KR20130112879A - 항체 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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조-안 혼고
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Abstract

본 발명은 항-gH 항체 및 항-복합체 I 항체를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항체 조성물 및 사용 방법 {ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
관련 출원
본원은 미국 가출원 번호 61/387,735 및 61/387,725 (둘 다 2010년 9월 29일에 출원됨), 및 미국 가출원 번호 61/504,056 (2011년 7월 1일에 출원됨)을 우선권 주장하며, 이들 모두는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
EFS-웹을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록은 "P4680R1US.txt"의 파일명 (작성일 2011년 9월 15일 및 크기 200,277 바이트)으로 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷 텍스트 파일로서 명세서와 동시에 제출되었다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항-복합체 I 및 항-gH 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
인간 시토메갈로바이러스 (HCMV)는 β-헤르페스바이러스이고, 인간 헤르페스바이러스-5 (HHV-5)로도 또한 공지되어 있다. 추가의 포유동물을 감염시키는 시토메갈로바이러스 (CMV)의 다른 종, 예컨대 뮤린 CMV (MCMV), 기니아 피그 CMV (GPCMV), 원숭이 CMV (SCCMV), 레서스 CMV (rhCMV) 및 침팬지 CMV (CCMV)가 존재한다. HCMV는 미국 인구의 거의 50%를 감염시킨 흔한 헤르페스바이러스이다. 대부분의 인간 감염된 개체의 경우에, HCMV 감염은 무증상이다. 그러나, 질병 및 면역 억제 (예를 들어, HIV 감염, 이식 환자에서의 약물-유도된 면역 억제)의 상태에서의 HCMV 재활성화 또는 일차 감염은 다양한 임상 징후, 예컨대 단핵구증, 간염, 망막염, 폐렴, 실명 및 기관 부전을 유발한다. 또한, 임신 상태에서 일차 CMV 감염의 획득은 모체에는 그다지 중요하지 않을지라도 발생중인 태아에서는 심각한 임상적 중요성을 가질 수 있다.
선천성 HCMV 감염은, 임신 동안 감염된 모체에서 태어난 수많은 소아가 자궁내 감염되고 강력한 임상 질환을 앓기 때문에 특히 중요하다. 미국 및 유럽에서, 126,000명의 여성이 임신 동안 일차 HCMV 감염을 앓고, 이들 모체에서 태어난 대략 40,000명의 영아가 선천성 감염을 앓는다. 미국에서, 750명의 소아 중 1명은 정신 지체, 청력 상실, 시각 상실, 기관 결함 및 성장 결함을 비롯한 HCMV 감염으로 인한 장애를 갖고 태어나거나 이러한 장애가 발병한다. 선천성 HCMV 감염은 태아 이상의 가장 흔한 감염성 원인이다. 임신한 여성의 일차 감염이 발생한 후에는, 태아 감염의 예방 또는 치료를 위한 승인된 요법이 현재 전혀 없다. 따라서, 선천성 HCMV 감염을 예방하기 위한 조성물 및 방법을 발견하는 것이 당업계에 매우 필요하다.
2005년에, 니그로(Nigro) 및 동료들은 인간 CMV 과다면역 글로불린 (HIG)을 일차 HCMV 감염을 앓는 임산부에게 투여한 연구를 발표하였다 (문헌 [Nigro et al. (2005) New Engl. J. Med. 353:1350-1362]). 연구의 한 부문에서, HCMV-감염된 모체에서 태어난 31명의 영아 중 단 1명만이 질환을 갖고 태어난 반면, 비처리된 여성에서 태어난 소아의 7/14 (50%)가 HCMV 질환을 갖고 태어났다. 상기 동일 문헌.
임신 동안, HCMV는 태반을 통해 감염된 모체로부터 태아로 퍼질 수 있다. 태아를 자궁에 고정시키는 태반은 특수 상피 세포, 기질 섬유모세포, 내피 세포 및 특수 대식세포를 함유한다. HCMV 바이러스 표면은, 태반에서 발견된 특이적 세포 유형의 감염에 필요한 것으로 나타난 다양한 바이러스 당단백질 복합체를 함유한다. gH/gL을 함유하는 CMV 당단백질 및 UL128, UL130 및 UL131의 복합체 (본원에서 "복합체 I"로 지칭됨)는 특히 내피 세포, 상피 세포 및 대식세포의 감염에 필요하다. gH/gL 및 gO를 함유하는 CMV 당단백질의 복합체 (본원에서 "복합체 II"로 지칭됨)는 특히 섬유모세포의 감염에 필요하다. HIG는 HCMV 감염에 걸리기 쉬운 4종 모두의 태반 세포 내로의 바이러스 진입을 차단하는 것으로 나타났다.
HIG를 제조하고 광범위하게 유통시키는 것의 어려움, 및 특히 임신한 여성에서 인간 혈액 산물을 사용하는 것에 대한 의사 및 의료 공동체의 저항감으로 인해, 태아를 선천성 HCMV 감염으로부터 보호할 수 있는 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체들을 포함하는 조성물을 생성하는 것이 가장 유익할 것이다. 현재까지는 CMV의 모체-태아 전염의 예방을 위한 모노클로날 항체 조성물이 전혀 개발되지 않았다. 란차베키아(Lanzavecchia) 및 마카그노(Macagno)는, CMV 전염을 중화시키는 UL130 및 UL131의 조합 또는 UL128, UL130 및 UL131의 조합으로부터 유래된 입체형태적 에피토프에 결합하는 감염된 환자의 불멸화된 B 세포로부터 단리된 자연 발생 항체를 개시하였다 (미국 특허 공보 번호 2008/0213265 및 2009/0081230). 솅크(Shenk) 및 왕(Wang)은 복합체 I의 단백질에 결합하는 항체를 개시하였다 (미국 특허 번호 7,704,510). 후라노 등(Funaro et al.)은 또한 미국 특허 공보 번호 2010-0040602에서 CMV에 대한 중화 항체를 개시하였다. 추가로, 항-gH 모노클로날 항체 MSL-109를 인간에서, 동종 골수 이식 수용자 및 AIDS 및 CMV 망막염을 앓는 환자의 2개의 환자 집단에서 시험하였으나 실패하였다 (문헌 [Drobyski et al., Transplantation 51:1190-1196 (1991); Boeckh et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 7:343-351 (2001); 및 Borucki et al., Antiviral Res. 64:103-111 (2004)]).
선천성 HCMV 감염을 비롯한 HCMV 감염을 예방하기 위한 모노클로날 항체를 개발하는 것이 당업계에 여전히 필요하다.
본 발명은 HCMV 복합체 I에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-복합체 I 항체는 6개의 HVR: (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 10-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 항체는 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1 및 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 FR2를 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 항-복합체 I 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서 (a) HVR-H1은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HVR-H2는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HVR-H3은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고; (d) HVR-L1은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고; (f) HVR-L3은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하고; (e) HVR-L2, 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR3의 제1 아미노산은 서열 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 (a) 서열 45 또는 서열 46 또는 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH; (b) 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 이러한 항체는 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR3 및 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 서열 45 또는 서열 46 또는 서열 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, 및 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 45 또는 서열 46 또는 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 서열 45 또는 서열 46의 VH 서열 및 서열 49의 VL 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HCMV gH에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-gH 항체는 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
(a) HVR-H1은 서열 71의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HVR-H2는 서열 72, 서열 73, 서열 74 및 서열 93으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
(c) HVR-H3은 서열 75의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HVR-L1은 서열 76의 아미노산 서열을 포함하고;
(e) HVR-L2는 서열 77의 아미노산 서열을 포함하고;
(f) HVR-L3은 서열 78의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-gH 항체는 서열 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하며, 여기서 서열 93의 위치 6에서의 아미노산은 Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 93의 위치 8에서의 아미노산은 Thr 및 Arg으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 항-gH 항체는 서열 72, 서열 73 또는 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
다른 실시양태에서, 항-gH 항체는 (서열 94의) 위치 54에 Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 서열 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 위치 56에 Thr 및 Arg으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 아미노산 Asn54, Ser54, Thr54, Gln54, Phe54, Met54 또는 Leu54 및/또는 Arg56을 포함하는, 서열 94에 대해 아미노산 서열에서 적어도 95% 동일한 VH 서열을 갖는 항-gH 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 87, 서열 88 및 서열 89로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열 94에 대해 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 위치 54에 Asn54, Ser54, Thr54, Gln54, Phe54, Met54 또는 Leu54로부터 선택된 아미노산을 함유하고/거나 위치 56에 Arg (Arg56)을 함유하고; (b) VL 서열은 서열 90의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, VH는 서열 87, 서열 88 및 서열 89로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 90의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 89의 VH 서열 및 서열 90의 VL 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서 본 발명의 항체는 HCMV의 표면 상의 HCMV 복합체 I에 특이적으로 결합하여 0.1 μg/ml 이하의 EC90으로 HCMV를 중화시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-복합체 I 항체는 HCMV의 표면 상의 HCMV 복합체 I에 특이적으로 결합하여 0.05 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.013 μg/ml, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml, 0.009 μg/ml, 0.008 μg/ml, 0.007 μg/ml, 0.006 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.004 μg/ml, 0.003 μg/ml, 0.002 μg/ml, 0.001 μg/ml, 0.0009 μg/ml, 0.0008 μg/ml, 0.0007 μg/ml 또는 그 미만의 항체 농도에서 (예를 들어, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 항체 농도에서) 50%의 HCMV를 중화시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-gH 항체는 HCMV gH에 특이적으로 결합한다. 항체는 HCMV의 표면 상의 gH에 결합하여 1 μg/ml 이하의 EC90으로 HCMV를 중화시킨다. 본 발명의 단리된 항-gH 항체는 HCMV의 표면 상의 gH에 결합하여 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.013 μg/ml, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml, 0.009 μg/ml, 0.008 μg/ml, 0.007 μg/ml, 0.006 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.004 μg/ml, 0.003 μg/ml, 0.002 μg/ml, 0.001 μg/ml 또는 그 미만의 항체 농도에서 (예를 들어, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 항체 농도에서) 50%의 HCMV를 중화시킨다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 비롯한 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 HCMV gH 및/또는 복합체 I에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 제공한다.
특정한 실시양태에서, HCMV 복합체 I 및/또는 gH에 특이적으로 결합하는 항체는 전장 IgG1 항체이다.
본 발명은 또한 HCMV 복합체 I 및/또는 gH에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 복합체 I 및/또는 gH에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되도록 하는 것을 포함하는, 항체의 생산 방법을 추가로 제공한다. 방법은 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 항-복합체 I 항체, 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체 및 항-gH 항체의 조합물, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 각 항체의 제약 제제는 별개의 것일 수 있거나 또는 조합될 수 있다. 제약 제제는 추가의 치료제 (예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 항-복합체 I 항체, 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체 및 항-gH 항체의 조합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 각 항체를 포함하는 조성물은 별개의 것일 수 있거나 또는 조합될 수 있다. 조성물은 추가의 치료제 (예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 HCMV 감염을 억제하거나, 치료하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 항-복합체 I 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용도는 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 조직, 기관 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 조직 또는 기관 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 치료하거나 또는 예방하기 위한 것이다. 추가 실시양태는 이식 수용자가 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, 재활성화의 위험이 있는 것인 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조직 또는 기관 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다. 특정 실시양태에서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물은 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 별개의 것이다.
본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 또한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 HCMV 감염의 치료, 억제 또는 예방에, 예컨대 예를 들어 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 기관, 조직 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 기관 또는 조직 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 예방하거나 또는 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가 실시양태에서, 이식 수용자는 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, 재활성화의 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 의약은 추가의 치료제 (예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 기관 또는 조직 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다. 특정 실시양태에서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물은 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체와 별개의 조성물 중에 있다.
본 발명은 또한 환자에게 항-gH 항체, 항-복합체 I 항체, 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 임신한 여성에게 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 선천성 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 임신한 여성에게 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염된 태아를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 HCMV 감염된 영아 또는 잉태 동안 HCMV에 노출된 영아에게 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 영아를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 기관 공여자 또는 조직 공여자로부터 수득된 기관 또는 조직으로부터 발생하는 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하기 위해 이식된 기관 또는 조직 수용자에게 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 기관 또는 조직 이식 수용자에서 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태는 이식 수용자가 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, 재활성화의 위험이 있는 것인 방법을 포함한다. 치료 방법은 환자에게 추가의 치료제 (예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물은 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 별개의 조성물 중에 있다. 다른 실시양태에서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물은 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 투여된다.
본 발명은 또한 HCMV 감염을 억제하거나, 치료하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 항-복합체 I 및/또는 항-gH 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 용도는 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 조직, 기관 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 조직 또는 기관 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 치료하거나 또는 예방하기 위한 것이다. 추가 실시양태는 이식 수용자가 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, 재활성화의 위험이 있는 것인 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조직 또는 기관 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다.
본 발명의 항체는 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 HCMV 감염의 치료, 억제 또는 예방에, 예컨대 예를 들어 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 기관, 조직 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 기관 또는 조직 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 예방하거나 또는 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가 실시양태에서, 이식 수용자는 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, 재활성화의 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 의약은 추가의 치료제 (예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 기관 또는 조직 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다.
본 발명은 또한 환자에게 유효량의 항-gH 항체, 항-복합체 I 항체, 또는 그의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 임신한 여성에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 선천성 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 임신한 여성에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염된 태아를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 기관 공여자 또는 조직 공여자로부터 수득된 기관 또는 조직으로부터 발생하는 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하기 위해 이식된 기관 또는 조직 수용자에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 기관 또는 조직 이식 수용자에서 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태는 이식 수용자가 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, 재활성화의 위험이 있는 것인 방법을 포함한다. 치료 방법은 환자에게 추가의 치료제 (예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, HCMV gH에 결합하는 항체는 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체와 별개로 투여된다. 다른 실시양태에서, HCMV gH에 결합하는 항체는 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체와 동시에, 그 전에 또는 그 후에 투여된다.
특정 실시양태에서, 기관 이식은 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장 또는 흉선이다. 다른 실시양태에서, 조직 이식은 손, 각막, 피부, 안면, 랑게르한스섬, 골수, 줄기 세포, 전혈, 혈소판, 혈청, 혈액 세포, 혈관, 심장 판막, 골, 골 전구 세포, 연골, 인대, 건, 근육 내벽이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-gH 및/또는 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 실시양태는 서열 1의 위치 168에서의 트립토판; 서열 1의 위치 446에서의 아스파르트산; 서열 1의 위치 171에서의 프롤린; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함하는, HCMV gH의 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 추가 실시양태는 서열 203의 위치 47에서의 글루타민; (ii) 서열 203의 위치 51에서의 리신; (iii) 서열 203의 위치 46에서의 아스파르트산; 및 (iv) 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함하는, HCMV 복합체 I의 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 추가 실시양태는 HCMV 복합체 I의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 아미노산 서열 SRALPDQTRYKYVEQLVDLT LNYHYDAS (서열 194)를 포함한다.
도 1은 뮤린 mAb 8G8 (서열 50)의 중쇄 가변 영역 (VH)의, 선택된 인간 중쇄 가변 영역: VH1 FW (서열 52), 인간 VH3 FW (서열 53) 및 인간 VH7 FW (서열 54)와의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다. ●는 VL-VH 상호작용을 나타내고 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]); 이중 * (하나 위에 다른 하나)는 버니어 위치(Vernier Position) (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]) 및 FW-CDR 상호작용 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169])을 나타낸다. 위치 47, 64, 66, 68에서의 단일 *는 버니어 위치를 나타내고 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]); 위치 58에서의 단일 *는 FW-CDR 상호작용을 나타낸다 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]).
도 2는 뮤린 mAb 8G8 (서열 51)의 경쇄 가변 영역 (VL)의, 인간 경쇄 가변 영역: λ3 FW 영역 (서열 69) 및 인간 λ4 FW 영역 (서열 55)과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다. ●는 VL-VH 상호작용을 나타내고 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]); 이중 * (하나 위에 다른 하나)는 버니어 위치 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]) 및 FW-CDR 상호작용 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169])을 나타낸다. 위치 47, 64, 66, 68에서의 단일 *는 버니어 위치를 나타내고 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]); 위치 58에서의 단일 *는 FW-CDR 상호작용을 나타낸다 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]).
도 3은 8G8λ3 변이체를 8G8λ4 변이체와 비교한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 A: 인간 VH1, VH3 또는 VH7을 갖는 인간화 8G8λ3 항체를 마우스/인간 키메라 8G8 항체 (QE7/C2)와 비교하여 중화 검정에 사용하였다. 패널 B: 인간 VH1, VH3 또는 VH7을 갖는 인간화 8G8λ4 항체를 마우스/인간 키메라 8G8 항체 (QE7/C2)와 비교하여 중화 검정에 사용하였다. 실험에 대한 EC50 값을 각각의 실험 하단에 나타내었다.
도 4는 8G8 HVR-L2에서의 돌연변이체 서열을 보여준다. HVR-L2 및 FR3의 제1 아미노산의 아미노산 서열을 나타내었다 (WT, 서열 57; A1, 서열 58; E1, 서열 59; T1, 서열 60; A2, 서열 61; E2, 서열 62; T2, 서열 63; SG, 서열 64; SGSG, 서열 65; TGDA, 서열 66). 도면에서의 숫자는 카바트 넘버링을 기초로 하였다.
도 5는 단일 아미노산 치환을 함유하는 도 4에 나타낸 돌연변이된 HVR-L2 영역을 갖는 다양한 인간화 8G8 항체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 A: 중화 검정. HVR-L2 돌연변이체 항체는 모두 인간 8G8 VH1 쇄를 함유하였다. 패널 B: 실험에 대한 EC50 값.
도 6은 2개의 아미노산 치환을 함유하는 도 4에 나타낸 돌연변이된 HVR-L2 영역을 갖는 다양한 인간화 8G8 항체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 A: 중화 검정. HVR-L2 돌연변이체 항체는 모두 인간 8G8 VH1 쇄를 함유하였다. 패널 B: 실험에 대한 EC50 값.
도 7은 뮤린 mAb 8G8의 경쇄 가변 영역 (서열 51)의, 인간 경쇄 가변 영역 λ4 FW (서열 55) 및 λ4 FW 상의 8G8에 대한 인간화 경쇄 가변 영역 (hu8G8.λ4 FW) (서열 48)과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다. ●는 VL-VH 상호작용을 나타내고 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]); 이중 * (하나 위에 다른 하나)는 버니어 위치 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]) 및 FW-CDR 상호작용 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169])을 나타낸다. 위치 47, 64, 66, 68에서의 단일 *는 버니어 위치를 나타내고 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]); 위치 58에서의 단일 *는 FW-CDR 상호작용을 나타낸다 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]).
도 8은 뮤린 mAb 8G8의 중쇄 가변 영역 (서열 50)의, 인간 중쇄 가변 영역 VH1 프레임워크 (VH1 FW) (서열 52) 및 VH1 FW 상의 8G8에 대한 인간화 중쇄 가변 영역 (hu8G8.VH1) (서열 45)과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다. ●는 VL-VH 상호작용을 나타내고 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]); 이중 * (하나 위에 다른 하나)는 버니어 위치 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]) 및 FW-CDR 상호작용 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169])을 나타낸다. 위치 47, 64, 66, 68에서의 단일 *는 버니어 위치를 나타내고 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]); 위치 58에서의 단일 *는 FW-CDR 상호작용을 나타낸다 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]). hu8G8.VH1을 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 또한 나타내었다 (서열 185).
