ES2710174T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la metástasis ósea - Google Patents

Abstract

Un agente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ROBO4, un polipéptido señuelo de ROBO4 y un inhibidor de la expresión de ROBO4 para usar en un método para prevenir o tratar la metástasis ósea en un sujeto que lo necesite en donde el inhibidor de la expresión de ROBO4 se selecciona del grupo que consiste en siRNAs de ROBO4, shRNAs de ROBO4, ribozimas de ROBO4 y oligonucleótidos antisentido de ROBO4 y en donde el polipéptido señuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4.

Description

DESCRIPCION

Metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de la metastasis osea

Campo:

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de la metastasis osea.

Antecedentes:

La metastasis osea, la diseminacion del cancer a los huesos, ocurre en mas de 1,5 millones de pacientes con cancer en todo el mundo y se asocia mas comunmente con canceres de prostata, pulmon y mama (Weilbaecher et al., Nat Rev Cancer 2011; 11: 411-24). Las celulas cancerosas metastasicas que residen en la medula osea alteran las funciones de reabsorcion osea (osteoclastos) y celulas formadoras de hueso (osteoblastos) y se apropian de senales de secuestro que provienen de la matriz osea (Weilbaecher et al., Nat Rev Cancer 2011; 11:411-24). Alterando el equilibrio fisiologico entre la reabsorcion osea y la formacion osea, las celulas metastasicas promueven asf la destruccion esqueletica. El entendimiento de que las celulas metastasicas en la medula osea alteran las funciones de los osteoclastos y los osteoblastos ha llevado al uso de terapias dirigidas a los osteoclastos (bifosfonatos, denosumab). Muchos agentes terapeuticos para el tratamiento y la prevencion de la metastasis osea se describieron en la tecnica anterior (Rachel Theriault et al., “Biology of Bone Metastases”, Cancer Control, vol. 19, n° 2, 1 abril de 2012 (2012-04­ 01)). Por ejemplo, los bifosfonatos inhiben la actividad de reabsorcion osea de los osteoclastos y son los estandares de atencion para retrasar la destruccion osea en pacientes con cancer con metastasis osea (Gnant & Clezardin, Cancer Treat Rev 2011; Brown & Coleman, Nat Rev Clin Oncol 2012; 9: 110-8). Denosumab, un anticuerpo monoclonal completamente humanizado que se une espedficamente al activador del receptor del ligando NF-^k B (RANKL), inhibe la formacion de osteoclastos, reduciendo asf la destruccion osea (Brown & Coleman, Nat Rev Clin Oncol 2012; 9: 110­ 8). Sin embargo, estos tratamientos son solo paliativos y se asocian a menudo con efectos secundarios adversos. Por lo tanto, es vital para comprender mejor los mecanismos moleculares que preceden al desarrollo evidente de las lesiones esqueleticas con el fin de desarrollar farmacos que se dirijan a las celulas cancerosas durante la formacion temprana de la metastasis cuando colonizan la medula osea.

Se informo que la sialoprotema osea en el suero de pacientes con cancer de mama primario es un marcador pronostico de la metastasis osea posterior (Diel I. et al. “Serum bone sialoprotein in patients with primary breast cancer is a prognostic marker for subsequent bone metastases”, Clinical Cancer Research, The American Association For Cancer Research, EE.UU., vol. 5, n° 12, 1 diciembre 1999 (1999-12-01)).

Se informo que el siRNA ROBO4 anula la migracion de las celulas endoteliales mediada por el suero (Kaur Sukhbir et al., “Silencing of directional migration in roundabout 4 knockdown endothelial cells”, BMC Cell Biology, Biomed Central, London, GB, vol. 9, n° 1, 3 noviembre 2008 (2008-11-03)). Se demostro que el receptor de ROBO4 soluble, Robo4Fc, inhibe la angiogenesis in vivo y la migracion de la celula endotelial (Suchting et al: “Soluble Robo4 receptor inhibits in vivo angiogenesis and endothelial cells migration”, FASEB Journal, Fed. Of American Soc. for Experimental Biology, EE.UU., vol. 19, n° 1, 1 octubre 2005 (2005-10-01)). El documento W02008/100805 describe que un anticuerpo anti-ROBO4 inhibe el alargamiento del tubo en HUVEC, pero tambien ilustra que el anticuerpo anti-ROBO4 desnudo no tiene efecto anticancengeno in vivo.

Resumen:

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de la metastasis osea. En particular, la presente invencion se define por las reivindicaciones.

Mas particularmente, el primer objeto de la presente invencion se refiere a un agente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ROBO4, un polipeptido senuelo de ROBO4 y un inhibidor de la expresion de ROBO4 para usar en un metodo para prevenir o tratar la metastasis osea en un sujeto que lo necesita en donde el inhibidor de la expresion de ROBO4 se selecciona del grupo que consiste en siRNA de ROBO4, shRNAs de ROBO4, ribozimas de ROBO4 y oligonucleotidos antisentido de ROBO4 y en donde el polipeptido senuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4.

Un segundo objeto de la presente invencion se refiere a un metodo para probar si un paciente con cancer tiene riesgo de tener metastasis osea que comprende i) determinar el nivel de expresion de ROBO4 en una muestra obtenida de dicho paciente ii) comparar el nivel determinado en la etapa i) con un nivel de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente tiene un alto riesgo de tener metastasis osea cuando el nivel determinado en la etapa i) es mayor que el nivel de referencia predeterminado.

Descripcion detallada:

Los inventores conjeturan que los receptores ROBO apoyan las funciones de las celulas tumorales diseminadas (DTC), permitiendo a estas celulas adaptarse y desarrollarse en la medula osea. Usando celulas de cancer de mama B02 humanas, una subpoblacion de la lmea celular MDA-MB-231 que metastatiza solo en hueso, un analisis de microarrays mostro que ROBO1 y ROBO4 estaban significativamente sobreexpresados en celulas B02 en comparacion con lo observado con celulas parentales. ROBO2 y ROBO3 no se expresaban en ambas lmeas celulares. Por lo tanto, se evaluo el papel funcional de ROBO1/ROBO4 en la metastasis del cancer de mama B02, usando shRNAs dirigidos a cada uno de estos receptores. Consistente con su papel como gen supresor de tumores, el silenciamiento de ROBO1 mejoro las propiedades migratorias e invasivas de los clones de shROBOl in vitro y aumento el crecimiento de xenoinjertos de tumores shROBOl en animales. Ademas, el silenciamiento de ROBOl promovio la formacion de micrometastasis en la medula osea ex vivo. En acusado contraste, el silenciamiento de ROBO4 inhibio la migracion y la invasion de celulas de cancer de mama shROBO4 in vitro, disminuyo el crecimiento del tumor ortotopico in vivo y redujo la formacion de micrometastasis en la medula osea ex-vivo. Por lo tanto, los datos descubrieron una funcion previamente desconocida de los receptores ROBO en la formacion de micrometastasis en la medula osea y revelaron que ROBO1 y ROBO4 tienen funciones opuestas.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un agente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ROBO4, un polipeptido senuelo de ROBO4, un inhibidor de la expresion de ROBO4 para usar en un metodo para prevenir o tratar la metastasis osea en un sujeto que lo necesite en donde el inhibidor de la expresion de ROBO4 se selecciona del grupo que consiste en siRNAs de ROBO4, shRNAs de ROBO4, ribozimas de ROBO4 y oligonucleotidos antisentido de ROBO4 y en donde el polipeptido senuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4.

Los terminos “sujeto” y “paciente”, usados indistintamente en esta memoria, se refieren a un mairnfero, particularmente a un ser humano que padece un cancer como cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, melanoma, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de ovario y cancer cerebral.

Como se usa en esta memoria, el termino “ROBO4” tiene su significado general en la tecnica y designa la protema transmembrana de superficie celular Roundabout 4. ROBO4 se describio por primera vez como una protema receptora de grna de axones y su secuencia de aminoacidos y la secuencia genica que codifica la misma se describen en GenBank ID [n° de acceso AF361473].

Como se usa en esta memoria, “anticuerpo” incluye tanto los que aparecen de forma natural como los que no son naturales. Espedficamente, “anticuerpo” incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos monovalentes y divalentes de estos. Ademas, “anticuerpo” incluye anticuerpos quimericos, anticuerpos totalmente sinteticos, anticuerpos de cadena unica y fragmentos de estos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o no humano. Un anticuerpo no humano puede humanizarse mediante metodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre.

Los anticuerpos se pueden preparar de acurdo con la metodologfa convencional. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar usando el metodo de Kohler y Milstein (Nature, 256: 495, 1975). Para preparar anticuerpos monoclonales utiles en la invencion se inmuniza un raton u otro animal huesped apropiado a intervalos adecuados (p. ej., dos veces por semana, semanalmente, dos veces al mes o mensualmente) con formas antigenicas de ROBO4. Al animal se le puede administrar un “refuerzo” final de antfgeno dentro de una semana del sacrificio. A menudo es deseable usar un adyuvante inmunologico durante la inmunizacion. Los adyuvantes inmunologicos adecuados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, alumina, adyuvante Ribi, Titermax de Hunter, adyuvantes de saponina como QS21 o Quil A, u oligonucleotidos inmunoestimuladores que contienen CpG. Son bien conocidos en el campo otros adyuvantes adecuados. Los animales se pueden inmunizar por via subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intranasal u otras. Un animal dado se puede inmunizar con multiples formas del antfgeno por multiples rutas.

Brevemente, se pueden proporcionar las formas recombinantes de ROBO4 usando cualquier metodo descrito previamente. Despues del regimen de inmunizacion, se afslan los linfocitos del bazo, nodulo linfatico u otro organo del animal y se fusionan con una lmea celular de mieloma adecuada usando un agente como polietilen glicol para formar un hibridoma. Despues de la fusion, se colocan las celulas en medios permisivos para el crecimiento de hibridomas, pero no para los companeros de fusion, usando metodos estandar, como se describe (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology; Biochemistry and Immunology, 3a edicion, Academic Press, New York, 1996). Despues del cultivo de los hibridomas, se analizan los sobrenadantes celulares para la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, es decir, que se unen selectivamente al antfgeno. Las tecnicas analtticas adecuadas incluyen ELISA, citometna de flujo, inmunoprecipitacion y transferencia de Western. Son bien conocidas en el campo otras tecnicas de cribado. Las tecnicas preferidas son aquellas que confirman la union de los anticuerpos al antfgeno nativamente plegado, conformacionalmente intacto, como ELlSA no desnaturalizante, citometna de flujo e inmunoprecipitacion.

Significativamente, como es bien conocido en la tecnica, solo una pequena parte de una molecula de anticuerpo, el paratopo, esta implicada en la union del anticuerpo a su epftopo. Las regiones Fc' y Fc, por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento, pero no estan implicadas en la union del antfgeno. Un anticuerpo a partir del cual se ha escindido enzimaticamente la region pFc' o que se ha producido sin la region pFc', denominada un fragmento F(ab')2, retiene ambos sitios de union al antfgeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo a partir del cual se ha escindido enzimaticamente la region Fc, o que se ha producido sin la region Fc, denominada fragmento Fab, retiene uno de los sitios de union al antfgeno de una molecula de anticuerpo intacta. Continuando, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera del anticuerpo unida covalentemente y una porcion de la cadena pesada del anticuerpo denominado Fd. Los fragmentos Fd son los principales determinantes de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd se puede asociar con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd retienen la capacidad de union al epftopo en el aislamiento.

