KR102373930B1 - 정제된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

항체, 예컨대 치료 항체를 비롯한, 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포로부터 단리된 정제된 재조합 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 제조 및 사용하는 방법이 제공된다.

Description

정제된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING PURIFIED RECOMBINANT POLYPEPTIDES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 9월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 61/877,517을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2014년 8월 28일에 작성된 상기 ASCII 카피는 2014.AUG.28 P5704R1-WO Sequence Listing.txt로 명명되며, 크기가 34,811 바이트이다.
분야
항체, 예컨대 치료 항체를 비롯한, 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포로부터 단리된 정제된 재조합 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 제조 및 사용하는 방법이 제공된다.
천식 및 다른 호흡기 장애를 치료하기 위한 다수의 약물이 시판되고 있거나 개발되고 있다. 천식 요법을 위한 표적 중 하나는 IL-13이다. IL-13은 활성화 T 세포, NKT 세포, 호염기구, 호산구 및 비만 세포에 의해 생산되는 다면발현성 TH2 시토카인이고, 이는 전임상 모델에서 천식의 발병기전에 강하게 연루되었다. 항-IL-13 항체를 비롯한 IL-13 길항제가 이전에 기재되었다. 특정의 이러한 항체는 또한 인간 치료제로서 개발되었다. 최근에, 여러 연구는 천식의 치료에서 IL-13에 대한 모노클로날 항체의 임상 활성을 제시하였다 (예를 들어, 문헌 [Corren et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365, 1088-1098; Gauvreau et al., 2011, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, 1007-1014; Ingram and Kraft, 2012, J. Allergy Clin. Immunol. 130, 829-42; Webb, 2011, Nat Biotechnol 29, 860-863] 참조). 이들 중, IL-13 활성을 중화시키는 인간화 IgG4 항체인 레브리키주맙은, 대부분 흡입용 코르티코스테로이드 및 장기-작용 베타2-아드레날린성 수용체 효능제를 사용한 치료에도 불구하고 증후성인 천식 환자에서 폐 기능을 개선시켰다 (Corren et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365, 1088-1098).
추가로, IL-13은 다수의 다른 알레르기성 및 섬유화 장애에 연루되었다. 예를 들어, IL13에 의해 매개되는 이러한 질환 및/또는 상태는 알레르기성 천식, 비-알레르기성 (내인성) 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 습진, 두드러기, 식품 알레르기, 만성 폐쇄성 폐 질환, 궤양성 결장염, RSV 감염, 포도막염, 경피증 및 골다공증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
인간 환자에게 투여하는데 허용되는 재조합 생물제약 단백질의 경우, 제조 및 정제 방법으로부터 생성되는 잔류 불순물이 최종 생물학적 제품으로부터 제거되는 것이 중요하다. 이들 방법의 성분은 배양 배지 단백질, 이뮤노글로불린 친화성 리간드, 바이러스, 내독소, DNA 및 숙주 세포 단백질을 포함한다. 이들 숙주 세포 불순물은 재조합 DNA 기술로부터 유래된 생물제제에서 방법-관련 불순물/오염물인 방법-특이적 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함한다. HCP는 전형적으로 최종 약물 물질에 소량으로 (의도된 재조합 단백질의 백만분의 몇 또는 밀리그램당 몇 나노그램으로) 존재하지만, HCP는 바람직하지 않고 그의 양은 최소이어야 한다는 것이 인식된다. 예를 들어, 미국 식품 의약품국 (FDA)은 생체내 인간 사용을 위해 의도된 생물제약에 가능한 한 이질 불순물이 없어야 할 것 및 잠재적 오염물/불순물, 예컨대 HCP의 검출 및 정량화를 위한 시험을 요구한다.
세포 파편으로부터 단백질을 정제하는 절차는 처음에는 단백질의 발현 부위에 따라 달라진다. 일부 단백질은 세포로부터 주위 성장 배지 내로 직접 분비되고; 다른 것은 세포내에서 만들어진다. 후자의 단백질의 경우, 정제 방법의 제1 단계는 세포의 용해를 수반하고, 이는 기계적 전단, 삼투 쇼크 또는 효소 처리를 비롯한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 파괴는 세포의 전체 내용물을 균질물 내로 방출시키고, 추가로 작은 크기로 인해 제거하기 어려운 하위세포 단편들도 생산한다. 이들은 일반적으로 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 직접 분비되는 단백질의 경우에도 단백질 생산 실행 도중에 세포 자연사 및 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 동일한 문제가 발생한다.
관심 단백질을 함유하는 용액이 일단 수득되면, 이를 세포에 의해 생산된 다른 단백질로부터 분리하는 것이 상이한 크로마토그래피 기술의 조합을 사용하여 통상적으로 시도된다. 전형적으로, 이들 기술은 단백질의 혼합물을 그의 전하, 소수성 정도 또는 크기를 기초로 분리한다. 각각의 이들 기술마다 여러 상이한 크로마토그래피 수지가 이용가능하고, 이에 따라 수반된 특정한 단백질에 맞게 정제 계획을 정확하게 조정할 수 있다. 각각의 이들 분리 방법의 본질은, 단백질들이 긴 칼럼의 아래쪽 방향으로 상이한 속도로 이동될 수 있어서 이들이 칼럼 아래쪽으로 더 내려감에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성하는 것이거나, 또는 단백질들을 분리 매질에 선택적으로 부착시킬 수 있어서 이후에 이들을 상이한 용매로 차등적으로 용리시키는 것이다. 일부 경우에, 목적하는 단백질은 불순물이 칼럼에 특이적으로 부착하고 관심 단백질이 부착하지 않을 때 불순물로부터 분리되며, 즉 관심 단백질은 "관통" 상태로 존재한다.
교환가능한 반대이온에 대해 명명된 이온-교환 크로마토그래피는 이온화가능한 분자의 정제에 적용가능한 절차이다. 이온화된 분자는 그의 하전된 기와 고체 상 지지 매트릭스에 부착된 반대로 하전된 분자와의 비-특이적 정전기적 상호작용을 기초로 분리되어, 고체 상과 보다 강하게 상호작용하는 이온화된 분자를 지연시킨다. 각 유형의 이온화된 분자의 알짜 전하 및 매트릭스에 대한 친화도는 하전된 기의 수, 각각의 기의 전하 및 하전된 고체 상 매트릭스와의 상호작용에 대해 경쟁하는 분자의 성질에 따라 달라진다. 이들 차이는 이온-교환 크로마토그래피에 의한 다양한 분자 유형의 분해를 유발한다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 전형적인 단백질 정제에서, 예컨대 포유동물 세포 배양에서 숙주 세포로부터 유래된 많은 단백질의 혼합물이 이온-교환 칼럼에 적용된다. 비-결합 분자가 세척 제거된 후에, 조건은 예컨대 pH, 반대 이온 농도 등을 단계- 또는 구배-모드로 변화시켜 고체 상으로부터 비-특이적으로 보유된 또는 지연된 관심 이온화 단백질을 방출시키고 이를 상이한 전하 특징을 갖는 단백질로부터 분리하는 것에 의해 조정된다. 음이온 교환 크로마토그래피는 관심 음이온성 분자가 특정한 분리 방법의 조건 하 및 pH에서 고체 상 매트릭스에 부착된 양으로 하전된 분자와의 상호작용에 대해 음성 반대이온과 경쟁하는 것을 수반한다. 대조적으로, 양이온 교환 크로마토그래피는 관심 양이온성 분자가 특정한 분리 방법의 조건 하 및 pH에서 고체 상 매트릭스에 부착된 음으로 하전된 분자에 대해 양성 반대이온과 경쟁하는 것을 수반한다. 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피 (또한 다중모드 이온 교환 크로마토그래피로 지칭됨)는 동일한 단계에서 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 조합의 사용을 수반한다. 특히, "혼합 모드"는 양이온 교환, 음이온 교환 및 소수성 상호작용 모이어티의 혼합물이 공유 부착되는 고체 상 지지 매트릭스를 지칭한다.
단백질의 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 단백질의 하전된 아미노 또는 카르복실레이트 기와 히드록시아파타이트 상의 반대로 하전된 기와의 비-특이적 상호작용을 수반하며, 여기서 히드록시아파타이트 및 단백질의 알짜 전하는 완충제의 pH에 의해 제어된다. 용리는 이온, 예컨대 Ca2+ 또는 Mg2+와 쌍형성하는 비-특이적 단백질-히드록시아파타이트를 대체시킴으로써 달성된다. 음으로 하전된 단백질 기는 음으로 하전된 화합물, 예컨대 포스페이트에 의해 대체되어, 알짜-음으로 하전된 단백질을 용리시킨다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 분자, 예컨대 단백질을 그의 표면 소수친수성의 차이를 기초로 정제 및 분리하는데 전형적으로 사용된다. 단백질의 소수성 기는 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 소수성 기와 비-특이적으로 상호작용한다. 단백질 표면 소수성 기의 개수 및 성질의 차이는 HIC 칼럼 상의 단백질의 차등 지연 및 그 결과 단백질의 혼합물에서의 단백질의 분리를 유발한다.
정제될 단백질과 고정화된 포획제 사이의 특이적 구조적으로 의존성인 (즉, 공간적으로 상보성인) 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피는 일부 단백질, 예컨대 항체에 대한 표준 정제 옵션이다. 단백질 A는, 예를 들어 Fc 영역을 함유하는 항체와 같은 단백질의 친화성 크로마토그래피를 위한 유용한 흡착제이다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화도 (인간 IgG에 대해 약 10-8M)로 결합하는, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 41kD 세포벽 단백질이다.
재조합 폴리펩티드의 정제는 전형적으로 결합 및 용리 크로마토그래피 (B/E) 또는 관통형 (F/T) 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 이들은 하기에 간략하게 기재된다.
결합 및 용리 크로마토그래피 (B/E): B/E 크로마토그래피 하에서 산물은 통상적으로 크로마토그래피 물질에 대한 동적 결합 능력 (DBC)을 최대화하기 위해 로딩되고, 이어서 세척 및 용리 조건은 용리액에서 최대 산물 순도가 달성되도록 확인된다.
다양한 중간 세척 완충제를 비롯한, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 사용하기 위한 다양한 B/E 방법이 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,127,526 및 6,333,398은 소수성 전해질, 예를 들어 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC) 및 테트라에틸암모늄 클로라이드 (TEAC)를 사용하는 단백질 A 크로마토그래피 동안에, 고정화된 단백질 A 또는 단백질 A 칼럼에 결합된 관심 단백질이 아닌 오염물을 제거하기 위한 중간 세척 단계를 기재한다. 미국 특허 번호 6,870,034는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 사용하기 위한 추가의 방법 및 세척 완충제를 기재한다.
관통형 크로마토그래피 (F/T): F/T 크로마토그래피를 사용하여, 불순물은 크로마토그래피 물질에 강하게 결합하지만 산물은 관통하는 로드 조건이 확인된다. F/T 크로마토그래피는 표준 모노클로날 항체 제제 (MAb)에 대한 고 로드 밀도를 가능하게 한다.
CHO 세포에서 생산된 재조합 항-IL13 MAb 제제 및 특정의 다른 재조합 폴리펩티드에서, 본 발명자들은 총 CHOP ELISA 검정에서 이용가능한 항체보다 많은 양으로 존재하는 단일 CHOP 종으로서 포스포리파제 B-유사 2라는 효소를 확인하였다. 본원에 사용된, "PLB2" 및 "PLBL2" 및 "PLBD2"은 상호교환가능하게 사용되고, 효소 "포스포리파제 B-유사 2" 또는 그의 동의어인 "포스포리파제 B-도메인-유사 2"를 지칭한다. PLBL2에 대한 특정 과학 공개문헌은 [Lakomek, K. et al., BMC Structural Biology 9:56 (2009); Deuschi, et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006)]을 포함한다. PLBL2는 모 MW가 약 66,000인 프리-프로효소로서 합성된다. 제거되는 초기 리더 서열이 존재하고, 잠재적인 6개의 만노스-6-포스페이트 (M-6-P) 기가 번역후 변형 동안에 첨가된다. M-6-P는 M-6-P 수용체를 통해 상기 효소를 리소솜으로 향하게 하는 표적화 변형이다. PLBL2는 6개의 시스테인을 함유하며, 그 중 2개는 유리 술프히드랄을 갖고, 4개는 디술피드 결합을 형성한다. 산성 환경에서, PLBL2는 각각 32,000 및 45,000 MW를 갖는 N- 및 C-말단 단편으로 추가로 클리핑된다. 다른 리소솜 효소와 유사하게, 이 절단은 활성화 단계여서, 활성 부위에 대한 기질의 접근을 가능하게 한다.
효소의 햄스터 형태와 인간 형태 사이에 약 80% PLBL2 아미노산 서열 상동성이 존재한다. 효소 활성은 세포 막을 구성하는 인지질로부터 지방산 쇄를 절단하는 것으로 생각된다. 상이한 기질 절단 특이성을 갖는 다른 포스포리파제가 존재한다. 유사한 효소적 활성이 미생물에 존재하며, 여기서는 종종 병독성 인자이다. 미생물이 유사한 효소적 활성을 가지더라도, 이 활성을 생성하는 단백질은 상이하고, 미생물 PLBL2 효소와 포유동물 PLBL2 효소 사이에 서열 상동성은 낮다. 포스포리파제는 기질 가수분해의 한 산물로서 유리 지방산 (FFA)을 생산한다. 유리 지방산은 그 자체로 잠재적 면역-신호전달 인자이다. 탈수소화는 FFA를 아라카돈산으로 전환시키며, 이는 잠재적으로 에이코사노이드를 수반하는 염증 캐스케이드에 참여한다.
CHO 세포에서 생산된 재조합 항-IL13 MAb 제제 및 특정의 다른 재조합 폴리펩티드에서 단일 HCP (CHOP)로서 PLBL2를 확인하였으므로, 본 발명자들은 정제의 다양한 단계에서 항-IL-13 Mab 제제 (및 다른 재조합 폴리펩티드 산물) 중 PLBL2 수준의 특이적이고 감수성이며 정량적인 결정을 위한 시약, 방법 및 키트를 개발하였다. 이들은 하기 실시예 및 또한 미국 가특허 출원 번호 61/877,503 및 61/991,228에 간략하게 기재된다. 추가로, 후기 임상 및 상업적 용도를 비롯한 인간 치료 용도를 위해 충분한 순도의 MAb (PLBL2의 제거 포함)를 유발하는 항-IL13 MAb (및 다른 재조합 폴리펩티드 산물)의 정제를 위한 대규모의 강건하고 효율적인 방법을 개발하려는 굉장한 도전이 있었다. 본원에 기재된 본 발명은 특정의 상기 기재된 필요성을 충족시키며 다른 이익을 제공한다.
특허 출원 및 공개문헌을 비롯한, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드를 정제하여 정제된 산물에 실질적으로 감소된 수준의 햄스터 PLBL2를 제공하는 개선된 정제 방법의 개발을 기초로 한다. 치료 항체, 예컨대 항-IL13 항체를 비롯한, 본 발명의 방법에 따라 정제된 재조합 폴리펩티드는, 인간 대상체에게 투여될 때 감소된 면역원성을 나타낼 수 있다.
따라서, 한 측면에서, CHO 세포로부터 정제된 항-IL13 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항-IL13 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
또 다른 측면에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법에 의해 CHO 세포로부터 단리 및 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제가 제공된다. 특정 실시양태에서, 정제된 제제는 항-IL13 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우(PHENYL SEPHAROSE™ 6 Fast Flow) (고 치환) 수지를 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 관통물은 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물은 0.5 OD 내지 1.5 OD 사이에서 수집된다. 특정 실시양태에서, 관통물은 최대 8 칼럼 부피로 수집된다. 특정 실시양태에서, 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
또 다른 측면에서, CHO 세포로부터 단리된 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체 제제는 제1 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제3 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법에 의해 정제되어 정제된 제제를 생산한다. 특정 실시양태에서, 정제된 제제는 항-IL13 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어(MABSELECT SURE)™ 수지를 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스™ 패스트 플로우(Q SEPHAROSE™ Fast Flow)를 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스™ 패스트 플로우 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
또 다른 측면에서, CHO 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함하는 정제된 제제를 제공하는, 상기 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 성장 인자, 시토카인, 항체, 항체 단편 및 이뮤노어드헤신으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1 또는 IgG2 또는 IgG3 또는 IgG4이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG2이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG3이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG4이다. 특정 실시양태에서, 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 포함한다.
상기 정제 방법의 특정 실시양태에서, 정제된 항체는 항-IL13이다. 특정 실시양태에서, 항체는 레브리키주맙이다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 관통물은 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물은 0.5 OD 내지 1.5 OD 사이에서 수집된다. 특정 실시양태에서, 관통물은 최대 8 칼럼 부피로 수집된다. 특정 실시양태에서, 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제3 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지를 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스™ 패스트 플로우를 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스™ 패스트 플로우 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
상기 정제 방법의 특정 실시양태에서, 정제된 항체는 항-A베타이다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 크레네주맙이다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨 (pH 4.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨, 240 mM 황산나트륨 (pH 4.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨, 240 mM 황산나트륨 (pH 5.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 로드 밀도는 300 g/L이다. 특정 실시양태에서, 로드 밀도는 100 g/L이다. 특정 실시양태에서, 관통물은 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물은 0.5 OD에 시작하여 수집되고, 수집은 10 칼럼 부피에 대해 계속된다. 특정 실시양태에서, 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 혼합 모드 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 제2 혼합 모드 크로마토그래피 단계 및 제3 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지를 포함하고, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 캅토™ 어드히어(CAPTO™ Adhere)를 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 캅토™ 어드히어 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
상기 정제 방법의 추가 측면에서, 정제된 항체는 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-IL17 A/F이다. 일부 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 관통물은 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물은 0.5 OD에서 시작하여 10 칼럼 부피로 수집된다. 특정 실시양태에서, 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계 전에 제1 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 및 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지를 포함하고, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 포로스(POROS) 50 HS 수지를 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 포로스 50 HS 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법에 의해 CHO 세포로부터 정제된 항-A베타 모노클로날 항체 제제가 제공된다. 특정 실시양태에서, 정제된 제제는 항-A베타 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨 (pH 4.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨, 240 mM 황산나트륨 (pH 4.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 150 mM 아세트산나트륨, 240 mM 황산나트륨 (pH 5.0)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 로드 밀도는 300 g/L이다. 특정 실시양태에서, 로드 밀도는 100 g/L이다. 특정 실시양태에서, 관통물은 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물은 0.5 OD 내지 10 칼럼 부피로 수집된다. 특정 실시양태에서, 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 혼합 모드 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
한 측면에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법에 의해 CHO 세포로부터 단리 및 정제된 항-IL17 A/F 모노클로날 항체 제제가 제공된다. 특정 실시양태에서, 정제된 제제는 항-IL17 A/F 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIC 단계는 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제는 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 관통물은 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물은 0.5 OD 내지 10 칼럼 부피로 수집된다. 특정 실시양태에서, 방법은 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 특정 실시양태에서, 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 면역검정은 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 질량 분광측정법 검정은 LC-MS/MS이다.
또 다른 측면에서, CHO 세포로부터 정제된 항-A베타 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항-A베타 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 크레네주맙이다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-A베타 항체는 서열 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, CHO 세포로부터 정제된 항-IL17 A/F 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항-IL17 A/F 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 항-IL17 A/F 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함하며, 여기서 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만, 또는 15 ng/mg 미만, 또는 10 ng/mg 미만, 또는 8 ng/mg 미만, 또는 5 ng/mg 미만, 또는 3 ng/mg 미만, 또는 2 ng/mg 미만, 또는 1 ng/mg 미만, 또는 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL17 A/F 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 측면에서, CHO 세포로부터 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 및 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함하는 치료 조성물을 투여하는 것을 포함하는, IL-13-매개 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 20 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 15 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 10 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 8 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 3 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 2 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 미만이다. 특정 실시양태에서, 햄스터 PLBL2의 양은 0.5 ng/mg 내지 20 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 15 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 10 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 8 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 5 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 3 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 2 ng/mg, 또는 0.5 ng/mg 내지 1 ng/mg, 또는 검정 정량 한계 (LOQ) 내지 1 ng/mg이다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 중쇄 CDR인 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및 3개의 경쇄 CDR인 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 조성물은 4주마다 1회 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 치료 조성물은 8주마다 1회 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 치료 조성물은 12주마다 1회 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 1개월 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 3개월 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 6개월 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 9개월 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 12개월 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 18개월 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 적어도 2년 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자는 2년 초과 동안 4주마다 1회 치료된다. 특정 실시양태에서, IL-13-매개 장애는 천식이다. 특정 실시양태에서, IL-13-매개 장애는 특발성 폐 섬유증이다. 특정 실시양태에서, IL-13-매개 장애는 아토피성 피부염이다. 특정 실시양태에서, IL-13-매개 장애는 알레르기성 천식, 비-알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 습진, 두드러기, 식품 알레르기, 만성 폐쇄성 폐 질환, 궤양성 결장염, RSV 감염, 포도막염, 경피증 및 골다공증으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 상기에 기재된 임의의 방법에 따른 환자에 대한 치료 조성물의 투여는 참조 조성물의 투여와 비교하여 햄스터 PLBL2에 대해 덜 면역원성이며, 여기서 참조 조성물은 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포로부터 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 및 30 ng/mg 초과의 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 참조 조성물 중 햄스터 PLBL2의 양은 50 ng/mg 초과이다. 특정 실시양태에서, 참조 조성물 중 햄스터 PLBL2의 양은 100 ng/mg 초과이다. 특정 실시양태에서, 참조 조성물 중 햄스터 PLBL2의 양은 200 ng/mg 초과이다. 특정 실시양태에서, 참조 조성물 중 햄스터 PLBL2의 양은 300 ng/mg 초과이다. 특정 실시양태에서, 참조 조성물 중 햄스터 PLBL2의 양은 30 ng/mg 내지 300 ng/mg, 또는 30 ng/mg 내지 200 ng/mg, 또는 30 ng/mg 내지 100 ng/mg, 또는 30 ng/mg 내지 50 ng/mg이다.
도 1은 실시예 2에 기재된 바와 같이, 항-IL13 MAb의 카프릴산-처리 단백질 A 풀 중 총 CHOP 수준을 보여준다. (A) pH 4.5에서의 단백질 A 풀의 카프릴산 침전; (B) pH 5.0에서의 단백질 A 풀의 카프릴산 침전. CHOP 수준 (ng/mg)은 수직축을 따라 나타내어지고; 카프릴산의 백분율은 수평축을 따라 보여지며, 각각의 막대는 2배 연속 희석으로부터의 값을 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 기재된 바와 같이, 단백질 A 크로마토그래피에 이어서 포로스® 50HS 상의 양이온 교환 크로마토그래피에 따른 첨가제-처리 HCCF 항-IL13 MAb 중 총 CHOP 수준을 보여준다. 보정된 CHOP 수준 (ng/ml)은 수직축 상에 보여지고; 첨가제 (대조군, 0.6M 구아니딘 또는 0.6M 아르기닌)는 수평축 상에 나타내어지며, 각각의 막대는 나타낸 바와 같은 2배 연속 희석으로부터의 값을 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 기재된 바와 같이, 달라지는 염 및 pH 조건 하에서 상이한 HIC 수지에 적용된 항-IL13 MAb의 UFDF 풀 중 총 CHOP 수준을 보여준다. (A) 옥틸-세파로스® 패스트 플로우(OCTYL-SEPHAROSE® Fast Flow) 수지; (B) 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (저 치환) 수지; (C) 부틸-세파로스® 4 패스트 플로우(BUTYL-SEPHAROSE® 4 Fast Flow) 수지; (D) 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지; 최고 희석 CHOP (ppm)은 수직축 상에 보여지고, 황산나트륨 농도는 수평축 상에 보여지며; pH (5.5, 6.0, 7.0 또는 8.0)는 범례에 의해 나타내어진다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 통상의 기술자에게 본 출원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다.