도 9는 뮤린 mAb 8G8의 중쇄 가변 영역 (서열 50)의, 인간 중쇄 가변 영역 VH3 FW (서열 53) 및 VH3 FW 상의 8G8의 인간화 중쇄 가변 영역 (hu8G8.VH3) (서열 46)과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다. ●는 VL-VH 상호작용을 나타내고 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]); 이중 * (하나 위에 다른 하나)는 버니어 위치 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]) 및 FW-CDR 상호작용 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169])을 나타낸다. 위치 47, 64, 66, 68에서의 단일 *는 버니어 위치를 나타내고 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]); 위치 58에서의 단일 *는 FW-CDR 상호작용을 나타낸다 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]).
도 10은 뮤린 mAb 8G8 VL의 경쇄 가변 영역 (서열 51)의, λ4 FW 영역의 경쇄 가변 영역 (서열 55) 및 카바트 넘버링에 따른 아미노산 2 및 36에 아미노산 변화가 도입된 λ4 FW 상의 8G8의 인간화 경쇄 가변 영역 (λ4 8G8 이식편) (서열 49)과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다. ●는 VL-VH 상호작용을 나타내고 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]); 이중 * (하나 위에 다른 하나)는 버니어 위치 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]) 및 FW-CDR 상호작용 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169])을 나타낸다. 위치 47, 64, 66, 68에서의 단일 *는 버니어 위치를 나타내고 (문헌 [Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487]); 위치 58에서의 단일 *는 FW-CDR 상호작용을 나타낸다 (문헌 [Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169]). λ4 8G8 이식편을 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 또한 나타내었다 (서열 186).
도 11은 인간 항체 MSL-109의, mAb HB1과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 패널 A: MSL-109 VL (서열 90)의, 친화도-성숙 HB1 VL (또한 서열 90 (100% 동일성))과의 정렬; 및 패널 B: 인간 항체 MSL-109 VH (서열 92)의, 친화도-성숙 HB1 VH (서열 89)와의 아미노산 서열 정렬. 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 넘버링하였다. 초가변 영역 (HVR)은 박스로 표시하였다.
도 12a는 MSL-109 (서열 91) 및 IGHV3-21*01 (서열 93)로부터의 HVR-H2의 아미노산 서열, 및 생성된 다양한 아미노산 치환을 보여준다. 도 12b 및 도 12c는 돌연변이된 HVR-H2 영역을 함유하는 항체를 사용한 2개의 상이한 중화 검정의 결과를 보여준다. Fab (도 12b) 및 mAb (도 12c)를 사용한 중화 검정을 둘 다 나타내었다. IC50은 nM 단위로 제공하였다.
도 13은 상피 세포 및 섬유모세포의 감염을 예방하는 능력에 대해 λ4 8G8 이식편 및 hu8G8.VH1 (이하에서 "hu8G8") 및 HB1을 함유하는 항체를 HIG와 비교한 중화 검정의 결과를 보여준다.
도 14는 상피 세포 및 섬유모세포 상에서의 고갈된 과다면역 글로불린 (HIG)을 사용한 바이러스 중화 검정의 결과를 보여준다. HIG에서 항-gB 특이적 항체, 항-복합체 I 특이적 항체, 항-gH/gL 항체를 고갈시키거나, 또는 대조군으로서 모의-고갈시켰다.
도 15는 공지된 항-gB, 항-gH 및 항-UL131 항체와 비교하여 HB1 및 hu8G8 항체의 항원 특이성을 결정하기 위한 FACS 분석의 결과를 보여준다. x-축 상의 APC 강도는 항체 결합을 나타낸다. y-축은 임의의 강도에서 세포의 최대 개수의 백분율로 표시된, 주어진 강도에서의 세포의 비율을 플롯팅한다.
도 16은 hu8G8 및 HB1을 1:1 비로 혼합하고, 상피 세포 상에서 HCMV 감염을 억제하는 이들의 능력에 대해 희석 시리즈로 시험한 중화 검정의 결과를 보여준다. 2종의 항체의 조합물은 상가 효과를 갖고, 블리스 독립성 방정식에 따라 거동한다 (효과 A 및 B를 갖는 2종의 단일 화합물에 대한 조합된 반응 C는 C = A + B - A * B).
도 17은 가변 농도의 hu8G8을 사용한 HB1의 효능 또는 가변 농도의 HB1을 사용한 hu8G8의 효능을 결정한 중화 검정의 결과를 보여준다.
도 18은 HB1-내성 HCMV 돌연변이체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 A는 HB1 항체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 B는 hu8G8 항체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. HB1 내성 HCMV 돌연변이체는 여전히 hu8G8에 의한 중화에 대해 감수성이다.
도 19는 hu8G8-내성 HCMV 돌연변이체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 A는 HB1 항체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. 패널 B는 hu8G8 항체를 사용한 중화 검정의 결과를 보여준다. hu8G8 내성 HCMV 돌연변이체는 여전히 HB1에 의한 중화에 대해 감수성이다.
도 20은 상피 및 섬유모세포 상에서 다양한 HB1-내성 바이러스 돌연변이체와 비교하여 HCMV 균주 (WT) D1 (내성 균주를 생성할 때 동시에 VR1814 성장)의 바이러스 진입과 관련된 데이터를 보여준다.
도 21은 FACS 분석에 의한 검정시, gH 내에 내성-부여 점 돌연변이를 함유하는 세포-표면 발현된 gH/gL에 결합하는 HB1 항체의 능력을 보여준다. 다양한 항-gH 항체를 세포-표면 발현에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. x-축은 HCMV 당단백질 발현의 지표인 GFP 강도이다. y-축은 항체 결합을 나타내는 APC 신호이다.
도 22는 FACS 분석에 의한 검정시, 복합체 I 내에 내성-부여 점 돌연변이를 함유하는 세포-표면 발현된 복합체 I에 결합하는 hu8G8 항체의 능력을 보여준다. 항-UL131 항체 및 항-gH 항체를 세포-표면 발현에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. x-축은 HCMV 당단백질 발현의 지표인 GFP 강도이다. y-축은 항체 결합을 나타내는 APC 신호이다.
도 23 A 및 B는 hu8G8 및 HB1의 그의 항원에 대한 결합 친화도를 결정하기 위한 스캐차드 분석의 결과를 보여준다. 결과는 먼슨(Munson) 및 로드바드(Rodbard)의 핏팅 알고리즘을 이용하여 플롯팅하였다. y-축은 결합된 125I-표지된 항체 대 총 항체의 농도의 비를 플롯팅한다. 총 항체는 125I-표지된 항체 및 비표지된 항체의 농도로서 계산하였다.
도 24는 UL131의 펩티드 단편 (서열 194의 아미노산 41 (Ser) 내지 아미노산 68 (Ser)) (SRA-헬릭스 WT) 또는 아미노산 치환 Q47K를 함유하는 상응하는 단편 (SRA-헬릭스 Mut)에 대한 hu8G8 및 양성 대조군 항체 (항-HIS)의 결합을 측정하는 ELISA 검정의 결과를 보여준다.
발명의 실시양태의 상세한 설명
I. 정의
본원의 목적을 위해 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의된 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯한 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태가 하기 기재되어 있다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-복합체 I 항체" 및 "복합체 I에 결합하는 항체"는 항체가 복합체 I을 표적화하는데 있어 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 복합체 I에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-복합체 I 단백질에 대한 항-복합체 I 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의한 측정시 복합체 I에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 복합체 I에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 인간 CMV 단리물 사이에 보존되어 있는 복합체 I의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 다양한 종을 감염시키는 CMV 균주 사이에 보존되어 있는 복합체 I의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, "항-복합체 I 항체"는 복합체 I의 입체형태적 에피토프에 결합하고, 특정 실시양태에서 항-복합체 I 항체는 gH가 아닌 복합체 I의 개별 단백질 구성원 (즉, gL, UL128, UL130 또는 UL131) 내의 에피토프에 결합한다.
용어 "항-gH 항체" 및 "gH에 결합하는 항체"는 항체가 gH를 표적화하는데 있어 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 gH에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-gH 단백질에 대한 항-gH 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의한 측정시 gH에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, gH에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-gH 항체는 인간 CMV 단리물 사이에 보존되어 있는 gH의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-gH 항체는 다양한 종을 감염시키는 CMV 균주 사이에 보존되어 있는 gH의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 바람직한 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 차단하는 항체, 및 반대로 경쟁 검정에서 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 차단하는 참조 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇 가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "복합체 I"은 달리 나타내지 않는 한 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 감염시키는 CMV를 비롯한 임의의 시토메갈로바이러스 공급원으로부터의 임의의 천연 복합체 I을 지칭한다. 상기 용어는 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131 폴리펩티드 모두의 조합을 포함한다. 상기 용어는 또한 복합체 I의 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 HCMV gH의 아미노산 서열을 서열 1에 나타낸다. 예시적인 HCMV gL의 아미노산 서열을 서열 2에 나타낸다. 예시적인 HCMV UL128의 아미노산 서열을 서열 3에 나타낸다. 예시적인 HCMV UL130의 아미노산 서열을 서열 4에 나타낸다. 예시적인 HCMV UL131의 아미노산 서열을 서열 5에 나타낸다. HCMV gH, gL, UL128, UL130 및 UL131에 대한 추가의 예시적 서열은 진뱅크 등록 번호 GU179289에서 찾아볼 수 있고 (문헌 [Dargan et al., J. Gen. Virol. 91: 1535-1546 (2010)]), 이들은 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함되고, 서열 206 (gH), 서열 208 (gL), 서열 205 (UL128), 서열 204 (UL130); 및 서열 203 (UL131)으로서 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "복합체 II"는 달리 나타내지 않는 한 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 감염시키는 CMV를 비롯한 임의의 시토메갈로바이러스 공급원으로부터의 임의의 천연 복합체 II를 지칭한다. 상기 용어는 gH, gL 및 gO 모두의 조합을 포함한다. 상기 용어는 또한 복합체 II의 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 HCMV gH의 아미노산 서열을 서열 1에 나타내었다. 예시적인 HCMV gL의 아미노산 서열을 서열 2에 나타낸다. 예시적인 HCMV gO의 아미노산 서열을 서열 209에 나타낸다. HCMV gH, gL 및 gO에 대한 추가의 예시적 서열은 진뱅크 등록 번호 GU179289에서 찾아볼 수 있고 (문헌 [Dargan et al., J. Gen. Virol. 91: 1535-1546 (2010)]), 이들은 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함되고, 서열 206 (gH), 서열 208 (gL) 및 서열 207 (gO)로서 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "gH"는 달리 나타내지 않는 한 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 gH를 지칭한다. 상기 용어는 "전장" 비프로세싱된 gH 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 gH를 포함한다. 상기 용어는 또한 gH의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. gH의 아미노산 서열은 CMV 단리물 사이에 약 95% 동일하다. 예시적인 HCMV gH의 아미노산 서열을 서열 1에 나타낸다. HCMV gH에 대한 추가의 예시적 서열은 진뱅크 등록 번호 GU179289에서 찾아볼 수 있고 (문헌 [Dargan et al., J. Gen. Virol. 91: 1535-1546 (2010)]), 이들은 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함되고, 서열 206 (gH)으로서 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능의 억제 또는 저해 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절; 및 B-세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 변동성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 "영아"는 연령이 출생시부터 약 1년 이하의 범위인 개체 또는 대상체를 지칭하고, 0 내지 약 12개월의 영아를 포함한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체를 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의한 측정시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-복합체 I 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 별도의 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
"항-gH 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 별도의 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재하는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 상기 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2개의 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 대상체에 비독성인 제약 제제 중의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상 시술을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 질환의 발달을 지연시키거나, 또는 질환의 진행을 둔화시키거나, 또는 질환의 발병률 또는 질환 증상의 중증도를 감소시키기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로, HCMV의 감염을 중화시키는 모노클로날 항체의 개발을 기초로 한다. 특정 실시양태에서, 복합체 I에 결합하는 항체가 제공된다. 다른 실시양태에서, gH에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 HCMV 감염, 선천성 HCMV 감염, 및 HCMV-감염된 이식된 조직을 통한 환자의 감염의 예방, 억제 및/또는 치료에 유용하다. 항체는 또한 HCMV 감염의 진단에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 또한 부분적으로, 모든 태반 세포 유형: 내피 세포, 상피 세포, 단핵구/대식세포 및 섬유모세포로의 HCMV 바이러스 진입을 억제하고 HCMV 내성 균주의 형성을 감소시키고/거나 저해하는 모노클로날 항체의 조합물을 포함하는 조성물의 개발을 기초로 한다. 특정 실시양태에서, 이들 조성물의 사용 방법이 제공된다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어 HCMV 감염, 선천성 HCMV 감염, 및 HCMV로 이전에 또는 현재 감염된 환자로부터 수확된 HCMV-감염된 이식된 조직을 통한 환자의 감염의 예방, 억제 및/또는 치료에 유용하다. 조성물은 또한 HCMV 감염의 진단에 사용될 수 있다.
A. 예시적인 항-복합체 I 항체
한 측면에서, 본 발명은 복합체 I에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 UL128, UL130, UL131의 gH/gL과의 회합으로부터 유래된 입체형태적 에피토프 또는 복합체 I의 개별 구성원 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 0.7 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml 또는 그 미만의 EC90으로 HCMV를 중화시킨다. 다른 측면에서 항-복합체 I 항체는 HCVM의 표면 상의 복합체 I에 특이적으로 결합하여 0.05 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.013 μg/ml, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml, 0.009 μg/ml, 0.008 μg/ml, 0.007 μg/ml, 0.006 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.004 μg/ml, 0.003 μg/ml, 0.002 μg/ml, 0.001 μg/ml, 0.0009 μg/ml, 0.0008 μg/ml, 0.0007 μg/ml 또는 그 미만의 항체 농도에서 (예를 들어, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 항체 농도에서) 50%의 HCMV를 중화시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 10-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-복합체 I 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 10-19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 3개의 VH HVR 서열, 및 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 FR3의 제1 아미노산; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 항-복합체 I 항체의 임의의 1개 이상의 아미노산은 하기 HVR 위치에서 치환된다: HVR-L2 (서열 10)에서: 위치 4, 5, 11 및 12. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같이, 치환은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 하기 치환 중 임의의 하나 이상이 임의의 조합으로 생성될 수 있다: HVR-L2 (서열 57)에서: D4E, D4T, D4S, G5A, D11E, D11T, D11S 및 G12A. 상기 치환의 모든 가능한 조합은 서열 21의 컨센서스 서열에 포함된다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 22의 FR1 서열, 서열 23의 FR2 서열, 서열 24의 FR3 서열 및 서열 25의 FR4 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 22의 FR1 서열, 서열 27의 FR2 서열, 서열 28의 FR3 서열 및 서열 29의 FR4 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 30의 FR1 서열, 서열 31의 FR2 서열, 서열 32의 FR3 서열 및 서열 25의 FR4 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 33의 FR1 서열, 서열 23의 FR2 서열, 서열 34의 FR3 서열 및 서열 25의 FR4 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 35의 FR1 서열, 서열 36의 FR2 서열, 서열 37의 FR3 서열 및 서열 38의 FR4 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 39의 FR1 서열, 서열 40의 FR2 서열, 서열 41의 FR3 서열 및 서열 42의 FR4 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 43의 FR1 서열, 서열 44의 FR2 서열, 서열 41의 FR3 서열 및 서열 42의 FR4 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다.
임의의 상기 항체에서, VL FR3 서열은 서열 67 또는 서열 68로부터 선택된 것으로 치환될 수 있다.
또 다른 측면에서, 항-복합체 I 항체는 서열 46 또는 서열 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-복합체 I 항체는 복합체 I에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 45 또는 서열 46 또는 서열 47에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-복합체 I 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-복합체 I 항체는 복합체 I에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 48 또는 서열 49에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 10-19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-복합체 I 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 45 및 서열 49의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 46 및 서열 49의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 47 및 서열 49의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 45 및 서열 48의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 46 및 서열 48의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 47 및 서열 48의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프와 경쟁하고/거나 그에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 45-47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프와 경쟁하고/거나 그에 결합하는 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 본 발명은 서열 203의 아미노산 위치 47에서의 글루타민, 서열 203의 아미노산 위치 51에서의 리신; 서열 203의 아미노산 위치 46에서의 아스파르트산 및 그의 조합으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함하는 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 에피토프를 포함하는 상응하는 아미노산은 UL131 아미노산 서열 내의 대략 동일한 위치에 있을 수 있지만, 다양한 HCMV 균주 사이의 UL131에서의 아미노산 서열 차이로 인해 상이할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 HCMV 복합체 I의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 아미노산 서열 SRALPDQTRYK YVEQLVDLTLNYHYDAS (서열 194)를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프에 0.7 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml 또는 그 미만의 EC90으로 결합하는 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-복합체 I 항체와 동일한 에피토프에 결합하여 0.05 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.013 μg/ml, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml, 0.009 μg/ml, 0.008 μg/ml, 0.007 μg/ml, 0.006 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.004 μg/ml, 0.003 μg/ml, 0.002 μg/ml, 0.001 μg/ml, 0.0009 μg/ml, 0.0008 μg/ml, 0.0007 μg/ml 또는 그 미만의 항체 농도에서 (예를 들어, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 항체 농도에서) 50%의 HCMV를 중화시키는 항체를 제공한다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-복합체 I 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-복합체 I 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-복합체 I 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
B. 예시적인 항-gH 항체
한 측면에서, 본 발명은 gH에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-gH 항체는 gH의 에피토프에 특이적으로 결합하여 0.8 μg/ml, 0.7 μg/ml, 0.6 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.4 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.2 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.01 μg/ml, 0.015, 0.010 μg/ml 또는 그 미만의 EC90으로 HCMV를 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 항-gH 항체는 바큘로바이러스에서 생산된 gH/gL 이량체의 에피토프에 0.01 내지 0.17 nM 범위의 IC50으로 특이적으로 결합한다. 다양한 실시양태에서, IC50은 0.01 nM, 0.02 nM, 0.03 nM, 0.04 nM, 0.05 nM, 0.06 nM, 0.07 nM, 0.08 nM, 0.09 nM, 0.1 nM, 0.11 nM, 0.12 nM, 0.13 nM, 0.14 nM, 0.15 nM, 0.16 nM 또는 0.17 nM일 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 HCMV의 표면 상의 gH에 결합하여 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.013 μg/ml, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml, 0.009 μg/ml, 0.008 μg/ml, 0.007 μg/ml, 0.006 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.004 μg/ml, 0.003 μg/ml, 0.002 μg/ml, 0.001 μg/ml 또는 그 미만의 항체 농도에서 (예를 들어, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 항체 농도에서) 50%의 HCMV를 중화시킨다 .