Dentro de la parte de union al antigeno de un anticuerpo, como es bien conocido en la tecnica, hay regiones determinates de la complementariedad (CDRs), que interaccionan directamente con el epftopo del antigeno, y regiones de marco (FRs), que mantienen la estructura terciaria del paratopo. Tanto en el fragmento Fd de la cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG hay cuatro regiones marco (FR1 a FR4) separados respectivamente por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDRS). Las CDRs, y en particular las regiones CDRS, y mas en particular los CDRS de cadena pesada, son en gran parte responsables de la especificidad del anticuerpo.

Ahora esta bien establecido en la tecnica que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamfero se pueden reemplazar con regiones similares de anticuerpos conespedficos o heteroespedficos mientras se mantenga la especifidad epitopica del anticuerpo original. Esto se manifiesta mas claramente en el desarrollo y uso de anticuerpos “humanizados” en los que las CDR no humanas se unen covalentemente a las regiones humanas FR y/o Fc/pFc' para producir un anticuerpo funcional.

Esta descripcion proporciona en ciertas realizaciones, composiciones y metodos que incluyen formas humanizadas de anticuerpos. Como se usa en esta memoria, “humanizado” describe anticuerpos en donde algunos, la mayona o todos los aminoacidos fuera de las regiones CDR se reemplazan con aminoacidos correspondientes derivados de moleculas de inmunoglobulina humana. Los metodos de humanizacion incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes de EE.UU. N°s. 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 5.859.205. Las patentes anteriores de EE.UU. N°s. 5.585.089 y 5.693.761 y el documento WO 90/07861 tambien proponen cuatro criterios posibles que se pueden usar en el diseno de anticuerpos humanizados. La primera propuesta era aquella para un aceptor, usar un marco de lectura de una inmunoglobulina humana particular que sea inusualmente homologo a la inmunoglobulina donante a ser humanizada, o usar un marco consenso de muchos anticuerpos humanos. La segunda propuesta era que si un aminoacido es inusual en el marco de la inmunoglobulina humana y el aminoacido donante en esa posicion es tfpico de las secuencias humanas, entonces se puede seleccionar el aminoacido donante en lugar del aceptor. La tercera propuesta era que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDRs en la cadena de inmunoglobulina humanizada se puede seleccionar el aminoacido donante en lugar del aminoacido aceptor. La cuarta propuesta era usar el aminoacido donante que esta en las posiciones del marco en el que se predice que el aminoacido tendra un atomo en la cadena lateral a 3A de los CDRs en un modelo tridimensional del anticuerpo y se predice que sera capaz de interaccionar con los CDRs. Los metodos anteriores son meramente ilustrativos de algunos de los metodos que un experto en la tecnica podna emplear para hacer anticuerpos humanizados. Un experto en la tecnica estara familiarizado con otros metodos para la humanizacion de anticuerpos.

En una realizacion de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, la mayona o todos los aminoacidos que estan fuera de las regiones CDR se han reemplazado con aminoacidos de moleculas de inmunoglobulina humana pero donde no se cambian algunos, la mayona o todos los aminoacidos dentro de una o mas regiones CDR. Se permiten pequenas adiciones, supresiones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoacidos siempre y cuando no abolan la capacidad del anticuerpo para unirse a un antfgeno dado. Las moleculas de inmunoglobulina humana adecuadas incluinan moleculas IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo “humanizado” retiene una especificidad antigenica similar al anticuerpo original. Sin embargo, usando ciertos metodos de humanizacion, se puede aumentar la afinidad y/o especificidad de union del anticuerpo usando metodos de “evolucion dirigida”, como se describe en Wu et al.,./Mol. Biol. 294: 151, 1999.

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos tambien se pueden preparar inmunizando ratones transgenicos para grandes partes del loci de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana. Vease, p. ej., las patentes de EE.UU. N°s. 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807, 6.150.584 y referencias citadas en estas. Estos animales se han modificado geneticamente de tal manera que hay una eliminacion funcional en la produccion de anticuerpos endogenos (p. ej., murinos). Los animales se modifican adicionalmente para contener toda o una parte del locus del gen de inmunoglobulina de lrnea-germinal humana de modo que la inmunizacion de estos animales de como resultado la produccion de anticuerpos completamente humanos contra el antfgeno de interes. Despues de la inmunizacion de estos ratones (p. ej., ratones XenoMouse (Abgenix), HuMAb (Medarex/GenPharm)), se pueden preparar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la tecnologfa de hibridoma estandar. Estos anticuerpos monoclonales tendran secuencias de aminoacidos de inmunoglobulina humana y, por lo tanto, no provocaran respuestas de anticuerpos humanos anti-raton (KAMA) cuando se administren a seres humanos.

Tambien existen metodos in vitro para producir anticuerpos humanos. Estos incluyen la tecnologfa de “phage display”, visualizacion de fagos, (Patentes de EE.UU. N°s. 5.565.332 y 5.573.905) y la estimulacion in vitro de celulas B humanas (Patentes de EE.UU. N°s. 5.229.275 y 5.567.610).

Por lo tanto, como sera evidente para un experto en la tecnica, la presente descripcion tambien proporciona los fragmentos F(ab') 2 Fab, Fv y Fd; anticuerpos quimericos en los que se han reemplazado las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o de la cadena ligera de CDR3 por secuencias homologas humanas o no humanas; anticuerpos quimericos de fragmentos F(ab')2 en los que se han reemplazado las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o de la cadena ligera de CDR3 por secuencias homologas humanas o no humanas; anticuerpos quimericos de fragmentos Fab en los que se han reemplazado las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o de la cadena ligera de CDR3 por secuencias homologas humanas o no humanas; y anticuerpos quimericos de fragmentos Fd en los que se han reemplazado las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 por secuencias homologas humanas o no humanas. La presente descripcion tambien incluye los denominados anticuerpos de cadena unica.

Las diversas moleculas y fragmentos de anticuerpos pueden derivar de cualquiera de las clases de inmunoglobulinas comunmente conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, IgA, IgA secretoria, IgE, IgG e IgM. Tambien son bien conocidas por los expertos en la tecnica las subclases de IgG e incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.

En otra realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo de dominio unico. El termino “anticuerpo de dominio unico” (sdAb) o “VHH” se refiere al dominio variable de la cadena pesada unico de anticuerpos del tipo que se pueden encontrar en mairnferos camelidos que estan naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. Dichos VHH tambien se llaman “nanobody®”. De acuerdo con la descripcion, puede ser de modo particular sdAb de llama.

Como se usa en esta memoria, el termino “aptamero” se refiere a una clase de molecula que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular. Los aptameros son oligonucleotidos o secuencias de oligopeptidos con la capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moleculas diana con alta afinidad y especificidad. Por consiguiente, el termino “aptamero anti-ROBO4” se refiere a un aptamero dirigido contra ROBO4. Los aptameros se pueden aislar mediante Evolucion Sistematica de Ligandos por enriquecimiento EXponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener mediante smtesis qmmica combinatoria de ADN.

En una realizacion, el agente es un polipeptido senuelo de ROBO4 que es capaz de atrapar los ligandos de ROBO4 y asf evitar su activacion. Tfpicamente, el polipeptido senuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4 y, por lo tanto, incluye formas solubles de ROBO4. Una forma soluble adecuada de ROBO4 podna comprender, por ejemplo, una forma truncada de la protema de la que se ha eliminado el dominio transmembrana por metodos qmmicos, proteolfticos o recombinantes.

En una realizacion particular, el polipeptido senuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4 fusionado con el dominio Fc de una inmunoglobulina. El dominio Fc de dicha protema de fusion sirve para al menos a uno de los siguientes propositos: la secrecion de la protema de fusion a partir de celulas que producen dicha protema de fusion, lo que proporciona el dominio extracelular de ROBO4 en una forma (p. ej., estado de plegamiento o agregacion) funcional para atrapar los ligandos de ROBO4, la purificacion por afinidad de dicha protema de fusion, el reconocimiento de la protema de fusion por un anticuerpo, lo que proporciona propiedades favorables a la protema de fusion cuando se usa como un medicamento. Las inmunoglobulinas adecuadas son IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La IgG y la IgA son preferidas, las mas preferidas son las IgGs, p.ej., una IgG1. Dicho dominio Fc puede ser un dominio Fc completo o una variante conservadora de funcion de este. Una variante de Fc es conservadora de funcion si conserva al menos una de las funciones enumeradas anteriormente. Los dominios de la protema de fusion se pueden unir mediante un enlazador. El enlazador puede consistir en aproximadamente de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 10 aminoacidos.

Los polipeptidos se pueden producir por cualquier medio adecuado, como sera evidente para los expertos en la tecnica. Con el fin de producir cantidades suficientes del polipeptido para su uso de acuerdo con la presente descripcion, se puede lograr convenientemente la expresion cultivando en condiciones apropiadas celulas huesped recombinantes que contienen el polipeptido de la descripcion. Preferiblemente, el polipeptido se produce por medios recombinantes, mediante expresion a partir de una molecula de acido nucleico codificante. Son bien conocidos los sistemas para clonar y expresar un polipeptido en una variedad de celulas huesped diferentes. Cuando se expresa en forma recombinante, el polipeptido se genera preferiblemente por expresion a partir de un acido nucleico codificante en una celula huesped. Se puede usar cualquier celula huesped, dependiendo de los requisitos individuales de un determinado sistema. Las celulas huesped adecuadas incluyen bacterias, celulas de marnffero, celulas vegetales, levaduras y sistemas de baculovirus. Las lmeas celulares de mamfferos disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas renales de hamster recien nacido y muchas otras. Las bacterias tambien son huesped preferidos para la produccion de protema recombinante, debido a la facilidad con que las bacterias se pueden manipular y crecer. Un huesped bacteriano comun preferido es E. coli.

En realizaciones espedficas, se contempla que se pueden modificar los polipeptidos usados en los metodos terapeuticos de la presente descripcion para mejorar su eficacia terapeutica. Dicha modificacion de los compuestos terapeuticos se puede usar para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo de circulacion o modificar la biodistribucion. Por ejemplo, se puede disminuir significativamente la toxicidad de compuestos terapeuticos potencialmente importantes mediante la combinacion con una variedad de vehmulos transportadores de farmacos que modifican la biodistribucion. Como ejemplo, anadir dipeptidos puede mejorar la penetracion de un agente circulante en el ojo a traves de la barrera retiniana sangumea mediante el uso de transportadores endogenos.

Una estrategia para mejorar la viabilidad del farmaco es la utilizacion de polfmeros solubles en agua. Se ha demostrado que varios polfmeros solubles en agua modifican la biodistribucion, mejoran el modo de captacion celular, cambian la permeabilidad a traves de las barreras fisiologicas; y modifican la velocidad de aclaramiento del cuerpo. Para lograr un efecto de direccionamiento o efecto de liberacion sostenida se han sintetizado poKmeros solubles en agua que contienen restos de farmacos como grupos terminales, como parte del esqueleto o como grupos que penden de la cadena polimerica.

Se ha usado ampliamente el polietilenglicol (PEG) como transportador de farmacos, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificacion. Se ha demostrado que la union a varios farmacos, protemas y liposomas mejora el tiempo de residencia y disminuye la toxicidad. El PEG se puede acoplar a agentes activos a traves de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y a traves de otros metodos qmmicos; sin embargo, el PEG en si mismo esta limitado a como maximo dos agentes activos por molecula. En un enfoque diferente, se exploraron los copolfmeros de PEG y aminoacidos como nuevos biomateriales que retendnan las propiedades de biocompatibilidad del PEG, pero que tendnan la ventaja anadida de numerosos puntos de anclaje por molecula (proporcionando una mayor carga de farmaco) y que se podnan disenar sinteticamente para adaptarse a una variedad de aplicaciones.

