PT1270595E - Anticorpo recombinante de genes e os seus fragmentos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPO RECOMBINANTE DE GENES E OS SEUS FRAGMENTOS

DOMÍNIO TÉCNICO A presente invenção tem por objecto um anticorpo recom-binante e um fragmento desse anticorpo, que reage especifica-mente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular do receptor humano 4 de quimiocina CC (aqui referido a seguir como "CCR4"). Além disso, a presente invenção tem por objecto um anticorpo recombinante, tal como um anticorpo humanizado, um anticorpo humano e similares e um fragmento desse anticorpo que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N° . 17, do domínio extracelular de CCR4, com actividade citotóxica e com actividade de inibição da produção da citocina pelas células Th2 e compreende uma região de determinação especifica de complementaridade (aqui a seguir referida como "RDC"). Além disso, a presente invenção tem por objecto um ADN que codifica o anticorpo mencionado antes. Do mesmo modo, a presente'invenção tem por objecto um vector que compreende o ADN e um transformante transformado com o vector. A presente invenção ainda tem por objecto mais um processo de produção do anticorpo mencionado antes utilizando o transformante e um medicamento, tal como um agente terapêutico, um agente de diagnóstico e similares, para uma doença imunitária mediada por Th2, tal como doenças alérgicas e similares, que compreende a utilização do anticorpo. Além disso, a presente invenção ainda tem por objecto um medicamento, tal como, um agente terapêutico, um agente de diagnóstico e similares, para 1 cancros, tais como, cancros do sangue, por exemplo, leucemia, que incluem a utilização do anticorpo.

TÉCNICA ANTERIOR Há vários factores, tais como, eosinófilos, mastócitos, IgE e similares, que estão relacionados com doenças alérgicas, tais como, asma brônquica. Os eosinófilos infiltrados numa parte inflamatória, libertam uma proteína básica citotóxica, tal como, a PPB (principal proteína básica, MBP na terminologia inglesa) ou similares, por meio da sua desgranulação para assim induzir uma ferida nos tecidos circundantes. Os mastócitos libertam histamina por meio da ligação a um complexo imunitário de antígénio com IgE produzida a partir de células B, para assim induzir uma reacção alérgica imediata. São controlados por moléculas funcionais sob o ponto de vista biológico, tal como citocina, quimiocina e similares, que participam numa transdução de sinal entre células. Os eosinófilos são submetidos a uma indução por diferenciação e a um prolongamento da expectativa de vida por meio de IL-5, sendo ainda induzida a desgranulação. A IgE é produzida a partir de células B activadas por IL-4 e torna-se um complexo imunitário com o antigénio para acelerar a desgranulação dos mastócitos. Verificou-se que IL-4, IL-13 e similares são também produzidas a partir de mastócitos e contribuem para a produção de IgE a partir de células B e a presença de um anel de reforço da alergia, também foi confirmada (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152: 2059 (1995), Immunol, Today, 15: 19 (1994)). Assim, está presente uma rede bastante elaborada de citocina-quimiocina entre as células inflamatórias e que mantém equilíbrios complicados. A citocina e a quimiocina são produzidas por células T auxiliares que expressam CD4 na superfície das células (aqui 2 referido a seguir como "células CD4+Th"). Actualmente verificou-se que a infiltração de células T auxiliares se verifica visivelmente na parte inflamatória das vias aéreas de doentes com asma brônquica, onde um número consideravelmente grande de células T está activado e que o grau de severidade e de hipersensibilidade das vias aéreas na asma estão correlacionados com o número de células T activadas, assim como, as células T activadas estão também aumentadas no sangue periférico (Am. Rev. Respir. Dis., 145: S22 (1992)).

As células T auxiliares classificam-se em células Thl e células Th2 consoante o tipo de citocina a ser produzida por elas (Annu. Rev. Immunol., 7: 145 (1989)). Exemplos de citocinas produzidas por células Th2 incluem IL-4, IL-5, IL-13 e similares.

Verificou-se que um clone de células T especifico do antigénio, isolado de um doente com uma doença atópica, liberta citocina Th2 quando estimulado in vitro (Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 88: 4538 (1991)) e as células Th2 estão presentes no fluido de lavagem broncoalveolar (referido a partir de agora como LBA, BAL na terminologia inglesa) e na mucosa das vias aéreas dos doentes com asma (N. Engl. J. Med., 32.6: 298 (1992), Eur. J. Immunol., 23: 1445 (1993)). IL-4 e IL-5 das citocinas de Th2 estão aumentadas quando a expressão de ARNm em LBA é examinada utilizando um modelo de inflamação alérgica em animais (Clin. Immunol. Immunopathol., 75: 75 (1995)). Também, quando as células Th2 induzidas em ratos são administradas numa veia e na cavidade nasal, induz-se nos pulmões um sintoma inflamatório asmático, especifico do antigénio (J. Exp. Med., 186: 1737 (1997), J. Immunol., 160: 1378 (1998)) e provoca-se eosinofilia (J. Immunol., 161:3128 (1998)). A expressão de IL-5 observa-se na membrana mucosa das vias aéreas de doentes com asma e observam-se 3 lesões em pacientes com dermatite atópica (J. Clin. Invest., 87: 1541 (1991), J. Exp. Med., 173: 775 (1991)) e o nível de expressão de IL-13 na membrana mucosa da rinite alérgica contínua, está bem correlacionado com as quantidades de IgE total no soro e IgE específica do antigénio (Therapeutics, 32: 19 (1998)).

Quimiocina é um termo geral para proteínas básicas de ligação à heparina com migração leucocitária e funções da activação de leucócitos e classificam-se em sub-famílias de CXC, CC, C e CX3C consoante a posição do resíduo de cisteína preservado na estrutura primária. Até à data, já foram identificadas 16 espécies de receptores de quimiocina (Curr. Opi. Immunol., 11: 626 (1999)) e tem-se demonstrado que a expressão de cada receptor de quimiocina é diferente na superfície de cada leucócito, tal como, nas células Thl, nas células Th2 ou similares (Cell Engineering, 17: 1022 (1998)). CCR4 humana é uma proteína G complexada com sete receptores da transmembrana clonada como K5-5 a partir de uma linha de células basofílicas imaturas KU-812 e tem a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 17. Dado que as regiões da transmembrana de CCR4 são consideradas como estando nas posições 40-67, nas posições 78-97, nas posições 113-133, nas posições 151-175, nas posições 207-226, nas posições 243-270 e nas posições 285-308, considera-se que os domínios extracelulares são as posições 1-39, as posições 98-112, as posições 176-206 e as posições 271-284 na sequência de aminoácidos e que as regiões intracelulares são as posições 68-77, as posições 134-150, as posições 227-242 e as posições 309-360 (J. Biol. Chem., 270: 19495 (1995)). Quando se realizou a clonagem, foi referido que o ligando de CCR4 é PIM-1 alfa (proteína inflamatória macrófaga 1 alfa, MIP na terminologia inglesa), RANTES (regulada na activação normal 4 de células T expressas e segregadas) ou PCM-1 (proteína quimiotática monocítica, MCP na terminologia inglesa) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 218: 337 (1996), patente de invenção NO 96/23068). Contudo, depois, verificou-se que TQRA (timo e quimiocina regulada por activação, TARC na terminologia inglesa) produzida a partir de células mononucleares humanas de sangue periférico estimuladas (referidas daqui para a frente como "CMSP", PBMC na terminologia inglesa) e células do timo (J. Biol. Chem., 271: 21514 (1996)) se ligam especif icamente a CCR4 (J. Biol. Chem., 272: 15036 (1997)). Também tem sido referenciado que as QDM (quimiocinas derivadas de macrófagos, MDC na terminologia inglesa) isoladas de macrófagos (J. Exp. Med., 185: 1595 (1997)), também conhecidas como PQTE-1 (proteína 1 quimiotática das células T estimuladas, STCP-1 na terminologia inglesa) (J. Biol. Chem., 272: 25229 (1997)), se ligam a CCR4 mais fortemente do que a TQRA (J. Biol. Chem., 273: 1764 (1998)) .

Tem sido demonstrado que CCR4 é expressa em células CD4+Th que produzem citocinas e/ou quimiocina (J. Biol. Chem., 272: 15036 (1997)) e tem sido referenciado, que CCR4 é expressa selectivamente nas células Th2 entre as células CD4+Th (J. Exp. Med., 187: 129 (1998), J. Immunol., 161: 5111 (1998)). Além disso, encontraram-se células CCR4+ num grupo de células T de efector/memória (CD4+/CD45RO+) e quando as células CCR4+ foram estimuladas, produziram-se IL-4 e IL-5 mas não se produziu IFN-gama (Int. Immunol., 11: 81 (1999)). Também já foi referido que as células CCR4+ pertencem a um grupo de ALC (antigénio de linfócitos cutâneos) e a um grupo negativo para integrina alfa 4 beta 8 entre as células T de memória e CCR4 é expresso nas células T de memória relacionadas não com a imunidade do intestino mas com a imunidade sistémica da pele ou de órgãos semelhantes (Nature, 5 400: 776 (1999)). Estes resultados sugerem uma forte possibilidade de que as células T de memória, que são activadas por indução de CCR4 expressa por inflamação, migrem para um sitio inflamatório por meio de ligandos, QDM e TQRA e acelerem a activação de outras células inflamatórias.

Como processos correntes para o tratamento de doenças imunes mediadas por Th2, têm sido desenvolvidos os seguintes processos: (1) antagonistas para a citocina e a quimiocina, tal como, anticorpo anti-IL5 humanizado (SB-240563: Smith Kline Beecham, Sch-55700 (CDP-835): Shehling Plaw/Celltech), um anticorpo de IL-4 humanizado (patente de invenção norte-americana US N° . 5.914.110), um receptor solúvel de quimiocina (J. Immunol., 160: 624 (1998)), etc.; (2) inibidores da produção citocina e quimiocina, tais como, um inibidor da produção de IL-5 (pedido de patente de invenção japonesa, publicada e não examinada N°. 53355/96), um antagonista retinóide (patente de invenção WO 99/24024), tosilato de esplatasto (IPD-1151T, fabricado pela Taiho Pharmaceutical), etc.; (3) agentes para eosinófilos, mastócitos e similares como células inflamatórias finais, tal como, um anticorpo do receptor de IL-5 humanizado (patente de invenção WO 97/10354), um antagonista do receptor 3 de quimiocina CC (CCR3) (pedido de patente de invenção japonesa, publicada e não examinada N°. 147872/99), etc.; (4) inibidores de moléculas inflamatórias, tais como, um anticorpo anti-IgE humanizado (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157: 1429 (1998)), etc.; e similares. Mas eles inibem apenas uma parte da rede elaborada entre as citocinas, quimiocinas e células inflamatórias e, por isso, não são radicais. Os anticorpos anti-CD4 têm uma capacidade para controlar as células T e têm efeitos na asma severa dependente de esteróides. Contudo, dado que a molécula de CD4 é amplamente expressa em várias células imunitárias, falta- 6 lhes especificidade e têm a desvantagem de serem acompanhadas por um forte efeito imunossupressor (Int. Arch. Aller. Immunol., 118: 133 (1999)).

Assim, para inibir todos eles é necessário controlar especificamente o que se passa a montante da reacção alérgica problemática, nomeadamente, as células Th2. 0 principal processo utilizado correntemente para o tratamento de doenças imunitárias, sérias, mediadas por Th2, é a administração de esteróides, mas os efeitos colaterais provocados pelos esteróides não podem ser evitados. Também há a desvantagem que o estado clinico de cada doente volte à patologia original quando se suspende a administração dos esteróides e que a resistência ao fármaco seja adquirida quando se faz uma administração de esteróides durante longo tempo.

Até à data, não se estabeleceu nenhum anticorpo mono-clonal que possa detectar as células que expressam CCR4 e que também tenham citotoxicidade contra as células que expressam CCR4. Além disso, não se conhece até hoje nenhum agente terapêutico que possa inibir a produção de citocina de Th2.

Embora tenha sido referenciado que CCR4 também está expresso na leucemia (Blood, 96: 685 (2000)), não se conhece nenhum agente terapêutico que diminua as células leucémicas.

Sabe-se, de uma forma geral, que quando um anticorpo derivado de um animal não humano, por exemplo, um anticorpo de rato, é administrado a um ser humano, ele é reconhecido como uma substância estranha e induz um anticorpo humano contra o anticorpo de rato (anticorpo humano anti-rato: referido a partir daqui como "AHAR") no corpo humano. Sabe-se 7 que AHAR reage cora o anticorpo de rato administrado e causa efeitos colaterais (J. Clin. Oncol., 2: 881 (1984), Blood, 65: 1349 (1985), J. Natl. Câncer Inst., 80: 932 (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82: 1242 (1985)), até o desaparecimento rápido do corpo, do anticorpo de rato administrado (J. Nucl. Med., 26: 1011 (1985), Blood, 65: 1349 (1985), J. Natl. Câncer Inst., 80: 937 (1988)) e para reduzir os efeitos terapêuticos do anticorpo de rato (J. Immunol., 135: 1530 (1985), Câncer Res., 46: 6489 (1986)).

Para resolver estes problemas, têm sido feitas tentativas para converter um anticorpo derivado de um animal não humano num anticorpo humanizado, tal como, um anticorpo humano quimérico, um anticorpo enxertado numa região de determinação da complementaridade (referida daqui para a frente como "RDC") ou outro similar, utilizando técnicas de engenharia genética. O anticorpo quimérico humano é um anticorpo em que a sua região variável de anticorpo (referida daqui para frente como "região V") é um anticorpo derivado de um animal não humano e da sua região constante (referido daqui para a frente como "região C") deriva de um anticorpo humano (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81: 6851 (1984)}. 0 anticorpo humano enxertado na RDC é um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da RDC na região V derivado de um anticorpo de um animal não humano está enxertado na posição apropriada de um anticorpo humano (Nature, 321: 522 (1986)). Em comparação com anticorpos derivados de animais não humanos, tal como, anticorpos de ratos e similares, estes anticorpos humanizados têm várias vantagens para aplicações clinicas. Por exemplo, no que respeita à imunogenicidade e estabilidade no sangue, tem sido referido que o semi-período de vida de um anticorpo quimérico humano no sangue se torna cerca de 6 vezes maior do que o anticorpo de rato quando administrado a seres humanos (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 8 86: 4220 (1989)). No caso de um anticorpo humano enxertado em RDC, tem sido referido que a sua imunogenicidade ficou reduzida e o seu semi-periodo de vida no soro se tornou 4 a 5 vezes mais longo que um anticorpo de rato em experiencias utilizando um macaco (J. Immunol·., 147: 1352 (1991)). Assim, é espectável que os anticorpos humanizados tenham menos efeitos colaterais e os seus efeitos terapêuticos perdurem durante mais tempo do que os anticorpos derivados de animais não humanos. Do mesmo modo, em tratamentos particularmente para reduzir o número de células que expressam CCR4, uma actividade citotóxica superior, tal como, a actividade citotóxica dependente do complemento (daqui para a frente referida como "actividade CDC"), a actividade citotóxica mediada por células dependentes do anticorpo (daqui para a frente referida como "actividade de CCDA") e similares, por via da região Fc (a região situada dentro e depois da região charneira de um anticorpo de cadeia pesada) de um anticorpo, são importantes para os efeitos terapêuticos. Tem sido referido que nessas actividades citotóxicas, os anticorpos humanos são superiores aos anticorpos derivados de animais não humanos, dado que a região Fc dos anticorpos humanos activa de forma mais eficiente os componentes do complemento humano e as células efectoras humanas comportam receptores de

Fc na superfície das células, tais ’ como, monócitos, macrófagos, células NK (células assassinas naturais) e similares, do que a região Fc de anticorpos derivados de animais não humanos. Por exemplo, tem sido referido que a actividade citotóxica de tumores pelas células efectoras humanas foi aumentada num anticorpo quimérico humano, preparado por conversão da região Fc de um anticorpo de rato para GD2 na região Fc de um anticorpo humano (J. Immunol., 144: 1382 (1990)) e resultados semelhantes têm sido referidos em relação ao anticorpo humano enxertado na RDC para o antigénio CAMPATH-1 (Nature, 332: 323 (1988)). 9

Estes resultados mostram claramente que os anticorpos humanizados são preferíveis aos anticorpos derivados de animais não humanos, tais como, anticorpos de ratos e similares, para se utilizarem como anticorpos para aplicações clinicas a seres humanos.

Além disso, de acordo com recentes avanços na engenharia das proteínas e na engenharia genética, os fragmentos de anticorpos com um peso molecular menor, tais como, Fab, Fab', F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples (daqui para a frente referenciado como "scFv") (Science, 242: 423 (1988)), um fragmento de uma região V estabilizada por dissulfureto (daqui para a frente referenciado como "dsFv") (Molecular Immunol., 32: 249 (1995)) e similares, podem ser produzidos. Dado que os fragmentos são menores em termos de peso molecular do que as moléculas completas de anticorpo, eles são excelentes na capacidade transicional nos tecidos alvo (Câncer Res., 52: 3402 (1992)). Considera-se que estes fragmentos derivados de anticorpos humanizados são preferíveis em relação aos derivados de anticorpos que derivam de animais não humanos, tais como, anticorpos de rato, quando utilizados em aplicações clínicas em seres humanos.

Tal como se descreveu antes, podem esperar-se efeitos de diagnóstico e terapêuticos dos anticorpos humanizados e dos seus fragmentos quando utilizados isoladamente, mas têm se feito tentativas para melhorar ainda estes efeitos utilizando outras moléculas em combinação. Por exemplo, pode-se utilizar citocina como uma dessas moléculas. A citocina é um termo geral para vários factores solúveis, que controlam funções mútuas intracelulares em reacções imunitárias. A actividade CDC e a actividade CCDA, por exemplo, são conhecidas como actividades citotóxicas de anticorpos e a actividade CCDA é controlada por células efectoras que têm receptores de Fc na 10 superfície das células, tal como, monócitos, macrófagos, células NK e similares (J. Immunol., 138: 1992 (1987)). Dado que várias citocinas activam estas células efectoras, elas podem ser administradas em combinação com um anticorpo de modo a aumentar a actividade CCDA do anticorpo e similares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os anticorpos ligam-se ao antigénio correspondente por via de RDCs de regiões V de uma cadeia pesada (daqui para a frente referenciada como "cadeia P") e de uma cadeia leve (daqui para a frente referenciada como "cadeia L") e a sequência de aminoácidos da RDC regula a reactividade de ligação e a especificidade de ligação-do anticorpo (J. Exp. Med., 132: 211 (1970)). Assim, há uma procura de um anticorpo anti-CCR4 que contenha RDCs com uma nova sequência de aminoácidos e que se ligue especificamente a CCR4 humano, que tenha certas propriedades, tais como, reactividade da ligação, actividade citotóxica e similares, que são diferentes dos anticorpos CCR4 conhecidos. Além disso, há uma procura de um anticorpo que possa depletar selectivamente as células Th2 que expressam CCR4 como células que produzem citocinas, um anticorpo que iniba a produção da citocina de Th2 e um agente de diagnóstico e um agente terapêutico que utilize esse anticorpo. Além disso, há uma procura de um processo útil no diagnóstico e no tratamento de cancros do sangue, tal como, leucemia, que é uma doença causada pela transformação tumorigénica de células hematopoiéticas e similares.

Os requerentes obtiveram ADNcs que codificam anticorpos de cadeia P e de cadeia L do hibridoma KM2160, que produz um anticorpo monoclonal de rato para CCR4, pertencendo à classe de IgGl e verificaram que as RDCs da região V têm novas 11 sequências de aminoácidos e construíram um vector de expressão do anticorpo humanizado por clonagem dos ADNcs, que codificam uma região V de cadeia P e uma região V de cadeia L com as novas RDCs num vector de expressão de células de animais com ADNcs, que codifica a região C de cadeia P do anticorpo humano e a região C da cadeia L do anticorpo humano. 0 anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 foi expresso e purificado por introdução do vector de expressão em células de animais. A presente invenção tem sido realizada por meio da confirmação de que este anticorpo reage especificamente com CCR4 humano e reduz o número de células positivas do antigénio através da sua forte actividade citotóxica e mostrando a utilidade do anticorpo, utilizando no corpo humano.

Além disso, os requerentes completaram a presente invenção pela confirmação de que um anticorpo recombinante para CCR4 reage com as células leucémicas, particularmente, com as células leucémicas das células T, com uma elevada frequência e reduz o número de células leucémicas positivas para CCR4 através da sua actividade citotóxica potente e mostrando a utilidade do anticorpo no diagnóstico e no tratamento de cancros do sangue, tal como, a leucemia humana e similares. A presente invenção diz respeito aos objectos (1) a (47) que se seguem. (1) Um anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo, que reage especificamente com um epitopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCr4 humano, sendo o referido epitopo reconhecido 12 pelo anticorpo KM27S0 produzido pelo transformante KM2760 com o número de depósito FERM BP-7054. (2) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo de acordo com as alíneas (1) ou (2), que reage especificamente com a célula que expressa CCR4. (3) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo de acordo com as alineas (1) ou (2), que tem actividade citotóxica contra uma célula que expressa CCR4.

