CN102250248A

CN102250248A - 抗vegf/ang2双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN102250248A
Application number: CN2011101614952A
Authority: CN
Inventors: 霍世元; 叶亚东; 滕凌; 朱文华; 潘鹂; 路易斯易格那罗
Original assignee: CHANGZHOU ADAM BIOTECH Inc
Current assignee: CHANGZHOU ADAM BIOTECH Inc
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子（VEGF/VEGF-A）和人血管生成素2（angiopoietin2，ANG2）的双特异性单克隆抗体药物；抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，将其第二个抗原结合位点置换为特异性结合ANG2的抗体片断。

Description

抗VEGF/ANG2双特异性抗体及其应用

技术领域

本专利涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的双特异性单克隆抗体药物；

背景技术

早在一个多世纪以前，就有文献报道过肿瘤生长伴随着新生血管生成(Ferrara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在着某种肿瘤来源的血管生长刺激因子为肿瘤的生长提供血管供应(Ide et al.1939)。数年后，由于观察到血管密度的增高会先于肿瘤的快速生长，Algire等人认为“肿瘤的快速扩散取决于丰富的血管供给”(Algire et al.1945)。在上个世纪六十年代，Greenblatt、Shubik(Greenblatt et al.1968)和Ehrmann、Knoth(Ehrmann et al.1968)两个研究小组的实验相继提供初步证据，证实肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞产生的某些可扩散因子介导。

1971年，美国科学家福克曼(Judah Folkman)在《新英格兰医学杂志》中提出，抗血管生成可能是一种有效的抗癌手段(Folkman 1971)。从七十年代早期开始，以这个前瞻性的假说为基础，福克曼及其研究小组致力于从人体和动物的肿瘤中分离某种‘肿瘤血管生成因子‘(Folkman et al.1971)。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌症的观点(Gullino 1978)。随后，多种血管源因子(如，表皮生长因子EGF，转化生长因子TGF-α、TGF-β，肿瘤生长因子TNF-α和血管生长素等)先后被发现(Folkman et al.1987)。

血管内皮生长因子(VEGF)

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，也可写作VEGF-A)是一个血管生成的关键调节因子，对于VEGF基因家族在血管生成调节中所扮演的角色，人们已经深入研究了十多年之久(Ferrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成员(VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor，PlGF)(Maglione et al.1991)、VEGF-B(Olofsson et al.1996)、VEGF-C(Joukov et al.1996)、VEGF-D(Orlandini et al.1996)。其中VEGF-A是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的血管生长因子。VEGF有3个高亲合性的酪氨酸激酶受体(RTKs)，分别为VEGFR-1(Flt-1)(Shibuya et al.1990；de Vries et al.1992)、VEGFR-2(KDR、Flk-1)(Yoshiji et al.1996；Ellis et al.1998；Tomisawa et al.1999)和VEGFR3(Flt-4)(Joukov et al.1996)。KDR是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关。

肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2mm³。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，血管生成均发挥着重要作用。

原位杂交研究已经发现VEGF mRNA在多种人类肿瘤中都有表达，包括肺癌(Volm et al.1997)、乳腺癌(Yoshiji et al.1996)、胃肠癌(Ellis et al.1998)、肾癌(Tomisawa et al.1999)和卵巢癌(Sowter et al.1997)。多家实验室使用多种抗VEGF的手段均已实现了肿瘤生长的抑制，这些方法包括：针对VEGF或其受体(VEGFRs)的抗体、可溶性受体，VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制剂以及利用VEGF的突变异二聚体封闭其受体结合位点等。

