CN104428315A - 双特异性抗-vegf/抗-ang-2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有突变1253A、H310A和H435A的人IgG1或IgG4亚类的针对人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和针对人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体，其制备方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。

Description

双特异性抗-VEGF/抗-ANG-2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用

本发明涉及一种用于减少人IgG1或人IgG4亚类的抗体(包括双特异性抗体)的粘性的方法，涉及针对人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)且针对人血管生成素-2(ANG-2)的抗体，其制备方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。

发明背景

血管发生参与各种病症的发病机理，所述疾病包括实体瘤、眼内新血管综合征(intraocular neovascular syndromes)如增生性视网膜病(proliferative retinopathies)或年龄相关的黄斑变性(age-related maculardegeneration，AMD)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)(Folkman，J.，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)267(1992)10931-10934；Klagsbrun，M.，等，Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53(1991)217-239；和Garner，A.，Vascular diseases(血管疾病)，在：Pathobiology of ocular disease，A dynamic approach(眼科疾病的病理学，即动力学途径)，Garner，A.，和Klintworth，G.K，(编辑)，第二版，MarcelDekker，纽约，(1994)，第1625-1710页)。

雷珠单抗(Ranibizumab)(商品名称为)是一种与贝伐珠单抗(bevacizumab)(Avastin)来源于相同的亲本鼠源抗体的单克隆抗体片段。然而，其已被亲和力成熟从而提供更强的与VEGF-A的结合(WO 98/45331)。已知VEGF-A阻断可能与一些系统毒性相关，因此，雷珠单抗缺失Fc部分，从而减少血清半衰期并且因此降低系统毒性。其是一种已被核准用于治疗“湿”型年龄相关的黄斑变性(ARMD)(一种常见的年龄相关的视觉丧失)的抗血管生成剂。

角膜血管发生测定已经表明ANG-1和ANG-2具有相似的作用，与VEGF协同作用以促进新血管生长。Asahara，T.，等，Circ.Res.83(1998)233-40。存在剂量依赖性的内皮反应的可能性是由下述观察引起的：在体外以高浓度存在时，ANG-2也可能是促血管形成的(Kim，I.，等，Oncogene(癌基因)19(2000)4549-52)。在血清饥饿凋亡(serumdeprivation apoptosis)过程中，高浓度ANG-2通过经由PI-3激酶和Akt途径激活Tie2而作用为内皮细胞的凋亡存活因子(Kim，I.，等，Oncogene(癌基因)19(2000)4549-52)。

WO 2010/040508A9和WO 2011/117329涉及双特异性抗-VEGF/抗-ANG-2抗体。WO 2008/132568涉及与生长因子结合的融合蛋白。WO 2009/136352涉及抗血管形成的化合物。WO 2009/080253与WO 2011/117330涉及双特异性二价抗体形式。WO 2010/069532涉及Ang2抗体。

眼血管疾病，如年龄相关的黄斑变性(ARMD)和糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，分别是由于异常的脉络膜或视网膜新血管形成所导致。它们是工业化国家中视觉丧失的主要原因。由于视网膜由界限明确的神经元、神经胶质和血管元件层组成，相对小的干扰，如在血管增生或水肿中观察到的那些，可以导致显著的视功能丧失。遗传性视网膜变性，诸如色素性视网膜炎(Retinitis Pigmentosa，RP)也与血管遗传相关，诸如小动脉狭窄和血管萎缩。它们多至在每3500名个体中影响1人，并且特征在于进行性的夜盲(progressive)、视野丧失(visual field loss)、视神经萎缩(optic nerve atrophy)、小动脉变细(arteriolar attenuation)和通常进展为完全的失明的中央视觉丧失(central loss of vision)。

缺血性视网膜病变(Ischemic retinopathies)特征在于视网膜血管的丧失或功能障碍，其引起血流减少和缺氧。视网膜通过产生生长新血管的信号来响应缺氧，但是这些新血管通常是脆弱的和无组织性的。由于它们可能渗漏、出血或导致可能引起视网膜脱离的瘢痕，因此，正是这些异常新血管的生长产生大部分的视觉威胁。目前对于缺血性视网膜病变的治疗寻找终止病理性血管生长，但是没有解决推动其生长的潜在的缺血。此外，对糖尿病性视网膜病变(一种影响数百万人的缺血性视网膜神经病变)的标准治疗包括用激光破坏一部分视网膜，以尝试终止新血管生长并且保持中央视觉。已经应用一些策略来阻断血管内皮生长因子(VEGF)的功能，血管内皮生长因子是血管生长的主要促进剂。短期内，抗-VEGF治疗可以改善视觉，但是其没有解决潜在的缺血，并且事实上，由于其抑制所有的血管生长，包括有益的侧支的生长，可能加重这种病症。在老年人和/或糖尿病患者(在缺血性的脑、心脏或肢体中可能需要新血管生长)中，还存在对于系统性暴露于这些药物的严重的关注。

典型地，对于眼部疾病，通常使用通过玻璃体内应用的较小的抗体片段，如Fab或Fab(2)，原因在于其具有低血清半衰期，并且系统性毒性的危险较低。然而，这种较小的片段典型地导致较低的玻璃体内半衰期(例如，由于较快地扩散到血清中)并且必须典型地更频繁地给药。

Kim等，Molecular Vision(分子视觉)，15(2009)2803-2812涉及在眼中玻璃体内施用的全长抗体，其中在野生型小鼠中，具有FcRn结合的IgG被清除到血液中，而不具有FcRn结合的IgY不被清除到血液系统中。此外，在FcRn敲降的小鼠(FcRn knockdown-mice)中，具有FcRn结合的IgG不被清除到血液系统中。

本领域中对于用于治疗和预防诸如缺血性视网膜病变的各种眼血管疾病的更好的方式存在需要。

发明概述

本发明的一个方面是用于减少抗体的粘性的方法，其中所述抗体包含(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区，并且其中所述方法包括用突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)修饰人IgG1或人IgG4亚类的抗体恒定重链区。

在本发明的一个实施方案中，所述方法特征在于，所述抗体是双特异性抗体，包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其中

i)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQID NO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

在本发明的一个实施方案中，所述方法特征在于，上文所述的双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)并且还含有突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1亚类的恒定重链区。

本发明的一个实施方案是通过所述方法获得的抗体。

本发明的一个实施方案是突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)用于减少抗体的粘性的应用，其中所述抗体包含(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

在本发明的一个实施方案中，所述应用特征在于所述抗体是双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，

其中

i)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQID NO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

在本发明的一个实施方案中，所述具体的应用的特征在于，所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)并且还含有突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1亚类的恒定重链区。

本发明还涉及双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其中

i)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQID NO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于

i)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列作为重链可变结构域VH，和SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL；和

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为重链可变结构域VH，和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于iii)中的恒定重链区是人IgG1亚类的。在一个实施方案中，所述IgG1亚类的双特异性抗体特征在于所述IgG1亚类的恒定重链区还包含突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于iii)中的恒定重链区是人IgG4亚类的。在一个实施方案中，所述IgG4亚类的双特异性抗体特征在于所述IgG4亚类的恒定重链区还包含突变S228P和L235E(按照Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，所述IgG4亚类的双特异性抗体特征在于所述IgG4亚类的恒定重链区还包含突变S228P、L235E和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

本发明的另一个方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物，所述药物组合物用于治疗眼血管疾病，所述双特异性抗体用于制备用于治疗眼血管疾病的药物的应用，通过给需要这样的治疗的患者施用所述双特异性抗体来治疗患有限血管疾病的患者的方法。在一个实施方案中，包含所述双特异性抗体的所述双特异性抗体或所述药物组合物通过玻璃体内应用进行施用。

本发明的另一方面是编码本发明所述的双特异性抗体的重链和/或轻链的核酸分子。

本发明还提供包含本发明所述的核酸的表达载体，所述表达载体能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，并且提供包含所述载体的宿主细胞，所述宿主细胞用于重组生产本发明所述的双特异性抗体。

本发明还包括包含本发明所述的载体的原核或真核宿主细胞。

本发明还包括用于生产本发明所述的双特异性抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达本发明所述的核酸，并且从所述细胞或细胞培养物上清中回收所述双特异性抗体。一个实施方案是用于制备本发明所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用包含编码所述抗体的核酸分子的载体转化宿主细胞；

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养物回收所述抗体分子。

本发明还包括通过所述用于生产双特异性抗体的方法获得的抗体。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的氨基酸序列。

本发明所述的抗体由于其在Fc部分/恒定区中的特异性修饰而具有高度有价值的特性，所述特异性修饰引起对患有眼血管疾病的患者的益处。其在玻璃体内环境中具有高度的稳定性和从眼睛的缓慢扩散(与不具有恒定重链区的较小的抗体片段相比)，其中实际的疾病位于此并且在此处治疗(因此，与非IgG样抗体，例如，Fab和(Fab)2片段相比，治疗时间安排可能得到改善)。与未修饰的IgG抗体相比，令人吃惊地，在玻璃体内应用所述在恒定区具有突变I253A、H310A和H435A的抗体(不再有FcRn结合)后在眼中的半衰期是相似的(仅略微减小)(表17a和18a以及图7D和7E)，而从眼到血清中的扩散是相似的(表15和图7B)。由于对于治疗与ANG2和/或VEGF相关的眼血管疾病需要从眼部消除VEGF和Ang2(例如，通过将抗-ANG2/ANG2抗体复合物或抗-VEGF/VEGF抗体复合物转运至血清中)，所以这是高度有价值的。另一方面，当与未修饰的IgG抗体相比时，本发明所述的抗体非常快速地从血清中清除(对于减少由系统性暴露引起的潜在的副作用这是高度合乎需要的)。

令人吃惊地，它们还表现出较低的粘性(参见图2)(与在恒定区不具有突变I253A、H310A和H435A的版本相比)，并且因此在眼部疾病的治疗过程中特别有效的用于通过细针进行玻璃体内应用(对于此类应用，典型地使用细针进行，并且高粘性使得适当的应用变得相当困难)。所述较低的粘性还允许更高浓度的制剂。

还令人吃惊地，本发明所述的抗体在储存过程中表现出较低的聚集倾向性(图4)(与在Fc部分不具有突变I253A、H310A和H435A的版本相比)，这对于在眼中玻璃体内的应用是至关重要的(由于在所述治疗过程中，在眼中的聚集可能导致并发症)。本发明所述的双特异性抗体表现出抑制眼部疾病的良好功效。

在某些实施方案中，本发明所述的双特异性抗体由于其在恒定区中的特异性修饰(例如P329G LALA)表现出有价值的特性，如不结合Fcγ受体，这减少如血栓形成和/或不需要的细胞死亡(例如，由于ADCC引起)的副作用的危险性。

附图描述

图1 具有AAA突变(突变I253A、H310A和H435A-按照Kabat的EU索引编号)的<VEGF-ANG-2>IgG1或IgG4抗体的概念和优点的示意图

图2 小规模基于DLS的粘度测量以在200mM精氨酸/琥珀酸酯pH 5.5中150mg/mL外推的粘度(本发明所述的<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(具有AAA突变)与参比VEGFang2-0015(不具有所述AAA突变)比较)

