JP2012502954A - 癌治療のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)ChoK阻害剤に耐性を示す腫瘍細胞を、候補化合物と接触させる工程と、
(ii)前記細胞中の酸性セラミダーゼレベルを定量する工程とを含んでなり、候補化合物による治療後、細胞中の酸性セラミダーゼレベルが治療前より低い場合、前記候補化合物は、癌治療に対するChoK阻害剤効果を高めることができるとみなされる。
(本発明の第1の成分)
本発明の発明者らは、コリンキナーゼ(ChoK)阻害剤耐性の原発性ヒト腫瘍の存在を同定している(図1)。詳細には、本発明の実施例1では、ヒト非小細胞肺癌組織由来の種々の初代培養細胞が、公知のChoK阻害剤であるMN58bに対する分差感度を示すと述べている(図1)。驚くことに、この耐性は、本発明の実施例2および3で示されるように、酸性セラミダーゼの発現レベルの上昇によって引き起こされることが分かっている(図2)。ChoKの機能は、Choをリン酸化してホホコリン(Pcho)を生成することである。ホホコリンは、原形質膜の主要構成成分フォスファチジルコリン(PC)の前駆体である(Lacal JC, IDrugs. 2001; 4:419-26)。しかし、細胞膜そして故にPCが、細胞増殖には絶対的に必要である。したがって、いかなる理論によっても縛られたくないとは思うが、腫瘍細胞は、スフィンゴミエリン(SM)の分解でPChoを生成する代替経路の活性化によって、ChoK阻害に反応すると考えられている(図3)。しかし、SMの分解は、PCho生成のみならず、アポトーシス促進物質であるセラミドの生成にもつながり、結果的に腫瘍細胞には、アポトーシス細胞死が引き起こされる。興味深いことには、そうしたChoK阻害耐性の細胞には、アポトーシス促進性セラミドの分裂促進性スフィンゴシン−1Pへの転換を促進する酵素である酸性セラミダーゼのレベル上昇が見られることが、ここで同定されている(図3)。これらの結果により、酸性セラミダーゼの過剰発現は、細胞内でのセラミドレベルが減少するために、ChoK阻害による細胞死促進を抑制する可能性があることが示唆される。このため、腫瘍細胞内でChoK阻害により誘起されたアポトーシス促進性シグナルは、酸性セラミダーゼの過剰発現によって不活性化される。その上、生成されたセラミドは、分裂促進性スフィンゴシン−1Pに転換される可能性がある(図3)。
ここで使用されるコリンキナーゼ阻害剤としては、Chok活性を低下させることが可能な何らかの化合物に関連し、例えば、当該酵素の活性を低下させるChok阻害化合物に加え、ChoK遺伝子の発現を妨げ、ChoK mRNAまたはタンパク質のレベルを低減する化合物等がある。
ここで使用される酸性セラミダーゼ阻害剤としては、酸性セラミダーゼ活性の低下を生じさせることが可能な何らかの化合物に関連し、例えば、酸性セラミダーゼの活性部位に結合して当該酵素の活性を低下させる化合物に加えて、酸性セラミダーゼ遺伝子の発現を妨げ、酸性セラミダーゼmRNAまたはタンパク質のレベルを低減させる化合物等がある。
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに存在するエピトープに対する抗体は、これらのタンパク質の機能を効果的に遮断する可能性があり、したがって、本発明の組成物の阻害剤として使用することができる。ここで使用される“阻害抗体”とは、酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼの生物学的活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体を意味する。
ドーマ細胞を培養する前記培地(上澄み)を用いて単離される。クローンアッセイは、ChoKに対するモノクローナル抗体を得るために、流動細胞分析法、免疫沈降法、または、その他、RIAやELISA等のin vitroでの結合アッセイのような従来手法によって行われることができる。クローンはまた、動物における腹水腫瘍として、in vitroで培養されることができる。
幾つかの種(通常、mAbが生成された哺乳類)の抗体由来の可変領域および他の種(キメラ抗体が使用されることになる種)の定常領域とで構成された抗体を意味する。このような構成の目的は、オリジナルのmAbでありながら免疫原性が低く、治療される患者では寛容性が高く、改善された血清半減期を有し、エフェクターの免疫作用機序、例えば、補体、細胞毒性細胞のFc受容体または種特異性を示す免疫グロブリンに対する他の特異的受容体等のために認識され得る抗体を生成するためである。
「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体由来の抗体、典型的にはネズミ抗体であって、親抗体の抗原結合特性を保持しつつヒトでは免疫原性が低い抗体を意味する。この抗体の実現には、可能性として様々な手法がある。例えば、(a)非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を生成する;(b)非ヒト相補性決定領域(CDRs)のみを、臨界的フレームワーク残基を保持するかまたは保持していないヒトフレームワークならびに定常領域に、グラフトする;および(c)非ヒト可変ドメイン全体の移植ではあるが、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「覆う」等の方法がある。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で記述がある。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源から導入された1個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、典型的には、「移入」可変ドメインから取られたものである。ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者ら(Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することにより行われることができる。