Los expertos en la tecnica conocen las tecnicas de PEGilacion para la modificacion eficaz de farmacos. Por ejemplo, VectraMed (Plainsboro, N. J.) ha usado polfmeros de administracion de farmacos que consisten en polfmeros alternantes de PEG y monomeros trifuncionales como lisina. Las cadenas de PEG (tfpicamente de 2000 daltons o menos) estan unidas a los a- y e- grupos amino de la lisina a traves de enlaces de uretano estables. Dichos copolfmeros retienen las propiedades deseables del PEG, mientras proporcionan grupos colgantes reactivos (los grupos de acido carboxflico de la lisina) a intervalos estrictamente controlados y predeterminados a lo largo de la cadena del polfmero. Los grupos colgantes reactivos se pueden usar para la derivacion, entrecruzamiento o conjugacion con otras moleculas. Estos polfmeros son utiles para producir profarmacos estables de larga circulacion variando el peso molecular del polfmero, el peso molecular de los segmentos de PEG y el enlace escindible entre el farmaco y el polfmero. El peso molecular de los segmentos de PEG afecta al espaciado del complejo farmaco/grupo enlazador y la cantidad de farmaco por peso molecular de conjugado (segmentos mas pequenos de PEG proporcionan una mayor carga de farmaco). En general, aumentar el peso molecular total del conjugado de copolfmero en bloque aumentara la vida media circulatoria del conjugado. Aun asf, el conjugado debe ser facilmente degradable o tener un peso molecular por debajo del umbral limitante de filtracion glomerular (p. ej., menos de 45 kDa).

Ademas, dado que el esqueleto polimerico es importante para mantener la vida media circulatoria y la biodistribucion, se pueden usar enlazadores para mantener el agente terapeutico en forma de profarmaco hasta que se libere del esqueleto polimerico por un desencadenante espedfico, tfpicamente actividad enzimatica en el tejido diana. Por ejemplo, este tipo de distribucion de farmaco activado por tejido es particularmente util cuando se requiere la distribucion a un sitio espedfico de biodistribucion y el agente terapeutico se libere en o cerca del sitio de la patologfa. Se conocen por los expertos en la tecnica bibliotecas de grupos enlazadores para usar en la distribucion de farmacos activados y se pueden basar en la cinetica enzimatica, prevalencia de la enzima activa y especificidad de escision de las enzimas espedficas de enfermedad seleccionadas. Se pueden usar dichos enlazadores para modificar la protema o fragmento de la protema descrita en esta memoria para distribucion terapeutica.

Un “ inhibidor de la expresion de ROBO4” se refiere a un compuesto natural o sintetico que tiene un efecto biologico para inhibir o reducir significativamente la expresion del gen de ROBO4.

Los inhibidores de expresion para usar en la presente descripcion se pueden basar en constructos de oligonucleotidos antisentido. Los oligonucleotidos antisentido, que incluyen moleculas de ARN antisentido y moleculas de ADN antisentido, actuanan para bloquear directamente la traduccion del ARNm de ROBO4 uniendose al mismo y evitando asf la traduccion de protemas o aumentando la degradacion del ARNm, disminuyendo asf el nivel de ROBO4 y, por tanto, la actividad, en una celula. Por ejemplo, pueden sintetizarse oligonucleotidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones unicas de la secuencia del ARNm transcrito que codifica ROBO4, p. ej., mediante tecnicas de fosfodiester convencionales y administrarse mediante, p. ej., inyeccion intravenosa o infusion. Son bien conocidos en la tecnica los metodos para usar tecnicas antisentido para inhibir espedficamente la expresion genica de genes cuyas secuencias se conocen (p. ej., veanse las patentes de EE.UU. N°s. 6.566.135; 6.566.131; 6.365.354; 6.410.323; 6.107.091; 6.046.321 y 5.981.732).

Los ARNs inhibidores pequenos (siRNAs) tambien pueden funcionar como inhibidores de la expresion para usar en la presente descripcion. La expresion genica de ROBO4 se puede reducir poniendo en contacto un sujeto o celula con un ARN de doble cadena pequeno (dsRNA) o un vector o constructo que origina la produccion de un ARN de doble cadena pequeno, de modo que la expresion genica de ROBO4 se inhiba espedficamente (es decir, ARN de interferencia o ARNi). Los metodos para seleccionar un dsRNA o un vector codificante de dsRNA son bien conocidos en la tecnica para genes cuya secuencia se conoce (p. ej., vease Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et. al. (2001); Hannon, GJ. (2002); MacManus, MT. et al (2002); Brummelkamp, TR. et al.(2002); Patentes de EE.UU. Nos. 6.573.099 y 6.506.559; y las publicaciones de Patente internacional Nos. WO 01/36646, W o 99/32619 y WO 01/68836). Todos o parte de los enlaces fosfodiester de los siRNAs de la descripcion estan ventajosamente protegidos. Esta proteccion se implementa generalmente a traves de la ruta qrnmica que usa metodos que se conocen en la tecnica. Los enlaces fosfodiester se pueden proteger, por ejemplo, por un grupo funcional tiol o amina o por un grupo fenilo. Los extremos 5' y/o 3' de los si RNAs de la descripcion estan ventajosamente protegidos, por ejemplo, usando la tecnica descrita anteriormente para proteger los enlaces fosfodiester. Las secuencias de los siRNAs comprenden ventajosamente al menos doce dinucleotidos contiguos o sus derivados.

Como se usa en esta memoria, el termino “derivados de siRNAs” con respecto a las secuencias de acido nucleico presentes se refiere a un acido nucleico que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 90% con la eritropoyetina o fragmento de esta, preferiblemente al menos el 95%, como un ejemplo de al menos el 98% y mas preferiblemente de al menos el 98%.

Como se usa en esta memoria, “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de acido nucleico quiere decir el porcentaje de acido nucleico identico entre las dos secuencias a comparar obtenido con el mejor alineamiento de dichas secuencias, siendo este porcentaje puramente estadfstico y las diferencias entre estas dos secuencias distribuyendose aleatoriamente sobre las secuencias de acidos nucleicos. Como se usa en esta memoria, “mejor alineamiento” o “alineamiento optimo” significa el alineamiento para el que el porcentaje de identidad determinado (vease mas abajo) es el mas alto. La comparacion de secuencias entre dos secuencias de acidos nucleicos se realiza generalmente comparando estas secuencias que previamente se han alineado de acuerdo con el mejor alineamiento; esta comparacion se realiza en segmentos de comparacion con el fin de identificar y comparar las regiones locales de similitud. Se puede saber el mejor alineamiento de secuencias para realizar la comparacion, ademas de la forma manual, usando el algoritmo de homologfa global desarrollado por SMITH y WATERMAN (Ad. App. Math., vol. 2, p: 482, 1981), usando el algoritmo de homologfa local desarrollado por NEDd Le MAN y WUn Sc H (J. Mol. Biol., vol. 48, p. 443, 1970), usando el metodo de similitudes desarrollado por PEARSON y LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.

85, p. 2444, 1988), usando programas informaticos que usan dichos algoritmos (GAP, Be STFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA en el paquete informatico de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI EE.UU.), usando los algoritmos de alineamiento multiple MUSCLE (Edgar, Robert, C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p: 1792, 2004). Para obtener el mejor alineamiento local, se puede usar preferiblemente el programa informatico BLAST. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de acidos nucleicos se determina comparando estas dos secuencias optimamente alineadas, siendo las secuencias de acidos nucleicos capaces de comprender adiciones o supresiones con respecto a la secuencia de referencia con el fin de obtener el alineamiento optimo entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el numero de posiciones identicas entre estas dos secuencias y dividiendo este numero por el numero total de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Los shRNAs (ARN de horquilla corta) tambien pueden funcionar como inhibidores de la expresion para usar en la presente descripcion.

Las ribozimas tambien pueden funcionar como inhibidores de la expresion para usar en la presente descripcion. Las ribozimas son moleculas de ARN enzimaticas capaces de catalizar la escision espedfica del ARN. El mecanismo de accion de la ribozima implica la hibridacion espedfica de la secuencia de la molecula de ribozima con ARN diana complementario, seguido de la escision endonucleolftica. Las moleculas de ribozima disenadas con motivo de horquilla o de cabeza de martillo que catalizan espedfica y eficazmente la escision endonucleolftica de secuencias de ARNm de ROBO4 son, por lo tanto, utiles dentro del alcance de la presente descripcion. Inicialmente se identificaron los sitios espedficos de escision de la ribozima dentro de cualquier ARN diana mediante el escaner de la molecula diana en busca de sitios de escision de la ribozima que tfpicamente incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, se pueden evaluar las secuencias de ARN cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleotidos que corresponden a la region del gen diana que contiene el sitio de escision para las caractensticas estructurales predichas, como la estructura secundaria, que pueden hacer que la secuencia de nucleotidos sea inadecuada.

Tanto los oligonucleotidos antisentido como las ribozimas utiles como inhibidores de la expresion se pueden preparar por metodos conocidos. Estos incluyen tecnicas para la smtesis qrnmica como, p. ej., por smtesis qrnmica de fosforamadita en fase solida. Alternativamente, se pueden generar las moleculas de ARN antisentido mediante transcripcion in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molecula de ARN. Se pueden incorporar dichas secuencias de ADN en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados, como los promotores de la polimerasa T7 o SP6. Se pueden introducir varias modificaciones a los oligonucleotidos de la descripcion como un medio para aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adicion de secuencias flanqueantes de ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos a los extremos 5' y/o 3' de la molecula, o el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces de fosfodiesterasa dentro del esqueleto del oligonucleotido.

Los oligonucleotidos antisentido, siRNAs, shRNAs y ribozimas de la descripcion se pueden administrar in vivo solos o en asociacion con un vector. En su sentido mas amplio, un “vector” es cualquier vehmulo capaz de facilitar la transferencia del oligonucleotido antisentido, siRNA, shRNA o acido nucleico de la ribozima a las celulas y preferiblemente a las celulas que expresan ROBO4. Preferiblemente, el vector transporta el acido nucleico a las celulas con una reducida degradacion en relacion con el grado de degradacion que dana como resultado la ausencia del vector. En general, los vectores utiles en la descripcion incluyen, pero no se limitan a, plasmidos, fagemidos, virus, otros vehmulos derivados de fuentes virales o bacterianas que se han manipulado mediante la insercion o incorporacion de oligonucleotidos antisentido, siRNA, shRNA o secuencias de acido nucleico de ribozima. Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de acido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, virus de la leucemia murina moloney, virus del sarcoma murino de Harvey, virus del tumor mamario murino y virus del sarcoma de rous; adenovirus, virus adeno-asociado; virus tipo SV40; virus de polioma; virus de Epstein-Barr; virus de papiloma; virus del herpes; virus vaccinia; virus de la polio y virus de ARN como retrovirus. Se pueden emplear facilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la tecnica.

Los vectores vmcos preferidos se basan en virus eucarioticos no citopaticos en los que los genes no esenciales se han reemplazado con el gen de interes. Los virus no citopaticos incluyen retrovirus (p. ej., lentivirus), cuyo ciclo de vida implica la transcripcion inversa del ARN viral genomico en ADN con la integracion proviral posterior en el ADN celular del huesped. Se han aprobado los retrovirus para ensayos de terapia genica en seres humanos. Los mas utiles son aquellos retrovirus que son deficientes en la replicacion (es decir, capaces de dirigir la smtesis de las protemas deseadas, pero incapaces de fabricar una partmula infecciosa). Tales vectores de expresion retroviral alterados geneticamente tienen una utilidad general para la transduccion de alta eficiencia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos estandar para producir retrovirus deficientes en la replicacion (que incluyen las etapas de incorporacion de material genetico exogeno dentro de un plasmido, transfeccion de una lmea celular de empaquetamiento con el plasmido, produccion de retrovirus recombinantes por la lmea celular de empaquetamiento, recogida de partmulas virales del medio de cultivo tisular e infeccion de las celulas diana con partmulas virales) en Kriegler, 1990 y en Murry, 1991).