图3 在20mM His，140mM NaCl，pH 6.05中取决于温度的DLS聚集(包括DLS聚集起始温度)(本发明所述的<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(具有AAA突变)与参比VEGFang2-0015(不所述具有AAA突变)比较)

图4 以100mg/ml在40℃储存7天(降低的主峰减少和高分子量/HMW)增加)(显示出较低的聚集的本发明所述的<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(具有AAA突变)与参比VEGFang2-0015(不具有所述AAA突变)的比较)

图5A VEGFang2-0015(不具有AAA突变)的FcRn稳态亲和力：不同浓度Biacore传感图的重叠显示出VEGFang2-0015(不具有AAA突变)与FcRn的浓度依赖性的结合

图5B A：VEGFang2-0015(不具有AAA突变)的FcRn稳态亲和力：VEGFang2-0015(不具有AAA突变)的浓度依赖性结合反应曲线显示出与FcRn的结合

图5C VEGFang2-0016(具有AAA突变)的FcRn稳态亲和力：不同浓度Biacore传感图的重叠表示在所有浓度都不与FcRn结合

图5D VEGFang2-0016(具有AAA突变)的FcRn稳态亲和力：VEGFang2-0016(具有AAA突变)的浓度依赖性结合反应曲线不显示与FcRn的结合

图5E VEGFang2-0016(具有AAA突变)的FcRn稳态亲和力：VEGFang2-0016(具有AAA突变)的浓度依赖性结合反应曲线显示不与FcRn的结合(响应范围从-0.6到0.2RU/浓度规模范围从0到0.35M)

图6 不具有AAA突变的VEGFang2-0015和具有AAA突变的VEGFang2-0016的FcγRIIIa相互作用测量(二者均为具有P329G LALA突变的IgG1亚类；IgG1亚类的抗-Dig和基于IgG4的抗体用作对照)

图7A 确定血清和全眼裂解物中<VEGF/Ang2>双特异性抗体的浓度的示意性Pk-ELISA测定原理

图7B 静脉内应用后的血清浓度：化合物比较-不具有AAA突变的VEGFang2-0015与具有AAA突变的VEGFang2-0016

图7C 玻璃体内应用后的血清浓度：化合物比较-不具有AAA突变的VEGFang2-0015与具有AAA突变的VEGFang2-0016

图7D 右眼和左眼中VEGFang2-0016(具有AAA突变)的眼裂解物浓度(在仅对右眼玻璃体内应用后，与静脉内应用相比较)：在玻璃体内应用后仅在右眼中能够检测到明显的浓度。在静脉内应用后，由于VEGFang2-0016(具有AAA突变)的低血清半衰期，在眼裂解物中不能检测到其浓度

图7E 右眼和左眼中VEGFang2-0015(不具有AAA突变)的眼裂解物浓度(在仅对右眼玻璃体内应用后，与静脉内应用相比较)：在右眼中(并且在左眼中在一定程度上)在玻璃体内应用后，可以检测到VEGFang2-0015浓度。这表明从右眼到血清中的扩散以及从血清到左眼的扩散，这可以由VEGFang2-0015(不具有AAA突变)的长半衰期进行解释。静脉内应用后，由于血清稳定的VEGFang2-0015(不具有AAA突变)扩散到眼中，也可以在双眼的眼裂解物中检测到明显的浓度

发明详述

在本发明的一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体是二价的。

在本发明的一个方面中，本发明所述的双特异性二价抗体特征在于，其包含

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域CL和CH1各被其他替换。

关于特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体的这种双特异性二价抗体形式记述在WO 2009/080253中(包含凸起-进-孔洞修饰的CH3结构域)。基于这种双特异性二价抗体形式的抗体命名为CrossMabs。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体特征在于，其包含：

a)SEQ ID NO：25的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链，和SEQID NO：27的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO：26的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链，和SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体特征在于，其包含：

a)SEQ ID NO：21的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链，和SEQID NO：23的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO：22的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链，和SEQ ID NO：24的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体特征在于，其包含：

a)SEQ ID NO：29的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链，和SEQID NO：31的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO：30的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链，和SEQ ID NO：32的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的氨基酸序列。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，本发明所述的双特异性抗体特征在于，其包含：

a)特异性结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链；

b)特异性结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，其中所述重链的N端通过肽接头与所述轻链的C端连接。

关于特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体的这种双特异性二价抗体形式记述在WO 2011/117330中，其包含凸起-进-孔洞修饰的CH3结构域。基于这种双特异性二价抗体形式的抗体命名为OAscFabs。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体特征在于，其包含：

a)SEQ ID NO：33的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链，和SEQID NO：35的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO：34的氨基酸序列作为通过肽接头与第二全长抗体的轻链连接的第二全长抗体的重链。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体特征在于，其包含：

a)SEQ ID NO：36的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链，和SEQID NO：38的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和

b)SEQ ID NO：37的氨基酸序列作为通过肽接头与第二全长抗体的轻链连接的第二全长抗体的重链。

在一个实施方案中，第二全长抗体的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而进行二硫化物稳定：重链可变结构域位置44-轻链可变结构域位置100(总是按照Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。此类其他二硫化物稳定通过在第二全长抗体重链和轻链的可变结构域VH和VL之间引入二硫键而实现。例如，引入非天然二硫键进行稳定的技术记述在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.(蛋白质工程)10(1997)1453-59；Kobayashi等，Nuclear Medicine&Biology(核医学与生物学)25(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，Oncogene(癌基因)18(1999)1711-1721中。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的氨基酸序列。

因此，本发明的一个实施方案是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性二价抗体，其特征在于包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性二价抗体的CH3结构域通过“凸起-入-孔洞”技术改变，所述“凸起-入-孔洞”技术例如在WO 96/027011，Ridgway J.B.，等，Protein Eng(蛋白质工程)9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等，Nat Biotechnol(自然生物技术)16(1998)677-681中以一些实施例详细描述。在这种方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以增加包含这两个CH3结构域的两个重链的异源二聚体化。(这两个重链的)这两个CH3结构域中的每一个都可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。引入二硫键稳定该异源二聚体(Merchant，A.M，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell，S.，等J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)并且增加产量。

在本发明的优选方面中，本发明所述的所有的双特异性抗体特征在于：

一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域分别在包含所述抗体CH3结构域之间的原始界面的界面处相接；

其中所述界面被改变以促使形成双特异性抗体，其中所述改变特征在于：

a)一条重链的CH3结构域被改变，

以致在一条重链的CH3结构域与所述双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的原始界面相接的原始界面内，

氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，该凸起可放置在另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴内；

并且

b)另一条重链的CH3结构域被改变，

以致在第二CH3结构域与所述双特异性抗体内的第一CH3结构域的原始界面相接的原始界面中，

氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基置换，由此在第二CH3结构域内产生空穴，第一CH3结构域的界面内的凸起可放置在在该空穴内。

因此，本发明所述的抗体优选地特征在于：

a)的全长抗体的重链的CH3结构域和b)的全长抗体的重链的CH3结构域分别在这样的界面处相接，所述界面包含在抗体CH3结构域之间的原始界面中的改变；

其中i)在一条重链的CH3结构域中，

氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，所述凸起可放置在另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴中；

并且其中

ii)在另一条重链的CH3结构域中，

氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基置换，由此在第二CH3结构域的界面内产生空穴，第一CH3结构域的界面内的凸起可放置在所述空穴中。

优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由下述组成的组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。

优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由下述组成的组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。

在本发明的一个方面中，两个CH3结构域通过引入半胱氨酸(C)作为在每个CH3结构域的相对应的位置的氨基酸而进一步被改变，以致可以在两个CH3结构域之间形成二硫键。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含T366W突变并且在“孔洞链”的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变。也可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，A.M，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681)，例如，通过向“凸起链”的CH3结构域中引入Y349C突变，和向“孔洞链”的CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。

在另一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在另一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3结构域中包含另外的Y349C突变，和在另一个CH3结构域中包含另外的E356C或S354C突变，形成链间二硫键)(总是按照Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。但是，还可以备选地或另外应用EP 1 870 459 A1所述的其他凸起-入-孔洞技术。因此，关于双特异性抗体的另一个实例是在“凸起链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变(总是按照Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含T366W突变，并且在“孔洞链”的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变，以及另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或所述三价双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变，和另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体特征在于具有下述特性中的一种或多种(在如实施例6所述的测定中确定)：

-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，表现出较低的血清浓度(在小鼠中玻璃体内应用后96小时，所述小鼠缺失小鼠FcRn，但是关于人FcRn是半合子转基因的)；

-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中表现出相似的浓度(因子0.8-1.2)(在缺失小鼠FcRn但关于人FcRn是杂合子转基因的小鼠中，在右眼中玻璃体内应用后96小时)。

在一个实施方案中，所述双特异性二价抗体特征在于，其包含：

特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，特征在于

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7作为重链可变结构域(VH)，和SEQ ID NO：8作为轻链可变结构域(VL)；和

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：15作为重链可变结构域(VH)，并且SEQ ID NO：16作为轻链可变结构域(VL)；和

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)IgG1或IgG4亚类的恒定重链区；

并且具有下述特性中的一种或多种(在如实施例6所述的测定中确定)：

-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，表现出较低的血清浓度(在小鼠中玻璃体内应用后96小时，所述小鼠缺失小鼠FcRn，但是关于人FcRn是杂合子转基因的)；

-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中表现出相似的浓度(因子0.8-1.2)(在缺失小鼠FcRn但关于人FcRn是杂合子转基因的小鼠中，在右眼中玻璃体内应用后96小时)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于，其包含：

特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7(具有1、2或3个氨基酸残基置换)作为重链可变结构域(VH)，和SEQ ID NO：8(具有1、2或3个氨基酸残基置换)作为轻链可变结构域(VL)；和

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：15(具有1、2或3个氨基酸残基置换)作为重链可变结构域(VH)，并且SEQ ID NO：16(具有1、2或3个氨基酸残基置换)作为轻链可变结构域(VL)；和

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)IgG1或IgG4亚类的恒定重链区；

并且具有下述特性中的一种或多种(在如实施例6所述的测定中确定)：

-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，表现出较低的血清浓度(在小鼠中玻璃体内应用后96小时，所述小鼠缺失小鼠FcRn，但是关于人FcRn是杂合子转基因的)；

-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中表现出相似的浓度(因子0.8-1.2)(在缺失小鼠FcRn但关于人FcRn是杂合子转基因的小鼠中，在右眼中玻璃体内应用后96小时)。

用于本文时，“抗体”是指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用在本文中表示配体实际结合的抗体分子的区域。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)(VH/VL对)。

抗体特异性是指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。

本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的VEGF和作为第二抗原的ANG-2。

术语“单特异性”抗体用在本文中表示具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。

术语“价”在本申请中使用时表示结合位点在抗体分子上存在的具体数量。象这样，术语“二价”、“四价”和“六价”表示在抗体分子上分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本发明所述的双特异性抗体优选是“二价”的。