Exemplos de actividades citotóxicas incluem actividade CDC, actividade CCDA e similares. (4) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo de acordo com a alínea (3) , em que a actividade citotóxica contra a célula que expressa CCR4 é superior à de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma derivado de um animal não humano. A expressão "actividade citotóxica superior à de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma derivado de um animal não humano"·, significa que a actividade citotóxica do anticorpo recombinante obtido é superior à de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma derivado de um animal não humano, que reage específicamente com CCR4 utilizado na produção de um anticorpo recombinante que será descrito ruais tarde. (5) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo de acordo com a alínea (3) , em que a actividade citotóxica é uma actividade citotóxica mediada por células dependentes do anticorpo (CCDA). 13 (6) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo de acordo com a alinea (5} , em que a actividade citotóxica mediada por células dependentes do anticorpo, é a actividade de indução de apoptose de uma célula Th2. (7) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento deste anticorpo de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (6) , que tem actividade de depleção de uma célula de

Th2. (8) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (7) , que tem actividade de inibição da produção da citocina Th2. (9) 0 anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo de acordo com a alínea (8), em que a citocina de Th2 é IL-4, IL-5 ou IL-13. (10) 0 anticorpo recombinante de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (9), em que o anticorpo recombinante se selecciona entre um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. (11) 0 anticorpo recombinante de acordo com a alínea (10), em que o anticorpo humanizado é um anticorpo quimérico humano ou um anticorpo humano enxertado em RDC. (12) O anticorpo recombinante de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (11) , que pertence a um anticorpo humano de IgG. 14 (13) 0 anticorpo recombinante de acordo com a alínea (10) , em que anticorpo humanizado compreende: a região de determinação de complementaridade RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região variável (região V) , de cadeia pesada (cadeia P) , de um anticorpo com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7, respectivamente; e RDCl, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia leve (cadeia L) , de um anticorpo com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10 respectivamente. (14) O anticorpo recombinante de acordo com a alinea (11) , em que o anticorpo quimérico humano compreende: uma região variável (região V) , de cadeia pesada (cadeia P) , de um anticorpo e uma região V, de cadeia leve (cadeia L), de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com CCR4; e uma região constante (região C) , de cadeia P e uma região C, de cadeia L de um anticorpo humano. (15) O anticorpo recombinante de acordo com a alínea (14), em que o anticorpo quimérico humano compreende: uma região V, de cadeia P, com os aminoácidos 20-138 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15; e uma região V, de cadeia L, com os aminoácidos 20-132 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16. 15 (16) 0 anticorpo recombinante de acordo com a alinea (11), em que o anticorpo quimérico humano é um anticorpo KM2760 produzido por um transformante KM2760 com o número de depósito FERM BP-7054 e em que a sua região C da cadeia P do anticorpo pertence à sub-classe de IgGl humana. (17) 0 anticorpo recombinante de acordo com a alinea (10), em que o anticorpo humano compreende uma região variável (região V) , de cadeia pesada (cadeia) P, do anticorpo e uma região V, de cadeia leve (cadeia L) , do anticorpo. (18) O anticorpo recombinante de acordo com a alinea (17) , em que as regiões de determinação de complementaridade (RDCs) da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, do anticorpo humano, compreendem sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos das RDCs da região V, de cadeia P e da região V, da cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com CCR4. (19) O anticorpo recombinante de acordo com a alinea (18) , em que o anticorpo humano compreende: RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia P, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ IDN°s. 5, 6 e 7, respectivamente e RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia L, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente. 16 (20) O anticorpo recombinante de acordo com a alínea (17) , em que a região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, do anticorpo humano, compreendem sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos de uma região V, de cadeia P e de uma região V, da cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com CCR4. (21) O anticorpo recombinante de acordo com a alínea (20), em que o anticorpo humano compreende: uma região V, de cadeia P, com os aminoácidos 20-138 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15; e uma região V, de cadeia L, com os aminoácidos 20-132 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16. (22) O anticorpo recombinante de acordo com uma qualquer das alíneas (17) a (21), em que o anticorpo humano é um anticorpo obtido de uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos ou de um animal transgénicos que produz um anticorpo humano. (23) Um ADN que codifica o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22). (24) Um vector recombinante que compreende o ADN de acordo com a alínea (23) e um vector em tandem para a expressão do anticorpo humanizado. 17 (25) Ura transformante através do qual o vector recorabinante de acordo com a alínea (24) é introduzido numa célula hospedeira. (26) Ura transformante de acordo com a alínea (25) , em que o transformante é KM2760 e tem o número de depósito FERM BP-7054. (27) Ura processo para a produção de ura anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, que compreende a cultura do transformante de acordo com as alíneas (25) ou (26), para produzir e acumular o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo num meio de cultura e recuperar o anticorpo recombinante ou o fragmento desse anticorpo a partir desse meio de cultura. (28) 0 fragmento de um anticorpo de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (9), que é Fab, Fab', F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples, um fragmento da região C estabilizada por di-sulfureto ou um péptido que compreende as regiões de determinação de complementaridade (RDCs) de um anticorpo. (29) 0 fragmento de um anticorpo de acordo com a alínea (28), que compreende uma região variável (região V), de cadeia pesada (cadeia P), de anticorpo e uma região V de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo, de um anticorpo. (30) O fragmento de um anticorpo de acordo com a alínea (29}, em que as regiões de determinação de complementaridade (RDCs) da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L do fragmento do anticorpo compreendem sequências de aminoácidos que são iguais às 18 sequências de aminoácidos das RDCs de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com CCR4. (31) Um fragmento de um anticorpo de acordo com a alinea (30), que compreende: RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia P, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7, respectivamente e RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia L, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente. (32) Um fragmento de um anticorpo de acordo com a alinea (29) , em que a região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, do anticorpo humano, compreendem sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos de uma região V, de cadeia P e de uma região V, da cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com CCR4. (33) Um fragmento de um anticorpo de acordo com a alinea (32), em que compreende: uma região V, de cadeia P, com os aminoácidos 20-138 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15; e uma região V, de cadeia L, com os aminoácidos 20-132 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16. 19 (34) Um anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo, que é um anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34), que é conjugado quimicamente ou geneticamente com um radio-isótopo, uma proteína ou um agente. (35) Um processo in vitro para detectar imunologicamente CCR4, que compreende a utilização do anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34) .

Por exemplo, o CCR4 numa amostra pode ser detectado imunologicamente, permitindo que o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo contacte com a amostra. (36) Um processo in vitro para detectar imunologicamente uma célula que expressa CCR4 na superfície da célula, que compreende a utilização do anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34) .

Por exemplo, uma célula que expressa CCR4 na superfície da célula pode ser detectada imunologicamente, permitindo que o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo contacte com a célula. (37) Um processo in vitro para a redução ou a depleção de uma célula que expressa CCR4 na superfície da célula, que compreende a utilização do anticorpo recombinante ou 20 de um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34).

Por exemplo, a célula que expressa CCR4 na superfície da célula pode ser reduzida ou depletada pela administração de uma quantidade efectiva do anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo, a um ser humano ou a um animal. (38) Um processo in vitro para inibir a produção da citocina de Th2, que compreende a utilização do anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34) .

Por exemplo, a produção da citocina de Th2 pode ser inibida pela administração de uma quantidade efectiva do anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo, a um ser humano ou a um animal. (39) Um medicamento que compreende, como ingrediente activo, o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34) . (40) Um agente terapêutico ou de diagnóstico para doenças imunitárias mediadas por Th2, que compreende como ingrediente activo o anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alíneas (1) a (22) e (28) a (34).

Por exemplo, uma doença imunitária mediada por Th2 pode ser tratada pela administração de uma quantidade efectiva do anticorpo recombinante ou um fragmento desse 21 anticorpo, a um ser humano ou a um animal e uma doença imunitária mediada por Th2 pode ser diagnosticada, permitindo que o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo contactem com uma amostra a ser ensaiada. {41) Um agente terapêutico ou de diagnóstico para o cancro do sangue, que compreende como ingrediente activo o anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, de acordo com uma qualquer das alineas (1) a (22) e (28) a (34).

Por exemplo, um cancro do sangue pode ser tratado pela administração de uma quantidade efectiva do anticorpo recombinante ou de um fragmento desse anticorpo, a um ser humano ou a um animal e um cancro do sangue pode ser diagnosticado, permitindo que o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo contactem com uma amostra a ser ensaiada. (42) 0 agente terapêutico ou de diagnóstico de acordo com a alinea (41), em que o cancro do sangue é leucemia.

Exemplos de doenças imunitárias mediadas por Th2 na presente invenção incluem hipersensibilidade aguda ou crónica das vias respiratórias ou asma brônquica, doenças atópicas da pela, incluindo dermatite atópica, rinite alérgica, polinose e similares.

Exemplos do cancro na presente invenção incluem cancros do sangue e, particularmente, leucemia.

Qualquer anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo de acordo com a presente invenção (daqui para a 22 frente referenciado como "anticorpo da presente invenção") pode ser utilizado desde que possa reagir especificamente com um epitopo presente na posição 2-29 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 17, do domínio extracelular de CCR4 humano. Os anticorpos mais preferidos são os anticorpos que compreendem RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia P com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7,, respectivamente e RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia L com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente e um anticorpo que compreende uma região V, de cadeia P com aminoácidos das posições 20-138 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15 e uma região V, de cadeia L com aminoácidos das posições 20-132 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16. Os anticorpos e os fragmentos desses anticorpos em que um ou mais ácidos estão eliminados, adicionados, substituídos e/ou inseridos nestas sequências de aminoácidos e que reagem especificamente com um epitopo presente na posição 2-29 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, estão também incluídos dentro do âmbito da presente invenção.

Na presente invenção, uma ou mais eliminações, substituições, inserções ou adições de aminoácidos da sequência de aminoácidos significa que um ou mais aminoácidos são eliminados, substituídos, inseridos e/ou adicionados a uma ou várias posições na sequência de aminoácidos. A eliminação, substituição, inserção e/ou adição pode ser causada na mesma sequência de aminoácidos simultaneamente. Também o resíduo de aminoácido substituído, inserido ou adicionado pode ser natura ou não natural. Exemplos de resíduos de aminoácidos naturais incluem L-alanina, L-asparagína, ácido L-aspártíco, L-glutamína, ácido L-glu- 23 tâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenílalanína, L-prolina, L-serina, L-trionina, L-tríptofano, L-tírosina, L-valina, L-cisteina, e similares. A partir daqui, mostram-se exemplos de resíduos de aminoãcidos que são substituídos uns pelos outros. Os resíduos de aminoácidos no mesmo grupo podem ser substituídos uns pelos outros.

Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, ala-nina, ácido 2-aminobutanóico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclo-hexilalanina;

Grupo B: ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido iso-aspártico, ácido iso-glutâmico, ácido 2-aminoadipico, ácido 2-ami-no-subérico;

Grupo C: asparagina, glutamina;

Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanóico, ácido 2,3-diaminopropiónico;

Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina; 24

Grupo F: serina, trionina, homo-serina;

Grupo G: fenilalanina, tirosina.

Exemplos do anticorpo da presente invenção incluem um anticorpo humanizado, um anticorpo humano e um fragmento desses anticorpos, conforme se descreve a seguir.

Exemplos do anticorpo humanizado incluem um anticorpo quimérico humano e um anticorpo humano enxertado em RDC.

Um anticorpo quimérico humano, é um anticorpo que compreende uma região V, de cadeia P (daqui para a frente referenciada como "VP") e uma região V, de cadeia L do anticorpo (daqui para a frente referenciada como "VL"), de um animal não humano, uma região C, de cadeia P do anticorpo humano (daqui para a frente referenciada como "CP") e uma região C, de cadeia L de anticorpo humano (daqui para a frente referenciada como "CL"). 0 animal não humano pode ser qualquer um de murganho, rato, hamster, coelho e similares desde que possa ser preparado o respectivo hibridoma. 0 anticorpo quimérico humano da presente invenção, pode ser produzido obtendo ADNcs codificando uma VP e uma VL de um hibridoma, que produz um anticorpo monoclonal, que reage especificamente com epitopo presente na posição 2-29 na sequência de aminoácidos representada. pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, inserindo os ADNCs num vector de expressão de células de animais com genes que codificam um anticorpo humano de CP e um anticorpo humano de CL, para 25 construir um vector de expressão de um anticorpo quimérico humano e introduzir o vector numa célula de animal para expressar o anticorpo.

Qualquer CP de um anticorpo quimérico humano pode ser utilizada, desde que pertença a uma imunoglobulina humana (daqui para a frente referenciada como "hlg") mas preferem-se as da classe hlgG e qualquer uma das subclasses pertencendo ainda a hlgG, tal como, as hlgGl, hIgG2, hIgG3 e hIgG4, que também podem ser utilizadas. Também se pode utilizar qualquer Cl de um anticorpo quimérico humano desde que pertença a hlg e podem-se utilizar os da classe κ ou da classe γ.

Exemplos de anticorpos quiméricos anti-CCR4 incluem KM2760 em que VP do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos das posições 20-138 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15, a CP do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da subclasse da hlgGl, a VL do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos das posições 20-132 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16 e a CL do anticorpo tem a sequência dos aminoácidos da classe K de anticorpos humanos.

Um anticorpo humano enxertado em RDC é um anticorpo em que as sequências de aminoácidos da RDC de VP e VL de um anticorpo derivado de um animal não humano estão enxertadas nas posições apropriadas de VP e VL de um anticorpo humano. O anticorpo humano enxertado em RDC da presente invenção pode ser produzido enxertando as sequências de RDC de VP e VL de um anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 17 do dominio extracelular de CCR4, de um animal não humano, nas sequências de RDC de Vp e 26 VL de um anticorpo humano opcional, para construir ADNcs que codificam as regiões V obtidas, inserindo os ADNcs num vector de expressão de células de animais com genes que codificam a CP do anticorpo e a CL do anticorpo humano, para construir um vector de expressão do anticorpo humano enxertado em RDC e depois introduzindo o vector de expressão numa célula de animal para expressar o anticorpo.

Qualquer CP ou anticorpo humano enxertado em RDC pode ser utilizado, desde que pertença a hlg, mas prefere-se a classe hlgG e qualquer uma das classes que ainda pertencem a hlgG, tais, hlgGl, hIgG2, hIgG3 e hIgG4, que podem também ser utilizados. Do mesmo modo, qualquer CL de anticorpo humano enxertado em RDC pode ser utilizado, desde que pertença a hlg e podem-se utilizar os da classe κ ou da classe γ.

Originalmente, um anticorpo humano é um anticorpo com existência natural no corpo humano mas também inclui anticorpos obtidos de uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos e um anticorpo humano que produz animais trans-génicos, preparado à base dos recentes avanços da engenharia genética, da engenharia das células e das técnicas de engenharia do desenvolvimento. 0 anticorpo que existe no corpo humano pode ser obtido, por exemplo, isolando um linfócito do sangue periférico humano, imortalizando por infecção com virus EB ou um virus similar, seguido de clonagem, cultura de um linfócito que produz o anticorpo e purificação do anticorpo a partir do sobrenadante da cultura. A biblioteca de anticorpos humanos é uma biblioteca em qye um fragmento de anticorpo, tal como, Fab, scFv ou similares, está expresso na superfície de um fago, por meio da 27 inserção de um gene de anticorpo preparado a partir de células B humanas, no gene do fago. Um fago que expressa um fragmento de anticorpo e que tem a actividade de ligação do antigénio desejada pode ser recuperado a partir da biblioteca utilizando a actividade de ligação a um substrato imobilizado de antigénio como o índice. 0 fragmento de anticorpo pode ainda ser convertido numa molécula de anticorpo humano compreendendo duas cadeias P completas e duas cadeias L completas, por meio de técnicas de engenharia genética.

Um animal transgénico que produz anticorpos humanos é um animal não humano em que o gene do anticorpo humano é introduzido nas suas células. Especificamente, um animal transgénico que produz anticorpos humanos pode ser produzido introduzindo um gene de anticorpo humano, numa célula ES de rato, inoculando a célula ES num embrião em estado inicial de outro rato e desenvolvendo um animal. 0 anticorpo humano pode ser produzido e acumulado por obtenção de um hibridoma que produz um anticorpo humano de acordo com um processo de preparação de um hibridoma normalmente realizada em mamíferos que não sejam seres humanos e depois fazendo a cultura do hibridoma para se obter o anticorpo humano no sobrenadante da cultura.

Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2í scFv, dsFv, um péptido compreendendo as RDCs de um anticorpo de acordo com a presente invenção.

Um Fab é um fragmento de anticorpo com um peso molecular de cerca de 50.000 e uma actividade de ligação do antigénio, em que cerca de metade do lado do terminal N, da cadeia P e de toda a cadeia L, entre os fragmentos obtidos por tratamento de IgG com uma protease, a papaina (corte na 224a 28 posição do resíduo de aminoácido da cadeia P}, estão ligados em conjunto através de uma ligação de di-sulfureto. 0 Fab da presente invenção pode ser obtido por tratamento de um anticorpo que reage especificamente com um epi-topo presente nas posições 2-29 na sequência de. aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, com uma protease, a papaína. Alternativamente, 0 Fab pode ser produzido inserindo ADN que codifica Fab do anticorpo, no vector de expressão para procariotos ou num vector de expressão para eucariotos e a introdução do vector num procarioto ou num eucarioto para expressar o Fab.

Um F(ab' )z é um fragmento de anticorpo com um peso molecular de cerca de 100.000 e uma actividade de ligação do antigénio, que é ligeiramente superior à do Fab ligado por via de uma ligação de di-sulfureto, da região charneira, entre fragmentos obtidos por tratamento de IgG com uma protease, a pepsina (corte na 234a posição do resíduo de aminoácido da cadeia P). 0 F(ab')2 da presente invenção pode ser obtido tratando um anticorpo que reage especificamente com um epítopo presenta nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, com uma protease, a pepsina. Alternativamente, pode ser produzido ligando o Fab' descrito a seguir por via de uma ligação de tioéter ou uma ligação de di-sulfureto.

Um Fab' é um fragmento de anticorpo com um peso molecular de cerca de 50.000 e uma actividade de ligação do antigénio que se obtém cortando uma ligação de di-sulfureto da região charneira de FfabMz- 29 0 Fab' da presente invenção pode obter-se tratando o F{ab')2 que reage especificamente cora um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, com um agente de redução, o ditiotreitol. Alternativamente, 0 Fab' pode ser produzido inserindo ADN que codifica Fab' do anticorpo no vector de expressão para procariotos ou num vector de expressão para eucariotos e a introdução do vector num proca-rioto ou num eucarioto para expressar o Fab'.

Um scFv representa um polipéptido de VP-P-VL ou VL-P-VP em que uma cadeia VP e uma cadeia VL estão ligadas utilizando um ligante de péptidos apropriado (daqui para a frente referenciado como "P") . 0 VP e o VL em scFv da presente invenção, pode ser qualquer anticorpo da presente invenção que reage especificamente com epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, tal como um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. 0 scFv da presente invenção pode ser produzido obtendo os ADNcs que codificam VP e VL de um anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, construindo ADN que codifica scFv, inserindo o ADN num vector de expressão para procariotos ou um vector de expressão para eucariotos e depois introduzindo o vector de expressão num procarioto ou num eucarioto para expressar o scFv.

Um FVhd obtém-se ligando polipéptidos em que um resíduo de aminoácido de cada VP e VL está substituído com um resíduo de cisteína por via de uma ligação de di-sulfureto entre os resíduos de cisteína. 0 resíduo de aminoácidos a ser subs- 30 tituído com o resíduo de cisteína pode ser seleccionado com base numa estimativa de uma estrutura tridimensional do anticorpo, de acordo com o processo mostrado por Reiter et al. (Protein Engineering, 7: 697 (1994)). Tal como o VP e o VL contido no dsFv da presente invenção, pode-se utilizar qualquer anticorpo da presente invenção que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, tal como um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. 0 dsFv da presente invenção pode ser produzido obtendo os ADNcs que codificam VP e VL de um anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, construindo ADN que codifica dsFv, inserindo o ADN num vector de expressão para procariotos ou um vector de expressão para eucariotos e depois introduzindo o vector de expressão num procarioto ou num eucarioto para expressar o dsFv.

Um péptido que compreende RDCs de um anticorpo da presente invenção é constituindo por incluindo, pelo menos, uma região de RDCs de cadeia P e de cadeia L. Podem ligar-se vários RDCs directamente ou por via de um ligante de péptido apropriado. 0 péptido que compreende RDCs pode ser produzido obtendo ADNc que codifica VP ou VL de um anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, construindo ADN que codifica RDC inserindo no ADN um vector de expressão para procariotos ou um vector de expressão para eucariotos e depois 31 introduzindo o vector de expressão num procarioto ou num eucarioto para expressar o péptido. 0 péptido que contém as RDCs de um anticorpo da presente invenção, pode também ser produzido por um processo da síntese química, tal como, um processo de Fmoc (processo do fluorenilmetoxicarbonilo) , um processo de tBoc (processo de t-butiloxicarbonilo), ou similares. 0 anticorpo da presente invenção inclui derivados do anticorpo, em que um radio-isótopo, uma proteína ou um agente é conjugado quimicamente ou geneticamente com um anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, tal como um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou um fragmento desses anticorpos.

Os derivados do anticorpo da presente invenção podem ser produzidos conjugando quimicamente um radio-isótopo, uma proteína ou um agente com o lado do terminal N ou com o lado do terminal C, de uma cadeia P ou de uma cadeia L de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, com um grupo substituinte apropriado ou a cadeia lateral do anticorpo ou um fragmento do anticorpo ou uma cadeia de açúcar no anticorpo ou no fragmento do anticorpo (Antibody Engineering HandbooJc, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)).

Alternativamente, pode ser produzido geneticamente ligando um ADN que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, que reage especificamente com um epítopo presente 32 nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4, com outro ADN que codifica uma proteína a ser ligado, inserindo o ADN num vector de expressão e introduzindo o vector de expressão numa célula hospedeira.

Exemplos de isótopos incluem 131I, 125I e similares e podem ser conjugados com anticorpos, por exemplo, por meio do processo da cloramina T.

Como agente, prefere-se um composto de baixo peso molecular. Os exemplos incluem agentes anti-cancerígenos, tais como, agentes de alquilação (por exemplo, mostarda de azoto, ciclofosfamida, etc.), antagonistas metabólicos (por exemplo, 5-fluorouracilo, metotrexato, etc.), antibióticos (por exemplo, daunomicina, bleomicina, mitomicina C, daunorubicina, doxorubicina, etc.), alcaloide de plantas (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, etc.), fármacos de hormonas (por exemplo, tamoxifen, dexametasona, etc.) e similares (Clinicai Oncology, editado por Japanese Society of Clinicai Oncology, publicado por Câncer and Chemotherapy (1996)}; agentes anti-inflamatórios, tais como, agentes esteróides (por exemplo, hidrocortisona, prednisona, etc.), fármacos não esteroidais (por exemplo, aspirina, indome-tacina, etc.), imuno-reguladores (por exemplo, aurotioma-lato, penicilamina, etc.), agentes imuno-supressores (por exemplo, ciclofosfamida, azatioprina, etc.), agentes anti-histamínicos (por exemplo, maleato de clorfeniramina, clemas-tina, etc.) e similares (Inflammation and Antíinflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)}; e similares. Exemplos do processo para a conjugação de daunomicina com um anticorpo incluem um processo em que a daunomicina e um grupo amino de um anticorpo são conjugados por via de glutaraldeido, um processo em que um grupo amino de daunomicina e um grupo 33 carboxilo de um anticorpo são conjugados por via de uma carbodi- imida solúvel em água e similares. Como proteína, prefere-se a citocina que activa as células imunitárias. Os exemplos incluem interleucina 2 humana (daqui para a frente referenciado como "iL-2h· factor de estimulação de colónias de macrófagos de granulócitos humanos (daqui para a frente referenciado como "FCE-MGh"), factor de estimulação de colónias de macrófagos humanos (daqui para a frente referenciado como "FCE-Mh"), interleucina 12 humana (daqui para a frente referenciado como "IL-12h//) e similares. Também para inibir directamente as células de cancro, pode utilizar-se uma toxina, tal como, ricina, toxina da difteria e similares. Por exemplo, pode-se produzir um anticorpo de fusão com uma proteína por meio da ligação de um ADNc que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo a outro ADNc que codifica a proteína, construindo o ADN que codifica o anticorpo de fusão, inserindo o ADN num vector de expressão para procariotos ou um vector de expressão para eucariotos e depois introduzindo num procarioto ou eucarioto para expressar o anticorpo de fusão.

Os processos para a produção de um anticorpo quimérico humano que reage especificamente com um epitopo presente nas posições 2-29 na sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4 e que tem novas sequências de aminoácidos nas regiões V, de cadeia P e de cadeia L, estão explicados a seguir com base nos exemplos. 1. Produção de anticorpos monoclonaís anti-CCR4 por meio de hibridoma (1) Preparação de antigénio 34

Obtém-se uma proteína recombinante de CCR4 por meio da introdução de um vector de expressão contendo ADNc que codifica CCR4 numa célula hospedeira, tal como, Escherichia coli, levedura, células de insectos, células de animais ou similares. Alternativamente, pode-se utilizar como antigénio uma célula de tumor de cultura, que expressa CCR4, uma proteína de CCR4 purificada a partir da célula ou um péptido sintético com uma sequência parcial de CCR4.