특정 정의
본 명세서를 해석하고자 하는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우에는 언제라도, 단수형으로 사용된 용어는 복수형을 또한 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 하기 열거된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 상충되는 경우에는, 하기 기재된 정의가 우선한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "단백질" 또는 "항체"에 대한 언급은 각각 복수의 단백질 또는 항체를 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물 등을 포함한다.
용어 "검출하는"은 표적 분자의 정성적 측정 및 정량적 측정 둘 다를 포함하기 위해 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 검출은 단순히 샘플 내 표적 분자의 존재를 확인하는 것뿐만 아니라 표적 분자가 샘플에 검출가능한 수준으로 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다.
"샘플"은 보다 많은 양의 물질의 적은 부분을 지칭한다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법에 따른 시험은 샘플에 대해 수행된다. 샘플은 전형적으로, 예를 들어 배양된 숙주 세포로부터 수득된 재조합 폴리펩티드 제제로부터 수득된다. 샘플은, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 정제 방법 중 특정 단계에서 방법 중 풀로부터 또는 최종 정제된 산물로부터 수거된 세포 배양 유체로부터 수득될 수 있다.
본원에 기재된 용어 "산물"은 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 물질, 예를 들어 폴리펩티드이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의에는, 예를 들어 1종 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항체를 포괄한다.
"정제된" 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)는 폴리펩티드가 그의 자연 환경에서 존재하는 경우 및/또는 실험실 조건 하에서 최초로 합성 및/또는 증폭된 경우보다 더 순수한 형태로 존재하도록 순도가 증가한 것을 의미한다. 순도는 상대적 용어이고, 반드시 절대적 순도를 의미하지는 않는다.
용어 "에피토프 태그부착된"은 본원에 사용되는 경우에 "태그 폴리펩티드"에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공할 만큼 충분한 잔기를 갖지만, 그와 융합될 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 아주 고유한 것이 바람직하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 통상적으로는 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (특정 경우에, 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.
본원의 목적상 "활성인" 또는 "활성"은 관심 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 폴리펩티드의 형태(들)을 지칭하며, 여기서 "생물학적" 활성은 폴리펩티드가 소유한 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유발하는 능력 이외에 폴리펩티드에 의해 야기되는 생물학적 기능 (억제 또는 자극)을 지칭하고, "면역학적" 활성은 폴리펩티드가 소유한 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유발하는 능력을 지칭한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "효능제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는 구체적으로 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체 등을 포함한다. 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 폴리펩티드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키고, 폴리펩티드와 통상적으로 연관된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적에 "결합하는" 폴리펩티드는 폴리펩티드가 항원을 함유하는 샘플, 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 있어서 검정 시약, 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차반응하지 않는 것이다.
표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합과 관련해서, 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에의 "특이적 결합" 또는 이에 "특이적으로 결합" 또는 이에 대해 "특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적과의 경쟁에 의해 결정할 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2종의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조물을 포괄한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 상호교환가능하게 사용된다.
항체는 모두 이뮤노글로불린 폴드를 기초로 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 "중"쇄 및 2개의 "경"쇄를 가져 기능적 항체를 형성한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 그 자체는 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 반면에 C 영역은 구조 지지체를 제공하며 면역 이펙터와의 비-항원-특이적 상호작용에서 기능한다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적 특징에 의해 결정된다. 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신에, V 영역은 길이가 각각 9-12개 아미노산이며 가변성이 극도로 높아 "초가변 영역"이라 불리는 보다 짧은 영역에 의해 분리된, 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 상대적으로 불변성인 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형상을 채택하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 함께 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 수반되지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
각각의 V 영역은 전형적으로 3개의 상보성 결정 영역 ("CDR", 이들은 각각 "초가변 루프"를 함유함) 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 따라서, 특정한 목적하는 항원에 실질적인 친화도로 결합하는데 요구되는 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 전형적으로 3개의 CDR, 및 CDR을 적절한 입체형태로 유지 및 존재하게 하는 이들 사이에 배치된 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 전형적 4쇄 항체는 협력하여 VH 및 VL 도메인에 의해 정의되는 항원 결합 부위를 갖는다. 특정 항체, 예컨대 낙타 및 상어 항체는 경쇄가 결여되어 있고, 단지 중쇄에 의해 형성된 결합 부위에 의존한다. 결합 부위가 VH와 VL 사이의 협력없이 중쇄 또는 경쇄만으로 형성된 단일 도메인 조작된 이뮤노글로불린을 제조할 수 있다.
용어 "초가변 영역"은 본원에 사용되는 경우에 항원 결합을 담당하는 항체의 특정 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 상기에 논의된 바와 같이 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL에서는 대략적으로 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서는 대략적으로 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL에서는 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH에서는 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3)) (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 비-scFv, 또는 탠덤 (디,트리)-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않음); 및 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 포함한다.
항체의 파파인 소화는, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 잔류 "Fc" 단편을 생산하며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 긴밀, 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 형상에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역 3개만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화도로도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 지니는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 분명하게 상이한 2가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM인 5가지 주요 부류의 무손상 항체가 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 단편의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH - VL) 내에 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 단위가 다중에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼관능성 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용할 필요가 없다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하는 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유익하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 방법에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 반면에 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이고, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기에 언급된 바와 같은 FR 치환(들)을 제외하고, 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 상세내용에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원의 목적상, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우에 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 부분으로 간주하지 않으면서, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 내의 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공중 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 달라지지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우에, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭으로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "항-IL-13 항체" 및 "IL-13에 결합하는 항체"는 항체가 IL-13을 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 IL-13에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비관련, 비-IL-13 단백질에 대한 항-IL-13 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의한 측정 시, IL-13에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, IL-13에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-IL-13 항체는 상이한 종으로부터의 IL-13 사이에서 보존된 IL-13의 에피토프에 결합한다.
"IL-13 매개 장애"는 체내 국부적 및/또는 전신적 IL-13의 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는, 과량의 IL-13 수준 또는 활성과 연관된 장애를 의미한다. IL-13 매개 장애의 예는 암 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 교모세포종), 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 섬유증, 염증성 장 질환, 크론병, 폐 염증성 장애 (폐 섬유증, 예컨대 IPF 포함), COPD 및 간 섬유증을 포함한다.
용어 "호흡기 장애"는 천식 (예를 들어, 알레르기성 및 비-알레르기성 천식 (예를 들어, 예컨대 보다 어린 소아에서 예컨대 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 의한 감염으로 인한 것)); 기관지염 (예를 들어, 만성 기관지염); 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) (예를 들어, 기종 (예를 들어, 담배-유발 기종)); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과량의 점액 생성을 수반하는 상태, 예를 들어 낭성 섬유증, 폐 섬유증 및 알레르기성 비염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 기도 염증, 과다 기도 분비 및 기도 폐쇄를 특징으로 할 수 있는 질환의 예는 천식, 만성 기관지염, 기관지확장증 및 낭성 섬유증을 포함한다.
용어 "치료제"는 질환을 치료하는데 사용되는 임의의 작용제를 지칭한다. 치료제는, 예를 들어 단백질에 결합할 수 있는 폴리펩티드(들) (예를 들어, 항체, 이뮤노어드헤신 또는 펩티바디), 압타머 또는 소분자, 또는 표적을 코딩하는 핵산 분자에 결합할 수 있는 핵산 분자 (즉, siRNA) 등일 수 있다.
"네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 같은 이종 분자에 접합되지 않은 항체 (본원에 정의된 바와 같음)이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터, 뿐만 아니라 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정 시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
크로마토그래피와 관련하여 본원에 사용된 용어 "순차적"은 제1 크로마토그래피에 이어서 제2 크로마토그래피를 갖는 것을 지칭한다. 추가의 단계는 제1 크로마토그래피와 제2 크로마토그래피 사이에 포함될 수 있다.
크로마토그래피와 관련하여 본원에 사용된 용어 "연속적"은 제1 크로마토그래피 물질 및 제2 크로마토그래피 물질이 직접 연결되거나 또는 2종의 크로마토그래피 물질 사이의 연속적 유동을 허용하는 일부 다른 메카니즘을 갖는 것을 지칭한다.
"불순물" 및 "오염물"은 목적하는 폴리펩티드 산물과 상이한 물질을 지칭한다. 불순물 및 오염물은 비제한적으로, 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP (단일 CHOP 종 포함); 침출된 단백질 A; 핵산; 목적하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등을 포함한다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로, 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.
용어 "차이니즈 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"는 차이니즈 햄스터 난소 ("CHO") 세포 배양물로부터 유래된 숙주 세포 단백질 ("HCP")의 혼합물을 지칭하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. HCP 또는 CHOP는 일반적으로 세포 배양 배지 또는 용해물 (예를 들어, CHO 세포에서 발현된 관심 단백질, 예컨대 항체 또는 이뮤노어드헤신을 포함하는 수거된 세포 배양 유체 ("HCCF"))에 불순물로서 존재한다. 관심 단백질을 포함하는 혼합물에 존재하는 CHOP의 양은 관심 단백질의 순도의 척도이다. HCP 또는 CHOP는 숙주 세포, 예컨대 CHO 숙주 세포에 의해 발현된 관심 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전형적으로, 단백질 혼합물 중 CHOP의 양은 혼합물 중 관심 단백질의 양에 대한 백만분율로 표현된다. 숙주 세포가 또 다른 포유동물 세포 유형, 이. 콜라이, 효모, 곤충 세포 또는 식물 세포인 경우에, HCP는 숙주 세포의 용해물에서 발견되는 표적 단백질 이외의 다른 단백질을 지칭하는 것으로 이해된다.
용어 "백만분율" 또는 "ppm"은 본 발명의 방법에 의해 정제된 관심 단백질의 순도의 척도를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 단위 ppm은 밀리그램/밀리리터의 관심 단백질당 나노그램/밀리리터의 HCP 또는 CHOP의 양 (즉, CHOP ppm = (CHOP ng/ml)/(관심 단백질 mg/ml), 여기서 단백질은 용액으로 존재함)을 지칭한다. 단백질이 건조 (예컨대, 동결건조)된 경우에, ppm은 (CHOP ng)/(관심 단백질 mg)을 지칭한다. 불순물은 또한 본원에서 ppm과 상호교환가능하게 사용되는 "ng/mg"으로 표현될 수 있다.
폴리펩티드 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 "정제"하는 것은, 상기 조성물로부터 적어도 1종의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물 중 폴리펩티드의 순도를 증가시키는 것을 의미한다.
"정제 단계"는 "균질" 조성물을 생성하는 전체 정제 방법의 부분일 수 있으며, 이는 본원에서 관심 단백질을 포함하는 조성물 중 100ppm (100 ng/mg) 미만, 또는 90ppm (90 ng/mg) 미만, 또는 80ppm (80 ng/mg) 미만, 또는 70ppm (70 ng/mg) 미만, 또는 60ppm (60 ng/mg) 미만, 또는 50ppm (50 ng/mg) 미만, 또는 40ppm (40 ng/mg) 미만, 또는 30ppm (30 ng/mg) 미만, 또는 20ppm (20 ng/mg) 미만, 또는 10ppm (10 ng/mg) 미만, 또는 5ppm (5 ng/mg) 미만, 또는 3ppm (3 ng/mg) 미만, 또는 1 ppm (1 ng/mg) 미만의 HCP를 포함하는 조성물을 지칭하는 것으로 사용된다. 특정 실시양태에서, HCP는 단일 HCP 종이다. 한 실시양태에서, 단일 HCP 종은 햄스터 PLBL2이다.
본원에서 정제될 "조성물"은 관심 폴리펩티드 및 1종 이상의 불순물 또는 오염물을 포함한다. 조성물은 "부분적으로 정제"될 수 있거나 (즉, 1개 이상의 정제 단계에 적용될 수 있거나), 또는 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다 (예를 들어, 조성물은 수거된 세포 배양 유체를 포함할 수 있다).
용어 "단백질 A" 및 "ProA"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성에 의해 (예를 들어, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해) 생산된 단백질 A, 및 CH2/CH3 영역, 예컨대 Fc 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 단백질 A는 다양한 공급처로부터 상업적으로 구입될 수 있다. 단백질 A는 일반적으로 고체 상 지지체 물질 상에 고정화된다. 용어 "ProA"는 또한 단백질 A가 공유 부착되는 크로마토그래피 고체 지지 매트릭스를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 칼럼을 지칭한다.
용어 "크로마토그래피"는 혼합물 내의 개별 용질들이 이동 상의 영향 하에서 정지 매질을 통과하여 이동하는 속도에서의 차이의 결과로서, 또는 결합 및 용리 방법에서, 혼합물 내의 관심 용질이 혼합물 내의 다른 용질로부터 분리되는 방법을 지칭한다.
용어 "친화성 크로마토그래피" 및 "단백질 친화성 크로마토그래피"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 관심 단백질 또는 관심 항체가 생체특이적 리간드에 가역적으로 및 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기술을 지칭한다. 전형적으로, 생체특이적 리간드는 크로마토그래피 고체 상 물질에 공유 부착되고, 용액이 크로마토그래피 고체 상 물질에 접촉함에 따라 용액 내의 관심 단백질에 접근가능하다. 관심 단백질 (예를 들어, 항체, 효소 또는 수용체 단백질)은 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드 (예를 들어, 항원, 기질, 보조인자 또는 호르몬)에 대한 그의 특이적 결합 친화도를 유지하지만, 혼합물 내의 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 인지가능하게 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정화된 리간드에 대한 관심 단백질의 결합은, 관심 단백질이 고체 상 물질 상의 고정화된 리간드에 특이적으로 결합된 채로 남아있는 동안 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매질을 통과하도록 한다. 이어서, 특이적으로 결합된 관심 단백질은 저 pH, 고 pH, 고 염, 경쟁 리간드 등을 사용하여 고정화된 리간드로부터 활성 형태로 제거하고, 앞서 칼럼을 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없이, 용리 완충제를 사용하여 크로마토그래피 칼럼을 통과시킨다. 임의의 성분이 그의 각각의 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다.
용어 "비-친화성 크로마토그래피" 및 "비-친화도 정제"는 친화성 크로마토그래피가 이용되지 않는 정제 방법을 지칭한다. 비-친화성 크로마토그래피는 관심 분자 (예컨대 단백질, 예를 들어 항체)와 고체 상 매트릭스 사이의 비-특이적 상호작용에 의존하는 크로마토그래피 기술을 포함한다.
크로마토그래피와 관련하여, 예컨대 관심 분자와 고체 상 매트릭스에 결합된 리간드 사이의 상호작용을 기재하기 위해 본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은, 결합 부위에서 정전기력, 수소 결합, 소수성 힘 및/또는 반 데르 발스 힘으로 커플링된 결합 부위에서 단백질 및 리간드 구조의 공간적 상보성의 조합 효과를 통한 리간드에 대한 관심 단백질의 일반적으로 가역적인 결합을 의미한다. 공간적 상보성이 보다 클수록 및 결합 부위에서 다른 힘이 보다 강할수록, 단백질의 그의 각각의 리간드에 대한 결합 특이성이 보다 커질 것이다. 특이적 결합의 비-제한적인 예는 항체-항원 결합, 효소-기질 결합, 효소-보조인자 결합, 금속 이온 킬레이트화, DNA 결합 단백질-DNA 결합, 조절 단백질-단백질 상호작용 등을 포함한다. 전형적으로, 친화성 크로마토그래피에서, 특이적 결합은 유리 용액 중 약 10-4 내지 10-8 M의 친화도로 발생한다.
크로마토그래피와 관련하여, 예컨대 관심 분자와 고체 상 매트릭스에 결합된 리간드 또는 다른 화합물 사이의 상호작용을 기재하기 위해 본원에 사용된 용어 "비-특이적 결합"은, 상호작용 부위에서 비-구조적 힘의 효과를 증진시키는 구조적 상보성이 결여된 정전기력, 수소 결합, 소수성 힘 및/또는 반 데르 발스 힘을 통한 고체 상 매트릭스 상의 리간드 또는 화합물에 대한 관심 단백질의 결합을 의미한다. 비-특이적 상호작용의 예는 정전기력, 소수성 및 반 데르 발스 힘, 및 수소 결합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"염"은 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물이다. 예시적인 염은 아세테이트 (예를 들어 아세트산나트륨), 시트레이트 (예를 들어 시트르산나트륨), 클로라이드 (예를 들어 염화나트륨), 술페이트 (예를 들어 황산나트륨) 또는 칼륨 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "용매"는 1종 이상의 다른 물질을 용해 또는 분산시켜 용액을 제공할 수 있는 액체 물질을 지칭한다. 용매는 수성 및 유기 용매를 포함하며, 여기서 특정 유기 용매는 비-극성 용매, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 2,2-티오디글리콜을 포함한다.
용어 "세제"는 이온성 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일- 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨), 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN) 20®) 또는 폴리소르베이트 80 (트윈 80®)을 지칭한다.
"중합체"는 본원에서 2종 이상의 단량체의 공유 연결에 의해 형성된 분자이며, 여기서 단량체는 아미노산 잔기가 아니다. 중합체의 예는 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 공중합체 (예를 들어 플루로닉스(PLURONICS)™, PF68 등), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예를 들어 PEG 400 및 PEG 8000을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 혼합물 내의 관심 용질 (예컨대 단백질)이 혼합물 내의 용질 불순물 또는 오염물보다 더 많이 또는 더 적게, 하전된 화합물과 비-특이적으로 상호작용하도록, 상기 관심 용질이 고체 상 이온 교환 물질에 연결된 (예컨대 공유 부착에 의해) 하전된 화합물과 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 혼합물 내의 오염성 용질은 관심 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 용리되거나 또는 관심 용질에 비해 수지에 결합되거나 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.
어구 "이온 교환 물질"은 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 하전된 (즉, 음이온 교환 수지) 고체 상을 지칭한다. 1종 이상의 하전된 리간드를, 예를 들어 공유 연결에 의해 고체 상에 부착시킴으로써 전하를 제공할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 전하는 고체 상의 고유의 특성일 수 있다 (예를 들어, 실리카의 경우에서와 같이, 이는 전체 음전하를 갖는다).
"고체 상"이란 1종 이상의 하전된 리간드가 부착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 고체 상은 정제 칼럼, 별개 입자의 불연속 상, 막 또는 필터 등일 수 있다. 고체 상을 형성하는 물질의 예는 폴리사카라이드 (예컨대 아가로스 및 셀룰로스); 및 다른 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 실리카 (예를 들어 제어형 세공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상기의 임의의 유도체를 포함한다.
"양이온 교환 수지"는, 음으로 하전되고 고체 상 위로 또는 고체 상을 통해 통과하는 수용액 내의 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상을 지칭한다. 고체 상에 부착되어 양이온 교환 수지를 형성하는 음으로 하전된 리간드는, 예를 들어 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 수지는 카르복시-메틸-셀룰로스, 아가로스 상에 고정화된 술포프로필 (SP) (예를 들어, SP-세파로스 패스트 플로우 (또는 SP-세파로스 하이 퍼포먼스(SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE))), 및 아가로스 상에 고정화된 술포닐 (예를 들어, S-세파로스 패스트 플로우), 및 포로스®HS를 포함한다.
"혼합 모드 이온 교환 수지"는 양이온성, 음이온성 및 소수성 모이어티로 공유 변형된 고체 상을 지칭한다. 혼합 모드 이온 교환은 또한 "다중모드 이온 교환"으로 지칭된다. 상업적으로 입수가능한 혼합 모드 이온 교환 수지는, 예를 들어 실리카 겔 고체 상 지지 매트릭스에 부착된 약한 양이온 교환 기, 저 농도의 음이온 교환 기 및 소수성 리간드를 함유하는 베이커본드 ABX(BAKERBOND ABX)로 입수가능하다. 추가의 예시적 혼합 모드 이온 교환 수지는 캅토™ 어드히어 수지, QMA 수지, 캅토™ MMC 수지, MEP 하이퍼셀(HyperCel) 수지, HEA 하이퍼셀 수지, PPA 하이퍼셀 수지 또는 크로마소르브(ChromaSorb) 막 또는 사토바인드(Sartobind) STIC를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 캅토™ 어드히어 수지이다.
용어 "음이온 교환 수지"는 양으로 하전된, 예를 들어 1종 이상의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 4급 아미노기가 부착된 고체 상을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, QAE 세파덱스(SEPHADEX), 및 패스트 Q 세파로스™ 및 Q 세파로스™ 패스트 플로우를 포함한다.
"완충제"는 짝산-짝염기 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 내성이 있는 용액이다. 예를 들어, 완충제의 목적하는 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충제가 문헌 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기재되어 있다. 특정 경우에, 완충제의 pH는 약 2 내지 약 9, 대안적으로 약 3 내지 약 8, 대안적으로 약 4 내지 약 7, 대안적으로 약 5 내지 약 7의 범위이다. 이러한 범위에서 pH를 제어할 완충제의 비-제한적인 예는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스(Tris), HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합이 포함된다.
용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피" 또는 "HIC"는 소수친수성을 기초로 분자를 분리하는 크로마토그래피 방법을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. HIC에 사용될 수 있는 예시적인 수지는 페닐-, 부틸-, 옥틸-세파로스, 부틸-세파로스® 4 패스트 플로우, 페닐 세파로스™ 하이 퍼포먼스, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (저 치환) 및 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전형적으로, 고 염 완충제 중 샘플 분자가 HIC 칼럼 상에 로딩된다. 완충제 중 염은 물 분자와 상호작용하여 용액 중 분자의 용매화를 감소시키며, 그에 의해 샘플 분자 내 소수성 영역이 노출되어 결과적으로 HIC 칼럼에 의해 흡착된다. 분자가 보다 소수성일수록, 결합을 촉진하는데 필요한 염이 보다 적다. 전형적으로, 감소하는 염 구배를 사용하여 칼럼으로부터 샘플을 용리시킨다. 이온 강도가 감소함에 따라, 분자의 친수성 영역의 노출은 증가하고, 분자는 소수친수성을 증가시키는 순서로 칼럼으로부터 용리된다. 샘플 용리는 또한 용리 완충제에 온화한 유기 개질제 또는 세제를 첨가하여 달성될 수 있다.
"로딩 완충제"는 관심 폴리펩티드 분자 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 조성물을 이온 교환 수지 상에 로딩하는데 사용되는 것이다. 로딩 완충제는 관심 폴리펩티드 분자 (및 일반적으로 1종 이상의 불순물)가 이온 교환 수지에 결합하도록 하거나 또는 관심 단백질이 칼럼을 관통하는 한편 불순물은 수지에 결합하도록 하는 전도도 및/또는 pH를 갖는다.