术语“VEGF”用在本文中是指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，是一种165个氨基酸的人血管内皮生长因子(人VEGF165的前体序列的氨基酸27-191：SEQ ID NO：17；氨基酸1-26表示信号肽)，和相关的121、189和206血管内皮细胞生长因子同种型(isoform)，如Leung，D.W.，等，Science(科学)246(1989)1306-9；Houck等，Mol.Endocrin.(分子内分泌学)5(1991)1806-1814；Keck，P.J.，等，Science(科学)246(1989)1309-12和Connolly，D.T.，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)264(1989)20017-24所述；以及这些生长因子的天然存在的等位基因形式和加工的形式。VEGF参与与肿瘤和眼内病症相关的正常和异常的血管发生与新血管生成的调控(Ferrara，N.，等，Endocr.Rev.(内分泌综述)18(1997)4-25；Berkman，R.A.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)91(1993)153-159；Brown，L.F.，等，Human Pathol.(人类病理学)26(1995)86-91；Brown，L.F.，等，Cancer Res.(癌症研究)53(1993)4727-4735；Mattern，J.，等，Brit.J.Cancer.(英国癌症学杂志)73(1996)931-934；和Dvorak，H.F.，等，Am.J.Pathol.(美国病理学杂志)146(1995)1029-1039)。VEGF是同二聚体糖蛋白，已经从数种来源分离，并且包括一些同种型。VEGF对内皮细胞显示出高度特异性的促有丝分裂活性。

术语“ANG-2”用在本文中是指人血管生成素-2(ANG-2)(替代地缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ ID NO：18)，其在Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60和Cheung，A.H.，等，Genomics(遗传学)48(1998)389-91中描述。发现血管生成素-1(SEQ ID NO：19)和-2是Ties的配体，Ties是选择性在血管内皮内表达的酪氨酸激酶家族(Yancopoulos，G.D.，等，Nature(自然)407(2000)242-48)。现在有四种明确的血管生成素家族的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因位点的非常不同的对应物(Kim，I.，等，FEBSLet，443(1999)353-56；Kim，I.，等，J Biol Chem(生物化学杂志)274(1999)26523-28)。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂而鉴定(对于ANG-1：参见Davis，S.，等，Cell(细胞)87(1996)1161-69；对于ANG-2：Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60)。所有已知血管生成素基本上都结合Tie2(SEQ ID NO：20)，且Ang-1和-2均以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2(Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60)。

本发明的双特异性抗体的抗原结合位点可包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDRs(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDRs(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。

本发明的抗体包含来源于一种或多种免疫球蛋白种类的人源免疫球蛋白恒定区，其中，所述免疫球蛋白种类包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE种类，并且，在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚类，特别是IgG1和IgG4。

术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生本发明所述的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。也将这种嵌合抗体称作“类别转换抗体“。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison，S.L.，等，Proc.Natl.Acad Sci.USA(美国国家科学院学报)81(1984)6851-6855；US 5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包含与亲本免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。参见，例如，Riechmann，L.，等，Nature(自然)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，Nature(自然)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上关于嵌合抗体指出的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生本发明所述的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。

用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol(当前化学生物学观点).5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature(自然)362(1993)255-258；Brueggemann，M.，等.，Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole，A.等和Boerner，P.，等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，A.，等.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Liss A.L.，p.77(1985)；和Boerner，P.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对本发明所述的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生本发明所述的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR结合的特性，例如通过“类别转换”，即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。

用于本文时，术语“重组抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。本发明所述的重组抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。

“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)，重链的可变结构域(VH))用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构，且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列广泛保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDRs通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDRs一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用，并因此提供本发明的另一个目的。

用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDRs通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照KabatE.A.等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质序列)，第5版，PublicHealth Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定CDR和FR区域。

用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用纯化的野生型抗原的等离子体共振测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中，抗体与抗原(人VEGF或人ANG-2)的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。在一个实施方案中，结合或特异性结合意为10^-8mol/l以下，优选地10^-9M到10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。

在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。

术语“全长抗体”表示由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD和IgE。本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。所述全长抗体的重链或轻链的C端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指在所述重链或轻链的N端的最后的氨基酸。

术语“肽接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。这些本发明所述的肽接头用于通过肽接头连接第二全长抗体(其特异性结合第二抗原)的轻链的C端与重链的N端。在第二全长抗体重链和轻链内的肽接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，优选具有32-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是具有32-40个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8，9或10，和m＝0，1，2或3)或(x＝4和n＝6，7或8和m＝0，1，2或3)，优选地x＝4，n＝6或7和m＝0，1，2或3，更优选地x＝4，n＝7和m＝2。在一个实施方案中，所述接头是(G₄S)₆G₂。

术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但是显示出不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为亚类，如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为κ(kappa)和λ(lambda)。

术语“来自人来源的恒定区”或“人恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的，并且例如由Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)描述(还参见，例如，Johnson，G.，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.(核酸研究)28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)72(1975)2785-2788)。在本申请中，关于位置的编号，使用Kabat，E.A.等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)描述的EU编号系统(EU索引)，并且称其为“依据Kabat的EU索引编号”。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体具有(来源于人IgG1亚类的)人IgG1亚类的恒定区。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体具有(来源于人IgG1亚类的)人IgG4亚类的恒定区。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体是人IgG1亚类的，具有突变L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)和P329G(Pro329Gly)。所述抗体具有减少的FcR结合(特别地，其不再表现出与FcRγI、FcRγII和FcRγIII的结合)。这特别有效地减少潜在的副作用，如例如，血栓形成(Meyer，T.，等，J.Thromb.Haemost.(血栓与止血杂志)7(2009)171-81)。在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体是IgG4亚类的，具有突变S228P(Ser228Pro)、L235E(Leu235Glu)和P329G(Pro329Gly)。所述抗体表现出减少的FcR结合，如上文所示。尽管已经描述的Pro329Ala突变仅去除三分之二的FcγRIIIa夹心相互作用，但是，本发明所述的抗体中的Pro329Gly完全赋予Fc部分与FcγRIII的结合。这是特别有效的，原因在于FcγRIII参与导致细胞死亡的ADCC(抗体-依赖性细胞毒性)，这可能对癌症疾病的治疗有帮助，但是这可能在其他血管或免疫学疾病的基于抗体的治疗中引起严重的副作用。因此，本发明所述的具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1亚类的抗体和具有突变S228P、L235E和P329G的IgG4亚类的抗体是特别有用的，原因在于它们都不再表现出与FcRγI、FcRγII和FcRγIII的结合。

术语“具有突变AAA”用在本文中是指在IgG1或IgG4的恒定重链区中的突变I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)和H435A(His435Ala)，其中编号按照Kabat的EU索引进行。

术语“具有突变P329G LALA”用在本文中是指在IgG1亚类的恒定重链区中的突变L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)和P329G(Pro329Gly)，其中编号按照Kabat的EU索引进行。术语“具有突变SPLE”用在本文中是指在IgG4亚类的恒定重链区中的S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)，其中编号按照Kabat的EU索引进行。术语“具有突变SPLE和P239G”用在本文中是指在IgG4亚类的恒定重链区中的S228P(Ser228Pro)，L235E(Leu235Glu)和P329G(Pro329Gly)，其中编号按照Kabat的EU索引进行。

本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的，并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.(蛋白表达与纯化)17(1999)183-202；Geisse，S.，等，Protein Expr.Purif.(蛋白表达与纯化)8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.(分子生物技术)16(2000)151-160；Werner，R.G.，Drug Res.(药物研究)48(1998)870-880的综述文章中描述。

因此，本发明的一个实施方案是用于制备本发明所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括下述步骤：

a)用包含编码所述抗体的核酸分子的载体转化宿主细胞；

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养物回收所述抗体分子。

在一个实施方案中，c所述的回收步骤包括使用轻链恒定结构域特异性的捕获剂(例如，其对κ或λ恒定轻链特异，这取决于在本发明所用的双特异性抗体中是否存在κ或λ轻链)。在一个实施方案中，这种轻链特异性捕获剂以结合-洗脱模式使用。所述轻链恒定结构域特异性捕获剂的实例，例如，来自GE Healthcare/BAC的KappaSelect^TM和LambdaFabSelectTM，其是基于高度刚性的琼脂糖系基质，该基质允许大规模下的高流速和低回压。它们作用为分别与κ或λ轻链的恒定区结合的配体(即，缺少轻链恒定区的片段不被结合；图1)。因此，二者都能结合其他含有轻链恒定区的靶分子，例如，IgG，IgA和IgM。配体通过长的亲水间隔臂连接到基质上，以使其容易地用于结合所述靶分子。它们是基于针对人Igκ或λ筛选的单链抗体片段。

双特异性抗体适当地通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基中分离，所述纯化方法如，例如蛋白质A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。

双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征，如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。

术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生本发明所述的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。

在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等，Cytotechnology(细胞技术学)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等，Nucl.Acids.Res.(核酸研究)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，Cytotechnology(细胞技术学)30(1999)71-83和Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)194(1996)191-199中。

适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，其是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌性前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌性前导序列的情形中，是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。

通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学中的方法)，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和力材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech(应用生物化学生物技术).75(1998)93-102)。

本发明所述的双特异性二价抗体表现出对需要VEGF和ANG-2靶向治疗的人患者的益处。

本发明所述的针对人VEGF和人ANG-2的二价双特异性抗体可以具有有价值的功效/安全性模式，并且可以为需要抗-VEGF和抗-ANG-2治疗的患者提供益处。

本发明的一个方面是包含本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是本发明所述的抗体在制备药物组合物中的应用。本发明的另一个方面是制备包含本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一方面，本发明提供包含与药物载体一起配制的本发明所述的抗体的组合物，例如，药物组合物。

用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的试剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。优选地，所述载体适于通过局部途径施用给受试者的给药。例如，抗体或其组合物可以通过眼内应用施用给受试者，例如，通过眼内注射，如玻璃体内注射施用。这可以按照本领域已知的标准方法进行。参见，例如，Ritter等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)116(2006)3266-76；Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.(神经病理学和应用神经学)25(1999)196-206；和Wray等，Arch.Neurol.33(1976)183-5。

本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员应该理解的，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域中已知的。

可以使用多种可能的递送方式，包括，但不限于，眼内应用或局部应用。在一个实施方案中，所述应用是眼内的，并且包括，但不限于，结膜下注射，前房内注射(intracanieral injection)，通过颞侧缘(temporallimbus)注射到前房中，基质内注射，角膜内注射，视网膜下注射，眼房水注射，眼筋膜下(subtenon)注射或持续递送装置，玻璃体内注射(例如，玻璃体前、中或后注射)。在一个实施方案中，所述应用是局部的，并且包括，但不限于，到角膜的滴眼液。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体或药物组合物通过玻璃体内应用进行施用，例如，通过玻璃体内注射进行。这可以按照本领域已知的标准方法进行。例如，参见，Ritter等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)116(2006)3266-76；Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.(神经病理学和应用神经学)25(1999)196-206；和Wray等，Arch.Neurol.33(1976)183-5。

