JP7283806B2 - 抗ｐｄ－ｌ１／ｖｅｇｆ二機能性抗体およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍免疫学の分野に関し、具体的には、抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二機能性抗体およびその用途に関する。

腫瘍（ｔｕｍｏｕｒ）は、新し生物の細胞特性および体への危険程度によって、良性腫瘍および悪性腫瘍の二つに分けることができ、ここで、悪性腫瘍疾患は、今の社会で人間の健康を危険にさらす重大な疾患であり、致死率は、二番目であり、よく見られる腫瘍は、肝臓癌、肺がん、胃がん、乳がんおよび膀胱がん等がある。報告によると、２０１８年には、世界中で焼く１８１０万人の新しい癌の症例および９６０万人の癌による死亡症例（非黒色腫皮膚がんを除いた後、それぞれ１７００万人および９５０万人）あり、ここで、１８１０万人の新しい癌の症例のちう、アジアは、ほぼ半分を占め、９６０万人の癌による死亡者のうち、アジアは、ほぼ７０％を占める。

悪性腫瘍の個人差のため、ほとんどの患者は、一般に包括的な治療を行い、つまり、治癒率を大幅に向上させ、患者の生活の質を改善するために、手術、化学療法、放射線療法、免疫治療、伝統的な中国漢方療法、介入療法およびマイクロ波療法等を総合的に使用する。ここで、免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、体の低いまたは高い免疫状態に対して、体の免疫機能を人為的に向上して、疾患を治療する目的を達成する治療方法である。様々な疾患の治療に適した免疫治療の方法は、たくさんある。腫瘍の免疫治療は、体の免疫システムを活性化し、自己免疫機能に依存して、癌細胞および腫瘍細胞を殺すことにより、腫瘍を制御および排除する治療方法を指す。従来の手術、化学療法、放射線療法および標的治療とは異なり、免疫治療の標的は、腫瘍細胞および組織ではなく、人体自身の免疫システムである。モノクローナル抗体免疫チェックポイント阻害剤、治療用抗体、癌ワクチン、細胞療法および小分子阻害剤等を含む。近年、腫瘍免疫治療の朗報が続いており、現在、例えば、黒色腫，非小細胞肺がん、腎臓がんおよび前立腺がんなどの固形腫瘍の治療において、強力な抗腫瘍活性を示し、多くの腫瘍免疫治療薬は、臨床応用のために米国ＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）によって承認された。

現在、市販される抗体薬のほとんどは、モノクローナル抗体であり、治療用モノクローナル抗体は、癌、自己免疫疾患、炎症および他の疾患の治療に使用され、そのほとんどが標的に特異的である。しかしながら、モノクローナル抗体治療を受ける患者には、耐性または無反応を発症する可能性がある。いくつかの疾患は、例えば、異なるシグナル伝達経路、異なるサイトカインおよび受容体の調節メカニズム等を含む、体に複数の影響因子を有し、単一標的の免疫療法は、癌細胞を破壊するのに十分ではないようである。従って、異なる薬物を組み合わせるか、または多重特異性抗体を使用した多重標的戦略によって達成される必要がある。

二機能性抗体は、抗体薬の研究開発の方向であるが、例えば、臨床前評価モデル、低発現レベル、安定性の低さ、複雑なプロセス、品質管理の大きな違い等の多くの課題に直面しているため、二機能性抗体の開発は、常に困難である。

従って、このぶんやでは、優れた特異性、優れた治療効果および容易な調製を備えた抗腫瘍二重抗体を開発ことが急務である。

本発明の目的は、安定した構造、良好な特異性および容易な調製を有する抗腫瘍二重抗体を提供することである。
本発明の第１の態様は、二機能性抗体を提供し、前記二機能性抗体は、
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメント、および
（ｂ）前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメントに連結する抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントを含む。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメントおよび前記抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントは、接続ペプチドによって接続される。

別の好ましい例において、前記接続ペプチドは、抗体定常領域配列を含む。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントは、重鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖可変領域、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体の領域に接続される。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントは、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体の重鎖可変領域の開始端に接続される。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントは、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体の重鎖定常領域の末端に接続される。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメントは、重鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖可変領域、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される前記抗ＶＥＧＦの抗体の領域に接続される。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメントは、前記抗ＶＥＧＦの抗体の重鎖可変領域の開始端に接続される。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメントは、前記抗ＶＥＧＦの抗体の重鎖定常領域の末端に接続される。

別の好ましい例において、前記エレメントは、リガンド、受容体またはタンパク質の細胞外領域を含む。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体は、ナノ抗体、一本鎖抗体および二本鎖抗体からなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス由来抗体）、キメラ抗体およびヒト由来抗体からなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記ヒト由来抗体は、完全ヒト由来抗体を含む。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１のエレメントは、ＰＤ－Ｌ１の受容体（例えば、ＰＤ－１）またはタンパク質の細胞外領域を含む。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦの抗体は、ナノ抗体、一本鎖抗体および二本鎖抗体からなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦの抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス由来抗体）、キメラ抗体およびヒト由来抗体からなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦのエレメントは、ＶＥＧＦの受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ）またはタンパク質の細胞外領域を含む。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントは、一価形態または多価形態（例えば、二価形態）である。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体において、前記抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントの数は、１～６であり、好ましくは、１～４である。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、ホモ二量体である。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、式Ｉに示されるＮ末端からＣ末端までの構造を有し、

ここで、
Ｄは、それぞれ独立して、存在しないか、または抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントであり、且少なくとも一つのＤは、抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、それぞれ独立して、結合またはリンカーエレメントであり、
ＶＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域を表し、
ＣＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域を表し、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
ここで、前記二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する同時にＶＥＧＦに結合する活性を有する。

別の好ましい例において、式Ｉに示されるＤは、それぞれ独立して、存在しないか、または抗ＶＥＧＦのエレメントであり、少なくとも一つのＤは、抗ＶＥＧＦのエレメントである。

別の好ましい例において、前記リンカーエレメントは、同じであっても異なっていてもよい。

別の好ましい例において、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５またはＬ６は、それぞれ独立して、ＧＳ、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）から選択される。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、および／または
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＣＤＲ１’、
アミノ酸配列がＧＩＳであるＣＤＲ２’、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ３’の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含む。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示されるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または９に示されるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい例において、前記的抗ＶＥＧＦのエレメント包括血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の第２の膜外領域Ｄ２（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）。

別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦのエレメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、二本鎖抗体である。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）を有する。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体のＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体のＬ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい例において、前記抗体は、薬物コンジュゲートの形態である。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、検出可能なマーカー、標的マーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはそれらの組み合わせをさらに含む（好ましくは、カップリングされる）。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、腫瘍標的マーカーコンジュゲートとカップリングされる。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、前記二機能性抗体の活性フラグメントおよび／または誘導体をさらに含み、ここで、前記活性フラグメントおよび／または前記誘導体は、前記二機能性抗体の７０～１００％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％）の抗ＰＤ－Ｌ１活性および７０～１００％の抗ＶＥＧＦ活性を保持する。

