WO2023008533A1 - 膵臓がん及び胆管がんの治療のための医薬用組成物 - Google Patents

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zic5
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protein
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希代子 深見
礼子 佐藤
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition that suppresses cell proliferation and has an anticancer effect in pancreatic cancer and bile duct cancer.
  • Platelet growth factor is a potent mitogen involved in the development of various cancers and consists of five disulfide dimers (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF -DD).
  • PDGF-AA disulfide dimers
  • PDGF-AB disulfide dimers
  • PDGF-BB PDGF-BB
  • PDGF-CC PDGF-CC
  • PDGF -DD PDGF-DD
  • PDGFD PDGFD
  • ZIC5 ZIC family member 5 (odd-paired homolog, Drosophila) protein promotes the expression of PDGFD, which is associated with FAK (Focal Adhesion Kinase) and STAT3 (Signal Transducer). and Activator of Transcription 3), enhancing the drug resistance of melanoma cells, and suppressing the expression of the ZIC5 gene suppresses the expression of the PDGFD gene and suppresses the cell proliferation of melanoma cells.
  • ZIC5 also contributes to enhancement of drug resistance (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • the ZIC5 protein functions as a transcription factor for E-cadherin, and by suppressing the expression of the ZIC5 gene, the decrease in the expression level of E-cadherin is suppressed, and malignant transformation and acquisition of metastatic potential are suppressed. It has also been reported that it can be done (Patent Document 1). According to the TCGA (The Cancer Genome Atlas) database (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga), in humans, ZIC5 However, it is highly expressed in various cancer tissues, including pancreatic cancer and bile duct cancer.
  • PDGF-BB is known to be involved in pancreatic cancer and bile duct cancer.
  • PDGF-BB treatment of pancreatic cancer cells significantly promotes cell proliferation and enhances invasiveness through the Hippo/YAP signaling pathway.
  • Hh Hedgehog
  • TRAIL Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Induced Ligand
  • pancreatic cancer and bile duct cancer are located deep in the abdomen, making early detection difficult. It is a so-called intractable cancer, and the 5-year survival rate in Japan is as low as about 10% for pancreatic cancer and about 20% for bile duct cancer. These cancers are often difficult to cure surgically because they already have metastasis at the time of diagnosis, and chemotherapy is currently the main treatment of choice.
  • anticancer drugs such as gemcitabine, tegafur/gimeracil/oteracil potassium combination drug, and nab-paclitaxel are used for pancreatic cancer. (Non-Patent Document 5).
  • gemcitabine and cisplatin are used in combination as chemotherapy in the treatment of bile duct cancer, but this also has low sensitivity to chemotherapy. In either cancer, no molecular-targeted drug that exhibits high efficacy has yet been put into practical use.
  • Non-Patent Documents 6-9 Pancreatic cancer and cholangiocarcinoma are often accompanied by inflammation such as pancreatitis and cholangitis.
  • Non-Patent Documents 6-9 IL-6 and IL-22 activate STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) in cancer cells. It has been shown that IL-22 activates STAT3 signaling in pancreatic cancer, leading to increased expression of stemness genes and EMT (epithelial-mesenchymal transition)-related transcription factors, enhancing stemness and tumorigenicity ( Non-Patent Document 6). In addition, STAT3 expression promotes metastasis of intrahepatic cholangiocarcinoma and correlates with poor prognosis. Both in vitro and in vivo, overexpression of STAT3 has been shown to promote invasion, metastasis, proliferation, and STAT3 phosphorylation of intrahepatic cholangiocarcinoma (Non-Patent Document 9).
  • the main purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition that suppresses cell proliferation and has an anticancer effect in pancreatic cancer and bile duct cancer.
  • the pharmaceutical composition and ZIC5 protein-reducing agent according to the present invention are as follows.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is a substance that suppresses the expression of the ZIC5 gene.
  • the pharmaceutical composition of [2] above, wherein the substance that suppresses ZIC5 gene expression is a nucleic acid molecule that suppresses ZIC5 gene expression by RNA interference.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (1)
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (2)
  • R 1 to R 13 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (3)
  • R 1 to R 7 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (4)
  • R 1 to R 18 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (5)
  • R 1 to R 3 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (6)
  • R 1 to R 14 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (7)
  • R 1 to R 14 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (8)
  • R 1 to R 12 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the substance that reduces the intracellular content of the ZIC5 protein is represented by the following general formula (9)
  • R 1 to R 12 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, an alkoxy group, formyl group, acyloxy group, or optionally substituted tetrahydropyranyloxy group
  • the pharmaceutical composition of the above [1] which is a compound represented by any of or a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the anticancer agent is one or more selected from the group consisting of BRAF inhibitors and DNA synthesis inhibitors.
  • a ZIC5 protein-reducing agent comprising, as an active ingredient, a compound represented by any one of the general formulas (1) to (9), a derivative thereof, a salt of these compounds, or a solvate thereof.
  • the pharmaceutical composition and ZIC5 protein-reducing agent according to the present invention suppress cell proliferation in pancreatic cancer cells and bile duct cancer cells, and have anticancer effects. Therefore, the pharmaceutical composition or the like is a novel agent that is very effective in treating pancreatic cancer and bile duct cancer.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analyzing ZIC5 mRNA expression levels in cancerous and nontumor areas in clinical specimens of pancreatic cancer (PAAD) and cholangiocarcinoma (CHOL) in Reference Example 1.
  • FIG. . 1 is a diagram showing the results of survival analysis of pancreatic cancer cases and bile duct cancer cases classified according to the presence or absence of ZIC5 gene expression in Reference Example 1.
  • FIG. FIG. 2 shows the results of real-time PCR analysis of ZIC5 mRNA expression levels in human normal tissues, pancreatic cancer cell lines, and bile duct cancer cell lines in Reference Example 2.
  • Example 1 is a diagram showing the results of examining the effect of suppressing ZIC5 gene expression on apoptosis induction in pancreatic cancer cell lines and cholangiocarcinoma cell lines in Example 1.
  • FIG. 1 in the pancreatic cancer cell line and the cholangiocarcinoma cell line, after suppressing the expression of the ZIC5 gene, gemcitabine (gem) was added and cultured for 14 days. It is a diagram showing.
  • Example 2 the PANC-1 strain (left) and RBE strain (right) were transfected with siNeg#1 or siZIC5#1, and two days later, IL-6 and gemcitabine were added and cultured. It is the figure which showed the result of having measured the relative number of cells.
  • FIG. 2 shows Western blot images of PANC-1 strain and RBE strain cells transfected with siNeg#1 or siZIC5#1 and cultured in the presence of IL-22 or IL-6 in Example 2.
  • 2 is a Western blot image of PANC-1 strain, MiaPaca-2 strain, and RBE strain cells transfected with siNeg#1 or siZIC5#1 in Example 2.
  • FIG. 3 ZIC5 protein and GAPDH protein in A375 cells treated with compound (T-1) (left) and compound (T-2) (right) were quantified by Western blot, and the relative amount of ZIC5 protein ([ FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring ZIC5 protein amount]/[GAPDH protein amount]).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring ZIC5 protein amount]/[GAPDH protein amount]).
  • FIG. 4 shows the results of measuring the apoptosis induction rate (%) of each cell treated with compound (T-1) (upper) and compound (T-2) (lower) in Example 4.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the apoptosis induction rate (%) of each cell treated with compound (T-1) and compound (T-2) in Example 4.
  • FIG. 5 the results of measuring the relative cell number of cells treated with the BRAF inhibitor (Vem) after treatment with compound (T-1) (left) and compound (T-2) (right) are shown. It is a diagram.
  • Example 6 the compound (T-1) (left) and the FIG. 4 shows the results of measuring the relative cell number of cells treated with compound (T-2) (right).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measuring the growth rate of pancreatic cancer cells virus-introduced with shZIC5/pSIREN-GFP or shNeg/pSIREN-GFP in Example 7, when the cells were cultured for 3 days.
  • Example 8 tet-shZIC5-introduced MiaPaca-2 cells and tet-shNeg-introduced MiaPaca-2 cells were treated with dox for 48 hours, and then the ZIC5 mRNA expression level of each cell was measured. It is a figure showing.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measuring the volume of tumor over time in immunodeficient mice implanted with tet-shZIC5-introduced MiaPaca-2 cells or tet-shNeg-introduced MiaPaca-2 cells in Example 8. be.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains, as an active ingredient, a substance that reduces the intracellular content of ZIC5 protein (hereinafter sometimes referred to as "ZIC5 protein-reducing substance"), and is used for the treatment of pancreatic cancer or bile duct cancer. It is characterized by being used.
  • ZIC5 protein-reducing substance a substance that reduces the intracellular content of ZIC5 protein
  • the ZIC5 protein belongs to the Zic family and has five C2H2-type zinc finger motifs. In pancreatic cancer cells and cholangiocarcinoma cells, when the intracellular content of ZIC5 protein is reduced, cell proliferation is suppressed and anticancer effects are obtained.
  • ZIC5 protein is a transcription factor of a protein that contributes to growth signals in pancreatic cancer cells and cholangiocarcinoma cells. may function as In melanoma, colorectal cancer, and prostate cancer, ZIC5 is involved in PDGFD-mediated growth signals, and suppressing the expression of the ZIC5 gene suppresses the expression of the PDGFD gene, resulting in cell proliferation of melanoma cells. Suppressed.
  • PDGFD-mediated signal transduction but also mainly PDGF-BB-mediated signal transduction is involved in proliferation and survival.
  • the ZIC5 protein-reducing substance which is the active ingredient of the pharmaceutical composition according to the present invention, includes substances that have the effect of suppressing the expression of the ZIC5 gene itself by RNA interference or the like.
  • examples of such substances include siRNA (small interfering RNA) and shRNA (short hairpin RNA) having a double-stranded structure consisting of a sense strand and an antisense strand of the cDNA partial region of the ZIC5 gene (RNAi (RNA interference) target region).
  • RNAi RNA interference
  • nucleic acids that directly inhibit the expression of the ZIC5 gene such as miRNA (microRNA).
  • RNAi-inducing vector capable of producing siRNA or the like in target tumor cells.
  • Preparation of siRNA, shRNA, miRNA, and RNAi-inducing vectors can be designed and produced by conventional methods from base sequence information of the target ZIC5 gene cDNA.
  • RNAi-inducing vectors can also be produced by inserting the nucleotide sequence of the RNAi target region into the nucleotide sequences of various commercially available RNAi vectors.
  • the ZIC5 protein-reducing substance used in the present invention may be a substance that degrades ZIC5 protein. When the ZIC5 protein itself is degraded, its function is inhibited.
  • the substance that degrades the ZIC5 protein may be a degrading enzyme that directly degrades the ZIC5 protein, or a substance that carries various labels such as polyubiquitin so as to become a substrate for the protease.
  • the substance may be a protein or peptide, a nucleic acid, or a low-molecular-weight compound.
  • a ZIC5 protein-reducing substance can be obtained, for example, by screening from a compound library.
  • the compound library may be a nucleic acid library, a peptide library, or a low-molecular-weight compound library. Cells in which the ZIC5 protein is overexpressed are treated with each of the compounds constituting the library, and compounds with reduced intracellular ZIC5 protein levels can be selected as candidate compounds for ZIC5 protein-reducing substances.
  • ZIC5 protein-reducing substances that are low-molecular-weight compounds include compounds represented by the following general formulas (1) to (9). Hereinafter, these compounds may be referred to as "ZIC5 protein-reducing agents”.
  • R 1 to R 18 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, A hydroxyalkyl group, an alkoxy group, a formyl group, an acyloxy group, or a tetrahydropyranyloxy group which may have a substituent.
  • the halogen atom includes a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • a chlorine atom is preferred as the halogen atom for R 1 to R 18 .
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear, branched, or a group having a cyclic structure. is preferably Specific examples include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, t-butyl group, pentyl group, isoamyl group, hexyl group and cyclohexyl group.
  • the alkyl group represented by R 1 to R 18 is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms may be linear, branched, or a group having a cyclic structure. is preferably Specific examples include ethenyl group (vinyl group), 1-propenyl group, 2-propenyl group (allyl group), 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group and the like. .
  • the alkenyl groups represented by R 1 to R 18 are preferably alkenyl groups having 2 to 4 carbon atoms, more preferably alkenyl groups having 2 to 3 carbon atoms.
  • the hydroxyalkyl group is preferably a group in which at least one hydrogen atom bonded to a carbon atom of an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is substituted with a hydroxy group, and the carbon of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • a group in which one of the hydrogen atoms bonded to the atom is substituted with a hydroxy group is more preferable, and one of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is a hydroxy group.