在一些实施方案中，本发明的治疗试剂盒可以包含一个或多个剂量的存在于本文所述的药物组合物中的双特异性抗体、用于玻璃体内注射所述药物组合物的适当的装置和详细说明适当的受试者和实行注射的流程的使用说明。在这些实施方案中，所述组合物典型地通过玻璃体内注射施用给需要治疗的受试者。这可以按照本领域已知的标准方法进行。例如，参见，Ritter等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)116(2006)3266-76；Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.(神经病理学和应用神经学)25(1999)196-206；和Wray等，Arch.Neurol.33(1976)183-5。

所述组合物还可以包含辅剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法(见上文)和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。可能还需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。

不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。

在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域公知的类似因素。

所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。

适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过维持需要的粒度和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。

所述组合物可以包括用于结膜下施用的含有活性剂的眼科长效制剂。所述眼科长效制剂包含基本上纯的活性剂(例如，本发明所述的双特异性抗体)的微粒。所述包含本发明的双特异性抗体的微粒可以包埋在生物相容性药用聚合物或脂质包封剂中。所述长效制剂可以适于在延长的时间阶段中释放所有或基本上所有的活性物质。聚合物或脂质基质，如果存在，可以适于充分降解，从而在释放所有或基本上所有的活性剂后从施用位点转移。所述长效制剂可以是脂质制剂，包含药用聚合物和溶解的或分散的活性剂。注射时，聚合物在注射位点形成储库，例如，通过胶凝或沉淀形成。

本发明的另一方面是本发明所述的双特异性抗体，其用于治疗眼血管疾病。

本发明的一个实施方案是本发明所述的双特异性抗体，其用于治疗眼血管疾病。

本发明的另一方面是所述药物组合物，其用于治疗眼血管疾病。

本发明的另一方面是本发明所述的抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的应用。

本发明的另一方面是治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过给需要所述治疗的患者施用本发明所述的抗体进行。

术语“眼血管疾病”和“血管性眼病”在本文中可互换使用，并且包括，但不限于，眼内新血管综合征(intraocular neovascular syndromes)，如糖尿病性视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema)，早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)，新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)，视网膜静脉闭塞(retinal vein occlusions)，视网膜中央静脉闭塞(central retinal vein occlusions)，黄斑变性，年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration)，色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)，视网膜血管瘤增生(retinal angiomatousproliferation)，黄斑毛细管扩张(macular telangectasia)，缺血性视网膜病变(ischemic retinopathy)，虹膜新生血管形成(iris neovascularization)，眼内新生血管形成(intraocular neovascularization)，角膜新生血管化(corneal neovascularization)，视网膜新生血管化(retinalneovascularization)，脉络膜新生血管化(choroidal neovascularization)和视网膜变性(retinal degeneration)。(Garner，A.，Vascular diseases(血管疾病)，在：Pathobiology of ocular disease，A dynamic approach(眼病病理生物学，动力过程)，Garner，A.，和Klintworth，G.K.，(编)，第2版，Marcel Dekker，New York(1994)，pp.1625-1710)。用于本文时，眼血管病症是指任意这样的病理性病况，其特征在于改变的或失控的新血管增生和侵入到眼组织(如视网膜或角膜)的结构中。在一个实施方案中，所述眼血管疾病选自由下述组成的组：湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)，干性年龄相关的黄斑变性(干性AMD)，糖尿病性黄斑水肿(DME)，囊样黄斑水肿(cystoid macular edema，CME)，非增生性糖尿病性视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)，增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，囊样黄斑水肿，血管炎(vasculitis)(例如，视网膜中央静脉闭塞)，视盘水肿(papilloedema)，视网膜炎(retinitis)，结膜炎(coniunctivitis)，葡萄膜炎(uveitis)，脉络膜炎(choroiditis)，多病灶性脉络膜炎(multifocalchoroiditis)，眼组织胞浆菌病(ocular histoplasmosis)，眼睑炎(blepharitis)，干眼症(dry eye)(舍格伦病(disease))和其他眼科疾病，其中所述眼病或病症与眼部新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关。因此，本发明所述的双特异性抗体有效用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、眼睑炎、干眼症和葡萄膜炎，还优选地是湿性AMD、干性AMD、眼睑炎和干眼症，还优选地是CME、DME、NPDR和PDR，还优选地是眼睑炎和干眼症，特别是湿性AMD和干性AMD，并且还特别是湿性AMD。在一些实施方案中，所述眼部选自由湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病和糖尿病性视网膜病变组成的组。

与角膜新生血管化相关的其他疾病包括，但不限于，流行性角结膜炎(epidemic keratoconjunctivitis)，维生素A缺乏病(Vitamin Adeficiency)，隐形眼镜佩带过度(contact lens overwear)，变应性角膜炎(atopic keratitis)，高级边缘性角膜炎(superior limbic keratitis)，翼状胬肉干燥性角膜炎(pterygium keratitis sicca)，舍格伦病(sjogrens)，红斑痤疮(acne rosacea)，phylectenulosis，梅毒(syphilis)，分枝杆菌感染(Mycobacteria infections)，脂质变性(lipid degeneration)，化学灼伤(chemical burns)，细菌性溃疡(bacterial ulcers)，真菌性溃疡(fungalulcers)，单纯疱疹感染(Herpes simplex infections)，带状疱疹感染(Herpeszoster infections)，原虫感染(protozoan infections)，卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)，莫伦溃疡(Mooren ulcer)，Terrien′s边缘变性(Terrien′s marginaldegeneration)，边缘性角质层分离(mariginal keratolysis)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，全身性红斑狼疮(systemic lupus)，多动脉炎(polyarteritis)，外伤(trauma)，韦格纳结节病(Wegeners sarcoidosis)，巩膜炎(Scleritis)，史蒂文斯约翰逊病(Steven′s Johnson disease)，periphigoid放射状角膜切开(periphigoid radial keratotomy)和角膜移植排斥(corneal graph rejection)。

与视网膜/脉络膜新血管生成相关的疾病包括，但不限于，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性，镰状细胞性贫血(sickle cell anemia)，结节病(sarcoid)，梅毒(syphilis)，弹性假黄色瘤(pseudoxanthoma elasticum)，佩吉特病(Pagets disease)，静脉闭塞(vein occlusion)，动脉闭塞(arteryocclusion)，颈动脉闭塞病(carotid obstructive disease)慢性葡萄膜炎/玻璃体炎(chronic uveitis/vitritis)，分枝杆菌感染(mycobacterialinfections)，莱姆病(Lyme′s disease)，全身性红斑性狼疮(systemic lupuserythematosis)，早产儿视网膜病，色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)，视网膜水肿(retina edema)(包括黄斑水肿)，伊尔斯病(Eales disease)，Bechets病(Bechets disease)，引起视网膜炎或脉络膜炎的感染(infections causing a retinitis or choroiditis)，假定的眼组织胞浆菌病(presumed ocular histoplasmosis)，贝斯特病(Bests disease)，近视(myopia)，视窝(optic pits)，斯达加特病(Stargarts disease)，睫状体扁平部炎(pars planitis)，慢性视网膜脱离(chronic retinal detachment)，高粘稠度综合征(hyperviscosity syndromes)，弓形体病(toxoplasmosis)，外伤和激光后综合症(post-laser complications)。其他疾病包括，但不限于，与潮红(角的新生血管形成)相关的疾病和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。

早产儿视网膜病(ROP)是一种影响早产儿的眼部疾病。认为其由视网膜血管的无组织性生长引起，其可能导致瘢痕和视网膜剥离。ROP可以是轻度的，并且可以自然治愈，但是在严重的病例可能导致失明。因此，所有早产儿都有ROP的危险，并且非常低的出生体重是另外的危险因素。氧中毒和相关的缺氧都可能有助于ROP的发展。

黄斑变性是一种主要在老年人中发现的医学病症，其中已知为视网膜黄斑区域的眼睛的内衬中心变薄、萎缩，并且在一些情形中，出血。这可能导致中央视觉的丧失，这使得不能看到更详细的东西，不能阅读，或者不能辨识面部。依据美国眼科学会，其是当代美国年龄大于五十岁的人们中的中央视觉丧失(失明)的主要原因。尽管一些影响年轻人的黄斑营养不良(macular dystrophies)有时也称为黄斑变性，但是该术语通常是指年龄相关的黄斑变性(AMD或ARMD)。

年龄相关的黄斑变性从在视网膜色素上皮与其下的脉络膜之间的黄斑(提供详细的中央视觉的视网膜中央区域，称为小窝)中的特征性的黄色沉积(称为玻璃疣)开始。大部分具有这些早期改变(称为年龄相关的黄斑病变(maculopathy))的人们具有良好的视力。具有玻璃疣的人们可以继续发展晚期AMD。当玻璃疣变大并且变多，并且与在斑下的色素细胞层中的紊乱相关时，危险是相当高的。大且软的玻璃疣与升高的胆固醇沉积相关，并且可能响应降胆固醇剂或Rheo Procedure。

导致深入的视觉丧失的晚期AMD具有两种形式：干性的和湿性的。中央萎缩，即，干性形式的晚期AMD，由在视网膜下的视网膜色素上皮层的萎缩导致，其通过丧失在眼睛中央部分的光感受器(杆状和锥体)而引起视觉丧失。尽管对于这种病况没有可用的治疗，但是国家眼科研究所(National Eye Institute)和其他机构已经证明使用高剂量的抗氧化剂、叶黄素和玉米黄素的维生素补充减缓干性黄斑变性的进展，并且在一些患者中，改善视敏度。

色素性视网膜炎(RP)是一组遗传性眼病。在RP症状的进展过程中，夜盲症(night blindness)通常在视野收缩(tunnel vision)之前数年或甚至几十年发生。许多患有RP的人直到他们四十多岁或五十多岁时才变成法定意义上的失明，并且终生保留些许视力。其他人由RP发展至完全失明，在一些情形中，早在儿童期就发展至完全的失明。RP的进展在每个病例中都是不同的。RP是一种类型的遗传性视网膜营养不良，一组遗传性病症，其中光感受器(杆状和锥体)或视网膜的视网膜色素上皮(RPE)的异常导致进展性的视觉丧失。患病的个体首先经历缺陷性的暗适应(defective dark adaptation)或夜盲(nyctalopia)(夜盲症)，之后是周边视野减少(称为管状视(tunnel vision))，并且有时在该疾病的过程晚期丧失中央视觉。

当流体和蛋白沉积集中在眼睛的黄斑上或之下使其变厚和肿胀时发生黄斑水肿，黄斑是视网膜的黄色中央区域。肿胀可以使人的中央视觉扭曲，原因在于黄斑位于眼球后部视网膜的中心附近。该区域容纳紧密包装的视网膜椎体，其提供灵敏清楚的中央视觉允许人们看清直接在视线上的形式、颜色和详情。囊样黄斑水肿是一种类型的包括包囊形成的黄斑水肿。

