CN105722532A - 包含纯化的重组多肽的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从中国仓鼠卵巢宿主细胞分离的纯化的重组多肽，包括抗体(如治疗抗体)，以及该多肽的制备方法和使用方法。

Description

包含纯化的重组多肽的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年9月13日提交的美国临时申请号61/877,517的优先权的权益，在此通过引用以其整体并入。
序列表
本申请包含已通过EFS-Web提交的序列表，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年8月28日，被命名为2014.AUG.28P5704R1-WOSequenceListing.txt，大小34,811字节。
技术领域
提供了从中国仓鼠卵巢宿主细胞分离的纯化的重组多肽(包括抗体，如治疗性抗体)以及制备和使用此类多肽的方法。
背景技术
许多药物用于治疗哮喘和其他呼吸疾患已经上市或正在开发中。用于哮喘治疗的一个靶标是IL-13。IL-13是由激活的T细胞、NKT细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生的多效性TH2细胞因子，在临床前模型中已强烈暗示其参与哮喘的发病机理。以前已描述了IL-13拮抗剂，包括抗IL-13抗体。某些此类抗体也已经被开发用于人治疗。最近，一些研究表明针对IL-13的单克隆抗体在治疗哮喘中的临床活性(例如，见Corren等人,2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098；Gauvreau等人,2011,Am.J.Respir.Crit.CareMed.183,1007-1014；IngramandKraft,2012,J.AllergyClin.Immunol.130,829-42；Webb,2011,NatBiotechnol29,860-863)。在这些单克隆抗体中，lebrikizumab，一种中和IL-13活性的人源化IgG4抗体，改善了对大多数尽管用吸入糖皮质激素和长效β2-肾上腺素受体激动剂治疗了但仍然有症状的哮喘患者的肺功能(Corren等人,2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098)。
此外，已暗示IL-13参与许多其他过敏性和纤维化疾患。例如，由IL13介导的这类疾病和/或病症(condition)包括但不限于，过敏性哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病和骨质疏松。
为了使重组生物制药蛋白被接受用于人患者施用，重要的是从最终生物产物中除去制造和纯化方法中产生的残余杂质。这些方法组分包括培养基蛋白、免疫球蛋白亲和配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白。这些宿主细胞杂质包括方法特定的宿主细胞蛋白(HCP)，其是来自重组DNA技术的生物制剂中的方法相关杂质/污染物。尽管HCP通常少量(以每百万预期重组蛋白中的若干份或每毫克预期重组蛋白中的纳克)存在于最终药品(drugsubstance)中，公认HCP是不所期望的的、其数量应减到最小。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求用于人体内的生物制药应该尽可能地不含外来杂质，并且要求检测和定量潜在污染物/杂质(如HCP)的测试。
从细胞碎片纯化蛋白的步骤首先取决于蛋白质表达的位点。一些蛋白质直接从细胞分泌到周围的生长培养基；另一些蛋白质在细胞内生成。对于后者，纯化方法的第一步包括细胞裂解，这可以通过多种方法进行，包括机械剪切、渗透压休克、或酶处理。这种破坏使细胞的全部内容物释放到匀浆中，并且另外产生由于其尺寸小而难以除去的亚细胞碎片。这些通常通过离心或过滤除去。直接分泌的蛋白质也出现同样的问题，原因是细胞的自然死亡和蛋白质生产方法运行中细胞内宿主细胞蛋白质的释放。
一旦获得含有目的蛋白质的溶液，通常使用不同色谱法技术的组合试图从细胞产生的其他蛋白质中分离该目的蛋白质。通常情况下，这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度或大小分离蛋白质混合物。对于这些技术中的每种可采用几种不同的色谱法树脂，该色谱法树脂允许为所包含的特定蛋白质精确定制纯化方案。这些分离方法中每个的本质是，或者可以使蛋白质以不同的速率沿着柱向下移动、当其进一步向下通过柱时，实现物理分离的增加；或者使蛋白质选择性地粘附到分离介质，然后通过不同溶剂差异洗脱。在一些情况下，当杂质特异地粘附至柱、而感性趣的蛋白质并不特异地粘附至柱时，所期望的蛋白质从杂质分离，即，目的蛋白质存在于“流出液(flow-through)”。
离子交换色谱法，针对可交换的抗衡离子(counterion)命名，是适用于可电离分子的纯化方法。电离分子基于其带电基团与附着至固相支持基质的相反电荷的分子的非特异性静电相互作用被分离，由此阻滞那些与固相更强地相互作用的电离分子。每类电离分子的净电荷和其对基质的亲和力，根据带电基团的数量、各基团的电荷、与带电固相基质竞争相互作用的分子的性质而变化。这些差异导致离子交换色谱法对不同类型分子的分离。在使用离子交换色谱法典型的蛋白质纯化中，如在哺乳动物细胞培养物中的来自宿主细胞的许多蛋白质的混合物，被施加到离子交换柱。非结合分子被洗掉后，例如通过以逐步或梯度模式改变pH值、抗衡离子浓度等调节条件，从固相释放目的非特异性保留或阻滞的电离蛋白质，并将其从具有不同带电特性的蛋白质中分离出来。阴离子交换色谱法涉及目的阴离子分子在特定分离方法的pH和条件下与负性抗衡离子竞争与附着至固相基质上的带正电荷的分子的相互作用。与此相反，阳离子交换色谱法涉及目的阳离子分子在特定分离方法的pH和条件下与正性抗衡离子竞争与附着至固相基质上的带负电荷的分子的相互作用。混合模式离子交换色谱法(也称为多模式离子交换色谱法)涉及在相同的步骤中使用阳离子和阴离子交换色谱法介质的组合。特别是，“混合模式”指的是共价附着阳离子交换、阴离子交换、以及疏水相互作用部分的混合物的固相支持基质。
蛋白质的羟磷灰石色谱法涉及蛋白质的带电氨基或羧基与羟磷灰石上带相反电荷基团的非特异性相互作用，其中羟磷灰石和蛋白质的净电荷被缓冲液pH值控制。通过用离子如Ca2+或Mg2+置换非特异性蛋白质-羟磷灰石对完成洗脱。带负电的蛋白质基团由带负电的化合物(如磷酸盐)置换，从而洗脱净负电荷的蛋白质。
疏水相互作用色谱法(HIC)通常根据其表面疏水性的差异用于纯化和分离分子，如蛋白质。蛋白质的疏水基团与耦合到色谱法基质的疏水基团非特异性地相互作用。蛋白质表面疏水基团的数量和性质的差异导致蛋白质在HIC柱上差异阻滞，从而分离蛋白质混合物中的蛋白质。
亲和色谱法，利用了待纯化蛋白质和固定的捕获剂之间特异的结构上依赖(即，空间互补)的相互作用，其是一些蛋白质(例如抗体)的标准纯化选择。例如蛋白A是蛋白质(如抗体，其包含Fc区)亲和色谱法的有用的吸附剂。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)的41kD细胞壁蛋白，其以高亲和力(对人IgG约10-8M)结合抗体的Fc区。
重组多肽的纯化通常是使用结合-洗脱色谱法(B/E)或流出液(flow-through)(F/T)色谱法进行。以下简要描述这些方法。
结合-洗脱色谱法(B/E)：在B/E色谱法中，通常以最大化动态结合容量(DBC)上样产物至色谱法材料，然后确定洗涤和洗脱条件，从而在洗出液中获得最大产物纯度。
已描述了各种使用蛋白A亲和色谱法的B/E方法，包括各种中间洗涤液。例如，美国专利号6,127,526和6,333,398描述了蛋白A色谱法期间使用疏水性电解质(例如，四甲基氯化铵(TMAC)和四乙基氯化铵(TEAC))的中间洗涤步骤，以除去污染物，而不是结合至蛋白A柱的固定的蛋白A或目的蛋白质。美国专利号6,870,034描述了使用蛋白A亲和色谱法的另外的方法和洗涤液。
流出液色谱法(F/T)：使用F/T色谱法，确认其中杂质强力结合到色谱法材料，同时产物流出的上样条件。F/T色谱法允许标准单克隆抗体制剂(MAb)的高上样密度。
我们在总CHOPELISA测定法中、在CHO细胞中产生的重组抗IL13MAb制剂和某些其他重组多肽中、确定了一种酶，磷脂酶B样2，作为单个CHOP种类过量存在于可用抗体。如本文中所使用的，“PLB2”和“PLBL2”和“PLBD2”可互换使用并且是指“磷脂酶B样2”或其同义词，“磷脂酶B结构域样2”。关于PLBL2的某些科学出版物包括Lakomek,K.等人,BMCStructuralBiology9:56(2009)；Deuschi,等人,FEBSLett580:5747-5752(2006)。PLBL2作为亲本MW约66,000的前酶原被合成。其具有被去除的初始前导序列和潜在的6甘露糖-6-磷酸(M-6-P)基团在翻译后修饰过程中加入。M-6-P是靶向修饰的，将此酶通过M-6-P受体导向溶酶体。PLBL2含有6个半胱氨酸，其中两个具有游离的巯基、四个形成二硫键。在酸性环境中，PLBL2被进一步剪切成分别具有32,000和45,000MW的N-和C-末端片段。通过与其他溶酶体酶类推，这种切割是活化步骤，允许底物进入活性位点。
酶的仓鼠和人形式之间具有约80％PLBL2氨基酸序列同源性。认为酶的活性是从构成细胞膜的磷脂切割任一脂肪酸链。存在其他的具有不同底物切割特异性的磷脂酶。在微生物中存在相似的酶活性，其中，它们经常是毒力因子。尽管微生物具有类似的酶活性，但是产生该活性的蛋白质是不同的，在微生物和哺乳动物PLBL2酶之间具有低的序列同源性。磷脂酶产生游离脂肪酸(FFA)，作为底物水解的一个产物。游离脂肪酸本身是潜在的免疫信号传导因子。脱氢作用转化FFA为花生四烯酸，其可能参与涉及花生酸类的炎症级联。
确定了PLBL2作为CHO细胞中产生的重组抗IL13MAb制剂和某些其他重组多肽的单一HCP(CHOP)，我们开发了特异、灵敏和定量测定抗IL-13Mab制剂(和其他重组多肽产物)中和纯化的各阶段中PLBL2水平的试剂、方法和试剂盒。这些将在下面的实施例中以及美国临时专利申请号61/877,503和61/991,228中简单说明。此外，开发大规模、稳健和有效地纯化抗IL-13Mab(和其他重组多肽产物)的方法、以获得足以用于人治疗用途(包括后期临床和商业用途)的纯度的MAb(包括除去PLBL2)，存在艰巨的挑战。本文描述的发明满足某些上述需要，并提供了其他益处。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用将其全文并入。
发明内容
本发明是基于，至少部分地基于用于纯化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的重组多肽的方法的改进，所述方法提供具有大幅降低的仓鼠PLBL2水平的纯化产物。根据本发明的方法纯化的重组多肽，包括治疗性抗体，例如抗IL-13抗体，当施用于人受试者可能具有降低的免疫原性。
因此，在一个方面，提供了包含从含有抗IL-13抗体的CHO细胞纯化的抗IL-13单克隆抗体的组合物，所述组合物包含残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量在0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量组合物中仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白质ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在另一方面，提供了使用包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法从CHO细胞分离和纯化的抗IL-13单克隆抗体制剂。在某些实施方案中，纯化的制剂包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量在0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。在某些实施方案中，HIC步骤包括在流出模式操作含树脂柱。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液的每个包含50mM乙酸钠pH5.0。在某些实施方案中，在280纳米的吸光度监测流出液和收集0.5OD至1.5OD之间的流出液。在某些实施方案中，收集最多8个柱体积的流出液。在某些实施方案中，方法进一步包括亲和色谱法步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法是蛋白A色谱法。在某些实施方案中，方法进一步包括离子交换色谱法步骤。在某些实施方案中，离子交换色谱法为阴离子交换色谱法。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白质ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在又一方面，提供了从CHO细胞中分离的纯化抗IL-13单克隆抗体制剂。在某些实施方案中，该抗体制剂通过包括第一蛋白A亲和色谱法步骤，第二阴离子交换色谱法步骤，和第三疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法纯化，从而产生纯化的制剂。在某些实施方案中，纯化的制剂包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量在0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，阴离子交换色谱法步骤包括QSEPHAROSETMFastFlow，和HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱，阴离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含QSEPHAROSETMFastFlow树脂的柱，以及HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白质ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在又一方面，提供了纯化CHO细胞中生产的重组多肽的方法，其中所述方法提供了包含重组多肽和残留量仓鼠PLBL2的纯化制剂。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量在0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，重组多肽选自生长因子、细胞因子、抗体、抗体片段和免疫粘附素。在某些实施方案中，重组多肽是抗体。在某些实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG1、或IgG2或IgG3或IgG4。在某些实施方案中，抗体是IgG1。在某些实施方案中，抗体是IgG2。在某些实施方案中，抗体是IgG3。在某些实施方案中，抗体是IgG4。在某些实施方案中，方法包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。在某些实施方案中，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。
在上述纯化方法的某些实施方案中，纯化的抗体是抗IL-13。在某些实施方案中，抗体是lebrikizumab。在某些实施方案中，HIC步骤包括在流出模式操作含树脂柱。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠pH5.0。在某些实施方案中，在280纳米的吸光度监测流出液和收集0.5OD至1.5OD之间的流出液。在某些实施方案中，收集最多8个柱体积的流出液。在某些实施方案中，方法进一步包括亲和色谱法步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法是蛋白A色谱法。在某些实施方案中，方法进一步包括离子交换色谱法步骤。在某些实施方案中，离子交换色谱法为阴离子交换色谱法。在某些实施方案中，方法包括第一蛋白A亲和色谱法步骤，第二阴离子交换色谱法步骤和第三疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，阴离子交换色谱法步骤包括QSEPHAROSETMFastFlow和HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱，阴离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含QSEPHAROSETMFastFlow树脂的柱，以及HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在上述纯化方法的某些实施方案中，纯化的抗体是抗Aβ。在某些实施方案中，抗Aβ抗体是crenezumab。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：23的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：24的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：25的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：26的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：27的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：28的CDR-L3。在某些实施方案，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。在某些实施方案中，HIC步骤包括在流出模式操作含树脂柱。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠pH5.0。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠pH4.0。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠、240mM硫酸钠pH4.0。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包括150mM乙酸钠、240mM硫酸钠pH5.0。在某些实施方案中，上样密度为300g/L。在某些实施方案中，上样密度为100g/L。在某些实施方案中，在280纳米吸光度下监测流出液并在0.5OD开始收集流出液，收集持续10个柱体积。在某些实施方案中，方法进一步包括亲和色谱法步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法是蛋白A色谱法。在某些实施方案中，方法还包括混合模式色谱法步骤。在某些实施方案中，方法包括第一蛋白A亲和色谱法步骤，第二混合模式色谱法步骤和第三疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，混合模式色谱法步骤包括CAPTOTMAdhere树脂，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱，混合模式色谱法步骤包括在流出模式操作含CAPTOTMAdhere树脂的柱，HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂的柱。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在上述纯化方法的又一方面，纯化的抗体是IgG1。在一些实施方案中，抗体是抗IL17A/F。在一些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：15的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：16的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：17的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：18的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：19的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：20的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。在某些实施方案中，HIC色谱法步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠pH5.5。在某些实施方案中，在280纳米吸光度下监测流出液并在0.5OD开始收集流出液，收集持续10个柱体积。在某些实施方案中，方法进一步包括亲和色谱法步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法是蛋白A色谱法。在某些实施方案中，方法还包括阳离子交换色谱法步骤。在某些实施方案中，方法包括第一蛋白A亲和色谱法步骤，第二阳离子交换色谱法步骤和之后的疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，阳离子交换色谱法步骤包括POROS50HS树脂，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂。在某些实施方案中，亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱，阳离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含POROS50HS树脂的柱，HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
在又一方面，提供了通过包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法从CHO细胞纯化的抗Aβ单克隆抗体制剂。在某些实施方案中，纯化的制剂包含抗Aβ抗体和残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量为0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。在某些实施方案中，HIC步骤包括在流出模式操作含树脂的柱。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠pH5.0。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠pH4.0。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠、240mM硫酸钠pH4.0。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含150mM乙酸钠、240mM硫酸钠pH5.0。在某些实施方案中，上样密度为300g/L。在某些实施方案中，上样密度为100g/L。在某些实施方案中，在280纳米吸光度下监测流出液并在0.5OD开始收集流出液，收集持续10个柱体积。在某些实施方案中，方法进一步包括亲和色谱法步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法是蛋白A色谱法。在某些实施方案中，方法还包括混合模式色谱法步骤。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：23的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：24的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：25的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：26的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：27的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：28的CDR-L3。在某些实施方案，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在一个方面，提供了通过包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法从CHO细胞分离和纯化的抗IL17A/F单克隆抗体制剂。在某些实施方案中，纯化的制剂包含抗IL17A/F抗体和残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量为0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。在某些实施方案中，HIC步骤包括在流出模式操作含树脂的柱。在某些实施方案中，HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中每个平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠pH5.5。在某些实施方案中，在280纳米的吸光度监测流出液和在0.5OD之间收集流出液，收集持续10个柱体积。在某些实施方案中，方法进一步包括亲和色谱法步骤。在某些实施方案中，亲和色谱法是蛋白A色谱法。在某些实施方案中，方法还包括阳离子交换色谱法步骤。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：15的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：16的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：17的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：18的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：19的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：20的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：32的轻链可变区。在某些实施方案中，使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。在某些实施方案中，免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。在某些实施方案中，质谱测定法是LC-MS/MS。