実際のところ、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの超可変領域残基および、もしかすると幾つかのフレームワーク(FR)残基が、齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体生成において使用される重鎖および軽鎖のヒト可変ドメインの選択は、抗原に対する特異性および親和性を保持する免疫原性を低減するために非常に重要である。所謂「最適な」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列について、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーがスクリーニングされる。そして、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(FR)として認められる(Suns et al., J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. MoI. Biol, 196:901 (1987))。もう一つの方法は、軽鎖または重鎖の特定サブグループの全ヒト抗体コンセンサス配列から由来する特定フレームワーク領域を用いる。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体に用いる場合がある(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151 :2623 (1993))
ヒト抗体により類似の抗体を作製するこうしたアプローチにおける次の段階は、所謂霊長類化抗体、すなわち、サル(または他の霊長類)の可変重鎖および軽鎖ドメインを含むように構築された組換え抗体、詳細には、カニクイザル抗体であり、ヒト定常ドメイン配列、好ましくは、ヒト免疫グロブリンγ1またはγ4定常ドメイン(もしくはPEバリアント)を含むものである。このような抗体の作製については、Newman et al, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)、米国特許US5658570およびUS6113898に記載されている。これらの抗体は、ヒト抗体に対する高い相同性85%〜98%を示し、ヒトエフェクター機能を発揮し、低免疫原性であるため、ヒト抗原に対し高親和性である可能性が報告されている。組換え抗体生成におけるもう一つの高効率的手段が、Newman, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)によって開示されている。
「ヒト抗体」とは、公知の標準的な方法のいずれかによって生成された、全体としてヒト軽鎖および重鎖ならびに定常領域を含む抗体を意味する。
抗体断片は、例えば、Fab、F(ab’)2、Fab’およびscFvのような抗体断片である。抗体断片の生成のために様々な技術が開発されてきている。従来は、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質消化により誘導されていたが、ごく最近では、組換え宿主細胞によって直接生成されることができる。他の複数の態様によれば、選択される抗体は1本鎖Fv(scFv)断片で、さらに単一特異的または二重特異的であってもよい。
2重特異性抗体は、少なくとも2個以上の異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例えば、2重特異性抗体は、B細胞表面マーカーの2個の異なるエピトープに結合するものがあり、また他の2重特異性抗体は、第1のB細胞表面マーカーに結合し、さらに第2のB細胞表面マーカーに結合するものがある。あるいは、抗B細胞マーカー結合アームが、T細胞受容体分子(例えば、CD2もしくはCD3)等の白血球上のトリガー分子、またはIgGのFc受容体(FcyR),例えば、FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)、FcyRIII(CD16)等に結合するアームと結合して、B細胞に細胞防御機序を集中させることができる。2重特異性抗体はまた、細胞傷害性薬物をB細胞に局在化するために使用されることもできる。これらの抗体は、B細胞マーカー結合アームおよび細胞傷害性薬物(サポリン、抗インターフェロン‐α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン等)に結合するアームを有している。2重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(F(ab)2二重特異性抗体等)として作製できる。
もう一つの態様によれば、本発明の組成物の一部を構成する酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼの阻害剤は、酸性セラミダーゼおよび/またはコリンキナーゼの発現、または酸性セラミダーゼおよび/またはコリンキナーゼ機能に必要な任意の成分遺伝子の発現をノックダウンさせることが可能なRNAiである。RNAiは、真核細胞に発生する可能性のある、配列特異的な転写後遺伝子発現のプロセスである。一般に、このプロセスは、特定の配列のmRNAの分解を伴う。該mRNA分解は、その配列に相同的な二本鎖RNA(dsRNA)によって誘導される。例えば、特定の一本鎖mRNA(ssmRNA)の配列に相当する長鎖dsRNAの発現が、そのメッセージを不安定にし、それによって、対応する遺伝子の発現の「干渉」となる。したがって、任意の選択遺伝子の抑制が、その遺伝子に対するmRNAの全体または重要部分に相当するdsRNAの導入によって可能になる。長鎖dsRNAが発現すると、最初に、リボヌクレアーゼIIIによる処理で、わずか21〜22個の塩基対からなる、これまでよりも短い長さのdsRNAオリゴヌクレオチドにされるように思われる。したがって、RNAiは、比較的短い相同的なdsRNAsの導入または発現によって実行されることができる。事実、比較的短い相同dsRNAsの使用には、以下で述べるような特定の利点がある可能性がある。
