TWI506036B - 雙特異性抗-vegf/抗-ang-2抗體及其治療眼部血管疾病之用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於抗人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)且抗人類血管生成素-2(ANG-2)之雙特異性抗體、其產生方法、含有該等抗體之醫藥組合物及其用途。
血管生成參與包括實體腫瘤、眼內新生血管症候群(例如增生性視網膜病變或年齡相關性黃斑退化(AMD))、類風濕性關節炎及牛皮蘚之各種病症之發病機制(Folkman,J.等人,J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934;Klagsbrun,M.等人,Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239;及Garner,A.,Vascular diseases,於:Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.及Klintworth,G.K.(編輯),第二版,Marcel Dekker,New York(1994),第1625頁至第1710頁)。
蘭尼單抗(Ranibizumab,商標名Lucentis®)係源自與貝伐珠單抗(bevacizumab,Avastin)相同之親代鼠類抗體之單株抗體片段。然而,其已經親和力成熟以提供與VEGF-A之更強結合(WO 98/45331)。已知VEGF-A阻斷可與一些全身性毒性有關,因而蘭尼單抗(ranibizumab)缺少減少血清半衰期且從而全身性毒性之Fc部分。其係已經批准治療「濕性」型之年齡相關性黃斑退化(ARMD,即年齡相關性視覺喪失之常見形式)之抗血管生成劑。
角膜血管生成分析已顯示,ANG-1及ANG-2二者具有類似效應,與VEGF協同作用以促進新血管之生長。Asahara,T.等人,Circ.Res.83(1998)233-40。在活體外在高濃度下ANG-2亦可係促血管生成之觀測結果得出存在劑量依賴性內皮反應之可能性(Kim,I.等人,Oncogene 19(2000)4549-52)。在高濃度下,在藉助經由PI-3激酶及Akt途徑激活Tie2來達成之血清剝奪凋亡期間ANG-2用作內皮細胞之凋亡存活因子(Kim,I.等人,Oncogene 19(2000)4549-52)。
WO 2010/040508 A9及WO 2011/117329係關於雙特異性抗-VEGF/抗-ANG-2抗體。WO 2008/132568係關於結合至生長因子之融合蛋白。WO 2009/136352係關於抗血管生成化合物。WO 2009/080253及WO 2011/117330係關於雙特異性二價抗體格式。WO 2010/069532係關於Ang2抗體。
諸如年齡相關性黃斑退化(ARMD)及糖尿病視網膜病變(DR)等眼部血管疾病係分別歸因於異常脈絡膜或視網膜新血管生成.其係工業化國家中視覺喪失之主要原因。由於視網膜係由良好界定之神經元、神經膠及血管元素之層組成,故相對較小干擾(例如血管增生或水腫中所見之彼等)可導致視覺功能之顯著喪失。遺傳性視網膜退化(例如色素性視網膜炎(RP))亦與血管異常(例如小動脈狹窄及血管萎縮)相關。其影響多達3500個個體中有1個,且特徵為進行性夜盲、視野缺損、視神經萎縮、小動脈衰減及常進展為全盲之中心視覺喪失。
局部缺血性視網膜病變之特徵為導致血流減少及缺氧之視網膜脈管系統之喪失或功能障礙。視網膜藉由產生生長新血管之信號來響應缺氧,但該等新血管通常較脆弱且紊亂。對視覺造成大部分威脅的係該等異常新血管之生長,此乃因其可洩漏、出血或導致可以視網膜脫落結束之結瘢。局部缺血性視網膜病變之目前治療試圖停止病理性血管之生長,但不解決驅使其生長之潛在局部缺血。此外,糖尿病視
網膜病變(即影響數百萬人之局部缺血性視網膜病變)之標準治療涉及利用雷射破壞一部分視網膜力圖終止新血管生長並保護中心視覺。已採用策略來阻斷血管內皮生長因子(VEGF,即血管生長之主要促進劑)之功能。就短期而言,抗-VEGF療法可改善視覺,但其不解決潛在局部缺血且事實上可加劇此病狀,此乃因其抑制所有血管生長,包括有益側枝循環。亦存在該等藥物在之全身性暴露之嚴重問題,在老年及/或糖尿病患者中在局部缺血性腦、心臟或肢體中可需要新血管生長。
通常對於經由玻璃體內施加之眼部疾病而言,經常使用如Fab或Fab(2)等較小抗體片段,此乃因其具有低血清半衰期且全身性毒性之風險較低。然而,此較小片段通常亦具有較低玻璃體內半衰期(例如,由於較快速擴散至血清中)且通常必須更頻繁給藥。
Kim等人,Molecular Vision,15(2009)2803-2812係關於在眼內經玻璃體內投與之全長抗體,其中在野生型小鼠中將具有FcRn結合之IgG排除至血液中,而未將不具有FcRn結合之IgY排除至血液系統中。此外,在FcRn敲低-小鼠中未將具有FcRn結合之IgG排除至血液系統。
業內需要治療及預防各種眼部血管疾病(例如局部缺血性視網膜病變)之較好方式。
本發明之一態樣係降低抗體之黏度之方法,其中該抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,其中該方法包含利用突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)修飾人類IgG1或人類IgG4亞類之抗體重鏈恆定區。
在本發明之一實施例中,該方法之特徵在於,該抗體係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-
2之第二抗原結合位點的雙特異性抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L區,且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
在本發明之一實施例中,該方法之特徵在於,上文所闡述之該雙特異性抗體包含人類IgG1亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)且進一步包含突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
本發明之一實施例係藉由該方法獲得之抗體。
本發明之一實施例係使用突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)用於降低抗體之黏度之用途,其中該抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區。
在本發明之一實施例中,該用途之特徵在於,該抗體係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構
域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L區,且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
在本發明之一實施例中,該具體使用之特徵在於,該雙特異性抗體包含人類IgG1亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)且進一步包含突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
本發明進一步係關於包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L
區,且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
在一實施例中,該雙特異性抗體之特徵在於i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列作為重鏈可變結構域VH且包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列作為輕鏈可變結構域VL,且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列作為重鏈可變結構域VH且包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列作為輕鏈可變結構域VL。
在一實施例中,該雙特異性抗體之特徵在於,iii)下之重鏈恆定區屬於人類IgG1亞類。在一實施例中,IgG1亞類之該雙特異性抗體之特徵在於,IgG1亞類之重鏈恆定區進一步包含突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
在一實施例中,該雙特異性抗體之特徵在於,iii)下之重鏈恆定區屬於人類IgG4亞類。在一實施例中,IgG4亞類之該雙特異性抗體之特徵在於,IgG4亞類之重鏈恆定區進一步包含突變S228P及L235E(根據Kabat之EU索引編號)。在一實施例中,IgG4亞類之該雙特異性抗體之特徵在於,IgG4亞類之重鏈恆定區進一步包含突變S228P、L235E及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
本發明之再其它態樣係包含該雙特異性抗體之醫藥組合物、用於治療眼部血管疾病之該醫藥組合物、該雙特異性抗體用於製造用以治療眼部血管疾病之醫藥的用途、藉由向需要該治療之患者投與該雙特異性抗體來治療罹患眼部血管疾病之患者的方法。在一實施例中,
該雙特異性抗體或包含該雙特異性抗體之醫藥組合物係經由玻璃體內施加來投與。
本發明之又一態樣係編碼本發明之雙特異性抗體之重鏈及/或輕鏈之核酸分子。
本發明進一步提供含有本發明之該核酸且能夠在原核或真核宿主細胞中表現該核酸之表現載體,及含有該等載體用於本發明之雙特異性抗體之重組產生之宿主細胞。
本發明進一步包含包含本發明之載體之原核或真核宿主細胞。
本發明進一步包含產生本發明之雙特異性抗體之方法,其特徵為在原核或真核宿主細胞中表現本發明之核酸並自回收該雙特異性抗體自該細胞或細胞培養上清液。一實施例係製備本發明之雙特異性抗體之方法,其包含以下步驟:a)利用包含編碼該抗體之核酸分子之載體轉形宿主細胞;b)在允許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞;及c)自該培養物回收該抗體分子。
本發明進一步包含藉由用於產生雙特異性抗體之該方法獲得之抗體。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其特徵在於包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其特徵在於包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28之胺基酸序列。
本發明之抗體因其在Fc部分/恆定區中為罹患眼部血管疾病之患
者帶來益處之具體修飾而具有極具價值之性質。其在玻璃體內環境中顯示高穩定性並自眼睛緩慢擴散(與不具有重鏈恆定區之較小抗體片段相比),實際疾病係位於眼睛中並在眼睛中治療(故與非IgG類抗體(例如,Fab及(Fab)2片段)相比,可潛在改良治療時間表)。令人驚奇地,與未經修飾之IgG抗體相比,在玻璃體內施加在恆定區中具有突變I253A、H310A及H435A之抗體(不具有更多FcRn結合)之後在眼睛中之半衰期係類似的(僅稍有減少)(表17a及18a及圖7D及7E),而自眼睛擴散至血液血清中係類似的(表15及圖7B)。此極具價值,此乃因自眼睛排除VEGF及Ang2(例如經由以抗-ANG2/ANG2抗體複合體或抗-VEGF/VEGF抗體複合體形式轉運至血液血清中)對於治療與ANG2及/或VEGF有關之眼部血管疾病係合意的。當與相比未經修飾之IgG抗體相比時,本發明之抗體另一方面自血清極快速地清除(此對於減少由全身性暴露引起之潛在副效應係極合意的)。
令人驚奇地,其亦顯示較低黏度(參見圖2)(與在恆定區中不具有突變I253A、H310A及H435A之形式相比),且從而尤其可用於在眼睛疾病治療期間藉助細針進行玻璃體內施加(對於該施加通常使用細針且高黏度使得適當施加相當困難)。較低黏度亦允許較高濃度調配物。
亦令人驚奇地,本發明之抗體在儲存期間顯示較低聚集傾向(圖4)(與在Fc部分中不具有突變I253A、H310A及H435A之形式相比),此對於在眼睛中玻璃體內施加甚為關鍵(此乃因在該治療期間在眼睛中聚集可導致併發症)。本發明之雙特異性抗體在血管疾病抑制方面顯示良好效力。
在某些實施例中,本發明之雙特異性抗體因其在恆定區中之具體修飾(例如,P329G LALA)而顯示有價值之性質,如無結合Fcγ受體,此降低如血栓形成及/或不期望細胞死亡(例如歸因於ADCC)等副
效應之風險。
圖1
具有AAA突變(突變I253A、H310A及H435A--根據Kabat之EU索引編號)之<VEGF-ANG-2>IgG1或IgG4抗體之概念及優勢之圖解
圖2
以150mg/mL存於200mM精胺酸/琥珀酸鹽(pH 5.5)中之小規模基於DLS之黏度量測外推黏度(本發明之<VEGF-ANG-2>抗體VEGFAng2-0016(具有AAA突變)與參照VEGFAng2-0015(不具有該等AAA突變)之比較)
圖3
在20mM His、140mM NaCl(pH 6.0 5)下取決於溫度(包括DLS聚集起始溫度)之DLS聚集(本發明之<VEGF-ANG-2>抗體VEGFAng2-0016(具有AAA突變)與參照VEGFAng2-0015(不具有該等AAA突變)之比較)
圖4
在40℃及100mg/ml下儲存7天(主峰減小且高分子量/HMW峰增加)(本發明<VEGF-ANG-2>抗體VEGFAng2-0016(具有AAA突變,顯示較低聚集)與參照VEGFAng2-0015(不具有該等AAA突變)之比較)
圖5A及B
A:VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)及B:VEGFAng2-0016(具有AAA突變)之FcRn穩態親和力
圖6
不具有AAA突變之VEGFAng2-0015及具有AAA突變之VEGFAng2-0016之FcγRIIIa相互作用之量測(二者皆為具有P329G LALA突變之IgG1亞類;使用IgG1亞類之抗-Dig及基於IgG4之抗體作為對照)
圖7A
測定<VEGF/Ang2>雙特異性抗體在血清及全眼溶解物中之濃度之Pk-ELISA分析之原理示意圖
圖7B
靜脈內施加後之血清濃度:化合物VEGFAng2-0015(不具
有AAA突變)與VEGFAng2-0016(具有AAA突變)之比較
圖7C
玻璃體內施加後之血清濃度:化合物VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)與VEGFAng2-0016(具有AAA突變)之比較
圖7D
VEGFAng2-0016(具有AAA突變)在右眼及左眼中之眼睛溶解物濃度(在僅玻璃體內施加至右眼中後,與靜脈內施加相比):在玻璃體內施加後可僅在右眼中檢測到顯著濃度。在靜脈內施加後,因VEGFAng2-0016(具有AAA突變)之短血清半衰期,在眼睛溶解物中無法檢測到濃度
圖7E
VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)在右眼及左眼中之眼睛溶解物濃度(在僅玻璃體內施加至右眼中後,與靜脈內施加相比):在右眼中(且在一定程度上在左眼中)在玻璃體內施加後可檢測到VEGFAng2-0015之濃度。此指示自右眼擴散至血清中並自血清擴散至左眼,此可藉由VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)之長半衰期來解釋。在靜脈內施加後,因血清穩定性VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)擴散至眼睛中,亦可在兩個眼睛之眼睛溶解物中檢測到顯著濃度
在本發明之一實施例中,本發明之雙特異性抗體係二價的。
在本發明之一態樣中,本發明之該雙特異性二價抗體之特徵在於包含a)特異性結合至VEGF之第一全長抗體之重鏈及輕鏈;b)特異性結合至ANG-2之第二全長抗體之經修飾重鏈及經修飾輕鏈,其中恆定結構域CL及CH1係經彼此替代。
特異性結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)之雙特異性抗體之此雙特異性二價抗體格式係闡述於WO 2009/080253中(包括經凸起至孔洞中(Knobs-into-Holes)修飾之CH3結
構域)。基於此雙特異性二價抗體格式之抗體係命名為CrossMab。
在一實施例中,該雙特異性二價抗體之特徵在於包含a)SEQ ID NO:25之胺基酸序列作為第一全長抗體之重鏈及SEQ ID NO:27之胺基酸序列作為第一全長抗體之輕鏈,及b)SEQ ID NO:26之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾重鏈及SEQ ID NO:28之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾輕鏈。