Selecciona-se uma sequência parcial de proteína com, aproximadamente, 5 a 30 resíduos como um péptido parcial para um antigénio. Para se obter um anticorpo que reconheça a proteína que tem uma estrutura natural não modificada, é necessário seleccionar uma sequência parcial que exista na superfície da estrutura tridimensional da proteína como um péptido de antigénio. A parte existente na superfície da estrutura tridimensional da proteína pode ser prevista, estimando uma sequência parcial que tenha uma hidrofilicidade elevada, utilizando um software de análise de sequências de proteína disponível comercialmente, tal como, Genetyx Mac ou similares. Em geral, as porções que têm uma baixa hidrofilicidade estão na maior parte dos casos presentes dentro da estrutura tridimensional da proteína, enquanto as porções que têm uma hidrofilicidade elevada estão mais provavelmente presentes na superfície da proteína. Também o terminal N e o terminal C de uma proteína estão presentes na superfície da proteína em muitos casos. Contudo, um péptido parcial seleccionado neste processo não funciona sempre como um antigénio que estabelece o anticorpo alvo.

Para reticular o péptido parcial com a proteína, adiciona-se um resíduo de cisteína à região terminal do péptido parcial. Quando se selecciona uma sequência interna da 35 proteína, o terminal N e o terminal C do péptido estão aceti-lados e amidados, respectivamente, se necessário. 0 péptido parcial pode ser sintetizado por um processo de síntese de péptidos usual, de fase líquida ou de fase sólida, um seu processo combinado ou este processo modificado (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 1, editado por Erhard Gross e Johannes Meinhofer, Academic Press (1979), vol. 2 (1980), vol. 3 (1981); Fundamentais and Experiments on Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya, Maruzen (1985); Development of Drugs - Second Series, vol. 14, Peptide Synthesis, editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten (1991); International Journal of Peptide Protein Research, 35: 161 (1990)).

Também se pode utilizar um sintetizador automático de péptidos. Pode-se sintetizar um péptido por meio de um sintetizador de péptidos, utilizando aminoácidos com as cadeias laterais apropriadas protegidas, tais como, ácido Noí-Fmoc-amino, ácido Να-Boc-amino e similares, num sintetizador de péptidos disponível comercialmente, por exemplo, um sintetizador de péptidos fabricado pela Shimadzu, um sintetizador de péptidos fabricado pela Applied Biosystems, Inc. , USA (daqui para a frente referenciado como "ABI"), um sintetizador de péptidos fabricado pela Advanced ChemTech Inc., USA (daqui para a frente referenciado como "ACT") ou similares, de acordo com o programa de síntese de cada sintetizador.

Os aminoácidos protegidos e as resinas veiculares, como materiais iniciais, podem ser comprados na ABI, Shimadzu, Kokusan Kagaku, Nova Biochem, Watanabe Kagaku, ACT, Peptide Institute ou similares. Também os aminoácidos protegidos, os ácidos orgânicos protegidos e as aminas orgânicas protegidas, como materiais iniciais, podem ser sintetizados por processos 36 de síntese conhecidos ou por processos resultantes das suas modificações (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 1, editado por Erhard Gross e Johannes Meinhofer, Academic Press (1979), vol. 2 (1980), vol. 3 (1981);

Fundamentais and Experiments on Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya, Maruzen (1985); Development of Drugs - Secgunda Série, vol. 14, Peptide Synthesis, editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten (1991); International Journal of Peptide Protein Research, 35: 161 (1990)). (2) Imunização de um animal e preparação da célula que produz o anticorpo

Qualquer animal tal como, murganhos, ratos, hamsters, coelhos e similares, podem ser utilizados na imunização, desde que seja produzido um hibridoma. Um exemplo de utilização de murganhos e ratos está descrito a seguir.

Faz-se a imunização de um murganho ou um rato com 3 a 20 semanas de idade com o antigénio preparado na 1 (1) anterior e recolhem-se as células de produção do anticorpo do baço, nódulos linfáticos ou sangue periférico do animal. Realiza-se a imunização administrando o antigénio ao animal várias vezes através de uma injecção subcutânea, intravenosa ou intraperitonial, em conjunto com um adjuvante apropriado. Exemplos de adjuvantes incluem um adjuvante completo de Freund, uma combinação de gel de hidróxido de alumínio com vacina pertussis e similar. Quando o antigénio é um péptido parcial, produz-se um conjugado com uma proteína veicular, tal como, a ASB (albumina de soro bovino), KLH (hemocianina de um molusco semelhante à lapa, uma proteína carregadora) e similar, que é utilizada como o antigénio. Três a sete dias após a administração, recolhe-se uma amostra de sangue do fundo do olho ou da veia da cauda do animal, faz-se a análise 37 da reactividade com o antigénio utilizado, CCR4, por exemplo, por um imuno-ensaio com enzimas (ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas (ELISA), publicado por Igaku Shoin (1976)) e depois o rato e o murganho que exibe um titulo de anticorpo suficiente no seu soro, é utilizado como a fonte de fornecimento das células que produzem anticorpo. No 3o ao 7o dias após a administração final do antigénio, faz-se a excisão do baço do murganho imunizado ou do rato imunizado para realizar a fusão das células de baço com células de mieloma, de acordo com processos conhecidos (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). (3) Preparação de células de mieloma

Pode-se utilizar qualquer célula de mieloma, desde que prolifere ín vitro. Os exemplos incluem linhas de células estabelecidas, obtidas da linha de células de mieloma de rato resistente a 8-azaguaniha (BALB/c), P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) (Europ. J. Immunol, 6: 511 (1976)}, SP2/0-Agl4 (SP-2) (Nature, 276: 269 (1978)), P3-X63-Ag8653 (653) (J. Immunol., 123: 1548 (1979)), P3-X63-Ag8 (X63) (Nature, 256: 495 (1975)) e similares. Estas linhas de células são postas em cultura e faz-se uma sub-cultura de acordo com processos conhecidos (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) e 2 x 107 ou mais das células estão seguras até à fusão das células. (4) Fusão de células

As células que produzem anticorpos obtidas antes são lavadas, adiciona-se então um meio de agregação de células, tal como, polietileno-glicol 1000 (PEG-1000) ou similar, para fundir as células e as células são suspensas no meio. Para a lavagem das células, pode-se utilizar o meio MEM, SBF (1,83 g 38 de fosfato de hidrogénio disódico, 0,21 g de fosfato de hidrogénio e potássio, 7,65 g de cloreto de sódio, 1 litro de água destilada, a pH 7,2) ou similar. Também para se obter a selectividade das células fundidas alvo, pode-se utilizar como o meio para a suspensão das células fundidas, o meio HAT {meio normal (um meio preparado adicionando glutamina (1,5 mM) , 2-mercaptoetanol (5 x 10”5 M), gentamicina (10 pg/mL) e soro bovino fetal (SBF) (a 10 %, produzido pela CSL) com o meio RPHT-1640 complementado com hipoxantina (IO-4 M) , timidina (1,5 x 10”5 M) e aminopterina (4 x 10”7 M) } .

Depois de se fazer a cultura, faz-se amostras do sobre-nadante de uma porção da cultura, que reage com uma proteína do antigénio, mas não reage com a proteína que não é do antigénio e selecciona-se por imuno-ensaio com enzimas. Depois, realiza-se a coloração por um processo de limitação da diluição e selecciona-se um hibridoma que exibe um elevado titulo de anticorpo de uma forma estável é seleccionado como o hibridoma que produz o anticorpo monoclonal. (5) Selecção do hibridoma que produz o anticorpo monoclonal anti-CCR4

Selecciona-se um hibridoma que produza um anticorpo monoclonal anti-CCR4, por meio de um ensaio descrito a seguir, de acordo com processo descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ou similar. De acordo com o ensaio, a actividade de ligação do anticorpo humano anti-CCR4, contido num sobrenadante de cultura de um transformante que produz o anticorpo quimérico, humano, anti-CCR4 descrito a seguir ou um fragmento de anticorpo ou todos os anticorpos anti-CCR4 podem ser medidos.

Imuno-ensaio de enzima: 39

Reveste-se um antigénio numa placa de ELISA de 96 cavidades. Realiza-se uma reacção utilizando um sobrenadante de cultura de hibridoma ou um anticorpo purificado, obtido no processo anterior como um primeiro anticorpo.

Depois da reacção do primeiro anticorpo, lava-se a placa e adiciona-se-lhe um segundo anticorpo.

Obtém-se o segundo anticorpo marcado o anticorpo que possa reconhecera imunoglobulina do primeiro anticorpo com biotina, uma enzima, uma substancia quimio-luminescente, um composto radioactivo ou similares. Se se utiliza um rato para a produção do hibridoma, utiliza-se um anticorpo que possa reconhecer a imunoglobulina do rato como um segundo anticorpo .

Depois da reacção, realiza-se uma reacção apropriada para a substância utilizada para a marcação do segundo anticorpo, para seleccionar um hibridoma que produza um anticorpo monoclonal que reage especificamente com o antigénio.

Exemplos de hibridomas incluem o hibridoma KM2160-(6) Purificação do anticorpo monoclonal

As células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal anti-CCR4, obtidas em 1 (4), são administradas por injecção intraperitonial em ratos ou ratos pelados com 8 a 10 semanas de idade, tratados pristano (0,5 mL de 2,6,10,14-te-trametilpentadecano (pristano) é administrado intraperitone-almente, seguido de alimentação durante 2 semanas), a uma dose de 2 x 107 a 5 x 106 células/animal. 0 hibridoma causa ascites do tumor no prazo de 10 a 21 dias. 0 fluido ascitico 40 é recolhido do rato ou do rato pelado, centrifugado, submetido a um tratamento com sal com 40 a 50 % de sulfato de amónio saturado ou com uma precipitação de ácido caprilico e depois faz-se passar através de uma coluna de DEAE-sefarose, uma coluna de proteína A ou celulotina GSL 2000 (fabricada pela Seikagaku Corporation) para recolher uma fracção de IgG ou de IgM, sob a forma de um anticorpo monoclonal purificado. A sub-classe do anticorpo monoclonal purificado, pode ser determinada utilizando um anticorpo monoclonal de rato num kit ou um kit impresso com um anticorpo monoclonal de rato. A quantidade da proteína pode ser determinada pelo processo de Lowry ou pela absorvência a 280 nm. A sub-classe de um anticorpo significa isótipos dentro da classe, tal como, IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 no caso de ratos e IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 no caso de seres humanos.

Os do tipo de IgG2a, IgG2b e IgG3 de rato e do tipo de IgGl e IgG3 de seres humanos têm uma actividade citotóxica relativamente elevada, tal como, a actividade de CDC, a actividade de ADCC e similares. De modo que eles são úteis na aplicação a tratamentos médicos. 2. Produção de anticorpo humanizado (1) Construção do vector de expressão do anticorpo humanizado

O vector de expressão do anticorpo humanizado é um vector de expressão para uma célula de animal em cujos genes codifica uma região C, de cadeia P e uma região C, de cadeia L, de um anticorpo humano foram inseridas e constrói-se por clonagem cada região C, de cadeia P e região C, de cadeia L 41 de ura anticorpo humano num vector de expressão para células de animais. A região C de um anticorpo humano pode ser uma região C, de cadeia P e uma região c, de cadeia L de qualquer anticorpo humano. Os exemplos incluem uma região C que pertence à subclasse de IgGl de uma cadeia P de um anticorpo humano (daqui para a frente referenciado como "ΙιΟγΙ") , uma região C pertencente à classe κ de uma cadeia L de um anticorpo humano (daqui para a frente referenciado como "hCx") e similares. Dado que o gene codifica a região C, de cadeia P e a região C, de cadeia L de um anticorpo humano, pode-se utilizar um ADN cromossómico que compreenda um exão e um intrão ou ADNc.

Como vector de expressão para uma célula de animal, pode-se utilizar qualquer vector de expressão desde que a região C de um anticorpo humano seja aí inserida e aí expressa. Os exemplos incluem pAGEl07 (Cytotechnology, 3: 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101: 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27: 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 1527 (1981)), pSGI pd2-4 (Cytotechnology, 4: 173 (1990)) e similares. Exemplos de um promotor e de um melhorador utilizado para um vector de expressão para células de animais, incluem um promotor precoce de SV40 e um melhorador (J. Biochem., 101: 1307 (1987)), um promotor e melhorador de LTR do vírus de leucemia do rato Moloney (Biochem. Biophys. Res. Comun., 149: 960 (1987)), um promotor de imunoglobulina de cadeia P (Cell, 41: 479 (1985)) e um melhorador (Cell, 33: 717 (1983)) e similares. O vector de expressão do anticorpo humanizado pode ser do tipo em que o gene que codifica um anticorpo de cadeia P e um gene que codifica um anticorpo de cadela L existem em vectores separados, ou do tipo em que os genes existem no 42 mesmo vector (do tipo tandem). No que respeita à facilidade de construção de um vector de expressão de um anticorpo humanizado, a facilidade de introdução nas células de animais e o equilíbrio entre as quantidades de expressão do anticorpo de cadeias P e L em células de animais, do tipo tandem de vector de expressão de anticorpo humanizado é o preferido (J. Immunol. Methods, 167: 271 (1994)). Exemplos de vectores de expressão de anticorpo humanizado do tipo tandem incluem pKANTEX93 (patente de invenção WO 97/10354), pEE18 (HYBRIDOMA, 17: 559 (1998)) e similares. 0 vector de expressão do anticorpo humanizado pode ser utilizado para a expressão de um anticorpo quimérico humano e um anticorpo enxertado em RDC humana em células de animais. (2) Preparação de ADNc que codifica a região V do anticorpo derivado de um animal não humano e as análises das sequências de aminoácidos

Os ADNcs que codificam a região V, de cadeia P e a região V de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal não humano, tal como, um anticorpo de rato, obtêm-se tal como se segue.

Extrai-se o ARNm das células de hibridoma, que produzem um anticorpo de rato ou faz-se o mesmo com síntese de ADNc. O ADNc sintetizado é inserido num vector, tal como, um fago, um plasmido ou similares, para preparar uma biblioteca de ADNc. Cada um dos fagos recombínantes ou dos plasmidos recom-binantes contendo o ADNc que codifica uma região V, de cadeia P e um fago recombinante ou um plasmido recombinante contendo ADNc que codifica uma região V, de cadeia L é isolado da biblioteca utilizando uma parte da região C ou da região V de um anticorpo de rato, como a sonda. As sequências completas 43 de nucleótidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L do anticorpo do rato de interesse no fago recombinante ou no plasmido recombinante, são determinadas e deduz-se a sequência de aminoácidos completa da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L a partir das sequências de nucleótidos. 0 animal não humano pode ser um animal, tal como, um murganho, um rato, um hamster, um coelho ou similares, desde que as células do hibridoma possam ai ser produzidas.

Exemplos do processo para a preparação do ARN a partir de uma célula de hibridoma incluem o processo de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de césio (Methods in Enzymol., 154: 3 (1987)) e similares. Exemplos do processo para a preparação de ARNm a partir do ARN total incluem um processo de coluna com um oligo (dT) imobilizado em celulose (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)) e similares. Também exemplos para um kit de preparação de ARNm a partir de uma célula de hibridoma incluem o kit de isolamento de ARNm Fast Track (fabricado pela Invitrogen), o kit de purificação de ARNm Quick Prep (fabricado pela Pharmacia) e similares.

Exemplos do processo para a síntese do ADNc e a preparação de uma biblioteca de ADNc incluem processos conhecidos (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989); Current Protocols in Molecular Biologyr Suplemento 1-34); um processo utilizando um kit disponível comercialmente, tal como, o Super Script™ Plasmid System para a síntese de ADNc e clonagem de plasmidos (fabricado pela GIBCO BRL), um kit de ZAP-cADN (fabricado pela Stratagene), etc.; e similares. 44 0 vector em que se sintetiza o ADNc, utilizando o ARNm extraído de uma célula de hibridoma como a matriz, é inserido para a preparação de uma biblioteca de ADNc, pode ser qualquer vector, desde que o ADNc possa ser inserido. Exemplos incluem o ZAP Express (Strategies, 5: 58 (1992)), pBluescript XI SK( + ) (Nucleic Acids Research, 17: 9494 (1989)), XzapII (fabricado pela Stratagene) , ÀgtlO e Xgtll (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)), Lambda

BlueMid (fabricado pela Clontech) , ÀExCell e pT7T3 18CJ (fabricado pela Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol., 3: 280 (1983)), pUC18 (Gene, 33: 103 (1985)) e similares.

Pode-se utilizar qualquer E. colí para a introdução da biblioteca de ADNc construída por um vector de fago ou de plasmido, desde que a biblioteca de ADNc possa ser introduzida, expressa e mantida. Os exemplos incluem XLl-Blue MRF' (Strategies, 5: 81 (1992)), C600 (Genetics, 39: 440 (1954)), Y1088 e Y1090 (Science, 222: 778 (1983)), NM522 (J. Mol. Biol., 166: 1 (1983)), K802 (J. Mol. Biol., 16: 118 (1966)), JM105 (Gene, 38: 275 (1985)) e similares.

Pode-se utilizar um processo de hibridação de colónias ou um processo de hibridação de placas, utilizando uma sonda marcada com um isótopo ou uma substância fluorescente, seleccionando clones de ADNc que codificam a região V, de cadeia P e a região V, de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal não humano na biblioteca de ADNc (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)). Do mesmo modo, podem preparar-se ADNcs que codificam uma região V, de cadeia P e uma região V, de cadeia L através de uma reacção em cadeia de polimerase (daqui para a frente referenciada como "RCP"; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989; Current Protocols em Molecular Biology, Suplementos 1- 45 34) preparando iniciadores e utilizando o ADNc preparado a partir de ARNm ou uma biblioteca de ADNc como matriz. A sequências de nucleótidos do ADNc pode ser determinada pela digestão do ADNc seleccionado pelo processo anterior com as enzimas de restrição e similares apropriados, clonando os fragmentos num plasmido, tal como, pBluescript SK(-) (fabricado pela Stratagene) ou similares, realizando a reacção por meio de um processo de análise de nucleótidos utilizado normalmente, tal como, o processo de didesoxi de Sanger, F. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 (1977)) ou similares e analisando depois a sequência utilizando um analisador automático de sequências de nucleótidos, tal como, o sequenciador de ADN A.L.F. (fabricado pela Pharmacia) ou similares.

Quando os ADNcs obtidos codificam todas as sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L ou o anticorpo que contém uma sequência secretória de sinal pode ser confirmado estimando as sequências completas de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L a partir de determinadas sequências de nucleótidos e comparando-as com as sequências completas de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L de anticorpos conhecidos (sequências de proteínas de interesse imunológico, US Dept. Health and Human Services (1991)). 0 comprimento da sequência secretória de sinal e a sequência de aminoácidos com terminal N, podem ser deduzidos por comparação das sequências completas de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L do anticorpo que contém uma sequência secretória de sinal com as sequências completas de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L de anticorpos conhecidos (sequências de proteínas de interesse imunológico, US Dept. Health and Human 46

Services (1991) ) e o subgrupo ao qual pertencem, pode ser conhecido. Além disso, a sequência de aminoácidos de cada uma das RDCs da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, pode ser encontrada por comparação das sequências de aminoácidos obtidas com sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L de anticorpos conhecidos (sequências de proteínas de interesse imunológico, US Dept. Health and Human Services (1991)).

Além disso, a novidade da sequência pode ser examinada fazendo uma pesquisa de homologia com sequências em qualquer base de dados, por exemplo, SWISS-PROT, PIR-Protein ou similares, utilizando as sequências de aminoácidos de comprimento completo da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, por exemplo, de acordo com o processo BLAST (J. Mol. Biol., 215: 403 (1990)) ou similares. (3) Construção do vector de expressão do anticorpo quimérico humano

Pode-se produzir um vector de expressão do anticorpo quimérico humano clonando ADNcs que codifica uma região V, de cadeia P e uma região V, de cadeia L de um anticorpo, derivado de um animal não humano, numa região a montante dos genes que codificam a região C, de cadeia P e a região C de cadeia L de um anticorpo humano no vector de expressão do anticorpo humanizado, tal como descrito antes em 2 (1). Por

exemplo, cada ADNcs que codifica uma região V, de cadeia P e uma região V, de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal não humano, está ligado com sequências de nucleótidos que compreendem ADN sintetizado nas extremidades 3' de uma região V, de cadeia P e uma região V, de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal não humano e as sequências de nucleótidos nas extremidades 5' de uma região C, de cadeia P 47 e uma região C, de cadeia L de um anticorpo humano com uma sequência de reconhecimento da enzima de restrição apropriada em ambas as extremidades e cada ADNc é clonado de tal modo que seja expresso apropriadamente a montante dos genes que codificam a região C, de cadeia P e a região C de cadeia L do vector de expressão do anticorpo humanizado, tal como descrito antes em 2 (1), para assim construir um vector de expressão do anticorpo quimérico humano. Do mesmo modo, os ADNcs da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L de um anticorpo desejado de um animal não humano, são amplificados por RCP utilizando um ADN sintético com uma sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição apropriada em ambas as extremidades e cada uma delas pode ser clonada no vector de expressão de anticorpo humanizado, tal como descrito antes em 2 (1). (4) Construção do ADNc que codifica a região V do anticorpo

enxertado em RDC

Os ADNcs que codificam uma região V, de cadeia P e uma região V, de cadeia L de um anticorpo humano enxertado em RDC podem obter-se como se segue. Primeiro, seleccionam-se sequências de aminoácidos de FRs na região V, de cadeia P e na região V, de cadeia L de um anticorpo humano ao qual as sequências de aminoácidos das RDCs na região V, de cadeia P e na região V, de cadeia L de um anticorpo derivado de um anticorpo de um animal não humano estão enxertadas. Pode-se utilizar qualquer sequência de aminoácidos de FRs numa região V, de cadeia P e numa região V, de cadeia L de um anticorpo humano, desde que derivem de um ser humano. Os exemplos incluem sequências de aminoácidos de FRs numa região V, de cadeia P e numa região V, de cadeia L de anticorpos humanos registados na base de dados, tal como, no Protein Data Bank ou similares e as sequências de aminoácidos são comuns aos 48 subgrupos de FRs na região V, de cadeia P e na região V, de cadeia L de anticorpos humanos (sequências de proteínas de interesse imunológico, US Dept. Health and Human Services (1991)) e similares. Para produzir um anticorpo humano enxertado em RDC com uma potente activídade, seleccionam-se, preferencialmente, as sequências de aminoácidos que têm uma elevada homologia (pelo menos 60 % ou mais) com as sequências de aminoácidos de FRs de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L de um anticorpo alvo derivado de um animal não humano. Depois, as sequências de aminoácidos da RDCs de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L do anticorpo derivado de um animal não humano, são enxertadas nas sequências de aminoácidos de FRs de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L que tinham sido seleccionadas de um anticorpo humano, para produzir sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L de um anticorpo humano enxertado em RDC. As sequências de aminoácidos produzidas são convertidas nas sequências ADN tendo em conta a frequência de utilização do codão encontrado nas sequências de nucleótidos dos genes dos anticorpos (sequências de proteínas de interesse imunológico, US Dept. Health and Human Services (1991)) e produzem-se as sequências de ADN que codificam as sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L de um anticorpo humano enxertado em RDC. Sintetizam-se vários ADNs sintéticos com um comprimento de cerca de 100 nucleótidos e realiza-se neles uma RCP: Neste caso, prefere-se que em cada uma das cadeias P e das cadeias L em que se produzem os 6 ADNs sintéticos tenham em vista a eficiência da reacção de RCP e os comprimentos dos ADNs que podem ser sintetizados.