別の好ましい例において、前記抗体の誘導体は、本発明の抗体と少なくとも８５％の配列同一性を有する。

別の好ましい例において、前記抗体の誘導体は、一つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換後に少なくとも８５％の同一性を保持する本発明の抗体の配列である。

別の好ましい例において、前記抗体の誘導体は、本発明の抗体と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有する。

別の好ましい例において、前記置換は、保存的な置換である。

別の好ましい例において、前記二機能性抗体は、式ＩａまたはＩｂに示されるＮ末端からＣ末端までの構造を有し、

ここで、
Ｄは、抗ＶＥＧＦのエレメントであり、
Ｌ１は、存在しないかまたはリンカーエレメントであり、
ＶＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域を表し、
ＣＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域を表し、
「～」は、ジスルフィド結合を表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
ここで、前記二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する同時にＶＥＧＦに結合する活性を有する。

別の好ましい例において、前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ３を含む。

別の好ましい例において、前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＣＤＲ１’、アミノ酸配列がＧＩＳであるＣＤＲ２’およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ３’を含む。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示されるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または９に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明の第２の態様は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体をコードする。

別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、前記二機能性抗体のＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを有する。

別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、前記二機能性抗体のＨ鎖をコードするポリヌクレオチドを有する。

別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドにおいて、Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドとＨ鎖をコードするポリヌクレオチドとの比は、１：１である。

本発明の第３の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第２の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。

別の好ましい例において、前記ベクターは、本発明の第２の態様に記載のポリヌクレオチドのすべてのポリヌクレオチドを同時に含む。

別の好ましい例において、前記ベクターは、それぞれ本発明の第２の態様に記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。

別の好ましい例において、前記ベクターは、発現ベクターである。

別の好ましい例において、前記ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルスまたは他のベクターを含む。

本発明の第４の態様は、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第３の態様に記載のベクターまたはゲノム中に本発明の第２の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた。

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗体を調製する方法を提供し、

（ｉ）適切な条件下で、本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養して、本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体を含む混合物を得る段階と、および
（ｉｉ）段階（ｉ）で得られた混合物を精製および／または単離することにより、本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体を得る段階とを含む。

別の好ましい例において、前記精製は、タンパク質Ａアフィニティーカラムによって精製および単離して標的抗体を得ることができる。

別の好ましい例において、精製および単離後の前記標的抗体の純度は、９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、９９％を超え、好ましくは、１００％である。

本発明の第６の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（Ｉ）本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体、および
（ＩＩ）薬学的に許容されるベクターを含む。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、追加の抗腫瘍剤をさらに含む。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、単位剤形である。

別の好ましい例において、前記抗腫瘍剤は、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、アキシチニブ（Ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｖａｔｉｎｉｂ）またはペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を含む。

別の好ましい例において、前記抗腫瘍剤は、前記二機能性抗体と別個のパッケージに別々に存在することができるか、または前記抗腫瘍剤は、前記二機能性抗体とカップリングされることができる。

別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、胃腸投与剤形または非経口投与剤形を含む。

別の好ましい例において、前記非経口投与剤形は、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、または腔内注射を含む。

本発明の第７の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、前記免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分を含む。

別の好ましい例において、前記コンジュゲート部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素、放射性核種、生物学的毒性素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）、抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等から選択される。

別の好ましい例において、前記抗体部分および前記カップリング部分は、化学結合またはリンカーを介してカップリングされる。

本発明の第８の態様は、（ａ）検出試薬またはキットを調製するために使用されること、および／または（ｂ）癌または腫瘍を予防および／または治療する医薬組成物を調製するために使用される、本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体または本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。

別の好ましい例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記腫瘍は、卵巣がん、結腸癌、直腸がん、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓癌、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頚部癌、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体腫瘍および骨肉腫からなる群から選択される。本発明の方法で治療することができる他の癌の例は、骨肉腫、膵臓がん、皮膚がん、前立腺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、肛門がん、精巣がん、ファロピウス管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰部腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および慢性リンパ芽球性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベスト誘発がんを含む環境誘発がん、および前記癌の組み合わせを含む。

別の好ましい例において、前記腫瘍は、直腸がん、非小細胞性肺がん、黒色腫、膀胱がん、またはそれらの組み合わせである。

別の好ましい例において、前記腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを高度に発現する腫瘍である。

別の好ましい例において、前記薬物または製剤は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ（発現陽性的）に関連する疾患を予防および／または治療するための薬物または製剤を調製するために使用される。

別の好ましい例において、前記抗体は、薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態である。

別の好ましい例において、前記検出試薬またはキットは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ関連疾患の診断に使用される。

別の好ましい例において、前記検出試薬またはキットは、サンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質を検出する。

別の好ましい例において、前記検出試薬は、検出チップである。

本発明の第９の態様は、ＣＡＲ構築物を提供し、前記ＣＡＲ構築物の抗原結合領域は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合領域およびＶＥＧＦに特異的に結合する結合領域を含み、前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合領域は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有し、ここで、

前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ３を含み、
前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＣＤＲ１’、アミノ酸配列がＧＩＳであるＣＤＲ２’およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ３’を含む。

別の好ましい例において、前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合領域は、血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の第２の膜外領域Ｄ２（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）を含む。

別の好ましい例において、前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明は、前記ＣＡＲ構築物をコーティング核酸配列をさらに含む。

本発明は、前記前記ＣＡＲ構築物をコーティング核酸配列を含むベクターをさらに提供する。

本発明の第１０の態様は、本発明の第９の態様に記載の外因性ＣＡＲ構築物を発現する組換え免疫細胞を提供する。

別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）に由来する。

本発明は、安全かつ要綱な量の本発明の第１の態様に記載の二機能性抗体、または本発明の第６の態様に記載の医薬組成物、または本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲート、または本発明の第１０の態様に記載の免疫細胞、またはそれらの組み合わせを必要とする対象に投与する段階を含む、腫瘍を治療するための方法をさらに提供する。

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

二機能性抗体９００３８７および９００３８８の構造マップを示す。 二機能性抗体９００３８７および９００３８８のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図を示す。ここで、レーン１：９００３８７酸化型または還元型、レーン２：９００３８８酸化型または還元型。 二重特異性抗体および比標的分子の非特異的吸着検出のセンサーグラムを示す。 細胞密度（Ａ）、生存率（Ｂ）、ｐＨ（Ｃ）、乳酸代謝（Ｄ）、発現レベル（Ｅ）、純度（Ｆ）を含むリアクター培養の結果を示す。２２３：インターバル給餌、３３℃までに冷却、２２５：インターバル給餌、３１℃までに冷却、毎日給餌、３１℃までに冷却。 各グループの動物の腫瘍体積（Ａ）および相対的な腫瘍体積変化傾向（Ｂ）を示す。注：図面に示されるのは、各グループの動物の腫瘍体積の平均値±ＳＥＭであり、ｂ．ｉ．ｗ．週２回、ｉ．ｖ．静脈内注射。 Ｄ３２日の各グループの腫瘍重量（ｇ）を示す。注：図面に示されるのは、各グループの動物の体重の平均値±ＳＥＭであり、ｂ．ｉ．ｗ．週２回、ｉ．ｖ．静脈内注射。