在一實施例中,該雙特異性二價抗體之特徵在於包含a)SEQ ID NO:21之胺基酸序列作為第一全長抗體之重鏈及SEQ ID NO:23之胺基酸序列作為第一全長抗體之輕鏈,及b)SEQ ID NO:22之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾重鏈及SEQ ID NO:24之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾輕鏈。
在一實施例中,該雙特異性二價抗體之特徵在於包含a)SEQ ID NO:29之胺基酸序列作為第一全長抗體之重鏈及SEQ ID NO:31之胺基酸序列作為第一全長抗體之輕鏈,及b)SEQ ID NO:30之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾重鏈及SEQ ID NO:32之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾輕鏈。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其其特徵在於包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28之胺基酸序列。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其其特徵在於包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特
異性二價抗體,其其特徵在於包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:32之胺基酸序列。
在本發明之另一態樣中,本發明之雙特異性抗體之特徵在於包含a)特異性結合至VEGF之第一全長抗體之重鏈及輕鏈;b)特異性結合至ANG-2之第二全長抗體之重鏈及輕鏈,其中重鏈之N端係經由肽連接體鏈接至輕鏈之C端。
特異性結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管生成素-2(ANG-2)之此雙特異性抗體之此雙特異性二價抗體格式係闡述於WO 2011/117330中,包括經凸起至孔洞中修飾之CH3結構域。基於此雙特異性二價抗體格式之抗體係命名為OAscFab。
在一實施例中,該雙特異性二價抗體之特徵在於包含a)SEQ ID NO:33之胺基酸序列作為第一全長抗體之重鏈及SEQ ID NO:35之胺基酸序列作為第一全長抗體之輕鏈,及
b)SEQ ID NO:34之胺基酸序列作為經由肽連接體鏈接至第二全長抗體之輕鏈之第二全長抗體之重鏈。
在一實施例中,該雙特異性二價抗體之特徵在於包含a)SEQ ID NO:36之胺基酸序列作為第一全長抗體之重鏈及SEQ ID NO:38之胺基酸序列作為第一全長抗體之輕鏈,及b)SEQ ID NO:37之胺基酸序列作為經由肽連接體鏈接至第二全長抗體之輕鏈之第二全長抗體之重鏈。
在一實施例中,藉由在以下為止之間引入二硫鍵對第二全長抗體之重鏈及輕鏈之抗體重鏈可變結構域(VH)及抗體輕鏈可變結構域(VL)進行二硫鍵穩定:重鏈可變結構域44位至輕鏈可變結構域100位(總是根據Kabat之EU索引編號(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,
National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。藉由在第二全長抗體重鏈及輕鏈之可變結構域VH與VL之間引入二硫鍵來達成該進一步二硫鍵穩定。引入非天然雙硫橋用於穩定之技術係闡述於(例如)WO 94/029350、Rajagopal,V.等人,Prot.Engin.10(1997)1453-59;Kobayashi等人,Nuclear Medicine & Biology 25(1998)387-393;或Schmidt,M.等人,Oncogene 18(1999)1711-1721中。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其特徵在於包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35之胺基酸序列。
因此,本發明之一實施例係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性二價抗體,其特徵在於包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
在一實施例中,藉由「凸起至孔洞中」技術改變本發明之雙特異性二價抗體之CH3結構域,該技術係利用若干實例詳細闡述於(例如)WO 96/027011、Ridgway J.B.等人,Protein Eng 9(1996)617-621;及Merchant,A.M.等人,Nat Biotechnol 16(1998)677-681中。在此方法中,改變兩個CH3結構域之相互作用表面以增加兩個含有該兩個CH3結構域之重鏈之異源二聚化。兩個CH3結構域(兩個重鏈)中之每一者可為「凸起」,而另一者為「孔洞」。雙硫橋之引入穩定異源二聚體(Merchant,A.M等人,Nature Biotech 16(1998)677-681;Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)並增加產量。
在本發明之較佳態樣中,本發明之所有雙特異性抗體之特徵在於一重鏈之CH3結構域及另一重鏈之CH3結構域各自於界面處相
遇,該界面包含介於抗體CH3結構域之間之原始界面;其中改變該界面以促進雙特異性抗體之形成,其中該改變之特徵在於:a)改變一重鏈之CH3結構域,以使得在雙特異性抗體內在一重鏈之CH3結構域之原始界面內與另一重鏈之CH3結構域之原始界面相遇,用具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代胺基酸殘基,從而於一重鏈之CH3結構域之界面內生成隆凸,該隆凸可定位於另一重鏈之CH3結構域之界面內之腔中,且b)改變另一重鏈之CH3結構域,以使得在雙特異性抗體內在第二CH3結構域之原始界面內與第一CH3結構域之原始界面相遇,用具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代胺基酸殘基,從而在第二CH3結構域之界面內生成腔,第一CH3結構域之界面內之隆凸可定位於該腔內。
因此,本發明之抗體之特徵較佳在於a)之全長抗體之重鏈之CH3結構域及b)之全長抗體之重鏈之CH3結構域各自於界面處相遇,該界面包含介於抗體CH3結構域之間之原始界面中之改變;其中i)在一重鏈之CH3結構域中用具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代胺基酸殘基,從而於一重鏈之CH3結構域之界面內生成隆凸,該隆凸可定位於另一重鏈之CH3結構域之界面內之腔中,且其中ii)在另一重鏈之CH3結構域中
用具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代胺基酸殘基,從而在第二CH3結構域之界面內生成腔,第一CH3結構域之界面內之隆凸可定位於該腔內。
較佳地,具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)組成之群。
較佳地,具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈氨酸(V)組成之群。
在本發明之一態樣中,藉由引入半胱胺酸(C)作為每一CH3結構域之相應位置中之胺基酸來進一步改變兩個CH3結構域,以使得可形成介於兩個CH3結構域之間之雙硫橋。
在一實施例中,該雙特異性抗體包含於「凸起鏈」之CH3結構域中之T366W突變及於「孔洞鏈」之CH3結構域中之T366S、L368A、Y407V突變。亦可藉由(例如)將Y349C突變引入「凸起鏈」之CH3結構域中並將E356C突變或S354C突變引入「孔洞鏈」之CH3結構域中來使用介於CH3結構域之間之額外鏈間雙硫橋(Merchant,A.M等人,Nature Biotech 16(1998)677-681)。
在另一實施例中,本發明之雙特異性抗體包含於兩個CH3結構域中之一者中之Y349C、T366W突變及於兩個CH3結構域中之另一者中之E356C、T366S、L368A、Y407V突變。在另一較佳實施例中,該雙特異性抗體包含於兩個CH3結構域中之一者中之Y349C、T366W突變及於兩個CH3結構域中之另一者中之S354C、T366S、L368A、Y407V突變(一CH3結構域中之額外Y349C突變及另一CH3結構域中之額外E356C或S354C突變形成鏈間雙硫橋)(綜述根據Kabat之EU索引編號(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。而且可或者或另外使用由EP 1 870 459 A1闡述之其它凸
起於孔洞中技術。因此,該雙特異性抗體之另一實例係於「凸起鏈」之CH3結構域中之R409D;K370E突變及於「孔洞鏈」之CH3結構域中之D399K;E357K突變(綜述根據Kabat之EU索引編號(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
在另一實施例中,該雙特異性抗體包含於「凸起鏈」之CH3結構域中之T366W突變及於「孔洞鏈」之CH3結構域中之T366S、L368A、Y407V突變且另外於「凸起鏈」之CH3結構域中之R409D;K370E突變及於「孔洞鏈」之CH3結構域中之D399K;E357K突變。
在另一實施例中,該雙特異性抗體包含於兩個CH3結構域中之一者中之Y349C、T366W突變及於兩個CH3結構域中之另一者中之S354C、T366S、L368A、Y407V突變,或該三價、雙特異性抗體包含於兩個CH3結構域中之一者中之Y349C、T366W突變及於兩個CH3結構域中之另一者中之S354C、T366S、L368A、Y407V突變且另外於「凸起鏈」之CH3結構域中之R409D;K370E突變及於「孔洞鏈」之CH3結構域中之D399K;E357K突變。
在本發明之一實施例中,本發明之雙特異性抗體之特徵在於具有一或多個以下性質(在如實例6中所闡述之分析中所測定)- 與不具有iii)下所闡述突變之相應雙特異性抗體相比,顯示較低血清濃度(於小鼠中玻璃體內施加後96小時,該等小鼠為FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn之半合子轉基因小鼠);- 與不具有下iii)所闡述突變之相應雙特異性抗體相比,在整個右眼溶解物中顯示類似(因子0.8至1.2)濃度(在小鼠中,該等小鼠為FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn之半合子轉基因小鼠,於右眼中玻璃體內施加後96小時)。
在一實施例中,該雙特異性二價抗體係特徵在於包含
特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於i)該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO:7作為重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO:8作為輕鏈可變結構域(VL);且ii)該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO:15作為重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO:16作為輕鏈可變結構域(VL);且iii)該雙特異性抗體包含IgG1或IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)
且具有一或多個以下性質(在如實例6中所闡述之分析中所測定)- 與不具有iii)下所闡述突變之相應雙特異性抗體相比,顯示較低血清濃度(於小鼠中玻璃體內施加後96小時,該等小鼠為FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn之半合子轉基因小鼠);- 與不具有下iii)所闡述突變之相應雙特異性抗體相比,在整個右眼溶解物中顯示類似(因子0.8至1.2)濃度(在小鼠中,該等小鼠為FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn之半合子轉基因小鼠,於右眼中玻璃體內施加後96小時)。
在一實施例中,該雙特異性抗體之特徵在於包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於i)該第一抗原結合位點包含具有1個、2個或3個胺基酸殘基取代之SEQ ID NO:7作為重鏈可變結構域(VH)及具有1個、2個或3個胺基酸殘基取代之SEQ ID NO:8作為輕鏈可變結構域(VL);且ii)該第二抗原結合位點包含具有1個、2個或3個胺基酸殘基取代之SEQ ID NO:15作為重鏈可變結構域(VH)及具有1個、2個或3個胺基酸殘基取代之SEQ ID NO:作為輕鏈可變結構域(VL);且
iii)該雙特異性抗體包含IgG1或IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)
且具有一或多個以下性質(在如實例6中所闡述之分析中所測定)- 與不具有iii)下所闡述突變之相應雙特異性抗體相比,顯示較低血清濃度(於小鼠中玻璃體內施加後96小時,該等小鼠為FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn之半合子轉基因小鼠);- 與不具有下iii)所闡述突變之相應雙特異性抗體相比,在整個右眼溶解物中顯示類似(因子0.8至1.2)濃度(在小鼠中,該等小鼠為FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn之半合子轉基因小鼠,於右眼中玻璃體內施加後96小時)。
本文所使用「抗體」係指包含抗原結合位點之結合蛋白。本文所使用術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示配體所實際結合之抗體分子區域。術語「抗原結合位點」包含抗體重鏈可變結構域(VH)及抗體輕鏈可變結構域(VL)(VH/VL之對)。
抗體特異性係指抗體對抗原之特定表位之選擇性識別。例如,天然抗體為單特異性的。
本發明之「雙特異性抗體」係具有兩個不同抗原結合特異性之抗體。本發明之抗體對兩個不同抗原(即作為第一抗原之VEGF及作為第二抗原之ANG-2)具有特異性。
本文所使用術語「單特異性」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體,其每一者結合至同一抗原之相同表位。
本申請案內所使用之術語「價」表示抗體分子中存在指定數量之結合位點。由此,術語「二價」、「四價」及「六價」表示抗體分子中分別存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。本發明之雙特異性抗體較佳為「二價」。
本文所使用術語「VEGF」係指人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)、165-胺基酸人類血管內皮細胞生長因子(人類VEGF165:SEQ ID NO:17之前體序列之胺基酸27至191;胺基酸1至26代表信號肽)及相關121、189及206血管內皮細胞生長因子同種型,如Leung,D.W.等人,Science 246(1989)1306-9;Houck等人,Mol.Endocrin.5(1991)1806-1814;Keck,P.J.等人,Science 246(1989)1309-12及Connolly,D.T.等人,J.Biol.Chem.264(1989)20017-24所闡述;以及彼等生長因子之天然存在之對偶基因形式及經加工形式。VEGF參與調節與腫瘤及眼內病症相關之正常及異常血管生成及新血管生成(Ferrara,N.等人,Endocr.Rev.18(1997)4-25;Berkman,R.A.等人,J.Clin.Invest.91(1993)153-159;Brown,L.F.等人,人類Pathol.26(1995)86-91;Brown,L.F.等人,Cancer Res.53(1993)4727-4735;Mattern,J.等人,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934;及Dvorak,H.F.等人,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF係已自若干來源分離之同二聚糖蛋白且包括若干同種型。VEGF顯示內皮細胞之高度特異性之細胞分裂活性。