標的mRNA転写物を触媒作用で開裂するために設計されたリボザイム分子も、酸性セラミダーゼおよび/またはコリンキナーゼmRNAの翻訳を妨げるために使用されることができる。したがって、もう一つの態様によれば、本発明の組成物は、mRNA酸性セラミダーゼおよび/またはコリンキナーゼを特異的に対象とするリボザイムを含んでなる。リボザイムは、RNAの特定の開裂を触媒することができる酵素RNA分子である(概説は、Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994を参照)。リボザイム作用の機序は、相補的な標的RNAに対するリボザイムの配列特異的ハイブリダイゼーション、そしてそれに続くヌクレオチド鎖開裂事象に関与する。リボザイム分子の組成物は、好ましくは、標的mRNAに相補的な1つ以上の配列およびmRNA開裂に関連する公知の触媒配列または機能的に等価な配列を含む(例えば、米国特許第5,093,246号を参照。尚、該特許はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる)。
本発明のさらなる様態は、例えば、酸性セラミダーゼおよび/またはコリンキナーゼ核酸の転写および/または翻訳の阻害により、発現を阻害するための単離「アンチセンス」核酸の使用に関する。前記アンチセンス核酸は、従来の塩基対相補性によって、または、例えば、二重螺旋の主要な溝での特異的相互作用を通じてDNAに結合する場合に、潜在的な標的薬剤に結合することができる。一般に、これらの方法は、当該分野で一般に使用される技術の範囲に当てはまり、またオリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に依拠するいかなる方法をも含む。
本発明のさらなる態様は、酸性セラミダーゼおよび/またはコリンキナーゼ阻害剤がDNA酵素である組成物に関する。DNA酵素は、アンチセンスおよびリボザイム両技術の仕組みの特徴を幾つか組み込む。DNA酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとまさに同様に特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムとほぼ同様に、触媒的に働き特異的に標的核酸を開裂させるように設計される。
(本発明の第2の組成物)
本発明の発明者らは、驚くべきことに、コリンキナーゼ阻害剤MN58b治療への耐性が、シスプラチン、タキソール、ビレルビンまたはゲムシタビン等の従来の化学療法剤への耐性と相関関係がないことを発見している。
これらに限られない。
(本発明の第3の組成物)
本発明の発明者らは、細胞死受容体リガンドおよびChoK阻害剤を個別に使用した治療と比べて、細胞死受容体リガンドおよびChoK阻害剤併用による腫瘍細胞治療が、細胞増殖をより阻害することを明らかにしている。例えば、本発明の実施例8で示されるように、コリンキナーゼ阻害剤RSM−932A(ChoKI)およびTRAILの併用による大腸癌細胞の治療は、各化合物を個別投与して同じ細胞を治療する場合と比べ、細胞傷害性が上昇している。さらに、本発明の実施例8によれば、ChoK阻害剤MN58bおよびTRAILの併用使用により、腫瘍異種移植モデルでの腫瘍成長の阻害が、それらの化合物の各々を別々に使用する場合に見られるよりも改善された結果が示されている。
1593号に記載されているようなTRAILをコードするポリヌクレオチドを含んでなるDNAベクター等が挙げられる。
本発明の第1、第2および第3の組成物の一部を構成する化合物としては、そうした化合物のみならず薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、プロドラッグ、等が挙げられる。「薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ」という表現は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、または受容体への投与の場合、本発明に記載の化合物を(直接または間接的に)提供することが可能な他の任意の化合物を意味する。しかし、薬学的に許容されない塩も、薬学的に許容される塩の調製に役立つため本発明の範囲に包含される。塩、プロドラッグおよび誘導体の調製は、当該分野に公知の方法を用いて実施されることができる。
代謝拮抗剤,例えば葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤等があり、シタラビン(CYTOSAR‐U)、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル(5‐FU)、フロキシウリジン(FudR)、6‐チオグアニン、6‐メルカプトプリン(6‐MP)、ペントスタチン、メトトレキサート、10‐プロパルギル‐5,8‐ジデアザ葉酸(PDDF、CB3717)、5,8‐ジデアザテトラヒドロ葉酸(DDATHF)、ロイコボリン、フルダラビンリン酸、ペントスタチンおよびゲムシタビン等が挙げられるが、これらに限られない;
好適な天然生成物およびそれらの誘導体(ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗体、酵素、リンパ球ならびにエピポドフィロトキシン等)、例えばAra‐C,パクリタキシル(タキソール(k)、ドセタキシル(タキソテール)、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン‐C、L‐アスパラギナーゼ、アザチオプリン;ブレキナル;アルカロイド類、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等;ポドフィロトキシン類、例えばエトポシド、テニポシド等;抗体類、例えばアントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン(ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン)、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンならびにモルフォリノ誘導体等;フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えばダクチノマイシン;塩基性糖ペプチド、例えばブレオマイシン;アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン(ミトラマイシン);アントラセンジオン、例えばミトキサントロン;アジリノピロロインドールジオン、例えばマイトマイシン;大環状免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、FK‐506(タクロリムス、プログラフ)、ラパマイシン等が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗増殖性・細胞毒性薬剤は、ナベルベン、CPT‐11,アナストロゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびドロキサフィン等が挙げられる;