Além disso, podem ser facilmente clonados no vector de expressão de anticorpos humanizado, construído antes em 2 49 (1), por meio da introdução da sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição apropriada na extremidade 5' dos ADNs sintéticos presentes em ambas as extremidades. Depois da RCP, faz-se a clonagem do produto amplificado num plasmido, tal como, pBluescript SK(-) (fabricado pela Stratagene) ou similares e determinam-se as sequências de nucleótidos de acordo com o processo descrito antes em 2 (2), para se obter um plasmido que contenha as sequências de ADN que codificam a região V, de cadeia P e a região V, de cadeia L de um anticorpo humano enxertado em RDC desenhado. (5) Modificação da sequência de aminoácidos de região V, de

um anticorpo humano enxertado em RDC

Sabe-se que quando se produz um anticorpo humano enxertado em RDC por um enxertando simplesmente apenas RDCs numa região V, de cadeia P e numa região V, de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal não humano em PRs de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L de um anticorpo humano, a sua actividade de ligação ao antigénio é inferior à do anticorpo original derivado de um animal não humano (BIO/TECHNOLOGY, 9: 266 (1991)). Por esta razão, considera-se que vários resíduos de aminoácidos não estão apenas relacionados directa ou indirectamente com as RDCs mas também com as FRs no que respeita à actividade de ligação do antigénio na região V, de cadeia P e na região V, de cadeia L do anticorpo original derivado de um animal não humano e que se mudam para diferentes resíduos de aminoácidos das diferentes FRs na região V, de cadeia P e na região V, de cadeia L de um anticorpo humano. Para resolver este problema, em anticorpos humanos enxertados em RDC, entre as sequências de aminoácidos de FRs numa região V, de cadeia P e numa região V, de cadeia L de um anticorpo humano, identifica-se e modifica-se um resíduo de aminoácido que se relaciona 50 directamente com a ligação a um antigénio ou um resíduo de aminoácido que indirectamente se relaciona com a ligação a um antigénio, por interacção com um resíduo de aminoácido na RDC ou mantendo a estrutura tridimensional de um anticorpo, para um resíduo de aminoácido que se encontra no anticorpo original de um animal não humana para aumentar assim a actividade de ligação do antigénio que tinha diminuído (BIO/TECHNOLOGY, 9: 266 (1991)). Na produção de um anticorpo humano enxertado em RDC, a forma como se identificam eficientemente os resíduos de aminoácidos relacionados com a actividade de ligação do antigénio na FR é muitíssimo importante para que a estrutura tridimensional de um anticorpo seja construída e analisada por cristalografia por raio X (J. Mol. Biol., 112: 535 (1977)), por um modelo de computador (Protein Engineering, 7: 1501 (1994)) ou similares. Embora a informação sobre a estrutura tridimensional dos anticorpos tenha sido útil para a produção de um anticorpo humano enxertado em RDC, não se pode aplicar nenhum processo para a produção de um anticorpo humano enxertado em RDC a nenhum anticorpo pelo menos naquilo que foi estabelecido até à data. Por isso, várias tentativas têm sido feitas e são necessárias, por exemplo, vários anticorpos modificados de qualquer anticorpo são produzidos e a relação entre cada um dos anticorpos modificados e a actividade de ligação ao seu anticorpo é examinada. A modificação da sequência de aminoácidos seleccionada de Fr na região V, de cadeia P e na região V, de cadeia L de um anticorpo humano pode ser conseguida utilizando vários ADNs sintéticos para fazer a modificação de acordo com a RCP, tal como descrito antes em 2 (4). No que respeita ao produto amplificado obtido por RCP, determina-se a sequência de nucleótidos de acordo com o processo conforme descrito antes 51 em 2 (2) de tal modo que se possa confirmar a modificação objectiva realizada. (6) Construção de um vector humano de expressão de

anticorpos enxertado na RDC

Pode-se construir um vector humano de expressão de um anticorpo enxertado em RDC fazendo a clonagem de ADNcs que codificam a região V, de cadeia P e a região V, de cadeia L do anticorpo humano enxertado em RDC construindo antes em 2 (4) e em 2 (5) a montante dos genes que codificam a região C, de cadeia P e a região C, de cadeia L d o anticorpo humano no vector de expressão de anticorpos humanizado, tal como descrito antes em 2 (1).

Por exemplo, quando se introduzem sítios de reconhecimento para enzimas de restrição apropriadas no terminal 5' dos ADNs sintéticos posicionados em ambas as extremidades nos ADNs sintéticos utilizados na construção de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L do anticorpo humano enxertado em RDC nas 2 (4) e 2 (5) anteriores, pode realizar-se a clonagem de tal maneira que sejam expressos de uma forma apropriada a montante dos genes codificam a região C, de cadeia P e a região C, de cadeia L do anticorpo humano no vector humanizado de expressão do anticorpo, tal como descrito antes em 2 (1). (7) Expressão temporária de anticorpos humanizados

Para avaliar eficazmente a actividade de ligação do an-tigénio de vários anticorpos humanizados produzidos, os anticorpos humanizados podem ser expressos temporariamente utilizando o vector humanizado de expressão de anticorpos, tal como descrito antes em 2 (3) e 2 (6) ou o seu vector de 52 expressão modificado. Pode-se utilizar qualquer célula como célula hospedeira, desde que a célula hospedeira possa expressar um anticorpo humanizado. Geralmente, utiliza-se células COS-7 (ATCC CRL1651) tendo em vista a sua elevada quantidade de expressão (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, p. 283 (1991)). Exemplos do processo para a introdução do vector de expressão nas células COS-7 incluem um processo de DEAE-dextrano (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, p. 283 (1991)}, um processo de lipofecção (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 7413 (1987)} e similares.

Depois da introdução do vector, a quantidade de expressão e a actividade de ligação do antigénio do anticorpo humanizado no sobrenadante da cultura, pode ser determinada por um imuno-ensaio de enzimas (ELISA); Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press Limited (1996)) e similares. (8) Expressão estável de anticorpos humanizados

Um transformante que produz um anticorpo humanizado de forma estável pode obter-se por introdução de uma célula hospedeira apropriada, do vector humanizado de expressão de anticorpos descrito antes em 2 (3) e em 2 (6).

Exemplos do processo para a introdução do vector de expressão numa célula hospedeira incluem electroporação (pedido de patente de invenção japonesa publicada, não examinada N°. 257891/90, Cytotechnology, 3: 133 (1990)) e similares.

Pode-se utilizar qualquer célula como célula hospedeira, na qual se introduz o vector humanizado de expressão de anticorpos, desde que ela possa expressar um anticorpo huma- 53 nizado. Os exemplos incluem células SP2/Q-Agl4 de rato (ATCC CRL1581), célula P3X63-Ag8.653 de rato (ATCC CRL1580), célula CHO em que se detecta um gene de di-hidrof olato-redutase (daqui para a frente referenciado como "gene DHFR") (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77: 4216 (1980)), célula YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20 de rato (ATCC CRL1662, daqui para a frente referenciado como "célula YB2/0") e similares.

Uma célula hospedeira para a produção de um anticorpo que tem actividade citotóxica mediada pela célula e dependente do anticorpo é, preferencialmente, uma célula que tem uma actividade enzimática baixa ou que não tem nenhuma actividade enzimática relacionada com a reacção, à qual se adiciona fucose à N-acetilglicosamina ligada à região Fc do anticorpo .

Exemplos de uma enzima para adicionar a fucose à N-acetilglicosamina incluem enzimas relacionadas com a ligação al,6-, tal como, oíI, 6-fucosiltransferase, enzimas relacionadas com a biossintese de GDP-fucose, por exemplo, GDP-mano-se 4,β-desidratase, GDP-p-L-fucosepirofosforilase, fococinase e similares. De acordo com isto, as células obtendo submetendo células utilizadas como células hospedeiras a uma mutação artificial, em que o gene da enzima é eliminado ou o gene é mutado de forma a reduzir assim ou a eliminar a actividade da enzima, pode também ser utilizada como uma célula hospedeira.

Como célula hospedeira, pode-se utilizar qualquer célula de bactérias, leveduras, células de animais, células de insectos, células de plantas e similares, desde que o anticorpo recombinante possa ai ser produzido. Preferem-se as células de animais e os exemplos incluem células YB2/0, células de mieloma de rato, tal como, NSO e células SP2/0, 54 células de ovário de hamster chinês, tal como, células de OHC/dhfr e células OHC/DG44, células de macaco, tais como, células COS, células de mieloma humano, tais como, células de Namalwa e similares.

Um anticorpo que contenha a cadeia de açúcar ligada à região Fc do anticorpo que contém um elevado teor de cadeia de açúcar a N-glicósido, em que a fucose não se liga a N-acetilglicosamina, pode obter-se utilizando a célula hospedeira. 0 anticorpo mostra a actividade citotóxica mediada por células dependente do anticorpo maior contra as células que expressam CCR4 do que o anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma derivado de um animal não humano.

Depois da introdução do vector de expressão, os trans-formantes que expressam um anticorpo humanizado de forma estável seleccionam-se no processo descrito no pedido de patente de invenção japonesa publicada, não examinada N°. 257891/90, fazendo a cultura num meio para cultura de células de animais contendo um agente tal como sulfato G418 (daqui para a frente referenciando como "G418", fabricado pela Sigma) ou similares. Exemplos de meios para a cultura de células de animais incluem o meio PRMI1640 (fabricado pela Nissui Pharmaceutical), meio GIT (fabricado pela Nissui Pharmaceutical), meio EX-CELL302 (fabricado pela JRH), meio IMDM (fabricado pela GIBCO BRL}, meio de hibridoma-SFM (fabricado pela GIBCO BRL), meio obtido adicionando vários aditivos, tais como, SBF a estes meios e similares. O anticorpo humanizado pode ser produzido e acumulado num meio de cultura, fazendo as culturas dos transformantes seleccio-nados num meio. A quantidade de expressão e a actividade de ligação do antigénio do anticorpo humanizado no sobrenadante da cultura, pode ser media por ELISA ou similares. Também no transformante, a quantidade de expressão do anticorpo huma- 55 nizado pode ser aumentada utilizando um sistema de amplificação dhfr ou similar, de acordo com o processo descrito no pedido de patente de invenção japonesa publicada, não examinada N°. 257891/90. O anticorpo humanizado pode ser purificado a partir do sobrenadante da cultura do transformante utilizando uma coluna de proteina A (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capitulo 8 (1988), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press Limited (1996)). Também se pode utilizar qualquer método convencional para a purificação de proteínas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser purificado por uma combinação de filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, ultra-filtração e similares. O peso molecular da cadeia P ou da cadeia L do anticorpo humanizado, purificado ou da molécula de anticorpo no seu todo, é determinado por electroforese em gel de poliacrilamida (daqui para frente referenciado como "EGPA-SDC") [Nature, 227: 680 (1970)], Western blotting (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capitulo 12 (1988), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press Limited (1996)) e similares. (9) Avaliação da actividade do anticorpo humanizado

Pode-se determinar a reactividade de ligação a um anti-génio e a actividade de ligação a uma linha de células que expressam CCR4 do anticorpo humanizado, purificado, por ELISA, um processo imuno-fluorescente (Câncer Immuno Immunother., 36: 373 (1993)). A actividade citotóxica contra uma linha de células de cultura positiva do antigénio pode ser avaliada medindo a actividade de CDC, a actividade de 56 ADCC ou semelhante (Câncer Immunol. Immunother., 36: 373 (1993)). 3. Processo para a detecção e a determinação de CCR4 utilizando um anticorpo CCR4 A presente invenção tem por objecto um processo in vitro para a detecção imunológica e a determinação de CCR4 ou uma célula que expresse CCR4 na sua superfície, utilizando o anticorpo da presente invenção. 0 processo para a detecção imunológica e a determinação de CCR4 ou de uma célula que expresse CCR4 na sua superfície utilizando o anticorpo da presente invenção, inclui um processo imuno-fluorescente, um ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas (ELISA), ura imuno-ensaio radioactivo de material marcado (RIA), um processo de coloração imuno-histoquímico, tal como, um processo de coloração de imunócitos, um processo de coloração de imuno-tecidos, ou similares (processo ABC, processo CSA, etc.), o imuno-ensaio de enzimas anterior, uma sandwich ELISA (Monoclonal Antibody Experiment Manual (publicado por Kodansha Scientific, 1987), Segunda Série do Biochemical Experiment Course, Vol. 5, Iramunobiochemistry Research Method, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1986)). 0 processo imuno-fluorescente compreende a reacção de uma célula, tecido ou similar separados, com o anticorpo da presente invenção, reagindo o reagente com um anticorpo anti-imunoglobulina ou um fragmento de ligação marcado com uma substância fluorescente, tal como, isotiocianato de flúores-ceína (FITC) ou similar e depois medindo a substância fluorescente com um citómetro de fluxo. 57 0 ensaio imuno-absorvente ligado a uma enzima (ELISA) compreende a reacção de uma célula separada ou uma sua solução moída, um tecido ou uma sua solução moída, o sobrenadante de uma cultura de células, soro, fluido pleural, fluido de ascites, fluido ocular ou similares, com o anticorpo da presente invenção, reagindo o reagente com um anticorpo anti-imunoglobulina ou um fragmento de ligação marcado com uma enzima, tal como, peroxidase, biotina ou similares e depois medindo o corante desenvolvido resultante com um fotómetro de absorção. 0 imuno-ensaio de material radioactivo marcado (RIA) compreende a reacção de uma célula separada ou de uma sua solução moída, um tecido ou uma sua solução moída, um sobrenadante de cultura de células, soro, fluido pleural, fluido de ascites, fluido ocular ou similares com o anticorpo da presente invenção, reagindo ainda o reagente com um anticorpo anti-imunoglobulina ou um fragmento de ligação marcado com um radioisótopo e depois medindo a radio-actividade com um contador de cintilação ou similar. Os processos de coloração de imunócitos e os processos de coloração de imuno-tecidos compreendem a reacção de uma célula separada, um tecido ou similar com o anticorpo da presente invenção, reagindo o reagente com um anticorpo anti-imunoglobulina ou um fragmento de ligação marcado com uma substância fluorescente, tal como, isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou similar ou uma enzima, tal como, peroxidase, biotina ou similares e depois observando a célula, o tecido ou similares com um microscópio. A sanduíche de ELISA é um processo que compreende a absorção, numa placa, de um de dois anticorpos com um epítopo diferente entre os anticorpos da presente invenção; a marcação de outro anticorpo com uma substância fluorescente, tal 58 como, FITC ou similar ou uma enzima, tal como, peroxidase, biotina ou similares; a reacção de uma célula separada ou de uma sua solução moída, de um tecido ou de uma sua solução moída, do sobrenadante de culturas de células, soro, fluido pleural, fluido de ascites, fluido ocular ou similares, com a placa de absorção de anticorpos; e depois fazendo-a reagir com, o anticorpo marcado para realizar uma reacção de acordo com a substância marcada. 4. Diagnóstico e tratamento de doenças imunitárias ou cancros mediados por Th2

Dado que o anticorpo humanizado da presente invenção se liga especificamente a CCR4 e que é expresso numa linha de células de cultura e exibe actividade citotóxica, tal como, actividade de CDC, actividade de ADCC e similares, seria útil no diagnóstico e no tratamento de doenças mediadas por Th2 e similares. Também, que a proporção das sequências de aminoácidos derivadas de um anticorpo humano num anticorpo humanizado é superior à dos anticorpos num animal não humano, é de esperar que exiba uma forte actividade citotóxica no corpo humano, que não mostre imunogenicidade e os seus efeitos perdurem durante longo tempo.

Além disso, a produção de citocínas de Th2 que são produzidas por células, tais como, IL-4, IL-5, IL-13 e similares, pode ser inibida pela administração do anticorpo da presente invenção a células ou a tecidos de um indivíduo submetido a uma experiência, A célula Th2 utilizada na presente invenção é, preferencialmente, uma célula Th2 activada ou uma célula Th2 memória. Os exemplos específicos incluem células que têm propriedades de CD45RA- e CD4+. 59

As actividades citotóxicas do anticorpo recombinante da presente invenção são geradas, por exemplo, quando o anticorpo da presente invenção se liga a uma célula Th2 induzindo assim a apoptose na célula. Do mesmo modo, a célula pode ser obstruída e depletada pela indução de apoptose.

Também os exemplos do processo para o diagnóstico de doenças imunitárias ou de cancros mediados por Th2 incluem um processo em que a célula humana positiva para CCR4, que existem nas células ou nos tecidos de um indivíduo submetido a uma experiência são detectadas imunologicamente, tal como se descreveu antes. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser utilizado como um agente de diagnóstico para doenças imunitárias ou cancros mediados por Th2 ou doenças em que os estados mórbidos avançam devido a um aumento ou uma diminuição anormal das células Th2.

Além disso, dado que o anticorpo da presente invenção pode reduzir ou depletar as células que expressam CCR4 por meio da sua actividade citotóxica, ele pode fornecer um processo de diagnóstico ou um processo terapêutico para doenças imunitárias ou cancros mediados por Th2, que utilizam o anticorpo da presente invenção e agentes terapêuticos ou preventivos para doenças imunitárias ou cancros mediados por Th2, que compreendem o anticorpo da presente invenção como o ingrediente activo.

As doenças imunitárias mediadas por Th2 incluem, res-pectivamente, doenças inflamatórias ligeiras ou severas, tais como, hipersensibilidade aguda ou crónica das vias respiratórias ou asma brônquíca, doenças atópicas da pele, incluindo dermatite atópica, rinite alérgica, polinose (febre dos fenos) e similares; doenças causadas por células concorrentes de inflamação, tais como, eosinófilos, mastócitos e simila- 60 res, que se podem propagar ou ser activados por citocinas e quimiocinas libertadas das células Th2, moléculas funcionais sob o ponto de vistas biológico, tal como, IgE e similares, que são produzidas por citocinas e quimiocinas libertadas pelas células Th2 e similares; e doenças imunitárias em que os estados mórbidos avançam devido a alterações anormais nas células Th2. 0 anticorpo da presente invenção pode ser administrado isoladamente, mas em geral, prefere-se que seja administrado sob a forma de uma formulação farmacêutica produzida misturando-o com, pelo menos, um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, de acordo com um processo bem conhecido do domínio técnico dos produtos farmacêuticos. É preferível seleccionar uma via de administração que seja a mais eficaz para a realização do tratamento pretendido, tal como, administração oral ou administração paren-térica, por exemplo, administração intra-oral, administração traqueal, administração rectal, injecção subcutânea, injecção intramuscular, injecção intravenosa e similares. Prefere-se a injecção intravenosa num anticorpo ou formulação de péptidos. A forma posológica inclui aerossóis, cápsulas, comprimidos, grânulos, xaropes, emulsões, supositórios, injecções, pomadas, adesivos e similares.

Exemplos de formulações apropriadas para administração oral incluem emulsões, xaropes, cápsulas, comprimidos, pós, grânulos e similares.

Podem produzir-se preparações liquidas, tais como, emulsões e xaropes, utilizando aditivos, tais como, água; sacá-ridos, por exemplo, sacarose, sorbitol, frutose, etc.; gli- 61 cóis, por exemplo, polietileno-glicol, propileno-glicol, etc.; óleos, por exemplo, óleo de sésamo, azeite, óleo de soja, etc.; anti-sépticos, por exemplo, p-hidroxibenzoato, etc.; aromatizantes, por exemplo, aroma de morango, de hortelã-pimenta, etc.; e similares.

Podem produzir-se cápsulas, comprimidos, pós, grânulos e similares utilizando aditivos, tais como, cargas, por exemplo, lactose, glicose, sacarose, manitol, etc.; agentes de desintegração, por exemplo, amido, alginato de sódio, etc.; lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, etc.; ligantes, por exemplo, álcool de polivinilo, hidroxipropil-celulose, gelatina, etc.; tensioactivos, por exemplo, ésteres de ácidos gordos, etc.; plastificantes, por exemplo, glicerina, etc.; e similares.

Exemplos de formulações apropriadas para administração parentérica incluem injecções, supositórios, aerossóis e similares.

As injecções podem ser preparadas utilizando um veiculo, tal como, uma solução salina, uma solução de glicose, uma mistura de ambas ou similares.

Os supositórios podem ser preparados utilizando um veículo, tal como, manteiga de cacau, gordura hidrogenada, ácido carboxílico ou similares.

Também os aerossóis podem ser preparados a partir de um anticorpo ou do próprio péptido utilizando um veículo ou similar, que não estimule as membranas orais e as membranas mucosas das vias aéreas dos doentes e pode facilitar a absorção do anticorpo ou do péptido por dispersão como partículas minúsculas. 62

Exemplos de veículos incluem lactose, glicerina e similares. Consoante as propriedades do anticorpo ou do péptido e do veículo a ser utilizado, podem produzir-se aerossóis, pós secos e similares. Os aditivos exemplificados nas preparações orais podem também ser adicionados às preparações parentéricas. A dose e a frequência de administração variam consoante o efeito terapêutico pretendido, o processo de administração, o período de tratamento, a idade, o peso do corpo e similares, mas a dose é geralmente de 10 pg/kg a 8 mg/kg por dia, por adulto.

BREVE EXPLICAÇÃO DOS DESENHOS A Fíg. 1 é um desenho que mostra a reactividade de KM2160 com um composto de acordo com ELISA. A Fig. 2 é um desenho que mostra as etapas de construção dos plasmidos pKM2160VH41 e pKM2160VL61. A Fig. 3 é um desenho que mostra a etapa de construção do plasmído pKANTEX2160H. A Fig. 4 é um desenho que mostra a etapa de construção do plasmido pKANTEX2160. A Fig. 5 é um desenho que mostra um modelo de electroforese por EGPA-SDS (gradiente de gel de 5 a 20 %) de anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado, KM2760. O lado esquerdo mostra um resultado da electroforese realizado em condições de não redução e o lado direito em condições de redução. As colunas 1, 2, 3 e 4 mostram modelos de electroforese de marcadores de elevado peso molecular, 63 KM276Q, marcadores de baixo peso molecular, KM2760, respectivamente. A Fig. 6 é um desenho que mostra a actividade de um anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado, KM2760, para se ligar a um péptido parcial de CCR4, medido por alteração da concentração de anticorpo. A ordenada e a abcissa representam a actividade de ligação de CCR4 e a concentração do anticorpo, respectivamente. A Fig. 7 é um desenho que mostra a reactividade de KM2760 com as células que expressam em grande quantidade CCR4 (CCR4/EL-4), medida por um separador de células de activação de imunofluorescência. A Fig. 8 é um desenho que mostra a citotoxicidade pela actividade de ADCC para as células CCR4/EL-4 (parte superior do gráfico) e para as células EL-4 (parte inferior do gráfico). A Fig. 9 é um desenho que mostra a citotoxicidade pela actividade de ADCC para CMSP humanas, medida como uma relação positiva de anexina V em 4 fracções que têm capacidades de coloração diferentes de CD4 e de CD45RA. A Fig. 10 é um desenho que mostra o efeito de inibição da produção de IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ de CMSP humanas. A Fig. 11 é um desenho que mostra a reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, com as linhas de células T humanas de leucemia. A Fig. 12 é um desenho que mostra a citotoxicidade pelo anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, para as linhas de 64 células T humanas de leucemia, com reactividade com um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, foi confirmada. A Fig. 13 é um desenho que mostra as alterações das caracteristicas ao longo do tempo, numa quantidade de IL-4 produzida, quando se administrou um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, a Macaca fascícularis. A Fig. 14 é um desenho que mostra as alterações das caracteristicas ao longo do tempo, numa quantidade de IL-13 produzida, quando se administrou um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, a Macaca fascícularis. A Fig. 15 é um desenho que mostra as alterações das caracteristicas ao longo do tempo, numa quantidade de IL-γ produzida, quando se administrou um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, a Macaca fascícularis. A Fig. 16 é um desenho que mostra as alterações nas caracteristicas ao longo do tempo no valor médio dos volumes do tumor, quando um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, foi administrado a ratos cujas células derivadas de rato expressam em grande escala CCR4h, células CCR4/EL-4, que tinham sido enxertadas subcutaneamente. A Fig. 17 é um desenho que mostra a relação do valor médio dos volumes do tumor, num grupo em que se administrou o produto, em relação ao valor médio dos volumes do tumor num grupo a que não se administrou quando um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, foi administrado a ratos cujas células derivadas de rato expressam em grande escala CCR4h, células CCR4/EL-4, que tinham sido enxertadas subcutaneamente. 65 A Fig. 18 é um desenho que mostra as alterações nas características ao longo do tempo no valor médio dos volumes do tumor, quando um anticorpo quimérico anti-CCR4, KM2760, foi administrado a ratos cuja linha de células CCRF-CEM de células T humanas de leucemia (ATCC CCL-119) que expressam CCR4, que tinham sido enxertadas subcutaneamente.