  • a group substituted on the group is more preferred.
  • hydroxymethyl group 1-hydroxyethyl group, 2-hydroxyethyl group, 1-hydroxypropyl group, 2-hydroxypropyl group, 3-hydroxypropyl group, 1-hydroxybutyl group, 2-hydroxybutyl group , 3-hydroxybutyl group, 4-hydroxybutyl group and the like.
  • the alkoxy group is preferably a group in which the alkyl group portion is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably a group in which the alkyl group portion is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. More preferred is a group which is a 3 linear alkyl group. Specifically, methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, t-butoxy group, s-butoxy group, n-pentyloxy group, n-hexyloxy group, etc. is mentioned.
  • the acyloxy group is preferably an acyloxy group having 2 to 7 carbon atoms, more preferably an acyloxy group having 2 to 4 carbon atoms. Specifically, acetyloxy group, propanoyloxy group, n-butanoyloxy group, 2-methylpropanoyloxy group, n-pentanoyloxy group, 2,2-dimethylpropanoyloxy group, n-hexanoyl An oxy group and the like can be mentioned.
  • 1 to 4 of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the tetrahydropyranyloxy group are halogen atoms, hydroxy groups, and 1 to 6 carbon atoms. , an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group, a formyl group, an acyloxy group, or a group substituted with an optionally substituted tetrahydropyranyloxy group.
  • substituents the same groups as those mentioned above can be used.
  • each substituent may be a group of the same type or a group of different types.
  • 1 to 4 of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the tetrahydropyranyloxy group are a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, Or a group substituted with a tetrahydropyranyloxy group having a substituent is preferable, and 1 to 4 of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the tetrahydropyranyloxy group are a hydroxy group and a methyl group.
  • ethyl group, propyl group, isopropyl group, hydroxymethyl group, hydroxyethyl group, hydroxypropyl group, hydroxyisopropyl group, or 1 to 4 of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the tetrahydropyranyloxy group are A group substituted with a group substituted with a hydroxy group, a methyl group or a hydroxymethyl group is more preferred.
  • hydroxy groups Among the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the tetrahydropyranyloxy group, three are hydroxy groups and one is a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a hydroxymethyl group, and a hydroxyethyl group.
  • the compound represented by the general formula (1) is preferably a compound in which R 1 to R 2 are each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and R 1 is a hydroxy group. and R 2 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a compound in which R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and R 2 is a hydroxy group. preferable.
  • each of R 1 to R 13 is independently a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms.
  • compounds are preferred, at least one of R 1 to R 13 is a hydroxy group, and each of R 1 to R 4 is independently a hydrogen atom, a hydroxy group, or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms;
  • a compound in which to R 13 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is more preferable, and R 1 to R 3 are each independently a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 4 , R 9 and R 10 are hydroxy groups, and R 5 to R 8 and R 11 to R 13 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 1 to R 7 are each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms are preferred, and R 1 to R 7 are preferred. are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 1 to R 18 is a hydroxy group
  • each of R 1 to R 18 is independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group
  • a compound having an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or an alkenyl group having 2 to 3 carbon atoms is preferable
  • R 2 and R 9 are hydroxy groups
  • R 1 , R 3 to R 8 and R 10 to R 18 are More preferred are compounds each independently being a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or an alkenyl group having 2 to 3 carbon atoms.
  • the compound represented by the general formula (5) is preferably a compound in which at least one of R 1 to R 3 is a hydroxy group, at least one of R 1 to R 3 is a hydroxy group, and R 1 to R 3 are each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a compound in which R 1 and R 3 are hydroxy groups and R 2 is a hydrogen atom or carbon A compound having an alkyl group of number 1 to 3 is more preferable.
  • the compound represented by the general formula (6) is preferably a compound in which at least one of R 1 to R 14 is a hydroxy group, at least one of R 1 to R 14 is a hydroxy group, and R 1 to R 14 are each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a substituent is more preferable, R 3 and R 6 are hydroxy groups, R 8 is a tetrahydropyranyloxy group optionally having a substituent, R 1 , R 2 , R 4 to R 7 and R 9 to R 14 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, or carbon a compound of 1 to 4 acyloxy groups, or a compound in which
  • the compound represented by the general formula (7) is preferably a compound in which at least one of R 1 to R 14 is a hydroxy group, at least one of R 1 to R 14 is a hydroxy group, and R 1 to R 14 are each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a substituent and R 3 , R 6 , R 10 and R 12 are hydroxy groups, and R 8 is a tetrahydropyranyloxy group optionally having a substituent.
  • each of R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 , R 11 , R 13 and R 14 is independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms; , a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, or an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms are more preferable.
  • the compound represented by the general formula (8) is preferably a compound in which at least one of R 1 to R 12 is a hydroxy group, at least one of R 1 to R 12 is a hydroxy group, and R 1 to R 12 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a substituent is more preferred, R 3 is a hydroxy group, R 6 is a tetrahydropyranyloxy group optionally having substituent(s), R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 7 to R 12 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, or 1 to 1 carbon atoms. Further preferred are compounds which are 4 acyloxy groups
  • the compound represented by the general formula (9) is preferably a compound in which at least one of R 1 to R 12 is a hydroxy group, at least one of R 1 to R 12 is a hydroxy group, and R 1 to R 12 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a substituent and R 6 is a hydroxy group, R 4 is a hydroxy group or a hydrogen atom, and R 1 to R 3 , R 5 , R 7 to Further preferred are compounds in which each R 12 is independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a formyl group, or an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the compounds represented by any of general formulas (1) to (9) may form salts.
  • Acids or bases that form the salts include mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid; organic acids such as acetic acid, succinic acid and citric acid; alkali metals such as sodium and potassium; alkaline earth metals such as calcium and magnesium. mentioned.
  • the compounds represented by any of formulas (1) to (9) may be in the form of solvates such as hydrates.
  • the low-molecular compound may be a derivative of the compound represented by any one of general formulas (1) to (9).
  • Examples of such derivatives include compounds in which any group of R 1 to R 18 in general formulas (1) to (9) is modified with various functional groups, oxidized, reduced, or atom-substituted. is mentioned.
  • the ZIC5 protein-reducing substance is more preferably a derivative obtained by prodrugating a compound represented by any one of the general formulas (1) to (9), which is performed for pharmaceuticals.
  • a derivative of the compound represented by any one of the general formulas (1) to (9) may form a salt, and may be a solvent such as a hydrate. It may be in the form of a Japanese product.
  • the salt those listed above can be used.
  • Cell proliferation of pancreatic cancer cells and cholangiocarcinoma cells is also suppressed by using a substance that suppresses or inhibits the function of ZIC5 protein by directly or indirectly binding to ZIC5 protein instead of the ZIC5 protein-reducing substance. and have anti-cancer effects.
  • the substance is not particularly limited, and may be any of nucleic acids, peptides, proteins, and low-molecular-weight compounds.
  • a substance that suppresses or inhibits the function of ZIC5 protein by directly or indirectly binding to ZIC5 protein a substance that binds to ZIC5 protein and inhibits interaction with the promoter sequence of a target gene in which ZIC5 protein functions as a transcription factor
  • examples include nucleic acids that The nucleic acid that binds to the ZIC5 protein and inhibits interaction with the promoter sequence of the target gene in which the ZIC5 protein functions as a transcription factor includes, for example, a region that is identical or homologous to the ZIC5 protein-binding region in the promoter sequence of the target gene. and a nucleic acid molecule having a high base sequence (so-called decoy nucleic acid).
  • the decoy nucleic acid may be DNA, RNA, single-stranded nucleic acid, or double-stranded nucleic acid. Double-stranded DNA is preferable as the decoy nucleic acid because of its excellent in vivo stability.
  • proteins that bind to ZIC5 protein and inhibit the intracellular function of ZIC5 protein include anti-ZIC5 antibodies.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Moreover, it may be an artificially synthesized antibody such as a chimeric antibody, a single-chain antibody, or a humanized antibody. These antibodies can be produced by conventional methods.
  • the substance that inhibits the intranuclear localization of ZIC5 protein may be a substance that inhibits translocation of the ZIC5 protein into the nucleus or a substance that promotes export from the nucleus.
  • Substances that inhibit nuclear translocation include, for example, ZIC5 protein and a substance that binds to the nuclear translocation signal of ZIC5 protein so as to cover it. Such substances may be proteins, peptides, or low-molecular-weight compounds.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated into dosage forms suitable for various dosage forms such as oral administration, intravenous injection, direct administration to the nasal cavity or oral cavity, transdermal administration, etc., by a conventional method.
  • the dosage forms include tablets, powders, granules, capsules, chewables, syrups, liquids, suspensions, injections, gargles, sprays, patches, ointments and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain various additives in addition to the ZIC5 protein-reducing substance as an active ingredient.
  • additives include excipients, binders, lubricants, wetting agents, solvents, disintegrants, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, buffers, preservatives. , antioxidants, flavoring agents, coloring agents, and the like. These additives can be appropriately selected and used from among pharmaceutically acceptable substances that are used in pharmaceutical formulations.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain other anticancer agents in addition to the ZIC5 protein-reducing substance, which is an active ingredient.
  • a higher therapeutic effect is likely to be obtained by combined use of an anticancer drug that exerts an anticancer effect by a mechanism different from that of the ZIC5 protein-reducing substance.
  • the other anticancer agent is not particularly limited, and examples thereof include BRAF inhibitors, DNA synthesis inhibitors, and the like. Examples of BRAF inhibitors include Vemurafenib, Dabrafenib, Encorafenib and the like.
  • DNA synthesis inhibitors include pyrimidine analogues such as gemcitabine and cytarabine; purine analogues such as fludarabine and cladribine; dihydrofolate reductase inhibitors such as methotrexate; and thymidylate synthase inhibitors such as 5-fluorouracil, tegafur and capecitabine.
  • IMP dehydrogenase inhibitors such as 6-mercaptopurine; adenosine deaminase inhibitors such as pentostatin; ribonucleotide reductase inhibitors such as hydroxycarbamide; methotrexate antidotes such as calcium folinate.
  • the other anticancer drug contained in the pharmaceutical composition according to the present invention may be one type or two or more types.
  • cancers to be treated with the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited as long as they are pancreatic cancer or bile duct cancer, but cancers expressing ZIC5 protein are preferred.
  • Pancreatic cancer or bile duct cancer expressing ZIC5 protein may be primary cancer or metastatic cancer.
  • pancreatic cancer and bile duct cancer to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered to obtain an anticancer effect may be cancers that cause inflammation.
  • the animal to which the pharmaceutical composition according to the present invention is administered is not particularly limited, and may be either a human or a non-human animal.
  • Non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters and guinea pigs, and birds such as chickens, quails and ducks.
  • the intracellular ZIC5 protein amount may be measured at the mRNA level or at the protein level.
  • the method for measuring the amount of ZIC5 protein in cells is not particularly limited as long as it is a method capable of quantitatively or semi-quantitatively measuring the amount of target protein or target mRNA in cells. It can be appropriately selected and used from known methods used for detection of proteins. Each method can be performed by a conventional method.
  • the amount of ZIC5 gene mRNA may be detected by a hybridization method using a probe that can hybridize with the ZIC5 gene mRNA, and a nucleic acid amplification reaction using a primer that can hybridize with the ZIC5 gene mRNA and a polymerase. It may be detected by the method used. In addition, commercially available detection kits and the like can also be used. For example, after synthesizing cDNA by performing a reverse transcription reaction using total RNA extracted from the tumor cells to be tested as a template, PCR (Polymerase Chain Reaction) or the like is performed using the obtained cDNA as a template, and the amount of amplification product obtained By measuring , the amount of ZIC5 gene mRNA can be quantified.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the amount of amplified product can be quantitatively measured by detecting it after specific separation by gel, capillary electrophoresis, or the like.
  • semi-quantitative PCR such as real-time PCR instead of PCR, the mRNA of the ZIC5 gene can be easily detected and simultaneously quantified.
  • the amount of ZIC5 protein can be measured using an antibody that specifically binds to ZIC5 protein (anti-ZIC5 antibody).
  • anti-ZIC5 antibody an antibody that specifically binds to ZIC5 protein
  • immunostaining is performed using an anti-ZIC5 antibody as a primary antibody, and based on the presence or absence of staining and the staining intensity, the presence or absence of ZIC5 expression and the expression intensity in the tumor cells to be tested are examined.
  • the immunostaining may be an enzyme antibody staining method using an enzyme-labeled antibody, or a fluorescent antibody staining method using a fluorescence-labeled antibody.