在又一方面，提供了包含从含有抗Aβ抗体的CHO细胞纯化的抗Aβ单克隆抗体的组合物，所述组合物包含残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量为0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，抗Aβ抗体是crenezumab。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：23的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：24的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：25的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：26的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：27的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：28的CDR-L3。在某些实施方案，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。在某些实施方案中，抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。
在又一方面，提供了包含由含有抗IL17A/F抗体的CHO细胞纯化的抗IL17A/F单克隆抗体的组合物，所述组合物包含残留量的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，组合物包含抗IL17A/F抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量为0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：15的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：16的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：17的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：18的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：19的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：20的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。
在一个方面，提供了治疗IL-13介导的疾患的方法，所述方法包括施用包含从CHO细胞纯化的抗IL-13单克隆抗体和残留量的仓鼠PLBL2的治疗组合物。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于15ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于10ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于8ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于3ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于2ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于1ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量小于0.5ng/mg。在某些实施方案中，仓鼠PLBL2的量为0.5ng/mg和20ng/mg之间，或0.5ng/mg和15ng/mg之间，或0.5ng/mg和10ng/mg之间，或0.5ng/mg和8ng/mg之间，或0.5ng/mg和5ng/mg之间，或0.5ng/mg和3ng/mg之间，或0.5ng/mg和2ng/mg之间，或0.5ng/mg和1ng/mg之间，或定量测定法的极限(LOQ)和1ng/mg之间。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含三个重链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，和三个轻链CDR，具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。在某些实施方案，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。在某些实施方案中，抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。在某些实施方案中，治疗组合物每四周皮下施用一次。在某些实施方案中，治疗组合物每八周皮下施用一次。在某些实施方案中，治疗组合物每12周皮下施用一次。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少一个月。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少三个月。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少六个月。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少九个月。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少12个月。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少18个月。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续至少两年。在某些实施方案中，患者每四周治疗一次，持续超过两年。在某些实施方案中，IL-13介导的疾患是哮喘。在某些实施方案中，IL-13介导的疾患是特发性肺纤维化。在某些实施方案中，IL-13介导的疾患是特应性皮炎。在某些实施方案中，IL-13介导的疾患选自过敏性哮喘、非过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病和骨质疏松症。
另一个方面，根据任何上述方法向患者施用的治疗组合物相比于施用参考组合物，对仓鼠PLBL2的免疫原性更低，其中所述参考组合物包含从中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗IL-13单克隆抗体和残留量大于30ng/mg的仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，参考组合物中的仓鼠PLBL2的量大于50ng/mg。在某些实施方案中，参考组合物中的仓鼠PLBL2的量大于100ng/mg。在某些实施方案中，参考组合物中的仓鼠PLBL2的量大于200ng/mg。在某些实施方案中，参考组合物中的仓鼠PLBL2的量大于300ng/mg。在某些实施方案中，参考组合物中的仓鼠PLBL2的量为30ng/mg和300ng/mg之间，或30ng/mg和200ng/mg之间，或30ng/mg和100ng/mg之间，或30ng/mg和50ng/mg之间。
附图说明
图1示出如实施例2所述，抗IL-13MAb的辛酸处理的蛋白A池中总CHOP的水平。(A)蛋白A池在pH4.5的辛酸沉淀。(B)蛋白A池在pH5.0的辛酸沉淀。沿纵轴指示以ng/mg计的CHOP水平；沿横轴示出辛酸的百分比，每个棒代表来自2倍连续稀释的值。
图2示出如实施例2所示，在蛋白A色谱法以及其后的50HS上的阳离子交换色谱法后，在添加剂处理的HCCF抗IL-13Mab中总CHOP的水平。纵轴显示以ng/ml计的修正的CHOP水平；横轴表示添加剂(对照、0.6M胍、或0.6M精氨酸)，每个棒代表所示的来自2倍连续稀释的值。
图3示出如实施例2所示，在不同的盐和pH条件下、进行不同的HIC树脂的抗IL-13MAb的UFDF池中总CHOP的水平。(A)FastFlow树脂；(B)PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(lowsub)树脂；(C)4FastFlow树脂；(D)PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂；最高稀释的CHOP(以ppm计)示于纵轴，硫酸钠的浓度示于横轴；pH值(5.5，6.0，7.0或8.0由图例指示。
详细说明
除非另外定义，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第二版，J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1994),以及March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure第四版,JohnWiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)，为本领域技术人员提供本申请使用的许多术语的一般指导。
某些定义
为了解释本说明书的目的，将应用下列定义，在任何适当的时候，以单数使用的术语也包括复数，反之亦然。如果下面阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件发生冲突，以下面提出的定义为准。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种蛋白质”或“一种抗体”分别包括多个蛋白质或抗体；提及“一种细胞”包括细胞的混合物，等等。
术语“检测”在本文中用于最广泛的意义，包括靶分子的定性和定量测量。检测包括仅识别靶分子在样品中的存在，以及确定所述靶分子是否在样品中以可检测的水平存在。
“样品”指的是大量材料的一小部分。通常，根据本文所述的方法对样品进行测试。样品典型地从获得的重组多肽制备物得到，例如，重组多肽制备物从培养的宿主细胞得到。样品可以从，例如但不限于从收获的细胞培养液得到、从纯化方法的特定步骤中、进程(in-process)池中得到，或者从最终纯化产物得到。
如本文所描述的术语“产物”是待由各种色谱方法纯化的物质；例如，多肽。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。该术语还包括天然地或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。还包括在该定义内的是，例如，含有一种或多种氨基酸类似物的多肽(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰。如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”特别涵盖抗体。
“纯化的”多肽(例如，抗体或免疫粘附素)是指该多肽已经增加了纯度，使得其以比其在其天然环境和/或初始合成时和/或在实验室条件下扩增时更纯的形式存在。纯度是一个相对的术语，并不一定意味着绝对纯度。
术语“标记表位”在用于本文时是指嵌合多肽，其包含融合到“标签多肽”的多肽。标签多肽具有足够的残基以提供表位，针对这些表位可制备抗体，但其也足够短使得它不干扰与它融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得抗体基本上不与其他表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少六个氨基酸残基，通常在约8和50个氨基酸残基之间(在某些情况下，约10至20个氨基酸残基之间)。
本文中“活性的”或“活性”是指保留目的生物和/或免疫活性的多肽形式，其中“生物”活性指由多肽引起的生物学功能(抑制的或刺激的)，而不是诱导抗多肽具有的抗原表位的抗体产生的能力，“免疫学”活性指诱导抗多肽具有的抗原表位的抗体产生的能力。
术语“拮抗剂”以最广的意义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和天然多肽(例如，细胞因子)的生物活性的任何分子。以类似的方式，术语“激动剂”以最广的意义使用，包括模拟天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子具体地包括激动或拮抗性抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体，等等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，测量通常与该多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
“结合”目的抗原(例如肿瘤相关的多肽抗原靶)的多肽，是以足够的亲和力结合抗原的多肽，使得该多肽可作为检测试剂、诊断和/或治疗剂用于靶向含有抗原的样品、表达抗原的细胞或组织，并且不显著地与其他多肽交叉反应。
关于多肽与靶分子的结合，术语“特异的结合”或“特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位是指结合可检测程度地不同于非特异性相互作用。特异的结合，例如，可通过与对照分子的结合相比较测定分子的结合来确定，对照分子通常为结构类似的不具有结合活性的分子。例如，通过与类似于靶标的对照分子的竞争来确定特异的结合，例如，过量的未标记靶标。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。
术语“抗体”在本文中以最广的意义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出所期望的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体互换使用。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的结构，全部基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体有二硫键键合的两个“重”链和两个“轻”链，形成功能性抗体。每条重链和轻链本身包含“恒定区”(C)和“可变区”(V)。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支撑和与免疫效应子非抗原特异性相互作用中的功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特性决定。可变性并非均匀分布在可变结构域的110个氨基酸跨度。相反，V区由称为构架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的片段和称为“高变区”的、每个为9-12个氨基酸长的极端可变性的较短区域组成，构架区被高变区分开。天然重链和轻链的每个可变结构域包含四个FR，其主要采取β折叠构型，通过三个高变区连接，形成环连接，在某些情况中形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第五版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，如抗体参与的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
每个V区通常包含三个互补决定区(“CDR”，其每个包含一个“高变环”)和四个构架区。因此抗体结合位点(以大量亲和力结合具体所期望的抗原所必须的最小结构单元)通常包括三个CDR，和至少三个，优选四个，穿插其间的框架区，以使CDR保持和呈现在适当的构象中。经典的四链抗体具有VH和VL结构域协同限定的抗原结合位点。某些抗体，如骆驼和鲨鱼抗体缺乏轻链，依靠仅由重链形成的结合位点。可以制备单结构域工程化的免疫球蛋白，其中结合位点单独由重链或轻链形成，不存在VH和VL之间的协同。
在用于本文时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的某些氨基酸残基。高变区可包含来自如上讨论的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在VL中约为残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和在VH中约为31-35B(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，在VL中残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和在VH中26-32(H1)，52A-55(H2)和96-101(H3)(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
“框架区”或“FR”残基是除文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)，线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体，单可变结构域抗体，微抗体，单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc,taDb-Fc,taDb-CH3,(scFV)4-Fc,di-scFv,bi-scFv,或串联(di,tri)-scFv)；和双特异性T细胞接合器(BiTE)。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个具有单抗原结合位点)和残余的“FC”片段(其名称反映出其易于结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变结构域紧密、非共价结合的二聚体组成。正是在这种构型中，各可变结构域的三个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含特异于抗原的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整结合位点相比亲和力更低。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段不同于Fab片段，其在重链CH1结构域的羧基末端增加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初作为其之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入基于其恒定结构域的氨基酸序列的两种截然不同类型中的一种，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体可归入不同的种类。完整抗体有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定结构域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同种类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，使得scFv能够形成用于抗原结合的所期望的结构。关于scFv的综述参见PlückthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于，例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
术语“多特异性抗体”以最广的意义使用，特别地覆盖具有多表位特异性的抗体。这样的多特异性抗体包括但不限于，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性；具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，其中每个VHVL单元结合不同的表位；具有两个或更多个单可变结构域的抗体，其中每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗体，双特异性双抗体，三抗体，三官能抗体，已被共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指的是特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”指的是仅结合一个表位的能力。根据一个具体实施方案，多特异性抗体是以亲和力5μM至0.001pM,3μM至0.001pM,1μM至0.001pM,0.5μM至0.001pM,或0.1μM至0.001pM结合每个表位的IgG抗体。
表述“单结构域抗体”(sdAbs)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常是指其中单可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，所述单可变结构域不需要为了识别靶抗原与另一个可变结构域相互作用。单结构域抗体的例子包括来自骆驼科(lamas和骆驼)和软骨鱼类(例如，铰口鲨)的和由重组方法来自人和小鼠抗体的那些(Nature(1989)341:544-546；DevCompImmunol(2006)30:43-56；TrendBiochemSci(2001)26:230-235；TrendsBiotechnol(2003):21:484-490；WO2005/035572；WO03/035694；FebsLett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO02/051870)。
如文中使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，构成群的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了生产单克隆抗体的过程中出现的可能的变体，这种变体通常少量存在。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性，单克隆抗体的优点在于其未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示由于从基本上同质群的抗体获得的抗体特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本文提供的方法中使用的单克隆抗体可通过Kohler等人,Nature256:495(1975)最初描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。该“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要其表现出期望生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中目的嵌合抗体包括包含源自非人灵长类动物的可变结构域抗原结合序列(例如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)和人恒定区序列(美国专利号5，693，780)的“灵长类化”抗体。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区替代，如具有所期望的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含受体抗体中或供体抗体中不存在的残基。做出这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般地，除了以上提及的FR取代，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变结构域的全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，以及FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区的至少部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。为了解更多详情，参见Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；andPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
