ES2746136T3

ES2746136T3 - Anticuerpos modificados de unión a FcRn humano y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2746136T3
Application number: ES14721806T
Authority: ES
Inventors: Guido Hartmann; Joerg Thomas Regula; Matthias Rueth; Wolfgang Schaefer; Tilman Schlothauer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2020-03-04
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: SG11201508911PA; CA2904806C; JP7426190B2; AU2020201429A1; CN105143262A; CL2018002194A1; KR20160002858A; JP2016528167A; EP2992012A1; PL2992012T3; CL2018002193A1; JP7642574B2; SG10201800492PA; US20160159894A1; TWI747803B; CR20150512A; CA2904806A1; EP3628685A1; BR112015027385A2; KR20210094669A

Abstract

Un anticuerpo que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc, en el que el primer y el segundo polipéptido de la región Fc son ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana y comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y H435A están comprendidas en la región Fc.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos modificados de unión a FcRn humano y procedimientos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos y polipéptidos de fusión de la región Fc que se unen específicamente a ligandos de receptores solubles que tienen afinidades de unión modificadas con respecto al receptor de Fc neonatal humano, procedimientos para su producción, formulaciones farmacéuticas que contienen estos anticuerpos y usos de los mismos.

ANTECEDENTES

La angiogénesis está implicada en la patogenia de una variedad de trastornos que incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular senil (DMS), artritis reumatoide y psoriasis (Folkman, J. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M. et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; y Garner, A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A. y KlintWorth, G. K. (eds.), 2.a edición, Marcel Dekker, Nueva York (1994), pp. 1625-1710).

Ranibizumab (nombre comercial Lucentis®) es un fragmento de anticuerpo monoclonal derivado del mismo anticuerpo murino original que bevacizumab (Avastin). Sin embargo, ha madurado en afinidad para proporcionar una unión más fuerte a VEGF-A (documento WO 98/45331). Se conoce que el bloqueo de VEGF-A puede estar relacionado con algunas toxicidades sistémicas, por lo que al ranibizumab le falta una región Fc para reducir la semivida en suero y, en consecuencia, las toxicidades sistémicas. Es un agente antiangiogénico que ha sido aprobado para tratar el tipo "húmedo" de la degeneración macular senil (DMS), una forma común de pérdida de visión senil.

Las enfermedades vasculares oculares, tales como la degeneración macular senil (DMS) y la retinopatía diabética (RD), se deben a una neovascularización coroidea o retiniana anómala, respectivamente. Son las principales causas de pérdida de visión en los países industrializados. Dado que la retina consiste en capas bien definidas de elementos neuronales, gliales y vasculares, los trastornos relativamente pequeños, tales como los observados en la proliferación vascular o el edema, pueden dar lugar a una pérdida significativa de la función visual. Las degeneraciones retinianas hereditarias, como la retinosis pigmentaria (RP), también se asocian con anomalías vasculares, tales como el estrechamiento arteriolar y la atrofia vascular. Afectan a 1 de cada 3.500 individuos y se caracterizan por ceguera nocturna progresiva, pérdida de campo visual, atrofia del nervio óptico, atenuación arteriolar y pérdida central de la visión que a menudo progresa hasta la ceguera completa.

Las retinopatías isquémicas se caracterizan por la pérdida o disfunción de la vasculatura de la retina que da como resultado una reducción del flujo sanguíneo e hipoxia. La retina responde a la hipoxia generando señales para que crezcan nuevos vasos sanguíneos, pero estos nuevos vasos normalmente son frágiles y desorganizados. Es el crecimiento de estos nuevos vasos anómalos lo que crea la mayor parte de la amenaza para la visión, ya que pueden filtrar, dando lugar a una hemorragia o dando lugar a cicatrices que pueden terminar en desprendimiento de retina. Los tratamientos actuales para las retinopatías isquémicas buscan detener el crecimiento de los vasos patológicos, pero no abordan la isquemia subyacente que impulsa su crecimiento. Además, el tratamiento estándar para la retinopatía diabética, una retinopatía isquémica que afecta a millones de personas, implica la destrucción de una parte de la retina con un láser para intentar detener el crecimiento de nuevos vasos y preservar la visión central. Se han empleado estrategias para bloquear la función del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un importante promotor del crecimiento de los vasos. A corto plazo, la tratamiento anti-VEGF puede mejorar la visión, pero no aborda la isquemia subyacente y, de hecho, puede exacerbar esta afección, ya que inhibe el crecimiento de todos los vasos, incluidos los colaterales beneficiosos. También existe la seria preocupación de la exposición sistémica de estos fármacos en pacientes ancianos y/o diabéticos, donde se puede requerir el crecimiento de nuevos vasos en los cerebros, corazones o extremidades isquémicos.

Típicamente, para las enfermedades oculares a través de la aplicación intravítrea, a menudo se usan fragmentos de anticuerpos más pequeños como Fab o Fab², ya que tienen una semivida en suero baja y el riesgo de toxicidad sistémica es menor. Sin embargo, estos fragmentos más pequeños típicamente también tienen semividas intravítreas más bajas (por ejemplo, debido a la difusión más rápida en el suero) y tienen que dosificarse en general más a menudo.

Casi todos los receptores de Fc se unen asimétricamente a la región Fc simétrica de los anticuerpos.

Por ejemplo, el receptor IIIA de Fcy humano interactúa con diferentes residuos aminoacídicos en los dos polipéptidos de la región Fc. Por tanto, se deben usar mutaciones introducidas asimétricamente (por ejemplo, en la región bisagra inferior en los residuos 233 a 238) para incrementar o disminuir la interacción del anticuerpo con el receptor IIIA de Fcy humano.

Pero, la interacción entre el receptor de Fc neonatal humano FcRn es simétrica: dos moléculas de FcRn se pueden unir a una única IgG con una estequiometría 2:1 (véase, por ejemplo, Huber, A.W. et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). Por tanto, las mutaciones introducidas asimétricamente reducen la unión a/por un FcRn pero no a/por ambos.

Los ejemplos de moléculas asimétricas tipo IgG incluyen, pero no se limitan a, las obtenidas con las siguientes tecnologías o usando los siguientes formatos: Triomab/Quadroma, Knobs-into-Holes (botón en ojal), CrossMab, anticuerpos adaptados electrostáticamente, LUZ-Y, cuerpo de dominio genomanipulado por intercambio de cadena, Biclonic y DuoBody.

En el documento WO 2012/125850 se informa de proteínas que contienen Fc que comprenden sustituciones asimétricas en sus regiones Fc y que tienen una unión incrementada al receptor IIIA de Fcy humano y una actividad ADCC potenciada.

En el documento WO 2012/58768, heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en la que la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones aminoacídicas para promover la formación de heterodímeros con estabilidad incrementada, en el que la región Fc heterodimérica comprende además un dominio CH2 variante que comprende modificaciones asimétricas de aminoácidos para promover la unión selectiva de un receptor de Fcgamma.

En el documento WO 2011/131746 se informa de que, al introducir mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de las dos proteínas de partida monoespecíficas, la reacción de intercambio Fab-brazo se puede forzar para ser direccional y, de este modo, producir proteínas heterodiméricas altamente estables.

Kim et al. (Kim, H. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (2008) 2025-2029) informan de que, a excepción del tejido epitelial y coroideo pigmentario retiniano, los tejidos oculares, incluyendo el cuerpo ciliar y el iris, la retina, la conjuntiva, la córnea, el cristalino y el haz de nervios ópticos, mostraron la presencia de transcrito FcRn en el tamaño previsto. La barrera hematoocular mostró la expresión del receptor FcRn, lo que indica que el transporte de IgG desde los tejidos oculares hasta el sistema sanguíneo puede usar este receptor. Dado que los tejidos oculares internos, tales como la retina, están separados del sistema sanguíneo por la barrera hematoocular, no se esperaría detectar un anticuerpo de longitud completa en el sistema sanguíneo solo poco tiempo después de la inyección intravítrea. Sin embargo, los datos farmacocinéticos recientes de monos y humanos indican en todos los casos que el bevacizumab intravítreo aparece en la sangre en las horas siguientes a la inyección intravítrea. Por lo tanto, puede ser que la función del receptor FcRn en los vasos linfáticos conjuntivales sea actuar como un receptor de salida para la eliminación eficaz de los complejos de IgG antígeno-anticuerpo del espacio conjuntival. A pesar de los pesos moleculares similares, se detectó IgG (150 kDa) en el humor acuoso; sin embargo, no se detectó IgA (160 kDa). La discrepancia entre la penetración de IgG e IgA del suero al humor acuoso se puede explicar por la presencia de los receptores FcRn, que son selectivos para las IgG.

Kim et al. informaron también (Kim, H. et al., Mol. Vis. 15 (2009) 2803-2812) de que la inyección intravítrea directa se ha convertido en un enfoque común para administrar anticuerpos terapéuticos en el segmento posterior del ojo para tratar trastornos de la retina. Tanto el bevacizumab (IgG) como la IgY de pollo administrados por vía intravítrea superaron la limitante barrera interna de la membrana y se difundieron hacia las estructuras retinianas más profundas. Después de difundirse a través de la retina, el bevacizumab cruzó la barrera hematorretiniana y se filtró en la circulación sistémica. La IgY de pollo intrarretiniana solo se localizó a lo largo del lado abluminal de la barrera hematorretiniana. Además, en los vasos sanguíneos coroideos no se observó la presencia de IgY de pollo. Se han descubierto niveles séricos fisiológicamente relevantes de bevacizumab después de la administración intravítrea, que representan hasta el 30 % de la dosis inyectada. Esto sugiere un mayor riesgo de efectos secundarios sistémicos que los reconocidos previamente. La barrera hematoocular manifiesta un mecanismo específico para transportar y eliminar las IgG de longitud completa a la circulación sistémica. Su estudio actual confirma la hipótesis de que este mecanismo es el receptor de Fc neonatal.

Pero la unión a FcRn prolonga su semivida en la circulación, lo que potencialmente aumenta los efectos secundarios sistémicos.

Existe una necesidad en la técnica de mejores medios para tratar y prevenir diversas enfermedades vasculares oculares tales como las retinopatías isquémicas.

Magdelaine-Beuzelin, C. et al. informan, para los anticuerpos terapéuticos en oftalmología, de que lo antiguo vuelve a ser nuevo (MABS 2 (2010) 176-180).

Steinbrook, R. informa del precio de la vista - Ranibizumab, Bevacizumab y el tratamiento de la degeneración macular (New Eng. J. Med. 355 (2006) 1409-1412).

En el documento US 2011/236388 se informa de anticuerpos bivalentes anti-VEGF/anti-ANG-2.

Kuo, TT, et al. informan sobre el receptor de Fc neonatal: de la inmunidad a la terapéutica (J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789).

Medesan, C. et al. informan de la delineación de los residuos aminoacídicos involucrados en la transcitosis y el catabolismo de la IgG1 de ratón (J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217).

Qiao, S.-W. et al. informan de la dependencia de la presentación de antígeno mediada por anticuerpos en FcRn (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 9337-9342).

Kim, J.K., et al. informan del mapeo del sitio en la IgG humana para la unión del receptor relacionado con MHC de clase I, FcRn (Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825).

Kuo, T.T., et al. informan sobre el receptor de Fc neonatal y las terapias basadas en IgG (MABS 3 (2011) 422-438). El documento WO 2010/040508 divulgó anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-ANG-2.

Martin, W.L. et al. divulgaron la estructura cristalina a 2,8 ANG de un complejo FcRn/Fc heterodimérico y su mecanismo de unión dependiente del pH (Mol. Cell. 2001 (7) 867-877).

El documento WO 2010/045193 divulgó variantes de inmunoglobulinas y usos de las mismas.

SUMARIO

La invención se define por las reivindicaciones.

Para el uso de un anticuerpo que se dirige/se une a los antígenos no solo presentes en el ojo, sino también en el resto del cuerpo, una semivida sistémica corta después del paso de la barrera hematoocular desde el ojo a la sangre es beneficiosa para evitar los efectos secundarios.

También para un anticuerpo que se une específicamente a un ligando de un receptor y que es eficaz en el tratamiento de enfermedades oculares, el complejo antígeno-anticuerpo (= complejo anticuerpo-ligando de receptor) tiene después de la eliminación del ojo y después de que el anticuerpo (ya sea después de la disociación o como complejo) se deba eliminar de la circulación sistémica para evitar efectos secundarios, es decir, el anticuerpo funciona como un vehículo para la eliminación de los ligandos del receptor del ojo, inhibe de este modo la señalización del receptor y se elimina rápidamente de la circulación sanguínea para evitar efectos secundarios sistémicos.

Se ha descubierto que un anticuerpo que comprende una región Fc que no se une al receptor de Fc neonatal humano puede pasar la barrera hematoocular. Esto es sorprendente, ya que el anticuerpo no se une a FcRn humano, aunque se considera que la unión a FcRn es necesaria para el transporte a través de la barrera hematoocular.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc, en el que el primer y un segundo polipéptido de la región Fc son ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana y comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253a , H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y H435A están comprendidas en la región Fc. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo bivalente.

En un modo de realización,

i) el primer polipéptido de la región Fc se selecciona del grupo que comprende

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V,

- IgG1 o IgG4 humana con las mutaciones K392D, y

y

ii) el segundo polipéptido de la región Fc se selecciona del grupo que comprende

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones S354C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones Y349C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366W

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366W

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354C, T366W, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366W, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S354C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones Y349C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366W

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366W

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366W, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366W, - IgG1 humana con las mutaciones D399K, D356K y/o E357K, y

- IgG4 humana con las mutaciones D399K, E356K y/o E357K.

En un modo de realización,

i) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana, o

ii) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, o

iii) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, p329G, o

iv) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366S L368A, Y407V, o

v) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354c , T366W y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S L368A, Y407V, o

vi) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana, o

vii) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, o

viii) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, p 329G, o

ix) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366S L368A, Y407V, o

x) el primer polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc es un polipéptido de la región Fc IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico tiene una especificidad de unión que se une específicamente a ANG-2 humana y una especificidad de unión que se une específicamente a VEGF humano.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, en el que

i) el primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF comprende, en el dominio variable de cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 14, una región CDR2H de Se Q ID NO: 15 y una región CDR1H de SEQ ID NO: 16 y, en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3L de SEQ ID NO: 17, una región CDR2L de SEQ ID NO: 18 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 19, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende, en el dominio variable de cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 22, una región CDR2H de SEQ ID NO: 23 y una región CDR1H de SEQ ID NO: 24 y, en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3L de SEQ ID NO: 25, una región CDR2L de SEQ ID NO: 26 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 27.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana, en el que

i) el primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF comprende, como dominio variable de cadena pesada VH, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y, como dominio variable de cadena ligera VL, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende, como dominio variable de cadena pesada VH, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y, como dominio variable de cadena ligera VL, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende

a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y

b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en el que los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende

b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en el que el extremo N de la cadena pesada está conectado al extremo C de la cadena ligera por medio de un conector peptídico.

El anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.

El anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad vascular ocular.

Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención.

Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

Uso del anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

En el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para la eliminación de uno o más ligandos de receptores solubles del ojo.

En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para su uso en la eliminación de uno o más ligandos de receptores solubles del ojo.

En el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para el transporte de uno o más ligandos de receptores solubles desde el espacio intravítreo a la circulación sanguínea.

En el presente documento se describe un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para su uso en el transporte de uno o más ligandos de receptores solubles desde el espacio intravítreo a la circulación sanguínea.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no presenta unión detectable a FcRn usando resonancia de plasmón de superficie.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une a FcRn humano con un valor de Kd de más de 1,7 |jM a pH 6, es decir, con baja afinidad.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo tiene un tiempo de retención en una columna de cromatografía de afinidad por FcRn de tres minutos o menos.

En un modo de realización, la columna de afinidad por FcRn tiene las dimensiones de columna de 50 mm x 5 mm, la altura del lecho es de 5 cm y la carga es de 50 jg de anticuerpo. En un modo de realización, el tampón de equilibrado es MES 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 5,5, el tampón de elución es Tris/HCl 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 8,8 y la elución se realiza mediante la aplicación de 7,5 VC de tampón de equilibrado, del 0 % al 100 % de tampón de elución en 30 VC y, después de esto, 10 VC de tampón de elución.

En el presente documento se divulgan anticuerpos que tienen al menos las mutaciones I253A/H310A/H435A o H310A/H433A/Y436A o L251D/L314D/L432D o combinaciones de las mismas (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en ambos polipéptidos de la región Fc.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo tiene una región Fc heterodimérica.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular.

En el presente documento se describe un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para su uso en el transporte de un ligando de receptor soluble desde el ojo a través de la barrera hematoocular hasta la circulación sanguínea.

En el presente documento se describe un anticuerpo que comprende una región Fc con unión a FcRn suprimida para su uso en presente documento se describe un anticuerpo que comprende una región Fc con unión de FcRn suprimida para su uso en el tratamiento de enfermedades oculares, especialmente enfermedades vasculares oculares.

En un modo de realización de todos los aspectos, el tratamiento o la aplicación del anticuerpo es por aplicación intravítrea.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une a FcRn humano con un valor de Kd de más de 1,7 pM a pH 6, es decir, con baja afinidad.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo tiene el mismo o un tiempo de retención más corto en una columna de cromatografía de afinidad por FcRn que un anticuerpo que comprende una región Fc con las mutaciones I253A/H310A/H435A o H310A/H433A/Y436A o L251D/L3l4D/L432D o combinaciones de las mismas (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat).

En un modo de realización, la columna de afinidad por FcRn tiene las dimensiones de columna de 50 mm x 5 mm, la altura del lecho es de 5 cm y la carga es de 50 pg de anticuerpo. En un modo de realización, el tampón de equilibrado es MES 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 5,5, el tampón de elución es Tris/HCl 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 8,8 y la elución se realiza mediante la aplicación de 7,5 VC de tampón de equilibrado, del 0 % al 100 % de tampón de elución en 30 VC y, después de esto, 10 VC de tampón de elución.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no se une específicamente al FcRn humano. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une específicamente a la proteína A estafilocócica. En un modo de realización de todos los aspectos, el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V ("ojal") y el segundo polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones S354C y T366W ("botón").

En un modo de realización de todos los aspectos, los polipéptidos de la región Fc son de la subclase IgG1 humana. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además las mutaciones L234A y L235a . En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además la mutación P329G.

En un modo de realización de todos los aspectos, los polipéptidos de la región Fc son de la subclase IgG4 humana. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además las mutaciones S228P y L235e . En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además la mutación P329G.

En un modo de realización, la región Fc de clase IgG humana es una región Fc heterodimérica de clase IgG humana variante.

En un modo de realización, el emparejamiento del primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc para formar una región Fc da como resultado la formación de un heterodímero.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

i) el primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF comprende, en el dominio variable de cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 14, una región CDR2H de SEQ ID NO: 15 y una región CDR1H de SEQ ID NO: 16 y, en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3L de SEQ ID NO: 17, una región CDR2L de SEQ ID NO: 18 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 19, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende, en el dominio variable de cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 22, una región CDR2H de SEQ ID NO: 23 y una región CDR1H de SEQ ID NO: 24 y, en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3L de SEQ ID NO: 25, una región CDR2L de SEQ ID NO: 26 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 27, y

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región de cadena pesada constante de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivada de origen humano) que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

en el que

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región de cadena pesada constante de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivada de origen humano) que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),

y en el que los dominios variables comprenden no más de 3 mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 20, 21, 28 y 29.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una región de cadena pesada constante de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivada de origen humano) que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) en ambos polipéptidos de la región Fc.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Esquema de concepto y ventajas de anticuerpos IgG1 o IgG4 <VEGF-ANG-2> con mutación IHH-AAA (= combinación de mutaciones I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat)).

Figura 2: Medición de viscosidad basada en DLS a pequeña escala: Viscosidad extrapolada a 150 mg/ml en arginina/succinato 200 mM, pH 5,5 (comparación de anticuerpos <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) con un anticuerpo de referencia VEGFang2-0015 (sin dichas mutaciones IHH-AAA)).

Figura 3: La agregación por DLS depende de la temperatura (incluyendo la temperatura de inicio de la agregación por DLS) en un tampón de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 (comparación de anticuerpos <VEGF-ANG-2> como se informan en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) con un anticuerpo de referencia VEGFang2-0015 (sin dicha mutación IHH-AAA)).

Figura 4: Siete días de almacenamiento a 40 °C a 100 mg/ml (disminución del pico principal e incremento de peso molecular alto (PMA)) (comparación de anticuerpos <VEGF-ANG-2> como se informan en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) que mostraron una agregación más baja con un anticuerpo de referencia VEGFang2-0015 (sin dicha mutación IHH-a Aa )).

Figura 5A y B: Afinidad por FcRn en estado estable de A: VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) y B: VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA).

Figura 6: Medición de la interacción FcgammaRIIIa de VEGFang2-0015 sin mutación IHH-AAA y VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA (ambos son subclase IgG1 con mutaciones P329G LALA; como control se usaron un anticuerpo anti-digoxigenina (anti-Dig) de subclase IgG1 y un anticuerpo basado en IgG4).

Figura 7A: Esquema del principio del ensayo ELISA farmacocinético (PK) para la determinación de concentraciones de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> en suero y lisados oculares completos.

Figura 7B: Concentración sérica después de la aplicación intravenosa (i.v.): comparación de VEGFang2-0015 sin mutación IHH-AAA y VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA.

Figura 7C: Concentración sérica después de la aplicación intravítrea: comparación de VEGFang2-0015 sin mutación IHH-AAA y VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA.