本文所使用術語「ANG-2」係指人類血管生成素-2(ANG-2)(或者簡寫為ANGPT2或ANG2)(SEQ ID NO:18),其係闡述於(例如)Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60及Cheung,A.H.等人,Genomics 48(1998)389-91中。發現血管生成素-1(SEQ ID NO:19)及-2為Tie之配體,該等Tie係於血管內皮內選擇性表現之酪胺酸激酶家族(Yancopoulos,G.D.等人,Nature 407(2000)242-48)。現已確定血管生成素家族有四個成員。血管生成素-3及-4(Ang-3及Ang-4)可代表相同基因座在小鼠及人類中顯著分叉之對應物(Kim,I.等人,FEBS Let,443(1999)353-56;Kim,I.等人,J Biol Chem 274(1999)26523-28)。ANG-1及ANG-2最初在組織培養實驗中分別識別為激動劑
及拮抗劑(關於ANG-1參見:Davis,S.等人,Cell 87(1996)1161-69;且關於ANG-2參見:Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。所有已知血管生成素主要結合至Tie2(SEQ ID NO:20),且Ang-1及-2二者以3nM(Kd)之親和力結合至Tie2(Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。
本發明之雙特異性抗體之抗原結合位點含有6個互在不同程度上有助於結合位點對抗原之親和力之補決定區(CDR)。存在3個重鏈可變結構域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及3個輕鏈可變結構域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。藉由與胺基酸序列之編譯數據庫比較來確定CDR及框架區(FR)之範圍,在該編譯數據庫中根據序列間之可變性界定彼等區域。
本發明之抗體包含源自一或多個免疫球蛋白類別之人類來源之免疫球蛋白恆定區,其中該等免疫球蛋白類別包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE類別且在IgG及IgA之情形下其亞類、尤其IgG1及IgG4。
本文所使用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具有單一胺基酸組成之抗體分子製品。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變區(即,結合區)及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部分的單株抗體,其通常藉由重組DNA技術來製備。含有鼠類可變區及人類恆定區之嵌合抗體較佳。本發明所涵蓋之「嵌合抗體」之其它較佳形式係其中恆定區已自原始抗體之恆定區經修飾或改變以產生本發明之性質、尤其在Clq結合及/或Fc受體(FcR)結合方面之彼等。該等嵌合抗體亦稱為「類別轉換之抗體」。嵌合抗體為經表現之免疫球蛋白基因(其包含編碼鼠類免疫球蛋白可變區之DNA片段及編碼人類免疫球蛋白恆定區之DNA片段)之產物。產生嵌合抗體之方法包括習用重組DNA及基因轉染技術,其為業內所熟知。例如參見Morrison,s.L.等人,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238及US 5,204,244。
術語「人類化抗體」係指其中框架或「互補決定區」(CDR)已經修飾包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性之免疫球蛋白之CDR的抗體。在較佳實施例中,將鼠類動物CDR移植至人類抗體之框架區中以製備「人類化抗體」。例如參見Riechmann,L.等人,Nature 332(1988)323至327;及Neuberger,M.S.等人,Nature 314(1985)268至270。尤佳CDR對應於識別嵌合抗體之上述抗原之彼等代表序列。本發明所涵蓋之「人類化抗體」之其它形式係其中恆定區已另外自原始抗體之恆定區經修飾或改變以產生本發明之性質、尤其在Clq結合及/或Fc受體(FcR)結合方面之彼等。
本文所使用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖細胞係免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體為當前技術領域所熟知(van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。亦可在轉基因動物(例如小鼠)中產生人類抗體,該等轉基因動物在免疫後能夠在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生完整人類抗體譜或人類抗體精選物。該等生殖細胞系突變小鼠中之人類生殖細胞系免疫球蛋白基因陣列之轉移將導致在抗原攻擊後產生人類抗體(例如參見Jakobovits,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等人,Nature 362(1993)255-258;Brueggemann,M.等人,Year Immunol.7(1993)33-40)。亦可在噬菌體展示文庫中產生人類抗體(Hoogenboom,H.R.及Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole,A.等人及Boerner,P.等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole,A.等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Liss,A.L.,p.77(1985);及Boerner,P.等人,J.Immunol.
147(1991)86-95)。如已針對本發明之嵌合及人類化抗體所提及,本文所使用之術語「人類抗體」亦包含在恆定區中已經修飾以產生本發明之性質、尤其在Clq結合及/或FcR結合方面之該等抗體,例如其係藉由「類別轉換」、即Fc部分之變化或突變(例如,自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變)達成。
本文所使用之術語「重組人類抗體」意欲包括所有可藉由重組方式製備、表現、產生或分離之人類抗體,例如分離自諸如NS0或CHO細胞等宿主細胞或分離自人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)的抗體、或使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體。該等重組抗體以重排形式具有可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已經受活體內體細胞超突變。因此,重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係雖然源自人類生殖細胞系VH及VL序列且與之相關但非天然存在於活體內人類抗體生殖細胞系譜中之序列。
本文所使用「可變區」(輕鏈之可變區(VL)、重鏈之可變區(VH))表示每一對直接參與抗體與抗原結合之輕鏈及重鏈。可變人類輕鏈及重鏈之結構域具有相同之通用結構,且每一結構域包含四個序列高度保守之框架(FR)區,該等FR區藉由三個「超變區」(或互補決定區,CDR)鏈接。架構區採用β-折板構象,且CDR可形成鏈接β-折板結構之環。每一鏈中之CDR係藉由框架區來保持其三維結構,並與另一鏈中之CDR一起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈之CDR3區在本發明抗體之結合特異性/親和力方面發揮特別重要之作用,且藉此提供本發明之又一目的。
本文所使用之術語「超變區」或「抗體之抗原結合部分」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區係除本文所定義之超變區殘基以外之彼等可變結構域區。因此,抗體之輕鏈及重鏈自N-
端至C-端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。每一鏈上之CDR係藉由該等框架胺基酸分開。尤其,重鏈之CDR3係對抗原結合貢獻最大之區域。CDR及FR區係根據Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之標準定義來確定。
上文所使用術語「結合」或「特異性結合」係指在活體外分析中、較佳在利用經純化野生型抗原之電漿子共振分析(BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中抗體與抗原(人類VEGF或人類ANG-2)之表位之結合。結合親和力係藉由術語ka(與抗體/抗原複合物中之抗體締合之速率常數)、kD
(解離常數)及KD
(kD
/ka)來定義。在一實施例中,結合或特異性結合意指10-8
mol/l或更少、在一實施例中10-9
M至10-13
mol/l之結合親和力(KD
)。
術語「表位」包括能夠特異性結合至抗體之任何多肽決定簇。在某些實施例中,表位決定簇包括分子之化學活性表面基群,例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基,且在某些實施例中可具有特異性之三維結構特徵及/或特異性電荷特徵。表位係抗原中由抗體結合之區域。
在某些實施例中,當抗體在蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中優先識別其標靶抗原時,稱其特異性結合抗原。
術語「全長抗體」表示由兩個「全長抗體重鏈」及兩個「全長抗體輕鏈」組成之抗體。「全長抗體重鏈」係沿N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體重鏈恆定結構域1(CH1)、抗體鉸鏈區(HR)、抗體重鏈恆定結構域2(CH2)及抗體重鏈恆定結構域3(CH3),簡寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3;及在亞類IgE之抗體之情形下視情況抗體重鏈恆定結構域4(CH4)組成之多肽。較佳地,「全長抗體重鏈」
係沿N-端至C-端方向由VH、CH1、HR、CH2及CH3組成之多肽。「全長抗體輕鏈」係沿N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結構域(VL)及抗體輕鏈恆定結構域(CL)組成之多肽,簡寫為VL-CL。抗體輕鏈恆定結構域(CL)可為κ(卡帕,kappa)或λ(蘭布達,lambda)。兩個全長抗體鏈係經由介於CL結構域與CH1結構域之間以及介於全長抗體重鏈之鉸鏈區之間之多肽間二硫鍵連接在一起。典型全長抗體之實例係天然抗體,如IgG(例如,IgG1及IgG2)、IgM、IgA、IgD及IgE。本發明之全長抗體可來自單一物種,例如人類,或其可係嵌合化或人類化抗體。本發明之全長抗體包含兩個各自藉由一對VH及VL形成之抗原結合位點,其二者皆特異性結合至同一抗原。該全長抗體之重鏈或輕鏈之C-端表示該重鏈或輕鏈之C-端之最後一個胺基酸。該全長抗體之重鏈或輕鏈之N端表示該重鏈或輕鏈之N-端之最後一個胺基酸。
本發明內所使用之術語「肽連接體」表示具有較佳為合成來源之胺基酸序列之肽。本發明之該等肽係用於經由肽連接體將第二全長抗體(其特異性結合至第二抗原)之輕鏈之C-端鏈接至重鏈之N-端。第二全長抗體重鏈及輕鏈內之肽連接體係具有長度為至少30個胺基酸、較佳地長度為32個至50個胺基酸之胺基酸序列之肽。在一實施例中,肽連接體係具有長度為32個至40個胺基酸之胺基酸序列之肽。在一實施例中,該連接體係(GxS)n,其中G=甘胺酸,S=絲胺酸,(x=3,n=8、9或10且m=0、1、2或3)或(x=4且n=6、7或8且m=0、1、2或3),較佳地,其中x=4,n=6或7且m=0、1、2或3,更佳地,其中x=4,n=7且m=2。在一實施例中,該連接體係(G4
S)6
G2
。
本申請案內所使用之術語「恆定區」表示抗體中除可變區以外之結構域之總和。恆定區不直接參與抗原結合,但呈現各種效應子功能。視其重鏈之恆定區之胺基酸序列而定,將抗體分成以下類別:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且該等中之若干類可進一步分成亞類,
例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。與不同類別之抗體相對應之重鏈恆定區係分別稱為α、δ、ε、γ及μ。可在所有5種抗體類別中發現之輕鏈恆定區係稱為κ(卡帕)及λ(蘭布達)。
本申請案中所使用之術語「源自人類來源之恆定區」或「人類恆定區」表示亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之重鏈恆定區及/或輕鏈κ或λ恆定區。該等恆定區為當前技術領域所熟知,例如由Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)所闡述(例如亦參見Johnson,G.及Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218;Kabat,E.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。在本申請案內為對位置及突變編號,使用根據Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之EU編號系統(EU索引),並將其稱為「根據Kabat之EU索引編號」。
在一實施例中,本發明之雙特異性抗體具有人類IgG1亞類(源自人類IgG1亞類)之恆定區。
在一實施例中,本發明之雙特異性抗體具有人類IgG4亞類(源自人類IgG1亞類)之恆定區。
在一實施例中,本發明之雙特異性抗體屬於具有突變L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)及P329G(Pro329Gly)之人類IgG1亞類。該抗體具有降低之FcR結合(尤其,其顯示不再結合至FcRγI、FcRγII及FcRγIII)。此尤其可用於降低副效應,如例如,血栓形成(Meyer,T.等人,J.Thromb.Haemost.7(2009)171-81)。在一實施例中,本發明之雙特異性抗體屬於具有突變S228P(Ser228Pro)、L235E
(Leu235Glu)及P329G(Pro329Gly)之人類IgG4亞類。該抗體顯示降低之FcR結合,如上文所指示。儘管已闡述之Pro329Ala突變僅去除三分之二之FcγRIIIa夾心相互作用,但本發明抗體中之Pro329Gly完全賦予Fc部分至FcγRIII之結合。此尤其有用,此乃因至FcγRIII之結合參與導致細胞死亡之ADCC(抗體依賴性細胞毒性),ADCC可有助於治療癌症疾病,但可在其它血管或免疫疾病之基於抗體之治療中引起嚴重副效應。故本發明之具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1亞類及具有突變S228P、L235E及P329G之IgG4亞類之抗體尤其有用,此乃因其皆顯示不再結合至FcRγI、FcRγII及FcRγIII。
本文中所使用之術語「具有(該等)突變AAA」係指在IgG1或IgG4之重鏈恆定區中之突變I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)及H435A(His435Ala),其中編號係根據Kabat之EU索引進行。
本文中所使用之術語「具有(該等)突變P329G LALA」係指在IgG1亞類之重鏈恆定區中之突變L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)及P329G(Pro329Gly),其中編號係根據Kabat之EU索引進行。本文中所使用之術語「具有(該等)突變SPLE」係指IgG4亞類之重鏈恆定區之S228P(Ser228Pro)及L235E(Leu235Glu),其中編號係根據Kabat之EU索引進行。本文中所使用之術語「具有(該等)突變SPLE及P239G」係指IgG4亞類之重鏈恆定區之S228P(Ser228Pro)、L235E(Leu235Glu)及P329G(Pro329Gly),其中編號係根據Kabat之EU索引進行。
本發明之抗體係藉由重組方式來產生。因此,本發明之一態樣係編碼本發明之抗體之核酸,且又一態樣係包含編碼本發明之抗體之該核酸之細胞。重組產生之方法為當前技術領域所廣泛習知,且包含於原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後分離該抗體及通常純化至醫藥上可接受之純度。為在宿主細胞中表現前述抗體,藉由標準方法將
編碼各別經修飾輕鏈及重鏈之核酸插入至表現載體中。在適當原核或真核宿主細胞(如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞)中實施表現,且自該等細胞(上清液或溶解後之細胞)回收抗體。重組產生抗體之一般方法為當前技術領域所熟知並闡述於(例如)Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880之綜述文章中。