为了本文的目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域和Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链间二硫键联的数量不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域排列在一起，轻链可变结构域与重链的可变结构域排列在一起。特定氨基酸残基被认为形成轻链和重链可变结构域之间的交界。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，如果需要引入缺口，达到最大百分比的序列同一性，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。可以本领域技术范围内的各种方式实现测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对，例如，使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当的参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。但是，对于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档提交给美国版权局，华盛顿，20559，其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可公开获自Genentech,Inc.，南圣弗朗西斯科，加利福尼亚，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数字UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
当ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相较于、与、或针对给定氨基酸序列B(或者可表述为相较于、与、或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)的％氨基酸序列同一性如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是在A和B的程序比对中由序列对比程序ALIGN-2打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相较于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相较于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值如紧接在前面的段落中所述，使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“抗IL-13抗体”和“结合IL-13的抗体”是指能够以足够的亲和力结合IL-13的抗体，使得该抗体用作为靶向IL-13的诊断和/或治疗剂。在一些实施方案中，抗IL-13抗体结合至不相关的、非IL-13蛋白的程度小于所测量(例如，通过放射免疫测定法(RIA))的抗体与IL-13结合的约10％。在某些实施方案中，结合IL-13的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的离解常数(Kd)(例如，10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。在特定实施方案中，抗IL-13抗体结合来自不同物种的IL-13中保守的IL-13表位。
“IL-13介导的疾患”是指与过量IL-13水平或活性相关的疾患，其中由于身体局部和/或全身的IL-13水平或活性可表现非典型症状。IL-13介导的疾患的实例包括：癌症(例如，非霍奇金淋巴瘤，胶质母细胞瘤)、特应性皮炎、过敏性鼻炎、哮喘、纤维变性、炎性肠病、克罗恩病、肺的炎性疾患(包括肺纤维化，如IPF)、COPD、和肝纤维化。
术语“呼吸系统疾患”包括但不限于，哮喘(例如，过敏性和非过敏性哮喘(例如，由于如呼吸道合胞病毒(RSV)感染，例如在年幼的儿童))；支气管炎(例如，慢性支气管炎)；慢性阻塞性肺疾病(COPD)(例如，肺气肿(例如，香烟引起的肺气肿)；涉及气道炎症的病症，嗜酸粒细胞增多症，纤维化和过量粘液产生，例如，囊性纤维化，肺纤维化和过敏性鼻炎。可由气道炎症、过度气道分泌、以及气道阻塞表征的疾病的实例包括哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张、和囊性纤维化。
术语“治疗剂”是指用于治疗疾病的任何试剂。治疗剂可以是，例如，多肽(例如，抗体、免疫粘附素或肽体)，可结合蛋白质或核酸分子(其可以结合编码靶标的核酸分子(即，siRNA))的适体或小分子，等等。
“裸抗体”是不缀合异源分子(如细胞毒性部分或放射性标记)的抗体(如本文定义)。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指其中已引入外源核酸的细胞，包括该细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和不考虑传代数目的来自原代转化细胞的后代。后代可能在核酸含量上与亲代细胞不完全相同，但也可以含有突变。本文包括具有与针对最初转化细胞所筛选或选择的相同的功能或生物活性的突变后代。
如本文所用的术语“载体”，是指能够繁殖其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体，以及掺入其所导入的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能指导表达其可操作地连接的核酸。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
“分离的”抗体是从其天然环境成分中分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过，例如，电泳(例如，SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。对于评估抗体纯度方法的综述，见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
如本文中所用的关于色谱法的术语“相继的”指的是具有第一色谱法以及随后的第二色谱法。第一色谱法和第二色谱法之间可以包括额外步骤。
如本文中所用的关于色谱法的术语“连续的”指的是具有直接连接或一些其他机制连接的第一色谱法材料和第二色谱法材料，所述其他机制允许在两个色谱法材料之间连续流动。
“杂质”和“污染物”是指不同于所期望的多肽产物的物质。杂质和污染物包括但不限于：宿主细胞物质，如CHOP，包括单一CHOP物种；过滤的蛋白A；核酸；所期望的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；其他多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分等。在一些实例中，污染物可能是宿主细胞蛋白(HCP)，所述宿主细胞蛋白来自例如，但不限于，细菌细胞，如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞。
术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”可互换使用，指的是来自中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP一般作为包含目的蛋白(如CHO细胞中表达的抗体或免疫粘附素)的细胞培养基或裂解物(例如，收获的细胞培养液(“HCCF”))中的杂质存在。包含目的蛋白质的混合物中CHOP存在的量提供目的蛋白质的纯度程度的量度。HCP或CHOP包括但不限于，宿主细胞，如CHO宿主细胞表达的目的蛋白质。通常情况下，蛋白质混合物中CHOP的量以相对于混合物中目的蛋白质的量的每百万份表示。可以理解的是，其中宿主细胞是其他哺乳动物细胞类型、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、或植物细胞时，HCP是指存在于宿主细胞裂解物中的不是靶蛋白的蛋白质。
术语“每百万份”或“ppm”在本文中可互换使用，指本发明方法纯化的目的蛋白质的纯度的量度。单位ppm指的是每以毫克/毫升计的目的蛋白质中纳克/毫升的HCP或CHOP的量(即，CHOPppm＝(CHOPng/ml)/(目的蛋白质mg/ml)，其中蛋白质在溶液中)。其中蛋白质被干燥时(例如通过冻干)，ppm指(CHOPng)/(目的蛋白质mg))。杂质也可以表示为“ng/mg”，其与ppm可互换使用。
从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中“纯化”多肽是指通过从组合物中除去(完全或部分)至少一种杂质增加组合物中多肽的纯度程度。
“纯化步骤”可以是产生“均质”组合物的整个纯化方法中的一部分，“均质”组合物在本文中用于指在含有目的蛋白质的组合物中包含小于100ppmHCP(100ng/mg)、或小于90ppm(90ng/mg)、或小于80ppm(80ng/mg)、或小于70ppm(70ng/mg)、或小于60ppm(60ng/mg)、或小于50ppm50ng/mg)、或小于40ppm(40ng/mg)、或小于30ppm(30ng/mg)、或小于20ppm(20ng/mg)、或小于10ppm(10ng/mg)、或小于5ppm(5ng/mg)、或小于3ppm(3ng/mg)或小于1ppm(1ng/mg)的杂质的组合物。在某些实施方案中，HCP是单一HCP种类。在一个实施方案中，单一HCP种类是仓鼠PLBL2。
文中待纯化“组合物”包含目的多肽和一种或多种杂质或污染物。该组合物可被“部分纯化”(即，已经经过一个或多个纯化步骤)，或者可直接获得自产生多肽的宿主细胞或生物体(例如，组合物可包含收获的细胞培养液)。
术语“蛋白质A”和“ProA”在本文中可互换使用，包括从其天然来源物回收的蛋白A、合成(例如，通过肽合成或通过重组技术)产生的蛋白A、以及保留了结合具有CH2/CH3区(如Fc区)的蛋白质的能力的其变体。蛋白A可商购自各种来源。蛋白A通常固定在固相载体材料上。术语“ProA”还指含有共价附着蛋白A的色谱固体支持物基质的亲和色谱法树脂或柱。
术语“色谱法”是指这样的方法，由于在移动相的影响下、或在结合-洗脱过程中，混合物中的各溶质通过静止介质的迁移速率不同，从而通过该方法从混合物的其他溶质中分离混合物中的目的溶质。
术语“亲和色谱法”和“蛋白质亲和色谱法”在本文中可互换使用，是指一种蛋白质分离技术，其中目的蛋白质或目的抗体可逆地和特异性地结合至生物特异性配体。通常，所述生物特异性配体共价附着于色谱法固相材料，当溶液与色谱法固相材料接触时，溶液中的目的蛋白质可接近该生物特异性配体。在色谱法步骤中目的蛋白质(例如，抗体、酶或受体蛋白)保留其对生物特异性配体(例如，抗原、底物、辅因子、或激素)的特异性结合亲和力，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质不明显或特异性地结合至配体。目的蛋白质与固定的配体的结合允许污染的蛋白质或蛋白质杂质通过色谱法介质流出而目的蛋白质仍然特异性地结合于固相材料上固定的配体。然后利用低pH、高pH、高盐、竞争性配体等从固定的配体除去活性形式的特异性结合的目的蛋白质，并利用洗脱缓冲液使目的蛋白质流过色谱柱，其不含较早允许流过柱的污染性蛋白质或蛋白质杂质。任何组分可作为配体用于纯化它的各自特异性结合蛋白，例如抗体。
术语“非亲和色谱法”和“非亲和纯化”指其中未利用亲和色谱法的纯化方法。非亲和色谱法包括依赖于目的分子(如蛋白质，例如抗体)和固相基质之间的非特异性相互作用的色谱法技术。
如本文在色谱法上下文中使用的术语“特异性结合”，如描述目的分子和结合于固相基质的配体之间的相互作用，指的是目的蛋白质通过蛋白质和配体结构在结合位点的空间互补性加上在结合位点的静电力、氢键键合、疏水力和/或范德华力的组合效应，通常可逆地结合配体。空间互补性越大、在结合位点的其他力越强，蛋白质与其相应配体的结合特异性越大。非限制性的特异性结合包括抗体-抗原结合、酶-底物结合、酶-辅因子结合、金属离子螯合、DNA结合蛋白-DNA结合、调控蛋白-蛋白相互作用，等。典型地，在亲和色谱法上发生在自由溶液中亲和力约10-4至10-8M的特异性结合。
在本文色谱法的上下文中使用的术语“非特异性结合”，如描述目的分子和结合于固相基质的配体或其他化合物之间的相互作用，是指目的蛋白通过在相互作用位点上的静电力、氢键、疏水力和/或范德华力结合固相基质上的配体或化合物，但缺乏增强非结构性力的效应的结构互补性。非特异性相互作用的实例包括但不限于，静电力、疏水力和范德华力以及氢键键合。
“盐”是由酸和碱的相互作用形成的化合物。示例性的盐包括但不限于，乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、氯盐(例如氯化钠)、硫酸盐(例如，硫酸钠)、或钾盐。
如本文所用，“溶剂”是指能够溶解或分散一种或多种其他物质，以提供溶液的液体物质。溶剂包括水和有机溶剂，其中，某些有机溶剂包括非极性溶剂、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、己二醇、丙二醇、和2,2-硫二甘醇。
术语“去污剂”是指离子和非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基磺酸钠；辛钠配糖体；月桂基-、十四烷基-、亚油基-、或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、十四烷基-、亚油基-或硬脂基肌氨酸；亚油基-、十四烷基-、或十六烷基甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-，palmidopropyl-、或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、palmidopropyl-、或异硬脂酰胺丙基二甲胺；钠甲基椰油酰基-、或二钠甲基油烯基月桂酸酯；和MONAQUAT(tm)系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,NewJersey)，聚山梨醇酯，如聚山梨酯20(TWEEN20(r))或聚山梨醇酯80(TWEEN80(r))。
在本文中“聚合物”是由两种或更多种单体共价连接形成的分子，其中所述单体不是氨基酸残基。聚合物的例子包括但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、和共聚物(例如PLURONICSTM，PF68等)，聚乙二醇(PEG)，例如PEG400和PEG8000。
术语“离子交换”和“离子交换色谱法”指的是色谱方法，其中混合物中目的溶质(如蛋白质)与连结(例如通过共价连接)至固相离子交换材料的带电化合物相互作用，使得目的溶质比混合物中溶质杂质或污染物更多或更少地非特异性地与带电化合物相互作用。混合物中的污染溶质比目的溶质更快或更慢从离子交换材料柱洗脱，或相对于目的溶质结合树脂或从树脂排出。“离子交换色谱法”具体包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式色谱法。
短语“离子交换材料”是指带负电荷(即，阳离子交换树脂)或带正电荷(即，阴离子交换树脂)的固相。电荷可通过将一个或多个带电配体附着(例如可以共价连接)至固相提供。可替代地，或另外地，电荷可以是固相的固有特性(例如，如二氧化硅的情况下，其具有整体负电荷)。
“固相”是指非水性基质，其可附着一个或多个带电配体。固相可以是纯化柱、离散颗粒的不连续相、膜、或者过滤器等。用于形成固相的材料的例子包括多糖(如琼脂糖和纤维素)；和其他机械稳定的基质如二氧化硅(例如可控孔度玻璃)，聚(苯乙烯二乙烯)苯，聚丙烯酰胺，陶瓷颗粒和上述任何的衍生物。
“阳离子交换树脂”是指带负电荷的固相，因此其具有游离的阳离子与流经或流过固相的水性溶液中的阳离子交换。附着到固相、以形成阳离子交换树脂的带负电荷的配体可以是，例如，羧酸盐或磺酸盐。市售的阳离子交换树脂包括但不限于：固定在琼脂糖上的羧基甲基纤维素，磺丙基(SP)(例如SP-SEPHAROSEFASTFLOW(或SP-SEPHAROSEHIGHPERFORMANCE))和固定在琼脂糖和HS上的磺酰基(例如，S-SEPHAROSEFASTFLOW)。
“混合模式离子交换树脂”是指共价修饰具有阳离子、阴离子、和疏水部分的固相。混合模式离子交换也被称为“多模式离子交换”。市售的混合模式离子交换树脂是可用的，例如，BAKERBONDABX，其含有弱阳离子交换基团，低浓度的阴离子交换基团，和附着至二氧化硅固相支持基质的水性配体。另外的示例性混合模式离子交换树脂包括但不限于，CAPTOTMAdhere树脂、QMA树脂、CAPTOTMMMC树脂、MEPHyperCel树脂、HEAHyperCel树脂、PPAHyperCel树脂、或ChromaSorb膜或SartobindSTIC。在一些实施方案中，混合模式材料是CAPTOTMAdhere树脂。
术语“阴离子交换树脂”在本文中用于指带正电的固相，例如，其具有与其附着的一个或多个带正电荷的配体，如季氨基团。市售的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAESEPHADEX和FASTQSEPHAROSETM和QSEPHAROSETMFASTFLOW。
“缓冲液”是通过其酸碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可使用的各种缓冲液，例如，取决于所期望的缓冲液pH，描述于Buffers.AGuideforthePreparationandUseofBuffersinBiologicalSystems,Gueffroy,D.,ed.CalbiochemCorporation(1975)。在某些情况下，缓冲液具有的pH值范围从约2至约9，或者从约3至约8，或者从约4至约7，或者从约5至约7。将pH控制在该范围内的缓冲液的非限制性例子包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、以及铵缓冲液、以及它们的组合。
术语“疏水相互作用色谱法”或“HIC”在本文中用于指基于分子的疏水性分离分子的色谱方法。可用于HIC的示例性树脂包括但不限于苯基-、丁基-、辛基-SEPHAROSE、4FastFlow、PHENYLSEPHAROSETMHighPerformance、PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(lowsub)、和PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)。通常，将高盐缓冲液中的样品分子上样到HIC柱。缓冲液中的盐与水分子相互作用以降低溶液中分子的溶剂化，由此暴露样品分子的疏水区，其随后由HIC柱吸附。分子疏水性越强，促进结合所需的盐越少。通常情况下，使用递减的盐梯度从柱上洗脱样品。由于离子强度降低，分子亲水区的暴露增加，分子从柱上洗脱以增加疏水性。也可以通过向洗脱缓冲液中加入温和的有机改性剂或去污剂实现样品的洗脱。
“上样缓冲液”是用来向离子交换树脂上样包含目的多肽分子和一种或多种杂质的组合物的缓冲液。上样缓冲液具有导电性和/或pH，以使目的多肽分子(通常以及一种或多种杂质)结合至离子交换树脂，或使目的蛋白质流过柱而杂质结合至树脂。
“中间缓冲液”用于在洗脱目的多肽分子之前从离子交换树脂洗脱一种或多种杂质。中间缓冲液的导电性和/或pH使得一种或多种杂质从离子交换树脂洗脱，但目的多肽的量不显著。
当用于本文时，术语“洗涤缓冲液”是指在目的多肽分子洗脱前用于洗涤或再平衡离子交换树脂的缓冲液。在某些情况下，为方便起见，洗涤缓冲液和上样缓冲液可以是相同的，但是这不是必需的。
在“洗脱缓冲液”用于从固相洗脱目的多肽。洗脱缓冲液的导电性和/或pH使得目的多肽从离子交换树脂洗脱。
“再生缓冲液”可用于再生离子交换树脂，使得它可以被重新使用。再生缓冲液具有从离子交换树脂基本上除去所有杂质和目的多肽所需的导电性和/或pH。
术语“导电性”是指水性溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水性溶液中存在的离子含增的增加，溶液将具有较高的导电性。导电性的测量单位为每厘米milliSeimens(mS/cm)，并且可以使用例如，Orion出售的电导仪测量。可以通过改变其中的离子浓度改变溶液的导电性。例如，为了实现期望的导电性，可以改变溶液中的缓冲液浓度和/或盐(例如NaCl或KCl)浓度。
多肽的“pI”或“等电点”是指该多肽的正电荷与其负电荷平衡的pH。pI可从氨基酸残基的净电荷计算，或从附着多肽的碳水化合物的唾液酸残基计算，或者可以通过等电点聚焦来确定。
分子与离子交换材料“结合”是指在合适的条件(pH/导电性)下使分子暴露于离子交换材料，使得所述分子通过分子与离子交换材料的带电基团(一个或多个)之间的离子相互作用可逆地固定在离子交换材料内或上。
“洗涤”离子交换材料是指使适当的缓冲液流过或流经离子交换材料。
至于从离子交换材料“洗脱”分子(例如多肽或杂质)是指，通过改变环绕离子交换材料的缓冲液的离子强度，使得缓冲液与分子竞争离子交换材料上的带点位点，而从离子交换材料上除去分子。
“超滤”是膜过滤的形式，其中静压迫使液体透过半透膜。悬浮固体和高分子量溶质保留，而水和低分子量溶质流过膜。在一些实例中，超滤膜具有1至100nm范围的孔径大小。术语“超滤膜”和“超滤过滤器”可以互换使用。
“渗滤”是结合超滤膜从溶液除去盐或其他微溶剂的方法。小分子从溶液中分离，同时较大分子保留在滞留物中。该方法选择性地利用可渗透的(多孔的)膜过滤器，以基于它们的分子大小分离溶液和悬浮液的组分。
如本文所用，“滤液”指的是穿过过滤膜的样品部分。
如本文所用，“滞留物”指的是基本上由滤膜保留的样品部分。
术语“药物制剂”是指一种制剂，其是使得其中包含的活性成分的生物活性是有效的形式，并且不含有对施用该制剂的受试者是不可接受的毒性的其他成分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中非活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(及其语法变形如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指临床介入以试图改变被治疗个体的自然进程，并且可以用于预防或临床病理学过程中进行。治疗所期望的效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展率、改善或缓解疾病状态、及缓解或改善预后。在一些实施方案中，抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
文中提及的“约”某值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
抗IL-13抗体
在一些实施方案中，提供结合IL-13的分离的和纯化的抗体。示例性抗IL-13抗体是已知的，包括但不限于，例如，lebrikizumab、IMA-026、IMA-638(也称为anrukinzumab，INN编号910649-32-0；QAX-576)、tralokinumab(也称为CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称为人源化的13C5.5抗体。这种抗IL-13抗体和其他IL13抑制剂的实例公开于，例如WO2005/062967、WO2008/086395、WO2006/085938、US7,615,213、US7,501,121、WO2007/036745、WO2010/073119、WO2007/045477。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是人源化的IgG4抗体。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是lebrikizumab。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三个重链CDR，CDR-H1(SEQIDNO：1)，CDR-H2(SEQIDNO：2)和CDR-H3(SEQIDNO：3)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三个轻链CDR，CDR-L1(SEQIDNO：4)，CDR-L2(SEQIDNO：5)和CDR-L3(SEQIDNO：6)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，CDR-H1(SEQIDNO：1)，CDR-H2(SEQIDNO：2)，CDR-H3(SEQIDNO：3)，CDR-L1(SEQIDNO：4)，CDR-L2(SEQIDNO：5)和CDR-L3(SEQIDNO：6)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含具有选自SEQIDNO：7和8的氨基酸序列的可变重链区，VH。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的可变轻链区，VL。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含具有选自SEQIDNO：7和8的氨基酸序列的可变重链区VH，和具有SEQIDNO：9的氨基酸序列的可变轻链区VL。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含具有SEQIDNO:10或SEQIDNO:11或SEQIDNO:12或SEQIDNO.:13的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含具有SEQIDNO：14的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含具有选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO.:13的氨基酸序列的重链，和具有SEQIDNO：14的氨基酸序列的轻链。
