a FcRn humano y procedimientos de uso
JP6568521B2 (ja) * 2013-12-13 2019-08-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多価多重特異性分子の生物学的活性を決定するためのｓｐｒベースの架橋アッセイ
KR20160104636A (ko) 2014-01-15 2016-09-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 단백질 Ａ-결합이 개선된 Ｆｃ-영역 변이체
CN106456614A (zh) 2014-03-14 2017-02-22 爱尔皮奥治疗有限公司 HPTP‑β抑制剂
EP3125937A4 (en) * 2014-04-04 2017-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gastric cancer
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
JP6738316B2 (ja) * 2014-07-17 2020-08-12 ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ 粘度を低下させるためのｔｒｅｍ−１抗体の部位特異的変異誘発
ES2808153T3 (es) 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
MX2017005148A (es) * 2014-11-06 2017-08-08 Hoffmann La Roche Variantes de region fc con union del receptor fc neonatal (fcrn) modificado y metodos de uso.
MX2017005150A (es) * 2014-11-06 2017-08-08 Hoffmann La Roche Variantes de region fc con propiedades modificadas de union a receptor neonatal fc (fcrn) y proteina a.
PE20171107A1 (es) 2014-11-07 2017-08-07 Eleven Biotherapeutics Inc Anticuerpos mejorados contra il-6
KR20170080584A (ko) * 2014-11-10 2017-07-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항체 및 안과학에서 이의 사용 방법
JP6787888B2 (ja) 2014-11-10 2020-11-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 抗ｉｌ−１ベータ抗体及び使用方法
CA2963606A1 (en) * 2014-11-10 2016-05-19 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-ang2 antibodies and methods of use
JP6946184B2 (ja) * 2014-11-10 2021-10-06 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 抗ｐｄｇｆ−ｂ抗体及び使用法
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US20160144025A1 (en) * 2014-11-25 2016-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and formulations for treating vascular eye diseases
AR103477A1 (es) * 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2
CN107849126B (zh) * 2015-07-29 2022-04-08 阿勒根公司 仅有重链的抗ang-2抗体
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
US20190352386A1 (en) * 2015-09-14 2019-11-21 Galaxy Biotech, Llc Highly potent monoclonal antibodies to angiogenic factors
EP3353204B1 (en) 2015-09-23 2023-10-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer
RU2763916C2 (ru) 2015-09-23 2022-01-11 Дженентек, Инк. Оптимизированные варианты анти-vegf антител
CN113713101B (zh) 2015-09-23 2023-07-28 视点制药公司 用tie-2的激活剂治疗眼内压的方法
PL3356404T3 (pl) * 2015-10-02 2022-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała anty-pd1 i sposoby ich stosowania
SI3356411T1 (sl) 2015-10-02 2021-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecifična protitelesa, specifična za PD1 in TIM3
EP3368568B1 (en) * 2015-10-29 2022-04-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-variant fc-region antibodies and methods of use
AU2016363668A1 (en) * 2015-11-30 2018-05-24 Pieris Australia Pty Ltd. Novel anti-angiogenic fusion polypeptides
BR112018013407A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-18 Kodiak Sciences Inc anticorpos e conjugados dos mesmos
CN106661117B (zh) * 2015-12-30 2020-11-17 深圳先进技术研究院 IgG杂合型抗TNFα和IL-17A双特异性抗体
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
JP6987424B2 (ja) 2016-05-11 2022-01-05 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
AR108800A1 (es) * 2016-06-17 2018-09-26 Genentech Inc Purificación de anticuerpos multiespecíficos
EP3478717B1 (en) * 2016-07-04 2022-01-05 F. Hoffmann-La Roche AG Novel antibody format
EP3487586A4 (en) 2016-07-20 2020-03-04 Emory University FORMULAS FOR THE SUPRACHOROIDAL SPACE OF AN EYE AND METHOD
MX2019000727A (es) 2016-07-20 2019-05-02 Aerpio Therapeutics Inc Anticuerpos monoclonales humanizados que tienen como blanco ve-ptp (hptp-b).