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 72, 73 또는 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-gH 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열, 및 서열 72, 서열 73 또는 서열 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 72, 서열 73 또는 서열 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 75로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 78로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 78로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 78로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 항-gH 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산은 하기 HVR 위치에서 치환된다: HVR-H2 (서열 91)에서: 위치 6 및 8. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같이, 치환은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 하기 치환 중 임의의 하나 이상이 임의의 조합으로 생성될 수 있다: HVR-H2 (서열 91)에서: D6S, D6T, D6N, D6Q, D6F, D6M, D6L 및 T8R. 상기 치환의 모든 가능한 조합은 서열 93의 컨센서스 서열에 포함된다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-gH 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 항-gH 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-gH 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 79의 FR1 서열, 서열 80의 FR2 서열, 서열 81의 FR3 서열 및 서열 82의 FR4 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-gH 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 서열 83의 FR1 서열, 서열 84의 FR2 서열, 서열 85의 FR3 서열 및 서열 86의 FR4 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-gH 항체는 서열 92 (단, 여기서 위치 54에서의 아미노산은 Asn (N)이고/거나, 위치 56에서의 아미노산은 Asn (R)임)의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-gH 항체는 gH에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 92 (단, 여기서 위치 54에서의 아미노산은 Asn (N)이고/거나, 위치 56에서의 아미노산은 Asn (R)임)에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-gH 항체는 서열 87, 서열 88 또는 서열 89의 VH 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 72, 서열 73 및 서열 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-gH 항체는 서열 90의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-gH 항체는 gH에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 90에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-gH 항체는 서열 90의 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 77의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-gH 항체는 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 87 및 서열 90의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).
또 다른 실시양태에서, 항체는 각각 서열 88 및 서열 90의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).
또 다른 실시양태에서, 항체는 각각 서열 89 및 서열 90의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-gH 항체와 동일한 에피토프와 경쟁하고/거나 그에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 87, 88 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 90의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-gH 항체와 동일한 에피토프와 경쟁하고/거나 그에 결합하는 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 본 발명은 서열 1의 아미노산 위치 168에서의 트립토판, 서열 1의 아미노산 위치 446에서의 아스파르트산; 서열 1의 아미노산 위치 171에서의 프롤린 및 그의 조합으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함하는 항-gH 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 에피토프를 포함하는 상응하는 아미노산은 gH 아미노산 서열 내의 대략 동일한 위치에 있을 수 있지만, 다양한 HCMV 균주 사이의 gH에서의 아미노산 서열 차이로 인해 상이할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-gH 항체와 동일한 에피토프에 0.01 내지 0.17 nM 범위의 IC50으로 결합하는 항체를 제공한다. 다양한 실시양태에서, IC50은 0.17 nM 이하 (예를 들어, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM 또는 그 미만)일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, HB1 (서열 89의 VH 서열 및 서열 90의 VL 서열을 포함하는 항-gH 항체)와 동일한 에피토프에 결합하고, 0.17 nM 이하 (예를 들어, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM 또는 그 미만)의 IC50을 갖거나, 또는 0.8 μg/ml, 0.7 μg/ml, 0.6 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.4 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.2 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.01 μg/ml, 0.015, 0.010 μg/ml 또는 그 미만의 EC90으로 HCMV 감염을 중화시키는 항체가 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-gH 항체와 동일한 에피토프에 결합하여 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.02 μg/ml, 0.015 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.013 μg/ml, 0.012 μg/ml, 0.011 μg/ml, 0.010 μg/ml, 0.009 μg/ml, 0.008 μg/ml, 0.007 μg/ml, 0.006 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.004 μg/ml, 0.003 μg/ml, 0.002 μg/ml, 0.001 μg/ml 또는 그 미만의 항체 농도에서 (예를 들어, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M 또는 그 미만의 항체 농도에서) 50%의 HCMV를 중화시키는 항체를 제공한다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-gH 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-gH 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 상기 실시양태에 따른 항-gH 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 본 발명의 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에서 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트-20(MICROSCINT-20)™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 약 10의 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k오프/k온의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol Biol 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 항체의 결합 속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1을 초과하면, 분광계, 예컨대 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정된 바와 같이, 결합 속도는 25℃에서 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역투과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, "최적-적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이됨) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 개괄적으로 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 좌위를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 조성물 중의 항체는 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 바람직한 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공보 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 하나의 결합 특이성은 복합체 I 또는 gH에 대한 것이며, 나머지는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 하나의 결합 특이성은 복합체 I에 대한 것이며, 나머지는 gH에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 복합체 I 또는 gH의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포 표면 상에 복합체 I 또는 gH를 갖는 세포로 세포독성제를 국부화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(Knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2종 이상의 항체 또는 단편을 가교시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 이용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 이용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하는 것에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 복합체 I 또는 gH 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 모든 조합이 이루어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 바람직한 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 체세포 성숙 과정 동안 HVR "핫스팟", 즉, 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 바람직한 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 바람직한 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이분지 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이분지 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부차적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫꼬 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공보의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC, NK 세포를 조절하기 위한 1차 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464면 상의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. C1q 결합 검정을 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍된다는 것을 확인하기 위해 수행할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
C. 재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 기재하는 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에서 제공한 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체가 발현하는데 적합한 조건 하에서 배양하는 것, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (293 또는, 예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
D. 검정
본원에 제공된 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
한 측면에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 이용하여 복합체 I의 결합에 대해 본원에 기재된 항-복합체 I 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 이용하여 gH의 결합에 대해 본원에 기재된 항-gH 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다.
특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 gH 또는 복합체 I이 결합하는 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다.
항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 복합체 I 또는 gH를 복합체 I 또는 gH에 각각 결합하는 제1 표지된 항체 및 복합체 I 또는 gH에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 복합체 I 또는 gH를 제1 표지된 항체를 포함하고 제2 비표지된 항체를 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. 복합체 I 또는 gH에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션한 후, 잉여 비결합 항체를 제거하고, 고정화된 복합체 I 또는 gH와 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 복합체 I 또는 gH와 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 제2 항체가 복합체 I 또는 gH에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
경쟁 검정은 또한 gH 및/또는 복합체 I 또는 복합체 II의 다른 구성원으로 형질감염되고 세포 표면 상에 발현된 세포를 사용하여 FACS를 이용한 상기 기재된 바와 같은 방식으로 수행할 수 있다. 추가로, gH 및/또는 재구성된 복합체 I 또는 복합체 II를 사용한 ELISA를 또한 경쟁 검정에 이용할 수 있다. 항-gH 및 항-복합체 I 항체를 측정하기 위한 FACS 및 ELISA의 이용은 실시예에 추가로 기재되어 있다.
2. 활성 검정
한 측면에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-복합체 I 항체를 확인하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은 0.7 μg/ml 이하의 EC90으로 HCMV를 중화하는 것, 예를 들어 UL128, UL130, UL131 및 gH/gL의 회합으로부터 유래하는 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것, 또는 복합체 I의 단일 단백질 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, EC90은 0.5 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.3 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.1 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.08 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.06 μg/ml 이하이다. 또 다른 실시양태에서 EC90은 0.04 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.02 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.015 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.012 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.011 μg/ml 이하이다. 다른 실시양태에서 EC90은 0.010 μg/ml 이하이다. 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
한 측면에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-gH 항체를 확인하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어 1 μg/ml, 0.9 μg/ml, 0.8 μg/ml, 0.7 μg/ml, 0.6 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.4 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.2 μg/ml, 0.1 μg/ml, 0.09 μg/ml, 0.08 μg/ml, 0.07 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.05 μg/ml, 0.04 μg/ml 또는 그 미만의 EC90으로의 HCMV의 중화를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 중의 항-gH 항체는 0.17 nM 이하 (예를 들어, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM 또는 그 미만)의 IC50으로 바큘로바이러스에서 발현된 gH/gL 이량체에 결합한다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 이러한 검정의 예시적인 설명을 위해서는 실시예 3을 참조한다.
E. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체를 포함하는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합되어 있는 것인 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 제조된 상기 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지 않는다.
F. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 임의의 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물은 생물학적 샘플에서 복합체 I 및/또는 gH의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 태반, 신장, 심장, 폐, 간, 췌장, 장, 흉선, 골, 건, 각막, 피부, 심장 판막, 및 정맥을 포함한다. 추가로, 항체를 포함하는 조성물은 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포 및 대식세포에서 HCMV를 검출하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출의 방법에 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 복합체 I 및/또는 gH의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 복합체 I에 대한 항-복합체 I 항체의 결합 및/또는 gH에 대한 항-gH 항체의 결합을 허용하는 조건 하에, 본원에 기재된 바와 같은 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것, 및 항-복합체 I 항체와 복합체 I 및/또는 항-gH 항체와 gH 사이에 복합체가 형성되었는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체의 조합물은 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체의 조합물을 사용한 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용되며, 예를 들어 여기서 복합체 I 및 gH는 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
본 발명의 조성물을 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 HCMV 감염, 예컨대 이식된 기관 또는 조직으로부터의 HCMV 감염, 선천성 HCMV 감염, 임신 동안의 HCMV 감염, 및 소아, 영아 및 성인에서의 HCMV 감염을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
G. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-복합체 I 항체, 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체I 항체 및 항-gH 항체의 조합물의 제약 제제는 바람직한 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 본원에 기재된 바와 같이, 항-복합체 I 항체 및 항-gH 항체는 단일 조합된 제약 제제로, 또는 별개의 제약 제제로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법 (rHuPH20 포함)은 미국 특허 공보 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정한 적응증에 대해 필요하다면, 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체에 더하여 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
H. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 임의의 조성물이 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 추가 측면에서, HCVM 감염을 치료하는데 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 HCMV 감염을 앓는 개체에게 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 조직, 기관 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 조직 또는 기관 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 조직 또는 기관 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다. 추가 실시양태에서, 이식 수용자 또는 개체는 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, HCMV 재활성화 및 감염의 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 개체 또는 이식 수용자에게 유효량의 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 HCMV 감염된 영아 또는 잉태 동안 HCMV에 노출된 영아에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 영아의 치료 방법에 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 감염의 위험이 있는 개체에서 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 항-복합체 I 항체 또는 항-gH 항체, 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 생산 또는 제조에서의 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체 또는 항-복합체 I 항체와 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 HCMV 감염을 앓는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하여, HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하는데 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서 의약은 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 조직, 기관 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 조직 또는 기관 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 조직 또는 기관 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다. 추가 실시양태에서, 이식 수용자 또는 개체는 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, HCMV 재활성화 및 감염의 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 의약은 유효량의 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 의약은 HCMV 감염을 억제하거나 또는 예방하기 위해 감염의 위험이 있는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체에서 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 의약은 HCMV 감염된 영아 또는 잉태 동안 HCMV에 노출된 영아에게 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 영아를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 의약은 개체에서 HCMV 바이러스 역가를 감소시키거나 또는 HCMV 바이러스 역가의 증가를 예방하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 HCMV 바이러스 역가를 감소시키거나 HCMV 바이러스 역가의 증가를 예방하기 위해 개체에게 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 HCMV 감염의 위험이 있는 인간, 및/또는 임산부 및/또는 기관 이식 수용자이다.
추가 측면에서, 본 발명은 HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 개체에게 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 개체 또는 이식 수용자에게 항-복합체 I 항체 및 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 선천성 HCMV 감염 또는 이식된 조직, 기관 또는 공여자가 HCMV에 감염되어 있거나 또는 감염된 적이 있는 것인 조직 또는 기관 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 조직 또는 기관 이식 수용자는 HCMV 감염에 대해 혈청음성이다. 추가 실시양태에서, 이식 수용자 또는 개체는 이전에 HCMV에 감염된 적이 있고, HCMV 재활성화 및 감염의 위험이 있다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 HCMV 감염된 영아 또는 잉태 동안 HCMV에 노출된 영아에게 본 발명의 항체 또는 그의 조합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 영아를 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 감염의 위험이 있는 개체에서 HCMV 감염을 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 HCMV 감염을 억제하거나 또는 예방하기 위해 개체에게 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 HCMV 바이러스 역가를 감소시키거나 또는 HCMV 바이러스 역가의 증가를 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 HCMV 바이러스 역가를 감소시키거나 또는 HCMV 바이러스 역가의 증가를 예방하기 위해 개체에게 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 HCMV 감염의 위험이 있는 인간, 및/또는 임산부 및/또는 기관 이식 수용자이다.
HCMV 바이러스 역가는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어 바이러스 항체를 측정하기 위한 ELISA, 바이러스 DNA (바이러스 로드를 결정하기 위한 특정 바이러스 유전자 및/또는 바이러스 게놈)의 양을 정량화함으로써 HCMV의 존재를 측정하기 위한 혈청학적 또는 조직 기반 검정, 및/또는 샘플로부터 바이러스를 배양하는 것에 의해 측정할 수 있다. 이러한 진단 시험은 상업적으로 시판되며, 예를 들어 HCMV DNA의 정량화에 의해 HCMV 감염을 진단하고 항바이러스 요법을 모니터링하는데 사용될 수 있는 코바스(COBAS)® 앰플리프렙(AmpliPrep)/코바스® 택맨(TaqMan)® CMV 시험 및 코바스® 앰플리코르(AMPLICOR) CMV 모니터 시험 (로슈(Roche))이 있다. 특정 실시양태에서, 개체에서의 HCMV 바이러스 역가는 치료되지 않은 개체와 비교하거나 또는 치료 전의 동일한 개체의 바이러스 역가와 비교하여 약 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 그 미만 중 임의의 것만큼 감소된다.
추가 실시양태에서, 이식된 기관 또는 조직은 하나의 개체로부터 제2 개체로 이식될 수 있는 임의의 기관 또는 조직일 수 있다. 예를 들어, 이식된 기관은 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장 또는 흉선일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 추가로, 예를 들어 이식된 조직은 손, 각막, 피부, 안면, 랑게르한스섬, 골수, 줄기 세포, 전혈, 혈소판, 혈청, 혈액 세포, 혈관, 심장 판막, 골, 골 전구 세포, 연골, 인대, 건, 근육 내벽일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-복합체 I 항체 및/또는 gH 항체를 포함하는 조성물 및 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체, 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 조성물 중의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 간시클로비르, 발간시클로비르, 포스카르넷 및/또는 시도포비르이다. 다른 실시양태에서, 추가의 치료제는 추가로 치료적으로 단리된 항체이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체 조성물의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물 (및 임의의 추가 치료제)은 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 조성물은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 전문의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로, 조성물은 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 중에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료법의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 조성물 중에 함유된 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합으로 사용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 조성물 중에 포함된 각 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형과 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 간에, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg-10 mg/kg)의 각각의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 바람직한 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 각 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체 대신에 또는 이에 더하여 본원에 기재된 항체의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
I. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 용기가 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 보유하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합하여 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥주사액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에 조성물을 함유하고 있는 제1 용기 (이 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 (b) 그 내부에 조성물을 함유하고 있는 제2 용기 (이 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조품이 항-복합체 I 항체 및/또는 항-gH 항체 대신에 또는 이에 더하여 본원에 기재된 항체의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 기초하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
물질 및 방법
바이러스 성장. VR1814 (라벨로 랩, 폰다지온 IRCCS 폴리클리니코 산 마테오(Ravello Lab, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo), 이탈리아 파비아)를 DMEM 중의 경우를 제외하고는 지시된 바와 같이 7-14 계대에서 배양된 인간 태아 폐 섬유모세포 (MRC5) (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), ATCC; 버지니아주 마나사스) 중에서 확대시키거나, 또는 지시된 바와 같이 4-6 계대에서 P0 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) (론자(Lonza); 스위스 바젤) 중에서 확대시키고, 상청액을 농축시키고, 완전 배지 중에 재현탁시키고, 동결시켰다. 완전 배지는 10% 소 태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L 글루타민 (모두 인비트로젠(Invitrogen)으로부터; 캘리포니아주 칼스배드) 및 10 mM HEPES (셀그로(Cellgro); 버지니아주 마나사스)로 보충된 DMEM으로 구성하였다. 검정을 MRC5 및 HUVEC 세포 중에서 및 또한 인간 망막 색소 상피 세포 (ARPE-19) (지시된 바와 같이 ATCC-배양됨), 단핵구 유래 대식세포 (MDM) 및 태반 상피 세포인 세포영양막 중에서 96 웰 플레이트에서 수행하였다. MDM은 지시된 바와 같이 로제트셉(RosetteSep) 인간 단핵구 풍부화 칵테일 (스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), 캐나다 브리티쉬 컬럼비아주 밴쿠버)을 사용하여 전혈로부터 단리하였다. 이어서, 단핵구를 0.1 μg/ml 리포폴리사카라이드 (LPS) (인비보젠(Invivogen))로 자극하고, DMEM 중에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈소판 및 결합되지 않은 세포를 감염 전에 PBS로 세척하여 제거하였다. 세포영양막을 19주 태반 (페레이라 랩(Pereira Lab), UCSF, 문헌 [Librach et al., 1991, JCV 113:437-449]로부터의 프로토콜을 이용함)으로부터 단리하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 세포영양막 시료를 세포영양막 마커 시토케라틴 7 (CK7) (다코(Dako))에 대해 검정하여, 감염 시작시에 90% 초과 양성임을 밝혔다.
하기 HCMV 균주는 제이 넬슨 박사(Dr. Jay Nelson) (유니버시티 오브 오리건 헬쓰 앤드 사이언스 유니버시티(University of Oregon Health and Science University) (OHSU); 오리건주 포틀랜드)로부터 얻었다: Adinis, Brown, Cano, Davis, Dement, Grunden, Harris, Keone, Lysistrata, NewRock, Phoebe, Powers, Salvo, Schmoe, Simpson 및 Watkins. 하기 HCMV 균주는 순웬 초우 박사(Dr. Sunwen Chou) (OHSU)로부터 얻었다: C079, C323, C327, C336, C352, C353 및 C359. 해동시킨 바이러스를 MRC5 섬유모세포에 첨가하고, 100% CPE가 가시적일 때까지 성장하도록 하였다 (감염후 대략 10-12일). 3일 후, 세포를 스크랩핑하고, 상청액을 수확하고, 초원심분리를 이용하여 농축시켰다. 각 균주의 희석물을 사용하여 96-웰 플레이트에서 새로운 섬유모세포를 감염시켰다. 바이러스를 18시간 동안 감염되도록 하고, 그 후에 세포를 100% 에탄올로 고정시켰다. Mab810, 항-IE 항체 (밀리포어(Millipore); 매사추세츠주 빌레리카)로 염색하고, 면역형광 분석을 수행하였다. 역가를 계산하고, 이를 이용하여 중화 검정을 위해 1의 감염 다중도 (MOI)에 필요한 바이러스의 양을 결정하였다.
중화 검정. 검정을 DMEM (깁코(Gibco)) 중에서 수행하고 상기 기재된 바와 같은 면역형광에 의해 검출한 것을 제외하고는 본질적으로 문헌 [Abai et al., 2007, J. Immunol Methods, 322:82-93]에서와 같이 중화 검정을 수행하였다. 간략하게, 항체를 연속적으로 희석하고, 최종 비리온 농도가 배지 또는 비-억제성 항체와 혼합하였을 때 대략 1의 세포당 감염성 바이러스 (MOI=1)가 되도록 완전 배지 중에 희석한 바이러스와 혼합하였다. 항체 및 바이러스를 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, MRC5, ARPE-19, HUVEC 또는 단핵구-유래 대식세포 (MDM)의 전면 단층에 첨가하였다. 바이러스를 18시간 동안 감염되도록 하고, 이 시간 후에 세포를 100% 에탄올로 고정시켰다. 세포를 PBS, 2% BSA 중에서 차단시키고, 이어서 항-HCMV IE 항체, Mab810 (밀리포어) 또는 토끼 항 HCMV IE (존슨 랩(Johnson Lab), 오리건 헬쓰 사이언스 유니버시티)로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 적절한 알렉사플루오르 488(AlexaFluor 488) 및 훽스트(Hoechst) 염색제 (인비트로젠)와 함께 인큐베이션하였다. 주어진 항체 농도를 함유하는 2벌 웰로부터의 데이터를 평균화하고, 항체의 부재 하에서의 감염 (100%로 설정됨)과 비교하였다. 이미지엑스프레스(ImageXpress)® 마이크로(Micro)™ 및 메타엑스프레스(MetaXpress)® (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)를 이용하여 세포를 영상화하고 계수하였다. 데이터를 로그 변환하고, 정규화하고, 그래프화하고, 프리즘(Prism) (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 캘리포니아주 라 졸라)을 이용하여 EC50 및 EC90을 계산하였다. EC50-곡선 핏팅 알고리즘을 이용하여 최적-적합 곡선으로부터 EC90 값을 계산하였다. 검출의 검정 범위는 웰당 100-6.5 x 105개 감염성 바이러스 입자였다. 검정 검증은 실험 사이에, 특히 바이러스의 감염 다중도를 달리하여 확인하였다.