组合治疗：在某些实施方案中，本发明所述的双特异性抗体或药物组合物单独施用(不具有另外的治疗剂)，用于治疗一种或多种本文所述的眼血管疾病。

在另一些实施方案中，本发明所述的双特异性抗体或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂或方法组合施用，用于治疗一种或多种本文所述的眼血管疾病。

在另一些实施方案中，本发明所述的双特异性抗体或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合配制并且施用，用于治疗一种或多种本文所述的眼血管疾病。

在某些实施方案中，本文提供的组合治疗包括这样的施用：本发明所述的双特异性抗体或药物组合物与一种或多种用于治疗一种或多种本文所述的眼血管疾病的另外的治疗剂先后施用。

所述另外的治疗剂包括，但不限于，色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)，EyeOOl(抗-VEGF聚乙二醇化的适体)，角鲨胺，RETAANE(TM)(用于长效混悬液的乙酸阿奈可他(anecortave acetate)；Alcon，Inc.)，考布他汀A4前药(Combretastatin A4 Prodrug，CA4P)，MACUGEN(TM)，MIFEPREX(TM)(米非司酮(mifepristone)-ru486)，subtenon曲安奈德(triamcinolone acetonide)，玻璃体内结晶曲安奈德(intravitrealcrystalline triamcinolone acetonide)，普啉司他(Prinomastat)(AG3340-合成的基质金属蛋白酶抑制剂，Pfizer)，氟西奈德(fluocinoloneacetonide)(包括氟轻松眼内植入物(fluocinolone intraocular implant)，Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)，VEGFR抑制剂(Sugen)，VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)，伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)和SU1 1248(舒尼替尼(sunitinib))，利诺胺(linomide)，和整联蛋白v.β.3功能和拮抗剂的抑制剂。

可以与本发明所述的双特异性抗体或药物组合物组合使用的其他的药物治疗剂包括，但不限于，使用非热激光的VISUDYNE(TM)，PKC412，Endovion(NeuroSearch A/S)，神经营养因子，包括，例如，胶质细胞衍生的神经营养因子和睫状神经营养因子，diatazem，多佐胺(dorzolamide)，Phototrop，9-顺式-视黄醛，眼药(包括Echo治疗)，包括碘依可酯(phospholine iodide)或依可酯(echothiophate)或碳酸酐酶抑制药(carbonic anhydrase inhibitors)，AE-941(AEterna Laboratories，Inc.)，Sirna-027(Sima Therapeutics，Inc.)，培加他尼(pegaptanib)(NeXstarPharmaceuticals/Gilead Sciences)，神经营养蛋白(neurotrophins)(包括，仅是举例，NT-4/5，Genentech)，Cand5(Acuity Pharmaceuticals)，INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)，整联蛋白拮抗剂(包括来自JeriniAG and Abbott Laboratories的那些)，EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)，BDM-E(BioDiem Ltd.)，沙立度胺(thalidomide)(例如，由EntreMed，Inc.使用)，心脏营养素-1(cardiotrophin-1)(Genentech)，2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol)(Allergan/Oculex)，DL-8234(Toray Industries)，NTC-200(Neurotech)，四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)(University ofMichigan)，LYN-002(Lynkeus Biotech)，微藻(microalgal)化合物(Aquasearch/Albany，Mera Pharmaceuticals)，D-9120(Celltech Group pic)，ATX-S10(Hamamatsu Photonics)，TGF-β2(Genzyme/Celtrix)，酪氨酸激酶抑制剂(Allergan，SUGEN，Pfizer)，NX-278-L(NeXstarPharmaceuticals/Gilead Sciences)，Opt-24(OPTIS France SA)，视网膜细胞神经节神经保护剂(retinal cell ganglion neuroprotectants)(CogentNeurosciences)，N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)，KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)，环孢素A(cyclosporin A)，Timitedretinal translocation″，光动力学治疗，(包括，仅以举例方式，靶向受体的PDT，Bristol-Myers Squibb，Co.；与PDT一起注射的卟吩姆钠(porfimer sodium)；维替泊芬(verteporfin)，QLT Inc.；罗培泊芬(rostaporfin)与PDT，Miravent Medical Technologies；他拉泊芬钠(talaporfin sodium)与PDT，Nippon Petroleum；莫特沙芬镥(motexafinlutetium)，Pharmacyclics，Inc.)，反义寡核苷酸(包括，例如，由NovagaliPharma SA和ISiS-13650，Isis Pharmaceuticals测试的产品)，激光光凝术，玻璃疣激光术，黄斑裂孔手术，黄斑易位手术，可植入的微型镜管，Phi-Motion血管造影术(还称为显微-激光治疗(Micro-Laser Therapy)和Feeder Vessel治疗)，质子束治疗，微刺激治疗，视网膜剥离和玻璃体手术，巩膜扣(Scleral Buckle)，黄斑下手术(Submacular Surgery)，经瞳孔的热治疗(Transpupillary Thermotherapy)，光系统I治疗，应用RNA干扰(RNAi)，体外rheopheresis(extracorporeal rheopheresis)(也称为膜分化的过滤和Rheotherapy(membrane differential filtration andRheotherapy))，微型芯片植入，干细胞治疗，基因替换治疗，核酶基因治疗(包括用于缺氧响应元件的基因治疗，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因治疗，GenVec)，光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin，Inc.；视网膜细胞植入物，Cell Genesys，Inc.)，和针灸。

任何抗-血管生成剂可以与本发明所述的双特异性抗体或药物组合物组合使用，其包括，但不限于，Carmeliet和Jain，2000，Nature(自然)407：249-257所列出的那些。在某些实施方案中，所述抗-血管生成剂是另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗-VEGFR抗体、低分子量的VEGFR酪氨酸激酶抑制剂和它们的任意组合，并且这些包括抗-VEGF适体(例如，培加尼布(Pegaptanib))，可溶性重组诱饵受体(例如VEGF Trap)。在某些实施方案中，所述抗-血管生成剂包括皮质类固醇，拮抗剂类固醇，乙酸阿奈可他，血管生成抑制因子(angiostatin)，内皮他丁(endostatin)，减少VEGFR或VEGF配体表达的小干扰RNA′s，使用酪氨酸激酶抑制剂的后-VEGFR阻断，MMP抑制剂，IGFBP3，SDF-1阻断剂，PEDF，γ-分泌酶，δ-样配体4，整联蛋白拮抗剂，HIF-1α阻断，蛋白激酶CK2阻断，和使用血管内皮钙粘蛋白(CD144)和间质衍生的因子(SDF)-I抗体抑制归巢到新生血管形成位点的干细胞(即，内皮祖细胞)。

还可以使用靶向VEGF受体的小分子RTK抑制剂，包括PTK787。还可以使用具有针对新生血管形式的活性的试剂(不必是抗-VEGF化合物)，并且包括抗炎性药物，m-Tor抑制剂，雷帕霉素(rapamycin)，依维莫司(everolismus)，temsirolismus，环孢素(cyclospohne)，抗-TNF试剂，抗-补体试剂，和非类固醇类的抗炎剂。还可以使用神经保护性且能够潜在地减少干性黄斑变性的进展的试剂，诸如称为‘神经类固醇’的药物种类。这些包括下述药物，如脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)(DHEA)(商标名称：Prastera(R)和Fidelin(R))，硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate)，和硫酸孕烯诺龙(pregnenolonesulfate)。任何AMD(年龄相关的黄斑变性)治疗剂可以与本发明所述的双特异性抗体或药物组合物组合使用，包括，但不限于，与PDT组合的维替泊芬，培加他尼钠(pegaptanib sodium)，锌或抗氧化剂(单独的或以任意组合的)。

术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物，如人患者和非人灵长类，以及实验用动物，如兔、大鼠和小鼠，以及其他动物。动物包括所有的脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如狗、猫、绵羊、母牛、猪、兔、鸡等。用于实施本发明的治疗方法的优选的受试者是人。需要治疗的受试者包括已经患有眼血管疾病或病症的患者以及倾向于发展此类病症的那些人。

用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。

术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F.L.，van der Eb，A.J.，Virology(病毒学)52(1973)546-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如，一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，S.N.，等，PNAS.(美国科学院院报).69(1972)2110-2114所述。

用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”是核酸分子，特别是自我复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。

提供下述实施例、序列表和附图来辅助对本发明的理解，其真正目的是在附上的权利要求书中列出。应该理解，在不背离本发明的精神的前提下，可以在所述的方法中进行修改。

序列表(氨基酸序列)描述

在下文中，列出本发明的实施方案：

1.一种双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，

其中

i)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQID NO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

2.根据实施方案1所述的双特异性抗体，其中

i)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列作为重链可变结构域VH，和SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL；和

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为重链可变结构域VH，和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL。

3.根据实施方案1-2中任一项所述的双特异性抗体，其中iii)所述的恒定重链区是IgG1亚类的。

4.根据实施方案3所述的双特异性抗体，其中所述IgG1亚类的恒定重链区还包含突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

5.根据实施方案1-2中任一项所述的双特异性抗体，其中iii)所述的恒定重链区是IgG4亚类的。

6.根据实施方案5所述的双特异性抗体，其中所述IgG4亚类的恒定重链区还包含突变S228P和L235E(按照Kabat的EU索引编号)。

7.根据实施方案5所述的双特异性抗体，其中所述IgG4亚类的恒定重链区还包含突变S228P、L235E和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

8.一种药物组合物，其包含实施方案1-7中任一项所述的抗体。

9.根据实施方案1-7中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗眼血管疾病。

10.实施方案1-7中任一项所述的双特异性抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的应用。

11.根据实施方案9或10中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。

12.一种治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过给需要所述治疗的患者施用实施方案1-7中任一项所述的抗体。

13.编码实施方案1-7中任一项所述的双特异性抗体的核酸。

14.含有实施方案13所述的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。

15.包含实施方案14所述的载体的原核或真核宿主细胞。

16.一种制备实施方案1-7中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括下述步骤：

a)用包含编码所述抗体的核酸分子的载体转化宿主细胞；

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养物回收所述抗体分子。

17.通过实施方案16的方法获得的双特异性抗体。

18.一种双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于其包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的氨基酸序列。

19.一种双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于其包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

20.一种双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于其包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列。

实验方法

表1：双特异性抗体及其各自的序列

请注意，术语“具有(所述)突变AAA”用在本文中是指在IgG1或IgG4的恒定重链区中的突变I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)和H435A(His435Ala)(编号按照Kabat的EU索引进行)，术语“具有(所述)突变P329G LALA”用在本文中是指在IgG1亚类的恒定重链区中的突变L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)和P329G(Pro329Gly)(编号按照Kabat的EU索引进行)，术语“具有(所述)突变SPLE”用在本文中是指在IgG4亚类的恒定重链区中的S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)(编号按照Kabat的EU索引进行)。