Los virus preferidos para ciertas aplicaciones son los adenovirus y los virus adeno-asociados (AAV) que son virus de ADN de doble cadena que ya se han aprobado para uso humano en terapia genica. Realmente se conocen 12 serotipos de AAV diferentes (AAV1 a 12), cada uno con diferentes tropismos celulares (Wu, Z Mol Ther 2006; 14: 316­ 27). Los AAV recombinantes se derivan de los parvovirus dependientes AAV2 (Choi, VW J Virol 2005; 79: 6801-07). Los virus adeno-asociados de tipo 1 a 12 se pueden disenar para ser deficientes en la replicacion y ser capaces de infectar una amplia gama de tipos y especies celulares (Wu, Z Mol Ther 2006; 14: 316-27). Ademas tiene ventajas como estabilidad en disolvente lipfdico y en calor; altas frecuencias de transduccion en celulas de diversos linajes que incluyen celulas hematopoyeticas; y ausencia de inhibicion de la superinfeccion permitiendo asf multiples series de transducciones. Segun se informa, el virus adeno-asociado puede integrarse en el ADN celular humano de una manera espedfica de sitio, minimizando asf la posibilidad de mutagenesis de insercion y la variabilidad de la expresion del gen insertado caractenstica de la infeccion retroviral. Ademas, se han seguido las infecciones por virus adeno-asociados de tipo salvaje en cultivo tisular durante mas de 100 pases en ausencia de presion selectiva, lo que implica que la integracion genomica del virus adeno-asociado es un evento relativamente estable. El virus adeno-asociado tambien puede funcionar de forma extracromosomica.

Otros vectores incluyen vectores plasirndicos. Los vectores plasirndicos se han descrito ampliamente en la tecnica y son bien conocidos por los expertos en la materia. Vease p. ej. Sambrook et al., 1989. En los ultimos anos, los vectores plasirndicos se han usado como vacunas de ADN para administrar genes que codifican antfgenos a celulas in vivo. Son particularmente ventajosos para esto porque no tienen los mismos problemas de seguridad que muchos de los vectores virales. Estos plasmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la celula huesped, pueden expresar un peptido a partir de un gen operativamente codificado dentro del plasmido. Algunos plasmidos de uso comun incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript. Son bien conocidos por los expertos en la tecnica otros plasmidos. Adicionalmente, se pueden disenar plasmidos a medida usando enzimas de restriccion y reacciones de ligacion para eliminar y anadir fragmentos espedficos de ADN. Los plasmidos se pueden distribuir por una variedad de rutas. Por ejemplo, el plasmido de ADN se puede inyectar por ruta intramuscular, intradermica, subcutanea u otras rutas. Los plasmidos se pueden administrar en una solucion acuosa, secarse sobre partmulas de oro o en asociacion con otro sistema de distribucion de ADN que incluye, pero no se limita a, liposomas, dendnmeros, cocleato y microencapsulacion.

En una realizacion preferida, el oligonucleotido antisentido, siRNA, shRNA o secuencia de acido nucleico de ribozima esta bajo el control de una region reguladora heterologa, p. ej., un promotor heterologo.

El agente de la descripcion se puede administrar en forma de una composicion farmaceutica, como se define a continuacion. Preferiblemente, dicho agente en una cantidad terapeuticamente eficaz. Por una “cantidad terapeuticamente eficaz” se entiende una cantidad suficiente del agente para tratar la enfermedad con una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico. Se entendera que el uso diario del agente o la composicion farmaceutica que lo comprende se decidira por el medico que lo atiende dentro del alcance de un buen criterio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier sujeto en particular dependera de una variedad de factores que incluyen el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el tiempo de administracion, ruta de administracion y velocidad de excrecion del agente espedfico empleado; la duracion del tratamiento; farmacos usados en combinacion o coincidentes con el agente espedfico empleado y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas. Por ejemplo, esta bien dentro de la habilidad de la tecnica empezar con dosis del agente a niveles inferiores que los requeridos para alcanzar el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logra el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria del agente puede variar en un amplio rango de 0,01 a 1000 mg por adulto y por dfa. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del agente para el ajuste sintomatico de la dosis al sujeto a tratar. Un medicamento tfpicamente contiene de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Normalmente se suministra una cantidad eficaz del farmaco a un nivel de dosis de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dfa, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por dfa.

En una realizacion particular, el agente de la presente descripcion se puede usar en combinacion con bifosfonatos y/o con un anticuerpo anti-RANKL (p. ej., denosumab).

El agente de la descripcion puede formularse asf en composiciones farmaceuticas que comprenden ademas un transportador, diluyente, adyuvante o vetuculo farmaceuticamente aceptables. En una realizacion, la presente descripcion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un agente de la descripcion descrito anteriormente y un transportador, diluyente, adyuvante o vehuculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende una cantidad eficaz de un agente de la presente descripcion o una sal farmaceuticamente aceptable de este y un transportador, diluyente, adyuvante o vehfculo farmaceuticamente aceptable. Los transportadores farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, diluyentes, excipientes o transportadores farmaceuticos seleccionados adecuadamente con respecto a la forma de administracion prevista y consistentes con las practicas farmaceuticas convencionales.

Un transportador farmaceuticamente aceptable puede contener ingredientes inertes que no inhiban indebidamente la actividad biologica del agente. Los transportadores farmaceuticamente aceptables deben ser biocompatibles, p. ej., no toxicos, no inflamatorios, no inmunogenicos o desprovistos de otras reacciones no deseadas o efectos secundarios en cuanto a la administracion a un sujeto. Se pueden emplear tecnicas estandar de formulacion farmaceuticas.

El transportador, adyuvante o vehfculo farmaceuticamente aceptable, como se usa en esta memoria, incluye cualquiera y todos los disolventes, diluyentes u otros vehfculos, asistentes de dispersion o suspension lfquidos, agentes tensioactivos, agentes isotonicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes solidos, lubricantes y similares, segun sea adecuado para la forma de dosificacion particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Decimosexta edicion, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) describe diversos transportadores usados en la formulacion de composiciones farmaceuticamente aceptables y tecnicas conocidas para la preparacion de estos. Excepto en la medida en que cualquier medio transportador convencional sea incompatible con los compuestos descritos en esta memoria, como producir cualquier efecto biologico indeseable o interaccionar si no de manera perjudicial con cualquier otro componente(s) de la composicion farmaceuticamente aceptable, se contempla su uso dentro del alcance de esta descripcion.

Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como transportadores farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores ionicos, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protemas sericas (como albumina serica humana), sustancias tamponantes (como twin 80, fosfatos, glicina, acido sorbico o sorbato potasico), mezclas de gliceridos parciales de acidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos (como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato disodico, hidrogeno fosfato potasico, cloruro sodico o sales de zinc), sflice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, poliacrilatos, ceras, polfmeros bloque de polietileno-polioxipropileno, metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, grasa de lana, azucares como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones como almidon de mafz y almidon de patata; celulosa y sus derivados como carboxi metilcelulosa sodica, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon; aceite de cartamo; aceite de sesamo; aceite de oliva; aceite de mafz y aceite de soja; glicoles como un propilen glicol o polietilen glicol; esteres como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes como hidroxido magnesico e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua libre de pirogenos; solucion salina isotonica; solucion de Ringer; alcohol etflico y soluciones tamponantes de fosfato, asf como otros lubricantes compatibles no toxicos como lauril sulfato sodico y estearato de magnesio, asf como agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes tambien pueden estar presentes en la composicion de acuerdo con el criterio del formulador.

Las composiciones descritas en esta memoria se pueden administrar por via oral, parenteral, por inhalacion de espray, topica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por via de un deposito implantado dependiendo de la gravedad de la enfermedad a tratar. El termino “parenteral” como se usa en esta memoria incluye, pero no se limita a, inyeccion o tecnicas de infusion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional e intracraneal.

Las formas inyectables esteriles de las composiciones descritas en este memoria pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con tecnicas conocidas en la tecnica que usan agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspension. La preparacion inyectable esteril tambien puede ser una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vehfculos y solventes aceptables que se pueden emplear son agua, solucion de Ringer y solucion de cloruro sodico isotonico. Ademas, los aceites fijos esteriles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspension. Para este proposito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave que incluye mono- o di-gliceridos sinteticos. Los acidos grasos, como acido oleico y sus derivados gliceridos son utiles en la preparacion de inyectables, igual que los aceites farmaceuticamente aceptables naturales, como aceite de oliva o aceite de castor, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas suspensiones o soluciones de aceite tambien pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comunmente en la formulacion de formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos comunmente usados, como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comunmente en la fabricacion de formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables solidas, lfquidas u otras tambien se pueden usar para los fines de la formulacion.

Las composiciones farmaceuticas descritas en esta memoria se pueden administrar por via oral en cualquier forma de dosificacion oral aceptable que incluye, pero no se limita a, capsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los transportadores comunmente usados incluyen, pero no se limitan a, lactosa y almidon de mafz. Se pueden tambien anadir tfpicamente agentes lubricantes como el estearato de magnesio. Para la administracion oral en forma de capsula, los diluyentes utiles incluyen lactosa y almidon de mafz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el agente se combina con agentes emulsionantes y de suspension. Si se desea, se pueden anadir tambien ciertos agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.

Alternativamente, las composiciones farmaceuticas descritas en esta memoria se pueden administrar en forma de supositorios para administracion rectal. Estos se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que sea solido a temperatura ambiente pero lfquido a temperatura rectal y, por lo tanto, se fundira en el recto para liberar el medicamento. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a, manteca de cacao, cera de abeja y polietilen glicoles.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para probar si un paciente con cancer tiene riesgo de tener metastasis osea que comprende i) determinar el nivel de expresion de ROBO4 en una muestra obtenida de dicho paciente ii) comparar el nivel determinado en la etapa i) con un nivel de referencia predeterminado e iii) concluir que el paciente tiene una alto riesgo de tener metastasis osea cuando el nivel determinado en la etapa i) es mas alto que el nivel de referencia predeterminado.

Como se usa en esta memoria, el termino “muestra” se refiere a una muestra aislada del tumor primario del paciente o puede consistir en una coleccion de celulas tumorales aisladas de la muestra de sangre obtenida del paciente.

La determinacion del nivel de expresion de ROBO4 se puede evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de metodos bien conocidos.