1993年，费拉拉制备了VEGF的鼠源性抗体，在体外实验中，鼠源性抗体可以显著抑制数种人类癌细胞系的生长。从此，VEGF抗体的临床应用价值开始显露。为了降低鼠源性抗体的免疫原性，费拉拉将鼠源抗体的骨架换做了人源抗体IgG1的部分，由此诞生了基因泰克公司“重磅炸弹级”药物--贝伐单抗(Avastin)。它是一种抗VEGF的人源化抗体(IgG1)，93％的人源结构域和7％的鼠源结合区域组成，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物，2004年2月美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准该药用于治疗转移性结肠癌(mCRC)、小细胞分子肺癌(GBM)和转移性肾癌。阿瓦斯汀区别于已有抗癌药物，以VEGF为药物靶点，加之抗体的特异性结合能力，使其临床疗效显著。在人体试验中，即使对于晚期的癌症患者，注射阿瓦斯汀也可延长寿命数月。2007年ASCO会议Souglakos报道Avastin联合靶向EGFR的单克隆抗体Cetuximab(西妥昔单抗)可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。基因泰克公司正在用Avastin对超过40种癌症进行适应症研究，希望可以生产出更多的单抗延伸产品。同时，他们也在研究将全抗体分子IgG切割之后，先将蛋白用原核细胞表达，然后再将其通过基因工程的手段连接为IgG。

除了癌症外，VEGF也是治疗包括老年性黄斑变性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病关键。为了治疗这些疾病，在Avastin的基础上，基因泰克公司又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此成就另一药物--Avastin的孪生姊妹兰尼单抗(Lucentis)。2006年，兰尼单抗被美国药监局批准用于治疗老年黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，很快就成为治疗老年性黄斑变性，糖尿病引起的眼底病的首选药，占领北美市场80％以上的份额。

血管生成素2(Ang2)

美国科学家福克曼(J.Folkman)在1971年提出，肿瘤的生长与转移依赖于血管的生成(Folkman 1971)。这个观点在随后的几十年中被许多研究所证实。血管生成素(Angiopoietin，Ang)是第一个被确定的来源于人肿瘤组织具有促进血管生成作用的细胞因子。Ang是一种分泌型单链碱性蛋白，是促血管生成因子中唯一具有核糖核酸酶(Rnase)活性的物质。目前已知的Ang包括四个亚型，Ang1，Ang2，Ang3和Ang4，其中Ang1和Ang2与血管的生成关系最为密切，而对Ang2的研究较多(李国灏et al.2004)。

人类Ang2基因位于8号染色体短臂区(8p23.1)，转录生成的mRNA为1491bp，编码496个氨基酸组成的蛋白，分子量为75kD。Ang2可与Tie2(tyrosinekinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain 2)结合，是其天然的配体。Ang2主要由血管内皮细胞合成，通过自分泌作用与自身细胞膜上的Tie2受体特异性结合，可以竞争性抑制由Ang1诱导形成的不稳定血管。实验证明，VEGF的存在可以提高Ang2的表达(Gu et al.2006)。

Ang2参与多种肿瘤的血管生成，且与肿瘤血管形成的数目、肿瘤的临床分期及预后关系密切。应用Ang2cDNA转染人结肠癌细胞HT29建立小鼠荷瘤模型，Ahmad等人发现Ang2转染的肿瘤体积明显变大，肿瘤内血管密度增高，肿瘤细胞增殖指数变高(Ahmad et al.2001)。Etoh等对胃癌病例的研究也发现，组织中Ang2高表达同时伴有血管密度增高、成熟度下降，患者临床TNM分期晚，术后生存率低(Etoh et al.2001)。用Ang2转染的胃癌细胞接种裸鼠，结果发现肿瘤转移率增高，且转染的胃癌细胞在体外VEGF存在的条件下，能促进人脐静脉内皮细胞分泌更多的金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)和尿激酶等蛋白水解酶，这可能与Ang2促进肿瘤生长、转移有关。陈林莺等人的研究表明，Ang1可以抑制胃癌组织血管的生成，而Ang2拈抗Ang1的功能，对血管生成具有双向调节作用，并呈VEGF依赖性(陈林莺et al.2004)。张真真等人认为，Ang2/Ang1的比值是决定胃癌组织血管生成和肿瘤生长的最终因素。当Ang2/Ang1＞1时，促进胃癌组织血管生成，反之则抑制其血管的生成。同时他们推测血管生成素及其受体在胃癌血管生成的调解作用是以Ang2为主导的(张真真et al.2006)。Ang2在胃癌的发生，发展中起到了重要的作用，可以成为胃癌抗血管治疗的一个潜在靶标。另外，Ang2除了在胃癌肿瘤血管生成中的作用外，其表达还与胶质瘤，结肠癌，前列腺癌和乳腺癌等的侵袭和转移表型有关(Bach et al.2001，Imanishi et al.2001)。

