JP2011518554A - 抗areg/hb−egf抗体と治療 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は癌治療に関する。特に、本発明は、抗癌剤に対する耐性への感受性を決定する方法、こうした耐性を克服する方法、及び癌治療用の併用療法に関する。
癌は、西洋諸国において主要な死亡原因である。癌を治療すべく、過去50年間に多くの化学療法剤が開発された。化学療法剤の大半は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び抗腫瘍剤の群の1つに分類できる。これらの薬剤すべてが細胞分裂又はDNAの合成に影響を及ぼし、何らかの形で機能する。
本発明者らは、2つ以上の異なるEGFに特異的に結合する多重特異性抗体の開発によって、2つ以上のEGFの標的化を採用する化学療法戦略の使用をさらに開発した。また、化学療法治療の後に、腫瘍細胞への抗体の結合が強化されることが見出された。異なるEGFが異なる癌でアップレギュレートされていると予測される。したがって、2つ以上のEGFと結合できる多特異性抗体の開発は、臨床、及び研究での利用に大きな利点をもたらす。二重特異性抗体の開発は、癌の様々な特徴を標的とすることができる。例えば、HBEGFは、細胞運動性及び増殖、さらには血管新生に関連があることが示されている。AREGの発現により細胞浸潤が増加している。したがって、HBEGFとAREGの両方をターゲットとする抗体は、これらの特性に著しい効果を有する可能性がある。
そのような多特異性抗体は、当技術分野において知られるいかなる方法を使用して産生してもよい。二重特異性抗体を産生する1つの方法は、化学的橋架、ハイブリドーマ細胞の融合、又は分子遺伝学的技術によって産生された人工の抗体が、第1の抗原に対する結合特異性を有する重鎖と軽鎖のペア1つと、第2の抗原に対する結合特異性を有する重鎖と軽鎖の第2のペアを有するように操作する方法である。そのような実施形態では、2つの標的の抗原決定基は一般に関連していない。しかしながら、本発明者らは2つのEGF、例えばHBEGFとAREGのペプチド配列の保存領域を選択する戦略を採用し、前記領域に対するモノクローナル抗体を産生した。この技術を使用することにより、エンジニアリングを必要とせず、複数の特異性を備えた抗体を産生できる。この方法を用いると、費用効率が高く、タイムリーな方法を用いた機能的抗体の開発につながる。
KKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEKS
配列番号2
KRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCH
MEWSWVILFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDSY
IHWVNQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASITADTSSNTAYLQLSS
LTSEDTAVYYCVSASYRYGFSYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPWVPGSLX
8d7 1c8 1e9 VL配列(配列番号6)
XADXISISCRSNKSLLHTNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDR
FSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRXX
8d7 1f6 2f7 VH配列(配列番号7)
MKCSWIIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDSY
IHWVNQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASITADTSSNTAYLQLSS
LTSEDTAVYYCVSASYRYGFSYWGQGTLVTVSAAKTTPPPVYPLAPGSL
8d7 1f6 2f7 VL配列(配列番号8)
MRAPAQFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSNKSLLHT
NGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE
AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
8d7 1f6 2b3 VH配列(配列番号9)
MKCSWVMFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDSY
IHWVNQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASITADTSSNTAYLQLSS
LTSEDTAVYYCVSASYRYGFSYWGQGTLVTVSAAKTTPPPVYPLAPGSL