抗増殖活性を有する微小管影響性の薬剤も使用に好適であり、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない:アロコルヒチン(NSC 406042)、ハリコンドリンB(NSC 609395)、コルヒチン(NSC 757)、コルヒチン誘導体(NSC 33410等)、ドルスタチン10(NSC 376128)、メイタンシン()、リゾキシン()、パクリタキセル(タキソール)、タキソール誘導体()、デセタキセル()、チオコルヒチン()、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、エポチロンA,エポチロンB、ジスコデルモリド等を含むがこれらに限定されない天然および合成エポチロン;エストラムスチン、ノコダゾール等がある;
チロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィニチブ、イマチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブならびにエルロチニブ等がある;
トポイソメラーゼII阻害剤、例えばトポテカン、イリノテカン、エトポシドならびにテニポシド等のエピポドフィロトキシン等があげられるが、これらに限定されない;
アントラサイクリン(ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン等)がある;
モノクローナル抗体、例えばセツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アレムツズマブならびにトラスツズマブ等がある。
1593号に記載されているようなTRAILをコードするポリヌクレオチドを含んでなるDNAベクター等が挙げられる。
本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖阻害におけるそれらの相乗効果の点から、医療に用いられることができる。したがって、もう一つの様態で、本発明は、医薬に用いられる本発明の組成物に関する。
本発明の発明者らはまた、コリンキナーゼ阻害剤に対する反応が、酸性セラミダーゼ阻害剤(本発明の実施例6を参照)、化学療法剤(実施例7および9を参照)または細胞死受容体リガンド(実施例8を参照)をあらかじめもしくは同時に投与して治療する場合に高まることも確認している。
さらにまた、本発明の発明者らによる発見は、ChoK阻害剤療法に耐性を示す可能性のある癌患者を、該患者の試料中の酸性セラミダーゼレベルを定量することにより同定できる可能性を拓くものである。もし酸性セラミダーゼレベルが基準試料よりも高ければ、患者のChoK阻害剤耐性の可能性を示すことになる。これは、ChoK阻害剤に反応して産生されたアポトーシス促進性セラミダーゼが加水分解され、細胞分裂促進効果を有するスフィンゴシンが生成されるためである。反対に、もし酸性セラミダーゼレベルが、基準試料のレベルより低いかまたは少なくとも高くない場合は、その患者はChoK阻害剤療法に対して好ましい反応を示すことが分かる。
本発明の発明者らにより提供された研究成果によって、ChoK阻害剤療法に耐性を示す可能性のある癌患者を、その患者由来の試料中の酸性セラミダーゼの発現レベルに基づいて同定することが可能になっている。したがって、さらにもう一つの態様によれば、本発明は、癌の患者のための個別化治療を選択するための方法(以下、本発明の第2の方法という)に関し、該方法は、前記患者由来の試料中の酸性セラミダーゼのレベルを同定する方法を含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼの発現レベルが、基準試料よりも高い場合、前記患者は、ChoK阻害剤またはChoK阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤併用の治療候補者である。
本発明の発明者らは、ChoK阻害剤に高い耐性を示す腫瘍細胞が、酸性セラミダーゼレベルが高いことを確認している。したがって、所定の化合物に反応して酸性セラミダーゼが上昇するレベルを測定することにより、該化合物がChoK阻害剤耐性を低減できるかどうかを判定すること、言い換えればこれらの化合物の治療効果を高めることが可能となる。
患者
本分析のために使用されたのは、2001〜2004年までの間にNSCLCの外科切除を受け、その後マドリードのLa Paz病院のMedical Oncology divisionによりフォローアップされた、84人の無作為に選択された患者から採取された肺癌組織の標本である。これらの患者には、アジュバント療法は行われなかった。本研究は、病院の治験審査委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントが全患者から得られた。
NSCLC患者由来の切除組織が分離され(組織分離用篩い‐組織粉砕キット CD1 SIGMA)、得られた細胞が24ウェルプレート(BD Falcon、バイオサイセンス社、米国カルフォルニア州サンホセ)に接種された。細胞は、DDP、タキソール、ビノレルビン、ゲムシタビンの濃度を漸増して(0、0.5、1、5、10および20μM)、10%ウシ胎児血清(FBS:ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド)を添加したDMEM:12HAM培地(D8437:シグマ社)で、10日間培養された。各ウェル内の最終的に残存する集団が前述されたようなクリスタルバイオレット法により定量化された(Rodriguez- Gonzalez, A. et al, Oncogene, 22:8803-8812)。