ENQUADRAMENTOS PARA A REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO A seguir dão-se exemplos da presente invenção, mas a presente invenção não está limitada por eles.

Exemplo 1

Produção de células de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais anti-CCR4 de ratos:

Produziram-se células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal anti-CCR4, KM2160 (Int. Immunol., 11: 81 (1999)), de acordo com o seguinte processo. (1) Preparação do antigénio

Analisou-se a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°. 17) de CCR4 humano (daqui para a frente referenciado como "CCR4h") utilizando Genetyx Mac e seleccionou-se o composto 1 (SEQ ID N°. 1) como uma sequência parcial considerada apropriada como antigénio entre as porções que tinham uma elevada hidrofilicidade, o terminal N e o terminal C. Também se seleccionou uma porção da sequência de aminoácidos de uma proteína de CCR4 de rato (daqui para a frente referenciado como "CCR4r") (BBRC, 218: 337 (1996)) correspondendo ao composto 1, como composto 2 (SEQ ID N°. 2). As SEQ ID N°s. 1 66 e 2 correspondem às posições 2-29 dos aminoácidos de terminal C de CCr4 humano e CCr4 de rato, respectivamente.

As abreviaturas dos aminoácidos e os seus grupos de protecção utilizados na presente invenção foram utilizados de acordo com as recomendações da IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (European Journal of Biochemistry, 138: 9 (1984)). A menos que seja indicado de outra forma, as abreviaturas que se seguem representam os seguintes aminoácidos.

Ala: L-alanina Asn: L-asparagina Asp: ácido L-aspártico Asx: ácido L-aspártico ou Cis: L-cisteina Gin: L-glutamina Glu: Ácido L-glutâmico Glx: ácido L-glutâmico ou Gli: glicina Ile: L-isoleucina Leu: L-leucina Lis: L-lisina Met: L-metionina Fen: L-fenilalanina Pro: L-prolina Ser: L-serina Tre: L-trionina Tir: L-tirosina Vai: L-valina L-asparagina L-glutamina 67

As abreviaturas que se seguem representam grupos de protecção dos correspondentes amínoácidos e aminoácidos de protecção de cadeias laterais.

Fmoc: tBu: Trt: Boc: Fmoc-Tre(tBu)-OH: Fmoc-Ser(tBu)-OH: Fmoc-Tir(tBu)-OH: Fmoc-Lis(Boc)-OH: Fmoc-Asn(Trt)-OH: Fmoc-Gln(Trt}-OH: Fmoc-Asp(OtBu)-OH:

Fmoc-Glu(OtBu)-OH:

Fmoc-Cys(Trt)-OH: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo t-butilo tritilo t-butiloxicarbonilo Να-9-fluorenilmetiloxicarbonil-O-t-butil-L-trionina Να-9-fluorenilmetiloxicarbonil-O-t-butil-L-serina Να-9-fluorenilmetiloxicarbonil-O-t- butil-L-tírosina Να-9-fluorenilmetiloxicarbonil-Ns-t- butiloxicarbonil-L-lisina Να-9-fluorenilmetiloxicarbonil-Νγ- tritil-L-asparagina

Na-9-fluorenilmetiloxicarbonyl-N5- tritil-L-glutamina éster β-t-butílico do ácido Na-9-fluorenilmetiloxicarbonil-L-aspárti- co éster γ-t-butílico do ácido Noí-9- fluorenilmetiloxicarbonil-L-glutâmi- co Να-9-fluorenilmetiloxicarbonil-S-tritil-L-cisteina

As abreviaturas que se seguem representam os os reagentes da reacção e os dissolventes da reacção correspondentes. 68

PiBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitri- pirrolidinofosfónio HOBt: N-hidroxibenzotriazole

DMF

DCM N,N-dimetilformamida diclorometano

TFA

NMM

DTT ácido trifluoroacético N-metilmorfolina ditiotreitol (i) Síntese do composto 1 (SEQ ID N°. 1) (H-Asn-Pro-Tre-Asp-Ile-Ala-Asp-Tre-Tre-Leu-Asp-Glu-Ser-Ile-Tir-Ser-Asn-Tir-Tír-Leu-Tir-Glu-Ser-Ile-Pro-Lis-Pro-Cis-OH)

Num reactor de um sintetizador automático (fabricado pela Shimadzu), colocou-se 30 mg de uma resina veicular (reina de clorotritilo, fabricada pela AnaSpec) à qual se tinham ligado 16,8 pmole de H-Cis(Trt), adicionou-se 1 mL de DCM/DMF (1:1), seguido de agitação durante 10 minutos, escorreu-se a solução, adicionou-se mais 1 mL de DMF, seguido de agitação durante 1 minuto, escorreu-se a solução e depois realizou-se o seguinte processo de acordo com o programa de síntese dado pela Shimadzu. (a) Agitou-se Fmoc-Pro-OH (168 pmole), PiBOP (168 pmole), HoBt'lH20 (168 pmole) e NMM (252 pmole), no seio de DMF (588,2 pL) , durante 5 minutos, adicionou-se a solução resultante à resina, seguida de agitação durante 60 minutos e depois escorreu-se a solução. (b) Lavou-se a resina veicular durante 1 minuto com 707 pL de DMF e repetiu-se esta etapa 5 vezes. Desta forma, sintetizou-se Fmoc-Pro-Cis(Trt) no veículo. 69

Em seguida, realizaram-se as etapas de desprotecção do grupo Fmoc. (c) Adicionou-se 707 pL de uma solução de piperidina- DMF a 30 %, seguida de agitação durante 4 minutos e depois escorreu-se a solução e repetiu-se este processo novamente. (d) Lavou-se a resina veicular durante 1 minuto com 707 pL de DMF e depois escorreu-se a solução e repetiu-se esta etapa 5 vezes.

Desta forma, obteve-se a resina veicular à qual tinha estado ligado H-Pro~Cis(Trt} eliminado do grupo Fmoc.

Em seguida, realizou-se uma reacção de condensação na etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Lis(Boc)-OH e depois sintetizou-se Η-Lis(Boc)-Pro-Cis(Trt) no veículo por via da etapa de lavagem da alinea (b) e as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d) . Em seguida, repetiram-se as etapas de (a) a (d) utilizando Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tir(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tir(tBu)-OH e Fmoc-Tir(tBu)-OH, nesta ordem, na etapa da alínea (a). Em seguida, realizou-se a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Asn(Trt)-OH, realizou-se a etapa de lavagem da alínea (b), a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Asn(Trt)-OH e a etapa de lavagem da alínea (b) foi repetida e depois realizaram-se as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d) . Em seguida, repetiram-se as etapas de (a) a (d) utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tir(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH e Fmoc-Asp(OtBu)-OH, nesta ordem. Em seguida, realizou-se a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Leu-OH, realizou-se a etapa de lavagem da 70 alínea (b), a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Leu-OH e a etapa de lavagem da alínea (b) foi repetida e depois realizaram-se as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d) . Em seguida, repetiram-se as etapas de reacção de condensação das alíneas (a) e (b) , duas vezes, utilizando Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH and Fmoc-Asn(Trt)-OH, nesta ordem, na etapa da alínea (a) e realizaram-se as etapas de desprotecção de (c) e (d) e depois, após a repetição de uma série destas etapas, lavou-se a mistura com etanol e éter de butilo, por esta ordem e secou-se a pressão reduzida durante 12 horas, para se obter a resina veicular à qual se tinha ligado um péptído protegido na cadeia lateral. Adicionou-se-lhe uma solução mista (1 mL) de TFA (90 %), tioanisole (5 %) e 1,2-etanoditiol (5 %) e incubou-se à temperatura ambiente, durante 2 horas para eliminar os grupos de protecção da cadeia lateral e simultaneamente cortar o péptido da resina. Depois da eliminação da resina por filtração, adici.onou-se cerca de 10 mL de éter à solução resultante e assim formou-se um precipitado que se recuperou por centrifugação e decantação e se secou a pressão reduzida, para se obter 63,7 mg do péptido impuro. Dissolveu-se o produto impuro no seio de 2 mL de DMF, na presença de 60 mg de DTT e depois purificou-se por CLER utilizando uma coluna de fase inversa (CAPCELL PAK C18, 30 mm I.D. x 25 mm, fabricada pela

Shiseido). Realizou-se a eluição de acordo com um processo de gradiente de densidade linear em que se adicionou uma solução aquosa de acetonitrilo a 90 %, contendo TFA a 0,1 % a uma solução aquosa de TFA a 0,1 % e realizou-se a detecção a 220 nm para se obter uma fracção contendo o composto 1. Depois da liofilização desta fracção, obteve-se 2,5 mg do composto 1.

Espectometria de massa (FAB EM): m/z = 3.227,5 (M+H+) 71

Análise dos aminoácidos: Asx 4,8 (5), Glx 2,7 (2), Ser 3,1 (3), Tre 2,0 (3), Ala 1,1 (1), Pro 3,1 (3), Tir 3,8 {4), Leu 2,2 (2), Lis 1,2 (1), Ile 3,0 (3), Cis 1,2 (1) (ii) Síntese do composto 2 (SEQ ID N°. 2) (H-Asn-Ala-Tre-Glu-

Val-Tre-Asp-Tre-Tre-Gln-Asp-Glu-Tre-Val-Tir-Asn-Ser-Tir-

Fen-Tir-Glu-Ser-Met-Pro-Lis-Pro-Cis-OH)

Utilizando 50 mg de uma resina veicular (resina de clo-rotritilo, fabricada pela AnaSpec) à qual se tinha ligado 28,0 pmole de H-Cis(Trt) como material inicial, repetiram-se as etapas das alíneas (a) a (d) utilizando Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lis(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,

Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tir(tBu)-OH, Fmoc-Fen-OH, Fmoc-Tir(tBu)-OH e Fmoc-Tir(tBu)-OH, por esta ordem, na etapa (a) na mesma maneira que na alínea (i). Em seguida, realizou-se a reacçâo de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH, realizou-se a etapa de lavagem da alínea (b) , a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH e a etapa de lavagem da alínea (b) foi repetida e depois realizaram-se as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d). Em seguida, realizou-se a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Asn(Trt)-OH, realizou-se a etapa de lavagem da alínea (b) , a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Asn (Trt) -OH e a etapa de lavagem da alínea (b) foi repetida e depois realizaram-se as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d) . Em seguida, repetiram-se as etapas de (a) a (d) utilizando Fmoc-Tir(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH e Fmoc-Asp(OtBu)-OH, por esta ordem. Em seguida, realizou-se a reacção de condensação da etapa da alínea (a) utilizando Fmoc-Gln(Trt)-OH, realizou- 72 se a etapa de lavagem da alinea (b), a reacção de condensação da etapa da alinea (a) utilizando Fmoc-Gln(Trt)-OH e a etapa de lavagem da alinea (b) foi repetida e depois realizaram-se as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d) . Em seguida, repetiram-se as etapas da reacção de condensação das alíneas (a) e (b) utilizando Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH and Fmoc-Asn(Trt)-OH, por esta ordem, na etapa da alínea (a) e realizaram-se as etapas de desprotecção das alíneas (c) e (d) e depois após repetição de uma série destas etapas, lavou-se a mistura e secou-se, para se obter a resina veicular à qual esta ligada um péptido protegido na cadeia lateral. Obteve-se um péptido impuro (96,3 mg) por eliminação dos grupos de protecção da cadeia lateral e cortou-se o péptido da resina da mesma maneira que na alínea (i) e purificou-se um pouco mais por CLER utilizando uma coluna de fase inversa, para se obter 5,8 mg do composto 2.

Espectometria de Massa (TOF EM): m/z = 3.297,7 (M+H+)

Análise dos amínoácidos: Asx 4,1 (4), Glx 4,3 (4), Ser 2,0 (2), Tre 4,6 (5), Ala 1,0 (1), Pro 2,2 (2), Tir 3,9 (4), Vai 1,9 (2), Met 1,0 (1), Fen 1,0 (1), Lis 1,1 (1), Cis 1,1 (1) (2) Preparação do imunogénio O péptido parcial de CCR4h obtido no exemplo 1 (1) foi utilizado como o imunogénio depois da preparação do seu conjugado com KLH (Calbiochem) seguindo o processo de modo a aumentar a sua imunogenicidade. Isto é, dissolveu-se KLH em SBF para se obter 10 mg/mL e adicionou-se-lhe, gota a gota, um volume de 1/10 de 25 mg/mL de MBS (Nakalai Tesque), seguido de agitação durante 30 minutos. Eliminou-se o MBS livre por meio de uma coluna de filtração em gel, tal como, uma coluna Sephadex G-25, que tinha sido equilibrada antes com 73 SBF ou similar e misturou-se 2,5 mg de KLH-MB resultante com 1 mg do péptido dissolvido em tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0), seguido de agitação à temperatura ambiente, durante 3 horas. Depois da reacção, fez-se uma diálise da mistura contra SBF. (3) Imunização do animal e produção das células que produzem o anticorpo

Administrou-se 100 pg do conjugado de péptido KLH preparado no exemplo 1 (2) a ratos fêmeas (Balb/c) com 5 semanas de idade, em conjunto com 2 mg de gel de alumínio e 1 x 109 células de vacina pertussis (fabricado pelo Chiba Serum Institute) e, 2 semanas mais tarde, administrou-se 100 pg do conjugado uma vez por semana, num total de 4 vezes. Recolheu-se uma amostra de sangue de cada animal a partir do plexus venoso do fundo do olho, examinou-se o tipo do seu soro por um imuno-ensaio de enzima descrito a seguir e retirou-se o baço 3 dias depois da imunização final de um rato que exibiu um titulo de anticorpo suficiente. O baço foi excisado de um rato no 3o dia após a administração final e foi cortado em peças em MEM (fabricado pela Missui Pharmaceutical) e desligaram-se as células utilizando um par de tenazes e centrifugou-se (1.200 rpm, 5 minutos), eliminou-se o sobrenadante, seguido de tratamento com 3 mL de um tampão de Tris-cloreto de amónio (pH 7,65), durante 1 a 2 minutos, para eliminar os eritrócitos. As células remanescentes foram ainda lavadas três vezes com MEM e utilizadas para a fusão das células. (4) Preparação de células de mieloma de rato

Fez-se uma cultura de uma linha de células de mieloma de rato resistente a 8-azaguanina, P3X63Ag8U.l (ATCC CRL-1597, 74 daqui para a frente referenciada como "P3-U1") e utilizou-se como a linha parental na fusão das células. (5) Preparação de células de hibridoma

Misturaram-se as células de baço e as células de mieloma obtidas no exemplo 1 (3) e (4), numa relação de 10:1, seguida de centrifugação (1.200 rpm, 5 minutos), para eliminar o sobrenadante, adicionou-se 0,5 mL de uma solução de poli-etileno-glicol (uma solução contendo 2 g de polietileno-glicol-1000, 2 mL de MEM e 0,7 mL de DMSO) às células assim precipitadas por 108 de células de baço, em condições de 37 °C, seguida de uma suspensão cuidadosa. Depois, adicionou-se várias vezes 1 a 2 mL de MEM a intervalos de 1 a 2 minutos e ajustou-se o volume final para 50 mL com MEM. Depois da eliminação do sobrenadante por centrifugação (900 rpm, 5 minutos), fez-se a suspensão do precipitado no seio de 100 mL de meio HAT, distribuiu-se em 100 pL/cavidade numa placa microtituladora de 96 (fabricada pela Sumitomo Bakelite), seguido da cultura numa incubadora com C02 a 5 %, a 37 °C, durante 10 a 14 dias. Utilizando cavidades nas quais se observou a propagação das células fundidas, mediu-se a actividade de ligação para o péptido parcial de CCR4h (composto 1} no sobrenadante da cultura, pelo processo ELISA descrito em 2 (3) do exemplo 2. Cada cavidade na qual a actividade foi confirmada, foi clonada para um total de 2 vezes a diluição limite, mudando-se uma vez o meio para o meio HT e depois mudando o meio para o meio normal. Desta forma, obteve-se uma célula de hibridoma KM2160, que produz o anticorpo de rato KM2160. Tal como se mostra na Fig. 1, KM2160 reagiu especificamente com o péptido parcial de CCR4h (composto 1) . 75

Exemplo 2

Preparação do anticorpo quimérico anti-CCR4: 1. Isolamento e análise do ADNc, que codifica a região V do anticorpo de rato anti-CCR4: (1) Preparação do ARNm de células de hibridoma que produzem anticorpo de rato anti-CCR4

Preparou-se um ARNm a partir de células de hibridoma KM2160 descritas no exemplo 1. Preparou-se cerca de 48 pg de ARNm a partir de 8 x 107 das células de hibridoma KM2160, utilizando um kit de preparação de ARNm, o kit de isolamento de ARNm Fast Track (fabricado pela Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. (2) Produção da biblioteca de ADNc de cadeia P e de cadeia L do anticorpo de rato anti-CCR4

Sintetizou-se ADNc tendo adaptadores de EcoRI-Wotl em ambos os terminais a partir de 5 pg do ARNm de KM2160 obtido em 1 (1) do exemplo 2, utilizando o kit de síntese de ADNc (fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc assim preparado foi dissolvido no seio de 20 pL de água esterilizada e fraccionado por electroforese em gel de agarose e recuperou-se cerca de 1,5 kb de fragmentos de ADNc correspondentes à cadeia P do anticorpo do tipo IgG e cerca de 1,0 kb de fragmentos de ADNc correspondentes à cadeia L do tipo k, respectivamente, utilizando o kit de extracção de gel QIAquick (fabricado pela QIAGEN). Em seguida, utilizando o kit de vector tratado com EcoRI/CIAP pré-digerido com ÀZAPII (fabricado pela Stratagene) , cada 0,1 pg de cerca de 1,5 kb 76 de fragmentos de ADNc e 0,1 μg de cerca de 1,0 kb de fragmentos de ADNc foram ligados a 1 pg do vector ÀZAPII, que tinha sido digerido com uma enzima de restrição EcoRI e a que se tinha desfosforilado o terminal com fosfatase alcalina de intestino de bovino, de acordo com as instruções do fabricante. Embalou-se uma porção de 2,5 pL de cada solução reaccional após a ligação no fago λ utilizando o extracto de embalamento GigapacklII Gold (fabricado pela Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante e depois infectou-se a linha de Escherichia coli XLl-Azul (Biotechniques, 5: 376 (1987)) com uma quantidade apropriada do fago, para se obter 9,3 x 1Q4 de clones de fago como a biblioteca de ADNc de cadeia P, de KM2160 e 7,4 x 104 de clones de fago como a biblioteca de ADNc de cadeia L. Depois, fixou-se cada fago num filtro com membrana de nylon Hybond-N+ (fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante. (3) Clonagem dos ADNcs de cadeia P e de cadeia L de anticorpo de rato anti-CCR4

Utilizando um sistema de detecção e de marcação directa de ácidos nucleicos ECL (fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech), de acordo com as instruções do fabricante, detectaram-se clones nos filtros da membrana de nylon da biblioteca de ADNc de cadeia P de KM2160 e da biblioteca de ADNc de cadeia L preparados em 1 (2) do exemplo 2, utilizando o ADNc da região C de um anticorpo de rato (a cadeia P é um fragmento BamHI-EcoRI de ADNc de Cyl de rato (EMBO J., 3: 2047 (1984)), a cadeia L é um fragmento de Hpal-EcoRI do ADNc de Ck (Cell, 22: 197 (1980)) como a sonda e obtiveram-se os clones de fago fortemente ligados à sonda como 10 clones por cada cadeia P e cadeia L. Em seguida, cada clone de fago foi convertido num plasmido pelo processo de incisão ín vivo, 77 utilizando um kit de clonagem de XZAPII, de acordo com as instruções do fabricante (fabricado pela Stratagene). Utilizando um kit de reacção rápida de FS de sequenciação do sítio terminador BigDye (fabricado pela PE Biosystems), obteve-se a sequência de nucleótidos do ADNc contido em cada plasmido desta maneira foi analisado por meio de um sequenciador de ADN ABI PRISM 377 do mesmo fabricante, de acordo com as instruções do fabricante. Como resultado, obteve-se um plasmido pKM2160H4 contendo um ADNc de cadeia P funcional de comprimento completo e um plasmido pKM2160L6 contendo o ADNc de cadeia L de comprimento completo, em que uma sequência ATG considerada como sendo um codão de iniciação está presente na extremidade 5/ do ADNc. (4) Análise da sequência de aminoácidos da região V do anticorpo de rato anti-CCR4

Uma sequência completa de nucleótidos da região V, de cadeia P contida no plasmido pKM2160H4, uma sequência completa de aminoácidos da região V, de cadeia P dela deduzida, uma sequência de nucleótidos completa da região V, de cadeia L contida no plasmido pKM2160L6 e uma sequência completa de aminoácidos da região V, de cadeia L dela deduzida, estão ilustradas nas SEQ ID N°. 3, 15, 4 e 16, respectivamente. Também há muitas sequências de nucleótidos que correspondem às sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 15 e 16 para além das representadas nas SEQ ID N°s. 3 e 4 e todas elas estão incluídas dentro do âmbito da presente invenção. Com base na comparação com dados de sequências de anticorpos conhecidos de ratos (Sequences of

Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)) e a comparação dos resultados das análises das sequências de aminoácidos de terminal N de cadeia e de cadeia L do anticorpo KM2160 de rato, anti-CCR4 purificado 78 utilizando um sequenciador de proteína (PPSQ-10, fabricado pela Shimadzu), verificou-se que cada ADNc assim isolado é um ADNc de comprimento completo, que codifica o anticorpo KM2160 de rato anti-CCR4, contendo sequências de sinal segregadoras, que são aminoácidos das posições 1-19 na sequência de amínoácidos mostrada na SEQ ID N°. 15 na cadeia P e aminoácidos nas posições 1-19 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 16 na cadeia L.