8d7 1f6 2b3 VL配列(配列番号10)
MRPPLSFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSNKSLLHT
NGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE
AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
MECNWILPFILSVTSGVYSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTRYW
MQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNGDIRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSS
LASEDSAVYYCARGTTPSSYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGS
SVTLGCLVKGYF
6E11 1E9 1C6 VL配列(配列番号4)
MMSPAQFLFLLVLWIRETSGDVVMTQTPLTLSVSIGQPASISCKSSQSLLDS
DGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVE
AEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGAS
VVCFLNNFYPK
本発明は、2つ以上のEGF阻害剤の特定の組合せが、腫瘍細胞増殖の減弱において相加的効果を示すこと、さらには、2つ以上のEGFに対する結合特異性を有する多特異性抗体を、EGFとの効率的な結合のために、且つ診断及び治療方法に使用してもよいという実証に基づいている。
上述のように、一実施形態において、本発明は、例えば、特定の化学療法剤を使用する治療に対する適性を判定するために、EGF遺伝子の発現、又はポリペプチドについて、腫瘍細胞を含む試料をスクリーニングする方法に関する。
ペプチド増殖因子のEGFファミリーは、ErrB受容体(ErrB1つまりEGF受容体、ErrB2つまりHer2、ErrB3、及びErrB4)に選択的に結合する能力を有する10のメンバーからなる。
例えば、EGFがAREGである場合、Areg遺伝子は、NM_001657であり得る。
上述のように、本発明は、少なくとも2つ、例えば、3つ又は4つの異なるEGF分子に結合する多特異性抗体分子を提供する。一実施形態において、抗体は、HB−EGF、AREG、EREG、BTC、又はTGFαから選択される2つ、3つ、又は4つのEGFに特異的に結合する。
KKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEKS
配列番号2
KRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCH
上述のように、本発明のある実施形態において、抗体分子は化学療法剤と併用してもよい。使用してもよい化学療法剤の例としては、チミジル酸シンターゼ阻害薬を含む代謝拮抗剤、ヌクレオシド類似体、白金細胞毒性剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又は抗微小管剤がある。本発明において使用してもよいチミジル酸シンターゼ阻害薬の例としては、5−FU、MTA、及びTDX等がある。使用してもよい代謝拮抗剤の例としては、トムデックス(TDX)がある。使用してもよい白金細胞毒性剤の例としては、シスプラチン、及びオキサリプラチン等がある。
「治療」又は「療法」とは、ヒト又は非ヒト動物に有益な任意の療法を含む。治療は、すでにある症状に対するものであっても、又は予防的(予防的治療)であってもよい。治療には、治癒効果、緩和効果、又は予防効果がある。
本発明による医薬組成物、及び、本発明に従い使用される医薬組成物は、活性成分、例えば、多特異性抗体分子、及び/又はこのような抗体分子をコードする核酸分子に加えて、薬剤的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者によく知られている他の物質を含んでもよい。(例えば、Remington:the Science and Practice of Pharmacy、第21版、Gennaro ARら編、Lippincott Williams&Wilkins、2005を参照されたい)。こうした物質には、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝液、抗酸化剤、防腐剤、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸、炭水化物、キレート化剤、等張化剤、及び界面活性剤等がある。