实施例

材料和一般方法

在Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白序列)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman，G.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))对抗体链的氨基酸进行编号和描述。

重组DNA技术

将标准方法用于操作DNA，如在Sambrook，J.，等，MolecularCloning：A laboratory manual(分子克隆：实验室手册)；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。

基因合成

按照Geneart(Regensburg，德国)提供的详细说明定购需要的基因片段。

DNA序列确定

通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，德国)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，德国)进行的双链测序来确定DNA序列。

DNA和蛋白序列分析和序列数据处理

使用GCG′s(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2版本和Infomax′s Vector NT1 Advance suite版本8.0来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。

表达载体

为了表达所述的抗体，应用基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造(organization)或基于具有CMV启动子的基因组构造的用于在细胞中瞬时表达(例如在HEK293-F中)的表达质粒的变体。

除抗体表达盒以外，所述载体包括：

-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌(E.coli)中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，和

-来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因作为在真核细胞中的选择性标记；

-由下述元件组成的抗体基因的转录单位：

-5’末端处的独特限制位点

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，

-在cDNA组构的情形中，随后是内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人抗体链(野生型或具有结构域交换)作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组构

-具有聚腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和

-3’末端处的独特限制位点。

如下所述的包括抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生，并使用已知的重组方法和技术，通过在各自的载体中例如利用特有的限制性位点来连接相应的核酸区段来装配。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制剂来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。

细胞培养技术

如在Current Protocols in Cell Biology(细胞生物学中的当前方法)(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编)，John Wiley&Sons，Inc中所述使用标准细胞培养技术。

双特异性抗体通过在悬浮生长的HEK29-F细胞中瞬时共转染各种表达质粒进行表达，如下文所述。

实施例1

表达和纯化

在HEK293-F系统中瞬时转染

通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照制造商的说明瞬时转染各种质粒(例如，编码重链和修饰的重链和相应的轻链和修饰的轻链)来生成双特异性抗体。简言之，用四种表达质粒和293fectin^TM或fectin(Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyle^TM293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，HEK293-F细胞以1.0E*6个细胞/mL的密度接种在600mL中并以120rpm，8％CO2温育。次日，用大约42mL的混合物，以大约1.5E*6个细胞/mL的细胞密度来转染细胞，所述混合物为A)具有600μg分别编码等摩尔比的重链或修饰的重链，和相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μl/mL)的混合物。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获包含分泌的抗体的上清液，并且直接由上清液纯化抗体，或冷冻并保存上清液。

纯化

通过使用MabSelectSure-Sepharose^TM(用于非_AAA突变体)(GEHealthcare，Sweden)或kappaSelect-Agarose(用于AAA突变体)(GEHealthcare，Sweden)的亲和层析法，使用丁基-Sepharose(GE Healthcare，Sweden)的疏水相互作用层析法和Superdex 200大小排阻(GE Healthcare，Sweden)层析法，从细胞培养物上清液纯化双特异性抗体。

简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelect SuRe树脂上，用平衡缓冲液洗涤，并用pH 3.0的25mM柠檬酸钠洗脱。AAA突变体捕获在用25mM Tris，50mM NaCl，pH 7.2平衡的kappaSelect选择树脂上，用平衡缓冲液洗涤，并用pH 2.9的25mM柠檬酸钠洗脱。汇集洗脱的蛋白级分，并用2M Tris，pH 9.0中和。通过加入1.6M硫酸铵溶液至硫酸铵的终浓度为0.8M并用乙酸调节pH至pH 5.0，制备抗体汇集物用于疏水相互作用层析。用35mM乙酸钠，0.8M硫酸铵，pH 5.0平衡丁基-Sepharose树脂后，将所述抗体上样到树脂上，用平衡缓冲液洗涤，并用线性梯度洗脱到pH 5.0的35mM乙酸钠中。汇集含有双特异性抗体的级分，进一步使用用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex 200 26/60GL(GE Healthcare，Sweden)柱通过大小排阻层析纯化。汇集含有双特异性抗体的级分，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.，France)浓缩至需要的浓度，并且保存在-80℃。

表2：双特异性<VEGF-ANG-2>抗体的产量

在每个纯化步骤后通过使用微流体Labchip技术(microfluidicLabchip technology，Caliper Life Science，USA)的CE-SDS分析纯度和抗体完整性。制备5μl的蛋白溶液用于利用HT蛋白表达试剂盒按照供应商的使用说明进行CE-SDS分析和使用HT蛋白表达芯片在LabChipGXII系统上分析。数据利用LabChip GX软件进行分析。

表3：通过由CE-SDS确定的不同顺序的纯化步骤去除典型的副产物。

使用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)在2xPBS(20mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，274mM NaCl和5.4mM KCl，pH 7.4)运行缓冲液中在25℃通过高效SEC分析抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白以0.75ml/min的流速注射到柱上，并且等度洗脱50分钟。

类似地，制备并纯化<VEGF-ANG-2>双特异性抗体VEGFang2-0012和VEGFang2-0201，具有下述产量：

也可以类似地制备和纯化具有AAA突变和SPLE突变的<VEGF-ANG-2>双特异性抗体<VEGF-ANG-2>CrossMAb IgG4(SEQID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32)，具有AAA突变的<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG1(SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35)和具有AAA突变和SPLE突变的<VEGF-ANG-2>OAscFab IgG4(SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38)。

实施例2

分析和可展性(Developability)

小规模的基于DLS的粘度测量

粘度测量基本上按照(He，F.等，Analytical Biochemistry(分析生物化学)399(2009)141-3)中所述进行。简言之，在加入聚苯乙烯胶乳珠(直径为300nm)和聚山梨醇酯20(0.02％v/v)之前，将样品浓缩至在pH 5.5的200mM精氨酸琥珀酸酯中的各种蛋白浓度。通过经由0.4μm滤板的离心将样品转移到光学384-孔平板中，并用石蜡油覆盖。通过在25℃的动力光散射确定胶乳珠的表观直径。溶液的粘度可以计算为：η＝η0(rh/rh，0)(η：粘度；η0：水的粘度；rh：胶乳珠的表观流体动力学半径；rh，0：胶乳珠在水中的流体动力学半径。

为了允许在相同的浓度下比较各种样品，将粘度-浓度数据用门尼方程(Mooney equation)(方程1)(Mooney，Colloid Sci，1951；Monkos，Biochem.Biophys.Acta 1997)和由此内插的数据进行拟合。

$\mathrm{\&eta;}={\mathrm{\&eta;}}_0\exp \left(\frac{\mathrm{S\&Phi;}}{1-\mathrm{K\&Phi;}}\right)$   方程1

(S：蛋白的流体动力学相互作用参数；K：自集因子(self-crowdingfactor)；Φ：溶解的蛋白的体积分数)

结果显示在图2中：与在Fc部分不具有AAA突变的VEGFang2-0015相比，在Fc部分具有AAA突变的VEGFang2-0016在所有检测温度均显示出较低的粘度。

DLS聚集开始温度

在20mM组氨酸/组氨酸氯化物，140mM NaCl，pH 6.0中以1mg/mL的浓度制备样品，通过经由0.4μm滤板的离心转移到光学384-孔平板中，并且用石蜡油覆盖。在以0.05℃/min的速率从25℃至80℃加热所述样品时，通过动力光散射重复测量流体动力学半径。聚集开始的温度定义为流体动力学半径开始增加的温度。结果显示在图3中。在图3中，显示了不具有AAA突变的VEGFang2-0015相对于在Fc部分具有AAA突变的VEGFang2-0016的聚集VEGFang2-0016表现出61℃的聚集开始温度，而不具有AAA突变的VEGFang2-0015表现出60℃的聚集开始温度。

DLS时程

在20mM组氨酸/组氨酸氯化物，140mM NaCl，pH 6.0中以1mg/mL的浓度制备样品，通过经由0.4μm滤板的离心转移到光学384-孔平板中，并且用石蜡油覆盖。在将所述样品保持在50℃的恒定温度多至145小时时，通过动力光散射重复测量流体动力学半径。在该实验中，天然未折叠的蛋白在升高的温度下的聚集倾向将引起平均颗粒直径随时间的增加。这种基于DLS的方法对聚集物非常灵敏，原因在于这些聚集物高比例地(over-proportionally)贡献于三色的光强度。甚至在50℃(接近聚集开始温度的温度，见上文)145小时后，对于VEGFang2-0015和VEGFang2-0016二者，仅发现小于0.5nm的平均颗粒直径增加。

以100mg/ml在40℃存储7天(HMW增加)

将样品浓缩至在pH 5.5的200mM精氨酸琥珀酸酯中100mg/mL的终浓度，无菌过滤并且在40℃静置保存7天。在保存之前和之后，通过大小排阻层析法确定高分子量和低分子量种类(分别为HMWs和LMWs)的含量。在保存的样品与制备后立即测量的样品之间的HMW和LMW含量的差别分别报告为“HMW增加”和“LMW增加”。结果显示在表4和图4中，其显示与VEGF Ang2-0016(具有AAA突变)相比，VEGFang2-0015(无AAA突变)表现出更高的主峰减少和更高的HMW增加。令人惊讶地，与VEGFang2-0015(无AAA突变)相比，VEGFAng2-0016(具有AAA突变)显示出较低的聚集倾向性。

表4：在40℃7天后的δ主峰、HMW和LMW峰

使用T100或T200仪器(GE Healthcare)在25℃通过表面等离子共振(SPR)测定抗-VEGF和抗-Ang2双特异性抗体的功能分析。系统充分建立用于分子相互作用的研究。SPR-技术是基于接近于金包被的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的改变表示由固定的配体与以溶液注射的分析物之间的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子结合表面上固定的配体，则质量增加，并且反之亦然，在分析物与固定的配体解离的情形中，质量减少(反映复合物解离)。SPR允许对配体/分析物结合的持续的实时监测，由此确定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。

实施例3

与VEGF、Ang2、FcγR和FcRn的结合

VEGF同种型动力学亲和性包括物种-交叉反应性的评估

使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，将大约12000个共振单位(RU)的捕获系统(10μg/ml山羊抗人F(ab)’₂；Order Code：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden)在pH 5.0偶联到CM5芯片(GEHealthcare BR-1005-30)上。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20)pH 7.4。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并且用运行缓冲液致敏两次。通过以5μl/min的流速注射50nM溶液30秒而捕获双特异性抗体。通过300秒的以30μl/min的流速从300nM开始以1∶3稀释注射在溶液中不同浓度的人hVEGF121、小鼠mVEGF120或大鼠rVEGF164测量缔合。解离相监测多至1200秒，并且通过由样品溶液转换至运行缓冲液而引发。通过用pH 2.1的甘氨酸溶液以30μl/min的流速洗涤60秒而使表面再生。通过减去由山羊抗人F(ab’)₂表面获得的反应而校正本体折射率差异(Bulkrefractive index differences)。也减去空白注射液(＝双重参比)。使用Langmuir 1∶1模型计算表观K_D和其他动力学参数。结果显示在表5中。

