JP5919593B2 - 併用療法 - Google Patents
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Description
本発明は、癌治療に関する。具体的には、本発明は、抗癌剤に対する耐性への感受性を決定する方法、こうした耐性を克服する方法、及び癌治療用の併用療法に関する。
癌は、欧米諸国において、死亡率の主要原因である。癌を治療すべく、極めて多くの化学療法剤が、過去50年間に開発された。化学療法剤の大半は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び抗腫瘍剤に分類することができる。これらの薬剤すべてが細胞分裂又はDNAの合成に影響し、何らかの形で機能する。
本発明者らは、異なるクラスの化学療法による治療に応答して上方調節されるタンパク質を探索し、驚くべきことに、上皮増殖因子(EGF)ファミリーのペプチド増殖因子をコードする各種遺伝子が、異なるクラスの化学療法の異なる生理的に関連のある用量によるin vivoでのチャレンジ後に、多数の異なる種類の癌由来の多数の異なる癌の腫瘍細胞株モデルにおいて過剰発現することを示した。
(i)第1のEGFの阻害剤と、
(ii)第2のEGFの阻害剤と
を含むキットを提供する。
配列番号1:
GAAAAUCGCUUAUAUACCUUU
配列番号2:
AGGUAUAUAAGCGAUUUUCUU
を有するsiRNAである。
配列番号3:
UGAAGUUGGGCAUGACUAAUU
配列番号4:
UUAGUCAUGCCCAACUUCAUU
を有するsiRNAである。
配列番号5:
GGACCCAUGUCUUCGGAAAUU
配列番号6:
UUUCCGAAGACAUGGGUCCUU
を有するsiRNAである。
配列番号7:
GGAGAAUGCAAAUAUGUAUU
配列番号8:
UCACAUAUUUGCAUUCUCCUU
を有するsiRNAである。
配列番号9:
UGAUAACGAACCACAAAUAUU
配列番号10:
UAUUUGUGGUUCGUUAUCAUU
を有するsiRNAである。
配列番号11:
UGAGUGAAAUGCCUUCUAGUU
配列番号12:
CUAGAAGGCAUUUCACUCAUU
を有するsiRNAである。
配列番号13:
GUUAUUACAGUCCAGCUUAUU
配列番号14:
UAAGCUGGACUGUAAUAACUU
を有するsiRNAである。
配列番号15:
GAAAGAAACUUCGACAAGAUU
配列番号16:
UCUUGUCGAAGUUUCUUUCUU
を有するsiRNAである。
6E11 1E9 1C6 VH配列(配列番号27):
MECNWILPFILSVTSGVYSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTRYWMQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNGDIRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARGTTPSSYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYF
6E11 1E9 1C6 VL配列(配列番号28):
MMSPAQFLFLLVLWIRETSGDVVMTQTPLTLSVSIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK
(a)対象由来の腫瘍細胞試料を提供すること、
(b)前記腫瘍細胞試料の一部を前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露すること、
(c)前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露された前記腫瘍細胞試料の一部における、AREG、TGF、EREG、BTC、及びNRG3からなる群から選択される、1つ又は複数のEGFをコードする1つ又は複数の遺伝子の発現を、前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露されていない前記試料の対照の一部における前記(1つ又は複数の)遺伝子の発現と比較すること、
を含み、前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露された試料の一部における発現の増強が、前記トポイソメラーゼ阻害剤に対する感受性の低下を示す方法が提供される。
(a)前記化学療法による治療前に対象から得た、腫瘍細胞を含有するin vitro試料中において、EGFをコードする遺伝子の発現を決定すること、
(b)前記化学療法による治療後に対象から得た、腫瘍細胞を含有するin vitro試料中において、AREG、TGF、EREG、BTC、及びNRG3からなる群から選択される前記EGFをコードする前記遺伝子の発現を決定すること、