本発明の抗体分子を第2の作用薬、例えば化学療法剤と併用する本発明の実施形態において、抗体は、第2の作用薬と同時に、個別に、又は逐次投与してもよい。個別に又は逐次投与する場合、抗体と第2の作用薬は、互いに任意の適切な時間以内、例えば、1、2、3、6、12、24、48、又は72時間以内に投与してもよい。好ましい実施形態において、抗体と第2の作用薬は、互いに6時間以内、好ましくは2時間以内、より好ましくは1時間以内、最も好ましくは20分以内に投与される。
本発明の、及び本発明に使用する、抗体分子、又は前記抗体分子をコードする核酸分子、及び、場合によって化学療法剤は、「治療上有効な量」で個体に適切に投与され、個体に利益をもたらすことが十分証明されている。実際の投与レジメンは、治療される症状、その重症度、治療される患者、使用される作用薬を含む多数の因子に依存し、医師の裁量下にある。
細胞株と培養条件
MDA−MB231ヒト乳癌細胞株とHT29ヒト結腸直腸癌細胞株をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen、UK)で維持した。HCT116(p53野生型)ヒト結腸直腸腺癌細胞株をMcCoys(Invitrogen、UK)で維持した。すべての培地は、10%FCS標準(Invitrogen、UK)又は透析済みFCS(Autogene Bioclear、UK)、1%ペン/ストレップ(pen/strep)、1%L−グルタミン(すべてInvitrogen、UK)を含む。
AREG、HB−EGF及び対照siRNA、並びにDharmafect4トランスフェクション試薬はDharmacon(Lafayette,CO、USA)から入手した。
3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT、Sigma)アッセイ(Mosmann、1983)により、細胞生存率を評価した。化学療法/siRNAの相互作用を評価するために、96ウェルプレートに1ウェル当たり5000個の細胞を播種した。24時間後、細胞にsiRNAをトランスフェクトし、異なる濃度の様々な化学療法剤により処置した。48時間後、各ウェルにMTT(1.0mg/ml)を添加し、細胞を37℃で2時間インキュベートした。培養培地を除去し、ホルマザン結晶をDMSO200μlに溶解させた。マイクロプレートリーダー(Tecan Sunrise、Biorad、UK)を使用して、570nmにおける各ウェルの吸光度を読み取ることにより、細胞生存率を測定した。
遺伝子特異的プライマー(図6b)を使用して、cDNAライブラリーからPCRにより、HBEGFタンパク質をコードするDNA配列を増幅した。HBEGF遺伝子を、細菌発現ベクターpRSETa内にクローニングし、組換えタンパク質のN末端にヘキサヒスチジンタグを組み込んだ。次いで、このコンストラクトを使用して、コンピテントBL21 DE3 E.coli細胞(Invitrogen)を形質転換した。多重クローニング部位(図6b)に隣接するベクター特異的プライマーを使用して、コロニーPCRにより、陽性形質転換細胞を選択した。
アンピシリンを50μM添加したルリア−ベルターニ(LB)培地5mlで、37℃で一晩、陽性クローンを増殖した。この培養物の300μl分を二次培養液の接種用に保管し、試料の残部をQiagenミニプレップキットを使用してミニプレップし、DNA配列決定により配列を確認した。
誘導された組換えタンパク質は、8M尿素緩衝液(尿素480g、塩化ナトリウム29g、リン酸二水素ナトリウム(二水和物)3.12g、イミダゾール0.34g)50ml中で一晩溶解させた。溶液を6000rpmで1時間遠心分離した後、精製前に上清を、0.8μmジャイロディスクフィルターを使用して濾過した。
リフォールディングしたタンパク質を免疫抗原として使用し、モノクローナル抗体を産生した。BALB/Cマウス5匹を、精製組換えタンパク質150μgで3週間間隔で免疫し、3回目と5回目のブースト後に、抗体力価を解析した。各動物から試験血液を取得し、1:1000の希釈度で100ngの抗原に対しウエスタンブロット法で検査した。ブロットは、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)を使用して発色させた。
モノクローナル抗体をELISA法によりをスクリーニングして、増殖すべきクローンを決定した。スクリーニング抗原を含むコーティング緩衝液(緩衝液A:炭酸水素ナトリウム0.42g/水100μl、緩衝液B:炭酸ナトリウム0.53g/水100μl、pH9.5)100μlを各ウェルに添加して(100ng/well)、Maxi Sorb 96ウェルプレートを組換え抗原でコートした。対照抗原も使用し、非特異性のクローンを除去した。プレートを37℃で1時間インキュベートして、抗原をウェルに結合させ、次いで、PBS/3%BSA200μlを各ウェルに添加することにより、室温で1時間にわたりプレートをブロックした。
