CN103313727A - 抗体组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性结合HCMV复合物I的分离抗体。在一些实施方案中，本发明抗复合物I抗体包含6个HVR：（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；（b）HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；（e）HVR-L2包含选自SEQ ID NOs:10-19的氨基酸序列；和（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。抗体可以进一步包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR1；和含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR2。

Description

抗体组合物及使用方法
相关申请
本申请要求于2010年9月29日提交的美国临时申请号61/387,735和61/387,725，和于2011年7月1日提交的美国临时申请号61/504,056的利益，所述美国临时申请均整体引入本文作为参考。
对经由EFS-WEB以文本文件提交的序列表的参考
序列表经由EFS-Web作为ASCII格式的文本文件与说明书同时提交，其文件名为“P4680R1US.txt”，创建日期2011年9月15日，具有200,277字节的大小。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的部分并且在此整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及抗复合物I和抗gH抗体及其使用方法。
背景技术
人巨细胞病毒（HCMV）是β型疱疹病毒，也称为人疱疹病毒5型（HHV-5）。存在感染别的哺乳动物的其他巨细胞病毒（CMV）种类，例如鼠CMV（MCMV）、豚鼠CMV（GPCMV）、猿猴CMV（SCCMV）、恒河猴CMV（rhCMV）和黑猩猩CMV（CCMV）。HCMV是感染接近50%美国人口的常见疱疹病毒。对于绝大多数感染的人个体，HCMV感染是无症状的。然而，在生病和免疫抑制（例如HIV感染、移植患者中药物诱导的免疫抑制）的条件下，HCMV再活化或原发感染可以引起多种临床表现，例如单核细胞增多症、肝炎、视网膜炎、肺炎、失明和器官衰竭。此外，在妊娠的背景中，原发性CMV感染的获得，尽管对母亲几乎没有影响，但在发育中的胎儿中可以造成严重的临床后果。
先天性HCMV感染尤其重要，因为由在妊娠过程中感染的母亲生育的许多儿童会在子宫内被感染并且患上毁灭性的临床疾病。在美国和欧洲，126,000个女性在妊娠过程中具有原发性HCMV感染，并且在这些母亲生育的婴儿中约40,000个具有先天性感染。在美国，750个儿童中有1个由于HCMV感染而生而具有残疾或发展出残疾，包括：智力迟钝、听力丧失、视力丧失、器官缺陷和生长缺陷。先天性HCMV感染是胎儿畸形的最常见感染原因。在孕妇出现原发感染后，目前尚没有被批准用于预防或治疗胚胎感染的治疗。因此，本领域极需发现防止先天性HCMV感染的组合物和方法。
在2005年，Nigro和同事公开了一个研究，其中人CMV超免疫球蛋白（HIG）施用于具有原发性HCMV感染的待产妇（Nigro等人（2005）New Engl.J.Med.353:1350-1362）。在研究的一个组（arm）中，受HCMV感染的母亲生育的31个婴儿中仅1个生而具有疾病，而未治疗女性生育的儿童中7/14（50%）生而具有HCMV疾病。同前引文。
在妊娠过程中，HCMV可以经由胎盘从受感染母亲传播给胎儿。将胎儿固定至子宫的胎盘含有特化的上皮细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞和特化的巨噬细胞。HCMV病毒表面含有多种病毒糖蛋白复合物，其已被证实是感染胎盘中的特定细胞类型所必需的。含有gH/gL和UL128、UL130和UL131的CMV糖蛋白复合物（本文称为“复合物I”）是感染内皮细胞、上皮细胞和巨噬细胞所特别需要的。含有gH/gL和gO的CMV糖蛋白复合物（本文称为“复合物II”）是成纤维细胞感染所特别需要的。HIG已显示可以阻断病毒进入对HCMV感染敏感的所有这四种胎盘细胞内。
由于HIG难于制备和广泛分发而且医生和医学团体不愿意使用人血液制品（特别是在孕妇中），因此，产生包含可以保护胎儿不受先天性HCMV感染的一种或多种单克隆抗体的组合物将是最有利的。迄今为止，仍未开发出用于防止CMV的母婴传播的单克隆抗体组合物。Lanzavecchia和Macagno已公开了从受感染患者的永生化B细胞中分离的天然存在的抗体，其与由UL130和UL131的组合或UL128、UL130和UL131的组合导致的构象表位结合，中和CMV传播（美国专利公开号2008/0213265和2009/0081230）。Shenk和Wang已公开了与复合物I的蛋白质结合的抗体（美国专利号7,704,510）。Funaro等人还在美国专利公开号2010-0040602中公开了针对CMV的中和抗体。另外，抗gH单克隆抗体MSL-109在两个患者群体中进行了人测试，但未成功，所述两个患者群体是同种异体骨髓移植接受者和具有AIDS和CMV视网膜炎的患者（Drobyski等人，Transplantation51:1190-1196（1991）；Boeckh等人，Biol.Blood MarrowTransplant.7:343-351（2001）；和Borucki等人，Antiviral Res.64:103-111（2004）。
本领域仍需要开发用于防止HCMV感染，包括先天性HCMV感染，的单克隆抗体。
发明概述
本发明提供了与HCMV复合物I特异性结合的分离抗体。在特定实施方案中，本发明的抗复合物I抗体包含六个HVRs:（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3；（d）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（e）包含选自SEQ ID NOs:10-19的氨基酸序列的HVR-L2；和（f）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。抗体可以进一步包括包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR1和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的FR2。
在另外实施方案中，本发明的抗复合物I抗体包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；（b）HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；（c）HVR-H3包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列；（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和（e）HVR-L2和轻链可变结构域构架FR3的第一个氨基酸包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在特定实施方案中，抗复合物I抗体包含（a）包含SEQ ID NO:45、或SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH；和（b）包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL。此类抗体可以进一步包括包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR3和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FR4。
在一些实施方案中，抗复合物I抗体包含与SEQ ID NO:45、或SEQ IDNO:46、或SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列，和与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:45、或SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，抗复合物I抗体包括包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，抗复合物I抗体包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的VH序列和SEQ ID NO:49的VL序列。
本发明还提供了与HCMV gH特异性结合的分离抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗gH抗体包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中：
（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
（b）HVR-H2包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74和SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；
（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；
（e）HVR-L2包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；和
（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗gH抗体包括包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，其中在SEQ ID NO:93的位置6上的氨基酸选自Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Met和Leu，并且在SEQ ID NO:93的位置8上的氨基酸选自Thr和Arg。
在特定实施方案中，抗gH抗体包括包含SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2。
在其它实施方案中，抗gH抗体包括包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的HVR-H2，其中所述序列在（SEQ ID NO:94的）位置54上包含选自Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Met和Leu的氨基酸。在一些实施方案中，抗体进一步在位置56上包含选自Thr和Arg的氨基酸。
本发明还提供了具有在氨基酸序列上与SEQ ID NO:94至少95%相同的VH序列的抗gH抗体，其中所述序列包含氨基酸Asn54、Ser54、Thr54、Gln54、Phe54、Met54或Leu54和/或Arg56。在特定实施方案中，抗体包括包含选自SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:94具有95%相同的氨基酸序列，其中所述序列含有在位置54上的选自Asn54、Ser54、Thr54、Gln54、Phe54、Met54或Leu54的氨基酸和/或在位置56上的Arg（Arg56）；和（b）与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列。在特定实施方案中，VH包含选自SEQ ID NO:87、SEQID NO:88和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在特定实施方案中，抗体包含SEQ IDNO:89的VH序列和SEQ ID NO:90的VL序列。
在特定实施方案中，本发明的抗体与HCMV表面上的HCMV复合物I特异性结合，且以0.1μg/ml或更少的EC90中和HCMV。在特定实施方案中，本发明的分离的抗复合物I抗体与HCMV表面上的HCMV复合物I特异性结合，并且以0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.015μg/ml、0.014μg/ml、0.013μg/ml、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ml、0.003μg/ml、0.002μg/ml、0.001μg/ml、0.0009μg/ml、0.0008μg/ml、0.0007μg/ml或更少的抗体浓度（例如，以10-8M、10-9M10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更低的抗体浓度）中和50%HCMV。
在特定实施方案中，本发明的分离的抗gH抗体与HCMV gH特异性结合。抗体与HCMV表面上的gH结合，且以1μg/ml或更少的EC90中和HCMV。本发明的分离的抗gH抗体与HCMV表面上的gH结合，并且以0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.015μg/ml、0.014μg/ml、0.013μg/ml、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ml、0.003μg/ml、0.002μg/ml、0.001μg/ml或更少的抗体浓度（例如，以10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更低的抗体浓度）中和50%HCMV。
本发明的抗体可以是单克隆抗体，包括例如人、人源化或嵌合抗体。本发明还提供了特异性结合HCMV gH和/或复合物I的抗体片段。
在特定实施方案中，特异性结合HCMV复合物I和/或gH的抗体是全长IgG1抗体。
本发明还提供了编码特异性结合HCMV复合物I和/或gH的抗体的分离核酸。本发明还提供了包含编码此类抗体的核酸的宿主细胞。
本发明进一步提供了产生抗体的方法，其包括培养含有编码特异性结合复合物I和/或gH的抗体的核酸的宿主细胞，从而使得抗体产生。该方法可以进一步包括从宿主细胞回收抗体。
本发明还提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合和药学可接受的载体的药物制剂。各抗体的药物制剂可以是分开的或组合的。药物制剂可以进一步包含另外的治疗剂（例如更昔洛韦(ganciclovir)、磷卡萘替(foscarnet)、缬更昔洛韦(valganciclovir)和昔多呋韦(cidofovir)）。
本发明还提供了包含抗复合物I抗体、或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合的组合物。包含各抗体的组合物可以是分开或组合的。组合物可以进一步包含另外的治疗剂（例如更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦）。
本发明还提供了包含抗复合物I和/或抗gH抗体的组合物用于抑制、治疗或预防HCMV感染。在一些实施方案中，该用途是用于抑制、治疗或预防先天性HCMV感染、或在所移植的组织、器官或供体被HCMV感染或已被HCMV感染的组织或器官移植受体中用于抑制、治疗或预防HCMV感染。另外的实施方案包括这样的用途，其中移植受体先前已感染了HCMV，并且有再活化的危险。在特定实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。在特定实施方案中，包含结合HCMVgH的抗体的组合物与包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物是分开的。
包含本发明抗体的组合物也可以用于药物的制造中。药物可以用于HCMV感染的治疗、抑制或预防中，例如抑制、预防或治疗先天性HCMV感染、或器官或组织移植受体中的HCMV感染，其中对于所述移植受体，该移植的器官、组织或供体被HCMV感染或已被HCMV感染。在另外实施方案中，移植受体先前已被HCMV感染，并且有再活化的危险。在特定实施方案中，药物可以进一步包含另外的治疗剂（例如更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦）。在特定实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。在特定实施方案中，包含结合HCMVgH的抗体的组合物在与结合HCMV复合物I的抗体分开的组合物中。
本发明还提供了治疗、抑制或预防HCMV感染的方法，其包括给患者施用有效量的包含抗gH抗体、抗复合物I抗体或其组合的组合物。本发明还提供了治疗、抑制或预防先天性HCMV感染的方法，其包括给孕妇施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物。本发明还提供了治疗HCMV感染的胎儿的方法，其包括给孕妇施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物。本发明还提供了治疗HCMV感染的婴儿或在妊娠期中暴露过HCMV的婴儿的方法，其包括给婴儿施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物。
本发明还提供了在器官或组织移植受体中治疗、抑制或预防HCMV感染的方法，其包括给移植了器官或组织的受体施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物，以治疗、抑制或预防由获自被HCMV感染或已被HCMV感染的器官供体或组织供体的器官或组织引起的HCMV感染。另外的实施方案包括方法，其中移植受体先前已被HCMV感染且有再活化的危险。治疗方法可以进一步包括给患者施用另外的治疗剂（例如更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦）。
在特定实施方案中，包含结合HCMV gH的抗体的组合物在与包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物分开的组合物中。在其他实施方案中，包含结合HCMV gH的抗体的组合物在包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物施用的同时、之前或之后施用。
本发明还提供了抗复合物I和/或抗gH抗体用于抑制、治疗或预防HCMV感染。在一些实施方案中，该用途是用于抑制、治疗或预防先天性HCMV感染、或组织或器官移植受体中的HCMV感染，其中对于所述移植受体，该移植的组织、器官或供体被HCMV感染或已被HCMV感染。另外的实施方案包括用途，其中移植受体先前已被HCMV感染，并且有再活化的危险。在特定实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。
本发明的抗体也可以用于药物的制造中。药物可以用于HCMV感染的治疗、抑制或预防中，例如抑制、预防或治疗先天性HCMV感染或器官或组织移植受体中的HCMV感染，对于所述移植受体，该移植的器官、组织或供体被HCMV感染或已被HCMV感染。在另外实施方案中，移植受体先前已被HCMV感染，并且有再活化的危险。在特定实施方案中，药物可以进一步包含另外的治疗剂（例如更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦）。在特定实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。
本发明还提供了治疗、抑制或预防HCMV感染的方法，其包括给患者施用有效量的抗gH抗体、抗复合物I抗体或其组合。本发明还提供了治疗、抑制或预防先天性HCMV感染的方法，其包括给孕妇施用有效量的本发明的抗体或其组合。本发明还提供了治疗HCMV感染的胎儿的方法，其包括给孕妇施用有效量的本发明的抗体或其组合。
本发明还提供了治疗、抑制或预防器官或组织移植受体中的HCMV感染的方法，其包括给该移植了器官或组织的受体施用有效量的本发明的抗体或其组合，以治疗、抑制或预防由得自被HCMV感染或已被HCMV感染的器官供体或组织供体的器官或组织引起的HCMV感染。另外的实施方案包括方法，其中移植受体先前已被HCMV感染且有再活化的危险。治疗方法可以进一步包括给患者施用另外的治疗剂（例如更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦）。
在特定实施方案中，结合HCMV gH的抗体与结合HCMV复合物I的抗体分开地施用。在其他实施方案中，结合HCMV gH的抗体与结合HCMV复合物I的抗体同时、在之前或在之后施用。
在特定实施方案中，器官移植物是心、肾、肝、肺、胰腺、肠或胸腺。在其他实施方案中，组织移植物是手、角膜、皮肤、面部、胰岛、骨髓、干细胞、全血、血小板、血清、血细胞、血管、心脏瓣膜、骨、骨祖先细胞、软骨、韧带、腱、肌衬里(muscle lining)。
本发明还提供了与本发明的抗gH和/或抗复合物I抗体结合相同表位的抗体。另外的实施方案包括结合包含如下氨基酸的HCMV gH表位的抗体，所述氨基酸对应于选自下述的氨基酸：在SEQ ID NO:1的位置168上的色氨酸；在SEQ ID NO:1的位置446上的天冬氨酸；在SEQ ID NO:1的位置171上的脯氨酸；及其组合。另外的实施方案包括结合包含如下氨基酸的HCMV复合物I表位的抗体，所述氨基酸对应于选自下述的氨基酸：在SEQ ID NO:203的位置47上的谷氨酰胺；（ii）在SEQ ID NO:203的位置51上的赖氨酸；（iii）在SEQ ID NO:203的位置46上的天冬氨酸；和（iv）其组合。另外的实施方案包括与HCMV复合物I的多肽结合的抗体，其中所述多肽包含氨基酸序列SRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDAS（SEQ ID NO:194）。
附图简述
图1显示了鼠mAb8G8（SEQ ID NO:50）的重链可变区（VH）与所选人重链可变区：VH1FW（SEQ ID NO:52）、人VH3FW（SEQ IDNO:53）、和人VH7FW（SEQ ID NO:54）的氨基酸序列比对。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。圆圈指示VL-VH相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）；双星号（一个在另一个上）指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）和FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。在位置47、64、66、68上的单个星号指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）；在位置58上的单个星号指示FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。
图2显示鼠mAb8G8（SEQ ID NO:51）的轻链可变区（VL）与人轻链可变区λ3FW区（SEQ ID NO:69）和人λ4FW区（SEQ ID NO:55）的氨基酸序列比对。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。圆圈指示VL-VH相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）；双星号（一个在另一个上）指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）和FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。在位置47、64、66、68上的单个星号指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）；在位置58上的单个星号指示FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。
图3显示中和测定试验的结果，比较了8G8λ3变体与8G8λ4变体。小图A：除了小鼠/人嵌合8G8抗体（QE7/C2）外，具有人VH1、VH3或VH7的人源化8G8λ3抗体也用于中和测定试验中。小图B：除了小鼠/人嵌合8G8抗体（QE7/C2）外，具有人VH1、VH3或VH7的人源化8G8λ4抗体也用于中和测定试验中。实验的EC50值显示在相应的实验下方。
图4显示8G8HVR-L2的突变体序列。显示了HVR-L2的氨基酸序列和FR3的第一个氨基酸（WT，SEQ ID NO:57；A1，SEQ ID NO:58；E1，SEQ ID NO:59；T1，SEQ ID NO:60；A2，SEQ ID NO:61；E2，SEQ IDNO:62；T2，SEQ ID NO:63；SG，SEQ ID NO:64；SGSG，SEQ ID NO:65；TGDA，SEQ ID NO:66）。该图中的编号基于Kabat编号。
图5显示中和测定试验结果，其中使用具有图4所示的含有单个氨基酸置换的突变HVR-L2区的多种人源化8G8抗体。小图A：中和测定试验。HVR-L2突变抗体都含有人8G8VH1链。小图B：实验的EC50值。
图6显示中和测定试验结果，其中使用具有图4中所示的含有两个氨基酸置换的突变HVR-L2区的多种人源化8G8抗体。小图A：中和测定试验。HVR-L2突变抗体都含有人8G8VH1链。小图B：实验的EC50值。
图7显示鼠mAb8G8的轻链可变区（SEQ ID NO:51）与人轻链可变区λ4FW（SEQ ID NO:55）和在λ4FW上8G8的人源化轻链可变区（hu8G8.λ4FW）（SEQ ID NO:48）的氨基酸序列比对。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。圆圈指示VL-VH相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）；双星号（一个在另一个上）指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）和FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。在位置47、64、66、68上的单个星号指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）；在位置58上的单个星号指示FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。
图8显示鼠mAb8G8的重链可变区（SEQ ID NO:50）与人重链可变区VH1构架（VH1FW）（SEQ ID NO:52）和在VH1FW上8G8的人源化重链可变区（hu8G8.VH1）（SEQ ID NO:45）的氨基酸序列比对。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。圆圈指示VL-VH相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）；双星号（一个在另一个上）指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）和FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。在位置47、64、66、68上的单个星号指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）；在位置58上的单个星号指示FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。还显示了编码hu8G8.VH1的示例性核酸序列（SEQ ID NO:185）。
图9显示鼠mAb8G8的重链可变区（SEQ ID NO:50）与人重链可变区VH3FW（SEQ ID NO:53）和在VH3FW上8G8的人源化重链可变区（hu8G8.VH3）（SEQ ID NO:46）的氨基酸序列比对。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。圆圈指示VL-VH相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）；双星号（一个在另一个上）指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）和FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。在位置47、64、66、68上的单个星号指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）；在位置58上的单个星号指示FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。
图10显示鼠mAb8G8VL的轻链可变区（SEQ ID NO:51）与λ4FW区的轻链可变区（SEQ ID NO:55）和在λ4FW上8G8的人源化轻链可变区（λ48G8嫁接物）（SEQ ID NO:49）的氨基酸序列比对，在所述人源化轻链可变区中在根据Kabat编号的氨基酸2和36上引入了氨基酸变化。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。圆圈指示VL-VH相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）；双星号（一个在另一个上）指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）和FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。在位置47、64、66、68上的单个星号指示Vernier位置（Foote和Winter（1992）J.Mol.Biol.224:487）；在位置58上的单个星号指示FW-CDR相互作用（Padlan（1994）Mol.Immunol.31:169）。还显示了编码λ48G8嫁接物的示例性核酸序列（SEQ ID NO:186）。
图11显示人抗体MSL-109与mAb HB1的氨基酸序列比对。小图A：MSL-109VL（SEQ ID NO:90）与亲和力成熟的HB1VL（也为SEQ IDNO:90（100%同一性））的比对；小图B：人抗体MSL-109VH（SEQ IDNO:92）与亲和力成熟的HB1VH（SEQ ID NO:89）的氨基酸序列比对。氨基酸根据Kabat编号进行编号。高变区（HVRs）是加框的。
图12A显示来自MSL-109（SEQ ID NO:91）和IGHV3-21*01（SEQID NO:93）的HVR-H2的氨基酸序列和进行的各种氨基酸置换。图12B和图12C显示使用含有突变的HVR-H2区的抗体进行的两个不同中和测定试验的结果。显示了用Fab（图12B）和mAb（图12C）的中和测定试验。IC50以nM单位提供。
图13显示中和测定试验结果，就防止上皮细胞和成纤维细胞感染的能力，比较了含有λ48G8嫁接物和hu8G8.VH1的抗体（下文“hu8G8”）和HB1与HIG。
图14显示在上皮细胞和成纤维细胞上使用耗竭的超免疫球蛋白（HIG）的病毒中和测定试验结果。使HIG耗竭抗gB特异性抗体、抗复合物I特异性抗体、抗gH/gL抗体、或作为对照进行模拟耗竭。
图15显示FACS分析结果，与已知的抗gB、抗gH和抗UL131抗体相比较，以确定HB1和hu8G8抗体的抗原特异性。在x轴上的APC强度指示抗体的结合。y轴标示在给定强度的细胞比例，表达为在任何强度的最大细胞数目的百分比。
图16显示中和测定试验结果，其中hu8G8和HB1以1:1比混合且以稀释系列测试了其抑制HCMV感染上皮细胞的能力。两种抗体的组合具有加性效应，且其具有依据Bliss独立方程(Bliss independence equation)（对于具有效应A和B的两种单独化合物的组合应答C是C=A+B–A*B）的行为表现。
图17显示中和测定试验结果，测定与各种浓度的hu8G8联合的HB1效力、或与各种HB1浓度联合的hu8G8效力。
图18显示用HB1抗性HCMV突变体的中和测定试验结果。小图A显示了使用HB1抗体的中和测定试验结果。小图B显示了使用hu8G8抗体的中和测定试验结果。HB1抗性HCMV突变体对hu8G8引起的中和作用仍是敏感的。
图19显示用hu8G8抗性HCMV突变体的中和测定试验结果。小图A显示了使用HB1抗体的中和测定试验结果。小图B显示了使用hu8G8抗体的中和测定试验结果。hu8G8抗性HCMV突变体对HB1引起的中和作用仍是敏感的。
图20显示，在上皮和成纤维细胞细胞上，与多种HB1抗性病毒突变体相比较，HCMV株（WT）D1（在产生抗性株时平行生长的VR1814）的病毒进入的数据。
图21显示通过FACS分析测定的HB1抗体与细胞表面表达的gH/gL结合的能力，所述gH/gL在gH中含有赋予抗性的点突变。不同的抗gH抗体用作细胞表面表达的阳性对照。x轴是GFP强度，指示HCMV糖蛋白的表达。y轴是指示抗体结合的APC信号。
图22显示通过FACS分析测定的hu8G8抗体与细胞表面表达的复合物I结合的能力，该细胞表面表达的复合物I在复合物I中含有赋予抗性的点突变。抗UL131抗体和抗gH抗体用作细胞表面表达的阳性对照。x轴是指示HCMV糖蛋白表达的GFP强度。y轴是指示抗体结合的APC信号。