因此,本發明之一實施例係製備本發明之雙特異性抗體之方法,且包含以下步驟:a)利用包含編碼該抗體之核酸分子之載體轉形宿主細胞;b)在允許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞;及c)自該培養物回收該抗體分子。
在一實施例中,c下之回收步驟包括使用輕鏈恆定結構域特異性捕獲試劑(例如其對κ或λ恆定輕鏈具有特異性,此取決於在本發明之雙特異性抗體中使用κ或λ輕鏈)。在一實施例中,以結合及溶析模式使用此輕鏈特異性捕獲試劑。該等輕鏈恆定結構域特異性捕獲試劑之實例係(例如)來自GE Healthcare/BAC之kappaSelectTM
及λ FabSelectTM
,其係基於允許大規模高流速及低背壓之極具剛性之基於瓊脂糖之基質。其展示分別結合至κ或λ輕鏈之恆定區之配體之特徵(即,將不結合缺乏輕鏈之恆定區之片段;圖1)。二者因此皆能夠結合含有輕鏈之恆定區之其它標靶分子,例如IgG、IgA及IgM。經由長親水間隔臂將配體附接至基質,以使得易於結合至標靶分子。其係基於針對人類Ig κ或λ所篩選之單鏈抗體片段。
藉由習用免疫球蛋白純化程序適宜地將雙特異性抗體與培養基分離,例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透
析或親和層析法。容易地分離編碼單株抗體之DNA及RNA並使用習用程序進行測序。融合瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。分離後,可將DNA插入表現載體中,然後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中,以在宿主細胞中合成重組單株抗體。
藉由將適當核苷酸變化引入抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製備雙特異性抗體之胺基酸序列變體(或突變體)。然而,僅可在極有限範圍內實施該等修飾。例如,該等修飾不改變上文所提及之抗體特徵,例如IgG亞類及抗原結合,但可改良重組產生產量、蛋白質穩定性或有助於純化。
本申請案中所使用之術語「宿主細胞」表示可經改造以生成本發明之抗體之任何種類之細胞系統。在一實施例中,HEK293細胞及CHO細胞係用作宿主細胞。本文所使用之表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用,且所有該等名稱皆包括其子代。因此,詞語「轉形體」及「轉形細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物,而不考慮轉移次數。亦應瞭解,所有子代之DNA含量可能由於特意的或無意的突變而不精確地相同。包括與最初轉形細胞中所篩選者具有相同功能或生物活性之變體子代。
於NS0細胞中之表現係由(例如)Barnes,L.M.等人,Cytotechnology 32(2000)109-123;Barnes,L.M.等人,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270所闡述。短暫表現係由(例如)Durocher,Y.等人,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9所闡述。可變結構域之選殖係由Orlandi,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837;Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289;及Norderhaug,L.等人,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87所闡述。較佳短暫表現系統(HEK 293)係由Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.,in
Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger,E.-J.,in J.Immunol.Methods 194(1996)191-199所闡述。
例如,適宜於原核生物之控制序列包括啟動子、(視情況)操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、增強子及聚腺苷酸化信號。
當使核酸與另一核酸序列具有功能關係時,該核酸係「經可操作連接」。例如,若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白,則該DNA與多肽之DNA係可操作連接;若啟動子或增強子可影響編碼序列之轉錄,則該啟動子或增強子與該編碼序列係可操作連接;或若核糖體結合位點係經定位以有助於轉譯,則該核糖體結合位點與該編碼序列係可操作連接。一般而言,「可操作連接」意指所連接之DNA序列係鄰接序列,且在分泌前導序列之情形下係鄰接序列且在讀碼框中。然而,增強子無需鄰接。藉由在便捷之限制位點處接合來完成連接。若該等限制位點不存在,則依照習用實踐使用合成性寡核苷酸銜接子或連接體。
藉由標準技術(包括鹼性/SDS治療、CsCl分級、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及其它業內熟知技術)實施抗體之純化,以排除細胞組份或其它污染物,例如其它細胞核酸或蛋白質。參見Ausubel,F.等人編輯,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。不同方法已充分確定且廣泛用於蛋白質純化,例如利用微生物蛋白質之親和層析法(例如蛋白質A或蛋白質G親和層析法)、離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、喜硫吸附(例如利用β-巰基乙醇及其它SH配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析法(例如利用苯基-瓊脂糖凝膠、氮雜-親芳烴(arenophilic)樹脂、或間-胺基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析法(例如利用Ni(II)-及Cu(II)-親和性
材料)、粒徑排阻層析法及電泳方法(例如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本發明之雙特異性二價抗體顯示對需要VEGF及ANG-2靶向療法之人類患者之益處。
本發明之抗人類VEGF及人類ANG-2之二價雙特異性可具有有價值之效力/安全特性且可為需要抗-VEGF及抗-ANG-2療法之患者提供益處。
本發明之一態樣係包含本發明之抗體之醫藥組合物。本發明之另一態樣係使用本發明之抗體用於製造醫藥組合物之用途。本發明之又一態樣係製造包含本發明之抗體之醫藥組合物之方法。在另一態樣中,本發明提供含有本發明之與醫藥載劑調配在一起之抗體之組合物、例如醫藥組合物。
本文所使用之「醫藥載劑」包括任何及所有生理上兼容之溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。較佳地,該載劑係適宜於經由局部途徑向受試者投與之投與。例如,可藉由眼內施加、例如藉由眼內注射(例如玻璃體內注射)向該受試者投與該抗體或其組合物。此可依照業內已知之標準程序來實施。例如參見Ritter等人,J.Clin.Invest.116(2006)3266-76;Russelakis-Carneiro等人,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206;及Wray等人,Arch.Neurol.33(1976)183-5。
可藉由各種業內已知方法投與本發明之組合物。如熟習此項技術者所應瞭解,投與之途徑及/或模式將視期望結果來改變。為藉由某些投與途徑投與本發明之化合物,可能需要用一材料包覆該化合物或與一材料一起共投與該化合物以防止其不活化。例如,可在適當載劑(例如脂質體或稀釋劑)中向受試者投與該化合物。醫藥上可接受之稀釋劑包括鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水溶液或分散
液,及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。使用該等介質及藥劑用於醫藥活性物質為業內已知。
可使用許多可能遞送模式,包括(但不限於)眼內施加或局部施加。在一實施例中,該施加係在眼內進行且包括(但不限於)結膜下注射、前房內注射(經由顳緣注射至前房中)、基質內注射、角膜內注射、視網膜下注射、眼前房液注射、特農囊(tenon)下注射或持續遞送裝置、玻璃體內注射(例如,前部、中間或後部玻璃體注射)。在一實施例中,該施加係局部的且包括(但不限於)至角膜之點眼劑。
在一實施例中,經由玻璃體內施加(例如經由玻璃體內注射)投與本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物。此可依照業內已知之標準程序來實施。例如參見Ritter等人,J.Clin.Invest.116(2006)3266-76;Russelakis-Carneiro等人,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206;及Wray等人,Arch.Neurol.33(1976)183-5。
在一些實施例中,本發明之治療套組可含有一或多個劑量之存在於本文中所闡述醫藥組合物中之雙特異性抗體、用於醫藥組合物之玻璃體內注射之適宜裝置及詳述適宜受試者之說明書及實施該注射之方案。在該等實施例中,通常經由玻璃體內注射向需要治療之受試者投與該等組合物。此可依照業內已知之標準程序來實施。例如參見Ritter等人,J.Clin.Invest.116(2006)3266-76;Russelakis-Carneiro等人,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206;及Wray等人,Arch.Neurol.33(1976)183-5。
該等組合物亦可含有佐劑,例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序(參見上文)且藉由引入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如,對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者確保防止微生物存在。該等組合物中亦可期望包括等滲劑,例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外,可藉由包含能延緩吸收之試劑(例如單硬
脂酸鋁及明膠)達成可注射醫藥形式之長效吸收。
不管選擇何種投與路徑,本發明之化合物皆可以適宜水合形式及/或本發明醫藥組合物形式使用,藉由熟習此項技術者所習知之習用方法將其調配成醫藥上可接受之劑型。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量含量可有所變化,以獲得對於特定患者、組合物及投與模式達到期望治療反應而對患者不具毒性之有效活性成份量。所選劑量含量將取決於各種藥物動力學因素,該等因素包括所採用之本發明特定組合物之活性、投與途徑、投與時間、所採用之特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所採用之特定組合物組合使用之其它藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、狀況、總體健康及先前病史及為醫學技術中所熟知之類似因素。
該組合物必須為無菌的且其流動性達可藉由注射器遞送該組合物之程度。除水以外,該載劑較佳為等滲緩衝鹽水溶液。
可(例如)藉由使用諸如卵磷酯等塗覆劑、在分散液情形下藉由維持所需粒徑以及藉由使用表面活性劑來維持合適流動性。在許多情形下,該組合物中較佳包括等滲劑,例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。
該組合物可包含包括用於結膜下投與之活性劑之眼用儲積調配物。該眼用儲積調配物包含基本上純之活性劑(例如本發明之雙特異性抗體)之微米粒子。可將包含本發明之雙特異性抗體之微米粒子包埋於生物兼容性之醫藥上可接受之聚合物或脂質囊封劑中。該等儲積調配物可適於在經延長時期內釋放所有或實質上所有活性材料。該聚合物或脂質基質(若存在)可適於充分降解以在釋放所有或實質上所有活性劑後自投與位點轉運。該儲積調配物可為液體調配物,包含醫藥可接受之聚合物及經溶解或經分散活性劑。在注射後,該聚合物在注
射位點處藉由(例如)凝膠化或沈澱形成儲積物。
本發明之另一態樣係本發明之用於治療眼部血管疾病之雙特異性抗體。
本發明之一實施例係本發明之用於治療眼部血管疾病之雙特異性抗體。
本發明之另一態樣係用於治療眼部血管疾病之該醫藥組合物。
本發明之另一態樣係使用本發明之抗體用於製造用以治療眼部血管疾病之醫藥之用途。
本發明之另一態樣係藉由向需要該治療之患者投與本發明之抗體來治療罹患眼部血管疾病之患者之方法。
術語「眼部血管疾病」及「血管眼睛疾病」在本文中可互換使用,且包括(但不限於)眼內新生血管症候群,例如糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、早產兒視網膜病變、新生血管性青光眼、視網膜靜脈阻塞、中央性視網膜靜脈阻塞、黃斑退化、年齡相關性黃斑退化、色素性視網膜炎、視網膜血管瘤樣增生、黃斑毛細血管擴張、局部缺血性視網膜病變、虹膜新血管生成、眼內新血管生成、角膜新血管生成、視網膜新血管生成、脈絡膜新血管生成及視網膜退化。(Garner,A.,Vascular diseases,於:Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.,及Klintworth,G.K.,(編輯),第二版,Marcel Dekker,New York(1994),第1625頁至第1710頁)。上文所使用之眼部血管病症係指特徵為經改變或失調之增生及新血管至眼部組織(例如視網膜或角膜)之結構中之入侵的任何病理學病狀。在一實施例中,眼部血管疾病係選自由以下組成之群:濕性年齡相關性黃斑退化(濕性AMD)、乾性年齡相關性黃斑退化(乾性AMD)、糖尿病黃斑水腫(DME)、黃斑囊樣水腫(CME)、非增生性糖尿病視網膜病變(NPDR)、增生性糖尿病視網膜病變(PDR)、黃斑囊樣水腫、脈管炎
(例如,中央性視網膜靜脈阻塞)、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎、眼色素層炎、脈絡膜炎、多灶性脈絡膜炎、眼部組織漿菌症、眼瞼炎、乾眼(休格倫氏疾病,Sjögren’s disease)及其他眼病,其中眼睛疾病或病症係與眼部新血管生成、血管滲漏及/或視網膜水腫相關。故本發明之雙特異性抗體可用於預防及治療濕性AMD、乾性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、眼瞼炎、乾眼及眼色素層炎,亦較佳地濕性AMD、乾性AMD、眼瞼炎及乾眼,亦較佳地CME、DME、NPDR及PDR,亦較佳地眼瞼炎及乾眼,特定而言濕性AMD及乾性AMD,且亦特定而言濕性AMD。在一些實施例中,眼部疾病係選自由濕性年齡相關性黃斑退化(濕性AMD)、黃斑水腫、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變及糖尿病視網膜病變組成之群。
與角膜新血管生成相關之其他疾病包括(但不限於)流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏症、隱形眼鏡過戴症、異位性角膜炎、上輪部角膜炎、乾燥性翼狀胬肉角膜炎、休格倫氏症(sjogrens)、紅斑、泡性角結膜炎、梅毒、分枝桿菌感染、脂質退化、化學灼傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、原蟲感染、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、蠶蝕性角膜潰瘍、特芮安氏角膜邊緣退化(Terrien’s marginal degeneration)、邊緣性角質層分離、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、外傷、華格納氏類肉瘤病(Wegeners sarcoidosis)、鞏膜炎、史帝芬強生疾病(Steven’s Johnson disease)、類天皰瘡放射狀角膜切開及角膜移植片排斥。
與視網膜/脈絡膜新血管生成相關之疾病包括(但不限於)糖尿病視網膜病變、黃斑退化、鐮狀細胞貧血症、肉狀瘤、梅毒、彈性假黃瘤、佩吉特氏病(Pagets disease)、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分枝桿菌感染、萊姆病(Lyme’s disease)、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、色素性視網膜炎、