除了以上提到的癌症外，Ang2还与非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织的血管新生和生长有密切的关系。邢丽华等和Takanami应用RT-PCR技术，检测了NSCLC肿瘤细胞中ANG2基因的表达水平，他们发现ANG2的mRNA量明显高于作为对照的正常细胞组织(邢丽华et al.2003，Takanami 2004)。另外，Park等人及萧淑华等人分别用ELISA技术对136例及82例NSCLC病人血液进行检测，发现相对于对照组，NSCLC病人血液中ANG2和VEGF的浓度明显高于前者(Park et al.2007，萧淑华et al.2011)。国内张轩斌等人对37例NSCLC病人肿瘤样本进行了免疫组化(ICH)的检测，他们发现NSCLC病人肿瘤标本中ANG2，VEGF以及微血管密度(MVD)均明显高于用于对照的正常组织。因此他们认为Ang-2与非小细胞肺癌的浸润、进展密切相关；其对非小细胞肺癌肿瘤血管生成有促进作用，而且这种作用具有明显的VEGF依赖性(张轩斌et al.2000)。在最近发表的一项研究中，Andersen等人也提出了类似的观点。这些研究人员分别应用芯片(microarray)和免疫组化(ICH)的方法对随机抽取的335例NSCLC患者肿瘤样本进行了针对ANG和VEGF-A的检测，他们发现ANG2和VEGF-A的表达量在肿瘤组织中有明显的增长，且两者的表达量密切相关，存在正相关的关系(Andersen et al.2011)。

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发明内容

发明目的

本发明提供抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别ANG2的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体。

技术方案

抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于该抗体由SEQ NO.5的N端依次连接有SEQ NO.4、SEQ NO.3、SEQ NO.2和SEQ NO.1，其中SEQ NO.5的C端通过(GGGGS)₃封闭。

抗VEGF/ANG2双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

具体来说氨基酸序列表SEQ NO.1为Anti-ANG2Fab VL-CL；氨基酸序列表SEQ NO.2为Anti-ANG2Fab VH-CH；氨基酸序列表SEQ NO.3为Anti-VEGFA Fab VH-CH；氨基酸序列表SEQ NO.3为Anti-VEGF A Fab VL-CL；氨基酸序列表SEQ NO.3为Fc；

有益效果

1、本专利涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别ANG2的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。

2、本专利涉及的双特异性抗体可以特异性结合VEGF-A和ANG2分子，抑制其刺激新生血管生长的生物学功能。实验表明，该双特异性抗体单独结合VEGF-A或ANG2的能力与抗VEGF-A或抗ANG2单克隆抗体近似，并且其具有很强的同时与这两种抗原结合的能力。实验表明，同时抑制VEGF-A和ANG2比单独抑制两者中的一种能够更好的抑制肿瘤血管的生长，因此使用该双特异性抗体即能有效的抑制肿瘤组织的生长，又能避免同时使用两种单克隆抗体时用药量的增加，给患者带来的不可预知的风险。

3、抗VEGF-PDGFR beta双特异性抗体对多种肿瘤都有效果，是广谱的抗肿瘤药物。

附图说明

图1.抗VEGF-ANG2双特异性抗体结构示意图。；

图2.Anti-VEGF-ANG2双特异性抗体重链表达载体；

图3.Anti-VEGF抗体轻链表达载体；

图4、Anti-ANG2抗体轻链表达载体

图5.ELISA测定抗体与抗原VEGF特异性结合能力。bsAb：抗VEGF-ANG2双特异性抗体；anti-VEGF眼明：抗VEGF Fab片断；anti-ANG2：抗ANG2单克隆抗体。

图6.ELISA测定抗体同时与抗原VEGF和ANG2特异性结合能力。bsAb：抗VEGF-ANG2双特异性抗体；anti-VEGF眼明：抗VEGF Fab片断；anti-ANG2：抗ANG2单克隆