图23A和B显示Scatchard分析结果，以测定hu8G8和HB1对于其抗原的结合亲和力。使用Munson和Rodbard的拟合算法将结果绘图。y轴标示结合的125I标记的抗体与总抗体的浓度比。总抗体计算为125I标记的和未标记的抗体的浓度。
图24显示ELISA测定结果，测量了hu8G8和阳性对照抗体（抗HIS）与UL131的肽片段（SEQ ID NO:194的氨基酸41（Ser）至氨基酸68（Ser））（SRA-Helix WT）或含有氨基酸置换Q47K的相应片段（SRA-Helix Mut）的结合。
发明实施方案的详述
I.定义
用于本文目的的“接纳体人构架”是含有源自人免疫球蛋白构架或人共有构架（如下文定义）的轻链可变结构域（VL）构架或重链可变结构域（VH）构架的氨基酸序列的构架。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含与其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL接纳体人构架在序列上等同于VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列。
“亲和力”指一个分子（例如抗体）的单个结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间的非共价相互作用的总和力量。除非另有说明，如本文使用的，“结合亲和力”指固有的结合亲和力，其反映结合对的成员（例如抗体和抗原）之间的1:1相互作用。分子X对于其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数（Kd）表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法，包括本文描述的那些方法，进行测量。用于测量结合亲和力的特定举例说明和示例性实施方案在下文描述。
“亲和力成熟的”抗体指：在一个或多个高变区（HVRs）中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比较，此类改变导致抗体对于抗原的亲和力的改善。
术语“抗复合物I抗体”和“与复合物I结合的抗体”指能够以足够亲和力结合复合物I的抗体，该亲合力使得该抗体可以用作靶向复合物I的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，如通过例如放射性免疫测定（RIA）测量的，抗复合物I抗体与无关的非复合物I蛋白质的结合程度小于抗体与复合物I的结合的约10%。在特定实施方案中，与复合物I结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M）的解离常数（Kd）。在特定实施方案中，抗复合物I抗体与在人CMV分离株中保守的复合物I表位结合。在特定实施方案中，抗复合物I抗体与在感染不同物种的CMV株中保守的复合物I表位结合。在特定实施方案中，“抗复合物I抗体”结合复合物I的构象表位，并且在特定实施方案中，抗复合物I抗体与并非gH的单个复合物I蛋白质成员（即gL、UL128、UL130或UL131）内的表位结合。
术语“抗gH抗体”和“与gH结合的抗体”指能够以足够亲和力结合gH的抗体，所述亲合力使得抗体可以用作靶向gH的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如通过放射性免疫测定（RIA）测量的，抗gH抗体与无关的非gH蛋白质的结合程度小于抗体与gH的结合的约10%。在特定实施方案中，与gH结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M）的解离常数（Kd）。在特定实施方案中，抗gH抗体与在人CMV分离株中保守的gH表位结合。在特定实施方案中，抗gH抗体与在感染不同物种的CMV株中保守的gH表位结合。
术语“抗体”在本文中以最广泛含义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们显示出所需抗原结合活性即可。
“抗体片段”指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，该部分与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F（ab'）2；双抗体（diabody）；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv）；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指这样的抗体，该抗体在竞争测定试验中阻断参考抗体与其抗原的结合的50%或更多，且反过来地，参考抗体在竞争测定试验中阻断该抗体与其抗原的结合的50%或更多。示例性竞争测定试验在本文中提供。
术语“嵌合”抗体指其中重和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
抗体的“种类”指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要的抗体种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ、和μ。
如本文使用的，术语“复合物I”，除非另有说明，指来自任何巨细胞病毒来源的任何天然复合物I，包括感染哺乳动物例如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠）的CMV。该术语涵盖gH、gL、UL128、UL130和UL131多肽之全部的组合。该术语还包括复合物I的蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV gH的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1中。示例性HCMV gL的氨基酸序列显示于SEQ IDNO:2中。示例性HCMV UL128的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:3中。示例性HCMV UL130的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4中。示例性HCMV UL131的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:5中。关于HCMV gH、gL、UL128、UL130和UL131的另外示例性序列可以在Genbank登记号GU179289（Dargan等人，J.Gen.Virol.91：1535-1546（2010））中发现，其都整体引入本文作为参考，并且作为SEQ ID NO：206（gH）、SEQID NO：208（gL）、SEQ ID NO：205（UL128）、SEQ ID NO：204（UL130）；和SEQ ID NO：203（UL131）包括在本文中。
如本文使用的，除非另有说明，术语“复合物II”指来自任何巨细胞病毒来源的任何天然复合物II，包括感染哺乳动物例如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠）的CMV。该术语涵盖gH、gL和gO之全部的组合。该术语还包括复合物II的蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV gH的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1中。示例性HCMV gL的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2中。示例性HCMV gO的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:209中。关于HCMV gH、gL和gO的另外示例性序列可以在Genbank登记号GU179289（Dargan等人，J.Gen.Virol.91：1535-1546（2010））中发现，其都整体引入本文作为参考，并且作为SEQ ID NO：206（gH）、SEQ ID NO：208（gL）和SEQID NO：207（gO）包括在本文中。
如本文使用的，除非另有说明，术语“gH”指来自任何脊椎动物来源的任何天然gH，包括哺乳动物例如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠）。该术语涵盖“全长”未加工的gH以及由于细胞中的加工而产生的任何gH形式。该术语还涵盖天然存在的gH变体，例如剪接变体或等位基因变体。gH的氨基酸序列在CMV分离株之间具有约95%同一性。示例性HCMV gH的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1中。关于HCMV gH的另外示例性序列可以在Genbank登记号GU179289（Dargan等人，J.Gen.Virol.91：1535-1546（2010））中发现，其都整体引入本文作为参考，并且作为SEQ ID NO：206（gH）包括在本文中。
如本文使用的术语“细胞毒素剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒素剂包括但不限于放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素）；化学治疗剂或药物（例如氨甲蝶呤、阿霉素（adriamicin）、长春花生物碱（长春新碱、长春碱、依托泊苷）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂）；生长抑制剂；酶及其片段例如溶核酶；抗生素；毒素例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应子功能”指可归于抗体的Fc区的那些生物活性，其随着抗体同种型而改变。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性（CDC）；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）的下调；和B细胞激活。
活性剂例如药物制剂的“有效量”指在所需剂量和时间段可以有效达到期望的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其含有恒定区的至少部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸（Lys447）可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
“构架”或“FR”指除了高变区（HVR）残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。相应地，HVR和FR序列一般在VH（或VL）中以下述顺序出现：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指外源核酸已引入其内的细胞，包括此细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，与传代数无关。后代可以在核酸内容上不完全等同于亲本细胞，而是可以含有突变。具有与在原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变后代包括在本文中。
“人抗体”是具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的或衍生自非人来源的抗体的氨基酸序列，其中所述非人来源利用人的抗体库(antibody repertoires)或其他人抗体编码序列。人抗体的这个定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表在选择的人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最通常出现的氨基酸残基的构架。一般地，该选择的人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列亚组。一般地，该序列亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD（1991），第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如在Kabat等人，同上引文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如在Kabat等人，同上引文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定实施方案中，人源化抗体将包含至少一个和一般地两个可变结构域的基本上全部，其中HVRs（例如CDRs）的全部或基本上全部对应于非人抗体的HVRs（例如CDRs），并且FRs的全部或基本上全部对应于人抗体的FRs。人源化抗体任选可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”指已经历人源化的抗体。
如本文使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构上限定的环（“高变环”）的各个区域。一般地，天然四链抗体包含六个HVRs；VH中的三个（H1、H2、H3）和VL中的三个（L1、L2、L3）。HVRs一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”（CDRs）的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32（L1）、50-52（L2）、91-96（L3）、26-32（H1）、53-55（H2）和96-101（H3）上。（Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917（1987）.）示例性CDRs（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3）出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102上。（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD（1991）.）除了VH中的CDR1外，CDRs一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDRs还包含“特异性决定残基”或“SDRs”，其是接触抗原的残基。SDRs包含在称为缩简的CDRs(abbreviated-CDRs)或a-CDRs的CDRs区域内。示例性a-CDRs（a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3）出现在L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102上。（参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633（2008）.）除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基（例如FR残基）在本文中根据Kabat等人，同上引文编号。
“免疫缀合物”是缀合至一个或多个异源分子（包括但不限于细胞毒素剂）的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物（例如牛、绵羊、猫、犬和马）、灵长类（例如人和非人灵长类例如猴）、兔和啮齿类（例如小鼠和大鼠）。在特定实施方案中，个体或受试者是人。
如本文使用的“婴儿”指年龄范围从出生到不超过约一岁的个体或受试者，包括0–约12个月的婴儿。
“分离的”抗体是已与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至超过95%或99%纯度，如通过例如电泳（例如SDS-PAGE、等电点聚焦（IEF）、毛细管电泳）或色谱（例如离子交换或反相HPLC）测定的。关于用于评估抗体纯度的方法综述，参见例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848:79-87（2007）。
“分离的”核酸指已与其天然环境中的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在正常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
“编码抗复合物I抗体的分离核酸”指编码抗体重和轻链（或其片段）的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的此(一个或多个)核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的此(一个或多个)核酸分子。
“编码抗gH抗体的分离核酸”指编码抗体重和轻链（或其片段）的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开载体中的此(一个或多个)核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的此(一个或多个)核酸分子。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群体的抗体，即，除了可能的变体抗体外，该群体中包含的各抗体个体是相同的和/或结合相同表位，其中所述可能的变体抗体例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中出现，且此类变体一般以微小量存在。与一般包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品中的每一个单克隆抗体都针对抗原上的一个决定簇。因此，修饰词“单克隆的”指得自基本上同质的抗体群体的抗体的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法生产该抗体。例如，待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。
“裸抗体”指不缀合异源部分(moiety)（例如细胞毒性部分）或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体蛋白质，由二硫键连接的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N到C端，每条重链具有可变区（VH），也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域（CH1、CH2和CH3）。类似地，从N到C端，每条轻链具有可变区（VL），也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻链（CL）结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以归于称为kappa（κ）和lambda（λ）的两个类型之一。
术语“包装说明书”用于指习惯上包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于此治疗产品使用的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
相对于参考多肽序列而言的“百分比（%）氨基酸序列同一性”被定义为：在比对候选序列和参考序列且在需要时引入空位以达到最大百分比序列同一性后，不将任何保守置换考虑为序列相同部分，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基等同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域内的多种方式进行，例如使用公众可获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在待比较的序列的全长上达到最大对齐所需的任何算法。然而，对于本文目的，%氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已与用户手册一起提交给美国版权局(U.S.Copyright Office，WashingtonD.C.，20559)，注册在美国版权注册号TXU510087下。ALIGN-2程序从Genentech，Inc.，South San Francisco，California是公众可获得的，或可以由源代码编译。ALIGN-2程序应编译用于在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设置，不进行改变。
在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、和、或相对于给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（其可以可替代地表达为：与、和或相对于给定氨基酸序列B具有或包含特定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是在A和B的ALIGN-2程序比对中通过该序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数目。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文使用的所有%氨基酸序列同一性值均使用ALIGN-2计算机程序如紧先前段落中所述的获得。
术语“药物制剂”指具有如下形式的制品，该形式允许该制品中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且该形式不含有对于制剂将施用于的受试者具有无法接受的毒性的另外组分。
“药学可接受的载体”指除了活性成分外，对于受试者无毒的药物制剂中的成分。药学可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文使用的，“治疗”(treatment)（及其语法变体，例如“治疗”(treat或treating)）指力图改变所治疗个体的自然过程的临床干预，其可以执行用于预防或在临床病理学过程中执行。治疗的期望效果包括但不限于，防止疾病的出现或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、以及缓解或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的组合物用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展或减少疾病的发生率或疾病症状的严重性。
术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域（分别为VH和VL）一般具有相似结构，其中每个结构域包含四个保守构架区（FRs）和三个高变区（HVRs）。（参见例如，Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91页（2007））。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补VH或VL结构域文库，而分离结合该特定抗原的抗体。参见例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887（1993）；Clarkson等人，Nature352:624-628（1991）。
如本文使用的，术语“载体”指能够扩增与之连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已引入了其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与之可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于中和HCMV感染的单克隆抗体的发现。在特定实施方案中，提供了与复合物I结合的抗体。在其他实施方案中，提供了与gH结合的抗体。本发明的抗体可以例如用于预防、抑制和/或治疗HCMV感染，先天性HCMV感染和通过HCMV感染的移植组织而造成的患者感染。抗体还可以用于诊断HCMV感染。
在一个方面，本发明还部分基于发现了包含单克隆抗体组合的组合物，所述组合物可以抑制HCMV病毒进入胎盘的所有细胞类型：内皮细胞、上皮细胞、单核细胞/巨噬细胞和成纤维细胞，且减少和/或抑制HCMV抗性株的形成。在特定实施方案中，提供了使用这些组合物的方法。本发明的组合物可以例如用于预防、抑制和/或治疗HCMV感染，先天性HCMV感染和通过HCMV感染的移植器官或组织造成的患者感染，其中所述移植器官或组织从先前或现在被HCMV感染的患者中收获。组合物还可以用于诊断HCMV感染。
A.示例性抗复合物I抗体
在一个方面，本发明提供了与复合物I结合的分离抗体。在特定实施方案中，抗复合物I抗体特异性结合于由UL128、UL130、UL131与gH/gL的缔合而形成的构象表位，或结合于复合物I的单个成员内的表位。在一些实施方案中，抗复合物I抗体以0.7μg/ml、0.5μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.015、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml或更少的EC90，中和HCMV。在其他方面，抗复合物I抗体特异性结合HCMV表面上的复合物I，并且在0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.015μg/ml、0.014μg/ml、0.013μg/ml、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ml、0.003μg/ml、0.002μg/ml、0.001μg/ml、0.0009μg/ml、0.0008μg/ml、0.0007μg/ml或更少的抗体浓度（例如在10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更低的抗体浓度），中和50%HCMV。
在一个方面，本发明提供了包含选自下述的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVRs的抗复合物I抗体：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3；（d）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（e）包含选自SEQ ID NOs:10-19的氨基酸序列的HVR-L2；和（f）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供了包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列的抗体：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供了包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列的抗体：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含选自SEQ ID NOs:10-19的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含选自下述的所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3，以及选自下述的三个VL HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-L2和轻链可变区构架FR3的第一个氨基酸；和（c）包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的HVR-L3。在特定实施方案中，如上文提供的抗复合物I抗体的任何一个或多个氨基酸在下述HVR位置上发生置换：在HVR-L2（SEQ ID NO:10）中：位置4、5、11和12。在特定实施方案中，置换是保守置换，如本文提供的。在特定实施方案中，下述置换中的任何一个或多个可以以任何组合进行：在HVR-L2（SEQ ID NO:57）中：D4E、D4T、D4S、G5A、D11E、D11T、D11S和G12A。SEQ ID NO:21的共有序列涵盖了上述置换的所有可能组合。
在上述任何实施方案中，抗复合物I抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包含接纳体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在另一个实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:22的FR1序列、SEQ ID NO:23的FR2序列、SEQID NO:24的FR3序列、和SEQ ID NO:25的FR4序列的VH。在其他实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:22的FR1序列、SEQ ID NO:27的FR2序列、SEQ ID NO:28的FR3序列、和SEQ ID NO:29的FR4序列的VH。在其他实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:30的FR1序列、SEQ ID NO:31的FR2序列、SEQ ID NO:32的FR3序列、和SEQ ID NO:25的FR4序列的VH。在其他实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:33的FR1序列、SEQ ID NO:23的FR2序列、SEQ ID NO:34的FR3序列、和SEQ ID NO:25的FR4序列的VH。
在另一个实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:35的FR1序列、SEQ ID NO:36的FR2序列、SEQ ID NO:37的FR3序列、和SEQ ID NO:38的FR4序列的VL。在其他实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:39的FR1序列、SEQ ID NO:40的FR2序列、SEQ ID NO:41的FR3序列、和SEQ ID NO:42的FR4序列的VL。在其他实施方案中，抗复合物I抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQ ID NO:43的FR1序列、SEQ ID NO:44的FR2序列、SEQ ID NO:41的FR3序列、和SEQ ID NO:42的FR4序列的VL。
在任何上述抗体中，VL FR3序列可以由选自SEQ ID NO:67或SEQID NO:68中的一个置换。
在另一个方面，抗复合物I抗体包含与SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:47的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域（VH）序列。在特定实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换（例如保守置换）、插入或缺失，但包含该序列的抗复合物I抗体保留与复合物I结合的能力。在特定实施方案中，在SEQ ID NO:45、或SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:47中共1–10个氨基酸已发生置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中（即在FRs中）。在特定实施方案中，VH包含选自下述的一个、两个或三个HVRs：（a）包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-H1，（b）包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-H2，和（c）包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，提供了抗复合物I抗体，其中所述抗体包含与SEQ IDNO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域（VL）。在特定实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有相对于参考序列的置换（例如保守置换）、插入或缺失，但包含该序列的抗复合物I抗体保留与复合物I结合的能力。在特定实施方案中，在SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49中共1–10个氨基酸已发生置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中（即在FRs中）。在特定实施方案中，VL包含选自下述的一个、两个或三个HVRs：（a）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含选自SEQ IDNOs:10-19的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供了抗复合物I抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH、和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含SEQ IDNO:46的VH和SEQ ID NO:49的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:48的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:46的VH和SEQID NO:48的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:48的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在进一步方面，本发明提供了与本文提供的抗复合物I抗体竞争和/或结合相同的表位的抗体。例如，在特定实施方案中，提供了与抗复合物I抗体竞争和/或结合相同的表位的抗体，所述抗复合物I抗体包括包含SEQID NOs:45-47的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL。