"중간 완충제"는 관심 폴리펩티드 분자의 용리 전에 이온 교환 수지로부터 1종 이상의 불순물을 용리시키기 위해 사용된다. 중간 완충제의 전도도 및/또는 pH는 1종 이상의 불순물이 이온 교환 수지로부터 용리되지만 유의한 양의 관심 폴리펩티드는 그렇지 않도록 하는 것이다.
용어 "세척 완충제"는 본원에 사용되는 경우에 관심 폴리펩티드 분자를 용리시키기 전에 이온 교환 수지를 세척 또는 재-평형화시키는데 사용된 완충제를 지칭한다. 특정 경우에, 편의상, 세척 완충제 및 로딩 완충제는 동일한 것일 수 있지만, 이것이 요구되는 것은 아니다.
"용리 완충제"는 관심 폴리펩티드를 고체 상으로부터 용리시키는데 사용된다. 용리 완충제의 전도도 및/또는 pH는 관심 폴리펩티드가 이온 교환 수지로부터 용리되도록 하는 것이다.
"재생 완충제"는 이온 교환 수지가 재사용될 수 있도록 이온 교환 수지를 재생시키는데 사용될 수 있다. 재생 완충제는 실질적으로 모든 불순물 및 관심 폴리펩티드를 이온 교환 수지로부터 제거하는데 요구되는 전도도 및/또는 pH를 갖는다.
용어 "전도도"는 2개의 전극 사이에 전류를 전도시키는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액 내에서는, 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온 양을 증가시키면, 용액은 보다 높은 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 측정 단위는 센티미터당 밀리지멘스(milliSeimens) (mS/cm)이고, 예를 들어 오리온(Orion)에 의해 시판되는 전도도 측정기를 사용하여 측정될 수 있다. 용액의 전도도는 용액 중 이온의 농도를 변화시켜 변경될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 전도도를 달성하기 위해 용액 중 완충제의 농도 및/또는 염 (예를 들어, NaCl 또는 KCl)의 농도를 변경시킬 수 있다.
폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하와 균형을 이루는 pH를 지칭한다. pI는 폴리펩티드의 부착된 탄수화물의 아미노산 잔기 또는 시알산 잔기의 알짜 전하로부터 계산될 수 있거나 또는 등전 포커싱에 의해 결정될 수 있다.
분자를 이온 교환 물질에 "결합"시킨다는 것은, 적절한 조건 (pH/전도도) 하에 분자를 이온 교환 물질에 노출시켜, 분자와 이온 교환 물질의 하전기 또는 하전기들 사이의 이온 상호작용에 의해 상기 분자가 가역적으로 이온 교환 물질 중에 또는 그 상에 고정화될 수 있도록 하는 것을 의미한다.
이온 교환 물질을 "세척"한다는 것은, 적절한 완충제가 이온 교환 물질을 통해 또는 이온 교환 물질 위로 통과하는 것을 의미한다.
이온 교환 물질로부터 분자 (예를 들어 폴리펩티드 또는 불순물)를 "용리시키는 것"은, 완충제가 이온 교환 물질 상의 하전된 부위에 대해 분자와 경쟁하도록 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충제의 이온 강도를 변경함으로써 이온 교환 물질로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다.
"한외여과"는 액체가 유체정역학적 압력에 의해 반투과성 막을 통과하는 막 여과의 형태이다. 현탁된 고체 및 고분자량의 용질은 보유되는 반면에, 물 및 저분자량 용질은 막을 통과한다. 일부 예에서, 한외여과 막은 1 내지 100 nm의 범위의 세공 크기를 갖는다. 용어 "한외여과 막" 및 "한외여과 필터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"투석여과"는 염 또는 다른 미세용질을 용액으로부터 제거하기 위해 한외여과 막을 혼입시키는 방법이다. 소분자는 용액으로부터 분리되지만, 보다 더 큰 분자는 보유물에 보유된다. 방법은 선택적으로 투과성 (다공성) 막 필터를 이용하여 용액 및 현탁액의 성분을 그의 분자 크기를 기초로 분리한다.
본원에 사용된 "여과물"은 여과 막을 통과하는 샘플의 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 "보유물"은 여과 막에 의해 실질적으로 보유되는 샘플의 부분을 지칭한다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료될 개체의 자연적 과정을 변경시키기 위한 시도로의 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 방지하는 것, 증상을 완화시키는 것, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과를 감소시키는 것, 전이를 방지하는 것, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태를 개선 또는 경감시키는 것, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 해당 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시된 변화를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
항-IL13 항체
일부 실시양태에서, 단리 및 정제된, IL-13에 결합하는 항체가 제공된다. 예시적인 항-IL13 항체는 공지되어 있고, 예를 들어 레브리키주맙, IMA-026, IMA-638 (또한 안루킨주맙으로 지칭됨, INN 번호 910649-32-0; QAX-576), 트랄로키누맙 (또한 CAT-354로 지칭됨, CAS 번호 1044515-88-9); AER-001, ABT-308 (또한 인간화 13C5.5 항체로 지칭됨)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 항-IL13 항체 및 IL13의 다른 억제제의 예는, 예를 들어 WO 2005/062967, WO2008/086395, WO2006/085938, US 7,615,213, US 7,501,121, WO2007/036745, WO2010/073119, WO2007/045477에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 인간화 IgG4 항체이다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 레브리키주맙이다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 중쇄 CDR인 CDR-H1 (서열 1), CDR-H2 (서열 2) 및 CDR-H3 (서열 3)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 경쇄 CDR인 CDR-L1 (서열 4), CDR-L2 (서열 5) 및 CDR-L3 (서열 6)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR인 CDR-H1 (서열 1), CDR-H2 (서열 2), CDR-H3 (서열 3), CDR-L1 (서열 4), CDR-L2 (서열 5) 및 CDR-L3 (서열 6)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7 및 8로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역 VH를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 7 및 8로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역 VH 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10 또는 서열 11 또는 서열 12 또는 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-IL13 항체는 서열 10, 서열 11, 서열 12 및 서열 13으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-IL-13 항체는 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-IL-13 항체는 인간 IL-13에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 8에서 치환, 변경, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-IL13 항체는 서열 8의 VH 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-IL-13 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-IL-13 항체는 IL-13에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 9에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-IL-13 항체는 서열 9의 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-IL-13 항체는 서열 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 영역 및 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 영역을 포함한다.
하기 표는 레브리키주맙의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 영역의 아미노산 서열을 VH, VL, 중쇄 서열 및 경쇄 서열과 함께 제시한다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, VH 및 중쇄는 N-말단 글루타민을 포함할 수 있고, 중쇄는 또한 C-말단 리신을 포함할 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, N-말단 글루타민 잔기는 피로글루타메이트를 형성할 수 있고, C-말단 리신 잔기는 제조 방법 동안 클리핑될 수 있다.
<표 1> 항-IL13 항체 (레브리키주맙) 아미노산 서열
Figure 112016034000941-pct00001
Figure 112016034000941-pct00002
다른 재조합 폴리펩티드
CHO 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드는 단지 잔류 양 또는 검출불가능한 양이 남도록 햄스터 PLBL2의 수준을 제거하거나 감소시키기 위해 본원에 기재된 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는, 비제한적으로, 성장 인자, 시토카인, 이뮤노글로불린, 항체, 펩티바디 등을 포함한다.
특정의 예시적인 항체는 A베타에 대한 항체, IL17A/F에 대한 항체 및 CMV에 대한 항체를 포함한다. 예시적인 항-A베타 항체 및 이러한 항체를 생산하는 방법은 이전에, 예를 들어 WO2008011348, WO2007068429, WO2001062801 및 WO2004071408에 기재되었다. 예시적인 항-IL17 A/F 항체 및 이러한 항체를 생산하는 방법은 이전에, 예를 들어 WO 2009136286 및 미국 특허 번호 8,715,669에 기재되었다. 항-CMV-MSL을 비롯한, 예시적인 항-CMV 항체 및 이러한 항체를 생산하는 방법은 이전에, 예를 들어 WO 2012047732에 기재되었다.
예시적인 폴리펩티드는 포유동물 단백질, 예컨대, 예를 들어 CD4, 인테그린 및 그의 서브유닛, 예컨대 베타7, 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; ct-l-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA, 예를 들어 악티바제(Activase)®, TNKase®, 레타바제(Retavase)®); 봄바진; 트롬빈; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시에 정상 T-세포 발현 및 분비 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-I-a); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); IgE, 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; 다른 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴 (EPO); 트롬보포이에틴 (TPO); 골유도 인자; 면역독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 또는 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33 등; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자 (DAF); 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어 HIV 외피의 일부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDlla, CDllb, CDllc, CD18, 인테그린 서브유닛, 예컨대 알파4, 알파E, 베타7; 세포 부착 분자, 예컨대 ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 HER1, (EGFR), HER2, HER3 또는 HER4 수용체; Apo2L/TRAIL 및 임의의 상기 열거된 폴리펩티드의 단편; 뿐만 아니라 이뮤노어드헤신 및 이에 결합하는 항체; 및 임의의 상기-열거된 단백질의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
추가의 예시적인 폴리펩티드는 뇌 폴리펩티드, 비제한적으로 베타-세크레타제 1 (BACE1), A베타, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 타우, 아포지단백질 E (ApoE), 알파-시뉴클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질 (PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2 (LRRK2), 파르킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR), P-셀렉틴 및 카스파제 6, 및 임의의 상기 열거된 폴리펩티드의 단편; 뿐만 아니라 이뮤노어드헤신 및 이에 결합하는 항체; 및 임의의 상기-열거된 단백질의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
추가의 예시적인 폴리펩티드는 하기 항원 중 1종 이상에 대한 항체 (항체 단편 포함)을 비제한적으로 포함하는 치료 항체 및 이뮤노어드헤신을 포함한다: HER1 (EGFR), HER2 (예를 들어, 트라스투주맙, 페르투주맙), HER3, HER4, VEGF (예를 들어, 베바시주맙, 라니비주맙), MET (예를 들어, 오나르투주맙), CD20 (예를 들어, 리툭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙), CD22, CD1la, CD1lb, CDllc, CD18, ICAM, VLA-4, VCAM, IL-17A 및/또는 F, IgE (예를 들어, 오말리주맙), DR5, CD40, Apo2L/TRAIL, EGFL7 (예를 들어, 파사투주맙), NRP1, 인테그린 베타7 (예를 들어, 에트롤리주맙), IL-13 (예를 들어, 레브리키주맙), A베타 (예를 들어, 크레네주맙, 간테네루맙), P-셀렉틴 (예를 들어, 인클라쿠맙), IL-6R (예를 들어, 토실리주맙), IFNα (예를 들어, 론탈리주맙), M1프라임 (예를 들어, 퀼리주맙), 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK), OX40L, TSLP, 인자 D (예를 들어, 람팔리주맙) 및 수용체, 예컨대 IL-9 수용체, IL-5 수용체, IL-4 수용체 알파, IL-13 수용체 알파1 및 IL-13 수용체 알파2, OX40, TSLP-R, IL-7R알파 (TSLP에 대한 보조 수용체), IL17RB (IL-25에 대한 수용체), ST2 (IL-33에 대한 수용체), CCR3, CCR4, CRTH2, Fc 엡실론 RI 및 Fc 엡실론 RII/CD23 (IgE에 대한 수용체). 다른 예시적인 항체는 비제한적으로 항에스트로겐 수용체 항체, 항프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CDllc 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-tau 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체로부터 선택된 것을 포함한다.
특정 정제 방법
본원에 기재된 방법을 사용하여 정제될 단백질은 재조합 기술을 사용하여 일반적으로 생산된다. 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 특정 실시양태에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생산된다 (예를 들어, WO 94/11026 참조). 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제될 수 있는 항-IL13 모노클로날 항체 (항-IL13 MAb)를 비롯한 단백질의 예는 상기에 기재되었다.
재조합 기술을 사용하는 경우에, 단백질은 세포내, 주변세포질 공간에서 생산되거나 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 단백질이 세포내 생산되는 경우에, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 단백질이 배지 내로 분비되는 경우에, 재조합 숙주 세포를 예를 들어 접선 흐름 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 분리할 수 있다.
고체 상에 고정화된 단백질 A는 항-IL13 MAb 제제를 정제하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 고체 상은 단백질 A를 고정화시키기 위한 유리, 실리카, 아가로스 또는 폴리스티렌 표면을 포함하는 칼럼이다. 특정 실시양태에서, 고체 상은 제어형 세공 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 때때로, 칼럼은 칼럼에 대한 비특이적 부착을 방지하기 위한 시도로 글리세롤과 같은 시약으로 코팅되었다. 바이오프로세싱 리미티드(Bioprocessing Limited)로부터 상업적으로 입수가능한 프로셉A(PROSEP A)™ 칼럼은 글리세롤로 코팅된 단백질 A 제어형 세공 유리 칼럼의 한 예이다. 본원에서 고려되는 칼럼의 다른 예는 포로스® 50 ATM (폴리스티렌) 칼럼 또는 r단백질 A 세파로스 패스트 플로우™ (아가로스) 칼럼 또는 지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)로부터 입수가능한 맙셀렉트 슈어™ (아가로스) 칼럼을 포함한다.
단백질 A 크로마토그래피를 위한 고체 상은 적합한 완충제로 평형화된다. 예를 들어, 평형 완충제는 25mM 트리스, 25mM NaCl, pH 7.70 ± 0.20일 수 있다.
재조합 숙주 세포로부터 유래되며 불순물 및/또는 오염물을 함유하는 제제를 평형 완충제와 동일한 것일 수 있는 로딩 완충제를 사용하여 평형화 고체 상에 로딩한다. 불순물/오염물을 함유하는 제제가 고체 상을 관통함에 따라, 단백질은 고정화된 단백질 A에 흡착되고, 다른 불순물/오염물 (예컨대 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP), 단백질은 CHO 세포에서 생산됨)은 고체 상에 비특이적으로 결합할 수 있다.
순차적으로 수행된 다음 단계는 중간 세척 단계에서 고체 상을 세척하여 고체 상, 항체 및/또는 단백질 A에 결합된 불순물/오염물을 제거하는 것을 수반한다. 로딩 후에, 고체 상은 중간 세척 단계의 시작 전에 평형 완충제로 평형화될 수 있다.
중간 세척 완충제는 염 및 임의로 추가의 화합물, 예컨대 (a) 세제 (예를 들어, 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80); (b) 용매 (예컨대 헥실렌 글리콜); 및 (c) 중합체 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG))를 포함할 수 있다.
사용된 염은 관심 단백질을 기초로 선택될 수 있다. 예시적인 염은 아세트산나트륨, 시트르산나트륨 및 인산칼륨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조성물 중 염 및 추가의 화합물 (존재한다면)의 양은 합한 양이 관심 단백질을 실질적으로 제거하지 않으면서 불순물(들)/오염물(들)을 용리시키도록 한다. 이러한 세척 완충제 중 예시적인 염 농도는 약 0.1 내지 약 2M, 또는 약 0.2M 내지 약 0.6M이다. 유용한 세제 농도는 약 0.01 내지 약 5%, 또는 약 0.1 내지 1%, 또는 약 0.5%이며, 여기서 세제는 폴리소르베이트이다. 예시적인 용매 농도는 약 1% 내지 40%, 또는 약 5 내지 약 25%이다. 추가의 화합물이 중합체 (예를 들어 PEG 400 또는 PEG 8000)인 경우에, 그의 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%일 수 있다.
중간 세척 완충제의 pH는 전형적으로 약 4 내지 약 8, 또는 약 4.5 내지 약 5.5, 또는 약 5.0이다. 한 실시양태에서, pH는 7.00 ± 0.10이다.
상기에 기재된 중간 세척 단계 후에, 관심 단백질은 칼럼으로부터 회수된다. 이것은 전형적으로 적합한 용리 완충제를 사용하여 달성된다. 단백질은, 예를 들어 약 2 내지 약 5 범위 또는 약 2.5 내지 약 3.5 범위의 낮은 pH (또한 산성 조건으로 지칭됨)를 갖는 용리 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 용리될 수 있다. 이 목적을 위한 용리 완충제의 예는 시트레이트 또는 아세테이트 완충제를 포함한다.
용리된 단백질 제제는 단백질 A 크로마토그래피 단계 전 또는 후 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다. 예시적인 추가의 정제 단계는 히드록시아파타이트 크로마토그래피; 투석; 단백질을 포획하기 위한 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC); 황산암모늄 침전; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 한외여과-투석여과 (UFDF) 및 겔 여과를 포함한다. 본원의 예에서, 단백질 A 크로마토그래피 단계 후에 하류 음이온 교환 (예를 들어, Q-세파로스-패스트 플로우) 또는 다중모드 (예를 들어 혼합 모드) 이온 교환 (예를 들어, 캅토™ 어드히어) 및 HIC (예를 들어, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 - 고 치환) 정제 단계가 이어진다.
이와 같이 회수된 단백질은 제약상 허용되는 담체 중에 제제화될 수 있고, 다양한 진단, 치료 또는 이러한 분자에 대해 공지된 다른 용도를 위해 사용된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 이온 교환 크로마토그래피 물질; 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 양으로 하전되고 고체 상 위로 또는 고체 상을 통해 통과하는 수용액 내의 음이온과의 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 막, 모노리스 또는 수지일 수 있다. 한 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민 또는 4급 암모늄 이온 관능기, 폴리아민 관능기 또는 디에틸아미노에틸 관능기를 포함할 수 있다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 막이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 통상적인 크로마토그래피 물질 또는 전달성 크로마토그래피 물질을 이용할 수 있다. 통상적인 크로마토그래피 물질은, 예를 들어 살포성 물질 (예를 들어, 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 수지) 및 확산성 물질 (예를 들어, 가교 아가로스 수지)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 수지는 포로스® 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교 아가로스 수지는 술포프로필-세파로스 패스트 플로우 ("SPSFF") 수지일 수 있다. 전달성 크로마토그래피 물질은 막 (예를 들어, 폴리에테르술폰) 또는 모노리스 물질 (예를 들어 가교 중합체)일 수 있다. 폴리에테르술폰 막은 무스탕(Mustang)일 수 있다. 가교 중합체 모노리스 물질은 가교 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메타크릴레이트)일 수 있다.
음이온 교환 물질의 예는 포로스® HQ 50, 포로스® PI 50, 포로스® D, 무스탕 Q, Q 세파로스™ FF 및 DEAE 세파로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수친수성에 따라 생체분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. HIC 크로마토그래피 물질의 예는 토요펄(Toyopearl) 헥실 650, 토요펄 부틸 650, 토요펄 페닐 650, 토요펄 에테르 650, 소스(Source), 리소스(Resource), 세파로스 하이-트랩, 옥틸 세파로스, 페닐 세파로스™ 하이 퍼포먼스, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (저 치환) 및 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, HIC 크로마토그래피 물질은 HIC 크로마토그래피 막이다.
일부 측면에서, 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 물질이다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 단백질 A 또는 단백질 G로 유도체화된 크로마토그래피 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 친화성 크로마토그래피 물질의 예는 프로셉-VA, 프로셉-VA 울트라 플러스, 단백질 A 세파로스 패스트 플로우, 토요펄 단백질 A, 맙셀렉트, 맙셀렉트 슈어™ 및 맙셀렉트 슈어™ LX를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 막이다.
예를 들어 완충제의 목적하는 pH, 완충제의 목적하는 전도도, 관심 단백질의 특징 및 정제 방법에 따라 다양한 완충제가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 완충제를 사용하는 것을 포함한다. 완충제는 로딩 완충제, 평형 완충제 또는 세척 완충제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제, 평형 완충제 및/또는 세척 완충제 중 하나 이상은 동일하다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제, 평형 완충제 및/또는 세척 완충제는 상이하다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완충제는 염을 포함한다. 로딩 완충제는 염화나트륨, 아세트산나트륨 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 염화나트륨 완충제이다. 일부 실시양태에서, 로딩 완충제는 아세트산나트륨 완충제이다.
본원에 사용된 로드는 크로마토그래피 물질 상에 로딩된 조성물이다. 로딩 완충제는 크로마토그래피 물질 상에 관심 산물을 포함하는 조성물을 로딩하는데 사용된 완충제이다. 크로마토그래피 물질은 정제될 조성물을 로딩하기 전에 평형 완충제로 평형화될 수 있다. 일부 예에서, 세척 완충제는 조성물을 크로마토그래피 물질 상에 로딩한 후에 고체 상으로부터 관심 폴리펩티드를 용리시키기 전에 사용된다. 그러나, 일부 관심 산물 일부, 예를 들어 폴리펩티드 중 일부는 세척 완충제에 의해 (예를 들어 관통 모드와 유사하게) 크로마토그래피 물질로부터 제거될 수 있다.
본원에 사용된 용리는 크로마토그래피 물질로부터 산물, 예를 들어 폴리펩티드를 제거하는 것이다. 용리 완충제는 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드 또는 다른 관심 산물을 용리시키는데 사용된 완충제이다. 다수의 경우에, 용리 완충제는 로드 완충제 및 상이한 물리적 특징을 갖는다. 예를 들어, 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 전도도 또는 로드 완충제와 상이한 pH를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 더 낮은 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 더 높은 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 더 낮은 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 로드 완충제보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서 용리 완충제는 로드 완충제와 상이한 전도도 및 상이한 pH를 갖는다. 용리 완충제는 보다 높거나 또는 보다 낮은 전도도 및 보다 높거나 또는 보다 낮은 pH의 임의의 조합을 가질 수 있다.
전도도는 2개의 전극 사이에 전류를 전도시키는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액 내에서는, 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온 양을 증가시키면, 용액은 보다 높은 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 기본 측정 단위는 지멘 (또는 mho), mho (mS/cm)이며, 전도도 측정기, 예컨대 다양한 모델의 오리온 전도도 측정기를 사용하여 측정될 수 있다. 전해질 전도도는 전류를 운반하는 용액 중 이온의 능력이기 때문에, 용액의 전도도는 용액 중 이온 농도를 변화시켜 변경될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 전도도를 달성하기 위해 용액 중 완충제의 농도 및/또는 염 (예를 들어, 염화나트륨, 아세트산나트륨 또는 염화칼륨)의 농도를 변경시킬 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충제의 염 농도를 변형시켜 목적하는 전도도를 달성한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 50 CV/hr, 40 CV/hr 또는 30 CV/hr 중 어느 것 미만이다. 유량은 약 5 CV/hr 내지 50 CV/hr, 10 CV/hr 내지 40 CV/hr, 또는 18 CV/hr 내지 36 CV/hr 중 어느 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 9 CV/hr, 18 CV/hr, 25 CV/hr, 30 CV/hr, 36 CV/hr 또는 40 CV/hr 중 어느 것이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 약 100 cm/hr, 75 cm/hr 또는 50 cm/hr 중 어느 것 미만이다. 유량은 약 25 cm/hr 내지 150 cm/hr, 25 cm/hr 내지 100 cm/hr, 50 cm/hr 내지 100 cm/hr, 또는 65 cm/hr 내지 85 cm/hr, 또는 50 cm/hr 내지 250 cm/hr, 또는 100 cm/hr 내지 250 cm/hr, 또는 150 cm/hr 내지 250 cm/hr 중 어느 것일 수 있다.