(c)(b)における発現を(a)における発現と比較すること、
を含み、(a)と比較した(b)における発現の増強により、患者が、トポイソメラーゼ阻害剤と前記EGF阻害剤とを含む併用療法から利益を受け得ることが示される方法を提供する。
上記及び実施例における記載の通り、本発明は、各種のEGF遺伝子及びタンパク質の発現が、特定の化学療法の存在下にある腫瘍細胞中で上方調節され、2つ以上のEGF阻害剤の特定の組合せと同様に、EGF阻害剤及び化学療法剤の特定の組合せが、腫瘍細胞増殖の減弱において相加的効果を示すことの実証に基づいている。
上記の通り、一実施形態において、本発明は、特定の化学療法剤を用いる治療に対する適性を判定するために、腫瘍細胞を含む試料を、EGF遺伝子の発現についてスクリーニングする方法に関する。
順方向:TTTTTTGGATCCAATGACACCTACTCTGGGAAGCGT(配列番号17)
逆方向:TTTTTTAAGCTTAATTTTTTCCATTTTTGCCTCCC(配列番号18)
及びエキソンにまたがる、
順方向:TTTTTTGGATCCCTCGGCTCAGGCCATTATGCTGCT(配列番号19)
逆方向:TTTTTTAAGCTTTACCTGTTCAACTCTGACTG(配列番号20)
順方向5’−TTTCTGGCTGCAGTTCTCTCGGCACT−3’(配列番号21)
逆方向5’−CCTCTCCTATGGTACCTAAACATGAGAAGCCCC−3’(配列番号22)
の1つ又は複数を用いてよい。
本発明のある実施形態では、化学療法剤を用いてよい。例えば、用い得る作用薬は、チミジル酸シンターゼ阻害剤を含む代謝拮抗剤、核酸類似体、白金細胞毒性剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又は抗微小管剤を含む。本発明で用い得るチミジル酸シンターゼ阻害剤の例は、5−FU、MTA、及びTDXを含む。用い得る代謝拮抗剤の例は、トムデックス(TDX)である。用い得る白金細胞毒性剤の例は、シスプラチン及びオキサリプラチンを含む。
上述の通り、本発明者らは、2つ以上のEGF阻害剤の組合せを用いて、腫瘍細胞増殖に対する減弱効果の劇的な増強を得ることができることを見出した。本発明の特定の実施形態では、EGF遺伝子の発現を低下させるか、又はEGFタンパク質にアンタゴナイズする任意の分子を、EGF阻害剤として用いてよい。特定の実施形態において、EGFは、HB−EGF、AREG、TGF、EREG、BTC、又はNRG3である。
本発明で用いるEGF阻害剤及びHB−EGF阻害剤は、遺伝子発現を調節する能力を有する、例えば、EGFタンパク質をコードする配列の発現を下方調節する能力を有する核酸分子を含み得る。こうした核酸分子は、アンチセンス分子、短鎖干渉核酸(siNA)、例えば、短鎖干渉RNA(siRNA)、二重鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA、短いヘアピンRNA(shRNA)、核酸センサー分子、アロザイム、酵素性核酸分子、及び三重鎖オリゴヌクレオチド、並びに、RNA干渉「RNAi」又は配列特異的な形での遺伝子サイレンシングを媒介するのに用い得る他の任意の核酸分子を含むが、これらに限定されない(例えば、Bass,2001年,Nature,第411巻,428〜429頁;Elbashirら,2001年,Nature,第411巻,494〜498頁;国際公開第00/44895号パンフレット;国際公開第01/36646号パンフレット;国際公開第99/32619号パンフレット;国際公開第00/01846号パンフレット;国際公開第01/29058号パンフレット;国際公開第99/07409号パンフレット;及び国際公開第00/44914号パンフレット;Allshire,2002年,Science,第297巻,1818〜1819頁;Volpeら,2002年,Science,第297巻,1833〜1837頁;Jenuwein,2002年,Science,第297巻,2215〜2218頁;Hallら,2002年,Science,第297巻,2232〜2237頁;Hutvagner及びZamore,2002年,Science,第297巻,2056〜2060頁;McManusら,2002年,RNA,第8巻,842〜850頁;Reinhartら,2002年,Gene&Dev,第16巻,1616〜1626頁;並びに、Reinhart&Bartel,2002年,Science,第297巻,1831頁を参照されたい)。
