ES2915378T3 - Procedimientos para detectar y cuantificar una proteína de célula huésped en líneas celulares - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de selección de una línea de células huésped óptima de un grupo de dos o más líneas de células huésped, en el que la línea de células huésped óptima expresa una baja cantidad de PLBL2 de hámster, que comprende: (i) obtener una muestra de línea de células huésped de cada una de las dos o más líneas de células huésped; (ii) calcular la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped de acuerdo con un procedimiento para detectar la proteína fosfolipasa de tipo B 2 (PLBL2) de hámster en cada una de las muestras de línea de células huésped, comprendiendo el procedimiento: (a) poner en contacto un primer anticuerpo de captura que se une a PLBL2 de hámster con la muestra, generando, de este modo, un material de combinación muestra-anticuerpo de captura; (b) poner en contacto un segundo anticuerpo de detección que se une a PLBL2 de hámster con el material de combinación muestra-anticuerpo de captura; y (c) detectar el segundo anticuerpo unido al material de combinación muestra-anticuerpo de captura; (d) cuantificar el nivel del segundo anticuerpo de detección unido usando una curva de valoración patrón, (e) calcular una cantidad de PLBL2 de hámster presente en la muestra en base al nivel del segundo anticuerpo de detección unido, (iii) comparar la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped con la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped del grupo; (iv) identificar la muestra de línea de células huésped que tiene la cantidad más baja de PLBL2 en comparación con cada una de las muestras de línea de células huésped del grupo, generando, de este modo, una línea de células huésped identificada del grupo que tiene la cantidad más baja de PLBL2; y (v) seleccionar la línea de células huésped identificada de (iv) como la línea de células huésped óptima, en el que el anticuerpo monoclonal de captura que se une a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 20, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22, y/o en el que el anticuerpo monoclonal de detección que se une a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 10, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para detectar y cuantificar una proteína de célula huésped en líneas celulares

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud de EE. UU. provisional n.° 61/991.228, presentada el 9 de mayo de 2014, y la solicitud de EE. UU. provisional n.° 61/877.503, presentada el 13 de septiembre de 2013.

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado por medio de EFS-Web. Dicha copia ASCII, creada el 28 de agosto de 2014, se denomina P5701R1WO PCT SequenceListing.txt y tiene un tamaño de 28.965 bytes.

Campo

Se proporcionan anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster. También se proporcionan procedimientos para detectar y cuantificar la fosfolipasa de tipo B 2 de hámster, por ejemplo, en preparaciones de polipéptidos recombinantes, así como kits para llevar a cabo dichos procedimientos. También se proporcionan procedimientos de cribado o selección de líneas de células huésped o líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante que expresan bajos niveles de fosfolipasa de tipo B 2 de hámster.

Antecedentes

Para que las proteínas biofarmacéuticas recombinantes sean aceptables para su administración a pacientes humanos, es importante que las impurezas residuales resultantes del procedimiento de fabricación y purificación se retiren del producto biológico final. Estos componentes del procedimiento incluyen proteínas de medio de cultivo, ligandos de afinidad por inmunoglobulinas, virus, endotoxina, ADN y proteínas de célula huésped. Estas impurezas de célula huésped incluyen proteínas de célula huésped (HCP) específicas de procedimiento, que son impurezas/contaminantes relacionados con el procedimiento en los productos biológicos derivados de la tecnología de ADN recombinante. Aunque las HCP están típicamente presentes en la sustancia farmacéutica final en pequeñas cantidades (en partes por millón o nanogramos por miligramo de la proteína recombinante pretendida), se reconoce que las HCP son indeseables y sus cantidades se deben minimizar. Por ejemplo, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE. UU. requiere que los productos biofarmacéuticos pretendidos para uso en seres humanos in vivo estén lo más libres posible de impurezas externas, y requiere pruebas para la detección y cuantificación de contaminantes/impurezas potenciales, tales como HCP. Además, la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) proporciona pautas sobre procedimientos de prueba y criterios de aceptación para productos biotecnológicos/biológicos. Las pautas sugieren que para las HCP se utilice un inmunoanálisis sensible que pueda detectar un amplio intervalo de impurezas de proteína. Aunque los autores y otros han desarrollado ensayos y reactivos para detectar inmunoglobulinas, a Dn , endotoxinas, virus y HCP totales, por ejemplo, proteínas de ovario de hámster chino (CHOP) totales (revisado en Chen AB, J Biotechnol in Healthcare 3:70-80 (1996); Krawitz et al., Proteomics 6:94-110 (2006)), actualmente no existe ningún reactivo comercial o procedimiento analítico de suficiente especificidad y sensibilidad para la detección y cuantificación de HCP específicas de procedimiento únicas en preparaciones de proteínas recombinantes, tales como productos de inmunoglobulina, incluyendo las que se purifican conjuntamente con preparaciones de proteínas recombinantes.