Por ejemplo, la expresion del gen que codifica ROBO4 se evalua analizando la expresion del transcrito de ARNm o precursores de ARNm, como el ARN naciente, de dicho gen. Dicho analisis se puede evaluar preparando ARNm/ADNc a partir de celulas en la muestra obtenida del paciente e hibridar el ARNm/ADNc con una sonda. El ARNm/ADNc preparado se puede usar en ensayos de hibridacion o de amplificacion que incluyen, pero no se limitan a, analisis de Southern o de Northern, analisis de reaccion en cadena de la polimerasa, como PCR cuantitativa (TaqMan) y arrays de sondas como GeneChip (TM) DNA Arrays (AFF YMETRIX). De manera ventajosa, el analisis del nivel de expresion de ARNm transcrito a partir del gen que codifica ROBO4 implica el proceso de amplificacion del acido nucleico. p. ej., por RT-PCR (la realizacion experimental expuesta en la Patente de EE.UU. N° 4.683.202), reaccion en cadena de la ligasa (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , vol. 88, p: 189-193, 1991), replicacion de secuencia autosostenida (GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 57, p: 1874-1878, 1990), sistema de amplificacion transcripcional (KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p: 1173-1177, 1989), Replicasa Q-Beta (LIZARDI et al., Biol. Technology, vol. 6, p: 1197, 1988), replicacion de cfrculo rodante (patente de EE.UU. N° 5.854.033) o cualquier otro metodo de amplificacion de acido nucleico, seguido de la deteccion de las moleculas amplificadas usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica. Estos esquemas de deteccion son especialmente utiles para la deteccion de moleculas de acido nucleico si tales moleculas estan presentes en numeros muy bajos. Como se usa en esta memoria, los cebadores de amplificacion se definen como una par de moleculas de acido nucleico que se pueden aparear con las regiones 5' o 3' de un gen (cadenas mas y menos, respectivamente, o viceversa) y contener una region corta en el medio. En general, los cebadores de amplificacion son de aproximadamente 10 a 30 nucleotidos de longitud y flanquean una region de aproximadamente 50 a 200 nucleotidos de longitud. Bajo condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificacion de una molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos flanqueada por los cebadores.

En otra realizacion preferida, el nivel de expresion de ROBO4 en la muestra se puede evaluar determinando el numero de celulas cancerosas que expresan ROBO4 y/o el nivel de ROBO4 en la superficie de las celulas cancerosas. Son bien conocidos en la tecnica los metodos estandar para detectar la expresion de un marcador espedfico de superficie en la superficie celular. Tfpicamente, la etapa que consiste en medir el nivel de ROBO4 en la superficie de la celula cancerosa puede consistir en recoger la poblacion de celulas cancerosas y usar al menos una pareja de union diferencial dirigido contra el ROBO4, en donde las celulas cancerosas se unen a traves de las parejas de union a ROBO4. Como se usa en esta memoria, el termino “pareja de union dirigido contra ROBO4” se refiere a cualquier molecula (natural o no) que es capaz de unirse a ROBO4 con alta afinidad. Dichas parejas de union incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, aptameros y peptidos. Las parejas de union pueden ser anticuerpos que pueden ser policlonales o monoclonales, preferiblemente monoclonales, dirigidos espedficamente contra ROBO4.

Los anticuerpos policlonales de la descripcion o un fragmento de estos se pueden generar de acuerdo con metodos conocidos administrando el antigeno o epttopo apropiado a un animal huesped seleccionado, p. ej., de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Se pueden usar diversos adyuvantes conocidos en la tecnica para potenciar la produccion de anticuerpos. Aunque los anticuerpos utiles en la practica de la descripcion pueden ser policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales o un fragmento de estos se pueden preparar y aislar usando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo a partir de lmeas celulares en cultivo. Las tecnicas para la produccion y aislamiento incluyen, pero no se limitan a, originalmente la tecnica de hibridoma; la tecnica de hibridoma de celulas B humanas y la tecnica de hibridoma EBV.

Las parejas de union de la descripcion como anticuerpos o aptameros se pueden marcar con una molecula o sustancia detectable, como preferentemente una molecula fluorescente o una molecula radiactiva o cualquier otro marcador conocido en la tecnica. Se conocen marcadores en la tecnica que proporcionan generalmente (ya sea directa o indirectamente) una senal. Como se usa en esta memoria, el termino “marcado” con respecto al anticuerpo o aptamero pretende abarcar el marcaje directo del anticuerpo o aptamero por acoplamiento (es decir, union ffsica) de una sustancia detectable, como un fluoroforo [p. ej., isotiocianato de fluorescema (FITC) o ficoeritrina (PE) o Indocianina (Cy5)] o un agente radiactivo al anticuerpo o aptamero, asf como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable. Un anticuerpo o aptamero de la descripcion se puede marcar con una molecula radiactiva por cualquier metodo conocido en la tecnica. Las moleculas radiactivas incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, atomo radiactivo para estudios de centellograffa como I123, I124, I n l l l , Re186, Re188. Preferiblemente, los anticuerpos ya estan conjugados con un fluoroforo (p. ej., conjugado con FITC y/o conjugado con PE).

Los ensayos mencionados anteriormente pueden implicar la union de las parejas de union (es decir, anticuerpos o aptameros) a un soporte solido. La superficie solida podna ser una placa de microtitulacion recubierta con la pareja de union. Despues de la incubacion de la muestra, las celulas cancerosas que expresan ROBO4 se unen espedficamente a la pareja de union. Alternativamente, las superficies solidas pueden ser perlas, como perlas activadas, perlas magneticamente sensibles. Las perlas pueden estar hechas de diferentes materiales que incluyen, pero no se limitan a, vidrio, plastico, poliestireno y acnlico. Ademas, las perlas estan preferiblemente marcadas con fluorescencia. En una realizacion preferida, las perlas fluorescentes son aquellas contenidas en tubos TruCount(TM), disponibles en Becton Dickinson Biosciences, (San Jose, California). De acuerdo con la descripcion, los metodos de citometna de flujo son los metodos preferidos para medir el nivel de ROBO4 en la superficie de la celula. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se puede por lo tanto usar la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS).

En una realizacion, los valores de referencia predeterminados pueden ser valores mdice o se pueden derivar de uno o mas algoritmos de prediccion de riesgo o indices computados para el desarrollo de metastasis osea. Un valor de referencia predeterminado puede ser relativo a un numero o valor derivado de estudios poblacionales. Dichos valores de referencia predeterminados se pueden derivar de analisis estadfsticos y/o datos de prediccion de riesgo de poblaciones obtenidos de algoritmos matematicos e indices computados de desarrollo de metastasis. En una realizacion de la presente descripcion, el valor de referencia predeterminado se deriva del nivel del expresion de ROBO4 en una muestra control derivada de uno o mas sujetos que no desarrollaron metastasis osea. En otra realizacion, dichos sujetos se monitorizan y/o se reevaluan periodicamente durante un periodo de tiempo diagnosticamente relevante (“estudios longitudinales”) para verificar despues de dicha prueba la ausencia continua de metastasis osea. Dicho periodo de tiempo puede ser un ano, dos anos, de dos a cinco anos, cinco anos, de cinco a diez anos, diez anos, o de diez a mas anos desde la fecha de prueba inicial para la determinacion del valor de referencia. Ademas, la medicion retrospectiva del nivel de expresion de ROBO4 en bancos historicos de muestras de sujetos correctamente almacenadas se pueden usar para establecer estos valores de referencia predeterminados, lo que acorta el tiempo de estudio requerido. Tfpicamente, los niveles de ROBO4 en un paciente con riesgo de tener metastasis osea se consideran mas altos que el valor de referencia obtenido de pacientes que nunca desarrollan metastasis osea.

La invencion se ilustrara adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deben interpretar de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion.

Figuras:

Figura 1: La expresion de ROBO4 en tumores de mama primarios se asocia con un peor pronostico en la supervivencia sin recafda. (A) Estimaciones de Kaplan-Meier para tasas de supervivencia libre de recafdas en 254 pacientes con cancer de mama, de acuerdo con el estado de ROBO1. (B) lo mismo que en (A), pero los casos se categorizan de acuerdo con el estado de ROBO4. (C) Tasas de supervivencia libre de recafda en 137 pacientes con cancer de mama con ganglios positivos (pN+) de acuerdo con el estado de ROBO4. (D) lo mismo que en (C) pero para la supervivencia libre de metastasis osea.

Figura 2: Se inocularon transfectantes Sh- o Sc-Robo4 en la arteria de la cola de los animales. El dfa 28 despues de la inoculacion de celulas tumorales, se analizaron las lesiones oseas mediante radiograffa, histologfa y tincion TRAP.

Las imagenes representativas de las lesiones oseas en cada grupo se muestran en el lado izquierdo. Los datos cuantitativos se muestran en el lado derecho.

Figura 3: Formacion de osteoclastos in vitro de celulas de medula osea murinas tratadas con MCSF+RANKL y el medio condicionado de celulas de cancer de mama silenciadas para ROBO1 o ROBO4. Los osteoclastos maduros se cuantificaron como celulas TRAP-positivas multinucleadas. Se muestran imagenes representativas de osteoclastos maduros para cada grupo.

Figura 4: (A) Ensayo de migracion celular. Las celulas de cancer de mama silenciadas para ROBO1 (lado izquierdo) o ROBO4 (lado derecho) se cargaron en insertos con una membrana porosa (camara superior) y el quimioatractante (suero) se coloco en pocillos de una placa de acompanamiento (camara inferior). Despues de 6 h de incubacion a 37°C, se eliminaron las celulas que no migraron y las celulas que migraron sobre la superficie inferior de los insertos se fijaron, tineron y se contaron al microscopio. (B) Ensayo de invasion celular. Para la invasion celular, los insertos se recubrieron con membrana basal Matrigel. Despues de 24 h de incubacion a 37°C, se eliminaron las celulas no invasoras y se realizo el resto de los experimentos como se describe en (A). (C) Efectos de concentraciones crecientes de anticuerpos anti-Robol (izquierda) o anti-Robo4 (derecha) sobre la invasion de celulas de cancer de mama osteotropicas B02. Recuadros: efectos de las concentraciones mas altas de anticuerpos anti-Robol y anti-Robo4 en comparacion con los anticuerpos control negativo de isotipo emparejado.

Figura 5: (A) Siete dfas despues de la inoculacion intraarterial de celulas de cancer de mama transfectantes Sh-Robo1/4 o B02 parentales se sacrificaron los animales, se recogieron las extremidades posteriores y se enjuago la medula osea, como se muestra en el dibujo. Las celulas de medula osea cultivadas se colocaron bajo seleccion de antibiotico, lo que permite el crecimiento selectivo de celulas tumorales resistentes a antibiotico. Las colonias de celulas tumorales se fijaron, tineron y se contaron. Se muestran imagenes representativas de cada grupo. (B) Lo mismo que en (A) pero para la inoculacion intratibial de celulas tumorales transfectadas Sc- y Sh-Robo4. (C) Ensayo de formacion de colonias en agar blando. El silenciamiento de ROBO4 disminuye el numero y tamano de las colonias.

Figura 6: Estimaciones de Kaplan-Meier para tasas de supervivencia sin recafda en 254 pacientes con cancer de mama, de acuerdo con el estado de ROBOl y ROBO4. P = 0,058 por prueba de log-rank. El numero total de eventos de metastasis (numero de eventos) en cada subgrupo se muestra en la tabla inserta.

Figura 7: Asociacion entre la angiogenesis tumoral y el silenciamiento de ROBO1 o ROBO4 en celulas tumorales. (A) Analisis inmunohistoqmmico de xenoinjertos tumorales Sc-ROBO1 y Sh-ROBO1 en el dfa 50 despues de la inoculacion de celulas tumorales, usando un anticuerpo anti-CD31 que reconoce espedficamente celulas endoteliales murinas. Se cuantifico el numero de vasos sangumeos positivos para CD31 dentro de los tumores. Las flechas muestran los vasos sangumeos. ** P < 0,01. (B) Lo mismo que en (A), pero para los xenoinjertos tumorales Sc-ROBO4 y Sh-ROBO4. * P < 0,05.