アプタマーとは、特異的な分子標的に固く結合する核酸(DNA及びRNA)高分子である。これらは、例えば、SELEX(指数的濃縮によるリガンドの系統的進化)法による、小分子、タンパク質、核酸など各種の分子標的への結合を、反復ラウンドのin vitro選択を介して迅速に産生されうる(Ellington及びSzostak,Nature,第346巻,第6287号,818〜822頁,1990年;Tuerk及びGold,Science,第249巻,第4968号,505〜510頁,1990年;米国特許第6,867,289号明細書;米国特許第5,567,588号明細書;米国特許第6,699,843号明細書を参照されたい)。
「治療」又は「療法」とは、ヒト又は非ヒト動物に利益を与えることのできる任意のレジメンを含む。治療は、既存の状態に関することもあり、又は、予防的(予防的処置)でもあり得る。治療は、治癒効果、緩和効果、又は予防効果を含み得る。
本発明による医薬組成物、及び、本発明に従い用いる医薬組成物は、活性成分、例えば、(i)化学療法剤及び/若しくはEGF阻害剤、又は(ii)第1のEGFの阻害剤及び第2のEGFの阻害剤に加え、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝液安定剤、又は当業者によく知られる他の物質(例えば、Remington:the Science and Practice of Pharmacy,第21版,Gennaro ARら編,Lippincott Williams&Wilkins社,2005年を参照されたい)を含み得る。こうした物質は、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液;抗酸化剤;防腐剤;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸;炭水化物;キレート化剤;等張化剤;及び界面活性剤を含み得る。
EGF阻害剤及び化学療法剤を治療に用いる本発明の実施形態において、EGF阻害剤は、化学療法剤と同時に、個別に、又は逐次投与してよい。同様に、第1のEGF阻害剤及び第2のEGF阻害剤を共に治療に用いる本発明の実施形態において、第1のEGF阻害剤は、第2のEGF阻害剤と同時に、個別に、又は逐次投与してよい。個別に又は逐次投与する場合、これらは、例えば、互いに1、2、3、6、12、24、48、又は72時間以内の任意の適切な時間以内に投与し得る。好ましい実施形態において、これらは、互いに6時間以内、好ましくは、2時間以内、より好ましくは、1時間以内、最も好ましくは、20分以内に投与される。
本発明は、癌の治療用又は腫瘍細胞の殺滅用の各種のキットまでさらに拡張する。キットは、場合によって、各成分、例えば、EGF阻害剤及び化学療法剤、又は第1のEGF阻害剤及び第2のEGF阻害剤の個別、逐次、又は同時の投与のための指示書を含むことがある。
本発明のEGF阻害剤及び/又は化学療法剤、及び、本発明に用いるEGF阻害剤及び/又は化学療法剤は、「治療的な有効量」で個体に投与することに適し、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。実際の投与レジメンは、治療される状態、その重症度、治療される患者、用いられる作用薬を含む多数の因子に依存し、医師の裁量下にある。
[細胞株と培養条件]
HCT116(p53野生型)ヒト結腸直腸腺癌細胞株を、マッコイ(Invitrogen社製、UK)中で保持した。RKO(p53野生型)結腸直腸癌細胞株、MDA−MB231ヒト乳癌細胞株、及びHT29ヒト結腸直腸癌細胞株を、各々、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen社製、UK)中で保持した。
6〜8週齢のSCID雌マウスの各側腹部に、2×106個のHCT116+/+ヒト結腸直腸腺癌細胞を植え込んだ。対数増殖期にあるHCT116細胞を回収し、PBS中で洗浄し、HBSS中に再懸濁させた。これらに等量のマトリゲルを混合して、5×106個/mlの最終濃度とした。植え込みの5日後にマウスを無作為に治療群に分割し、異なる化学療法の用量で治療した。5−Fu(70mgs/kg)、CPT11(70mgs/kg)、又は対照の生理食塩液、そして、異なる時点(注入の24及び48時間後)でマウスを安楽死させた。すべての薬剤は、ボーラス注射により投与した。動物は、各時点で安楽死させ、解析用に腫瘍を除去した。
約10μgのトータルRNAを腫瘍細胞から単離し、プローブ調製用の出発物質として用いた。Affymetrix社製U133 plus 2.0 GeneChip(登録商標)を用いて、マイクロアレイ解析を実施した。プローブは、製造元の推奨に従って調製した。
[a−細胞培養]
対数増殖期にある細胞を、〜20%のコンフルエンスでT75フラスコ内に播種し、一晩インキュベートして、プレートに付着させた。濃度7.5μMのCPT−11(イリノテカン)及び5−Fu(フルオロウラシル)により、48時間にわたりウェルを処置した。対照フラスコでは、化学療法を生理食塩液で置換した。化学療法への異なる時間の曝露後、細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、製造元の指示書に従い、RNA TAT−60試薬を用いてトータルRNAを単離した。