広範囲にわたる詳細な研究を通じて、本発明者らは、抗ＰＤ－Ｌ１の抗体および抗ＶＥＧＦナノ抗体が直列に構成された二機能性抗体を予期せずに獲得した。好ましくは、本発明の二機能性抗体は、ホモ二量体である。インビトロ実験によると、本発明の二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＶＥＧＦと同時に結合することにより、ＰＤ－Ｌ１陽性および／またはＶＥＧＦの腫瘍細胞（特に、悪性腫瘍細胞）に対する治療効果を発揮することができ、従って、本発明の二機能性抗体は、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬物として開発することができる。これに基づいて、本発明者らは、本発明を完成させた。

用語
本発明をより容易に理解するために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書で明確に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。

本発明で使用されるアミノ酸３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載されるとおりである。

本明細書に使用されるように、「投与」および「処理」という用語は、動物、ヒト、受験者、細胞、組織、器官または生体液への外因性薬物、治療剤、診断剤または組成物の適用を指す。「投与」および「処理」は、治療、薬物動態学、診断、研究および実験方法を指すことができる。細胞の処理は、試薬と細胞との接触、および試薬と流体との接触ならびに流体と細胞との接触を含む。「投与」および「処理」は、さらに、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞によるインビトロおよびエクスビボでの処理を意味する。「処理」がヒト、動物または研究受験者に適用される場合、治療処理、予防または予防措置、研究および診断を指し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体およびヒトまたは動物、受験者、細胞、組織、生理学的区画（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）または生理液の接触を含む。

本明細書に使用されるように、「治療」という用語は、一つまたは複数の疾患症状を有する患者への、本発明の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体およびその組成物のいずれかの一つを含む、内部または外部用の治療剤の投与を指し、よく知られている前記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有する。一般に、一つまたは複数の疾患の症状を緩和するのに有効な量（治療有効量）の治療剤を患者に投与する。

本明細書に使用されるように、「任意」または「任意的に」という用語は、後で説明されるイベントまたは状況が発生する可能性があるが、必須ではないことを意味する。例えば、「任意に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が必ずしもそうであるとは限らないが、１個、２個または３個であり得ることを意味する。

本発明で説明される「配列同一性」とは、適切な置換、挿入または欠失等の突然変異と比較される場合の二つの核酸または二つのアミノ酸配列間の同一性の程度を指す。本発明で説明される配列とその同一性を有する配列との間の配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％、好ましくは、少なくとも９５％であり得る。非限定的な実施例は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％を含む。

一般に、「抗体」は、「免疫グロブリン」とも呼ばれ、天然または従来の交代であり得、ここで、二つの重鎖は、ジスルフィド結合によって相互に接続され、各重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合によって接続される。軽鎖には、λ（ｌ）およびκ（ｋ）の二種類が存在する。抗体分子の機能活性を決定する重鎖には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの五つの主なタイプ（またはアイソタイプ）が存在する。各鎖は、異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）の二つのドメインまたは領域を含む。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および三つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる）の四つのドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域の両方とも、抗原に対する結合識別および特異性を決定する。軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常領域（ＣＨ）は、例えば、抗体鎖の結合、分泌、経胎盤移動、補体結合、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の結合等の重要な生物学的特性をもたらす。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンＦａｂフラグメントのＮ－末端部分であり、一つの軽鎖および一つの重鎖の可変部分で構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定領域との間の構造的相補性に依存する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。時折、非超可変またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、全体的なドメイン構造に影響を与え、従って、結合部位に影響を与える。相補性決定領域またはＣＤＲは、結合親和力と天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の特異性を共同に限定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－ＬおよびＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈと呼ばれる三つのＣＤＲを有する。従って、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む六つのＣＤＲを含む。

本明細書に使用されるように、「単一ドメイン抗体」および「ナノ抗体」という用語は、同じ意味を有し、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築することを指し、それは、完全な機能を有する最小の抗原結合フラグメントである。通常、最初に軽鎖および重鎖定常領域１（ＣＨ１）が天然に欠失した抗体を獲得した後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築する。

本明細書に使用されるように、「可変」という用語は、抗体において、可変領域の特定の部分が配列上で異なり、特定の抗体に対する様々な特定の抗原の結合および特異性を形成することを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域全体に均等に分布されない。これは、軽鎖および重鎖可変領域において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中される。可変領域のより保存的部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ四つのＦＲ領域を含み、これらは、大抵β－折り畳み構成であり、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続され、場合によって、部分的なβ－折り畳み構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して緊密に配置され、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１－３２４２、Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ、６４７－６６９ページ（１９９１）を参照）を形成する。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、例えば、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、異なるエフェクター機能を示す。

本明細書に使用されるように、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入するアミノ酸配列、つまり、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的に保存する免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる四つのＦＲを有する。相応的に、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と呼ばれることができ、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と呼ばれることができる。好ましくは、本発明のＦＲは、ヒト抗体ＦＲまたはその誘導体であり、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は、天然に存在するヒト抗体ＦＲと基本的に同じであり、即ち、配列同一性は、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。

ＣＤＲのアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。

本明細書に使用されるように、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と基本的に同じ（約８５％またはそれ以上、具体的には、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）フレームワーク領域である。

本明細書に使用されるように、「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、特定の抗原に対して単一のアミノ酸を有する抗体分子を指し、特定の方法による当該抗体の生成を必要とするものとして理解されるべきではない。モノクローナル抗体は、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一クローンによって生成することができるが、組換え、つまり、タンパク質工学によって生成することもできる。

本明細書に使用されるように、「抗原」または「標的抗原」という用語は、抗体または抗体様結合タンパク質によって結合されることができる分子または分子の一部を指す。当該用語は、さらに、当該抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成するために動物で使用されることができる分子または分子の一部を指す。標的抗原は、一つまたは複数のエピトープを有することができる。抗体または抗体様結合タンパク質によって識別される各標的抗原について、抗体様結合タンパク質は、標的抗原を識別する完全な抗体と競合することができる。

本明細書に使用されるように、「親和力」という用語は、理論的には、完全な抗体と抗原との間のバランスによって定義される。本発明の二重抗体の親和力は、ＫＤ値（解離定数）（または他の測定方式）、例えば、ＦｏｒｔｅｂｉｏＲｅｄ９６機器を使用して決定するバイオレイヤー干渉技術（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）によって評価または測定されることができる，。