在进一步方面，本发明提供了与包含如下氨基酸的抗复合物I抗体结合相同的表位的抗体，所述氨基酸对应于选自下述的氨基酸：在SEQ IDNO:203的位置47上的谷氨酰胺、在SEQ ID NO:203的位置51上的赖氨酸、在SEQ ID NO:203的位置46上的天冬氨酸、及其组合。包含表位的相应氨基酸可以在UL131氨基酸序列中位于大约相同的位置上，但由于各HCMV株之间在UL131上的氨基酸序列差异而不同。
在进一步方面，本发明提供了与HCMV复合物I的多肽结合的抗体，其中所述多肽包含氨基酸序列SRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDAS（SEQ ID NO:194）。
在进一步方面，本发明提供了与本文提供的抗复合物I抗体结合相同的表位的抗体。在另外方面，本发明提供了以0.7μg/ml、0.5μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.015、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml或更少的EC90与本文提供的抗复合物I抗体结合相同的表位的抗体。在其他方面，本发明提供了这样的抗体，其与本文提供的抗复合物I抗体结合相同的表位，并且在0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.015μg/ml、0.014μg/ml、0.013μg/ml、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ml、0.003μg/ml、0.002μg/ml、0.001μg/ml、0.0009μg/ml、0.0008μg/ml、0.0007μg/ml或更少的抗体浓度（例如在10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更低的抗体浓度）中和50%HCMV。
在本发明的进一步方面，根据上文任何实施方案的抗复合物I抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗复合物I抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体种类或同种型。
在进一步方面，根据上文任何实施方案的抗复合物I抗体可以并入如下文1-7节中所述的任何单一特征或其任何组合。
B.示例性抗gH抗体
在一个方面，本发明提供了与gH结合的分离抗体。在特定实施方案中，抗gH抗体特异性结合gH的表位，并且以0.8μg/ml、0.7μg/ml、0.6μg/ml、0.5μg/ml、0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.015、0.010μg/ml或更少的EC90中和HCMV。在一些实施方案中，抗gH抗体以在0.01-0.17nM范围中的IC50与杆状病毒中产生的gH/gL二聚体的表位特异性结合。在各种实施方案中，该IC50可以是0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.11nM、0.12nM、0.13nM、0.14nM、0.15nM、0.16nM或0.17nM。
在其他实施方案中，抗体与HCMV表面上的gH结合，并且在0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.015μg/ml、0.014μg/ml、0.013μg/ml、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ml、0.003μg/ml、0.002μg/ml、0.001μg/ml或更少的抗体浓度（例如在10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更低的抗体浓度）中和50%HCMV。
在一个方面，本发明提供了包含选自下述的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVRs的抗gH抗体：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含选自SEQ ID NO:72、73或74的氨基酸序列的HVR-H2；（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3；（d）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1；（e）包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2；和（f）包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，本发明提供了包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列的抗体：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2；和（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供了包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列的抗体：（a）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-L3，以及包含选自SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2。
在另一个方面，本发明提供了包含（a）VH结构域和（b）VL结构域的抗体，所述VH结构域包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列：（i）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1，（ii）包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2，和（iii）包含选自SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3，所述VL结构域包含选自下述的至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列：（i）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1，（ii）包含SEQID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2，和（iii）包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供了包含下述的抗体：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的HVR-H2；（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3；（d）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1；（e）包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2；和（f）包含选自SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供了包含下述的抗体：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HVR-H2；（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3；（d）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1；（e）包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2；和（f）包含选自SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供了包含下述的抗体：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1；（b）包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2；（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3；（d）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1；（e）包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2；和（f）包含选自SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-L3。
在特定实施方案中，在下述HVR位置上，如上文提供的抗gH抗体中的任何一个或多个氨基酸发生置换：在HVR-H2（SEQ ID NO:91）中：位置6和8。在特定实施方案中，置换是保守置换，如本文提供的。在特定实施方案中，下述置换中的任何一个或多个可以以任何组合进行：HVR-H2（SEQ ID NO:91）中：D6S、D6T、D6N、D6Q、D6F、D6M、D6L和T8R。SEQ ID NO:93的共有序列涵盖了上述置换的所有可能组合。
在上述任何实施方案中，抗gH抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗gH抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包含接纳体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在另一个实施方案中，抗gH抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQID NO:79的FR1序列、SEQ ID NO:80的FR2序列、SEQ ID NO:81的FR3序列、和SEQ ID NO:82的FR4序列的VH。在其他实施方案中，抗gH抗体包含如上述任何实施方案中的HVRs，并且进一步包括包含SEQID NO:83的FR1序列、SEQ ID NO:84的FR2序列、SEQ ID NO:85的FR3序列、和SEQ ID NO:86的FR4序列的VL。
在另一个方面，本发明的抗gH抗体包含与如下氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域（VH）序列，其中所述氨基酸序列是SEQ IDNO:92但其中在位置54上的氨基酸是Asn（N）和/或其中在位置56上的氨基酸是Asn（R）。在特定实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有相对于参考序列的置换（例如保守置换）、插入或缺失，但包含该序列的抗gH抗体保留与gH结合的能力。在特定实施方案中，已在SEQ ID NO:92但其中在位置54上的氨基酸是Asn（N）和/或其中在位置56上的氨基酸是Asn（R）的序列中发生共1–10个氨基酸的置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失在HVRs外的区域中（即在FRs中）发生。任选地，抗gH抗体可以包含SEQ ID NO：87、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自下述的一个、两个或三个HVRs：（a）包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-H1，（b）包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2，和（c）包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明的抗gH抗体包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域（VL）。在特定实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有相对于参考序列的置换（例如保守置换）、插入或缺失，但包含该序列的抗gH抗体保留与gH结合的能力。在特定实施方案中，已在SEQ ID NO:90中发生共1–10个氨基酸的置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失在HVRs外的区域中（即在FRs中）发生。任选地，抗gH抗体包含SEQ ID NO:90中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自下述的一个、两个或三个HVRs：（a）包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L1；（b）包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L2；和（c）包含选自SEQ IDNO:78的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的gH抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH、和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:87中的VH和SEQ ID NO:90中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:88中的VH和SEQ IDNO:90中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在另一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:89中的VH和SEQ IDNO:90中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在进一步方面，本发明提供了与本文提供的抗gH抗体竞争和/或结合相同的表位的抗体。例如，在特定实施方案中，提供了与抗gH抗体竞争和/或结合相同的表位的抗体，所述抗gH抗体包括包含SEQ ID NOs:87、88或89的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL。
在进一步方面，本发明提供了与包含如下氨基酸的抗gH抗体结合相同的表位的抗体，所述氨基酸对应于选自下述的氨基酸：在SEQ ID NO:1的位置168上的色氨酸，在SEQ ID NO:1的位置446上的天冬氨酸；在SEQ ID NO:1的位置171上的脯氨酸、及其组合。在gH氨基酸序列中包含表位的相应氨基酸可以位于大约相同的位置上，但可以由于在各个HCMV株之间在gH上的氨基酸序列差异而不同。
在另外方面，本发明提供了以在0.01-0.17nM范围中的IC50与本文提供的抗gH抗体结合相同的表位的抗体。在各种实施方案中，IC50可以是0.17nM或更少（例如0.16nM、0.15nM、0.14nM、0.13nM、0.12nM、0.11nM、0.10nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM或更少。例如，在特定实施方案中，提供了这样的抗体，其与HB1（包含SEQ ID NO:89的VH序列和SEQ IDNO:90的VL序列的抗gH抗体）结合相同的表位，并且具有0.17nM或更少（例如0.16nM、0.15nM、0.14nM、0.13nM、0.12nM、0.11nM、0.10nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM或更少）的IC50，或以0.8μg/ml、0.7μg/ml、0.6μg/ml、0.5μg/ml、0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.015、0.010μg/ml或更少的EC90中和HCMV感染。
在其他方面，本发明提供了这样的抗体，其与本文提供的抗gH抗体结合相同的表位，并且在0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ml、0.015μg/ml、0.014μg/ml、0.013μg/ml、0.012μg/ml、0.011μg/ml、0.010μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ml、0.003μg/ml、0.002μg/ml、0.001μg/ml或更少的抗体浓度（例如在10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更低的抗体浓度）中和50%HCMV。
在本发明的进一步方面，根据上文任何实施方案的抗gH抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗gH抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体种类或同种型。
在进一步方面，根据上文实施方案的抗gH抗体可以并入如下文1-7节中所述的任何单一特征或其任何组合。
1.抗体亲和力
在特定实施方案中，如本文提供的本发明抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M）的解离常数（Kd）。
在一个实施方案中，如通过下述测定试验描述的，通过用目的抗体的Fab形式及其抗原执行放射性标记的抗原结合测定（RIA），以测量Kd。通过在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的（125I）标记的抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，测量Fab对于抗原的溶液结合亲和力（参见例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881（1999））。为了建立测定试验的条件，
Figure BDA00003258722200381
多孔板（ThermoScientific）用在50mM碳酸钠（pH9.6）中的5μg/ml捕获性抗Fab抗体（Cappel Labs）包被过夜，并且随后用在PBS中的2%（w/v）牛血清白蛋白在室温（约23℃）封闭二至五小时。在非吸附板（Nunc#269620）中，将100pM或26pM[125I]抗原与系列稀释的目的Fab混合（例如与在Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599（1997）中的抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）。目的Fab随后温育过夜；然而，温育可以继续更长时间（例如约65小时），以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获板用于在室温温育（例如一小时）。随后取出溶液，并且将板用在PBS中的0.1%聚山梨醇酯20
Figure BDA00003258722200382
洗涤八次。当板已干燥时，加入150μl/孔的闪烁体（MICROSCINT-20TM；Packard），并且在TOPCOUNT TMγ计数器（Packard）上计数板十分钟。选择给出小于或等于20%最大结合的每种Fab的浓度用于在竞争结合测定试验中使用。
根据另一个实施方案，在25℃，使用
Figure BDA00003258722200383
-2000或
Figure BDA00003258722200384
Figure BDA00003258722200385
（BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ），使用固定化抗原CM5芯片，以～10应答单位（RU），使用表面等离振子共振测定使用，测量Kd。简言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片（CM5，BIACORE，Inc.）。在以5μl/分钟的流速注射抗原前，用10mM乙酸钠，pH4.8将抗原稀释至5μg/ml（～0.2μM），以达到约10应答单位（RU）的偶联蛋白质。在抗原注射后，注射1M乙醇胺，以封闭未反应的基团。对于动力学测量，以约25μl/分钟的流速，在25℃，在具有0.05%聚山梨醇酯20（TWEEN-20TM）表面活性剂的PBS中（PBST）注射Fab的两倍系列稀释物（0.78nM-500nM）。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型（
Figure BDA00003258722200391
Evaluation Software版本3.2），计算结合速率（kon）和解离速率（koff）。平衡解离常数（Kd）计算为koff/kon比值。参见例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881（1999）。如果结合速率通过上文的表面等离振子共振测定超过106M-1s-1，那么结合速率可以通过使用荧光猝灭技术进行测定，所述荧光猝灭技术测量在递增浓度的抗原的存在下20nM抗抗原抗体（Fab形式）在PBS，pH7.2中在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的增加或减少，如在分光光度计例如配备停流装置的分光光度计（Aviv Instruments）或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计（ThermoSpectronic）中测量。
2.抗体片段
在特定实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于一些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134（2003）。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün，The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编辑（Springer-Verlag，New York），第269-315页（1994）；还参见WO93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,可以是二价或双特异性的。参见例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134（2003）；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448（1993）。三抗体（Triabody）和四抗体(Tetrabody)也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134（2003）中描述。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在特定实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体（Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如，美国专利号6,248,516B1）。
抗体片段可以通过多种技术进行制备，所述多种技术包括但不限于完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞（例如大肠杆菌或噬菌体）生产，如本文描述的。
3.嵌合和人源化抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。一些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855（1984））中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区（例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类,例如猴的可变区）和人恒定区。在再一例子中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中该抗体的种类或亚类已不同于亲本抗体的。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在特定实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化，以减少对于人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs例如CDRs（或其部分）衍生自非人抗体，并且FRs（或其部分）衍生自人抗体序列。人源化抗体任选还可以包含人恒定区的至少部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基由来自非人抗体（例如HVR残基所衍生自的抗体）的相应残基置换，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备其的方法在例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633（2008）中综述，并且在例如下述文献中进一步描述：Riechmann等人，Nature332:323-329（1988）；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033（1989）；美国专利号5、821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods36:25-34（2005）（描述SDR（a-CDR）嫁接）；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498（1991）（描述“表面再建”(resurfacing)）；Dall’Acqua等人，Methods36:43-60（2005）（描述“FR改组”）；和Osbourn等人，Methods36:61-68（2005）和Klimka等人，Br.J.Cancer，83:252-260（2000）（描述FR改组的“引导选择”方法）。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”(best-fit)方法选择的构架区（参见例如，Sims等人J.Immunol.151:2296（1993））；衍生自特定亚组的轻或重链可变区的人抗体共有序列的构架区（参见例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285（1992）；和Presta等人J.Immunol.，151:2623（1993））；人成熟（体细胞突变的）构架区或人种系构架区（参见例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633（2008））；和衍生自筛选FR文库的构架区（参见例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684（1997）和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618（1996））。
4.人抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体在van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74（2001）和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459（2008）中一般地描述。
人抗体可以通过给转基因动物施用免疫原进行制备，其中所述转基因动物已经被修饰成可以响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物一般含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替换内源免疫球蛋白基因座、或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因组一般已被灭活。关于用于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125（2005）。还参见，例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M 
Figure BDA00003258722200422
技术的美国专利号7,041,870，和描述
Figure BDA00003258722200423
技术的美国专利申请公开号US2007/0061900）。来自此类动物产生的完整抗体的人可变区可以例如通过与不同人恒定区组合，进一步修饰。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法进行制备。用于人单克隆抗体生产的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已有描述。（参见例如，KozborJ.Immunol.，133：3001（1984）；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，第51-63页（Marcel Dekker，Inc.，New York，1987）；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86（1991）.）经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562（2006）中描述。另外方法包括例如在美国专利号7,189,826（描述自杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体）和Ni，XiandaiMianyixue，26（4）:265-268（2006）（描述人-人杂交瘤）中描述的那些。人杂交瘤技术（Trioma技术）也在Vollmers和Brandlein，Histology andHistopathology，20（3）:927-937（2005）以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27（3）:185-91（2005）中描述。
人抗体还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列而生成。此类可变结构域序列随后可以与期望的人恒定结构域组合。用于从抗体文库中选择人抗体的技术在下文描述。
5.文库衍生的抗体
在本发明的组合物中的抗体可以通过在组合文库中筛选具有一种或多种期望活性的抗体而分离。例如，本领域已知多种方法可以用于生成噬菌体展示文库以及在此文库中筛选具有所需结合特征的抗体。此类方法在例如Hoogenboom等人in Methods in Molecular Biology178:1-37（O’Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001）中综述，并且在例如下述文献中进一步描述：McCafferty等人，Nature348:552-554；Clackson等人，Nature352：624-628（1991）；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597（1992）；Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology248:161-175（Lo，编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003）；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338（2）：299-310（2004）；Lee等人，J.Mol.Biol.340（5）：1073-1093（2004）；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101（34）：12467-12472（2004）；和Lee等人，J.Immunol.Methods284（1-2）：119-132（2004）。