In vivo毒性試験用に、マウスの各側腹部に、2×106個のHCT116+/+ヒト結腸直腸腺癌細胞を接種した。植え込みの5日後にマウスを無作為に治療群に分割し、5Fu(毎日15mg/kg、又は毎週2回70mg/kg)により治療した、又は治療せずに置いた。すべての薬剤は、ボーラス注射により投与した。動物は、各時点で安楽死させ、臓器及び腫瘍を解析用に除去した。
PTC 225 Gradient Cycler(MJ Research社製)を用いて半定量的RT−PCR法を実施した。最終容量25μLのPCR混合液は、12.5μLの2倍濃度Biomix(Bioline社製、UK)、2μLのプライマー(10μmol/L)、1μLのcDNA、及び9.5μLのdH2Oを含有する。PCR法の条件は、95℃で10分間の最初の変性ステップの後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリングステップ、及び72℃で90秒間の伸長からなる35サイクルが続き、最後に72℃で10分間にわたり伸長を行った。5μlの増幅反応産物を、1.5%アガロースゲル(0.001%臭化エチジウム)に添加し、これを、UVボックスでの解析前に、90Vで30〜40分間泳動した。cDNAごとにベータアクチン対照のPCR増幅を実施して、PCR混合液に投入されたcDNAレベルを点検した。
[a−細胞溶解]
HCT116、RKO、HT29、及びH630は、ヒト結腸直腸癌細胞株である。化学療法への異なる時間の曝露の後、細胞を回収し、1倍濃度PBSで洗浄した。次いで、プロテアーゼ阻害剤を補充した適量の1倍濃度RIPA溶解緩衝液(150mM NaCl、pH7.2の10mMトリス、0.1%SDS、1.0%triton X−100、及び5mM EDTA)中で細胞ペレットを溶解した。細胞溶解物を短時間ボルテックスし、氷上で10分間インキュベートし、次いで、12、000rpmで遠心分離して細胞破砕物を除去した。遠心分離後、溶解物上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。
製造元の指示書に従い、BCA Protein Assay(Pierce社製)を用いて、タンパク質濃度を調べた。マイクロプレートリーダーを用いて、620nmにおける各試料の吸光度を調べた。実験ごとに基準BSA曲線をプロットし、各試料のタンパク質濃度を計算した。
各試料に、等量の5倍濃度のウェスタン用試料緩衝液、及び、最終容量の10%のβ−メルカプトエタノール(Sigma社製)を添加した。試料は95℃で5分間にわたり変性させ、SDSポリアクリルアミドゲル(SDS PAGE)上に添加する前に、氷上に置いた。ゲルの1つのウェル内に、10μlの染色済タンパク質用分子量マーカーを添加した。
電気泳動後に、1倍濃度ウェスタン用転写緩衝液中にゲルを浸漬した。30秒間にわたり、PVDF(Millipore社製)片を100%メタノール中に浸漬し、次いで、脱イオン化H2Oで洗浄し、1倍濃度転写緩衝液中で平衡化した。
転写後、1倍濃度PBS/5%ミルク中で1時間にわたりブロックする前に、1倍濃度PBS/0.1%Tweenで10分間にわたり3回、PDVF膜を洗浄した。ブロックした膜は、1倍濃度PBS/0.1%Tween/5%ミルクで適度に希釈した、適切な一次抗体と共に1時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、1倍濃度PBS/0.1%Tweenで膜を3回洗浄した後、1倍濃度PBS/5%ミルク中で1:5000に希釈した適切な二次抗体(Bio−Rad社製)により、1時間にわたり、プローブした。その後、各回10分間ずつ3回にわたり、膜を1倍濃度PBS/0.1%Tweenで洗浄した後、製造元が説明する通りに、Super Signal検出法(Pierce社製)を用いて可視化した。オートラジオグラフへの曝露、その後の現像して、タンパク質バンドを検出した。同じ免疫ブロットから第2のタンパク質の検出を要する場合は、膜をウェスタン用のストリッピング緩衝液中に浸漬し、50℃のロッキングインキュベーター内で、30分間にわたりインキュベートした。膜のストリッピング後に、1倍濃度PBS/0.1%Tweenで10分間ずつ5回にわたり洗浄した。前回と同様、適切な抗体により、膜をリプローブした。
AREG、HB−EGF、及び対照siRNA、並びにDharmafect 4トランスフェクション試薬は、Dharmacon社(ラファイエット、コロラド州、米国)から入手した。
1 センス配列
GAAAAUCGCUUAUAUACCUUU(配列番号1)
1 アンチセンス配列
AGGUAUAUAAGCGAUUUUCUU(配列番号2)
2 センス配列