MN58bが国際公開WO9805644に記載されており、1,4‐(4‐4’‐ビス‐((4‐(ジメチルアミン)ピリジニウム‐1‐イル)メチル)ジフェニル)ブタンジブロマイドに相当する。RSM‐932Aは、米国特許出願US2007185170号に記載されており、1,1’‐(ビフェニル‐4,4’‐ジルメチレン)ビス[4‐(4‐クロロ‐N‐メチルアニリノ‐)キノリニウム]ジブロマイドに相当する。NOEは、Sugita et al (Biochim.Biphys.Acta, 1975, 398:125-131)による記載があり、N‐オレオイルエタノールアミン(NOE)に相当する。D‐NMAPPDは、3‐エトキシ‐1‐(2‐メチルアミノエチル)‐3‐フェニル‐インドール‐2‐オン(CAS 35922‐06‐6)に相当し、Raisova, M., et al. (FEBS Lett., 2002, 516:47-52) およびSelzner, M. et al. (Cancer Res., 2001, 61 :1233-1240)により記載されている。TRAILは前述されており、ヒトTRAIL(アミノ酸95‐281)細胞外ドメインに相当する。
選択された生検のRNAが、RNeasy Mini Kit(キアゲン社、ドイツ、ヒルデン)を用いて、製品の指示に従って、マイクロアレイおよびQT‐PCRのために単離された。試料が調製され、アフィメトリクスジーンチップ発現解析(Affymetrix GeneChip Expression Analysis)技術マニュアルに従って、マイクロアレイのハイブリダイゼーションが行われた。Affymetrix U133plus2遺伝子チップとのハイブリダイゼーション(47,000個の転写物を表す54,614個のプローブセット)、染色、洗浄およびスキャニングの工程が、国立バイオテクノロジーセンター(スペイン、マドリード)のゲノム施設で実施された。これは、www.affymetrix.com (アフィメトリクス社、カルフォルニア州サンタクララ)に掲載されている。シグナルLog比(Signal Log Ratio)で、転写物の大きさおよび変化の方向が評価される。使用されたLogスケールは、2を底とする。したがって、1.0のシグナルLog比は、転写レベルの増加が2倍であることを示し、−1.0は、2倍の減少を示す。シグナルLog比が0であれば、変化が無いことを示す。
RNA1μgを使い、高性能cDNAアーカイブキット(High-Capacity cDNA Archive Kit:アプライド・バイオシステムズ社)を用いてcDNAを生成し、定量的リアルタイムPCRを、ABI PRISM 7700 配列検出システム(アプライド・バイオシステムズ社)を用いて3点測定で実施した。GAPDHおよび18SリボソームmRNAを、内部対照として増幅した。増幅用のプローブとしては、アプライド・バイオシステムズ社製のTaqman Gene Expression Assaysのプローブ(ASAHl : HS00602774 M1 Taqman Probe, ASAH2: HS00184096 M1 Taqman Probe and ASAH3: HS00370322 M1 Taqman Probe, DUT: HS00798995 S1 Taqman Probe, TYMS: HS00426591 M1 Taqman Probe, UPPl : HS00427695 M1 Taqman Probe, RRM2: HS00357247 G1 Taqman Probe)を使用した。各遺伝子の相対的発現の計算には、2‐ΔΔCt法を使用した(Livak KJ., Methods. 2001; 25:402-8)。
本研究で使用される全細胞株を、温度(37℃)、湿度(95%)および二酸化炭素(5%)の標準条件下で維持した。ヒト初代気管支上皮細胞NHBE(BEC)(CC‐2541、カンブレックス社)を、BEGM(気管支上皮細胞増殖培地)BulletKit(CC‐3170、カンブレックス社)で増殖させた。ヒト初代乳房上皮細胞HMEC(CC−2551、クロネティクス社)を、ブレットキット添加のMEMB培地で増殖させた。上皮非小細胞肺癌細胞株H460ならびにH1299、および小細胞肺癌細胞株H510ならびにH82を、10%ウシ胎児血清(FBS:ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド)を添加したRPMIで維持した。
細胞を、6000個/ウェルの密度で96ウェルプレート(BD Falcon,バイオサイエンス社、米国カルフォルニア州サンホセ)に接種し、24時間標準条件下でインキュベートした。次に、異なる濃度のChoK阻害剤(各濃度4つずつ)で細胞を処理し、72時間維持した。各ウェル内に残っている細胞数の定量化を、MTT(3‐(4,5‐ジメチルチアゾール‐2‐イル)‐2,5‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)法により行った。595nmの吸光度を、VersaMaxマイクロプレートリーダー (モレキュラーデバイス社, 米国カルフォルニア州サニーベイル)で測定する。酸性セラミダーゼ阻害剤への感作のために、NOEに相当するIC50で、細胞を4時間前処理した後、ChoK阻害剤で処理した。NOE(N‐オレオイルエタノールアミン)は、カルバイオケム社製(米国カルフォルニア州ラホラ)を使用した。
指定細胞を、接種(106細胞/0.1モル)直前にDMEMで再懸濁し、免疫抑制マウス(nu/nu)に皮下注射した。スペイン政府ガイドラインに従い、標準的ラボ条件下に置いた。腫瘍が平均体積0.1cm3に達した時、マウスを対照群と治療群に無作為化した。抗腫瘍剤(および対照群にはビークル)による治療を以下の指定スケジュールで実施した(腹腔内投与)。腫瘍は、週3回、直径の大(D)・小(d)を測定してモニターし、腫瘍体積は、V=(D*d2)/2で算出した。腫瘍の成長における有意な変化の統計解析を、SPSSソフトv.13.0を使用して算定した。