ハイブリドーマ細胞株に由来する上清をウエスタンブロット法により解析し、モノクローナル抗体が癌細胞株の範囲で、組換えタンパク質、及び内因性の天然タンパク質の両方を検出する能力を判定した。HCT116、HT29、及びMDA全細胞溶解物(〜30μg/ml)、又は組換えタンパク質の一定量をSDS−PAGE法により分離し、Hybond−C Extraニトロセルロース膜(Amersham Biosciences)上に移した。膜をPBS/5%marvel中で室温で1時間インキュベーションしてブロックし、その後PBS中で短時間すすいだ。モノクローナル抗体を1:500又は1:250の希釈度でPBSに溶かし、4℃で一晩、穏やかに揺動させながら膜上でインキュベートした。次いで、ブロットをPBS/1%marvelと0.1%Tween−20で3回すすぎ、次いで、1:3000の希釈度のヤギ抗マウスHRP標識二次抗体で室温で1時間、振動させながらインキュベートした。次いで、ブロットをPBS/1%marvelと0.1%Tween−20溶液で3回すすぎ、次にPBSで短時間すすいだ。ブロットを、ECL plus基質(Amersham Bioscicences)で室温で5分間インキュベートした後、Kodak imagerで分析した。
HCT116細胞を、2.5μMイリノテカンを添加して、又は添加せずに48時間処置した。48時間後、PBSで細胞を洗浄した。5x105個の細胞を、AREG抗体、又はアイソタイプ対照と一緒に2時間インキュベートし、PBSで洗浄した。細胞をFITC標識ヤギ抗マウス抗体で1時間インキュベートし、PBSで洗浄後、BD FACS cantoで分析した。
滅菌した12ウェルプレートを冷凍庫に入れ、また、マトリゲルを冷蔵庫で氷上に一晩置き解凍した。12ウェルプレートを氷上に置き、マトリゲルでコートした。1xPBS1mlを使用して、ウェルに水分を補給した。次いで、PBSを除去し、マトリゲル70μlを滴下によりプレートに添加した。プレートを平らな面に置き、室温で5〜10分間インキュベートし、次いで、37℃で45分〜1時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理しカウントした。1ウェル当たり、細胞1x105個を使用した。適正濃度まで抗体を調製し、細胞に添加した。細胞がよく拡がるように、細胞と抗体を滴下によりウェルに添加した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。ウェルの画像を取得し、分岐解析を実施した。
8μm孔膜を備えた改変されたボイデンチャンバーを使用して、in vitroの浸潤アッセイを実施した。上部の膜表面を150μlマトリゲル(1mg/ml)でコートし、37℃で5時間インキュベートして、マトリゲルのゲルを形成した。適切な抗体が所定の濃度で存在する状態で細胞を追加した(無血清培地250μl中2.5×105細胞)。上記の対応するウェルに適用したのと同じ濃度の抗体を添加した、新たな完全培地を下部チャンバ(750μl)に添加した。アッセイをすべて2セット実行し、浸潤プレートを5%CO2、37℃で24時間インキュベートした。
MDA−MB231細胞を5x105個、6ウェルプレートのカバーガラス上に播種し、一晩放置し、培養密度90%まで増殖させた。細胞から培地を除去し、ピペットチップを使用して、細胞に傷をつけた。PBSで細胞をすすぎ、適正濃度の抗体とマイトマイシンC5μg/mlを含む培地を添加した。傷が閉じるまで17時間放置し、その後、細胞をPBS中4%PFAで20分間固定した。細胞を固定したカバーガラスを顕微鏡のスライドガラス上に載せ、傷の画像を取得し傷の幅を測定した。
8μm孔膜を備えた改変されたボイデンチャンバーを使用して、in vitroの遊走アッセイを実施した。適切な抗体が所定の濃度で存在する状態で細胞を追加した(無血清培地250μl中2.5×105細胞)。上記の対応するウェルに適用したのと同じ濃度の抗体を添加した、新たな完全培地を下部チャンバ(750μl)に添加した。アッセイをすべて2セット実行し、浸潤プレートを5%CO2、37℃で24時間インキュベートした。
1.5x106個の細胞を、10cm3シャーレの血清10%を含む培地に播種した。細胞を播種した24時間後、血清を4時間欠乏させた。抗体を、組換えHBEGF30ng/mlで1時間プレインキュベートし、細胞へ添加し、2%血清で20分間インキュベートした。細胞をホスファターゼ阻害剤を含むPBSで3回洗浄し、こすり落とした。細胞をペレット状とし溶解させた。タンパク質濃度を測定し、ウエスタンブロット解析を行うため、タンパク質30μgをSDS−PAGE上に流した。ブロットをpEGFR(Tyr1068)抗体に反応させた。
6〜8週齡の雌のC57bl/6マウスに、尾静脈から3LL細胞5x105個を静脈注射した。この細胞は、対数増殖期の培養物から新たに回収し、ハンクス緩衝生理食塩水(HBSS)中で再度懸濁させた。治療群当たり最低8匹のマウスを使用した。動物を、抗体又はアイソタイプ対照の投与量範囲で治療する。調査を終了し、25日目でマウスを安楽死させる。肺を摘出し、マクロ分析を実施し可視のリンパ節腫瘍数を数える。次いで、組織学的検査のために肺をホルマリン固定しパラフィン包埋する。リンパ節腫瘍数をH&E切片を顕微鏡分析して数え、腫瘍領域もニコンカメラソフトウエアを使用して測定する。治療群間の転移性肺リンパ節の数において観察された差異の統計的有意性を評価する。