Figura 8: Deteccion in situ de osteoclastos despues de la tincion con fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) de la metafisis tibial de patas metastasicas de animales inoculados intratibialmente con celulas tumorales transfectadas con Sh- o Sc-Robo4. Las imagenes representativas se muestran a la izquierda. Los osteoclastos se tinen de rojo (flecha). La relacion superficie relativa de osteoclasto (OC) con respecto a la superficie del hueso se expreso en porcentaje. **, P < 0,01 en comparacion con el grupo Sc-Robo4.

Figura 9: El tratamiento de celulas de cancer de mama B02 humanas con un anticuerpo policlonal dirigido contra Robo4 inhibe la formacion de micrometastasis de medula osea en animales.

Ejemplo 1:

Materiales & Metodos

Pacientes

Las caractensticas clmicas y biologicas de las cohortes de pacientes con cancer de mama se han descrito en otras partes (Berthier et al., 2010). La mediana de seguimiento de las cohortes de pacientes del Hospices Civils de Lyon (n = 254) y del hospital Rene Hughenin (n = 456) fue de 54 y 120,5 meses, respectivamente.

RT-PCR a tiempo real

Se extrajo ARN total de tumores de mama humanos y de medula osea murina usando el reactivo Trizol (Sigma). Para eliminar cualquier contaminacion de ADN genomico, el ARN total se trato con DNAsa I libre de RNAsa y se purifico usando microcolumnas RNeasy (Qiagen). Se verifico la calidad del ARN usando un Agilent Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies). Se sintetizo el ADNc usando el kit iScript cDNA Synthesis (Biorad). Las reacciones de PCR se realizaron con el kit SYBR® Green qPCR (Life technologies) en placas de 96 pocillos en un sistema Mastercycler EP (Realplex2, Eppendorf, hamburg-Eppendorf, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La r T-PCR a tiempo real se llevo a cabo con una etapa inicial de 2 minutos a 95°C seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C, 15 segundos a la Tm (mL32: 58°C, mSlit2: 64°C, TBP: 67°C, Robo1: 63°C, Robo4: 67°C) y 20 segundos a 72°C. La expresion de ROBO1 y ROBO4 se normalizo con TBP. Slit2 murino se normalizo con mL32.

Lmeas celulares, cultivo celular y transfeccion.

La lmea celular de cancer de mama B02 humana es una subpoblacion de la lmea cancerosa MDA-MB-231 que se selecciono por la alta eficacia con la que metastatiza en hueso en animales (Peyruchaud et al., 2003). Aqu se uso un subclon que expresaba Flp (MDA-MB-231/B02-Frt11), que se habfa generado previamente (Bruijs et al., 2007), para los experimentos de transfeccion celular.

Los ARNs de horquilla pequena (ShRNA) dirigidos contra el ARNm de ROBO1 humano y las secuencias codificadas correspondientes (ScRNA) se disenaron con el Si Designer Tool (Promega). Los oligonucleotidos usados fueron los siguientes: ShRNA directo, 5'-ACCgCAgTACTAAgggAA-CAATAAgTTCTCTATTgTTCCCTTAgTACTgCTTTTTC-3'; ShRNA inverso, 5'-TgCAgAAAAAgCAg-TACTAAgggAACAATAgAgAACTTATTgTTCCCTT-AgTACTg-3'. Los shRNAs y los correspondientes duplex codificados se sintetizaron con el kit de puromicina psiSTRIKE (Promega) bajo el promotor U6. Los plasmidos se transfectaron en celulas B02-Frt usando el reactivo Transfast (Promega). Las celulas se cultivaron durante 2 semanas en presencia de puromicina (2 |ig/ml, PAA) y los clones se aislaron usando cilindros de clonaje.

Los shRNAs dirigidos al ARNm de ROBO4 y su correspondiente control ScRNA se disenaron con las herramientas de diseno de siRNA (Genscript) y se clonaron en el vector pRNA-U6.1/zeocin (Genscript). Los oligonucleotidos usados fueron los siguientes: ShRNA directo, 5'-GAGCAGAGAAGAGTGACGA-3'; ShRNA inverso, 5'-TCTTACACGGCCTTGTTCA-3'. Despues de la transfeccion, las celulas se cultivaron durante 3 semanas en presencia de zeocina (800 |ig/ml, Life technologies) y se aislaron los clones usando cilindros de clonacion. Los clones silenciados para ROBO1 y ROBO4 y sus controles respectivos se seleccionaron entonces mediante transferencia de Western.

Transferencia de Western

Los extractos celulares se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida en gradiente del 4%-12% (Life technologies) y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Billerica, MA). Se usaron anticuerpos contra Robol (Ab7279; AbCam; dilucion 1:300), Robo4 (Ab10547, AbCam; dilucion 1:500), a-tubulina (Sigma; dilucion 1:2.000), Akt (#9272, Cell signaling; dilucion 1:2.000), fosfo-AkT (#9271S, Cell signaling; dilucion 1:2.000), Src (clon GD11, Millipore; dilucion 1:500), fosfo-Src (clon 9A6, Millipore; dilucion 1:500) y ciclina D1 (clon EPR2241, Millipore; dilucion 1:10.000) para la inmunotransferencia de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Despues de la incubacion con anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios anti-conejo y antiraton de burro conjugados con peroxidasa de rabano (HRP) (Amersham; dilucion 1:2.000) y luego se realizo la inmunotincion con el sistema de deteccion de quimioluminiscencia aumentada (ECL) (Perkin Elmer).

Ensayos de migracion e invasion celular

Los experimentos se llevaron a cabo en placas de cultivo celular de 24 pocillos con insertos de tamano de poro de 8 |im de diametro, como se describio previamente (Zhang et al., 2007; Fradet et al., 2011). Para los ensayos de invasion celular, los insertos se recubrieron con 100 |il de membrana basal Matrigel (0,3 mg/ml). Se resuspendieron las celulas tumorales parentales o las transfectantes (1,6 X 105 celulas/ml) en medio de cultivo que contema albumina serica bovina al 0,1% (p/v) y se cargaron 300 |il de esta suspension celular en cada inserto (camara superior). Para los experimentos con anticuerpos anti-Robo1 (clon 1F8, Sigma) y anti-Robo4 (ab10547, Abcam), cada uno de estos anticuerpos se preincubo 90 minutos a 37°C con celulas tumorales antes de agregarlas a las camaras superiores. El quimioatractante [suero de ternera fetal (v/v) al 10%] se coloco en la camara inferior (750 |il/pocillo). Para los experimentos de migracion e invasion celular se incubaron las placas durante 6 h a 24 h a 37°C en un incubador de CO2 al 5%, respectivamente. Despues de la incubacion, los insertos se recogieron, se eliminaron las celulas que no migraron y las celulas que migraron en la superficie inferior de los insertos se fijaron y tineron con cristal violeta. Se contaron entonces las celulas bajo el microscopio.

Animales

Los ratones inmunocomprometidos NMRI y Balb/c de cuatro semanas hembras y los ratones OF1 macho se compraron en Charles River Laboratories (St. Germain sur l'Arbresle, Francia). Todos los procedimientos que implican animales, que incluyen su alojamiento y su cuidado, el metodo mediante el cual se sacrificaron, y los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con un codigo de practica establecido por el comite de etica local de la Universidad de Lyon.

Estudios de animales

Se llevaron a cabo experimentos de xenoinjerto de tumor ortotopico en ratones inmunodeficientes NMRI, como se describio anteriormente (Fradet et al., 2011). Se inyectaron ratones desnudos hembra de cuatro semanas de edad en la almohadilla de grasa de la cuarta glandula mamaria con un conjunto de transfectantes (106 celulas en 50 |il de PBS). Al final de los protocolos, los ratones se sacrificaron y se recogieron los tumores, se pesaron y se prepararon para la inmunohistoqmmica.

Se realizaron experimented de xenoinjerto de tumores intraoseos en ratones hembra Balb/c desnudos, como se describio anteriormente (Zhang et al., 2007). Brevemente, se perforo un pequeno orificio con una aguja esteril de calibre 30 a traves de la meseta tibial con la rodilla flexionada. Usando una nueva aguja esteril ajustada a una jeringa Hamilton esteril de 50 ml, se inyecto una unica suspension celular (105 celulas en 30 |il de PBS) en la cavidad de la medula osea. Se monitorizo la progresion de las lesiones osteolfticas mediante radiograffa de animales anestesiados usando un sistema de rayos X en gabinete.

Se llevaron a cabo experimentos de metastasis osea en ratones hembra Balb/c desnudos, como se describio anteriormente (Fradett et al., 2011; Peyruchaud et al., 2003; Zhang et al., 2007). Los transfectantes (5 X 105 celulas en 100 |il de PBS) se inyectaron en la arteria de la cola de ratones desnudos anestesiados. Se tomaron radiograffas como se describio anteriormente. Se identificaron las lesiones osteolfticas en las radiograffas como lesiones radiolucidas en el hueso. El area de las lesiones osteolfticas se midio usando un sistema de analisis de imagen computerizado y el grado de destruccion osea por pata se expreso en miftmetros cuadrados.

Histologfa osea, histomorfometna e inmunohistoqmmica

La histologfa osea y el analisis histomorfometrico de las secciones de tejido oseo se realizaron como se describio anteriormente (Fradet et al., 2011; Peyruchaud et al., 2003; Zhang et al., 2007). Las mediciones histomorfometricas [las relaciones de volumen oseo (BV)/volumen tisular (TV) y volumen tumoral (TuV)/volumen de tejido blando (STV)] se realizaron en una zona estandar de la metafisis tibial, situada a 0,5 mm de la placa de crecimiento, que incluye hueso cortical y trabecular. La relacion BV/TV representa el porcentaje de tejido oseo. La relacion TuV/STV representa el porcentaje de tejido tumoral. La deteccion in situ de osteoclastos se realizo en secciones intermedias longitudinales embebidas en parafina tenidas con fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) de metafisis tibiales con el uso de un kit comercial (Sigma). La superficie de reabsorcion del osteoclasto se calculo como la relacion entre la superficie osea trabecular TRAP-positiva y la superficie osea trabecular total en la interfase tumor-hueso. Para la inmunodeteccion de vasos sangumeos, se incubaron secciones de tumor con un anticuerpo policlonal de conejo anti-CD31 (AnaSpec) seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo unido a HRP. Se cuantifico la densidad de microvasos tumorales como se describio anteriormente (Fradet et al., 2011; Peyruchaud et al., 2003).

Ensayo de osteoclastogenesis

Los experimentos se realizaron como se describio anteriormente (Fradet et al., 2011). Brevemente, se cultivaron celulas de medula osea de extremidades posteriores de ratones machos OF1 de seis semanas de edad en medio a-MEM que contema suero de ternera fetal al 10% (v/v) suplementado con M-CSF (20 ng/ml) y RANK-L (200 ng/ml) en presencia de medio condicionado de transfectantes (20 |ig/ml). Despues de 7 dfas, se enumeraron los osteoclastos maduros bajo un microscopio en base al numero de nucleos (mas de tres nucleos) y la actividad TRAP. Los resultados se expresaron como el numero de osteoclastos por pocillo.

Ensayo de micrometastasis de medula osea ex-vivo

Se inyectaron transfectantes Sh/Sc-Robo y celulas de cancer de mama B02 parentales en la arteria de la cola de los animales y los animales se sacrificaron el dfa 7 despues de la inoculacion de las celulas tumorales. Se recolectaron las extremidades posteriores y se cortaron ambos extremos de tibias y femures y se enjuago la medula osea con medio de cultivo usando una aguja de calibre 23. Luego se sembraron las celulas de medula osea en placas de 6 pocillos y se cultivaron en medio completo. Despues de 1 dfa de cultivo, las celulas de medula osea se colocaron bajo seleccion de antibiotico durante 2 semanas, lo que permite el crecimiento selectivo de celulas tumorales resistentes al antibiotico. Se fijaron las colonias de celulas tumorales, se tineron con cristal violeta y se contaron.