UGAAGUUGGGCAUGACUAAUU(配列番号3)
2 アンチセンス配列
UUAGUCAUGCCCAACUUCAUU(配列番号4)
3 センス配列
GGACCCAUGUCUUCGGAAAUU(配列番号5)
3 アンチセンス配列
UUUCCGAAGACAUGGGUCCUU(配列番号6)
4 センス配列
GGAGAAUGCAAAUAUGUAUU(配列番号7)
4 アンチセンス配列
UCACAUAUUUGCAUUCUCCUU(配列番号8)
を有した。
1 センス配列
UGAUAACGAACCACAAAUAUU(配列番号9)
1 アンチセンス配列
UAUUUGUGGUUCGUUAUCAUU(配列番号10)
2 センス配列
UGAGUGAAAUGCCUUCUAGUU(配列番号11)
2 アンチセンス配列
CUAGAAGGCAUUUCACUCAUU(配列番号12)
3 センス配列
GUUAUUACAGUCCAGCUUAUU(配列番号13)
3 アンチセンス配列
UAAGCUGGACUGUAAUAACUU(配列番号14)
4 センス配列
GAAAGAAACUUCGACAAGAUU(配列番号15)
4 アンチセンス配列
UCUUGUCGAAGUUUCUUUCUU(配列番号16)
を有した。
3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT、Sigma社製)アッセイ(Mosmann,T,1983年,J.Immunol.Methods,第65巻,55〜63頁)により、細胞生存率を評価した。化学療法/siRNA間相互作用を評価するため、96ウェルプレートにウェル当たり5000個の細胞を播種した。24時間後、細胞にsiRNAをトランスフェクトし、異なる濃度の各種化学療法剤により処置した。48時間後、各ウェルにMTT(1.0mg/ml)を添加し、細胞を37℃で2時間にわたりインキュベートした。培地を除去し、200μl DMSO中にホルマザン結晶を再吸収させた。マイクロプレートリーダー(Tecan Sunrise、Biorad社製、UK)を用いて、570nmにおける各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞生存率を決定した。
遺伝子特異的プライマーを用いて、cDNAライブラリーから、PCR法により、アンフィレグリンタンパク質をコードするDNA配列を増幅した。AREG遺伝子は、細菌発現ベクターpET100内にクローンされ、これが、組換えタンパク質のN末端へのヘキサヒスチジンタグの組み込みを可能とした。次いで、この構築物を用いて、コンピテントのTOP10F’大腸菌細胞(Invitrogen社製)を形質転換した。多重クローニング部位に隣接するベクター特異的プライマーを用いるコロニーPCR法により、陽性形質転換細胞を選択した。
50μMアンピシリンを補充した5mlのルリア−ベルターニ(LB)培地中において、37℃で一晩、陽性クローンを増殖させた。この培養液の300μlのアリコートを、二次培養液の接種用に保管し、Qiagen社製のミニプレップキットを用いて試料の残余をミニプレップし、DNAシーケンシングにより配列を確認した。
発現誘導された組換えタンパク質は、50mlの8M尿素緩衝液(480g尿素、29g NaCl、3.12g NaH2PO4(二水和物)、0.34gイミダゾール)中で一晩にわたり溶解させた。6000rpmで1時間にわたり溶液を遠心分離した後、精製前に、0.8μmジャイロディスクフィルターを用いて上清を濾過した。
リフォールディングしたタンパク質を免疫原として用いて、モノクローナル抗体を産生した。150μgの精製組換えタンパク質により、3週間間隔で、5匹のBALB/Cマウスを免疫化し、3回目と5回目のブースト後に、抗体力価を解析した。各動物から試験血液を採取し、100ngの抗原に対するウェスタンブロット法により、1:1000の希釈率で調べた。ブロットは、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)を用いて発色させた。
ELISA法によりモノクローナル抗体をスクリーニングして、どのクローンを増殖させるかを決定する。スクリーニング抗原を含有する100μlのコーティング緩衝液(緩衝液A:0.42g重炭酸ナトリウム/100μl H20、緩衝液B:0.53g炭酸ナトリウム/100μl H20、pH9.5)を各ウェルに添加(100ng/ウェル)することにより、Maxi Sorb 96ウェルプレートを組換え抗原によりコートした。対照抗原も用いて、非特異的クローンを除去した。37℃で1時間にわたりプレートをインキュベートして、抗原をウェルに結合させ、次いで、200μl PBS/3%BSAを各ウェルに添加することにより、室温で1時間にわたりプレートをブロックした。