在另一方面，抗IL-13抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：8具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-13抗体保留结合人IL-13的能力。在某些实施方案中，SEQIDNO：8中总共有1至10个氨基酸被取代、改变地插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域(即，在FR内)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQIDNO：8中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一方面，提供抗IL-13抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：9具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-13抗体保留结合IL-13的能力。在某些实施方案中，SEQIDNO：9中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域(即，在FR内)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQIDNO：9中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在又一实施方案中，抗IL-13抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：9具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的VL区，和与氨基酸序列SEQIDNO：8具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的VH区。
下面的表格示出了lebrikizumab的CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3区的氨基酸序列，以及VH，VL，重链序列和轻链序列。如下面表1所示，VH和重链可以包括N-末端谷氨酰胺，重链还可包含C-末端赖氨酸。如本领域中所熟知的，在制造过程中N-末端谷氨酰胺残基可以形成焦谷氨酸和C末端赖氨酸残基可以被剪除。
表1.抗IL-13抗体(lebrikizumab)氨基酸序列。
其他重组多肽
可以根据本文描述的方法纯化CHO细胞中产生的重组多肽，消除或降低仓鼠PLBL2水平，使得仅剩余残留量或检测不到的量。此类多肽包括但不限于，生长因子、细胞因子、免疫球蛋白、抗体、肽体(peptibody)等等。
某些示例性的抗体包括Aβ抗体、IL17A/F抗体和CMV抗体。示例性抗Aβ抗体和生产这类抗体的方法之前已被描述于，例如，WO2008011348，WO2007068429，WO2001062801和WO2004071408中。示例性抗IL17A/F抗体和生产这类抗体的方法之前已被描述于，例如，WO2009136286和美国专利号8,715,669。示例性抗CMV抗体，包括抗CMV-MSL，以及生产这种抗体的方法之前已被描述于WO2012047732。
示例性的多肽包括哺乳动物蛋白，诸如，例如，CD4；整联蛋白及其亚基，如β7；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；ct-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B-链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC，因子IX，组织因子和vonWillebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或组织型纤溶酶原激活物(t-PA，例如，)；bombazine；凝血酶；肿瘤坏死因子α和-β；脑啡肽；RANTES(调节的正常T细胞表达和分泌活化)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-I-A)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；DNA酶；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；IgE，激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；其他CD蛋白如CD3，CD8，CD19和CD20；促红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β，或-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，IL-22，IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-27，IL-28，IL-29，IL-30，IL-31，IL-32，IL-33等；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(DAF)；病毒抗原，诸如，例如，HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CDlla，CD11b，CDllc，CD18，整联蛋白亚组如α4，αE，β7；细胞粘附分子如ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER1，(EGFR)，HER2，HER3或HER4受体；Apo2L/TRAIL，和上述列出的多肽的任何片段；和结合上述所列的任何蛋白质的免疫粘附素和抗体；和上述所列的任何蛋白质的生物活性片段或变体。
其他的示例性多肽包括脑多肽，包括但不限于β-分泌酶1(BACE1)，Aβ，表皮生长因子受体(EGFR)，人表皮生长因子受体2(HER2)，tau，载脂蛋白E(ApoE)，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，朊蛋白(PrP)，富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，死亡受体6(DR6)，淀粉状蛋白前体蛋白(APP)，p75神经营养因子受体(p75NTR)，P-选择素，和半胱天冬酶6，和上述列出的任何多肽的片段；和免疫粘附素和结合上述列出的任何蛋白质的抗体；和上述列出的任何蛋白质的生物活性片段或变体。
其他示例性多肽包括治疗性抗体和免疫粘附素，包括但不限于，以下一种或多种抗原的抗体，包括抗体片段：HER1(EGFR)，HER2(如，曲妥单抗，帕妥珠单抗)，HER3，HER4，VEGF(如贝伐单抗，兰尼单抗)，MET(如onartuzumab)，CD20(例如，利妥昔单抗，obinutuzumab，ocrelizumab)，CD22，CD1la，CD1lb，CDllc，CD18，ICAM，VLA-4，VCAM，IL-17A和/或F，IgE(例如奥马珠单抗)，DR5，CD40，Apo2L/TRAIL，EGFL7(例如，parsatuzumab)，NRP1，整联蛋白β7(例如，etrolizumab)，IL-13(例如，lebrikizumab)Aβ(例如，crenezumab，gantenerumab)，P-选择素(例如，inclacumab)，IL-6R(例如，tociluzumab)，IFNα(例如，rontalizumab)，M1prime(例如，quilizumab)，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，OX40L，TSLP，因子D(例如，lampalizumab)和受体，例如：IL-9受体，IL-5受体，IL-4受体α，IL-13受体α1和IL-13受体α2，OX40，TSLP-R，IL-7Rα(TSLP的共受体)，IL17RB(IL-25的受体)，ST2(IL-33的受体)，CCR3，CCR4，CRTH2，FcepsilonRI和FcepsilonRII/CD23(IgE的受体)。其他示例性的抗体包括但不限于选自以下的那些，抗雌激素受体抗体，抗孕酮受体抗体，抗p53抗体，抗组织蛋白酶D抗体，抗Bcl-2抗体，抗E-钙粘蛋白抗体，抗CA125抗体，抗CA15-3抗体，抗CA19-9抗体，抗c-erbB-2抗体，抗P-糖蛋白抗体，抗CEA抗体，抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体，抗ras癌蛋白抗体，抗LewisX抗体，抗Ki-67抗体，抗PCNA抗体，抗CD3抗体，抗CD4抗体，抗CD5抗体，抗CD7抗体，抗-CD8抗体，抗CD9/p24的抗体，抗CD10抗体，抗CDllc抗体，抗CD13抗体，抗CD14抗体，抗CD15抗体，抗CD19抗体，抗CD23抗体，抗CD30抗体，抗CD31抗体，抗CD33抗体，抗CD34抗体，抗CD35抗体，抗CD38抗体，抗CD41抗体，抗LCA/CD45抗体，抗CD45RO抗体，抗CD45RA抗体，抗CD39抗体，抗CD100抗体，抗CD95/Fas抗体，抗CD99抗体，抗CD106抗体，抗泛素抗体，抗CD71抗体，抗c-myc抗体，抗细胞角蛋白抗体，抗波性蛋白抗体，抗HPV蛋白抗体，抗κ轻链抗体，抗λ轻链抗体，抗黑素体抗体，抗前列腺特异性抗原抗体，抗S-100抗体，抗tau抗原抗体，抗血纤蛋白抗体，抗角蛋白抗体和抗Tn抗原抗体。
某些纯化方法
使用本文描述的方法来纯化的蛋白质一般是使用重组技术生产的。用于生产重组蛋白的方法描述于，例如，美国专利编号5,534,615和4,816,567，在此具体地并入作参考。在某些实施方案中，目的蛋白质在CHO细胞中生产(参见，例如WO94/11026)。蛋白质的实例包括抗IL-13单克隆抗体(抗IL-13MAb)，其可以使用本文上面已经描述的方法进行纯化。
当使用重组技术时，蛋白质可以在细胞内生产、在周质空间生产、或直接分泌到培养基中。如果蛋白质在细胞内生产，作为第一步骤，例如，通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。在蛋白质被分泌到培养基的情况中，例如，可以通过切向流过滤从细胞培养基中分离重组宿主细胞。
固定在固相的蛋白A被用于纯化抗IL-13Mab制剂。在某些实施方案中，固相是包含用于固定蛋白A的玻璃、二氧化硅，琼脂糖或聚苯乙烯表面的柱。在某些实施方案中，所述固相是可控孔径玻璃柱(controlledporeglasscolumn)或硅酸柱。有时，柱已包被有试剂，如甘油，力图防止非特异性粘附到柱。可购自BioprocessingLimited的PROSEPATM柱，是包被有甘油的蛋白A可控孔径玻璃柱的一个例子。本文涉及的柱的其他实例包括50ATM(聚苯乙烯)柱或rProteinASEPHAROSEFASTFLOWTM(琼脂糖)柱或MABSELECTSURETM(琼脂糖)柱，其可购自GEHealthcareLifeSciences(琼脂糖)。
用于蛋白A色谱法的固相用合适的缓冲液平衡。例如，该平衡缓冲液可以是25mMTris，25mMNaCl，pH7.70+0.20。
来自重组宿主细胞且含有杂质和/或污染物的制剂在使用上样缓冲液平衡的固相上上样，上样缓冲液可以与平衡缓冲液相同。当含杂质/污染物的制剂流经固相时，蛋白质被吸附到固定的蛋白A，其他杂质/污染物(在CHO细胞中生产蛋白质的情况下，诸如中国仓鼠卵巢蛋白，CHOP)可以非特异性地结合到固相。
依次进行的下一步骤需要通过在中间洗涤步骤中洗涤固相，除去结合于固相、抗体和/或蛋白质A的杂质/污染物。上样后，可以在开始中间洗涤步骤之前用平衡缓冲液平衡固相。
中间洗涤缓冲液可以包括盐和任选其他化合物，例如(a)去污剂(例如，聚山梨酯，例如聚山梨酯20或聚山梨酯80)；(b)溶剂(如己二醇)；和(c)聚合物(如聚乙二醇{PEG])。
所使用的盐可以基于目的蛋白质选择。示例性的盐包括但不限于，乙酸钠、柠檬酸钠、和磷酸钾。
组合物中盐和其他化合物(如果有的话)的量为洗脱杂质/污染物、而基本上不除去目的蛋白质的组合量。这样的洗涤缓冲液中示例性盐浓度是约0.1至约2M、或约0.2M至约0.6M。有用的去污剂浓度为约0.01至约5％、或约0.1％至1％、或约0.5％，例如，其中去污剂是聚山梨醇酯时。示例性溶剂的浓度为约1％至40％、或约5至约25％。其中其他化合物是聚合物(例如PEG400或PEG8000)时，其浓度可以是，例如，约1％至约20％，或约5％至约15％。
中间洗涤缓冲液的pH通常为约4至约8、或约4.5至约5.5、或约5.0。在一个实施方案中，pH为7.00±0.10。
在上述中间洗涤步骤之后，从柱回收目的蛋白质。这通常通过使用合适的洗脱缓冲液实现。该蛋白质可以是，例如，使用具有低pH(亦称为酸性条件)的洗脱缓冲液从柱洗脱，例如pH在约2至约5的范围，或在约2.5至约3.5的范围。用于此目的洗脱缓冲液的实例包括柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液。
洗脱的蛋白质制剂可在蛋白A色谱法步骤之前或之后经过额外的纯化步骤。示例性进一步的纯化步骤包括羟磷灰石色谱法；透析；使用抗体捕获蛋白的亲和色谱法；疏水相互作用色谱法(HIC)；硫酸铵沉淀；阴离子或阳离子交换色谱；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅上的色谱法；聚焦色谱法；超滤渗滤(UFDF)，和凝胶过滤。在文中的例子中，蛋白A色谱法步骤之后是下游阴离子交换(例如，Q-Sepharose-FastFlow)或多模式(例如，混合模式)离子交换(例如，CAPTOTMAdhere)和HIC(例如，PHENYLSEPHAROSETM6fastflow-highsub)纯化步骤。
由此回收的蛋白质可配制在药学上可接受的载体中，用于对这些分子已知的各种诊断、治疗或其他用途。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，色谱法材料为离子交换色谱法材料；例如，阴离子交换色谱法材料。在一些实施方案中，阴离子交换色谱法材料是带正电的固相，具有游离的阴离子与流经或流过固相的水性溶液中的阴离子交换。在本文所述任何方法的一些实施方案中，阴离子交换材料可以是膜、整料、或树脂。在一个实施方案中，阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，阴离子交换材料可包括伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团，多胺官能团或二乙氨乙基(diethylaminoaethyl)官能团。在上述一些实施方案中，阴离子交换色谱法材料为阴离子交换色谱法柱。在上述一些实施方案中，阴离子交换色谱法材料为阴离子交换色谱法膜。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，离子交换材料可利用常规的色谱法材料或对流色谱法材料。常规的色谱法材料包括，例如，散发(perfusive)材料(例如，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂)和扩散(diffusive)材料(例如，交联的琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂可以是树脂。在一些实施方案中，交联的琼脂糖树脂可以是sulphopropyl-SepharoseFastFlow("SPSFF")树脂。对流色谱法材料可以是膜(例如，聚醚砜)或整料材料(例如交联的聚合物)。聚醚砜膜可以是Mustang。交联的聚合物整料材料可以是交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-乙二醇二甲基丙烯酸酯)。
阴离子交换材料的例子包括，但不限于，HQ50，PI50，D，MustangQ，QSEPHAROSETMFF和DEAESepharose。
在一些方面，色谱法材料为疏水相互作用色谱法材料。疏水相互作用色谱法(HIC)是一种液体色谱法技术，其根据疏水性分离生物分子。HIC色谱法材料的例子包括，但不限于，Toyopearlhexyl650,Toyopearlbutyl650,Toyopearlphenyl650,Toyopearlether650,Source,Resource,SepharoseHi-Trap,Octylsepharose,PHENYLSEPHAROSETMhighperformance,PHENYLSEPHAROSETM6fastflow(lowsub)和PHENYLSEPHAROSETM6fastflow(highsub)。在上述的一些实施方案中，HIC色谱法材料是HIC色谱法柱。在上述的一些实施方案中，HIC色谱法材料是HIC色谱法膜。
在一些方面，色谱法材料是亲和色谱法材料。亲和色谱法材料的实例包括，但不限于，与蛋白A或蛋白G衍生的色谱法材料。亲和色谱法材料的实例包括，但不限于，Prosep-VA,Prosep-VAUltraPlus,ProteinAsepharosefastflow,TyopearlProteinA,MAbSelect,MABSELECTSURETM和MABSELECTSURETMLX。在上述的一些实施方案中，亲和色谱法材料是亲和色谱法柱。在上述一些实施方案中，亲和色谱法材料是亲和色谱法膜。
可根据，例如，期望的缓冲液pH值、期望的缓冲液导电性、目的蛋白质的特性、和纯化方法使用各种缓冲液。在本文所述任何方法的一些实施方案中，方法包括使用缓冲液。缓冲液可以是上样缓冲液、平衡缓冲液、或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种上样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是相同的。在一些实施方案中，上样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，缓冲液包含盐。上样缓冲液可以包含氯化钠、乙酸钠或其混合物。在一些实施方案中，上样缓冲液为氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，上样缓冲液为乙酸钠缓冲液。
如本文所使用的上样物(load)，是上样到色谱法材料上的组合物。上样缓冲液是用于将包含目的产物的组合物上样到色谱法材料上的缓冲液。可以在上样待纯化的组合物之前用平衡缓冲液平衡色谱法材料。在一些实施例中，在组合物上样到色谱法材料之后、以及在目的多肽从固相洗脱之前、使用洗涤缓冲液。然而，一些目的产物，例如多肽，可以被洗涤缓冲液(例如，流出模式)从色谱法材料移除。
如本文所使用的洗脱，是从色谱法材料除去产物，例如多肽。洗脱缓冲液是用于从色谱法材料洗脱目的多肽或其他产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液具有不同于上样缓冲液的物理特征。例如，洗脱缓冲液可具有不同于上样缓冲液的导电性或不同于上样缓冲液的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有低于上样缓冲液的导电性。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有高于上样缓冲液的导电性。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有低于上样缓冲液的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有高于上样缓冲液的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有与上样缓冲液不同的导电性和不同的pH。洗脱缓冲液可以具有更高或更低的导电性和更高或更低的pH的任何组合。
导电性指水性溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输。因此，随着水性溶液中存在的离子量的增加，该水性溶液将具有更高的导电性。测量导电性的基本单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，并且可以使用电导仪测量，如Orion电导仪的各种型号。由于电解质的导电性是溶液中离子携带电流的能力，溶液的导电性可以通过改变其中的离子浓度而改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠、或氯化钾)的浓度，以获得所期望的导电性。优选地，改变各种缓冲液的盐浓度，以获得期望的导电性。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，流率小于约50CV/hr、40CV/hr或30CV/hr中的任何。流速可以为约5CV/hr和50CV/hr之间、10CV/hr和40CV/hr之间、或18CV/hr和36CV/hr之间的任何。在一些实施方案中，流速为约9CV/hr、18CV/hr、25CV/hr、30CV/hr、36CV/hr、或40CV/hr的任何。在本文所述任何方法的一些实施方案中，流率小于约100cm/hr、75cm/hr、或50cm/hr的任何。流速可以是约25cm/hr和150cm/hr之间、25cm/hr和100cm/hr之间、50cm/hr和100cm/hr之间、或65cm/hr和85cm/hr之间、或50cm/hr和250cm/hr之间、或100cm/hr和250cm/hr之间、或150cm/hr和250cm/hr之间的任何。
床高度是使用的色谱法材料的高度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，床高度高于约3cm、10cm、或15cm中的任何。床高度可以是约3cm和35cm之间、5cm和15cm之间、3cm和10cm之间、或5cm和8cm之间中的任何。在一些实施方案中，床高度为约3cm、5cm、10cm、或15cm中的任何。在一些实施方案中，根据上样中的多肽或污染物的量来确定床高度。
在一些实施方案中，色谱法在容器的柱中，容器的体积大于约1mL,2mL,3mL,4mL,5mL,6mL,7mL,8mL,9mL,10mL,15mL,20mL,25mL,30mL,40mL,50mL,75mL,100mL,200mL,300mL,400mL,500mL,600mL,700mL,800mL,900mL,1L,2L,3L,4L,5L,6L,7L,8L,9L,10L,25L,50L,100L,200L,400L,或450L。
在一些实施方案中，从色谱法收集级分。在一些实施方案中，收集的级分大于约0.01CV,0.02CV,0.03CV,0.04CV,0.05CV,0.06CV,0.07CV,0.08CV,0.09CV,0.1CV,0.2CV,0.3CV,0.4CV,0.5CV,0.6CV,0.7CV,0.8CV,0.9CV,1.0CV,2.0CV,3.0CV,4.0CV,5.0CV。在一些实施方案中，汇集含有产物(例如多肽)的级分。在一些实施方案中，汇集含有来自上样级分和洗脱级分的多肽的级分。级分中多肽的量可以由本领域技术人员确定；例如，级分中多肽的量可通过UV光谱法来确定。在一些实施方案中，汇集含有可检测的多肽片段的级分。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，至少一种杂质或污染物是宿主细胞材料，如CHOP；过滤的蛋白A；核酸；所期望多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分，庆大霉素的等任何一种或多种。在一些实施例中，杂质或污染物可以是宿主细胞蛋白(HCP)，其来自例如但不限于，细菌细胞如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞。