JP7174691B2 (ja) 2016-08-23 2022-11-17 メディミューン リミテッド 抗ｖｅｇｆ－ａおよび抗ａｎｇ２抗体ならびにそれらの使用
CA3038909A1 (en) * 2016-09-29 2018-04-05 Amgen Inc. Low-viscosity antigen binding proteins and methods of making them
JP6785372B2 (ja) * 2016-09-30 2020-11-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性分子の機能分析のためのｓｐｒに基づく二重結合アッセイ
CN108299557A (zh) * 2017-01-13 2018-07-20 杭州翰思生物医药有限公司 提高IgG类抗体对FcRn的结合亲和力并延长其血清半衰期的方法
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
EP3600441A1 (en) 2017-03-22 2020-02-05 Genentech, Inc. Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
AR111249A1 (es) 2017-03-22 2019-06-19 Genentech Inc Composiciones de anticuerpo optimizadas para el tratamiento de trastornos oculares
BR112019017329A2 (pt) 2017-04-03 2020-04-14 Hoffmann La Roche imunoconjugados, um ou mais polinucleotídeos e vetores, métodos para a produção de um imunoconjugado, tratamento de uma doença e para a estimulação do sistema imunológico, composição, uso do imunoconjugado, invenção e usos da composição
CN116375876A (zh) 2017-04-05 2023-07-04 豪夫迈·罗氏有限公司 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
EP3626745A4 (en) * 2017-09-01 2021-03-17 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. RECOMBINANT BISPECIFIC ANTIBODY
US11945839B2 (en) * 2017-12-22 2024-04-02 Hoffmann-La Roche Inc. Depletion of light chain mispaired antibody variants by hydrophobic interaction chromatography
CN110003328B (zh) * 2018-01-05 2022-04-19 百奥泰生物制药股份有限公司 一种长效低毒的重组抗vegf人源化单克隆抗体及其生产方法
WO2019154776A1 (en) * 2018-02-06 2019-08-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of ophthalmologic diseases
CN110305210B (zh) * 2018-03-27 2023-02-28 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途
EP3560945A1 (en) 2018-04-27 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for purification of polypeptides using polysorbates
US11518819B2 (en) 2018-08-17 2022-12-06 Trican Biotechnology Co., Ltd Anti-angiogenesis fusion protein and uses thereof
WO2020068653A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. MULTISPECIFIC ANTIBODIES THAT TARGET HPTP - β (VE-PTP) AND VEGF
MA54052A (fr) * 2018-10-29 2022-02-09 Hoffmann La Roche Formulation d'anticorps
MX2021007421A (es) 2018-12-21 2021-08-05 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y a interleucina 1 beta (il-1beta) y metodos de uso.
US20220185875A1 (en) * 2019-03-18 2022-06-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2
US11253502B2 (en) 2019-04-29 2022-02-22 EyePoint Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 activators targeting the Schlemm's canal
CN114258403A (zh) 2019-06-19 2022-03-29 豪夫迈·罗氏有限公司 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价多特异性抗体表达细胞的方法
MX2021015538A (es) 2019-06-19 2022-02-10 Hoffmann La Roche Metodo para la generacion de una celula que expresa un anticuerpo biespecifico bivalente mediante la integracion dirigida de multiples casetes de expresion en una organizacion definida.