ウェスタンブロット法によりハイブリドーマ細胞株に由来する上清を解析し、モノクローナル抗体が癌細胞株の範囲において組換えAREG及び内因性の天然AREGタンパク質(癌におけるAREG発現を表す)を共に検出する能力を判定した。SDS−PAGE法により、HCT116及びHT29の全細胞溶解物(〜30μg/ml)、又は組換えAREGタンパク質のアリコートを分離し、Hybond−C Extraニトロセルロース膜(Amersham Biosciences社製)上に転写した。膜は、室温で1時間にわたりPBS/5%マーベル(marvel)中でのインキュベーションによりブロックし、その後、PBS中で短時間にわたりすすいだ。モノクローナル抗体は、PBS中で1:500又は1:250の希釈率で用い、緩やかにロッキングしながら4℃で一晩にわたり膜上でインキュベートした。次いで、PBS/1%マーベル(marvel)及び0.1%Tween−20によりブロットを3回すすぎ、次いで、振盪しながら室温で1時間にわたり1:3000の希釈率におけるヤギ抗マウスHRP抱合二次抗体でインキュベートした。次いで、PBS/1%マーベル(marvel)及び0.1%Tween−20溶液によりブロットを3回すすいだ後、PBS中で短時間にわたりすすいだ。ブロットは、室温で5分間にわたりECL plus基質(Amersham Bioscicences社製)と共にインキュベートした後、Kodak imager上で解析した。
2.5μMイリノテカンを伴うか又は伴わずに、48時間にわたりHCT116又はH460細胞を処置した。48時間後、PBS中で細胞を洗浄し、通常ヤギ血清中で20分間にわたりブロックした。2時間にわたり、AREG抗体又はアイソタイプ対照と共に5×105個の細胞をインキュベートし、PBS−T中で洗浄した。1時間にわたりFITC抱合ヤギ抗マウス抗体と共に細胞をインキュベートし、PBS−T中で洗浄した後で、BD FACS canto上で解析した。
[実施例1]
処置の24及び48時間後における、2つの異なる化学療法薬に対する遺伝子応答を調べる異種移植試験をセットした。各マウスに等量のHCT116細胞を植え込み、各条件をトリプリケートで実施した。3匹ずつのマウスの4群に100ul CPT−11(70mg/kg)、5−FU(70mg/kg)、又は生理食塩液対照を投与した。次いで、24時間後(5−FU)&48時間後(CPT−11、5−FU)に、腫瘍を切除した。腫瘍の平均質量は、対照及び薬剤治療群を通じて変化しなかった。
[結腸直腸及び乳癌細胞株において化学療法により誘導されたAREGの上方調節]
複数の癌細胞株において、AREGの上方調節がさらに確認された。ヒトHT29結腸直腸癌細胞及びヒトHCT116結腸直腸癌細胞において、IC50用量のCPT11による処置後に、AREG mRNAの上方調節が観察された(図6A及び6B)。さらに、ヒトMDA−MB231乳癌細胞株におけるIC50用量の5−FUによる処置後に、AREG mRNAの上方調節が示された(図6C)。
siRNAは、非処置細胞、モックトランスフェクション、及び対照siRNAと比較して、HCT116結腸直腸細胞株におけるAREG(図7A)及びHB−EGF(図7B)の発現を強力に下方調節した。図9及び図11のそれぞれにおいて、AREGのノックダウンは、HT29結腸直腸癌細胞及びMDA−MB231においてもまた示される。
siRNAによるAREG及びHB−EGFのサイレンシングを確認した後、MTTアッセイを実施して、これらの2つの遺伝子の下方調節が細胞増殖に対して及ぼす効果を検討した。
組換えヒトアンフィレグリンに対して、マウスモノクローナル抗体のパネルを作製した(図14〜16)。ELISA法、ウェスタンブロット法(結腸直腸細胞株HCT116及びHT29に由来する全細胞溶解物)、及び共焦点顕微鏡解析によりこれらを特徴付け、AREG特異的な認識を裏付けた(図17〜22)。
HCT116細胞及びH460細胞のフローサイトメトリー解析は、抗AREGモノクローナル抗体を用いて評価した場合におけるAREGの細胞表面認識を示す(図23は、AREGクローン4G5及び6E11、並びにアイソタイプ対照により処置したHCT116細胞のFACS解析を示す)。さらに、解析前に48時間にわたり2.5μMイリノテカンにより処置した細胞は、AREGの細胞表面発現の最大40%の上昇を示した。抗AREGクローン6E11 1E9では、イリノテカンによる処置後のHCT116細胞において、20%のAREG発現上昇を検出した(図24)。