图7.HUVECs和HBVP共培养，测试抗VEGF-ANG2bsAb对血管内皮细胞生长，及内皮细胞-周细胞结合的抑制作用：A.Bevacizumab，Bevacizumab+antiANG2和anti-VEGF-ANG2bsAb(同为25nM)对新生血管生长的抑制效果；B.不同浓度的Bevacizumab和anti-VEGF-ANG2bsAb对新生血管生长的抑制效果(p＜0.01)。

图8.重组双特异性单克隆抗体在哺乳动物细胞中表达与生产流程图。构建好的表达载体转入细胞后，在96孔板中培养，筛选稳定表达的细胞株。筛选得到的细胞株逐级放大培养，最后在生物反应器中进行大规模生产。

具体实施方式

实施例1

1.抗VEGF-ANG2双特异性抗体(bsAb)核苷酸序列设计和合成：

根据该bsAb重链HC_VEGF(GGGGS)₃-HC_ANG2(反向)的氨基酸序列和连接形式设计重链核苷酸序列，并在该序列5’端加入Sac I酶切位点，KOZAK序列及前导序列，在其3’端加入Xho I酶切位点。设计3个3’端含EcoR I酶切位点的寡核苷酸引物，分别合成重链HC_VEGF-(GGGGS)₃和HC_ANG2(反向)片断，应用PCR直接连接法(SDLPCR)合成全长2616bp的bsAb重链基因。

根据人抗VEGF-A IgG1轻链氨基酸序列及人抗ANG2IgG1轻链氨基酸序列，设计5’端含Not I酶切位点，KOZAK序列及前导序列，3’端含Psi I酶切位点的PCR引物，应用PCR法扩增全长639bp的人抗VEGF-A轻链基因及全长633bp的人抗ANG2轻链基因。

2.抗VEGF-ANG2bsAb表达载体的构建：

将该bsAb重链基因用Sac I和Xho I双酶切，将轻链基因用Not I，Psi I双酶切后，用T4连接酶将重链基因连接到经Sac I和Xho I处理的真核表达载体中；将轻链基因连接到经Not I和Psi I处理的真核表达载体中。

含有重链基因的表达载体和含轻链基因(抗VEGF或抗ANG2)的表达载体(均包含phoA启动子)接着被同时转入BL21感受态大肠杆菌菌株。转化后的BL21菌株选取阳性克隆，在含50ug/mL的LB培养基(2mL)中于37℃过夜培养。之后菌株转入2L含50ug/mL的CRAP培养基中于30℃培养24小时。

菌液3000转常温离心弃上清，所得的大肠杆菌用Qiagen公司的质粒提取试剂盒裂解并提取质粒，获得含重链和轻链的表达载体。

3.抗VEGF-ANG2bsAb的表达和分离纯化

纯化后的两个表达载体用电穿孔法共转染Flp-In^TMCHO细胞(Invitrogen)，在500ug/ml新霉素(neo)存在的条件下悬浮培养，筛选阳性细胞株。

重组抗体用亲和层析法(Protein A)和分子筛层析分离提纯分子量为200kDa左右的完整双特异性抗体分子。提纯后的各个组分通过SDS-PAGE法鉴定。

具体方法：

1.上样应用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体，AKTAexplorer100进行监测。收集放大培养筛选得到的细胞培养基上清液用0.02M，pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释，以1ml/min的流速上样。

2.洗脱用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min。然后用0.02M，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体。同时用AKTAexplorer100进行监测，当出现洗脱峰时，取干净的离心管收集。每收集3ml后，立即用1M，pH9.0的Tris-HCl缓冲液调整pH值至7.0。

实施例2

抗原抗体结合测试(ELISA法)：

1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗原(hVEGF-A或ANG2)稀释至蛋白质含量为5μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.加样：加一定稀释的待检抗体(anti-VEGF Fab，anti-ANG2单抗或anti-VEGF-ANG2bsAb)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体(羊抗人IgG-gamma)：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

实验结果：

单独测试bsAb与VEGF或ANG2结合能力时，该双特异性抗体与抗原的结合能力与单一特异性的对应单抗于抗原的结合能力相同(图6，图7)。图8显示，该双特异性抗体能够特异性的同时结合VEGF和ANG2，而单一特异性的bevacizumab或抗ANG2单抗没有这种能力。