층 높이는 사용된 크로마토그래피 물질의 높이이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 층 높이는 약 3 cm, 10 cm 또는 15 cm 중 어느 것 초과이다. 층 높이는 약 3 cm 내지 35 cm, 5 cm 내지 15 cm, 3 cm 내지 10 cm, 또는 5 cm 내지 8 cm 중 어느 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 층 높이는 약 3 cm, 5 cm, 10 cm 또는 15 cm 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 층 높이는 로드 중 폴리펩티드 또는 오염물의 양을 기초로 결정된다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200L, 400L, 또는 450L 초과의 부피를 갖는 용기의 칼럼에서의 것이다.
일부 실시양태에서가 분획이 크로마토그래피로부터 수집된다. 일부 실시양태에서, 수집된 분획은 약 0.01 CV, 0.02 CV, 0.03 CV, 0.04 CV, 0.05 CV, 0.06 CV, 0.07 CV, 0.08 CV, 0.09 CV, 0.1 CV, 0.2 CV, 0.3 CV, 0.4 CV, 0.5 CV, 0.6 CV, 0.7 CV, 0.8 CV, 0.9 CV, 1.0 CV, 2.0 CV, 3.0 CV, 4.0 CV, 5.0 CV 초과이다. 일부 실시양태에서, 산물, 예를 들어 폴리펩티드를 포함하는 분획이 풀링된다. 일부 실시양태에서, 로드 분획 및 용리 분획으로부터의 폴리펩티드를 함유하는 분획이 풀링된다. 분획 중 폴리펩티드의 양은 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어 분획 중 폴리펩티드의 양은 UV 분광분석법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 폴리펩티드 단편을 함유하는 분획이 풀링된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 불순물 또는 오염물은 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 목적하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분, 겐타미신 등 중 어느 1종 이상이다. 일부 예에서, 불순물 또는 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.
숙주 세포 단백질 (HCP)은 폴리펩티드가 생산되는 세포로부터의 단백질이다. 예를 들어, CHOP는 숙주 세포로부터의 단백질, 즉 차이니즈 햄스터 난소 단백질이다. CHOP의 양은 효소-연결된 면역흡착 검정 ("ELISA") 또는 질량 분광측정법에 의해 측정될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, HCP (예를 들어 CHOP)의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것 초과만큼 감소된다. HCP의 양은 약 10% 내지 99%, 30% 내지 95%, 30% 내지 99%, 50% 내지 95%, 50% 내지 99%, 75% 내지 99%, 또는 85% 내지 99% 중 어느 것만큼 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, HCP의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 중 어느 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 중 HCP의 양을 정제 단계(들) 이전의 조성물 중 HCP의 양과 비교하여 결정된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 정제된 폴리펩티드를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제된 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 정제 단계로부터 회수된다. 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, HIC 또는 단백질 A 크로마토그래피일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 단계는 단백질 A, 이어서 음이온 교환 또는 다중모드 이온 교환, 이어서 HIC이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 바이러스 여과에 의한 크로마토그래피 후에 추가로 정제된다. 바이러스 여과는 폴리펩티드 정제 공급스트 중에 바이러스 오염물을 제거하는 것이다. 바이러스 여과의 예는 한외여과 및 마이크로여과를 포함한다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 파르보바이러스 필터를 사용하여 정제된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 후에 농축된다. 농축 방법의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 한외여과 및 투석여과를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 정제 방법의 정제된 폴리펩티드를 제약상 허용되는 담체와 조합하는 것을 추가로 포함한다.
모노클로날 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 정제된 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 동종인 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하는 집단으로부터 수득된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개 또는 폴리클로날 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 사용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 도출하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결여된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시양태에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고, 배지 예컨대 HAT 배지에 민감한 것이다. 이들 중에서, 일부 실시양태에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되었다 (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론이 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장할 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 예를 들어 폴리펩티드 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 사용하여 용이하게 단리 및 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서 이를 달리 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용하는, 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 기재한다. 후속 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합형 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))을 기재한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)]), 이뮤노글로불린 코딩 서열을 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유 연결함으로써 변형될 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 이들은 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생산한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 모노클로날 항체이다.
인간화 항체
일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내로 도입되는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되며, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 본질적으로 상응하는 인간 항체의 서열을 초가변 영역 서열로 치환시키는 것에 의한, 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인 이외의 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적-피팅" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 받아들여진다 (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
또한, 항체가 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 중요하다. 이 목표를 달성하기 위해, 방법의 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이들의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기가 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 영향을 미치는데 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 수반된다.
인간 항체
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시에, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면 항원 챌린지 시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369; 및 5,545,807을 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))을 사용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 폴리펩티드 유전자 내로 인-프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기초로 한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 이에 대한 검토를 위해 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 의해 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).
항체 단편
일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
키메라 폴리펩티드
본원에 기재된 폴리펩티드는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 분자는 폴리펩티드와, 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 항-태그 항체를 사용하거나 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화도 정제에 의해 폴리펩티드가 용이하게 정제되도록 할 수 있다.
기타
폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)]에 개시되어 있다.
폴리펩티드 수득
본원에 기재된 정제 방법에 사용된 폴리펩티드는 재조합 방법을 비롯한, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 하기 섹션은 이들 방법에 대한 안내를 제공한다.
폴리뉴클레오티드
본원에서 상호교환가능하게 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 소유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 편리하게는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 이뮤노글로불린 분자 쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하며, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재는 바람직할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 (전형적으로) CH1 및 CK 또는 CL 도메인이 절제된 2가 항체 단편이다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 이들은 임상/진단 용도에서 보다 우수한 조직 침투를 달성하여야 하지만, 2가이므로 이들은 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 높은 결합 친화도를 보유하여야 한다. 따라서, 문맥상 달리 표시되지 않는다면, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포괄한다. 바람직하게는 코딩된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크에 대해 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역에 대해 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 분자가 그의 정상 또는 자연 환경으로부터 제거 또는 분리되거나, 또는 그것이 그의 정상 또는 자연 환경에 존재하지 않는 방식으로 생산되는 것을 나타내도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 정제된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 정제된은 적어도 일부 오염 분자 또는 물질이 제거된 것을 나타내도록 의도된다.
적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 관련 폴리뉴클레오티드가 조성물에 존재하는 우세한 (즉, 가장 풍부한) 폴리뉴클레오티드를 구성하도록 실질적으로 정제된다.
폴리뉴클레오티드의 발현
하기 설명은 주로 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, 폴리펩티드를 제조하기 위해 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 대안적 방법을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 그의 부분은 고체-상 기술을 사용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기(Applied Biosystems Peptide Synthesizer) (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 다양한 부분은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 목적하는 폴리펩티드를 생산하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 벡터(들) 내로 삽입된다. 용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 제어 서열은 프로모터 (예를 들어, 천연-회합 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 핵산은 폴리펩티드가 그의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 핵산에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 핵산 서열이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
항체의 경우, 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 핵산 절편은 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 코딩 서열 및 임의적인 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에 대해서는 통상적으로 염화칼슘 형질감염이 이용되고, 반면에 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱 또는 바이러스-기반 형질감염을 다른 세포 숙주에 사용할 수 있다. (일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)] 참조). 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미세주사의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물의 생산을 위해, 트랜스진은 수정란 내에 미세주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 상기 세포의 핵은 제핵 난모세포 내로 전달될 수 있다.
벡터
용어 "벡터"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터 및 셔틀 벡터를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 구축물을 의미한다.
용어 "형질전환 벡터"는 하나의 엔티티에서 또 다른 엔티티로 전달될 수 있는 구축물을 의미하며 - 이는 해당 종의 것일 수 있거나 상이한 종의 것일 수 있다. 구축물이 하나의 종에서 또 다른 종으로 - 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 플라스미드에서 박테리아, 예컨대 바실루스(Bacillus) 속으로 - 전달될 수 있는 경우, 형질전환 벡터는 때때로 "셔틀 벡터"로 지칭된다. 이는 심지어는 이. 콜라이 플라스미드에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 거쳐 식물로 전달될 수 있는 구축물일 수 있다.
벡터는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 하기 기재된 바와 같은 적합한 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. 다양한 벡터가 공중 이용가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차를 통해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입된다. 이들 성분 중 1종 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 통상의 기술자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
벡터는, 복제 기점, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절제를 갖는 한, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 1종 이상의 선택 마커 유전자를 함유할 수 있다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다.
숙주 세포
숙주 세포는, 예를 들어 박테리아, 효모 또는 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
유전자 조작된 트랜스제닉 다세포 숙주 유기체는 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 유기체는, 예를 들어 트랜스제닉 포유동물 유기체 (예를 들어, 트랜스제닉 염소 또는 마우스 계통)일 수 있다.
적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공중 이용가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아, 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 폴리뉴클레오티드 산물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주 중 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소 양의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이가 일어나도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 추가로, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시 및 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
진핵 미생물이 발현에 사용될 수 있다. 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 보다 낮은 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것은 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)를 포함한다. 메틸영양 효모는 본원에서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로엑케라(Kloeckera), 피키아, 사카로미세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사카로미세스는 원하는 경우 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등이 존재하는 적합한 벡터를 갖는 바람직한 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터로는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히 알콜 데히드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물뿐만 아니라, 또한 포유동물 조직 세포 배양물을 사용하여 본원에 기재된 폴리펩티드를 발현 및 생산할 수 있고, 이는 일부 경우에 바람직하다 (문헌 [Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)] 참조). 일부 실시양태의 경우, 이종 폴리펩티드 (예를 들어, 무손상 이뮤노글로불린)를 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 관련 기술분야에서 개발되었기 때문에, 진핵 세포가 바람직할 수 있고, 이는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO 또는 CHO-DP-12 세포주); 마우스 세르톨리 세포; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
제제 및 제제의 제조 방법
또한 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 포함하는 제제 및 제제의 제조 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 정제된 폴리펩티드는 제약상 허용되는 담체와 조합될 수 있다.
폴리펩티드 제제는 일부 실시양태에서 목적하는 순도를 갖는 폴리펩티드를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 아연-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 제제 내의 폴리펩티드는 기능적 활성을 유지한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한 경우에는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 뿐만 아니라, 하나의 제제에 추가의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
본원에 기재된 항-IL13 항체의 예시적인 제제는 국제 특허 공개 번호 WO 2013/066866에 제공된다.
제조 물품
본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 및/또는 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제는 제조 물품 내에 함유될 수 있다. 제조 물품은 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제조 물품은 (a) 용기 내에 본원에 기재된 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 용기; 및 (b) 제제를 대상체에게 투여하기 위한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한다.
제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 제제를 유지 또는 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 폴리펩티드이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제공되는 폴리펩티드 및 임의의 다른 약물의 투약량 및 간격에 관한 구체적 안내를 받은 대상체에서 조성물의 사용을 지시한다. 제조 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 시린지이다. 일부 실시양태에서, 시린지는 추가로 주사 장치 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 주사 장치는 자동주사기이다.
"패키지 삽입물"은, 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기, 포장된 제품과 조합되는 다른 치료 제품, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례상 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 기재된 항-IL13 항체의 제제를 함유하는 예시적인 제조 물품은 국제 특허 공개 번호 WO 2013/066866에 제공된다.
본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 참고문헌의 개시내용은 본원에 명백히 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예 및 본원 다른 곳에 사용된 바와 같이, "PLB2" 및 "PLBL2" 및 "PLBD2"는 상호교환가능하게 사용되고, 효소 "포스포리파제 B-유사 2" 또는 그의 동의어인 "포스포리파제 B-도메인-유사 2"를 지칭한다.
실시예 1 - 일반적 방법
모든 실시예를 위한 물질 및 방법은 실시예에서 달리 나타내지 않는 한 하기 나타낸 바와 같이 수행하였다.
MAb 공급원료
모든 실시예를 위한 MAb 공급원료를 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 산업적, 파일럿 또는 소규모 세포 배양 배치로부터 선택하였다. 세포 배양물 발효 기간 후에, 세포를 분리하였고, 특정 경우에 정화된 유체 (수거된 세포 배양 유체, HCCF)를 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피 및 1개 이상의 추가의 크로마토그래피 단계 및 여과 단계에 의해 정제하였다.
MAb 정량화
항체의 농도를 UV-가시 분광광도계 (8453 모델 G1103A; 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 또는 나노드롭(NanoDrop) 1000 모델 ND-1000 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific); 미국 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 280 및 320 nm에서의 흡광도를 통해 결정하였다. 항체 이외의 종 (즉, 불순물)은 UV 흡광도 상에서 인지가능한 효과를 나타내기에는 농도가 너무 낮았다. 필요에 따라, 샘플을 0.1-1.0 흡광도 단위 범위의 적절한 비-간섭 희석제로 희석하였다. 샘플 제조 및 UV 측정을 이중으로 수행하고, 평균 값을 기록하였다. mAb 흡광 계수는 1.42 내지 1.645/mg·ml·cm 범위였다.
총 CHO 숙주 세포 단백질 (CHOP) 정량화
ELISA를 사용하여 CHOP로 불리는 총 숙주 세포 단백질의 수준을 정량화하였다. 산물 중 CHO 단백질을 검출하는데 사용된 ELISA는 샌드위치 ELISA 포맷을 기반으로 하였다. CHOP에 대한 친화도-정제된 폴리클로날 항체를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서, 표준물, 대조군 및 샘플을 개별 웰 내로 이중으로 로딩하였다. CHOP는, 샘플 내에 존재하는 경우에, 코트 항체 (폴리클로날 항-CHOP)에 결합할 것이다. 인큐베이션 단계 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 항-CHOP 폴리클로날 항체를 플레이트에 첨가하였다. 최종 세척 단계 후에, CHOP는 HRP 효소에 의해 작용될 때 비색 신호를 생성하는, KPL (키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈, 인크.(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.), 메릴랜드주 게이더스버그, 카탈로그 번호 53-00-03)로부터의 슈어블루 리저브(SUREBLUE RESERVE)™로서 또한 입수가능한 테트라메틸 벤지딘 (TMB)의 용액을 첨가함으로써 정량화하였다. 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 각 웰에서 측정하였다. 5-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스® 프로(SOFTMAX® Pro), 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 샘플 CHOP 농도를 표준 곡선으로부터 계산하였다. 총 CHOP ELISA의 검정 범위는 5 내지 320 ng/ml였다. CHOP 농도 (ng/mL)는 보정물로서 CHOP 표준물을 사용한 샘플 중 CHOP의 양을 지칭한다. CHOP 비 (ng/mg 또는 ppm)는 산물 농도에 대한 CHOP 농도의 계산된 비를 지칭하고, 특정 경우에서는 시험 방법에 대해 보고된 값이었다. 총 CHOP ELISA를 사용하여 샘플 중 총 CHOP 수준을 정량화할 수 있지만 개별 단백질의 농도를 정량화하지는 않는다.
뮤린 모노클로날 항-햄스터 PLBL2 ELISA 검정
마우스 항-햄스터 PLBL2 모노클로날 항체의 생성 및 이러한 항체를 사용하는 재조합 폴리펩티드 제제에서 PLBL2의 검출 및 정량화를 위한 ELISA 검정의 개발은 미국 특허 가출원 번호 61/877,503 및 61/991,228에 기재되어 있다. 간략하게, 검정은 하기와 같이 수행한다.
뮤린 모노클로날 항체 19C10을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 절반 면적 상에 카르보네이트 완충제 (0.05M 탄산나트륨, pH 9.6) 중 0.5 μg/mL의 농도로 밤새 2-8℃에서 코팅하였다. 코팅 후에, 플레이트를 차단 완충제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린(Proclin)® 300 [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]; 또한 검정 희석제로 지칭됨)로 차단하여 단백질의 비-특이적 점착을 방지하였다. 이어서, 표준물, 대조군 및 샘플을 검정 희석제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린® 300 [시그마-알드리치]) 중에 희석한 다음, 개별 웰 내로 이중으로 로딩하고, 2시간 동안 실온 (22-27℃)에서 인큐베이션하였다. PLBL2는, 샘플 내에 존재하는 경우에, 코트 (또한 본원에서 포획으로 지칭됨) 항체에 결합할 것이다. 상기에 기재된 인큐베이션 단계 후에, 미결합 물질을 세척 완충제 (0.05% 폴리소르베이트 20/PBS [코닝 셀그로(Corning cellgro) 카탈로그 번호 99-717-CM])를 사용하여 세척해내고, 비오틴에 접합된 15G11 항-PLBL2 뮤린 모노클로날 항체를 검정 희석제 중에 0.03125 μg/mL의 농도로 희석하고, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다.
비오틴 접합을 하기와 같이 수행하였다. 비오티닐화 키트를 피어스 써모 사이언티픽(Pierce Thermo Scientific)으로부터 구입하고 (P/N 20217, E-Z 링크 NHS-비오틴(E-Z Link NHS-Biotin)), 스트렙타비딘-HRP (SA-HRP)을 잭슨 이뮤노(Jackson Immuno)로부터 구입하였다 (카탈로그 번호 016-030-084). 피어스 키트 내의 지침서를 따랐다. 간략하게, IgG를 PBS (pH 7.4) 중에 희석하고, 비오틴을 그 단백질에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 이어서, 표지된 항체를 PBS (pH 7.4)에 대해 투석하여 잉여량의 비오틴을 제거하고, 여과하고, 단백질 농도를 A280에 의해 결정하였다.
실온에서의 비오티닐화 15G11과의 2시간 인큐베이션 단계 후에, 스트렙타비딘 HRP (검정 희석제 중 1:200,000 희석)를 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하였다. 세척 완충제 (상기에 기재됨)를 사용한 최종 세척 단계 후에, TMB 용액 (50 μl/웰) (KPL (키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈, 인크., 메릴랜드주 게이더스버그)로부터의 슈어블루 리저브™, 카탈로그 번호 53-00-03)을 첨가하고 이어서 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션함으로써 색을 발현시켰다 (PLBL2 정량화를 위함). 검출은 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스(SpectraMax) M5e를 사용하여 각 웰에서 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 평가함으로써 수행하였다. 4-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스 프로 v5.2 rev C)을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 샘플 PLBL2 농도를 표준 곡선의 선형 범위로부터 계산하였다. 표준 곡선의 선형 범위에서의 값을 사용하여 공칭 PLBL2 (ng/mg 또는 ppm)를 계산하였다. 선형 범위는 대략 EC10 - EC85 또는 1.5 - 40 ng/mL였으며, 범위는 플레이트마다 약간 달랐다. 이 ELISA를 사용하여 PLBL2에 대해 수득된 값은 다른 방법 (예를 들어, 검정의 LOQ로 희석하였을 때 LC-MS/MS, 폴리클로날 PLBL2 ELISA 또는 총 CHOP ELISA)에 의해 만들어진 추정치에 필적하였다.
토끼 폴리클로날 항-햄스터 PLBL2 ELISA 검정
토끼 항-햄스터 PLBL2 폴리클로날 항체의 생성 및 이러한 항체를 사용하는 재조합 폴리펩티드 제제에서 PLBL2의 검출 및 정량화를 위한 ELISA 검정의 개발은 미국 특허 가출원 번호 61/877,503 및 61/991,228에 기재되어 있다. 간략하게, 검정은 하기와 같이 수행한다.
친화도 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 절반 면적 상에 카르보네이트 완충제 (0.05M 탄산나트륨, pH 9.6) 중 0.5 ug/mL의 농도로 밤새 2-8℃에서 코팅하였다. 코팅 후에, 플레이트를 차단 완충제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린® 300 [시그마-알드리치])로 차단하여 단백질의 비-특이적 점착을 방지하였다. 표준물, 대조군 및 샘플을 검정 희석제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린® 300 [시그마-알드리치]) 중에 희석한 다음, 개별 웰 내로 이중으로 로딩하고, 2시간 동안 실온 (22-27℃)에서 인큐베이션하였다. PLBL2는, 샘플 내에 존재하는 경우에, 코트 (또한 본원에서 포획으로 지칭됨) 항체에 결합할 것이다. 상기에 기재된 인큐베이션 단계 후에, 미결합 물질을 세척 완충제 (0.05% 폴리소르베이트 20/PBS [코닝 셀그로 카탈로그 번호 99-717-CM])를 사용하여 세척해내고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 친화도 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 검정 희석제 중에 40 ng/mL의 농도로 희석하고, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다.
HRP 접합을 하기와 같이 수행하였다. HRP 접합 키트를 피어스 써모 사이언티픽으로부터 구입하였다 (P/N 31489, E-Z 링크 플러스 액티베이티드 퍼옥시다제 앤드 키트(E-Z Link Plus Activated Peroxidase and Kit)). 피어스 키트 내의 지침서를 따랐다. 간략하게, IgG를 카르보네이트-비카르보네이트 완충제 (pH 9.4) 중에 희석하고, E-Z 링크 플러스 액티베이티드 퍼옥시다제를 그 단백질에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 이후에, 소듐 시아노보로히드라이드 및 켄칭 완충제를 첨가하여 접합을 안정화시키고, 반응을 켄칭하였다. 이어서, 표지된 항체를 PBS (pH 7.4)에 대해 투석하고, 여과하고, 단백질 농도를 A280에 의해 결정하였다.
실온에서의 HRP 접합된 토끼 폴리클로날 항체와의 2시간 인큐베이션 단계 후에, 세척 완충제 (상기에 기재됨)를 사용한 최종 세척 단계를 수행하였다. 그 후에, TMB 용액 (50 ul/웰) (KPL (키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈, 인크., 메릴랜드주 게이더스버그)로부터의 슈어블루 리저브™, 카탈로그 번호 53-00-03)을 첨가하고 이어서 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션함으로써 색을 발현시켰다 (PLBL2 정량화를 위함). 검출은 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 M5e를 사용하여 각 웰에서 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 평가함으로써 수행하였다. 5-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스 프로 v5.2 rev C)을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 샘플 PLBL2 농도를 표준 곡선의 선형 범위로부터 계산하였다. 표준 곡선의 선형 범위에서의 값을 사용하여 공칭 PLBL2 (ng/mg 또는 ppm)를 계산하였다. 검정의 정량적 범위는 0.5-50 ng/mL였다. 이 ELISA를 사용하여 PLBL2에 대해 수득된 값은 다른 방법 (예를 들어, 검정의 LOQ로 희석하였을 때 뮤린 모노클로날 PLBL2 ELISA, LC-MS/MS 또는 총 CHOP ELISA)에 의해 만들어진 추정치에 필적하였다.
LC-MS/MS 검정
LC-MS/MS에 의한 PLBL2의 정량화를 위해, 워터스 액퀴티 H-클래스 바이오 UPLC(Waters Acquity H-Class Bio UPLC) 및 AB 사이엑스 트리플TOF 5600+(AB Sciex TripleTOF 5600+) 질량 분광계를 사용하였다. 샘플 및 보정 표준물 (NS0 세포로부터 수득한 재조합 인간화 모노클로날 항체 제제 내에 섞은 재조합 PLBL2 [NS0 세포주는 햄스터 PLBL2를 함유하지 않음])을 트립신에 의해 환원 및 소화시켰다. 총 40 μg의 소화된 샘플을 워터스 BEH300 C18 칼럼, 입자 크기 1.7 μm를 사용하여 UPLC 상에 주사하였다. 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 펩티드를 300 μl/min의 유량 및 60℃의 칼럼 온도에서 용리시켰다.