宿主细胞蛋白(HCP)是来自在其中产生多肽的细胞的蛋白质。例如，CHOP是来自宿主细胞的蛋白质，即，中国仓鼠卵巢蛋白。CHOP的量可以通过酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)或质谱法来测量。在本文所述任何方法的一些实施方案中，HCP(例如CHOP)的量减少大于约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％中的任何。HCP的量可以减少约10％和99％之间，30％和95％之间，30％和99％之间，50％和95％之间，50％和99％之间，75％和99％之间，或85％和99％之间中的任何。在一些实施方案中，HCP的量减少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％中的任何。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中HCP的量与纯化步骤之前组合物中HCP的量来确定减少。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括回收纯化的多肽。在一些实施方案中，纯化的多肽从本文所述的纯化步骤中的任何步骤回收。色谱法步骤可以是阴离子交换色谱法、HIC或蛋白A色谱法。在一些实施方案中，第一色谱法步骤是蛋白A，接着是阴离子交换或多模式离子交换，接着是HIC。
在一些实施方案中，色谱法之后多肽进一步通过病毒过滤纯化。病毒过滤是除去多肽纯化进料流中的病毒杂质。病毒过滤的例子包括超滤和微滤。在一些实施方案中，多肽使用细小病毒过滤器纯化。
在一些实施方案中，在色谱法后浓缩多肽。浓缩方法的实例在本领域中是已知的，包括但不限于超滤和渗滤。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，方法进一步包括组合纯化方法中的纯化多肽与药学上可接受的载体。
单克隆抗体
在一些实施方案中，根据本发明的方法纯化的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体从一群基本上同质的抗体获得，即，构成群的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了生产单克隆抗体的过程中出现的可能的变体，这种变体通常少量存在。因此，修饰语“单克隆”表示抗体特征，其不是不同的抗体的混合物或多克隆抗体。
例如，可通过Kohler等人,Nature256:495(1975)最初描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，或者可通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，如仓鼠，以诱发生成或能够生成抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的多肽。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基，优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷的细胞生长。
在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是高效融合、支持所选择的抗体生成细胞稳定高水平地生成抗体、并且对培养基(如HAT培养基)敏感的那些。在这些中，在一些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如可从SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA获得的源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可从美国典型培养物保藏中心，Rockville,MarylandUSA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplicationspp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。
针对生产抗抗原的单克隆抗体而检测杂交瘤细胞生长的培养基。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法来确定，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
单克隆抗体的结合亲和力，例如，可以通过Munson等人,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
鉴定得到生成具有所期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可将该克隆通过有限稀释步骤亚克隆并通过标准方法生长(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPracticepp.59-103(AcademicPress,1986))。用于此目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在体内作为动物腹水肿瘤生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法适当地从培养基、腹水或血清中分离由亚克隆分泌的单克隆抗体，如，例如，多肽A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。
使用常规步骤很容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA(例如使用寡核苷酸探针，其能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因)。在一些实施方案中，杂交瘤细胞作为此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到否则不产生免疫球蛋白多肽的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述性文章包括Skerra等人,Curr.OpinioninImmunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。
在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty等人,Nature348:552-554(1990)中描述的技术生产的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库的鼠和人抗体的分离。后续出版物描述了通过链改组生产高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人,Bio/Technology10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是可替代传统单克隆抗体杂交瘤技术用于分离单克隆抗体。
也可以改变DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA81:6851(1984))，或者通过共价连接免疫球蛋白编码序列的全部或部分编码序列与非免疫球蛋白多肽。
典型地，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者其取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以创建嵌合二价抗体，其包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，抗体是IgA，IgD，IgE，IgG或IgM抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG单克隆抗体。
人源化抗体
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。用于人源化非人抗体的方法在本领域中已有描述。在一些实施方案中，人源化抗体具有引入其中的一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，其通常来自“输入”可变结构域。人源化可基本上根据Winter和合作者的(Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science239:1534-1536(1988))的方法，通过用高变区序列取代相应的人抗体序列进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上不完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
在制备人源化抗体中使用的人可变结构域(包括轻链和重链)的选择对于减少抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变结构域序列。然后将最接近啮齿类序列的人序列作为人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用源自轻链或重链可变区特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993))。
更重要的是被人源化的抗体保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现这一目标，在该方法的某些实施方案中，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获得一些说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些显示能够分析在候选免疫球蛋白序列中发挥功能的残基的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。以这种方式，可以从接受(序列)和输入序列选择和组合FR残基，从而实现所期望的抗体特征，如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，高变区残基直接和最实质地参与影响抗原结合。
人抗体
在一些实施方案中，抗体是人抗体。作为人源化的替代，可以生成人抗体。例如，现在有可能生成转基因动物(例如小鼠)，其免疫后能够产生人抗体的所有组成成分，而没有内源性免疫球蛋白生成。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失，导致内源性抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体。见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature362:255-258(1993)；Bruggermann等人,YearinImmuno.7:33(1993)；和美国专利号5,591,669；5,589,369；和5,545,807。
可替代地，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature348:552-553(1990))在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分生产人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因在框内(in-frame)克隆至丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳多肽基因，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以各种形式进行；有关综述参见，例如，Johnson,KevinS.和Chiswell,DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature352:624-628(1991)从源自免疫小鼠脾小的V基因随机组合文库分离了多样化的抗恶唑酮抗体。可以构建来自未经免疫的人供体的V基因组集，并基本上根据Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991),或Griffith等人,EMBOJ.12:725-734(1993)所描述的技术分离多样化抗原(包括自抗原)的抗体。还参见，美国专利号5,565,332和5,573,905。
也可以通过体外活化的B细胞来产生人抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
抗体片段
在一些实施方案中，抗体是抗体片段。已经开发了各种技术用于生成抗体片段。传统上，这些片段经由蛋白水解消化完整的抗体衍生(见，例如，Morimoto等人,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)和Brennan等人,Science229:81(1985))。然而，这些片段现在可直接由重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离。可替代地，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一方法，F(ab')2片段可以直接从重组宿主细胞培养物分离。用于生成抗体片段的其他技术是本领域技术人员显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如在美国专利5,641,870中描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，提供了本文所述的抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、Fv和双抗体。
嵌合多肽
本文描述的多肽可以以一种方式改变，以形成包含融合另一异源多肽或氨基酸序列的多肽的嵌合分子。在一些实施方案中，嵌合分子包括多肽与标签多肽融合，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性地结合的表位。表位标签通常位于多肽的氨基或羧基末端。可以使用抗标签多肽的抗体来检测多肽的此类表位标签形式的存在。另外，提供表位标签使得能够容易地使用抗标签抗体或其他类型的结合表位标签的亲和基质通过亲和纯化纯化多肽。
其他
多肽共价修饰的另一种类型包括将多肽连接至多种非蛋白质性质的聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯(polyoxyalkylenes)，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。多肽还可以包裹在例如，通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊中、在胶状药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中，或在大乳剂中。这种技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，Gennaro,A.R.,Ed.,(1990)。
获得多肽
本文所描述的纯化方法中使用的多肽可以使用本领域中熟知的方法获得，包括重组方法。下面的部分提供了有关这些方法的指导。
多核苷酸
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”，指任何长度核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。
编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于，从认为具有多肽mRNA且以可检测水平表达的组织制备的cDNA文库。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地从人组织制备的cDNA文库获得。编码多肽的基因也可从基因组文库获得，或通过已知的合成步骤(例如自动化核酸合成)获得。
例如，多核苷酸可编码整个免疫球蛋白分子链，如轻链或重链。完整的重链不仅包含重链可变区(VH)，还包含重链恒定区(CH)，其通常包含三个恒定结构域：CH1，CH2和CH3；和“铰链”区。在某些情况下，恒定区的存在是期望的。
可以由多核苷酸编码的其他多肽包括抗体的抗原结合片段，如单结构域抗体(“dAb”)，Fv，scFv，Fab'和F(ab')2和“微抗体”。微抗体(通常情况下)是CH1和CK或CL结构域已经被从其上切除的二价抗体片段。由于微抗体比常规抗体更小，其在临床/诊断应用中应实现更好的组织穿透，但作为二价其应该保留比单价抗体片段(例如dAb)更高的结合亲和力。相应地，除非上下文另有规定，文中所使用的术语“抗体”在本文中不仅包括整个抗体分子，还包括上面讨论的类型的抗体的抗原结合片段。优选存在于所编码多肽中的各构架区相对于相应的人受体构架区包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，框架区相对于受体构架区可以总共包含，三，四，五，六，七，八，九，十，十一，十二，十三，十四，或十五个氨基酸取代。
合适地，本文描述的多核苷酸可以被分离和/或纯化。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
术语“分离的多核苷酸”意图指分子从其正常或天然环境中被移除或分离，或以不存在于正常或天然环境的方式生成。在一些实施方案中，多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语纯化的意图指至少一些污染分子或物质被除去。
合适地，多核苷酸基本上是纯化的，使得相关的多核苷酸构成存在于组合物中占主导地位的(即，最丰富的)多核苷酸。
多核苷酸的表达
下面的描述主要涉及通过培养含有编码多肽的多核苷酸的载体转化或转染的细胞生产多肽。当然，预期在本领域中公知的替代性方法，可以用来制备多肽。例如，可以使用固相技术通过直接肽合成生产适当的氨基酸序列，或其部分(见，例如，Stewart等人,Solid-PhasePeptideSynthesisW.H.FreemanCo.,SanFrancisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。体外蛋白合成可以使用手动技术或通过自动化来进行。自动合成可通过，例如，使用AppliedBiosystemsPeptideSynthesizer(FosterCity,Calif.)，使用制造商的说明书实现。可以独立地化学合成多肽的各个部分，并使用化学或酶促方法组合各部分，来生产所期望的的多肽。
如本文所述的多核苷酸被插入到表达载体用于生产多肽。术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达所必需的DNA序列，其可操作地连接编码序列。该控制序列包括但不限于，启动子(例如，天然相关的或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。
当其被置于与另一多核苷酸序列的功能关系中时，多核苷酸被“可操作地连接”。例如，如果多肽作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列或分泌前导的核酸可操作地连接到多肽的核酸；如果其影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接到编码序列；或者如果其被定位以促进翻译，则核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。一般地，“可操作地连接”是指被连接的核酸序列是连续的，并且，在分泌前导的情况下，是连续的并在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点的连接完成连接。如果不存在此类位点，根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
对于抗体，轻链和重链可以克隆到相同或不同的表达载体。编码免疫球蛋白链的核酸区段可操作地连接到表达载体中的控制序列，以确保免疫球蛋白多肽的表达。
含有多核苷酸序列(例如，可变重链和/或可变轻链编码序列和任选的表达控制序列)的载体可通过公知的方法转移到宿主细胞中，这取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪法或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress,2nded.,1989))。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了生产转基因动物，转基因可显微注射到受精卵母细胞，或可掺入到胚胎干细胞的基因组中，并且这种细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
载体
术语“载体”包括表达载体和转化载体和穿梭载体。
术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”是指能够从一个实体转移到另一个实体的构建体-实体可以是相同物种的实体或可以是不同物种的实体。如果构建体能够被从一个物种转移到另一个物种-例如从大肠杆菌质粒转移到细菌，如芽孢杆菌属，那么转化载体有时称为“穿梭载体”。它甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移到土壤杆菌到植物中的构建体。
如下所述，载体可以转化到合适的宿主细胞以提供多肽的表达。各种载体是公众可获得的。载体，例如，可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。合适的核酸序列可以通过各种步骤插入载体中。在一般情况下，使用本领域中已知的技术将DNA插入到适当的限制性内切酶位点。采用本领域技术人员已知的标准连接技术构建含有这些组分中的一种或多种的合适的载体。
载体可以是例如，质粒、病毒或噬菌体载体，其具有复制起点，任选具有用于表达所述多核苷酸的启动子和任选具有启动子的调节子。载体可含有本领域中公知的一种或多种选择性标记基因。
这些表达载体通常在宿主生物体内或者作为附加体或者作为宿主染色体DNA的整合部分，是可复制的。
宿主细胞
宿主细胞例如，可以是细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、或哺乳动物细胞。
可使用已经被遗传工程操作的转基因多细胞宿主生物体生产多肽。该生物体可以是，例如，转基因哺乳动物生物体(例如，转基因山羊或小鼠系)。
合适的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌，肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如，(Serratiamarcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，地衣芽孢杆菌41P(B.licheniformis41P))，假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。这些实例是说明性的而不是限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是重组多核苷酸产物发酵的常用宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最小量的蛋白质水解酶。例如，可以修饰菌株W3110，以实现编码宿主内源性多肽的基因中的基因突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonAptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)，其具有完整的基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degPompTkan'；大肠杆菌菌株W311037D6，其具有完整的基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degPompTrbs7ilvGkan'；大肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6；和具有突变的周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其他核酸聚合酶反应，也是合适的。
可以在这些原核宿主中制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任何数量的各种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常控制表达，任选具有操纵子序列，并具有核糖体结合位点序列等，用于起和完成转录和翻译。