임상 균주의 증폭 및 클러스터링. HCMV의 임상 균주 (오리건 헬쓰 사이언스 유니버시티로부터)를 섬유모세포 상에서 성장시키고, 상청액을 수확하고, 초원심분리를 이용하여 농축시켰다. DNeasy 혈액 & 조직 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 감염된 세포로부터 DNA를 단리하였다. 공개된 HCMV 균주의 정렬을 이용하여 HCMV 유전자 프라이머를 설계하였다. 500개 염기 미만으로 떨어진 보존 영역을 선택하였다. 임상 균주로부터의 서열을 시퀀셔(Sequencher)®를 이용하여 확인하고, 맥벡터(MacVector)를 이용하여 번역하였다. 정렬을 잘뷰(Jalview) 정렬 편집기에서 클러스탈W(ClustalW)에 의해 수행하고, 최근접 동일성 %를 이용하여 트리를 구축하였다.
바큘로바이러스에 의한 단백질 발현. 발현된 단백질을 검출하기 위해, 토끼 폴리클로날 항체를 표준 절차에 의해 생산하였다. 각각의 토끼를 HCMV 단백질에 상응하는 펩티드로 면역화시켰다. 펩티드는 하기와 같았다:
Figure pct00002
혈청을 펩티드-결합된 칼럼 상에서의 포획 및 후속적 용리에 의해 정제하였다. 분비된 단백질을 위해, 각각의 개별 HCMV 단백질의 세포외 도메인에 대해 바큘로바이러스 구축물을 제조하였다. 각각의 HCVM 세포외 도메인을 C-말단 상의 바큘로바이러스 신호 서열 및 6X-His 태그에 융합시켰다. 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 SF9 또는 Tini 곤충 세포를 감염시켰다. 단백질을 수확하고, 겔 여과하고, 아크릴아미드 겔 전기영동 및 쿠마시 염색에 의해 검사하였다. 모든 5종의 단백질 (gH, gL, UL128, UL130 및 UL131)을 함유하는 분획을 모았다. gB S64-K115를 Q499-E655에 융합시킴으로써 gB 삼량체 구축물을 생성하였다. 곤충 세포의 감염에 의해 발현되었을 때, 상기 구축물은 막 고정되지 않은 gB 단백질을 생성하고, 예상한 바와 같이 삼량체를 형성하고, 중화 및 비-중화 gB 항체에 결합하였고, 그의 융합전 형태로 있을 확률이 높았다. gH 및 gL이 공발현되었을 때, 생성된 gH/gL 단백질은 비-입체형태적 및 입체형태적 gH 에피토프를 둘 다 인식하는 HB1 및 하기 항체에 결합하였다: MSL-109, 토끼 항-gH, 토끼 항-gL (데이비드 존슨(David Johnson)으로부터, OHSU, 문헌 [Ryckman et al., J. Virol. 82:60-70 (2008)), 토끼 항-gH_977 및 토끼 항-gL_873. gH, gL, UL128, UL130 및 UL131에 의한 곤충 세포의 동시감염은 hu8G8, 및 토끼 항-gH, 항-gL, 항-UL128, 항-130, 항-131 및 상기 기재된 토끼 폴리클로날 항체를 비롯한 비-입체형태적 및 입체형태적 항체에 결합하는 소량의 이종유래 단백질을 생성하였다.
pRK-CMV 벡터의 구축. 전장 바이러스 당단백질의 표면 발현을 위해, 3종의 별개의 인간 발현 플라스미드를 구축하였다. 개별 HCMV 유전자를 시작위치부터 정지위치까지 증폭시켰다. gH, gL, gB를 게놈 DNA로부터 증폭시키고, UL128, UL130, UL131을 cDNA로부터 증폭시키고, 첫째로 PCR 블런트 II 토포(PCR Blunt II TOPO) (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 그 후, 각각의 HCMV 유전자 및 마지막 3' 유전자를 eGFP를 코딩하는 유전자로부터 분리하는 "자가-절단 2A 펩티드" 서열 (문헌 [Szymczak et al., Nat. Biotechnol. 22:589-94 (2004)])과 함께 제넨테크 포유동물 발현 벡터 (pRK-tk-Neo) 내로 유전자를 클로닝하였다. 3종의 플라스미드를 하나는 gB 및 eGFP와 함께, 하나는 gH, gL 및 eGFP와 함께, 및 하나는 UL128, UL130, UL131 및 eGFP와 함께 구축하였다. 리포펙타민 2000 (인비트로젠; 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 인간 배아 신장 (HEK)-293T 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, ATCC; 버지니아주 마나사스) 내로 플라스미드를 형질감염시켰다.
시토감(Cytogam)® (HIG) 고갈. 상피 세포 내로의 바이러스 진입을 중화시키는 HIG의 성분의 검정을 위해, HEK-293T 세포를 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 사용하여 각각 gB/eGFP 또는 gH/gL/eGFP 및 UL128/UL130/UL131/eGFP 또는 모의 플라스미드로 형질감염시키고, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 아쿠타제(Accutase) (시그마(Sigma))를 사용하여 해리시키고, 펠릿화하고, 12개의 분취액으로 분할하였다. 시토감®을 PBS 및 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 중에 20 μg/ml로 희석하고, 3 x 107개의 감염된 세포와 함께 현탁액 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 시토감®을 3 x 107개의 감염된 세포의 새로운 분취액으로 연속적으로 옮겼다. 새로운 세포 상의 계대배양을 항체의 최대 특이적 고갈이 확인될 때까지 수행하였다 (6 계대). ELISA 검정을 수행하여 특정 HCMV 특이적 항체의 고갈을 검출하였다. 맥시소르프(Maxisorp) (눈크) 플레이트를 PBS 중 정제된 바큘로바이러스 생산된 gB, gH/gL 또는 gH/gL/UL128/UL130/UL131 및/또는 감염된 HEK293T 세포의 용해물로 코팅하였다. 검출을 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-인간 IgG, Fcγ (잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory), 메인주 바 하버)를 사용하여 결정하였다. 검출의 하한치는 0.08 μg/ml였다. 이어서, 생성된 HIG를 상기 기재된 바와 같은 중화 검정에 사용하기 위해 100 kD 분자량 컷오프 농축기 (센트리콘(Centricon))를 사용하여 농축시켰다.
친화도 고갈 칼럼을 하기 방식으로 생성하였다. 단백질 (가용성 gB 또는 gH/gL 1-2 mg)을 PBS에 대하여 충분히 투석하고, PBS 중에서 평형화시킨 스테로진(Sterogene) ALD 슈퍼플로우(Superflow) 수지 대략 1 ml에 첨가하였다. 나트륨 시아노보로히드라이드 (1 M 용액 0.2 ml)를 첨가하여 단백질을 알데히드 함유 수지에 화학적으로 커플링시키고, 반응을 4℃에서 밤새 진행되도록 하였다. 개별 수지를 소형 칼럼 내에 로딩하고, PBS로 충분히 세척하여 임의의 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 800 μl 부피의 시토감® 2 밀리그램을 칼럼 상에 로딩하고, 0.4 mL/분의 유량으로 PBS로 세척하였다. 결합되지 않은 단백질을 몇 개의 0.5 ml 분취액 중에 수집하고, 이들을 별개로 5000 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 회전 농축기에서 대략 100 μl로 농축시켰다. 샘플을 멸균 여과하고, 검정시까지 4℃에서 보관하였다.
FACS. 앞서 기재된 pRK-CMV 벡터를 단독으로 또는 gH/gL 및 UL128-131과 함께 50:50 비로 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 사용하여 HEK293T 세포 내로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 아쿠타제 (시그마)를 사용하여 해리시켰다. 모든 1차 또는 2차 항체 (잭슨 랩스)의 인큐베이션 및 세척은 PBS, 2% FCS, 0.2% 나트륨 아지드 (FACS 완충제) 중에서 이루어졌다. 염색한 후, 세포를 FACS 완충제 중 2% 파라포름알데히드 중에서 고정시켰다. FACS 칼리버4(Calibur4) (벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson))를 사용하여 형광 분석을 수행하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타 인크.(Tree Star Inc.))를 사용하여 데이터를 가공하였다.
내성 바이러스 돌연변이체의 생성. 본원에 기재된 항체에 내성이 있는 바이러스 돌연변이체를 생성하기 위해, HCMV 균주 VR1814를 준최적 농도의 항체 MSL-109 (문헌 [Aulitzky et al., J. Infect. Dis. 163:1344-47 (1991)], 제넨테크에서 합성됨), HB1, hu8G8, 또는 ARPE 19 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, ATCC; 버지니아주 마나사스) 중의 HB1 및 hu8G8의 조합물의 존재 하에 상피 세포 상에서 성장시켰다. 24 웰 플레이트에서 3개의 웰을 사용하여 각각 EC50, 2X EC50 또는 EC90의 항체 및 0.5의 감염 다중도 (MOI)로 실험을 시작하였다. 각 주마다, 각 웰 부피의 절반을 새로운 세포 상에서 계대배양하고, 항체의 농도를 1.5배로 증가시키거나 또는 안정상태를 유지하였다. 전형적으로, 돌연변이체는 대략 9 계대에 의해 단일 바이러스 플라크로 나타났다. 이들 바이러스를, 항체의 농도를 10X EC90의 최종 농도로 증가시키면서 성장시켰다. 후속적으로, 돌연변이체를 스톡화하고, 상기 기재된 바와 같은 중화 검정에 의해 HB1 및 hu8G8에 대한 내성에 대해 분석하였다. 전체 과정을 ARPE-19 세포 상에서 별개로 4회 (항체 농도당 3개의 웰), 및 MRC5 세포 상에서 HB1 및 MSL 109만을 사용하여 (hu8G8이 MRC5 세포 상에서 바이러스를 중화시키지 않음) 별개로 2회 개시하였다.
추가의 내성 돌연변이를 생성하기 위해, 세포외 바이러스를 N-에틸-N 니트로소우레아 (ENU, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 미주리주 세인트 루이스) 또는 자외선 (254λ 스트라타링커(Stratalinker), 스트라타진(Stratagene); 캘리포니아주 산타 클라라)으로 처리하고, 24-웰 포맷 (처리당 24개의 웰) 또는 96-웰 포맷 (처리당 72개의 웰)으로 ARPE-19 또는 MRC5 세포를 감염시키도록 하였다. 감염 후 (1 또는 2의 MOI에서), 배지를 EC100의 HB1 또는 EC100의 hu8G8 또는 각각 EC50의 두 항체의 조합물, 또는 간시클로비르 (GCV, 시그마-알드리치)를 함유하는 완전 배지로 대체하였다. 각 주마다, 상청액을 항체 또는 GCV의 농도를 증가시키면서 새로운 세포로 계대배양하였다. 성장중인 바이러스를 보다 큰 웰로 옮기고, 2-3개월 후에 스톡화하였다. 전체 과정을 별개로 2회 개시하였다.
당단백질의 서열분석. DNA를 대조군 또는 돌연변이체 바이러스 감염된 세포 또는 상청액으로부터 단리하였다 (DNA 혈액/조직 추출 키트, 퀴아젠; 캘리포니아주 발렌시아). 미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI) 데이터베이스에서 이용가능한 HCMV 균주 AD169, FIX, TB40E, Toledo 및 Towne 서열의 정렬에 따라 각각의 유전자 사이에 보존된 서열에 대해 프라이머를 설계하였다. 당단백질 H를 각각의 임상 균주로부터 시작 코돈부터 정지 코돈 직전의 염기 2196까지 증폭시켰다. 당단백질 B를 시작위치부터 정지 코돈 직전의 염기 2686까지 증폭시켰다. UL128, UL130 및 UL131을 각각 문헌 [Akter et al., J. Gen. Virol. 84:1117-22 (2003)]으로부터 얻은 cDNA 서열에 따라 시작위치부터 정지위치까지 증폭시켰다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 생성물을 염료 종결자 반응을 이용하여 서열분석하고, 서열을 정렬시키고 말단절단하였다 (시퀀서(Sequencer)).
돌연변이의 개괄. 상기 기재된 바와 같이, gH/gL 유전자 또는 UL128/UL130/UL131 유전자를 함유한 pRK-CMV 발현 플라스미드를 각각의 내성 돌연변이체에서 발견되는 단일 돌연변이를 치환하도록 변형시켰다. 각각의 gH/gL 플라스미드를 HEK 293T 세포 (ATCC) 내로 형질감염시키고 (리포펙타민 2000, 인비트로젠; 캘리포니아주 칼스배드), 2일 동안 발현되도록 하고, 이어서 상기 기재된 바와 같은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석에 의해, 대조군 항-gH 항체 10F8 또는 HB1에 결합하는 표면 발현된 HCMV 단백질의 능력에 대해 평가하였다. 각각의 UL128/UL130/UL131 플라스미드를 gH/gL 플라스미드로 동시형질감염시키고, 2일 동안 발현되도록 하고, 이어서 HB1, hu8G8 및 대조군 토끼 항-UL131_993 항체에 결합하는 표면 발현된 단백질의 능력에 대해 평가하였다. 분석 및 영상을 플로우조 (트리스타; 오리건주 애슐랜드)를 사용하여 생성하였다.
바이러스 진입의 분석. 내성 및 대조군 균주의 스톡 (항체의 부재 하에 ARPE-19 세포 상에서 동시에 계대배양함)을 성장시키고, 상청액을 수확하였다 (순수). 정량적 PCR (qPCR)을 pp65 DNA에 대해 수행하였다 (pp65F TCGCGCCCGAAGAGG (서열 189), pp65R CGGCCGGATTGTGGATT (서열 190), 택맨 프로브 CACCGACGAGGATTCCGACAACG (서열 191)). 복제수를 확인하기 위해, 표준 곡선을 제로 블런트 PCR 클로닝(Zero Blunt PCR Cloning) (인비트로젠) 내로 클로닝된 pp65를 사용하여 수득하였다. 고정 및 가시화 전에 18시간 동안, 복제수를 기초로 한 바이러스의 희석물로 ARPE-19 및 MRC5 세포를 감염시키도록 하였다. DNA 카피당 감염성 입자를 계산하고, 항체 없이 통과시킨 균주에 대해 정규화하고, 엑셀(Excel) 버전 14.1.2 (마이크로소프트(Microsoft); 워싱턴주 레드몬드)를 사용하여 그래프화하였다.
실시예 1 - 항-복합체 I 및 항-gH 항체의 생산
항-복합체 I 뮤린 mAb 8G8의 생산. Balb/c 마우스의 2개의 군 (각각의 군에 10마리)을 전체 UV 비활성화된 (3000mJ) HCMV (균주 VR1814)로 마우스당 1 x 106 pfu의 농도로 주 2회 총 7회의 SC/IP 주사로 면역화시켰다. 동물의 제1 군에서, 각각의 마우스를 RIBI 아주반트로 프라이밍하고, 후속적으로 PBS 중 HCMV를 주사하였다. 마우스의 제2 군에서, 동물을 프라이밍하지 않고, 이어서 RIBI 아주반트 중 HCMV를 주사하였다. 면역화된 마우스의 시험 채혈을 ELISA에 의한 혈청 샘플 적정 및 상기 기재된 바와 같은 바이러스 중화 검정에 적용시켰다. 상위 5마리의 응답한 마우스를 하이브리도마의 생산을 위해 선택하였다. 별개의 2 세트의 융합을 슬와 및 서혜 림프절로부터의 림프구 및 마우스 골수종 세포주 X63-Ag8.653을 사용하여 수행하였다. 융합된 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트 (58 플레이트)에 플레이팅하고, HAT 배지 공급 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)을 이용한 하이브리도마 선택을 융합 1일 후 시작하였다. 총 738개의 IgG+ 하이브리도마를 상기 기재된 바와 같이 상피 세포 상에서 바이러스 중화 검정을 이용하여 스크리닝하였다. 생성된 항체에 대한 HCMV 균주 VR1814에 대한 EC50 (μg/ml)을 다양한 세포 유형에 대해 시험하고, MSL-109 (항-gH 항체)와 비교하여 하기 표 2에 나타내었다. 모노클로날 항체 8G8이 스크리닝에서 확인된 가장 강력한 중화 항체였고, 이를 인간화 및 추가 특성화를 위해 선택하였다.
<표 2>
Figure pct00003
뮤린 8G8 mAb의 인간화 및 분석. 뮤린 하이브리도마 8G8을 람다 3 또는 4 경쇄 (도 2) 및 VH1, VH3 또는 VH7 중쇄 프레임워크 (도 1)를 이용하여 표준 CDR 이식에 의해 인간화하였다. 비교를 위해, λ3 및 λ4에 대한 컨센서스 인간 λ 배선 서열의 정렬을 도 2에 나타내었다. 8G8 인간/뮤린 키메라 항체 (QE7/C2)를 8G8 λ3 또는 λ4 경쇄와 조합된 8G8 VH1, VH3 또는 VH7 인간화 중쇄와 비교하여 중화 검정을 수행하였다. λ4 변이체는 HCMV를 중화시키지만 λ3 변이체는 그렇지 않다는 것이 밝혀졌다 (도 3).
λ4의 HVR-L2를 도 4에 나타낸 바와 같이 돌연변이시켜, 카바트 넘버링에 따른 아미노산 50C, 50D, 56에서의 치환, 뿐만 아니라 아미노산 57 (FR3의 제1 아미노산)에서의 아미노산 치환을 도입시킴으로써 항체에 안정성을 제공하였다. 이어서, 다양한 돌연변이된 경쇄를 8G8 인간 VH1 쇄와 조합하고, 생성된 항체를 상기 기재된 바와 같은 중화 검정으로 시험하였다. 단일 아미노산 치환을 갖는 항체는 모두 우수한 중화 활성을 보여주었다 (즉, A1, E1, T1, A2, E2 및 T2) (도 5). 마찬가지로, 2개의 아미노산 치환을 함유하는 모든 항체는 우수한 중화 활성을 보여주었다 (즉, SGSG 및 TGDA). 단일 돌연변이체 SG가 비교 대조군으로서 포함되었고, 이는 또한 우수한 중화 활성을 보여주었다. (도 6).