6〜8週齡のBALB/c nu/nu雌マウスの側腹部皮下に、HCT116細胞1×106個を移植する。細胞は、対数増殖期の培養物から新たに回収し、移植に先立って、HBSS/BD基底膜マトリゲルを1対1で混合した混合物に再懸濁させた。特定病原体除去の条件下でマウスを維持する。下記の式を使用して、腫瘍の体積を測定する:体積(mm3)=0.5x(最小径2x最大径)。腫瘍が100mm3の平均体積に到達した時に、マウスを治療群へ分類する。治療群当たり最低8匹のマウスを使用した。動物を、抗体又はアイソタイプ対照の投与量範囲で治療する。体重と腫瘍体積を毎週3回測定する。腫瘍が1000mm3の平均体積に到達した時に、調査を終了する。安楽死にあたり、組織学的検査のために腫瘍とマウスのすべての臓器を摘出しホルマリン固定する。腫瘍体積の上昇をグラフにプロットし、また、二元分散分析を、治療群間の統計的有意性を測定するために実施した。
このモデルで、抗体+化学療法併用療法の有効性を評価する。6〜8週齡のBALB/c nu/nu雌マウスの側腹部皮下に、HCT116細胞1×106個を移植する。細胞は、対数増殖期の培養物から新たに回収し、移植に先立って、HBSS/BD基底膜マトリゲルを1対1で混合した混合物に再懸濁させた。特定病原体除去の条件下でマウスを維持する。下記の式を使用して、腫瘍の体積を測定する:体積(mm3)=0.5x(最小径2x最大径)。腫瘍が100mm3の平均体積に到達した時に、マウスを治療群へ分類する。治療群当たり最低8匹のマウスを使用した。動物を、抗体又はアイソタイプ対照の投与量範囲で、化学療法との併用で治療する。体重と腫瘍体積を毎週3回測定する。腫瘍が1000mm3の平均体積に到達した時に、調査を終了する。安楽死にあたり、組織学的検査のために腫瘍とマウスのすべての臓器を摘出しホルマリン固定する。腫瘍体積の上昇をグラフにプロットし、また、二元分散分析を、治療群間の統計的有意性を測定するために実施した。
このモデルを使用して、抗体が、同所性の乳房脂肪体腫瘍からマウスの肝臓、肺、骨組織及び脳への転移を防ぐ能力を評価する。
このモデルを使用して、薬剤が、同所性の乳房脂肪体腫瘍からリンパ節への転移を防ぐ能力を評価する。(このモデルは、腫瘍細胞の血流から肺、膵臓、及び脾臓への転移を防ぐ薬剤の能力を評価するために使用してもよい。)腫瘍細胞をルシフェラーゼで標識するため、バイオイメージャーを使用して、蛍光によって、腫瘍転移を追跡することができる。
AREGのsiRNA/抗体とHBEGFのsiRNAの併用による細胞増殖の減弱
細胞生存率アッセイ(図1)を実施し、細胞増殖に対するRNA干渉による、AREGとHBEGFの発現のノックダウン効果を調査した。AREGのsiRNAにより細胞増殖が50%減少し、HBEGFのsiRNA単独では、20%減少するという効果が観察された。両siRNAが併用して細胞へ添加された場合、細胞増殖が85%減少することが観察された。これは、癌にあるこれらの2つのEGF様リガンドを標的とすることにより、細胞増殖が減弱できることを示唆する。
EGF様リガンド5つの配列比較により、EGFドメインで見出され、リガンド結合に関連すると考えられている保存された6つのシステイン残基を除き、リガンド間には相同性がほとんどないことが示された(図3)。図4は、AREGとHBEGFの配列比較を示し、抗体産生のために選択された領域をさらに示す。AREGとHBEGFの両方を標的にする1つの抗体を産生できると考えられる。この領域の組換えタンパク質を大腸菌中で産生し、マウスを免疫するために使用した。
EGFR経路上のAREGとHBEGFに対する交差特異性抗体の効果を、EGFRのリン酸化を調査することで評価した。細胞に添加する前に、抗体をHBEGFリガンドでプレインキュベートした。交差特異性抗体が、HBEGF刺激によるEGFRのチロシン1068のリン酸化を抑制することが明らかに観察される。
組換えHBEGFリガンドが、結腸直腸癌細胞株LoVoの増殖を約60%刺激した。細胞に添加する前に、アイソタイプ対照と交差特異性抗体を組換えHBEGFと共に1時間プレインキュベートした。アイソタイプ対照抗体には、HBEGFによる増殖刺激作用に効果はなかった。交差特異性抗体(1E9)は、用量依存的な方法(図17)でリガンドが引き起こす増殖を阻止できた。交差特異性抗体が300nMである場合、HBEGFによる細胞増殖に対するいかなる刺激も妨げている。この結果により、抗体はリガンドに結合して、リガンドの機能を妨げていることが示される。