真核微生物可用于表达。真核微生物如丝状真菌或酵母是用于编码多肽的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他包括裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母宿主(Kluyveromyceshosts)如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574)，脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)，威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24178)，Kwaltii(ATCC56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)，Kthermotolerans，和马克斯克鲁维(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP402226)；毕赤酵母(Pichiapastoris)；假丝酵母菌属(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia)；粗糙脉胞霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌如，例如脉孢菌(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养型酵母在这里是合适的，包括但不限于，能够在甲醇生长的酵母，其选自汉逊酵母(Hansenula)，念珠菌(Candida)，Kloeckera，毕赤酵母属(Pichia)，酵母(Saccharomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。酵母(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，其带有合适的载体，所述载体具有根据需要的表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子除其他外，包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
除了微生物，哺乳动物组织细胞培养物也可以用于表达和生产如本文所述的多肽，并且在某些情况下是优选的(参见Winnacker,FromGenestoClonesVCHPublishers,N.Y.,N.Y.(1987)。对于一些实施方案，真核细胞可以是优选的，因为在本领域中开发了许多能够分泌异源多肽(例如，完整的免疫球蛋白)的适宜宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、优选，骨髓瘤细胞系、或转化的B细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是脊椎动物宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养中生长)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12系)；小鼠睾丸支持细胞；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞病毒(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(HepG2细胞)。
制剂及制备制剂的方法
本文提供了制剂和制备制剂的方法，所述制剂包含用本文所描述的方法纯化的多肽(例如，抗体)。例如，纯化的多肽可以与药学上可接受的载体组合。
为了存储，在一些实施方案中的多肽制剂可通过混合具有期望纯度的多肽和任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂来制备(Remington’sPharmaceuticalSciences，第16版,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式。
本文所用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度上对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。
可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，多肽制剂中的多肽保持功能活性。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易通过无菌滤膜过滤来实现。
本文的制剂也可以含有一种以上的对所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有互补活性且不会不利地相互影响的那些。例如，除了多肽，可能期望在一个制剂中包含另外的多肽(例如，抗体)。可替代地，或另外地，组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素试剂、和/或心脏保护剂。此类分子适合以有效用于预期目的的量存在于组合中。
本文所述的抗IL-13抗体的示例性制剂在国际专利公开号WO2013/066866中提供。
产品
本文中所描述的方法纯化的多肽和/或包含本文中所描述的方法纯化的多肽的制剂可以包含在产品中。产品可包含含有多肽和/或多肽制剂的容器。在某些实施方案中，所述产品包含：(a)容器，在容器中包含含有本文所述的多肽和/或多肽制剂的组合物；和(b)说明书，具有向受试者施用制剂的说明。
产品包含容器和插在容器上或与容器相关联的标签或说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料，如玻璃或塑料制成。容器装有或含有制剂，并且可以具有无菌存取口(例如容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在组合物中的至少一种活性剂是多肽。标签或说明书指示受试者中组合物的使用，配有关于给药量和提供的多肽和其他药物的间隔的具体指导。产品可进一步包括从商业和用户观点来看需要的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。在一些实施方案中，容器是注射器。在一些实施例中，注射器还包含在注射装置内。在一些实施方案中，注射装置是自动注射器。
“说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产物组合的其他治疗产物的信息，和/或关于使用此类治疗产物的警告。
含有本文描述的抗IL-13抗体的制剂的示例性的产品提供于国际专利公开WO2013/066866中。
本发明的进一步细节通过以下非限制性实施例说明。在本说明书中所有引用的公开内容通过引用明确地并入本文。
实施例
如下面的实施例与本文其他地方使用的，“PLB2”和“PLBL2”和“PLBD2”可互换使用并且是指酶“磷脂酶B样2”或其同义词，“磷脂酶B结构域样2”。
实施例1-通用方法
除非在实施例另有说明，所有实施例的材料和方法如下所述。
MAb原料
用于所有实施例的MAb原料选自Genentech(SouthSanFrancisco,CA,U.S.A.)的工业的、中试规模或小规模细胞培养批次。细胞培养发酵一段时期后，将细胞分离，在某些情况下，通过蛋白A色谱法和一种或多种另外的色谱法步骤和过滤步骤纯化澄清的液体(收获的细胞培养液，HCCF)，如以下的实施例所示。
MAb定量
使用UV可见分光光度计(8453模型G1103A；AgilentTechnologies；SantaClara,CA,U.S.A.)或NanoDrop1000型ND-1000(ThermoFisherScientific；Waltham，MA，USA)在280和320nm的吸光度测定抗体浓度。抗体以外的其他种类(即杂质)浓度太低，对UV吸光度没有明显的作用。根据需要，将样品用合适的非干扰稀释剂稀释在0.1-1.0吸光度单位的范围内。样品制备和UV测量一式两份进行，将其平均值记录下来。mAb吸收系数范围为1.42～1.645/mg·ml·cm。
总CHO宿主细胞蛋白(CHOP)定量
用ELISA定量称为CHOP的总宿主细胞蛋白的水平。用于检测产物中CHO蛋白的ELISA基于夹心ELISA模式。亲和纯化的CHOP的多克隆抗体包被在96孔微量板上。然后将标准、对照和样品一式两份上样到单独的孔中。如果样品中存在CHOP，其将结合到包被抗体(多克隆抗CHOP)。孵育步骤后，向平板中加入缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗CHOP多克隆抗体。在最后的洗涤步骤后，通过加入四甲基联苯胺(TMB)溶液定量CHOP，该溶液也可作为SUREBLUERESERVETM，从KPL,Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.,Gaithersburg,MD,商品号53-00-03获得，其中，当HRP酶作用时产生色度信号。测量每个孔中450nm处的光密度(OD)。五参数曲线拟合程序(Pro,MolecularDevices,Sunnyvale,CA)用于产生标准曲线，从标准曲线计算样品CHOP浓度。总CHOPELISA的测定范围是从5至320ng/ml。以ng/mL计的CHOP浓度，是指使用CHOP标准作为校准的样品中的CHOP的量。CHOP比(以ng/mg或ppm计)指计算的CHOP浓度与产物浓度的比率，在某些情况下，是该测试方法的报告值。总CHOPELISA可以用于定量样品中总的CHOP水平，但不定量单个蛋白质的浓度。
鼠单克隆抗仓鼠PLBL2ELISA测定法
小鼠抗仓鼠PLBL2单克隆抗体的产生和使用这种抗体的用于检测和定量重组多肽制剂中PLBL2的ELISA测定法的开发描述在美国临时专利申请号61/877,503和61/991,228中。简言之，该测定法如下进行。
鼠单克隆抗体19C10以在碳酸盐缓冲液(0.05M碳酸钠，pH9.6)中0.5μg/mL的浓度包被于96孔微量板的半区，在2-8℃过夜。包被后，将板用封闭缓冲液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich]；也称为测定稀释液)封闭，以防止蛋白质的非特异性粘附。标准、对照和样品在测定稀释液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich])中稀释，然后一式两份上样到单独的孔中，并在室温(22-27℃)孵育2小时。如果样品中存在PLBL2，PLBL2将结合到包被(在本文中也称捕获)抗体。上述孵育步骤之后，未结合的物质被洗涤缓冲液(0.05％聚山梨酯20/PBS[Corningcellgro目录号99-717-CM])洗掉，缀合生物素的15G11抗PLBL2鼠单克隆抗体在测定稀释液中稀释至浓度0.03125μg/mL，并加入到微量板的孔中。
生物素缀合如下进行。生物素化试剂盒从PierceThermoScientific购买,(P/N20217,E-ZLinkNHS-Biotin)，以及链霉亲和素HRP(SA-HRP)从JacksonImmunoCat.No.016-030-084购买。遵循Pierce试剂盒中的说明。简言之，将IgG透析到PBS，pH7.4中，将生物素加入到蛋白质中，在室温下混合1小时。然后将标记的抗体对PBS，pH7.4渗析以除去过量的生物素，过滤，蛋白质浓度由A280测定。
与生物素化15G11在室温下孵育2小时的步骤后，链霉亲和素HRP(在测定稀释液中1：200,000稀释)加入到微量板的孔中。用洗涤缓冲液(如上所述)最后洗涤的步骤后，加入TMB溶液(50μl/孔)(SUREBLUERESERVETM，购自KPL,Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.,Gaithersburg,MD,目录号53-00-03)，随后在室温下孵育10-20分钟发色(对于PLBL2定量)。使用MolecularDevicesSpectraMaxM5e在450nm处评估每孔中的光密度(OD)进行检测。四参数曲线拟合程序(SoftMaxProv5.2revC)用于生成标准曲线，从标准曲线的线性范围计算样品的PLBL2浓度。在标准曲线线性范围内的值被用于计算标称PLBL2(ng/mg或ppm)。线性范围为约EC10-EC85或1.5-40ng/mL，由于板与板间的范围略微变化。使用该ELISA得到的PLBL2值与通过其他方法(例如，LC-MS/MS，多克隆PLBL2ELISA或总CHOPELISA，稀释到测定的LOQ时)获得的估算是可比的。
兔多克隆抗仓鼠PLBL2ELISA测定法
兔抗仓鼠PLBL2多克隆抗体的生成和使用这种抗体用于检测和定量重组多肽制剂中PLBL2的ELISA测定法的开发描述在美国临时专利申请号61/877,503和61/991,228中。简言之，该测定如下进行。
亲和纯化的兔多克隆抗体以在碳酸盐缓冲液(0.05M碳酸钠，pH9.6)中0.5μg/mL的浓度包被于96孔微量板的半区，在2-8℃过夜。包被后，将板用封闭缓冲液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich])封闭，以防止蛋白质的非特异性粘附。标准、对照和样品在测定稀释液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich])中稀释，然后一式两份上样到单独的孔中，并在室温(22-27℃)孵育2小时。如果样品中存在PLBL2，PLBL2将结合到包被(在本文中也称捕获)抗体上。上述孵育步骤之后，未结合的物质被洗涤缓冲液(0.05％聚山梨酯20/PBS[Corningcellgro目录号99-717-CM])洗掉，缀合辣根过氧化物酶(HRP)的亲和纯化的兔多克隆抗体在测定稀释液中稀释至浓度40ng/mL，并加入到微量板的孔中。
HRP缀合如下进行。HRP缀合试剂盒从PierceThermoScientific,(P/N31489,EZ-连接并活化的过氧化物酶和试剂盒(E-ZLinkPlusActivatedPeroxidaseandKit))购买。遵循Pierce试剂盒的说明书。简言之，将IgG透析入碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH9.4，将EZ-连接并活化的过氧化物酶(E-ZLinkPlusActivatedPeroxidase)加入到蛋白质中，在室温下混合1小时。随后加入氰基硼氢化钠和淬灭缓冲液，以稳定缀合和淬灭反应。然后将标记的抗体对PBS，pH7.4，透析、过滤，蛋白质浓度由A280测定。
在与HRP缀合的兔多克隆抗体在室温下孵育2小时的步骤后，用洗涤缓冲液(如上所述)进行最后洗涤步骤。而后，加入TMB溶液(50μl/孔)(SUREBLUERESERVETM，购自KPL,Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.,Gaithersburg,MD,目录号53-00-03)，随后在室温下孵育10-20分钟发色(对于PLBL2定量)。使用MolecularDevicesSpectraMaxM5e在450nm处评估每孔中的光密度(OD)进行检测。五参数曲线拟合程序(SoftMaxProv5.2revC)用于生成标准曲线，从标准曲线的线性范围计算样品的PLBL2浓度。在标准曲线线性范围内的值被用于计算标称PLBL2(ng/mg或ppm)。测定法的定量范围为0.5-50ng/mL。使用该ELISA得到的PLBL2值与，通过其他方法(例如，鼠单克隆PLBL2ELISA，LC-MS/MS或总CHOPELISA，稀释到测定的LOQ时)获得的估算是可比的。
LC-MS/MS测定法
对于通过LC-MS/MS的PLBL2定量，使用WatersAcquityH-ClassBioUPLC和ABSciexTripleTOF5600+质谱仪。样品和校准标准品(重组PLBL2掺入来自小鼠NS0细胞系的重组人源化单克隆抗体制剂[NS0细胞系不含有仓鼠PLBL2])被胰蛋白酶还原和消化。总共40μg消化的样品注射到UPLC，使用WatersBEH300C18柱，颗粒大小1.7μm。使用线性梯度的乙腈，以流速300μl/min和柱温度60℃洗脱肽。
从UPLC洗脱的肽通过电喷射离子化以正电离模式引入到质谱仪。离子源温度设定在400℃，离子喷射电压5500v，去簇电压(declusteringpotential)76v。使用设置为32的碰撞能碎片化所选择的肽离子。在多反应监测高分辨率(MRMHR)模式操作质谱仪，使用四个特定PLBL2肽和它们的碎片离子转换。由四极质谱仪选择母体离子，质荷比(masstocharge)(M/Z)选择窗口为1.2amu。每个母体离子的碎片离子由飞行时间质谱仪分离并选择用于定量后的数据采集，选择窗口为0.025amu。
通过测量四个转换的特定信号响应测定样品中PLBL2的浓度，使用线性拟合从来自2-500ppm范围内的标准物的那些校准。下面的表2示出了通过LC-MS/MS监测的PLBL2肽的列表。
表2.通过LC-MS/MS监测的PLBL2肽的列表。
实施例2–为降低仓鼠PLBL2改进的纯化方法
建立了CHO生产的抗IL-13MAb(lebrikizumab)的纯化方法，以支持早期阶段的临床试验，在此被称为“初始方法(InitialProcess)”。初始方法依次采用以下的色谱法步骤：蛋白A亲和色谱法(MABSELECTSURETM)、而后是阳离子交换(HS)、而后是阴离子交换(QSEPHAROSETMFastFlow)。包括额外的病毒灭活和过滤步骤，以及最终的超滤渗滤(UFDF)步骤。最终产物(药品)配制在20mM组氨酸醋酸盐、6％蔗糖、0.03％聚山梨醇酯20，pH值5.7中，浓度125mg/mL。
使用总CHOPELISA测定法(以上实施例1中描述)，我们发现，根据初始方法纯化的过程中的中间体和药品证实非典型稀释依赖行为，导致标准化系列样品稀释间变异系数＞20％。该稀释依赖行为由表3中呈现的数据示例，其中抗IL-13MAb产物的每一个连续两倍的稀释导致更高水平的CHOP(以ppm表示)，如使用总CHOPELISA所确定。使用灵敏的分析方法，如LC-MS/MS，我们确定了单一CHOP种类或HCP，是这一非典型稀释依赖行为的原因。特别是，我们确立了在总CHOPELISA上稀释依赖行为是由于抗原过量。进一步的调查使我们能够确定单一HCP为酶，仓鼠磷脂酶B样2(PLBL2)。通过将产物样品稀释至定量测定法的极限(LOQ)，我们能够估计使用初始方法纯化的lebrikizumab的临床批次中PLBL2的水平，确定存在高达300ppm(300ng/mg)以及以上的水平。
表3.产物稀释和CHOP水平。
稀释倍数 总CHOP(ppm)
2 0.5842 -->
4 1
8 2
16 4
32 7
64 14
128 26
256 49
512 97
1024 147
2048 228
4096 314
8192 346
如我们观察到的单一CHOP种类的此杂质水平(＞300ppm)，被认为是用于人临床和/或治疗应用、特别是后期临床试验以及以后的MAb产物中所不希望的。例如，如实施例3中所述，当施用给人受试者时这样的水平可以是免疫原性的。
因此，我们研究了各种对初始方法的改进，如以下简要概述。根据这些研究的结果，我们开发了一种在下面详细描述的改进的纯化方法，并且在此将其称为“改进方法”。改进方法的使用导致纯化的抗IL-13MAb(lebrikizumab)产物含有实质上降低的PLBL2水平。
改进纯化方法以降低PLBL2的努力包括与初始方法正交的方法，包括：沉淀、测试各种HCCF的添加剂、额外的柱洗涤、疏水相互作用和混合模式色谱法。通过使用实施例1中描述的测定法中的一种或多种进行这些努力，来监测研究的每种改进对降低总CHOP和/或PLBL2水平的有效性。探讨的各种改进如下所述。
使用辛酸沉淀HCCF和蛋白A池中的CHOP
以前已经描述了辛酸沉淀，包括用于单克隆抗体工业中(Wang等人,BioPharmInternational；DownstreamProcessing2010,p4-10,Oct2009；Brodsky等人,BiotechnologyandBioengineering,109(10):2589,2012)以选择性地从目的靶蛋白质中沉淀杂质。辛酸，也称为正辛酸，是具有八个碳原子的饱和脂肪酸(式CH3(CH2)6COOH)。使用抗IL-13MAb进行研究以确定收获的细胞培养液(HCCF)或蛋白A池的辛酸沉淀是否会导致CHOP降低和/或在总CHOPELISA中稀释依赖行为的降低。
用于这些研究的抗IL13MAb起始材料是从1KL收获的HCCF和蛋白A池。1％(v/v)辛酸加入到HCCF中，不同浓度的辛酸(0％-3％v/v)加入到pH4.5或pH5.0的蛋白A池。在环境温度下混合样品，持续≥5小时，0.2μm过滤，并用总CHOPELISA稀释剂稀释，用于使用总CHOPELISA的检测和定量。根据本领域中已知的标准方法进行HPLC滴度测定法，用于测定辛酸处理之前和之后的HCCF中抗IL-13MAb的滴度。
用1％v/v辛酸处理HCCF降低CHOP约5倍，导致91％的抗IL-13MAb的产率。当用不同浓度的辛酸(范围从0-3％v/v)处理蛋白A池时，我们观察到在pH5.0产率损失>20％，在pH4.5产率没有损失。当我们评估这些辛酸处理的蛋白A池中总CHOP时，我们观察到CHOP降低2倍至3倍(图1A和B)。然而，也如图1A和B所示，在各检测条件下稀释依赖性仍存在，表明辛酸沉淀不能有效地解决总CHOPELISA中观察到的稀释依赖行为，因此不能有效地降低该产物中PLBL2的水平。
HCCF的添加剂
Sisodiya等人,BiotechJ.7:1233(2012)先前的工作证明，向HCCF添加的添加剂如胍或氯化钠可以降低随后纯化的蛋白A池中的CHOP。也表明，当作为蛋白A柱上的洗涤剂使用时，精氨酸降低CHOP(MilliporeTechnicalBulletin,Lit.No.TB1024EN00,Rev.A,December,2005；MilliporeTechnicalBulletin,Lit.No.1026EN00,July,2006,可以从网址www.Millipore.com获得)，我们将精氨酸作为HCCF的添加剂包括在内。各种盐、离液剂、及辛酸加入到抗IL-13MAbHCCF中，以评估在MABSELECTSURETM(MSS)蛋白A色谱法上捕获产物期间，其每个对降低产物和CHOP相互作用的效力。测试的向HCCF添加的添加剂为：0.6M胍、0.6M精氨酸、0.6M氯化钠、磷酸盐缓冲盐水、和1％辛酸。
将用各种HCCF添加剂处理的样品加载至MSS上的蛋白A色谱法上。调节蛋白A池至pH4.9，并使用初始方法条件在HS阳离子交换色谱法步骤上进一步纯化。稀释蛋白A池和HS池，并进行总ChopELISA。根据本领域中已知的方法在SEC-HPLC上测试调整的蛋白A池，用于评估％聚集体，％变异种类等。
对于其中将胍或精氨酸加入HCCF的运行，MABSELECTSURETM上的产率稍低。在测试的所有HCCF的添加剂中，胍和精氨酸最有效地实质上降低CHOP水平(见表4)并且呈现降低蛋白A池上的稀释依赖性(数据未显示)。但是，HS上蛋白A池的进一步的下游处理显示，CHOPELISA稀释依赖性残留在相应的池中，如图2所示。因此，数据表明，向HCCF加入胍或精氨酸对降低该产物的PLBL2水平无效。
表4.HCCF添加剂和对CHOP的效果。
蛋白A柱的洗涤(MABSELECTSURETM)
观察到，在MABSELECTSURETM(MSS)蛋白A色谱法上更多的稀释依赖性CHOP洗脱在早期含有产物的级分中。这表明，在洗脱前MSS上额外的洗涤步骤可能进一步降低CHOP/PLBL2。测试了MSS上一些洗涤降低蛋白A池中CHOP/PLBL2的能力。对于这项研究，使用纯化的抗IL-13MAbUFDF池作为上样物质。稀释该UFDF池至1.7mg/mL(约HCCF滴度)，并以29克/L树脂上样到MSS。测试多种洗涤，例如，0.5M精氨酸pH8.5，有和没有1％聚山梨醇酯20的0.5M精氨酸pH9.5，0.5MTMACpH7.1，25mMMOPSpH7.1，并与高盐洗涤pH7.0相比较。产物在酸性条件下(pH2.8)洗脱并汇集，在0.5OD(A280)开始并持续至2.4个柱体积的总体积。稀释各调节池，并用总CHOPELISA测定。这些结果的总结是，没有任何洗涤充分降低CHOP/PLBL2或降低总CHOPELISA中的稀释依赖性。因此，看起来我们不会发现有效降低该抗IL-13MAb产物中PLBL2水平的蛋白A的洗涤条件，因而我们没有进一步调查。
阳离子交换柱的洗涤( HS)
根据使用抗IL-13MAb和PLBL2杂质氨基酸序列的理论计算，我们估计PLBL2的pI约为6.0，与抗IL-13MAb(pI6.1)的类似。我们还估计，在≤pH4和≥pH10时，抗IL13MAb和PLBL2之间的净电荷将有显著差异。因此，我们测试了初始方法HS阳离子交换步骤上的各种低pH洗涤，以评估其是否会有效地、选择性地降低总CHOP和/或PLBL2和稀释依赖行为。在pH4测试了以下洗涤液：(ⅰ)乙酸盐梯度，300mM-1000mM超过20个柱体积(CV)；(ii)柠檬酸梯度，100mM–500mM超过20CV；(ⅲ)在260mM柠檬酸盐洗涤步骤；及(iv)精氨酸梯度15mS/cm(导电性测量)超过20CV。
结果表明，在pH4乙酸盐梯度高达测试盐浓度1M时，不能洗脱抗IL-13MAb与CHOP。柠檬酸盐或乙酸盐增加的量导致产物的不溶性和沉淀。所有的pH4的洗涤条件导致HS步骤上的低产率，没有洗涤条件显著降低CHOP稀释依赖性。因此，在阳离子交换柱中加入低pH洗涤不能有效地降低该产物中PLBL2的水平。
羟磷灰石树脂和CAPTO TM Adhere树脂
陶瓷羟基磷灰石(CHT)大孔树脂I型，40um(BioRad)由重复的六边形结构的磷酸钙(Ca5(PO4)3OH)2组成。有两个不同的结合位点；C位点具有5个钙离子双连体的组，P位点含有一对-OH，各-OH含有三个磷酸根(phosphatetriplets)。这种树脂有混合模式特性，并已被证明分离具有挑战性的杂质如聚集体(P.Gagnon,NewBiotechnology25(5):287(2009))。
为了鉴定运行CHT柱的初始条件，我们进行CHT树脂I型，40um的高通量机器人筛选，测试的pH范围6.5-8.0，以及不同的氯化钠和磷酸钠浓度用于洗脱。这种高通量机器人筛选先前已被描述，例如，在Wensel等人,Biotechnol.Bioeng.100:839(2008)中。在总CHOPELISA中测试了来自这些筛选的样品。