アポスクリーン・アネキシンV・アポトーシスキット(Aposcreen Annexin V Apoptosis Kit) (サザンバイオテク社)を用いて製造者の手順に従い、フローサイトメトリーにより、細胞死の解析を行った。細胞は、4×105個/ウェルとなるように6ウェルプレートに接種した。24時間後、指定の化合物で処理した。冷やしたPBSで細胞を2回洗って、PBSを除去後、1×106〜1×107個/mLの濃度になるように、冷やしたIX結合バッファーで再懸濁した。これらの細胞の100μlをフローサイトメトリー用の試験管に集め、アネキシンVを10μl加えた。ボルテックスで静かに混和し、氷で15分間インキュベートし、遮光した。洗浄しないで、各試料にIX結合バッファー380μlを加え、次にプロピジウムイオジン10μlを加え、速やかにフローサイトメリーにより細胞解析を行った。
70%エタノールで固定してプロピジウムイオダイド4μg/mLで染色した細胞(IX106)の細胞周期解析を、Beckton Dickinson FACs SCANを用いて実施した。サイトメトリーのデータは、Cell Quest解析プログラム(ベクトンデッキンソン社)およびFlowJoソフトを使用して解析した。
細胞を、6ウェルプレートに1×105個/ウェルとなるように接種し、2日間[14C]‐セリンで脂質を標識した。24時間標識培地は交換せずに、細胞を培養した。次に、脂質を抽出して、事前に記載されたプロトコールを用いてTLCにより解析した(van Echten-Deckert, G. (2000) Sphingo lipid extraction and analysis by thin-layer chromatography. Methods Enzymol, 312, 64-79)。脂質抽出に先だって、細胞は−20℃で保たれた。メタノールで細胞をハーベストして脂質を、最終比60:30:6(v/v/v)のクロロホルム‐メタノール‐水で抽出した。有機相をコンセントレーター内でN2フロー下37℃で乾燥させた。試料をクロロホルム‐メタノール(1:1v/v)で再懸濁してTLCプレートに塗布した。クロロホルム‐メタノール‐2Mアンモニウム(60:45:4、v/v/v)の溶媒混合液を用いて脂質を分離させ、インスタントイメージャー(instant imager)により定量化を行った(Pakard, Meriden, CT, USA)。
細胞を、p100プレート1枚につき8×105個の密度で接種し、24時間後、指定の化合物で処理した。次いで、PBS洗浄を行い、短時間トリプシン処理して採取し、細胞のアリコットを取り出してタンパク質の測定を行った。内部標準物質(N−ドデカノイルスフィンゴシン、N‐ドデカノイルグルコシルスフィンゴシンおよびN‐ドデカノイル スフィンゴシルホスホリルコリンを各0.5モル)で強化されたスフィンゴ脂質抽出物を調製して解析した。液体クロマトグラフィー質量分析装置は、ウォーターズ社直交加速型飛行時間質量分析計(Waters LCT Premier mass spectrometer)に接続されたウォーターズ社Aquity UPLCシステム(ウォーターズ社:マサチューセッツ州ミルフォード)からなり、ポジティブ電子噴霧イオン化モードで作動させた。50〜1500Daの完全スキャンスペクトラムが得られ、個々のスペクトルを合計してデータポイント各0.2sが生成された。質量精度と再現性が、ロックスプレー・インターフィアランス(LockSpray interference)を介する独立した標準噴霧を用いて維持された。解析カラムは、Aquity UPLC BEHC8カラム:100mm×2.1mmi.d;1.7μm(ウォーターズ社)を使用した。二つの移動相は、移動相A:meOH/H2O/HCOOH(74:25:1;v/v/v)および移動相B:meOH/HCOOH(99/1;v/v)で、両者とも5mMのギ酸アンモニウムを含んでいた。勾配が計画された―0.0分、80%B;3分、90%B;6分、90%B;15分、99%B;18分、99%B;20分、80%B.フロー速度は、0.3mL min−1であった。カラムは30℃で保たれた。50mDaウィンドウを使用し、各化合物の抽出イオンクロマトグラムを用いて定量化を行った。直線ダイナミックレンジが、標準混合物を注入することにより決定された。化合物のポジティブ同定は、正確な質量測定に基づいていた(エラー<5ppmおよびLC保持時間±2%:標準との比較)。
等量の細胞溶解産物(30μg)のウェスタンブロット解析を、各相当の抗体を用いて行った。タンパク質を電気泳動で分離して、10%SDS‐PAGEゲルに付着させ、ニトロセルロースにトランスフェクトした。ブロットを、T‐TBS中の5%無脂肪ドライミルクで2時間ブロックした。ASAH1の同定は、BDトランスダクション・ラボラトリーズ社(Ref:6123012)から入手したモノクローナル抗体(1:250)を使用して実施した。ローディングコントロールとして、α‐チューブリン(T9026、シグマ社)を使用してブロットのアッセイを行った。カスパーゼ‐3およびPARPの同定には、抗カスパーゼ‐3および抗‐PARP抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー社、カルフォルニア州サンタクルーズ)を使用した。
上述された細胞増殖MTTアッセイを使用して、ChoK阻害剤との併用におけるシスプラチンの評価を行った。一晩インキュベートした細胞に、様々に異なる濃度のシスプラチンを添加し、3時間インキュベートした。濃度を漸増しながら、ChoK阻害剤を4時間添加した後、新鮮な培地でさらに24時間培養した。相乗作用、加成性または拮抗作用の点で、コンビネーションアッセイの結果を、チョウ・タラレイ(Chou Talalay)の組み合わせ指数アイソボログラム法 (Chou TC. et al, Trends Pharmacol Sci, 1983, 4:450-4)を用いて解析した。CIの範囲は、既に記載されている値で設定される(Chou TC. et al., supra.)。組み合わせ指数(CI)<1は、2剤間の相乗的相互作用を表す。付加的相互作用は、CI=1で表され、CI>1は両剤間の拮抗作用を表す。協調効果は、相互作用CI<1.0としてみなされる。全ての試験は4通り行った。