Ang2溶液亲和力包括物种交叉反应性的评估

通过确定平衡混合物中游离相互作用配偶体的浓度，溶液亲和力测量相互作用的亲和力。溶液亲和力测定包括混合<VEGF-ANG-2>双特异性抗体，保持在恒定浓度，使用不同浓度的配体(＝Ang2)。使用由GEHealthcare供应的胺偶联试剂盒，将最大可能共振单位(例如，17000个共振单位(RU))的抗体在pH 5.0固定在CM5芯片(GE HealthcareBR-1005-30)表面上。样品和系统缓冲液是HBS-P pH 7.4。流动池设置为25℃，并且样品区组设置为12℃，并用运行缓冲液致敏两次。为了产生校正曲线，将增加浓度的Ang2注射到含有固定的VEGF-ANG-2>双特异性抗体的BIAcore流动池中。结合的Ang2的量确定为共振单位(RU)并且针对浓度绘图。每种配体溶液(对于VEGF-ANG-2>双特异性抗体，从0至200nM的11个浓度)用10nM Ang2温育，并且允许在室温达到平衡。由在用已知量的Ang2测量溶液响应之前和之后产生的校正曲线确定游离的Ang2浓度。使用游离Ang2浓度作为y轴和用于抑制所用的抗体浓度作为x轴，利用Model 201，使用XLfit4(IDBS软件)设置4-参数拟合。通过确定该曲线的拐点计算亲和力。通过用0.85％H₃PO₄溶液以30μl/min的流速洗涤一次30秒，使表面再生。通过减去由空白偶联的表面获得的响应校正本体折射率差异。结果显示在表6中。

FcRn稳态亲和力

对于FcRn测量，稳态亲和力用于比较针对彼此的双特异性抗体。将人FcRn稀释到偶联缓冲液(10μg/ml，乙酸钠pH5.0)中，并且使用BIAcore向导通过靶向固定方法固定在C1-芯片(GE HealthcareBR-1005-35)上至终响应200RU。流动池设置为25℃，并且样品区组设置为12℃，用运行缓冲液致敏两次。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20)pH 6.0。为了对每种抗体评估不同的IgG浓度，制备62.5nM、125nM和250nM、500nM的浓度。流速设定为30μl/min，并且将不同的样品连续注射到芯片表面上，选择180秒的缔合时间。通过以30μl/min的流速注射pH 8的PBS-T60秒而使表面再生。通过减去由空白表面获得的响应而校正本体折射率差异。也减去缓冲液注射(＝双重参比)。使用来自Bia-Evaluation软件的方法计算稳态亲和力。简言之，将RU值(RU max)针对所分析的浓度绘图，产生剂量-响应曲线。基于2-参数拟合，计算上渐进线，允许确定半最大RU值，由此确定亲和力。结果显示在图5和表7中。类似地，可以确定针对食蟹猴、小鼠和兔FcRn的亲和力。

FcγRIIIa测定

使用直接结合测定进行FcγRIIIa测定。通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒将大约3000个共振单位(RU)的捕获系统(1μg/mlPenta-His；Quiagen)在pH 5.0偶联到CM5芯片上。样品和系统缓冲液为HBS-P+pH 7.4。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并且用运行缓冲液致敏两次。通过以5μl/min的流速注射100nM溶液60秒来捕获FcγRIIIa-His-受体。通过以30μl/的流速注射100nM的双特异性抗体或单特异性对照抗体(IgG1亚类的抗-Dig和IgG4亚类抗体)180秒来测量结合。通过用pH 2.5的甘氨酸溶液以30μl/min的流速洗涤120秒使表面再生。由于FcγRIIIa结合不同于Langmuir 1∶1模型，利用这一测定仅确定结合/无结合。以相似的方式可以确定FcγRIa和FcγRIIa结合。结果显示在图6中，其中其遵循通过引入突变P329G LALA，没能检测到更多的针对FcγRIIIa的结合。

针对<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的独立的VEGF-和Ang2-结合的评估

通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，将大约3500个共振单位(RU)的捕获系统(10μg/ml山羊抗人IgG；GE HealthcareBio-Sciences AB，Sweden)在pH 5.0偶联到CM4芯片(GE HealthcareBR-1005-34)上。样品和系统缓冲液为PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20)pH 7.4。流动池的温度设置为25℃，样品区组的温度设置为12℃。捕获前，将流动池用运行缓冲液致敏两次。

通过以5μl/min的流速注射10nM溶液60秒来捕获所述双特异性抗体。通过确定针对顺序或同时添加(流速为30μl/min)的每种配体的活性结合能力来分析每种配体与所述双特异性抗体的独立结合。

1.注射浓度为200nM的人VEGF 180秒(鉴定单一抗原结合)

2.注射浓度为100nM的人Ang2 180秒(鉴定单一抗原结合)

3.注射浓度为200nM的人VEGF 180秒，接着另外注射浓度为100nM的人Ang2 180秒(在VEGF的存在下鉴定Ang2结合)

4.注射浓度为100nM的人Ang2180秒，接着另外注射浓度为200nM的人VEGF(在Ang2的存在下鉴定VEGF结合)

5.共同注射浓度为200nM的人VEGF和浓度为100nM的人Ang2180秒(同时鉴定VEGF结合和Ang2结合)。

通过以30μl/min的流速用3m MgCl2溶液洗涤60秒使表面再生。通过减去由山羊抗人IgG表面获得的响应而校正本体折射率差异。

如果上述方法3，4&5得到的最终信号等于或与方法1和2各自的最终信号的总和相似，则所述双特异性抗体能够独立地交互地结合两种抗原。结果显示在表9中，其中两种抗体VEGFang2-0016、VEGFang2-0012都显示出能够独立地交互地结合VEGF和ANG2。

与<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的同时VEGF-和Ang2-结合的评估

第一，通过使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，将大约1600个共振单位(RU)的VEGF(20μg/ml)在pH 5.0偶联到CM4芯片(GEHealthcare BR-1005-34)上。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20)pH 7.4。。流动池设置为25℃，并且样品区组设置为12℃，并且用运行缓冲液致敏两次。第二，将50nM双特异性抗体溶液以30μl/min的流速注射180sec。第三，以30μl/min的流速注射hAng-2 180秒。hAng-2的结合响应取决于与VEGF结合的双特异性抗体的量，并且表现出同时结合。通过用0.85％H3PO4溶液以30μl/min的流速洗涤60秒使表面再生。通过hAng2与之前VEGF结合的<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的另外的特异性结合信号显示同时结合。对于两种双特异性抗体VEGFang2-0015和VEGFang2-0016，可以检测到与<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的同时的VEGF-和Ang2-结合(数据未显示)。

表5：结果：针对来自不同物种的VEGF同种型的动力学亲和力

表6：结果：针对Ang2的溶液亲和力

表7：结果：<VEGF-ANG-2>双特异性抗体针对FcRn的亲和力

表8：针对FγRI-IIIa的结合结果

表9：结果：VEGF-和Ang2针对<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的独立的结合

实施例4

质谱法

本部分描述<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的表征，重点强调正确的组装。通过去糖基化的、并且完好或IdeS-消化(化脓链球菌(S.pyogenes)的IgG-降解酶)的VEGF-ANG-2>双特异性抗体的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)来验证预测的一级结构。IdeS-消化这样进行：在100mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH 7.1中用2μg IdeS蛋白酶(Roche)在37℃温育100μg纯化的抗体5小时。随后，将所述抗体以1mg/ml的蛋白浓度在37℃在100mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH 7.1中用N-糖苷酶F、神经氨酸酶和O-糖苷酶(Roche)中去糖基化多至16小时，然后在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上通过HPLC脱盐。通过在装配有TriVersa NanoMate来源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上进行的ESI-MS确定总质量。

关于IdeS-消化的、去糖基化的(表10)、或完好的、去糖基化的(表11)分子获得的质量对应于由<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的氨基酸序列推断的预测质量，所述双特异性抗体由两个不同的轻链LC_Ang2和LC_Lucentis以及两个不同的重链HC_Ang2和HC_Lucentis组成。

表10：去糖基化的且IdeS-消化的双特异性<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0201(无AAA突变)和VEGFang2-0012(有AAA突变)的质量

表11：去糖基化的<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0016(有AAA突变)和VEGFang2-0015(无AAA突变)的质量

实施例5

Fc-Rn层析法

与链霉抗生物素蛋白sepharose偶联

向生物素化且透析的受体中加入1克链霉抗生物素蛋白sepharose(GE Healthcare)，并且摇动温育两小时。将受体衍生的sepharose填装到1ml XK柱(GE Healthcare)中。

使用FcRn亲和柱的层析

条件：

柱尺寸：50mmx5mm

床高度：5cm

上样：50μg样品

平衡缓冲液：20mM MES，具有150mM NaCl，调节至pH 5.5

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl，具有150mM NaCl，调节至pH 8.8

洗脱：7.5CV平衡缓冲液，在30CV 100％洗脱缓冲液中，10CV洗脱缓冲液中

人FcRn亲和柱层析

在下表中，提供<VEGF-ANG-2>双特异性抗体在包含人FcRn的亲和柱上的保留时间。数据使用上述条件获得。在下表中，提供<VEGF-ANG-2>双特异性抗体关于人FcRn的保留时间。

表12：结果：<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的保留时间

实施例6

药物代谢动力学(PK)特性

使用针对人FcRn为转基因的Fc-Rn小鼠得到的PK数据

在生活相中

本研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景)；缺失FcRn但是对人FcRn是半合子转基因的小鼠(huFcRn，品系276-/tg)。

第1部分

所有小鼠都玻璃体内注射一次，注射到右眼中2μL/只动物的适当的溶液(即，21μg化合物/只动物(VEGFAng2-0015(无AAA突变)或23.6μg化合物/只动物(VEGFAng2-0016(有AAA突变))。

将小鼠分成2组，每组6只动物。组1在第2、24和96小时采集血样，组2在给药后7、48和168小时采集血样。

向小鼠右眼玻璃体内的注射通过使用来自德国柏林PrecisionInstruments，Inc.的用于纳升注射的NanoFil微注射器系统。用2.5％异氟醚麻醉小鼠，并且对于小鼠眼的显现，使用具有40倍放大率的LeicaMZFL 3显微镜和具有Leica KL 2500LCD闪光的环形光(ring-light)。然后，使用35号针头注射2μL的化合物。

通过对侧眼的眼球后静脉丛从每只动物采集血液，用于确定血清中的化合物水平。

在室温1小时后，通过在4℃离心(9300xg)3分钟，从血液获得至少50μl的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻，并且在分析之前冷冻保存在-80℃。组1的动物的治疗的眼在治疗后96小时分离出来，并且组2的动物的眼在治疗后168小时分离出来。在分析之前，样品冷冻保存在-80℃。

第2部分

所有小鼠通过尾静脉静脉内注射一次，注射200μL/只动物的适当的溶液(即，21μg化合物/只动物(VEGFAng2-0015(无AAA突变)或23.6μg化合物/只动物(VEGFAng2-0016(有AAA突变))。