Figura 7D: Concentración de lisados oculares de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) en el ojo derecho e izquierdo (después de aplicación intravítrea solo en el ojo derecho en comparación con la aplicación intravenosa): se pudieron detectar concentraciones significativas solo en el ojo derecho después de la aplicación intravítrea; después de la aplicación intravenosa no se pudo detectar ninguna concentración en los lisados oculares debido a la baja semivida en suero de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA).

Figura 7E: Concentración de lisados oculares de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) en el ojo derecho e izquierdo (después de aplicación intravítrea solo en el ojo derecho en comparación con la aplicación intravenosa): en el ojo derecho (y hasta cierto punto en el ojo izquierdo) después de la aplicación intravítrea se pudieron detectar concentraciones de VEGFang2-0015; esto indica la difusión desde el ojo derecho hacia el suero y desde allí hacia el ojo izquierdo, lo que se puede explicar por la larga semivida de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA); después de la aplicación intravenosa también se pudieron detectar concentraciones significativas en los lisados oculares de ambos ojos debido a la difusión en los ojos del VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) estable en suero.

Figura 8: Anticuerpos genomanipulados con respecto a su capacidad para unirse a FcRn muestran semividas in-vivo prolongadas (mutación YTE) o más cortas (mutación IHH-AAA), unión potenciada (mutación YTE) o reducida (mutación IHH-AAA) en comparación con el anticuerpo natural (wt) de referencia en el análisis de resonancia de plasmón de superficie (RPS), así como un tiempo de retención potenciado o reducido en la cromatografía en columna de FcRn; a) Datos de PK después de la aplicación de un solo bolo i.v. de 10 mg/kg en ratones C57BL/6J transgénicos huFcRn /- 276: Datos de ABC para IgG natural, así como IgG con Fc modificadas con mutaciones YTE e IHH-AAA; b) Sensograma BIAcore; c) Elución en la columna de afinidad por FcRn; anticuerpo anti-IGF-1R natural (referencia), mutante YTE de anticuerpo anti-IGF-1R, mutante IHH-AAA de anticuerpo anti-IGF-1R.

Figura 9: Cambio en el tiempo de retención en una cromatografía de afinidad por FcRn dependiendo del número de mutaciones introducidas en la región Fc.

Figura 10: Cambio en la unión a FcRn dependiendo de la distribución asimétrica de las mutaciones introducidas en la región Fc.

Figura 11: Cromatograma de elución de un anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> (VEGF/ANG2-0121) con las mutaciones H310A, H433A e Y436A en ambas cadenas pesadas de dos columnas de cromatografía de afinidad por proteína A consecutivas.

Figura 12: Cromatograma de elución de un anticuerpo anti-IGF-1R (IGF-1R-0045) con las mutaciones H310A, H433A e Y436A en ambas cadenas pesadas de una columna de cromatografía de afinidad por proteína A.

Figura 13: Unión de anticuerpos <VEGF-ANG-2> con región Fc de IgG modificada a la proteína A inmovilizada en un chip CM5.

Figura 14: Cromatograma de elución de diferentes anticuerpos <VEGF-ANG-2> en una columna de afinidad por FcRn.

Figura 15: Unión de diferentes polipéptidos de fusión a la proteína estafilocócica A (RPS).

Figura 16: Unión de diferentes anticuerpos <VEGF-ANG-2> y mutantes de anticuerpos anti-IGF-1R a la proteína A inmovilizada (RPS).

Figura 17: Comparación de las concentraciones séricas después de la aplicación intravenosa de anticuerpos IGF-1R 0033, 0035 y 0045.

Figura 18: Comparación de la concentración del lisado ocular después de la aplicación intravítrea e intravenosa del anticuerpo IGF-1R 0033.

Figura 19: Comparación de la concentración del lisado ocular después de la aplicación intravítrea e intravenosa del anticuerpo IGF-1R 0035.

Figura 20: Comparación de la concentración del lisado ocular después de la aplicación intravítrea e intravenosa del anticuerpo IGF-1R 0045.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

I. DEFINICIONES

El término "aproximadamente" indica un intervalo de un /- 20 % del siguiente valor numérico posterior. En un modo de realización, el término aproximadamente indica un intervalo de un /- 10 % del siguiente valor numérico posterior. En un modo de realización, el término aproximadamente indica un intervalo de un /- 5 % del siguiente valor numérico posterior.

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener alteraciones en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de alteraciones de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

El término "alteración" indica la mutación (sustitución), inserción (adición) o deleción de uno o más residuos aminoacídicos en un anticuerpo o polipéptido de fusión original, por ejemplo, un polipéptido de fusión que comprende al menos una porción de unión al FcRn de una región Fc, para obtener un anticuerpo o polipéptido de fusión modificado. El término "mutación" indica que el residuo aminoacídico especificado se sustituye por un residuo aminoacídico diferente. Por ejemplo, la mutación L234A indica que el residuo aminoacídico lisina en la posición 234 en una región Fc de anticuerpo (polipéptido) está sustituido por el residuo aminoacídico alanina (sustitución de lisina por alanina) (numeración de acuerdo con el índice EU).

El término "mutación aminoacídica" indica la sustitución de al menos un residuo aminoacídico existente por otro residuo aminoacídico diferente (= residuo aminoacídico de reemplazo). El residuo aminoacídico de reemplazo puede ser un "residuo aminoacídico natural" y se puede seleccionar del grupo que consiste en alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V). El residuo aminoacídico de reemplazo puede ser un "residuo aminoacídico no natural". Véanse, por ejemplo, los documentos US 6.586.207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W. et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. y Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W. et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; y Wang, L. y Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10.

El término "inserción aminoacídica" indica la incorporación (adicional) de al menos un residuo aminoacídico en una posición predeterminada en una secuencia de aminoácidos. En un modo de realización, la inserción será la inserción de uno o dos residuos aminoacídicos. El/los residuo(s) aminoacídico(s) insertado(s) puede(n) ser cualquier residuo aminoacídico natural o no natural.

El término "deleción aminoacídica" indica la eliminación de al menos un residuo aminoacídico en una posición predeterminada en una secuencia de aminoácidos.

El término "ANG-2", como se usa en el presente documento, se refiere a angiopoyetina-2 (ANG-2) humana (de forma alternativa abreviada como ANGPT2 o ANG2) (SEQ ID NO: 31) que se describe, por ejemplo, en Maisonpierre, P.C. et al., Science 277 (1997) 55-60 y Cheung, A.H. et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Las angiopoyetinas-1 (SEQ ID NO: 32) y -2 fueron descubiertas como ligandos para las Tie, una familia de tirosina cinasas que se expresan de manera selectiva dentro del endotelio vascular (Yancopoulos, G.D. et al., Nature 407 (2000) 242 -248). Existen cuatro miembros definitivos de la familia de las angiopoyetinas. La angiopoyetina-3 y -4 (ANG-3 y ANG-4) puede representar contrapartes ampliamente divergentes del mismo locus de genes en ratones y hombres (Kim, I. et al., FEBS Lett, 443 (1999) 353-356; Kim, I. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-26528). ANG-1 y ANG-2 se identificaron originalmente en experimentos de cultivo de tejidos como agonista y antagonista, respectivamente (véase para ANG-1: Davis, S. et al., Cell 87 (1996) 1161-1169; y para ANG-2: Maisonpierre, P.C. et al., Science 277 (1997) 55-60). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2 (SEQ ID NO: 33), y tanto ANG-1 como -2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd) (Maisonpierre, P.C. et al., Science 277 (1997) 55-60).

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno y/o proteína A y/o FcRn deseada.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

El término "región Fc asimétrica" indica un par de polipéptidos de la región Fc que tienen diferentes residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat.

El término "región Fc asimétrica con respecto a la unión a FcRn" indica una región Fc que consiste en dos cadenas polipeptídicas que tienen diferentes residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes, con lo que las posiciones se determinan de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat, con lo que diferentes posiciones afectan a la unión de la región Fc al receptor Fc neonatal humano (FcRn). Para el propósito en el presente documento, las diferencias entre las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc en una "región Fc asimétrica con respecto a la unión a FcRn" no incluyen las diferencias que se han introducido para facilitar la formación de regiones Fc heterodiméricas, por ejemplo, para la producción de anticuerpos biespecíficos. Estas diferencias también pueden ser asimétricas, es decir, las dos cadenas tienen diferencias en los residuos aminoacídicos no correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat. Estas diferencias facilitan la heterodimerización y reducen la homodimerización. Ejemplos de dichas diferencias son las sustituciones denominadas "botón en ojal" (KiH, del inglés "knob-into-holes") (véanse, por ejemplo, los documentos US 7.695.936 y US 2003/0078385). Se ha descubierto que las siguientes sustituciones "botón en ojal" en las cadenas polipeptídicas individuales de una región Fc de un anticuerpo IgG de subclase IgG1 incrementan la formación de heterodímeros: 1) Y407T en una cadena y T366Y en la otra cadena; 2) Y407A en una cadena y T366W en la otra cadena; 3) F405A en una cadena y T394W en la otra cadena; 4) F405W en una cadena y T394S en la otra cadena; 5) Y407T en una cadena y T366Y en la otra cadena; 6) T366Y y F405A en una cadena y T394W e Y407T en la otra cadena; 7) T366W y F405W en una cadena y T394S e Y407A en la otra cadena; 8) F405W e Y407A en una cadena y T366W y t 394S en la otra cadena; y 9) T366W en una cadena y T366S, L368A e Y407V en la otra cadena, con lo que la última enumerada es especialmente adecuada. Además, los cambios que crean nuevos puentes disulfuro entre las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc facilitan la formación de heterodímeros (véase, por ejemplo, el documento US 2003/0078385). Se ha descubierto que las siguientes sustituciones dan como resultado residuos de cisteína separados de manera apropiada para la formación de nuevos enlaces disulfuro intracatenarios en las cadenas polipeptídicas individuales de una región Fc de un anticuerpo IgG de subclase IgG1 incrementan la formación de heterodímeros: Y349C en una cadena y S354C en la otra; Y349C en una cadena y E356C en la otra; Y349C en una cadena y E357C en la otra; L351C en una cadena y S354C en la otra; T394C en una cadena y E397C en la otra; o D399C en una cadena y K392C en la otra. Otros ejemplos de cambios de aminoácidos que facilitan la heterodimerización son las llamadas "sustituciones de pares de carga" (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/089004). Se ha descubierto que las siguientes sustituciones de pares de carga en las cadenas polipeptídicas individuales de una región Fc de un anticuerpo IgG de subclase IgG1 incrementan la formación de heterodímeros: 1) K409D o K409E en una cadena y D399K o D399R en la otra cadena; 2) K392D o K392E en una cadena y D399K o D399R en la otra cadena; 3) K439D o K439E en una cadena y E356K o E356R en la otra cadena; 4) K370D o K370E en una cadena y E357K o E357R en la otra cadena; 5) K409D y K360D en una cadena y D399K y E356K en la otra cadena; 6) K409D y K370D en una cadena y D399K y E357K en la otra cadena; 7) K409d y K392d en una cadena y D399K, E356K y E357K en la otra cadena; 8) K409D y K392D en una cadena y D399K en la otra cadena; 9) K409D y K392D en una cadena y D399K y E356K en la otra cadena; 10) K409D y K392D en una cadena y D399K y D357K en la otra cadena; 11) K409D y K370D en una cadena y D399K y D357K en la otra cadena; 12) D399K en una cadena y K409D y K360D en la otra cadena; y 13) K409D y K439D en una cadena y D399K y E356K en la otra.

El término "unión (a un antígeno)" indica la unión de un anticuerpo a su antígeno en un ensayo in vitro, en un modo de realización en un ensayo de unión en el que el anticuerpo se une a una superficie y la unión del antígeno al anticuerpo se mide por resonancia de plasmón de superficie (RPS). Unión significa una afinidad de unión (K^d) de 10'8 M o menos, en algunos modos de realización de 10'13 a 10'8 M, en algunos modos de realización de 10'13 a 10'9 M.

La unión se puede investigar mediante un ensayo BIAcore (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Suecia). La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno), kd (constante de disociación) y KD(kd/ka).

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.

El término "dominio CH2" indica la parte de un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 231 a la posición Eu 340 (sistema de numeración EU de acuerdo con Kabat). En un modo de realización, un dominio CH2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09:

APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVW DVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRW SVLT VLHQDW LNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKT1S KAK.

El término "dominio CH3" indica la parte de un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 341 a la posición EU 446. En un modo de realización, el dominio CH3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10: GQPREPQ VYTLPPSR D E L T K N Q V S LT C LV K G FY P S D I AVEW ESN G Q P ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹e IgA². Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, y y H, respectivamente.

El término "longitud comparable" indica que dos polipéptidos comprenden el número idéntico de residuos aminoacídicos o pueden tener una longitud diferente en uno o más y hasta 10 residuos aminoacídicos como máximo. En un modo de realización, los polipéptidos de la región Fc comprenden el número idéntico de residuos aminoacídicos o difieren en un número de 1 a 10 residuos aminoacídicos. En un modo de realización, los polipéptidos de la región Fc comprenden el número idéntico de residuos aminoacídicos o difieren en un número de 1 a 5 residuos aminoacídicos. En un modo de realización, los polipéptidos de la región Fc comprenden el número idéntico de residuos aminoacídicos o difieren en un número de 1 a 3 residuos aminoacídicos.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "polipéptido de fusión de Fc" indica una fusión de un dominio de unión (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo de cadena única, o un polipéptido tal como un ligando de un receptor) con una región Fc de anticuerpo que exhibe la actividad de unión a diana y/o proteína A y/o FcRn deseada.

El término "región Fc de origen humano" indica la región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina de origen humano que contiene al menos una parte de la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. En un modo de realización, la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, m D (1991), NIH Publication 913242. La región Fc está compuesta por dos polipéptidos de la región Fc de cadena pesada, que se pueden unir covalentemente entre sí por medio de los residuos de cisteína de la región bisagra que forman enlaces disulfuro inter-polipéptidos.

El término "FcRn" indica el receptor de Fc neonatal humano. FcRn funciona rescatando a la IgG de la vía de degradación lisosómica, dando como resultado un aclaramiento reducido y una semivida incrementada. El FcRn es una proteína heterodimérica que consiste en dos polipéptidos: una proteína similar al complejo principal de histocompatibilidad de clase I de 50 kDa (a-FcRn) y una microglobulina p2 (p2m) de 15 kDa. El FcRn se une con afinidad alta a la porción CH2-CH3 de la región Fc de la IgG. La interacción entre IgG y FcRn depende estrictamente del pH y se produce en una estequiometría 1:2, uniéndose una IgG a dos moléculas de FcRn por medio de sus dos cadenas pesadas (Huber, A.H. et al., J. Mol. Biol.230 (1993) 1077-1083). La unión al FcRn se produce en el endosoma a pH ácido (pH <6,5) y se libera IgG en la superficie celular neutra (pH de aproximadamente 7,4). La naturaleza sensible al pH de la interacción facilita la protección mediada por FcRn de las IgG pinocitadas en las células a partir de la degradación intracelular mediante la unión al receptor dentro del entorno ácido de los endosomas. Entonces, el FcRn facilita el reciclado de la IgG a la superficie celular y su posterior liberación en la circulación sanguínea tras la exposición del complejo FcRn-IgG al entorno de pH neutro fuera de la célula.

El término "parte de unión a FcRn de una región Fc" indica la parte de un polipéptido de cadena pesada de un anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 243 a la posición EU 261 y aproximadamente desde la posición EU 275 a la posición EU 293 y aproximadamente desde la posición EU 302 a la posición EU 319 y aproximadamente desde la posición EU 336 a la posición EU 348 y aproximadamente desde la posición EU 367 a la posición EU 393 y la posición EU 408 y aproximadamente desde la posición EU 424 a la posición EU 440. En un modo de realización, uno o más de los siguientes residuos aminoacídicos de acuerdo con la numeración EU de Kabat son F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 y S440 alterados (numeración EU).

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

El término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento. Un anticuerpo de longitud completa puede comprender otros dominios, tales como, por ejemplo, un scFv o un scFab conjugado con una o más de las cadenas del anticuerpo de longitud completa. Estos conjugados también están abarcados por el término anticuerpo de longitud completa.

Los términos "heterodímero" o "heterodimérico" indican una molécula que comprende dos cadenas polipeptídicas (por ejemplo, de longitud comparable), en el que las dos cadenas polipeptídicas tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un residuo aminoacídico diferente en una posición correspondiente, con lo que la posición correspondiente se determina de acuerdo con el índice EU de Kabat.

Los términos "homodímero" y "homodimérico" indican una molécula que comprende dos cadenas polipeptídicas de longitud comparable, en el que las dos cadenas polipeptídicas tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica en las posiciones correspondientes, con lo que las posiciones correspondientes se determinan de acuerdo con el índice EU de Kabat.

Un anticuerpo o un polipéptido de fusión de la región Fc como se informa en el presente documento puede ser homodimérico o heterodimérico con respecto a su región Fc que se determina con respecto a las mutaciones o propiedades objetivo. Por ejemplo, con respecto a la unión a FcRn y/o proteína A (es decir, las propiedades objetivo), una región Fc (anticuerpo) es homodimérica (es decir, ambos polipéptidos de la región Fc de cadena pesada comprenden estas mutaciones) con respecto a las mutaciones H310A, H433A e Y436A (estas mutaciones son objetivo con respecto a la propiedad de unión a FcRn y/o proteína A del anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc), pero al mismo tiempo es heterodimérica con respecto a las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V (estas mutaciones no son objetivo, ya que estas mutaciones están dirigidas a la heterodimerización de las cadenas pesadas y no a las propiedades de unión a FcRn/proteína A), así como a las mutaciones S354C y T366W, respectivamente (el primer conjunto está comprendido solo en el primer polipéptido de la región Fc, mientras que el segundo conjunto está comprendido solo en el segundo polipéptido de la región Fc). Además, por ejemplo, un anticuerpo o un polipéptido de fusión de la región Fc como se informa en el presente documento puede ser heterodimérico con respecto a las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435A e Y436A (es decir, estas mutaciones se dirigen todas a las propiedades de unión a FcRn y/o proteína A del polipéptido dimérico), es decir, un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones I253a , H310A y H435A, mientras que el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones H310A, H433A e Y436A.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pasos. La descendencia puede que no sea completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que aparecen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

El término "derivado de" indica que una secuencia de aminoácidos se deriva de una secuencia de aminoácidos original mediante la introducción de alteraciones en al menos una posición. Por tanto, una secuencia de aminoácidos derivada difiere de la secuencia de aminoácidos original correspondiente en al menos una posición correspondiente (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat para las regiones Fc del anticuerpo). En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original difiere en de uno a quince residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original difiere en de uno a diez residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original difiere en de uno a seis residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes. Del mismo modo, una secuencia de aminoácidos derivada tiene una alta identidad de secuencia de aminoácidos con su secuencia de aminoácidos original. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original tiene un 80 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original tiene un 90 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original tiene un 95 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos.

El término "polipéptido de la región Fc humana" indica una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un polipéptido de la región Fc humana "natural". El término "polipéptido de la región Fc (humana) variante" indica una secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de la región Fc humana "natural" en virtud de al menos una "alteración de aminoácidos". Una "región Fc humana" consiste en dos polipéptidos de la región Fc humana. Una "región Fc (humana) variante" consiste en dos polipéptidos de la región Fc, con lo que ambos pueden ser polipéptidos de la región Fc (humana) variante o uno es un polipéptido de la región Fc humana y el otro es un polipéptido de la región Fc (humana) variante.

En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc humana tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana de SEQ ID NO: 60, o de un polipéptido de la región Fc de la IgG2 humana de SEQ ID NO: 61, o de un polipéptido de la región Fc de la IgG3 humana de SEQ ID NO: 62, o de un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana de SEQ ID NO: 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc se deriva de un polipéptido de la región Fc de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63 y tiene al menos una mutación aminoacídica en comparación con el polipéptido de la región Fc de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc comprende/tiene de aproximadamente una a aproximadamente diez mutaciones aminoacídicas, y en un modo de realización de aproximadamente una a aproximadamente cinco mutaciones aminoacídicas. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc tiene al menos aproximadamente un 80 % de homología con un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc tiene al menos aproximadamente un 90 % de homología con un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc tiene al menos aproximadamente un 95 % de homología con un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63.

El polipéptido de la región Fc derivado de un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63 se define por las alteraciones de aminoácidos que están contenidas. Así, por ejemplo, el término P329G indica un polipéptido de la región Fc derivado de un polipéptido de la región Fc humana con la mutación de prolina a glicina en la posición aminoacídica 329 en relación con el polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 61 o 62 o 63.

Como se usa en el presente documento, las posiciones aminoacídicas de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" o "numeración de Kabat" en el presente documento. Específicamente el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660 de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991)) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 y CH3).