인간화 8G8 λ4 항체 서열을 도 7 (hu8G8.λ4 FW)에 나타내었다. 도 8은 인간화 8G8 VH1 서열 (hu8G8.VH1)의 서열을 보여주고, 반면에 도 9는 인간화 8G8 VH3 서열 (hu8G8.VH3)의 서열을 보여준다. 도 10은 처음 2개의 아미노산 (QP)이 폴리펩티트가 세린으로 시작하도록 변형되고 (Q는 결실되고 L은 S로 돌연변이됨) 아미노산 36이 뮤린 아미노산 (Y)으로 유지되는 인간화 8G8 λ4 항체 서열을 보여준다. 상기 항체의 폴리펩티드 서열을 λ4 8G8 이식편으로서 나타내었다. 폴리펩티드를 코딩하는 대표적인 핵산 서열을 폴리펩티드 서열 아래에 나타내었다.
항-gH 항체의 친화도 성숙. 모노클로날 항체 MSL-109를 1994년 8월 4일에 공개된 PCT 공보 번호 WO 94/16730 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 공개된 MSL-109의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열에 대한 항체 서열을 이용하여 합성하였다. MSL-109 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열을 도 11 (VL, 서열 90; VH, 서열 92)에 나타내었다. MSL-109 항체는 중쇄 VH3 및 경쇄 Vκ2를 함유하는 IgG1 프레임워크를 기초로 하였다. 상기 항체를 코딩하는 재조합 DNA를 CHO 세포 내로 클로닝하였다.
항체 MSL-109를 상보성 결정 영역 (CDR)의 무작위화에 의해 친화도 성숙시키고, 이어서 점진적 한계 농도의 비오티닐화 gH/gL을 사용한 파지 디스플레이에 의해 결합제를 선택하였다. CDR의 각각의 위치를 "NNK" 코돈 (여기서, N은 4개의 천연 뉴클레오티드 중 임의의 것이고, K는 50% 티민 및 50% 구아닌임)을 갖는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발에 의해 무작위화하였다. NNK 코돈은 20종의 천연 아미노산 중 임의의 것을 코딩할 수 있다. 경쇄 및 중쇄를 위한 라이브러리를 별개로 제조하고, 각 쇄의 3개의 CDR 각각을 동시에 무작위화하였다. 이는 각 쇄 내에 0 내지 3개의 무작위 아미노산 변화를 갖는 클론을 생성하였다 (각 CDR에 1개 이하의 돌연변이를 가짐). 라이브러리를 파지 Fab 단편 디스플레이 벡터에서 표준 방법에 의해 제조하였다. 파지 디스플레이 라이브러리를 연속적인 선택 라운드에서 1 및 0.1 nM 비오티닐화 gH/gL과 함께 인큐베이션하고, 이어서 100 nM gH/gL 또는 MSL-109 IgG와 경쟁시켜 보다 낮은 친화도 클론이 gH/gL에 결합하는 것을 감소시킴으로써 결합하는 클론을 선택하였다. 결합된 클론을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획하고, 실온에서 10분 동안 10 mM HCl 중에서 세척 및 용리하였다. 용리된 파지를 1/10 부피의 1 M 트리스 pH 8.0으로 중화시키고, 다음 선택 라운드를 위한 증폭을 위해 이. 콜라이를 감염시키는데 사용하였다. 제 2선택 라운드로부터의 클론을 서열분석하여, 선택된 파지에서 빈번한 돌연변이를 결정하였다. 선호되는 돌연변이를 갖는 클론을 경쟁 파지 ELISA에 의해 시험하였다.
중쇄 카바트 위치 53 및 55에서 개별 또는 조합된 돌연변이를 갖는 돌연변이체 MSL-109의 IgG와 Fab 단편을 발현시켜 CMV의 시험관내 중화에 대해 시험하였다. 아미노산 53에서의 아미노산 치환 (D53을 S, I, N, Q, F, M, L, G, H, K, W, Y, V 또는 A로 대체함)은 단독으로 또는 아미노산 55에서의 아미노산 치환 (T55를 R 또는 K로 대체함)과 조합되어, 개선된 중화 능력을 갖는 항체를 제공하였다 (도 12b 및 12c). 이들 변화 중 일부의 개략도를 도 12a에 나타내었다. 추가로, MSL-109 내의 아미노산 N52는 S로 대체될 수 있다. 상기 치환은 효능에 영향을 미치지 않지만, 위치 52의 글리코실화 없이 위치 53에 S를 허용하였다. 아미노산 53 및/또는 아미노산 위치 55에서의 다양한 아미노산 치환을 이용한 중쇄 가변 서열에 대해 89개의 가능한 조합이 있다 (서열 87, 88, 89 및 96-182). 컨센서스 서열은 서열 94로서 제공되어 있다. 이들 항-gH 항체의 Fab 단편을 바큘로바이러스에서 생산된 gH/gL 이량체에 대한 친화도에 대해 파지 디스플레이 ELISA 검정으로 측정하였다. 특히 MSL-109 변이체 Fab 단편을 디스플레이하는 파지 클론을 연속 희석된 gH/gL과 함께 인큐베이션하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 gH/gL로 코팅된 ELISA 플레이트 웰에서 10분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 결합되지 않은 파지를 검출하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 항-M13 HRP 접합체와 함께 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척하고, TMB 기질로 발색시킴으로써, 고정된 gH/gL에 결합된 파지를 검출하였다. 파지-gH/gL 혼합물 중 50%의 파지가 유리되는 지점인 IC50을 비-선형 회귀에 의해 계산하였다. IC50은 0.01-0.1 nM의 범위였다. 선택된 변이체에 대한 개별 친화도를 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3>
Figure pct00004
놀랍게도, VH2 HVR에서의 아미노산 변화는 극적으로 더 높은 결합 및 중화 능력을 갖는 항체를 생산하였다. 예를 들어, HB1 (D53N/T55R)은 파지 ELISA에 의해 나타난 바와 같이 gH/gL에 대해 MSL-109에 비해 10배 증가된 친화도를 가졌다 (표 3). 이. 콜라이에서 Fab 단편으로서 발현되었을 때, HB1 (D53N/T55R)은 중화 검정에 의해 나타난 바와 같이 ARPE-19 세포로의 HCMV 진입 억제에 대해 모 MSL-109 항체에 비해 대략 40배 더 강력하였다 (즉, EC50 = 0.15 nM 대 6.2 nM) (도 12b). 추가로, HB1 (D53N/T55R)은 CHO 세포에서 전장 IgG로서 발현되었을 때, 중화 검정에 의해 나타난 바와 같이 ARPE-19 세포로의 HCMV 진입 억제에 대해 대략 6배 더 강력하였다 (표 4, 도 12c). 다양한 세포 유형 상에서 중화 검정 (하나의 대표적인 실험)으로 MSL-109 항체와 비교한 HB1 항체에 대한 EC50 및 EC90 (μg/ml)을 하기 표 4에 나타내었다.
<표 4>
Figure pct00005
실시예 2 - 항체 기능 연구
HB1 (D53N/T55R) 및 hu8G8을 상피 세포, 내피 세포, 대식세포 및 섬유모세포로의 HCMV 바이러스 진입을 차단하는 능력에 대해 중화 검정으로 HIG와 비교하였다. hu8G8은 상피 세포 상에서 0.003 μg/ml (0.02 nM), 내피 세포 상에서 0.004 μg/ml (0.03 nM), 단핵구 상에서 0.001 μg/ml (0.006 nM)의 EC50을 가졌다. hu8G8은 각각의 이들 세포 유형 상에서 HCMV를 중화함에 있어 HB1에 비해 적어도 8배 더 강력하였다. 그러나, 예상된 바와 같이, hu8G8은 섬유모세포로의 바이러스 진입을 차단하지 않았고, 반면에 HB1은 0.11 μg/ml (0.7 nM)의 EC50으로 그렇게 하였다 (도 13 참조).
HIG는 1차 HCMV 감염을 앓는 임신한 여성에게 주어졌을 때 HCMV 태아 감염 및/또는 질환을 예방하는 것으로 보고된 바 있고 (문헌 [Nigro et al., 2005]), 이는 발달중인 태아에게 보호를 부여하는 CMV-특이적 항체의 능력을 시사한다. 중화 검정에 의해 평가했을 때, HIG는 모든 시험된 세포 유형으로의 바이러스 진입을 중화시키지만, 어떠한 모노클로날 항체보다도 훨씬 더 적은 효능으로 중화시키는 것으로 밝혀졌다 (도 13 참조). 이러한 비교적 낮은 효능은 항-CMV 중화 활성을 갖는 단백질을 단지 적은 분율로 갖는 HIG의 폴리클로날 성질로 인한 것이다.
실시예 3 - HIG 고갈 연구.
과다면역 글로불린 내의 중화 항체 성분을 확인하기 위해, 6회의 연속 인큐베이션에 의해 gB 또는 복합체 I로 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여 HIG에서 항-gB 항체 또는 항-복합체 I (gH/gL/UL128/UL130/UL131) 항체를 고갈시켰다. 시토감® (HIG) 고갈을 상기 기재된 방법에 따라 수행하였다. 정제된 gB ELISA에 의해 검정시, 흡착된 혈청의 분석은 대조군 세포 상에서의 0%와 비교하여 gB-형질감염된 세포와 반응성인 항체 중 >95%가 상기 절차에 의해 흡착되었음을 보여주었다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이 감염된 HEK293T 세포로부터의 용해물을 사용한 ELISA에 의해 검정시, 대조군 세포 상에서의 0%와 비교하여 복합체 I로 형질감염된 세포와 반응성인 항체 중 약 45%만이 흡착되었다.
이어서, 고갈된 HIG를 중화 검정에 사용하여, 상피 세포로의 바이러스 진입을 예방하는 것에 대한 고갈의 효과를 결정하였다. 모의-흡착된 HIG와 비교하여 흡착된 HIG 제제의 연속 희석물을 상기 기재된 바와 같은 중화 검정에 사용하였다. 이들 실험의 결과를 도 14에 나타내었다. gB에 대항하는 항체는 상피 세포에 대한 HIG의 중화 능력에 유의하게 기여하지 않는 것처럼 보였고, 반면에 복합체 I에 대항하는 항체는 HIG의 중화 능력에 유의하게 기여하는 것처럼 보였다. 복합체 I 특이적 항체의 제거는 상피 세포 상에서 시험하였을 때 HIG의 중화 능력 (EC50)을 약 85%만큼 감소시켰다.
섬유모세포 상에서의 고갈된 HIG의 검정은 중화를 검출하기 위해 매우 고농도가 필요했기 때문에 불가능하였다. HIG의 EC50은 이 세포 유형에서 대략 500 μg/ml이었다. UL128, UL130 및 UL131 단백질이 섬유모세포로 진입할 필요가 없기 때문에, 상기 기재된 바와 같이 칼럼에 결합된 바큘로바이러스발현된 gB 또는 gH/gL을 사용하여 이들 단백질/복합체에 특이적인 HIG로부터 항체를 특이적으로 고갈시켰다. 항 gB 항체의 거의 완전한 고갈 (gB 칼럼 상의 gB 항체의 95% 고갈 대 gH/gL 칼럼 상의 gB 항체의 0% 고갈)과 함께, 어떠한 중화 변화도 관찰되지 않았다. 그러나, 항 gH/gL 항체의 대부분이 고갈되었을 때 (gH/gL 칼럼 상의 gH/gL 항체의 84% 고갈 대 gB 칼럼 상의 gH/gL 항체의 0% 고갈), EC50에서의 65% 감소가 확인되었다 (도 14 참조).
이들 데이터로부터, HIG 내의 주요 중화 항체가 gH/gL/UL128/UL130/UL131 복합체에 지시된다는 결론을 내렸다. 특히, 복합체 I 중화 항체는 HIG에서 상피 세포 진입에 대한 주요 중화 항체이다. 추가로, HIG 내의 gH/gL 항체는 섬유모세포로의 바이러스 진입 억제에서 지배적인 역할을 갖는다. 이들 실험은 HIG 중화에서 항-gB 항체는 역할이 거의 없음을 보여준다.
바큘로바이러스발현된 gB, gH/gL 및 gH/gL/UL128/UL130/UL131을 사용하여 HIG를 흡착시킴으로써, ELISA에 의해, 대략 1%의 HIG가 gB 반응성이고, 반면에 대략 0.1-0.2%가 복합체 I 또는 gH/gL과 반응성임을 결정하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, HIG 내의 복합체-특이적 항체의 농도를 밝힘으로써, 중화를 유발하는 적절한 복합체에 실제로 지시된 IgG의 백분율에 대해 무손상 HIG의 중화 효능을 보정함으로써 그 복합체-특이적 항체의 중화 효능을 계산할 수 있었다 (예를 들어, 섬유모세포 상에서 810 μg/ml x 0.1-0.2 = 0.8-1.6).
<표 5>
Figure pct00006
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, HB1 및 인간화 8G8 (VH1 또는 VH3)의 조합은 중화 검정으로 시험된 모든 세포 유형 상의 HIG의 중화 효능을 근사화시킬 수 있었다. 세포를 하기 감염 다중도 (MOI)의 HCMV로 감염시켰다: 상피 세포 MOI = 1, 내피 세포 MOI = 1, 대식세포 MOI = 0.5 및 섬유모세포 MOI = 1. HB1은 섬유모세포 상의 감염 억제에 대해 HIG (복합체 I-특이적인 HIG의 양에 대해 보정시)와 비슷한 중화 효능을 갖지만, 상피 세포, 내피 세포 또는 대식세포 상에서는 적당한 효능을 제공하지 않았다. 인간화 8G8 (VH1) 및 (VH3)은 상피 세포, 내피 세포 및 대식세포 상에서 HIG (복합체 I-특이적인 HIG의 양에 대해 보정시)와 비슷한 중화 효능을 가졌다. 그러나, 이는 섬유모세포의 감염을 중화하는데는 실패하였다. 따라서, 항체의 조합은 시험된 모든 세포 유형 상에서 복합체 I-특이적 항체에 대해 조정된 HIG의 중화와 비슷한 HCMV의 중화를 제공하였다.
모든 다양한 세포 유형에서 HCMV를 중화하는 HB1 및 hu8G8 (VH1 함유)의 능력을 중화 검정으로 다시 시험하고, HIG의 계산된 및 실제 중화 효능과 비교하였다. 세포를 하기 MOI의 HCMV로 감염시켰다: 상피 세포 MOI = 1, 내피 세포 MOI = 0.25, 대식세포 MOI = 0.25 및 섬유모세포 MOI = 0.8. 상기 실험의 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 상기 실험 및 표 5에 나타낸 결과로부터의 평균 EC90을 하기 표 6에서 음영처리된 박스 안에 나타내었다.
<표 6>
Figure pct00007
실시예 4 - HCMV 임상 단리물의 중화
오리건 헬쓰 사이언스 유니버시티에서 2개의 실험실로부터 얻은 20개 초과의 임상 단리물로부터 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131 유전자를 서열분석하고, 추가의 공개적으로 이용가능한 서열로 컴파일링하였다. 공개적으로 이용가능한 서열은 미국, 유럽 및 일본으로부터 기원한 균주로부터 생성되었다.
각각의 균주에 의해 감염된 세포를 용해시키고, DNA 혈액/조직 추출 키트 (퀴아젠; 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI) 데이터베이스에서 이용가능한 AD169, FIX, TB40E, Toledo 및 Towne 서열의 정렬에 따라 보존된 서열에 대해 프라이머를 설계하였다. 당단백질 gH를 각각의 임상 균주로부터 시작 코돈부터 정지 코돈 직전의 염기 2196까지 증폭시켰다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 생성물을 제넨테크에서 염료 종결자 반응을 이용하여 서열분석하였다. 서열을 정렬시키고 말단절단하였다 (시퀀서). NCBI 데이터베이스로부터 문헌 [Chou et al., J. Infect. Dis. 166:604-7 (1992)]으로부터의 하나의 등록 번호를 이용하고, 이어서 "관련 서열"을 얻음으로써 추가의 gH 서열을 수득하였다. 전부 합하여, 57개 균주로부터의 당단백질 서열을 신호 펩티드를 제거한 후에 클러스터링하고 (클러스탈W, 유러피안 바이오인포매틱스 인스티튜트(European Bioinformatics Institute) (EBI); 영국 캠브리지셔), 백분율 동일성에 의한 평균 거리를 이용하여 트리 내에 정렬시켰다 (잘뷰; 문헌 [Waterhouse et al. 2009]).
서열분석 결과는 임상 단리물 사이에서 UL128, UL130 및 UL131에서 서열에서의 1% 차이를 나타내었다 (신호 펩티드 제거 후). 상기 발견은 UL128, UL130 및 UL131이 1차 HCMV 감염을 앓는 임신한 여성 사이에 고도로 보존되었음을 입증한 유럽에서의 연구와 일치하였다 (문헌 [Baldanti et al., Arch. Virol. 151:1225-33 (2006)]).
gH는 단백질 수준에서 모든 균주 사이에 적어도 95% 동일하다 (신호 펩티드 제거 후). 2개의 구별되는 분지를 갖는 계통 트리가 구축되었다 (데이터는 제시되지 않음). 상기 트리는 gH 단백질 서열이 2개의 계통 군으로 분리된다는 이전 보고와 일치하였다 (문헌 [Chou, J. Infect. Dis. 166:604-7 (1992)]). 또한 문헌에 따르면, 두 분지 모두에서의 HCMV 단리물은 지리학적으로 구별되지 않았다 (즉, 일본에서 단리된 균주가 두 분지 모두에서 발견될 수 있음) (문헌 [Pignatelli, J. Gen. Virol. 84:647-655 (2003)]).
섬유모세포 상에서 다양한 패널의 HCMV의 임상 단리물의 감염성을 중화하는 HB1 (D53N/T55R)의 능력을 시험하였다. 하기 표 7은 HIG와 비교한 HB1의 유효성을 보여준다. HB1은 최대 gH 서열 다양성을 나타내는 각각의 HCMV 균주를 HIG (gH/gL/UL128/UL130/UL131-특이적인 HIG의 양에 대해 보정시)만큼 또는 더 우수하게 중화시키는 것으로 밝혀졌다. 다중 실험에서, HCMV 균주 Dement, Adinis 및 VR1814를 다양한 MOI로 사용한 중화 검정의 결과를 또한 하기 표 7에 나타내었다.
<표 7>
Figure pct00008
실시예 5 - 항체의 특이성
HB1 및 hu8G8의 항원 특이성을 평가하였다. 바이러스 당단백질을 함유하는 플라스미드를, 각각의 유전자를 "자가 절단 2A 펩티드"로 분리함으로써 각각의 단백질이 동일한 화학량론으로 발현되도록 구축하였다 (문헌 [Szymczak et al., Nat. Biotechnol. 22:589-94 (2004)]). 플라스미드는 gB/eGFP, gH/gL/eGFP 또는 UL128/UL130/UL131/eGFP의 전장 유전자를 함유하였다 (cDNA로부터 클로닝함). 플라스미드를 리포펙타민 2000 (인비트로젠; 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, ATCC; 버지니아주 마나사스) 내로 형질감염시켜 그의 표면에 CMV 당단백질을 발현시켰다. 2일 후, 세포를 해리시키고, 1차 항체 HB1, hu8G8, 항 gB, 친화도-정제된 토끼 항 UL131_933 또는 친화도-정제된 토끼 항 gH_977을 포화시키면서 염색하였다. 세포를 알로피코시아닌 (APC, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch); 펜실베니아주 웨스트 그로브)에 접합된 적절한 2차 항체로 염색하였다. 개별 세포의 형광을 FACS칼리버(FACSCalibur) (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences); 캘리포니아주 산 호세)를 사용하여 측정하고, 플로우조 소프트웨어 (트리 스타; 오리건주 애슐랜드)를 사용하여 분석하였다. GFP 양성 세포 (CMV 트랜스진을 발현하는 것)를 선택적으로 그래프화하여 항체 결합을 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, HB1은 gH/gL을 단독으로 또는 UL128/UL130/UL131과의 복합체로 발현하는 세포에 반응하였다. Hu8G8은 gH/gL/UL128/UL130/UL131을 발현하는 세포에만 반응하였고 (도 15), gH/gL 단독 또는 gH/gL/gO를 발현하는 세포에는 반응하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 어떠한 항체도 gB를 발현하는 세포에 반응하지 않았다. 따라서, HB1은 gH/gL 복합체 및 복합체 I에 존재하는 gH 상의 에피토프를 인식한다. hu8G8 항체는 복합체 I을 형성하는 5개의 외피 단백질 내의 에피토프에 결합하지만, gH/gL/gO 또는 gH/gL 단독에는 결합하지 않는다.