实施例3

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人鼻咽癌CNE裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/ANG2双特异性抗，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：

TV＝0.52×a×b²

其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV

表3.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人鼻咽癌CNE裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表3顺铂组10mg/kg，对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为73.68％，但对实验动物的体重具有显著性的影响；恩度组2.5mg/kg，对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为45.10％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为55.17％，61.25％，50.45％，对实验动物体重无显著性影响。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人鼻咽癌CNE移植瘤的生长有最好的抑制作用；与阳性对照顺铂组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例4

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/ANG2双特异性抗，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：

TV＝0.52×a×b²

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV

表4.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表4，5-Fu(5-氟尿嘧啶)组10mg/kg，对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率为80.95％，但5-Fu毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡；恩度组2.5mg/kg，对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率为19.84％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤的抑瘤率达40.48％，69.84％，55.56％，对裸鼠体重没有显著性影响。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人甲状腺癌SW-579裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人甲状腺癌SW-579移植瘤的生长有显著性的抑制作用；与阳性对照顺铂组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。

实施例5

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人胰腺癌SW-1990裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

TV＝0.52×a×b²

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV

表5抗VEGF/ANG2双特异性抗对人胰腺癌SW-1990裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表5，5-Fu组10mg/kg，对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤的抑瘤率为78.52％；恩度组2.5mg/kg，对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤的抑瘤率为35.16％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤的抑瘤率达77.09％，64.30％，48.77％。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人胰腺癌SW-1990裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗6mg/kg组和抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组都对人胰腺癌SW-1990移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例6

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人肺癌H460裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

TV＝0.52×a×b²

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV

表6.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表6，紫杉醇组10mg/kg，对人肺癌H460裸小鼠移植瘤的抑瘤率为70.05％；恩度组2.5mg/kg，对人肺癌H460裸小鼠移植瘤的抑瘤率为23.46％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人肺癌H460裸小鼠移植瘤的抑瘤率达75.88％，60.64％，34.32％。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人肺癌H460裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗6mg/kg组和抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人肺癌H460移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例7

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人食管癌Ec 109裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

TV＝0.52×a×b²

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV

表7.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人食管癌Ec109裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表7，紫杉醇组10mg/kg，对人食管癌Ec109裸小鼠移植瘤的抑瘤率为69.41％；恩度组2.5mg/kg，对人食管癌Ec109裸小鼠移植瘤的抑瘤率为50.02％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人食管癌Ec 109裸小鼠移植瘤的抑瘤率达59.54％，78.76％，50.21％％。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人食管癌Ec 109裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人食管癌Ec109移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例8

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

TV＝0.52×a×b²

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV

表8.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表8，紫杉醇组10mg/kg，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为75.29％；恩度组2.5mg/kg，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率为65.45％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的抑瘤率达70.71％，81.57％，45.57％。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗6mg/kg组和抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组都对人乳腺癌MDA-MB-231移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例9

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人肾癌A498裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

取对数生长期的人肾癌A498细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表9.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表9，紫杉醇组10mg/kg，对人肾癌A498裸小鼠移植瘤的抑瘤率为85.53％；恩度组2.5mg/kg，对人肾癌A498裸小鼠移植瘤的抑瘤率为32.57％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人肾癌A498裸小鼠移植瘤的抑瘤率达71.49％，65.17％，57.33％。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人肾癌A498裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗6mg/kg组和抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人肾癌A498移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例10

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验

取对数生长期的人胆囊癌GBC-SD细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表10.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人胆囊癌GBC-SD裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表10，紫杉醇组10mg/kg，对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠移植瘤的抑瘤率为76.75％；恩度组2.5mg/kg，对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠抑制瘤的抑瘤率为28.53％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人胆囊癌GBC-SD裸小鼠移植瘤的抑瘤率为58.21％，65.80％，54.85％。

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人胆囊癌GBC-SD小鼠移植瘤的抑瘤率的试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人胆囊癌GBC-SD移植瘤的生长抑制作用最明显。