癌細胞株であるMDA−MB231乳癌細胞(図26&図27)及びHCT116結腸直腸癌細胞(図28)に対して、MTTアッセイを実施し、細胞増殖に対するAREGモノクローナル抗体の効果を確認した。MDA−MB231細胞株における異なるクローンの活性をスクリーニングしたところ、複数のクローンが、非処置細胞と比較して、〜40%の細胞増殖の低下を示した。HCT116細胞では、より著明な効果が観察され、クローン4G5及び6E11では、〜60%の細胞生存率の低下が観察された。図29は、AREGクローン6E11 1E9 2D8(6E11 1E9 1C6と同じクローンであることが示されている)による、MDA−MB231乳癌細胞における細胞増殖に対する同様の効果を示す。図30及び31は、HCT116細胞株におけるAREG抗体の効果を示す。図30では、細胞生存率の65%の低下が観察され、図31は、細胞増殖の50%の低下を示す。図32は、肺癌H460細胞株におけるAREG抗体6E11 1E9 1C6の効果を示し、その効果を、アイソタイプの対照抗体と比較し、抗体が肺癌細胞の細胞生存率を著明に減弱することを示す。まとめると、これらの結果は、AREGモノクローナル抗体が、結腸直腸癌、肺癌、及び乳癌を含むAREG発現癌細胞の細胞生存率に対して著明な効果を及ぼすことを示す。
MTT細胞生存率アッセイを実施することにより、AREG抗体と組み合わせたHBEGF siRNAの下方調節効果を探索した(図33)。HBEGF siRNA単独による細胞増殖の低下がわずかであったのに対し、AREG抗体6E11 1E9 2D8は、細胞増殖を〜50%低下させた。HBEGF siRNA及び6E11 1E9 2D8を組み合わせて添加したところ、細胞生存率のさらなる低下が観察された。この効果が相乗的であるかどうかを見るため、Kern 1988により説明され、Romanelli 1998により改変されたRI値を計算した。RI値は、A及びBの組合せについて、細胞生存率の観察値(Sobs)に対する生存率の予測値(薬剤A単独により観察される生存率と、薬剤B単独により観察される生存率との積として定義されるSexp)の比率(RI=Sexp/Sobs)として計算される。相乗効果は、RI>1として定義される。6E11 1E9 2D8のRI値は、約2であった。しかし、6E11 1E9 1C6のRI値は、5を上回ると計算された。まとめると、これらの結果は、Erbリガンド又はEGFと関連する癌(結腸直腸癌、乳癌、肺癌を含む)の治療におけるHBEGF及びAREGの両方に対する標的化の組合せが、細胞増殖の相乗的減弱をもたらすことを示す。
Claims (31)
- AREGの阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる新生物性疾患治療用薬剤の調製における、HB−EGFの阻害剤の使用であるか、又は
HB−EGFの阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる新生物性疾患治療用薬剤の調製における、AREGの阻害剤の使用であって、
前記HB−EGFの前記阻害剤が、前記HB−EGFの発現を阻害する核酸分子であり、
前記AREGの前記阻害剤が、前記AREGに結合する抗体分子、又は前記AREGの発現を阻害する核酸分子である、使用。 - 前記HB−EGFの前記阻害剤が第1のsiRNAであり、及び/又は前記AREGの前記阻害剤が第2のsiRNAである、請求項1に記載の使用。
- 前記AREGの前記阻害剤が、抗AREG抗体分子である、請求項1に記載の使用。
- 前記AREGの前記阻害剤が、配列番号27のアミノ酸配列を有する可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を有する可変領域とを含む抗体分子である、請求項3に記載の使用。
- 薬剤を、化学療法剤と同時に、個別に、又は逐次用いる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 化学療法剤が、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、及び植物アルカロイドからなる群から選択される、請求項5に記載の使用。
- 化学療法剤がCPT−11である、請求項6に記載の使用。
- 化学療法剤が5−FUである、請求項6に記載の使用。
- 前記新生物性疾患が、結腸直腸癌、乳癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
- 新生物性疾患が、p53変異を含む癌である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
- (i)HB−EGFの阻害剤と、(ii)AREGの阻害剤とを含む医薬組成物であって、
前記AREGの前記阻害剤が、前記AREGに結合する抗体分子、又は前記AREGの発現を阻害する核酸分子であり、
前記HB−EGFの前記阻害剤が、前記HB−EGFの発現を阻害する核酸分子である、医薬組成物。 - 前記AREGの前記阻害剤が抗AREG抗体分子である、請求項11に記載の組成物。
- 前記AREGの前記阻害剤が、配列番号27のアミノ酸配列を有する可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を有する可変領域とを含む抗体分子である、請求項12に記載の組成物。