실시예 6 - 상승작용 또는 길항작용의 평가
HB1 및 hu8G8을 조합하여 바이러스 중화 검정으로 시험함으로써, 2종의 항체가 조합되었을 때 효능에 차이가 존재하는지를 결정하였다. 항체가 상이한 표적을 갖고, 아마도 바이러스 진입을 차단함에 있어 독립적으로 작용하기 때문에, HB1 및 hu8G8의 효과는 상가적인 것으로 가정하였다. 따라서, 블리스 독립성 방정식을 적용하였다 (효과 A 및 B를 갖는 2종의 단일 화합물에 대한 조합된 반응 C는 C = A + B - A*B임). 이를 위해, HB1 및 hu8G8을 1:1 비로 혼합하고, 상피 세포 상에서 바이러스 중화 검정으로 희석 시리즈로 시험하고, EC50을 상기 기재된 바와 같이 계산하였다. HB1은 상피 세포 상에서 hu8G8의 효능을 증진시키거나 또는 감소시키지 않았고, 1:1 곡선은 시뮬레이션된 블리스 독립성 곡선과 정확하게 중첩되어, 상승작용보다는 오히려 상가성을 시사하였다 (도 16 및 표 8 참조). 마찬가지로, hu8G8이 섬유모세포로의 HCMV 진입을 차단하지 않는 것으로부터 예상된 바와 같이, hu8G8은 섬유모세포 상에서 HB1의 효능을 변경시키지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, HB1 및 hu8G8은 1:1 비에서 어떠한 길항작용 또는 상승작용도 입증하지 않았다.
<표 8>
Figure pct00009
HB1 및 hu8G8이 넓은 범위의 비에서 상승작용 또는 길항작용을 입증했는지의 여부를 평가하기 위해, EC50 값을 늘어놓은 쌍 "체커 보드" 희석 시리즈를 이용하여 중화 검정을 수행하였다. 각 항체를 하기 표 9에 제시된 바와 같이 희석하였고, 반면에 바이러스 농도는 일정하였다. 상피 세포 상에서 항체 농도의 다양한 조합에 대해, 감염된 세포의 퍼센트 (항체 부재 대조군에 대해 정규화됨)를 하기 표 9에 나타내었다:
<표 9>
Figure pct00010
상기 기재된 바와 같은 중화 검정을 이용하여, HB1 및 hu8G8에 대한 EC50을 0.8, 0.016, 0.0032 μg/ml의 다른 항체의 존재 하에 결정하였다. 이들 실험의 결과를 하기 표 10 및 11, 및 도 17에 나타내었다.
<표 10> - 다양한 농도의 HB1을 사용한 hu8G8 효능
Figure pct00011
<표 11> - 다양한 농도의 hu8G8을 사용한 HB1 효능
Figure pct00012
각 항체의 단독 효능을 다양한 비의 조합과 비교시, 어떠한 상승작용 또는 길항작용의 증거도 없었다. 예를 들어, hu8G8의 효능 곡선을 hu8G8 및 0.08 μg/ml의 HB1의 곡선과 비교시 (적정된 항체의 부재 하의 감염을 100%로 정규화함), 본 발명자들은 곡선이 중첩된다는 것을 발견하였다 (도 17 참조). 결과적으로, 각각의 HB1 효능 곡선은 다양한 농도의 hu8G8의 존재 하에 중첩되었다 (100% 감염에 대해 정규화함) (도 17 참조). 따라서, 넓은 범위의 비에서, 항체 사이에 어떠한 상승작용 또는 길항작용의 증거도 없었다.
실시예 7 - 발생된 바이러스 내성의 평가
인간 CMV가 상대적으로 낮은 돌연변이율을 가질지라도 (C형 간염 바이러스 (HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 비교시), 내성 돌연변이의 생성을 통해 HB1 또는 hu8G8 또는 둘 다에 대해 중화를 회피하는 바이러스의 능력을 평가하였다. 바이러스를 준최적 농도의 HB1 (또는 MSL-109), 또는 hu8G8, 또는 HB1 및 hu8G8 항체 둘 다의 존재 하에 성장시켰다. 각 주마다 바이러스를 새로운 세포 상에서 계대배양하면서, 각 항체의 농도를 점진적으로 증가시켰다 (각 라운드에 대략 50%의 부피를 새로운 세포 상에서 사용함). 각각의 개별 항체에 대해 내성이 있는 돌연변이체 바이러스가 관찰되었지만, 어떠한 돌연변이체도 조합에 내성을 부여하지 않았다. 모든 내성 바이러스 돌연변이체는 단일 플라크로부터 발생하였다.
HB1에 의한 중화에 대해 내성을 부여하는 돌연변이체가 발생하였다 (도 18 참조). 그러나, 이들 돌연변이체는 중화 검정에 의해 나타난 바와 같이 여전히 비슷한 EC50으로 hu8G8에 민감하였다 (도 18 및 표 12 및 13 참조).
<표 12> - HB1에 대해 내성이 있는 HCMV 돌연변이체가 발생하였다.
Figure pct00013
<표 13> - HCMV HB1 내성 돌연변이체는 여전히 hu8G8 중화에 민감하였다.
Figure pct00014
또한, hu8G8에 의한 중화에 대해 내성을 부여하는 돌연변이체가 발생하였고, 이들 돌연변이체는 여전히 비슷한 EC50으로 HB1에 민감하였다 (도 19 및 표 14 및 15 참조).
<표 14> - hu8G8에 대해 내성이 있는 HCMV 돌연변이체가 발생하였다.
Figure pct00015
<표 15> - HCMV hu8G8 내성 돌연변이체는 여전히 HB1 중화에 민감하였다.
Figure pct00016
HB1 및 hu8G8 항체에 대해 내성이 있는 분자 성질을 이해하기 위해, 각각의 내성 균주로부터의 gB, gH, gL, UL128, UL130 및 UL131을 서열분석하였다. HB1에 대해 내성이 있는 모든 균주는 gH에 단일 비-보존적 아미노산 돌연변이를 가졌고, VR1814 및 D1 균주 (항체 압박 없이 동시에 상피 세포 상에서 계대배양된 VR1814)와 비교시 다른 당단백질에서 어떠한 다른 돌연변이도 발견되지 않았다 (표 16). HB1에 대해 내성이 있는 11개의 개별 균주가 생성되었고, 이들은 단지 3개의 아미노산에 5개의 특징적인 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하였다. 서열분석되거나 또는 서열이 공개된 임상 균주에서 이들 아미노산 중 어떠한 것도 돌연변이된 것으로 밝혀지지 않았다.
hu8G8에 반응하는 돌연변이는 덜 빈번하게 발생하였고, 단지 3개의 균주만이 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. hu8G8에 대해 내성이 있는 모든 3개의 균주는 UL131에 단일 비-보존적 아미노산 돌연변이를 가졌고, VR1814 및 D1 균주와 비교시 다른 당단백질에서 어떠한 다른 돌연변이도 발견되지 않았다 (표 16 참조). 돌연변이된 gH 및 UL131 서열을 60개의 이용가능한 임상 균주 서열과 비교하였을 때, 균주 중 어떠한 것도 이들 돌연변이를 보유하지 않았다.
<표 16> - 내성을 유발하는 돌연변이의 맵핑
Figure pct00017
D1 균주에 대하여 세포를 감염시키는 HB1-내성 균주의 능력을 비교할 때, 이들 내성 균주는 극심한 진입 결함을 가졌고 (20x 이하로 더 적은 효율), 이는 이들 균주가 생체내에서 성장이 약화될 것임을 시사한다 (도 20 참조). D1 균주에 대하여 세포를 감염시키는 hu8G8-내성 균주의 능력을 비교할 때, 내성 균주가 세포를 동일한 효율로 감염시킬 수 있었다는 것이 밝혀졌으나; 이들 균주는 매우 느리게 성장하였고, 이는 생산에서의 결함을 시사한다 (데이터는 제시되지 않음). 상기 약화를 위한 메카니즘을 이해하기 위해서는 추가 분석이 필요하였다.
이들 돌연변이가 각각 gH 및 UL131에 결합하는 HB1 및 hu8G8의 능력에 영향을 미쳤는지 결정하기 위해, 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 HEK-293T 세포의 표면 상에 내성 돌연변이를 갖는 복합체 I (gH/gL/UL128/UL130/UL131)을 일시적으로 발현시키고, 항체 결합의 FACS 분석을 수행하였다. P171에 대한 돌연변이 (돌연변이체 1 및 3: P171 → H 또는 S)는 HB1에 대해 단지 2 내지 5배 더 내성이 있었고, gH/gL에 대한 이 항체의 결합은 현저하게 변화되지 않았다. 그러나, HB1-돌연변이체 2, 5 및 6에서 발견된 돌연변이 (W168 → C 또는 R)는 HB1의 결합 능력을 완전히 제거하였다 (도 21 참조). 추가로, 이들 바이러스 돌연변이체는 HB1에 의해 중화되지 않았다 (도 18 참조). 돌연변이체 4 (D446N)는 중간 표현형을 나타내었고; 이는 HB1에 의한 중화에 대해 500배 더 내성이 있었지만 (도 18 참조), HB1에 대한 결합을 여전히 검출할 수 있었다 (도 21 참조).
UL131에서의 돌연변이가 hu8G8 결합에 어떻게 영향을 미쳤는지 결정하기 위해, gH/gL/UL128/UL130/UL131의 야생형 또는 돌연변이체 복합체를 사용한 HEK-293T 세포의 형질감염을 수행하였고, 항-gH (HB1 및 MSL-109), 항-UL131_993 및 hu8G8에 대한 결합을 FACS 분석에 의해 측정하였다 (도 22 참조). 모든 3개의 UL131 돌연변이는 gH/gL/UL128/UL130/UL131 복합체에 대한 hu8G8의 결합을 제거하였다.
HB1-내성 돌연변이를 HCMV 당단백질 H의 구조의 모델 상에 맵핑하였다 (HSV-2 gH 및 EBV gH에 대한 최근 규명된 구조를 기초로 하여) (문헌 [Backovic et al., PNAS, 197:22635-22640 (2010)]). 모든 돌연변이된 잔기는 gH의 동일한 면에 맵핑되었다 (데이터는 제시되지 않음). HB1 Fab를 gH의 구조 상에 모델링하였다. HB1 Fab의 풋프린트는 모든 돌연변이를 포함하였고, 이는 HB1이 이들 돌연변이에 의해 정의된 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다. 유사하게, hu8G8-내성 돌연변이는 서로 인접해 있고 (4개 잔기만큼 떨어져 있음), UL131에 대한 구조가 공지되어 있지 않을지라도, 둘 모두는 추정 알파-나선 도메인에 맵핑되고, 헬릭스의 동일한 면에 놓여있을 것으로 예상된다. 따라서, 결합 분석과 함께, 내성 돌연변이는 gH/gL/UL128/UL130/UL131 복합체 상의 HB1 및 hu8G8 둘 모두를 위한 에피토프를 설명한다.
실시예 8 - 친화도 분석
HB1 및 hu8G8의 둘 모두의 친화도를 하기 기재된 바와 같이 각각 비아코어 및 스캐차드 분석에 의해 측정하였다.
가용성 바큘로바이러스-발현된 gH/gL에 대한 HB1의 친화도를 비아코어 분석에 의해 측정하였고, 1nM인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 바큘로바이러스 발현된 분비된 gH/gL에 결합하는 HB1의 능력을, 비아코어 3000 기기 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare); 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 측정 (문헌 [Karlsson et al. 1991])에 의해 평가하였다. SPR 기반 바이오센서는 표면 근처의 굴절률 변화를 기록하였다. 단백질 표적 ("리간드")이 센서 칩 표면 상에 공유적으로 고정화되었을 때, SPR을 이용하여 표면 상에서 주입된 결합 파트너 ("분석물")의 비공유 상호작용을 모니터링할 수 있고; 분석물 결합의 실시간 측정을 이용하여 상호작용의 동역학 및 친화도 둘 모두를 결정할 수 있다.
분석물 B가 고정화된 리간드 A에 결합하는 1:1 상호작용의 경우에, 평형은 하기 방정식 1을 이용하여 설명된다:
Figure pct00018
방정식 1에서, k온은 회합 속도 상수이고, k오프는 해리 속도 상수이고, 평형 해리 상수 KD는 KD = k오프/k온으로부터 결정된다. 1:1 결합에 대한 복합체 형성의 속도는 하기 방정식 2를 이용하여 결정된다:
Figure pct00019
SPR 신호 (R)의 관점에서 나타내어지는 경우에, 방정식 2는 하기 방정식 3으로서 표현될 수 있다:
Figure pct00020
방정식 3에서, C는 유리 분석물의 농도이고, R최대는 표면의 최대 분석물 결합 능력이다. 유사하게, 2개의 결합 부위를 형성하는 용액 중 이량체화가 가능한 분석물 B에 대해, 평형은 하기 방정식 4에 의해 설명될 수 있다.
Figure pct00021
결합 속도의 농도 의존성, 및 유리 분석물 부재 하의 해리 속도를 측정함으로써, 동역학 상수를 결정하고, 이를 KD를 계산하는데 사용할 수 있다.
결합의 동역학 측정을 위해, HB1을 비-공유적으로 고정화시키는 항-Fc 포획 방법을 이용하고, 이어서 다양한 농도의 gH/gL을 주입하여 SPR 측정을 수행하였다. CM5 바이오센서 칩 (BR 1000 14, CM5 연구 등급; 비아코어, 인크.)을 도킹하고, 러닝 완충제 (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl 및 0.01% 폴리소르베이트 20)로 프라이밍하고, 제조업체에 의해 제공된 지침에 따라 70% 글리세롤로 정상화시켰다. 하기 간략하게 요약된 바와 같이, 마우스 모노클로날 항-인간 Fc 항체 (인간 항체 포획 키트, BR-1008-39, 비아코어, 인크.)를 CM5 칩의 모든 4개의 유동 세포 상에 고정화시켰다. 유동 세포를 제조업체에 의해 기재된 프로토콜에 따라 7분의 활성화 시간을 이용하여 N-에틸 N' (3 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) (아민 커플링 키트, BR-1000-50; 비아코어, 인크.)를 사용하여 활성화시켰다. 이어서, 10 μL/분의 유량으로 10 mM 아세트산나트륨, pH 5.0 중에 희석된 25 μg/mL 항체 60 μL를 주입함으로써, 활성화된 매트릭스를 아민 커플링을 통해 포획 항체와 반응시켰다. 커플링 주입 종료시에, 임의의 남아있는 미반응 NHS 기를 5 μL/분의 유량으로 1 M 에탄올아민-HCl 35 μL를 주입함으로써 불활성화시켰다. 상기 방식으로 공유적으로 고정화된 포획 항체의 양을 커플링 절차 전후의 SPR 신호로부터 추정하였고, 이는 4개의 유동 세포에 걸쳐 8000-9500 RU의 범위를 제공하였다.
약 100 미만의 R최대 값 (임의 SPR 또는 공명 단위 (RU))은 통상적으로 결정될 수 있는 동역학 상수 범위의 제한 없이 우수한 신호대잡음비를 제공하는 것으로 인정된다. 예비 실험은 30 μL/분의 유량으로 0.13 μg/mL HB1을 60 μL 주입하는 것이 gH/gL로 포화시에 약 50 RU의 신호가 관찰되도록 충분한 HB1의 포획을 일으킨다는 것을 나타내었다. 따라서, 상기 HB1의 농도 및 주입 프로토콜을 동역학 상수의 결정에 이용하였다.
HB1을 참조로서 사용된 유동 세포 1과 함께 상기 기재된 바와 같은 유동 세포 2 상에 포획함으로써 결합 측정을 수행하였다. 농도를 2배 증분으로 0.39 nM 내지 100 nM로 변화시킨 gH/gL의 용액을 러닝 완충제 중에 제조하였다. 30 μL/분의 유량으로 센서 칩 표면 상에서 이들 용액 60 μL의 주입에 대해 센서그램을 수집하였다. 센서 칩을 25℃로 유지하고, 해리를 주입 종료 후에 10분 동안 모니터링하였다. 센서 칩 표면을 3 M MgCl2 30 μL의 주입을 통해 결합 주기 사이에 재생시켰다. 상기 주입은 임의의 남아있는 HB1:gH/gL 복합체의 포획 항체로부터의 해리를 유발하였다. 이어서, HB1을 다음 결합 주기를 위해 상기와 같이 유동 세포 2 상에 포획시켰다. "블랭크" 센서그램을 센서 칩 상의 러닝 완충제의 주입에 대해 유사하게 수집하였다.
관찰된 센서그램을, 첫째로 참조 세포에 대해 측정된 신호를 감산함으로써 동역학 분석을 위해 준비하였다. 곡선의 재생 부분으로부터 유래된 신호를 제거하였다. 이어서, 분석물 주입전 기준선의 평균 RU 값을 감산함으로써 센서그램을 0에 맞추었다. 최종적으로, 단지 러닝 완충제의 주입에 대해 측정된 센서그램을, gH/gL을 함유하는 용액의 주입에 대해 얻은 곡선으로부터 감산하였다. 제조업체에 의해 공급된 소프트웨어를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델 또는 2가 분석물 모델에 따라 데이터를 분석하였다.
전체 SPR 신호는 gH/gL 농도와 함께 증가했고, 이는 Fc-포획된 HB1이 항원 결합에 대해 적격임을 나타낸다. 1:1 랭뮤어 결합 모델에 따른 데이터의 분석은 표 17에 나타낸 동역학 상수와 함께 0.15 nM의 명백한 평형 해리 상수 (KD)를 나타내었으나; 계산된 곡선은 관찰된 센서그램과 2.1의 상대적으로 큰 χ2 값으로 잘 매치되지 않았다. 관찰된 센서그램은 1.0 nM의 명백한 KD 및 표 18에 나타낸 동역학 상수를 생성하는 2가 분석물 KD 모델에 의해 더 잘 설명되었다 (χ2 = 0.4).