在一些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的库(repertoires)通过聚合酶链反应（PCR）分开地被克隆，并在噬菌体文库中随机重组，之后可以在该噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455（1994）中描述的。噬菌体一般展示抗体片段，以单链Fv（scFv）片段或Fab片段的形式。来自经免疫的来源的文库可以提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆幼稚库(
Figure BDA00003258722200431
)（例如从人中），以提供针对广泛范围的非自身以及自身抗原的单一抗体源，无需任何免疫接种，如通过Griffiths等人，EMBOJ，12：725-734（1993）描述的。最后，幼稚文库还可以通过下述合成制备：自干细胞克隆未重排的V基因区段，使用含有随机序列的PCR引物以编码高可变CDR3区和在体外完成重排，如通过Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388（1992）描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库中分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是具有针对至少两个不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在特定实施方案中，结合特异性之一针对复合物I或gH，并且另一个针对任何其他抗原。在特定实施方案中，结合特异性之一针对复合物I，并且另一个针对gH。在特定实施方案中，双特异性抗体可以与复合物I或gH的两个不同表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒素剂定位至在细胞表面上具有复合物I或gH的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达（参见Milstein和Cuello，Nature305：537（1983）），WO93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10：3655（1991）），和“钮进洞（knob-in-hole）”工程化（参见例如，美国专利号5,731,168）。多特异性抗体还可以通过下述进行制备：工程化设计静电引导效应(electrostatic steering effect)以制备抗体Fc-异源二聚体分子（WO2009/089004A1）；交联两种或更多种抗体或片段（参见例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science，229：81（1985））；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体（参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148（5）:1547-1553（1992））；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段（参见例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448（1993））；和使用单链Fv（sFv）二聚体（参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152:5368（1994））；和例如Tutt等人J.Immunol.147：60（1991）中所述的制备三特异性抗体。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中（参见例如US2006/0025576A1）。
在本文中抗体或片段还包括包含抗原结合位点的“双重作用FAb”(Dual Acting FAb)或“DAF”，所述抗原结合位点与复合物I或gH以及另一种不同抗原结合（参见例如，US2008/0069820）。
7.抗体变体
在特定实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成而制备。此类修饰包括，例如，在抗体的氨基酸序列内进行残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合，以达到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a）置换、插入和缺失变体
在特定实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVRs和FRs。保守置换显示于表1的“保守置换”标题下。更实质性的改变在表1的“示例性置换”标题下提供，并且在下文中参考氨基酸侧链种类进一步描述。氨基酸置换可以引入目的抗体内，并且就所需活性例如保留/改善的抗原结合、减少的免疫原性或改善的ADCC或CDC，筛选产物。
表1
Figure BDA00003258722200461
氨基酸可以根据共同侧链性质进行分组：
（1）疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
（2）中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
（3）酸性的：Asp，Glu；
（4）碱性的：His，Lys，Arg；
（5）影响链取向的残基：Gly，Pro；
（6）芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换需要将这些类型之一的成员交换成另一类型。
一类置换变体涉及置换亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步研究的所得变体将具有相对于亲本抗体在一些生物性质上的改变（例如改善）（例如增加的亲和力、减少的免疫原性），和/或将基本上保留亲本抗体的一些生物性质。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文描述的技术，方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上且筛选特定生物活性（例如结合亲和力）。
改变（例如置换）可以在HVRs中作出，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”（即，由在体细胞成熟过程中高频率发生突变的密码子编码的残基（参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196（2008）））、和/或SDRs（a-CDRs）中进行，测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库和从中再选择的亲和力成熟已在例如Hoogenboom等人in Methods in Molecular Biology178:1-37（O’Brien等人，编辑，Human Press，Totowa，NJ,（2001））中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种（例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变），将多样性引入到选择用于成熟的可变基因内。随后构建二级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中几个HVR残基（例如一次4-6个残基）被随机化。涉及抗原结合的HVR残基可以，例如使用丙氨酸筛选诱变或建模，而被特异地鉴定。CDR-H3和CDR-L3尤其常被作为靶标。
在特定实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVRs内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，基本上不减少结合亲和力的保守改变（例如如本文提供的保守置换）可以在HVRs中作出。此类改变可以在HVR“热点”或SDRs外。在上文提供的变体VH和VL序列的特定实施方案中，每个HVR或者是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以作为诱变靶标的抗体残基或区域的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham和Wells（1989）Science，244:1081-1085描述的。在这种方法中，鉴定残基或靶残基组（例如荷电残基，例如arg、asp、his、lys和glu），且替换为中性或带负电荷的氨基酸（例如丙氨酸或聚丙氨酸），以测定抗体与抗原的相互作用是否受影响。进一步置换可以在证实对最初置换具有功能敏感性的氨基酸位置引入。可替代地或另外地，通过抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以被作为用于置换的候选物而被靶向或消除。可以筛选变体以测定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括酶（例如用于ADEPT）或增加抗体的血清半衰期的多肽与抗体的N或C末端的融合。
b）糖基化变体
在特定实施方案中，改变本文提供的抗体，以增加或减少抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点，而方便地完成。
当抗体包含Fc区时，可以改变与之附着的碳水化合物。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分支的、二天线型的寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如，Wright等人TIBTECH15:26-32（1997）。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、半乳糖和唾液酸，以及附着在二天线型寡糖结构的“茎”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本发明的抗体中进行寡糖的修饰，以便产生具有特定改善性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有缺乏（直接或间接）附着在Fc区上的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1%-80%、1%-65%、5%-65%或20%-40%。如例如WO2008/077546中所述的，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，相对于与Asn297附着的所有糖结构（例如复杂的、杂合的和高甘露糖的结构）的总和，通过计算在Asn297的糖链内岩藻糖的平均量，确定岩藻糖的量。Asn297指位于Fc区的大约位置297上的天冬酰胺残基（Fc区残基的Eu编号）；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游的约±3个氨基酸处，即位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US2003/0157108（Presta，L.）；US2004/0093621（Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd）。与“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体有关的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249（2004）；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614（2004）。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括具有蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞（Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545（1986）；美国专利申请号US2003/0157108A1，Presta，L；和WO2004/056312A1，Adams等人，特别在实施例11上），和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞（参见例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614（2004）；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94（4）:680-688（2006）；和WO2003/085107）。
进一步提供了具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区附着的二天线寡糖通过GlcNAc平分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子例如在WO2003/011878（Jean-Mairet等人）；美国专利号6,602,684（Umana等人）；和US2005/0123546（Umana等人）中描述。还提供了在与Fc区附着的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体例如在WO1997/30087（Patel等人）；WO1998/58964（Raju，S.）；和WO1999/22764（Raju，S.）中描述。
c）Fc区变体
在特定实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区内，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包括包含在一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰（例如置换）的人Fc区序列（例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。
在特定实施方案中，本发明考虑具有一些但并非所有效应子功能的抗体变体，这使得其成为用于如下应用的期望候选物，在所述应用中抗体在体内的半衰期是重要的，而一些效应子功能（例如补体和ADCC）是不需要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可以进行Fc受体（FcR）结合测定试验，以确保抗体缺乏FcγR结合（从而可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达
Figure BDA00003258722200502
而单核细胞表达
Figure BDA00003258722200503
Figure BDA00003258722200504
和
Figure BDA00003258722200505
在造血细胞上的FcR表达概括在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492（1991）的第464页表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性例子在美国专利号5,500,362（参见例如，Hellstrom，I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063（1986））和Hellstrom，I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502（1985）；5,821,337（参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361（1987））中描述。可替代地，可以采用非放射性测定试验方法（参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定试验（CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和
Figure BDA00003258722200501
非放射性细胞毒性测定试验（Promega，Madison，WI）。可以用于此类测定试验的效应细胞包括外周血单核细胞（PBMC）和自然杀伤（NK）细胞。可替代地或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，例如公开于Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656（1998）中的。还可以执行C1q结合测定试验，以证实抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以执行CDC测定试验（参见例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202:163（1996）；Cragg，M.S.等人，Blood101:1045-1052（2003）；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103:2738-2743（2004））。FcRn结合和体内清除率/半衰期确定还可以使用本领域已知的方法进行（参见例如，Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.18（12）:1759-1769（2006））。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些（美国专利号6,737,056）。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个上具有置换的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的置换的所谓“DANA”Fc突变体（美国专利号7,332,581）。
描述了具有改善或减少的FcRs结合的特定抗体变体。（参见例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9（2）：6591-6604（2001）.）
在特定实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334上的置换（残基的EU编号）。
在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，以导致改变的（例如改善或减少的）C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性（CDC），例如如美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184（2000）中所述的。
在US2005/0014934A1（Hinton等人）中描述了具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体（FcRn）结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责母源IgGs至胎儿的转移（Guyer等人，J.Immunol.117:587（1976）和Kim等人，J.Immunol.24:249（1994））。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述一个或多个置换改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在如下Fc区残基的一个或多个上具有置换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的置换（美国专利号7,371,826）。
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan & Winter，Nature322:738-40（1988）；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d）半胱氨酸工程化抗体变体
在特定实施方案中，可能期望制备半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基由半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，被置换的残基位于抗体的可接近位点上。通过用半胱氨酸置换这些残基，从而将反应性巯基基团置于抗体的可接近位点上，这些巯基基团可以用于使抗体缀合至其他部分例如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在特定实施方案中，下述残基中的任何一个或多个可以由半胱氨酸残基置换：轻链的V205（Kabat编号）；重链的A118（EU编号）；和重链Fc区的S400（EU编号）。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述生成。
e）抗体衍生物
在特定实施方案中，本文提供的抗体可以进一步被修饰，以含有本领域已知的且可容易获得的另外非蛋白质性部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇（PEG）、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三
Figure BDA00003258722200521
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（同聚物或随机共聚物）、和葡聚糖或聚（n-乙烯吡咯烷酮）聚乙二醇、propropylene glycol同聚物、聚氧丙烷/聚氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛，由于其在水中的稳定性，可以在制造中具有优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或未分支的。附着至抗体的聚合物数目可以改变，并且如果附着超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于如下考虑进行确定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否用于在限定条件下的治疗中，等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射线而被选择性加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管（Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：11600-11605（2005））。辐射线可以具有任何波长，并且包括但不限于，这样的波长，所述波长不伤害普通细胞、但使非蛋白质性部分加热至可杀死抗体-非蛋白质性部分附近的细胞的温度。
C.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物进行生产，例如如美国专利号4,816,567中所述的。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗复合物I抗体或抗gH抗体的分离核酸。此核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列（例如抗体的轻和/或重链）。在进一步实施方案中，提供了包含此核酸的一个或多个载体（例如表达载体）。在进一步实施方案中，提供了包含此核酸的宿主细胞。在一个此实施方案中，宿主细胞包含（例如已转化了）：（1）包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或（2）包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体、和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或淋巴样细胞（例如Y0、NS0、Sp20细胞）。在一个实施方案中，提供了制备抗复合物I抗体或抗gH抗体的方法，其中所述方法包括在适合于抗体表达的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选从宿主细胞（或宿主细胞培养基）中回收抗体。
对于抗复合物I抗体或抗gH抗体的重组生产，分离例如如上所述的编码抗体的核酸，并且插入一个或多个载体内用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此核酸可以使用常规程序（例如通过使用能够与编码抗体重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）容易地分离且测序。
用于抗体编码载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，抗体可以在细菌中生产。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。（还参见Charlton，Methods inMolecular Biology，第248卷（B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003），第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达）。在表达后，抗体可以在可溶级分中从细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。
除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，这导致具有部分或全人糖基化模式的抗体生产。参见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414（2004）和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215（2006）。
用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物（无脊椎动物和脊椎动物）。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定了众多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别用于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429（描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术）。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，悬浮生长适应化的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是SV40转化的猴肾CV1系（COS-7）；人胚肾系（如例如Graham等人，J.Gen Virol.36:59（1977）中所述的293或293细胞）；幼仓鼠肾细胞（BHK）；小鼠塞尔托利细胞（如例如Mather，Biol.Reprod.23:243-251（1980）中所述的TM4细胞）；猴肾细胞（CV1）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76）；人宫颈癌细胞（HELA）；犬肾细胞（MDCK；Buffalo大鼠肝细胞（BRL3A）；人肺细胞（W138）；人肝细胞（Hep G2）；小鼠乳房肿瘤（MMT060562）；如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68（1982）中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，包括DHFR-CHO细胞（Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216（1980））；和骨髓瘤细胞系例如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的一些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷（B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ），第255-268页（2003）。
D.测定试验
通过本领域已知的多种测定试验，可以就其物理/化学性质和/或生物活性，鉴定、筛选、或表征本文提供的抗复合物I抗体或抗gH抗体。
1.结合测定试验及其他测定试验
在一个方面，通过已知方法例如ELISA、蛋白质印迹等，就其抗原结合活性，测试本发明的抗体。
在另一个方面，竞争测定试验可以用于鉴定与本文描述的抗复合物I抗体竞争结合复合物I的抗体。
在另一个方面，竞争测定试验可以用于鉴定与本文描述的抗gH抗体竞争结合gH的抗体。
在特定实施方案中，此类竞争抗体与gH或复合物I结合相同的表位（例如线性或构象表位）。
用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法在Morris（1996）“Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular Biology第66卷（Humana Press，Totowa，NJ）中提供。
在示例性竞争测定试验中，在溶液中温育固定化的复合物I或gH，所述溶液包含与复合物I或gH结合的第一标记的抗体、和待测试其与第一抗体竞争结合复合物I或gH的能力的第二未标记的抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在溶液中温育固定化的复合物I或gH，所述溶液包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体。在允许第一抗体与复合物I或gH结合的条件下温育后，去除过量的未结合的抗体，测量与固定化的复合物I或gH结合的标记量。如果与固定的复合物I或gH结合的标记量在测试样品中相对于在对照样品中有实质性的减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争结合复合物I或gH。参见Harlow和Lane（1988）Antibodies：A Laboratory Manual第14章（Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY）。
竞争测定试验还可以以如上所述的方式用FACS执行，其中使用gH和/或复合物I或复合物II的其他成员转染并且在细胞表面上表达的细胞。另外，用gH和/或重构的复合物I或复合物II的ELISA也可以用于竞争测定试验中。FACS和ELISA用于测量抗gH和抗复合物I抗体的用途在实施例中进一步描述。
2.活性测定试验
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的抗复合物I抗体的测定试验。生物活性可以包括例如，与由UL128、UL130、UL131和gH/gL的结合而形成的构象表位特异性结合，或与复合物I的单一蛋白质内的表位特异性结合，以0.7μg/ml或更少的EC90中和HCMV。在一些实施方案中，EC90是0.5μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.3μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.1μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.08μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.06μg/ml或更少。在另外其他实施方案中，EC90是0.04μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.02μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.015μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.012μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.011μg/ml或更少。在其他实施方案中，EC90是0.010μg/ml或更少。还提供了包含具有此类生物活性的抗体的组合物。
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的抗gH抗体的测定试验。生物活性可以包括例如以1μg/ml、0.9μg/ml、0.8μg/ml、0.7μg/ml、0.6μg/ml、0.5μg/ml、0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.09μg/ml、0.08μg/ml、0.07μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml或更少的EC90中和HCMV。