Un polipéptido de la región Fc de IgG1 humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

D KTH TC P PC PA PELLG G PS VFLFP PK PKD TLM 1SR TPEV TC V VV D V SH ED PE

V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R W S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A LP A P TE K TTS K A K G Q P R E P Q V Y TLP P S R D E LTK N Q V S LTC LV K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V LD S D G S F F LY S K LT V D K S R W Q Q G N V FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 60).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

D KTH TC P PC PA PELLG G PS VFLFP PK PKD TLM IS R TP EV TC W VD VS H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R W S V L T V L H Q D W L N G K E Y K CK V SNKALPAPTEKTT S K A KGQPREPQ V YTLPPS R D E LTK N Q V SLTC LVK G F YPSD IAVEW ESN G Q PEN N YKTTPPVLD SD G SFFLYSKLTVD KSR W Q Q G N V FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

D KTH TC P PC PA PELLG G PS VFLFP PK PKD TLM IS R TP EV TC W VD VS H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R W S V L T V L H Q D W LN G K E Y K CK V SNKAL,P APTEKT1 S K A KGQPREPQ V YTLPPS R D ELTK N Q V SLTC L V K G F

YPSD IAVEW ESN G Q PEN N YKTTPPVLD SD G SEFLYSKLTVD KSR W Q Q G N V FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 65).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones T366W, S354C tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

D KTH TC P PC PA PELLG G PSVFLFPPKPKD TLM ISR TPEVTC VW D VSH ED PE V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V LT V LH Q D W LN G K E Y K C K V S N K A LP APJEKTIS K A K G QPREPQ VYTLPPC R D E LTK N Q VS LW C L V K G FYPSDIAVEW ESNGQ PENN YKTTPPVLD SD G SFFLYSKLTVD KSR W Q Q G N VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 66).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

D KTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE V K F N W Y V D G V E V H N A KTKPREEQ Y N ST Y R V V S V L T V LH Q D W LN G KE Y K CK V SN KALP APTEKTT S K A KGQPREPQ V YTLPPS R D E LTK N Q V SLTC LVK G F YPSD IAVEW ESN G Q PEN N YKTTPPVLD SD G SFFLYSKLTVD KSR W Q Q G N V FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 67).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con una mutación L234A, L235A y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VK FN W Y V D G V E VH N AKTK PR EE Q YN ST Y R V V S V LT V LH Q D W LN G K E Y K C K V S N K A LPAPIEKTISKAKG Q PREPQ VYTLPPCR D ELTKN Q V S LW C L VKG FYP SD IAVEW ESN G Q PEN N YKTTPPVLD SD G SFFLYSKLTVD KSR W Q Q G N VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 68).

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de IgG1 humana con una mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEIEDPE

VKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRW SVLT VLHQD WLN GKE YK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSHffLYSKLTVDKSRWQQGN

WSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 69).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y la mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFN WY VDGVE VHNAKTKPREEQ YNSTYRVVS VLT VLHQD WLN G KEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMIIEALIINIIYTQKSI..SLSPGK (SEQ ID NO: 70).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con una mutación P329G y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFN WY VDGVE V HNAKTKPREEQ YN ST YRVVS VLT VLHQD WL N G KE YK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALETNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 71).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con una mutación P329G y las mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLV1 ISRTPE VTOV V VDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 72).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEIEDPE VKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F YPSDIAVE WESN GQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLY S KLT V DKSRW QQGN VFSCSVMnEAUINIIYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 73).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G y las mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEIEDPE VKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F YPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).

Un polipéptido de la región Fc de IgG4 humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

k c k v s n k g l p s s ie k t t s k a k g q p r e p q v y t l p p s q e e m t k n q v s l t c l v k

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 63).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P y L235E tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGGPSSIEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 75).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y la mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSTEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 76).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones T366W, S354C tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSQED

PEV QFN W YV DGVE V HN AKTKPREEQFN ST Y RV V S V LTV LHQD WLN GKEY KCKVSNKGLPSSTEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GF YP SDIAV EWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 77).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSTEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 78).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con una mutación S228P, L235E y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEV QFN W Y V DGVEVHN AKTKPREEQFN ST Y R W S V LTV LHQD WLN GKEY KCKVSNKGLPSSTEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 79).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con una mutación S228P, L235E y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

LSKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM7SRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 80).

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de IgG4 humana con una mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEY KCKV SNKGLP SSLEKTISKAKGQPREPQVYTLPP S QEEMTKNQV SETCL V K GFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 81).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con una mutación P329G y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTEM1SRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEY KCKV SNKGLP SSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPP S QEEMTKNQV SETCL V K GFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 82).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con una mutación P329G y las mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSQED

PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGN VFSCSVM H EALH NH YTQ KSLSLSPG K (SEQ ID NO: 83).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con una mutación S228P, L235E, P329G y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVM H EALH NH YTQ KSLSLSPG K (SEQ ID NO: 84).

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG4 humana con una mutación S228P, L235E, P329G y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGEPSSTEKTTSKAKGQPREPQVYTEPPSQEEMTKNQVSETCEVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN

(SEQ ID NO: 85).

A continuación se muestra una alineación de las diferentes regiones Fc humanas (numeración EU):

2 2

3 5

0 0

IGGl DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED

IGG2 ...VECPPCP APP.VAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED

IGG3 DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED

IGG4 ...PPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSQED

-- HINGE -| CH2 -------------

3

O

IGGl PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK

IGG2 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RWSVLTWH QDWLNGKEYK

IGG3 PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RWSVLTVLH QDWLNGKEYK

IGG4 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK

-- CH2 -----------------------------------

3

5

O

IGGl CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK

IGG2 CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK

IGG3 CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK

IGG4 CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK

-- C H2 ...... CH2 -- -- CH 3 ------ --- -------------

4

O

IGGl GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

IGG2 GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

IGG3 GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

IGG4 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEG

-- CH3 ----------------------------------------------

4

7

IGGl NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

IGG2 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

IGG3 NIFSCSVMHE ALHNRFTQKS LSLSPGK

IGG4 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK

-- CH3 -------------

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR como se indican en el presente documento incluyen

(a) los bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(b) las CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) NIH Publication 91-3242.);

(c) los contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

(d) las combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

En un modo de realización, los residuos de HVR comprenden aquellos identificados en otro lugar en la memoria descriptiva.

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat (Kabat et al., supra.).

El término "IGF-1R", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier IGF-1R natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba el IGF-1R no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de IGF-1 R que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de IGF-1R, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IGF-1 R humana se muestra en la SEQ ID NO: 11.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, un anticuerpo se purifica a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una recapitulación de los procedimientos para evaluar la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-IGF-1R" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único plásmido o en plásmidos separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes en general dichas variantes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; estando descritos en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático públicamente disponible, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "conector peptídico", como se usa en el presente documento, indica un péptido con secuencias de aminoácidos que, en un modo de realización, es de origen sintético. El conector peptídico es, en un modo de realización, un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 30 aminoácidos, en un modo de realización con una longitud de 32 a 50 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de 32 a 40 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico es (GxS)n con G = glicina, S = serina, (x = 3, n = 8, 9 o 10) o (x = 4 y n = 6, 7 u 8), en un modo de realización con x = 4, n = 6 o 7, en un modo de realización con x = 4, n = 7. En un modo de realización, el conector peptídico es (G4S)6G2.

El término "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, indica todos los anticuerpos (quiméricos, humanizados y humanos) que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes. Esto incluye anticuerpos aislados de una célula huésped tal como una célula NS0 o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados usando un plásmido de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes tienen regiones variables y constantes en forma reordenada. Los anticuerpos recombinantes como se informa en el presente documento se pueden someter a hipermutación somática in vivo. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de secuencias de VH y VL de la estirpe germinal humana y están relacionadas con ellas, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar' o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de las metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o atenuación de la enfermedad y la remisión o el pronóstico mejorado. En algunos modos de realización se usan anticuerpos o polipéptidos de fusión de la región Fc como se informa en el presente documento para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "-valente", como se usa en la presente solicitud, indica la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula (anticuerpo). Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula (anticuerpo). Los anticuerpos biespecíficos, como se informa en el presente documento, son en un modo de realización preferente "bivalentes".

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo a su antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (véase, por ejemplo, Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano S. et al., J. Immunol.

150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628.

El término "enfermedad vascular ocular" incluye, pero no se limita a, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía del prematuro, glaucoma neovascular, oclusiones de la vena retiniana, oclusiones de la vena retiniana central, degeneración macular, degeneración macular senil, retinosis pigmentaria, proliferación angiomatosa retiniana, telangectasia macular, retinopatía isquémica, neovascularización del iris, neovascularización intraocular, neovascularización corneal, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea y degeneración de la retina (véase, por ejemplo, Garner, A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A. y Klintworth, G.K. (eds.), 2.a edición, Marcel Dekker, Nueva York (1994), pp.

1625-1710).

El término "plásmido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se une. El término incluye el plásmido como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el plásmido incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados plásmidos pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se unen funcionalmente. Dichos plásmidos se denominan en el presente documento "plásmidos de expresión".

El término "VEGF", como se usa en el presente documento, se refiere al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF-A), el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humano de 165 aminoácidos (aminoácidos 27-191 de la secuencia precursora del VEGF 165 humano: SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-26 representan el péptido señal), y las isoformas del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares relacionadas 121, 189 y 206, como lo describen Leung, D.W. et al., Science 246 (1989) 1306-1309; Houck et al., Mol. Endocrin 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J. et al., Science 246 (1989) 1309-1312 y Connolly, D.T. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-20024; conjuntamente con las formas alélicas y procesadas naturales de esos factores de crecimiento. VEGF participa en la regulación de la angiogénesis normal y anómala y en la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara, N. et al., Endocrin. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A. et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F. et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F. et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattem, J. et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; y Dvorak, H.F. et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF es una glucoproteína homodimérica que se ha aislado de varias fuentes e incluye varias isoformas. VEGF muestra una actividad mitogénica altamente específica para las células endoteliales.

El término "con (la) mutación IHH-AAA", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) y H435A (His435Ala) y el término "con (la) mutación HHY-AAA", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) e Y436A (Tyr436Ala) y el término "con (la) mutación YTE", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de mutaciones M252Y (Met252Tyr), S254T (Ser254Thr) y T256E (Thr256Glu) en la región de cadena pesada constante de las subclases IgG1 o IgG4, en la que la numeración está de acuerdo con el índice EU de Kabat.

El término "con (las) mutaciones P329G LALA", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) y P329g (Pro329Gly) en la región de cadena pesada constante de la subclase IgG1, en la que la numeración está de acuerdo con el índice EU de Kabat. El término "con (la) mutación SPLE", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones S228P (Ser228Pro) y L235E (Leu235Glu) en la región de cadena pesada constante de la subclase IgG4, en la que la numeración está de acuerdo con el índice EU de Kabat. El término "con (la) mutación SPLE y P329G", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) y P329G (Pro329Gly) en la región de cadena pesada constante de la subclase IgG4, en la que la numeración está de acuerdo con el índice EU de Kabat.

II. COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los anticuerpos para la aplicación intravítrea son beneficiosos y no tienen unión a FcRn, ya que estos anticuerpos no tienen semividas sustancialmente modificadas en comparación con los anticuerpos con unión a FcRn en el ojo, pero se eliminan rápidamente de la circulación sanguínea sistémica, dando como resultado efectos secundarios sistémicos nulos o muy limitados fuera del ojo. Los anticuerpos como se informa en el presente documento son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que mutaciones o combinaciones de mutaciones específicas que influyen en la unión de una región Fc de inmunoglobulina al receptor Fc neonatal (FcRn), es decir, que reducen o incluso eliminan la unión de la región Fc al FcRn no eliminan simultáneamente la unión de la región Fc a la proteína A estafilocócica. Esto tiene un efecto profundo en el procedimiento de purificación que se puede emplear como, por ejemplo, que no se requieren materiales de cromatografía de afinidad específicos y de especies limitadas tales como, por ejemplo, KappaSelect™, que solo se une a los anticuerpos que comprenden una cadena ligera kappa. Por tanto, con las mutaciones como se informa en el presente documento es posible al mismo tiempo reducir o incluso eliminar la unión a FcRn mientras se mantiene la unión a la proteína A.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que, usando diferentes mutaciones en cada uno de los polipéptidos de la región Fc de una región Fc, se puede proporcionar una molécula heterodimérica tal como, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que tenga una unión a FcRn a medida y se pueden proporcionar anticuerpos que se tengan una semivida sistémica a medida.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que, usando diferentes mutaciones en cada uno de los polipéptidos de la región Fc de una región Fc, se puede proporcionar una molécula heterodimérica tal como, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que por un lado tiene una unión reducida o incluso eliminada a FcRn pero por otro lado mantiene la capacidad de unirse a la proteína A estafilocócica. Esta unión a la proteína A se puede usar para separar el anticuerpo heterodimérico de los subproductos homodiméricos. Por ejemplo, combinando las mutaciones I253A, H310A y H435A en un polipéptido de la región Fc con las mutaciones H310A, H433A e Y436A en el otro polipéptido de la región Fc usando el enfoque "botón en ojal", se puede obtener una región Fc heterodimérica que por un lado no se une a FcRn (ambos conjuntos de mutaciones son silenciosos con respecto a FcRn humano) pero mantiene la unión a la proteína A estafilocócica (el polipéptido de la región Fc con las mutaciones I253A, H310A y H435A no se une a FcRn y no se une a la proteína A, mientras que el polipéptido de la región Fc con las mutaciones H310A, H433A e Y436A no se une a FcRn pero aún se une a la proteína A). Por tanto, la cromatografía de afinidad por proteína A estándar se puede usar para eliminar el subproducto homodimérico "ojal-ojal", ya que este ya no se une a la proteína A. Por tanto, al combinar el enfoque "botón en ojal" con las mutaciones I253A, H310A y H435A en la cadena "ojal" y las mutaciones H310A, H433A e Y436A en la cadena "botón" se puede facilitar la purificación/separación del producto heterodimérico "botón en ojal" del subproducto homodimérico "ojal-ojal".

La combinación de mutaciones I253A, H310A, H435A o L251D, L314D, L432D o L251S, L314S, L432S da como resultado una pérdida de la unión a la proteína A, mientras que la combinación de las mutaciones I253A, H310A, H435A o H310A, H433A, Y436A, o L251D, L314D, L432D da como resultado una pérdida de la unión al receptor Fc neonatal humano.

La siguiente tabla presenta una visión general ejemplar de los residuos aminoacídicos en una región Fc que están involucrados en las interacciones o se han cambiado para modificar las interacciones.

Las modificaciones/mutaciones como se informa en el presente documento alteran la especificidad de unión para uno o más receptores Fc, tal como el FcRn humano. Al mismo tiempo, algunas de las mutaciones que alteran la unión a FcRn humano no alteran la unión a la proteína A.

En modos de realización específicos, las mutaciones alteran o alteran sustancialmente la semivida en suero del anticuerpo en comparación con un anticuerpo correspondiente que carece de estas mutaciones.

En modos de realización específicos adicionales, las mutaciones además no alteran o no alteran sustancialmente la unión del anticuerpo a la proteína A en comparación con un anticuerpo correspondiente que carece de estas mutaciones.

A. El receptor Fc neonatal (FcRn)

El receptor Fc neonatal (FcRn) es importante para el destino metabólico de los anticuerpos de la clase IgG in vivo. El FcRn funciona rescatando a la IgG natural de la vía de degradación lisosómica, dando como resultado un aclaramiento reducido y una semivida incrementada. Es una proteína heterodimérica que consiste en dos polipéptidos: una proteína similar al complejo principal de histocompatibilidad de clase I de 50 kDa (a-FcRn) y una microglobuNnap2 (p2m) de 15 kDa. El FcRn se une con afinidad alta a la porción CH2-CH3 de la región Fc de un anticuerpo de la clase IgG. La interacción entre un anticuerpo de la clase IgG y el FcRn depende del pH y se produce en una estequiometría 1:2, es decir, una molécula de anticuerpo IgG puede interactuar con dos moléculas de FcRn por medio de sus dos polipéptidos de la región Fc de cadena pesada (véase, por ejemplo, Huber, A.H. et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083).

Por tanto, las propiedades/características de la unión a FcRn in vitro de las IgG son indicativas de sus propiedades farmacocinéticas in vivo en la circulación sanguínea.

En la interacción entre el FcRn y la región Fc de un anticuerpo de la clase IgG participan diferentes residuos aminoacídicos del dominio CH2 y CH3 de cadena pesada. Los residuos aminoacídicos que interactúan con el FcRn están localizados aproximadamente entre la posición EU 243 y la posición EU 261, aproximadamente entre la posición EU 275 y la posición EU 293, aproximadamente entre la posición EU 302 y la posición EU 319, aproximadamente entre la posición EU 336 y la posición EU 348, aproximadamente entre la posición EU 367 y la posición EU 393, en la posición EU 408, y aproximadamente entre la posición EU 424 y la posición EU 440. Más específicamente, los siguientes residuos aminoacídicos de acuerdo con la numeración EU de Kabat están involucrados en la interacción entre la región Fc y el FcRn: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 y S440.

Los estudios de mutagénesis dirigida han demostrado que los sitios de unión críticos en la región Fc de las IgG para FcRn son Histidina 310, Histidina 435 e Isoleucina 253 y, en menor medida, Histidina 433 y Tirosina 436 (véase, por ejemplo, Kim, J.K. et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M. et al., Biochem. 34 (1995) 14649-146579; Medesan, C. et al., J Immunol. 158 (1997) 2211- 2217).

Los procedimientos para incrementar la unión de IgG a FcRn se han realizado mediante la mutación de IgG en varios residuos aminoacídicos: Treonina 250, Metionina 252, Serina 254, Treonina 256, Treonina 307, Ácido glutámico 380, Metionina 428, Histidina 433 y Asparagina 434 (véase Kuo, T.T. et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777- 789).

En algunos casos se desean anticuerpos con semivida reducida en la circulación sanguínea. Por ejemplo, los medicamentos para aplicación intravítrea deben tener una semivida larga en el ojo y una semivida corta en la circulación del paciente. Dichos anticuerpos también tienen la ventaja de una exposición incrementada a un sitio de enfermedad, por ejemplo, en el ojo.

Se conocen diferentes mutaciones que influyen en la unión a FcRn y, con ello, en la semivida en la circulación sanguínea. Se han identificado residuos de la región Fc críticos para la interacción Fc de ratón-FcRn de ratón mediante mutagénesis dirigida (véase, por ejemplo, Dall'Acqua, W.F. et al., J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Los residuos I253, H310, H433, N434 y H435 (numeración EU de acuerdo con Kabat) están implicados en la interacción (Medesan, C. et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M. et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K. et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). Se descubrió que los residuos I253, H310 y H435 eran críticos para la interacción de Fc humano con FcRn murino (Kim, J.K. et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825). Los residuos M252Y, S254T, T256E se han descritos por Dall'Acqua et al. para mejorar la unión al FcRn mediante estudios de interacción proteína-proteína (Dall'Acqua, W.F. et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). Los estudios del complejo Fc humano-FcRn humano han demostrado que los residuos I253, S254, H435 e Y436 son cruciales para la interacción (Firan, M. et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.F. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). En Yeung, Y.A. et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) se ha informado de y se han examinado diversos mutantes de los residuos 248 a 259 y 301 a 317 y 376 a 382 y 424 a 437. Las mutaciones ejemplares y su efecto sobre la unión a FcRn se enumeran en la siguiente tabla.

Tabla.

Se ha descubierto que una mutación en un lado en un polipéptido de la región Fc es suficiente para debilitar significativamente la unión a FcRn. Cuantas más mutaciones se introducen en la región Fc, más débil se vuelve la unión al FcRn. Pero las mutaciones asimétricas en un lado no son suficientes para inhibir completamente la unión a FcRn. Las mutaciones en ambos lados son necesarias para inhibir completamente la unión a FcRn.

Los resultados de una modificación simétrica de una región Fc de IgG1 para influir en la unión a FcRn se muestran en la siguiente tabla (alineación de mutaciones y tiempo de retención en una columna de cromatografía de afinidad por FcRn).

Tabla.

Los tiempos de retención inferiores a 3 minutos corresponden a la ausencia de unión, ya que la sustancia se encuentra en el flujo continuo (ausencia de pico).

La mutación única H310A es la mutación simétrica más silenciosa para eliminar cualquier unión a FcRn.

La mutación única simétrica I253A y H435A dan como resultado un cambio relativo del tiempo de retención de 0,3 a 0,4 min. Esto se puede considerar en general como una unión no detectable.

La mutación única Y436A da como resultado una fuerza de interacción detectable en la columna de afinidad por FcRn. Sin estar ligados a esta teoría, esta mutación podría tener una semivida mediada por FcRn que se puede diferenciar de una interacción cero, tal como la combinación de las mutaciones I253A, H310A y H435A (mutación IHH-AAA). Los resultados obtenidos con un anticuerpo anti-HER2 modificado simétricamente se presentan en la siguiente tabla (véase el documento WO 2006/031370 como referencia).

Tabla.

El efecto de la introducción de mutaciones asimétricas que afectan a la unión a FcRn en la región Fc se ha ejemplificado con un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/ANG-2 ensamblado utilizando la tecnología "botón en ojal" (véanse, por ejemplo, el documento Us 7.695.936, el documento US 2003/0078385; mutaciones en la cadena "ojal": S354C/t 366W, mutaciones en la cadena "botón": Y349C/T366S/L368A/Y407V). El efecto de las mutaciones introducidas en la unión a FcRn se puede determinar fácilmente usando un procedimiento de cromatografía de afinidad por FcRn (véase la Figura 9 y la Tabla siguiente). Los anticuerpos que tienen una elución posterior de la columna de afinidad por FcRn, es decir, que tienen un tiempo de retención más largo en la columna de afinidad por FcRn, tienen una semivida más larga in vivo, y viceversa.

Tabla.