  • the amount of ZIC5 protein in the tumor cells to be tested can be quantitatively measured by Western blotting or the like after the protein in the cell extract prepared from the tumor cells to be tested is separated by SDS-PAGE or the like. can.
  • ⁇ Cell culture> the cells used were cultured as follows. Three types of pancreatic cancer cell lines (AsPC-1 strain, Panc-1 strain, MiaPaca-2 strain) and one type of cholangiocarcinoma cell line (RBE strain) were distributed from ATCC (American Type Culture Collection). I used something else. These cells were cultured at 37° C. in the presence of 5% CO 2 in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum.
  • RPMI 1640 medium Invitrogen
  • Apoptosis induction rate was measured as follows. First, CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent (manufactured by Invitrogen) and Hoechst 33342 were added to each cell and incubated for 40 minutes. Next, the stained state of the cells after incubation was analyzed using a DAPI filter and an FITC filter of an imaging cytometer "IN Cell Analyzer 2000" (manufactured by GE Healthcare).
  • the ratio (%) of Caspase-3/7 active cells (CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent positive cells) to all DAPI-stained cells (DAPI positive cells) was measured using "IN Cell Analyzer Workstation 3.7" (GE Healthcare (manufactured by Co., Ltd.), and this was defined as the apoptosis induction rate (%).
  • PAAD pancreatic cancer
  • CHOL cholangiocarcinoma
  • ⁇ Measurement of ZIC5 expression level by qRT-PCR The amount of ZIC5 gene mRNA in each cultured cell line was measured by qRT-PCR. The amount of mRNA of the GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene was used as an internal standard. Measurements were made in two independent trials. First, total RNA was collected from each cell, and reverse transcription reaction was performed using this as a template to synthesize cDNA.
  • RNA Cell Miniprep System A commercially available kit "ReliaPrep RNA Cell Miniprep System” (manufactured by Promega) was used to collect total RNA, and a commercially available kit “High Capacity cDNA Reverse Transcription kit” (manufactured by Applied Biosystems) was used for the reverse transcription reaction. Each was carried out according to the protocol attached to the product. Next, real-time PCR was performed using the resulting cDNA and human normal tissue-derived cDNA as templates. Real-time PCR was performed using a commercially available kit "THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix” (manufactured by Toyobo) and a thermal cycler "CFX96" (manufactured by Bio-Rad). Table 1 shows the primers used.
  • n.d means not detected.
  • expression was detected only in brain, and detected in other tissues (bone marrow, liver, lymph node, leukocyte, spleen, thymus, tonsil, heart, placenta, lung, smooth muscle, kidney, pancreas). it wasn't.
  • ZIC5 gene expression was detected in pancreatic cancer cell lines (AsPC-1 strain, Panc-1 strain, MiaPaca-2 strain) and cholangiocarcinoma cell strain (RBE strain). These results indicated that the ZIC5 gene was very low expressed in many normal human tissues.
  • Example 1 We examined whether the ZIC5 protein affects survival in pancreatic cancer and bile duct cancer. Specifically, three types of pancreatic cancer cell lines (AsPC-1 strain, Panc-1 strain, MiaPaca-2 strain) and one type of cholangiocarcinoma cell line (RBE strain) were treated with endogenous DNA by RNA interference. The expression of the ZIC5 gene was suppressed, and the percentage of apoptotic cells was examined.
  • each cell was transfected with two types of control siRNA (siNeg#1, siNeg#2) listed in Table 2 and two types of siRNA (siZIC5#1, siZIC5#2) targeting the mRNA of the ZIC5 gene. and cultured for 72 hours, the ratio of apoptotic cells (apoptosis induction rate) (%) was examined. Apoptosis induction rate was detected using CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent (manufactured by Invitrogen). The results are shown in FIG.
  • pancreatic cancer and bile duct cancer unlike melanoma, cell proliferation is controlled not only by PDGFD-mediated signal transduction, but also mainly by PDGF-BB-mediated signal transduction. Nevertheless, as shown in FIG. 4, apoptosis was induced in pancreatic cancer cells and bile duct cancer cells in which the expression of the ZIC5 gene was suppressed. 17% of pancreatic cancer cell AsPC-1 strain, 30% of PANC-1 strain, 23% of Mia Paca-2 strain, and 29% of cholangiocarcinoma RBE strain caused cell death. rice field. These results indicate that suppression of ZIC5 gene expression induces apoptosis and suppresses cell proliferation in pancreatic cancer cells and cholangiocarcinoma cells.
  • siNeg and siZIC5 listed in Table 2 were introduced into each cell by transfection and cultured for 24 hours.
  • Gemcitabine a standard therapeutic drug for pancreatic cancer and cholangiocarcinoma, was added and cultured for an additional 48 hours. After that, the apoptosis induction rate (%) was examined. The results are shown in FIG. As a result, apoptosis was induced by treatment with gemcitabine (0.1 ⁇ M), and the rate of apoptosis induction was further increased in cells in which ZIC5 gene expression was suppressed. These results suggest that the ZIC5 protein promotes survival and drug resistance (primary resistance) in pancreatic cancer and bile duct cancer.
  • siNeg and siZIC5 were introduced by transfection, cultured for 24 hours, gemcitabine (0.1 ⁇ M) was added, cultured for an additional 14 days, and viable cells were stained with Giemsa. detected by A stained image is shown in FIG. As shown in FIG. 5, in the PANC-1 strain and the RBE strain, viable cells were not detected in the siZIC5-introduced cells even when gemcitabine was not treated, and the cells died only by suppressing the expression of the ZIC5 gene. I understand. In the AsPC-1 strain and the MIA-PaCa-2 strain, among the siZIC5-introduced cells, viable cells were detected in cells that were not treated with gemcitabine.
  • Example 2 Verify whether the apoptosis-inducing and growth-suppressing effects of pancreatic cancer and cholangiocarcinoma by reducing the amount of intracellular ZIC5 protein can be obtained even when inflammation occurs in cancer cells and inflammatory cytokines act on cancer cells. bottom.
  • pancreatic cancer-derived PANC-1 strain and cholangiocarcinoma-derived RBE strain were transfected with siNeg#1 or siZIC5#1, and two days later IL-6 (20 ng/mL) and gemcitabine (0. 1 ⁇ M) was added, the culture was continued, and the number of cells was quantified 6 days after transfection.
  • Fig. 6 shows the relative number of cells under each culture condition.
  • the left panel in FIG. 6 shows the results for the PANC-1 strain, and the right panel shows the results for the RBE strain.
  • inhibition of ZIC5 gene expression suppressed cell proliferation.
  • a decrease in cell number upon gemcitabine treatment was similarly induced.
  • siNeg#1 or siZIC5#1 was transfected, and two days later, 1% FBS-containing medium, 1% FBS and IL-22 (20 ng / mL)-containing medium, or 1% The medium was replaced with a medium containing FBS and IL-6 (20 ng/mL), and cultured for an additional 24 hours.
  • Cells were harvested after culture and Western blotting was performed to detect phosphorylated STAT3 (pSTAT3: Tyr705), total STAT3 (STAT3), and GAPDH (loading control).
  • Western blotting was performed using anti-pSTAT3 antibody (manufactured by Cell Signaling), STAT3 antibody (manufactured by BD Biosciences), and anti-GAPDH antibody (manufactured by Cell Signaling).
  • Fig. 7 shows the stained image of Western blot. As shown in FIG. 7, in the presence of IL-6, suppression of ZIC5 gene expression did not suppress STAT3 phosphorylation. From these results, it was considered that reduction of ZIC5 protein also contributes to suppression of proliferation in pancreatic cancer and bile duct cancer cells through a pathway not mediated by STAT3.
  • pancreatic cancer-derived PANC-1 strain pancreatic cancer-derived MiaPaca-2 strain
  • bile duct cancer-derived RBE strain were transfected with siNeg#1 or siZIC5#1 and cultured for 3 days.
  • Cells were harvested after culture and Western blots were performed to detect pre-processing PDGFD (pro-PDGFD) and GAPDH.
  • Western blotting was performed using an anti-PDGFD antibody (manufactured by Santa Cruz) and an anti-GAPDH antibody (manufactured by Cell Signaling).
  • Fig. 8 shows the stained image of Western blot. As shown in FIG. 8, in both cell lines, there was no difference in the expression level of pro-PDGFD between cells introduced with siZIC5#1 and cells introduced with siNeg#1. did not affect the expression of
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • pancreatic cancer cells and cholangiocarcinoma cells suppression of ZIC5 gene expression suppressed cell proliferation, but did not affect the expression level of PDGFD. It was revealed that the role of the ZIC5 protein is based on a molecular mechanism different from melanoma and the like.
  • Example 3 In order to identify compounds that reduce the amount of ZIC5 protein in cells, the Validated Compound Library (approximately 3500 compounds) were screened.
  • melanoma-derived A375 cells overexpressing the GFP-fused ZIC5 protein were used. After adding a candidate compound to the cells and culturing for 1 day, the amount of GFP fluorescence in each cell was quantified using an imaging cytometer "In Cell Analyzer 2000" (manufactured by Cytiva). - Quantitation of ZIC5 amount was performed. Candidate compounds whose GFP fluorescence intensity was less than the mean value of GFP fluorescence intensity in control cells -3 SD in two assays were selected as primary hit compounds.
  • A375 cells overexpressing the ZIC5 protein (no fusion protein) were cultured by adding the primary hit compound to a final concentration of 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, or 10 ⁇ M. and fixed the cells the next day.
  • the fixed cells were stained with an anti-ZIC5 antibody (clone: GTX104840) and an AlexaFluor568-anti-rabbit IgG antibody as a secondary antibody, and the amount of ZIC5 protein was quantified using the imaging cytometer.
  • the 12 primary hit compounds (compounds (T-1) to (T-12)) whose average fluorescence intensity in two assays was smaller than the average value -SD of compound-untreated cells were treated with ZIC5 degradation-promoting compounds. was selected as
  • Table 3 shows the relative ZIC5 protein amount when the ZIC5 protein amount of control cells (compound-untreated cells) is set to 100.
  • ND indicates samples that could not be measured due to cell death.
  • the mean-SD figure is 78.6.
  • compound (T-1) and compound (T-2) were investigated by Western blotting. Specifically, compound (T-1) or compound (T-2) was added to A375 cells (nothing was overexpressed) at 0, 0.1, 0.5, or 1 ⁇ M and cultured for 48 hours. The cultured cells were collected and Western blotting was performed using an anti-ZIC5 antibody and an anti-GAPDH antibody. The amount of each protein was quantified from the density of the bands in the Western blot image. The relative amount of ZIC5 protein ([ZIC5 protein amount]/[GAPDH protein amount]) is shown in FIG. 9 together with Western blot images. As shown in FIG. 9, the amount of ZIC5 protein in cells is reduced in a concentration-dependent manner of compound (T-1) and compound (T-2), and these compounds reduce the amount of ZIC5 protein in cells. It was confirmed that there is an effect of
  • Example 4 Two human melanoma-derived vemurafenib-resistant strains (A375vemR strain, HT144vemR strain), two high ZIC5-expressing melanoma cell strains (A375 strain, HT144 strain), two low ZIC5-expressing melanoma cell strains (Colo829 strain, SKmel28 strain) , ZIC5 non-expressing normal human melanocyte cells (NHM), a total of 7 cells were treated with compound (T-1) or compound (T-2) and cultured for 48 hours. Apoptosis induction rate (%) was determined in the same manner as above.
  • FIG. 10 shows the measurement results.
  • the upper part of FIG. 10 shows the results of cells treated with compound (T-1), and the lower part shows the results of cells treated with compound (T-2).
  • Compound (T-1) induced apoptosis in human melanoma-derived vemurafenib-resistant strains and ZIC5 high-expressing melanoma cell lines at a concentration of 1.2 ⁇ M, but in ZIC5 low-expressing melanoma cell lines and ZIC5 non-expressing normal human melanocyte cells. did not induce apoptosis.
  • the compound (T-2) induces apoptosis in one of human melanoma-derived vemurafenib-resistant strains, ZIC5 high-expressing melanoma cell lines, and ZIC5 low-expressing melanoma cell lines (Colo829 strain) at a concentration of 1.2 ⁇ M.
  • pancreatic cancer cell line (Panc-1 strain) and the cholangiocarcinoma cell line (RBE strain) were similarly treated with compound (T-1) or compound (T-2) and cultured for 48 hours.
  • the apoptosis induction rate (%) was determined in the same manner as in Example 1 for the cells after treatment.
  • the measurement results are shown in FIG. Among the data of each cell line, the right figure shows the results of cells treated with compound (T-1), and the left figure shows the results of cells treated with compound (T-2).