在本发明的组合物中抗gH抗体，以0.17nM或更少（例如，0.16nM、0.15nM、0.14nM、0.13nM、0.12nM、0.11nM、0.10nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM或更少）的IC50，与杆状病毒中表达的gH/gL二聚体结合。还提供了包含在体内和/或体外具有此生物活性的抗体的组合物。
在特定实施方案中，就此生物活性，测试本发明的抗体。关于此类测定试验的示例性描述，参见实施例3。
E.免疫缀合物
本发明还提供了包含免疫缀合物的组合物，所述免疫缀合物包含缀合至一种或多种细胞毒素剂的本文的抗复合物I抗体或抗gH抗体，所述细胞毒素剂例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素（例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段）、或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物（ADC），其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于类美登素(maytansinoid)（参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1）；澳瑞他汀（auristatin）例如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF（MMAE和MMAF）（参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298）；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物（参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342（1993）；和Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928（1998））；蒽环类例如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星（参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523（2006）；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362（2006）；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721（2005）；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834（2000）；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532（2002）；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343（2002）；和美国专利号6,630,579）；氨甲蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷（taxane）例如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇（paclitaxel）、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合至酶促活性毒素或其片段的如本文描述的抗体，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa））、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐（Aleurites fordii）蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆（Phytolaca americana）蛋白质（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜（momordica charantia）抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草（sapaonaria officinalis）抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素类。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子的如本文描述的抗体，以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于放射性缀合物的产生。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，mri）的自旋标记，例如再次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒素剂的缀合物可以使用多种双官能蛋白质偶联剂进行制备，例如3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-琥珀酰亚胺酯（SPDP）、4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）、亚氨基硫烷（IT）、亚氨酸酯的双官能衍生物（例如二甲基己二酸酯HCl）、活性酯（例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯）、醛（例如戊二醛）、双-叠氮基化合物（例如双（对叠氮基苯甲酰基）己二胺）、双-重氮
Figure BDA00003258722200591
衍生物（例如双（对重氮
Figure BDA00003258722200592
苯甲酰基）-乙二胺）、二异氰酸酯（例如2,6-二异氰酸甲苯酯）、和双-活性氟化合物（例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人Science 238：1098（1987）中所述进行制备。碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸（MX-DTPA）是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒药物在细胞中释放的“可断裂接头”。例如，可以使用对酸敏感的接头、对肽酶敏感的接头、光敏接头、二甲基接头或含二硫键的接头（Chari等人Cancer Research 52：127-131（1992））。
免疫缀合物或ADCs在本文中明确考虑，但不限于，用交联接头试剂制备的此类缀合物，包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB（琥珀酰亚胺基-（4-乙烯基砜）苯甲酸酯），其是商购可得的（例如来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A）。
F. 用于诊断和检测的方法和组合物
在特定实施方案中，如本文提供的任何抗复合物I抗体和/或抗gH抗体、或包含此抗体的组合物，可以用于检测生物样品中复合物I和/或gH的存在。如本文使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在特定实施方案中，生物样品包含细胞或组织，例如胎盘、肾、心、肺、肝、胰腺、肠、胸腺、骨、腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜和静脉。此外，包含抗体的组合物可以用于检测内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞中的HCMV。
在一个实施方案中，提供了用于在诊断或检测的方法中使用的抗复合物I抗体和/或抗gH抗体。在进一步方面，提供了检测生物样品中复合物I和/或gH的存在的方法。在特定实施方案中，该方法包括在允许抗复合物I抗体与复合物I结合和/或抗gH抗体与gH结合的条件下，使生物样品与如本文描述的抗复合物I抗体和/或抗gH抗体接触，并且检测是否形成抗复合物I抗体和复合物I和/或抗gH抗体和gH之间的复合物。此方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗复合物I抗体或抗gH抗体、或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合用于选择如下疗法的合格受试者，所述疗法使用抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合来进行，例如，当复合物I和gH是用于患者选择的生物标记时。
可以使用本发明的组合物诊断的示例性病症包括HCMV感染，例如来自移植的器官或组织的HCMV感染，先天性HCMV感染，在妊娠过程中的HCMV感染，和儿童、婴儿和成人中的HCMV感染。
在特定实施方案中，提供了包含标记的抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物。标记包括但不限于，直接检测的标记或部分（例如荧光、生色、电子致密、化学发光和放射性标记），以及间接（例如通过酶促反应或分子相互作用）检测的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团例如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶（美国专利号4,737,456），萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，杂环氧化酶例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶例如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
G.药物制剂
可以通过使具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学可接受的载体（Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition，Osol，A.标记（1980））混合，以冻干制剂或水溶液形式，制备如本文描述的抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合的药物制剂。如本文描述的，抗复合物I抗体和抗gH抗体可以配制在单一的组合药物制剂或分开的药物制剂中。药学可接受的载体在采用的剂量和浓度下对接受者一般是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（例如十八基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物（例如Zn-蛋白质络合物）；和/或非离子型表面活性剂例如聚乙二醇（PEG）。示例性药学可接受的载体在本文中进一步包括间质（insterstitial）药物分散剂例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白（sHASEGP），例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20（Baxter International，Inc.）。一些示例性sHASEGPs和使用方法，包括rHuPH20，在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后面的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
除了抗复合物I抗体和/或抗gH抗体外，在本文中制剂还可以含有对于待治疗的特定适应症需要的活性成分，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。例如，可能期望进一步提供更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦。此类活性成分适于以对于预期目的有效的量存在于组合中。
活性成分可以截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中（例如分别地羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-（甲基丙烯酸甲酯）微囊）、在胶体药物递送系统（例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米囊）中、或在粗乳液中。此类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Oslo，A.，Ed.,（1980）中。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质可以为成形物品例如薄膜或微胶囊的形式。
待用于体内施用的制剂一般是无菌的。无菌性可以通过例如经由无菌过滤膜过滤而容易地达到。
H.治疗方法和组合物
包含本文提供的抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的任何组合物均可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物用作药物。在进一步方面，提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物用于在治疗HCMV感染中使用。在特定实施方案中，提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物用于在治疗方法中使用。在特定实施方案中，本发明提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物用于在治疗具有HCMV感染的个体的方法中使用，所述方法包括给个体施用有效量的包含抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物。在其他实施方案中，本发明提供了组合物用于预防、抑制或治疗先天性HCMV感染或组织或器官移植受体中的HCMV感染的方法中，对于所述移植受体，所移植的组织、器官或供体被HCMV感染或已被HCMV感染。在一个此类实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。在另外的实施方案中，移植受体或个体先前已被HCMV感染，并且有HCMV再活化和感染的危险。在特定实施方案中，如下文描述的，该方法进一步包括给个体或移植受体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在其他实施方案中，本发明还提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物用于HCMV感染的婴儿或在妊娠过程中暴露于HCMV的婴儿的治疗方法中，所述治疗方法包括给婴儿施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物。在进一步实施方案中，本发明提供了包含抗复合物I抗体或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物用于在有感染危险的个体中治疗、抑制或预防HCMV感染。根据上述任何实施方案的“个体”优选是人。
在进一步方面，本发明提供了包含抗复合物I抗体和/或抗gH抗体或抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物在药物制造或制备中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗、预防或抑制HCMV感染。在进一步实施方案中，药物用于在治疗、预防或抑制HCMV感染，其包括给具有HCMV感染的个体施用有效量的药物。在其他实施方案中，药物用于在预防、抑制或治疗先天性HCMV感染或组织或器官移植受体中的HCMV感染的方法中，对于所述移植受体，所移植的组织、器官或供体被HCMV感染或已被HCMV感染。在一个此类实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。在另外的实施方案中，移植受体或个体先前已被HCMV感染，并且有HCMV再活化和感染的危险。在特定实施方案中，药物进一步包含有效量的例如如下文描述的至少一种另外的治疗剂。在进一步实施方案中，药物用于在有感染危险的个体中治疗、抑制或预防HCMV感染，其包括给个体施用可以有效抑制或预防HCMV感染的量的药物。在其他实施方案中，药物用于治疗HCMV感染的婴儿或在妊娠过程中暴露于HCMV的婴儿，其包括给婴儿施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物。根据上述任何实施方案的“个体”可以是人。在特定实施方案中，药物用于在个体中减少HCMV病毒滴度或防止HCMV病毒滴度的增加。在一个实施方案中，该方法包括给个体施用有效量的包含抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物，以减少HCMV病毒滴度或防止HCMV病毒滴度的增加。在一个实施方案中，“个体”是处于HCMV感染危险中的人和/或孕妇和/或器官移植受体。
在进一步方面，本发明提供了用于治疗、预防或抑制HCMV感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括给个体施用有效量的包含抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物。在其他实施方案中，本发明提供了预防、抑制或治疗先天性HCMV感染或组织或器官移植受体中的HCMV感染的方法，其中对于所述移植受体，所移植的组织、器官或供体被HCMV感染或已被HCMV感染，所述方法包括给个体或移植受体施用有效量的包含抗复合物I抗体和抗gH抗体的组合物。在一个此类实施方案中，组织或器官移植受体对于HCMV感染是血清阴性的。在另外的实施方案中，移植受体或个体先前已被HCMV感染，并且有HCMV再活化和感染的危险。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括给个体施用有效量的如下文描述的至少一种另外的治疗剂。在其他实施方案中，本发明提供了用于治疗、抑制或预防HCMV感染的婴儿或在妊娠过程中暴露于HCMV的婴儿的方法，其包括给婴儿施用有效量的包含本发明的抗体或其组合的组合物。根据上述任何实施方案的“个体”可以是人。
在进一步方面，本发明提供了用于在有感染危险的个体中抑制或预防HCMV感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括给个体施用有效量的包含抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物，以抑制或预防HCMV感染。在一个实施方案中，“个体”是人。
在特定实施方案中，本发明提供了用于个体中减少HCMV病毒滴度或防止HCMV病毒滴度的增加的方法。在一个实施方案中，该方法包括给个体施用有效量的包含抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物，以减少HCMV病毒滴度或防止HCMV病毒滴度的增加。在一个实施方案中，“个体”是处于HCMV感染危险中的人和/或孕妇和/或器官移植受体。
HCMV病毒滴度可以通过本领域已知的任何方法进行测量，例如通过ELISA以测量病毒抗体，基于血清学或组织的测定试验通过在样品中定量病毒DNA的量（特定病毒基因和/或病毒基因组以确定病毒负荷）和/或从样品培养病毒以测量HCMV的存在。此类诊断检查是商业销售的，例如
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Figure BDA00003258722200652
Figure BDA00003258722200653
CMV Test和
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AMPLICOR CMV MONITOR Test（Roche），其可以用于诊断HCMV感染且通过定量HCMV DNA以监控抗病毒疗法。在特定实施方案中，相个体中的HCMV病毒滴度，相对于未治疗的个体或相对于相同个体在治疗前的病毒滴度，减少如下数值之任一：约100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或更少。
在另外的实施方案中，移植的器官或组织可以是能够从一个个体移植到第二个个体的任何器官或组织。例如，移植的器官可以是但不限于，心、肾、肝、肺、胰腺、肠或胸腺。另外地，例如，移植的组织可以是，但不限于，手、角膜、皮肤、面部、胰岛、骨髓、干细胞、全血、血小板、血清、血细胞、血管、心脏瓣膜、骨、骨祖先细胞、软骨、韧带、腱、肌衬里。
在进一步方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗复合物I抗体和/或抗gH抗体的组合物和药物制剂，例如用于在上述任何治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗复合物I抗体和/或抗gH抗体和药学可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗复合物I抗体和/或抗gH抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。
在本发明的组合物中的抗体可以在治疗中单独或与其他活性剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共施用。在特定实施方案中，另外的治疗剂是更昔洛韦、缬更昔洛韦、磷卡萘替和/或昔多呋韦。在其他实施方案中，另外的治疗剂是另外的治疗分离的抗体。
上文提到的组合疗法涵盖组合的施用（其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中）和分开施用，在分开施用的情况下，本发明的抗体组合物的施用可以在另外的治疗剂和/或助剂施用之前、同时和/或之后进行。
本发明的组合物（和任何另外的治疗剂）可以通过任何合适的方法施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，和如果期望局部治疗，损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑各种给药方案，包括但不限于，经过多个时间点的单次或多次施用、浓注施用、和脉冲输注。
本发明的组合物将以符合良好医疗实践的方式配制，给药和施用。在此考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、活性剂递送部位、施用方法、施用时间安排和医学从业者已知的其他因素。组合物无需但可以任选地与目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种活性剂配制在一起。此类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其他因素。这些一般以与本文描述的相同剂量和施用途径使用，或以本文描述的剂量的约1-99%，或以通过由经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
对于疾病预防或治疗，在本发明的组合物中含有的抗体的合适剂量（当单独或与一种或多种其他的另外治疗剂组合使用时）将取决于待治疗的疾病类型、抗体类型、疾病严重性和过程、抗体是施用用于预防还是治疗、先前疗法、患者的临床史和对抗体的应答、和主治医师的判断。本文描述的组合物中包括的每种抗体都适宜一次或经过一系列治疗而施用于患者。取决于疾病类型和严重性，对于每种抗体，约1μg/kg-15mg/kg（例如0.1mg/kg-10mg/kg）可以是用于施用于患者的起始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上文提及的因素，一个典型的日剂量可以为1μg/kg-100mg/kg或更多。对于历经几天或更久时间的反复施用，取决于状况，治疗一般持续直至出现期望的疾病症状抑制。对于每种抗体，一个示例性剂量将为约0.05mg/kg-约10mg/kg。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg（或其任何组合）中的一个或多个剂量可以施用于患者。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周一次（例如，以使得患者接受抗体的约二个至约二十个，例如约六个剂量）。可以施用初始较高的负荷剂量，随后为一个或多个较低剂量。这个疗法的进展可以通过常规技术和测定试验容易地监控。
应当理解，上述任何制剂或治疗方法均可以使用本文描述的抗体的免疫缀合物代替或加上抗复合物I抗体和/或抗gH抗体执行。
I.制造品
在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制造品。制造品包含容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与对于治疗、预防和/或诊断所述状况有效的另一种组合物组合的组合物，且可以具有无菌访问口（例如容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选择的状况。此外，制造品可以包含（a）其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和（b）含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它的细胞毒素剂或另外的治疗剂。在本发明的这个实施方案中，制造品可以进一步包含指示组合物可以用于治疗特定状况的包装说明书。可替代地或另外地，制造品可以进一步包括包含药学可接受的缓冲液的第二（或第三）容器，所述药学可接受的缓冲液例如抑菌注射用水（BWFI）、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
应当理解，上述任何制造品均可以包括本文描述的抗体的免疫缀合物代替或加上抗复合物I抗体和/或抗gH抗体。
III.实施例
下文是本发明的方法和组合物的例子。应当理解，考虑到上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
材料与方法
病毒生长。VR1814（Ravello Lab，Fondazione IRCCS Policlinico SanMatteo，Pavia Italy），除了在DMEM中外按指导的在第7-14次传代培养的人胎肺成纤维细胞（MRC5）（美国典型培养物中心，ATCC；Manassas，VA）中扩增，或如指导的在第4-6次传代的P0人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（Lonza；Basel，瑞士）中扩增，将上清液浓缩，重悬浮于完全培养基中且冷冻。完全培养基由补充有10%胎牛血清、青霉素/链霉素、L谷氨酰胺（都来自Invitrogen；Carlsbad，CA）和10mM HEPES（Cellgro；Manassas，VA）的DMEM组成。测定试验在96孔板中在MRC5和HUVEC细胞中以及也在人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）（如ATCC培养的，按指导）、衍生自单核细胞的巨噬细胞（MDM）和细胞滋养层（其为胎盘上皮细胞）中执行。MDM使用RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail（Stemcell Technologies，Vancover，BC，Canada）从全血中按指导的分离。单核细胞随后用0.1μg/ml脂多糖（lipolysacchardies,LPS）（Invivogen）刺激且在DMEM中温育过夜。在感染前用PBS洗掉血小板和未结合的细胞。从19周胎盘中分离细胞滋养层（Pereira Lab，UCSF，使用来自Librach等人，1991，JCV113:437-449的方案），并且在96孔组织培养板中种植。就细胞滋养层标记细胞角蛋白7（CK7）（Dako），测定细胞滋养层制品，并且发现在感染开始时超过90%阳性。
下述HCMV株得自Dr.Jay Nelson（University of Oregon Health andScience University（OHSU）；Portland，OR）：Adinis、Brown、Cano、Davis、Dement、Grunden、Harris、Keone、Lysistrata、NewRock、Phoebe、Powers、Salvo、Schmoe、Simpson和Watkins。下述HCMV株得自Dr.Sunwen Chou（OHSU）：C079、C323、C327、C336、C352、C353和C359。将解冻的病毒加入MRC5成纤维细胞中，且允许生长直至可见100%CPE（感染后约10-12天）。三天后，刮取细胞并且收获上清液且使用超速离心浓缩。每株的稀释物用于感染96孔板中的新鲜成纤维细胞。允许病毒感染18小时，这之后将细胞用100%乙醇固定。用Mab810，抗IE抗体（Millipore；Billerica，MA）执行染色，进行免疫荧光分析。计算滴度且用于确定感染复数（MOI）1所需的病毒量以用于中和测定试验。
中和测定试验。中和测定试验基本上如Abai等人，2007，J.ImmunolMethods，322:82-93中所述执行，除了测定试验在DMEM（Gibco）中执行且如上所述通过免疫荧光检测外。简言之，将抗体系列稀释，且与病毒混合，其中所述病毒在完全培养基中稀释从而使得当与培养基或与非抑制性抗体混合时，最终病毒粒子浓度导致约1个感染性病毒/细胞（MOI=1）。将抗体和病毒混合且在37度温育一小时，之后加入MRC5、ARPE-19、HUVEC或单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）的汇合单层中。允许病毒感染18小时，在所述时间后用100%乙醇固定细胞。细胞在PBS、2%BSA中封闭且随后用抗HCMV IE抗体，Mab810（Millipore）或兔抗HCMV IE（Johnson Lab，Oregon Health Sciences University）染色。将细胞用PBS洗涤，与合适的AlexaFluor488和Hoechst染剂（Invitrogen）一起温育。将来自含有给定抗体浓度的一式两份孔的数据求平均值，并且与在不存在抗体的情况下的感染（这设为100%）相比较。使用
Figure BDA00003258722200691
MicroTM和（Molecular Devices）将细胞成像且计数。使用Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA），将数据进行log转换，标准化，图示、和计算EC50和EC90。使用EC50曲线拟合算法，由最佳拟合曲线计算EC90值。测定试验的检测范围是100-6.5x105感染性病毒颗粒/孔。在实验之间（特别是具有不同病毒感染复数），观察测定试验的验证。
临床株的扩增和聚类。HCMV临床株（来自Oregon Health SciencesUniversity）在成纤维细胞上生长，收获上清液，并且使用超速离心浓缩。使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）从受感染细胞中分离DNA。使用在公众域中的HCMV株的比对，设计了HCMV基因引物。选择相隔小于500个碱基的保守区。使用
Figure BDA00003258722200701
显现来自临床株的序列，且使用MacVector翻译。通过ClustalW和在Jalview Alignment Editor中执行比对，并且使用最近邻%同一性建树。
通过杆状病毒表达蛋白质。为了检测表达的蛋白质，通过标准程序产生兔多克隆抗体。用相应于HCMV蛋白质的肽，免疫接种每只兔。肽如下：
gH_871HPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTR(SEQIDNO:195),
gH_977CPHVWMPPQTTPHDWKGSHTTSGLHRPH(SEQIDNO:196),
gL_873CGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR(SEQIDNO:197),
UL128988VGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ(SEQIDNO:198),
UL128989RQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIR(SEQIDNO:199),
UL130892RDYSVSRQVRLTFTEANNQTYTFCTHPN(SEQIDNO:200),
UL130_892SPWFTLTANQNPSPPWSKLTYPKPHDC(SEQIDNO:201),和
UL131_993TAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYK(SEQIDNO:202).