El efecto de la introducción de mutaciones asimétricas que afectan a la unión a FcRn en la región Fc se ha ejemplificado además con un anticuerpo monoespecífico anti-IGF-1R ensamblado utilizando la tecnología "botón en ojal" para permitir la introducción de mutaciones asimétricas (véanse, por ejemplo, el documento US 7.695.936, el documento US 2003/0078385; mutaciones en la cadena "ojal": S354C/T366W, mutaciones en la cadena "botón": Y349C/T366S/L368A/Y407V). El efecto de las mutaciones introducidas en la unión a FcRn se puede determinar fácilmente usando un procedimiento de cromatografía de afinidad por FcRn (véase la Tabla siguiente). Los anticuerpos que tienen una elución posterior de la columna de afinidad por FcRn, es decir, que tienen un tiempo de retención más largo en la columna de afinidad por FcRn, tienen una semivida más larga in vivo, y viceversa.

Tabla.

Las mutaciones asimétricas IHH-AAA y LLL-DDD (mutación LLL-DDD = L251D, L314D y L432D) muestran una unión más débil que el anticuerpo original o natural correspondiente.

La mutación simétrica HHY-AAA (= combinación de las mutaciones H310A, H433A e Y436A) da como resultado una región Fc que ya no se une al FcRn humano, mientras que la unión a la proteína A se mantiene (véase Figuras 11, 12, 13 y 14).

El efecto de la introducción de mutaciones asimétricas que afectan a la unión a FcRn en la región Fc también se ha ejemplificado además con un anticuerpo monoespecífico anti-IGF-1R (IGF-1R), un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/ANG-2 (VEGF/ANG2) y un anticuerpo de longitud completa con fusiones en el extremo C de ambas cadenas pesadas (fusión) ensambladas utilizando la tecnología "botón en ojal" para permitir la introducción de mutaciones asimétricas (véanse, por ejemplo, el documento US 7.695.936, el documento US 2003/0078385; mutaciones en la cadena "ojal": S354C/T366W, mutaciones en la cadena "botón": Y349C/T366S/L368A/Y407V). El efecto de las mutaciones introducidas sobre la unión a FcRn y la unión a proteína A se puede determinar fácilmente usando un procedimiento de cromatografía de afinidad por FcRn, un procedimiento de cromatografía de afinidad por proteína A y procedimientos basados en RPS (véase la siguiente Tabla).

Un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo que comprende la región Fc de clase IgG variante humana como se informa en el presente documento.

El polipéptido de la región Fc confiere las características descritas anteriormente al anticuerpo o a su compañero de fusión.

El compañero de fusión puede ser cualquier molécula que tenga una actividad biológica cuya semivida in vivo se reduzca o aumente, es decir, cuya semivida in vivo se defina claramente y se modifique para su aplicación prevista.

Los polipéptidos de fusión de la región Fc pueden comprender, por ejemplo, una región Fc de la clase IgG variante (humana) como se informa en el presente documento y una proteína receptora que se une a una diana que incluye un ligando, tal como por ejemplo el polipéptido de fusión de la región Fc de t Nf R (TNFR = receptor del factor de necrosis tumoral humano), el polipéptido de fusión de la región Fc de IL-1R (IL-1R = receptor de interleucina humana 1), o polipéptidos de fusión de la región Fc de VEGFR (VEGFR = receptor del factor de crecimiento endotelial vascular humano), o polipéptidos de fusión de la región Fc de ANG2R (ANG2r = receptor de angiopoyetina 2 humana).

Los polipéptidos de fusión de la región Fc pueden comprender, por ejemplo, una región Fc de la clase IgG variante (humana) como se informa en el presente documento y un fragmento de anticuerpo que se une a una diana que incluye, tal como por ejemplo un fragmento Fab de anticuerpo, scFv (véase, por ejemplo, Nat. Biotechnol 23 (2005) 1126-1136), o anticuerpos de dominio (dAb) (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2004/058821 y WO 2003/002609).

Los polipéptidos de fusión de la región Fc pueden comprender, por ejemplo, una región Fc de clase IgG variante (humana) como se informa en el presente documento y un ligando del receptor (ya sea de origen natural o artificial).

B. Enfermedades vasculares oculares

Las enfermedades vasculares oculares son cualquier afección patológica caracterizada por la proliferación e invasión alteradas o no reguladas de nuevos vasos sanguíneos en las estructuras de los tejidos oculares, tal como la retina o la córnea.

En un modo de realización, la enfermedad vascular ocular se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular senil húmeda (DMS húmeda), degeneración macular senil seca (DMS seca), edema macular diabético (EMD), edema macular quistoide (EMQ), retinopatía diabética no proliferativa (RDNP), retinopatía diabética proliferativa (RDP), vasculitis (por ejemplo, oclusión de la vena retiniana central), papiloedema, retinopatía, conjuntivitis, uveítis, coroiditis, coroiditis multifocal, histoplasmosis ocular, blefaritis, ojo seco (enfermedad de Sjogren) y otras enfermedades oftalmológicas en las que la enfermedad o trastorno ocular se asocia con neovascularización ocular, extravasación vascular y/o edema retiniano.

El anticuerpo como se informa en el presente documento es útil en la prevención y el tratamiento de la DMS húmeda, DMS seca, EMQ, EMD, RDNP, RDP, blefaritis, ojo seco y uveítis, también en un modo de realización preferente de la DMS húmeda, DMS seca, blefaritis y ojo seco, también en un modo de realización preferente de la EMQ, EMD, RDNP y RDP, también en un modo de realización preferente de la blefaritis y ojo seco, en particular de la DMS húmeda y DMS seca, y también en particular de la DMS húmeda.

En algunos modos de realización, la enfermedad vascular ocular se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular senil húmeda (DMS húmeda), edema macular, oclusiones de la vena retiniana, retinopatía del prematuro y retinopatía diabética.

Otras enfermedades asociadas con la neovascularización corneal incluyen, pero no se limitan a, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, exceso de uso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis pterigea seca, enfermedad de Sjogren, acné rosácea, flictenulosis, sífilis, infecciones por micobacterias, degeneración lipídica, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras por hongos, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zóster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratólisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, traumatismo, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Stevens-Johnson, queratotomía radial perifigoidea y rechazo de injerto corneal.

Las enfermedades asociadas con la neovascularización retiniana/coroidea incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia drepanocítica, sarcoide, sífilis, pseudoexantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión de las venas, oclusión de las arterias, enfermedad obstructiva de la carótida, uveitis/vitritis crónica, infecciones por micobacterias, enfermedad de Lyme, lupus sistémico, eritematosis, retinopatía del prematuro, retinosis pigmentaria, edema de retina (incluido edema macular), enfermedad de Eale, enfermedad de Bechet, infecciones que causan retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Best, fosetas ópticas, enfermedad de Stargart, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismo y complicaciones post-láser.

Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con la rubeosis (neovascularización del ángulo) y enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso, incluyendo todas las formas de vitreorretinopatía proliferativa.

La retinopatía del prematuro (RdP) es una enfermedad del ojo que afecta a los bebés prematuros. Se cree que está causada por un crecimiento desorganizado de los vasos sanguíneos de la retina que puede dar como resultado cicatrización y desprendimiento de la retina. La RdP puede ser leve y se puede resolver de forma espontánea, pero puede dar lugar a ceguera en casos graves. Como tal, todos los bebés prematuros están en riesgo de RdP, y un peso al nacer muy bajo es un factor de riesgo adicional. Tanto la toxicidad del oxígeno como la hipoxia relativa pueden contribuir al desarrollo de RdP.

La degeneración macular es una afección médica que se encuentra predominantemente en adultos ancianos en los que el centro del revestimiento interno del ojo, conocido como área de la mácula de la retina, sufre afinamiento, atrofia y, en algunos casos, sangrado. Esto puede dar como resultado la pérdida de la visión central, lo que implica la incapacidad de ver detalles finos, leer o reconocer caras. De acuerdo con la Academia Americana de Oftalmología, es la causa principal de pérdida de visión central (ceguera) en los Estados Unidos hoy en día para las personas mayores de cincuenta años. Aunque algunas distrofias maculares que afectan a individuos más jóvenes a veces se denominan degeneración macular, el término se refiere en general a la degeneración macular senil (DMS).

La degeneración macular senil comienza con depósitos amarillos característicos en la mácula (área central de la retina que proporciona una visión central detallada, llamada fóvea) llamados drusas entre el epitelio pigmentario de la retina y la coroides subyacente. La mayoría de las personas con estos cambios tempranos (denominados maculopatías seniles) tienen buena visión. Las personas con drusas pueden desarrollar DMS avanzada. El riesgo es considerablemente mayor cuando las drusas son grandes y numerosas y se asocian con alteraciones en la capa de células pigmentadas debajo de la mácula. Las drusas grandes y suaves están relacionadas con elevados depósitos de colesterol y pueden responder a los agentes reductores del colesterol o al procedimiento Rheo.

La DMS avanzada, que es responsable de la pérdida de visión profunda, tiene dos formas: seca y húmeda. La atrofia geográfica central, la forma seca de la DMS avanzada, resulta de la atrofia de la capa epitelial pigmentaria retiniana debajo de la retina, que causa pérdida de visión a través de la pérdida de fotorreceptores (bastoncillos y conos) en la parte central del ojo. Si bien no existe un tratamiento disponible para esta afección, el National Eye Institute y otros han demostrado que los suplementos vitamínicos con altas dosis de antioxidantes, luteína y zeaxantina ralentizan la progresión de la degeneración macular seca y, en algunos pacientes, mejoran la agudeza visual.

La retinosis pigmentaria (RP) es un grupo de afecciones genéticas de los ojos. En la progresión de los síntomas de RP, la ceguera nocturna precede en general a la visión de túnel en años o incluso décadas. Muchas personas con RP no se vuelven legalmente ciegas hasta los 40 o 50 años y conservan algo de vista durante toda su vida. Otros se vuelven completamente ciegos por RP, en algunos casos desde la infancia. La progresión de la RP es diferente en cada caso. La RP es un tipo de distrofia retiniana hereditaria, un grupo de trastornos hereditarios en los que las anomalías de los fotorreceptores (bastoncillos y conos) o el epitelio pigmentario retiniano (EPR) de la retina conducen a una pérdida visual progresiva. Las personas afectadas experimentan primero una adaptación defectuosa a la oscuridad o ambliopía (ceguera nocturna), seguida de una reducción del campo visual periférico (conocida como visión de túnel) y, a veces, pérdida de la visión central posteriormente en el curso de la enfermedad.

El edema macular se produce cuando se acumulan depósitos de líquido y proteína en o debajo de la mácula del ojo, un área central amarilla de la retina, que hace que se espese y se hinche. La hinchazón puede distorsionar la visión central de una persona, ya que la mácula está cerca del centro de la retina en la parte posterior del globo ocular. Esta área contiene conos bien empaquetados que proporcionan una visión central clara y nítida para que la persona pueda ver la forma, el color y los detalles que se encuentran directamente en la línea de visión. El edema macular quistoide es un tipo de edema macular que incluye la formación de quistes.

C. Anticuerpos ejemplares

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que han suprimido la unión a FcRn, es decir, estos anticuerpos se unen a FcRn humano con una afinidad comparable a o menor que un anticuerpo que tiene las mutaciones I253A/H310A/H435A o H310A/H433A/Y436A o L251D/L314D/L432D o combinaciones de las mismas en la región Fc, es decir, en ambos polipéptidos de la región Fc (numeración de acuerdo con el sistema de numeración de índice EU de Kabat).

Se divulga un anticuerpo que ha suprimido la unión a FcRn y comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc, en el que

i) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones I253A, H310A y H435A, o

ii) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones H310A, H433A e Y436A, o

iii) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones L251D, L314D y L432D, o

iv) el primer polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A y el segundo polipéptido de la región Fc comprende

a) las mutaciones H310A, H433A e Y436A, o

b) las mutaciones L251D, L314D y L432D,

o

vi) el primer polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones H310A, H433A e Y436A y el segundo polipéptido de la región Fc comprende

a) las mutaciones L251D, L314D y L432D.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no se une específicamente al FcRn humano. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une específicamente a la proteína A estafilocócica.

En un modo de realización de todos los aspectos, el segundo polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V ("ojal") y el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones S354C y T366W ("botón").

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico tiene una especificidad de unión que se une específicamente a ANG-2 humana y una especificidad de unión que se une específicamente a VEGF humano.

Un anticuerpo ejemplar como se informa en el presente documento y también en un aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico bivalente con unión a FcRn suprimida que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

ii) el segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende, en el dominio variable de cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 22, una región CDR2H de SEQ ID NO: 23 y una región CDR1H de SEQ ID NO: 24 y, en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3L de SEQ ID NO: 25, una región CDR2L de SEQ ID NO: 26 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 27,

y en el que

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc de clase IgG que comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivados de origen humano), que comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y h 435a están comprendidas en la región Fc de clase IgG.

En un modo de realización de todos los aspectos, la región Fc de clase IgG es una región Fc de clase IgG variante (humana). En un modo de realización, la región Fc de clase IgG variante (humana) es una región Fc heterodimérica de clase IgG.

En un modo de realización de todos los aspectos, el emparejamiento del primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc para formar una región Fc de clase IgG (funcional) da como resultado la formación de un heterodímero.

En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc humana es un polipéptido de la región Fc humana de la subclase IgG1 o de la subclase IgG4.

En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc humana es un polipéptido de la región Fc humana de la subclase IgG1 con la mutación L234A, L235A y P329G.

En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc humana es un polipéptido de la región Fc humana de la subclase IgG4 con la mutación S228P y L235E.

En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones S354C y T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la región Fc de iii) es de subclase IgG1 humana. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la región Fc de subclase IgG humana comprende además las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones S354C y T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C y T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la región Fc de iii) es de subclase IgG4 humana. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la región Fc de subclase IgG4 humana comprende además las mutaciones S228P y L235E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la región Fc de subclase IgG4 humana comprende además las mutaciones S228P, L235E y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones S354C y T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones Y349C y T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc que comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (es decir, derivados de origen humano) que comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y H435A están comprendidas en la región Fc.

Todavía otros aspectos como se informa en el presente documento son una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, la formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares, el uso del anticuerpo biespecífico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares oculares, un procedimiento de tratamiento del paciente que padece enfermedades vasculares oculares mediante la administración del anticuerpo biespecífico a un paciente que necesite dicho tratamiento. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico o la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico se administran por medio de aplicación intravítrea.

Otro aspecto de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento.

La invención proporciona además plásmidos de expresión que contienen ácido nucleico como se informa en el presente documento que pueden expresar el ácido nucleico en una célula huésped procariota o eucariota, y células huésped que contienen dichos plásmidos para la producción recombinante de un anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento.

La invención comprende además una célula huésped procariota o eucariota que comprende un plásmido como se informa en el presente documento.

La invención comprende además un procedimiento para la producción de un anticuerpo biespecíficos como se informa en el presente documento, caracterizado por expresar un ácido nucleico como se informa en el presente documento en una célula huésped procariota o eucariota y recuperar el anticuerpo biespecífico de la célula o del sobrenadante de cultivo celular. Un modo de realización es un procedimiento para la preparación de un anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento que comprende las etapas de

a) transformar una célula huésped con plásmidos que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo,

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la síntesis del anticuerpo, y

c) recuperar el anticuerpo del cultivo.

La invención comprende además el anticuerpo obtenido por dicho procedimiento para la producción de un anticuerpo biespecífico.

Los anticuerpos como se informa en el presente documento tienen propiedades muy valiosas debido a sus modificaciones específicas en la región Fc que causan un beneficio para un paciente que padece enfermedades vasculares oculares. Muestran una alta estabilidad en el entorno intravítreo y una lenta difusión desde el ojo (en comparación con los fragmentos de anticuerpos más pequeños sin una región de cadena pesada constante), donde se localiza y trata la enfermedad real (por lo que la pauta de tratamiento se puede mejorar potencialmente en comparación con anticuerpos de tipo IgG de longitud no completa como, por ejemplo, fragmentos Fab y (Fab)2. Por otro lado, los anticuerpos como se informan en el presente documento se eliminan bastante rápidamente del suero (algo que es altamente deseable para reducir los efectos secundarios potenciales derivados de la exposición sistémica). Sorprendentemente, también muestran una viscosidad más baja (véase Figura 2) (en comparación con las versiones sin las mutaciones I253A, H310A y H435A en la región constante) y, por lo tanto, son especialmente útiles para la aplicación intravítrea a través de agujas finas durante el tratamiento de enfermedades oculares (para dicha aplicación típicamente se usan agujas finas y la alta viscosidad hace que una aplicación apropiada sea bastante difícil). La menor viscosidad también permite formulaciones de concentraciones más altas. También sorprendentemente, los anticuerpos como se informa en el presente documento muestran una tendencia más baja a la agregación (véase Figura 4) durante el almacenamiento (en comparación con las versiones sin las mutaciones I253A, H310A y H435A en la región Fc) que es crítica para la aplicación intravítrea en el ojo (ya que una agregación en el ojo puede dar lugar a complicaciones durante dicho tratamiento). Los anticuerpos biespecíficos como se informa en el presente documento muestran una buena eficacia en la inhibición de enfermedades vasculares. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos como se informa en el presente documento debido a sus modificaciones específicas en la región constante (por ejemplo, P329G LALA) muestran propiedades valiosas como la ausencia de unión a/de los receptores de Fcgamma, lo que reduce el riesgo de efectos secundarios como la trombosis y/o la muerte celular no deseada (debido a, por ejemplo, ADCC).

En un modo de realización como se informa en el presente documento, el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento es bivalente.

En un aspecto de acuerdo con la invención, dicho anticuerpo bivalente biespecífico como se informa en el presente documento se caracteriza por comprender

Este formato de anticuerpo biespecífico bivalente para el anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) se describe en el documento WO 2009/080253 (incluyendo los dominios CH3 modificados "botón en ojal"). Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo biespecífico bivalente se denominan CrossMab.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico bivalente se caracteriza por comprender

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 37.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 41.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 45.

En consecuencia, un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, de SEQ ID NO: 103, de SEQ ID NO: 36 y de SEQ ID NO: 37.

En consecuencia, un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, de SEQ ID NO: 105, de SEQ ID NO: 40 y de SEQ ID NO: 41.

En consecuencia, un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, de SEQ ID NO: 107, de SEQ ID NO: 44 y de SEQ ID NO: 45.

En otro aspecto como se informa en el presente documento, el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se caracteriza por comprender

Este formato de anticuerpo biespecífico bivalente para este anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) se describe en el documento WO 2011/117330 (incluyendo los dominios CH3 modificados "botón en ojal"). Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo biespecífico bivalente se denominan Fab de cadena única de un solo brazo (OAscFab).

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, y

b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectada a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa a través de un conector peptídico, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y

b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectada a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa a través de un conector peptídico, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.

En un modo de realización, el dominio variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo y el dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo de la cadena pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa se estabilizan adicionalmente mediante la introducción de un puente disulfuro entre las siguientes posiciones: posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Las técnicas para introducir puentes disulfuro para la estabilización se describen, por ejemplo, en el documento w O 94/029350, Rajagopal, V. et al., Prot. Eng. 10 (1997) 1453-1459, Kobayashi et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393, y Schmidt, M. et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721.

En consecuencia, un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, de SEQ ID NO: 109 y de SEQ ID NO: 48.

En consecuencia, un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, de SEQ ID NO: 111 y de SEQ ID NO: 51.

En un modo de realización, los dominios CH3 del anticuerpo biespecífico bivalente como se informa en el presente documento están alterados por la tecnología "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos, por ejemplo, en el documento w O 96/027011, Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, y Merchant, A.M. et al., Nat. Biotecnol. 16 (1998) 677-681. En este procedimiento, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza adicionalmente los heterodímeros (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S. et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26- 35) e incrementa el rendimiento.

En un modo de realización preferente de todos los aspectos de los que se informa en el presente documento, los anticuerpos biespecíficos se caracterizan por que

el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo,

en el que la interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico, en el que la alteración se caracteriza por que:

a) el dominio CH3 de una cadena pesada se altera,

de modo que dentro de la interfase original del dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico

un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede colocar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada,

y

b) el dominio CH3 de la otra cadena pesada se altera,

de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico

un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro del cual se puede posicionar una protuberancia de la interfase del primer dominio CH3.

Por tanto, el anticuerpo de acuerdo con la invención está en un modo de realización preferente caracterizado por que el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de b) se encuentran en una interfase que comprende una alteración en la interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo,

en el que

i) en el dominio CH3 de una cadena pesada

y en el que

ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada

En un modo de realización preferente, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

En un modo de realización preferente, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

En un modo de realización, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de un residuo de cisteína (C) en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que se puede formar un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la cadena "ojal". También se puede usar un puente disulfuro intercatenario adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), por ejemplo, introduciendo una mutación Y349C o S354C en el dominio CH3 de la cadena "botón" y una mutación Y349C o E356C o S354C en el dominio CH3 de la cadena "ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento comprende la mutación Y349C o S354C y la mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y la mutación S354C o E356C o Y349C y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En un modo de realización preferente, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación S354C adicional en el otro dominio CH3 que forman un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). En un modo de realización preferente, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación S354C adicional en el otro dominio CH3 que forman un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, m D (1991)).

Pero también se pueden usar de forma alternativa o adicional otras tecnologías "botón en ojal", como se describe en el documento EP 1870459 A1. Por tanto, otro ejemplo para el anticuerpo biespecífico son las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la cadena "ojal" y adicionalmente las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones S354C, T366W en una de los dos dominios CH3 y las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".