視網膜水腫(包括黃斑水腫)、伊爾斯氏病
(Eales disease)、貝塞特氏病(Bechets disease)、引起視網膜炎或脈絡膜炎之感染、疑似眼部組織漿菌症、白斯特氏病(Bests disease)、近視、視盤小凹、斯特格氏病(Stargarts disease)、睫狀體平坦部炎、慢性視網膜脫落、黏度過大症候群、弓蟲症、外傷及雷射後併發症。其他疾病包括(但不限於)與發紅(角之新血管生成)相關之疾病及因纖維小管或纖維組織之異常增生引起之疾病(包括增生性玻璃體視網膜病變之所有形式)。
早產兒視網膜病變(ROP)係影響早產嬰兒之眼睛疾病。認為其係由可導致結瘢及視網膜脫落之視網膜血管之紊亂生長引起。ROP可係輕度的且可自發解決,但可在嚴重情形下導致失明。由此,所有早產嬰兒皆具有ROP之風險,且極低初生體重係額外風險因素。氧中毒及相對缺氧二者皆可有助於ROP發展。
黃斑退化係係主要在其中眼睛內襯之中心(稱為視網膜之黃斑區域)遭受變薄、萎縮且在一些情形下出血之老年成年人中發現之醫學病狀。此可導致中心視覺之喪失,其使得不能看見精細細節、閱讀或識別人臉。根據美國眼科學會(American Academy of Ophthalmology),現在在美國對於超過50歲之彼等而言,其係中心視覺喪失(失明)之主要原因。儘管一些影響年輕個體之黃斑營養障礙有時係稱為黃斑退化,但該術語通常係指年齡相關性黃斑退化(AMD或ARMD)。
年齡相關性黃斑退化始於黃斑(視網膜之提供精細中心視覺之中心區域,稱為中央窩)中之特徵性黃色沈積物,該特徵性黃色沈積物稱為介於視網膜色素上皮與下面脈絡膜之間之隱結。具有該等早期變化(稱為年齡相關性黃斑病變)之大部分人具有良好視覺。具有隱結之人可接著患上晚期AMD。當隱結較大且多並與黃斑下面之色素細胞層之障礙相關時,該風險明顯較高。大型軟性隱結係與升高之膽固醇
沈積物相關且可因應膽固醇降低劑或Rheo程序。
導致顯著視覺喪失之晚期AMD具有兩種形式:乾性及濕性。中央地圖狀萎縮(即晚期AMD之乾形式)由視網膜下面之視網膜色素上皮層之萎縮造成,該萎縮藉助眼睛中央部分中之光受器(視桿及視錐)之喪失引起視覺喪失。儘管此病狀無可用治療,但國家眼科研究所(National Eye Institute)及其他機構已證明具有高劑量之抗氧化劑、黃體素及玉米黃質之維生素補充劑減緩乾性黃斑退化之進展且在一些患者中改善視覺敏銳度。
色素性視網膜炎(RP)係一組遺傳性眼睛病狀。在RP之症狀之進展中,夜盲症通常先於管狀視覺數年或甚至數十年。許多患有RP之人直至其40多或50多才變成法定盲人,且一輩子保持一些視力。其他人自RP變得完全失明,在一些情形下早在兒童期即完全失明。RP之進展在每一情形下皆不同。RP係一類遺傳性視網膜營養性萎縮,即一組其中視網膜之光受器(視桿及視錐)或視網膜色素上皮(RPE)之異常導致進行性視覺喪失之遺傳性病症。受影響個體首先經歷缺陷性暗適應或夜盲症(nyctalopia,night blindness),接著經歷周邊視野之減少(稱為管狀視覺)及有時在病程後期中心視覺之喪失。
在流體及蛋白質沈積物集中於眼睛黃斑(視網膜之黃色中央區域)之上或之下而引起黃斑變厚及腫脹時發生黃斑水腫。腫脹可使一個人之中心視覺扭曲,此乃因黃斑接近於眼球背後之視網膜之中央。此區域保持緊密填充之視錐,該等視錐提供敏銳清楚之中心視覺,以使得一個人能夠看到直接在視線內之形狀、顏色及細節。黃斑囊樣水腫係一類包括囊腫形成之黃斑水腫。
組合療法:在某些實施例中,單獨(不與額外治療劑一起)投與本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物用於治療一或多種本文中所闡述之眼部血管疾病。
在其他實施例中,與一或多種額外治療劑或方法組合投與本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物用於治療一或多種本文中所闡述之眼部血管疾病。
在其他實施例中,將本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物與一或多種額外治療劑組合調配,並投與用於治療一或多種本文中所闡述之眼部血管疾病。
在某些實施例中,與一或多種額外治療劑依序投與本文中所提供之組合治療包括投與本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物用於治療一或多種本文中所闡述之眼部血管疾病。
額外治療劑包括(但不限於)色胺醯基-tRNA合成酶(TrpRS)、EyeOOl(抗-VEGF聚乙二醇化適配體)、鯊胺(squalamine)、RETAANE(TM)(乙酸阿奈可他(anecortave acetate)儲積懸浮液;Alcon公司)、康布瑞塔卡汀(Combretastatin)A4前藥(CA4P)、MACUGEN(TM)、MIFEPREX(TM)(米非司酮-ru486(mifepristone-ru486))、特農囊下曲安奈德(subtenon triamcinolone acetonide)、玻璃體內結晶曲安奈德、普利司他(Prinomastat,AG3340-合成基質金屬蛋白質酶抑制劑,Pfizer)、鹽酸膚輕鬆(fluocinolone acetonide,包括膚輕鬆眼內植入物,Bausch & Lomb/Control Delivery Systems)、VEGFR抑制劑(Sugen)、VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)、VEGF受體酪胺酸激酶抑制劑(例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基六氫吡啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib,PTK787)及SU1 1248(舒尼替尼,sunitinib))、利諾胺(linomide)及整合素v.β.3功能之抑制劑及血管抑素。
可要求與所投與之本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物組合使用之其他醫藥療法包括(但不限於)使用非熱雷射之VISUDYNE(TM)、
PKC 412、恩多文(Endovion,NeuroSearch A/S)、神經滋養因子(舉例而言,包括神經膠細胞源神經滋養因子及睫狀神經滋養因子)、地爾硫卓(diatazem)、多佐胺(dorzolamide)、向光素(Phototrop)、9-順-視網膜、眼藥(包括回音療法,包括碘化磷醯硫膽鹼(phospholine iodide)或乙磷硫膽鹼(echothiophate)或碳酸酐酶抑制劑)、AE-941(AEterna Laboratories公司)、Sirna-027(Sima Therapeutics公司)、哌加他尼(pegaptanib,NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、神經滋養蛋白(僅舉例而言,包括NT-4/5,Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整合素拮抗劑(包括得自Jerini AG及Abbott Laboratories之彼等)、EG-3306(Ark Therapeutics有限公司)、BDM-E(BioDiem有限公司)、沙利度胺(thalidomide,如(例如)EntreMed公司所使用)、心肌營養因子-1(cardiotrophin-1,Genentech)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫鉬酸鹽(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany,Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group pic)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪胺酸激酶抑制劑(Allergan,SUGEN,Pfizer)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、視網膜細胞神經節神經保護劑(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、環孢素A、有限型視網膜易位、光動力療法(僅舉例而言,包括受體靶向PDT,Bristol-Myers Squibb公司;利用PDT之注射用卟吩姆鈉(porfimer sodium);維替泊芬(verteporfin),QLT公司;利用PDT之羅培泊芬(rostaporfin),Miravent Medical Technologies;利用PDT之他拉泊芬鈉(talaporfin sodium),Nippon Petroleum;莫特沙
芬鑥(motexafin lutetium),Pharmacyclics公司)、反義寡核苷酸(舉例而言,包括由Novagali Pharma SA測試之產品及ISIS-13650(Isis Pharmaceuticals))、雷射光凝、隱結產生雷射、黃斑裂孔手術、黃斑易位手術、可植入小型望遠鏡、Phi-Motion血管攝影術(亦稱為微雷射療法及滋養血管治療)、質子束療法、微刺激療法、視網膜脫落及玻璃體手術、鞏膜扣壓術、黃斑下手術、經瞳孔熱療法、光系統I療法、使用RNA干擾(RNAi)、體外血流動力析離術(extracorporeal rheopheresis,亦稱為膜示差過濾及Rheotherapy)、微晶片植入、幹細胞療法、基因置換療法、核糖酶基因療法(包括針對缺氧反應元件之基因療法,Oxford Biomedica;Lentipak,Genetix;PDEF基因療法,GenVec)、光受器/視網膜細胞移植(包括可移植視網膜上皮細胞,Diacrin公司;視網膜細胞移植物,Cell Genesys公司)及針灸。
本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物可與任何抗血管生成劑組合使用,包括(但不限於)由Carmeliet及Jain,2000,Nature 407:249-257所列示之彼等。在某些實施例中,該抗血管生成劑係另一VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑,例如VEGF變體、可溶性VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適配體、中和抗-VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶之低分子量抑制劑及其任何組合,且該等包括抗-VEGF適配體(例如,哌加他尼)、可溶性重組誘餌受體(例如,VEGF陷阱)。在某些實施例中,該抗血管生成劑包括皮質類固醇、血管抑制類固醇、乙酸阿奈可他、血管抑素、內皮抑素、降低VEGFR或VEGF配體表現之小干擾RNA、利用酪胺酸激酶抑制劑之VEGFR後阻斷、MMP抑制劑、IGFBP3、SDF-1阻斷、PEDF、γ-分泌酶、δ-樣配體4、整合素拮抗劑、HIF-1 α阻斷、蛋白質激酶CK2阻斷,及使用血管內皮鈣黏素(CD-144)及基質細胞源因子(SDF)-I抗體達成之歸巢至新血管生成位點之幹細胞(即內皮祖細胞)之抑制。可使用靶向VEGF受體之小分子
RTK抑制劑(包括PTK787)。可使用不必為抗-VEGF化合物之具有抗新血管生成活性之藥劑,且其包括抗炎藥物、m-Tor抑制劑、雷帕黴素(rapamycin)、依維莫司(everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、環孢黴素、抗TNF劑、抗補體劑及非類固醇抗炎劑。可使用具有神經保護性且可潛在降低乾性黃斑退化進程之藥劑,例如稱為「神經類固醇」之藥物類別。該等包括諸如去氫表雄固酮(DHEA)(商標名稱:Prastera(R)及Fidelin(R))、硫酸去氫表雄固酮及硫酸孕烯醇酮等藥物。可與本發明之雙特異性抗體或醫藥組合物組合使用任何AMD(年齡相關性黃斑退化)治療劑,包括(但不限於)與PDT組合之維替泊芬(verteporfin)、哌加他尼鈉、鋅或抗氧化劑(單獨或以任何組合形式)。
術語「受試者」及「患者」可互換使用,且係指哺乳動物(例如人類患者及非人類靈長類)以及實驗動物(例如兔、大鼠及小鼠)及其他動物。動物包括所有脊椎動物,例如哺乳動物及非哺乳動物,例如狗、貓、綿羊、牛、豬、兔、雞及等。實踐本發明之治療方法之較佳受試者為人類。需要治療之受試者包括已罹患眼部血管疾病或病症之患者以及易於患上該病症之彼等。
本文所使用之表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用,且所有該等名稱皆包括其子代。因此,詞語「轉形體」及「轉形細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物,而不考慮轉移次數。亦應瞭解,所有子代之DNA含量可能由於特意的或無意的突變而不精確地相同。包括與最初轉形細胞中所篩選者具有相同功能或生物活性之變體子代。若意欲使用獨特名稱,則根據上下文將明瞭。
本文所使用之術語「轉形」係指載體/核酸至宿主細胞中之轉移過程。若使用不具有強大細胞壁障壁之細胞作為宿主細胞,則藉由(例如)Graham,F.L.、van der Eb,A.J.,Virology 52(1973)546-467闡述之磷酸鈣沈澱方法實施轉染。然而,可使用將DNA引入至細胞中之
其他方法,例如藉由核注射或藉由原生質融合。若使用原核細胞或含有實質細胞壁構造之細胞,則例如一轉染方法為使用氯化鈣之鈣治療,如Cohen,S.N.等人,PNAS.69(1972)2110-2114所闡述。
本文所使用之「表現」係指將核苷酸轉錄至mRNA中之過程及/或隨後將所轉錄mRNA(亦稱為轉錄物)轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及所編碼多肽共同係指基因產物。若多核苷酸係源自基因組DNA,則在真核細胞中表現可包括mRNA之剪接。
「載體」係核酸分子,特定而言為自複製的,其將所插入核酸分子轉移至宿主細胞中及/或在宿主細胞之間轉移。術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中(例如,染色體整合)之載體、主要用於複製DNA或RNA之複製載體及用於轉錄及/或轉譯DNA或RNA之表現載體。亦包括提供一或多種所闡述功能之載體。
「表現載體」係當引入適當宿主細胞中時可轉錄病轉譯成多肽之多核苷酸。「表現系統」通常係指包括可用於產生期望表現產物之表現載體之適宜宿主細胞。
提供以下實例、序列表及圖以幫助理解本發明,本發明之實際範圍係闡釋於隨附申請專利範圍中。應瞭解,可對所述程序做出修改,而不背離本發明之精神。
序列表(胺基酸序列)之說明
在下文中,列示本發明實施例:
1.一種雙特異性抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L區,且其中
iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
2.如實施例1之雙特異性抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列作為重鏈可變結構域VH且包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列作為輕鏈可變結構域VL,且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列作為重鏈可變結構域VH且包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列作為輕鏈可變結構域VL。
3.如實施例1至2中任一實施例之雙特異性抗體,其中iii)下之重鏈恆定區屬於IgG1亞類。
4.如實施例3之雙特異性抗體,其中IgG1亞類之重鏈恆定區進一步包含突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
5.如實施例1至2中任一實施例之雙特異性抗體,其中iii)下之重鏈恆定區屬於IgG4亞類。
6.如實施例5之雙特異性抗體,其中IgG4亞類之重鏈恆定區進一步包含突變S228P及L235E(根據Kabat之EU索引編號)。
7.如實施例5之雙特異性抗體,其中IgG4亞類之重鏈恆定區進一步包含突變S228P、L235E及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
8一種醫藥組合物,其包含如實施例1至7中任一實施例之抗體。
9.如實施例1至7中任一實施例之雙特異性抗體,其用於治療眼部血管疾病。
10.一種如實施例1至7中任一實施例之雙特異性抗體之用途,用於製造用以治療眼部血管疾病之醫藥。
11.如實施例9或10中之任一實施例之雙特異性抗體,其中該抗
體係經由玻璃體內施加來投與。