CAPTOTMAdhere(GEHealthcare)是即呈现离子特性又呈现疏水性特性的混合模式树脂。基本矩阵是刚性的琼脂糖，配体是N-苄基-N-甲基乙醇胺。首先用高通量筛选研究、然后用随后的柱条件评估了这种树脂降低总CHOP和/或PLBL2的能力。
使用与以上描述类似的高通量机器人筛选方法，进行确定运行CAPTOTMAdhere柱条件的初始研究，以测试在两个上样密度(5克/L树脂和为40g/L树脂)下抗IL-13MAb与CAPTOTMAdhere的结合。还测试了盐和pH的范围；从25mM-200mM乙酸钠，pH4.0-6.5。上样物质是初始方法UFDF池，在总CHOPELISA的LOQ上，其含有约200ppm的总CHOP。稀释CAPTOTMAdhere上未结合(流出)的样品，并使用总CHOPELISA测定。
结果如下。对于CHT色谱法，没有测试条件实质上降低总CHOP或PLBL2或影响测定的稀释依赖行为。另外，收益率差，并且没有实现高分子量种类的清除。对于CAPTOTMAdhere色谱法，收益率差，测定物质显示，在总CHOPELISA中实质上的稀释依赖行为。因此，没有进一步开发CHT和CAPTOTMAdhere树脂的使用，因为很明显，我们将不可能发现使用这些树脂有效降低该抗IL-13MAb产物中PLBL2水平的条件。
疏水相互作用色谱法树脂和膜
我们最初测试的HIC膜吸附称为Sartobind，由Sartorius制造。Sartobind由再生纤维素的基础基质与共价连接的疏水苯基配体基团组成。
测试的膜是SartobindHIC3mL装置(8mm床高度)。我们将来自初始方法HS池的池调整到0.55M磷酸钾pH7.0，并使用10mL/min的流速。在0.55M磷酸钾pH7.0中洗脱产物(在未结合级分中收集3mL级分)。
我们观察到当条件设定到0.55M磷酸钾时抗IL-13MAb变得模糊和浑浊，需要额外的0.2um过滤步骤。结果表明：总CHOP降低，然而，剩余的CHOP在总CHOPELISA中仍表现出稀释依赖行为。没有进一步评估这种膜的用途，因为似乎不可能确定降低该产物中PLBL2水平的有效条件。
接下来，我们采用高通量筛选评估几种不同的HIC树脂。FastFlow(FF)、4FastFlow、PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)和PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(lowsub)从GEHealthcare获得。选择这四个树脂，是因为它们代表了广泛变化的疏水性(FastFlow疏水性最低，其次为PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(lowsub)和4FastFlow，PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)疏水性最高。我们测试了几个pH和盐浓度的组合的降低抗IL-13MAb制剂中PLBL2的有效性。用于HIC树脂实验的抗IL-13MAb制剂来自使用初始方法运行的UFDF池。抗IL-13MAb浓度为180mg/mL和上样密度为40mg抗体/mL树脂。我们测试了pH5.5(25mM乙酸钠)、pH6.0(25mMMES)、pH7.0(25mMMOPS)和pH8.0(25mMTris)和0mM至400mM之间浓度的硫酸钠。对于测试的每个条件，收集、稀释流出样品，并使用总CHOPELISA测定法进行测试。
结果示于图3A-D。随着盐增多，我们观察到各树脂流出液中的总CHOP越少。FastFlow树脂(图3A)显示总CHOP的水平最高，而PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂将总CHOP降低到非常低的水平，即使使用较低量的盐(图3D)，PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(lowsub)和FastFlow树脂显示中等水平的总CHOP。有趣的是，pH对使用各树脂去除CHOP也具有最小的影响，除低盐条件的PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)以外(图3D)。对于这种树脂，低盐条件、较高的pH导致流出级分中更高的CHOP(图3D)。基于这些结果，PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)看起来是有前景的，选择其用于进一步的研究，包括在结合-洗脱或流通模式运行柱。
使用PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂在结合-洗脱模式操作HIC需要用盐调整抗IL-13MAb上样，使得抗体与树脂结合。增加盐就增加了上样产物与树脂的动态结合能力(每mL树脂抗IL-13的mg)。但随着产物中盐浓度增加，我们观察到增加的浑浊度和高分子量种类(HMW)的形成，特别是组合较低的pH时。
如上所述，PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)也可以在流出模式操作，该操作需要上样中较少的盐条件。从产物质量和产物稳定性的观点考虑，例如，具有较少混浊度、较少HMW的产物，需要较少的盐条件。因此，我们继续进行流出模式下使用PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂的流程优化。
为了优化流程，我们调查了许多用于运行HIC柱的参数，包括上样浓度、上样pH、上样盐摩尔浓度、树脂上的上样密度、床高度、流速、温度、平衡缓冲液pH和摩尔浓度。对于这些实验，我们使用总CHOPELISA监测总CHOP，并还通过LC-MS/MS监测PLBL2。某些示例性数据示于表5。表5中的数据表明，在流出模式的指定条件下运行HIC柱有效地从蛋白A池检测到的高水平实质上地降低了PLBL2水平。与蛋白A池的水平相比，HIC后PLBL2水平降低几百倍。
表5.在不同HIC柱条件下总CHOP和PLBL2水平。
使用PLBL2LC-MS/MS测定法和其他典型的产物质量测定法(如，SE-HPLC、CE-SDS、iCIEF)指导流程参数选择，我们确定下列条件作为运行HIC柱的期望条件，如产物质量特性和PLBL2的降低所评估的：平衡和洗涤缓冲液：50mM乙酸钠，pH5.0；目标上样密度：100g/L，流速：150cm/hr，22℃±3℃。这些条件的某些小的变化也可能是希望的，例如，25℃±3℃或27℃±3℃。光密度(OD)用在280nm的吸光度(A280)监测，在0.5OD至1.5OD之间或在洗涤8个柱体积后收集池(即，流出液)。
如上所提及，初始方法是：蛋白A亲和色谱法(MABSELECTSURETM)，随后是阳离子交换(HS)，随后是阴离子交换(QSEPHAROSETMFastFlow)。在如上所述开发降低PLBL2水平的方法后，我们接下来试图以方便的方式实现方法的变化。因此，我们研究向初始方法增加HIC柱，从而产生一个四柱方法，以及用HIC柱替代CEX柱或AEX柱，最后我们探索了柱的顺序。我们发现三柱方法，蛋白A亲和色谱法(MABSELECTSURETM)，随后是阴离子交换(QSEPHAROSETMFastFlow)，随后是在流出模式操作HIC(PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub))提供了最方便的方法，其最有效降低最终药品中的PLBL2。此三柱方法将在下面详细描述。
第一亲和色谱法步骤是使用MABSELECTSURETM树脂的结合-和-洗脱过程。柱平衡(25mM氯化钠，25mMTrispH7.7)后，将HCCF上样到柱上，并用平衡缓冲液和高盐pH7.0的洗涤缓冲液洗涤。抗IL-13MAb在酸性条件下(pH2.8)下从柱洗脱。
第二阴离子交换色谱法步骤使用QSEPHAROSETMFastFlow(QSFF)树脂在结合-洗脱模式运行。柱平衡(50mMTris，pH8.0)后，调整来自MABSELECTSURETM柱的抗IL13池至pH8.05，并上样到柱上。洗涤该柱(50mMTris，pH8.0)，用85mM氯化钠、50mMTrispH8.0从柱洗脱抗IL-13MAb。
第三和最后的疏水相互作用色谱法步骤使用PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂在流出模式下操作。柱平衡(50mM乙酸钠pH5.0)后，调整来自QSFF柱的抗IL13池至pH5.0并上样到柱上。该抗IL-13MAb流出，并用平衡缓冲液(50mM乙酸钠pH5.0)洗涤柱。基于A280起始和终止该抗IL-13MAb池，在0.5至1.5OD之间进行汇集或汇集最多8个柱体积。
如同初始方法，包括其他病毒灭活和过滤步骤，以及最终的超滤渗滤(UFDF)步骤。最终产物(药品)配制在20mM组氨酸醋酸盐，6％蔗糖，0.03％聚山梨醇酯20，pH5.7中，浓度125mg/mL。
如分别由总CHOPELISA和单克隆PLBL2ELISA所测量的，初始方法与改进方法在总CHOP和PLBL2方面的比较，提供在表6(初始方法)和7(改进方法)中。表6中的数据清楚地表明，初始方法导致纯化的产物(UFDF池)含有高水平的总CHOP(在三个不同的运行中179，310和189ng/mg)和高水平的PLBL2(在三个不同的运行中242，328，和273ng/mg)，而表7中的数据清楚地表明，改进方法相当有效地生产具有实质上降低水平的总CHOP(在四个不同的运行中1.1，<0.9，2.8和3.4ng/mg)和实质上降低水平的PLBL2(在四个不同的运行中0.21，0.42，0.35，和0.24ng/mg)的纯化产物。与上面给出的数据一致，表7中的数据表明，在上述条件下运行HIC柱特别有效地降低抗IL-13MAb制剂中的总CHOP和PLBL2水平。
表6.使用初始方法在纯化抗IL-13MAb的各个阶段中总CHOP和PLBL2水平。
表7使用改进方法在纯化抗IL-13MAb的各个阶段中总CHOP和PLBL2水平。
总之，面对纯化的抗IL-13MAb制剂中单一CHOP种类的高水平导致的测定法非线性稀释行为的问题，我们首先确定了CHOP种类为仓鼠PLBL2，其是先前未被描述的由CHO细胞生产的重组蛋白制剂中的杂质。接下来我们确定了有效地降低抗IL-13MAb制剂中PLBL2水平的纯化条件。最后，我们综合这些纯化条件形成导致现有抗IL-13MAb纯化方法的改进的整体纯化方法。这个改进的方法采用在流出模式运行的HIC柱，以降低PLBL2水平，其组合亲和色谱法步骤和阴离子交换色谱法步骤运行。我们表明，改进的方法稳健和有效地实质上降低抗IL-13MAb制剂中仓鼠PLBL2水平。我们表明，改进的方法与初始方法相比，可重复地降低PLBL2水平约1000倍。PLBL2水平的这种降低对于生产适用于晚期临床试验及以后的患者治疗用途的纯化抗IL13MAb产物是重要的。
降低抗Aβ抗体制剂中仓鼠PLBL2的纯化方法
接下来，我们设法评估上述纯化方法，特别是使用HIC柱用于最终色谱法步骤，是否同样有效地用于降低其他抗体制剂中的PLBL2水平。对于该实验，我们选择了抗Aβ抗体，其是在CHO细胞中产生。示例性抗Aβ抗体和生产这类抗体的方法先前已被描述，例如，在WO2008011348、WO2007068429、WO2001062801和WO2004071408中。这些特定的实验中使用被称为crenezumab的抗Aβ抗体。如对抗IL-13MAb所述，我们探索了用于蛋白A亲和柱之后的第二柱的各种树脂和缓冲液，以及我们探索了用于HIC柱的各种缓冲液和运行条件，以确定对抗Aβ的产物质量和稳定性特性以及对于去除仓鼠PLBL2最佳的那些条件。
我们发现，三柱方法，蛋白A亲和色谱法(MABSELECTSURETM)、接着使用混合模式树脂(CAPTOTMAdhere)、接着是流出模式下操作HIC(PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub))方便和有效地降低最终药品中的PLBL2。此三柱方法将在下面详细描述。
第一亲和色谱法步骤是使用类似于以上描述的用于抗IL-13MAb的MABSELECTSURETM树脂的结合-洗脱方法。
第二混合模式色谱法步骤使用CAPTOTMAdhere树脂在流出模式操作。柱平衡(20mMMES，150mM乙酸钠，pH6.25)之后，调节来自MABSELECTSURETM柱的抗Aβ池的pH值至6.25并上样到柱上。在上样期间汇集开始在0.5OD。完成上样后，用5个柱体积(CV)的平衡缓冲液(20mMMES，150mM乙酸钠，pH6.25)洗涤柱并且还收集整个5个CV。
第三和最后的疏水相互作用色谱法步骤使用PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂在流出模式操作。柱平衡(150mM乙酸钠pH5.0)之后，调节来自CAPTOTMAdhere柱的抗Aβ池的pH值至5.0并上样到柱上。抗AβMAb流出，并且还用平衡缓冲液(150mM乙酸钠pH5.0)洗涤柱。在上样期间开始抗AβMAb池，基于A280汇集开始于0.5OD。用10CV的平衡缓冲液(150mM乙酸钠pH5.0)洗涤柱，并且还收集了整个10CV。如抗IL-13MAb，还包括了另外的病毒灭活和过滤步骤，以及最终的超滤渗滤(UFDF)步骤。
在四种不同的纯化运行中使用上述方法的结果示于下表8。
表8.在使用HIC纯化抗AβMAb的各个阶段的PLBL2水平。
在表8中所示的结果表明，使用HIC树脂作为最终色谱法步骤有效地将抗AβMAb制剂中残留的PLBL2水平降低至类似于抗IL-13MAb中看到的量。尽管从产物回收和PLBL2降低的观点看，上样密度300g/L产生了所希望的结果，然而将HIC柱的上样密度从300g/L减少至100g/L观察到残留PLBL2进一步减少。
我们还研究了HIC色谱法步骤的其他两个条件，上样pH值和上样硫酸盐摩尔浓度。对于这些实验，我们用含有51ng/mgPLBL2(如通过ELISA测量的)、15mM乙酸钠pH5.5的CAPTOTMAdhere池开始。我们使用不同pH值的0mM硫酸钠或800mM硫酸钠储备溶液，调整上样pH和上样硫酸盐摩尔浓度至下表9所示的值。我们测试了在低硫酸盐摩尔浓度的条件下(0mM)和高硫酸盐摩尔浓度的条件下(240mM)下表9中所示的各上样pH值。在上样密度60g/L下测试各条件。如表9呈现的结果所示，降低上样pH至pH4或pH5或增加上样硫酸盐的摩尔浓度(至240mM硫酸盐)分别有效地降低在最终HIC池中的PLBL2水平。上样中pH4.0和240mM硫酸盐的组合对最小化HIC池中残留的PLBL2量是特别有效的。
表9.在一定范围的上样pH和硫酸盐摩尔浓度下观察的HIC池中PLBL2水平。
因此，使用HIC树脂作为纯化CHO产生的多肽(如本文所述的抗IL-13MAb和抗AβMAb)的最终色谱法步骤，有效地降低仓鼠PLBL2的残留量至很低的水平，例如在HIC池中1ng/mg或以下。
降低IgG1抗体制剂中仓鼠PLBL2的纯化方法
接下来，我们评估了描述的用于纯化抗IL-13和抗AβIgG4抗体制剂的方法(特别是使用HIC柱用于最终色谱法步骤)是否同样有效地降低IgG1抗体制剂中的PLBL2水平。对于这些实验，我们首先选择抗IL17A/F抗体，其是IgG1抗体且在CHO细胞中产生。示例性的抗IL17A/F抗体和产生这类抗体的方法先前已被描述，例如WO2009136286和美国专利号8,715,669。如对抗IL-13和抗AβMAb所描述的，我们探索了各种树脂(具体地，PHENYLSEPHAROSETMFF[lowsub]和PHENYLSEPHAROSETMFF[highsub]和缓冲液条件(具体地，50mM乙酸钠，pH5.5和50mMTris，85mM乙酸钠，pH8.0)用于HIC柱，以确定那些用于抗IL17A/F的产物质量和稳定性特性以及用于去除仓鼠PLBL2的最佳条件。
我们发现，三柱方法，蛋白A亲和色谱法(MABSELECTSURETM)、接着使用结合-洗脱模式下操作的阳离子交换色谱法(50HS)、和流出模式下操作的HIC(PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub))方便和有效地降低最终药品中的PLBL2。此三柱方法将在下面详细描述。
第一亲和色谱法步骤是类似于以上描述的用于抗IL13和抗AβMAb的使用MABSELECTSURETM树脂的结合-洗脱方法。第二阳离子交换色谱法步骤使用50HS树脂，在结合-洗脱模式下操作。柱平衡(40mM乙酸钠，pH5.5)后，将调过pH的抗IL17A/FMABSELECTSURETM池(pH为5.0)上样到柱上。洗涤柱(40mM乙酸钠，pH5.5)，然后用40和400mM乙酸钠，pH5.5创建的导电性梯度将抗IL17A/F抗体从柱上洗脱。在梯度洗脱期间基于A280汇集，≥0.5OD开始以及≤2.0OD结束。
第三和最后的疏水相互作用色谱法步骤使用PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂在流出模式操作。柱平衡(50mM乙酸钠pH5.5)之后，来自50HS柱的抗IL17A/F池直接上样到柱上，不调节pH。抗IL17A/FMAb流出。在上样期间基于A280汇集抗IL17A/FMAb，开始于≥0.5OD。用10CV的平衡缓冲液(50mM乙酸钠，pH5.5)洗涤柱，在洗涤期间在≤1.0OD结束汇集。
在一个纯化运行期间使用上述方法的结果示于下表10。
表10使用HIC纯化抗IL17A/FMAb的各个阶段的PLBL2水平。
表10所示的结果表明，使用HIC树脂作为最终色谱法步骤有效地降低抗IL17A/FMAb(IgG1)制剂中残留的PLBL2水平，降低的量与抗IL13和抗AβMAb(IgG4)观察到的类似。
抗CMV抗体
除了测试抗IL17A/F，我们测试了另一个IgG1MAb，抗CMV-MSL抗体，其也在CHO细胞中产生。示例性抗CMV抗体，包括抗CMV-MSL，以及生产这种抗体的方法之前已被描述，例如WO2012047732。
再次，我们发现，三柱方法，蛋白A亲和色谱法(MABSELECTSURETM)，接着是在结合-洗脱模式操作的阳离子交换色谱法(50HS)，和流出模式下操作的HIC(PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub))方便和有效地降低最终药品中的PLBL2。此三柱方法在下面详细描述。
第一亲和色谱法步骤是使用类似于上述的用于抗IL-13、抗Aβ和抗IL17A/FMAb的MABSELECTSURETM树脂的结合-洗脱方法。第二阳离子交换色谱法步骤中使用50HS树脂并在结合-洗脱模式下操作。柱平衡(40mM乙酸钠，pH5.5)后，将pH调整过的CMV-MSLMABSELECTSURETM池(pH5.0)上样到柱上。洗涤该柱(40mM乙酸钠，pH5.5)，然后用40和400mM乙酸钠，pH5.5创建的导电性梯度从柱上洗脱CMV-MSL抗体。在梯度洗脱期间基于A280汇集，在≥0.5OD开始并在≤1.0OD结束。
在此具体的运行中，在阳离子交换和疏水相互作用色谱法步骤之间使用ViresolvePro作为病毒过滤和FluorodyneUEDF过滤器作为预过滤进行在病毒过滤步骤。
第三和最后的疏水相互作用色谱法步骤使用PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂在流出模式操作。柱平衡(50mM乙酸钠pH5.5)之后，来自50HS柱的抗CMV-MSL池直接上样到柱上，不调节pH。抗CMV-MSLMAb流出。在上样期间基于A280汇集抗CMV-MSLMAb，开始于≥0.5OD。用10CV的平衡缓冲液(50mM乙酸钠，pH5.5)洗涤柱，在洗涤期间在≤0.5OD结束汇集。
在一个纯化运行期间使用上述方法的结果示于下表11。
表11.使用HIC纯化抗CMV-MSLMAb的各个阶段中PLBL2水平。
表11所示的结果表明，使用HIC树脂作为最终色谱法步骤有效地降低抗CMV-MSLMAb制剂中残留的PLBL2水平，降低量类似于在抗IL-13、抗Aβ和抗IL17A/FMAb中看到的。因此，在纯化CHO-产生的多肽(如抗IL-13MAb和本文描述的其他MAb)中使用HIC树脂作为最终色谱法步骤，有效地将仓鼠PLBL2的残留量降低至非常低的水平，例如，在HIC池中少于1ng/mg。因此，我们表明使用如本文中描述的HIC色谱法步骤来降低PLBL2水平对IgG1MAb和IgG4MAb是有效的，示出了该方法用于降低重组多肽制剂中仓鼠PLBL2水平的普遍适用性。
实施例3-在施用含不同量仓鼠PLBL2的抗IL13MAb组合物的患者中评估人抗仓鼠PLBL2反应
为了评估CHOPLBL2杂质的潜在影响，我们开发了ELISA测定法(桥连ELISA测定法)来检测接受抗IL-13MAb(lebrikizumab)的人受试者中抗仓鼠PLBL2的抗体。分析参加lebrikizumab各种临床研究的患者以及接受安慰剂受试者的血清样品的给药前和给药后的抗仓鼠PLBL2抗体的证据。临床研究的细节先前已被描述(WO2012/083132,Corren等人,NEnglJMed365:1088-98(2011))，在下面仅提供这些研究中最相关的细节。
开发并验证了检测人血清中抗仓鼠PLBL2抗体的抗体桥接ELISA测定法，使用两个缀合试剂来捕获针对仓鼠PLBL2抗体的所有同种型：纯化的缀合生物素的仓鼠PLBL2(生物素-PLBL2)和纯化的缀合地高辛的仓鼠PLBL2(DIG-PLBL2)。使用本领域技术人员公知的标准方法进行仓鼠PLBL2的生产和纯化，其也公开在美国临时申请号61/877,503和61/991,228中，使用本领域技术人员公知的标准方法进行与生物素或地高辛的缀合。在该半同质抗体桥接ELISA测定法中，在测定稀释剂中(PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨醇酯20/0.05％Proclin300，pH值7.4±0.1)的75μL/孔的缀合溶液含有Biotin-PLBL2和DIG-PLBL2各3μg/mL，在环境温度下与75μL/孔的测定稀释液中1:20稀释的血清样品和对照样品，在聚丙烯微管(NationalScientificSupplyCo.；Claremont,CA)中共同孵育过夜(16-24小时)。孵育后，100μL/孔混合物从微管转移到链亲和素包被的96孔微量板(StreptaWellTMHighBind；RocheDiagnostics；Indianapolis,IN)，该微量板在自动洗板仪器(BioTekELx405)中用400μL/孔的洗涤缓冲液(PBS/0.05％聚山梨醇酯20)洗涤3次，并在环境温度下孵育2小时±10分钟。将板在洗板仪中用400μL/孔洗涤缓冲液洗涤4次，随后，以100μL/孔加入400ng/mL缀合辣根过氧化物酶(HRP)的小鼠抗地高辛抗体(JacksonImmunoResearchCat.200-032-156)，并在环境温度下孵育2小时±10分钟，进行检测。板在洗板仪中用400μL/孔洗涤缓冲液洗涤4次以后，以100μL/孔加入过氧化物酶底物(四甲基联苯胺)(0.4g/LTMB)和过氧化物酶溶液B(0.02％过氧化氢)(KPLCat.50-76-03)的等量混合溶液，在环境温度下孵育18-28分钟用于显色，通过加入100μL/孔的1M磷酸停止反应。在450nm读取板以检测吸光度和在630nm读取参考吸光度。用于该测定法的阳性对照是一种单克隆抗体构建体，其由人IgG1框架上的鼠抗仓鼠PLBL2特异的互补决定区(CDR)组成。使用该抗体的测定法的相对灵敏度被确定为25ng/mL。使用该抗体的测定药物耐受性的实验表明，血清中高达50μg/mL的lebrikizumab或1μg/mL的仓鼠PLBL2在测定法中没有造成干扰或交叉反应性。
为了进行测定法，首先在测定法中以1/20的最小稀释筛选血清样品。然后使用竞争验证性测定法确认筛选的阳性样品的仓鼠PLBL2特异性。如果样品被确认为阳性，则系列稀释该样品得到滴度值。以滴度单位报告阳性反应，其是稀释因子的log10，在该值样品信号等于测定法截点(用于确定阳性的阈值)的信号。
使用如上所述的抗仓鼠PLBL2ELISA分析患者样品的四个临床研究如下简要描述。研究1是随机、双盲、安慰剂对照、概念验证研究的II期，以评估哮喘患者中lebrikizumab的作用，用吸入皮质类固醇(ICS)的长期治疗过程中对该哮喘疾病控制不佳。总共219名患者随机(分组)，其中106名接收至少一次皮下(SC)250mglebrikizumab的剂量，92名接收六个月的剂量。
研究2是对哮喘患者的随机、双盲、安慰剂对照、剂量范围研究的II期，其中哮喘患者没有接受ICS治疗。患者由SC施用接受lebrikizumab三个剂量(500，250，或125mg)之一或安慰剂。在12周的治疗期间施用研究药物四次。共有158名患者暴露于至少一个lebrikizumab剂量，145名患者接受所有四个剂量。
研究3是在健康的日本和高加索志愿者中lebrikizumab的PK研究的I期。20名健康日本和高加索受试者(每个种族组中10名受试者)的三个离散组以7：3的比率随机分为lebrikizumab(125，250，和375mgSC)和安慰剂组。受试者第1天接受一次剂量和随后监控120天。共有42受试者各接受一次lebrikizumab。
在研究1-3中，共306受试者，其中264是哮喘患者，每位接受至少一次剂量的含仓鼠PLBL2的物质。对仓鼠PLBL2的暴露是可变的，取决于接受的lebrikizumab剂量。
研究4是随机、双盲、安慰剂对照研究的IIb期，以评估在不受控制的哮喘患者中lebrikizumab的疗效和安全性，该哮喘患者使用ICS和第二控制药物。患者通过SC施用每月接受三个剂量(250，125，或37.5mg)的lebrikizumab中之一或安慰剂。在研究4中，总共463名患者随机(分组)，其中347名接收至少一个剂量的lebrikizumab。对仓鼠PLBL2的暴露是可变的，取决于接受的lebrikizumab剂量。
以下表12提供了研究1-4每个的总结，其表明受试者暴露的仓鼠PLBL2的水平范围和lebrikizumab的剂量。