En un modo de realización como se informa en el presente documento, el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se caracteriza por tener una o más de las siguientes propiedades:

- muestra una concentración sérica más baja en comparación con el anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (96 horas después de la aplicación intravítrea en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano) (determinado en ensayos como se describe en el Ejemplo 6), y/o

- muestra una concentración similar (factor de 0,8 a 1,2) en lisados del ojo derecho completo en comparación con el anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano, 96 horas después de la aplicación intravítrea en el ojo derecho) (determinado en ensayos como se describe en el Ejemplo 6), y

- ha suprimido la unión al FcRn humano, y/o

- no presenta unión a la proteína estafilocócica A (determinada por RPS), y/o

- ha mantenido la unión a la proteína A estafilocócica (determinada por RPS).

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico bivalente se caracteriza por comprender

un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por que

i) el primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la SEQ ID NO: 20 y como dominio variable de cadena ligera (VL) la SEQ ID NO: 21; y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la SEQ ID NO: 28 y como dominio variable de cadena ligera (VL) la SEQ ID NO: 29; y

iii) el anticuerpo biespecífico comprende

una región Fc de clase IgG que comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivados de origen humano), que comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y H435A están comprendidas en la región Fc de clase IgG variante (humana),

y que tiene una o más de las siguientes propiedades:

- muestra una concentración similar (factor de 0,8 a 1,2) en lisados del ojo derecho completo en comparación con el anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano, 96 horas después de la aplicación intravítrea en el ojo derecho) (determinado en ensayos como se describe en el Ejemplo 6), y/o

- ha suprimido la unión al FcRn humano, y/o

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por que

i) el primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la SEQ ID NO: 20 con 1, 2 o 3 sustituciones de residuos aminoacídicos, y como dominio variable de cadena ligera (VL) la SEQ ID NO: 21 con 1,2 o 3 sustituciones de residuos aminoacídicos; y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de cadena pesada (VH) la SEQ ID NO: 28 con 1, 2 o 3 sustituciones de residuos aminoacídicos, y como dominio variable de cadena ligera (VL) la SEQ ID NO: 28 con 1,2 o 3 sustituciones de residuos aminoacídicos; y

iii) el anticuerpo biespecífico comprende

una región Fc de clase IgG que comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivados de origen humano), que comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y H435A están comprendidas en la región Fc de clase IgG variante (humana), y que tiene una o más de las siguientes propiedades:

- ha suprimido la unión al FcRn humano, y/o

Los sitios de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento contienen seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) que contribuyen en grados variables a la afinidad del sitio de unión por el antígeno. Existen tres CDR de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominio variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3). La extensión de las CDR y las regiones estructurales (FR) se determina por comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en la que esas regiones se han definido de acuerdo con la variabilidad entre las secuencias.

El anticuerpo como se informa en el presente documento se produce por medios recombinantes. Por tanto, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se informa en el presente documento y otro aspecto es una célula que comprende el ácido nucleico que codifica un anticuerpo como se informa en el presente documento. Los procedimientos para la producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y, normalmente, la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos mencionados anteriormente en una célula huésped, los ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas (modificadas) respectivas se insertan en plásmidos de expresión por procedimientos estándar. La expresión se realiza en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas, tales como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante de cultivo o células después de la lisis). Los procedimientos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de recapitulación de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; y Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

En consecuencia, un aspecto como se informa en el presente documento es un procedimiento para la preparación de un anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento que comprende las etapas de

c) recuperar el anticuerpo del cultivo.

En un modo de realización, la etapa de recuperación en c) incluye el uso de un reactivo de captura específico del dominio constante de la cadena ligera (que, por ejemplo, es específico para la cadena ligera constante kappa o lambda, dependiendo de si se usa una cadena ligera kappa o lambda en el anticuerpo biespecífico). En un modo de realización, el reactivo de captura específico de cadena ligera se usa en un modo de unión y elución. Los ejemplos de dichos reactivos de captura específicos del dominio constante de la cadena ligera son, por ejemplo, KappaSelect™ y LambdaFabSelect™ (disponibles en GE Healthcare/BAC), que se basan en una matriz de base de agarosa altamente rígida que permite altos caudales y baja contrapresión a gran escala. Estos materiales contienen un ligando que se une a la región constante de la cadena ligera kappa o lambda, respectivamente (es decir, los fragmentos que carecen de la región constante de la cadena ligera no se unirán; Figura 1). Por lo tanto, ambas son capaces de unirse a otras moléculas diana que contienen la región constante de la cadena ligera, por ejemplo, IgG, IgA e IgM. Los ligandos se unen a la matriz por medio de un largo brazo espaciador hidrófilo para que estén fácilmente disponibles para unirse a la molécula diana. Se basan en un fragmento de anticuerpo de cadena única que se criba para detectar Ig kappa o lambda humana.

En un modo de realización, la etapa de recuperación en c) incluye el uso de un reactivo de captura específico de la región Fc. En un modo de realización, el reactivo de captura específico de la región Fc se usa en un modo de unión y elución. Ejemplos de dichos reactivos de captura específicos de la región Fc son, por ejemplo, materiales de cromatografía de afinidad basados en la proteína A estafilocócica.

Los anticuerpos biespecíficos se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (proteína A-sefarosa, KappaSelect™, LambdaFabSelect™), cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel o diálisis.

El ADN y el ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se aíslan y secuencian fácilmente usando procedimientos convencionales. Los linfocitos B o células de hibridoma pueden servir como fuente de dichos ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN se puede insertar en plásmidos de expresión, que se transfectan a continuación en células huésped tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Algunos de los anticuerpos (biespecíficos) como se informan en el presente documento proporcionan facilidad de aislamiento/purificación al comprender regiones Fc que se modifican diferencialmente, en el que al menos una de las modificaciones da como resultado i) una afinidad diferencial del anticuerpo (biespecífico) por la proteína A, y ii) una afinidad diferencial del anticuerpo (biespecífico) por el FcRn humano, y el anticuerpo (biespecífico) se puede aislar de una célula alterada, de un medio o de una mezcla de anticuerpos en base a su afinidad por la proteína A.

La purificación de los anticuerpos se realiza para eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. (véase, por ejemplo, Ausubel, F. et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987)). Diferentes procedimientos están bien establecidos y se usan ampliamente para la purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo, cromatografía de afinidad por proteína A o proteína G), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio catiónico (resinas de carboximetilo), intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) e intercambio mixto), adsorción tiofílica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatografía de interacción hidrófoba o adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico), cromatografía de afinidad por quelatos metálicos (por ejemplo, con material de afinidad por Ni(II) y Cu(II)), cromatografía de exclusión por tamaño y procedimientos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

El anticuerpo biespecífico bivalente contra VEGF humano y ANG-2 humana como se informa en el presente documento puede tener un valioso perfil de eficacia/seguridad y puede proporcionar beneficios para un paciente que necesite un tratamiento anti-VEGF y anti-ANG-2.

Un aspecto como se informa en el presente documento es una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo como se informa en el presente documento. Otro aspecto como se informa en el presente documento es el uso de un anticuerpo como se informa en el presente documento para la fabricación de una formulación farmacéutica. Otro aspecto como se informa en el presente documento es un procedimiento para la fabricación de una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo como se informa en el presente documento. En otro aspecto se proporciona una formulación, por ejemplo, una formulación farmacéutica, que contiene un anticuerpo como se informa en el presente documento, formulado conjuntamente con un vehículo farmacéutico.

Una formulación como se informa en el presente documento se puede administrar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto como se informa en el presente documento mediante determinadas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y soluciones tampón acuosas. Los vehículos farmacéuticos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica.

Se pueden usar muchos modos posibles de administración, que incluyen, pero sin limitarse a, la aplicación intraocular o la aplicación tópica. En un modo de realización, la aplicación es intraocular e incluye, pero no se limita a, inyección subconjuntival, inyección intracraneal, inyección en la cámara anterior a través del limbo temporal, inyección intraestromal, inyección intracorneal, inyección subrretiniana, inyección en el humor acuoso, inyección en subtenón o dispositivo de administración sostenida, inyección intravítrea (por ejemplo, inyección vítrea frontal, media o posterior). En un modo de realización, la aplicación es tópica e incluye, pero no se limita a, gotas oculares en la córnea.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento se administra mediante una aplicación intravítrea, por ejemplo, mediante inyección intravítrea. Esto se puede realizar de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206, y Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185).

En algunos modos de realización, los kits terapéuticos como se informa en el presente documento pueden contener una o más dosis de un anticuerpo (biespecífico) presente en una formulación farmacéutica descrita en el presente documento, un dispositivo adecuado para la inyección intravítrea de la formulación farmacéutica, y una instrucción que detalla los sujetos adecuados y los protocolos para llevar a cabo la inyección. En estos modos de realización, las formulaciones se administran típicamente al sujeto que necesita el tratamiento mediante inyección intravítrea. Esto se puede realizar de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206, y Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185).

Las formulaciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. T ambién puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares, en las formulaciones. Además, se puede producir la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos como se informan en el presente documento que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas como se informan en el presente documento, se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Se pueden variar las concentraciones de dosificación reales de los ingredientes activos en las formulaciones farmacéuticas como se informan en el presente documento para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, formulación y modo de administración particulares, sin que sean tóxicas para el paciente. La concentración de dosificación seleccionada dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las formulaciones particulares como se informa en el presente documento empleadas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las formulaciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos anteriores del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

La formulación debe ser estéril y fluida en la medida en que la formulación sea administrable mediante jeringuilla. Además del agua, el vehículo es preferentemente una solución salina tamponada isotónica.

La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la formulación.

La formulación puede comprender una formulación de liberación lenta oftálmica que comprende un agente activo para administración subconjuntival. La formulación de liberación lenta oftálmica comprende micropartículas de agente activo esencialmente puro, por ejemplo, el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento. Las micropartículas que comprenden el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se pueden incluir en un polímero farmacéuticamente aceptable biocompatible o un agente de encapsulación de lípidos. Las formulaciones de liberación lenta se pueden adaptar para liberar todo o sustancialmente todo el material activo durante un período de tiempo prolongado. El polímero o matriz lipídica, si está presente, se puede adaptar para degradarse lo suficiente como para ser transportado desde el sitio de administración después de la liberación de todo o sustancialmente todo el agente activo. La formulación de liberación lenta puede ser una formulación líquida, que comprende un polímero farmacéuticamente aceptable y un agente activo disuelto o dispersado. Tras la inyección, el polímero forma un depósito en el sitio de inyección, por ejemplo, mediante gelificación o precipitación.

Otro aspecto como se informa en el presente documento es el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

Un modo de realización como se informa en el presente documento es el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

Otro aspecto como se informa en el presente documento es la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

Otro aspecto como se informa en el presente documento es el uso de un anticuerpo como se informa en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad vascular ocular.

Por la presente se indica expresamente que el término "que comprende" como se usa en el presente documento comprende el término "que consiste en". Por tanto, todos los aspectos y modos de realización que contienen el término "que comprende" se describen igualmente con el término "que consiste en".

D. Modificaciones

En otro aspecto, un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-6 a continuación:

1. Afinidad de anticuerpos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 100 nM, < 10 nM (por ejemplo, 10-7 M o menos, por ejemplo, de 10-7 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M).

En un modo de realización, la Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, los chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare Inc.) se activan con clorhidrato de W-etil-W'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces (por ejemplo, de Fab) (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kaso) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kaso (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Si la velocidad de asociación supera 106 M-1 s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con interrupción de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en el documento US 4.816.567; y Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en los seres humanos, mientras que se retienen la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos modos de realización, algunos residuos de FR de un anticuerpo humanizado se sustituyen por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se recapitulan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; los documentos US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 y US 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describen el injerto en la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describen el "barajado de FR"); Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68; y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Y Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la estirpe germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).

3. Anticuerpos humanos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol.5 (2001) 368-374 y Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición a antígeno. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan a los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una recapitulación de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 (véase también, por ejemplo, los documentos US 6.075.181 y US 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; el documento US 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; el documento US 7.041.870 que describe la tecnología KM MOUSE®, y el documento US 2007/0061900 que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, mediante combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos mediante procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), pp. 51-63; y Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en el documento US 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas de células de hibridoma) y Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 y Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

4. Anticuerpos derivados de colecciones

Los anticuerpos como se informan en el presente documento se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para determinar los anticuerpos con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se recapitulan, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. y Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Fee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; y Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de los genes VH y VL se clonan por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que después se pueden cribar para determinar los fagos que se unen a los antígenos como se describe en Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad por el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De manera alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, a partir de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: los documentos US 5.750.373, US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 y US 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

5. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es para un primer antígeno y la otra para un segundo antígeno diferente. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes del mismo antígeno. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expresan al menos uno de los antígenos. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, el documento WO 93/08829 y Traunecker, A. et al., e Mb O J.

10 (1991) 3655-3659), y la genomanipulación "botón en ojal" (véase, por ejemplo, el documento US 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos manipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, el documento US 4.676.980, y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y usando dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

Los anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de doble actuación" o "DAF" (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.

6. Variantes de anticuerpos

En determinados modos de realización se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados modos de realización se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla a continuación bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Los cambios más sustanciales se proporcionan en la siguiente Tabla bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de la cadena lateral de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

TABLA.

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadas en presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), y/o residuos que se ponen en contacto con el antígeno, sometiendo a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración de afinidad mediante la construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. En algunos modos de realización de maduración de afinidad se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada.

Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados modos de realización se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden, por ejemplo, estar fuera de los residuos que se ponen en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y v L variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se puede seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham, B.C. y Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicional, se puede usar una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para la sustitución. Las variantes se pueden cribar para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de glucosilación

En determinados modos de realización se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo se puede conseguir convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se creen o eliminen uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que se une, en general, mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc (véase, por ejemplo, Wright, A. y Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo como se informa en el presente documento para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura glucídica que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, la Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a pequeñas variaciones de secuencia en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véase, por ejemplo, el documento US 2003/0157108; el documento US 2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficitarias en fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; Wo 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lee13 deficitarias de fucosilación de proteínas (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; el documento US 2003/0157108; y el documento WO 2004/056312, especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con desactivación génica, tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con desactivación génica (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng., 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; y el documento WO 2003/085107).

Las variantes de anticuerpo se proporcionan además con oligosacáridos bisegmentados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo está bisegmentado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en los documentos WO 2003/011878; US 6.602.684; y Us 2005/0123546. También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

c) Variantes de la región Fc

En determinados modos de realización se pueden introducir una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución/mutación) en una o más posiciones de aminoácido.

En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como CDC y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (de ahí que sea probable que carezca de actividad ADCC), pero retiene su capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRIi y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch, J.V. y Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en los documentos US 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; y Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); el documento US 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicional, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por lo tanto, carece de actividad CDC (véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402). Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; y Cragg, M.S. y Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743). También se pueden realizar la unión al FcRn y las determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

Los anticuerpos con una función efectora reducida incluyen aquellos con una sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (documento US 6.737.056). Dichas variantes de la región Fc incluyen regiones Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de la región Fc "DANA" con la sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (documento US 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida al FcR (véanse, por ejemplo, los documentos US 6.737.056, WO 2004/056312, y Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos).

En algunos modos de realización se hacen alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, bien mejoradas o disminuidas), por ejemplo, como se describe en los documentos US 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

En el documento US 2005/0014934 se describen anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434). Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de la región Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (documento US 7.371.826).

Véase también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y el documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

d) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína

En determinados modos de realización puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe más adelante en el presente documento. En determinados modos de realización, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se puede sustituir por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en el documento US 7.521.541.

e) Derivados de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar adicionalmente para que contenga restos no proteínicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, se pueden determinar el número y/o el tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado del anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro modo de realización se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar de forma selectiva mediante exposición a la radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, las longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que se destruyen las células proximales al resto no proteínico de anticuerpo.

f) Heterodimerización

Existen varios enfoques para las modificaciones en el dominio CH3 para garantizar la heterodimerización, que se describen bien, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Típicamente, en todos estos enfoques, tanto el primer dominio CH3 como el segundo dominio CH3 se genomanipulan de manera complementaria, de modo que cada dominio CH3 (o la cadena pesada que lo comprende) ya no puede homodimerizarse, sino que se ve obligado a heterodimerizarse con el otro CH3 genomanipulado complementario (de modo que el primer y el segundo dominio CH3 se heterodimerizan y no se forman homodímeros entre los dos primeros o los dos segundos dominios CH3). Estos diferentes enfoques para mejorar la heterodimerización de la cadena pesada se contemplan como alternativas diferentes en combinación con las modificaciones de la cadena pesada y ligera (intercambio/reemplazo de VH y VL en un brazo de unión y la introducción de sustituciones de aminoácidos cargados con cargas opuestas en la interfase CH1/CL) en los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención que reducen el emparejamiento erróneo de una cadena ligera y los productos secundarios tipo Bence-Jones.

En un modo de realización preferente de la invención (en caso de que el anticuerpo multiespecífico comprenda dominios CH3 en las cadenas pesadas), los dominios CH3 de dicho anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se pueden alterar mediante la tecnología "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, el documento WO 96/027011, Ridgway, J.B. et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; y Merchant, A.M. et al., Nat. Biotecnol. 16 (1998) 677-681; el documento WO 98/050431. En este procedimiento, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza adicionalmente los heterodímeros (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S. et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26 -35) e incrementa el rendimiento.

Por tanto, en un modo de realización de la invención, dicho anticuerpo multiespecífico (comprende un dominio CH3 en cada cadena pesada y) se caracteriza además por que

el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada del anticuerpo de a) y el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada del anticuerpo de b) se encuentran en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo

en el que dicha interfase se altera para promover la formación del anticuerpo multiespecífico, en el que la alteración se caracteriza por que:

i) el dominio CH3 de una cadena pesada se altera,

de modo que dentro de la interfase original del dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo multiespecífico,

un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede colocar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada

y

ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada se altera,

de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo multiespecífico

Preferentemente, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

Preferentemente dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

En un aspecto de la invención, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que se puede formar un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En un modo de realización preferente, dicho anticuerpo multiespecífico comprende una mutación aminoacídica T366W en el primer dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el segundo dominio CH3 de la cadena "ojal". También se puede usar un puente disulfuro intercatenario adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por ejemplo, introduciendo una mutación aminoacídica Y349C en el dominio CH3 de la cadena "ojal" y una mutación aminoacídica E356C o una mutación aminoacídica S354C en el dominio CH3 de la cadena "botón".

En un modo de realización preferente, dicho anticuerpo multiespecífico (que comprende un dominio CH3 en cada cadena pesada) comprende mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación aminoacídica S354C adicional en un dominio CH3 y la mutación aminoacídica Y349C adicional en el otro dominio CH3 que forma un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con Kabat).

Otras técnicas de modificación de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas de la invención y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP 1870 459A1 se puede usar de forma alternativa. Este enfoque se basa en la introducción de sustituciones/mutaciones de aminoácidos cargados con la carga opuesta en posiciones específicas de aminoácidos en la interfase dominio CH3/CH3 entre ambas cadenas pesadas. Un modo de realización preferente para dicho anticuerpo multiespecífico son las mutaciones aminoacídicas R409D, K370E en el primer dominio CH3 del anticuerpo multiespecífico y las mutaciones aminoacídicas D399K, E357K en el segundo dominio CH3 del anticuerpo multiespecífico (numeración de acuerdo con Kabat).

En otro modo de realización, dicho anticuerpo multiespecífico comprende una mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la cadena "botón" y mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la cadena "ojal" y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones aminoacídicas D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".

En otro modo de realización, dicho anticuerpo multiespecífico comprende mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o dicho anticuerpo multiespecífico comprende mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y adicionalmente mutaciones aminoacídicas R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y mutaciones aminoacídicas D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2013/157953 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D. En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la mutación aminoacídica L351K. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además una mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E).

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2012/058768 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además una mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R o S400K, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, N390R, N390K o N390D, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366a , K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otras mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2011/143545 se puede usar de forma alternativa, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2011/090762, que también usa la tecnología "botón en ojal" descrita anteriormente, se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366W y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407a . En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366Y y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407T.

En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es de isotipo IgG2 y el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2010/129304 se puede usar de forma alternativa.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento W02009/089004 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de K392 o N392 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y un segundo dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de D399, E356, D356 o E357 con un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356K). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución aminoacídica de K409 o R409 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución aminoacídica de K439 y/o K370 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D)).

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2007/147901 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K253E, D282K y K322D y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K292D.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO2007/110205 se puede usar de forma alternativa.

E. Procedimientos y composiciones recombinantes

Los anticuerpos se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. En un modo de realización se proporciona(n) ácido(s) nucleico(s) aislado(s) que codifica(n) un anticuerpo como se informa en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En otro modo de realización se proporcionan uno o más plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un plásmido que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer plásmido que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo plásmido que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realización se proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo como se informa en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y recuperar opcionalmente el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo como se informa en el presente documento, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más plásmidos para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se pueden unir específicamente a genes que codifican el polipéptido de la región Fc variante o las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión de plásmidos que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523 (véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para plásmidos que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus rutas de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una recapitulación de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, Nj (2004), pp. 255-268.

F. Tratamiento combinado

En determinados modos de realización, el anticuerpo o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento se administra solo (sin un agente terapéutico adicional) para el tratamiento de una o más enfermedades vasculares oculares descritas en el presente documento.

En otros modos de realización, el anticuerpo o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales o procedimientos para el tratamiento de una o más enfermedades vasculares oculares descritas en el presente documento.

En otros modos de realización, el anticuerpo o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento se formula en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales y se administra para el tratamiento de una o más enfermedades vasculares oculares descritas en el presente documento.

En determinados modos de realización, los tratamientos de combinación proporcionados en el presente documento incluyen que el anticuerpo o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento se administren secuencialmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de una o más enfermedades vasculares oculares descritas en el presente documento.

Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a, triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), EyeOO1 (aptámero PEGilado anti-VEGF), escualamina, RETAANE™ (acetato de anecortava para suspensión de liberación lenta; Alcon, Inc.), profármaco Combretastatina A4 (CA4P), MACUGEN™, MIFEPREX™ (mifepristona-ru486), acetónido de triamcinolona subtenoniana, acetónido de triamcinolona cristalina intravítrea, Prinomastat (inhibidor de metaloproteinasa de matriz sintética AG3340, Pfizer), acetónido de fluocinolona (incluyendo implante intraocular de fluocinolona, Bausch & Lomb/Control Delivery Systems), inhibidores de VEGFR (Sugen), VEGF-Trap (Regeneron/Aventis), inhibidores de la tirosina cinasa receptora de VEGF tales como 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi)quinazolina (AZD2171), vatalanib (PTK787) y SU1 1248 (sunitinib), linomida e inhibidores de la función integrina v.beta.3 y angiostatina.

Otros tratamientos farmacéuticos que se pueden usar en combinación con el anticuerpo o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, VISUDYNE™ con el uso de un láser no térmico, PKC 412, Endovion (NeuroSearch A/S), factores neurotróficos, incluyendo a modo de ejemplo el factor neurotrófico derivado de glial y el factor neurotrófico ciliar, diatazem, dorzolamida, Phototrop, 9-cis-retinal, medicación para los ojos (incluyendo el tratamiento con ecocardio) que incluye yoduro de fosfolina o ecotiofato o inhibidores de la anihidrasa carbónica, AE-941 (AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (Sima Therapeutics, Inc.), pegaptanib (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), neurotrofinas (incluyendo, solo a modo de ejemplo, NT-4/5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), antagonistas de integrina (incluyendo los de Jerini AG y Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), talidomida (como se usa, por ejemplo, por EntreMed, Inc.), cardiotrofina-1 (Genentech), 2-metoxiestradiol (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), tetratiomolibdato (Universidad de Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), compuesto microalgal (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group plc), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-beta 2 (Genzyme/Celtrix), inhibidores de la tirosina cinasa (Allergan, SUGEN, Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), neuroprotectores de células ganglionares retinales (Cogent Neurosciences), derivados de N-nitropirazol (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), ciclosporina A, tratamiento fotodinámico de translocación retiniana limitada, (incluyendo, solo a modo de ejemplo, PDT dirigida a receptores, Bristol-Myers Squibb, Co.; porfímero sódico para inyección con PDT; verteporfina, QLT Inc.; rostaporfina con PDT, Miravent Medical Technologies; talaporfina sódica con PDT, Nippon Petroleum; motexafina de lutecio, Pharmacyclics, Inc.), oligonucleótidos antisentido (incluyendo, a modo de ejemplo, productos probados por Novagali Pharma SA e ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals), fotocoagulación con láser, tratamiento con láser de drusas, cirugía de orificio macular, cirugía de translocación macular, telescopios en miniatura implantables, angiografía Phi-Motion (también conocida como tratamiento con microláser y tratamiento de vasos de alimentación), tratamiento con haz de protones, tratamiento de microestimulación, desprendimiento de retina y cirugía vítrea, cerclaje escleral, cirugía submacular, termoterapia transpupilar, tratamiento con fotosistema I, uso de interferencia por ARN (ARNi), reoféresis extracorpórea (también conocida como filtración diferencial de membrana y reoterapia), implante de microchip, tratamiento con células madre, tratamiento de reemplazo génico, tratamiento génico con ribozimas (incluyendo el tratamiento génico para el elemento de respuesta a la hipoxia, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; tratamiento génico con PDEF, GenVec), trasplante de fotorreceptores/células de la retina (incluyendo las células epiteliales retinianas transplantables), Diacrin, Inc.; trasplante de células retinianas, Cell Genesys, Inc.) y acupuntura.

Se puede usar cualquier agente antiangiogénico en combinación con el anticuerpo o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, los enumerados por Carmeliet y Jain, Nature 407 (2000) 249-257. En determinados modos de realización, el agente anti-angiogénico es otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF tal como variantes de VEGF, fragmentos de receptor de VEGF solubles, aptámeros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR neutralizantes, inhibidores de bajo peso molecular de VEGFR tirosina cinasas y cualquiera de combinación de los mismos y éstos incluyen aptámeros anti-VEGF (por ejemplo, pegaptanib), receptores señuelo recombinantes solubles (por ejemplo, VEGF-Trap). En determinados modos de realización, el agente antiangiogénico incluye corticosteroides, esteroides angiostáticos, acetato de anecortava, angiostatina, endostatina, expresión de disminución del ARN interferente pequeño de VEGFR o ligando de VEGF, bloqueo post-VEGFR con inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de MMP, IGFBP3, bloqueadores de SDF-1, p Ed F, gamma-secretasa, ligando 4 de tipo Delta, antagonistas de integrina, bloqueo de HIF-1 alfa, bloqueo de proteína cinasa CK2 e inhibición de células madre (es decir, células progenitoras endoteliales) de asentamiento en el sitio de neovascularización usando cadherina endotelial vascular (CD-144) y anticuerpos de factor derivado de estroma (SDF)-I. También se pueden usar inhibidores de RTK de molécula pequeña que se dirigen a los receptores de VEGF, incluyendo PTK787. Los agentes que tienen actividad contra la neovascularización que no son necesariamente compuestos anti-VEGF también se pueden usar e incluyen fármacos antiinflamatorios, inhibidores de m-Tor, rapamicina, everolismus, temsirolismus, ciclosporina, agentes anti-TNF, agentes anti-complemento y agentes antiinflamatorios no esteroideos. También se pueden usar agentes que son neuroprotectores y que potencialmente pueden reducir la progresión de la degeneración macular seca, tales como la clase de fármacos llamados "neuroesteroides". Estos incluyen fármacos tales como la deshidroepiandrosterona (DHEA) (Nombres comerciales: Prastera® y Fidelin®), sulfato de deshidroepiandrosterona y sulfato de pregnenolona. Cualquier agente terapéutico contra DMS (degeneración macular senil) se puede usar en combinación con el anticuerpo biespecífico o la formulación farmacéutica como se informa en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, verteporfina en combinación con PDT, pegaptanib sódico, zinc o un antioxidante, solo o en cualquier combinación.

G. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (Ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, son atóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables de ejemplo en el presente documento incluyen, además, agentes de dispersión intersticial del fármaco tales como glucoproteínas de hialuronidasa neutra-activa soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en los documentos US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un aspecto se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.

Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en el documento US 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en los documentos US 6.171.586 y WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo, según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos principios activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Los principios activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son, en general, estériles. Se puede lograr fácilmente la esterilidad, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

H. Composiciones y procedimientos terapéuticos

Cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto se proporciona un anticuerpo como se informa en el presente documento para su uso como medicamento. En aspectos adicionales se proporciona un anticuerpo para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares. En determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización se proporciona el anticuerpo para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad vascular ocular, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe anteriormente en la sección D. En otros modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo para su uso en la inhibición de la angiogénesis en el ojo. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo para su uso en un procedimiento de inhibición de la angiogénesis en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo para inhibir la angiogénesis. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es en un modo de realización preferente un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad vascular ocular. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad vascular ocular, que comprende administrar a un individuo que tiene una enfermedad vascular ocular una cantidad eficaz del medicamento. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe anteriormente. En otro modo de realización, el medicamento es para inhibir la angiogénesis. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inhibición de la angiogénesis en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inhibir la angiogénesis. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En el presente documento se divulga un procedimiento para inhibir la angiogénesis en el ojo en un individuo. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo como se informa en el presente documento para inhibir la angiogénesis. En un modo de realización, un "individuo" es un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Los anticuerpos como se informa en el presente documento se pueden usar solos o en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo como se informa en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional.

Un anticuerpo como se informa en el presente documento (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar mediante cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier ruta adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo, en parte, de si la administración es breve o prolongada. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen pero no se limitan a administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración intravenosa rápida, e infusión pulsada.

Los anticuerpos como se informa en el presente documento se formularán, dosificarán y administrarán de una forma consecuente con las prácticas médicas correctas. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, el mamífero particular al que se esté tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos de cabecera. Aunque no se necesita, el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y por las rutas de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y mediante cualquier ruta que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo como se informa en el presente documento (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y la evolución de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento previo, de la anamnesis del paciente y de su respuesta al anticuerpo y del criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,5 mg/kg a 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación inicial candidata para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. La evolución de este tratamiento se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

III. Artículos de fabricación

En otro aspecto como se informa en el presente documento se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas con solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una formulación que es por sí misma o combinada con otra formulación eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la formulación es un anticuerpo como se informa en el presente documento. La ficha técnica o prospecto indica que la formulación se usa para tratar la afección de elección. Por otra parte, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una formulación contenida en el mismo, en el que la formulación comprende un anticuerpo como se informa en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una formulación contenida en el mismo, en el que la formulación comprende otro agente citotóxico o terapéutico con otro modo de acción. El artículo de fabricación en este modo de realización como se informa en el presente documento puede comprender además un prospecto que indique que las formulaciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicional, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFl), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado como se informa en el presente documento en lugar de o además de un anticuerpo como se informa en el presente documento.

IV. MODOS DE REALIZACIÓN ESPECÍFICOS DE LA INVENCIÓN

1. Un anticuerpo que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc, en el que el primer y un segundo polipéptido de la región Fc son ambos de subclase de IgG1 humana o IgG4 humana (derivada de origen humano) y comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y H435A están comprendidas en la región Fc de clase IgG variante (humana).

2. El anticuerpo de acuerdo con el modo de realización 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

3. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo bivalente.

4. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 3, en el que

) el primer polipéptido de la región Fc se selecciona del grupo que comprende

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG2 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG3 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones S354C, T366S,

- L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, Y349C , T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, S354C , T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S , L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354C, T366S , L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, Y349C , T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, S354C , T366S, L368A, Y407V, - polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S , L368A, Y407V,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366S , L368A, Y407V,

- IgG1, IgG2 o IgG4 humana con las mutaciones K392D, y

- IgG3 humana con la mutación N392D,

y

ii) el segundo po ipéptido de la región Fc se selecciona del grupo que comprende

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG2 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG3 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones S354C, T366W

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones Y349C T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S354C, T366W

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones Y349C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366W,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366W,

- IgG2, IgG3 o IgG4 humana con las mutaciones D399K, E356K y/o E357K.

5. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 3, en el que

i) el primer polipéptido de la región Fc tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 60, 61,62, 63, 64, 65, 67, 69, 70, 71, 73, 75, 76, 78, 80, 81, 82 y 84, y

ii) el segundo polipéptido de la región Fc tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 72, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 83 y 85.

6. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 3, en el que

7. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 3, en el que

i) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o

ii) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, o

iii) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o

iv) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, o

v) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, o

vi) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o

vii) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, o

viii) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, o

ix) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, o

x) el primer polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 y el segundo polipéptido de la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84.

8. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 7, en el que el anticuerpo biespecífico tiene una especificidad de unión que se une específicamente a ANG-2 humana y una especificidad de unión que se une específicamente a VEGF humano.

9. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 8, en el que el anticuerpo comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

10. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 9, en el que el anticuerpo comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

11. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 10, que comprende

12. El anticuerpo de acuerdo con el modo de realización 11, que comprende

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

13. El anticuerpo de acuerdo con el modo de realización 11, que comprende

14. El anticuerpo de acuerdo con el modo de realización 11, que comprende

15. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 10, caracterizado por que comprende

16. El anticuerpo de acuerdo con el modo de realización 15, que comprende

17. El anticuerpo de acuerdo con el modo de realización 15, que comprende

18. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 15 a 17, en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo y el dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo de la cadena pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa se estabilizan con disulfuro mediante la introducción de un puente disulfuro entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de acuerdo con el sistema de numeración de índice EU de Kabat).

19. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana, en el que

el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, 35, 36 y 37, o

el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 39, 40 y 41, o

el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 43, 44 y 45, o

el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, 47 y 48, o

el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 50 y 51,

y

el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc de subclase IgG1 humana o IgG4 humana que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A en los polipéptidos de la región Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

20. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana,

en el que

los dominios variables comprenden SEQ ID NO: 20, 21,28 y 29 con 0, 1, 2 o 3 mutaciones en cada dominio variable, y

21. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana,

en el que

el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21, 28 y 29,

y

22. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana,

en el que

y en el que los dominios variables comprenden no más de 3 mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 20, 21,28 y 29.

23. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc de subclase IgG1 humana o IgG4 humana que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A en los polipéptidos de la región Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

24. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana,

en el que

25. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 18, en el que el anticuerpo no es un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a a NG-2 humana.

26. Un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, de SEQ ID NO: 103, de SEQ ID NO: 36 y de SEQ ID NO: 37.

27. Un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, de SEQ ID NO: 105, de SEQ ID NO: 40 y de SEQ ID NO: 41.

28. Un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, de SEQ ID NO: 107, de SEQ ID NO: 44 y de SEQ ID NO: 45.

29. Un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, de SEQ ID n O: 109 y de SEQ ID NO: 48.

30. Un anticuerpo biespecífico bivalente que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, de SEQ ID n O: 111 y de SEQ ID NO: 51.

31. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 30, en el que el anticuerpo no se une a FcRn humano.

32. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 31, en el que el anticuerpo se une a la proteína A estafilocócica.

33. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 31 a 32, en el que la unión o no unión se determina por resonancia de plasmón de superficie.

34. El anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 33, en el que el anticuerpo

- muestra una concentración sérica más baja en comparación con el anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones en los polipéptidos de la región Fc (96 horas después de la aplicación intravítrea en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano) (determinado en ensayos como se describe en el Ejemplo 6), y/o

- muestra una concentración similar (factor de 0,8 a 1,2) en lisados del ojo derecho completo en comparación con el anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones en los polipéptidos de la región Fc (en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano, 96 horas después de la aplicación intravítrea en el ojo derecho) (determinado en ensayos como se describe en el Ejemplo 6).

35. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso como medicamento.

36. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el tratamiento de una enfermedad vascular ocular.

37. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en la eliminación de uno o más ligandos de receptor solubles del ojo.

38. Uso de un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para el tratamiento de enfermedades oculares, especialmente de enfermedades vasculares oculares.

39. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el transporte de uno o más ligandos de receptor solubles desde el espacio intravítreo hasta la circulación sanguínea.

40. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular.

41. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el transporte de un ligando de receptor soluble desde el ojo a través de la barrera hematoocular hasta la circulación sanguínea. 42. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en la eliminación de uno o más ligandos de receptor solubles del ojo.

43. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el tratamiento de enfermedades oculares, especialmente enfermedades vasculares oculares.

44. Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el transporte de uno o más ligandos de receptor solubles desde el espacio intravítreo hasta la circulación sanguínea.

45. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34.

46. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

47. Uso del anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 34 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

48. La formulación farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 45 a 46, en la que el anticuerpo se administra mediante aplicación intravítrea.

V. EJEMPLOS

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y formulaciones como se informa en el presente documento. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle por medio de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance como se informa en el presente documento.

Procedimientos

Ionización por electropulverización/espectrometría de masas/(ESI-EM)

Se desglucosilaron alícuotas de proteínas (50 pg) añadiendo 0,5 pl de N-Glycanase plus (Roche) y tampón fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,1) para obtener un volumen de muestra final de 115 pl. La mezcla se incubó a 37 °C durante 18 h. Luego, para la reducción y desnaturalización se añadieron 60 pl de TCEP 0,5 M (Pierce) en guanidina * HCl 4 M (Pierce) y 50 pl de guanidina * HCl 8 M. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min. Las muestras se desalaron por cromatografía de exclusión por tamaño (sefarosa G-25, isocrática, 40 % de acetonitrilo con 2 % de ácido fórmico). Se registraron espectros de masas de ESI (+ va) en un instrumento Q-TOF (maXis, Bruker) equipado con una fuente de nano-ESI (TriVersa NanoMate, Advion). Las configuraciones de los parámetros de e M fueron como sigue: transferencia: embudo de RF, 400 Vpp; energía ISCID, 0 eV; RF multipolar, 400 Vpp; cuadrupolo: energía iónica, 4,0 eV; masa baja, 600 m/z; fuente: gas seco, 8 l/min; temperatura del gas seco, 160 °C; celda de colisión: energía de colisión, 10 eV; RF de colisión: 2000 Vpp; refrigerador de iones: RF de refrigerador de iones, 300 Vpp; tiempo de transferencia: 120 ps; almacenamiento de prepulsos, 10 ps; intervalo de barrido de m/z de 600 a 2000. Para la evaluación de los datos se usó un programa informático desarrollado internamente (MassAnalyzer).

Análisis por resonancia de plasmón de superficie (RPS) para FcRn

Se analizaron las propiedades de unión del anticuerpo natural y los mutantes al FcRn mediante tecnología de resonancia de plasmón de superficie (RPS) usando un instrumento BIAcore T100 (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Este sistema está bien establecido para el estudio de las interacciones moleculares. Permite un seguimiento continuo en tiempo real de las uniones ligando/analito y, por tanto, la determinación de los parámetros cinéticos en diversas configuraciones de ensayo. La tecnología r Ps se basa en la medición del índice de refracción cerca de la superficie de un chip biosensor recubierto de oro. Los cambios en el índice de refracción indican cambios de masa en la superficie provocados por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en solución. Si las moléculas se unen a un ligando inmovilizado en la superficie, la masa se incrementa; en caso de una disociación, la masa disminuye. En el ensayo actual, se inmovilizó el receptor FcRn en un chip biosensor CM5 de BIAcore (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Suecia) por medio de acoplamiento de amina a un nivel de 400 unidades de respuesta (UR). El ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente con PBS, Tween 20™ al 0,05 %, pH 6,0 (GE Healthcare Bioscience) como tampón de migración y dilución. Se inyectaron 200 nM de muestras de anticuerpo a un caudal de 50 pl/min a temperatura ambiente. El tiempo de asociación fue de 180 segundos, la fase de disociación tardó 360 segundos. La regeneración de la superficie del chip se alcanzó mediante una inyección corta de HBS-P, pH 8,0. Se realizó la evaluación de los datos de RPS mediante comparación de la altura de señal de respuesta biológica a los 180 segundos después de la inyección y a los 300 segundos después de la inyección. Los parámetros correspondientes son el nivel máx. de UR (180 segundos después de la inyección) y la estabilidad tardía (300 segundos después del final de la inyección).

Análisis por resonancia de plasmón de superficie (RPS) para la proteína A

El ensayo se basa en la espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie. La proteína A se inmoviliza sobre la superficie de un biosensor RPS. Al inyectar la muestra en las cubetas de lectura del espectrómetro RPS, forma un complejo con la proteína A inmovilizada, lo que da como resultado un incremento de masa en la superficie del chip sensor y, por lo tanto, una respuesta más alta (ya que 1 UR se define como 1 pg/mm2). Después, el chip sensor se regenera disolviendo el complejo muestra-proteína A. Las respuestas obtenidas se evalúan a continuación para la señal alta en unidades de respuesta (UR) y para el comportamiento de disociación.

Se acoplaron aproximadamente 3.500 unidades de respuesta (UR) de proteína A (20 pg/ml) en un chip CM5 (GE Healthcare) a pH 4,0 usando un kit de acoplamiento de amina de GE Healthcare.

La muestra y el tampón del sistema fueron HBS-P+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, surfactante P20 al 0,005 %, filtrado estéril, pH 7,4). La temperatura de la cubeta de lectura se ajustó a 25 °C y la temperatura del compartimento de la muestra a 12 °C. El sistema se purgó con el tampón de migración. A continuación, se inyectaron soluciones 5 nM de las construcciones de muestra durante 120 segundos con un caudal de 30 pl/min, seguido de una fase de disociación de 300 segundos. A continuación, la superficie del chip sensor se regeneró mediante dos inyecciones de 30 segundos de duración de glicina-HCl pH 1,5 a un caudal de 30 pl/min. Cada muestra se midió por triplicado.

Anticuerpos biespecíficos y sus respectivas secuencias

El término "con (la) mutación IHH-AAA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) y H435A (His435Ala) en una región de cadena pesada constante de subclase IgG1 o IgG4 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); el término "con (la) mutación HHY-AAA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) e Y436A (Tyr436Ala) en una región de cadena pesada constante de subclase IgG1 o IgG4 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); el término "con (la) mutación P329G LALA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) y P329G (Pro329Gly) en una región de cadena pesada constante de la subclase IgG1 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y el término "con (la) mutación SPLE" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones S228P (Ser228Pro) y L235E (Leu235Glu) en una región de la cadena pesada constante de subclase IgG4 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

General

La información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana se proporciona en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los residuos aminoacídicos de las cadenas de anticuerpos se numeran y referencian de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis génica

Los segmentos genéticos deseados se ordenaron de acuerdo con las especificaciones dadas en Geneart (Regensburg, Alemania).

Determinación de las secuencias de ADN

Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación bicatenaria realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o SequiServe GmbH (Vaterstetten, Alemania).

Análisis de secuencias de ADN y proteínas y gestión de datos de secuencias

Se usaron el paquete de software de GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), versión 10.2 y el paquete Plasmid NT1 Advance, versión 8.0 de Infomax para la creación, mapeo, análisis, anotación e ilustración de secuencias. Plásmidos de expresión

Para la expresión de los anticuerpos descritos se usaron plásmidos para la expresión transitoria (por ejemplo, en células HEK293-F) basada en una organización de ADNc con o sin un promotor CMV-Intron A o en una organización genómica con un promotor CMV.