TW202317613A (zh) * 2019-08-06 2023-05-01 美商建南德克公司 眼科疾病之個人化治療
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
US11179473B2 (en) 2020-02-21 2021-11-23 Silverback Therapeutics, Inc. Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof
CN115605507A (zh) 2020-03-13 2023-01-13 基因泰克公司（Us） 抗白介素-33抗体及其用途
BR112022018847A2 (pt) 2020-03-24 2022-11-22 Genentech Inc Anticorpos, ácido nucleico, célula hospedeira, conjugados, composição farmacêutica, dispositivo de entrega de ação prolongada para entrega ocular, método para tratar um distúrbio e uso do anticorpo
CN115397850A (zh) 2020-03-30 2022-11-25 豪夫迈·罗氏有限公司 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法
AU2021300362A1 (en) 2020-07-01 2023-02-23 ARS Pharmaceuticals, Inc. Anti-ASGR1 antibody conjugates and uses thereof
JP2023533173A (ja) 2020-07-09 2023-08-02 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー タンパク質の濃縮組成物、それらの調製及びそれらの使用
PE20230986A1 (es) 2020-09-04 2023-06-21 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a y ang2, y metodos de uso
WO2022057888A1 (zh) * 2020-09-17 2022-03-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合vegf和ang-2的双特异性抗原结合分子
JP2023545514A (ja) 2020-10-15 2023-10-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療薬の長時間作用型送達のためのバーシカン（ｖｇ１）のヒアルロン酸結合誘導体
WO2022226539A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-27 Immunome, Inc. Methods of administering antibodies against sars-cov-2 spike protein
WO2022253314A1 (zh) 2021-06-04 2022-12-08 信达生物制药(苏州)有限公司 结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子以及其用途
AU2022332896A1 (en) * 2021-08-23 2024-03-28 Avirmax Biopharma Inc. Compositions and methods for transgene expression
CN116265487A (zh) * 2021-12-16 2023-06-20 三优生物医药(上海)有限公司 抗ang2-vegf双特异性抗体及其用途
WO2024065268A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 科兴生物制药股份有限公司 能够识别ang-2的抗体或抗原结合片段和同时识别vegf和ang-2的双抗

Family Cites Families (318)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4490473A (en) 1983-03-28 1984-12-25 Panab Labeled antibodies and methods
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4752601A (en) 1983-08-12 1988-06-21 Immunetech Pharmaceuticals Method of blocking immune complex binding to immunoglobulin FC receptors
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5985599A (en) 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5576184A (en) 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
EP0359096B1 (en) 1988-09-15 1997-11-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibodies having modified carbohydrate content and methods of preparation and use
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5364930A (en) 1990-10-16 1994-11-15 Northwestern University Synthetic C1q peptide fragments
US5419904A (en) 1990-11-05 1995-05-30 The Regents Of The University Of California Human B-lymphoblastoid cell line secreting anti-ganglioside antibody
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE4137512A1 (de) 1991-11-15 1993-05-19 Henkel Kgaa Heisssiegelbeschichtung auf dispersionsbasis
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
ATE295420T1 (de) 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
CA2124592A1 (en) 1992-09-28 1994-04-14 Karel Grohmann Fermentation of cellulose and hemicellulose in corn fiber and distillers dried grains with solubles to ethanol
BR9207175A (pt) 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5412468A (en) 1993-03-09 1995-05-02 The Perkin-Elmer Corporation Grouping of spectral bands for data acquisition in a spectrophotometer
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5747035A (en) 1995-04-14 1998-05-05 Genentech, Inc. Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5730977A (en) 1995-08-21 1998-03-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Anti-VEGF human monoclonal antibody
WO1997010354A1 (en) 1995-09-11 1997-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ANTIBODY AGAINTS α-CHAIN OF HUMAN INTERLEUKIN 5 RECEPTOR
DE19533718A1 (de) 1995-09-12 1997-03-13 Basf Ag Verfahren zur Hydrierung von aromatischen Verbindungen, in denen mindestens eine Aminogruppe an einen aromatischen Kern gebunden ist
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
WO1998002462A1 (en) 1996-07-16 1998-01-22 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP0942992B1 (en) 1997-01-31 2007-03-07 Genentech, Inc. O-fucosyltransferase
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6323321B1 (en) 1997-03-05 2001-11-27 Eberhard-Karls-Universitat Tubingen Universitatsklinikum Antibody 97A6
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
ES2361267T3 (es) 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.