通过在肽结合的柱上捕获和后续洗脱，纯化血清。对于分泌性蛋白质，制备杆状病毒构建体用于每种HCMV蛋白质的细胞外结构域。使HCMV细胞外结构域各自与杆状病毒信号序列和6X-His标签（在C末端上）融合。杆状病毒表达载体用于感染SF9或Tini昆虫细胞。将蛋白质收获且凝胶过滤，并且通过丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯染色以检查。合并含有所有五种蛋白质（gH、gL、UL128、UL130和UL131）的级分。通过使gB S64-K115与Q499-E655融合，制备gB三聚体构建体。当通过感染昆虫细胞表达时，该构建体导致这样的gB蛋白质，该gB蛋白质不是膜锚定的，如预期的形成三聚体，结合中和与非中和gB抗体，并且可能为其融合前形式。当gH和gL共表达时，所得到的gH/gL蛋白质结合HB1和识别非构象和构象gH表位的下述抗体：MSL-109、兔抗gH、兔抗gL（来自David Johnson，OHSU，Ryckman等人，J. Virol. 82:60-70（2008））、兔抗gH_977和兔抗gL_873。gH、gL、UL128、UL130和UL131共转染昆虫细胞，导致小量异质蛋白质，其结合hu8G8以及非构象和构象抗体，包括兔抗gH、抗gL、抗UL128、抗130、抗131以及上文描述的兔多克隆抗体。
pRK-CMV载体的构建。对于全长病毒糖蛋白的表面表达，构建了三个分开的人表达质粒。从起点到终点扩增各HCMV基因。gH、gL、gB从基因组DNA中扩增，并且UL128、UL130、UL131从cDNA中扩增，首先使用PCR Blunt II TOPO（Invitrogen）克隆。其后，将基因克隆到Genentech哺乳动物表达载体（pRK-tk-Neo）内，所述pRK-tk-Neo具有“自切割2A肽”序列（Szymczak等人，Nat.Biotechnol.22:589-94（2004）），将各HCMV基因和来自编码eGFP的基因的最后3'基因分开。构建三个质粒，一个具有gB和eGFP，一个具有gH、gL和eGFP，以及一个具有UL128、UL130、UL131和eGFP。使用Lipofectamine2000（Invitrogen；Carlsbad，CA），将质粒转染到人胚肾（HEK）-293T细胞（美国典型培养物中心，ATCC；Manassas，VA）内。
Figure BDA00003258722200711
（HIG）耗竭。对于中和病毒进入上皮细胞的HIG的组分的分析，使用Lipofectamine2000（Invitrogen）用gB/eGFP或gH/gL/eGFP和UL128/UL130/UL131/eGFP或模拟质粒转染HEK-293T细胞，并且温育48小时。使用Accutase（Sigma）离解细胞，沉淀且分成12个等分试样。将在PBS和0.5%牛血清白蛋白（BSA）中稀释至20μg/ml，并且与3x107转染的细胞悬浮温育1小时。随后将系列转移至3x107转染细胞的新鲜等分试样。在新细胞上传递，直到见到抗体的最大特异性消耗（六次传递）。执行ELISA测定试验，以检测一些HCMV特异性抗体的耗竭。Maxisorp（NUNC）板用纯化的杆状病毒产生的gB、gH/gL或gH/gL/UL128/UL130/UL131在PBS中、和/或用转染的HEK293T细胞的裂解物包被。用缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG,Fcγ　（JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME），确定检测。检测下限是0.08μg/ml。随后使用100kD分子量截断浓缩器（Centricon）浓缩所得到的HIG，用于在如上所述的中和测定试验中使用。
亲和力耗竭柱以下述方式生成。蛋白质（1-2mg可溶性gB或gH/gL）相对于PBS全面透析，加入在PBS中平衡的约1ml Sterogene ALDSuperflow树脂中。加入氰基硼氢化钠（0.2ml1M溶液）以使蛋白质与含醛树脂化学偶联，并且允许反应在4℃进行过夜。将各树脂分别装载到小柱内，并且用PBS全面洗涤以去除任何未结合的蛋白。将在800μl体积中的两毫克
Figure BDA00003258722200721
装载到柱上，并且以0.4mL/分钟的流速用PBS洗涤。将未结合的蛋白质收集到几个0.5ml等分试样中，其在具有5000道尔顿分子量截断的旋转浓缩器中分开浓缩至约100μl。将样品无菌过滤且贮存于4℃直至测定试验时。
FACS。使用Lipofectamine2000（Invitrogen），将先前描述的pRK-CMV载体单个地、或以50:50比率（对于gH/gL和UL128-131），转染到HEK293T细胞内。在48小时后，使用Accutase（Sigma）离解细胞。一抗或二抗（Jackson Labs）和洗涤的所有温育都在PBS、2%FCS、0.2%叠氮化钠（FACS缓冲液）中。在染色后，将细胞在FACS缓冲液中在2%多聚甲醛中固定。使用FACS Calibur4（Beckton Dickinson）完成荧光分析，且使用FlowJo Software（Tree Star Inc.）处理数据。
抗性病毒突变体的生成。为了生成对本文描述的抗体具有抗性的病毒突变体，使HCMV株VR1814生长在上皮细胞上，期间存在亚最佳浓度的抗体MSL-109（Aulitzky等人，J.Infect.Dis.163:1344-47（1991））（其在Genentech合成）、HB1、hu8G8、或HB1和hu8G8的组合（在ARPE19细胞（美国典型培养物中心，ATCC；Manassas，VA）中）。实验在24孔板中开始，EC50、2X EC50或EC90的抗体各三个孔和0.5感染复数（MOI）。每周，将每个孔体积的一半传至新细胞上，并且抗体浓度增加1.5倍或保持不变。一般地，通过大约9次传递，突变体以单病毒噬斑出现。这些病毒在增加浓度的抗体（至10X EC90的终浓度）中生长。随后，将突变体贮存且通过如上所述的中和测定试验分析针对HB1和hu8G8的抗性。在ARPE-19细胞上分开四次（每抗体浓度，三个孔）起始该整个过程，在MRC5细胞上仅用HB1和MSL109（hu8G8不中和MRC5细胞上的病毒）分开两次起始该整个过程。
为了生成另外的抗性突变体，将细胞外病毒用N-乙基-N亚硝基脲（ENU，Sigma-Aldrich；St.Louis，MO）或紫外线（254λStratalinker，Stratagene；Santa Clara CA）处理，并且允许以24孔形式（24孔/处理）或96孔形式（72孔/处理）感染ARPE-19或MRC5细胞。在感染（以MOI1或2）后，将培养基替换为具有EC100的HB1或EC100的hu8G8或各EC50的两种抗体的组合、或更昔洛韦（GCV，Sigma-Aldrich）的完全培养基。每周，将上清液传代至具有增加浓度的抗体或GCV的新鲜细胞。将生长的病毒转移至更大的孔并且在2-3个月后贮存。分开两次起始该整个过程。
糖蛋白的测序。从对照或突变体病毒感染的细胞或上清液中分离DNA（DNA Blood/Tissue Extraction Kit，Qiagen；Valencia，CA）。根据可在美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中获得的HCMV株AD169、FIX、TB40E、Toledo和Towne序列的比对，设计针对每种基因的保守序列的引物。从每种临床株扩增糖蛋白H，从起始密码子至碱基2196，正好缺终止密码子。扩增糖蛋白B，从起始密码子至碱基2686，正好缺终止密码子。根据得自Akter等人，J.Gen.Virol.84:1117-22（2003）的cDNA序列，分别扩增从起始到终止的UL128、UL130和UL131。使用染料终止反应测序聚合酶链反应（PCR）产物，并且比对和修剪序列（Sequencer）。
突变的重演。修饰如上所述含有gH/gL基因或UL128/UL130/UL131基因的pRK-CMV表达质粒，以进行每种抗性突变体中发现的单突变的置换。将每种gH/gL质粒转染（Lipofectamine2000，Invitrogen；Carlsbad，CA）到HEK293T细胞（ATCC）内，允许表达2天，并且随后就表面表达的HCMV蛋白质结合对照抗gH抗体10F8或HB1的能力，通过如上所述荧光激活细胞分选（FACS）进行分析。每个UL128/UL130/UL131质粒与gH/gL质粒共转染，允许表达2天，随后评价表面表达的蛋白质结合HB1、hu8G8和对照兔抗UL131_993抗体的能力。使用FlowJo（Treestar；Ashland，OR）生成分析和图像。
病毒进入的分析。生长抗性和对照株的贮存物（在不存在抗体的情况下在ARPE-19细胞上平行传代），并且收获上清液（净）。对于pp65DNA（pp65F TCGCGCCCGAAGAGG（SEQ ID NO:189）、pp65RCGGCCGGATTGTGGATT（SEQ ID NO:190）、Taqman探针CACCGACGAGGATTCCGACAACG（SEQ ID NO:191），执行定量PCR（qPCR）。为了确定拷贝数，用克隆到Zero Blunt PCR Cloning（Invitrogen）内的pp65获得标准曲线。允许基于拷贝数的病毒稀释物感染ARPE-19和MRC5细胞18小时，之后固定和可视化。计算每DNA拷贝的感染性颗粒数，相对于无抗体情况下传代的株进行标准化，并且使用Excel版本14.1.2（Microsoft；Redmond，WA）绘图。
实施例1–抗复合物I和抗gH抗体的产生
抗复合物I鼠mAb8G8的产生。将2组Balb/c小鼠（每个组中10只）用完全UV灭活的（3000mJ）HCMV（株VR1814）以1x106pfu/小鼠的浓度免疫接种，每周两次，总共7次注射SC/IP。在第一组动物中，每只小鼠用RIBI佐剂引发，随后注射在PBS中的HCMV。在第二组小鼠中，动物不进行引发，随后用在RIBI佐剂中的HCMV注射。对采自免疫接种的小鼠的试验血液，通过ELISA进行血清样品滴定和如上所述的病毒中和测定试验。选择最高应答的前5名小鼠用于杂交瘤生产。使用来自腘和腹股沟淋巴结的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤系X63-Ag8.653，进行两组分开的融合。将融合的细胞种在96孔组织培养板（58块板）中，并且在融合后一天开始使用HAT培养基补充物（Sigma，St.Louis，Mo.）进行杂交瘤选择。如上所述在上皮细胞上使用病毒中和测定试验，筛选了总共738个IgG+杂交瘤。对于多个细胞类型，在HCMV株VR1814上，测试了所得抗体的EC50（μg/ml），并且与MSL-109（抗gH抗体）比较，显示于表2中。单克隆抗体8G8是在筛选中鉴定的最有效的中和抗体，其被选择用于人源化和进一步表征。
表2
Figure BDA00003258722200751
鼠8G8mAb的人源化和分析。使用λ3或4轻链（图2）和VH1、VH3或VH7重链构架（图1），通过标准CDR嫁接，人源化鼠杂交瘤8G8。为了比较，对于λ3和λ4，共有人λ种系序列的比对显示于图2中。执行中和测定试验，比较8G8人/鼠嵌合抗体（QE7/C2）与8G8λ3或λ4轻链与8G8VH1、VH3或VH7人源化重链的组合。发现λ4变体，但不是λ3变体，中和HCMV（图3）。
如图4中所示突变λ4的HVR-L2，根据Kabat编号，引入在氨基酸50C、50D、56上的置换、以及在氨基酸57上的氨基酸置换（FR3的第一个氨基酸），以提供抗体的稳定性。随后使各种突变的轻链与8G8人VH1链组合，并且在如上所述的中和测定试验中测试所得到的抗体。具有单个氨基酸置换的抗体都显示良好的中和活性（即A1、E1、T1、A2、E2和T2）（图5）。同样地，含有两个氨基酸置换的所有抗体都显示良好的中和活性（即SGSG和TGDA）。包括单突变体SG作为比较对照，它也显示出良好的中和活性。（图6）。
人源化8G8λ4抗体序列显示于图7（hu8G8.λ4FW）中。图8显示了人源化8G8VH1序列（hu8G8.VH1）的序列，图9显示了人源化8G8VH3序列（hu8G8.VH3）的序列。图10显示了人源化8G8λ4抗体序列，其中前两个氨基酸（QP）已进行了修饰，使得多肽以丝氨酸开始（Q被缺失，L突变为S），并且氨基酸36保留鼠氨基酸（Y）。这种抗体的多肽序列显示为λ48G8嫁接物。编码该多肽的代表性核酸序列显示于该多肽序列下。
抗gH抗体的亲和力成熟。使用PCT公开号WO94/16730（于1994年8月4日公开，整体引入本文作为参考）中公开的MSL-109的可变重链和可变轻链序列的抗体序列，合成单克隆抗体MSL-109。MSL-109VH和VL链的氨基酸序列显示于图11（VL，SEQ ID NO:90；VH，SEQ ID NO:92）中。MSL-109抗体基于含有重链VH3和轻链Vκ2的IgG1构架。将编码该抗体的重组DNA克隆到CHO细胞内。
通过互补决定区（CDRs）的随机化，随后通过噬菌体展示用渐进地限制性浓度的生物素化gH/gL选择结合者，对抗体MSL-109进行亲和力成熟。CDRs的每个位置都通过寡核苷酸指导的诱变、使用“NNK”密码子随机化，其中N是四个天然核苷酸中的任何一个，并且K是50%胸腺嘧啶和50%鸟嘌呤。NNK密码子可以编码20种天然氨基酸中的任何一个。分开制备轻链和重链的文库，并且每条链的3个CDRs均同时随机化。这导致在每条链中具有0–3个随机氨基酸变化的克隆，在每个cDNA中不超过一个突变。文库在噬菌体Fab片段展示载体中，通过标准方法制备。通过在相继的选择回合中使噬菌体展示文库与1和0.1nM生物素化的gH/gL一起温育，选择结合性克隆，并且随后与100nM gH/gL或MSL-109IgG竞争，以减少较低亲和力克隆与gH/gL的结合。将结合的克隆捕获在由中性抗生物素蛋白(neutravidin)或链霉亲和素包被的ELISA板上，洗涤、在10mM HCl中在室温洗脱10分钟。用1/10体积的1M Tris pH8.0中和洗脱的噬菌体，用于感染大肠杆菌进行扩增以用于下一轮选择。测序来自第二轮选择的克隆，以确定在选择的噬菌体中频繁的突变。通过竞争噬菌体ELISA，检查具有有利突变的克隆。
表达在重链Kabat位置53和55中具有单个或组合突变的突变体MSL-109的IgG和Fab片段，测试对CMV的体外中和作用。氨基酸53上的氨基酸置换（将D53替换为S、I、N、Q、F、M、L、G、H、K、W、Y、V或A）单独地或与氨基酸55上的氨基酸置换（将T55替换为R或K）组合，提供了具有改善的中和能力的抗体（图12B和12C）。这些变化中的一些的示意图显示于图12A中。另外，在MSL-109中的氨基酸N52可以替换为S。这个置换不影响效力但允许S在位置53而无位置52的糖基化。使用在氨基酸53和/或氨基酸位置55的各种氨基酸置换，对于重链可变序列，存在89种可能组合（SEQ ID NOs:87、88、89和96-182）。SEQID NO:94提供共有序列。这些抗gH抗体的Fab片段在噬菌体展示ELISA测定试验中测量了与杆状病毒中产生的gH/gL二聚体的亲和力。具体地，展示MSL-109变体Fab片段的噬菌体克隆与系列稀释的gH/gL一起温育且在室温温育1小时。通过使混合物与gH/gL包被的ELISA板孔在室温温育10分钟，检测未结合的噬菌体。板用PBS-T洗涤，并且通过与抗M13HRP缀合物一起温育30分钟随后洗涤和用TMB底物显色，检测与固定的gH/gL结合的噬菌体。通过非线性回归，计算IC50——在该噬菌体-gH/gL混合物中50%噬菌体游离的点。IC50s在0.01-0.1nM的范围中。关于所选变体的亲和力显示于表3中。
表3
Figure BDA00003258722200781
令人惊讶的是，在VH2HVR上的氨基酸变化产生了具有显著更高的结合和中和能力的抗体。例如，如通过噬菌体ELISA显示的，HB1（D53N/T55R）比MSL-109对gH/gL具有增加10倍的亲和力（表3）。如通过中和测定试验显示的（图12B），当作为Fab片段在大肠杆菌中表达时，HB1（D53N/T55R）抑制HCMV进入ARPE-19细胞的效力，比亲本MSL-109抗体，高约40倍（即EC50=0.15nM相对于6.2nM）。此外，如通过中和测定试验显示的（表4，图12C），当作为全长IgG在CHO细胞中表达时，HB1（D53N/T55R）抑制HCMV进入ARPE-19细胞的效力，高约6倍。在多种细胞类型上，在中和测定试验（一个代表性实验）中，与MSL-109抗体比较，HB1抗体的EC50和EC90（μg/ml）显示于下表4中。
表4
Figure BDA00003258722200791
实施例2–抗体功能研究
就阻断HCMV病毒进入上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞内的能力，HB1（D53N/T55R）和hu8G8在中和测定试验中与HIG比较。hu8G8在上皮细胞上具有0.003μg/ml（0.02nM）的EC50、对内皮细胞具有0.004μg/ml（0.03nM）、对单核细胞具有0.001μg/ml（0.006nM）的EC50。在这些细胞类型之每一个上，对于中和HCMV，hu8G8比HB1强至少8倍。然而，如预期的，hu8G8不阻断病毒进入成纤维细胞内，而HB1阻断病毒进入并具有0.11μg/ml（0.7nm）的EC50（参见图13）。
已报道，当给予具有原发性HCMV感染的孕妇时，HIG预防HCMV胎儿感染和/或疾病（Nigro等人，2005），提示CMV特异性抗体对发育中的胎儿赋予保护的能力。当通过中和测定试验评估时，发现HIG中和病毒进入所有测试的细胞类型，但效力远远小于任一单克隆抗体（参见图13）。此相对低的效力是由于HIG的多克隆性质导致的，HIG中仅小部分蛋白质具有抗CMV中和活性。
实施例3–HIG耗竭研究。
为了鉴定在超免疫球蛋白中的中和抗体组分，通过六个系列温育，使用gB或复合物I转染的HEK293T细胞，使HIG耗竭抗gB抗体或抗复合物I（gH/gL/UL128/UL130/UL131）抗体。根据上文描述的方法，执行
Figure BDA00003258722200801
（HIG）耗竭。如通过纯化的gB ELISA测定的，对吸收后的血清的分析显示，与在对照细胞上的0%相比较，通过该程序吸收了与gB转染细胞反应的>95%抗体。然而，如上所述，通过ELISA用来自转染的HEK293T细胞的裂解物测定的，与在对照细胞上的0%比较，与复合物I转染的细胞反应的抗体中仅约45%已被吸收。
耗竭的HIG随后用于中和测定试验中，以测定耗竭对防止病毒进入上皮细胞的影响。与模拟吸收的HIG相比较，经吸收的HIG制备物的系列稀释物用于如上所述的中和测定试验中。这些实验的结果显示于图14.中。抗gB的抗体看起来对HIG在上皮细胞上的中和能力不具有显著贡献，而抗复合物I的抗体看起来对HIG的中和活性具有显著贡献。当在上皮细胞上测试时，复合物I特异性抗体的去除使HIG的中和能力（EC50）减少约85%。
经耗竭的HIG在成纤维细胞上的测定试验是不可能的，这是因为为了检测中和作用需要非常高的浓度。HIG的EC50对这个细胞类型是约500μg/ml。因为UL128、UL130和UL131蛋白质不是进入成纤维细胞所需的，所以如上所述与柱结合的杆状病毒表达的gB或gH/gL用于从HIG中耗竭特异性针对这些蛋白质/复合物的抗体。随着抗gB抗体的几乎完全耗竭（在gB柱上gB抗体的95%耗竭相对于在gH/gL柱上gB抗体的0%耗竭），未观察到中和作用的转变。然而，随着大多数抗gH/gL抗体的耗竭（在gH/gL柱上gH/gL抗体的84%耗竭相对于在gB柱上gH/gL抗体的0%耗竭），观察到EC50的65%减少（参见图14）。
从这些数据得出结论：HIG中的大多数中和抗体指向gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物。特别地，对于上皮细胞进入，复合物I中和抗体是HIG中的主要中和抗体。另外，对于抑制病毒进入成纤维细胞，HIG中的gH/gL抗体具有主要作用。这些实验显示抗gB抗体在HIG中和中几乎没有作用。
通过使用杆状病毒表达的gB、gH/gL和gH/gL/UL128/UL130/UL131吸收HIG，通过ELISA确定：约1%的HIG是gB反应性的，而约0.1-0.2%是复合物I或gH/gL反应性的。通过了解复合物特异性抗体在HIG中的浓度，这些复合物特异性抗体的中和效力可以通过相对于如下IgG的百分比来校正完整HIG的中和效力，进行计算，其中所述IgG为实际针对相关复合物而导致中和作用的IgG（例如在成纤维细胞上810μg/ml x0.1-0.2=0.8-1.6），如下表5中所示的。
表5
Figure BDA00003258722200811
EC90值相对于HIG中的gH/gL/UL128/UL130/UL131抗体浓度（0.1-0.2%），进行了调整
如上表5中所示，在中和测定试验中测试的所有细胞类型上，HB1和人源化8G8（VH1或VH3）的组合能够接近HIG的中和效力。细胞以下述HCMV感染复数（MOI）进行感染：上皮细胞MOI=1，内皮细胞MOI=1，巨噬细胞MOI=0.5和成纤维细胞MOI=1。对于抑制对成纤维细胞的感染，HB1具有与HIG相当的中和效力（如针对复合物I特异性的HIG量校正的），但对上皮细胞、内皮细胞或巨噬细胞，没有提供足够效力。人源化8G8（VH1）和（VH3）对上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞具有与HIG相当的中和效力（如针对复合物I特异性的HIG量校正的）。然而，它未能中和成纤维细胞的感染。因此，对测试的所有细胞类型，抗体的组合可以提供与针对复合物I特异性抗体校正的HIG中和作用相当的HCMV中和。
再次在中和测定试验中测试了HB1和具有VH1的hu8G8中和在所有不同细胞类型上的HCMV的能力，且与计算和实际的HIG中和效力比较。细胞用下述HCMV MOI进行感染：上皮细胞MOI=1，内皮细胞MOI=0.25，巨噬细胞MOI=0.25和成纤维细胞MOI=0.8。这个实验的结果显示于下表6中。来自这个实验的平均EC90和表5中显示的结果于下表6的阴影框中显示。
表6
Figure BDA00003258722200821
Figure BDA00003258722200822
相对于gH/gL/UL128/UL130/UL131抗体的浓度进行调整的HIG。
实施例4–HCMV临床分离株的中和
从得自Oregon Health Sciences University的两个实验室的超过20个临床分离株中测序gH、gL、UL128、UL130和UL131基因，且与另外的公知可获得的序列汇编。该公知可获得的序列产生自起源于美国、欧洲和日本的株。