表12.在Lebrikizumab临床试验中仓鼠PLBL2暴露。
a来自四个不同批次的临床材料的范围。
使用上述抗仓鼠PLBL2抗体测定法进行从研究1所选时间点的回顾分析，检测抗仓鼠PLBL2抗体。分析来自安慰剂和给药受试者的样品，以确定预先存在的反应水平，以及对lebrikizumab给药反应的抗体的发生。有113名安慰剂受试者和106名接受至少一次lebrikizumab剂量的给药受试者。选择用于分析的时间点是第0、29、85、141、225天和提前终止。在下一次剂量前取样品；因此，第29天的样品在第二次剂量施用前提取。在每个时间点抗仓鼠PLBL2抗体阳性受试者的百分比如下计算：取在每个时间点阳性受试者的数目，除以在每个时间点检测的受试者总数。该数据示于表13。
表13.研究1的抗仓鼠PLBL2抗体的结果。
a在药物研究早期没有继续的8名lebrikizumab受试者中，只有3名报告了作为药物研究停止的原因的不良反应。
在第0天给药前是阳性的6名研究1安慰剂受试者在整个研究过程持续阳性。在验证性竞争测定法中证实来自这些受试者的样品为阳性，在第0天具有滴度范围从1.6到2.9滴度单位。在以后的访问中获得的滴度类似于第0天所获得的滴度。其他一些安慰剂受试者在研究期间具有低水平的阳性反应。
在该接受lebrikizumab的研究1的受试者中，98％(104/106)给药后具有阳性抗体反应，并贯穿研究结束仍为阳性，其中大多数受试者在接受至少两个剂量的lebrikizumab之后成为阳性。给药后滴度范围从1.35至4.76滴度单位，滴度一般随着时间而增加。抗仓鼠PLBL2抗体发展的临床意义不明。在本研究中没有确定临床上重要的安全性信号，鉴于仓鼠PLBL2抗体的高发率，可以认为其与安全事件无相关性。
在研究4收集的样品上还进行了中期分析。分析了来自安慰剂和给药的受试者，以确定预先存在的反应水平以及对lebrikizumab给药反应的抗仓鼠PLBL2抗体的发生。有116名安慰剂受试者和347名接受至少一次lebrikizumab剂量的给药受试者。来自92名安慰剂受试者和268名给药受试者的样品在这数据组中表示。结果示于表14。
表14.没有事先暴露于Lebrikizumab的受试者的研究4的抗仓鼠PLBL2抗体结果。
a在药物研究早期没有继续的12名lebrikizumab受试者中，只有4名报告了作为研究药物停止的原因的不良反应。
在给药前第0天是阳性的四名研究4的安慰剂受试者具有低水平的阳性反应，仅高于测定法的检测极限。在某些随后的时间点上(但不是全部)可检测低水平的反应。
在给药前第0天是阳性的15名研究4的接受lebrikizumab的受试者在随后的时间点持续阳性，多次剂量后滴度增加。此外，研究4中有10名受试者之前在研究1中接受lebrikizumab。这些受试者有9名随后在研究4中再给药lebrikizumab，而1名接受安慰剂。所有10名受试者在研究4的给药前第0天是阳性，并在随后的时间点持续阳性。这10名受试者的数据从表14排除，因为他们以前暴露于lebrikizumab。
在研究4接受lebrikizumab的受试者中，在剂量组之间似乎存在阳性率的差异。然而，由于这些数据是不完整的，在此时间点不能作出关于这些差异的显著性的结论。与来自研究1的数据相似，大多数受试者在接受至少两个剂量的lebrikizumab后变为阳性。给药后滴度范围从1.68到4.55滴度单位，滴度一般随着时间而增加。由于这是一个不完整的数据组，阳性百分数和滴度范围可以由附加数据的累积而改变。
研究4的中期安全性评估显示出类似较早完成的研究的安全特性，其中没有临床显著的安全性信号，包括无过敏反应或严重超敏反应的报告。值得注意的是，在研究1中接受lebrikizumab并随后在研究4中重新给药lebrikizumab的9名患者中的6名在中期分析的时间点没有报告任何不良事件，只有1名患者报告有任何局部注射部位反应。迄今在临床试验中没有确定该抗仓鼠PLBL2抗体反应的临床后遗症。
我们还对来自研究2的125mg剂量组进行了评估，那些结果显示在表15中。
表15.研究2抗仓鼠PLBL2抗体的结果。
a在药物研究早期没有继续的2名受试者中，均没有报告作为研究药物停止的原因的不良反应。
在给药前第0天是阳性的两名研究2的受试者在所有后续的时间点持续阳性，多次剂量后滴度增加。在接受125mglebrikizumab的研究2受试者中，87％(46/53)给药后具有阳性抗体反应，并在整个研究至结束保持阳性，其中大多数受试者在接受至少两次剂量的lebrikizumab之后变成阳性。给药后滴度范围从1.51～4.09滴度单位，滴度一般随着时间而增加。
结论
为了评估CHOPLBL2杂质的潜在影响，开发了一种测定法，其检测接受含有显著水平的仓鼠PLBL2的lebrikizumab制剂的受试者中抗仓鼠PLBL2抗体。在研究1的完整数据集和研究2的125mg剂量组和研究4的部分数据组的基础上，在lebrikizumab制剂中存在的仓鼠PLBL2在暴露于仓鼠PLBL2的大多数受试者中产生免疫反应。
在抗仓鼠PLBL2抗体测定法中许多安慰剂和lebrikizumab剂量组受试者具有预先存在的免疫反应性。这种预先存在的反应的原因是未知的；先前在正常人血清样品中已表征并证实对CHO宿主细胞蛋白的抗体反应性，该血清无已知的之前暴露于CHO-衍生的生物制品(Xue等人,TheAAPSJournal12(1):98-106(2010))。但是，没有对单一种类CHOP，PLBL2特定的数据公布。
对于在抗仓鼠PLBL2抗体测定法中在该研究开始时具有预先存在的免疫反应的受试者，重复给药lebrikizumab后有一个持续上升的抗体滴度。对于在研究开始时抗体阴性的受试者，所有四项研究中的多数受试者在至少两次施用lebrikizumab后变成阳性，且在所有随后的时间点仍然是阳性。
抗仓鼠PLBL2抗体发生的临床意义尚不清楚。虽然在研究受试者中仓鼠PLBL2抗体的发生率高，但是可以认为其与安全事件之间没有相关性。重要的是，在这些完全或中期研究中没有鉴定到安全信号，特别是没有报道过敏反应、类过敏反应、或者严重的超敏性反应。尽管如此，仍担心长期暴露于重复给药可能会增加潜在的不期望的效果，例如过敏反应、超敏反应和免疫复合物沉积，特别是在哮喘患者人群和其他过敏或超敏的患者群体。因此，在后期临床研究和之后(其中可能有很长一段时间这样重复给药)向患者给药含有实质上降低仓鼠PLBL2水平的IL-13MAb(例如，lebrikizumab)制剂以便尽可能降低免疫原性是重要的。
其他抗体序列提供于下表16。
表16.抗IL17A/F抗体氨基酸序列(SEQIDNOS：15-22)和抗Aβ抗体氨基酸序列(SEQIDNOS：23-30)。

Claims (99)

1.一种包含从中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗IL-13单克隆抗体的组合物，其中所述组合物包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中质谱测定法是LC-MS/MS。
12.一种从中国仓鼠卵巢宿主细胞分离的经纯化的抗IL-13单克隆抗体制剂，其中所述制剂通过包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法纯化，从而生成纯化的制剂，其中纯化的制剂包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
13.根据权利要求12所述的抗IL-13抗体制剂，其中HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。
14.根据权利要求13所述的抗IL-13抗体制剂，其中HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
15.根据权利要求14所述的抗IL-13抗体制剂，其中HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液各包含50mM乙酸钠pH5.0。
16.根据权利要求15所述的抗IL-13抗体制剂，其中在280纳米的吸光度监测流出液和收集0.5OD至1.5OD之间的流出液。
17.根据权利要求15所述的抗IL-13抗体制剂，其中收集最多8个柱体积的流出液。
18.根据权利要求12所述的抗IL-13抗体制剂，其中方法进一步包括亲和色谱法步骤。
19.根据权利要求18所述的抗IL-13抗体制剂，其中亲和色谱法是蛋白A色谱法。
20.根据权利要求12所述的抗IL-13抗体制剂，其中方法进一步包括离子交换色谱法步骤。
21.根据权利要求20所述的抗IL-13抗体制剂，其中离子交换色谱法为阴离子交换色谱法。
22.一种从中国仓鼠卵巢细胞分离的经纯化的抗IL-13单克隆抗体制剂，其中所述抗体制剂通过包括第一蛋白A亲和色谱法步骤、第二阴离子交换色谱法步骤、和第三疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法纯化，从而产生纯化的制剂，其中纯化的制剂包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
23.根据权利要求22所述的抗IL-13抗体制剂，其中亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，阴离子交换色谱法步骤包括QSEPHAROSETMFastFlow树脂，和HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。
24.根据权利要求23所述的抗IL-13抗体制剂，其中
亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱；
阴离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含QSEPHAROSETMFastFlow树脂的柱；
HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
25.根据权利要求12或权利要求22所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中所述三个重链CDR的具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。
26.根据权利要求25所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区。
27.根据权利要求25所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。
28.根据权利要求26所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链。
29.根据权利要求27所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。
30.根据权利要求25所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。
31.根据权利要求30所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。
32.根据权利要求12或权利要求22所述的抗IL-13抗体制剂，其中使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。
33.根据权利要求32所述的抗IL-13抗体制剂，其中免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。
34.根据权利要求32所述的抗IL-13抗体制剂，其中质谱测定法是LC-MS/MS。
35.一种纯化中国仓鼠卵巢宿主细胞中生产的重组多肽的方法，其中所述方法提供了包含重组多肽和残留量仓鼠PLBL2的纯化制剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
37.根据权利要求36所述的方法，其包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。
38.根据权利要求37所述的方法，其中HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
40.根据权利要求37所述的方法，其中重组多肽选自生长因子、细胞因子、抗体、抗体片段和免疫粘附素。
41.根据权利要求40所述的方法，其中重组多肽是抗体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中抗体是人源化单克隆抗体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中抗体是IgG1、或IgG2或IgG3或IgG4。
44.根据权利要求43所述的方法，其中抗体是IgG4。
45.根据权利要求41所述的方法，其中抗体是抗IL-13。
46.根据权利要求44所述的方法，其中抗体是lebrikizumab。
47.根据权利要求45所述的方法，其中抗IL-13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。
48.根据权利要求45、46或47任一项所述的方法，其中HIC步骤包括在流出模式操作含树脂柱，包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液各包含50mM乙酸钠pH5.0。
49.根据权利要求48所述的方法，其中在280纳米的吸光度监测流出液和收集0.5OD至1.5OD之间的流出液。
50.根据权利要求48所述的方法，其中收集最多8个柱体积的流出液。
51.根据权利要求48所述的方法，进一步包括亲和色谱法步骤。
52.根据权利要求51所述的方法，其中亲和色谱法是蛋白A色谱法。
53.根据权利要求48所述的方法，进一步包括离子交换色谱法步骤。
54.根据权利要求53所述的方法，其中离子交换色谱法为阴离子交换色谱法。
55.根据权利要求48所述的方法，包括第一蛋白A亲和色谱法步骤和第二阴离子交换色谱法步骤以及之后的疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。
56.根据权利要求55所述的方法，其中亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，阴离子交换色谱法步骤包括QSEPHAROSETMFastFlow和包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)的HIC步骤。
57.根据权利要求56所述的方法，其中
亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱；
阴离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含QSEPHAROSETMFastFlow树脂的柱，和
HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
58.根据权利要求41所述的方法，其中抗体是抗Aβ。
59.根据权利要求44所述的方法，其中抗体是crenezumab。
60.根据权利要求58所述的方法，其中抗Aβ抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：23的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：24的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：25的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：26的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：27的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：28的CDR-L3。
61.根据权利要求58、59或60任一项所述的方法，其中HIC步骤包括在流出模式操作含树脂柱，和HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液各包含150mM乙酸钠pH5.0。
62.根据权利要求61所述的方法，其中在280纳米吸光度下监测流出液并在0.5OD开始收集流出液，收集持续10个柱体积。
63.根据权利要求61所述的方法，其进一步包括亲和色谱法步骤。
64.根据权利要求63所述的方法，其中亲和色谱法是蛋白A色谱法。
65.根据权利要求61所述的方法，其包括混合模式色谱法步骤。
66.根据权利要求61所述的方法，其包括第一蛋白A亲和色谱法步骤和第二混合模式色谱法步骤和之后的疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。
67.根据权利要求66所述的方法，其中亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，混合模式色谱法步骤包括CAPTOTMAdhere，HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)。
68.根据权利要求67所述的方法，其中
亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱；
混合模式色谱法步骤包括在流出模式操作含CAPTOTMAdhere树脂的柱，和
HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂的柱。
69.根据权利要求36所述的方法，其中使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。
70.根据权利要求69所述的方法，其中免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。
71.根据权利要求69所述的方法，其中质谱测定法是LC-MS/MS。
72.一种包含从中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗Aβ单克隆抗体的组合物，其中组合物包含抗Aβ抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中抗Aβ抗体是crenezumab。
74.根据权利要求72所述的组合物，其中抗Aβ抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：23的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：24的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：25的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：26的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：27的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：28的CDR-L3。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区。
76.根据权利要求74所述的组合物，其中抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。
77.根据权利要求74所述的组合物，其中抗Aβ抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：29的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：30的轻链可变区。
78.根据权利要求43所述的方法，其中抗体是IgG1。
79.根据权利要求41所述的方法，其中抗体是抗IL17A/F。
80.根据权利要求79所述的方法，其中抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：15的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：16的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：17的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：18的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：19的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：20的CDR-L3。
81.根据权利要求79或权利要求80所述的方法，其中HIC步骤包括在流出模式操作含树脂柱，和HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液各包含50mM乙酸钠pH5.5。
82.根据权利要求81所述的方法，其中在280纳米的吸光度监测流出液和在0.5OD开始收集流出液，收集持续10个柱体积。
83.根据权利要求81所述的方法，进一步包括亲和色谱法步骤。
84.根据权利要求83所述的方法，其中亲和色谱法是蛋白A色谱法。
85.根据权利要求81所述的方法，进一步包括阳离子交换色谱法步骤。
86.根据权利要求81所述的方法，其包括第一蛋白A亲和色谱法步骤和第二阳离子交换色谱法步骤和之后的疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。
87.根据权利要求86所述的方法，其中亲和色谱法步骤包括MABSELECTSURETM树脂，阳离子交换色谱法步骤包括50HS树脂，和HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(highsub)树脂。
88.根据权利要求87所述的方法，其中
亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱；
阳离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含50HS树脂的柱，和
HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
89.一种包含由中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗IL17A/F单克隆抗体的组合物，其中所述组合物包含抗IL17A/F抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中抗IL17A/F抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：15的CDR-H1，具有氨基酸序列SEQIDNO：16的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：17的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：18的CDR-L1，具有氨基酸序列SEQIDNO：19的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：20的CDR-L3。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区。
92.根据权利要求90所述的组合物，其中抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。
93.根据权利要求90所述的组合物，其中抗IL17A/F抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：21的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：22的轻链可变区。
94.一种治疗患者中IL-13介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用治疗组合物，其中治疗组合物包含权利要求1-8任一项的治疗组合物。
95.根据权利要求94所述的方法，其中施用的治疗组合物相比于施用参考组合物，对仓鼠PLBL2的免疫原性更低，其中所述参考组合物包含从中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗IL-13单克隆抗体和残留量大于30ng/mg、或大于50ng/mg、或大于100ng/mg、或大于200ng/mg、或大于300ng/mg的仓鼠PLBL2。
96.根据权利要求94所述的方法，其中治疗组合物每四周皮下施用一次、或每八周皮下施用一次、每12周皮下施用一次。
97.根据权利要求96所述的方法，其中患者每四周治疗一次，持续至少一个月，或持续至少三个月，或持续至少六个月，或持续至少九个月，或持续至少12个月，或持续至少18个月，或持续至少两年，或持续超过两年。
98.根据权利要求94所述的方法，其中IL-13介导的疾患选自哮喘、特发性肺纤维化和特应性皮炎。
99.根据权利要求94所述的方法，其中IL-13介导的疾患选自过敏性哮喘、非过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病和骨质疏松症。
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