EP0915987A2 (en) 1997-04-21 1999-05-19 Donlar Corporation POLY-($g(a)-L-ASPARTIC ACID), POLY-($g(a)-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
DE19721700C1 (de) 1997-05-23 1998-11-19 Deutsches Krebsforsch Mutierter OKT3-Antikörper
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US20040191256A1 (en) 1997-06-24 2004-09-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6172213B1 (en) 1997-07-02 2001-01-09 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
DK1049787T3 (da) 1998-01-23 2005-04-04 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofderivater med flere anvendelsesmuligheder
CA2320403A1 (en) 1998-02-25 1999-09-02 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
WO2000035956A1 (fr) 1998-12-16 2000-06-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps monoclonal anti-vegf humain
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6676927B1 (en) 1999-01-20 2004-01-13 The Rockefeller University Animal model and methods for its use in the selection of cytotoxic antibodies
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
WO2000053634A1 (fr) 1999-03-10 2000-09-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fv monocatenaire induisant l'apoptose
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
ECSP992970A (es) 1999-06-01 2000-01-27 Secuencia del gen relacionado con angiopoyetino scarface 3
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
IL149116A0 (en) 1999-10-29 2002-11-10 Genentech Inc Anti-prostate stem cell antigen (psca) antibody compositions and methods of use
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
CA2401491C (en) 2000-03-03 2011-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ccr4-binding antibody and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US7416726B2 (en) 2000-04-13 2008-08-26 The Rockefeller University Enhancement of antibody-mediated immune responses
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
US7598055B2 (en) 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US20060034830A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GalGlcNAcMan5GLcNAc2 glycoform
US20060034828A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform
US20060029604A1 (en) 2000-06-28 2006-02-09 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
US20060024304A1 (en) 2000-06-28 2006-02-02 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GlcNAc2 glycoform
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
EP2354149B1 (en) 2000-12-12 2017-08-30 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2002250293B2 (en) 2001-03-09 2007-10-11 Arnason, Barry G. Mr Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity FCGammaReceptors
ES2364816T3 (es) 2001-04-02 2011-09-14 Genentech, Inc. Terapia de combinación.
UA83791C2 (uk) 2001-04-13 2008-08-26 Байоджен Айдек Ма Инк. Антитіло проти vla-1, фармацевтична композиція, що його містить, та їх застосування для лікування індивідуума з імунологічним розладом, опосередкованим vla-1
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
GB0118662D0 (en) 2001-07-31 2001-09-19 Univ Southampton Binding agents
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
EP1427829A4 (en) 2001-08-31 2005-10-12 Abmaxis Inc MULTIVALENT PROTEIN CONJUGATE WITH SEVERAL LIGANDEN BINDING RECORDORDOMAS
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20060024292A1 (en) 2001-12-27 2006-02-02 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
US20060034829A1 (en) 2001-12-27 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a MAN3GLCNAC2 glycoform
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
EP1490677A4 (en) 2002-02-27 2006-01-18 California Inst Of Techn COMPUTER METHOD FOR DESIGNING ENZYMES FOR THE INCORPORATION OF AMINO ACID ANALOGUES INTO PROTEINS
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20080206242A1 (en) 2002-03-01 2008-08-28 Xencor, Inc. Method of treatment of th2-mediated conditions using optimized anti-cd30 antibodies
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US20070148171A1 (en) 2002-09-27 2007-06-28 Xencor, Inc. Optimized anti-CD30 antibodies
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US20080152649A1 (en) 2002-03-01 2008-06-26 Xencor, Inc. Optimized igf-1r antibodies and methods of using the same
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
WO2005056606A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004004798A2 (en) 2002-07-03 2004-01-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
JP2006500009A (ja) 2002-07-09 2006-01-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
CA2492447A1 (en) 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
ES2562177T3 (es) 2002-09-27 2016-03-02 Xencor Inc. Variantes de Fc optimizadas y métodos para su generación