将每种株感染的细胞裂解，并且使用DNA血液/组织提取试剂盒（Qiagen；Germantown，MD）提取DNA。根据可在美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中获得的AD169、FIX、TB40E、Toledo和Towne序列的比对，设计针对保守序列的引物。从每种临床株中扩增糖蛋白gH，从起始密码子至碱基2196，正好缺终止密码子。在Genentech使用染料终止反应，测序聚合酶链反应（PCR）产物。比对且修剪序列（Sequencer）。通过使用来自Chou等人，J.Infect.Dis.166:604-7（1992）的一个登记号且随后获得“相关序列”，从NCBI数据库中获得另外的gH序列。总共地，在去除信号肽后将来自57个株的糖蛋白序列聚类（ClustalW，EuropeanBioinformatics Institute（EBI）；Cambridgeshire，英格兰），并且通过百分比同一性使用平均距离比对成树（JalView；Waterhouse等人2009）。
测序结果指示，UL128、UL130和UL131在这些临床分离株（在去除信号肽后）之间存在序列的1%变异。这个发现与在欧洲的研究一致，所述研究证实UL128、UL130和UL131在具有原发性HCMV感染的孕妇中是高度保守的（Baldanti等人，Arch.Virol.151:1225-33（2006））。
gH在蛋白质水平上（在去除信号肽后）在所有株中具有至少95%相同性。构建了具有两个不同分支的系统发育树（数据未显示）。该树与先前报道一致，在该先前报道中gH蛋白质序列分离成两个系统发育组（Chou，J.Infect.Dis.166:604-7（1992））。也与文献一致，在两个分支中HCMV分离株均不是以地理位置区别的（即，在日本分离的株可以出现在两个分支中）（Pignatelli，J.Gen.Virol.84:647-655（2003））。
测试了HB1（D53N/T55R）中和一系列不同的HCMV临床分离株在成纤维细胞上的感染性的能力。表7显示了与HIG比较的HB1有效性。发现HB1与HIG一样好或更佳地中和这些HCMB株（代表了最大gH序列多样性）之每一个（当就gH/gL/UL128/UL130/UL131-特异性的HIG量校正后）。在多个实验中以多个MOI使用HCMV株Dement、Adinis和VR1814，得到的中和测定试验结果也显示于下表7中。
表7
Figure BDA00003258722200841
*EC90值相对于HCMV-HIG中的gH/gL/UL128/UL130/UL131抗体浓度（0.1-0.2%）进行了调整
实施例5–抗体的特异性
评估HB1和hu8G8的抗原特异性。构建含有病毒糖蛋白的质粒，从而使得通过用“自切割2A肽”（Szymczak等人，Nat.Biotechnol.22:589-94（2004））将各基因分开，以相等化学计量表达每种蛋白质。质粒含有gB/eGFP、gH/gL/eGFP或UL128/UL130/UL131/eGFP（由cDNA克隆）的全长基因。使用Lipofectamine2000（Invitrogen；Carlsbad，CA），将质粒转染到人胚肾（HEK）293T细胞（美国典型培养物中心，ATCC；Manassas，VA）内，以在其表面上表达CMV糖蛋白。在2天后，将细胞离解且用饱和一抗HB1、hu8G8、抗gB、亲和力纯化的兔抗UL131_933或亲和力纯化的兔抗gH_977染色。用缀合至别藻蓝蛋白（APC，JacksonImmunoResearch；West Grove，PA）的合适二抗染色细胞。使用FACSCalibur（BD Biosciences；San Jose，CA）测量各个细胞的荧光，并且使用FlowJo软件（Tree Star；Ashland，OR）分析。选择性地对GFP阳性细胞（表达CMV转基因的细胞）进行图示，以显示抗体结合。
如图15中所示，HB1与表达单独或与UL128/UL130/UL131复合的gH/gL的细胞反应。Hu8G8仅与表达gH/gL/UL128/UL130/UL131的细胞反应（图15），不与表达单独的gH/gL或gH/gL/gO的细胞反应（数据未显示）。无一抗体与表达gB的细胞反应。因此，HB1识别gH上的表位，所述表位存在于gH/gL复合物和复合物I中。hu8G8抗体与形成复合物I的五种包膜蛋白质中的表位结合，但不与gH/gL/gO或单独的gH/gL结合。
实施例6–协同或拮抗的评估
HB1和hu8G8在病毒中和测定试验中组合测试，以确定当组合两种抗体时是否存在效力的差异。因为这些抗体具有不同靶，并且推测在阻断病毒进入上是独立地起作用的，所以假定HB1和hu8G8的作用是加性的。因此，应用Bliss独立方程（对具有效应A和B的两种单一化合物的组合反应C是C=A+B–A*B）。为此，将HB1和hu8G8以1:1比率混合，并且在上皮细胞上在病毒中和测定试验中以稀释系列测试，如上所述计算EC50。HB1不增强或减少hu8G8对上皮细胞的效力，并且1:1曲线精确地重叠模拟的Bliss独立性曲线，暗示加性而不是协同性（参见图16和表8）。同样地，因为hu8G8不阻断HCMV进入成纤维细胞（数据未显示），如预期的，hu8G8不改变HB1对成纤维细胞的效力。因此，HB1和hu8G8以1:1比率，没有显示任何拮抗或协同作用。
表8
Figure BDA00003258722200851
为了评估HB1和hu8G8在广泛的比率范围是否显示协同或拮抗，跨EC50值的配对“检查板（checker board）”稀释系列被用于执行中和测定试验。每种抗体如下表9中所示进行稀释，而病毒浓度是恒定的。对于多个抗体浓度组合，在上皮细胞上，受感染细胞的百分比（相对于无抗体对照标准化）显示于下表9中：
表9
Figure BDA00003258722200861
阴影部分=其中存在部分中和的每种抗体的浓度。
使用如上所述中和测定试验，对于HB1和hu8G8，在0.8、0.016、0.0032μg/ml另一种抗体的存在下，测定了EC50s。这些实验的结果显示于下表10和11以及图17中。
表10–与不同浓度的HB1组合的hu8G8效力
抗体和浓度 hu8G8的EC50（μg/mL）
0.08μg/ml的HB1 0.0037
0.016μg/ml的HB1 0.0047
0.0032μg/ml的HB1 0.0028
0μg/ml的HB1 0.0031
表11–与不同浓度的hu8G8组合的HB1效力
抗体和浓度 HB1的EC50（μg/mL）
0.0032μg/ml的hu8G8 0.035
0.00064μg/ml的hu8G8 0.043
0.000128μg/ml的hu8G8 0.041
0μg/ml的hu8G8 0.030
在比较每种抗体单独与多种比率的组合的效力后，不存在协同或拮抗的迹象。例如，在比较hu8G8的效力曲线与hu8G8加0.08μg/ml HB1的效力曲线后（在不存在滴定抗体的情况下的感染被标化为100%），我们发现曲线是重叠的（参见图17）。反过来，在不同浓度的hu8G8存在时，各HB1效力曲线重叠（相对于100%感染标化）（参见图17）。因此，在宽比率范围，抗体之间不存在协同或拮抗的迹象。
实施例7–发展的病毒抗性的评估
尽管人CMV具有相对低的突变率（与肝炎病毒C（HCV）或人免疫缺陷病毒（HIV）相比较），但评估了病毒经由抗性突变的生成而逃脱HB1或hu8G8或两者的中和作用的能力。病毒在亚最佳浓度的HB1（或MSL-109）、或hu8G8、或HB1和hu8G8抗体组合的存在下生长。随着每周将病毒传代到新细胞上（其中每轮约50%体积传递到新细胞上），逐渐地增加每种抗体的浓度。观察到对每种抗体分别具有抗性的突变体病毒，但没有突变体赋予对组合的抗性。所有抗性病毒突变体从单噬斑出现。
出现赋予对HB1的中和作用的抗性的突变体（参见图18）。然而，这些突变体仍是对hu8G8敏感的，如通过中和测定试验显示的，具有相似EC50（参见图18以及表12和13）。
表12–出现对HB1具有抗性的HCMV突变体
HB1EC50（μg/ml）
无Ab对照 0.04
HB1–突变体病毒1 0.21
HB1–突变体病毒2 无中和
HB1–突变体病毒3 0.07
HB1–突变体病毒4 200
HB1–突变体病毒5 无中和
HB1–突变体病毒6 无中和
表13-HCMV HB1抗性突变体对hu8G8中和作用仍是敏感的
Figure BDA00003258722200881
此外，出现赋予对hu8G8的中和作用的抗性的突变体，并且这些突变体仍是对HB1敏感的，具有相似EC50s（参见图19以及表14和15）。
表14-出现对hu8G8具有抗性的HCMV突变体
hu8G8EC50（μg/ml）
无Ab对照 0.002
hu8G8–突变体病毒1 无中和
hu8G8–突变体病毒2 0.25
hu8G8–突变体病毒3 无中和
表15-HCMV hu8G8抗性突变体对HB1中和作用仍是敏感的
HB1EC50（μg/ml）
无Ab对照 0.22
hu8G8–突变体病毒1 0.18
hu8G8–突变体病毒2 0.07
hu8G8–突变体病毒3 0.06
为了理解针对HB1和hu8G8抗体的抗性的分子性质，测序了来自每个抗性株的gB、gH、gL、UL128、UL130和UL131。与VR1814和D1株相比较（在无抗体压力下，在上皮细胞上平行传代VR1814），所有HB1抗性株具有在gH中的单个非保守氨基酸突变，并且在其他糖蛋白中未发现其他突变（表16）。生成对HB1具有抗性的11个株，涵盖在仅3个氨基酸中的5种不同的核苷酸突变。这些氨基酸无一发现在测序的或已公开序列的临床株中是突变的。
响应hu8G8的突变较少频繁出现，其中仅三个株发现是抗性的。与VR1814和D1株相比较（参见表16），对hu8G8具有抗性的所有三个株都具有在UL131中的单个非保守氨基酸突变，并且在其他糖蛋白中未发现其他突变。当该突变的gH和UL131序列与60个可获得的临床株序列比较时，这些株无一携带这些突变。
表16–导致抗性的突变的作图
抗性株 突变的蛋白质 残基变化
HB1–突变体1 gH P171H
HB1–突变体2 gH W168C
HB1–突变体3 gH P171S
HB1–突变体4 gH D446N
HB1–突变体5 gH W168C
HB1–突变体6 gH W168R
hu8G8–突变体1 UL131 Q47K
hu8G8–突变体2 UL131 K51E
hu8G8–突变体3 UL131 D46N
当比较HB1抗性株相对于D1株感染细胞的能力时，这些抗性株具有显著的进入缺陷（效力低多达20x），提示这些株对于体内生长将是被减弱的（参见图20）。当比较hu8G8抗性株相对于D1株感染细胞的能力时，发现抗性株可以以相等效力感染细胞；然而，这些株是极慢生长的，提示生产缺陷（数据未显示）。需要进一步分析以理解这种减弱的机制。
为了确定这些突变是否影响HB1和hu8G8分别与gH和UL131结合的能力，通过定点诱变，在HEK-293T细胞表面上瞬时表达具有抗性突变的复合物I（gH/gL/UL128/UL130/UL131），并且执行抗体结合的FACS分析。P171的突变（突变体1和3：P171至H或S）具有仅高二至五倍的HB1抗性，该抗体与gH/gL的结合没有显著改变。然而，在HB1突变体2、5和6中发现的突变（W168至C或R）完全消除HB1结合的能力（参见图21）。此外，这些病毒突变体不被HB1中和（参见图18）。突变体4（D446N）展示中间表型；它对HB1的中和作用具有高500倍的抗性（参见图18），但仍可检测到与HB1的结合（参见图21）。
为了确定UL131中的突变如何影响hu8G8结合，用gH/gL/UL128/UL130/UL131的野生型或突变体复合物转染HEK-293T细胞，并且通过FACS分析测量与抗gH（HB1和MSL-109）、抗UL131_993和hu8G8的结合（参见图22）。所有三个UL131突变均消除hu8G8对于gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物的结合。
HB1抗性突变在HCMV糖蛋白H的结构模型上作图（基于HSV-2gH和EBV gH的近期解析的结构）（Backovic等人，PNAS，197:22635-22640（2010））。所有突变的残基均作图到gH的同一表面（数据未显示）。HB1Fab在gH结构上建模。HB1Fab的足迹（footprint）涵盖所有突变，提示HB1与由这些突变限定的表位结合。类似地，hu8G8抗性突变彼此紧靠（相隔四个残基），并且尽管UL131的结构是未知的，但这些突变均作图至推定的α-螺旋结构域且预测位于螺旋的同一面上。因此，连同结合分析一起，抗性突变阐明了在gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物上HB1和hu8G8的表位。
实施例8–亲和力分析
如下所述，分别通过biacore和Scatchard分析测定HB1和hu8G8的亲和力。
通过biacore分析测定HB1对于可溶性杆状病毒表达的gH/gL的亲和力，发现其是1nM。具体地，使用BIAcore3000仪器（GE Healthcare；Piscataway，NJ），通过表面等离振子共振（SPR）测量（Karlsson等人1991），评估HB1结合杆状病毒表达的分泌性gH/gL的能力。基于SPR的生物传感器报道近表面的折射率变化。当蛋白质靶（“配体”）共价固定在传感器芯片表面上时，SPR可以用于监控注射在表面上的结合配偶体（“分析物”）的非共价相互作用；对分析物结合的实时测量可以用于确定相互作用的动力学和亲和力。
在1:1相互作用的情况下（其中分析物B与固定的配体A结合），可以使用公式1描述该平衡：
Figure BDA00003258722200911
在公式1中，kon是结合速率常数，koff是解离速率常数，并且平衡解离常数KD由KD=koff/kon确定。关于1:1结合的复合物形成速率使用公式2确定：
当以SPR信号（R）表达时，公式2可以书写成公式3：
dR dt = k on CR max - ( k on C + k off ) R
在公式3中，C是游离分析物的浓度，并且Rmax是表面的最大分析物结合能力。类似地，对于能够在溶液中二聚化形成2个结合位点的分析物B，平衡可以通过公式4进行描述。
Figure BDA00003258722200914
通过测量结合速率的浓度依赖性、和在不存在游离分析物的情况下的解离速率，可以确定动力学常数且用于计算KD。
使用抗Fc捕获方法以非共价固定HB1，随后注射多种浓度的gH/gL用于确定结合动力学，从而进行SPR测量。根据由制造商提供的说明书，将CM5生物传感器芯片（BR100014，CM5研究级别；BIAcore，Inc.）对接(dock)，用运行缓冲液（10mM HEPES（pH7.4）、150mM NaCl和0.01%聚山梨醇酯20）引发，且用70%甘油标准化。如下文简要概述的，将小鼠单克隆抗人Fc抗体（Human Antibody Capture Kit，BR-1008-39，BIAcore，Inc.）固定在CM5芯片的所有四个流动池上。根据由制造商描述的方案，使用7分钟活化时间，利用N-乙基N'（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（胺偶联试剂盒，BR-1000-50；BIAcore，Inc.）活化流动池。随后，通过以10μL/分钟的流速注射在10mM乙酸钠，pH5.0中稀释的60μL25μg/mL抗体，通过胺偶联使活化的基质与捕获抗体反应。在偶联注射结束时，通过以5μL/分钟的流速注射35μL1M乙醇胺-HCl，灭活任何剩余未反应的NHS基团。由偶联程序前和后的SPR信号，估计以这种方式共价固定的捕获抗体量，其给出在4个流动池上8000-9500RU的范围。
小于约100（任意SPR或应答单位（RU））的Rmax值通常被公认为提供良好的信噪比，不限制可以测定的动力学常数范围。预实验指示，60μL0.13μg/mL HB1以30μL/分钟流速的注射导致了充足HB1的捕获，从而在用gH/gL饱和后观察到了约50RU信号。因此，这个HB1浓度和注射方案被用于动力学常数的确定中。
通过如上所述在流动池2上捕获HB1执行结合测量，其中流动池1用作参照。在运行缓冲液中制备从0.39nM到100nM的浓度2倍递增的gH/gL溶液。以30μL/分钟的流速在传感器芯片表面上注射60μL这些溶液，收集传感图。传感器芯片维持在25℃，并且在注射结束后监控解离10分钟。经由注射30μL3M MgCl2，在结合循环之间再生传感器芯片表面。该注射引起任何剩余HB1:gH/gL复合物从捕获抗体的解离。随后如上在流动池2上捕获HB1用于下一个结合循环。针对运行缓冲液在传感器芯片上的注射，类似地收集“空白”传感图。
通过首先扣除针对参照池测量的信号，准备观察到的传感图用于动力学分析。去除起因于曲线的再生部分的信号。随后通过扣除分析物注射前基线的平均RU值，将传感图归零。最后，从注射含有gH/gL的溶液获得的曲线中，扣除仅注射运行缓冲液而测量到的传感图。使用由制造商供应的软件，根据1:1Langmuir结合模型或二价分析物模型，分析数据。
总SPR信号随着gH/gL浓度而增加，指示Fc捕获的HB1有能力进行抗原结合。根据1:1Langmuir结合模型的数据分析指示，0.15nM的表观平衡解离常数（KD），其中动力学常数显示于表17中；然而，计算的曲线与观察到的传感图没有良好匹配，具有2.1的相对大χ2值。观察到的传感图通过二价分析物KD模型，得到更好的描述（χ2=0.4），产生1.0nM的表观KD和表18中所示的动力学常数。
表17–使用1:1Langmuir结合模型计算的动力学常数
Kon(M-1s-1) Koff(s-1) Rmax(RU) KD(nM) x2
6.8×105 1.02×10-4 42 0.15 2.1
表18–使用二价分析物KD模型计算的动力学常数
Figure BDA00003258722200931
因为biacore不能用于确定hu8G8的亲和力，所以Scatchard分析用作替代方法。在这种方法中，将碘化抗体与稀释系列的未标记抗体混合且测定竞争。使用Munson和Rodbard的拟合算法，对结果进行作图，以确定抗体的亲和力（图23）。平均Kd对于HB1是1.27nM，并且对于hu8G8是2.03nM（表17）。对于HB1和hu8G8，还通过Scatchard分析，在腺病毒细胞表面表达的gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物上，进行了亲和力测量，并且发现分别为1.27nM和2.03nM。
具体地，HB1和hu8G8使用Iodogen方法（Thermo-Fisher Scientific；Waltham，MA）进行碘化。使用NAP-5柱，通过凝胶过滤，从游离125I-Na中纯化放射性标记的抗体。纯化的hu8G8抗体具有12.30μCi/μg的比活性，纯化的HB1抗体具有14.66μCi/μg的比活性。将含有固定浓度的碘化抗体和递减浓度的未标记抗体的50μl竞争反应混合物，加入96孔板中。使用Sigma
Figure BDA00003258722200941
Solution（Sigma-Aldrich；St.Louis，MO）使表达蛋白质复合物gH/gL/128/130/131的腺病毒瞬时转染的ARPE-19细胞从烧瓶上脱壁，用多聚甲醛固定，用结合缓冲液（具有2%FBS、50mMHEPES，pH7.2和0.1%叠氮化钠的DMEM）洗涤。洗涤的细胞以25,000个细胞的密度在0.2mL结合缓冲液中加入含有一式三份的50μL竞争反应混合物的96孔板。在每个细胞竞争反应中碘化抗体的终浓度是100pM，而在细胞竞争反应中未标记抗体的终浓度是变化的，从500nM开始，随后通过1:2倍稀释而降低，共10个浓度，并且包括零加入的仅缓冲液样品。细胞竞争反应在室温温育2小时，随后转移至Millipore Multiscreen滤板，并且用结合缓冲液洗涤四次，以使游离的与结合的碘化抗体分离。滤器在Wallac Wizard1470γ计数器（PerkinElmer Life and Analytical Sciences；Wellesley，MA）上计数。使用New Ligand软件（Genentech）评价结合数据，所述软件使用Munson和Rodbard（Anal.Biochem.，7:22-39（1980））的拟合算法，以确定抗体的结合亲和力。
表19
Figure BDA00003258722200942
a KD=平衡解离常数；SD=标准差
实施例9–hu8G8与复合物I结合的分析
为了进一步表征hu8G8与复合物I的结合，执行ELISA测定试验，以测试hu8G8是否可以结合如实施例7中鉴定的含有抗性突变的UL131部分。具体地，扩增编码UL131的DNA，从位置41丝氨酸的密码子到位置68丝氨酸的密码子（SRALPDQTRY KYVEQLVDLT LNYHYDAS（SEQ ID NO:194），并且克隆到具有N末端His6、GST和TEV切割位点（DNA654570）的Restriction-Independent克隆（RIC）载体中。UL131的这个部分在蛋白质的二级结构中形成推定的α-螺旋。还克隆了具有突变Q47K的UL131，所述突变Q47K消除hu8G8与复合物I（gH/gL/UL128/UL130/UL131）中的UL131的结合。经序列验证的构建体在大肠杆菌菌株Rosetta2（DE3）中生长。起子培养物在30℃在具有50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中生长过夜。在1-L培养物中的蛋白质表达在OD6000.7用0.3mM IPTG在16℃诱导过夜。收获细胞，立即通过超声处理和细胞破裂器在含有无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（Roche）的100mM Tris pH8.0、500mM NaCl、5%甘油（缓冲液A）中裂解。裂解的细胞以10000rpm离心40分钟，并且将澄清的裂解产物装载到重力流Ni-螯合亲和柱（Qiagen）上。柱用10柱体积缓冲液A和具有50mM咪唑的10柱体积缓冲液A洗涤。蛋白质用100mM Tris pH8.0、500mM NaCl、5%甘油、500mM咪唑洗脱，且立即透析到50mM Tris pH8.0,200mMNaCl和5%甘油中。蛋白质在尺寸排阻层析柱（S20010/30，GE）上在25mMTris pH8.0，200mM NaCl和5%甘油中进一步纯化。
为了确定hu8G8与所述UL131蛋白质片段的结合，将Maxsorb ELISA板在4℃在碳酸盐包被缓冲液中以1μg、200ng或40ng蛋白质/孔包被过夜。在用洗涤缓冲液（具有0.05%Tween20[Sigma Chemical]的PBS）3次洗涤后，孔用试验稀释剂（具有0.5%BSA[Invitrogen；Carlsbad，CA]的洗涤缓冲液）封闭一小时。hu8G8在试验稀释剂中以10μg/ml或1μg/ml温育一小时。在3次洗涤后，孔与1:5000的过氧化物酶缀合的抗人抗体（Jackson Immunolabs，Bar Harbor，ME）温育、或与1:500或1:5000的辣根过氧化物酶缀合的抗-penta-HIS（Qiagen）温育1小时。实验结果显示于图24中，包括来自用200ng蛋白质包被且与10μg/ml hu8G8一起温育的ELISA板的数据。
尽管本发明为了清楚理解的目的已通过举例说明和实施例一定详细地进行了描述，但说明书和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容特别整体引入作为参考。
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Claims (102)