  • both compound (T-1) and compound (T-2) induced apoptosis in a pancreatic cancer cell line (Panc-1 line) and a cholangiocarcinoma cell line (RBE line).
  • the apoptosis induction rate of compound (T-2) was about 8-10%, while compound (T-1) induced apoptosis at a rate of 20-40%.
  • Example 5 It was verified whether a ZIC5 protein-reducing substance would change sensitivity to a BRAF inhibitor (PLX4032, vemurafenib) (manufactured by Selleckchem).
  • A375 cells were added with 0.5 ⁇ M compound (T-1) or 50 nM compound (T-2), cultured for 48 hours, and then vemurafenib was added to 0.1 ⁇ M. , and cultured for an additional 72 hours. After culturing, cell nuclei were stained with Hoechst and the number of cells was counted. Assuming that the number of A375 cells cultured without adding any compound was 1, the relative cell number of each cell was determined. The results are shown in FIG. The left panel of FIG. 12 shows the results of cells treated with compound (T-1), and the right panel shows the results of cells treated with compound (T-2). As a result, it was confirmed that compound (T-1) or compound (T-2) and vemurafenib synergistically decreased the number of cells, that is, synergistically suppressed cell proliferation.
  • Example 6 It was verified whether the apoptosis-inducing effect of compound (T-1) and compound (T-2) was caused by reducing the amount of ZIC5 protein.
  • a ZIC5 expression plasmid (Z5) or an empty vector (C) was introduced into A375 melanoma cells by transfection, and cells into which each plasmid was introduced were selected. Then, 0.1 ⁇ M or 0.5 ⁇ M compound (T-1) or 10 nM compound (T-2) was added to these cells and cultured for 4 days. After culturing, cell nuclei were stained with Hoechst and the number of cells was counted with an imaging cytometer "In Cell Analyzer 2000". Assuming that the cell number of cells into which an empty vector was introduced and which was not treated with a compound was 1, the relative cell number of each cell was determined. The results are shown in FIG. 13 together with a Western blot staining image.
  • the left panel of FIG. 13 shows the results of cells treated with compound (T-1), and the right panel shows the results of cells treated with compound (T-2).
  • “C” is the cell into which the empty vector was introduced
  • "Z5" is the cell into which the ZIC5 expression plasmid was introduced.
  • shRNA that suppresses ZIC5 was introduced into pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector (manufactured by Clontech) shZIC5 / pSIREN-GFP, and negative control shRNA (shNeg) was introduced into pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector shNeg /pSIREN-GFP was transfected into PlatA cells for retrovirus production to produce retrovirus.
  • Pancreatic cancer cells (MiaPaca-2 strain) were infected with the collected retrovirus to introduce ZIC5/pSIREN-GFP or shNeg/pSIREN-GFP into the pancreatic cancer cells.
  • retrovirus-infected pancreatic cancer cells were seeded in a 96-well plate and cultured for 3 days. ]/[number of GFP-positive cells on day 0 of culture]) was calculated.
  • Fig. 14 shows the measurement results of the proliferation rate of pancreatic cancer cells on day 3 of culture after virus infection.
  • Pancreatic cancer cells into which shZIC5/pSIREN-GFP, which suppresses ZIC5 were introduced also showed a lower proliferation rate than pancreatic cancer cells into which shNeg was introduced.
  • Example 8 Using mice implanted with cancer cells capable of inducing suppression of ZIC5 expression by the tet-on system, it was investigated whether suppression of ZIC5 would have a tumor regression effect in tumors engrafted in vivo.
  • tet-shZIC5 or tet-shNeg is introduced into human pancreatic cancer cells (MiaPaca-2 strain) by virus infection, and pancreatic cancer cells (tet-shZIC5-MiaPaca- 2) and pancreatic cancer cells (tet-shNeg-MiaPaca-2) capable of inducing shNeg expression by the tet-on system.
  • Fig. 15 shows the measurement results of the amount of ZIC5 gene mRNA in each cell.
  • dox treatment for 48 hours reduced the amount of ZIC5 gene mRNA to about 10% of that in control tet-shNeg-MiaPaca-2 cells.
  • dox was added to the drinking water of all mice until the end of the experiment (37th day after transplantation), and dox treatment was performed. gone.
  • gemcitabine 100 mg/kg body weight
  • Fig. 16 shows the results of measuring the tumor volume over time from the 23rd day to the 37th day after transplantation.
  • tumors implanted with tet-shZIC5-MiaPaca-2 cells showed a reduction in tumor volume after administration of gemcitabine compared to tumors implanted with control tet-shNeg-MiaPaca-2 cells.
  • rice field From these results, it was considered that suppression of ZIC5 enhanced sensitivity to gemcitabine in human pancreatic cancer cells engrafted in vivo in mice, resulting in a synergistic effect.

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Abstract

本発明は、膵臓がん及び胆管がんにおいて、細胞増殖を抑制し、抗がん効果を有する医薬用組成物を提供する。本発明は、ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質を有効成分とし、膵臓がん又は胆管がんの治療に用いられる、医薬用組成物、ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質以外の抗がん剤を含有する、前記の医薬用組成物、及び、前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質以外の抗がん剤を含有する、前記いずれかの医薬用組成物に係る。

Description

膵臓がん及び胆管がんの治療のための医薬用組成物
　本発明は、膵臓がん及び胆管がんにおいて、細胞増殖を抑制し、抗がん効果を有する医薬用組成物に関する。
　本願は、２０２１年７月３０日に、日本に出願された特願２０２１－１２６１５４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　血小板成長因子（ＰＤＧＦ）は、様々ながんの発症に関与している強力なマイトジェンであり、５種類のジスルフイドダイマー（ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ、ＰＤＧＦ－ＤＤ）からなるファミリーを構成している。例えば、メラノーマ、前立腺がん、大腸がんにおいては、主にＰＤＧＦＤ（ＰＤＧＦ－ＤＤ）を介したシグナル伝達によって細胞の増殖が制御されている。
　例えば、メラノーマ、前立腺がん、大腸がんにおいては、ＺＩＣ５（ZIC family member 5 (odd-paired homolog, Drosophila)）タンパク質がＰＤＧＦＤの発現を促進し、これがＦＡＫ（Focal Adhesion Kinase）やＳＴＡＴ３（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）の活性化を引き起こし、メラノーマ細胞の薬剤抵抗性を亢進させていること、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制すると、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現が抑制され、メラノーマ細胞の細胞増殖が抑制されること、ＺＩＣ５は、薬剤耐性の亢進にも寄与していることが、明らかとなっている（非特許文献１、非特許文献２）。さらに、メラノーマにおいて、ＺＩＣ５タンパク質が、Ｅ－カドヘリンの転写因子として機能しており、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制することにより、Ｅ－カドヘリンの発現量低下が抑制され、悪性化や転移性能獲得を抑制できることも報告されている（特許文献１）。なお、ＴＣＧＡ（The Cancer Genome Atlas）のデータベース（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）によれば、ヒトでは、ＺＩＣ５は、正常組織では脳と精巣以外ではほとんど発現が検出されないが、様々ながん組織において高発現しており、膵臓がんと胆管がんでも高発現している。
　これに対して、膵臓がん及び胆管がんでは、ＰＤＧＦ－ＢＢが関与していることが知られている。例えば、膵臓がん細胞は、ＰＤＧＦ－ＢＢ処理により、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路を介して、細胞増殖が有意に促進され、浸潤性も増強されることが明らかとなっている（非特許文献３）。また、胆管がん細胞では、ＰＤＧＦ－ＢＢ処理により、ヘッジホッグ（Ｈｈ）生存シグナルが促進される結果、ＴＲＡＩＬ（Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Induced Ligand）誘導アポトーシスから保護されることが明らかとなっている（非特許文献４）。
　膵臓がんと胆管がんは、いずれも腹部の深い位置に存在しているため、早期発見が難しい。いわゆる難治性がんであり、日本における５年生存率は、膵臓がんで１０％程度、胆管がんでも２０％程度と低い。これらのがんでは、診断時には既に転移があるために外科的治癒が困難な場合が多く、現在では化学療法が主に選択されている。化学療法では、膵臓癌では、ゲムシタビン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ナブパクリタキセルなどの抗がん剤が使用されているが、化学療法への耐性を持ちやすいことが、治療における問題点となっている（非特許文献５）。また、胆管がん治療では、化学療法としてゲムシタビンとシスプラチンなどが併用されているが、こちらも化学療法への感受性が低い。どちらのがんにおいても、高い奏効性を示す分子標的薬は、未だ実用化されていない。
　膵臓がん及び胆管がんは、膵炎や胆管炎などの炎症を伴うことが多く、炎症性サイトカインであるインターロイキン－６（ＩＬ－６）やインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）がこれらの癌の進行を促進することが示唆されている（非特許文献６～９）。ＩＬ－６やＩＬ－２２は、がん細胞内でＳＴＡＴ３（Signal transducer and activator of transcription 3）を活性化する。膵臓がんにおいてＩＬ－２２によってＳＴＡＴ３シグナルが活性化し、幹細胞性遺伝子や ＥＭＴ(上皮間葉転換) 関連転写因子の発現増加を引き起こし、幹細胞性、腫瘍形成能が亢進することが示されている（非特許文献６）。また、ＳＴＡＴ３の発現は、肝内胆管がんの転移を促進し、予後不良と相関を示す。in vitroとin vivoの両方で、 ＳＴＡＴ３の過剰発現により、肝内胆管がんの浸潤、転移、増殖、ＳＴＡＴ３のリン酸化を促進することが明らかになっている（非特許文献９）。
国際公開第２０１６／１７８３７４号
Satow et al., Cancer Research, 2017, vol.77(2), p.366-377. Satow et al., Cancer Science, 2017, vol.108, p.2405-2412, doi: 10.1111/cas.13419. Li et al., Oncology Reports, 2021, vol.45, p.83-94. Fingas et al., Hepatology, 2011, vol.54(6), p.2076-2088. Kato, Diagnostics (Basel), 2021, vol.11, p.252 He et al,, Cancer Research, 2018, vol.78(12), p.3293-3305, doi: 10.1158/0008-5472.CAN-17-3131. Fukuda et al., Cancer Cell, 2011, vol.19, p.441-455. Isomoto et al., Gastroenterology, 2007, vol.132, p.384-396. Yang et al., Oncotarget, 2017, vol.8(5), p.7710-7721.