- 前記HB−EGFの前記阻害剤が第1のsiRNAであり、及び/又は前記AREGの前記阻害剤が第2のsiRNAである、請求項11に記載の組成物。
- 新生物性疾患の治療において同時に、個別に、又は逐次用いる組合せにおいて、
(i)HB−EGFの阻害剤であって、前記HB−EGFの発現を阻害する核酸分子である阻害剤と、
(ii)AREGの阻害剤であって、前記AREGに結合する抗体分子、又は前記AREGの発現を阻害する核酸分子である阻害剤と
を含むキット。 - 前記AREGの前記阻害剤が抗AREG抗体分子である、請求項15に記載のキット。
- 前記AREGの前記阻害剤が、配列番号27のアミノ酸配列を有する可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を有する可変領域とを含む抗体分子である、請求項16に記載のキット。
- 前記HB−EGFの前記阻害剤が第1のsiRNAであり、及び/又は前記AREGの前記阻害剤が第2のsiRNAである、請求項15に記載のキット。
- (iii)(i)及び(ii)の個別、逐次、又は同時の投与のための指示書
をさらに含む、請求項15〜18のいずれか一項に記載のキット。 - 前記AREGの前記阻害剤が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を有するVH領域の少なくとも1つのCDR、及び/又は配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するVL領域の少なくとも1つのCDRを含む抗体分子である、請求項1に記載の使用。
- 前記抗体分子が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を有するVH領域の3つすべてのCDR、及び/又は配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するVL領域の3つすべてのCDRを含む、請求項20に記載の使用。
- 前記抗体分子が、配列番号27のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項21に記載の使用。
- 前記抗体分子が、配列番号28のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項21又は22に記載の使用。
- 前記AREGの前記阻害剤が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を有するVH領域の少なくとも1つのCDR、及び/又は配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するVL領域の少なくとも1つのCDRを含む抗体分子である、請求項11に記載の組成物。
- 前記抗体分子が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を有するVH領域の3つすべてのCDR、及び/又は配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するVL領域の3つすべてのCDRを含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記抗体分子が、配列番号27のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記抗体分子が、配列番号28のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項25又は26に記載の組成物。
- 前記AREGの前記阻害剤が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を有するVH領域の少なくとも1つのCDR、及び/又は配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するVL領域の少なくとも1つのCDRを含む抗体分子である、請求項15に記載のキット。
- 前記抗体分子が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を有するVH領域の3つすべてのCDR、及び/又は配列番号28として示されるアミノ酸配列を有するVL領域の3つすべてのCDRを含む、請求項28に記載のキット。
- 前記抗体分子が、配列番号27のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項29に記載のキット。
- 前記抗体分子が、配列番号28のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項29又は30に記載のキット。
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