Em seguida, examínou-se a novidade das sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e de cadeia L do anticorpo KM2160 de rato anti-CCR4. Utilizando o pacote GCG (versão 9.1, fabricado pela Genetics Computer Group) como o sistema de análises de sequências, pesquisou-se a base de dados de sequências de aminoácidos de proteínas conhecidas pelo processo BLAST (Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997)). Como resultado, não se encontraram sequências completamente coincidentes para ambas as cadeias P e L, por isso, ficou confirmado que a região V, de cadeia P e a região V, de cadeia L do anticorpo KM2160 de rato anti-CCR4 são novas sequências de aminoácidos.

Também se identificaram as RDCs da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L do anticorpo KM2160 de rato anti-CCR4 comparando-as com sequências de aminoácidos de anticorpos conhecidos. As sequências de aminoácidos de RDC1, RDC2 e RDC3 na região V, de cadeia P do anticorpo KM2160 de rato anti-CCR4, estão identificadas, respectivamente, nas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7, respectivamente e as sequências de aminoácidos de RDC1, RDC2 e RDC3 na região V, de cadeia L nas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente. 79 2. Expressão estável de anticorpo quimérico anti-CCR4 utilizando células de animais (1) Construção do vector de expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 pKANTEX2160

Construiu-se um vector de expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 pKANTEX2160 como se segue, utilizando um vector de expressão de anticorpo humanizado pKANTEX93, que expressa IgGl humana e um anticorpo do tipo κ e obtiveram-se os plasmidos pKM2160H4 e pKM2160L6 obtidos em 1 (3) do exemplo 2.

Desenhou-se um ADN sintético com as sequências de nucleótidos indicadas nas SEQ ID N°s. 11 e 12 de modo a obter o ADNc da região V, de cadeia P de KM2160 por RCP e outro ADN sintético com as sequências de nucleótidos mostradas nas SEQ ID N°s. 13 e 14 de modo a obter o ADNc da região V, de cadeia L. Cada ADN sintético contém uma enzima de restrição, que reconhece a sequência na sua extremidade 5' para a sua clonagem em pKANTEX93 e a síntese do ADN foi confiada à Genset Inc. 0 plasmido pKM2160H4 (20 ng) obtido em 1 (3) no exemplo 2, foi adicionado a um tampão contendo 50 pL de tampão #1 de RCP ligado ao KOD ADN Polimerase (fabricado pela T0Y0B0) , dNTPs 0,2 mM, cloreto de magnésio 1 mM e 0,5 μΜ de ADN sintético com as sequências de nucleótidos representadas pelas SEQ ID N°. 11 e 12 e aqueceu-se a mistura a 94 °C, durante 3 minutos. Depois de se adicionarem 2,5 unidades de KOD ADN Polimerase (fabricado pela TOYOBO), submeteu-se a mistura a 25 ciclos da reacção, incluindo cada ciclo aquecimento a 94 °C,. durante 30 segundos, a 58 °C, durante 30 segundos e a 74 °C, durante 1 minuto, utilizando um ciclizador térmico de ADN GeneAmp RCP System 9600 (fabricado pela PERKIN ELMER) . Da mesma maneira, obteve-se 20 ng do 80 plasmido pKM2160L6 obtido em 1 (3) no exemplo 2, foi adicionado a um tampão contendo 50 pL de tampão #1 de RCP ligado ao KOD ADN Polimerase (fabricado pela TOYOBO), dNTPs 0,2 mM, cloreto de magnésio 1 mM e 0,5 μΜ de ADN sintético com as sequências de nucleótidos representadas pelas SEQ ID N°. 13 e 14 e a realizou-se a RCP da mesma maneira que se descreveu antes. A solução reaccional (10 pL) foi submetida a electroforese de gel de agarose e depois recuperou-se cada um dos produtos de RCP da região V, de cadeia P de cerca de 0,46 kb e um produto de RCP da região V, de cadeia L de cerca de 0,43 kb utilizando o kit de extracção em gel QIAquick (fabricado pela QIAGEN).

Em seguida, adicionou-se 0,1 pg do ADN obtido por digestão de um plasmido pBluescript SK(-) (fabricado pela Stratagene) com uma enzima de restrição Smal (fabricado pela Takara Shuzo) e cerca de 0,1 pg de cada um dos produtos da RCP obtidos antes, para se obter 7,5 pL num volume final de água esterilizada e adicionou-se 7,5 pL da solução I do kit de ligação de ADN da TAKARA Versão 2 (fabricado pela Takara Shuzo} e 0,3 pL de uma enzima de restrição SmaI e deixou-se a mistura reagir a 22 °C, durante a noite. Utilizando a solução ADN do plasmido recombinante resultante, transformou-se DH5oí de E. coli (fabricado pela TOYOBO) . Preparou-se cada ADN de plasmido a partir de clones de transformantes e submeteu-se a uma reacção utilizando um kit de reacção imediata FS de sequenciação do ciclo de terminador BigDye (fabricado pela PE Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e analisou-se a sequência de nucleótidos por meio de um sequenciador de ADN ABI PRISM 377 do mesmo fabricante. Assim, os plasmidos pKM2160VH41 e pKM2160VL61 mostrados na Fig. 2, com as sequências de nucleótidos desejados, foram obtidos. 81

Em seguida, adicionou-se 3 pg do vector de expressão do anticorpo humanizado pKANTEX93 e 3 pg de pKM2160VH41 obtido antes, a um tampão contendo 30 pL de Tris-HCl 10 roM (pH 7,5), cloreto de magnésio 10 mM e DTT 1 mM, adicionou-se 10 unidades de uma enzima de restrição Apal (fabricado pela Takara Shuzo) e deixou-se a mistura reagir a 37 °C, durante 1 hora. Submeteu-se a solução reaccional a precipitação em etanol e adicionou-se o precipitado resultante a um tampão contendo 10 pL de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloreto de sódio 100 mM, cloreto de magnésio 10 mM, DTT 1 mM, 100 pg/mL de ASB e Triton X-100 a 0,01 %, adicionou-se 10 unidades de uma enzima de restrição No ti (fabricado pela Takara Shuzo) e deixou-se a mistura reagir a 37 °C, durante 1 hora. Fraccionou~se a mistura reaccional por electroforese em gel de agarose e recuperou-se cerca de 12,75 kb e cerca de 0,44 kb de fragmentos de Apal-No ti de pKANTEX93 e pKM2160VH41, respectivamente. Os dois fragmentos assim obtidos foram ligados utilizando um kit de ligação de ADN da TAKARA Versão 2, de acordo com as instruções do fabricante e transformou-se DH5a de E. coli (fabricado pela TOYOBO), utilizando a solução de ADN do plasmido recombinante. Cada ADN de plasmido foi preparado a partir de clones de transformante e confirmado por um tratamento com enzima de restrição, para se obter assim o plasmido pKANTEX2160H mostrado na Fig. 3, em que se tinha inserido cerca de 0,44 kb do fragmento desejado de Apal-NotI.

Em seguida, adicionou-se 3 pg do pKANTEX2160H e 3 pg do pKM2160VL61 obtidos antes a um tampão contendo 30 pL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloreto de sódio 100 mM, cloreto de magnésio 10 mM e DTT 1 mM e 100 pg/mL de ASB, ajustou-se a solução para se obter um volume total de 30 pL, adicionou-se 10 unidades de uma enzima de restrição BsiWI (fabricado pela New England Biolabs) e deixou-se a mistura reagir a 55 °C, 82 durante 1 hora. Depois, adicionou-se a enzima de restrição EcoRI (fabricado pela Takara Shuzo) e deixou-se a mistura reagir a 37 °C, durante 1 hora. Fraccionou-se a mistura reaccional por electroforese em gel de agarose e recuperou-se cerca de 13,20 kb e cerca de 0,41 kb de fragmentos de EcoRI-BsiWI de pKANTEX2160H e pKM2160VL61, respectivamente. Os dois fragmentos assim obtidos foram ligados utilizando um kit de ligação de ADN da TAKARA Versão 2, de acordo com as instruções do fabricante e transformou-se DH5a de E. coli (fabricado pela TOYOBO), utilizando a solução de ADN do plasmido recombinante resultante. Cada ADN de plasmido foi preparado a partir de clones de transformante e confirmado por um tratamento com enzima de restrição, para se obter assim o plasmido pKANTEX2160 mostrado na Fig. 4, em que se tinha inserido cerca de 0,41 kb do fragmento desejado de EcoRI-BsiWI. Quando se submeteu o plasmido a uma reacção utilizando um kit de reacção imediata FS de sequenciação do ciclo de terminador BigDye (fabricado pela PE Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante e analisou-se a sequência de nucleótidos por meio de um sequenciador de ADN ABI PRISM 377 do mesmo fabricante, confirmou-se que o plasmido desejado no qual o ADNc que codifica KM2160 da região V, de cadeia P e de cadeia L que tinha sido clonado, tinha sido obtido. (2) Expressão estável de anticorpo quimérico anti-CCR4 utilizando células de animais O anticorpo quimérico anti-CCR4 foi expresso em células de animais, conforme se descreve a seguir utilizando o vector de expressão de anticorpo quimérico anti-CCR4 pKANTEX2160 obtido em 2 (1) do exemplo 2. 83

Converteu-se o plasmido pKANTEX2160 de uma forma linear por digestão de uma enzima de restrição Aatll (fabricado pela TOYOBO) e introduziu-se 10 pg do plasmido em 4 x 106 da linha de células de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL1662} por electroporação (Cytotechnology, 3: 133 (1990)) e suspenderam-se as células no seio de 40 mL do meio de H-SFM (fabricado· pela GIBCO-BRL) (complementado com SBF a 5 %) e distribuído em 200 pL/cavidade numa placa microtituladora de 96 cavidades (fabricado pela Sumitomo Bakelite). Vinte e quatro horas após a incubação a 37 °C numa incubadora com CO2 a 5 %, adicionou-se G418, para se obter uma concentração de 1 mg/mL, seguida de uma cultura durante 1 a 2 semanas. Recuperou-se o sobrenadante da cultura a partir de uma cavidade, na qual apareceu uma colónia do transformante resistente a G418 e que se tornou confluente e mediu-se a actividade de ligação do antigénio do anticorpo quimérico anti-CCR4 no sobrenadante por ELISA mostrada em 2 (3) do exemplo 2 (utilizou-se como anticorpo secundário um anticorpo de IgG(y) anti-humano de cabra marcado com peroxidase).

Para aumentar a quantidade de anticorpo expressa, utilizando um sistema de amplificação de gene de dhfr, fez-se uma suspensão do transformante de uma das cavidades em que a expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 tinha sido verificada na cultura, para se obter uma densidade de 1 a 2 x 103 células/mL em meio H-SFM contendo 1 mg/mL de G418 e metotrexato 50 nM (daqui para a frente referenciado como "MTX": fabricado pela Sigma) , que é o iníbidor de um di-hidrofolato-reductase do produto do gene de dhfr (daqui para a frente referenciado como "DHFR") e distribuiu-se a suspensão em volumes de 1 mL das cavidades de uma placa de 24 cavidades (fabricado pela Greiner). Fez-se a cultura da mistura a 3 7 °C, durante 1 a 2 semanas, numa incubadora com uma atmosfera de CO2 a 5 %, de modo a que fosse induzido o 84 transformante que exibiu resistência a MTX 50 nM. Quando o transformante se tornou confluente numa cavidade, mediu-se a actividade de ligação do antigénio, do anticorpo quimérico anti-CCR4 no sobrenadante da cultura, por meio de ELISA, mostrado em 2 (3) do exemplo 2. No que respeita aos transformantes nas cavidades em que se verificou a expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 nos sobrenadantes da cultura, a concentração de MTX foi aumentada até 100 nM e depois até 200 nM da mesma maneira, para se obter finalmente um transformante que podia crescer num meio H-SFM contendo 1 mg/mL de G418 e 200 nM de MTX e podia também expressar fortemente o anticorpo quimérico anti-CCR4. O transformante assim obtido foi submetido a um simples isolamento de células (clonagem), por duas vezes, por um ensaio de diluição limitada e o clone de transformante que tinha a mais elevada expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 foi designado por KM2760. A quantidade expressa do anticorpo quimérico anti-CCR4 pelo KM2760 foi de cerca de 5 pg/106 células/24 horas. Além disso, a região C, de cadeia P do anticorpo de KM27 60 pertence à subclasse de IgGl humana. KM2760 tinha sido internacionalmente depositado como FERM BP-7054 em 24 de Fevereiro de 2000, no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (nome actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japão). (3) Medição da actividade de ligação do anticorpo ao péptido parcial de CCR4 (ELISA) 0 péptido parcial de CCR4h (composto 1) obtido no exemplo 1 (1) foi conjugado com tiroglobulina (daqui para a 85

frente referenciado "THY") e utilizado como o antigénio para o ensaio. 0 processo de produção foi tal como o descrito no exemplo 1 (2), excepto no facto de se ter utilizado o éster N-hidroxisuccinimidico do ácido 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxílico (SMCC, fabricado pela Sigma) em vez de MBS como o agente de reticulação. 0 conjugado preparado da forma anterior foi distribuído à razão de 10 pg/mL e 50 pL/cavidade numa placa de 96 cavidades para a realização de EIA (fabricado pela Greiner) e aderiu assim por incubação a ele, a 4 °C, durante a noite. Depois de se lavar com SBF, ASB a 1 % contendo SBF (daqui para a frente referenciado como "ASB-SBF a 1 %") foi adicionado a 100 pL/cavidade e deixou-se a mistura reagir à temperatura ambiente, durante 1 hora para bloquear os grupos activos remanescentes. Depois de eliminar ASB-SBF a 1 %, distribuíram-se as soluções diluídas de um sobrenadante da cultura do transformante, um anticorpo de rato purificado ou um anticorpo quimérico humano purificado, a 50 pL/cavidade e deixou-se a mistura reagir à temperatura ambiente, durante 1 hora. Depois da reacção, lavou-se cada cavidade com SBF contendo Tween 20 a 0,05 % (daqui para a frente referenciado como "Tween-SBF"), diluiu-se uma solução de anticorpo de Ig anti-rato de coelho marcada com peroxidase (fabricado pela DAKO) 4 00 vezes com ASB-SBF a 1 % e uma solução de anticorpo de IgG(y) anti-humana de cabra marcada com peroxidase (fabricado pela American Qualex) diluída 3.000 vezes com ASB-SBF a 1 % nas cavidades a que se tinha adicionado anticorpo de rato e nas cavidades a que se tinha adicionado anticorpo quimérico humano, respectivamente, como a solução secundária de anticorpo a 50 pL/cavidade e deixou-se a mistura reagir à temperatura ambiente, durante 1 hora. Depois da reacção, lavou-se cada cavidade com Tween-SBF, solução de ABTS (uma solução preparada por dissolução de 0,55 g de 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfóni-co) amónio, no seio de 1 litro de tampão de citrato a 0,1 M 86 (ρΗ 4,2) e adicionou-se 1 pL/mL de peróxido de hidrogénio imediatamente antes da utilização), foi distribuída a 50 pL/cavidade para o desenvolvimento da cor e mediu-se a densidade óptica a 415 nm (daqui para a frente referenciado como "D0415"). (4) Purificação do anticorpo quimérico anti-CCR4 a partir do sobrenadante da cultura O clone de célula de transformante KM2760 que expressa o anticorpo quimérico anti-CCR4 obtido em 2 (2) do exemplo 2, foi suspenso em H-SFM (fabricado pela GIBCO-BRL) contendo MTX 200 nM e GF21 da Daigo a 5 % (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries), para se obter uma densidade de 1 a 2 x 105 células/mL e foi dispensado a 100 mL em frascos de 175 cm2 (fabricado pela Greiner). Cultivaram-se as células a 37 °C, durante 5 a 7 dias, numa incubadora com atmosfera de CO2 a 5 % e recuperou-se o sobrenadante da cultura quando ela se tornou confluente. Purificou-se o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 a partir de cerca de 200 mL de sobrenadante da cultura, utilizando uma coluna Prosep-A {fabricado pela Bioprocessing), de acordo com as instruções do fabricante, para assim se obter cerca de 1,9 mg da proteína purificada. Aplicou-se cerca de 3 yg do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 a electroforese, de acordo com o processo conhecido (Nature, 227: 680 (1970)) para examinar o seu peso molecular

e o seu grau de purificação. Os resultados estão indicados na Fig. 5. Tal como se mostra na Fig. 5, o anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado KM2760 era de cerca de 150 quilodaltons (daqui para a frente referenciados como "Kd"), em condições não redutoras e observaram-se duas bandas de cerca de 50 e de cerca de 25 Kd em condições de redução. As dimensões das proteínas quase que coincidiam com os pesos moleculares deduzidos das sequências dos nucleótidos do ADNc da cadeia P 87 e da cadeia L de KM2760 (cadeia P: 49.226, cadeia L: 24.168) e também coincidiam com relatórios descrevendo que o anticorpo do tipo IgG tinha um peso molecular de cerca de 150 Kd em condições não redutoras e estava degradado na cadeia P com um peso molecular de cerca de 50 Kd e a cadeia L tinha um peso molecular de cerca de 25 Kd em condições redutoras, devido ao corte da ligação di-sulfureto intramolecular (daqui para a frente referenciada como "ligação S-S") (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capitulo 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press Limited (1996)), de tal modo que confirmou que o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 foi expresso como uma molécula de anticorpo que tinha uma estrutura correcta. Também se analisaram as sequências de aminoácidos de terminal N, da cadeia P e da cadeia L do anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado KM2760 utilizando um sequenciador de proteínas (PPSQ-10, fabricado pela Shimadzu) , que confirmou que coincidiam com as sequências de aminoácidos de terminal N, de cadeia P e de cadeia L do anticorpo de rato anti-CCR4 KM2160. 3. Estabelecimento das células que expressam em grande quantidade CCR4h (1) Construção do vector de expressão de CAG-pcADN3 para células de animais

Construi-se um vector de expressão como se descreve a seguir produzindo um vector de expressão (CAG-pcADN3) no qual a região promotora de um vector de expressão para uma célula de animal pcADN3 (fabricado pela INVITROGEN), foi alterada do promotor citomegalovírus (CMV) para o promotor CAG (AG (actina β de galinha modificada) com um melhorador de CMV-IE) e inserindo o gene de CCR4 no vector. 88

Deixou-se pcADN3 (5 pg) reagir com uma enzima de restrição NruI (fabricado pela Takara Shuzo), a 37 °C, durante 1 hora e depois recuperaram-se os fragmentos de ADN por precipitação em etanol. Em seguida, deixaram-se reagir com uma enzima de restrição HindIIl (fabricado pela Takara Shuzo) , a 37 °C, durante 1 hora e depois fraccionou-se por electroforese em gel de agarose para recuperar um fragmento de ADN de cerca de 5,8 kb não contendo nenhuma região promotora de CMV. Deixou-se reagir o plasmido CAG-pBluescript IIKS ( + ) (3 pg) tendo o promotor CAG (Nuc. Acid. Res., 23: 3816 (1995)) com uma enzima de restrição Sall (fabricado pela Takara Shuzo), a 37 °C, durante 1 hora e depois recuperaram-se os fragmentos de ADN por precipitação em etanol. Tornaram-se as extremidades cegas com um kit para tornar as extremidades de ADN cegas (fabricado pela Takara Shuzo), deixando-se reagir com HindIIl, a 37 °C, durante 1 hora e depois fraccionou-se por electroforese em gel de agarose para recuperar um fragmento de ADN de cerca de 1,8 kb, contendo a região promotora de CAG. Os fragmentos de ADN respectivos, recuperados, foram ligados utilizando um kit de ligação de ADN (fabricado pela Takara Shuzo) e transformou-se DH5a de E. coli utilizando o ADN do plasmido recombinante resultante, para se obter o plasmido CAG-pcADN3. (2) Construção do vector de expressão de CCR4h

Construiu-se um vector de expressão de CCR4h tal como descrito a seguir, utilizando o CAG-pcADN3 obtido em 3 (1) do exemplo 2 e o pcADN3 foi inserido no ADN de CCR4h (CCR4/pcADN3). Tanto CAG-pcADN3 como CCR4/pcADN3 reagiram com HindllI a 37 °C, durante 1 hora e recuperaram-se os fragmentos de ADN por precipitação em etanol. Em seguida, deixaram-se reagir com SglII (fabricado pela Takara Shuzo), a 37 °C, durante 1 hora e depois fraccionou-se por 89 electroforese em gel de agarose para recuperar um fragmento de ADN de cerca de 2,0 kb contendo a região promotora de CAG e um fragmento de ADN de cerca de 5,5 kb contendo a região do gene de CCR4h. Depois, obteve-se o plasmido CAG-CCR4/pcADN3 utilizando ambos os fragmentos de ADN da mesma maneira que em 3 (1) do exemplo 2. (3) Expressão de CCR4h em células de animais

Introduziu-se o plasmido em células de animais por electroporação da mesma forma que se descreveu em 2 (2) do exemplo 2. Fez-se uma suspensão de células EL-4 (ATCC TIB-39) em SBF(-) (fabricado pela GIBCO-BRL), para se obter uma densidade de 1 x 107 células/500 pL, adicionou-se 10 pg do CAG-CCR4/pcADN3 obtido em 3 (2) do exemplo 2 e incubou-se a mistura em gelo durante 10 minutos e depois colocou-se numa cuvete para utilização exclusiva (fabricado pela Bio-Rad), para realizar a introdução do gene a 260 V e 500 pFD. Depois incubou-se novamente a mistura em gelo durante 10 minutos, suspenderam-se as células no seio de 200 mL em meio FCS-RPMI a 10 % e distribuiu-se a 200 pL/cavidade numa placa de 96 cavidades para fazer a cultura das células. Vinte e quatro horas após o inicio da cultura, retirou-se 100 pL do sobrenadante da cultura de cada cavidade e distribuiu-se 100 pL/cavidade de meio FCS-RPMI a 10 %, contendo 1 mg/mL de G418, para se obter uma concentração final de 0,5 mg/mL. Duas semanas mais tarde, seleccionaram-se clones simples entre 10 e 100 e voltou a fazer-se uma cultura. (4) Selecção das células que expressam muito CCR4h

Foram seleccionadas por um processo de imunofluo-rescência utilizando KM2160 preparado no exemplo 1 (5). Numa placa com a forma de U, com 96 cavidades, dispersaram-se 2 x 90 IO5 células de cada uma das dez seleccionadas dos clones introduzidos nos genes. Diluiu-se KM2160 marcado com biotina por meio de um processo conhecido (processo do anticorpo da enzima, publicado por Gakusai Kikaku) até 5 pg/mL com um tampão para FACS (ASB-SBF a 1 %, EDTA a 0,02 %, NaN3 a 0,05 %, a pH 7,4), diluiu-se IgG humana (fabricado pela Welfide) até 3,75 mg/mL, para prevenir a coloração não específica e distribuiu-se cada uma destas soluções diluídas de anticorpos à razão de 200 pL/cavidade e deixou-se a mistura reagir em gelo durante 30 minutos. Como controlo negativo, utilizou-se um anticorpo anti-IL-5R biotinilado (patente de invenção WO 97/10354) à mesma concentração. Depois de se lavar duas vezes com 200 pL/cavidade do tampão, distribuiu-se a estrepto-avidina-PE (fabricado pela Becton Dickinson, Japão) à razão de 20 pL/cavidade. Trinta minutos depois de começar a reacção no gelo e no escuro, lavaram-se as células três vezes com 200 pL/cavidade e finalmente fez-se uma suspensão em 500 pL e mediu-se a intensidade da fluorescência com citómetro de fluxo para seleccionar uma linha de células que tivesse a mais elevada intensidade de fluorescência