12.一種治療罹患眼部血管疾病之患者之方法,其係藉由向需要該治療之患者投與如實施例1至7中任一實施例之抗體來達成。
13.一種核酸,其編碼如實施例1至7中任一實施例之雙特異性抗體。
14.一種表現載體,其含有如實施例13之該核酸,其能夠在原核或真核宿主細胞中表現該核酸。
15.一種原核或真核宿主細胞,其包含如實施例14之載體。
16.一種製備如實施例1至7之雙特異性抗體之方法,其包含以下步驟:a)利用包含編碼該抗體之核酸分子之載體轉形宿主細胞;b)在允許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞;及c)自該培養物回收該抗體分子。
17.一種雙特異性抗體,其係藉由如實施例16之方法獲得。
18.一種雙特異性二價抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28之胺基酸序列。
19.一種雙特異性二價抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
20.一種雙特異性二價抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:32之胺基酸序列。
請注意,本文中所使用之術語「具有(該)突變AAA」係指在IgG1或IgG4之重鏈恆定區中之突變I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)及H435A(His435Ala)(根據Kabat之EU索引編號),本文中所使用之術語「具有(該)突變P329G LALA」係指在IgG1亞類之重鏈恆定區中之突變L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)及P329G(Pro329Gly)(根據Kabat之EU索引編號),且本文中所使用之術語「具有(該)突變
SPLE」係指IgG4亞類之重鏈恆定區之S228P(Ser228Pro)及L235E(Leu235Glu)(根據Kabat之EU索引編號)。
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊參見:Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。根據EU編號對抗體鏈之胺基酸編號並提及(Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85;Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
使用標準方法操縱DNA,如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所闡述。根據製造商說明書使用分子生物試劑。
在Geneart(Regensburg,德國)根據所給規格定製期望基因區段。
DNA序列係藉由在MediGenomix GmbH(Martinsried,德國)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten,德國)實施之雙鏈測序測定。
使用GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)之軟體包(版本10.2)及Infomax之Vector NTI Advance suite(版本8.0)來創建
序列、映射、分析、注釋及說明。
為表現所闡述之抗體,施加用於基於具有或不具有CMV-內含子A之啟動子之cDNA組織或基於具有CMV啟動子之基因組組織進行短暫表現(例如,在HEK293-F細胞中)之表現質粒之變體。
除抗體表現盒以外,該等載體含有:- 複製起點,其允許在大腸桿菌(E.coli
)中複製此質粒,- ß-內醯胺酶基因,其在大腸桿菌中賦予胺苄青黴素抗性,及- 來自家鼷鼠(Mus musculus
)之二氫葉酸還原酶基因,作為真核細胞中之可選擇標記,- 抗體基因之轉錄單位係由以下元件組成:- 5’末端處之獨特限制位點,- 來自人類巨大病毒之即早增強子及啟動子,- 在cDNA組織之情形下接著係內含子A序列,- 人類抗體基因之5’-未轉譯區,- 免疫球蛋白重鏈信號序列,- 人類抗體鏈(野生型或具有結構域變化),作為具有免疫球蛋白外顯子-內含子組織之cDNA或基因組組織,- 具有多腺苷酸化信號序列之3’未轉譯區,及- 3’末端處之獨特限制位點。
藉由PCR及/或基因合成生成包含下文所闡述之抗體鏈之融合基因,並藉由已知重組方法及技術並藉由使用(例如)各別載體中之獨特限制位點鏈接相應核酸區段來組裝。藉由DNA測序驗證所亞選殖之核酸序列。為進行短暫轉染,藉由來自經轉形大腸桿菌培養物之質粒製劑(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)製備更大數量之質粒。
如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(編輯),John Wiley & Sons公司中所闡述使用標準細胞培養技術。
藉由各別表現質粒於懸浮生長之HEK29-F細胞中之短暫共轉染來表現雙特異性抗體,如下文所闡述。
藉由根據製造商說明書使用HEK293-F系統(Invitrogen)並利用各別質粒(例如,編碼重鏈及經修飾重鏈以及相應輕鏈及經修飾輕鏈)進行短暫轉染來生成雙特異性抗體。簡言之,在利用四種表現質粒與293fectinTM
或fectin(Invitrogen)之混合物轉染搖瓶中或在攪拌發酵槽中於無血清FreeStyleTM
293表現培養基(Invitrogen)中懸浮生長之HEK293-F細胞(Invitrogen)。對於2L搖瓶(Corning),將HEK293-F細胞以1.0E*6個細胞/mL之密度接種於600mL中,並在120rpm、8% CO2
下培育。後之日,以大約1.5E*6個細胞/mL之細胞密度利用A)具有以等莫耳比編碼重鏈或經修飾重鏈(分別)及相應輕鏈之600μg總質粒DNA(1μg/mL)之20mL Opti-MEM(Invitrogen)與B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293 fectin或fectin(2μl/mL)之大約42mL混合物轉染該等細胞。根據葡萄糖消耗,在發酵過程期間添加葡萄糖溶液。5天至10天後收穫含有所分泌抗體之上清液,且自上清液直接純化抗體,或將上清液冷凍並儲存。
藉由使用MabSelectSure-SepharoseTM
(對於非_AAA突變體)(GE Healthcare,Sweden)或kappaSelect-瓊脂糖(對於AAA突變體)(GE Healthcare,Sweden)之親和力層析法、使用丁基-瓊脂糖凝膠(GE
Healthcare,Sweden)之疏水相互作用層析法及Superdex 200粒徑排阻(GE Healthcare,Sweden)層析法自細胞培養上清液純化雙特異性抗體。
簡言之,將無菌經過濾細胞培養上清液捕獲於經PBS緩衝液(10mM Na2
HPO4
、1mM KH2
PO4
、137mM NaCl及2.7mM KCl,pH 7.4)平衡之MabSelect SuRe樹脂上,用平衡緩衝液洗滌,並在pH 3.0下利用25mM檸檬酸鈉溶析。將AAA突變體捕獲於經25mM Tris、50mM NaCl(pH 7.2)平衡之kappaSelect樹脂上,用平衡緩衝液洗滌,並利用25mM檸檬酸鈉(pH 2.9)溶析。將所溶析蛋白質溶離份彙集,並利用2M Tris(pH 9.0)中和。藉由添加1.6M硫酸銨溶液達0.8M硫酸銨之最終濃度來製備用於疏水相互作用層析法之抗體庫,且使用乙酸將pH調節至pH 5.0。利用35mM乙酸鈉、0.8M硫酸銨(pH 5.0)平衡丁基-瓊脂糖凝膠樹脂後,將抗體施加至樹脂,用平衡緩衝液洗滌,並利用達35mM乙酸鈉(pH 5.0)之線性梯度溶析。將含有雙特異性抗體之溶離份彙集,並藉由粒徑排阻層析法使用經20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)平衡之Superdex 200 26/60 GL(GE Healthcare,Sweden)管柱經一步純化。將含有雙特異性抗體之溶離份彙集,使用Vivaspin超濾裝置(Sartorius Stedim Biotech S.A.,France)濃縮至所需濃度,並儲存於-80℃下。
在每一純化步驟後藉由CE-SDS使用微射流實驗室晶片技術(microfluidic Labchip technology,Caliper Life Science,USA)分析純度及抗體完整性。根據製造商說明書使用HT Protein Express試劑套組製備用於CE-SDS分析之5μl蛋白質溶液,並於LabChip GXII系統上使用HT Protein Express晶片進行。使用LabChip GX軟體分析數據。
在25℃下藉由高效SEC使用Superdex 200分析型粒徑排阻管柱(GE Healthcare,Sweden)於2×PBS(20mM Na2
HPO4
、2mM KH2
PO4
、274mM NaCl及5.4mM KCl,pH 7.4)電泳緩衝液中分析抗體樣品之聚集體含量。將25μg蛋白質以0.75ml/min之流速注射於管柱上,並經50分鐘等度溶析。
類似地,製備並純化<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體VEGFAng2-0012及VEGFAng2-0201,且具有以下產量:
同樣,可以類似方式製備並純化具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG4(SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32)、具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG1(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35)及具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG4(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)。
基本上如(He,F.等人,Analytical Biochemistry 399(2009)141-3)中所闡述實施黏度量測。簡言之,將樣品在200mM精胺酸琥珀酸鹽(pH 5.5)中濃縮至各種蛋白質濃度,然後添加聚苯乙烯乳膠珠粒(300nm直徑)及聚山梨醇酯20(0.02% v/v)。藉由離心藉助0.4μm濾板將樣品轉移至光學384孔板中,並用石蠟油覆蓋。在25℃下藉由動態光散射測定乳膠珠粒之視直徑。溶液之黏度可計算為η=η0(rh/rh,0)(η:
黏度;η0:水之黏度;rh:乳膠珠粒之表觀水力半徑;rh,0:乳膠珠粒於水中之流體動力半徑。
為允許在相同濃度下比較各種樣品,利用慕尼等式(Mooney equation,等式1)(Mooney,Colloid Sci,1951;Monkos,Biochem.Biophys.Acta 1997)擬合黏度-濃度數據,且因此內插數據。
(S:蛋白質之流體動力相互作用參數;K:自集因子;Φ:所溶解蛋白質之體積分率)
結果係顯示於圖2中:與在Fc部分中不具有AAA突變之VEGFAng2-0015相比,在Fc部分中具有AAA突變之VEGFAng2-0016在所有量測溫度下顯示較低黏度。
以存於20mM組胺酸/組胺酸氯化物、140mM NaCl(pH 6.0)中1mg/mL之濃度製備樣品,藉由離心藉助0.4μm濾板將其轉移至光學384孔板中,並利用石蠟油覆蓋。藉由動態光散射重複量測流體動力半徑,同時以0.05℃/min之速率將樣品自25℃加熱至80℃。聚集起始溫度係定義為流體動力半徑開始增加之溫度。結果係顯示於圖3中。在圖3中,顯示在Fc部分中不具有AAA突變之VEGFAng2-0015與具有AAA突變之VEGFAng2-0016之聚集。VEGFAng2-0016顯示61℃之聚集起始溫度,而不具有AAA突變之VEGFAng2-0015顯示60℃之起始溫度。
以存於20mM組胺酸/組胺酸氯化物、140mM NaCl(pH 6.0)中1mg/mL之濃度製備樣品,藉由離心藉助0.4μm濾板將其轉移至光學384孔板中,並利用石蠟油覆蓋。藉由動態光散射重複量測流體動力
半徑,同時將樣品保持於50℃之恒溫下長達145小時。在此實驗中,天然的未摺疊蛋白質在高溫下之聚集趨勢將導致平均粒子直徑隨時間之增加。此基於DLS之方法對聚集體極為敏感,此乃因該等對散射光強度具有超比例貢獻。甚至在50℃下145小時後(接近聚集起始溫度之溫度,參見上文),VEGFAng2-0015及VEGFAng2-0016二者觀測到僅小於0.5nm之平均粒子直徑增加。
將樣品濃縮至存於200mM精胺酸琥珀酸鹽(pH 5.5)中100mg/mL之最終濃度,無菌過濾,並於40℃下靜置儲存7天。儲存之前及之後,藉由粒徑排阻層析法測定高及低分子量種類(分別HMW及LMW)之含量。HMW及LMW含量在儲存樣品與製備後立即量測之樣品之間之差異係分別報告為「HMW增加」及「LMW增加」。結果係顯示於表4及圖4中,其顯示與VEGF Ang2-0016(具有AAA突變)相比,VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)顯示主峰之減小較多且HMW之增加較多。令人驚奇地,與VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)相比,VEGF Ang2-0016(具有AAA突變)顯示較低聚集傾向。
在25℃下藉由表面電漿子共振(SPR)使用BIAcore® T100或T200儀器(GE Healthcare)評估抗-VEGF及抗-Ang2雙特異性抗體之功能分析。BIAcore®系統已充分確定用於分子相互作用之研究。SPR技術係基於接近金塗覆生物感測器晶片之表面之折射率之量測。折射率之變化指示該表面上由固定化配體與溶液中所注射之分析物之相互作用引
起之質量變化。若分子結合上表面之固定化配體,則質量增加,且反之亦然,在分析物自固定化配體解離(反映複合體解離)之情形下質量降低。SPR允許連續即時監測配體/分析物結合且由此測定締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及平衡常數(KD)。
在pH 5.0下,藉由使用GE Healthcare供應之胺偶聯套組,將捕獲系統之約12000個共振單元(RU)(10μg/ml山羊抗人類F(ab)’2
;命令碼:28958325;GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)偶聯於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。樣品及系統之緩衝液為PBS-T(包括0.05%吐溫20(Tween 20)之10mM磷酸鹽緩衝鹽水,pH 7.4)。將流動槽設定25℃-且將樣品區塊設定為12℃-並用電泳緩衝液灌注兩次。藉由以5μl/min之流速注射50nM溶液達30sec來捕獲雙特異性抗體。藉由以30μl/min之流速以存於溶液中之各種濃度(自300nM開始,1:3稀釋)注射人類hVEGF121、小鼠mVEGF120或大鼠rVEGF164達300sec來量測締合。監測解離階段長達1200sec,並藉由自樣品溶液切換至電泳緩衝液啟動。藉由以30μl/min之流速用甘胺酸溶液(pH 2.1)洗滌60sec來再生成表面。藉由減去自山羊抗人類F(ab’)2
表面獲得之反應來校正本體折射率差異。亦減去空白注射(=雙重參照)。為計算表觀KD
及其他動力學參數,使用Langmuir 1:1模型。結果係顯示於表5中。
溶液親和力藉由測定平衡混合物中之游離相互作用配偶體之濃度來量測相互作用之親和力。溶液親和力分析涉及混合<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體(保持在恆定濃度下)與不同濃度之配體(=Ang2)。在
pH 5.0下使用GE Healthcare供應之胺偶聯套組將最多可能共振單元(例如,抗體之17000個共振單元(RU))固定化於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)表面上。樣品及系統之緩衝液為HBS-P pH 7.4。將流動槽設定為25℃且樣品區塊設定為12℃,並用電泳緩衝液灌注兩次。為生成校準曲線,將增加之濃度之Ang2注射至含有固定化VEGF-ANG-2>雙特異性抗體之BIAcore流動槽中。將經結合Ang2之量測定為共振單元(RU),並對濃度作圖。將每一配體之溶液(對於VEGF-ANG-2>雙特異性抗體而言為11個濃度,自0nM至200nM)與10nM Ang2一起培育,並使其在室溫下達到平衡。自在利用已知量之Ang2量測溶液之反應之前及之後所生成之校準曲線測定游離Ang2濃度。利用XLfit4(IDBS軟體)、使用模型201並使用游離Ang2濃度作為y軸並及抑制所使用之抗體濃度作為x軸來設定4參數擬合。藉由測定此曲線之拐點來計算親和力。藉由以30μl/min之流速用0.85% H3