La unidad de transcripción del gen de anticuerpo se compuso de los siguientes elementos:

-sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 5',

-el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano,

-en el caso de la organización del ADNc, la secuencia Intron A,

-una región 5' no traducida de un gen de inmunoglobulina humana,

-un ácido nucleico que codifica una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina,

-un ácido nucleico que codifica la cadena de anticuerpo humano (natural o con intercambio de dominio) como ADNc o en organización genómica con la organización exón-intrón de inmunoglobulina,

-una región 3' no traducida con una secuencia de señal de poliadenilación, y

-sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 3'.

Además del casete de expresión de anticuerpos, los plásmidos contenían:

-un origen de replicación que permite la replicación del plásmido en E. coli,

-un gen de p-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli, y

-el gen de la dihidrofolato reductasa de Mus musculus como un marcador seleccionable en células eucariotas.

Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de anticuerpos se generaron por PCR y/o síntesis génica y se ensamblaron mediante procedimientos y técnicas recombinantes conocidos mediante la conexión de los segmentos de ácido nucleico correspondientes, por ejemplo, usando sitios de restricción únicos en los plásmidos respectivos. Las secuencias de ácidos nucleicos subclonadas se verificaron mediante secuenciación de ADN. Para las transfecciones transitorias se prepararon mayores cantidades de plásmidos mediante la preparación del plásmido a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de cultivo celular

Las técnicas estándar de cultivo celular se usaron como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. Los anticuerpos biespecíficos se expresaron mediante cotransfección transitoria de los plásmidos de expresión respectivos en células HEK293-F que crecían en suspensión como se describe a continuación.

Ejemplo 1

Expresión y purificación

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F

Los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos se generaron mediante transfección transitoria con los plásmidos respectivos (por ejemplo, codificando la cadena pesada y la cadena pesada modificada, así como la cadena ligera y la cadena ligera modificada correspondientes) usando el sistema HEK293-F (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se transfectaron células HEK293-F (Invitrogen) que crecían en suspensión en un matraz de agitación o en un fermentador agitado en un medio de expresión FreeStyle™ 293 sin suero (Invitrogen) con una mezcla de los plásmidos de expresión respectivos y 293fectin™ o fectina (invitrogen). Para un matraz de agitación de 2 l (Corning) se sembraron células HEK293-F a una densidad de 1*106 células/ml en 600 ml y se incubaron a 120 rpm, 8 % de CO². El día siguiente, las células se transfectaron a una densidad celular de aprox.

1,5*106 células/ml con aprox. 42 ml de una mezcla de A) 20 ml de Opti-MEM (Invitrogen) con 600 pg de ADN plasmídico total (1 pg/ml) que codifica la cadena pesada o la cadena pesada modificada, respectivamente, y la cadena ligera correspondiente en una proporción equimolar y B) 20 ml de Opti-MEM con 1,2 ml de fectina 293 o fectina (2 pl/ml). De acuerdo con el consumo de glucosa, se añadió solución de glucosa durante el curso de la fermentación. El sobrenadante que contenía el anticuerpo secretado se recogió después de 5-10 días y los anticuerpos se purificaron directamente del sobrenadante o el sobrenadante se congeló y se almacenó.

Purificación

Los anticuerpos biespecíficos se purificaron de los sobrenadantes de cultivos celulares mediante cromatografía de afinidad usando MabSelectSure-Sepharose™ (para anticuerpos sin mutaciones IHH-AAA) (GE Healthcare, Suecia) o KappaSelect-Agarose (para anticuerpos con mutaciones IHH-AAA) (GE Healthcare, Suecia), cromatografía de interacción hidrófoba usando cromatografía de exclusión por tamaño con butil-sefarosa (GE Healthcare, Suecia) y Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia).

En resumen, los sobrenadantes de cultivos celulares filtrados estériles se capturaron en una resina MabSelectSuRe equilibrada (anticuerpos sin mutaciones IHH-AAA y anticuerpos naturales) con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH²PO⁴1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4), se lavaron con tampón de equilibrado y se eluyeron con citrato sódico 25 mM a pH 3,0. Los anticuerpos con mutaciones IHH-AAA se capturaron en una resina KappaSelect equilibrada con Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, se lavaron con tampón de equilibrado y se eluyeron con citrato sódico 25 mM a pH 2,9. Las fracciones de anticuerpo eluidas se agruparon y neutralizaron con Tris 2 M, pH 9,0. Los agrupamientos de anticuerpos se prepararon para someterse a cromatografía de interacción hidrófoba añadiendo una solución de sulfato de amonio 1,6 M a una concentración final de sulfato de amonio 0,8 M y el pH se ajustó a pH 5,0 usando ácido acético. Después de equilibrar la resina de butil-sefarosa con acetato de sodio 35 mM, sulfato de amonio 0,8 M, pH 5,0, los anticuerpos se aplicaron a la resina, se lavaron con tampón de equilibrado y se eluyeron con un gradiente lineal a acetato de sodio 35 mM, pH 5,0. Las fracciones que contenían anticuerpos (monoespecíficos o biespecíficos) se agruparon y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna Superdex 20026/60 GL (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. Las fracciones que contenían anticuerpos (monoespecíficos o biespecíficos) se agruparon, se concentraron a la concentración requerida usando dispositivos de ultrafiltración Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., Francia) y se almacenaron a -80 °C.

Tabla: Rendimientos de anticuerpos <VEGF-ANG-2> biespecíficos

La pureza y la integridad de los anticuerpos se analizaron después de cada etapa de purificación mediante CE-SDS usando la tecnología de Labchip microfluídica (Caliper Life Science, EE. UU.). Se prepararon 5 pl de solución de proteína para el análisis por CE-SDS usando el kit de reactivo HT Protein Express de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizó en un sistema LabChip GXII usando un chip HT Protein Express. Los datos se analizaron usando el programa informático LabChip GX.

Tabla: Eliminación de productos secundarios típicos mediante diferentes etapas de purificación secuencial determinada por CE-SDs

El contenido agregado de muestras de anticuerpos se analizó mediante SEC de alto rendimiento utilizando una columna analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en tampón de migración 2xPBS (Na2HPÜ420 mM, KH²PO⁴2 mM, NaCl 274 mM y KCl 5,4 mM, pH 7,4) a 25 °C. Se inyectaron 25 pg de proteína en la columna a un caudal de 0,75 ml/min y se eluyó isocráticamente durante 50 minutos.

Análogamente, los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0012 y VEGFang2-0201 se prepararon y purificaron con los siguientes rendimientos:

También se pueden preparar y purificar de manera análoga los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG4 con mutación IHH-AAA y mutación SPLE (SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 con mutación IHH-AAA (SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 con mutación IHH-AAA y mutación SPLE (SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51), <VEGF-ANG-2> CrossMab IgG1 con mutación HHY-AAA y mutación P329G LALA (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41), <VEGF-ANG-2> CrossMab IgG4 con mutación HHY-AAA y mutación SPLE (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 con mutación HHY-AAA (SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 48), y <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 con mutación HHY-AAA y mutación SPLE (SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 51) y también los anticuerpos monoespecíficos <IGF-1R> <IGF-1R> natural (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89), <IGF-1R> IgG1 con mutaciones IHH-AAA (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90), <IGF-1R> IgG1 con mutaciones YTE (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 91), <IGF-1R> IgG1 natural con mutaciones KiH (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93), <IGF-1R> IgG1 con mutaciones KiH y la mutación IHH-AAA en la cadena "ojal" (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95), <IGF-1 R> IgG1 con mutaciones KiH y las mutaciones HHY-AAA en la cadena "ojal" (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99), <IGF-1R> IgG1 con mutación KiH y la mutación YTE (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99), <IGF-1R> IgG1 con mutación KiH y la mutación DDD (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101), e <IGF-1R> IgG1 con mutaciones HHY-AAA (SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 112).

Ejemplo 2

Analítica y desarrollabilidad

Medición de viscosidad basada en DLS a pequeña escala

La medición de la viscosidad se realizó esencialmente como se describe en He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-143. En resumen, las muestras se concentraron a diversas concentraciones de proteína en succinato de arginina 200 mM, pH 5,5, antes de que se añadieran microesferas de látex de poliestireno (diámetro de 300 nm) y Polisorbato 20 (0,02 % v/v). Las muestras se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con aceite de parafina. El diámetro aparente de las microesferas de látex se determinó mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) a 25 °C. La viscosidad de la solución se puede calcular como n = n⁰(rh/rh,⁰) ( |: viscosidad; r|0: viscosidad del agua; rh: radio hidrodinámico aparente de las microesferas de látex; rh,0: radio hidrodinámico de las microesferas de látex en agua).

Para permitir la comparación de diversas muestras a la misma concentración, los datos de viscosidad-concentración se ajustaron con la ecuación de Mooney (Ecuación 1) (Mooney, M., Colloid. Sci., 6 (1951) 162-170; Monkos, K., Biochem. Biophys. Acta 304 (1997) 1339) y los datos se interpolaron en consecuencia.

Ecuación 1

(S: parámetro de interacción hidrodinámica de la proteína; K: factor de apiñamiento; O: fracción de volumen de la proteína disuelta)

Los resultados se muestran en la Figura 2: VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA en la región Fc muestra una viscosidad más baja a todas las temperaturas medidas en comparación con VEGFang2-0015 sin la mutación IHH-AAA en la región Fc.

Temperatura de comienzo de la agregación por DLS

Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en histidina/clorhidrato de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con aceite de parafina. El radio hidrodinámico se midió repetidamente mediante dispersión dinámica de la luz (DLS), mientras que las muestras se calentaron a una velocidad de 0,05 °C/min de 25 °C a 80 °C. La temperatura de comienzo de la agregación se define como la temperatura a la que el radio hidrodinámico se empieza a incrementar. Los resultados se muestran en la Figura 3. En la Figura 3 se muestra la agregación de VEGFang2-0015 sin la mutación IHH-AAA frente a VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA en la región Fc. VEGFang2-0016 mostró una temperatura de comienzo de la agregación de 61 °C, mientras que VEGFang2-0015 sin la mutación IHH-AAA mostró una temperatura de comienzo de 60 °C.

Evolución temporal por DLS

Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en histidina/clorhidrato de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con aceite de parafina. El radio hidrodinámico se midió repetidamente mediante dispersión dinámica de la luz (DLS), mientras las muestras se mantuvieron a una temperatura constante de 50 °C durante hasta 145 horas. En este experimento, las tendencias de agregación de la proteína natural, desplegada a temperatura elevada darían lugar a un incremento del diámetro de partícula promedio con el tiempo. Este procedimiento basado en DLS es muy sensible para los agregados, ya que estos contribuyen de manera sobreproporcionada a la intensidad de luz dispersada. Incluso después de 145 horas a 50 °C (una temperatura cercana a la temperatura de comienzo de la agregación, véase arriba), se descubrió un incremento del diámetro de partícula promedio de solo menos de 0,5 nm para VEGFang2-0015 y para VEGFang2-0016.

Siete días de almacenamiento a 40 °C a 100 mg/ml

Las muestras se concentraron a una concentración final de 100 mg/ml en succinato de arginina 200 mM, pH 5,5, se filtraron de forma estéril y se almacenaron de forma estable a 40 °C durante siete días. Antes y después del almacenamiento, el contenido de especies de alto y bajo peso molecular (PMA y PMB, respectivamente) se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La diferencia en el contenido de PMA y PMB entre la muestra almacenada y una muestra medida inmediatamente después de la preparación se informa como "incremento de PMA" y "incremento de PMB", respectivamente. Los resultados se muestran en la siguiente tabla y en la Figura 4, que muestran que VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) muestra una mayor reducción del pico principal y un mayor incremento de PMA en comparación con VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA). Sorprendentemente, VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) mostró una menor tendencia a la agregación en comparación con VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA).

Tabla: Delta de picos principal, PMA y PMB después de siete días a 40 °C

El análisis funcional de los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> se evaluó mediante resonancia de plasmón de superficie (RPS) utilizando un instrumento BIAcore® T100 o T200 (GE Healthcare) a 25 °C. El sistema BIAcore® está bien establecido para el estudio de las interacciones moleculares. La tecnología RPS se basa en la medición del índice de refracción cerca de la superficie de un chip biosensor recubierto de oro. Los cambios en el índice de refracción indican cambios de masa en la superficie provocados por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en solución. La masa se incrementa si las moléculas se unen a ligandos inmovilizados en la superficie, y viceversa, la masa disminuye en caso de disociación del analito del ligando inmovilizado (reflejando la disociación del complejo). La RPS permite una monitorización continua en tiempo real de uniones ligando/analito y, por tanto, la determinación de la constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (kd) y la constante de equilibrio (KD).

Ejemplo 3

Unión a VEGF, ANG-2, FcgammaR y FcRn

Afinidad cinética de las ¡soformas de VEGF, incluyendo la evaluación de la reactividad cruzada entre especies

Aproximadamente 12.000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 pg/ml de anti-F(Ab)'²humano caprino; código de pedido: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) se acoplaron a un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20™ al 0,05 %), pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra se fijó a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. El anticuerpo biespecífico se capturó inyectando una solución 50 nM durante 30 segundos a un caudal de 5 pl/min. Se midió la asociación mediante inyección de hVEGF121 humano recombinante, mVEGF120 de ratón o rVEGF164 de rata a diversas concentraciones en solución durante 300 segundos a un caudal de 30 pl/min, partiendo de 300 nM en diluciones 1:3. Se monitorizó la fase de disociación durante hasta 1200 segundos y se desencadenó cambiando de la solución de muestra al tampón de migración. La superficie se regeneró en 60 segundos lavando con solución de glicina pH 2,1 a un caudal de 30 pl/min. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida de una superficie de anti-F(Ab')²humano caprino. También se restaron las inyecciones del blanco (= doble referencia). Para el cálculo de K^daparente y otros parámetros cinéticos se usó el modelo 1:1 de Langmuir. Los resultados se muestran a continuación.

Afinidad en solución de ANG-2, incluyendo la evaluación de la reactividad cruzada entre especies

La afinidad en solución mide la afinidad de una interacción al determinar la concentración de compañeros de interacción libre en una mezcla en equilibrio. El ensayo de afinidad en solución implica la mezcla de un anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2>, mantenido a una concentración constante, con un ligando (= ANG-2) a concentraciones variables. Las unidades de resonancia máximas posibles (por ejemplo, 17.000 unidades de resonancia (UR)) de un anticuerpo se inmovilizaron en la superficie del chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. El tampón de muestra y el tampón del sistema fueron HBS-P a pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. Para generar una curva de calibración se inyectaron concentraciones crecientes de ANG-2 en una cubeta de lectura BIAcore que contenía el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> inmovilizado. La cantidad de ANG-2 unida se determinó como unidades de resonancia (UR) y se representó frente a la concentración. Soluciones de cada ligando (11 concentraciones de 0 a 200 nM para el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2>) se incubaron con ANG-2 10 nM y se dejó que alcanzaran el equilibrio a temperatura ambiente. Las concentraciones de ANG-2 libre se determinaron a partir de la curva de calibración generada antes y después de medir la respuesta de las soluciones con cantidades conocidas de ANG-2. Se estableció un ajuste de 4 parámetros con XLfit4 (IDBS Software) usando el Modelo 201 usando la concentración de ANG-2 libre como eje y la concentración de anticuerpo usada para la inhibición como eje x. La afinidad se calculó determinando el punto de inflexión de esta curva. La superficie se regeneró mediante un lavado de 30 segundos con una solución de H³PO⁴al 0,85 % a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie acoplada al blanco. Los resultados se muestran a continuación.

Afinidad por FcRn de estado estable

Para la medición de FcRn se usó una afinidad de estado estable para comparar los anticuerpos biespecíficos entre sí. El FcRn humano se diluyó en un tampón de acoplamiento (acetato de Na 10 pg/ml, pH 5,0) y se inmovilizó en un chip C1 (GE Healthcare BR-1005-35) mediante un procedimiento de inmovilización dirigida utilizando un asistente BIAcore hasta una respuesta final de 200 UR. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20™ al 0,05 %), pH 6,0. Para evaluar diferentes concentraciones de IgG para cada anticuerpo se preparó una concentración de 62,5 nM, 125 nM, 250 nM y 500 nM. El caudal se estableció en 30 pl/min y las diferentes muestras se inyectaron consecutivamente sobre la superficie del chip, eligiendo el tiempo de asociación de 180 segundos. La superficie se regeneró inyectando PBS-T pH 8 durante 60 segundos a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie de blanco. También se restaron las inyecciones de tampón (= doble referencia). Para el cálculo de la afinidad de estado estable se utilizó el procedimiento del programa informático BIA-Evaluation. En resumen, los valores de UR se representaron frente a las concentraciones analizadas, proporcionando una curva dosis-respuesta. En base a un ajuste de 2 parámetros, se calculó la asíntota superior, permitiendo la determinación del valor de UR medio-máximo y, por tanto, de la afinidad. Los resultados se muestran en la Figura 5 y la tabla a continuación. De manera análoga, se puede determinar la afinidad por FcRn de macaco cangrejero, ratón y conejo.

Medición de FcgammaRIIIa

Para la medición de FcgammaRIIIa se utilizó un ensayo de unión directa. Se acoplaron aproximadamente 3000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (1 pg/ml de Penta-His, Qiagen) en un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. El tampón de muestra y el tampón del sistema fueron HBS-P+ a pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra se fijó a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. El receptor FcgammaRIIIa-His se capturó inyectando una solución 100 nM durante 60 segundos a un caudal de 5 pl/min. La unión se midió mediante la inyección de 100 nM de anticuerpo biespecífico o anticuerpos de control monoespecíficos (anticuerpo anti-digoxigenina (anti-Dig) para un anticuerpo de subclase IgG1 y de subclase IgG4) durante 180 segundos a un caudal de 30 pl/min. La superficie se regeneró en 120 segundos lavando con solución de glicina pH 2,5 a un caudal de 30 pl/min. Debido a que la unión a FcgammaRIIIa difiere del modelo 1:1 de Langmuir, con este ensayo solo se determinó la unión/no unión. De forma similar, se puede determinar la unión a FcgammaRIa y FcgammaRIIa. Los resultados se muestran en la Figura 6, donde se deduce que la introducción de las mutaciones P329G LALA provocó que ya no se pudiera detectar la unión a FcgammaRIIIa.

Evaluación de la unión independiente de VEGF y ANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Se acoplaron aproximadamente 3500 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 pg/ml de anti-IgG humana caprino; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) en un chip CM4 (GE Healthcare, BR-1005-34) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20™ al 0,05 %), pH 7,4. La temperatura de la cubeta de lectura se fijó a 25 °C y la del bloque de muestra a 12 °C. Antes de la captura, se purgó dos veces la cubeta de lectura con tampón de migración.

El anticuerpo biespecífico se capturó inyectando una solución 10 nM durante 60 segundos a un caudal de 5 pl/min. La unión independiente de cada ligando al anticuerpo biespecífico se analizó determinando la capacidad de unión activa para cada ligando, añadido secuencial o simultáneamente (caudal de 30 pl/min):

1. Inyección de VEGF humano a una concentración de 200 nM durante 180 segundos (identifica la unión única del antígeno).

2. Inyección de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos (identifica la unión única del antígeno).

3. Inyección de VEGF humano a una concentración de 200 nM durante 180 segundos, seguida de una inyección adicional de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos (identifica la unión de ANG-2 en presencia de VEGF).

4. Inyección de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos, seguida de una inyección adicional de VEGF humano a una concentración de 200 nM (identifica la unión de VEGF en presencia de ANG-2).

5. Coinyección de VEGF humano a una concentración de 200 nM y de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos (identifica la unión de VEGF y de ANG-2 al mismo tiempo).

La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 segundos con una solución 3 M de MgCb a un caudal de 30 pl/min. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida de una superficie de anti-IgG humana caprino.

El anticuerpo biespecífico se puede unir a ambos antígenos independientemente de forma mutua si la señal final resultante de los enfoques 3, 4 y 5 iguala o es similar a la suma de las señales finales individuales de los enfoques 1 y 2. Los resultados se muestran en la tabla a continuación, donde se demostró que ambos anticuerpos VEGFang2-0016, VEGFang2-0012 se pueden unir mutuamente de forma independiente a VEGF y ANG-2.

Evaluación de la unión simultánea de VEGF y ANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

En primer lugar, se acoplaron aproximadamente 1600 unidades de resonancia (UR) de VEGF (20 pg/ml) en un chip CM4 (GE Healthcare b R-1005-34) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20™ al 0,05 %), pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. En segundo lugar, se inyectó una solución 50 nM del anticuerpo biespecífico durante 180 segundos a un caudal de 30 pl/min. En tercer lugar, se inyectó hANG-2 durante 180 segundos a un caudal de 30 pl/min. La respuesta de unión de hANG-2 depende de la cantidad del anticuerpo biespecífico unido a VEGF y muestra la unión simultánea. La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 segundos con una solución de H³PO⁴al 0,85 % a un caudal de 30 pl/min. La unión simultánea se muestra mediante una señal de unión específica adicional de hANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> unidos previamente a VEGF. Para ambos anticuerpos biespecíficos VEGFang2-00l5 y vEGFang2-0016, se pudo detectar la unión simultánea de VEGF y ANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> (datos no mostrados).