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7365168B2 (en) 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2502904C (en) 2002-10-15 2013-05-28 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1944320A1 (en) 2002-12-16 2008-07-16 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US7608260B2 (en) 2003-01-06 2009-10-27 Medimmune, Llc Stabilized immunoglobulins
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
RS20181002A1 (sr) 2003-05-30 2018-12-31 Genentech Inc Tretman sa anti-vegf antitelima
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
CN100518817C (zh) * 2003-07-04 2009-07-29 南加州大学 恢复造血功能的治疗剂和组合物及其用途
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2536408A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
CA2534959A1 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
SG143252A1 (en) 2003-10-09 2008-06-27 Ambrx Inc Polymer derivatives
WO2005037867A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
PL1692182T3 (pl) 2003-11-05 2010-09-30 Roche Glycart Ag Przeciwciała CD20 o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej
SG149815A1 (en) 2003-11-06 2009-02-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
EP2275448A3 (en) 2003-12-19 2013-02-06 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
WO2005062916A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Centocor, Inc. Methods for generating multimeric molecules
EP3476861A1 (en) 2004-01-07 2019-05-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof
WO2005067980A2 (en) 2004-01-12 2005-07-28 Pointilliste, Inc. Design of therapeutics and therapeutics
US7118999B2 (en) 2004-01-16 2006-10-10 International Business Machines Corporation Method and apparatus to increase strain effect in a transistor channel
EP1706428B1 (en) 2004-01-22 2009-09-23 MERCK PATENT GmbH Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
NZ586034A (en) 2004-02-02 2011-10-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
US20050276806A1 (en) 2004-06-15 2005-12-15 Advanced Biotherapy, Inc. Treatment of autism
US20060009360A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Robert Pifer New adjuvant composition
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
ES2426817T3 (es) 2004-08-04 2013-10-25 Mentrik Biotech, Llc Regiones Fc variantes
US20060067930A1 (en) 2004-08-19 2006-03-30 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
DK1797127T3 (en) 2004-09-24 2017-10-02 Amgen Inc Modified Fc molecules
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
EP2325207B1 (en) 2004-11-12 2017-03-15 Xencor, Inc. FC variants with altered binding to FCRN
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CN101098890B (zh) 2004-11-12 2012-07-18 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
US20070135620A1 (en) 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
NZ556029A (en) 2004-12-21 2010-04-30 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US20060275282A1 (en) 2005-01-12 2006-12-07 Xencor, Inc. Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
WO2006093794A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
JP4743388B2 (ja) 2005-03-18 2011-08-10 栗田工業株式会社 フォトレジスト含有排水の処理方法
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
AU2006239851B2 (en) 2005-04-26 2011-06-16 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
WO2007008943A2 (en) 2005-07-08 2007-01-18 Xencor, Inc. Optimized anti-ep-cam antibodies
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US7956160B2 (en) 2005-07-22 2011-06-07 Amgen Inc. Concentrated protein lyophilates, methods, and uses
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
WO2007033216A2 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods and compositions for the treatment and diagnosis of diseases characterized by vascular leak, hypotension, or a procoagulant state
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2633211A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Astrazeneca Ab Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or flt1 antagonist for treating cancer
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
AR059432A1 (es) 2006-02-10 2008-04-09 Genentech Inc Anticuerpos anti-fgf19 y metodos que usan estos
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
DK2121751T3 (en) 2006-12-08 2017-04-24 Lexicon Pharmaceuticals Inc Monoclonal antibodies to ANGPTL3
MX2009006779A (es) 2006-12-19 2009-08-27 Genentech Inc Antagonistas especificos para terapia con adyuvantes y neo-adyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana.
KR101578940B1 (ko) 2007-01-24 2015-12-18 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 이펙터 활성이 증강된 유전자 재조합 항체 조성물
US10259860B2 (en) 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
WO2008149147A2 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
EA200901494A1 (ru) 2007-06-06 2010-06-30 Домантис Лимитед Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
US20110077383A1 (en) 2007-07-03 2011-03-31 Medimmune, Llc Hinge domain engineering
MX2010001637A (es) 2007-08-17 2010-03-15 Hoffmann La Roche Mediacion de citotoxicidad de celulas que evidencian la expresion superficial de cd9.