Matriz de citoquinas

Se uso una micromatriz comercial de protemas basada en anticuerpos disenada para detectar 79 factores de crecimiento, citoquinas y quimioquinas (RayBio Human Cytokine Array V, RayBiotech). Las membranas de la matriz se incubaron durante 2 h con el medio condicionado de celulas transfectadas cultivadas (150 |ig/ml). Despues del lavado, las membranas se incubaron con un coctel de 79 anticuerpos biotinilados, y el resto del procedimiento experimental se llevo a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante.

Analisis estadfstico

Todos los datos se analizaron usando el programa informatico StatView (version 5.0; SAS Institute Inc, Cary, NC). Los resultados se informan como media desviacion estandar (SD), como se indica en las leyendas de las figuras y tablas. Con respecto a los estudios preclrnicos, se llevaron a cabo comparaciones por pares mediante la realizacion de una prueba no parametrica U de Mann-Whitney. Con respecto a los datos clrnicos, la distribucion de Robo1 y la expresion de Robo4 en relacion con los parametros de pronostico habituales se llevo a cabo usando la prueba de Mann-Whitney o de Kruskall-Wallis. La comparacion entre las curvas de Kaplan-Meier se realizo mediante la prueba de log-rank. Se consideraron estadfsticamente significativos los valores de P menores de 0,05.

Resultados

Asociacion de la expresion de ROBO1/ROBO4 con recâ da clmica de cancer de mama.

Anteriormente se selecciono una subpoblacion de la lmea celular de cancer de mama humano MDA-MB-231 (denominada MDA-MB-231/B02) que solo metastatiza en hueso (Peyruchaud et al., 2003). Usando los U133 Affymetrix GeneChips A y B, se han comparado los perfiles de expresion genica de celulas MDA-Mb -231 y MDA-MB-231/B02 y se encontro que las celulas MDA-MB-231/B02 expresan un distintivo genico de metastasis osea (Bellahcene et al., Breast Cancer Res Treat., 101: 135-148, 2007; Garcia et al., Clin Exp Metastasis, 25: 33-42, 2008), que incluye genes de la familia de ROBO/SLIT. Para ser mas precisos, las celulas osteotropicas MDA-MB-231/B02 sobreexpresan ROBO1 y ROBO4 en comparacion con la lmea celular parental. ROBO2 y ROBO3 no se expresaron por celulas MDA-MB-231 y MDA-MB-231/B02. Los ligandos de Robo SLIT2 y, en menor medida, SLIT1 (pero no SLIT3) tambien se expresaron por celulas MDA-MB-231 y MDA-MB-231/B02.

Para investigar la asociacion de la expresion de ROBO1 y ROBO4 con el pronostico del cancer de mama, se examino una cohorte de 254 pacientes en los que no habfa evidencia de metastasis distante en el momento del diagnostico y sin tratamiento previo (Berthier et al., 2010). No se observo ninguna correlacion entre el estado de ROBO1 y las caractensticas clmicas y biologicas en pacientes con cancer de mama (Tabla 1). En sorprendente contraste, hubo una correlacion estadfsticamente significativa entre la expresion de ROBO4 y el estado ganglionar (P = 0,001); se observan con mayor frecuencia altos niveles de ROBO4 en tumores primarios en pacientes que tienen mas de tres ganglios linfaticos positivos (Tabla 1).Para definir los valores pronosticos de la expresion de ROBO1 y ROBO4 en pacientes con cancer de mama, se calcularon las curvas de supervivencia usando el metodo de Kaplan-Meier. Las tasas de supervivencia sin recafda no difirieron significativamente entre los grupos que expresaron altos o bajos niveles de ROBO1. Por el contrario, el numero de recafdas en una mediana de seguimiento de 54 meses en el grupo con altos niveles de expresion de ROBO4 fueron dos veces mas altos que en el grupo con niveles bajos de ROBO4 (32 frente a 15 recafdas, respectivamente; P = 0,009 mediante la prueba de log-rank).

Adicionalmente, el analisis de subgrupos de la cohorte de pacientes de acuerdo con el estatus de ROBO1 y ROBO4 mostro que las recafdas se produjeron con mayor frecuencia en pacientes que teman tumores primarios con altos niveles de ROBO4, independientemente de si los niveles de expresion de ROBO1 eran altos o bajos (P = 0,058). Dado que el estado de los ganglios linfaticos se ha correlacionado previamente con un alto riesgo de metastasis en la cohorte que se analizo (Berthier et al., 2010) y se observo aqrn una correlacion significativa entre la expresion de ROBO4 y el estado ganglionar (Tabla 1), se verifico si el estado ganglionar podna ser un factor de confusion. En pacientes con ganglios linfaticos negativos (pN0), la expresion de ROBO4 no se relaciono con el riesgo de metastasis (no se muestra). Por el contrario, cuando se restringio el analisis a pacientes con ganglios linfaticos positivos (pN+), los altos niveles de ROBO4 se correlacionan con recafdas distantes (P = 0,07 mediante prueba de log-rank) y recafdas oseas (P = 0,018 mediante prueba de log-rank). Por lo tanto, se correlaciono una alta expresion de ROBO4 con un peor pronostico.

El silenciamiento de ROBO1 aumenta, mientras que el silenciamiento de ROBO4 reduce el crecimiento experimental del tumor primario

Para determinar si existe un vinculo entre la expresion de ROBO1/ROBO4 y el crecimiento del tumor dentro de la glandula mamaria del raton se redujeron de forma estable los niveles endogenos de ROBO1 o ROBO4 en celulas de cancer de mama MDA-MB-231/B02 humanas usando la estrategia del ARN de interferencia. El silenciamiento mediado por shRNA redujo los niveles de protema Robo1 en >90% cuando se comparo con lo observado en celulas ScRobo1 transfectadas-codificadas y MDA-MB-231/B02 parentales. Los niveles de Robo4 se mantuvieron sin cambios en las celulas de cancer de mama ShRobo1 y ScRobo1. Luego se implantaron de manera ortotopica un conjunto de transfectantes MDA-MB-231/B02 silenciados para ROBO1 (clones Sh1.32 y Sh1.33) y despues se implantaron de manera ortotopica un conjunto de transfectantes simulados (clones Sc2.1 y Sc2.4) dentro de la glandula mamaria de los ratones inunodeficientes. El analisis de la mediana del tamano del tumor primario demostro que los tumores ShRobo1 eran mas grandes que los tumores ScRobo1. El analisis inmunohistoqmmico de los xenoinjertos tumorales con un anticuerpo anti-CD31 que reconoce espedficamente las celulas endoteliales murinas mostro que el silenciamiento de ROBO1 dio lugar a un aumento sustancial de la densidad de microvasos en los tumores ShRobo1 en comparacion con los tumores ScRobo1. Los niveles de VEGF producidos por las celulas de cancer de mama ShRobo1 tambien aumentaron estadfsticamente de manera significativa en comparacion con celulas ScRobo1 y parentales B02 (datos no mostrados). En marcado contraste, la implantacion ortotopica dentro de la glandula mamaria de raton de celulas de cancer de mama B02 silenciadas para ROBO4 dio lugar a una disminucion de 3 veces en el tamano medio de los tumores primarios ShRobo4 en comparacion con los tumores ScRobo4. El tamano mas pequeno de los tumores ShRobo4 se asocio con una disminucion de la angiogenesis tumoral, segun lo juzgado mediante la inmunotincion con CD31. Sin embargo, los niveles de VEGF producidos por las celulas de cancer de mama ShRobo4 y ScRobo4 fueron similares. En conjunto, estos datos sugirieron que Robo1 y Robo4 expresados en celulas tumorales teman funciones antagonicas; Robo1 y Robo4, siendo respectivamente, reguladores negativos y positivos del crecimiento del tumor primario.

Robo1 y Robo4 regulan de manera diferente la extension osea del cancer de mama y la formacion de lesiones osteolfticas

Para probar el papel de Robol y Robo4 en la metastasis osea se inyectaron un conjunto de transfectantes MDA-MB-231/B02 silenciados para ROBO1 (clones Sh1.32 y Sh1.33) o un conjunto de transfectantes silenciados para ROBO4 (clones Sh2.6 y Sh4.5) o conjuntos de los transfectantes simulados para ROBO1 (clones Sc2.1 y Sc2.4) y ROBO4 (clones Sc1.2 y Sc2.2) respectivos en la arteria de la cola de ratones inmunodeficientes. Usando este modelo animal, el analisis radiografico en el dfa 28 despues de la inyeccion revelo que aumento la extension de las lesiones osteolfticas en las extremidades posteriores de los animales con tumores shRobol, siendo un 40% mas grande que la de los animales con tumores ScRobol transfectados simulados. Esta diferencia fue acompanada de una marcada reduccion de la relacion BV/TV (que indica una mayor destruccion osea) y un aumento de 3 veces en la relacion TB/STV (una medida de la carga de tumor oseo) en comparacion con los ratones que tienen tumores ScRobol transfectados simulados, segun lo determinado mediante examen histomorfometrico. El silenciamiento de ROBO4 dio lugar a un modesto aumento en la extension de las lesiones osteolfticas en animales portadores de tumores ShRobo4 en comparacion con ratones portadores de tumores ScRobo4 transfectados simulados.

Sin embargo, el analisis histomorfometrico de las extremidades posteriores con metastasis mostro que las relaciones BV/TV y TB/STV no difirieron estadfsticamente de forma significativa entre los dos grupos de animales. Curiosamente, la tincion de fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) de secciones de tejido oseo de patas metastasicas de ratones con tumores ShRobo4 mostraron que las superficies de reabsorcion de osteoclastos activos en la interfase tumorhueso aumentaron sustancialmente en comparacion con los tumores ScRobo4. Por el contrario, las superficies de reabsorcion de osteoclastos activos en patas metastasicas de ratones portadores de tumores ShRobol o ScRobol fueron similares. Estas observaciones apuntaron a un papel espedfico de Robo4 derivado del tumor en la regulacion de la destruccion osea mediada por osteoclastos, mientras que Robol expresado en celulas tumorales se asocio con crecimiento metastasico en el esqueleto.