事象率の相関関係を、ピアソンのカイ二乗統計を用いて測定した。報告された全P値は両側P値であった。統計学的有意性は、P<0.05として定義された。統計学的分析は、SPSSソフトバージョン13.0(社、イリノイ州シカゴ)を使用して行った。
NSCLC患者におけるMN58bのChoK阻害に対する本質的薬剤耐性
MN58bによるChoKの特異的阻害に対する薬剤耐性の推定される機序を同定するために、我々は、マドリード(スペイン)La Paz病院の非小細胞肺癌(NSCLC)患者84人の臨床前研究を実施した。その目的のため、それらの患者の切除腫瘍由来の初代培養を確立して10日間培養した。細胞は、ChoK特異的阻害剤MN58bの濃度を20μMまで漸増しながら処理された。一つの濃度が、ヒト肺腫瘍から生成された幾つかの腫瘍由来細胞株における7〜50回のIC50を表す(表6参照)。図1に示されるように、本治療に対して様々な反応が認められた。一つは、一連の39個の試料(46.4%)が、MN58bに対して完全に耐性であったが、これは10日目に、薬剤の最大濃度で、ほぼ100%の細胞が生存していたためである。その一方、その他の45個の腫瘍(53.6%)は、MN58bの抗増殖作用に感受性を示した。中でも、15個の試料群は、10日目に該薬剤が低濃度であった場合でも、細胞の生存率はゼロであったため、MN58bに対して高い感受性があるとみなされた(33.3%)。最終的に、30個の試料群(66.7%)が、MN58bに部分的に感受性があると認められ、約50%の細胞が治療終了時に生存していた。
NSCLCにおけるChoK阻害への薬剤耐性メカニズムの同定
感受性を示した患者由来の、ChoK阻害剤に本質的に耐性を示す腫瘍の遺伝的相違を調査するため、我々は、代表的なNSCLC患者由来の腫瘍の転写的特徴を分析した。アフィメトリックスジーンチップ:ヒトゲノムHG‐U133およびマイクロアレイ2個を使用して、MN58b耐性を示す腫瘍の患者5人の一群と、同剤に高感受性を示す腫瘍の患者5人からなる別の一群とを比較した。このマイクロアレイプラットフォームは、47,000個の転写物を表す54,614個のプローブセットを含む。−2<倍率変化>2(−1<シグナル比>1)の観点では、912個の適格な転写物が、反応性試料との比較で、耐性のある腫瘍試料において有意な差別的調節を示した。差別的に発現した遺伝子の生物学的有意性を解釈するため、インジェヌイティー・パスウェイ解析(IPA:インジェヌイティーシステムズ社)を用いて遺伝子オントロジー解析を行った(Sorensen G., BMC Genomics. 2008, 9:114)。
MN58b耐性腫瘍のNSCLC細胞株における酸性セラミダーゼ発現
上述のように、脂質代謝に関与する酵素の酸性セラミダーゼ(ASAH1)は、MN58b耐性の腫瘍においては、いずれの選択基準によっても有意に過剰発現することが分かった。
酸性セラミダーゼの阻害により、ChoK阻害剤に対してNSCLC細胞を感作する
最初に、一連のヒト肺腫瘍細胞株(NSCLC細胞株としてH460ならびにH1299およびSCLC細胞株としてH510ならびにH82)におけるASAH1のレベルを調べた。図4に示されるように、SCLC由来細胞株は、老衰対照BEC細胞と類似する酸性セラミダーゼレベルを示し、NSCLCでのレベルよりもかなり低いレベルとなった。興味深いことに、これらのSCLC細胞株はまた、コリンキナーゼαが高レベルとなり、NSCLC細胞よりもChoK阻害に対する感受性が非常に高いことを示した(表6)。これにより、低レベルの酸性セラミダーゼは、ChoK阻害剤に対するSCLC細胞の非常に高い反応性を少なくとも部分的に示している可能性のあることが示唆されている。
ChoK阻害剤耐性NSLC細胞の生成
ChoK阻害に対する耐性の根底にあるメカニズムおよびこの阻害効果における酸性セラミダーゼの意味するものをさらに調査するため、我々は、ヒトNSCLC由来H460細胞株を使用して一連のin vitro試験を行った。この細胞株を9ヶ月間、MN58bおよび第2世代ChoKα阻害剤RSM‐932Aの投与サイクルを徐々に増やしながら培養状態で維持して、これらのChoKα阻害剤への耐性を獲得した新規細胞株を樹立した。対照細胞株(H460細胞株)も、H460の培養を維持しつつ、処理無しで同時に樹立された。したがって、MN58b耐性の樹立細胞株(H460 MN58R)およびRSM‐932A耐性の樹立細胞株(H460 RSM‐932A‐R)は、正常細胞株H460または対照細胞株H460が劇的に影響された濃度で影響を受けなかった。結果的に、これらのMN58bおよびRSM‐932A耐性細胞株における細胞増殖の50%を阻害するための必要濃度(IC50)は、対照群細胞に認められた濃度よりも有意に高くなっている(表9)。その上、両ChoK阻害剤間での強力な交差耐性が認められた。これは、これら2種類の抗腫瘍剤の作用機序が類似しているために起こりうると思われていた(表9)。
ChoKα阻害剤およびシスプラチン間の非交差耐性
前述されているように、NSCLC患者由来腫瘍の初代培養で実施された、種々の化学療法剤に反応する遺伝子の相関関係の統計学的解析によって、MN58b耐性は、試験された抗腫瘍剤の他のいずれに対する耐性とも関連がないことが分かった(表4)。患者の試料から得られたデータを検証するため、また、ChoK阻害剤耐性のメカニズムがNSCLC治療に使用される従来の他の抗腫瘍剤への耐性と無関係であることを証明するために、ChoK阻害耐性の樹立細胞におけるシスプラチンの抗増殖効果を分析した。表10に示すように、H460 MN58RおよびH460 RSM‐932A‐Rは、親細胞H460よりもシスプラチンの抗増殖効果に対してよりいっそう高い感受性を示した。これらの結果は、ChoK阻害耐性の獲得が、酸性セラミダーゼの過剰発現に関連する可能性のある特異的メカニズムを介して引き起こされ、シスプラチン等他の抗腫瘍剤の作用のメカニズムを妨げるものではないことを示唆する。
NSCLCにおけるシスプラチンおよびChoK阻害剤併用療法の有効性