　本発明は、膵臓がん及び胆管がんにおいて、細胞増殖を抑制し、抗がん効果を有する医薬用組成物を提供することを主たる目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究した結果、膵臓がんと胆管がんにおいて、ＺＩＣ５タンパク質の細胞内存在量を抑制することにより、細胞増殖が抑制されて抗がん効果が奏されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明に係る医薬用組成物、及びＺＩＣ５タンパク質低減剤は、下記の通りである。
［１］　ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質を有効成分とし、膵臓がん又は胆管がんの治療に用いられる、医薬用組成物。
［２］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制させる物質である、前記［１］の医薬用組成物。
［３］　前記ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制させる物質が、ＲＮＡ干渉により、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制させる核酸分子である、前記［２］の医薬用組成物。
［４］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［式中、Ｒ１～Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［５］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、Ｒ１～Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［６］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［式中、Ｒ１～Ｒ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［７］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［式中、Ｒ１～Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［８］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［９］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、Ｒ１～Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［１０］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、Ｒ１～Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［１１］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、Ｒ１～Ｒ１２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［１２］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
［式中、Ｒ１～Ｒ１２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、前記［１］の医薬用組成物。
［１３］　前記膵臓がん又は胆管がんが、ＺＩＣ５タンパク質が発現しているがんである、前記［１］～［１２］のいずれかの医薬用組成物。
［１４］　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質以外の抗がん剤を含有する、前記［１］～［１３］のいずれかの医薬用組成物。
［１５］　前記抗がん剤が、ＢＲＡＦ阻害剤及びＤＮＡ合成阻害剤からなる群より選択される１種以上である、前記［１４］の医薬用組成物。
［１６］前記一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物を有効成分とする、ＺＩＣ５タンパク質低減剤。
　本発明に係る医薬用組成物及びＺＩＣ５タンパク質低減剤は、膵臓がん細胞及び胆管がん細胞における細胞増殖を抑制し、抗がん効果を有する。このため、当該医薬用組成物等は、膵臓がん及び胆管がん治療に非常に有効な新規薬剤である。
参考例１において、膵臓がん（ＰＡＡＤ）及び胆管がん（ＣＨＯＬ）の臨床検体において、がん部と非がん部（not tumor）におけるＺＩＣ５ ｍＲＮＡ発現量を解析した結果を示した図である。 参考例１において、膵臓がん症例及び胆管がん症例について、ＺＩＣ５遺伝子の発現の有無により分類し、生存分析を行った結果を示した図である。 参考例２において、ヒト正常組織、膵臓がん細胞株、及び胆管がん細胞株におけるＺＩＣ５ ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示した図である。 実施例１において、膵臓がん細胞株及び胆管がん細胞株において、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制した場合のアポトーシス誘導に対する影響を調べた結果を示した図である。 実施例１において、膵臓がん細胞株及び胆管がん細胞株において、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制した後、ゲムシタビン（ｇｅｍ）を添加して１４日間培養した細胞に対して、ギムザ染色した染色画像を示した図である。 実施例２において、ＰＡＮＣ－１株（左）とＲＢＥ株（右）に対して、ｓｉＮｅｇ♯１又はｓｉＺＩＣ５♯１をトランスフェクションし、２日後にＩＬ－６及びゲムシタビンを添加して培養した細胞の相対細胞数を測定した結果を示した図である。 実施例２において、ｓｉＮｅｇ♯１又はｓｉＺＩＣ５♯１をトランスフェクションし、ＩＬ－２２又はＩＬ－６の存在下で培養したＰＡＮＣ－１株及びＲＢＥ株の細胞のウェスタンブロット像である。 実施例２において、ｓｉＮｅｇ♯１又はｓｉＺＩＣ５♯１をトランスフェクションしたＰＡＮＣ－１株、ＭｉａＰａｃａ－２株、及びＲＢＥ株の細胞のウェスタンブロット像である。 実施例３において、化合物（Ｔ－１）（左）及び化合物（Ｔ－２）（右）で処理したＡ３７５細胞中のＺＩＣ５タンパク質及びＧＡＰＤＨタンパク質をウェスタンブロットで定量し、ＺＩＣ５タンパク質の相対量（［ＺＩＣ５タンパク質量］／［ＧＡＰＤＨタンパク質量］）を測定した結果を示した図である。 実施例４において、化合物（Ｔ－１）（上段）及び化合物（Ｔ－２）（下段）で処理した各細胞のアポトーシス誘導率（％）を測定した結果を示した図である。 実施例４において、化合物（Ｔ－１）及び化合物（Ｔ－２）で処理した各細胞のアポトーシス誘導率（％）を測定した結果を示した図である。 実施例５において、化合物（Ｔ－１）（左）及び化合物（Ｔ－２）（右）で処理した後、ＢＲＡＦ阻害剤（Ｖｅｍ）で処理した細胞の相対細胞数を測定した結果を示した図である。 実施例６において、ＺＩＣ５発現プラスミド（Ｚ５）をトランスフェクションしてＺＩＣ５タンパク質を過剰発現させた細胞と、空ベクター（Ｃ）をトランスフェクションした細胞に対して、化合物（Ｔ－１）（左）及び化合物（Ｔ－２）（右）で処理した細胞の相対細胞数を測定した結果を示した図である。 実施例７において、ｓｈＺＩＣ５／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰ又はｓｈＮｅｇ／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰをウィルス導入した膵臓癌細胞を３日間培養した時の増殖率を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５が導入されたＭｉａＰａｃａ－２細胞とｔｅｔ－ｓｈＮｅｇが導入されたＭｉａＰａｃａ－２細胞を、ｄｏｘで４８時間処理した後の、各細胞のＺＩＣ５ ｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５が導入されたＭｉａＰａｃａ－２細胞又はｔｅｔ－ｓｈＮｅｇが導入されたＭｉａＰａｃａ－２細胞を移植した免疫不全マウスの腫瘍の体積を経時的に測定した結果を示した図である。
　本発明に係る医薬用組成物は、ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質（以下、「ＺＩＣ５タンパク質低減物質」ということがある）を有効成分とし、膵臓がん又は胆管がんの治療に用いられることを特徴とする。ＺＩＣ５タンパク質は、Ｚｉｃファミリーに属するタンパク質であって、Ｃ２Ｈ２型ジンクフィンガーモチーフを５つ持つ。膵臓がん細胞及び胆管がん細胞では、ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量が低減すると、細胞増殖が抑制され、抗がん効果が得られる。
　膵臓がん細胞及び胆管がん細胞におけるＺＩＣ５タンパク質の細胞増殖抑制に至る作用機序は明らかではないが、ＺＩＣ５タンパク質は、膵臓がん細胞及び胆管がん細胞における増殖シグナルに寄与するタンパク質の転写因子として機能している可能性がある。なお、メラノーマ、大腸がん、及び前立腺がんでは、ＺＩＣ５はＰＤＧＦＤを介した増殖シグナルに関与しており、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制すると、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現が抑制され、メラノーマ細胞の細胞増殖が抑制される。これに対して、膵臓がん及び胆管がんでは、ＰＤＧＦＤを介したシグナル伝達だけではなく、主にＰＤＧＦ－ＢＢを介したシグナル伝達も、増殖や生存に関与している。
　ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量の低減は、例えば、ＺＩＣ５遺伝子の発現を阻害することによって達成できる。すなわち、本発明に係る医薬用組成物の有効成分であるＺＩＣ５タンパク質低減物質としては、ＲＮＡ干渉等により、ＺＩＣ５遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質が挙げられる。当該物質としては、例えば、ＺＩＣ５遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ）等の直接的にＺＩＣ５遺伝子の発現を阻害する核酸が挙げられる。また、標的である腫瘍細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターであってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とするＺＩＣ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。
　本発明において用いられるＺＩＣ５タンパク質低減物質としては、ＺＩＣ５タンパク質を分解する物質であってもよい。ＺＩＣ５タンパク質自体が分解されることにより、その機能は阻害される。ＺＩＣ５タンパク質を分解する物質としては、ＺＩＣ５タンパク質を直接分解する分解酵素であってもよく、タンパク質分解酵素の基質になるようにポリユビキチン等の各種標識を行う物質であってもよい。当該物質としては、タンパク質やペプチドであってもよく、核酸であってもよく、低分子化合物であってもよい。
　ＺＩＣ５タンパク質低減物質は、例えば、化合物ライブラリーからスクリーニングすることにより得ることができる。当該化合物ライブラリーとしては、核酸ライブラリーであってもよく、ペプチドライブラリーであってもよく、低分子化合物ライブラリーであってもよい。ＺＩＣ５タンパク質を過剰発現させた細胞を、ライブラリーを構成する各化合物でそれぞれ処理し、細胞内のＺＩＣ５タンパク質量が低減した化合物を、ＺＩＣ５タンパク質低減物質の候補化合物として選抜することができる。
　低分子化合物であるＺＩＣ５タンパク質低減物質としては、具体的には、下記一般式（１）～（９）で表される化合物が挙げられる。以下、これらの化合物は、「ＺＩＣ５タンパク質低減剤」ということがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　一般式（１）～（９）中、Ｒ１～Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である。
　当該ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子が挙げられる。本発明においては、Ｒ１～Ｒ１８のハロゲン原子としては、塩素原子が好ましい。
　当該炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状構造を有する基であってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状の基であることが好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ヘキシル基、シクロへキシル基等が挙げられる。本発明においては、Ｒ１～Ｒ１８のアルキル基としては、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましく、直鎖状の炭素原子数１～３のアルキル基がより好ましい。
　当該炭素数２～６のアルケニル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状構造を有する基であってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状の基であることが好ましい。具体的には、エテニル基（ビニル基）、１－プロペニル基、２－プロペニル基（アリル基）、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等が挙げられる。本発明においては、Ｒ１～Ｒ１８のアルケニル基としては、炭素原子数２～４のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２～３のアルケニル基がより好ましい。
　当該ヒドロキシアルキル基としては、炭素数１～６のアルキル基の炭素原子に結合している水素原子の少なくとも１個がヒドロキシ基に置換された基が好ましく、炭素数１～６のアルキル基の炭素原子に結合している水素原子のうちの１個がヒドロキシ基に置換された基がより好ましく、炭素数１～３のアルキル基の炭素原子に結合している水素原子のうちの１個がヒドロキシ基に置換された基がさらに好ましい。具体的には、ヒドロキシメチル基、１－ヒドロキシエチル基、２－ヒドロキシエチル基、１－ヒドロキシプロピル基、２－ヒドロキシプロピル基、３－ヒドロキシプロピル基、１－ヒドロキシブチル基、２－ヒドロキシブチル基、３－ヒドロキシブチル基、４－ヒドロキシブチル基等が挙げられる。
　当該アルコキシ基としては、アルキル基部分が炭素数１～６のアルキル基である基が好ましくアルキル基部分が炭素数１～３のアルキル基である基がより好ましく、アルキル基部分が炭素数１～３の直鎖状アルキル基である基がさらに好ましい。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　当該アシルオキシ基としては、炭素数２～７のアシルオキシ基が好ましく、炭素数２～４のアシルオキシ基がより好ましい。具体的には、アセチルオキシ基、プロパノイルオキシ基、ｎ－ブタノイルオキシ基、２－メチルプロパノイルオキシ基、ｎ－ペンタノイルオキシ基、２，２－ジメチルプロパノイルオキシ基、ｎ－ヘキサノイルオキシ基等が挙げられる。
　当該置換基を有しているテトラヒドロピラニルオキシ基としては、テトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち１～４個が、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基で置換された基が挙げられる。これらの置換基としては、前記で挙げられたものと同様の基を用いることができる。２個以上の水素原子が置換されている場合、各置換基は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよい。本発明においては、テトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち１～４個が、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のヒドロキシアルキル基、又は置換基を有しているテトラヒドロピラニルオキシ基で置換されている基が好ましく、テトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち１～４個が、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシイソプロピル基、又は、テトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち１～４個がヒドロキシ基、メチル基若しくはヒドロキシメチル基で置換されている基で置換されている基がより好ましい。なかでも、テトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち、３個がヒドロキシ基で、１個がメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシイソプロピル基で置換されている基、又は、テトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち、２個がヒドロキシ基で、１個がメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシイソプロピル基で、１個がテトラヒドロピラニルオキシ基の炭素原子に結合している水素原子のうち１～４個がヒドロキシ基、メチル基若しくはヒドロキシメチル基で置換されている基で置換されている基が好ましい。