Exemplo 3

Análise da função do anticorpo quimérico anti-CCR4: 1. Evolução da actividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 (1) Reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 para CCR4 humano e de rato (ELISA)

Mediu-se a reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado KM27 60 em relação a CCR4 humano e CCR4 de rato, por meio de ELISA tal como se mostrou em 2 (3) do exemplo 2. Conjugou-se o péptido parcial de CCR4h (composto 1) e o 91 péptido parcial de CCR4m (composto 2} obtidos no exemplo exemplo 1 (2) com THY e utilizou-se como antigénio. Realizou-se a preparação da mesma maneira que no exemplo 1 (2), excepto no facto de se ter utilizado SMCC (fabricado pela Sigma) em vez de MBS como o agente de reticulação. A Fig. 6 mostra o resultado do exame da reactividade, em que o conjugado de péptidos de CCR4 que irá aderir, foi fixado a cada cavidade de uma placa de ELISA com 10 pg/mL e 50 pL/cavidade e alterou-se a concentração do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 a ser adicionado. Tal como se mostra na Fig. 6, o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 tem a actividade de ligação ao péptido parcial de CCR4h e ao péptido parcial de CCR4m a um nível quase semelhante. Com base neste resultado, verificou-se que o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 reconhece o epitopo existente numa região das posições 2-29 do aminoácido de terminal N de CCR4 humano e de CCR4 de rato. (2) Reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 com células que expressam altamente o CCR4h (processo imuno-fluorescente)

Mediu-se a reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado KM2760 com as células que expressam altamente CCR4h (daqui para a frente referenciado como "CCR4/EL-4") produzidas em 3 (4) do exemplo 2, da mesma maneira que em 3 (4) do exemplo 2. Tam como se mostra na Fig. 7, o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 exibiu uma forte reactividade com as células CCR4/EL-4. 2. Actividade citotóxica in vítro do anticorpo quimérico anti-CCR4 (actividade ADCC) 92

Para avaliar in vitro a actividade citotóxica do anticorpo quimérico CCR4 purificado obtido em 2 (4) do exemplo 2, mediu-se a actividade ADCC tal como se descreve a seguir. (1) Preparação da suspensão de células alvo

Fez-se uma cultura das células que expressam altamente CCR4h CCR4/EL-4 obtidas em 3 (4) do exemplo 2, em meio FCS-RPMI 1640 a 10 %, contendo 0,5 mg/mL de G418, para se obter uma densidade de 1 x 10® células/0,5 mL, adicionou-se 1,85 MBq equivalentes de cromato de sódio radioactivo (Na251Cr04) (fabricado pela Daiichi Pure Chemicals) e deixou-se a mistura reagir a 37 °C, durante 1, 5 horas para marcar assim as células com um marcador isotópico. Após a reacção, lavaram-se as células três vezes por meio da sua suspensão em meio RPMI 1640 e centrifugaram-se, voltou a fazer-se uma suspensão no meio e depois incubou-se em gelo a 4 °C, durante 30 minutos para libertarem assim espontaneamente a substância rádio-activa. Após centrifugação, adicionou-se 5 mL de meio FCS-RPMI 1640 a 10 %, para se obter assim uma densidade de 2 x 105 células/mL e utilizou-se a mistura como a suspensão de células alvo. (2) Preparação da suspensão de células efectoras

Recolheu-se sangue periférico de um ser humano saudável (60 mL) utilizando uma seringa contendo 200 unidades (200 pL) de uma injecção de heparina sódica (fabricado pela Takeda Pharmaceutical). Completou-se a quantidade para 120 mL diluindo-a duas vezes com o mesmo volume da solução salina fisiológica (fabricado pela Otsuka Pharmaceutical). Distribuiu-se Lymphoprep (fabricado pela NYCOMED) a 5 mL em 12 tubos de centrifugação com uma capacidade de 15 mL (fabricado pela Sumitomo Bakelite), o sangue periférico diluído foi 93 sobreposto a 10 mL e centrifugou-se a mistura à temperatura ambiente e 800 x g durante 20 minutos. As fracções CMSP entre a camada de plasma do sangue a camada de Lymphoprep foram recolhidas de todos os tubos de centrifugação, foram suspensas em meio RPMI 1640 contendo SBF a 1 % (fabricado pela GIBCO) (daqui para a frente referenciado como "RPMI-SBF a 1 %"), lavou-se duas vezes por centrifugação a 400 x g e a 4 °C, durante 5 minutos e depois voltou a suspender-se para se obter uma densidade de 5 x 106 células/mL para serem utilizadas como células efectoras.

(3) Medição da actividade ADCC

Distribuiu-se a suspensão de células alvo preparadas em 2 (1) do exemplo 3, a 50 pL (1 x 104 células/cavidade) nas cavidades de uma placa com fundo em U de 96 cavidades (fabricado pela Falcon). Em seguida, distribuiu-se a suspensão de células efectoras preparadas em 2 (2) do exemplo 3, a 100 pL (5 x 105 células/cavidade, em que a taxa de células efectoras em relação às células alvo se tornou em 50:1). Em seguida, adicionou-se a cada um o anticorpo quimérico anti-CCR4 para se obter uma concentração final de 0,01 a 10 pg/mL e deixou-se a mistura reagir a 37 °C, durante 4 horas. Após a reacção, centrifugou-se a placa e mediu-se em cada cavidade, com um contador γ, a quantidade de 51Cr em 100 pL do sobrenadante. Calculou-se a quantidade de 51Cr dissociada espontaneamente da mesma maneira que anteriormente, utilizando apenas meio em vez da suspensão das células efectoras e da solução de anticorpo e fez-se a medição da quantidade de 51Cr no sobrenadante. Calculou-se a quantidade do 51Cr total dissociado da mesma maneira que anteriormente, adicionando apenas o meio em vez da solução de anticorpo e ácido clorídrico 1 N em vez da suspensão de células efectoras e mediu-se a quantidade de 51Cr no 94 sobrenadante. Calculou-se a actividade ADCC pela equação seguinte: (quantidade de slCr no sobrenadante da amostra) - (quantidade de slCr espontaneamente libertado)

Actividade citotóxica (%) ----------------------------------------------- X 100 (quantidade de SICr total) - (quantidade de 51Cr espontaneamente libertado)

Os resultados estão ilustrados na Fig. 8. Tal como se mostra na Fig. 8, o anticorpo quimérico anti-CCR4 mostrou uma actividade citotóxica forte dependente da concentração do anticorpo, dentro de um intervalo de 0,01 a 10 pg/mL. Quando a actividade de uma linha de células em que não se incorporou genes, células EL-4, foi medida da mesma maneira como controlo negativo, não se verificou actividade, o que veio confirmar que a actividade citotóxica é específica de CCR4. Os resultados anteriores mostram que o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 pode reduzir ou depletar as células Th2 expressas em CCR4 activando eficientemente as células efectoras humanas e, por isso, são úteis para o diagnóstico ou o tratamento de doenças imunitárias em seres humanos mediadas por Th2, tal como, asma brônquica, inflamação da atópica da pele e similares.

Exemplo 4

Efeito do anticorpo quimérico anti-CCR4 no sangue periférico humano: (1) Medição da actividade ADCC em CMSP humanas

Isolou-se CMSP da mesma maneira que em 2 (2) do exemplo 3 e fez-se uma suspensão para se obter uma densidade final de 1 x 107 células/mL. Distribuiu-se a mistura a 100 pL/cavidade numa placa em U utilizada em 2 (3) do exemplo 3, para se obter uma densidade de 1 x 106 células/cavidade. Diluiu-se 95 cada um dos KM2760 e um controlo negativo de anticorpo receptor de anti-IL-5 (patente de invenção WO 97/10354), para se obter uma concentração de 20 pg/mL e distribuiu-se em 100 pL/cavidade nas cavidades em que se tinha distribuído as células. Viste quatro horas após o início da cultura a 37 °C, numa corrente de CO2 a 5 %, recuperaram-se as células. De-tectou-se a citotoxícidade utilizando um kit de detecção de apoptose Annexin V-EGFP (fabricado pela MBL) e as células V positivas para anexina foram consideradas como células mortas. Centrifugaram-se as células a 4 °C, durante 3 minutos, a 400 x g e fez-se uma suspensão no tampão de ligação ligado ao kit, para se obter uma densidade de 5 x 105 células/200 pL. Misturou-se a suspensão com 1 pL do reagente de Annexin V-EGFP, seguido da pipetagem, por várias vezes e depois deixou-se a mistura reagir durante 5 minutos à sombra. Após a reacção, centrifugou-se a mistura a 4 °C, durante 3 minutos, a 400 x g e eliminou-se o sobrenadante. Os aglomerados desapareceram por meio de uma agitação ligeira num misturador de vortex, adicionou-se 100 pL de metanol contendo CaCl2 2,5 mM que tinha sido arrefecido em gelo e fez-se a incubação da mistura a 4o C, durante 10 minutos. Centrifugou-se a mistura durante 30 segundos, a 8.000 x g e eliminou-se o sobrenadante. Fez-se uma suspensão do precipitado em 2 00 pL do tampão de ligação e lavou-se duas vezes por meio de centrifugação. Ao aglomerado remanescente após a eliminação do sobrenadante, adicionou-se 10 pL de anticorpo anti-CD4 marcado com PC5 (fabricado pela Coulter), 20 pL de anticorpo anti-CD45RA marcado com PE (fabricado pela Coulter) e 20 pL de tampão de FACS buffer contendo CaCl2 2,5 mM e deixou-se a mistura reagir a 4 °C, durante 30 minutos. Depois, lavou-se a mistura três vezes por centrifugação utilizando um tampão de FACS contendo CaCl2 2,5 mM e analisou-se por meio de um citómetro de fluxo (fabricado pela Coulter). Primeiro, fraccionou-se o grupo das células em 4 96 fracções (CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, CD4-CD45RA+ e CD4-CD45RA-) com base na diferença das propriedades de coloração entre CD4 e CD45RA. Em seguida, mediu-se a taxa positiva de anexina V em cada fracção e representou-se como a % de cito-toxicidade. Os resultados estão indicados na Fig. 9. Observou-se a citotoxicidade de CMSP apenas quando em co-cultura com KM2760 e detectou-se a toxicidade especificamente na fracção de CD4+CD45RA-, à qual as células positivas de CCR4 pertencem. (2) Efeito da inibição da produção de citocina de CMSP humanas

Da mesma maneira que se descreveu em 2 (3) do exemplo 3, induziu-se a actividade de ADCC fazendo co-cultura de CMSO e KM27 60 (concentração final: 10 pg/mL) durante 24 horas. Após a cultura, retirou-se 100 pL de sobrenadante e no seu lugar adicionou-se 100 pL de um, meio contendo 1 pg/mL de PMA (acetato de miristato de forbol) e 200 ng/mL de A23187 (calcimícina: fabricado pela RBI), de modo que a concentração final de PMA e A23187 se tornou em 0,5 pg/mL e 100 ng/mL, respectivamente e então induziu-se a produção de citocina estimulando as células (condição (i)). Como outras condições de estimulação, a produção de citocina foi induzida utilizando 50 ng/mL na concentração final de um anticorpo anti-CD3 OKT-3 (ATCC CRL-8001) em vez de A23187 (condição (ii)). Introduziu-se cada um dos agentes de estimulação e depois, vinte e quatro horas após a cultura, recuperou-se o sobrenadante para medir IL-4, IL-5, IL-13 e o interferão (IFN)-y um kit de medição das citocinas (fabricado pela BioSource). Tal como se mostra na Fig. 10, a produção de IL-4, IL-5 ou IL-13 da citocina Th2, foi inibida no grupo a que se adicionou KM2760, mas a produção de IFN-γ da citocina de Thl não foi influenciada. 97

Exemplo 5

Reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 com a linha de células de leucemia humana de células T (1) Capacidade de ligação à superfície da membrana (processo imuno-fluorescente) A reactividade do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 às seguintes 8 linhas de células de leucemia das células T humanas: HPB-ALL (Câncer Research, 54: 1511 (1994); leucemia aguda das células T, HSB-2 (ATCC CCL-120.1; leucemia (células T) ) , MOLT-4 (JCRB9031; linfoma (células T) ) , TALL-1 (JCRB 0086; leucemia (células T) ) , Jurkat (ATCC TIB-152; leucemia aguda das células T), CCRF-CEM (ATCC CCL-119; leucemia aguda das células T), PEER (JCB 0830; leucemia (células T)) e Hut78 (ATCC TIB-161; linfoma cutâneo das células T), foi medido da mesma maneira que em 3 (4) do exemplo 2. Neste caso, a concentração de KM2760 biotinilado alterou-se para 10 pg/mL. Tal como se mostra na Fig. 11, o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 mostrou uma forte reactividade com 5 linhas (HPB-ALL, Jurkat, CCRF-CEM, PEER e Hut78) entre as 8 linhas ensaiadas.

(2) Actividade de ADCC

Mediu-se a actividade de ' ADCC para cinco linhas de células cuja reactividade com o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 tinha sido confirmada em 1 do exemplo 5, da mesma que em 2 do exemplo 3. Tal como se mostra na Fig. 12, o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 prejudicou todas as células ensaiadas de uma forma dependente da concentração. 98

Exemplo 6

Evolução da actividade in vivo do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 (inibição da produção de citocina de Th2):

Para avaliar a actividade in vivo do anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado KM2760 obtido em 2 (4) do exemplo 2, administrou-se o anticorpo a Macaca fascicularis por meio de uma única injecção intravenosa e colheram-se amostras de sangue periodicamente durante cerca de 1 mês, induziu-se a produção de citocina nos leucócitos periféricos por estimulação com PMA (13-acetato de 12-miristato de folbol, fabricado pela Sigma) e IONOMYCIN (fabricado pela Sigma) e mediram-se as citocinas Th2, IL-4 e IL-13 e a citocina Thl, IFN-'γ. Os processos e os resultados estão descritos a seguir. A dose (teor de proteína) do anticorpo quimérico anti-CCR4 purificado KM27 60 foi de 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg ou 10 mg/kg e administrou-se o anticorpo a 2 animais, Macaca fascicularis, machos, com 4 anos de idade, por meio de uma única injecção intravenosa em cada um dos grupos da dose. Recolheram-se amostras de sangue da veia femoral antes da administração na Ia, 2a, 3a e 4a semana após a administração. Utilizou-se como anticoagulante a heparina (injecção de heparina sódica, 1.000 unidades/mL, fabricado pela Shimizu Pharmaceutical) e adicionou-se a 1 mL de sangue, para se obter uma concentração de 25 unidades/mL. Utilizando uma placa de fundo plano com 24 cavidades, dispersou-se o sangue periférico de cada um dos indivíduos à razão de 500 pL/cavidade em 2 cavidades. Adicionou-se a uma das cavidades um meio contendo o agente de estimulação (PMA com a concentração final de 50 ng/mL, IONOMYCIN com a concentração final de 1 pg/mL) e adicionou-se meio sem agente de estimulação à outra cavidade, cada um deles à razão de 500 99 pL/cavidade e agitou-se ligeiramente a mistura e fez-se a cultura a 37 °C, numa atmosfera de CO2 a 5 % e ar a 95 %, durante 24 horas. Também se preparou o meio utilizado por adição de 0,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina (fabricado pela GIBCO BRL) e 5,6 mL de soro bovino fetal imobilizado (fabricado pela PAA Laboratories) a 100 mL de RPM! 1640 (GIBCO BRL). Depois da cultura estar completa, recuperou-se o caldo da cultura contendo as células sanguíneas a partir de cada cavidade e centrifugou-se (6.700 x g, 5 minutos, 4 °C) , para se obter um sobrenadante. IL-4, IL-13 e IFN-γ contidos no sobrenadante da cultura resultante, foram determinados utilizando kits de medição de citocinas (IL-4: kit de IL-4 humana OptEIA, fabricado pela PharMingen; IL-13: kit de imuno-ensaio de IL-13 humana com ecrã Cyto, fabricado pela BioSource International; IFN-γ: kit de imuno-ensaio de IFN-γ humano com ecrã Cyto, fabricado pela BioSource International) . A quantidade de citocina produzida por cada indivíduo é um valor calculado subtraindo a quantidade obtida não adicionando o agente de estimulação a partir da quantidade obtida por adição do agente de estimulação (grupo de 0,1 mg/kg, indivíduos N°s. L-l e L-2; grupo 1,0 mg/kg, indivíduos N°s. M-l e M-2; grupo 10 mg/kg, indivíduos N°s. H-l e H-2). Os resultados estão indicados nas Figs. 13 a 15. Nestes desenhos, o valor de cada IL-4, IL-13 e IFN-γ em cada indivíduo antes da administração foi utilizado como 100 % e a quantidade produzida após a administração foi mostrada como percentagem. As citocinas de Th2, IL-4 (Fig. 13) e IL-13 (Fig. 14), diminuem significativamente na primeira semana após a administração em todos os grupos a que se administrou e a inibição continuou mesmo na 4a semana após a administração. Por outro lado, a influência sobre a citocina de Thl, IFN-γ (Fig. 15), foi extremamente pequena. 100

Com base nestes resultados, verificou-se que a produção da citocina Th2 a partir de células mononucleares do sangue periférico era inibida pelo menos durante 4 semanas quando se administrava o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2750 a Macaca fascicularis. Também se verificou que o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 reduziu ou depletou as células Th2 que expressam CCR4 no sangue periférico, no corpo de Macaca fascicularis.

Exemplo 6

Actividade anti-tumor in vivo do anticorpo quimérico anti-CCR4 : (1) Efeito anti-tumor do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 num modelo de enxerto intraperitonial singénico 0 efeito anti-tumor do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 num modelo de tumor singénico de rato, em que as células CCR4/EL-4 derivadas de rato expressaram em grande quantidade CCR4, células que foram obtidas em 2 (4) do exemplo 2, foi enxertado na cavidade abdominal do rato e foi medido. Utilizaram-se ratos machos, C57BL/6, com oito semanas de idade (CLEA, Japão). Fez-se uma suspensão das células CCR4/EL-4 em SBF(-) {fabricado pela Gibco BRL), para se obter uma densidade de 1 x 105 células/mL e enxertou-se na cavidade abdominal de cada um dos 10 ratos machos, C57BL/6, numa dose de 200 pL/animal. Quatro horas, três dias, seis dias e dez dias após a transplantação, administrou-se na cavidade abdominal de cada um dos 5 animais, 200 pL de KM2760 diluído para 2 mg/mL com um tampão de citrato (uma solução aquosa de 10 mmole/L de ácido cítrico e 150 mmole/L de cloreto de sódio, ajustado para pH 6). Os 5 animais remanescentes foram utilizados como um grupo de controlo· negativo ao qual o 101 anticorpo quimérico não foi administrado. 0 número de dias a partir do dia da transplantação até os ratos de cada um dos grupos morrerem devido à proliferação das células do tumor acompanhada por ascite, está indicado no quadro 1. 0 número médio de dias de sobrevivência foi de 16,4 dias no grupo de controlo negativo, enquanto que o número médio de dias de sobrevivência no grupo que se administrou KM2760 foi de 26,2 dias. Dado que 59,8 % do prolongamento do período de sobrevivência foi verificado pela administração de KM2760, o KM27 60 tem um efeito no prolongamento da vida num modelo de enxerto intraperitonial singénico de células de leucemia que expressam CCR4.

Quadro 1

Dias sobrevividos Valor médio (dia) Taxa de sobrevivência (%) Grupo de controlo negativo 14/14/16/18/20 16, 4 Grupo a que se administrou KM276Q 21/22/23/29/36 26,2 59,8 (2} Efeito anti-tumor do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 num modelo de enxerto subcutâneo singénico 0 efeito anti-tumor do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 num modelo de tumor singénico de rato, em que as células CCR4/EL-4 derivadas de rato expressaram em grande quantidade CCR4, células que foram obtidas em 2 (4) do

exemplo 2, foram enxertados subcutaneamente num rato e depois fez-se. a medição. Utilizaram-se ratos machos, C57BL/6, com oito semanas de idade (CLEA, Japão). Fez-se uma suspensão das células CCR4/EL-4 em SBF(-) (fabricado pela Gibco BRL), para se obter uma densidade de 1 x 106 células/mL e enxertou-se na cavidade abdominal de cada um dos 18 ratos machos, C57BL/6, numa dose de 50 pL/animal. Considerando 5 animais entre o grupo, administrou-se 100 pL de KM2760 diluído para 2 mg/mL 102 com um tampão de citrato (uma solução aquosa de 10 mmole/L de ácido cítrico e 150 mmole/L de cloreto de sódio, ajustado para pH 6) na veia da cauda, após 4 horas de transplantação, uma vez por dia, durante 5 dias seguidos. Neste caso, a dose por administração é de 200 pg/animal. Os 6 animais remanescentes 4 horas, 7 dias e 14 dias após a transplantação, administrou-se 200 pL de KM2760 diluído para 2 mg/mL com um tampão de citrato, na veia da cauda. Neste caso, a dose por administração é de 400 pg/animal. Os 7 animais remanescentes foram utilizados como um grupo de controlo negativo ao qual o anticorpo quimérico não foi administrado. Seis dias após a transplantação, o diâmetro do tumor foi periodicamente medido utilizando calibradores de lâmina e avaliou-se o efeito anti-tumor pela relação do valor médio do volume do tumor em cada grupo administrado, com o valor médio do volume do tumor em cada grupo não administrado e pelos dias de sobrevivência após o início da administração. O volume do tumor foi calculado pela seguinte equação:

Volume do tumor = (largura)2 x comprimento x 0,5 0 valor médio dos volumes do tumor em cada grupo está indicado no quadro 2 e na Fig. 16 e os resultados da relação do valor médio do volume do tumor em cada grupo administrado com o valor médio do volume do tumor nos grupos em que não se administrou nada, estão indicados no quadro 3 e na Fig. 17. A relação do valor médio dos volumes do tumor em cada grupo a que se administrou KM2760 com o valor médio dos volumes do tumor no grupo em que não se administrou nada no 18° dia após a transplantação, foi de 0,356 no grupo ao qual se administrou 200 pg continuamente durante 5 dias e 0, 257 no grupo em que se administrou 400 pg três vezes, de modo a que ο KM276Q mostrou um efeito de inibição do crescimento no 103 modelo singénico de enxerto subcutâneo de células de leucemia positivas a CCR4 por cada um dos esquemas de administração.