本明細書に使用されるように、「リンカー」という用語は、免疫グロブリンドメインへ挿入して、軽鎖および重鎖ドメインが折りたたまれて二重可変領域免疫グロブリンの一つまたは複数のアミノ酸残基を交換するのに十分な移動度を提供する。本発明で説明されるリンカーは、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４を指し、ここで、Ｌ１およびＬ４リンカーは、二つの抗ＶＥＧＦ抗体を接続し、Ｌ２は、本発明の二重抗体重鎖抗ＶＥＧＦ抗体二量体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域ＶＬとを接続し、Ｌ３は、本発明の二重抗体軽鎖抗ＶＥＧＦ抗体二量体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域ＣＨとを接続する。

適切なリンカーの例は、モノグリシン（Ｇｌｙ）またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含み、リンカーのアミノ酸残基の標識および配列は、リンカーに実装する必要のある二次構造エレメントのタイプによって異なることができる。好ましいリンカーであるＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５またはＬ６は、それぞれ独立して、ＧＳ、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）から選択される。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体
プログラム細胞死タンパク質－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＤ－１）は、近年発見された負の共刺激分子であり、ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーである。ＰＤ－１は、通常、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞で発現し、プログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）およびＰＤ－Ｌ２の二つの天然リガンドを有し、どちらもＢ７スーパーファミリーに属し、抗原提示細胞中で発現し、ＰＤ－Ｌ１は、様々な組織でも発現する。ここで、ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１の重要な負の免疫調節因子であり、Ｂ７－Ｈ１とも呼ばれ、ＰＤ－１との結合は、Ｔ細胞活性化の共阻害シグナルを媒介し、Ｔ細胞活性化および増殖を阻害し、ＣＴＬＡ－４と同様に負の調節効果を果たし、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することができる。それに、研究報告によると、腫瘍のマイクロ環境も、免疫細胞の破壊から腫瘍細胞を保護することができるため、腫瘍細胞を認識することができず、免疫回避現象が発生する。それに、腫瘍のマイクロ環境は、ＰＤ－Ｌ１持続的に発現し、腫瘍患者の免疫機能を極端に低下させる。

華僑科学者である陳列平の研究室は、ＰＤ－Ｌ１が腫瘍組織で高度に発現し、腫瘍浸潤ＣＤ８Ｔ細胞の機能を調節することを最初に発見した。従って、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫調節は、抗腫瘍にとって非常に重要である。近年、腫瘍免疫治療の臨床研究において、様々な抗Ａｎｔｉ－ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体が急速に開発されている。現在、ペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）およびニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）は、進行性黒色腫についてＦＤＡから承認されており、最近、ニボルマブは、進行性扁平上皮非小細胞肺がんの治療薬として米国ＦＤＡから承認されておる。さらに、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗－ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、Ａｖｅｌｕｍａｂ（抗－ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）等も、非小細胞癌，黒色腫，膀胱がん等の複数の腫瘍タイプを対象とした複数の進行性臨床研究に参加している。

本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の配列は、既知であるか、または従来の方法によって調整されるか、またはスクリーニングによって開発される抗体であり得る。好ましくは、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、スクリーニングによって得られ、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＣＤＲ１’、アミノ酸配列がＧＩＳであるＣＤＲ２’およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ３’を含む。

当業者は、一つまたは複数のアミノ酸残基を追加、欠失および／または置換する等、当業者に周知の技術によって本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を修飾または改変することができ、それにより、抗ＰＤ－Ｌ１の親和力または構造安定性をさらに増加させ、従来の測定方法で、就職または改変された結果を獲得することができる。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示されるアミノ酸配列（下線は、標識された順序の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である）を有する。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＧＹＴＩＨＷＶＫＱＲＳＧＬＧＬＥＷＬＧＷＦＹＰＧＳＧＴＬＫＹＮＥＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＶＹＬＥＬＳＲＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＨＧＴＧＴＬＭＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＧＹＴＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＴＬＫＹＳＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＫＳＬＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＴＧＴＬＭＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）

別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または９に示されるアミノ酸配列（下線は、標識された順序の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３的アミノ酸配列である）を有する。
ＤＶＶＶＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＦＧＤＱＶＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＡＮＳＹＧＮＴＹＬＳＷＹＬＨＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＧＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＴＩＫＰＥＤＬＧＭＹＹＣＬＱＧＴＨＱＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＡＮＳＹＧＮＴＹＬＳＷＹＬＨＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＧＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＬＱＧＴＨＱＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）

本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体二量体は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞を発現させることによって獲得することができる。

本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、哺乳動物ＰＤ－Ｌ１に結合し、好ましくは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。

本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＰＤ－Ｌ１との結合親和力は、９．４０Ｅ－１０ Ｍであり、好ましくは、５Ｅ－０９Ｍ以上である。

別の好ましい例において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒト由来抗体である。

抗ＶＥＧＦ抗体
血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、ＶＥＧＦとも呼ばれる。ＶＥＧＦタンパク質は、１９８９年に米国の二つのバイオテクノロジー企業の科学者によってそれぞれ精製および同定され、その遺伝子配列をクローンおよび測定し、ＶＰＦとＶＥＧＦとは、同じ遺伝子によってをコードされる同じタンパク質であることを証明した。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄおよび－Ｅの六つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を有し、その分子量は、３５～４４ｋＤａの範囲であり、各アイソフォームは、三つの「血管内皮増殖因子受容体」（ＶＥＧＦＲ－１、－２および－３）の特定の組み合わせに特異的に結合する。しかし、研究によると、これらの受容体は、ＶＥＧＦファミリー分子の親和力と異なり、ここで、ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦファミリーとの親和力が比較的に高いことを示した。

ＶＥＧＦは、高度に保存されたホモ二量体糖タンパク質である。分子量がそれぞれ２４ｋＤａである二つの一本鎖は、ジスルフィド結合を持つ二量体を形成する。ＶＥＧＦによって分解されたモノマーは、不活性であり、Ｎ２グリコシルの除去は、生物学的効果に影響を与えないが、細胞分泌に役割を果たす可能性がある。ｍＲＮＡの剪断方式が異なるため、それぞれＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８５およびＶＥＧＦ２０６等の少なくとも五つのタンパク質形態が生成され、ここで、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５は、分泌型可溶性タンパク質であり、血管内皮細胞に直接作用して血管内皮細胞増殖を促進することができ、血管透過性を向上する。１９９０年、米国のハーバード大学のフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）博士は、有名なフォークマン理論を提唱し、つまり、必ず血管新生の生成に依存して十分な酸素および栄養素を提供することにより腫瘍組織の成長を維持するため、ＶＥＧＦ臨床応用の基礎であると考えられる。特許ＣＮ １０３３１９６１０を参照すると、発明者らは、ＶＥＧＦＲ１の第２の膜外ドメインＤ２（Ｄｏｍａｉｎ２）に隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を付加するのは、強力なＶＥＧＦ結合活性を有し、従って、例えば、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２－Ｆｃ等の組換え融合タンパク質の薬物を開発する。