　一般式（１）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ２がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、又は炭素数１～３のアルキル基である化合物が好ましく、Ｒ１がヒドロキシ基であり、Ｒ２が水素原子若しくは炭素数１～３のアルキル基である化合物、又は、Ｒ１が水素原子若しくは炭素数１～３のアルキル基であり、Ｒ２がヒドロキシ基である化合物がより好ましい。
　一般式（２）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ１３がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、又は炭素数１～３のアルコキシ基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ１３のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ４がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、又は炭素数１～３のアルコキシ基、Ｒ５～Ｒ１３がそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である化合物がより好ましく、Ｒ１～Ｒ３がそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～３のアルコキシ基であり、Ｒ４、Ｒ９及びＲ１０がヒドロキシ基であり、Ｒ５～Ｒ８、Ｒ１１～Ｒ１３がそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（３）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ７がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、又は炭素数１～３のアルキル基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ７がそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である化合物がより好ましい。
　一般式（４）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ１８のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ１８がそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、又は炭素数２～３のアルケニル基である化合物が好ましく、Ｒ２及びＲ９がヒドロキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３～Ｒ８、Ｒ１０～Ｒ１８がそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルキル基、又は炭素数２～３のアルケニル基である化合物がより好ましい。
　一般式（５）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ３のうち少なくとも１個はヒドロキシ基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ３のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ３がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、又は炭素数１～３のアルキル基である化合物がより好ましく、Ｒ１及びＲ３がヒドロキシ基であり、Ｒ２が水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（６）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ１４のうち少なくとも１個はヒドロキシ基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ１４のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ１４がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、炭素数１～４のアシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である化合物がより好ましく、Ｒ３及びＲ６がヒドロキシ基であり、Ｒ８が置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４～Ｒ７、Ｒ９～Ｒ１４がそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、若しくは炭素数１～４のアシルオキシ基である化合物、又は、Ｒ３及びＲ８がヒドロキシ基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４～Ｒ７、Ｒ９～Ｒ１４がそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、若しくは炭素数１～４のアシルオキシ基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（７）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ１４のうち少なくとも１個はヒドロキシ基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ１４のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ１４がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、炭素数１～４のアシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である化合物がより好ましく、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ１０、及びＲ１２がヒドロキシ基であり、Ｒ８が置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４がそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、若しくは炭素数１～４のアシルオキシ基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（８）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ１２のうち少なくとも１個はヒドロキシ基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ１２のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ１２がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、炭素数１～４のアシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である化合物がより好ましく、Ｒ３がヒドロキシ基であり、Ｒ６が置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７～Ｒ１２がそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、又は炭素数１～４のアシルオキシ基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（９）で表される化合物としては、Ｒ１～Ｒ１２のうち少なくとも１個はヒドロキシ基である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ１２のうち少なくとも１個はヒドロキシ基であり、かつＲ１～Ｒ１２がそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、炭素数１～４のアシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である化合物がより好ましく、Ｒ６がヒドロキシ基であり、Ｒ４がヒドロキシ基又は水素原子であり、Ｒ１～Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７～Ｒ１２がそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、又は炭素数１～４のアシルオキシ基である化合物がさらに好ましい。
　本発明において用いられるＺＩＣ５タンパク質低減物質としては、一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物は、塩を形成してもよい。当該塩を形成する酸又は塩基としては、塩酸、硫酸等の鉱酸；酢酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属等が挙げられる。また、一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物は、水和物等の溶媒和物の形態であってもよい。
　本発明において用いられるＺＩＣ５タンパク質低減物質のうち、低分子化合物としては、一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物の誘導体であってもよい。当該誘導体としては、例えば、一般式（１）～（９）中のＲ１～Ｒ１８のいずれかの基が、各種の官能基での修飾、酸化、還元、又は原子の置換がなされた化合物が挙げられる。ＺＩＣ５タンパク質低減物質としては、一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物を、医薬品に対して行われているプロドラック化することによって得られる誘導体がより好ましい。当該誘導体としては、例えば、一般式（１）～（９）中のＲ１～Ｒ１８のうちのヒドロキシ基が、モノホスホルアミダイト基に置換されたモノホスホルアミダイト誘導体、当該ヒドロキシ基がモノホスホロチオエート基に置換されたモノホスホロチオエート誘導体などが挙げられる。また、本発明において用いられるＺＩＣ５タンパク質低減物質としては、一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物の誘導体は、塩を形成していてもよく、水和物等の溶媒和物の形態であってもよい。塩としては、前記で列挙したものを用いることができる。
　ＺＩＣ５タンパク質低減物質に代えて、ＺＩＣ５タンパク質に直接又は間接的に結合することによってＺＩＣ５タンパク質の機能を抑制又は阻害する物質を用いることによっても、膵臓がん細胞及び胆管がん細胞の細胞増殖が抑制され、抗がん効果が得られる。当該物質としては、特に限定されるものではなく、核酸、ペプチド、タンパク質、低分子化合物のいずれであってもよい。
　ＺＩＣ５タンパク質に直接又は間接的に結合することによってＺＩＣ５タンパク質の機能を抑制又は阻害する物質としては、ＺＩＣ５タンパク質に結合してＺＩＣ５タンパク質が転写因子として機能する標的遺伝子のプロモーター配列との相互作用を阻害する核酸を用が挙げられる。ＺＩＣ５タンパク質に結合してＺＩＣ５タンパク質が転写因子として機能する標的遺伝子のプロモーター配列との相互作用を阻害する核酸としては、例えば、標的遺伝子のプロモーター配列中のＺＩＣ５タンパク質との結合領域と同一又は相同性の高い塩基配列を有する核酸分子（いわゆる、デコイ核酸）が挙げられる。デコイ核酸としては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい、また、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよい。生体内での安定性に優れることから、デコイ核酸としては、２本鎖ＤＮＡが好ましい。
　ＺＩＣ５タンパク質に結合してＺＩＣ５タンパク質の細胞内における機能を阻害するタンパク質としては、例えば、抗ＺＩＣ５抗体が挙げられる。当該抗体としては、モノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。また、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の人工的に合成された抗体であってもよい。これらの抗体は、常法により製造することができる。
　ＺＩＣ５タンパク質低減物質に代えて、ＺＩＣ５タンパク質の核内局在を阻害する物質を用いることによっても、膵臓がん細胞及び胆管がん細胞の細胞増殖が抑制され、抗がん効果が得られる。ＺＩＣ５タンパク質の核内局在が阻害されると、ＺＩＣ５タンパク質は転写因子としての機能が阻害される。ＺＩＣ５タンパク質の核内局在を阻害する物質としては、ＺＩＣ５タンパク質の核内への移行を阻害する物質であってもよく、核外への排出を促進する物質であってもよい。核内移行を阻害する物質としては、例えば、ＺＩＣ５タンパク質と、ＺＩＣ５タンパク質の核内移行シグナルを被覆するように結合する物質が挙げられる。当該物質としては、タンパク質やペプチドであってもよく、低分子化合物であってもよい。
　本発明に係る医薬用組成物は、経口投与、静注、鼻腔又は口腔への直接投与、経皮投与等の各種投与形態に適した剤型に、常法により製剤化できる。当該剤型としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、含嗽剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
　本発明に係る医薬用組成物は、有効成分であるＺＩＣ５タンパク質低減物質に加えて、各種添加剤を含有していてもよい。当該添加剤としては、賦形剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等が挙げられる。これらの添加剤としては、薬学上許容される物質であって、医薬の製剤化に使用されているものの中から適宜選択して使用することができる。
　本発明に係る医薬用組成物は、有効成分であるＺＩＣ５タンパク質低減物質に加えて、その他の抗がん剤を含有していてもよい。ＺＩＣ５タンパク質低減物質とは異なる作用機序で抗がん作用が奏される抗がん剤を併用することにより、より高い治療効果が得られやすい。当該他の抗がん剤としては、特に限定されるものではなく、例えば、ＢＲＡＦ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤等が挙げられる。ＢＲＡＦ阻害剤としては、例えば、ベムラフェニブ（Vemurafenib）、ダブラフェニブ（Dabrafenib）、エンコラフェニブ（Encorafenib）等が挙げられる。また、ＤＮＡ合成阻害剤としては、例えば、ゲムシタビン、シタラビン等のピリミジンアナログ；フルダラビン、クラドリビン等のプリンアナログ；メトトレキサート等のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬；５－フルオロウラシル、テガフール、カペシタビン等のチミジル酸シンターゼ阻害薬；６－メルカプトプリン等のＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害薬；ペントスタチン等のアデノシンデアミナーゼ阻害薬；ヒドロキシカルバミド等のリボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ホリナートカルシウム等のメトトレキサート解毒薬等が挙げられる。本発明に係る医薬用組成物が含有する他の抗がん剤は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
　本発明に係る医薬用組成物をヒトやヒト以外の動物に投与し、膵臓がん細胞又は胆管がん細胞内のＺＩＣ５タンパク質の量を低減させることにより、膵臓がん細胞及び胆管がん細胞の増殖を抑制し、抗がん効果を得ることができる。本発明に係る医薬用組成物によって治療されるがんとしては、膵臓がん又は胆管がんであれば特に限定されるものではないが、ＺＩＣ５タンパク質が発現しているがんであることが好ましい。ＺＩＣ５タンパク質が発現している膵臓がん又は胆管がんとしては、原発性がんであってもよく、転移性がんであってもよい。
　ＩＬ－６等の炎症性サイトカインの含有量の多い膵臓がん細胞や胆管がん細胞であっても、細胞内のＺＩＣ５タンパク質量低減による細胞増殖抑制効果が得られる。このため、本発明に係る医薬用組成物を投与して抗がん効果を得る膵臓がん及び胆管がんとしては、炎症を生じているがんであってもよい。
　本発明に係る医薬用組成物を投与される動物としては、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
　細胞内のＺＩＣ５タンパク質量は、ｍＲＮＡレベルで測定してもよく、タンパク質レベルで測定してもよい。細胞内のＺＩＣ５タンパク質量の測定方法としては、細胞中の標的タンパク質量又は標的のｍＲＮＡ量を定量的又は半定量的に測定可能な方法であれば特に限定されるものではなく、検体中のｍＲＮＡやタンパク質の検出に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して用いることができる。各方法は常法により行うことができる。
　ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出してもよく、ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプライマーとポリメラーゼとを用いた核酸増幅反応を利用した方法により検出してもよい。その他、市販されている検出用キット等を利用することもできる。例えば、被検腫瘍細胞から抽出した総ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行い、得られた増幅産物量を測定することによって、ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量を定量できる。増幅産物量は、ゲルやキャピラリー電気泳動等で特異的に分離した後、それを検出することにより定量的に測定することができる。また、ＰＣＲに代えてリアルタイムＰＣＲ等の半定量的ＰＣＲを行うことにより、ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡの検出と同時にその定量を簡便に行うことができる。
　ＺＩＣ５タンパク質量は、ＺＩＣ５タンパク質と特異的に結合する抗体（抗ＺＩＣ５抗体）を用いて測定することができる。例えば、抗ＺＩＣ５抗体を一次抗体とした免疫染色を行い、染色の有無や染色強度に基づいて、被検腫瘍細胞中におけるＺＩＣ５の発現の有無や発現強度を調べる。当該免疫染色は、酵素標識した抗体を用いる酵素抗体染色法であってもよく、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体染色法であってもよい。また、被検腫瘍細胞のＺＩＣ５タンパク質量は、被検腫瘍細胞から調製された細胞抽出液中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等により分離させた後、ウェスタンブロット法等により定量的に測定することができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜細胞培養＞
　以下の実施例等において、使用した細胞の培養は以下の通りにして行った。
　３種類の膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ－１株、Ｐａｎｃ－１株、ＭｉａＰａｃａ－２株）と、１種類の胆管がん細胞株（ＲＢＥ株）は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より分譲されたものを用いた。これらの細胞は、３７℃、５％ＣＯ２存在下、１０％ウシ胎児血清を含有させたＲＰＭＩ １６４０培地（インビトロジェン社製）中で培養した。
＜アポトーシス誘導率の測定＞
　アポトーシス誘導率（％）は、次のようにして測定した。まず、各細胞にCellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent（Invitrogen社製）とヘキスト３３３４２を添加して４０分間インキュベートした。次いで、インキュベート後の細胞の染色状態を、イメージングサイトメーター「IN Cell Analyzer 2000」（ＧＥヘルスケア社製）のＤＡＰＩフィルターとＦＩＴＣフィルターを使用して解析した。ＤＡＰＩ染色された全細胞（ＤＡＰＩポジティブ細胞）に対するCaspase-3/7活性細胞（CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagentポジティブ細胞）の割合（％）は、「IN Cell Analyzer Workstation 3.7」（ＧＥヘルスケア社製）により決定し、これをアポトーシス誘導率（％）とした。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔｅｓｔ（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）により求めた。
［参考例１］
　ＴＣＧＡデータベース上のデータを解析して、膵臓がん及び胆管がんの臨床検体におけるＺＩＣ５ ｍＲＮＡ発現量を解析した。
　まず、ＴＣＧＡデータベースから、膵臓がん（ＰＡＡＤ）及び胆管がん（ＣＨＯＬ）の臨床検体におけるＲＮＡシークエンスデータを取得した。収集したシークエンスデータに対して、解析ソフトＪＭＰを用いて、非がん組織とがん組織におけるＺＩＣ５遺伝子の発現量について解析を行った。具体的には、膵臓がんのがん組織（ｎ＝１７９）とこれらに対応する非がん部（not tumor）（ｎ＝４）のＲＮＡシークエンスデータに対し、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔを行った。結果を図１（左図）に示す。また、胆管がんのがん組織（ｎ＝３６）とこれらに対応する非がん部（not tumor）（ｎ＝９）のＲＮＡシークエンスデータに対し、同様に解析した。結果を図１（右図）に示す。この結果、がん組織では、非がん組織よりも、ＺＩＣ５発現量が明らかに高いことがわかった。
　次いで、ＴＣＧＡデータベースから臨床データを取得し、膵臓がん（ＰＡＡＤ）症例をＺＩＣ５遺伝子の発現の有無で分類し、生存日数と関連するかを検証した。ＺＩＣ５遺伝子が発現しているＰＡＡＤ症例（ｎ＝１３０）とこれらに対応する非がん部症例（not tumor）（ｎ＝４８）について、生存分析解析を行った。結果を図２に示す。この結果、膵臓がんでは、ＺＩＣ５遺伝子の発現により、生存日数が有意に低下することが明らかになった。
［参考例２］
　ＴＨＰＡ（The Human Protein Atlas）データベース（https://www.proteinatlas.org/humanproteome/tissue）において、ＺＩＣ５ ｍＲＮＡは、正常成体ヒト組織では大脳皮質と精巣でのみ検出されており、その他の正常組織では発現が検出されないことが示唆されているが、定量的ＰＣＲにより検証された報告はなかった。そこで、ヒト正常組織由来ｃＤＮＡ（タカラ社製）と、３種類の膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ－１株、Ｐａｎｃ－１株、ＭｉａＰａｃａ－２株）と、１種類の胆管がん細胞株（ＲＢＥ株）におけるＺＩＣ５発現量を、定量的ＰＣＲで検証した。
＜ｑＲＴ－ＰＣＲによるＺＩＣ５発現量の測定＞
　各培養細胞株のＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子のｍＲＮＡ量を内部標準とした。測定は、２回の独立した試行により行った。
　まず、各細胞の総ＲＮＡを回収し、これを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。総ＲＮＡの回収には市販のキット「ReliaPrep RNA Cell Miniprep System」（プロメガ社製）を用い、逆転写反応には市販のキット「High Capacity cDNA Reverse Transcription kit」（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、それぞれ製品添付のプロトコールに従って行った。
　次いで、得られたｃＤＮＡとヒト正常組織由来ｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、市販のキット「THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix」（東洋紡社製）とサーマルサイクラー「CFX96」（バイオ・ラッド社製）を用いて行った。使用したプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　各細胞及びヒト正常組織のＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量によりノーマライズした。ＺＩＣ５遺伝子の相対発現量（［ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量］／［ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量］）の平均値（ｎ＝３）を図３に示す。図中、「ｎ.ｄ.」は、検出されなかったことを意味する。この結果、ヒト正常組織では脳でのみ発現が検出され、その他の組織（骨髄、肝臓、リンパ節、白血球、脾臓、胸腺、扁桃腺、心臓、胎盤、肺、平滑筋、腎臓、膵臓）では検出されなかった。膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ－１株、Ｐａｎｃ－１株、ＭｉａＰａｃａ－２株）及び胆管がん細胞株（ＲＢＥ株）においては、いずれもＺＩＣ５遺伝子の発現が検出された。これらの結果から、ＺＩＣ５遺伝子は多くのヒト正常組織で発現が非常に低いことが示された。
［実施例１］
　膵臓がん及び胆管がんにおいて、ＺＩＣ５タンパク質が生存に影響を与えるかを検証した。具体的には、３種類の膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ－１株、Ｐａｎｃ－１株、ＭｉａＰａｃａ－２株）と、１種類の胆管がん細胞株（ＲＢＥ株）について、ＲＮＡ干渉により内在性のＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制し、アポトーシス細胞の割合を調べた。
　まず、各細胞に、表２に記載の２種類のコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｅｇ＃１、ｓｉＮｅｇ＃２）、ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡを標的とする２種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２）をトランスフェクションにより導入し、７２時間培養した後、アポトーシスを起こした細胞の割合（アポトーシス誘導率）（％）を調べた。アポトーシス誘導率は、CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent（Invitrogen社製）を用いて検出した。結果を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　膵臓がんと胆管がんは、メラノーマ等とは異なり、ＰＤＧＦＤを介したシグナル伝達だけではなく、主にＰＤＧＦ－ＢＢを介したシグナル伝達によっても細胞増殖が制御されている。にもかかわらず、図４に示す通り、ＺＩＣ５遺伝子を発現抑制した膵臓がん細胞及び胆管がん細胞では、アポトーシスが誘導された。膵臓がん細胞であるＡｓＰＣ－１株では１７％、ＰＡＮＣ－１株では３０％、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２株では２３％、胆管がん細胞であるＲＢＥ株では２９％もの細胞が、細胞死を起こした。これらの結果から、ＺＩＣ５遺伝子を発現抑制することにより、膵臓がん細胞と胆管がん細胞では、アポトーシスが誘導され、細胞増殖が抑制されることがわかった。
　次いで、各細胞に、表２に記載のｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５をトランスフェクションにより導入し、２４時間培養した後、膵臓がん及び胆管がんの標準治療薬であるゲムシタビンを添加して、さらに４８時間培養した後、アポトーシス誘導率（％）を調べた。結果を図４に示す。この結果、ゲムシタビン（０．１μＭ）処理によりアポトーシスが誘導されたが、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制した細胞では、さらにアポトーシス誘導率が増加した。これらの結果から、膵臓がん及び胆管がんにおいて、ＺＩＣ５タンパク質は、生存及び薬剤抵抗性（一次耐性）を促進すると考えられた。
　さらに、より長期的な影響を観察するため、ｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５をトランスフェクションにより導入し、２４時間培養した後、ゲムシタビン（０．１μＭ）を添加してさらに１４日間培養した後に、生細胞をギムザ染色により検出した。染色画像を図５に示す。図５に示すように、ＰＡＮＣ－１株とＲＢＥ株においては、ｓｉＺＩＣ５を導入した細胞では、ゲムシタビン処理をしていない場合でも生細胞が検出されず、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制のみで細胞が死滅することがわかった。また、ＡｓＰＣ－１株とＭＩＡ－ＰａＣａ－２株においては、ｓｉＺＩＣ５を導入した細胞のうち、ゲムシタビン処理をしていない細胞では生細胞が検出されたが、ゲムシタビン処理をした場合には生細胞は検出されず、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制とゲムシタビン処理を組み合わせることによって細胞が死滅することが明らかになった。これらの結果は、膵臓がん及び胆管がんにおいて、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制、すなわち細胞内ＺＩＣ５タンパク質量の低減が、がん細胞の生存抑制又は薬剤抵抗性の阻害に有効であることを示している。
［実施例２］
　細胞内ＺＩＣ５タンパク質量の低減による膵臓がん及び胆管がんのアポトーシス誘導及び増殖抑制効果が、がん細胞に炎症が生じ、炎症性サイトカインが癌細胞に作用している場合でも得られるか、検証した。
　具体的には、膵臓がん由来ＰＡＮＣ－１株と胆管がん由来ＲＢＥ株について、ｓｉＮｅｇ♯１又はｓｉＺＩＣ５♯１をトランスフェクションし、２日後にＩＬ－６（２０ｎｇ／ｍＬ）及びゲムシタビン（０．１μＭ）を添加し、更に培養を続け、トランスフェクションから６日後の細胞数を定量した。ｓｉＮｅｇ♯１を導入し、ＩＬ－６とゲムシタビンのいずれも無添加で培養（すなわち、１０％ＦＢＳ培地での培養）した場合の細胞数を１として、相対細胞数を測定し、Ｔｕｋｅｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔｅｓｔを用いて有意差の有無を検討した（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
　各培養条件の相対細胞数を図６に示す。図６の左図がＰＡＮＣ－１株の結果であり、右図がＲＢＥ株の結果である。図６に示すように、１０％血清存在下と同様に、ＩＬ－６存在下においても、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制により細胞増殖が抑制された。ゲムシタビン処理時の細胞数の低下も同様に引き起こされた。これらのことから、炎症環境においても、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制は、膵臓がん及び胆管がんの細胞増殖抑制に有効であることが示唆された。
　次いで、ＰＡＮＣ－１株とＲＢＥ株について、ｓｉＮｅｇ♯１又はｓｉＺＩＣ５♯１をトランスフェクションし、２日後に１％ＦＢＳ含有培地、１％ＦＢＳとＩＬ－２２（２０ｎｇ／ｍＬ）含有培地、又は１％ＦＢＳとＩＬ－６（２０ｎｇ／ｍＬ）含有培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養後の細胞を回収し、ウェスタンブロットを行って、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３：Ｔｙｒ７０５）、総ＳＴＡＴ３（ＳＴＡＴ３）、及びＧＡＰＤＨ（ローディングコントロール）を検出した。ウェスタンブロットは、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（Cell Signaling社製）、ＳＴＡＴ３抗体（BD Biosciences社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Cell Signaling社製）を用いて行った。
　ウェスタンブロットの染色像を図７に示す。図７に示すように、ＩＬ－６存在下において、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制しても、ＳＴＡＴ３のリン酸化は抑制されなかった。これらの結果から、膵臓がんや胆管がんのがん細胞において、ＺＩＣ５タンパク質の低減は、ＳＴＡＴ３を介さない経路でも増殖抑制に寄与していると考えられた。
　次いで、膵臓がん細胞と胆管がん細胞において、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制のＰＤＧＦＤ遺伝子の発現に対する影響を調べた。具体的には、膵臓がん由来ＰＡＮＣ－１株と膵臓がん由来ＭｉａＰａｃａ－２株と胆管がん由来ＲＢＥ株について、ｓｉＮｅｇ♯１又はｓｉＺＩＣ５♯１をトランスフェクションし、３日間培養した。培養後の細胞を回収し、ウェスタンブロットを行って、プロセシング前のＰＤＧＦＤ（ｐｒｏ－ＰＤＧＦＤ）及びＧＡＰＤＨを検出した。ウェスタンブロットは、抗ＰＤＧＦＤ抗体（Santa Cruz社製）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Cell Signaling社製）を用いて行った。
　ウェスタンブロットの染色像を図８に示す。図８に示すように、いずれの細胞株においても、ｐｒｏ－ＰＤＧＦＤの発現量は、ｓｉＺＩＣ５♯１を導入した細胞とｓｉＮｅｇ♯１を導入した細胞で差がなく、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制は、ＰＤＧＦＤの発現に影響を与えなかった。
　メラノーマにおいては、主にＰＤＧＦＤを介したシグナル伝達により細胞増殖が促進され、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制すると、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現が抑制され、メラノーマ細胞の細胞増殖が抑制される（非特許文献１、非特許文献２）。これに対して、膵臓がん細胞と胆管がん細胞では、ＺＩＣ５遺伝子の発現抑制により、細胞増殖が抑制されるものの、ＰＤＧＦＤの発現量には影響がなかったことから、膵臓癌や胆管癌におけるＺＩＣ５タンパク質の役割は、メラノーマ等とは異なる分子機構によるものであることが明らかとなった。
［実施例３］