实施例11

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人结肠癌HT-29裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表11抗VEGF/ANG2双特异性抗对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表11，紫杉醇组10mg/kg，对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为67.43％；恩度组2.5mg/kg，对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为32.66％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.74％，62.04％，51.33％

因此，抗VEGF/ANG2双特异性抗对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人结肠癌HT-29移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例12

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人卵巢癌SK-OV-3细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；顺铂组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表12.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表12，顺铂组10mg/kg，对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤的抑瘤率为75.43％；恩度组2.5mg/kg，对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤的抑瘤率为22.62％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤的抑瘤率为59.59％，70.12％，50.08％。

因此，抗VEGF/ANG2双特异性抗对人卵巢癌SK-OV-3裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人卵巢癌SK-OV-3移植瘤的生长有显著性的抑制作用，抗VEGF/ANG2双特异性抗6mg/kg组对人卵巢癌SK-OV-3移植瘤的生长也有一定的抑制作用。

实施例13

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人宫颈癌HeLa裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表13.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表13，紫杉醇组10mg/kg，对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为65.34％；恩度组2.5mg/kg，对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为52.42％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.76％，72.04％，51.86％

因此，抗VEGF/ANG2双特异性抗对人宫颈癌HeLa裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人宫颈癌HeLa移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例14

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人前列腺癌DU-145裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人前列腺癌DU-145细胞株，在无菌条件下后制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；顺铂组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表14.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人前列腺癌DU-145裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表14，顺铂组10mg/kg，对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤的抑瘤率为71.38％；恩度组2.5mg/kg，对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤的抑瘤率为21.30％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤的抑瘤率为46.24％，65.72％，56.38％。

因此，抗VEGF/ANG2双特异性抗对人前列腺癌DU-145裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人前列腺癌DU-145移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例15

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人膀胱癌HT1376裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人膀胱癌HT1376细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表15.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人膀胱癌HT1376裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表15，紫杉醇组10mg/kg，对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤的抑瘤率为67.58；恩度组2.5mg/kg，对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤的抑瘤率为32.42％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤的抑瘤率为40.70％，62.03％，51.80％。

因此，抗VEGF/ANG2双特异性抗对人膀胱癌HT1376裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人膀胱癌HT1376移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

实施例16

抗VEGF/ANG2双特异性抗对人睾丸癌5637裸小鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人睾丸癌5637细胞株，在无菌条件下后制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；顺铂组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；抗VEGF/ANG2双特异性抗高中低组分别以6，3，1.5mg/kg，每天给药1次。给药结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表16.抗VEGF/ANG2双特异性抗对人睾丸癌5637裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

结果：见表16，顺铂组10mg/kg，对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤的抑瘤率为80.54％；恩度组2.5mg/kg，对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤的抑瘤率为30.62％；抗VEGF/ANG2双特异性抗高、中、低剂量组对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤的抑瘤率为58.22％，68.94％，39.56％。

因此，抗VEGF/ANG2双特异性抗对人睾丸癌5637裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/ANG2双特异性抗3mg/kg组对人睾丸癌5637移植瘤的生长有显著性的抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 常州亚当生物技术有限公司

<120> 抗VEGF/ANG2双特异性抗体及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Leu Phe Pro Pro Leu Pro Leu Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Gly Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

35 40 45

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Gln Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

85 90 95

Lys Val Ser Gln Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

115 120 125

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

145 150 155 160

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

180 185 190

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

195 200 205

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Glu Val Glx Leu Val Glx Ser Gly Gly Gly Val Val Glx Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Glx Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Pro Thr Ile Ser Arg Asp Asx Ala Lys Asx Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Asx Met Asx Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly Glx Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215

<210> 5

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Glx Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Glx Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Glx Lys Pro Gly Glx Ser

35 40 45

Pro Glx Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Pro Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glx Gly

85 90 95

Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Glx Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.抗VEGF/ANG2双特异性抗体，其特征在于该抗体由SEQ NO.5的N端依次连接有

SEQ NO.4、SEQ NO.3、SEQ NO.2和SEQ NO.1，其中SEQ NO.5的C端通过（GGGGS）₃封闭。

2.抗VEGF/ANG2双特异性抗体双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。