本発明の好ましい例において、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、抗ＶＥＧＦのエレメントとして選択される。
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）

好ましくは、本発明のＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のどちらの末端に接続されても、二つの同じＶＥＧＦＲ１Ｄ２がリンカーによって接続されて二量体の形態として現れる。

二機能性抗体（二重特異性抗体）
二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｓＡｂ）は、二つの異なる抗原またはタンパク質を同時に標的とし、二つの異なるシグナル伝達経路を遮断し、特異的免疫応答を刺激することができる非天然抗体であり、その特異性および二機能性は、腫瘍免疫治療においてますます重要な役割を果たし、今は世界の腫瘍の抗体工学治療における研究のホットスポットになっている。研究によると、二重特異性抗体は、主に腫瘍免疫治療における免疫細胞による腫瘍の死滅を仲介し、二重標的と結合し、二重シグナル伝達経路を遮断し、独特の機能または重複した機能を発揮して、耐性を効果的に防ぐことができ、強い特異性および標的性を有し、脱標的毒性を低下させ、治療原価を効果的に低減する等の利点（抗体サークルを参照）を有するため、二重特異性抗体薬を使用すると、腫瘍細胞が逃げる可能性を減らし、腫瘍細胞を排除し、治療効果を向上させることができる。

二重特異性抗体は、２ハイブリドーマ細胞、化学的カップリングおよび組換え遺伝子等の手段によって調製されることができ、ここで、組換え遺伝子技術は、結合部位および収量等において強い柔軟性を有する。不完全な統計によると、現在、６０を超える二重特異性抗体を有し、その特性および構造の違いにより、二重特異性抗体の構造は、主にＦｃフラグメントを含む二重特異性抗体（Ｆｃを媒介したエフェクター機能を有するＩｇＧ－ｌｉｋｅ二重特異性抗体）およびＦｃフラグメントを含まない二重特異性抗体（抗原結合能力を介して役割を果たし、低分子量、低免疫原性等の利点を有するｎｏｎ－ＩｇＧ－ｌｉｋｅ二重特異性抗体）の二つの構造を有する。２０１４年１２月０３日、米国ＦＤＡは、急性リンパ芽球性白血病の治療に使用される、アムジェン会社が開発した二重特異性抗体ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）の市販を承認した。ブリナツモマブは、ＣＤ１９およびＣＤ３の二重特異性抗体であり、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）は、米国ＦＤＡによって承認された最初の二重特性抗体である。

本明細書に使用されるように、「二重特異性抗体」、「二機能性抗体」「本発明の抗体」、「本発明の二重抗体」、「二重抗体」および「二機能性融合抗体」という用語は、交換可能に使用され、ＰＤ－Ｌ１とＶＥＧＦとに同時に結合する抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体を指す。

本発明において、前記二機能性抗体は、
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメント、および
（ｂ）前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体またはエレメントに連結する抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントを含む。

好ましい実施形態において、前記二機能性抗体は、式Ｉに示されるＮ末端からＣ末端までの構造を有し、

ここで、
Ｄは、それぞれ独立して、存在しないか、または抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントであり、且少なくとも一つのＤは、抗ＶＥＧＦの抗体またはエレメントであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、それぞれ独立して、結合またはリンカーエレメントであり、
ＶＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域を表し、
ＣＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域を表し、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
ここで、前記二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する同時にＶＥＧＦに結合する活性を有する。

好ましい実施形態において、本発明の二重抗体は、ＰＤ－Ｌ１抗体およびＶＥＧＲ１Ｄ２との融合によって形成され、相互に対称する二つのペアのペプチド鎖を有し、各ペアのペプチド鎖は、軽鎖Ｌ鎖および重鎖Ｈ鎖を含み、すべてのペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって接続され、ここで、任意の一つのペアのペプチド鎖は、式ＩａまたはＩｂに示されるＮ末端からＣ末端までのＬ鎖およびＨ鎖の構造を有し、

ここで、
Ｄは、抗ＶＥＧＦのエレメント（ＶＥＧＲ１Ｄ２）であり、
Ｌ１は、存在しないかまたはリンカーエレメントであり、
ＶＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域を表し、
ＣＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域を表し、
「～」は、ジスルフィド結合を表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
ここで、前記二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する同時にＶＥＧＦに結合する活性を有する。

式Ｉａまたは式Ｉｂにおいて、好ましいＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示され、好ましいＬ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。
Ｈ鎖：（重鎖可変領域でのＶＥＧＲ１Ｄ２のアミノ酸配列）
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＧＹＴＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＴＬＫＹＳＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＫＳＬＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＴＧＴＬＭＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｈ鎖：（重鎖定常領域でのＶＥＧＲ１Ｄ２のアミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＧＹＴＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＴＬＫＹＳＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＫＳＬＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＴＧＴＬＭＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
Ｌ鎖：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＡＮＳＹＧＮＴＹＬＳＷＹＬＨＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＧＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＬＱＧＴＨＱＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）

式Ｉａまたは式Ｉｂの構造式に示される二つの配列は、Ｈ鎖のジスルフィド結合によって接続され、それにより、対称的な二機能性抗体の構造を形成する。

本発明の二重抗体は、完全な抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体と他の配列とによって形成された融合タンパク質をさらに含む。従って、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体および類似体をさらに含む。本明細書に使用されるように、「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）一つのまたは複数の保存的または非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされる場合とされない場合であり得る）、または（ｉｉ）一つのまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチドまたは（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質配列または６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示によると、これらのフラグメント、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内である。

本発明の二重抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＶＥＧＦ活性を有し、前記式Ｉの構造のうちの二つを含む抗体を指す。当該用語は、式Ｉの前記構造をのうちの二つを含む、本発明の二重抗体と同じ機能を有する抗体の変異形態を含む。これらの変異形態（これらに限定されない）は、一つまたは複数（通常は、１～５０個、好ましくは、１～３０個、より好ましくは、１～２０個、最も好ましくは、１～１０である）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、およびＣ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数（通常は、２０個以下、好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５個以下である）のアミノ酸の追加を含む。例えば、この分野において、通常、性能が同様または類似のアミノ酸を使用して置換する場合、タンパク質の機能を変更しない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数のアミノ酸の追加も、通常、タンパク質の機能を変更しない。当該用語は、本発明の二重抗体の活性フラグメントおよび活性誘導体をさらに含む。

当該二重抗体の変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低いストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコーティングＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。

本発明において、「本発明の二重抗体の保存的変異体」は、本発明の二重抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が同様または類似の性質を有するアミノ酸の置換によって形成されたポリペプチドを指す。これらの保存性変異体ポリペプチドは、表Ａに従って、アミノ酸置換を行うことにより生成されるのが最もよい。

コーティング核酸および発現ベクター
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加のコード配列）および非コード配列を含む。