PO4
溶液洗滌一次達30sec來再生成表面。藉由減去自空白偶聯表面獲得之反應來校正本體折射率差異。結果係顯示於表6中。
對應於FcRn量測,使用穩態親和力將雙特異性抗體相互比較。將人類FcRn稀釋至偶聯緩衝液(10μg/ml,乙酸鈉pH5.0)中,並藉由靶向固定化程序使用BIAcore wizard固定化於C1晶片(GE Healthcare BR-1005-35)上,達200 RU之最終反應。將流動槽設定為25℃且樣品區塊設定為12℃,並用電泳緩衝液灌注兩次。樣品及系統之緩衝液為PBS-T(包括0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水,pH 6.0)。為評估每一抗體之不同IgG濃度,製備62.5nM、125nM及250nM、500nM之濃度。將流速設定為30μl/min,且將不同樣品連續注射至晶片表面上,選擇180sec締合時間。藉由以30μl/min之流速注射PBS-T pH 8達60sec來再生成表面。藉由減去自空白表面獲得之反應來校正本體折射
率差異。亦減去緩衝液注射(=雙重參照)。為計算穩態親和力,使用來自Bia-Evaluation軟體之方法。簡言之,將RU值對分析濃度作圖,產生劑量反應曲線。基於2參數擬合,計算上漸近線,從而允許測定半數最大RU值及因此親和力。結果係顯示於中圖5及表7中。可以類似方式測定對食蟹猴、小鼠及兔FcRn之親和力。
對於FcγRIIIa量測,使用直接結合分析。在pH 5.0下,藉由使用GE Healthcare供應之胺偶聯套組,將捕獲系統之約3000個共振單元(RU)(1μg/ml Penta-His;Quiagen)偶聯於CM5晶片(GE Healthcare BR-1005-30)上。樣品及系統之緩衝液為HBS-P+ pH 7.4。將流動槽設定為25℃-且樣品區塊設定為12℃-並用電泳緩衝液灌注兩次。藉由以5μl/min之流速注射100nM溶液達60sec來捕獲FcγRIIIa-His-受體。藉由以30μl/min之流速注射100nM雙特異性抗體或單特異性對照抗體(IgG1亞類之抗-Dig及IgG4亞類抗體)達180sec來量測結合。藉由以30μl/min之流速用甘胺酸溶液(pH 2.5)洗滌120sec來再生成表面。由於FcγRIIIa結合與Langmuir 1:1模型不同,故此分析僅測定結合/無結合。可以類似方式測定FcγRIa及FcγRIIa結合。結果係顯示於圖6中,其中由此斷定藉由引入突變P329G LALA可檢測到不再結合至FcγRIIIa。
在pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶聯套組,將捕獲系統之約3500個共振單元(RU)(10μg/ml山羊抗人類IgG;GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden)偶聯於CM4晶片(GE Healthcare BR-1005-34)上。樣品及系統之緩衝液為PBS-T(包括0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水,pH 7.4)。將流動槽之溫度設定為25℃且將樣品區塊之溫度設定為12℃。在捕獲前,將流動槽用電泳緩衝液灌注兩
次。
藉由以5μl/min之流速注射10nM溶液達60sec來捕獲雙特異性抗體。藉由測定每一配體之活性結合能力來分析每一配體與雙特異性抗體之獨立結合,每一配體係依序或同時添加(30μl/min之流速):
1.濃度為200nM之注射人類VEGF達180sec(鑒定抗原之單一結合)。
2.濃度為100nM之注射人類Ang2達180sec(鑒定抗原之單一結合)。
3.濃度為200nM之注射人類VEGF達180sec、接著再注射濃度為100nM之人類Ang2達180sec(鑒定Ang2在VEGF之存在下之結合)。
4.濃度為100nM之注射人類Ang2達180sec、接著再注射濃度為200nM之人類VEGF(鑒定VEGF在Ang2之存在下之結合)。
5.共注射濃度為200nM之人類VEGF及濃度為100nM之人類Ang2達180sec(鑒定VEGF及Ang2在相同時間之結合)。
藉由以30μl/min之流速用3m MgCl2
溶液洗滌60sec來再生成表面。藉由減去自山羊抗人類IgG表面獲得之反應來校正本體折射率差異。
若方法3、4及5之所得最終信號等於或類似於方法1及2之個別最終信號之和,則雙特異性抗體能夠彼此獨立地結合兩種抗原。結果係顯示於表9中,其中顯示抗體VEGFAng2-0016、VEGFAng2-0012二者能夠彼此獨立地結合至VEGF及ANG2。
第一,於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶聯套組,將VEGF(20μg/ml)之約1600個共振單元(RU)偶聯於CM4晶片(GE Healthcare BR-1005-34)上。樣品及系統之緩衝液為PBS-T(包括0.05%吐溫20之10mM磷酸鹽緩衝鹽水,pH 7.4)。將流動槽設定為25℃且樣
品區塊設定為12℃,並用電泳緩衝液灌注兩次。第二,以30μl/min之流速注射雙特異性抗體之50nM溶液達180sec。第三,以30μl/min之流速注射hAng-2達180sec。hAng-2之結合反應取決於結合至VEGF之雙特異性抗體之量,並顯示同時結合。藉由以30μl/min之流速用0.85% H3
PO4
溶液洗滌60sec來再生成表面。藉由hAng2與先前結合VEGF之<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體之額外特異性結合信號顯示同時結合。對於雙特異性抗體VEGFAng2-0015及VEGFAng2-0016二者,可檢測到與<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體之同時VEGF-及Ang2-結合(數據未顯示)。
表7:結果:<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體對FcRn之親和力
此部分闡述<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體之表徵,其著重於正確組裝。藉由經去糖基化且完整或經IdeS消化(釀膿鏈球菌(S.pyogenes)之IgG-降解酶)之<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體之電噴霧電離質譜法
(ESI-MS)證實期望一級結構。在37℃下於100mmol/L NaH2
PO4
/Na2
HPO4
(pH 7.1)中,利用100μg與2μg IdeS蛋白酶(Roche)一起培育之經純化抗體實施IdeS消化達5h。隨後,於37℃下於100mmol/L NaH2
PO4
/Na2
HPO4
(pH 7.1)中,利用N-核苷酶F、神經胺酸酶及O-核苷酶(Roche)以1mg/ml之蛋白質濃度使該等抗體去糖基化長達16h,且隨後於Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC去鹽。經由ESI-MS於配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
針對經IdeS消化之經去糖基化(表10)或完整之經去糖基化(表11)分子所獲得的質量與自由兩個不同輕鏈LCAng2
及LCLucentis
及兩個不同重鏈HCAng2
及HCLucentis
組成之<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體之胺基酸序列推斷之預測質量相當。
將1克鏈黴抗生物素瓊脂糖凝膠(GE Healthcare)添加至經生物素化且經透析之受體中,並在振盪下培育2小時。將受體衍生之瓊脂糖凝膠填充於1ml XK管柱(GE Healthcare)中。
使用FcRn親和力管柱之層析法:條件:管柱尺寸:50mm×5mm
床高度:5cm
裝載量:50μg樣品
平衡緩衝液:20mM MES,具有150mM NaCl,調節至pH 5.5
溶析緩衝液:20mM Tris/HCl,具有150mM NaCl,調節至pH 8.8
溶析:7.5 CV平衡緩衝液,於30 CV中至100%溶析緩衝液,10 CV溶析緩衝液
在下表中,給出<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體於包含人類FcRn之親和力管柱上之滯留時間。使用以上條件獲得數據。在下表中,給出<VEGF-ANG-2>雙特異性抗體於人類FcRn上之滯留時間。
該研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景);FcRn缺陷型小鼠,但為人類FcRn(huFcRn,種系276 -/tg)之半合子轉基因小鼠
向所有小鼠經玻璃體內注射一次2μL/動物之適當溶液(即21μg化合物/動物(VEGFAng2-0015(不具有AAA突變))或23.6μg化合物/動物(VEGFAng2-0016(具有AAA突變))),注射至右眼中。
將小鼠分配成2個群組,其中各自6只動物。在投藥後2小時、24小時及96小時自群組1且在投藥後7小時、48小時及168小時自群組2獲取血液樣品。
藉由使用來自World Precision Instruments公司(Berlin,德國)之用於奈升注射之NanoFil微注射器系統注射至小鼠右眼之玻璃體內。使小鼠麻醉利用2.5%異氟烷,且使用具有40倍放大率之Leica MZFL 3顯微鏡及具有Leica KL 2500 LCD照明設備之環型燈使小鼠眼睛可視化。隨後,使用35號針頭注射2μL化合物。
經由對側眼睛
之眼球後靜脈叢自每一動物收集血液用於測定血清中之化合物含量。
藉由在4℃下離心(9300×g)3min來自在室溫下1小時後之血液獲得至少50μl之血清樣品。在離心後直接冷凍血清樣品並將其冷凍儲存於-80℃下直至分析為止。治療後96小時分離群組1之動物之所治療眼睛且在治療後168小時分離群組2之動物之所治療眼睛。將樣品冷凍儲存於-80℃下直至分析為止。
經由尾靜脈向所有小鼠經靜脈內注射一次200μL/動物之適當溶
液(即21μg化合物/動物(VEGFAng2-0015(不具有AAA突變))或23.6μg化合物/動物(VEGFAng2-0016(具有AAA突變)))。
將小鼠分配成2個群組,其中各自5只動物。在投藥後1小時、24小時及96小時自群組1且在投藥後7小時、48小時及168小時自群組2獲取血液樣品。經由眼球後靜脈叢自每一動物收集血液用於測定血清中之化合物含量。
藉由在4℃下離心(9300×g)3min來自在室溫下1小時後之血液獲得至少50μl之血清樣品。在離心後直接冷凍血清樣品並將其冷凍儲存於-80℃下直至分析為止。
藉由來自實驗室動物之全眼之物理-化學分解獲得眼睛溶解物。對於機械破壞,將每一眼睛轉移至具有圓錐底部之1.5-mL微量小瓶中。在冷凍及解凍後,將眼睛用1mL細胞洗滌緩衝液洗滌一次(Bio-Rad,Bio-Plex細胞溶解套組,目錄編號171-304011)。在以下步驟中,添加500μL剛製備之細胞溶解緩衝液,且使用1.5mL組織研磨杵(Kimble Chase,1.5mL研磨杵,商品編號749521-1500)研磨眼睛。然後將混合物冷凍並解凍五次,並再次研磨。為自剩餘組織分離溶解物,使樣品以4500g離心4min。離心後,收集上清液,並將其儲存於-20℃下,直至定量ELISA中之進一步分析為止。
利用酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定<VEGF/ANG2>抗體在小鼠血清及眼睛溶解物中之濃度。
對於<VEGF/ANG2>抗體在小鼠血清樣品及眼睛溶解物中之定量,實施使用經生物素化及經去氧之單株抗體作為捕獲及檢測抗體之標準固相系列夾心式免疫分析。為驗證分析物之雙特異性之完整性,經生物素化之捕獲抗體識別抗-VEGF-結合位點,而經去氧之檢測抗
體將結合至分析物之抗-Ang2結合位點。然後利用偶聯至抗地穀新配質抗體之山葵過氧化酶檢測塗覆鏈黴抗生物素之微量滴定板(SA-MTP)之固相上之捕獲抗體、分析物及檢測抗體之經結合免疫複合體。在洗滌SA-MTP之未經結合材料及添加ABTS受質後,所獲得之信號係與SA-MTP之固相上所結合之分析物之量成比例。然後藉由將樣品之所量測信號轉換成關於平行分析之校準物之濃度來進行定量。
在第一步驟中,於MTP振盪器以500rpm用100μL/孔濃度為1μg/mL之經生物素化之捕獲抗體溶液(mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS))將SA-MTP塗覆1小時。同時,製備校準物、QC樣品及樣品。將校準物及QC樣品稀釋至2%血清基質;稀釋樣品,直至信號屬於校準物之線性範圍內為止。
用捕獲抗體塗覆SA-MTP後,用洗滌緩衝液及300μL/孔將該板洗滌三次。隨後,將100μl/孔之校準物、QC樣品及樣品移液於SA-MTP上,並以500rpm再培育1小時。該分析物現在利用其抗-VEGF結合位點經由捕獲抗體結合至SA-MTP之固相。培育及藉由洗滌該板去除未經結合之分析物後,將100μL/孔濃度為250ng/mL之第一檢測抗體(mAb<Id-<Ang2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu))添加至SA-MTP。而且,於振盪器上以500rpm將該板培育1小時。洗滌後,將100μL/孔濃度為50mU/mL之第二檢測抗體(pAb<Digoxigenin>S-Fab-POD(poly))添加至SA-MTP之各孔,且以500rpm將該板再培育1小時。在去除過量檢測抗體之最後一個洗滌步驟後,添加100μL/孔受質(ABTS)。抗體-酶偶聯物催化ABTS®受質之顯色反應。然後在405nm波長(參照波長:490nm([405/490]nm))下藉由ELISA讀數器量測信號。
藉由非隔室分析並使用藥物動力學評價程式WinNonlinTM(Pharsight,5.2.1版)計算藥物動力學參數。
血清濃度之結果係顯示於表13至16及7B至7C中
表15:VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)及VEGFAng2-0016(具有AAA突變):玻璃體內施加後之血清濃度之比較
眼睛溶解物中之濃度之結果係顯示於表17至18及圖7D至7E中
玻璃體內施加後,與不具有AAA突變之雙特異性<VEGF/ANG2>
抗體VEGFAng2-0015相比,本發明之雙特異性<VEGF/ANG2>抗體VEGFAng2-0016(具有AAA突變)顯示於眼睛溶解物中之類似濃度(96小時及168小時後)。
而且,在玻璃體內施加後,與不具有AAA突變之雙特異性<VEGF/ANG2>抗體VEGFAng2-0015相比,本發明之雙特異性<VEGF/ANG2>抗體VEGFAng2-0016(具有AAA突變)另外顯示於血清中之較快清除及較短半衰期。
為測試具有SEQ ID NO:7及8之各別抗-VEGF VH及VL以及SEQ ID NO:15及16之抗-ANG2 VH及VL之雙特異性<VEGF/ANG2>抗體在活體內對VEGF誘導之血管生成之抗血管生成效應,實施小鼠角膜血管生成分析。在此分析中,將經VEGF浸泡之Nylaflo盤植入無血管角膜袋中且與角膜緣血管之距離固定。血管立即生長至角膜中,朝向正在形成之VEGF梯度。8週至10週齡雌性Balb/c小鼠係購自Charles River(Sulzfeld,德國)。該方案係根據Rogers,M.S.等人,Nat.Protoc.2(2007)2545-2550所闡述之方法經修改。簡言之,在經麻醉小鼠中,在顯微鏡下使用手術刀片及尖鑷子在自角膜之邊緣至頂部大約1mm處製備寬度為約500μm之微袋。植入直徑為0.6mm之盤(Nylaflo®,Pall Corporation,Michigan),且使植入區域之表面平滑。將各盤於相應生長因子或媒劑中培育至少30min。在3天、5天及7天後(或者僅在3天、5天或7天後),對眼睛拍照且量測血管反應。藉由計算新血管面積/角膜總面積之百分比來定量該分析。
向該等盤加載300ng VEGF或加載PBS作為對照,並植入7天。在第3天、第5天及/或第7天隨時間監測血管自邊緣至盤之過生長。在盤植入前一天,以10mg/kg之劑量經靜脈內投與抗體(由於靜脈內施
加,使用與VEGFAng2-0016之不同僅在於AAA突變且具有相同抗-VEGF及抗-ANG2 VH及VL來調介效力之血清穩定性VEGFAng2-0015(不具有AAA突變)作為替代物),用於測試在活體內對VEGF誘導之血管生成之抗血管生成效應。對照群組中之動物接受媒劑。施加體積為10ml/kg。
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<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈可變結構域VL,<VEGF>蘭尼單抗