Para probar directamente si el silenciamiento de ROBO4 (o ROBO1) en celulas tumorales podna influir en la formacion de osteoclastos, se trataron cultivos primarios de celulas de medula osea de raton con RANKL y factor estimulante de colonias de macrofagos, que son dos factores hematopoyeticos tanto necesarios como suficientes para inducir osteoclastogenesis, junto con el medio condicionado de los diferentes transfectantes. De acuerdo con los datos in vivo, los medios condicionados de las celulas de cancer de mama B02 Sh-Robo1 y Sc-Robo1 estimularon la formacion de osteoclastos multinucleados TRAP-positivos en un grado similar. A la inversa, el medio condicionado de celulas Sh-Robo4 B02 indujo un aumento de 2 veces en la formacion de osteoclastos en comparacion con el de las celulas Sc-Robo4. Se uso despues una matriz de anticuerpos de citoquinas humanas para medir las citoquinas en el medio condicionado de los transfectantes. Estos transfectantes produjeron varias citoquinas e interleucinas que se sabe que estimulan la actividad de los osteoclastos (MCP-1, GM-c Sf , P1GF, VEGF, IL-6, IL-8). Los perfiles de citoquinas fueron similares para las celulas Sc-y Sh-Robo1. Por el contrario, hubo una mayor produccion de P1GF, MCP-1 e IL-8 por las celulas Sh-Robo4 que por las celulas Sc-Robo4, segun lo determinado mediante matriz de citoquinas y ELlSA. Estas citoquinas tambien se detectaron in vivo. Ademas, las concentraciones de P1GF e IL-8 (pero no de MCP-1) fueron mas altas en el suero de animales portadores de tumores Sh-Robo4 que en el grupo control. Por lo tanto, las superficies de reabsorcion aumentadas de osteoclastos activos en patas metastasicas de animales portadores de tumores ShRobo4 probablemente fueron el resultado de una mayor produccion de citoquinas pro-osteoclasticas por celulas tumorales in vivo. Por el contrario, las lesiones osteolfticas en animales portadores de tumores deficientes en Robol no se relacionaron directamente con el silenciamiento de ROBO1, sino con un resultado indirecto del mayor numero de celulas tumorales ShRobol que residen en la medula osea que, en su mayona, estimularon la destruccion osea mediada por osteoclastos.

Efectos del silenciamiento o focalizacion por anticuerpos de ROBO1 y ROBO4 en la migracion e invasion de celulas de cancer de mama

A la luz de estos resultados, se postula que el silenciamiento de ROBO1 podna dar lugar a una colonizacion osea mas rapida por las celulas tumorales ShRobol. De hecho, existe cierta evidencia en la bibliograffa de que Slit-Robo1 regula la migracion de celulas cancerosas (Mehlen et al., 2011). Por lo tanto, se investigo si Robol y/o Robo4 podnan regular la migracion/invasion de celulas de cancer de mama, usando un ensayo de camara de Boyden modificado. Primero se probaron los efectos del silenciamiento de ROBO1 o ROBO4 en la respuesta quimiotactica de las celulas de cancer de mama al suero. Hubo un aumento de 1,5 a 2 veces en la migracion de las celulas transfectadas Sh-Robo1 (conjunto de clones Sh1.32 y Sh 1.33) en comparacion con la de las celulas ScRobo1 transfectadas codificadas (conjunto de clones Sc2.1 y Sc2.4). De manera similar, hubo una ganancia sustancial en la invasion de celulas ShRobo1 cuando se comparo con las celulas ScRobo1. Por el contrario, el silenciamiento de ROBO4 dio lugar a una disminucion estadfsticamente significativa de la migracion de celulas ShRobo4 (conjunto de clones Sh2.6 y Sh4.5) en comparacion con la de las celulas de control (conjunto de clones Sc1.2 y Sc2.2). Ademas, hubo una disminucion de 4 veces en la invasion de celulas ShRobo4 en comparacion con la de las celulas ScRobo4. A continuacion, se evaluo el beneficio de focalizar Robo1 y Robo4 con anticuerpos en la invasion de celulas de cancer de mama B02 parentales. En comparacion con anticuerpos control con isotipo emparejado, el tratamiento de celulas de cancer de mama B02 con un anticuerpo monoclonal anti-Robo1 promovio la invasividad, mientras que la invasion de celulas B02 se inhibio de forma dependiente de la dosis en presencia de concentraciones crecientes de un anticuerpo policlonal anti-Robo4. Tomado en conjunto, se llega a la conclusion de que Robo1 y Robo4 en las celulas tumorales tienen propiedades antiinvasivas y pro-invasivas, respectivamente.

Por lo tanto, estos resultados sugirieron que el silenciamiento de Robol podna atraer a las celulas de cancer de mama a colonizar el hueso mas rapido que cuando se inyecta por via intravenosa, lo que explica la mayor carga tumoral osea en patas de animales portadores de tumores deficientes en Robol. Esta suposicion se apoyo de hecho por la observacion de que, cuando las celulas transfectadas Sc-Robo1 y Sh-Robo1 se inocularon directamente en la cavidad de la medula osea tibial, los ratones que portaban el control o tumores mermados en Robol teman un grado similar de destruccion osea y de carga tumoral osea, segun se determino mediante radiograffa y examen histomorfometrico. As^ el silenciamiento de ROBO1 doto a las celulas tumorales de una mayor invasividad in vivo. Con respecto a la funcion de Robo4 en la metastasis osea, las lesiones osteoltticas formadas por celulas tumorales Sh-Robo4 fueron comparables a las observadas en patas metastasicas de animales portadores de tumores Sc-Robo4. Esto fue inesperado dado que el silenciamiento de ROBO4 disminuyo la carga tumoral osea en animales metastasicos en comparacion con los tumores ScRobo4. Sin embargo, tambien hubo un fuerte aumento de osteoclastos TRAP-positivos en la interfase tumor-hueso y niveles mas altos de la citoquina pro-osteoclastica IL-8 en el suero de animales portadores de tumores ShRobo4 en comparacion con los tumores ScRobo4. Asf, una alta actividad estimuladora de osteoclastos endogena de celulas tumorales ShRobo4 es probable que explique por que los animales portadores del tumor ShRobo4 teman lesiones osteolfticas a pesar de una reduccion de la carga tumoral osea.

El silenciamiento de ROBO4 reduce la supervivencia y la extension de celulas de cancer de mama en la medula osea

La invasion de celulas tumorales se produce en una etapa muy temprana durante la formacion de la metastasis osea, lo que permite que las celulas tumorales se siembren y prosperen en la medula osea (Weilbaecher et al., 2011). Debido a que Robol y Robo4 regulan la invasion de celulas cancerosas in vitro y la formacion de metastasis osea in vivo, se hipotetiza que estos receptores podnan facilitar el injerto de celulas tumorales en el microambiente de la medula osea. Para abordar esta pregunta, se inyectaron transfectantes Sh-Robo y celulas de cancer de mama B02 parentales en la arteria de la cola de los animales y estos animales se sacrificaron el dfa 7 despues de la inoculacion de celulas tumorales, momento en el cual no hay evidencia de metastasis, segun lo juzgado por radiograffa, imagen por bioluminiscencia e histologfa (Garda et al., 2008). Despues, la medula osea de las extremidades posteriores de estos animales se enjuago y se coloco en cultivo bajo seleccion antibiotica, lo que permite el crecimiento selectivo de celulas tumorales resistentes al antibiotico. En comparacion con los ratones inoculados con celulas B02 parentales o celulas ShRobol, el numero de colonias de celulas tumorales en la medula osea de los ratones inoculados con celulas ShRobo4 se redujo en un 75 a un 80%. Ademas, cuando se inocula directamente en la cavidad de la medula osea de las tibias y se rastrea la extension tumoral, el numero de colonias ShRobo4 en la medula osea se redujo en un 78% en comparacion con el observado para las celulas ScRobo4. Se observo un efecto similar cuando las celulas tumorales crecieron independientemente ancladas en agar blando. En comparacion con las celulas ScRobo4 y las celulas B02 parentales, el numero y tamano de las colonias formadas por las celulas ShRobo4 disminuyeron de manera estadfsticamente significativa. Por lo tanto, se requirio Robo4 para la supervivencia de celulas de cancer de mama en la medula osea.

Ejemplo 2

Se inyectaron celulas B02 pre-tratadas con anticuerpo anti-Robo4 en la arteria de la cola de ratones inmunodeficientes. Una semana despues de la inoculacion de las celulas tumorales se enjuago la medula osea de las extremidades posteriores de estos animales y se colocaron en cultivo bajo seleccion de antibiotico, lo que permite el crecimiento selectivo de celulas tumorales resistentes al antibiotico. Despues de 2 semanas en cultivo, se fijaron, se tineron y se contaron las colonias de celulas tumorales. Cada serie de 3 pocillos muestra la extension de colonias de celulas tumorales de la medula osea de un solo animal. Habfa 4 ratones por grupo. La Figura 9 muestra que el tratamiento de celulas de cancer de mama B02 humano con un anticuerpo policlonal dirigido contra Robo4 inhibe la formacion de micrometastasis de medula osea en animales. Un analisis de PCR muestra que, si bien la mayona de las lmeas celulares de cancer de mama expresaron Robol, solo las que teman un tropismo oseo (B02 y BC-M1) expresaron Robo4. De manera adicional, se encontro que las celulas Hs578T y T47D expresaban fuertemente Robo2.

Expresion de Robol Expresion de Robo4 Caractensticas

n bajo(a) alto(a) P bajo(a) alto(a) P

Estado Pre 147 77 70 ,45 82 65 ,08 menopausico

Post 107 50 57 47 60

Tamano del < 20 mm 103 60 43 ,05 52 51 ,99 tumor

> 20 mm 143 64 79 73 70

Grado 1 27 15 12 ,74 15 12 ,12 histologico

2 110 52 58 52 58

3 58 28 30 37 21

Estado Negativo 117 66 51 ,13 74 43 ,001 ganglionar

1-3 83 35 48 39 44

> 3 54 26 28 16 38

Estado ER negativo 42 15 27 ,06 22 20 ,95 positivo 212 112 110 107 105 Estado PR negativo 55 26 29 ,76 30 25 ,63 positivo 199 101 98 99 100

(a) bajo: < 50% del cuartil; alto: > 50% del cuartil.

Los valores de P son para las comparaciones entre los grupos alto y bajo que usan la prueba de Chi-2.

Tabla 1

Referencias

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un agente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ROBO4, un polipeptido senuelo de ROBO4 y un inhibidor de la expresion de ROBO4 para usar en un metodo para prevenir o tratar la metastasis osea en un sujeto que lo necesite en donde el inhibidor de la expresion de ROBO4 se selecciona del grupo que consiste en siRNAs de ROBO4, shRNAs de ROBO4, ribozimas de ROBO4 y oligonucleotidos antisentido de ROBO4 y en donde el polipeptido senuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4.

2. El agente para usarde acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el sujeto padece un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, melanoma, cancer de pancreas, cancer colorectal, cancer de ovario y cancer cerebral.

3. El agente para usarde acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y anticuerpos monoclonales totalmente humanos.

4. El agente para usar de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el polipeptido senuelo de ROBO4 comprende el dominio extracelular de ROBO4 fusionado al dominio Fc de una inmunoglobulina.

5. El agente para usar de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el agente se administra al sujeto en combinacion con bifosfonatos.

6. El agente para usar de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el agente se administra al sujeto en combinacion con un anticuerpo anti-RANKL.

7. El agente para usar de acuerdo con la reivindicacion 6 en donde el anticuerpo anti-RANKL es denosumab.

8. Un metodo para evaluar si un paciente con un cancer tiene riesgo de tener metastasis osea que comprende i) determinar el nivel de expresion de ROBO4 en una muestra obtenida de dicho paciente ii) comparar el nivel determinado en la etapa i) con un nivel de referencia predeterminado e iii) concluir que el paciente tiene un alto riesgo de tener metastasis osea cuando el nivel determinado en la etapa i) es mayor que el nivel de referencia predeterminado.

9. El metodo de la reivindicacion 8 en donde la muestra se afsla del tumor primario del paciente o consiste en una recogida de celulas tumorales circulantes aisladas de la muestra de sangre obtenida del sujeto.

10. El metodo de la reivindicacion 8 en donde el sujeto padece un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, melanoma, cancer de pancreas, cancer colorectal, cancer de ovario y cancer cerebral.

11. El metodo de la reivindicacion 8 en donde el nivel de expresion de ROBO4 en la muestra se evalua determinando el numero de celulas cancerosas que expresan ROBO4 o el nivel de ROBO4 en la superficie de las celulas cancerosas.