Quadro 2

Constituição do grupo Dias após a transplantação 0 6 10 12 15 18 Grupo de controlo negativo 50+0 46+28 294+114 778+263 1825+708 3581+1279 KM276Q 200 pg x grupo de 5 dias de administração continua 50+0 16+20 115+60 299+194 601+429 1274+886 KM2760 400 pg x grupo de 3 vezes de administração 50+0 0+0 73+49 198+158 431+467 920+1163 Unidade: mmJ + desvio padrão

Quadro 3

Constituição do grupo Dias após a transplantação 0 6 10 12 15 18 Grupo de controlo negativo 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 KM2760 200 pg x grupo de 5 dias de administração contínua 1,000 0,348 0,393 0,384 0,330 0,356 KM2760 400 pg x grupo de 3 vezes de administração 1,000 0,000 0,250 0,254 0,236 0,257 (3) Efeito de anti-tumor do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 num modelo de xenoenxerto 0 efeito anti-tumor do anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 num modelo de xenoenxerto de tumores subcutâneos de rato, em que as células CCRF-CEM da linha da leucemia de células T humanas que expressaram CCR4h (ATCC CCL-119), foram enxertados subcutaneamente em ratos pelados e depois fez-se a medição. Utilizaram-se ratos pelados Balb/c, com oito semanas de idade (CLEA, Japão). Fez-se uma suspensão das células CCRF-CEM em meio RPMI 1640 (fabricado pela Gibco BRL) , para se obter uma densidade de 1 x 108 células/mL e enxertou-se na pelo do lado ventral de cada rato pelado Balb/c numa dose de 200 pL/animal. Depois, dividiram-se os animais em 4 grupos de 104 5 animais cada e administrou-se 200 pL de KM2760 diluído para 2 mg/mL, 0,5 mg/mL ou 0,2 mg/mL com um tampão de citrato, a administração fez-se a três grupos na veia da cauda, após 4 horas, 3 dias e 6 dias da transplantação. Neste caso, a dose de KM2760 administradas aos referidos grupos são de 400 pg/animal/dla, 100 pg/animal/dia e 40 pg/animal/dia. Os animais remanescentes do grupo foram utilizados como um grupo de controlo negativo ao qual se administrou 200 pg de imunoglobulina G humana (daqui para a frente referenciada como "IgGh", fabricado pela Welfide), diluído para 2 mg/mL com um tampão de citrato na veia da cauda (400 pg/animal/dia). Quatro dias após a transplantação, o diâmetro do tumor foi periodicamente medido utilizando calibradores de lâmina e avaliou-se o efeito anti-tumor pelo volume do tumor em cada grupo. O volume do tumor foi calculado pela seguinte equação:

Volume do tumor = (largura)2 x comprimento x 0,5

As alterações ao longo do tempo dos valores médios dos volumes do tumor em cada grupo estão indicadas no quadro 4 e na Fig. 18. A inibição completa do crescimento do tumor foi observada em todos os grupos a que se co-administrou MK2760, de tal modo que KM2760 mostrou um efeito da inibição crescente do modelo de xenoenxerto do tumor subcutâneo de células de leucemia positivas para CCR4.

Quadro 4

Constituição do grupo Dias após a transplantação 0 6 10 12 15 18 Grupo de controlo negativo 0+0 44+63 204+159 233+157 364+86 448+142 KM2760 40 pg administrados ao 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 grupo KM2760 100 pg administrados ao 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 grupo KM2760 400 pg administrados ao 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 grupo Unidade: + desvio padrão 105

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Tal como se discutiu antes, de acordo com a presente invenção um anticorpo recombinante e um seu fragmento, que se ligam especificamente a um epítopo presente na posição 2-29 da sequência de aminoácídos representada pela SEQ ID N°. 17 do domínio extracelular de CCR4 humano e contém novos RDCs para CCR4, conforme fica providenciado. 0 anticorpo da presente invenção é útil para a detecção imunológica de uma célula de Th2 no ser humano, por meio da coloração de imunócitos e servirá para o diagnóstico ou tratamento de todas as doenças imunitárias mediadas por Th2 incluindo asma brônquica e doenças de pele atópica, doenças em que os estados mórbidos avançam devido ao equilíbrio anormal das células Th2 e cancros incluindo cancros do sangue, tais como, leucemia.

TEXTO LIVRE DE LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID N°. 11 - Explanação da sequência sintética: ADN sintético

SEQ ID N°. 12 - Explanação da sequência sintética: ADN sintético

SEQ ID N°. 13 - Explanação da sequência sintética: ADN sintético

SEQ ID N°. 14 - Explanação da sequência sintética: ADN sintético 106 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Anticorpo recombinante de genes e um fragmento deste anticorpo <130> P-3 6976 <150> JP 2000-59508 <151> 2000-03-03 <150> JP 2000-401563 <151> 2000-12-28 <160> 17 <170> Patentln Ver. <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Asn X Pro Tre Asp Ile 5 Ala Asp Tre Tre Leu 10 Asp Glu Ser Ile Tir Ser 15 Asn Tir Tir Leu 20 Tir Glu Ser Ile Pro 25 Lis Pro Cis <210> 2 <211> 28

<212> PRT <213> Músculo Mus <400> 2

Asn 1 Ala Tre Glu Vai 5 Tre Asp Tre Tre Gin 10 Asp Glu Tre Vai Tir Asn 15 Ser Tir Tir Fen 20 Tir Glu Ser Met Pro 25 Lis Pro Cis 107 <210> 3 <211> 414

<212> ADN <213> Músculo Mus <220> <221> CDS <222> (1) .. (414) <4 0 0> 3 atg aac ctc ggg ctc agt ttg att ttc ctt gee ctc att tta aaa ggt 48 Met Asn Leu Gli Leu Ser Leu Ile Fen Leu Ala Leu Ile Leu Lis Gli 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta atg aag 96 Vai Gin Cis Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gli Gli Asp Leu Met Lis 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aaa ate tcc tgt gca gee tct gga ttc att ttc 144 Pro Gli Gli Ser Leu Lis Ile Ser Cis Ala Ala Ser Gli Fen Ile Fen 35 40 45 agt aat tat ggc atg tct tgg gtt ege cag act cca gac atg agg ctg 192 Ser Asn Tir Gli Met Ser Trp Vai Arg Gin Tre Pro Asp Met Arg Leu 50 55 60 gaa tgg gtc gca acc att agt agt gct agt act tat tcc tat tat cca 240 Glu Trp Vai Ala Tre Ile Ser Ser Ala Ser Tre Tir Ser Tir Tir Pro 65 70 75 80 gac agt gtg aag gga cga ttc acc ata tcc agg gac aac gee gag aac 288 Asp Ser Vai Lis Gli Arg Fen Tre Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn 85 90 95 tcc cta tat ctg caa atg gat agt ctg agg tct gag gac aca ggc ata 336 Ser Leu Tir Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Tre Gli Ile 100 105 110 tat tac tgt gga aga cat age gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg 384 Tir Tir Cis Gli Arg His Ser Asp Gli Asn Fen Ala Fen Gli Tir Trp 115 120 125 ggc cga ggg act ctg gtc act gtc tct gca 414 Gli Arg Gli Tre Leu Vai Tre Vai Ser Ala

130 13S <210> 4 <211> 396 <212> ADN <213> Músculo Mus <220>

<221> CDS <222> (1)..(396) 108 <400> 4 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg Met Lis Leu Pro Vai Arg Leu Leu 1 5 tcc age agt gat gtt ttg atg acc Ser Ser Ser Asp Vai Leu Met Tre 20 agt ctt gga gat caa gee tcc ate Ser Leu Gli Asp Gin Ala Ser Ile 35 40 gtt cat att gat ggt gac aca tat Vai His Ile Asn Gli Asp Tre Tir 50 55 ggc cag tet cca aag ctc cta ate Gli Gin Ser Pro Lis Leu Leu Ile 65 70 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc Gli Vai Pro Asp Arg Fen Ser Gli 85 ctc .aag ate age aga gtg gag gct Leu Lis Ile Ser Arg Vai Glu Ala 100 ttt caa ggt tea ctt ctt cog tgg Fen Gin Gli Ser Leu Leu Pro Trp 115 120 gaa ate aga cgg Glu Ile Arg Arg 130 gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Vai Leu Met Fen Trp Ile Pro Ala 10 15 caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Gin Tre Pro Leu Ser Leu Pro Vai 25 30 tet tgc aga tet agt cgg aac att 144 Ser Cis Arg Ser Ser Arg Asn Ile 45 tta gaa tgg tac ctg cag aga ccg 192 Leu Glu Trp Tir Leu Gin Arg Pro 60 tac aaa gtt tcc aac cga ttt tet 240 Tir Lis Vai Ser Asn Arg Fen Ser 75 80 agt gga tea ggg aca gat ttc aca 288 Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Tre 90 95 gag gat ctg gga gtt tat tac tgc 336 Glu Asp Leu Gli Vai Tir Tir Cis 105 110 acg ttc ggt gga ggc acc agg ctg 384 Tre Fen Gli Gli Gli Tre Arg Leu 125 396 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Músculo Mus <4 00> 5

Asn Tir Gli Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Músculo Mus <400> 6

Tre Ile Ser Ser Ala Ser Tre Tir Ser Tir Tir Pro Asp Ser Vai Lis 109 1 5 10 15

Gli <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Músculo Mus <400> 7

His Ser Asp Gli Asn Fen Ala Fen Gli Tir

1 5 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Músculo Mus <400> 8

Arg Ser Ser Arg Asn Ile Vai His Ile Asn Gli Asp Tre Tir Leu Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Músculo Mus <40 0> 9

Lis Vai Ser Asn Arg Fen Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Músculo Mus <400> 10 110

Fen Gin Gli Ser Leu Leu Fen Trp Tre 1 5

<210> 11 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: ADN sintético <400> 11

aaggaaaaaa gcggccgcga cccctcacca tgaacctcg 39 <210> 12 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: ADN sintético <400> 12 cgatgggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccag 39

<210> 13 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: ADN sintético <400> 13 ccggaattcg cctcctcaaa atgaagttgc c 31

<210> 14 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: ADN sintético 111 <4 00> 14 agccaccgta cgtctgattt ccagcctggt g <210> 15 <211> 138 <212> PRT <213> Músculo Mus <4G0> 15

Met Asn Leu Gli Leu Ser Leu Ile 1 5 Vai Gin Cis Glu Vai Gin Leu Vai 20 Pro Gli Gli Ser Leu Lis Ile Ser 35 40 Ser Asn Tir Gli Met Ser Trp Vai 50 55 Glu Trp Vai Ala Tre Ile Ser Ser 65 70 Asp Ser Vai Lis Gli Arg Fen Tre 85 Ser Leu Tir Leu Gin Met Asn Ser 100 Tir Tir Cis Gli Arg His Ser Asp 115 120 Gli Arg Gli Tre Leu Vai Tre Vai 130 135

Fen Leu 10 Ala Leu Ile Leu Lis 15 Gli Glu 25 Ser Gli Gli Asp Leu 30 Met Lis Cis AI a Ala Ser Gli 45 Fen Ile Fen Arg Gin Tre Pro 60 Asp Met Arg Leu Ala Ser Tre 75 Tir Ser Tir Tir Pro 80 Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Glu 95 Asn Leu 105 Arg Ser Glu Asp Tre 110 Gli Ile Gli Asn Fen Ala Fen 125 Gli Tir Trp

Ser Ala <210> 16 <211> 132 <212> PRT <213> Músculo Mus <400> 16

Met 1 Lis Leu Pro Vai 5 Arg Leu Leu Ser Ser Ser Asp 20 Vai Leu Met Tre Ser Leu Gli 35 Asp Gin Ala Ser Ile 40 Vai Lis 50 Ile Asn Gli Asp Tre 55 Tir Gli 65 Gin Ser Pro Lis Leu 70 Leu Ile

Vai Leu 10 Met Fen Trp Ile Pro 15 Ala Gin 25 Tre Pro Leu Ser Leu 30 Pro Vai Ser Cis Arg Ser Ser 45 Arg Asn Ile Leu Glu Trp Tir 60 Leu Gin Arg Pro Tir Lis Vai 75 Ser Asn Arg Fen Ser 80 112

Gli Vai Pro Asp Arg 85 Fen Ser Gli Leu Lis Ile Ser 100 Arg Vai Glu Ala Fen Gin Gli 113 Ser Leu Leu Pro Trp 120 Glu Ile 130 Arg Arg

Ser Gli 90 Ser Gli Tre Asp Fen 95 Tre Glu 105 Asp Leu Gli Vai Tir 110 Tir Cis Tre Fen Gli Gli Gli 125 Tre Arg Leu

<210> 17 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 17

Met Asn Pro Tre Asp Ile Ala Asp 1 5 Ser Asn Tir Tir Leu Tir Glu Ser 20 Gli Ile Lis Ala Fen Gli Glu Leu 35 40 Vai Fen Vai Fen Gli Leu Leu Gli 50 55 Fen Lis Tir Lis Arg Leu Arg Ser 65 70 Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Fen 85 Tir Tir Ala Ala Asp Gin Trp Vai 100 Ile Ser Trp Met Tir Lou Vai Gli 115 120 Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tir 130 135 Ser Leu Arg Ala Arg Tre Leu Tre 145 150 Tre Trp Ser Vai Ala Vai Fen Ala 165 Tre Cis Tir Tre Glu Arg Asn His 180 Leu Asn Ser Tre Tre Trp Lis Vai 195 200 Leu Gli Leu Vai Ile Pro Leu Gli 210 215 Ile Ile Arg Tre Leu Gin His Cis 225 230 Vai Lis Met Ile Fen Ala Vai Vai

Tre Tre Leu Asp Glu Ser Ile Tir 10 15 Ile Pro Lis Pro Cis Tre Lis Glu 25 30 Fen Leu Pro Pro Leu Tir Ser Leu 45 Asn Ser Vai Vai Vai Leu Vai Leu 60 Met Tre Asp Vai Tir Leu Leu Asn 75 80 Vai Fen Ser Leu Pro Fen Trp Gli 90 95 Fen Gli Leu Gli Leu Cis Lis Met 105 110 Fen Tir Ser Gli Ile Fen Fen Vai 125 Leu Ala Ile Vai His Ala Vai Fen 140 Tir Gli Vai Ile Tre Ser Leu Ala 155 160 Ser Leu Pro Gli Fen Leu Fen Ser 170 175 Tre Tir Cis Lis Tre Lis Tir Ser 185 190 Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile 205 Ile Met Leu Fen Cis Tir Ser Met 220 Lis Asn Glu Lis Lis Asn Lis Ala 235 240 Vai Leu Fen Leu Gli Fen Trp Tre 113 245

Pro Tir Asn Ile 260 Vai Leu Fen Leu Leu Gin Asp 275 Cis Tre Fen Glu Arg 280 Tre Glu 290 Tre Leu Ala Fen Vai 295 His Fen 305 Fen Leu Gli Glu Lis 310 Fen Arg Tre Cis Arg Gli Leu 325 Fen Vai Leu Ile Tir Ser Ala 340 Asp Tre Pro Ser Asp His Asp 355 Leu His Asp Ala Leu 360 250 255 Glu Tre Leu Vai Glu Leu Glu Vai 265 270 Tir Leu Asp Tir Ala Ile Gin Ala 285 Cis Cis Leu Asn Pro Ile Ile Tir 300 Lis Tir Ile Leu Gin Leu Fen Lis 315 320 Cis Gin Tir Cis Gli Leu Leu Gin 330 335 Ser Ser Tir Tre Gin Ser Tre Met 345 350

Lisboa, 5 de Setembro de 2008 114

Claims (44)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, caracte- rizado pelo facto de reagir especificamente com um epí-topo presente nas posições 2-29 na sequência de amino-ácidos representada pela SEQ ID n°. 17 do domínio extracelular de CCR4 humana, sendo o referido epítopo reconhecido pelo anticorpo KM2760 produzido pelo trans-formante KM2760 com o número de depósito FERM BP-7054.
2. 2. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de reagir especificamente com uma célula que expressa CCR4.
3. 3. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de ter actividade citotóxica contra uma célula que expressa CCR4 .
4. 4. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a actividade citotóxica contra uma célula que expressa CCR4 ser maior do que a de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma, derivado de um animal não humano.
5. 5. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a actividade citotóxica ser uma actividade citotóxica mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC).
6. 6. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto da actividade citotóxica mediada por células dependentes do 1 anticorpo ser uma actividade de indução da apoptose de uma célula Th2.
7. 7. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de ter actividade de depleção da célula Th2.
8. 8. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de ter actividade de inibição da produção da citocina Th2.
9. 9. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a citocina de Th2 ser IL-4, IL-5 ou IL-13.
10. 10. Anticorpo recombinante, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de o anticorpo recombinante se seleccionar entre um anticorpo humanizado e um anticorpo humano.
11. 11. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o anticorpo humanizado ser um anticorpo humano quimérico ou um anticorpo enxertado numa RDC humana.
12. 12. Anticorpo recombinante, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de pertencer a um anticorpo de IgG humana.
13. 13. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o anticorpo humanizado compreender: 2 uma região de determinação da complementaridade (RDC)l, RDC2 e RDC3 de uma região variável (região V) , de cadeia pesada (cadeia P) , com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7, respectivamente; e RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia leve (cadeia L) de um anticorpo, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente.
14. 14. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o anticorpo quimérico humano compreender: uma região variável (região V), de cadeia pesada (cadeia P) de um anticorpo e uma região V de cadeia leve (cadeia L) de um anticorpo, de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com CCR4; e uma região constante (região C) , de cadeia P e uma região C, de cadeia L de um anticorpo humano.
15. 15. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o anticorpo quimérico humano compreender: uma região V, de cadeia pesada P com aminoácidos das posições 20-138 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15; e uma região V, de cadeia pesada L com aminoácidos das posições 20-132 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16.
16. 16. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o anticorpo quimérico 3 humano ser um anticorpo KM2760 produzido por um trans-formante KM2760 com o número de depósito FERM BP-7054 e em que a região C, de cadeia P do anticorpo pertence à sub-classe das IgGl humanas.
17. 17. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o anticorpo humano compreender uma região variável {região V), de cadeia pesada (cadeia P) do anticorpo e uma região V, de cadeia leve (cadeia L) do anticorpo.
18. 18. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de as regiões de determinação da complementaridade (RDCs) da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L do anticorpo humano compreenderem sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos das RDCs de uma região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L, respecti-vamente, de um anticorpo monoclonal, que reage especifi-camente com CCR4.
19. 19. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o anticorpo humano compreender : RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia P, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7, respectivamente; e RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia L, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente.
20. 20. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a região V, de cadeia P 4 e a região V, de cadeia L do anticorpo humano compreenderem sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal que reage, especificamente, com CCR4.
21. 21. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o anticorpo humano compreender: uma região V de cadeia pesada P com aminoácidos das posições 20-138 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 15; e uma região V, de cadeia pesada L com aminoácidos das posições 20-132 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID N°. 16.
22. 22. Anticorpo recombinante, de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo facto de o anticorpo humano ser um anticorpo obtido de uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos ou de um animal transgénico que produz um anticorpo humano.
23. 23. ADN caracterizado pelo facto de codificar o anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22.
24. 24. Vector recombinante caracterizado pelo facto de compreender o ADN, de acordo.com a reivindicação 23 e um vector em tandem para a expressão de anticorpos humanizados . 5
25. 25. Transformante, caracterizado pelo facto de por meio dele se introduzir o vector recombinante, de acordo com a reivindicação 24, numa célula hospedeira.
26. 26. Transformante, de acordo com a reivindicação 25, ca-racterizado pelo facto de o transformante ser KM2760 com o número de depósito FERM BP-7054.
27. 27. Processo para a produção de um anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, caracterizado pelo facto de compreender a cultura do transformante de acordo com a reivindicação 25 ou 26, para produzir e acumular o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo num meio de cultura e recuperar o anticorpo recombinante ou um fragmento desse anticorpo do meio de cultura.
28. 28. Fragmento do anticorpo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de ser um Fab, um Fab', um F(ab')2/ um anticorpo de cadeia única, um fragmento da região V estabilizado por di-sulfureto ou um péptido que compreende as RDCs de um anticorpo.
29. 29. Fragmento do anticorpo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de o referido fragmento compreender uma região variável (região V) , de cadeia pesada (cadeia P) do anticorpo e uma região V, de cadeia leve (cadeia L) do anticorpo de um anticorpo.
30. 30. Fragmento do anticorpo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de as regiões de deter minação da complementaridade (RDCs) da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L do referido fragmento compreenderem sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos das RDCs de uma 6 região V, de cadeia P e de uma região V, de cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal, que reage especificamente com CCR4.
31. 31. Fragmento do anticorpo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de compreender: RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia P, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 5, 6 e 7, respectivamente; e RDC1, RDC2 e RDC3 de uma região V, de cadeia L, com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID N°s. 8, 9 e 10, respectivamente.
32. 32. Fragmento do anticorpo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de a região V, de cadeia P e a região V, de cadeia L do referido fragmento compreender sequências de aminoácidos que são iguais às sequências de aminoácidos da região V, de cadeia P e da região V, de cadeia L, respectivamente, de um anticorpo monoclonal que reage, especificamente, com CCR4.
33. 33. Fragmento do anticorpo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de compreender: aminoácidos das de aminoácidos aminoácidos das de aminoácidos uma região V, de cadeia P com posições 20-138 na sequência representada pela SEQ ID N°. 15; e uma região V, de cadeia L com posições 20-132 na sequência representada pela SEQ ID N°. 16.
34. 34. Anticorpo recombinante ou um seu fragmento, caracterizado pelo facto de o anticorpo recombinante ou o seu 7 fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 33, serem quimicamente ou geneticamente conjugados com um radioisótopo, uma proteína ou um agente.
35. 35. Processo in vitro para a detecção imunológica de CCR4, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de um anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34.
36. 36. Processo in vitro para a detecção imunológica de uma célula que expressa CCR4 na superfície da célula, caracterizado pelo facto de compreender a utilização do anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34.
37. 37. Processo in vitro para a redução ou a depleção de uma célula que expressa CCR4 na superfície da célula, caracterizado pelo facto de compreender a utilização do anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34.
38. 38. Processo in vitro para a inibição da produção da cito-cina Th2, caracterizado pelo facto de compreender a utilização do anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34.
39. 39. Medicamento, caracterizado pelo facto de compreender como ingrediente activo o anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34. 8
40. 40. Agente terapêutico ou de diagnóstico para doenças imunitárias mediadas por Th2, caracterizado pelo facto de compreender, como ingrediente activo, o anticorpo recom-binante ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34.
41. 41. Agente terapêutico ou de diagnóstico para cancro do sangue, caracterizado pelo facto de compreender como ingrediente activo o anticorpo recombinante ou um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34.
42. 42. Agente terapêutico ou de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de o cancro do sangue ser leucemia.
43. 43. Utilização de um anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22 e 28 a 34, caracterizado pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de cancros do sangue incluindo leucemia, doenças mediadas por Th2 incluindo doenças inflamatórias, tais como, hipersensibilidade aguda ou crónica das vias aéreas ou asma brônquica, doenças atópicas da pele incluindo dermatite atópica, rinite alérgica, polinose e doenças causadas pela inflamação de células competentes, tais como, células eosinofilicas ou mastócitos.
44. 44. Utilização, de acordo com a reivindicação 33, caracte-rizada pelo facto de a doença ser tratada pela redução ou depleção das células que expressam CCR4 na superfície da célula ou que podem ser tratadas pela inibição da produção de citocina Th2. Lisboa, 5 de Setembro de 2008 9