<표 17> - 1:1 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 계산된 동역학 상수
Figure pct00022
<표 18> - 2가 분석물 KD 모델을 이용하여 계산된 동역학 상수
Figure pct00023
비아코어를 hu8G8의 친화도를 측정하는데 사용할 수 없기 때문에, 스캐차드 분석을 대안적 방법으로서 사용하였다. 이 방법에서, 아이오딘화된 항체를 비표지된 항체의 희석 시리즈와 혼합하고, 경쟁에 대해 검정하였다. 먼슨 및 로드바드의 핏팅 알고리즘을 이용하여 결과를 플롯팅함으로써 항체의 친화도를 결정하였다 (도 23). 평균 Kd는 HB1에 대해 1.27nM 및 hu8G8에 대해 2.03nM이었다 (표 17). 친화도 측정을 또한 아데노바이러스 세포-표면-발현된 gH/gL/UL128/UL130/UL131 복합체에 대한 스캐차드 분석에 의해 결정하였고, 각각 1.27nM 및 2.03nM인 것으로 밝혀졌다.
구체적으로, HB1 및 hu8G8을 아이오도겐 방법 (써모-피셔 사이언티픽(Thermo-Fisher Scientific; 매사추세츠주 월썸)을 이용하여 아이오딘화하였다. 방사성표지된 항체를 NAP-5 칼럼을 사용한 겔 여과에 의해 유리 125I-Na로부터 정제하였다. 정제된 hu8G8 항체는 12.30 μCi/μg의 비활성을 가졌고, 정제된 HB1 항체는 14.66 μCi/μg의 비활성을 가졌다. 고정된 농도의 아이오딘화 항체 및 감소하는 농도의 비표지된 항체를 함유하는 50 μl의 경쟁 반응 혼합물을 96 웰 플레이트 내에 위치시켰다. 단백질 복합체 gH/gL/128/130/131을 발현하는 아데노바이러스 일시적으로 형질감염된 ARPE-19 세포를 시그마 아쿠타제® 용액 (시그마-알드리치; 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 플라스크로부터 떼어내고, 파라포름알데히드로 고정하고, 결합 완충제 (2% FBS, 50 mM HEPES, pH 7.2 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 DMEM)로 세척하였다. 3벌의 50 μL 경쟁 반응 혼합물을 함유하는 96 웰 플레이트에 세척된 세포를 결합 완충제 0.2 mL 중 25,000개 세포의 밀도로 첨가하였다. 세포와의 각 경쟁 반응에서 아이오딘화된 항체의 최종 농도는 100 pM이었고, 세포와의 경쟁 반응에서 비표지된 항체의 최종 농도는 500 nM에서 시작한 다음 10개의 농도에 대해 1:2 배수 희석에 의해 감소하는 것으로 달리하였고, 0 첨가, 완충제 단독 샘플을 포함하였다. 세포와의 경쟁 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 밀리포어 멀티스크린 필터 플레이트로 옮기고, 결합 완충제로 4회 세척하여 유리 아이오딘화 항체를 결합된 아이오딘화 항체로부터 분리하였다. 필터를 왈락 위자드(Wallac Wizard) 1470 감마 계수기 (퍼킨엘머 라이프 앤드 어낼리티컬 사이언시스(PerkinElmer Life and Analytical Sciences); 매사추세츠주 웰슬리) 상에서 계수하였다. 결합 데이터를 먼슨 및 로바드의 핏팅 알고리즘을 이용하는 뉴 리간드(New Ligand) 소프트웨어 (제넨테크)를 사용하여 평가함으로써 (문헌 [Anal. Biochem., 7:22-39 (1980)]), 항체의 결합 친화도를 결정하였다.
<표 19>
Figure pct00024
실시예 9 - 복합체 I에 결합하는 hu8G8의 분석
추가로 복합체 I에 대한 hu8G8의 결합을 특성화하기 위해, ELISA 검정을 수행하여 hu8G8이 실시예 7에서 확인된 바와 같은 내성 돌연변이를 함유하는 UL131의 일부에 결합할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 구체적으로, UL131을 코딩하는 DNA를 위치 41에서의 세린을 위한 코돈부터 위치 68에서의 세린을 위한 코돈까지 증폭시키고 (SRALPDQTRY KYVEQLVDLT LNYHYDAS (서열 194)), 및 N 말단 His6, GST 및 TEV 절단 부위를 갖는 제한-비의존성 클로닝 (RIC) 벡터 내로 클로닝하였다 (DNA654570). 상기 UL131의 일부는 단백질의 2차 구조에서 추정 알파-헬릭스를 형성하였다. UL131을 또한 복합체 I (gH/gL/UL128/UL130/UL131)과 관련하여 UL131에 결합하는 hu8G8을 제거하는 돌연변이 Q47K와 함께 클로닝하였다. 서열 확인된 구축물을 이. 콜라이 균주 Rosetta2 (DE3)에서 성장시켰다. 개시 배양물을 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 배지 중에서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 1-L 배양물 중의 단백질 발현을 OD600 0.7에서 0.3 mM IPTG를 사용하여 16℃에서 밤새 유도하였다. 세포를 수확하고, EDTA-무함유 프로테아제 억제제 정제 (로슈)를 함유하는 100mM 트리스 pH 8.0, 500mM NaCl, 5% 글리세롤 (완충제 A) 중에서 초음파처리 및 세포 파괴기에 의해 즉시 용해시켰다. 용해된 세포를 10000 rpm에서 40분 동안 회전 침강시키고, 투명해진 용해물을 중력 유동 Ni-킬레이팅 친화도 칼럼 (퀴아젠) 상에 로딩하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 완충제 A 및 10 칼럼 부피의 50 mM 이미다졸을 함유하는 완충제 A로 세척하였다. 단백질을 100mM 트리스 pH 8.0, 500mM NaCl, 5% 글리세롤, 500mM 이미다졸로 용리하고, 50mM 트리스 pH 8.0, 200mM NaCl 및 5% 글리세롤로 즉시 투석하였다. 단백질을 25mM 트리스 pH 8.0, 200mM NaCl 및 5% 글리세롤 중에서 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 (S200 10/30, GE) 상에서 추가로 정제하였다.
UL131 단백질 단편에 대한 hu8G8 결합을 측정하기 위해, 맥스소르브(Maxsorb) ELISA 플레이트를 카르보네이트 코팅 완충제 중 웰당 1μg, 200ng 또는 40ng 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 세척 완충제 (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS [시그마 케미칼(Sigma Chemical)])로 3회 세척한 후, 웰을 검정 희석제 (0.5% BSA를 함유하는 세척 완충제 [인비트로젠; 캘리포니아주 칼스배드])로 1시간 동안 차단시켰다. hu8G8을 검정 희석물 중에서 1시간 동안 10μg/ml 또는 1μg/ml로 인큐베이션하였다. 3회 세척한 후, 웰을 1시간 동안 1:5000의 퍼옥시다제-접합된 항-인간 항체 (잭슨 이뮤노랩스(Jackson Immunolabs), 메인주 바 하버)와 함께 인큐베이션하거나 또는 1:500 또는 1:5000의 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-펜타-HIS (퀴아젠)와 함께 인큐베이션하였다. 실험의 결과를 도 24에 나타내었고, 이는 200ng 단백질로 코팅되고 10μg/ml hu8G8과 함께 인큐베이션된 ELISA 플레이트로부터의 데이터를 포함한다.
상기 본 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHEN, XIAOCHENG DENNIS, MARK FEIERBACH, BECKET FOUTS, ASHLEY HOTZEL, ISIDRO LI, BING <120> ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> P4680R1-US <140> <141> <150> 61/504,056 <151> 2011-07-01 <150> 61/387,735 <151> 2010-09-29 <150> 61/387,725 <151> 2010-09-20 <160> 209 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 743 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 1 Met Arg Pro Gly Leu Pro Pro Tyr Leu Thr Val Phe Thr Val Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Ser His Leu Pro Ser Gln Arg Tyr Gly Ala Asp Ala Ala Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Asp Pro His Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg 35 40 45 Pro Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Ser 50 55 60 Ser Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn 65 70 75 80 Phe Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys 85 90 95 Leu Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu 100 105 110 Thr Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu 115 120 125 Val Ser Lys Asp Leu 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of Artificial Sequence: Synthetic Affinity-matured human Ig Heavy Chain polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Any amino acid <400> 94 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Val Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Xaa Ser Xaa Ser Xaa Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Ile Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 95 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr 1 5 10 15 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Description of Artificial Sequence: Synthetic Affinity matured human HC polypeptide <400> 105 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Val Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Ser Lys Ser Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Ile Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 106 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Affinity matured human HC polypeptide <400> 106 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 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Description of Artificial Sequence: Synthetic Affinity matured human HC polypeptide <400> 170 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Val Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Lys Ser Lys Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Ile Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 171 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Affinity matured human HC polypeptide <400> 171 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 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Description of Artificial Sequence: Synthetic Affinity matured human HC polypeptide <400> 183 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Ser Val Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Lys Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Ile Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 184 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Affinity matured human HC polypeptide <400> 184 Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 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cag agc cca agc gcc agc gcc agc ctg ggc gcc agc 48 Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 gtg aaa ctg acc tgc acc ctg agc agc cag cac agc acc tac acc atc 96 Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile 20 25 30 gaa tgg tat cag cag cag cca ggc aaa ggc cca cgc tac ctg atg aaa 144 Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys 35 40 45 ctg aaa aaa gat ggc agc cac agc acc ggc gat ggc atc cca gat cgc 192 Leu Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 ttc agc ggc agc agc agc ggc gcc gat cgc tac ctg acc atc agc aac 240 Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Asn 65 70 75 80 ctg cag agc gaa gat gaa gcc gat tac tac tgc ggc gtg ggc gat acc 288 Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr 85 90 95 atc aaa gaa cag ttc gtg tac gtg ttc ggc ggc ggt acc aaa ctg acc 336 Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 gtg ctg ggc 345 Val Leu Gly 115 <210> 187 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IGHV3-21*01 peptide <400> 187 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly 20 <210> 188 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic MSL-109 peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Asp, Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Thr or Arg <400> 188 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ser Xaa Ser Xaa Tyr Lys Tyr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly 20 <210> 189 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 tcgcgcccga agagg 15 <210> 190 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 cggccggatt gtggatt 17 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 caccgacgag gattccgaca acg 23 <210> 192 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 192 Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Val Pro His Tyr Trp Asp Ala 1 5 10 15 Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr Arg Tyr Lys 20 25 <210> 193 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 193 Cys Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His Asp Trp Lys 1 5 10 15 Gly Ser His Thr Thr Ser Gly Leu His Arg Pro His 20 25 <210> 194 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 194 Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr Arg Tyr Lys Tyr Val Glu Gln Leu 1 5 10 15 Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His Tyr Asp Ala Ser 20 25 <210> 195 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 195 His Pro His His Glu Tyr Leu Ser Asp Leu Tyr Thr Pro Cys Ser Ser 1 5 10 15 Ser Gly Arg Arg Asp His Ser Leu Glu Arg Leu Thr Arg 20 25 <210> 196 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 196 Cys Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His Asp Trp Lys 1 5 10 15 Gly Ser His Thr Thr Ser Gly Leu His Arg Pro His 20 25 <210> 197 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 197 Cys Gly Leu Pro Pro Glu Leu Lys Gln Thr Arg Val Asn Leu Pro Ala 1 5 10 15 His Ser Arg Tyr Gly Pro Gln Ala Val Asp Ala Arg 20 25 <210> 198 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 198 Val Gly Leu Asp Gln Tyr Leu Glu Ser Val Lys Lys His Lys Arg Leu 1 5 10 15 Asp Val Cys Arg Ala Lys Met Gly Tyr Met Leu Gln 20 25 <210> 199 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 199 Arg Gln Val Val His Asn Lys Leu Thr Ser Cys Asn Tyr Asn Pro Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Glu Ala Asp Gly Arg Ile Arg 20 25 <210> 200 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 200 Arg Asp Tyr Ser Val Ser Arg Gln Val Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala 1 5 10 15 Asn Asn Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr His Pro Asn 20 25 <210> 201 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 201 Ser Pro Trp Phe Thr Leu Thr Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Pro Trp 1 5 10 15 Ser Lys Leu Thr Tyr Pro Lys Pro His Asp Cys 20 25 <210> 202 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 202 Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Val Pro His Tyr Trp Asp Ala 1 5 10 15 Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr Arg Tyr Lys 20 25 <210> 203 <211> 129 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 203 Met Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val 1 5 10 15 Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg 20 25 30 Val Pro His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr 35 40 45 Arg Tyr Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His 50 55 60 Tyr Asp Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile 65 70 75 80 Asn Val Thr Glu Val Ser Leu Leu Ile Ser Asp Phe Arg Arg Gln Asn 85 90 95 Arg Arg Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Leu Ala Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala 115 120 125 Asn <210> 204 <211> 214 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 204 Met Leu Arg Leu Leu Leu Arg His His Phe His Cys Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ala Val Trp Ala Thr Pro Cys Leu Ala Ser Pro Trp Phe Thr Leu Thr 20 25 30 Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Pro Trp Ser Lys Leu Thr Tyr Pro Lys 35 40 45 Pro His Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Pro Phe Leu Tyr Pro Ser Pro 50 55 60 Pro Arg Ser Pro Ser Gln Phe Ser Gly Phe Gln Arg Val Ser Thr Gly 65 70 75 80 Pro Glu Cys Arg Asn Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Asn Arg Glu Gly 85 90 95 Gln Thr Leu Val Glu Arg Ser Ser Thr Trp Val Lys Lys Val Ile Trp 100 105 110 Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Gln Thr Ile Leu Gln Arg Met Pro Arg Thr 115 120 125 Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val Gln Ile Ser Val Glu Asp Ala 130 135 140 Lys Ile Phe Gly Ala His Met Val Pro Lys Gln Thr Lys Leu Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Val Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Gln Met Cys Val Met Lys Leu 165 170 175 Glu Ser Trp Ala His Val Phe Arg Asp Tyr Ser Val Ser Phe Gln Val 180 185 190 Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asn Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr 195 200 205 His Pro Asn Leu Ile Val 210 <210> 205 <211> 171 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 205 Met Ser Pro Lys Asn Leu Thr Pro Phe Leu Thr Ala Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gly His Ser Arg Val Pro Arg Val Arg Ala Glu Glu Cys Cys Glu 20 25 30 Phe Ile Asn Val Asn His Pro Pro Glu Arg Cys Tyr Asp Phe Lys Met 35 40 45 Cys Asn Arg Phe Thr Val Ala Leu Arg Cys Pro Asp Gly Glu Val Cys 50 55 60 Tyr Ser Pro Glu Lys Thr Ala Glu Ile Arg Gly Ile Val Thr Thr Met 65 70 75 80 Thr His Ser Leu Thr Arg Gln Val Val His Asn Lys Leu Thr Ser Cys 85 90 95 Asn Tyr Asn Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Asp Gly Arg Ile Arg Cys Gly 100 105 110 Lys Val Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Leu Leu Gly Ala Ala Gly Ser Val 115 120 125 Pro Tyr Arg Trp Ile Asn Leu Glu Tyr Asp Lys Ile Thr Arg Ile Val 130 135 140 Gly Leu Asp Gln Tyr Leu Glu Ser Val Lys Lys His Lys Arg Leu Asp 145 150 155 160 Val Cys Arg Ala Lys Met Gly Tyr Met Leu Gln 165 170 <210> 206 <211> 743 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 206 Met Arg Pro Gly Leu Pro Phe Tyr Leu Thr Val Phe Ala Val Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Ser His Leu Pro Ser Gln Arg Tyr Gly Ala Asp Ala Ala Ser Glu 20 25 30 Ala Leu Asp Pro His Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg 35 40 45 Pro Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Ser 50 55 60 Ser Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn 65 70 75 80 Phe Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys 85 90 95 Leu Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu 100 105 110 Thr Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu 115 120 125 Val Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Phe Pro Gln Gln Leu Lys 130 135 140 Ala Gln Asp Ser Leu Gly Gln Gln Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile 145 150 155 160 Asp Leu Ser Ile Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His 165 170 175 Asp Trp Lys Gly Ser His Thr Thr Ser Gly Leu His Arg Pro His Phe 180 185 190 Asn Gln Thr Cys Ile Leu Phe Asp Gly His Asp Leu Leu Phe Ser Thr 195 200 205 Val Thr Pro Cys Leu His Gln Gly Phe Tyr Leu Met Asp Glu Leu Arg 210 215 220 Tyr Val Lys Ile Thr Leu Thr Glu Asp Phe Phe Val Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ile Asp Asp Asp Thr Pro Met Leu Leu Ile Phe Gly His Leu Pro Arg 245 250 255 Val Leu Phe Lys Ala Pro Tyr Gln Arg Asp Asn Phe Ile Leu Arg Gln 260 265 270 Thr Glu Lys His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Thr Gln Leu Asn 275 280 285 Arg His Ser Tyr Leu Lys Asp Ser Asp Phe Leu Asp Ala Ala Leu Asp 290 295 300 Phe Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Leu Leu Arg Asn Ser Phe His Arg 305 310 315 320 Tyr Ala Val Asp Val Leu Lys Ser Gly Arg Cys Gln Met Leu Asp Arg 325 330 335 Arg Thr Val Glu Met Ala Phe Ala Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Ala Ala 340 345 350 Ala Arg Gln Glu Glu Ala Gly Thr Glu Ile Ser Ile Pro Arg Ala Leu 355 360 365 Asp Arg Gln Ala Ala Leu Leu Gln Ile Gln Glu Phe Met Ile Thr Cys 370 375 380 Leu Ser Gln Thr Pro Pro Arg Thr Thr Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala 385 390 395 400 Val Asp Leu Ala Lys Arg Ala Leu Trp Thr Pro Asp Gln Ile Thr Asp 405 410 415 Ile Thr Ser Leu Val Arg Leu Val Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Asn Gln 420 425 430 Gln His Leu Ile Pro Gln Trp Ala Leu Arg Gln Ile Ala Asp Phe Ala 435 440 445 Leu Gln Leu His Lys Thr His Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ala Phe Ala 450 455 460 Arg Gln Glu Leu Tyr Leu Met Gly Ser Leu Val His Ser Met Leu Val 465 470 475 480 His Thr Thr Glu Arg Arg Glu Ile Phe Ile Val Glu Thr Gly Leu Cys 485 490 495 Ser Leu Ala Glu Leu Ser His Phe Thr Gln Leu Leu Ala His Pro His 500 505 510 His Glu Tyr Leu Ser Asp Leu Tyr Thr Pro Cys Ser Ser Ser Gly Arg 515 520 525 Arg Asp His Ser Leu Glu Arg Leu Thr Arg Leu Phe Pro Asp Ala Thr 530 535 540 Val Pro Ala Thr Val Pro Ala Ala Leu Ser Ile Leu Ser Thr Met Gln 545 550 555 560 Pro Ser Thr Leu Glu Thr Phe Pro Asp Leu Phe Cys Leu Pro Leu Gly 565 570 575 Glu Ser Phe Ser Ala Leu Thr Val Ser Glu His Val Ser Tyr Val Val 580 585 590 Thr Asn Gln Tyr Leu Ile Lys Gly Ile Ser Tyr Pro Val Ser Thr Thr 595 600 605 Val Val Gly Gln Ser Leu Ile Ile Thr Gln Thr Asp Ser Gln Ser Lys 610 615 620 Cys Glu Leu Thr Arg Asn Met His Thr Thr His Ser Ile Thr Ala Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Ser Leu Glu Asn Cys Ala Phe Cys Gln Ser Ala Leu Leu 645 650 655 Glu Tyr Asp Asp Thr Gln Gly Val Ile Asn Ile Met Tyr Met His Asp 660 665 670 Ser Asp Asp Val Leu Phe Ala Leu Asp Pro Tyr Asn Glu Val Val Val 675 680 685 Ser Ser Pro Arg Thr His Tyr Leu Met Leu Leu Lys Asn Gly Thr Val 690 695 700 Leu Glu Val Thr Asp Val Val Val Asp Ala Thr Asp Ser Arg Leu Leu 705 710 715 720 Met Met Ser Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Ile Gly Ile Tyr Leu Leu 725 730 735 Tyr Arg Met Leu Lys Thr Cys 740 <210> 207 <211> 464 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 207 Met Gly Arg Lys Glu Asp Met Arg Ser Ile Ser Lys Leu Phe Phe Ile 1 5 10 15 Ile Ser Leu Thr Val Leu Leu Phe Ser Ile Ile Asn Cys Lys Val Val 20 25 30 Arg Pro Pro Gly Arg Tyr Trp Leu Gly Thr Val Leu Ser Thr Ile Gly 35 40 45 Lys Gln Lys Leu Asp Lys Phe Lys Leu Glu Ile Leu Lys Gln Leu Glu 50 55 60 Arg Glu Pro Tyr Thr Lys Tyr Phe Asn Met Thr