UPLC로부터 용리된 펩티드를 양성 이온화 모드의 전기분무 이온화에 의해 질량 분광계로 도입하였다. 이온 공급원 온도를 400℃로 설정하고, 이때 이온스프레이 전압은 5500 v이고 디클러스터링 전위는 76 v였다. 선택된 펩티드 이온의 단편화를 위해 충돌 에너지 설정 32를 사용하였다. 질량 분광계를 4종의 특이적 PLBL2 펩티드 및 그의 단편 이온 전이를 사용하여 다중 반응 모니터링 고해상도 (MRMHR) 모드로 작동시켰다. 모 이온은 1.2 amu의 전하에 대한 질량 (m/z) 선택 윈도우로 사중극자 질량 분광계에 의해 선택하였다. 각 모 이온의 단편 이온을 비행 시간 질량 분광계에 의해 분리하고, 0.025 amu의 선택 윈도우로 데이터 획득 후 정량화를 위해 선택하였다.
샘플 중 PLBL2의 농도는 4개 전이의 특이적 신호 반응을 측정함으로써 (선형 피팅을 사용하여 2-500 ppm 범위의 표준물로부터의 것으로 보정됨) 결정하였다. 하기 표 2는 LC-MS/MS에 의해 모니터링된 PLBL2 펩티드의 목록을 제시한다.
<표 2> LC-MS/MS에 의해 모니터링된 PLBL2 펩티드의 목록
Figure 112016034000941-pct00003
실시예 2 - 햄스터 PLBL2를 감소시키기 위한 개선된 정제 방법
CHO-생산된 항-IL13 MAb (레브리키주맙)에 대한 정제 방법은 초기 단계 임상 시험을 지지하기 위해 확립되었고, 본원에서 "초기 방법"으로 지칭된다. 초기 방법은 하기 크로마토그래피 단계를 순서대로 사용하였다: 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어™)에 이어서 양이온 교환 (포로스® HS)에 이어서 음이온 교환 (Q 세파로스™ 패스트 플로우). 추가의 바이러스 불활성화 및 여과 단계를 포함시키고, 최종 한외여과-투석여과 (UFDF) 단계를 포함시켰다. 최종 산물 (약물 물질)을 20 mM 히스티딘 아세테이트, 6% 수크로스, 0.03% 폴리소르베이트 20, pH 5.7 중 125 mg/mL의 농도로 제제화하였다.
총 CHOP ELISA 검정 (상기 실시예 1에 기재된 바와 같음)을 사용하여, 본 발명자들은 초기 방법에 따라 정제된 방법 중의 중간체 및 약물 물질이 정규화된 일련의 샘플 희석물에 걸쳐 > 20% 변동 계수를 유발하는 비정형 희석-의존성 거동을 입증하였음을 관찰하였다. 이 희석-의존성 거동은 표 3에 제공된 데이터에 의해 예시되며, 여기서 항-IL13 MAb 산물의 각각의 연속 2배 희석은 총 CHOP ELISA를 사용하여 결정 시 보다 높은 수준의 CHOP (ppm으로 표현됨)를 유발하였다. 민감한 분석 방법, 예컨대 LC-MS/MS를 사용하여, 본 발명자들은 단일 CHOP 종 또는 HCP가 이 비정형 희석-의존성 거동의 원인이었음을 결정하였다. 특히, 본 발명자들은 총 CHOP ELISA에 대한 희석-의존성 거동이 항원 과잉으로 인한 것이었음을 입증하였다. 추가 조사에 의해 본 발명자들은 단일 HCP를 햄스터 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2) 효소로서 확인할 수 있었다. 산물 샘플을 검정 정량 한계 (LOQ)로 희석함으로써, 본 발명자들은 초기 방법을 사용하여 정제된 레브리키주맙의 임상 로트 중 PLBL2의 수준을 추정할 수 있었고, 300 ppm (300 ng/mg)만큼 높은 수준 및 그 초과의 수준이 존재한다고 결정하였다.
<표 3> 산물 희석 및 CHOP 수준
Figure 112016034000941-pct00004
본 발명자들이 관찰한 바와 같은 이 단일 CHOP 종의 불순물 수준 (> 300 ppm)은 인간 임상 및/또는 치료 용도, 특히 후기 임상 시험 및 그 이후를 위해 의도된 MAb 산물에서 바람직하지 않은 것으로 간주된다. 예를 들어, 이러한 수준은 실시예 3에 기재된 바와 같이 인간 대상체에게 투여될 때 면역원성일 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 하기에 간략하게 약술한 바와 같이 초기 방법에 대한 다양한 변형을 조사하였다. 이들 조사의 결과를 기초로, 본 발명자들은 하기에 상세하게 기재되는 개선된 정제 방법을 개발하였고, 이는 본원에서 "개선된 방법"으로 지칭된다. 개선된 방법의 사용은 실질적으로 감소된 수준의 PLBL2를 함유하는 정제된 항-IL13 MAb (레브리키주맙) 산물을 생성하였다.
PLBL2를 감소시키는 정제 방법을 변형하기 위한 노력은 침전, HCCF에 대한 다양한 첨가제 시험, 추가의 칼럼 세척, 소수성 상호작용 및 혼합 모드 크로마토그래피를 비롯한, 초기 방법에 대한 직교 방법을 포함하였다. 이들 노력은 총 CHOP 및/또는 PLBL2 수준의 감소에 대해 조사된 각각의 변형의 유효성을 모니터링하기 위한 실시예 1에 기재된 검정 중 하나 이상의 사용에 의해 알려졌다. 연구된 다양한 변형은 하기에 기재된다.
카프릴산에 의한 HCCF 및 단백질 A 풀에서의 CHOP의 침전
관심 표적 단백질로부터 불순물을 선택적으로 침전시키기 위한 카프릴산 침전은 모노클로날 항체 산업에서의 사용 (Wang et al., BioPharm International; Downstream Processing 2010, p4-10, Oct2009; Brodsky et al., Biotechnology and Bioengineering, 109(10):2589, 2012)을 비롯하여 이전에 기재되었다. 옥탄산으로 또한 공지된 카프릴산은 8개의 탄소를 갖는 포화 지방산이다 (화학식 CH3(CH2)6COOH). 카프릴산에 의한 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 단백질 A 풀의 침전이 감소된 CHOP 및/또는 총 CHOP ELISA에서의 희석-의존성 거동의 감소로 이어질지의 여부를 결정하기 위해 항-IL13 MAb를 사용하여 연구를 수행하였다.
이들 연구를 위한 항-IL13 MAb 출발 물질은 1kL 수거물로부터의 HCCF 및 단백질 A 풀이었다. 1% (v/v) 카프릴산을 HCCF에 첨가하고, 가변 농도의 카프릴산 (0% - 3% v/v)을 pH 4.5 또는 pH 5.0에서 단백질 A 풀에 첨가하였다. 샘플을 ≥ 5시간 동안 주위 온도에서 혼합하고, 0.2 μm 여과하고, 총 CHOP ELISA를 사용하여 검출 및 정량화하기 위해 총 CHOP ELISA 희석제로 희석하였다. 카프릴산 처리 전 및 후에 HCCF 중 항-IL13 MAb의 역가는 관련 기술분야에 공지된 표준 방법에 따라 수행되는 HPLC 역가 검정을 사용하여 결정하였다.
1% v/v 카프릴산에 의한 HCCF의 처리는 CHOP를 대략 5배만큼 감소시켰고, 항-IL13 MAb의 수율 91%를 생성하였다. 단백질 A 풀을 0 - 3% v/v 범위의 다양한 농도의 카프릴산에 의해 처리하였을 때, 본 발명자들은 pH 5.0에서 > 20%의 수율 손실을 관찰하였고, pH 4.5에서는 수율 손실을 관찰하지 않았다. 본 발명자들이 이들 카프릴산-처리 단백질 A 풀에서 총 CHOP를 평가하였을 때, 본 발명자들은 CHOP의 2배 내지 3배 감소를 발견하였다 (도 1A 및 B). 그러나, 또한 도 1A 및 B에 보여지는 것처럼, 희석-의존성은 각각의 시험 조건 하에서 여전히 존재하였으며, 이는 카프릴산 침전이 총 CHOP ELISA에서 관찰된 희석-의존성 거동을 다루는데 효과적이지 않으므로 이 산물에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적이지 않을 것임을 나타낸다.
HCCF에 대한 첨가제
문헌 [Sisodiya et al., Biotech J. 7:1233 (2012)]에서의 이전 작업은 HCCF에 대한 첨가제, 예컨대 구아니딘 또는 염화나트륨이 이후에 정제된 단백질 A 풀에서 CHOP를 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 아르기닌이 또한 단백질 A 칼럼 상의 세척물로서 이용될 때 CHOP를 감소시킨 것으로 나타났으므로 (Millipore Technical Bulletin, Lit. No. TB1024EN00, Rev. A, December, 2005; Millipore Technical Bulletin, Lit. No. 1026EN00, July, 2006, www.Millipore.com에서 이용가능함), 본 발명자들은 그것을 HCCF에 대한 첨가제로서 포함시켰다. 다양한 염, 카오트로프제 및 카프릴산을 항-IL13 MAb HCCF에 첨가하여, 맙셀렉트 슈어™ (MSS) 단백질 A 크로마토그래피 상의 산물의 포획 동안 산물 및 CHOP 상호작용을 감소시키는 것에 대한 각각의 유효성을 평가하였다. 시험된 HCCF에 대한 첨가제는 0.6M 구아니딘, 0.6M 아르기닌, 0.6M NaCl, 포스페이트-완충 염수 및 1% 카프릴산이었다.
각각의 HCCF 첨가제로 처리한 샘플을 MSS 상의 단백질 A 크로마토그래피에 적용하였다. 단백질 A 풀을 pH 4.9로 조정하고, 포로스® HS 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 초기 방법 초건을 사용하여 추가로 정제하였다. 단백질 A 풀 및 포로스® HS 풀을 희석하고, 총 CHOP ELISA에 제출하였다. 또한, %응집체, %변이체 종 등의 평가를 위해 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 SEC-HPLC 상에서 조정된 단백질 A 풀을 시험하였다.
맙셀렉트 슈어™ 상에서의 수율은 구아니딘 또는 아르기닌이 HCCF에 첨가된 실행에서 약간 더 낮았다. 시험된 HCCF에 대한 모든 첨가제 중, 구아니딘 및 아르기닌은 실질적으로 CHOP 수준을 감소시키는데 가장 효과적이었고 (표 4 참조), 단백질 A 풀 상에서 희석-의존성을 감소시키는 것처럼 보였다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, 포로스® HS 상에서의 단백질 A 풀의 추가의 하류 가공은 도 2에 보여지는 바와 같이 상응하는 포로스® 풀에 남아있는 CHOP ELISA 희석-의존성을 나타냈다. 따라서, 데이터는 HCCF에 대한 아르기닌 또는 구아니딘의 첨가가 이 산물에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적이지 않을 것임을 입증한다.
<표 4> HCCF 첨가제 및 CHOP에 대한 효과
Figure 112016034000941-pct00005
단백질 A 칼럼 (맙셀렉트 슈어™)의 세척
보다 희석-의존성인 CHOP가 맙셀렉트 슈어™ (MSS) 단백질 A 크로마토그래피 상에서 초기 산물-함유 분획 중에 용리된 것을 관찰하였다. 이것은 용리 전에 MSS 상에서의 추가의 세척 단계가 CHOP/PLBL2를 추가로 감소시킬 수 있다는 것을 시사하였다. MSS 상에서의 여러 세척물을 단백질 A 풀에서 CHOP/PLBL2를 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 이 연구를 위해, 정제된 항-IL13 MAb UFDF 풀을 로드 물질로서 사용하였다. UFDF 풀을 1.7 mg/mL (대략 HCCF 역가)로 희석하고, MSS 상에 29 g/L 수지로 로딩하였다. 다양한 세척물, 예를 들어 0.5M 아르기닌 pH 8.5, 0.5M 아르기닌 pH 9.5 (1% 폴리소르베이트 20 존재 및 부재 하), 0.5M TMAC pH 7.1, 25 mM MOPS pH 7.1을 시험하고, 고 염 세척물 pH 7.0과 비교하였다. 산물을 산성 조건 (pH 2.8) 하에서 용리시키고, 0.5 OD (A280)에서 시작하여 풀링하고 2.4 칼럼 부피의 총 부피로 계속 풀링하였다. 각각의 조정된 풀을 총 CHOP ELISA를 사용하여 희석 및 검정하였다. 이들 결과의 요약은 어떠한 세척물도 CHOP/PLBL2 또는 총 CHOP ELISA에서의 희석-의존성을 적절히 감소시키지 않았다는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 이 항-IL13 MAb 산물에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적일 단백질 A 세척 조건을 발견할 가능성이 없는 것처럼 보였으므로, 본 발명자들은 이들을 추가로 조사하지 않았다.
양이온 교환 칼럼 (포로스® HS)의 세척
항-IL13 MAb 및 PLBL2 불순물의 아미노산 서열을 사용하는 이론적 계산을 기초로, 본 발명자들은 PLBL2의 pI가 대략 6.0이며 항-IL13 MAb (pI 6.1)과 유사하다고 추정하였다. 본 발명자들은 또한 ≤ pH 4 및 ≥ pH 10에서 항-IL13 MAb와 PLBL2 사이의 알짜 전하에 유의차가 존재할 것이라고 추정하였다. 이에 따라 본 발명자들은 이들이 총 CHOP 및/또는 PLBL2 및 희석-의존성 거동을 선택적으로 감소시키는데 효과적일지의 여부를 평가하기 위해 초기 방법 포로스® HS 양이온 교환 단계에서 다양한 저 pH 세척물을 시험하였다. 하기 세척물을 pH 4에서 시험하였다: (i) 아세테이트 구배, 20 칼럼 부피 (CV)에 걸쳐 300 mM - 1,000 mM; (ii) 시트레이트 구배, 20 CV에 걸쳐 100 mM - 500 mM; (iii) 260 mM에서의 시트레이트 세척 단계; 및 (iv) 20 CV에 걸쳐 15 mS/cm (전도도 측정)로의 아르기닌 구배.
결과는 항-IL13 MAb 및 CHOP가 1M의 시험된 염 농도까지의 pH 4 아세테이트 구배로는 용리되지 않았다는 것을 제시하였다. 증가하는 양의 시트레이트 또는 아세테이트는 산물 불용성 및 침전을 유발하였다. 모든 pH 4 세척물은 포로스® HS 단계에서 저수율을 유발하였고, 어떠한 세척물도 유의하게 CHOP 희석-의존성을 감소시키지 않았다. 따라서, 양이온 교환 칼럼의 저 pH 세척물의 포함은 이 산물에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적이지 않았다.
히드록시아파타이트 수지 및 캅토™ 어드히어 수지
세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 거대다공성 수지 타입 I, 40 um (바이오라드(BioRad))는 반복 육방정 구조의 인산칼슘 (Ca5(PO4)3OH)2으로 구성된다. 2개의 별개 결합 부위인, 5개 칼슘 이온 이중항의 세트를 갖는 C-부위 및 포스페이트 삼중항을 함유하는 -OH의 쌍을 함유하는 P-부위가 존재한다. 이 수지는 혼합 모드 특성을 갖고, 응집체와 같은 도전적인 불순물을 분리하는 것으로 나타났다 (P. Gagnon, New Biotechnology 25(5):287 (2009)).
CHT 칼럼을 실행하기 위한 초기 조건을 확인하기 위해, 본 발명자들은 용리를 위해 6.5 - 8.0의 pH 범위 및 염화나트륨과 인산나트륨의 가변 농도를 시험하는 CHT 수지 타입 I, 40 um의 고처리량 로봇 스크리닝을 수행하였다. 이러한 고처리량 로봇 스크리닝은 이전에, 예를 들어 문헌 [Wensel et al., Biotechnol. Bioeng. 100:839 (2008)]에 기재되었다. 이들 스크리닝으로부터의 샘플을 총 CHOP ELISA에서 시험하였다.
캅토™ 어드히어 (지이 헬스케어)는 이온성 및 소수성 특성 둘 다를 나타내는 혼합 모드 수지이다. 염기 매트릭스는 강성 아가로스이고, 리간드는 N-벤질-N-메틸에탄올아민이다. 총 CHOP 및/또는 PLBL2를 감소시키는 이 수지의 능력은 먼저 고처리량 스크리닝 연구 및 이어서 후속 칼럼 조건으로 평가하였다.
캅토™ 어드히어 칼럼을 실행하기 위한 조건을 확인하기 위한 초기 연구는, 2개의 로드 밀도 (5 g/L 수지 및 40 g/L 수지)에서 캅토™ 어드히어에 대한 항-IL13 MAb의 결합을 시험하기 위해 상기에 기재된 것과 유사한 고처리량 로봇 스크리닝 방법을 사용하여 수행하였다. 또한, 염 및 pH 범위를 25 mM - 200 mM 아세트산나트륨 및 pH 4.0 - 6.5로부터 시험하였다. 로드 물질은 총 CHOP ELISA에 의한 LOQ에서 총 CHOP 대략 200 ppm을 함유한 초기 방법 UFDF 풀이었다. 캅토™ 어드히어 상에 결합되지 않은 (관통하는) 샘플을 총 CHOP ELISA를 사용하여 희석 및 검정하였다.
결과는 하기와 같았다. CHT 크로마토그래피의 경우, 어떠한 시험 조건도 총 CHOP 또는 PLBL2를 실질적으로 감소시키지 않았거나 또는 검정 희석-의존성 거동에 영향을 미치지 않았다. 추가로, 수율은 불량하였고, 어떠한 고분자량 종의 클리어런스도 달성되지 않았다. 캅토™ 어드히어 크로마토그래피의 경우, 수율은 불량하였고, 검정된 물질은 총 CHOP ELISA에서 실질적인 희석-의존성 거동을 나타냈다. 따라서, CHT 및 캅토™ 어드히어 수지의 용도는 추가로 연구하지 않았는데, 본 발명자들은 이 항-IL13 MAb 산물에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적일 이들 수지를 사용하는 조건을 발견할 가능성이 없다는 것이 분명하였기 때문이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 수지 및 막
본 발명자들은 사토바인드로 지칭되며 사토리우스(Sartorius)에 의해 제조된 HIC 막 흡착제를 초기에 시험하였다. 사토바인드는 재생된 셀룰로스 및 공유 연결된 소수성 페닐 리간드 기의 염기 매트릭스로 만들어진다.
시험된 막은 사토바인드 HIC 3 mL 장치 (8mm 층 높이)였다. 본 발명자들은 초기 방법 포로스® HS 풀에서부터 0.55M 인산칼륨 (pH 7.0)으로 풀을 조정하였고, 10 mL/min의 유량을 사용하였다. 산물은 0.55M 인산칼륨 (pH 7.0) 중에 용리되었다 (3 mL 분획 중 미결합 분획으로 수집되었다).
본 발명자들은 항-IL13 MAb가 0.55M 인산칼륨으로 컨디셔닝 시에 흐리고 혼탁해지고, 추가의 0.2 um 여과 단계가 요구된다는 것을 관찰하였다. 결과는 총 CHOP의 감소를 나타냈지만, 남아있는 CHOP는 여전히 총 CHOP ELISA에서 희석 의존성 거동을 입증하였다. 이 막의 용도는 추가로 평가하지 않았는데, 이 산물에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적인 조건을 확인할 가능성이 없는 것처럼 보였기 때문이다.
다음에, 본 발명자들은 여러 상이한 HIC 수지를 평가하기 위해 고처리량 스크린을 사용하였다. 옥틸-세파로스® 패스트 플로우 (FF), 부틸-세파로스® 4 패스트 플로우, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 및 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (저 치환)를 지이 헬스케어로부터 수득하였다. 이들 4종의 수지는 폭넓은 범위의 가변 소수친수성을 나타내기 때문에 선택하였다 (옥틸-세파로스® 패스트 플로우는 가장 적은 소수성을 나타내고, 그 다음이 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (저 치환) 및 부틸-세파로스® 4 패스트 플로우이고, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)가 가장 많은 소수성을 나타낸다. 본 발명자들은 pH 및 염 농도의 여러 조합을 항-IL13 MAb 제제에서 PLBL2를 감소시키는데 있어서의 그의 효과에 대해 시험하였다. HIC 수지 실험을 위해 사용된 항-IL13 MAb 제제는 초기 방법을 사용한 실행으로부터의 UFDF 풀이었다. 항-IL13 MAb 농도는 180 mg/mL였고, 로드 밀도는 40 mg 항체/mL 수지였다. 본 발명자들은 pH 5.5 (25 mM 아세트산나트륨), pH 6.0 (25 mM MES), pH 7.0 (25 mM MOPS) 및 pH 8.0 (25 mM 트리스), 및 0 mM 내지 400 mM의 황산나트륨 농도를 시험하였다. 시험된 각각의 조건에 대해, 관통 샘플을 수집하고, 총 CHOP ELISA 검정을 사용하여 희석 및 시험하였다.
결과는 도 3A-D에 보여진다. 염을 증가시키는 경우, 본 발명자들은 각각의 수지에 대해 관통물 중 보다 적은 총 CHOP를 관찰하였다. 옥틸-세파로스® 패스트 플로우 수지 (도 3A)는 최고 수준의 총 CHOP를 나타낸 반면에, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지는 심지어 보다 적은 양의 염으로도 총 CHOP를 매우 낮은 수준으로 감소시켰고 (도 3D), 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (저 치환) 및 부틸-세파로스® 패스트 플로우 수지는 중간 수준의 총 CHOP를 나타냈다. 흥미롭게도, 저 염 조건에서는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) (도 3D)를 제외하고 각각의 수지를 사용한 CHOP 제거에 대해 pH가 최소의 효과를 나타냈다. 이 수지의 경우, 저 염 조건에서, 보다 높은 pH는 관통 분획 중 보다 높은 CHOP를 유발하였다 (도 3D). 이들 결과를 기초로, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)가 유망한 것처럼 보였고, 이를 결합-용리 모드 또는 관통 모드로의 칼럼 실행을 포함하는 추가의 연구를 위해 선택하였다.
페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 사용하여 결합-용리 모드로 HIC를 작동시키는 것은 수지에 대한 항체의 결합을 가능하게 하기 위해 염에 의한 항-IL13 MAb 로드의 컨디셔닝을 요구하였다. 염을 증가시키는 것은 수지에 산물을 로딩하기 위한 동적 결합 능력 (mg 항-IL13/mL 수지)을 증가시켰다. 그러나 본 발명자들은 산물 중 염 농도 증가로, 특히 보다 낮은 pH와 조합으로, 고분자량 종 (HMW)의 증가된 탁도 및 형성을 관찰하였다.
상기에 언급된 바와 같이, 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)는 또한 관통 모드로 작동될 수 있고, 이러한 작동은 로드의 보다 적은 염 컨디셔닝을 요구할 것이다. 산물 품질 및 산물 안정성 관점에서, 예를 들어 보다 적은 탁도 및 보다 적은 HMW를 갖는 산물은, 보다 적은 염 컨디셔닝이 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 관통 모드로 사용하는 방법 최적화를 계속 진행하였다.