上記で示した結果は、ChoK阻害剤が、シスプラチンに不応のNSCLC患者に抗腫瘍剤として使用可能であること、またその逆も可能であることを示唆している。そこで、ChoK阻害剤およびシスプラチンによる従来の白金系療法との併用治療がいかに強力的効果があるかを分析した。細胞生存率に対するシスプラチンとChoK阻害剤MN58bおよびRSM‐932Aとの併用による効果を、MTTアッセイを用いて、NSCLC由来細胞株H460で評価した。連続投与では、シスプラチンを3時間投与して、その後にChoK阻害剤を40時間投与した。その結果を、チョウ・タラレイ(Chou Talalay)の組み合わせ指数アイソボログラム法(Chou TC. et al., supra.)を用いて解析した。図6に示されているように、強力な相乗的(CIs<0.5)成長阻害が、H460細胞におけるシスプラチンとChoK阻害剤MN58bまたはRSM‐932Aの両剤間に認められ(それぞれCI=0.1およびCI=0.4)、これら2剤の併用が、NSCLC腫瘍成長抑制に有意な利点となり得ることが分かる。
コリンキナーゼ阻害剤とTRAILの協調が、大腸癌由来細胞株における細胞死を誘導する。
RSM‐932AおよびTRAILの抗腫瘍活性が、類似のまたは別個の作用メカニズムの結果として生じるのかを調査するために、腫瘍細胞の細胞毒性におけるコリンキナーゼ阻害剤(ChoKI)およびTRAILの併用による強調効果を試験した。その目的のために、5種類の大腸癌由来細胞株:DLD‐1、HT‐29、HCT‐116、SW620およびSW480を使用した。
コリンキナーゼ阻害剤および5‐FUの協調が、大腸癌由来細胞株における細胞死を誘導する。
さらに、コリンキナーゼ阻害剤および従来の5‐フルオロウラシル(5‐FU)併用に基づく大腸癌治療の潜在的効果も分析した。細胞生存率に対する5‐FUとChoK阻害剤MN58bおよびRSM‐932A併用の効果を、MTTアッセイによりDLD‐1、SW620およびHT‐29細胞で評価した。最高の組み合わせの選択肢は、並行投与またはChoK阻害剤を短時間(9〜24時間)投与後、5‐FUをそれより長く(48〜72時間)投与した連続投与であることが確認された。この結果を、チョウ・タラレイ(Chou Talalay)の組み合わせ指数アイソボログラム法(Chou TC. et al., supra.)を用いて解析した。図15に示すように、解析された全ヒト大腸癌細胞において、成長阻害への相乗的効果が、5‐FUとChoK阻害剤MN58bまたはRSM‐932Aとの間に認められ、これら2剤の併用が、大腸腫瘍成長抑制に有意な利点となり得ることが分かる。
Claims (22)
- 1種類以上のコリンキナーゼ阻害剤を含んでなる第1の成分と、
1種類以上の酸性セラミダーゼ阻害剤、1種類以上の化学療法剤および1種類以上の細胞死受容体リガンドからなる群から選択される第2の成分とを、個別にまたは共に含んでなる、組成物。 - 前記コリンキナーゼ阻害剤が、コリンキナーゼαに特異的である、請求項1に記載の組成物。
- 前記コリンキナーゼ阻害剤が、表1に示された化合物である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記酸性セラミダーゼが、表2に示された化合物である、請求項1または3に記載の組成物。
- 前記化学療法剤がアルキル化剤である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アルキル化剤が白金系化合物である、請求項5に記載の組成物。
- 前記白金系化合物がシスプラチンである、請求項6に記載の組成物。
- 前記化学療法剤が代謝拮抗剤である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記代謝拮抗剤が5−フルオロウラシルである、請求項8に記載の組成物。
- 前記細胞死受容体リガンドが、TRAIL、機能的に同等なその変異体、またはその模倣低分子化合物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
- 医薬に用いられる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 癌の治療に用いられる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記癌が非小細胞肺癌または大腸癌である、請求項13に記載の組成物。
- コリンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を高める方法であって、前記細胞と、酸性セラミダーゼ、化学療法剤、または細胞死受容体リガンドとを接触させることを含んでなる、方法。
- 前記化学療法剤がアルキル化剤または代謝拮抗剤である、請求項15に記載の方法。
- ChoK阻害剤を用いた療法に耐性を示す癌患者の同定方法であって、
前記患者由来の試料中における酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼレベルが基準試料よりも高い場合、前記患者はChoK阻害剤耐性であると同定される、方法。 - 前記試料が腫瘍試料である、請求項16に記載の方法。
- 癌患者のための個別化治療を選択する方法であって、
前記患者由来の試料中における酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼの発現レベルが前記基準試料におけるレベルよりも高い場合、前記患者は、ChoK阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤併用治療の候補者である、方法。 - 前記癌は、非小細胞肺癌または大腸癌である、請求項18に記載の方法。
- 前記ChoK阻害剤は、表1に示された化合物または化合物の混合物であり、および/または前記酸性セラミダーゼ阻害剤が、表2に示された化合物または化合物の混合物である、請求項19に記載の方法。
- 癌治療のためのChoK阻害剤の治療効果を高めることができる化合物の同定方法であって、
(i)ChoK阻害剤耐性を示す腫瘍細胞と、候補化合物とを接触させ、
(ii)前記細胞中の酸性セラミダーゼのレベルを定量することを含んでなり、
前記候補化合物による処置後に、前記細胞中の酸性セラミダーゼのレベルまたは酸性セラミダーゼ活性が、前記処置の前よりも低い場合、前記候補化合物は、癌治療のためのChoK阻害剤の効果を高めることができるとされる、方法。
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