交差特異性抗体を濃度100nMで単独で細胞に添加する場合、細胞増殖が40%減少することが観察された(図18a)。抗体を、10μMのcpt−11と併用して添加した場合、増殖はさらに減弱した(図18b)。細胞増殖は、アイソタイプ対照と化学療法とを併用した場合、増殖の40%まで減少した。これにより、AREGとHBEGFの二重の標的化が、単独で、及びの従来の化学療法との併用で、結腸直腸癌などの癌の細胞増殖に著しい効果があることが示される。
MDA−MB231乳癌細胞株における細胞浸潤と遊走を、ボイデンチャンバー浸潤アッセイと創傷遊走アッセイにより調査した。図20aは、ボイデンチャンバー浸潤アッセイの結果を示す。交差特異性抗体では、アイソタイプ対照と比較して浸潤細胞の数が著しく減少した。抗体により、細胞浸潤は30%〜50%減少した。図20bは、浸潤細胞の画像を示し、アイソタイプ抗体と交差特異性抗体との間の明らかな差異を確認できる。
HUVEC細胞株を使用して、AREGとHBEGFの両方の標的化が血管新生に効果があるかどうか調査した。ボイデンチャンバーとHUVEC細胞を用いる浸潤アッセイを使用した。交差特異性抗体により、アイソタイプ対照抗体と比較して、浸潤細胞数が30%減少した(図22)。
Claims (36)
- 少なくとも2つ、例えば、3つ又は4つの異なるEGF分子に結合する多特異性抗体分子。
- 二重特異性である、請求項1に記載の多特異性抗体分子。
- HBEGF及びAREGに結合する、請求項1又は2に記載の多特異性抗体分子。
- EREG、BTC、又はTGFαの1つ又は複数に結合しない、請求項3に記載の多特異性抗体分子。
- EREG、BTC、又はTGFαのいずれにも結合しない、請求項3又は4に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列を有するAREGの抗原フラグメント、及び配列番号2に示すアミノ酸配列を有するHBEGFの抗原フラグメントに結合する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
- モノクローナル抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
- (i)8d7 1c8 1e9抗体のVHドメインのCDRの1つ、2つ若しくは3つ、及び/又は8d7 1c8 1e9抗体のVLドメインのCDRの1つ、2つ若しくは3つを有する抗体、(ii)8d7 1f6 2f7抗体のVHドメインのCDRの1つ、2つ若しくは3つ、及び/又は8d7 1f6 2f7抗体のVLドメインのCDRの1つ、2つ若しくは3つを有する抗体、並びに(iii)8d7 1f6 2b3抗体のVHドメインのCDRの1つ、2つ若しくは3つ、及び/又は8d7 1f6 2b3抗体のVLドメインのCDRの1つ、2つ若しくは3つを有する抗体からなる群から選択される抗体分子である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号5に示すVH配列のCDRの少なくとも1つ、例えば2つ若しくは3つ、及び/又は配列番号6に示すVL配列のCDRの少なくとも1つ、例えば2つ若しくは3つを含む抗原結合ドメインを含む、請求項8に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号7に示すVH配列のCDRの少なくとも1つ、例えば2つ若しくは3つ、及び/又は、配列番号8に示すVL配列のCDRの少なくとも1つ、例えば2つ若しくは3つを含む、請求項8に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号9に示すVH配列のCDRの少なくとも1つ、例えば2つ若しくは3つ、及び/又は、配列番号10に示すVL配列のCDRの少なくとも1つ、例えば2つ若しくは3つを含む抗原結合ドメインを含む、請求項8に記載の多特異性抗体分子。
- 前記VH配列のCDRの3つすべて、及び/又は前記VL配列のCDRの3つすべてを含む抗原結合ドメインを含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号5に示すVHドメイン、及び/又は配列番号6に示すVL配列を含む、請求項12に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号7に示すVHドメイン、及び/又は配列番号8に示すVL配列を含む、請求項12に記載の多特異性抗体分子。
- 配列番号9に示すVHドメイン、及び/又は配列番号10に示すVL配列を含む抗体分子を含む抗体分子を含む、請求項12に記載の多特異性抗体分子。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子をコードする核酸分子。
- 医薬に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子。
- 新生物性疾患の治療に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子。
- 血管新生に関連する疾患又は障害の治療に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子。