「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。

本発明の核酸（および核酸の組み合わせ）は、適切な発現系において本発明の組換え抗体を精製することに使用されることができる。

本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃等のより低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイズおよび溶出、または（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２℃等の変性剤の添加、または（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。

本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。特にフラグメントの長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さなフラグメントを合成した後、接続して非常に長い配列のフラグメントを獲得する。さらに、重鎖のコード配列および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。

関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大領に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に移し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって行われる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。

現在、完全に科学的合成によって本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。

本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。

宿主細胞は、例えば、細菌細胞等の原核細胞、または例えば、酵母細胞等の下等真核細胞、または例えば、哺乳動物細胞等の上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、チャイニーズハムスター菌の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７および２９３細胞の動物細胞等を含む。

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ_２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ_２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。

得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。

初期の培養条件において、二重特異性抗体の発現レベルは、３．９ｇ／Ｌに達し、純度は、９７％以上であり得、培養プロセス中に乳酸を十分に代謝することができる。

前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜で発現されるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本発明の二重抗体は、単独で使用することができ、検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、または任意のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングすることができる。

診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。

本発明の抗体と結合またはカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物学的毒性、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．腫瘍治療剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態の抗腫瘍薬等を含むが、これらに限定されない。

医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、本発明の前記二重特異性抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質および薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物である。一般に、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（腹膜内等）、頭蓋内注射、または腔内注射をふくむが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質分子またはＰＤ－Ｌ１に結合するために直接使用することができるため、腫瘍を治療するために使用されることができる。さらに、他の治療剤と同時に使用されることもできる。

本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の前記ナノ抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の役１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤とともに使用することもできる。

本発明において、二重特異性抗体を単独で使用することができ、投与計画を調整して、最適の目標反応を得ることができる。例えば、単回投与、または一定期間にわたる複数回投与、または治療状況の緊急性に応じて、投与量を比例的に減少または増加することができる。

医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートが哺乳動物に陽よされ、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。

本発明の主な利点は、次のとおりである。
１．本発明の二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＶＥＧＦとに同時に結合することができ、二機能性抗体および結合標的の結合構成を不変に保つことができ、分子は、安定している。
２．本発明の二重特異性抗体ＨＢ００２５は、組換えヒトＰＤ－Ｌ１および組換えヒトＶＥＧＦ１６５に特異的に結合（ＫＤは、１０^－５Ｍ未満）することができ、非標的分子との非特異的な静電的および疎水性結合効果を有さなく、最初の培養条件において、二重特異性抗体の発現レベルは、３．９ｇ／Ｌに達し、純度は、９７％以上である。
３．本発明の二機能性抗体は、結合標的に対する高い結合親和力、良好な遮断活性を有し、特定の二重標的相乗効果を示し、腫瘍細胞（特に、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦを高発現する腫瘍）を効果的に死滅することにより、腫瘍体積および腫瘍を有意に減らし、癌を治療し、特に固形腫瘍を治療する。
４．単独の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＨＢ００２３等）および抗ＶＥＧＦ融合タンパク質（ＨＢ００２．１Ｔ等）と比較して、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに対する結合活性がより高い。具体的には、本発明の二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１の親和力は、約１Ｅ～１０ｍｏｌであり、ＶＥＧＦ１６５との親和力は、約１Ｅ～１１ｍｏｌである。
５．本発明の調製方法は、簡単で実行可能である。本発明によって申請する抗ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、良好な適用の見通しを有する。

以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。

特に明記されない限り、実施例で使用される材料または試薬は、すべて市販の製品である。

実施例１．二機能性抗体９００３８７および９００３８８の発現ベクターの構築およびタンパク質の発現および精製
本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質でマウスを免疫化した後、スクリーニングしてマウスモノクローナル抗体（重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される）を得た後、ヒト化して得られたヒト化モノクローナル抗体（９００３３９）である。ここで、重鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、軽鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。人工的に合成されたＶＥＧＦＲ１Ｄ２ （配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される）は、リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を介して重鎖発現ベクターの５’末端または３’末端に接続され、軽鎖ベクター（１：１）とともにＣＨＯ－Ｓ細胞に、３７℃、５％ＣＯ_２でコトランスフェクトされ、１３０ｒｐｍ／ｍｉｎで７日間培養した後、遠心分離して上清を収集する。上清を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５μｍフィルターメンブレンでろ過して、ろ液を収集する。ろ液をプロティン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａアフィニティーカラムで精製した後、抗体９００３８７および９００３８８を得、その構造マップは、図１に示される。精製されたタンパク質をＳＥＣ＿ＵＰＬＣによって検出され、純度は、９８％を超え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元または非還元電気泳動検出結果は、図２に示される。

９００３３９－ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（下線は、標識された順序の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＧＹＴＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＴＬＫＹＳＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＫＳＬＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＴＧＴＬＭＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
９００３３９－ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（下線は、標識された順序の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＡＮＳＹＧＮＴＹＬＳＷＹＬＨＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＧＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＬＱＧＴＨＱＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＶＥＧＦＲ１Ｄ２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴ

二重特異性抗体９００３８７および９００３８８を調製した。ここで、９００３８７のタンパク質番号は、ＨＢ００２５であり、以下の実験の関連する検出結果は、すべてＨＢ００２５として表し、その重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。

実施例２．二重特異性抗体の親和力の検出
本実施例において、ＳＰＲ法を使用して、抗体－抗原結合の動力学および親和力を測定する。

材料および機器
組換えヒトＰＤ－Ｌ１、シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、１００８４－Ｈ０８Ｈ
組換えヒトＶＥＧＦ１６５、シノバイオロジカル、１１０６６－ＨＮＡＨ
アミノカップリングキット、ＧＥ、ＢＲ－１０００－５０
ＨＢＳ－ＥＰ（１０Ｘ）、ＧＥ、ＢＲ－１００６－６９
ヒト抗体キャプチャーキット（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｒｕｅ Ｋｉｔ）、ＧＥ、ＢＲ－１００８－３９
Ｓシリーズセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５）、ＧＥ、ＢＲ－１００５－３０
ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）、ＧＥ、ビアコア ８Ｋ

方法：ヒト抗体キャプチャーキットのアミノカップリング法に従って、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｃａｐｔｕｒｅ－ＣＭ５チップを調製する。チップを室温において、２０～３０分間平衡化し、ビアコア８Ｋ機器に入れ、一過性タンパク質を平衡化緩衝液で実験作業濃度に希釈し、抗原を平衡化緩衝液で５０ｎＭに希釈した後、３倍希釈で七つの濃度勾配を設定し、二つのゼロ濃度（即ち、平衡化緩衝液）および一つの繰り返し濃度（一般に、最低濃度の繰り返し）を設定し、抗体、抗原、再生の順序に従って、往復循環して１０個の抗原濃度（二つのゼロ濃度、七つの勾配濃度および一つの繰り返し濃度）を分析し、抗原注入の流速は、３０μＬ／分であり、結合時間は、１２０秒であり、解離時間は、６００秒であり、分析完了後、対応する分析プログラムを使用してデータを分析し、明らかな参照結合（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）がないことを確認し、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１：１結合モデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｌｅ）選択して、データを適合して、ヒト―マウスキメラ抗体およびヒト由来抗体の動力学に関連するパラメーターのＫａ、ＫｄおよびＫＤ値を得る。組換えヒトＰＤ－Ｌ１および組換えヒトＶＥＧＦ１６５に対する二重特異性抗体ＨＢ００２５の親和力は、表１および表２に示される。