방법을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 수지 상의 로드 농도, 로드 pH, 로드 염 몰농도, 로드 밀도, 층 높이, 유량, 온도, 평형 완충제 pH 및 몰농도를 비롯한, HIC 칼럼을 실행하기 위한 다수의 파라미터를 조사하였다. 이들 실험을 위해, 본 발명자들은 총 CHOP ELISA를 사용하여 총 CHOP를, 또한 LC-MS/MS에 의해 PLBL2를 모니터링하였다. 특정의 예시적인 데이터가 표 5에 제시되어 있다. 표 5의 데이터는 나타낸 조건 하에서 관통 모드로 실행된 HIC 칼럼이 PLBL2 수준을 단백질 A 풀에서 검출된 높은 수준으로부터 실질적으로 감소시키는데 효과적었음을 제시한다. HIC 후에 PLBL2 수준은 단백질 A 풀에서의 수준과 비교하여 수백배만큼 감소하였다.
<표 5> 가변 HIC 칼럼 조건 하에서 총 CHOP 및 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00006
방법 파라미터 선택을 안내하기 위한 PLBL2 LC-MS/MS 검정 및 다른 전형적 산물 품질 검정 (예를 들어, SE-HPLC, CE-SDS, iCIEF)을 사용하여, 본 발명자들은 산물 품질 속성 및 PLBL2의 감소에 의해 평가된 바와 같이 HIC 칼럼의 실행에 바람직한 하기 조건을 확인하였다: 평형 및 세척 완충제: 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0); 표적 로드 밀도: 100 g/L, 유량: 150 cm/hr, 22℃ ± 3℃. 이들 조건의 특정의 적은 변화, 예를 들어 25℃ ± 3℃ 또는 27℃ ± 3℃가 또한 바람직할 수 있다. 광학 밀도 (OD)는 280 nm에서의 흡광도 (A280)에 의해 모니터링하고, 풀 (즉, 관통물)은 0.5 OD 내지 1.5 OD에서 또는 8 칼럼 부피의 세척 후에 수집하였다.
상기에 언급된 바와 같이, 초기 방법은 다음과 같앗다: 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어™)에 이어서 양이온 교환 (포로스® HS)에 이어서 음이온 교환 (Q 세파로스™ 패스트 플로우). 상기에 기재된 바와 같이 PLBL2 수준을 감소시키는 방법을 개발한 후에, 본 발명자들은 다음으로 방법 변화를 편리한 방식으로 실시하고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 초기 방법에 HIC 칼럼을 첨가하여 4-칼럼 방법을 생성하는 것뿐만 아니라 CEX 칼럼 또는 AEX 칼럼을 HIC 칼럼으로 치환하는 것을 연구하였고, 최종적으로 본 발명자들은 칼럼의 순서를 연구하였다. 본 발명자들은 3-칼럼 방법인 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어™)에 이어서 음이온 교환 (Q 세파로스™ 패스트 플로우)에 이어서 관통 모드로 작동하는 HIC (페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환))가 가장 편리한 방법을 제공하고 최종 약물 물질에서 PLBL2를 감소시키기는데 가장 효과적이었다는 것을 발견하였다. 이 3-칼럼 방법은 하기에 상세하게 기재된다.
제1 친화성 크로마토그래피 단계는 맙셀렉트 슈어™ 수지를 사용하는 결합-및-용리 방법이었다. 칼럼 평형 (25 mM 염화나트륨, 25 mM 트리스 pH 7.7) 후에, HCCF를 칼럼 상에 로딩하고 평형 완충제 및 고 염 pH 7.0 세척 완충제로 세척하였다. 항-IL13 MAb를 산성 조건 (pH 2.8) 하에서 칼럼으로부터 용리시켰다.
제2 음이온-교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스™ 패스트 플로우 (QSFF) 수지를 사용하여 결합-및-용리 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (50 mM 트리스, pH 8.0) 후에, 맙셀렉트 슈어™ 칼럼으로부터의 항-IL13 풀을 pH 8.05로 조정하고, 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 세척하고 (50 mM 트리스, pH 8.0), 항-IL13 MAb를 85 mM 염화나트륨, 50 mM 트리스 pH 8.0 하에 칼럼으로부터 용리시켰다.
제3 및 최종 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 사용하여 관통 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (50 mM 아세트산나트륨 pH 5.0) 후에, QSFF 칼럼으로부터의 항-IL13 풀을 pH 5.0으로 조정하고, 칼럼 상에 로딩하였다. 항-IL13 MAb는 관통하였고, 칼럼을 또한 평형 완충제 (50 mM 아세트산나트륨 pH 5.0)로 세척하였다. 항-IL13 MAb 풀은 A280을 기초로 개시 및 종결하였으며, 이때 풀링은 0.5 내지 1.5 OD 또는 최대 8 칼럼 부피로 일어났다.
초기 방법에서와 같이, 추가의 바이러스 불활성화 및 여과 단계를 포함시키고, 최종 한외여과-투석여과 (UFDF) 단계를 포함시켰다. 최종 산물 (약물 물질)을 20 mM 히스티딘 아세테이트, 6% 수크로스, 0.03% 폴리소르베이트 20, pH 5.7 중 125 mg/mL의 농도로 제제화하였다.
총 CHOP 및 PLBL2에 관하여 개선된 방법에 대한 초기 방법의 비교는, 각각 총 CHOP ELISA 및 모노클로날 PLBL2 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 표 6 (초기 방법) 및 표 7 (개선된 방법)에 제공된다. 표 6의 데이터는 초기 방법이 높은 수준의 총 CHOP (3개의 상이한 실행에서 179, 310 및 189 ng/mg) 및 높은 수준의 PLBL2 (3개의 상이한 실행에서 242, 328 및 273 ng/mg)를 함유하는 정제된 산물 (UFDF 풀)을 생성하였다는 것을 분명히 제시한 반면에, 표 7의 데이터는 개선된 방법이 실질적으로 감소된 수준의 총 CHOP (4개의 상이한 실행에서 1.1, < 0.9, 2.8 및 3.4 ng/mg) 및 실질적으로 감소된 수준의 PLBL2 (4개의 상이한 실행에서 0.21, 0.42, 0.35 및 0.24 ng/mg)를 갖는 정제된 산물을 생산하는데 꽤 효과적이었음을 분명히 제시한다. 상기에 제공된 데이터와 일치하게, 표 7의 데이터는 상기에 기재된 조건 하에서 실행된 HIC 칼럼이 항-IL13 MAb 제제에서 총 CHOP 및 PLBL2 수준을 감소시키는데 특히 효과적이었음을 제시한다.
<표 6> 초기 방법을 사용하는 항-IL13 MAb의 다양한 정제 단계에서의 총 CHOP 및 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00007
<표 7> 개선된 방법을 사용하는 항-IL13 MAb의 다양한 정제 단계에서의 총 CHOP 및 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00008
요약하면, 정제된 항-IL13 MAb 제제에서 높은 수준의 단일 CHOP 종에 기인한 검정 비-선형 희석 거동의 문제에 직면하면서, 본 발명자들은 처음으로, CHO 세포로부터 생산된 재조합 단백질 제제에서 이전에 기재되지 않았던 불순물인 햄스터 PLBL2로서 CHOP 종을 확인하였다. 본 발명자들은 다음으로, 항-IL13 MAb 제제에서 PLBL2의 수준을 효과적으로 감소시키기 위한 정제 조건을 확인하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 이들 정제 조건을 전체 정제 방법에 통합시켜 선행 항-IL13 MAb 정제 방법에 대한 개선을 가져왔다. 이 개선된 방법은 PLBL2 수준을 감소시키기 위한 관통 모드의 HIC 칼럼 실행을 친화성 크로마토그래피 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 조합하여 사용한다. 본 발명자들은 개선된 방법이 항-IL13 MAb 제제에서 햄스터 PLBL2 수준을 실질적으로 감소시키는데 강건하고 효과적이라는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 개선된 방법이 초기 방법과 비교하여 대략 1000배로 PLBL2 수준을 재현가능하게 감소시켰다는 것을 보여주었다. PLBL2 수준의 이러한 감소는 후기 임상 시험 및 그 이후의 환자에서 치료 용도에 적합한 정제된 항-IL13 MAb 산물을 생산하는데 중요하였다.
항-A베타 항체 제제에서 햄스터 PLBL2를 감소시키기 위한 정제 방법
본 발명자들은 다음으로 상기에 기재된 정제 방법, 특히 최종 크로마토그래피 단계를 위한 HIC 칼럼의 사용이 유사하게 다른 항체 제제에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적일지의 여부를 평가하고자 하였다. 이 실험을 위해, 본 발명자들은 CHO 세포에서 생산된 항-A베타 항체를 선택하였다. 예시적인 항-A베타 항체 및 이러한 항체를 생산하는 방법은 이전에, 예를 들어 WO2008011348, WO2007068429, WO2001062801 및 WO2004071408에 기재되었다. 이들 특정한 실험은 크레네주맙으로 공지된 항-A베타 항체를 사용하였다. 항-IL13 MAb에 대해 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 단백질 A 친화성 칼럼 후에 제2 칼럼을 위한 다양한 수지 및 완충제를 연구하였고, 본 발명자들은 산물 품질 및 안정성 속성뿐만 아니라 햄스터 PLBL2의 제거를 위해 항-A베타에 대해 최적인 것을 확인하기 위해 HIC 칼럼에 대한 다양한 완충제 및 실행 조건을 연구하였다.
본 발명자들은 3-칼럼 방법인 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어™)에 이어서 혼합 모드 수지 (캅토™ 어드히어)의 사용에 이어서 관통 모드로 작동된 HIC (페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환))가 최종 약물 물질에서 PLBL2를 감소시키는데 편리하고 효과적이라는 것을 발견하였다. 이 3-칼럼 방법은 하기에 상세하게 기재된다.
제1 친화성 크로마토그래피 단계는 항-IL13 MAb에 대해 상기에 기재된 것과 유사하게 맙셀렉트 슈어™ 수지를 사용하는 결합-및-용리 방법이었다.
제2 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 캅토™ 어드히어 수지를 사용하여 관통 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (20 mM MES, 150 mM 아세트산나트륨, pH 6.25) 후에, 맙셀렉트 슈어™ 칼럼으로부터의 항-A베타 풀을 pH 6.25로 조정하고, 칼럼 상에 로딩하였다. 풀링은 로드 상 동안 0.5 OD에서 시작하였다. 로드를 완료한 후에, 칼럼을 5 칼럼 부피 (CV)의 평형 완충제 (20 mM MES, 150 mM 아세트산나트륨, pH 6.25)로 세척하고, 전체 5 CV를 또한 수집하였다.
제3 및 최종 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 사용하여 관통 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0) 후에, 캅토™ 어드히어 칼럼으로부터의 항-A베타 풀을 pH 5.0으로 조정하고, 칼럼 상에 로딩하였다. 항-A베타 MAb는 관통하였고, 칼럼을 또한 평형 완충제 (150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0)로 세척하였다. 항-A베타 MAb 풀은 A280을 기초로 로드 상 동안 개시하였으며, 이때 풀링은 0.5 OD에서 시작하였다. 칼럼을 10 CV의 평형 완충제 (150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0)로 세척하고, 전체 10 CV를 또한 수집하였다. 항-IL13 MAb에서와 같이, 추가의 바이러스 불활성화 및 여과 단계를 포함시키고, 최종 한외여과-투석여과 (UFDF) 단계를 포함시켰다.
4개의 상이한 정제 실행 동안 상기 방법을 사용한 결과는 하기 표 8에 제시된다.
<표 8> HIC를 사용하는 항-A베타 MAb의 다양한 정제 단계에서의 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00009
표 8에 제시된 결과는 최종 크로마토그래피 단계로서의 HIC 수지의 사용이 항-A베타 MAb 제제에서 잔류 PLBL2 수준을, 항-IL13 MAb 제제에서 보인 것과 유사한 양으로 효과적으로 감소시켰다는 것을 입증한다. 300 g/L의 로드 밀도가 산물 회수율 및 PLBL2의 감소 둘 다의 관점에서 바람직한 결과를 낳았지만, 잔류 PLBL2의 추가의 감소는 HIC 칼럼에 대한 로드 밀도를 300 g/L에서 100 g/L로 감소시킴으로써 관찰되었다.
본 발명자들은 또한 HIC 크로마토그래피 단계에 대한 2개의 다른 조건인 로드 pH 및 로드 술페이트 몰농도를 조사하였다. 이들 실험을 위해, 본 발명자들은 51 ng/mg PLBL2 (ELISA에 의해 측정 시), 15 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)을 함유하는 캅토™ 어드히어 풀로 시작하였다. 본 발명자들은 로드 pH 및 로드 술페이트 몰농도를 가변 pH에서 0 mM 황산나트륨 또는 800 mM 황산나트륨 원액을 사용하여 하기 표 9에 제시된 값으로 조정하였다. 본 발명자들은 저 술페이트 몰농도 조건 (0 mM) 및 고 술페이트 몰농도 조건 (240 mM) 하에서 표 9에 나타낸 각각의 로드 pH를 시험하였다. 각각의 조건을 60 g/L의 로드 밀도에서 시험하였다. 표 9에 제공된 결과에 의해 제시된 바와 같이, 로드 pH를 pH 4 또는 pH 5로 감소시키는 것 또는 로드 술페이트 몰농도를 (240 mM 술페이트로) 증가시키는 것은 최종 HIC 풀에서 PLBL2의 수준을 감소시키는데 각각 효과적이었다. 로드에서 pH 4.0 및 240 mM 술페이트의 조합은 HIC 풀에서 잔류 PLBL2의 양을 최소화하는데 특히 효과적이었다.
<표 9> 로드 pH 및 술페이트 몰농도의 일정 범위에 걸쳐 관찰된 HIC 풀에서의 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00010
따라서, CHO-생산된 폴리펩티드, 예컨대 본원에 기재된 항-IL13 MAb 및 항-A베타 MAb의 정제에서 최종 크로마토그래피 단계로서의 HIC 수지의 사용은 HIC 풀에서 햄스터 PLBL2의 잔류 양을 매우 낮은 수준으로, 예를 들어 1 ng/mg 이하로 효과적으로 감소시켰다.
IgG1 항체 제제에서 햄스터 PLBL2를 감소시키기 위한 정제 방법
다음으로, 본 발명자들은 항-IL13 및 항-A베타 IgG4 항체 제제에 대해 기재된 정제 방법, 특히 최종 크로마토그래피 단계를 위한 HIC 칼럼의 사용이 유사하게 IgG1 항체 제제에서 PLBL2 수준을 감소시키는데 효과적일지의 여부를 평가하였다. 이들 실험을 위해, 본 발명자들은 먼저 IgG1 항체이자 CHO 세포에서 생산된 항-IL17 A/F 항체를 선택하였다. 예시적인 항-IL17 A/F 항체 및 이러한 항체를 생산하는 방법은 이전에, 예를 들어 WO 2009136286 및 미국 특허 번호 8,715,669에 기재되었다. 항-IL13 및 항-A베타 MAb에 대해 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 산물 품질 및 안정성 속성뿐만 아니라 햄스터 PLBL2의 제거를 위해 항-IL17 A/F에 대해 최적인 것을 확인하기 위해 HIC 칼럼에 대한 다양한 수지 (특히, 페닐 세파로스™ FF [저 치환] 및 페닐 세파로스™ FF [고 치환]) 및 완충제 조건 (특히, 50 mM 아세트산나트륨, pH 5.5 및 50 mM 트리스, 85 mM 아세트산나트륨, pH 8.0)을 연구하였다.
본 발명자들은 3-칼럼 방법인 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어™)에 이어서 결합-및-용리 모드로 작동된 양이온 교환 크로마토그래피 (포로스® 50HS) 및 관통 모드로 작동된 HIC (페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환))가 최종 약물 물질에서 PLBL2를 감소시키는데 편리하고 효과적이라는 것을 발견하였다. 이 3-칼럼 방법은 하기에 상세하게 기재된다.
제1 친화성 크로마토그래피 단계는 항-IL13 및 항-A베타 MAb에 대해 상기에 기재된 것과 유사하게 맙셀렉트 슈어™ 수지를 사용하는 결합-및-용리 방법이었다. 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 포로스® 50HS 수지를 사용하였고, 결합-및-용리 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (40 mM 아세트산나트륨, pH 5.5) 후에, pH-조정된 항-IL17 A/F 맙셀렉트 슈어™ 풀 (pH 5.0)을 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 세척하고 (40 mM 아세트산나트륨, pH 5.5), 이어서 항-IL17 A/F 항체를 40 내지 400 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)에 의해 생성된 전도도 구배로 칼럼으로부터 용리시켰다. 풀링은 A280을 기반으로 하였고, 구배 용리 상 동안 ≥ 0.5 OD에서 개시하여 ≤ 2.0 OD에서 종료하였다.
제3 및 최종 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 사용하였고, 관통 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (50 mM 아세트산나트륨 pH 5.5) 후에, 포로스® 50HS 칼럼으로부터의 항-IL17 A/F 풀을 pH 조정 없이 칼럼 상에 직접 로딩하였다. 항-IL17 A/F MAb는 관통하였다. 항-IL17 A/F MAb 풀링은 A280을 기반으로 하였고, 로드 상 동안 ≥ 0.5 OD에서 개시하였다. 칼럼은 10 CV의 평형 완충제 (50 mM 아세트산나트륨, pH 5.5)로 세척하고, 풀링은 이 세척 상 동안 ≤ 1.0 OD에서 종료하였다.
하나의 정제 실행 동안 상기 방법을 사용한 결과는 하기 표 10에 제시된다.
<표 10> HIC를 사용하는 항-IL17 A/F MAb의 다양한 정제 단계에서의 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00011
표 10에 제시된 결과는 최종 크로마토그래피 단계로서의 HIC 수지의 사용이 항-IL17 A/F MAb (IgG1) 제제에서 잔류 PLBL2 수준을, 항-IL13 및 항-A베타 MAb (IgG4)에서 보인 것과 유사한 양으로 효과적으로 감소시켰다는 것을 입증한다.
항-CMV 항체
항-IL17 A/F를 시험하는 것에 추가로, 본 발명자들은 CHO 세포에서 또한 생산되는 또 다른 IgG1 MAb인 항-CMV-MSL 항체를 시험하였다. 항-CMV-MSL을 비롯한 예시적인 항-CMV 항체 및 이러한 항체를 생산하는 방법은 이전에, 예를 들어 WO 2012047732에 기재되었다.
다시, 본 발명자들은 3-칼럼 방법인 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어™)에 이어서 결합-및-용리 모드로 작동된 양이온 교환 크로마토그래피 (포로스® 50HS) 및 관통 모드로 작동된 HIC (페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환))가 최종 약물 물질에서 PLBL2를 감소시키는데 편리하고 효과적이었다는 것을 발견하였다. 이 3-칼럼 방법은 하기에 상세하게 기재된다.
제1 친화성 크로마토그래피 단계는 항-IL13, 항-A베타 및 항-IL17 A/F MAb에 대해 상기에 기재된 것과 유사하게 맙셀렉트 슈어™ 수지를 사용하는 결합-및-용리 방법이었다. 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 포로스® 50HS 수지를 사용하였고, 결합-및-용리 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (40 mM 아세트산나트륨, pH 5.5) 후에, pH-조정된 aCMV-MSL 맙셀렉트 슈어™ 풀 (pH 5.0)을 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 세척하고 (40 mM 아세트산나트륨, pH 5.5), 이어서 aCMV-MSL 항체를 40 내지 400 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)에 의해 생성된 전도도 구배로 칼럼으로부터 용리시켰다. 풀링은 A280을 기반으로 하였고, 구배 용리 상 동안 ≥ 0.5 OD에서 개시하여 ≤ 1.0 OD에서 종료하였다.
이 특정한 실행에서, 바이러스 여과 단계는 바이러스 필터로서 바이어솔브 프로(Viresolve Pro) 및 프리-필터로서 플루오로다인(Fluorodyne) UEDF 필터를 사용하여 양이온 교환과 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 사이에서 수행하였다.
제3 및 최종 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 사용하였고, 관통 모드로 작동시켰다. 칼럼 평형 (50 mM 아세트산나트륨 pH 5.5) 후에, 포로스® 50HS 칼럼으로부터의 항-CMV-MSL 풀을 pH 조정 없이 칼럼 상에 직접 로딩하였다. 항-CMV-MSL MAb는 관통하였다. 항-CMV-MSL MAb 풀링은 A280을 기반으로 하였고, 로드 상 동안 ≥ 0.5 OD에서 개시하였다. 칼럼은 10 CV의 평형 완충제 (50 mM 아세트산나트륨, pH 5.5)로 세척하고, 풀링은 이 세척 상 동안 ≤ 0.5 OD에서 종료하였다.
하나의 정제 실행 동안 상기 방법을 사용한 결과는 하기 표 11에 제시된다.
<표 11> HIC를 사용하는 항-CMV-MSL MAb의 다양한 정제 단계에서의 PLBL2 수준
Figure 112016034000941-pct00012
표 11에 제시된 결과는 최종 크로마토그래피 단계로서의 HIC 수지의 사용이 항-CMV-MSL MAb 제제에서 잔류 PLBL2 수준을, 항-IL13, 항-A베타 및 항-IL17 A/F MAb에서 보인 것과 유사한 양으로 효과적으로 감소시켰다는 것을 입증한다. 따라서, CHO-생산된 폴리펩티드, 예컨대 본원에 기재된 항-IL13 MAb 및 다른 MAb의 정제에서 최종 크로마토그래피 단계로서의 HIC 수지의 사용은, HIC 풀에서 햄스터 PLBL2의 잔류 양을 매우 낮은 수준으로, 예를 들어 1 ng/mg 미만으로 효과적으로 감소시켰다. 따라서, 본 발명자들은 PLBL2 수준을 감소시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 HIC 크로마토그래피 단계의 사용이 IgG4 MAb에 대해서 만큼이나 IgG1 MAb에 대해서도 효과적이었다는 것을 제시하였으며, 이는 재조합 폴리펩티드 제제에서 햄스터 PLBL2 수준을 감소시키기 위한 이 방법의 일반적 적용가능성을 설명해준다.
실시예 3 - 가변 양의 햄스터 PLBL2를 함유하는 항-IL13 MAb 조성물을 투여한 환자에서의 인간 항-햄스터 PLBL2 반응의 평가
CHO PLBL2 불순물의 잠재적 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 항-IL13 MAb인 레브리키주맙을 받은 인간 대상체에서 햄스터 PLBL2에 대한 항체를 검출하기 위한 ELISA 검정 (가교 ELISA 검정)을 개발하였다. 레브리키주맙의 다양한 임상 연구에 참여한 환자로부터의 혈청 샘플을 투여전 및 투여후뿐만 아니라 위약을 받은 대상체에서 항-햄스터 PLBL2 항체의 증거에 대해 분석하였다. 임상 연구의 세부내용은 이전에 기재되었고 (WO 2012/083132, 문헌 [Corren et al., N Engl J Med 365:1088-98 (2011)]), 이들 연구 중 가장 관련있는 세부내용만을 하기에 제공한다.