将小鼠分成2组，每组5只动物。组1在第1、24和96小时采集血样，组2在给药后7、48和168小时采集血样。从每只动物经由眼球后静脉丛采集血液，用于血清血清中的化合物水平。

在室温1小时后，通过在4℃离心(9300xg)3分钟，从血液获得至少50μl的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻，并且在分析之前冷冻保存在-80℃。

制备全眼裂解物(小鼠)

通过物理-化学破碎来自实验室动物的全眼获得眼裂解物。对于机械分解，将每只眼转移到1.5-mL具有圆锥形底部的微瓶中。冷冻并解冻后，眼用1mL细胞洗涤缓冲液洗涤一次(Bio-Rad，Bio-Plex细胞裂解试剂盒，Cat.No.171-304011)。在下一步骤中，加入500μL新鲜制备的细胞裂解缓冲液，并且使用1.5mL组织碾磨研棒(Kimble Chase，1.5mL研棒，Art.No.749521-1500)将眼碾碎。然后，将混合物冷冻并解冻五次，并且再次碾磨。为了分离裂解物和其余的组织，将样品以4500g离心4分钟。离心后，收集上清液，并且以定量ELISA进一步分析之前保存在-20℃。

分析

利用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定<VEGF/ANG2>抗体在小鼠血清和眼裂解物中的浓度。

为了定量小鼠血清样品和眼裂解物中的<VEGF/ANG2>抗体，进行标准的固相系列夹心免疫测定，其中使用生物素酰化和洋地黄毒苷化的(digoxigenated)单克隆抗体作为捕获和检测抗体。为了证实分析物双特异性的完整性，所述生物素酰化的捕获抗体识别抗-VEGF-结合位点，而所述洋地黄毒苷化的检测抗体将于分析物的抗-Ang2结合位点结合。然后，用与抗洋地黄毒苷抗体偶联的辣根过氧化物酶检测在链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定平板(SA-MTP)的固相上的捕获抗体、分析物和检测抗体的结合的免疫复合物。洗去SA-MTP的未结合的物质并且加入ABTS-底物后，得到的信号与结合在SA-MTP的固相上的分析物的量成比例。然后，通过参照平行分析的校正剂将测量的样品信号转化成浓度来进行定量。

在第一步中，SA-MTP用100μL/孔的浓度为1μg/mL的生物素酰化的捕获抗体溶液(mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS))在MTP-摇动器上以500rpm包被1小时。同时制备校正剂、QC-样品和样品。将校正剂和QC-样品稀释至2％血清基质；稀释样品直到信号在校正剂的线性范围内。

用捕获抗体包被SA-MTP后，用洗涤缓冲液300μL/孔洗涤平板三次。然后，将100μl/孔的校正剂、QC-样品和样品移液到SA-MTP上，并以500rpm再温育1小时。现在，分析物通过捕获抗体以其抗-VEGF结合位点结合在SA-MTP的固相上。温育并通过洗涤平板去除未结合的分析物后，向SA-MTP加入100μL/孔浓度为250ng/mL的第一检测抗体(mAb<Id-<Ang2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu))。同样地，将平板在摇动器上以500rpm温育1小时。洗涤后，向SA-MTP的孔中加入100μL/孔浓度为50mU/mL的第二检测抗体(pAb<洋地黄毒苷>S-Fab-POD(poly))，并且将平板以500rpm再温育1小时。在最后的洗涤步骤去除过量的检测抗体后，加入100μL/孔的底物(ABTS)。抗体-酶缀合物催化底物的颜色反应。然后，通过ELISA读取仪以405nm波长(参比波长：490nm([405/490]nm))测量信号。

药物代谢动力学评价

利用药物代谢动力学评价程序WinNonlinTM(Pharsight)，版本5.2.1通过非房室分析(non-compartmental analysis)计算药物代谢动力学参数。

结果：A)血清浓度

关于血清浓度的结果显示在表13-16和图7B-7C中。

表13：VEGFAng2-0015(无AAA突变)：比较玻璃体内和静脉内应用后的血清浓度

表14：VEGFAng2-0016(有AAA突变)：比较玻璃体内和静脉内应用后的血清浓度

表15：VEGFang2-0015(无AAA突变)和VEGFang2-0016(有AAA突变)：比较玻璃体内应用后的血清浓度

表16：VEGFang2-0015(无AAA突变)和VEGFang2-0016(有AAA突变)：比较静脉内应用后的血清浓度

结果：B)左眼和右眼的眼裂解物的浓度

关于眼裂解物中的浓度的结果显示在表17-18和图7D-7E中。

表17a：在玻璃体内应用到右眼中后VEGFang2-0015(无AAA突变)在眼裂解物中的浓度

表17b：静脉内应用后VEGFang2-0015(无AAA突变)在眼裂解物中的浓度

表18a：在玻璃体内应用到右眼中后VEGFang2-0016(有AAA突变)在眼裂解物中的浓度

表18b：静脉内应用后VEGFang2-0016(有AAA突变)在眼裂解物中的浓度

结果总结

玻璃体内应用后，与无AAA突变的双特异性<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0015相比，在眼裂解物中，本发明所述的双特异性<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0016(有AAA突变)显示出相似的浓度(96和168小时后)。

此外，玻璃体内应用后，与无AAA突变的双特异性<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0015相比，在血清中，本发明所述的双特异性<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0016(有AAA突变)另外显示出更快速的清除和更短的半衰期。

实施例7

小鼠角膜微囊血管发生测定

为了检测具有各自的SEQ ID NO：7和8的抗-VEGF VH和VL和具有SEQ ID NO：15和16的抗-ANG2VH和VL的双特异性<VEGF/ANG2>抗体在体内对VEGF诱导的血管发生的抗血管发生作用，我们进行小鼠角膜血管发生测定。在该测定中，将VEGF浸没的Nylaflo圆片以与边缘血管(limbal vessel)固定距离植入到无血管的角膜的囊中。血管立即向角膜中生长，倾向于发展VEGF梯度。8-10周龄的雌性Balb/c小鼠购自德国苏尔茨费尔德的Charles River。按照Rogers，M.S.，等，Nat.Protoc.2(2007)2545-2550所述的方法修改流程。简言之，在显微镜下，在麻醉的小鼠中使用手术刀片和尖锐的镊子在从边缘到角膜顶部的大约1mm处制备宽度约为500μm的微囊。植入直径为0.6mm的圆片(Pall Corporation，Michigan)，并且使植入区域的表面变平滑。圆片在相应的生长因子或在赋形剂(vehicle)中温育至少30分钟。在3、5和7天后(或备选地，仅在3、5和7天后)，对眼睛拍照，并且测量血管反应。通过计算新血管面积/角膜的总面积的百分数来定量测定。

所述圆片负载300ng VEGF或作为对照的PBS，并植入7天。在第3、5和/或7天，随时监测从边缘到圆片的血管生长。在圆片植入前的一天，以10mg/kg的剂量静脉内施用抗体(由于静脉内应用，血清-稳定的VEGFang2-0015(无AAA突变)(其与VEGFang2-0016区别仅在于AAA突变并且具有相同的抗-VEGF和抗-ANG2VHs和VLs来介导效应)用作替代物)，用于检测在体内对VEGF-诱导的血管发生的抗血管发生作用。对照组的动物接受赋形剂。应用体积为10ml/kg。

Claims (31)

1.一种用于减少抗体粘性的方法，其中所述抗体包含(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区，并且

其中所述方法包括：

用突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)修饰所述人IgG1或人IgG4亚类的抗体恒定重链区。

2.权利要求1的方法，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，

其中

i)特异性结合VEGF的所述第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)特异性结合ANG-2的所述第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQ IDNO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

3.权利要求2的方法，其中所述双特异性抗体包含(来源于人源的)人IgG1亚类的恒定重链区，其包含突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)，并且还包含突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

4.由权利要求1-3中任一项的方法获得的抗体。

5.突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)用于减少抗体粘性的应用，其中所述抗体包含(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

6.权利要求5的应用，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，

其中

i)特异性结合VEGF的所述第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)特异性结合ANG-2的所述第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQ IDNO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

7.权利要求6的应用，其中所述双特异性抗体包含(来源于人源的)人IgG1亚类的恒定重链区，其包含突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)，并且还包含突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

8.一种双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，

其中

i)特异性结合VEGF的所述第一抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3H区、SEQ ID NO：2的CDR2H区和SEQ IDNO：3的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3L区、SEQ ID NO：5的CDR2L区和SEQ ID NO：6的CDR1L区；和

ii)特异性结合ANG-2的所述第二抗原结合位点在重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3H区、SEQ ID NO：10的CDR2H区和SEQ IDNO：11的CDR1H区，并且在轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3L区、SEQ ID NO：13的CDR2L区和SEQ ID NO：14的CDR1L区，并且其中

iii)所述双特异性抗体包含含有突变I253A、H310A和H435A(按照Kabat的EU索引编号)的(来源于人源的)人IgG1或人IgG4亚类的恒定重链区。

9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其中

i)特异性结合VEGF的所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列作为重链可变结构域VH，和SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL；和

ii)特异性结合ANG-2的所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为重链可变结构域VH，和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL。

10.根据权利要求8-9中任一项所述的双特异性抗体，其中iii)所述的恒定重链区是IgG1亚类的。

11.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述IgG1亚类的恒定重链区还包含突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

12.根据权利要求8-9中任一项所述的双特异性抗体，其中iii)所述的恒定重链区是IgG4亚类的。

13.根据权利要求12所述的双特异性抗体，其中所述IgG4亚类的恒定重链区还包含突变S228P和L235E(按照Kabat的EU索引编号)。

14.根据权利要求12所述的双特异性抗体，其中所述IgG4亚类的恒定重链区还包含突变S228P、L235E和P329G(按照Kabat的EU索引编号)。

15.一种药物组合物，其包含权利要求4和8-14中任一项所述的抗体。

16.根据权利要求4和8-14中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗眼血管疾病。

17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。

18.编码权利要求8-14中任一项所述的双特异性抗体的核酸。

19.含有权利要求18所述的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。

20.包含权利要求19所述的载体的原核或真核宿主细胞。

21.一种制备权利要求8-14中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括下述步骤：

a)用包含编码所述抗体的核酸分子的载体转化宿主细胞；

b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和

c)从所述培养回收所述抗体分子。

22.通过权利要求21的方法获得的双特异性抗体。

23.一种双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于其包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的氨基酸序列。

24.一种双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于其包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

25.一种双特异性二价抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于其包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的氨基酸序列。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗眼血管疾病。

27.根据权利要求26所述的双特异性抗体，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。

28.权利要求4和8-14和权利要求23-25中任一项所述的双特异性抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的应用。

29.权利要求28的应用，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。

30.一种治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过给需要所述治疗的患者施用权利要求4和8-14和权利要求23-25中任一项所述的抗体进行。

31.权利要求30的方法，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。