　細胞内のＺＩＣ５タンパク質量を低減させる化合物を同定するため、東京大学創薬機構(https://www.ddi.u-tokyo.ac.jp/chemical_library/ )より提供されたValidated Compound Library（約３５００化合物）に対してスクリーニングを行った。
　１次スクリーニングでは、ＧＦＰ融合ＺＩＣ５タンパク質を過剰発現させたメラノーマ由来Ａ３７５細胞を使用した。当該細胞に、候補化合物を添加して１日間培養した後に、各細胞のＧＦＰ蛍光量を、イメージングサイトメーター「In Cell Analyzer 2000」（Cytiva社製）を使用して定量し、各細胞内のＧＦＰ－ＺＩＣ５量の定量を行った。２回のアッセイにおいて、ＧＦＰ蛍光量が、コントロール細胞におけるＧＦＰ蛍光量の平均値－３ＳＤ以下となった候補化合物を１次ヒット化合物として選抜した。
　２次スクリーニングにおいては、ＺＩＣ５タンパク質（融合タンパクなし）を過剰発現させたＡ３７５細胞に対して、１次ヒット化合物を終濃度が０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、又は１０μＭとなるように添加して培養し、翌日に細胞を固定した。固定後の細胞に対して、抗ＺＩＣ５抗体（クローン：GTX104840）及び２次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８－抗ラビットＩｇＧ抗体を使用して染色し、ＺＩＣ５タンパク質量を、前記イメージングサイトメーターを使用して定量した。２回のアッセイの平均蛍光強度が、化合物未処理細胞の平均値－ＳＤより小さくなった１２種の１次ヒット化合物（化合物（Ｔ－１）～（Ｔ－１２））を、ＺＩＣ５分解促進化合物として選抜した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　表３に、コントロール細胞（化合物未処理細胞）のＺＩＣ５タンパク質量を１００とした場合の相対ＺＩＣ５タンパク質量を示した。表中、「ＮＤ」は、細胞死により測定不能だったサンプルを示す。平均値－ＳＤの数値は７８．６である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表３に示すように、これらの化合物はいずれも、０．１～１０μＭのいずれかの範囲内で、細胞内ＺＩＣ５タンパク質量をコントロール細胞よりも有意に低減させることができた。すなわち、これらの１２種の化合物は、ＺＩＣ５タンパク質低減物質であることが確認できた。
　化合物（Ｔ－１）及び化合物（Ｔ－２）について、ウェスタンブロット法により、細胞内ＺＩＣ５タンパク質量への影響を調べた。具体的には、Ａ３７５細胞（何も過剰発現させていない）に、化合物（Ｔ－１）又は化合物（Ｔ－２）を、０、０．１、０．５、又は１μＭとなるように添加して４８時間培養した。培養後の細胞を回収し、抗ＺＩＣ５抗体と抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロット像のバンドの濃さから、各タンパク質量を定量した。ＺＩＣ５タンパク質の相対量（［ＺＩＣ５タンパク質量］／［ＧＡＰＤＨタンパク質量］）を、ウェスタンブロット像と共に図９に示す。図９に示すように、化合物（Ｔ－１）及び化合物（Ｔ－２）の濃度依存的に細胞内のＺＩＣ５タンパク質量は低減しており、これらの化合物が、細胞内のＺＩＣ５タンパク質量を低減させる作用があることが確認できた。
［実施例４］
　２種類のヒトメラノーマ由来ベムラフェニブ耐性株 （Ａ３７５ｖｅｍＲ株、ＨＴ１４４ｖｅｍＲ株）、２種類のＺＩＣ５高発現メラノーマ細胞株（Ａ３７５株、ＨＴ１４４株）、２種類のＺＩＣ５低発現メラノーマ細胞株（Ｃｏｌｏ８２９株、ＳＫｍｅｌ２８株）、ＺＩＣ５非発現正常ヒトメラノサイト細胞 （ＮＨＭ）の合計７種の細胞を、化合物（Ｔ－１）又は化合物（Ｔ－２）で処理し、４８時間培養した後の細胞に対して、実施例１と同様にしてアポトーシス誘導率（％）を求めた。化合物（Ｔ－１）は０、０．１、０．５、又は１μＭとなるように処理し、化合物（Ｔ－２）は０、０．１、又は１μＭとなるように処理した。測定結果を図１０に示す。図１０の上段が化合物（Ｔ－１）で処理した細胞の結果であり、下段が化合物（Ｔ－２）で処理した細胞の結果である。
　化合物（Ｔ－１）は、ヒトメラノーマ由来ベムラフェニブ耐性株とＺＩＣ５高発現メラノーマ細胞株に１．２μＭの濃度でアポトーシスを誘導したが、ＺＩＣ５低発現メラノーマ細胞株とＺＩＣ５非発現正常ヒトメラノサイト細胞にはアポトーシスを誘導しなかった。一方、化合物（Ｔ－２）は、ヒトメラノーマ由来ベムラフェニブ耐性株、ＺＩＣ５高発現メラノーマ細胞株、及びＺＩＣ５低発現メラノーマ細胞株のうちの１種（Ｃｏｌｏ８２９株）に１．２μＭの濃度でアポトーシスを誘導したが、ＺＩＣ５低発現メラノーマ細胞株の１種（ＳＫｍｅｌ２８株）とＺＩＣ５非発現正常ヒトメラノサイト細胞には、アポトーシスを誘導しなかった。以上の結果より、化合物（Ｔ－１）及び化合物（Ｔ－２）は、ＺＩＣ５発現の高いがん細胞株でアポトーシスを誘導する傾向があることが示された。
　次いで、膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ－１株）と胆管がん細胞株（ＲＢＥ株）に対して、同様にして化合物（Ｔ－１）又は化合物（Ｔ－２）で処理し、４８時間培養した後の細胞に対して、実施例１と同様にしてアポトーシス誘導率（％）を求めた。測定結果を図１１に示す。各細胞株のデータのうち、右図が化合物（Ｔ－１）で処理した細胞の結果であり、左図が化合物（Ｔ－２）で処理した細胞の結果である。図１１に示すように、化合物（Ｔ－１）と化合物（Ｔ－２）はいずれも、膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ－１株）及び胆管がん細胞株（ＲＢＥ株）にアポトーシスを誘導した。特に、化合物（Ｔ－２）のアポトーシス誘導率は８～１０％程度であったが、化合物（Ｔ－１）は２０～４０％もの割合でアポトーシスを誘導した。
［実施例５］
　ＺＩＣ５タンパク質低減物質が、ＢＲＡＦ阻害剤（ＰＬＸ４０３２、ベムラフェニブ）（Selleckchem社製）に対する感受性に変化を与えるかについて、検証を行った。
　具体的には、Ａ３７５細胞に、０．５μＭの化合物（Ｔ－１）又は５０ｎＭの化合物（Ｔ－２）を添加して、４８時間培養した後、ベムラフェニブを０．１μＭとなるように添加し、さらに７２時間培養した。培養後、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔで染色して、細胞数をカウントした。全く化合物を添加せずに培養したＡ３７５細胞の細胞数を１として、各細胞の相対細胞数を求めた。結果を図１２に示す。図１２の左図が化合物（Ｔ－１）で処理した細胞の結果であり、右図が化合物（Ｔ－２）で処理した細胞の結果である。この結果、化合物（Ｔ－１）又は化合物（Ｔ－２）とベムラフェニブは、相乗的に細胞数を減少させること、すなわち、相乗的に細胞増殖を抑制することが確認された。
［実施例６］
　化合物（Ｔ－１）及び化合物（Ｔ－２）によるアポトーシス誘導効果が、ＺＩＣ５タンパク質量を低減させたことにより生じているかどうかを検証した。
　具体的には、Ａ３７５メラノーマ細胞に、ＺＩＣ５発現プラスミド（Ｚ５）又は空ベクター（Ｃ）をトランスフェクションにより導入し、それぞれのプラスミドが導入された細胞を選抜した。次いで、これらの細胞に対して、０．１μＭ若しくは０．５μＭの化合物（Ｔ－１）、又は１０ｎＭの化合物（Ｔ－２）を添加し、４日間培養した。培養後、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔで染色して、イメージングサイトメーター「In Cell Analyzer 2000」で細胞数をカウントした。空ベクターを導入し、化合物処理を行わなかった細胞の細胞数を１として、各細胞の相対細胞数を求めた。結果を、ウェスタンブロットの染色像と共に、図１３に示す。図１３の左図が化合物（Ｔ－１）で処理した細胞の結果であり、右図が化合物（Ｔ－２）で処理した細胞の結果である。図中、「Ｃ」が空ベクターを導入した細胞であり、「Ｚ５」がＺＩＣ５発現プラスミドを導入した細胞である。
　図１３に示すように、ＺＩＣ５過剰発現によりＺＩＣ５タンパク量が補填された細胞（Ｚ５）では、化合物（Ｔ－１）及び化合物（Ｔ－２）によるアポトーシス誘導とがん細胞増殖抑制が回復していた。これらの結果から、これらのＺＩＣ５タンパク質低減物質によるがん細胞増殖抑制効果は、細胞内のＺＩＣ５タンパク質量の減少が一因であると示された。
［実施例７］
　ＺＩＣ５を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）が、がん細胞の増殖を抑えるかどうか調べた。ＺＩＣ５を標的とするｓｈＲＮＡとしては、表４に記載のｓｈＺＩＣ５を用い、ネガティブコントロールのｓｈＲＮＡとしてｓｈＮｅｇを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　まず、ＺＩＣ５を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＺＩＣ５）をｐＳＩＲＥＮ－ＲｅｔｒｏＱ－ＺｓＧｒｅｅｎベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入したｓｈＺＩＣ５／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰと、ネガティブコントロールのｓｈＲＮＡ（ｓｈＮｅｇ）をｐＳＩＲＥＮ－ＲｅｔｒｏＱ－ＺｓＧｒｅｅｎベクターに導入したｓｈＮｅｇ／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰを、レトロウィルス産生用のＰｌａｔＡ細胞にトランスフェクションし、レトロウィルスを産生させた。回収したレトロウィルスを、膵臓がん細胞（ＭｉａＰａｃａ－２株）に感染させることにより、当該膵臓がん細胞にＺＩＣ５／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰ又はｓｈＮｅｇ／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰを導入させた。増殖アッセイ用に、レトロウィルス感染後の膵臓がん細胞を９６ウェルプレートに播種し、３日間培養した後、ＧＦＰ陽性細胞数を計測して、増殖率（［培養３日目のＧＦＰ陽性細胞数］／［培養０日目のＧＦＰ陽性細胞数］）を求めた。
　ウィルス感染後の培養３日目の膵臓がん細胞の増殖率の測定結果を図１４に示す。ＺＩＣ５を抑制するｓｈＺＩＣ５／ｐＳＩＲＥＮ－ＧＦＰを導入した膵臓がん細胞においても、ｓｈＮｅｇを導入した膵臓がん細胞と比較して、増殖率の低下がみられた。
［実施例８］
　ＺＩＣ５の発現抑制をｔｅｔ－ｏｎシステムにより誘導可能な癌細胞を移植したマウスを用いて、生体内に生着した腫瘍において、ＺＩＣ５の抑制が腫瘍退縮効果を示すかを調べた。
　まず、ｔｅｔ－ｏｎシステムによりｓｈＲＮＡの発現誘導が可能なプラスミドベクター（Ｔｅｔ－ｐＬＫＯ－ｐｕｒｏ、Ａｄｄｇｅｎｅ社製）に、実施例７で用いたｓｈＺＩＣ５を挿入したベクター（ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５）と、同様にｓｈＮｅｇを挿入したベクター（ｔｅｔ－ｓｈＮｅｇ）を、構築した。
　ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５又はｔｅｔ－ｓｈＮｅｇを、ウィルス感染によりヒト膵臓がん細胞（ＭｉａＰａｃａ－２株）に導入して、ｔｅｔ－ｏｎシステムによりｓｈＺＩＣ５の発現誘導が可能な膵臓癌細胞（ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５－ＭｉａＰａｃａ－２）と、ｔｅｔ－ｏｎシステムによりｓｈＮｅｇの発現誘導が可能な膵臓癌細胞（ｔｅｔ－ｓｈＮｅｇ－ＭｉａＰａｃａ－２）とを作製した。
　各ｔｅｔ－ｓｈＲＮＡを導入したＭｉａＰａｃａ－２細胞が、テトラサイクリン（ｔｅｔ）誘導体であるドキシサイクリン（ｄｏｘ）の添加により、各ｓｈＲＮＡの発現が誘導されるかを、確認した。まず、各細胞の培養培地にｄｏｘを添加して、４８時間培養した。培養後の細胞のＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量を内部標準として測定した。ｍＲＮＡの測定は、参考例２と同様にして、ｑＲＴ－ＰＣＲにより行った。
　各細胞のＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量の測定結果を図１５に示す。ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５－ＭｉａＰａｃａ－２細胞では、４８時間のｄｏｘ処理により、ＺＩＣ５遺伝子のｍＲＮＡ量が、コントロールのｔｅｔ－ｓｈＮｅｇ－ＭｉａＰａｃａ－２細胞の１０％程度まで低下した。
　次いで、ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５－ＭｉａＰａｃａ－２細胞又はｔｅｔ－ｓｈＮｅｇ－ＭｉａＰａｃａ－２細胞を、免疫不全マウス（Ｂａｌｂ－ｃ ｎｕ／ｎｕ）の皮下に移植し生着させた（各ｎ＝３）。移植から２３日目に、腫瘍の体積が１００ｍｍ３程度になったことが確認した後、実験終了（移植から３７日目）までの間、全マウスの飲水にｄｏｘを添加して、ｄｏｘ処理を行った。ｄｏｘを添加してから１０日後から、全マウスにゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を、１日１回、計３日間、腹腔内投与した。
　移植から２３日目から３７日目までの期間、腫瘍の体積を経時的に測定した結果を図１６に示す。図１６に示すように、ｔｅｔ－ｓｈＺＩＣ５－ＭｉａＰａｃａ－２細胞を移植した腫瘍では、コントロールのｔｅｔ－ｓｈＮｅｇ－ＭｉａＰａｃａ－２細胞を移植した腫瘍と比較し、ゲムシタビン投与後には腫瘍体積の縮小がみられた。これらの結果から、マウス生体内に生着したヒト膵臓癌細胞において、ＺＩＣ５を抑制することによってゲムシタビンに対する感受性が亢進し、相乗的な効果が得られたと考えられた。

Claims (16)

  1. 　ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質を有効成分とし、膵臓がん又は胆管がんの治療に用いられる、医薬用組成物。
  2. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制させる物質である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  3. 　前記ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制させる物質が、ＲＮＡ干渉により、ＺＩＣ５遺伝子の発現を抑制させる核酸分子である、請求項２に記載の医薬用組成物。
  4. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１～Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  5. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  6. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１～Ｒ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  7. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  8. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（５）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  9. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  10. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（７）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  11. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（８）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  12. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質が、下記一般式（９）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  13. 　前記膵臓がん又は胆管がんが、ＺＩＣ５タンパク質が発現しているがんである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  14. 　前記ＺＩＣ５タンパク質の細胞内含有量を低減させる物質以外の抗がん剤を含有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  15. 　ＢＲＡＦ阻害剤及びＤＮＡ合成阻害剤からなる群より選択される１種以上の抗がん剤を含有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  16. 下記一般式（１）～（９）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式中、Ｒ１～Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ホルミル基、アシルオキシ基、又は置換基を有していてもよいテトラヒドロピラニルオキシ基である］
    のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体、これらの化合物の塩、又はこれらの溶媒和物を有効成分とする、ＺＩＣ５タンパク質低減剤。
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