인간 혈청에서 햄스터 PLBL2에 대한 항체를 검출하기 위해 개발 및 검증된 항체 가교 ELISA 검정은 햄스터 PLBL2에 대해 지시된 항체의 모든 이소형을 포획하기 위한 2종의 접합 시약을 사용하였다: 비오틴에 접합된 정제된 햄스터 PLBL2 (비오틴-PLBL2) 및 디곡시게닌에 접합된 정제된 햄스터 PLBL2 (DIG-PLBL2). 햄스터 PLBL2의 생산 및 정제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행하였고, 이는 또한 미국 가출원 번호 61/877,503 및 61/991,228에 기재되어 있으며, 비오틴 또는 DIG에 대한 접합은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 이 반-균질 항체 가교 ELISA 검정에서, 각각 3 μg/mL의 비오틴-PLBL2 및 DIG-PLBL2를 함유하는 검정 희석제 (PBS/0.5% BSA/0.05% 폴리소르베이트 20/0.05% 프로클린 300, pH 7.4 ± 0.1) 중 접합 용액 75 μL/웰을, 폴리프로필렌 마이크로닉 튜브 (내셔널 사이언티픽 서플라이 캄파니(National Scientific Supply Co.); 캘리포니아주 클레어몬트) 내 검정 희석제 중 1:20 희석된 혈청 샘플 및 대조군 75 μL/웰과 함께 주위 온도에서 밤새 (16-24시간) 공동-인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 마이크로닉 튜브로부터의 혼합물 100 μL/웰을 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 마이크로플레이트 (스트렙타웰™ 하이 바인드(StreptaWell™ High Bind); 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics); 인디애나주 인디애나폴리스)로 옮기고, 이를 자동 플레이트 세척기 (바이오테크(BioTek) ELx405)에서 세척 완충제 (PBS/0.05% 폴리소르베이트 20) 400 μL/웰로 3회 세척하고, 주위 온도에서 2시간±10분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 플레이트 세척기에서 세척 완충제 400 μL/웰로 4회 세척하고, 이 후에 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 400 ng/mL 마우스 항-디곡신 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 카탈로그 200-032-156) 100 μL/웰을 첨가하고, 검출을 위해 주위 온도에서 2시간±10분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 플레이트 세척기에서 세척 완충제 400 μL/웰로 4회 세척한 후에, 퍼옥시다제 기질 (테트라메틸 벤지딘) (0.4 g/L TMB) 및 퍼옥시다제 용액 B (0.02% 과산화수소) (KPL 카탈로그 50-76-03)의 동등 혼합물 용액 100 μL/웰을 첨가하고, 색 발현을 위해 주위 온도에서 18-28분 동안 인큐베이션하고, 1 M 인산 100 μL/웰을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 플레이트를 검출 흡광도에 대해 450 nm에서 및 참조 흡광도에 대해 630 nm에서 판독하였다. 검정에 대한 양성 대조군은 인간 IgG1 프레임워크 상의 뮤린 항-햄스터 PLBL2-특이적 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어진 모노클로날 항체 구축물이었다. 이 항체를 사용하는 검정의 상대 감도는 25 ng/mL인 것으로 결정하였다. 이 항체를 사용하는 검정 약물 내성 실험은 혈청 중 최대 50 μg/mL의 레브리키주맙 또는 1 μg/mL의 햄스터 PLBL2가 이 검정에서 간섭 또는 교차-반응성을 야기하지 않았음을 입증하였다.
검정을 수행하기 위해, 혈청 샘플을 먼저 1/20의 최소 희석으로 검정에서 스크리닝하였다. 이어서, 양성으로 스크리닝된 샘플을 경쟁 확증적 검정을 사용하여 햄스터 PLBL2 특이성에 대해 확인하였다. 샘플이 양성으로 확인되면, 역가 값을 획득하기 위해 연속 희석하였다. 양성 반응을 역가 단위로 보고하였는데, 이는 샘플 신호가 검정 컷포인트의 신호 (확실성을 결정하기 위한 역치)와 동일한 희석 배율의 log10이다.
환자 샘플을 상기에 기재된 항-햄스터 PLBL2 ELISA를 사용하여 분석한 4개의 임상 연구는 간략하게 하기와 같이 기재된다. 단계 1은 흡입 코르티코스테로이드 (ICS)를 사용한 만성 요법 동안 부적절하게 제어된 질환인 천식을 가진 환자에서 레브리키주맙의 효과를 평가하기 위한 II상 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 개념-증명 연구였다. 총 219명의 환자를 무작위화하였으며, 이때 106명은 적어도 1회 250 mg 피하 (SC) 용량의 레브리키주맙을 받았고, 92명은 6개월마다 용량을 받았다.
연구 2는 ICS 요법 중이지 않은 천식을 가진 환자에서의 II상 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 용량-범위설정 연구였다. 환자는 레브리키주맙 또는 위약을 3가지 용량 (500, 250 또는 125 mg) 중 하나로 SC 투여를 통해 받았다. 연구 약물을 12주 치료 기간 동안 4회 투여하였다. 총 158명의 환자는 적어도 1회 용량의 레브리키주맙에 노출되었고, 145명의 환자는 모든 4회 용량을 받았다.
연구 3은 건강한 일본 및 백인 지원자에서의 레브리키주맙의 I상 PK 연구였다. 20명의 건강한 일본 및 백인 대상체 (각 인종 군에 10명의 대상체)의 3개의 별개 코호트를 레브리키주맙 (125, 250 및 375 mg SC)과 위약 사이에 7:3 비로 무작위화하였다. 대상체에게 제1일에 1회 투약하고, 이후에 120일 동안 모니터링하였다. 총 42명의 대상체 각각은 1회 용량의 레브리키주맙을 받았다.
연구 1-3에서, 총 306명의 대상체가 있었으며, 그 중 264명은 천식 환자이고, 각각 적어도 1회 용량의 햄스터 PLBL2 함유 물질을 받았다. 햄스터 PLBL2에 대한 노출은 받은 레브리키주맙의 용량에 따라 가변적이었다.
연구 4는 ICS 및 제2 제어제 의약을 사용한 비제어된 천식을 가진 환자에서 레브리키주맙의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 IIb상 무작위화, 이중-맹검, 위약-대조 연구였다. 환자는 레브리키주맙 또는 위약을 3가지 용량 (250, 125 또는 37.5 mg) 중 하나로 SC 투여를 통해 매월 받았다. 연구 4에서, 총 463명의 환자를 무작위화하였으며, 이때 347명은 적어도 1회 용량의 레브리키주맙을 받았다. 햄스터 PLBL2에 대한 노출은 받은 레브리키주맙의 용량에 따라 가변적이었다.
하기 표 12 는 대상체가 노출된 햄스터 PLBL2 수준의 범위 및 레브리키주맙의 용량을 보여주는 연구 1-4 각각의 요약을 제공한다.
<표 12> 레브리키주맙 임상 시험에서의 햄스터 PLBL2 노출
Figure 112016034000941-pct00013
a4개의 상이한 로트의 임상 물질로부터의 범위.
연구 1로부터의 선택 시점의 후향적 분석은 햄스터 PLBL2에 대한 항체를 검출하기 위해 상기에 기재된 항-햄스터 PLBL2 항체 검정을 사용하여 수행하였다. 위약 및 투약 대상체 둘 다로부터의 샘플을 분석하여, 레브리키주맙 투약에 대한 기존 반응의 수준을 결정하는 것뿐만 아니라 그에 반응한 항체의 발생을 결정하였다. 113명의 위약 대상체 및 적어도 1회 용량의 레브리키주맙을 받은 106명의 투약 대상체가 있었다. 분석을 위해 선택된 시점은 제0일, 제29일, 제85일, 제141일, 제225일 및 조기 종결이었다. 샘플은 다음 투여 전에 취하며; 따라서, 제29일 샘플은 제2 용량의 투여 전에 취하였다. 각 시점에서의 항-햄스터 PLBL2 항체-양성 대상체의 백분율은 각 시점에서의 양성 대상체의 수를 취하고 각 시점에서 시험된 대상체의 총수로 나누어 계산하였다. 데이터는 표 13에 제시된다.
<표 13> 연구 1에 대한 항-햄스터 PLBL2 항체 결과
Figure 112016034000941-pct00014
a 연구 약물을 조기 중단한 8명의 레브리키주맙 대상체 중, 단지 3명만이 연구 약물 중단에 대한 이유로서 유해 사례를 보고하였다.
제0일에 투여전 양성인 6명의 연구 1 위약 대상체는 연구 전반에 걸쳐 계속 양성이었다. 이들 대상체로부터의 샘플은 확증적 경쟁 검정에서 양성으로서 확인되었고, 제0일 역가가 1.6 내지 2.9 역가 단위의 범위였다. 후속 방문에서 수득된 역가는 제0일에 수득된 것과 유사하였다. 소수의 추가의 위약 대상체는 연구 동안 낮은 수준의 양성 반응을 나타냈다.
레브리키주맙을 받은 연구 1 대상체 중에서, 98% (104명/106명)는 투약 후에 양성 항체 반응을 나타냈고, 연구의 종료시까지 내내 양성으로 남아있었으며, 이때 대부분의 대상체는 적어도 2회 용량의 레브리키주맙을 받은 후에 양성이 되었다. 투약 후 역가는 1.35 내지 4.76 역가 단위의 범위였으며, 이때 역가는 일반적으로 시간이 지나면서 증가하였다. 항-햄스터 PLBL2 항체의 발생의 임상 유의성은 공지되어 있지 않다. 어떠한 임상적으로 중요한 안전성 신호도 이 연구에서 확인되지 않았고, 햄스터 PLBL2에 대한 항체의 높은 발생률 하에 안전성 사례와의 어떠한 상관관계도 만들어질 수 없었다.
중간 분석은 또한 연구 4에서 수집된 샘플에 대해 수행하였다. 위약 및 투약 대상체 둘 다로부터의 샘플을 분석하여, 레브리키주맙 투약에 대한 기존 반응의 수준을 결정하는 것뿐만 아니라 그에 반응한 항-햄스터 PLBL2 항체의 발생을 결정하였다. 116명의 위약 대상체 및 적어도 1회 용량의 레브리키주맙을 받은 347명의 투약 대상체가 있었다. 92명의 위약 대상체 및 268명의 투약 대상체로부터의 샘플이 이 데이터 세트에 나타난다. 결과는 표 14에 제시된다.
<표 14> 이전에 레브리키주맙에 노출되지 않은 대상체에서의 연구 4에 대한 항-햄스터 PLBL2 항체 결과
Figure 112016034000941-pct00015
a 연구 약물을 조기 중단한 12명의 레브리키주맙 대상체 중, 단지 4명만이 연구 약물 중단에 대한 이유로서 유해 사례를 보고하였다.
제0일에 투여전 양성인 4명의 연구 4 위약 대상체는 검정 검출 한계의 바로 위인 낮은 수준의 양성 반응을 나타냈다. 낮은 수준의 반응은 후속 시점에 일부에서 검출가능하였지만 전부에서는 아니었다.
제0일에 투여전 양성인, 레브리키주맙을 받은 15명의 연구 4 대상체는 후속 시점에 계속 양성이었으며, 다중 투여 후에 역가는 증가하였다. 추가로, 이전에 연구 1에서 레브리키주맙을 받은 10명의 대상체가 연구 4에 있었다. 이들 대상체 중 9명에게는 이후에 연구 4에서 레브리키주맙을 재-투약하였으며 1명의 대상체는 위약을 받았다. 모든 10명의 대상체는 연구 4 동안 제0일에 투여전 양성이었고, 후속 시점에 계속 양성이었다. 이들 10명의 대상체로부터의 데이터는 그들의 이전 레브리키주맙 노출로 인해 표 14에서 제외되었다.
레브리키주맙을 받은 연구 4 대상체 중에서, 투여 군 사이의 양성 비율에 차이가 있는 것처럼 보인다. 그러나, 이들 데이터가 불완전하므로, 이들 차이의 유의성에 관한 결론은 이 시점에 만들어질 수 없다. 연구 1로부터의 데이터와 유사하게, 대상체의 대부분은 적어도 2회 용량의 레브리키주맙을 받은 후에 양성이 된다. 투약 후 역가는 1.68 내지 4.55 역가 단위의 범위였으며, 이때 역가는 일반적으로 시간이 지나면서 증가하였다. 이것은 불완전한 데이터 세트이기 때문에, 양성 백분율 및 역가 범위는 추가의 데이터가 축적됨에 따라 변화할 수 있다.
연구 4의 중간 안전성 평가는 아나필락시스 또는 심각한 과민 반응의 보고 부재를 비롯한 임상적으로 유의한 안전성 신호가 없는 조기 완료된 연구와 유사한 안전성 프로파일을 제시하였다. 주목할 만하게, 연구 1에서 레브리키주맙을 받고 이후에 연구 4에서 레브리키주맙을 재-투약한 9명의 환자 중 6명은 중간 분석 시에 어떠한 유해 사례도 보고하지 않았으며, 단지 1명의 환자만이 임의의 국부 주사-부위 반응을 보고하였다. 이 항-햄스터 PLBL2 항체 반응의 어떠한 임상 후유증도 지금까지 임상 시험에서 확인되지 않았다.
본 발명자들은 또한 연구 2로부터의 125-mg 용량 군에 대한 평가를 수행하였고, 그 결과는 표 15에 제시된다.
<표 15> 연구 2에 대한 항-햄스터 PLBL2 항체 결과
Figure 112016034000941-pct00016
a 연구 약물을 조기 중단한 2명의 대상체 중, 둘 다 연구 약물 중단에 대한 이유로서 유해 사례를 보고하지 않았다.
제0일에 투여전 양성인 2명의 연구 2 대상체는 모든 후속 시점에 계속 양성이었으며, 다중 투여 후에 역가는 증가하였다. 125 mg의 레브리키주맙을 받은 연구 2 대상체 중에서, 87% (46명/53명)는 투약 후에 양성 항체 반응을 나타냈고, 연구의 종료시까지 내내 양성으로 남아있었으며, 이때 대부분의 대상체는 적어도 2회 용량의 레브리키주맙을 받은 후에 양성이 되었다. 투약 후 역가는 1.51 내지 4.09 역가 단위의 범위였으며, 이때 역가는 일반적으로 시간이 지나면서 증가하였다.
결론
CHO PLBL2 불순물의 잠재적 영향을 평가하기 위해, 유의한 수준의 햄스터 PLBL2를 함유한 레브리키주맙 제제를 받은 대상체에서 햄스터 PLBL2에 대한 항체를 검출하기 위한 검정을 개발하였다. 연구 1로부터의 완료된 데이터 세트 및 연구 2의 125 mg 용량 군 및 연구 4로부터의 부분 데이터 세트를 기초로 하여, 레브리키주맙 제제 중 햄스터 PLBL2의 존재는 햄스터 PLBL2에 노출된 대부분의 대상체에서 면역 반응을 생성시켰다.
위약 및 레브리키주맙 투여 군 둘 다에서의 다수의 대상체는 항-햄스터 PLBL2 항체 검정에서 기존 면역반응성을 가지고 있었다. 이 기존 반응의 원인은 공지되어 있지 않으며; CHO 숙주 세포 단백질에 대한 항체 반응성은 이전에 특징화되었고, CHO-유래 생물학적 산물에 대한 선행 노출이 공지되지 않은 정상 인간 혈청 샘플에서 확인되었다 (Xue et al., The AAPS Journal 12(1):98-106 (2010)). 그러나, 단일 종의 CHOP인 PLBL2에 특이적인 어떠한 공개된 데이터도 존재하지 않는다.
연구 시작 시에 항-햄스터 PLBL2 항체 검정에서 기존 면역반응성을 갖는 대상체의 경우, 레브리키주맙의 반복 투여 후에 항체 역가의 지속적 상승이 있었다. 연구 시작 시에 항체 음성인 대상체의 경우, 모든 4개의 연구에 걸쳐 대부분의 대상체는 레브리키주맙의 적어도 2회 투여 후에 양성이 되었고, 모든 후속 시점 전반에 걸쳐 양성으로 남아있었다.
항-햄스터 PLBL2 항체의 발생에 대한 임상 유의성은 공지되어 있지 않다. 연구 대상체에서 햄스터 PLBL2에 대한 항체의 높은 발생률이 존재하지만, 안전성 사례와의 어떠한 상관관계도 만들어질 수 없었다. 중요하게는, 이들 완료된 또는 중간 연구에서 확인된 안전성 신호는 없었으며, 특히 아나필락시스, 아나필락시스양 또는 심각한 과민 반응의 사례 보고도 없었다. 그럼에도 불구하고, 반복 투약 하에 장기간 노출은 특히 천식 환자 집단 및 다른 알레르기성 또는 과민성 환자 집단에서 바람직하지 않은 효과, 예컨대 아나필락시스, 과민증 및 면역 복합체 침착 가능성을 증가시킬 수 있다는 우려가 남는다. 따라서, 후기 임상 연구 및 그 이후에 환자를 투약하는 것이 중요하며, 여기서 가능한 한 면역원성을 최소로 하기 위해 실질적으로 감소된 수준의 햄스터 PLBL2를 함유하는 항-IL13 MAb (예를 들어, 레브리키주맙) 제제를 사용하는 장기간에 걸친 이러한 반복 투약이 존재할 수 있다.
추가의 항체 서열은 하기 표 16에 제공된다.
<표 16> 항-IL17 A/F 항체 아미노산 서열 (서열 15-22) 및 항-A베타 항체 아미노산 서열 (서열 23-30)
Figure 112016034000941-pct00017
Figure 112016034000941-pct00018
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING PURIFIED RECOMBINANT POLYPEPTIDES <130> P5704R1-WO <140> <141> <150> 61/877,517 <151> 2013-09-13 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Ala Tyr Ser Val Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Asp Tyr 1 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 29 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 115 120 125 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 180 185 190 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 305 310 315 320 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 325 330 335 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 340 345 350 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 355 360 365 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 <210> 30 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gly Leu Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg 1 5 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Ala Phe Ile Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Val Thr Ser Phe Ser Leu Ala Lys 1 5

Claims (99)

  1. 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포로부터 정제된 항-IL13 모노클로날 항체를 포함하는, 환자에서 IL-13-매개 장애를 치료하기 위한 조성물이며,
    항-IL13 항체를 포함하고 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함할 수 있으며, 여기서 햄스터 PLBL2의 잔류 양은 20 ng/mg 미만, 또는 15 ng/mg 미만, 또는 10 ng/mg 미만, 또는 8 ng/mg 미만, 또는 5 ng/mg 미만, 또는 3 ng/mg 미만, 또는 2 ng/mg 미만, 또는 1 ng/mg 미만, 또는 0.5 ng/mg 미만이고, 여기서 항-IL13 항체는
    3개의 중쇄 CDR인
    서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1,
    서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및
    서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및
    3개의 경쇄 CDR인
    서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1,
    서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및
    서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3
    을 포함하며,
    여기서 IL-13-매개 장애는 특발성 폐 섬유증, 아토피성 피부염, 알레르기성 천식, 비-알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 습진, 두드러기, 식품 알레르기, 만성 폐쇄성 폐 질환, 궤양성 결장염, RSV 감염, 포도막염, 경피증 및 골다공증으로부터 선택되는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및
    서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및
    서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 햄스터 PLBL2의 양이 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 면역검정이 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 질량 분광측정법 검정이 LC-MS/MS인 조성물.
  11. 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포로부터 단리된 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제이며,
    소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법에 의해 정제되어 정제된 제제가 생산된 것이고,
    항-IL13 항체를 포함하고 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함할 수 있으며, 여기서 햄스터 PLBL2의 잔류 양은 20 ng/mg 미만, 또는 15 ng/mg 미만, 또는 10 ng/mg 미만, 또는 8 ng/mg 미만, 또는 5 ng/mg 미만, 또는 3 ng/mg 미만, 또는 2 ng/mg 미만, 또는 1 ng/mg 미만, 또는 0.5 ng/mg 미만이고, 여기서 항-IL13 항체는
    3개의 중쇄 CDR인
    서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1,
    서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및
    서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및
    3개의 경쇄 CDR인
    서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1,
    서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및
    서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3
    을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  12. 제11항에 있어서, HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우(PHENYL SEPHAROSE™ 6 Fast Flow) (고 치환) 수지를 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  13. 제12항에 있어서, HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통(flow-through) 모드로 작동시키는 것을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  14. 제13항에 있어서, HIC 단계가 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하고, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제가 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  15. 제14항에 있어서, 관통물이 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물이 0.5 OD 내지 1.5 OD에서 수집되는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  16. 제14항에 있어서, 관통물이 최대 8 칼럼 부피로 수집되는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  17. 제11항에 있어서, 상기 방법이 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  18. 제17항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 크로마토그래피인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  19. 제11항에 있어서, 상기 방법이 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 것인 항-IL13 항체 제제.
  20. 제19항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  21. 차이니즈 햄스터 난소 세포로부터 단리된 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제이며,
    제1 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제3 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법에 의해 정제되어 정제된 제제가 생산된 것이고,
    항-IL13 항체를 포함하고 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함할 수 있으며, 여기서 햄스터 PLBL2의 잔류 양은 20 ng/mg 미만, 또는 15 ng/mg 미만, 또는 10 ng/mg 미만, 또는 8 ng/mg 미만, 또는 5 ng/mg 미만, 또는 3 ng/mg 미만, 또는 2 ng/mg 미만, 또는 1 ng/mg 미만, 또는 0.5 ng/mg 미만이고, 여기서 항-IL13 항체는
    3개의 중쇄 CDR인
    서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1,
    서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및
    서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및
    3개의 경쇄 CDR인
    서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1,
    서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및
    서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3
    을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  22. 제21항에 있어서,
    친화성 크로마토그래피 단계가 맙셀렉트 슈어(MABSELECT SURE)™ 수지를 포함하고,
    음이온 교환 크로마토그래피 단계가 Q 세파로스™ 패스트 플로우(Q SEPHAROSE™ Fast Flow) 수지를 포함하고,
    HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 포함하는 것인
    정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  23. 제22항에 있어서,
    친화성 크로마토그래피 단계가 맙셀렉트 슈어™ 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고;
    음이온 교환 크로마토그래피 단계가 Q 세파로스™ 패스트 플로우 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고;
    HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함하는 것인
    정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  24. 제11항 또는 제21항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  25. 제11항 또는 제21항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  26. 제24항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  27. 제25항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  28. 제11항 또는 제21항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및
    서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  29. 제28항에 있어서, 항-IL13 항체가
    서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및
    서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  30. 제11항 또는 제21항에 있어서, 햄스터 PLBL2의 양이 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화된 것인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  31. 제30항에 있어서, 면역검정이 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  32. 제30항에 있어서, 질량 분광측정법 검정이 LC-MS/MS인 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 제제.
  33. 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포에서 생산된 항-IL13 항체를 정제하는 방법이며,
    상기 항-IL13 항체를 포함하고 잔류 양의 햄스터 PLBL2를 포함할 수 있는 정제된 제제를 제공하고,
    상기 항-IL13 항체는
    3개의 중쇄 CDR인
    서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1,
    서열 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및
    서열 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 및
    3개의 경쇄 CDR인
    서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1,
    서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및
    서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3
    을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-IL13 항체가 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 항-IL13 항체가 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 항-IL13 항체가 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 항-IL13 항체가 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것인 방법.
  38. 제33항에 있어서, 항-IL13 항체가 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항-IL13 항체가 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것인 방법.
  40. 제33항에 있어서, 햄스터 PLBL2의 양이 20 ng/mg 미만, 또는 15 ng/mg 미만, 또는 10 ng/mg 미만, 또는 8 ng/mg 미만, 또는 5 ng/mg 미만, 또는 3 ng/mg 미만, 또는 2 ng/mg 미만, 또는 1 ng/mg 미만, 또는 0.5 ng/mg 미만인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  44. 제33항에 있어서, 항체가 레브리키주맙인 방법.