CN101842116A (zh) 2007-08-28 2010-09-22 比奥根艾迪克Ma公司 结合igf-1r多个表位的组合物
AU2008305851B2 (en) 2007-09-28 2014-12-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
PL2565206T3 (pl) 2007-10-30 2017-08-31 Genentech, Inc. Oczyszczanie przeciwciał za pomocą chromatografii kationowymiennej
CA2706419A1 (en) 2007-11-30 2009-06-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs binding il-13
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US9266967B2 (en) * 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE024903T2 (en) 2007-12-26 2016-02-29 Xencor Inc FC variants with modified binding to FCRN
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
US8507656B2 (en) 2008-01-28 2013-08-13 Medimmune Limited Stabilized angiopoietin-2 antibodies and uses thereof
KR101666229B1 (ko) 2008-02-08 2016-10-14 메디뮨 엘엘씨 Ｆｃ 리간드 친화성이 감소된 항-ＩＦＮＡＲ１ 항체
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
US8293714B2 (en) 2008-05-05 2012-10-23 Covx Technology Ireland, Ltd. Anti-angiogenic compounds
WO2009142460A2 (en) 2008-05-23 2009-11-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Antibody-peptide fused synergibody
ES2669591T3 (es) * 2008-06-20 2018-05-28 Novartis Ag Inmunoglobulinas con agregación reducida
HUE032894T2 (hu) 2008-06-25 2017-11-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit VEGF-gátló, stabilis és oldható antitestek
WO2010027981A1 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
CN114835812A (zh) 2008-12-09 2022-08-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
EP2443150B1 (en) 2009-06-17 2015-01-21 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
UY32920A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis
EP2539367A2 (en) 2010-02-23 2013-01-02 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-angiogenesis therapy for the treatment of ovarian cancer
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
WO2011139718A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Genentech, Inc. Compositions and methods useful for reducing the viscosity of protein-containing formulations
US8377337B2 (en) 2010-05-04 2013-02-19 Sabic Innovative Plastics Ip B.V. Method of incorporating an additive into a polyamide-poly(arylene ether) composition, composition prepared thereby, and article comprising the composition
CN102191209A (zh) * 2010-08-26 2011-09-21 苏州大学 VEGF165和Ang-1双基因共表达载体及其应用
MX336740B (es) 2011-03-29 2016-01-29 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CN102250247B (zh) 2011-06-15 2013-06-19 常州亚当生物技术有限公司 一种抗vegf/ang2双特异性抗体及其应用
CN102250248A (zh) 2011-06-15 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗vegf/ang2双特异性抗体及其应用
CN102453577A (zh) 2011-09-21 2012-05-16 李国庆 一种新型煤泥复合燃料及其制备方法
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
WO2013181452A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-l1 axis binding antagonists and vegf antagonists
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti

Also Published As

Publication number Publication date
NL301218I2 (nl) 2023-04-04
IL236292A0 (en) 2015-02-26
CA2874554A1 (en) 2014-01-16
JP2017140038A (ja) 2017-08-17
PH12014502713A1 (en) 2015-02-02
NZ702201A (en) 2018-01-26
MA37794A1 (fr) 2016-03-31