結果によると、二重特異性抗体ＨＢ００２５組換えヒトＰＤ－Ｌ１とは、良好な親和力を有し、二重特異性抗体ＨＢ００２５と組換えヒトＶＥＧＦ１６５とは、良好な親和力を有する。

実施例３．二重特異性抗体と非標的分子との非特異的吸着効果
本実施例において、ＳＰＲ法をしようして、抗体と非標的分子との非特異的吸着効果を測定する。

材料および機器：
卵白リゾチーム、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ３７９０
大豆膵臓阻害剤１－Ｓ型、シグマ、Ｔ－２３２７
アミノカップリングキット、ＧＥ、ＢＲ－１０００－５０
ＨＢＳ－ＥＰ（１０Ｘ）、ＧＥ、ＢＲ－１００６－６９
リゾチームのウサギポリクローナル抗体、ＡＢｃａｍ、Ａｂ３９１
抗トリプシン阻害剤抗体、ライフスパンバイオサイエンシーズ（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＳ－Ｃ７６６０９
０．８５％リン酸溶液、ＰｒｏｔｅＯｎ、１７６－２２６０
５０ｍＭ水酸化物、ＰｒｏｔｅＯｎ、１７６－２２３０
ＳシリーズセンサーチップＣＭ５、ＧＥ、ＢＲ－１００５－３０
ビアコア、ＧＥ、ビアコア ８Ｋ

方法：ＳシリーズセンサーチップＣＭ５チップを室温において、２０～３０分間平衡化し、ビアコア８Ｋ機器に入れる。アミノカップリングキットを使用して、卵白リゾチームおよび大豆膵臓阻害剤１－Ｓ型をそれぞれＣＭ５チップに固定する。注入緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＰ＋１Ｘであり、四つの平衡サイクルを設定する。リゾチームのウサギポリクローナル抗体、抗トリプシン阻害剤抗体およびヒト化モノクローナル抗体を平衡化緩衝液で１０００ｎＭに希釈し、流速を５μＬ／ｍｉｎに設定し、注入チャネル１、２および３を設定し、フローセル（Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ）１および２を設定する。結合時間は、１０分であり、解離時間は、１５分である。再生流速は、５０μＬ／ｍｉｎであり、まず０．８５％リン酸を６０秒間再生し、次に、５０ｍＭ水酸化ナトリウムを３０秒間再生する。二重特異性抗体ＨＢ００２５と非標的分子との非特異的吸着の結果は、表３に示されたようであり、二重特異性抗体と非標的分子との非特異的吸着検出センサーグラムは、図３に示されたようである。

注：一般に、緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）の影響を差し引いた後、２０ＲＵ以下の応答値の相互作用は、比較的に弱くて、無視できると考えられ、２０ＲＵを超えると、有意な相互作用があると見なされ、１００ＲＵ以上であると、非常に強い相互作用があると見なされる。

結果から、緩衝液のバックグラウンドを差し引いた後、ＨＢ００２５と大豆膵臓阻害剤１－Ｓ型およびリゾチームと結合されるシグナルは、すべて２０未満であるため、四つのサンプルは、非特異的静電結合および疎水性結合作用がないと見なすことができる。さらに、人体に抗体の注入を低下させた後、人体に対して免疫が発生し、血管腫等の一連の免疫疾患を引き起こす可能性がある。

ＳＰＲ技術をしようして、それぞれ卵白リゾチームおよび大豆膵臓阻害剤１－Ｓ型に対する抗リゾチームのウサギポリクローナル抗体および抗トリプシン阻害剤抗体の品質管理結果を通じて、卵白リゾチームおよび大豆膵臓阻害剤のアミノカップリングがＣＭ５チップに固定した後の活性は正常であり、活性も良好なままであることが確認されることができる（たとえば、結合されるシグナルがすべて２０未満である場合、サンプルは、非特異的静電および疎水性結合作用がないと見なす）。

実施例４．二重特異性抗体のインビボでの薬効の検出
４．１．二重特異性抗体の調製
図４に示されるように、ＢａｌａｎＡ培地を使用して、特定のフィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）追加して培養し、そのＣＨＯ－Ｋ１細胞株は、乳酸を十分に代謝することができ、細胞増殖状態は、良好で、１６日で獲得する場合、生存率は、９０％を超え、温度を３３℃および３１℃に下げても、発現に有意な差はなく、約３ｇ／Ｌであり、毎日の給餌は、細胞密度および発現レベルを大幅に増加させることができ、最重的な発現は、３．９ｇ／Ｌであり、培養プロセス全体の純度は、低下せず、約９７％に維持される。

４．２．インビボでの薬効実験の設計および結果
ＨＢ００２５のインビボでの薬効を検出する。ｈＣＤ３４＋ヒト化マウスの右脇の下にヒト肺腺癌ＨＣＣ－８２７細胞を接種し、腫瘍が平均約１００～１５０ｍｍ^３に成長したとき、末梢血中のｈＣＤ４５＋の比率および腫瘍体積に応じて、４８匹の担癌マウスをランダムに六つのグループに分け、各グループの八つの動物にグループＧ１のＰＢＳ、グループＧ２のＨＢ００２３（抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、実施例１のヒト化モノクローナル抗体９００３３９）１ｍｇ／ｋｇ、グループＧ３のＨＢ００２５ １ｍｇ／ｋｇ、グループＧ４のＨＢ００２５ ３ｍｇ／ｋｇ、グループＧ５のＨＢ００２５ １０ｍｇ／ｋｇおよびグループＧ６のＨＢ００２．１Ｔ（抗ＶＥＧＦ融合タンパク質、特許番号ＣＮ１０３３１９６１０Ｂ）１ｍｇ／ｋｇを尾静脉を介して投与し、２回／週、９回投与する。腫瘍体積およびマウス体重を２回／週測定した。実験中、特定のグループの動物の平均腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えるか、または実験が終了する場合、動物を安楽死させ、腫瘍の重さを量った。