Tabla: Resultados: Afinidades cinéticas a las isoformas de VEGF de diferentes especies

Tabla: Resultados: Afinidades en solución por ANG-2

Tabla: Resultados: Afinidad por FcRn de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Tabla: Resultados de la unión a FcgammaRI - IlIa

Tabla: Resultados: Unión independiente de VEGF y ANG-2 a anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Ejemplo 4

Espectrometría de masas

Esta sección describe la caracterización de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> con énfasis en el correcto ensamblaje. Las estructuras primarias esperadas se confirmaron mediante ionización por electropulverización/espectrometría de masas (ESI-EM) de los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> desglucosiladas e intactas o digeridos con IdeS (enzima degradadora de IgG de S. pyogenes). La digestión con IdeS se realizó con 100 |jg de anticuerpo purificado incubado con 2 pg de proteasa IdeS (Fabricator) en 100 mmol/l de NaH2PO4/Na2HPÜ4, pH 7,1 a 37 °C durante 5 h. Posteriormente, los anticuerpos se desglucosilaron con N-glucosidasa F, neuraminidasa y O-glucosidasa (Roche) en 100 mmol/l de NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,1 a 37 °C durante hasta 16 horas a una concentración de proteína de 1 mg/ml y posteriormente se desalificaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa total se determinó por medio de ESI-EM en un sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).

Las masas obtenidas para las moléculas desglucosiladas y digeridas con IdeS (Tabla a continuación) o desglucosiladas intactas (Tabla a continuación) corresponden a las masas previstas deducidas de las secuencias de aminoácidos para los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> que consisten en dos cadenas ligeras diferentes LCang^-2y LCLucentis, y dos cadenas pesadas diferentes HCang^-2y HCLucentis.

Tabla: Masas de los anticuerpos biespecíficos desglucosilados y digeridos con IdeS <VEGF/ANG2> VEGFang2-0201 (sin mutación iHh -AAA) y VEGFang2-0012 (con mutación IHH-AAA)

Tabla: Masas de los anticuerpos <VEGF/ANG2> desglucosilados VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA)

Ejemplo 5

Cromatografía de FcRn

Acoplamiento a estreptavidina sefarosa

Se añadió un gramo de estreptavidina sefarosa (GE Healthcare) al receptor biotinilado y dializado y se incubó durante dos horas con agitación. Se cargó la sefarosa derivatizada con el receptor en una columna XK de 1 ml (GE Healthcare). Cromatografía usando la columna de afinidad por FcRn:

Condiciones:

dimensiones de la columna: 50 mm x 5 mm

altura de lecho: 5 cm

carga: 50 jg de muestra

tampón de equilibrado: MES 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 5,5

tampón de elución: Tris/HCl 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 8,8

elución: 7,5 VC de tampón de equilibrado, en 30 VC hasta 100 % de tampón de elución, 10 VC de tampón de elución

Cromatografía en columna de afinidad por FcRn humano

En la siguiente tabla se proporcionan los tiempos de retención de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> en columnas de afinidad que comprenden FcRn humano. Se obtuvieron los datos usando las condiciones anteriores.

Tabla: Resultados: tiempos de retención de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Ejemplo 6

Propiedades farmacocinéticas (FC) de los anticuerpos con mutación IHH-AAA

Datos FC con ratones FcRn transgénicos para FcRn humano

Fase in vivo:

El estudio incluyó ratones C57BL/6J hembra (fondo), que eran ratones deficientes en FcRn pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano (huFcRn, línea 276 -/tg).

Parte 1:

A todos los ratones se les inyectaron una vez por vía intravítrea en el ojo derecho 2 pl/animal de la solución apropiada (es decir, 21 pg compuesto/animal (VEGFAng2-0015 (sin mutación IHH-AAA)) o 23,6 pg de compuesto/animal (VEGFAng2-0016 (con mutación IHH-AAA)).

Los ratones se asignaron a 2 grupos con 6 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 2, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación.

La inyección en el vitreo del ojo derecho del ratón se realizó usando el sistema de microjeringa NanoFil para inyección de nanolitros de World Precision Instruments, Inc., Berlín, Alemania. Se anestesiaron los ratones con isoflurano al 2,5 % y para la visualización del ojo del ratón se usó un microscopio Leica MZFL 3 con un aumento de 40 veces y un anillo de luz con una iluminación Leica KL 2500 LCD. Posteriormente, se inyectaron 2 pl del compuesto usando una aguja de calibre 35.

Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular del ojo contralateral de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Se obtuvieron muestras de suero de al menos 50 pl de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Las muestras de suero se congelaron directamente después de la centrifugación y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis. Los ojos tratados de los animales del grupo 1 se aislaron 96 horas después del tratamiento y los de los animales del grupo 2 se aislaron 168 horas después del tratamiento. Las muestras se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Parte 2:

A todos los ratones se les inyectaron una vez por vía intravenosa en la vena de la cola 200 pl/animal de la solución apropiada (es decir, 21 pg compuesto/animal (VEGFAng2-0015 (sin mutación IHH-AAA)) o 23,6 pg de compuesto/animal (VEGFAng2-0016 (con mutación IHH-AAA)).

Los ratones se asignaron a 2 grupos con 5 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 1, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación. Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Se obtuvieron muestras de suero de al menos 50 pl de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Las muestras de suero se congelaron directamente después de la centrifugación y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Preparación de lisados oculares completos (ratones)

Los lisados oculares se obtuvieron por desintegración fisicoquímica de todo el ojo de animales de laboratorio. Para la disgregación mecánica, se transfirió cada ojo a un microvial de 1,5 ml con fondo cónico. Después de la congelación y la descongelación, los ojos se lavaron una vez con 1 ml de tampón de lavado celular (Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Ref. 171-304011). En la siguiente etapa, se añadieron 500 pl de tampón de lisis celular recién preparado y se molieron los ojos usando una mano de mortero de molienda de tejido de 1,5 ml (Kimble Chase, mano de mortero de 1,5 ml, art. n.° 749521-1500). A continuación, la mezcla se congeló y descongeló cinco veces y se volvió a moler. Para separar el lisado del tejido restante, se centrifugaron las muestras durante 4 min a 4500 x g. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -20 °C hasta su análisis posterior en el ELISA de cuantificación.

Análisis

Las concentraciones de los anticuerpos <VEGF-ANG-2> en el suero y los lisados oculares de los ratones se determinaron con un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

Para la cuantificación de los anticuerpos <VEGF-ANG-2> en muestras de suero y lisados oculares de ratón, se realizó un inmunoensayo sándwich en serie de fase sólida estándar con anticuerpos monoclonales biotinilados y digoxigenilados usados como anticuerpos de captura y detección. Para verificar la integridad de la biespecificidad del analito, el anticuerpo de captura biotinilado reconoce el sitio de unión a VEGF, mientras que el anticuerpo de detección digoxigenilado se unirá al sitio de unión a ANG-2 del analito. A continuación, se detectó el complejo inmunitario unido del anticuerpo de captura, analito y anticuerpo de detección en la fase sólida de la placa de microtitulación recubierta con estreptavidina (SA-MTP) con una peroxidasa de rábano picante acoplada a un anticuerpo anti-digoxigenina. Después de lavar el material no unido de la SA-MTP y de la adición de sustrato ABTS, la señal conseguida fue proporcional a la cantidad de analito unido en la fase sólida de la SA-MTP. A continuación, se realizó la cuantificación convirtiendo las señales medidas de las muestras en concentraciones referenciadas a los calibradores analizados en paralelo.

En una primera etapa, se recubrió la SA-MTP con 100 pl/pocillo de la solución de anticuerpo de captura biotinilado (anticuerpo anti-idiotípico mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS)) con una concentración de 1 pg/ml durante una hora a 500 rpm en un agitador de MTP. Mientras tanto, se prepararon los calibradores, las muestras de control de calidad (CC) y las muestras. Los calibradores y las muestras de CC se diluyeron al 2 % en una matriz de suero; las muestras se diluyeron hasta que las señales estuvieron dentro del intervalo lineal de los calibradores.

Después de recubrir la SA-MTP con el anticuerpo de captura, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado y 300 pl/pocillo. Posteriormente, se pipetearon 100 pl/pocillo de los calibradores, muestras de CC y muestras en la SA-MTP y se incubaron de nuevo durante una hora a 500 rpm. El analito se unió ahora con su sitio de unión anti-VEGF por medio del anticuerpo de captura a la fase sólida de la SA-MTP. Después de la incubación y eliminación del analito no unido mediante lavado de la placa, se añadieron 100 pl/pocillo del primer anticuerpo de detección (anticuerpo anti-idiotípico mAb<Id-<ANG-2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu)) con una concentración de 250 ng/ml a la sA-MTP. De nuevo, se incubó la placa durante una hora a 500 rpm en un agitador. Después del lavado, se añadieron 100 pl/pocillo del segundo anticuerpo de detección ((pAb<Digoxigenina>S-Fab-POD (poli)) a una concentración de 50 mU/ml a los pocillos de la SA-MTP y se incubó nuevamente la placa durante una hora a 500 rpm. Después de una etapa de lavado final para eliminar el exceso del anticuerpo de detección, se añadieron 100 pl/pocillo de sustrato (ABTS). El conjugado anticuerpo-enzima cataliza la reacción de color del sustrato ABTS®. A continuación, se midió la señal mediante un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm ([405/490] nm)).

Evaluación farmacocinética

Se calcularon los parámetros farmacocinéticos mediante análisis no compartimental, usando el programa de evaluación farmacocinética WinNonlin™ (Pharsight), versión 5.2.1.

Resultados:

A) Concentraciones séricas

Los resultados para las concentraciones séricas se muestran en las siguientes tablas y Figuras 7B a 7C.

Tabla: VEGFAng2-0015 (sin mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa

Tabla: VEGFAng2-0016 (con mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa

Tabla: VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea

Tabla: VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravenosa

Resultados:

B) Concentraciones en los lisados oculares de los ojos izquierdo y derecho

Los resultados de las concentraciones en los lisados oculares se muestran en las siguientes tablas y Figuras 7D a 7E.

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravenosa

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravenosa

Resumen de resultados:

Después de la aplicación intravítrea, el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> como se informa en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) muestra concentraciones similares (después de 96 y 168 horas) en los lisados oculares en comparación con el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA).

También después de la aplicación intravítrea, el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> como se informa en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) muestra además un aclaramiento más rápido y una semivida más corta en suero en comparación con el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA).

Ejemplo 7

Ensayo de angiogénesis en microbolsillo corneal de ratones

Para someter a prueba el efecto anti-angiogénico del anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> con los respectivos VH y VL de unión a VEGF de SEQ ID NO: 20 y 21 y los VH y VL de unión a ANG-2 de SEQ ID NO: 28 y 29 en la angiogénesis inducida por VEGF in vivo, se realizó un ensayo de angiogénesis en microbolsillo corneal de ratón. En este ensayo se implantó un disco de Nylaflo empapado de VEGF en un bolsillo de la córnea avascular a una distancia fija de los vasos del limbo. Los vasos crecen inmediatamente en la córnea hacia el gradiente de VEGF en desarrollo. Se adquirieron ratones Balb/c hembra de 8 a 10 semanas de edad de Charles River, Sulzfeld, Alemania. El protocolo se modificó de acuerdo con el procedimiento descrito por Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550. En resumen, se prepararon microbolsillos con un ancho de aproximadamente 500 pm bajo un microscopio a aproximadamente 1 mm desde el limbo hasta la parte superior de la córnea usando un bisturí quirúrgico y unas pinzas afiladas en el ratón anestesiado. Se implantó el disco (Nylaflo®, Pall Corporation, Michigan) con un diámetro de 0,6 mm y se alisó la superficie del área de implantación. Los discos se incubaron en el factor de crecimiento correspondiente o en un vehículo durante al menos 30 min. Después de 3, 5 y 7 días (o de forma alternativa solo después de 3, 5 o 7 días) se fotografiaron los ojos y se midió la respuesta vascular. El ensayo se cuantificó calculando el porcentaje del área de nuevos vasos por área total de la córnea.

Los discos se cargaron con 300 ng de VEGF o con PBS como control y se implantaron durante 7 días. El crecimiento de los vasos desde el limbo hasta el disco se monitorizó a lo largo del tiempo los días 3, 5 y/o 7. Un día antes de la implantación del disco, los anticuerpos se administraron por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg (debido a la aplicación intravenosa, se utilizó como sustituto el VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) estable en suero que solo difiere del VEGFang2-0016 por la mutación IHH-AAA y tiene los mismos VH y VL anti-VEGF y anti-ANG-2 para mediar en la eficacia) para someter a prueba el efecto anti-angiogénico en la angiogénesis inducida por VEGF in vivo. Los animales del grupo de control recibieron el vehículo. El volumen de aplicación fue de 10 ml/kg.

Ejemplo 8

Propiedades farmacocinéticas (FC) de los anticuerpos con mutación HHY-AAA

Datos FC con ratones FcRn transgénicos para FcRn humano

Fase in vivo:

Parte 1:

A todos los ratones se les inyectaron una vez por vía intravítrea en el ojo derecho la solución adecuada de IGF-1R 0033, IGF-1R 0035, IGF-1R 0045 (es decir, 22,2 pg de compuesto/animal de IGF-1R 0033, 24,4 pg de compuesto/animal de IGF-1R 0035, 32,0 pg de compuesto/animal de IGF-1R y 32,0 pg de compuesto/animal de IGF-1R 0045).

Se asignaron trece ratones a 2 grupos con 6 y 7 animales cada uno, respectivamente. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 2, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación.

La inyección en el vítreo del ojo derecho del ratón se realizó usando el sistema de microjeringa NanoFil para inyección de nanolitros de World Precision Instruments, Inc., Berlín, Alemania. Se anestesiaron los ratones con isoflurano al 2,5 % y para la visualización del ojo del ratón se usó un microscopio Leica MZFL 3 con un aumento de 40 veces y un anillo de luz con una iluminación Leica KL 2500 LCD. Posteriormente, se inyectaron 2 pl del compuesto usando una aguja de calibre 35.

Parte 2:

A todos los ratones se les inyectaron una vez por vía intravenosa en la vena de la cola la solución adecuada de IGF-1R 0033, IGF-1R 0035, IGF-1R 0045 (es decir, 22,2 pg de compuesto/animal de IGF-1R 0033, 24,4 pg de compuesto/animal de IGF-1R 0035, 32,0 pg de compuesto/animal de IGF-1R y 32,0 pg de compuesto/animal de IGF-1R 0045).

Doce ratones se asignaron a 2 grupos con 6 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 1, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación. Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Preparación de tampón de lisis celular

Mezclar con cuidado 100 pl de factor 1, 50 pl de factor 2 y 24,73 ml de tampón de lisis celular (todos de Bio-Rad, kit de lisis celular Bio-Plex, Ref. 171-304011) y añadir 125 pl de solución PMSF (174,4 mg de fenilmetilsulfonilfluoruro diluido en 2,0 ml de DMSO).

Preparación de lisados oculares completos (ratones)

Los lisados oculares se obtuvieron por desintegración fisicoquímica de todo el ojo de animales de laboratorio. Para la disgregación mecánica, se transfirió cada ojo a un microvial de 1,5 ml con fondo cónico. Después de la descongelación, los ojos se lavaron una vez con 1 ml de tampón de lavado celular (Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Ref. 171-304011). En la siguiente etapa, se añadieron 500 pl de tampón de lisis celular recién preparado y se molieron los ojos usando una mano de mortero de molienda de tejido de 1,5 ml (VWR Int., art. n.° 431-0098). A continuación, la mezcla se congeló y descongeló cinco veces y se volvió a moler. Para separar el lisado del tejido restante, se centrifugaron las muestras durante 4 min a 4500 x g. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -20 °C hasta su análisis posterior en el ELISA de cuantificación.

Análisis (suero)

Para la cuantificación de los anticuerpos en muestras de suero de ratón, se realiza un inmunoensayo sándwich en serie de fase sólida estándar con anticuerpos monoclonales biotinilados y digoxigenilados usados como anticuerpos de captura y detección. El suero representa aproximadamente el 50 % del volumen total de la muestra de sangre.

Más detalladamente, las concentraciones de los anticuerpos en muestras de suero de ratón se determinaron mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática específico para IgG (Fab) humano. Las placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-Fab (kappa) humano biotinilado M-1.7.10-IgG como anticuerpo de captura diluido en tampón de ensayo durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Después de lavar tres veces con solución salina tamponada con fosfato-polisorbato 20 (Tween20), se agregaron muestras de suero a diversas diluciones seguido de una segunda incubación durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados repetidos, el anticuerpo unido se detectó por incubación posterior con el anticuerpo monoclonal anti-Fab (CH1) humano M-1.19.31-IgG conjugado con digoxigenina, seguido de un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se usó ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) como sustrato de HRP para formar un producto de reacción coloreado. Se leyó la absorbancia del producto de reacción resultante a 405 nm (ABTS; longitud de onda de referencia: 490 nm).

Se analizaron por duplicado todas las muestras de suero y las muestras de control positivo y negativo y se calibraron frente al estándar del anticuerpo.

Análisis (lisado ocular)

Las concentraciones de los analitos en muestras de lisado ocular de ratón se determinaron usando un procedimiento calificado de inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) basado en la plataforma de instrumento ELECSYS® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) en condiciones sin GLP.

El sobrenadante sin diluir (lisados oculares) se incubó con moléculas de captura y detección durante 9 min a 37 °C. Se usó el anticuerpo monoclonal anti-Fab (kappa) humano biotinilado M-1.7.10-IgG como molécula de captura y un anticuerpo monoclonal anti-Fab(CH1) humano M-1.19.31-IgG marcado con rutenio(II) tris(bispiridilo)32+ para la detección. Se añadieron micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se incubaron durante 9 min adicionales a 37 °C para permitir la unión de complejos inmunitarios preformados debido a las interacciones biotina-estreptavidina. Las micropartículas se capturaron magnéticamente en un electrodo y se generó una señal de quimioluminiscencia utilizando la tripropilamina (TPA) correactante. La señal obtenida se midió con un detector fotomultiplicador.

Tabla: Tabla estándar de IGF-1R 0033

Tabla: Tabla estándar de IGF-1R 0035

Tabla: Tabla estándar de IGF-1R 0045

Resultados:

A) Concentraciones séricas

Los resultados para las concentraciones séricas se muestran en las siguientes tablas y Figura 17.

Tabla: IGF-1R 0033 (sin mutación HHY-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa (n.d. = no determinado)

Tabla: IGF-1R 0035 (con mutación HHY-AAA en un polipéptido de la región Fc): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa

Tabla: IGF-1R 0045 (con mutación HHY-AAA en ambos polipéptidos de la región Fc): Comparación de

concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa (BLQ = por debajo del límite de

cuantificación)

Tabla: Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravenosa de anticuerpos IGF-1R 0033, 0035 y 0045 normalizados a 1 pg de anticuerpo aplicado

Resultados:

B) Concentraciones en los lisados oculares de los ojos izquierdo y derecho

Los resultados de las concentraciones en los lisados oculares se muestran en las siguientes tablas y Figuras 18 a 20.

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0033 (sin mutación HHY-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0033 (con la mutación HHY-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravenosa (BLQ = por debajo del límite de cuantificación)

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0035 (con la mutación HHY-AAA en un polipéptido de la región Fc) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0035 (con la mutación HHY-AAA en un polipéptido de la región Fc) en lisados oculares después de aplicación intravenosa (BLQ = por debajo del límite de cuantificación)

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0045 (con la mutación HHY-AAA en ambos polipéptidos de la región Fc) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0045 (con la mutación HHY-AAA en ambos polipéptidos de la región Fc) en lisados oculares después de aplicación intravenosa (BLQ = por debajo del límite de cuantificación)

Tabla: Concentraciones de IGF-1R 0033, 0035 y 0045 en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho, normalizados a 1 pg de anticuerpo aplicado

Resumen de resultados:

Después de la aplicación intravítrea, los anticuerpos anti-IGF-1R 0035 y 0045 como se informa en el presente documento (con mutación HHY-AAA de un lado o ambos lados) muestran concentraciones similares (después de 96 y 168 horas) en los lisados oculares en comparación con el anticuerpo anti-IGF 1R sin mutación HHY-AAa (IGF-1R 0033).

Además, después de la aplicación intravítrea, los anticuerpos anti-IGF-1 R 0035 y 0045 como se informa en el presente documento (con mutación HHY-AAA de un lado o ambos lados) muestran además una eliminación más rápida y una semivida más corta en el suero en comparación con el anticuerpo anti-IGF-1 R sin mutación HHY-AAA (IGF-1R 0033).

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de comprensión, no se deben interpretar las descripciones y ejemplos como limitantes del alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc, en el que el primer y el segundo polipéptido de la región Fc son ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana y comprenden una de las mutaciones seleccionadas del grupo de I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H435A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones I253A, H310A y h 435a están comprendidas en la región Fc.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

3. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo bivalente.

4. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A,

- polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con la mutación P329G,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E,

- polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con la mutación P329G,

- IgG1 o IgG4 humana con la mutación K392D,

y

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana,

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana,

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A,

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones S354C, T366W

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones Y349C, T366W

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con la mutación P329G,

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G,

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366W,

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366W,

polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E,

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G,

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S354C, T366W

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones Y349C, T366W

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con la mutación P329G,

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, S354C, T366W,

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones P329G, Y349C, T366W,

polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366W, polipéptido de la región Fc de IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366W, IgG1 humana con las mutaciones D399K, D356K y/o E357K, y

- IgG4 humana con las mutaciones D399K, E356K y/o E357K.

5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que

6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que el anticuerpo biespecífico tiene una especificidad de unión que se une específicamente a ANG-2 humana y una especificidad de unión que se une específicamente a VEGF humano.

7. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado por que el anticuerpo comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

8. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por que el anticuerpo comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

9. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado por que comprende a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y

10. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado por que comprende a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y

11. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso como medicamento.

12. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento de una enfermedad vascular ocular.

13. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

15. Uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.