1.一种结合HCMV复合物I的分离抗体，其包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中：
（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
（b）HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
（e）HVR-L2包含选自SEQ ID NOs:10-19的氨基酸序列；和
（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
2.一种结合HCMV复合物I的分离抗体，其包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中：
（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
（b）HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和
（e）HVR-L2和轻链可变结构域构架FR3的第一个氨基酸包含SEQID NO:21的氨基酸序列。
3.权利要求1的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包括包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR1；和包含选自SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR2。
4.权利要求1的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包括包含选自SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR3；和包含选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR4。
5.权利要求1的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包含与选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列、和与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列。
6.权利要求5的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
7.权利要求5的抗体，其中所述VL序列包含SEQ ID NO:48或SEQID NO:49的氨基酸序列。
8.权利要求5的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包括包含选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL。
9.权利要求8的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包含SEQID NO:45或SEQ ID NO:46的VH序列和SEQ ID NO:49的VL序列。
10.权利要求1-9中任一项的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体，在0.05μg/ml-0.0007μg/ml或更少的抗体浓度，中和50%HCMV。
11.一种结合HCMV gH的分离抗体，其包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中：
（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
（b）HVR-H2包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74和SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；
（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；
（e）HVR-L2包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；和
（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
12.权利要求11的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体包括包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，其中在SEQ ID NO:93的位置6上的氨基酸选自Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Met和Leu，并且在SEQ IDNO:93的位置8上的氨基酸选自Thr和Arg。
13.权利要求12的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体包括包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2。
14.权利要求13的抗体，其中HVR-H2包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
15.权利要求12的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体包含与SEQID NO:94的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列，其中在SEQID NO:94的位置54上的氨基酸选自Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Met和Leu，并且在SEQ ID NO:94的位置56上的氨基酸选自Thr和Arg。
16.权利要求15的抗体，其中所述VH包含选自SEQ ID NO:87、SEQID NO:88和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
17.权利要求15的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体包含与SEQID NO:90的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列。
18.权利要求17的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体包含SEQID NO:90的VL序列。
19.权利要求18的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体包含SEQID NO:89的VH序列。
20.权利要求11-19中任一项的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体以0.001-0.01μg/ml的EC90中和HCMV。
21.权利要求1-20中任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
22.权利要求1-21中任一项的抗体，其是人、人源化或嵌合抗体。
23.权利要求1-22中任一项的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
24.权利要求1-10和21-22中任一项的抗体，其中所述结合HCMV复合物I的抗体是全长IgG1抗体。
25.权利要求11-22中任一项的抗体，其中所述结合HCMV gH的抗体是全长IgG1抗体。
26.一种组合物，其包含权利要求1-25中任一项的抗体。
27.权利要求26的组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
28.权利要求26或27的组合物，其进一步包含药学可接受的载体。
29.一种分离核酸，其编码权利要求1-25中任一项的抗体。
30.一种宿主细胞，其包含权利要求29的核酸。
31.一种产生抗体的方法，其包括培养权利要求30的宿主细胞，从而使得抗体产生。
32.一种组合物，其包含结合HCMV复合物I的分离抗体和结合HCMV gH的分离抗体。
33.权利要求32的组合物，其中所述组合物中和HCMV感染。
34.权利要求33的组合物，其中所述组合物中和至少50%的HCMV。
35.权利要求32-34中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体和所述结合HCMV gH的抗体以1:1比率存在于所述组合物中。
36.权利要求32-35中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体浓度是至少0.0007μg/ml-0.05μg/ml，并且所述结合HCMVgH的抗体浓度是至少0.001-0.01μg/ml。
37.权利要求32-36中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中：
（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
（b）HVR-H2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
（e）HVR-L2包含选自SEQ ID NOs:10-19的氨基酸序列；和
（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
38.权利要求32-36中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包含三个重链高变区（HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3）和三个轻链高变区（HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3），其中：
（a）HVR-H1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
（b）HVR-H2包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74和SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
（c）HVR-H3包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；
（d）HVR-L1包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；
（e）HVR-L2包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；和
（f）HVR-L3包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
39.权利要求32-38中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包括包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR1；和包含选自SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR2。
40.权利要求32-39中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包括包含选自SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR3；和包含选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变结构域构架FR4。
41.权利要求32-40中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包含与选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列、和与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列。
42.权利要求41的组合物，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
43.权利要求41的组合物，其中所述VL序列包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
44.权利要求41的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包含：（a）包含选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH；和（b）包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL。
45.权利要求44的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的VH序列和SEQ ID NO:49的VL序列。
46.权利要求32-45中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包括包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的HVR-H2，其中在SEQ IDNO:93的位置6上的氨基酸选自Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Met和Leu，并且在SEQ ID NO:93的位置8上的氨基酸选自Thr和Arg。
47.权利要求32-46中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包括包含选自SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HVR-H2。
48.权利要求47的组合物，其中HVR-H2包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
49.权利要求32-46中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列，其中在SEQ ID NO:94的位置54上的氨基酸选自Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Met和Leu，并且在SEQ ID NO:94的位置56上的氨基酸选自Thr和Arg。
50.权利要求49的组合物，其中所述VH包含选自SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
51.权利要求50的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列。
52.权利要求51的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包含SEQID NO:90的VL序列。
53.权利要求52的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体包含SEQID NO:89的VH序列。
54.权利要求32-53中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体和所述结合HCMV gH的抗体是单克隆抗体。
55.权利要求32-54中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体和所述结合HCMV gH的抗体是人、人源化或嵌合抗体。
56.权利要求32-55中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体是抗体片段。
57.权利要求32-55中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体是抗体片段。
58.权利要求32-55和57中任一项的组合物，其中所述结合HCMV复合物I的抗体是全长IgG1抗体。
59.权利要求32-55和56中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体是全长IgG1抗体。
60.权利要求32-59中任一项的组合物，其进一步包含药学可接受的载体。
61.权利要求60的组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
62.权利要求61的组合物，其中所述另外的治疗剂选自更昔洛韦、磷卡萘替、缬更昔洛韦和昔多呋韦。
63.权利要求26-28和32-62中任一项的组合物，用作药物。
64.权利要求26-28和32-62中任一项的组合物，用于抑制、治疗或预防HCMV感染。
65.权利要求26-28和32-62中任一项的组合物，用于抑制、治疗或预防先天性HCMV感染或移植受体中的HCMV感染。
66.权利要求63-65中任一项的组合物，其中所述结合HCMV gH的抗体在与结合HCMV复合物I的抗体分开的组合物中。
67.权利要求26-28和32-62中任一项的组合物在药物制造中的用途。
68.权利要求67的用途，其中所述药物用于治疗、抑制或预防HCMV感染。
69.权利要求68的用途，其中所述药物用于治疗、抑制或预防先天性HCMV感染或移植受体中的HCMV感染。
70.权利要求67-69中任一项的用途，其中所述药物包含在与结合HCMV gH的抗体分开的组合物中的结合HCMV复合物I的抗体。
71.一种治疗、抑制或预防HCMV感染的方法，其包括给患者施用有效量的权利要求26-28和32-62中任一项的组合物。
72.一种治疗、抑制或预防先天性HCMV感染的方法，其包括给怀孕患者施用有效量的权利要求26-28和32-62中任一项的组合物。
73.一种治疗、抑制或预防移植受体中的HCMV感染的方法，其包括给所述移植受体施用有效量的权利要求26-28和32-62中任一项的组合物，以治疗、抑制或预防HCMV感染。
74.权利要求73的方法，其中所述移植受体是HCMV血清阴性的。
75.权利要求74的方法，其中所述移植受体正在接受或已接受了来自HCMV血清阳性供体的器官或组织。
76.权利要求71-75中任一项的方法，其进一步包括给所述患者施用另外的治疗剂。
77.权利要求71-76中任一项的方法，其中包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物与包含结合HCMV gH的抗体的组合物分开施用。
78.权利要求71-77中任一项的方法，其中包含结合HCMV gH的抗体的组合物是与包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物分开的组合物。
79.权利要求77或78的方法，其中包含结合HCMV gH的抗体的组合物与包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物同时施用。
80.权利要求77或78的方法，其中包含结合HCMV gH的抗体的组合物在包含结合HCMV复合物I的抗体的组合物之前或之后施用。
81.权利要求1-25中任一项的抗体或抗体的组合在药物制造中的用途。
82.权利要求81的用途，其中所述药物用于抑制、预防或治疗HCMV感染。
83.权利要求82的用途，其中所述药物用于抑制、预防或治疗先天性HCMV感染或移植受体中的HCMV感染。
84.权利要求1-25中任一项的抗体或抗体组合在治疗、预防或抑制HCMV感染中的用途。
85.权利要求84的用途，其中所述治疗是防止或抑制先天性HCMV感染或移植受体中的HCMV感染。
86.一种治疗、预防或抑制HCMV感染的方法，其包括给患者施用有效量的权利要求1-25中任一项的抗体或抗体的组合。
87.一种治疗、预防或抑制先天性HCMV感染的方法，其包括给怀孕患者施用有效量的权利要求1-25中任一项的抗体或抗体的组合。
88.一种治疗、预防或抑制移植受体中的HCMV感染的方法，其包括给所述移植受体施用有效量的权利要求1-25中任一项的抗体或抗体的组合。
89.权利要求88的方法，其中所述移植受体是HCMV血清阴性的。
90.权利要求89的方法，其中所述移植受体正在接受或已接受了来自HCMV血清阳性供体的器官或组织。
91.权利要求90的方法，其进一步包括给所述患者施用另外的治疗剂。
92.权利要求86-91中任一项的方法，其中所述结合HCMV复合物I的抗体与所述结合HCMV gH的抗体分开施用。
93.权利要求92的方法，其中所述结合HCMV gH的抗体与所述结合HCMV复合物I的抗体同时施用。
94.权利要求92的方法，其中所述结合HCMV gH的抗体在所述结合HCMV复合物I的抗体之前或之后施用。
95.一种分离抗体，其与权利要求1-25中任一项的抗体结合相同的表位。
96.一种结合HCMV gH表位的分离抗体，其中所述表位包含相应于选自以下的氨基酸的氨基酸：
（i）在SEQ ID NO:1的位置168上的色氨酸；
（ii）在SEQ ID NO:1的位置446上的天冬氨酸；
（iii）在SEQ ID NO:1的位置171上的脯氨酸；和
（iv）其组合。
97.权利要求96的抗体，其与包含选自下述的氨基酸的HCMV gH表位结合：
（i）在SEQ ID NO:1的位置168上的色氨酸；
（ii）在SEQ ID NO:1的位置446上的天冬氨酸；
（iii）在SEQ ID NO:1的位置171上的脯氨酸；和
（iv）其组合。
98.一种结合HCMV复合物I表位的分离抗体，其中所述表位包含相应于选自下述的氨基酸的氨基酸：
（i）在SEQ ID NO:203的位置47上的谷氨酰胺；
（ii）在SEQ ID NO:203的位置51上的赖氨酸；
（iii）在SEQ ID NO:203的位置46上的天冬氨酸；和
（iv）其组合。
99.权利要求98的抗体，其包含选自下述的氨基酸：
（i）在SEQ ID NO:203的位置47上的谷氨酰胺；
（ii）在SEQ ID NO:203的位置51上的赖氨酸；
（iii）在SEQ ID NO:203的位置46上的天冬氨酸；和
（iv）其组合。
100.一种与HCMV复合物I的多肽结合的分离抗体，所述多肽包含氨基酸序列SRALPDQTRYKYVEQLVDLT LNYHYDAS（SEQ IDNO:194）。
101.一种在患者中减少或防止HCMV病毒滴度增加的方法，其包括给所述患者施用有效量的权利要求1-25中任一项的抗体或抗体的组合。
102.一种在患者中减少或防止HCMV病毒滴度增加的方法，其包括给所述患者施用有效量的权利要求26-28和32-62中任一项的组合物。
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