  45. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, HIC 단계가 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함하고 평형 완충제 및 세척 완충제를 포함하며, 여기서 각각의 평형 완충제 및 세척 완충제가 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)을 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 관통물이 280 나노미터에서의 흡광도에 의해 모니터링되고, 관통물이 0.5 OD 내지 1.5 OD에서 수집되는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 관통물이 최대 8 칼럼 부피로 수집되는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 크로마토그래피인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계 전에 제1 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 및 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계가 맙셀렉트 슈어™ 수지를 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 Q 세파로스™ 패스트 플로우를 포함하고, HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환)를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    친화성 크로마토그래피 단계가 맙셀렉트 슈어™ 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고;
    음이온 교환 크로마토그래피 단계가 Q 세파로스™ 패스트 플로우 수지-함유 칼럼을 결합-용리 모드로 작동시키는 것을 포함하고;
    HIC 단계가 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우 (고 치환) 수지-함유 칼럼을 관통 모드로 작동시키는 것을 포함하는 것인
    방법.
  55. 제40항에 있어서, 햄스터 PLBL2의 양이 면역검정 또는 질량 분광측정법 검정을 사용하여 정량화되는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 면역검정이 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 ELISA 또는 햄스터 PLBL2 ELISA인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 질량 분광측정법 검정이 LC-MS/MS인 방법.
  58. 제1항에 있어서, 조성물의 투여가 참조 조성물의 투여와 비교하여 햄스터 PLBL2에 대해 덜 면역원성이고, 여기서 참조 조성물은 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포로부터 정제된 항-IL13 모노클로날 항체 및 30 ng/mg 초과, 또는 50 ng/mg 초과, 또는 100 ng/mg 초과, 또는 200 ng/mg 초과, 또는 300 ng/mg 초과의 양의 햄스터 PLBL2를 포함하는 것인 조성물.
  59. 제1항에 있어서, 4주마다 1회, 또는 8주마다 1회, 또는 12주마다 1회 피하로 투여되는 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 환자가 적어도 1개월, 또는 적어도 3개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 9개월, 또는 적어도 12개월, 또는 적어도 18개월, 또는 적어도 2년, 또는 2년 초과 동안 4주마다 1회 치료되는 것인 조성물.
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014145208A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Hydrophobic interaction protein chromatography under no-salt conditions
EP3043820A4 (en) * 2013-09-13 2017-07-12 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
AR102198A1 (es) 2014-10-09 2017-02-08 Regeneron Pharma Proceso para reducir partículas subvisibles en una formulación farmacéutica
TW201702380A (zh) 2015-02-27 2017-01-16 再生元醫藥公司 宿主細胞蛋白質修飾
CA2995385A1 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Genentech, Inc. Purification of fkpa and uses thereof for producing recombinant polypeptides
PL3337817T3 (pl) 2015-08-21 2022-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób zmniejszania zawartości białek komórek gospodarza w chromatografii powinowactwa
ES2877532T3 (es) * 2015-08-21 2021-11-17 Hoffmann La Roche Procedimiento para la reducción de proteínas de célula huésped en cromatografía de afinidad
WO2017178526A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Lonza Ltd Compositions and methods for the detection of host cell proteins
WO2018022628A1 (en) * 2016-07-25 2018-02-01 Cephalon, Inc. Affinity chromatography wash buffer
JP2019529350A (ja) 2016-08-16 2019-10-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 混合物から個々の抗体を定量する方法
CN109689675A (zh) 2016-09-07 2019-04-26 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 纯化抗体的方法
CN109790216A (zh) * 2016-10-06 2019-05-21 葛兰素史克知识产权开发有限公司 与工艺杂质的结合降低的抗体
AU2017350807B2 (en) 2016-10-25 2022-07-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for chromatography data analysis
AU2017380842A1 (en) 2016-12-23 2019-07-11 Serum Institute Of India Private Limited Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof
TW202003555A (zh) * 2018-03-07 2020-01-16 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 用於純化重組多肽之方法
TW202005694A (zh) 2018-07-02 2020-02-01 美商里珍納龍藥品有限公司 自混合物製備多肽之系統及方法
WO2020023566A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods of separating host cell lipases from a production protein in chromatographic processes
AU2020213017A1 (en) 2019-01-23 2021-07-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Methods for purifying antibodies comprising of a process by using activated carbon materials
WO2020157749A1 (en) * 2019-01-29 2020-08-06 Bnai Zion Medical Center Anti il-17 antibody for use in treating chronic spontaneous urticaria
CN114555622A (zh) * 2019-10-04 2022-05-27 默克专利股份有限公司 蛋白质的纯化和病毒灭活
US20230077205A1 (en) * 2020-01-29 2023-03-09 Merck Sharp & Dohme Llc Methods of separating host cell lipases from an anti-lag3 antibody production
WO2022235634A1 (en) * 2021-05-03 2022-11-10 Agilent Technologies, Inc. Chimeric immunogens and methods for making polyclonal antibodies against specific epitopes
WO2023215750A2 (en) * 2022-05-02 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipase activity
CN117169518B (zh) * 2023-11-03 2024-01-19 赛德特(北京)生物工程有限公司 T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011050071A2 (en) * 2009-10-20 2011-04-28 Abbott Laboratories Isolation and purification of anti-il-13 antibodies using protein a affinity chromatography
WO2013066866A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Genentech, Inc. Antibody formulations
WO2013066707A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates

Family Cites Families (181)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2031216A1 (de) 1969-06-19 1971-01-14 Citizen Watch Co Ltd , Tokio Tag und Datum Stellvorrichtung fur Uhren mit Kalender
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3422247A1 (de) 1984-06-15 1985-12-19 Pfeifer & Langen, 5000 Köln Gluco-oligosaccharid-gemisch und verfahren zu seiner herstellung
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
WO1989004838A1 (en) 1987-11-25 1989-06-01 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US4847745A (en) 1988-11-16 1989-07-11 Sundstrand Corp. Three phase inverter power supply with balancing transformer
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5011778A (en) 1989-05-23 1991-04-30 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibodies directed to IL-1 activated endothelial cells and medicaments employing the monoclonal antibodies
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU639754B2 (en) 1989-12-20 1993-08-05 Schering Corporation Antibody antagonists of human interleukin-4
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0506574T3 (da) 1991-03-29 1996-04-09 Sanofi Sa Protein med aktivitet af cytokintype, rekombinant-DNA, der koder for dette protein, celler og transformerede mikroorganismer
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US6329509B1 (en) 1991-08-14 2001-12-11 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies
US5994514A (en) 1991-08-14 1999-11-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5965709A (en) 1991-08-14 1999-10-12 Genentech, Inc. IgE antagonists
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU3658093A (en) 1992-02-10 1993-09-03 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
EP0626012B1 (en) 1992-02-11 2003-07-09 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CA2096289A1 (en) 1992-05-15 1993-11-16 Wouter Musters Cloning and expression of dna encoding a ripening form of a polypeptide having rhamnogalacturonase activity
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5596072A (en) 1992-08-21 1997-01-21 Schering Corporation Method of refolding human IL-13
JPH07508179A (ja) 1992-08-21 1995-09-14 シェリング・コーポレーション ヒトインターロイキン−１３
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
EP0604693A1 (en) 1992-12-29 1994-07-06 Schering-Plough Monoclonal antibodies against the human interleukin-4 receptor and hybridomas producing the same
ATE474925T1 (de) 1993-05-17 2010-08-15 Genentech Inc Rekombinante cho zell sialidase
WO1995006666A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Anti-gp39 antibodies and uses therefor
EP0659766A1 (en) 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5705154A (en) 1995-03-08 1998-01-06 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US6518061B1 (en) 1995-03-15 2003-02-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6911530B1 (en) 1995-10-23 2005-06-28 Amrad Operations, Pty., Ltd. Haemopoietin receptor and genetic sequences encoding same
AU718899C (en) 1995-10-23 2004-01-29 Amrad Operations Pty. Limited A novel haemopoietin receptor and genetic sequences encoding same
FR2742156A1 (fr) 1995-12-06 1997-06-13 Sanofi Sa Polypeptide recepteur de l'il-13
NZ536216A (en) 1996-02-09 2006-08-31 Abbott Biotech Ltd Use of an isolated antibody D2E7 for the treatment of a disorder in which TNF(alpha) activity is detrimental
US5710023A (en) 1996-03-01 1998-01-20 Genetics Institute, Inc. IL-13 cytokine receptor chain
US7078494B1 (en) 1996-03-01 2006-07-18 Genetics Institute, Llc Antibodies to human IL-13bc and methods of their use in inhibiting IL-13 binding
US6664227B1 (en) 1996-03-01 2003-12-16 Genetics Institute, Llc Treatment of fibrosis by antagonism of IL-13 and IL-13 receptor chains
WO1997047742A1 (en) 1996-06-12 1997-12-18 Smithkline Beecham Corporation Hr-1 receptor
WO1998010638A1 (en) 1996-09-10 1998-03-19 Amrad Operations Pty. Ltd. Therapeutic molecules
ATE451391T1 (de) 1996-11-27 2009-12-15 Genentech Inc Affinitätsreinigung von polypeptid-proteinen auf einer matrix
US6743604B1 (en) 1996-12-13 2004-06-01 Smithkline Beecham Corporation Substances and their uses
GB9625899D0 (en) 1996-12-13 1997-01-29 Glaxo Group Ltd Substances and their uses
EP0948355A1 (en) 1997-01-10 1999-10-13 Biogen, Inc. Treatment of lupus nephritis with anti-cd40l compounds
WO1998031394A2 (en) 1997-01-22 1998-07-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Tissue factor methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US6576232B1 (en) 1998-04-03 2003-06-10 The Penn State Research Foundation IL13 mutants
US6482403B1 (en) 1998-05-29 2002-11-19 Heska Corporation Caniney IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof
US6299875B1 (en) 1998-06-04 2001-10-09 Panacea Pharmaceuticals, Llc Methods to block IGE binding to cell surface receptors of mast cells
GB9820014D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Cancer Res Campaign Tech Receptor antagonists and uses thereof
US7083950B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use
DE19848026A1 (de) 1998-10-17 2000-04-20 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Bis(4-hydroxyaryl)alkanen
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US7553487B2 (en) 1998-12-14 2009-06-30 Genetics Institute, Llc Method and compositions for treating asthma
DK1141286T3 (da) 1998-12-14 2007-02-19 Genetics Inst Llc Kæde af cytokinreceptorer
AU2750800A (en) 1999-02-01 2000-08-18 Amgen Canada Inc. Materials and methods to inhibit hodgkin and reed sternberg cell growth
CA2404763A1 (en) 1999-11-11 2001-05-17 Raj K. Puri Mutated il-13 molecules and their uses
US20100041039A1 (en) 2000-01-15 2010-02-18 Synageva Biopharma Corp. Analysis of nucleic acid obtained from nucleated red blood cells
KR100767146B1 (ko) 2000-02-24 2007-10-15 워싱톤 유니버시티 Ａβ 펩티드를 격리시키는 인간화 항체
AU3607301A (en) 2000-03-03 2001-09-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk Gene recombinant antibody and its fragment
CN1323812A (zh) 2000-05-16 2001-11-28 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人白细胞介素－13(il－13)受体11和编码这种多肽的多核苷酸
EP1333850B1 (en) 2000-10-20 2008-08-20 Genetics Institute, Inc. Use of il-13 inhibitors for the treatment of tumors
CA2424371A1 (en) 2000-10-20 2003-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agonistic monoclonal antibody fragments
US7919467B2 (en) 2000-12-04 2011-04-05 Immunotope, Inc. Cytotoxic T-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
CA2447832C (en) 2000-12-22 2012-09-25 Jamshid Tanha Phage display libraries of human vh fragments
JP2005518336A (ja) 2001-06-26 2005-06-23 イムクローン システムズ インコーポレイティド Ｖｅｇｆ受容体に結合する二重特異性抗体
US20030023555A1 (en) 2001-07-26 2003-01-30 Cashworks, Inc. Method and system for providing financial services
EP1449850B9 (en) 2001-08-31 2011-05-11 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Human cdr-grafted antibodies and antibody fragments thereof
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
JP2005512522A (ja) 2001-10-26 2005-05-12 セントカー・インコーポレーテツド Ｉｌ−１３ムテインタンパク質、抗体、組成物、方法および使用
WO2003040164A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays presenting il-5, il-3 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases
WO2003066662A2 (en) 2002-02-05 2003-08-14 Genentech, Inc. Protein purification
AU2003223497A1 (en) 2002-04-05 2003-10-27 Centocor, Inc. Asthma-related anti-il-13 immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040060102A1 (en) 2002-04-10 2004-04-01 Interspiro, Inc. Garments for biological, chemical and fire protection
US7323553B2 (en) 2002-04-26 2008-01-29 Genentech, Inc. Non-affinity purification of proteins
ES2384439T3 (es) 2002-06-14 2012-07-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Procedimientos de tratamiento y prevención de colitis que se implican IL-13 y células NK-T
EP1534323A2 (en) 2002-08-30 2005-06-01 Glaxo Group Limited Il-14 vaccine for the treatment of asthma and atopic disorders
JP2006503017A (ja) 2002-08-30 2006-01-26 グラクソ　グループ　リミテッド Ｉｌ−１３要素及びｔ細胞エピトープを含む免疫原組成物並びにその治療上の使用
DE10303664A1 (de) 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
US7575747B2 (en) 2003-02-10 2009-08-18 Applied Molecular Evolution Aβ binding molecules
US7157276B2 (en) 2003-06-20 2007-01-02 Biogen Idec Inc. Use of depth filtration in series with continuous centrifugation to clarify mammalian cell cultures
PT1639011E (pt) 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
GB0407315D0 (en) 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
DK1711528T3 (da) 2003-12-23 2012-08-20 Genentech Inc Behandling af cancer med hidtil ukendte anti-il 13 monoklonale antistoffer
EP1704166B1 (en) 2004-01-07 2015-04-29 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof
WO2005071410A1 (en) 2004-01-13 2005-08-04 Tanox, Inc. Detecting and quantifying host cell proteins in recombinant protein products
US20050226883A1 (en) 2004-02-06 2005-10-13 Paul Averback Humanized antibody
PL1720909T3 (pl) 2004-02-23 2012-04-30 Lilly Co Eli Przeciwciało anty-abeta
RU2006138181A (ru) 2004-05-04 2008-06-10 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) О-связанные гликоформы полипептидов и способ их изготовления
US20070037966A1 (en) * 2004-05-04 2007-02-15 Novo Nordisk A/S Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides
US20070048785A1 (en) 2004-06-09 2007-03-01 Lin Laura L Anti-IL-13 antibodies and complexes
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
US7501121B2 (en) 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
TWI307630B (en) 2004-07-01 2009-03-21 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
EP1805320B1 (en) 2004-10-22 2014-09-03 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
BRPI0519405A2 (pt) 2004-12-24 2009-01-20 Commw Scient Ind Res Org composiÇÕes pesticidas e mÉtodos
CN104610422A (zh) 2005-03-11 2015-05-13 惠氏公司 弱分配层析的方法
MX2007012499A (es) 2005-04-11 2007-12-06 Medarex Inc Purificacion de proteinas.
WO2006138553A2 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Wyeth Methods of purifying fc region containing proteins
JP3982545B2 (ja) 2005-09-22 2007-09-26 ダイキン工業株式会社 空気調和装置
EP1942939B2 (en) * 2005-09-30 2021-07-07 Medimmune Limited Interleukin-13 antibody composition
PE20080036A1 (es) 2005-10-21 2008-03-06 Novartis Ag Anticuerpos humanos para la interleucina-13 (il13)
RS53270B2 (sr) 2005-11-30 2018-05-31 Abbvie Deutschland Monoklonalna antitela protiv amiloidnog beta proteina i njihova upotreba
US7667557B2 (en) 2005-12-06 2010-02-23 Tdk Corporation Thin-film bandpass filter using inductor-capacitor resonators
NZ568241A (en) 2005-12-12 2011-08-26 Hoffmann La Roche Antibodies against amyloid beta 4 with glycosylation in the variable region
NO345996B1 (no) 2005-12-12 2021-12-13 Ac Immune Sa A beta 1-42-spesifikke monoklonale antistoffer med terapeutiske egenskaper.
DK1966244T3 (da) 2005-12-30 2012-04-23 Merck Patent Gmbh Anti-il-6-antistoffer der forebygger bindingen af il-6 sammensat af il-6ralfa til gp130
US7563875B2 (en) 2006-03-20 2009-07-21 The United States of America as represented by the Sercretary of the Army Recombinant chimeric human anti-botulinum antibodies
NZ596517A (en) * 2006-04-05 2013-06-28 Abbott Biotech Ltd Antibody purification
MX2008013394A (es) 2006-04-21 2008-10-31 Wyeth Corp Metodos para tamizado de alta emision de lineas celulares.
WO2008011348A2 (en) 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
AR062947A1 (es) 2006-09-21 2008-12-17 Verenium Corp Fosfolipasas acidos nucleicos que las codifican y metodos para prepararlas y usarlas
EP2074145B1 (en) 2006-10-02 2017-08-16 AC Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
PT2069798E (pt) 2006-10-04 2014-06-24 Genentech Inc Elisa para vegf
US8383350B1 (en) 2006-12-20 2013-02-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Assay for detection of IL-10 antibodies
MX2009007406A (es) 2007-01-09 2010-01-25 Wyeth Corp Formulaciones de anticuerpo anti-il-13 y usos de las mismas.
WO2008140455A1 (en) 2007-05-15 2008-11-20 Tanox, Inc. Treatment of radiation and chemo-therapy induced fibrosis using novel anti-il 13 monoclonal antibodies
EP2170953B1 (en) 2007-06-12 2015-07-15 AC Immune S.A. Monoclonal anti beta amyloid antibody
RS53793B1 (en) 2007-06-12 2015-06-30 Ac Immune S.A. HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST BETA AMYLOID
US9433922B2 (en) 2007-08-14 2016-09-06 Emd Millipore Corporation Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same
CA2701790A1 (en) 2007-10-05 2009-04-16 Ac Immune S.A. Use of humanized anti-beta-amyloid antibody in ocular diseases
WO2009048537A2 (en) 2007-10-05 2009-04-16 Genentech, Inc. Humanized antibody
RS53174B (en) 2007-10-05 2014-06-30 Genentech Inc. USE OF ANTIAMYLOID BETA ANTIBODY IN THE EVENT OF ANY DISEASE
WO2009058769A1 (en) * 2007-10-30 2009-05-07 Schering Corporation Purification of antibodies containing hydrophobic variants
MX348362B (es) 2008-03-31 2017-06-07 Genentech Inc * Composiciones y metodos para tratar y diagnosticar asma.
WO2009131643A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Monabio, Inc. Immunoassay for specific determination of s-adenosymethionine and analogs thereof in biological samples
AU2009245440C1 (en) 2008-05-05 2013-03-14 Novimmune Sa Anti-IL-17A/IL-17F cross-reactive antibodies and methods of use thereof
DK2322221T3 (da) 2008-08-05 2014-09-01 Toray Industries Farmaceutisk sammensætning til behandling og forebyggelse af cancer
US8790642B2 (en) * 2008-08-29 2014-07-29 Genentech, Inc. Cross-reactive and bispecific anti-IL-17A/F antibodies
GB0818674D0 (en) 2008-10-10 2008-11-19 Univ Bath Materials and methods for resolving polyhydric species by electrophoresis
BRPI0919547A2 (pt) 2008-10-20 2015-12-08 Abbott Lab anticorpos que se ligam a il-12 e métodos de purificação do mesmo
KR101722423B1 (ko) 2008-10-20 2017-04-18 애브비 인코포레이티드 항체 정제 동안의 바이러스 불활성화
BRPI0920027A2 (pt) 2008-10-20 2015-10-06 Abbott Lab isolamento e purificação de anticorpos usando cromatografia de afinidade a proteína a
JP2012506239A (ja) 2008-10-20 2012-03-15 アボット・ラボラトリーズ Ｉｌ−１８に結合する抗体およびそれを精製する方法
CN101979404B (zh) 2008-12-09 2015-01-14 厦门大学 H5亚型禽流感病毒保守中和表位模拟肽及其用途
FR2944448B1 (fr) 2008-12-23 2012-01-13 Adocia Composition pharmaceutique stable comprenant au moins un anticorps monodonal et au moins un polysacharide amphiphile comprenant des substituants derives d'alcools hydrofobes ou d'amines hydrophobes.
WO2011010940A1 (en) 2009-07-19 2011-01-27 Serguei Zavtrak Solar electric power generator
EP2462158B1 (en) 2009-08-06 2018-01-10 F. Hoffmann-La Roche AG Method to improve virus removal in protein purification
AU2010289677B2 (en) 2009-09-03 2014-07-31 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-GITR antibodies
UA109884C2 (uk) 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
TR201806936T4 (tr) 2010-01-29 2018-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3 antikoru.
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
GEP20166442B (en) 2010-03-04 2016-03-10 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
WO2011143624A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanized and chimeric monoclonal antibodies to cd47
BR112012029281B1 (pt) 2010-05-17 2020-12-08 Livtech, Inc anticorpo contra trop-2 humano, anticorpo monoclonal contra trop-2 humano, fragmento de anticorpo derivado de anticorpo, hibridoma, conjugado, composição farmacêutica, uso de composição farmacêutica, método para detectar um tumor e kit para tratar, diagnosticar ou detectar um tumor
WO2011150110A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 Genentech, Inc. Methods of purifying polypeptides
EP2591005A2 (en) 2010-07-06 2013-05-15 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-ron antibodies
SG187173A1 (en) 2010-07-30 2013-02-28 Ac Immune Sa Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody
BR112013007514A2 (pt) 2010-09-29 2019-09-24 Genentech Inc anticorpo isolado, uso da composição e método
US20120171120A1 (en) * 2010-11-30 2012-07-05 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
SG10201401746TA (en) 2010-12-16 2014-10-30 Genentech Inc Diagnosis And Treatments Relating To TH2 Inhibition
DK2699264T3 (en) 2011-04-20 2018-06-25 Medimmune Llc ANTIBODIES AND OTHER MOLECULES BINDING B7-H1 AND PD-1
RU2014124842A (ru) * 2011-11-21 2015-12-27 Дженентек, Инк. Очистка анти-с-мет антител
JP6092892B2 (ja) 2011-12-15 2017-03-08 プレステージ バイオファーマ プライベート リミテッド 抗体の精製方法
WO2013120497A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
EP3255063A3 (en) 2012-02-29 2018-02-07 Gilead Biologics, Inc. Antibodies to matrix metalloproteinase 9
EP3043820A4 (en) * 2013-09-13 2017-07-12 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
RU2016107435A (ru) 2013-09-13 2017-10-18 Дженентек, Инк. Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011050071A2 (en) * 2009-10-20 2011-04-28 Abbott Laboratories Isolation and purification of anti-il-13 antibodies using protein a affinity chromatography
JP2013508387A (ja) 2009-10-20 2013-03-07 アボット・ラボラトリーズ プロテインａアフィニティークロマトグラフィーを利用した抗ｉｌ−１３抗体の単離精製
WO2013066866A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Genentech, Inc. Antibody formulations
WO2013066707A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates

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