- 前記使用が、化学療法剤と同時、別々、又は逐次である、請求項18に記載の多特異性抗体分子又は核酸。
- 化学療法剤が、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、及び植物アルカロイドからなる群から選択される、請求項20に記載の多特異性抗体分子又は核酸。
- 前記新生物性疾患が、結腸直腸癌、乳癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項18、20、又は21のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子又は核酸。
- 前記使用が、血管新生阻害剤と同時、別々、又は逐次である、請求項18〜22のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子又は核酸。
- 血管新生阻害剤が、Sorafenib(Bayer/onyx)、Sunitinib(Pfizer)、PTK787(Novartis)、AG013676(Pfizer)、ZD6474(AstraZeneca)及びVEGF−Trap(Regeneron)、AG−13958(Pfizer)、Cand5等のVEGFのsiRNA、squalamine(エビゾン(Evizon)(商標))、anecortave(レターヌ(Retaane)(商標))、及びCombretastatinからなる群から選択される、請求項23に記載の多特異性抗体分子又は核酸。
- 対象における新生物性疾患を治療する方法であって、前記対象に、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子の有効量を投与するステップを含む方法。
- 前記対象に化学療法剤の有効量を同時、逐次、又は別々に投与するステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 化学療法剤が、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、及び植物アルカロイドからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記新生物性疾患が、結腸直腸癌、乳癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 対象における血管新生に関連する疾患又は障害を治療する方法であって、前記対象に、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子の有効量を投与するステップを含む方法。
- 前記対象に血管新生阻害剤の有効量を同時、逐次、又は別々に投与するステップをさらに含む、請求項25〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 血管新生阻害剤が、Sorafenib(Bayer/onyx)、Sunitinib(Pfizer)、PTK787(Novartis)、AG013676(Pfizer)、ZD6474(AstraZeneca)及びVEGF−Trap(Regeneron)、AG−13958(Pfizer)、Cand5等のVEGFのsiRNA、squalamine(エビゾン(Evizon)(商標))、anecortave(レターヌ(Retaane)(商標))、及びCombretastatinからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
- 化学療法剤及び/又は血管新生阻害剤をさらに含む、請求項32に記載の医薬組成物。
- 同時、逐次、又は別々に投与する、(i)請求項1〜15のいずれか一項に記載の多特異性抗体分子、又は請求項16に記載の核酸分子、並びに(ii)化学療法剤、及び/又は血管新生阻害剤を含むキット。
- 前記化学療法剤が、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、及び植物アルカロイドからなる群から選択される、請求項33に記載の医薬組成物、又は請求項34に記載のキット。
- 血管新生阻害剤が、Sorafenib(Bayer/onyx)、Sunitinib(Pfizer)、PTK787(Novartis)、AG013676(Pfizer)、ZD6474(AstraZeneca)及びVEGF−Trap(Regeneron)、AG−13958(Pfizer)、Cand5等のVEGFのsiRNA、squalamine(エビゾン(Evizon)(商標))、anecortave(レターヌ(Retaane)(商標))、及びCombretastatinからなる群から選択される、請求項33若しくは35に記載の医薬組成物、又は請求項34若しくは35に記載のキット。
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