Arg Gln His Val Lys 65 70 75 80 Asn Leu Thr Met Asn Met Thr Gln Phe Pro Gln Tyr Tyr Ile Leu Ala 85 90 95 Gly Pro Ile Arg Asn Asp Ser Ile Thr Tyr Leu Trp Phe Asp Phe Tyr 100 105 110 Ser Thr Gln Leu Arg Lys Pro Ala Lys Tyr Val Tyr Ser Gln Tyr Asn 115 120 125 His Thr Ala Lys Thr Ile Thr Phe Arg Pro Pro Ser Cys Gly Thr Val 130 135 140 Pro Ser Met Thr Cys Leu Ser Glu Met Leu Asn Val Ser Lys Arg Asn 145 150 155 160 Asp Thr Gly Glu Gln Gly Cys Gly Asn Phe Thr Thr Phe Asn Pro Met 165 170 175 Phe Phe Asn Val Pro Arg Trp Asn Thr Lys Leu Tyr Val Gly Pro Thr 180 185 190 Lys Val Asn Val Asp Ser Gln Thr Ile Tyr Phe Leu Gly Leu Thr Ala 195 200 205 Leu Leu Leu Arg Tyr Ala Gln Arg Asn Cys Thr His Ser Phe Tyr Leu 210 215 220 Val Asn Ala Met Ser Arg Asn Leu Phe Arg Val Pro Lys Tyr Ile Asn 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Lys Asn Thr Met Arg Lys Leu Lys Arg Lys Gln Ala 245 250 255 Pro Val Lys Glu Gln Leu Glu Lys Lys Thr Lys Lys Ser Gln Ser Thr 260 265 270 Thr Thr Pro Tyr Phe Ser Tyr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Asn Val Thr 275 280 285 Thr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Thr Thr Ser Ala Lys Arg Ile Pro Thr 290 295 300 Ser Thr Ile Ala Tyr Arg Pro Asp Ser Ser Phe Met Lys Ser Ile Met 305 310 315 320 Ala Thr Gln Leu Arg Asp Leu Ala Thr Trp Val Tyr Thr Thr Leu Arg 325 330 335 Tyr Arg Asn Glu Pro Phe Cys Lys Pro Asp Arg Asn Arg Thr Ala Val 340 345 350 Ser Glu Phe Met Lys Asn Thr His Val Leu Ile Arg Asn Glu Thr Pro 355 360 365 Tyr Thr Ile Tyr Gly Thr Leu Asp Met Ser Ser Leu Tyr Tyr Asn Glu 370 375 380 Thr Met Ser Val Glu Asn Glu Thr Ala Ser Asp Asn Asn Glu Thr Thr 385 390 395 400 Pro Thr Ser Pro Ser Thr Arg Phe Gln Lys Thr Phe Ile Asp Pro Leu 405 410 415 Trp Asp Tyr Leu Asp Ser Leu Leu Phe Leu Asp Lys Ile Arg Asn Phe 420 425 430 Ser Leu Gln Leu Pro Ala Tyr Gly Asn Leu Thr Pro Pro Glu His Arg 435 440 445 Arg Ala Val Asn Leu Ser Thr Leu Asn Ser Leu Trp Trp Trp Leu Gln 450 455 460 <210> 208 <211> 278 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 208 Met Cys Arg Arg Pro Asp Cys Gly Phe Ser Phe Ser Pro Gly Pro Val 1 5 10 15 Val Leu Leu Trp Cys Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Ser Ser Val Ala 20 25 30 Val Ser Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu Cys Pro 35 40 45 Glu Leu Thr Arg Arg Cys Leu Leu Gly Glu Val Phe Gln Gly Asp Lys 50 55 60 Tyr Glu Ser Trp Leu Arg Pro Leu Val Asn Val Thr Gly Arg Asn Gly 65 70 75 80 Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Tyr Arg Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala 85 90 95 Asn Ser Val Leu Leu Asp Asp Ala Phe Leu Asp Thr Leu Ala Leu Leu 100 105 110 Tyr Asn Asn Pro Asp Gln Leu Arg Ala Leu Leu Thr Leu Leu Ser Ser 115 120 125 Asp Thr Ala Pro Arg Trp Met Thr Val Met Arg Gly Tyr Ser Glu Cys 130 135 140 Gly Asp Gly Ser Pro Ala Val Tyr Thr Cys Val Asp Asp Leu Cys Arg 145 150 155 160 Gly Tyr Asp Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Gly Arg Ser Ile Phe Thr Glu 165 170 175 His Val Leu Gly Phe Glu Leu Val Pro Pro Ser Leu Phe Asn Val Val 180 185 190 Val Ala Ile Arg Asn Glu Ala Thr Arg Thr Asn Arg Ala Val Arg Leu 195 200 205 Pro Val Ser Thr Ala Ala Ala Pro Glu Gly Ile Thr Leu Phe Tyr Gly 210 215 220 Leu Tyr Asn Ala Val Lys Glu Phe Cys Leu Arg His Gln Leu Asp Pro 225 230 235 240 Pro Leu Leu Arg His Leu Asp Lys Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Pro Glu 245 250 255 Leu Lys Gln Thr Arg Val Asn Leu Pro Ala His Ser Arg Tyr Gly Pro 260 265 270 Gln Ala Val Asp Ala Arg 275 <210> 209 <211> 472 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 209 Met Gly Lys Lys Glu Met Ile Met Val Lys Gly Ile Pro Lys Ile Met 1 5 10 15 Leu Leu Ile Ser Ile Thr Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Cys Asn 20 25 30 Val Leu Val Asn Ser Arg Gly Thr Arg Arg Ser Trp Pro Tyr Thr Val 35 40 45 Leu Ser Tyr Arg Gly Lys Glu Ile Leu Lys Lys Gln Lys Glu Asp Ile 50 55 60 Leu Lys Arg Leu Met Ser Thr Ser Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Leu Met 65 70 75 80 Tyr Pro Ser Gln Gln Lys Phe His Ala Ile Val Ile Ser Met Asp Lys 85 90 95 Phe Pro Gln Asp Tyr Ile Leu Ala Gly Pro Ile Arg Asn Asp Ser Ile 100 105 110 Thr His Met Trp Phe Asp Phe Tyr Ser Thr Gln Leu Arg Lys Pro Ala 115 120 125 Lys Tyr Val Tyr Ser Glu Tyr Asn His Thr Ala His Lys Ile Thr Leu 130 135 140 Arg Pro Pro Pro Cys Gly Thr Val Pro Ser Met Asn Cys Leu Ser Glu 145 150 155 160 Met Leu Asn Val Ser Lys Arg Asn Asp Thr Gly Glu Lys Gly Cys Gly 165 170 175 Asn Phe Thr Thr Phe Asn Pro Met Phe Phe Asn Val Pro Arg Trp Asn 180 185 190 Thr Lys Leu Tyr Ile Gly Ser Asn Lys Val Asn Val Asp Ser Gln Thr 195 200 205 Ile Tyr Phe Leu Gly Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Ala Gln Arg 210 215 220 Asn Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Leu Val Asn Ala Met Ser Arg Asn Leu 225 230 235 240 Phe Arg Val Pro Lys Tyr Ile Asn Gly Thr Lys Leu Lys Asn Thr Met 245 250 255 Arg Lys Leu Lys Arg Lys Gln Ala Leu Val Lys Glu Gln Pro Gln Lys 260 265 270 Lys Asn Lys Lys Ser Gln Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Leu Ser Tyr Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Ala Phe Asn Val Thr Thr Asn Val Thr Tyr Ser Ala Thr 290 295 300 Ala Ala Val Thr Arg Val Ala Thr Ser Thr Thr Gly Tyr Arg Pro Asp 305 310 315 320 Ser Asn Phe Met Lys Ser Ile Met Ala Thr Gln Leu Arg Asp Leu Ala 325 330 335 Thr Trp Val Tyr Thr Thr Leu Arg Tyr Arg Asn Glu Pro Phe Cys Lys 340 345 350 Pro Asp Arg Asn Arg Thr Ala Val Ser Glu Phe Met Lys Asn Thr His 355 360 365 Val Leu Ile Arg Asn Glu Thr Pro Tyr Thr Ile Tyr Gly Thr Leu Asp 370 375 380 Met Ser Ser Leu Tyr Tyr Asn Glu Thr Met Ser Val Glu Asn Glu Thr 385 390 395 400 Ala Ser Asp Asn Asn Glu Thr Thr Pro Thr Ser Pro Ser Thr Arg Phe 405 410 415 Gln Arg Thr Phe Ile Asp Pro Leu Trp Asp Tyr Leu Asp Ser Leu Leu 420 425 430 Phe Leu Asp Lys Ile Arg Asn Phe Ser Leu Gln Leu Pro Ala Tyr Gly 435 440 445 Asn Leu Thr Pro Pro Glu His Arg Arg Ala Ala Asn Leu Ser Thr Leu 450 455 460 Asn Ser Leu Trp Trp Trp Ser Gln 465 470

Claims (102)

  1. 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
    (a) HVR-H1은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-H3은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-L2는 서열 10-19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    HCMV 복합체 I에 결합하는 단리된 항체.
  2. 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
    (a) HVR-H1은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-H3은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-L2, 및 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR3의 제1 아미노산은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    HCMV 복합체 I에 결합하는 단리된 항체.
  3. 제1항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 35, 서열 39 및 서열 43으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 및 서열 36, 서열 40 및 서열 44로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR2를 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 37 및 서열 41로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR3; 및 서열 38 및 서열 42로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR4를 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 45, 서열 46 및 서열 47로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, 및 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 VH 서열이 서열 45, 서열 46 및 서열 47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 VL 서열이 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  8. 제5항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 45, 서열 46 또는 서열 47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체.
  9. 제8항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 45 또는 서열 46의 VH 서열 및 서열 49의 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체가 0.05 μg/ml 내지 0.0007 μg/ml 이하의 항체 농도에서 50%의 HCMV를 중화시키는 것인 항체.
  11. 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
    (a) HVR-H1은 서열 71의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2는 서열 72, 서열 73, 서열 74 및 서열 93으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-H3은 서열 75의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1은 서열 76의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-L2는 서열 77의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3은 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    HCMV gH에 결합하는 단리된 항체.
  12. 제11항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하며, 여기서 서열 93의 위치 6에서의 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 93의 위치 8에서의 아미노산이 Thr 및 Arg으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
  13. 제12항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 72, 서열 73 및 서열 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 것인 항체.
  14. 제13항에 있어서, HVR-H2가 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  15. 제12항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 94의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함하며, 여기서 서열 94의 위치 54에서의 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 94의 위치 56에서의 아미노산이 Thr 또는 Arg으로부터 선택된 것인 항체.
  16. 제15항에 있어서, VH가 서열 87, 서열 88 및 서열 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  17. 제15항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 90의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  18. 제17항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 90의 VL 서열을 포함하는 것인 항체.
  19. 제18항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 89의 VH 서열을 포함하는 것인 항체.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 0.001 내지 0.01 μg/ml의 EC90으로 HCMV를 중화시키는 것인 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  24. 제1항 내지 제10항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체가 전장 IgG1 항체인 항체.
  25. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 전장 IgG1 항체인 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  30. 제29항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  31. 제30항의 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되도록 하는 것을 포함하는 항체의 생산 방법.
  32. HCMV 복합체 I에 결합하는 단리된 항체 및 HCMV gH에 결합하는 단리된 항체를 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, HCMV 감염을 중화시키는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 적어도 50%의 HCMV를 중화시키는 조성물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체 및 HCMV gH에 결합하는 항체가 1:1 비로 조성물에 존재하는 것인 조성물.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체의 농도가 적어도 0.0007 μg/ml 내지 0.05 μg/ml이고, HCMV gH에 결합하는 항체의 농도가 적어도 0.001 내지 0.01 μg/ml인 조성물.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체가 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
    (a) HVR-H1이 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2가 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-H3이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1이 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-L2가 서열 10-19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3이 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    조성물.
  38. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 상기 항체가 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3) 및 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3)을 포함하며, 여기서
    (a) HVR-H1이 서열 71의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HVR-H2가 서열 72, 서열 73, 서열 74 및 서열 93으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HVR-H3이 서열 75의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HVR-L1이 서열 76의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HVR-L2가 서열 77의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HVR-L3이 서열 78의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    조성물.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 35, 서열 39 및 서열 43으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 및 서열 36, 서열 40 및 서열 44로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR2를 포함하는 것인 조성물.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 37 및 서열 41로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR3; 및 서열 38 및 서열 42로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR4를 포함하는 것인 조성물.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 45, 서열 46 및 서열 47로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, 및 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 VH 서열이 서열 45, 서열 46 및 서열 47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 상기 VL 서열이 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  44. 제41항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 (a) 서열 45, 서열 46 또는 서열 47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 48 또는 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 조성물.
  45. 제44항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 서열 45 또는 서열 46의 VH 서열 및 서열 49의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하며, 여기서 서열 93의 위치 6에서의 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 93의 위치 8에서의 아미노산이 Thr 및 Arg으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 72, 서열 73 및 서열 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 것인 조성물.
  48. 제47항에 있어서, HVR-H2가 서열 74의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  49. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 94의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함하며, 여기서 서열 94의 위치 54에서의 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Phe, Met 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 94의 위치 56에서의 아미노산이 Thr 또는 Arg으로부터 선택된 것인 조성물.
  50. 제49항에 있어서, VH가 서열 87, 서열 88 및 서열 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 90의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 90의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  53. 제52항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 서열 89의 VH 서열을 포함하는 것인 조성물.
  54. 제32항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체 및 HCMV gH에 결합하는 상기 항체가 모노클로날 항체인 조성물.
  55. 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체 및 HCMV gH에 결합하는 상기 항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 조성물.
  56. 제32항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 상기 항체가 항체 단편인 조성물.
  57. 제32항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 상기 항체가 항체 단편인 조성물.
  58. 제32항 내지 제55항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체가 전장 IgG1 항체인 조성물.
  59. 제32항 내지 제55항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 전장 IgG1 항체인 조성물.
  60. 제32항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 추가의 치료제가 간시클로비르, 포스카르넷, 발간시클로비르 및 시도포비르로부터 선택된 것인 조성물.
  63. 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물.
  64. 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 감염을 억제하거나, 치료하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물.
  65. 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 선천성 HCMV 감염 또는 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 치료하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체가 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체와 별개의 조성물 중에 있는 것인 조성물.
  67. 의약의 제조에서의 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  68. 제67항에 있어서, 의약이 HCMV 감염의 치료, 억제 또는 예방을 위한 것인 용도.
  69. 제68항에 있어서, 의약이 선천성 HCMV 감염 또는 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 예방하거나 또는 치료하기 위한 것인 용도.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 HCMV gH에 결합하는 항체와 별개의 조성물 중에 포함하는 것인 용도.
  71. 환자에게 유효량의 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법.
  72. 임신한 환자에게 유효량의 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 선천성 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법.
  73. HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하기 위해 이식 수용자에게 유효량의 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 이식 수용자에서 HCMV 감염을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 이식 수용자가 HCMV 혈청음성인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 이식 수용자가 HCMV 혈청양성 공여자로부터 기관 또는 조직을 수용하고 있거나 또는 수용한 것인 방법.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 별개로 투여하는 방법.
  78. 제71항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물이 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 별개의 조성물인 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물과 동시에 투여하는 방법.
  80. 제77항 또는 제78항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 포함하는 조성물 전에 또는 그 후에 투여하는 방법.
  81. 의약의 제조에서의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 조합물의 용도.
  82. 제81항에 있어서, 의약이 HCMV 감염의 억제, 예방 또는 치료를 위한 것인 용도.
  83. 제82항에 있어서, 의약이 선천성 HCMV 감염 또는 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 억제하거나, 예방하거나 또는 치료하기 위한 것인 용도.
  84. HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 조합물의 용도.
  85. 제84항에 있어서, 치료가 선천성 HCMV 감염 또는 이식 수용자에서의 HCMV 감염을 예방하거나 또는 억제하기 위한 것인 용도.
  86. 환자에게 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하는 방법.
  87. 임신한 환자에게 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 선천성 HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하는 방법.
  88. 이식 수용자에게 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 이식 수용자에서 HCMV 감염을 치료하거나, 예방하거나 또는 억제하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 이식 수용자가 HCMV 혈청음성인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 이식 수용자가 HCMV 혈청양성 공여자로부터 기관 또는 조직을 수용하고 있거나 또는 수용한 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 환자에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, HCMV 복합체 I에 결합하는 항체를 HCMV gH에 결합하는 항체와 별개로 투여하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체를 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체와 동시에 투여하는 방법.
  94. 제92항에 있어서, HCMV gH에 결합하는 항체를 HCMV 복합체 I에 결합하는 항체 전에 또는 그 후에 투여하는 방법.
  95. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  96. (i) 서열 1의 위치 168에서의 트립토판;
    (ii) 서열 1의 위치 446에서의 아스파르트산;
    (iii) 서열 1의 위치 171에서의 프롤린; 및
    (iv) 그의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함하는, HCMV gH의 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  97. 제96항에 있어서,
    (i) 서열 1의 위치 168에서의 트립토판;
    (ii) 서열 1의 위치 446에서의 아스파르트산;
    (iii) 서열 1의 위치 171에서의 프롤린; 및
    (iv) 그의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는, HCMV gH의 에피토프에 결합하는 항체.
  98. (i) 서열 203의 위치 47에서의 글루타민;
    (ii) 서열 203의 위치 51에서의 리신;
    (iii) 서열 203의 위치 46에서의 아스파르트산; 및
    (iv) 그의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함하는, HCMV 복합체 I의 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  99. 제98항에 있어서,
    (i) 서열 203의 위치 47에서의 글루타민;
    (ii) 서열 203의 위치 51에서의 리신;
    (iii) 서열 203의 위치 46에서의 아스파르트산; 및
    (iv) 그의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 항체.
  100. 아미노산 서열 SRALPDQTRYKYVEQLVDLT LNYHYDAS (서열 194)를 포함하는, HCMV 복합체 I의 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체.
  101. 환자에게 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 HCMV 바이러스 역가를 감소시키거나 또는 그의 증가를 예방하는 방법.
  102. 환자에게 유효량의 제26항 내지 제28항 및 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 HCMV 바이러스 역가를 감소시키거나 또는 그의 증가를 예방하는 방법.
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