実験中、ＰＢＳ溶媒対照グループ（Ｇ１）マウスの腫瘍体積は、増加し続け（図５を参照），ＨＣＣ８２７肺がん細胞ｈＣＤ３４＋ヒト化マウスの皮下移植腫瘍モデルが構築されたことを示す。Ｇ２動物にＨＢ００２３ １ｍｇ／ｋｇを投与し、投与後の腫瘍体積の増加は比較的にゆっくりとなり、同時期の溶媒対照グループと比較して、腫瘍体積および相対腫瘍体積は、比較的に減少するが、統計的差はなく、Ｄ３２試験が終了する場合、溶媒対照グループと比較して、腫瘍重量は、比較的に減少し（Ｐ＞０．０５、図５および図６を参照）、腫瘍阻害率は、１７．４８％である。Ｇ６動物にＨＢ００２．１Ｔ １ｍｇ／ｋｇを投与し、投与後、腫瘍体積がゆっくりと増加し、同時期の溶媒対照グループと比較して、腫瘍体積および相対腫瘍体積は、有意に減少し（Ｐ＜０．０５、図５を参照）、Ｄ３２試験が終了する場合、溶媒対照グループと比較して、腫瘍重量は、有意に減少し（Ｐ＜０．０５、図６を参照）、腫瘍阻害率は、６４．０８％である。

グループＧ３、Ｇ４およびＧ５の動物は、それぞれＨＢ００２５ １ ｍｇ／ｋｇ、３ ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇを投与し、投与後、腫瘍体積は、ゆっくりと増加し、腫瘍体積および相対腫瘍体積は、同時期の溶媒対照グループ（ｐ＜０．０５）よりも有意に低く、Ｄ３２試験が終了する場合、溶媒対照グループと比較して、腫瘍重量は、有意に減少し（Ｐ＜０．０５、図６を参照）、腫瘍阻害率は、それぞれ７０．８７％、８４．４７％および８５．４４％であり、ＨＢ００２５がｈＣＤ３４＋ヒト化マウスＨＣＣ８２７肺がんの皮下移植瘤の増殖を効果的に阻害することができることを示し、有効な腫瘍抑制剤の量は、１ｍｇ／ｋｇである。

１ｍｇ／ｋｇのＨＢ００２３およびＨＢ００２．１Ｔ単一標的抗体／融合タンパク質の投与と比較して、同じ量の二重特異性抗体ＨＢ００２５を投与した動物の腫瘍体積、相対腫瘍体積、腫瘍重量は、相応的に減少し（図５および図６を参照）、特定の二重標的の相乗効果を示す。

実施例５
本実施例は、実施例１で調製された二重特異性抗体９００３８８（重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される）に対する親和力、非標的分子との非特異性吸着効果およびインビボでの薬効を検出し、実験方法は、実施例２～４のＨＢ００２５を二重特異性抗体９００３８８に置き換えた。

結果によると、二重特異性抗体９００３８８と組換えヒトＰＤ－Ｌ１および組換えヒトＶＥＧＦ１６５とは、より良い親和力を有し、非特異的静電および疎水性結合作用がなくても、腫瘍を十分に治療し、動物の腫瘍体積および腫瘍重量を有意に減らすことができる。

以上の実施例によると、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞に発現されることができ、アフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製することができることを示す。得られた二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞およびＶＥＧＦ陽性細胞に結合することができる。さらに、当該抗体は、良好な親和力を有し、良好な抗ＶＥＧＦ生物学的活性を有するだけでなく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の生物学的活性も完全に保持している。従って、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、良好な適用の見通しを有する。

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態もまた添付の本出願の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。

Claims (14)

1. （ａ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体；および
   （ｂ）前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体に連結する抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメントであって、抗ＶＥＧＦエレメントがＶＥＧＦ受容体の細胞外領域である、抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメント；
   を含み、
   前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が以下の三つの相補性決定領域（すなわちＨＣＤＲ）：
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＨＣＤＲ１、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＨＣＤＲ２、および
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ３
   を含み、
   前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）が以下の三つの相補性決定領域（すなわちＬＣＤＲ）：
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＬＣＤＲ１、
   アミノ酸配列がＧＩＳであるＬＣＤＲ２、および
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＬＣＤＲ３
   を含む二機能性抗体であって、
   二機能性抗体は、式Ｉに示されるＮ末端からＣ末端までの構造を有し、
   

   

   ここで、
   Ｄは、それぞれ独立して、存在しないか、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはエレメントであり、少なくとも一つのＤは、抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメントであり、
   Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、それぞれ独立して、結合またはリンカーであり、
   ＶＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域を表し、
   ＣＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖定常領域を表し、
   ＶＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域を表し、
   ＣＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域を表し、
   「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表し、
   「－」は、ペプチド結合を表し、
   二機能性抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに同時に結合する活性を有する、
   、二機能性抗体。
2. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、および前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する；あるいは
   前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有し、および前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるアミノ酸配列を有する、
   請求項１に記載の二機能性抗体。
3. 前記抗ＶＥＧＦエレメントが、血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の第２の細胞外領域Ｄ２（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）を含む、請求項１に記載の二機能性抗体。
4. 前記二機能性抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＶＥＧＦＲ１Ｄ２との融合によって形成され、対称な二つのペアのペプチド鎖を有し、各ペアのペプチド鎖は式ＩａまたはＩｂに示されるＮ末端からＣ末端までの構造を有し、
   

   

   ここで、
   Ｄは、抗ＶＥＧＦエレメントであり、
   Ｌ３またはＬ５は、独立して、存在しないかまたはリンカーであり、
   ＶＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域を表し、
   ＣＬは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖定常領域を表し、
   ＶＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域を表し、
   ＣＨは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖定常領域を表し、
   「～」は、ジスルフィド結合を表し、
   「－」は、ペプチド結合を表す、
   請求項１に記載の二機能性抗体。
5. 前記抗ＶＥＧＦ抗体は、ナノ抗体、一本鎖抗体および二本鎖抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の二機能性抗体。
6. 前記二機能性抗体の重鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有し、前記二機能性抗体の軽鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の二機能性抗体。
7. 請求項１に記載の二機能性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
9. 請求項８に記載のベクターを含むか、またはゲノム中に請求項７に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた、遺伝子操作された宿主細胞。
10. （ｉ）宿主細胞の増殖に適切な条件下で、請求項９に記載の宿主細胞を培養して、請求項１に記載の二機能性抗体を含む混合物を得る段階と、および
    （ｉｉ）段階（ｉ）で得られた混合物を精製および／または単離することにより、請求項１に記載の二機能性抗体を得る段階とを含む、
    請求項１に記載の二機能性抗体を調製する方法。
11. （Ｉ）請求項１に記載の二機能性抗体、および
    （ＩＩ）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
12. （ａ）請求項１に記載の二機能性抗体、および
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、サイトカイン、放射性核種、酵素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分を含み、
    前記薬物が抗腫瘍薬である、免疫コンジュゲート。
13. 請求項１に記載の二機能性抗体または請求項１２に記載の免疫コンジュゲートを含む、検出試薬またはキット。
14. 請求項１に記載の二機能性抗体または請求項１２に記載の免疫コンジュゲートを含む、癌または腫瘍を予防および／または治療するための医薬組成物。

Images