RS62509B1 (sr) 2021-11-30
LTPA2023507I1 (uk) 2023-03-10
RS57704B1 (sr) 2018-12-31
JP2021036888A (ja) 2021-03-11
EP2872534B1 (en) 2018-08-08
EP3495387B1 (en) 2021-09-01
JP6796184B2 (ja) 2020-12-02
SI2872534T1 (sl) 2018-11-30
ES2896493T3 (es) 2022-02-24
PE20150361A1 (es) 2015-03-14
NO2023009I1 (no) 2023-02-14
EP2872534A1 (en) 2015-05-20
PL3495387T3 (pl) 2022-01-10
KR20150023688A (ko) 2015-03-05
FIC20230011I1 (fi) 2023-02-13
WO2014009465A1 (en) 2014-01-16
IL236292B (en) 2020-06-30
FR23C1010I2 (fr) 2024-04-05
JP2020062036A (ja) 2020-04-23
US9695233B2 (en) 2017-07-04
CN104428315A (zh) 2015-03-18
CR20140542A (es) 2015-02-12
ES2690312T3 (es) 2018-11-20
US20230212277A1 (en) 2023-07-06
HK1206365A1 (en) 2016-01-08
JP6462750B2 (ja) 2019-01-30
SI3495387T1 (sl) 2021-12-31
JP2015527064A (ja) 2015-09-17
MA37794B1 (fr) 2017-07-31
AU2013288641A1 (en) 2014-12-11
NL301218I1 (uk) 2023-02-15
CA2874554C (en) 2019-12-03
EA201500132A1 (ru) 2015-08-31
US20140017244A1 (en) 2014-01-16
ZA201408969B (en) 2019-04-24
LT2872534T (lt) 2018-10-25
DK2872534T3 (en) 2018-10-22
PT2872534T (pt) 2018-10-26
EA032192B1 (ru) 2019-04-30
TW201406782A (zh) 2014-02-16
US20210095013A1 (en) 2021-04-01
MY183712A (en) 2021-03-09
HRP20211641T1 (hr) 2022-02-04
CN104428315B (zh) 2017-09-29
PL2872534T3 (pl) 2018-12-31
US10683345B2 (en) 2020-06-16
FR23C1010I1 (fr) 2023-04-14
MX2014015518A (es) 2015-06-23
JP2019062905A (ja) 2019-04-25
SG11201408538PA (en) 2015-02-27
CO7151542A2 (es) 2014-12-29
AR092027A1 (es) 2015-03-18
JP6640319B2 (ja) 2020-02-05
HRP20181595T1 (hr) 2018-12-14
DK3495387T3 (da) 2021-11-08
JP7280859B2 (ja) 2023-05-24
EP3495387A1 (en) 2019-06-12
JP6154900B2 (ja) 2017-06-28
CL2015000061A1 (es) 2015-05-08
TWI506036B (zh) 2015-11-01
PH12014502713B1 (en) 2015-02-02
LT3495387T (lt) 2021-11-25
KR101774121B1 (ko) 2017-09-01
AR124240A2 (es) 2023-03-01
IN2014DN11157A (uk) 2015-10-02
HUE056217T2 (hu) 2022-02-28
CY1124681T1 (el) 2022-07-22
AU2013288641B2 (en) 2017-07-06
US20170260265A1 (en) 2017-09-14
CL2017002146A1 (es) 2018-04-13
HUS2300008I1 (hu) 2023-02-28
MX361337B (es) 2018-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120029C2 (uk) Спосіб зниження в'язкості біспецифічного антитіла до vegf/ang-2 та застосування такого антитіла для лікування судинних очних захворювань
TWI647239B (zh) 抗－ｐｄｇｆｒ－貝他抗體及其用途
CA2850824C (en) Treatment of ocular disease
UA124734C2 (uk) Антитіло проти с5 і його застосування
UA125432C2 (uk) Оптимізовані варіанти анти-vegf антитіл
KR20190138636A (ko) 안구 장애의 치료를 위한 최적화된 항체 조성물
KR102608028B1 (ko) 인간 원형질막 소포 관련 단백질 pv-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도
CA2966365A1 (en) Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
UA122673C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв'язується з людським il-6
CN105164158A (zh) 消除对FcRn-结合的抗-IGF-1R抗体及其在血管性眼病治疗中的用途
CA2665956A1 (en) Combination treatment for ocular diseases
US20220033520A1 (en) Modified antibody fcs and methods of use
CA2967070C (en) Method of treating or preventing stroke
US20130149237A1 (en) Delivery system for diagnostic and therapeutic agents
CN110520439B (zh) 抗分泌粒蛋白iii(scg3)抗体及其用途
RU2782355C2 (ru) Оптимизированные композиции антител для лечения заболеваний глаз