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈CDR3H,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈CDR2H,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈CDR1H,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 11
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈CDR3L,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈CDR2L,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈CDR1L,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 14
<210> 15
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈可變結構域VH,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 15
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈可變結構域VL,<ANG-2>Ang2i_LC10變體
<400> 16
<210> 17
<211> 191
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
<210> 18
<211> 496
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
<210> 19
<211> 498
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
<210> 20
<211> 1124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
<210> 21
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0012)之重鏈1
<400> 21
<210> 22
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0012)之重鏈2
<400> 22
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0012)之輕鏈1
<400> 23
<210> 24
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGF-Ang2-0012)之輕鏈2
<400> 24
<210> 25
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變及P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0016)之重鏈1
<400> 25
<210> 26
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變及P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0016)之重鏈2
<400> 26
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變及P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0016)之輕鏈1
<400> 27
<210> 28
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變及P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(VEGFAng2-0016)之輕鏈2
<400> 28
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG4之重鏈1
<400> 29
<210> 30
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG4之重鏈2
<400> 30
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG4之輕鏈1
<400> 31
<210> 32
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG4之輕鏈2
<400> 32
<210> 33
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG1之重鏈1
<400> 33
<210> 34
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG1之重鏈2
<400> 34
<210> 35
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG1之輕鏈1
<400> 35
<210> 36
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG4之重鏈1
<400> 36
<210> 37
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG4之重鏈2
<400> 37
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<200>
<223> 具有AAA突變且具有SPLE突變之<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG4之輕鏈1
<400> 38
<210> 39
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> <VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1野生型(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0201)之重鏈1
<400> 39
<210> 40
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> <VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1野生型(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0201)之重鏈2
<400> 40
<210> 41
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> <VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1野生型(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0201)之輕鏈1
<400> 41
<210> 42
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> <VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1野生型(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0201)之輕鏈2
<400> 42
<210> 43
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 僅具有P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0015)之重鏈1
<400> 43
<210> 44
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 僅具有P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0015)之重鏈2
<400> 44
<210> 45
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 僅具有P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(不具有AAA突變)(VEGFAng2-0015)之輕鏈1
<400> 45
<210> 46
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 僅具有P329G LALA突變之<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG1(不具有AAA突變)
(VEGFAng2-0015)之輕鏈2
<400> 46
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
<210> 48
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
<210> 49
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
<210> 50
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Claims (29)
- 一種降低抗體之黏度之方法,其中該抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區其中該方法包含利用突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)修飾人類IgG1或人類IgG4亞類之該抗體重鏈恆定區。
- 如請求項1之方法,其中該抗體係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L區,且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含該等突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
- 如請求項2之方法,其中該雙特異性抗體包含人類IgG1亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含該等突變I253A、 H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)且進一步包含突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
- 一種抗體,其係藉由如請求項1至3中任一項之方法來獲得。
- 一種突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)之用途,其用於降低抗體之黏度,其中該抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區。
- 如請求項5之用途,其中該抗體係包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點的雙特異性抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L區,且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含該等突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
- 如請求項6之用途,其中該雙特異性抗體包含人類IgG1亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含該等突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)且進一步包含突變 L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
- 一種雙特異性抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區;且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:9之CDR3H區、SEQ ID NO:10之CDR2H區及SEQ ID NO:11之CDR1H區且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO:12之CDR3L區、SEQ ID NO:13之CDR2L區及SEQ ID NO:14之CDR1L區,且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1或人類IgG4亞類(源自人類來源)之重鏈恆定區,該重鏈恆定區包含突變I253A、H310A及H435A(根據Kabat之EU索引編號)。
- 如請求項8之雙特異性抗體,其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列作為重鏈可變結構域VH且包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列作為輕鏈可變結構域VL,且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列作為重鏈可變結構域VH且包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列作為輕鏈可變結構域VL。
- 如請求項8至9中任一項之雙特異性抗體,其中iii)下之該重鏈恆定區屬於IgG1亞類。
- 如請求項10之雙特異性抗體,其中IgG1亞類之該重鏈恆定區進一步包含突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
- 如請求項8至9中任一項之雙特異性抗體,其中iii)下之該重鏈恆定區屬於IgG4亞類。
- 如請求項12之雙特異性抗體,其中IgG4亞類之該重鏈恆定區進一步包含突變S228P及L235E(根據Kabat之EU索引編號)。
- 如請求項12之雙特異性抗體,其中IgG4亞類之該重鏈恆定區進一步包含突變S228P、L235E及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項4及8至14中任一項之抗體。
- 如請求項4及8至14中任一項之雙特異性抗體,其用於治療眼部血管疾病。
- 如請求項16之雙特異性抗體,其中該抗體係經由玻璃體內施加來投與。
- 一種核酸,其編碼如請求項8至14中任一項之雙特異性抗體。
- 一種表現載體,其含有如請求項18之該核酸,其能夠在原核或真核宿主細胞中表現該核酸。
- 一種原核或真核宿主細胞,其包含如請求項19之載體。
- 一種製備如請求項8至14中任一項之雙特異性抗體之方法,其包含以下步驟:a)利用包含編碼該抗體之核酸分子之載體轉形宿主細胞;b)在允許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞;及c)自該培養物回收該抗體分子。
- 一種雙特異性抗體,其係藉由如請求項21之方法來獲得。
- 一種雙特異性二價抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一 抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28之胺基酸序列。
- 一種雙特異性二價抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
- 一種雙特異性二價抗體,其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合位點及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合位點,其特徵在於包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:32之胺基酸序列。
- 如請求項23至25中任一項之雙特異性抗體,其用於治療眼部血管疾病。
- 如請求項26之雙特異性抗體,其中該抗體係經由玻璃體內施加來投與。
- 一種如請求項4、8至14及23至25中任一項之雙特異性抗體之用途,其用於製造用以治療眼部血管疾病之醫藥。
- 如請求項28之用途,其中該抗體係經由玻璃體內施加來投與。
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