En determinados casos, se puede observar una significativa dependencia de la dilución cuando se usan inmunoanálisis para la detección y cuantificación de las HCP totales, por ejemplo, CHOP total, lo que sugiere que dichos ensayos no son procedimientos de prueba apropiados para la cuantificación exacta de las impurezas de HCP en un producto particular. La investigación de dicha dependencia de la dilución es importante para posibilitar el desarrollo de procedimientos de prueba más apropiados. En determinados casos, la dependencia de la dilución se puede deber a un "exceso de antígeno" en el que una especie de HCP única presente en exceso de los anticuerpos disponibles explica los efectos observados sobre el funcionamiento del ensayo (Anicetti et al., J. Immunol. Methods 91:213-224 (1986); Chen AB, J Biotechnol in Healthcare 3:70-80 (1996), Wang X, et al., Biotechnol Bioeng. 103(3):446-58 (2009)).

Se pueden usar procedimientos analíticos sensibles, tales como CL-EM/EM, para identificar y cuantificar especies de HCP únicas presentes en exceso de los anticuerpos disponibles. Tras la identificación de dichas especies de HCP únicas, se necesitan desarrollar ensayos alternativos de suficiente sensibilidad y especificidad y que se puedan validar para su aprobación por las autoridades reguladoras y que se puedan usar como una plataforma en múltiples productos de proteínas recombinantes.

En determinadas de las presentes preparaciones de proteínas recombinantes producidas en células CHO, se identificó una enzima, fosfolipasa de tipo B 2, como una especie de CHOP única presente en exceso de los anticuerpos disponibles en un ensayo ELISA para CHOP total. Como se usa en el presente documento, "PLB2" y "PLBL2" y "PLBD2" se usan de manera intercambiable y se refieren a la enzima "fosfolipasa de tipo B 2" o a su sinónimo, "dominio de fosfolipasa de tipo B 2". Determinadas publicaciones científicas sobre PLBL2 incluyen Lakomek, K. et al., BMC Structural Biology 9:56 (2009); Deuschi, et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006). PLBL2 se sintetiza como una preproenzima con un PM original de aproximadamente 66.000. Existe una secuencia líder inicial que se retira y se añaden 6 grupos manosa-6-fosfato (M-6-P) potenciales durante la modificación postraduccional. M-6-P es una modificación dirigida que dirige esta enzima al lisosoma por medio del receptor de M-6-P. PLBL2 contiene 6 cisteínas, teniendo dos de ellas sulfhidrilos libres y formando cuatro, enlaces disulfuro. En entornos ácidos, PLBL2 se recorta además en los fragmentos N y C terminales que tienen PM de 32.000 y 45.000, respectivamente. Por analogía con otras enzimas lisosómicas, esta escisión es una etapa de activación, lo que permite el acceso del sustrato al sitio activo. Cusabio describe un kit de ELISA para la determinación de la concentración de PLBD2 (CUSABIO, 1 de enero de 2012 (01-01-2012), páginas 1-14).

Existe aproximadamente un 80 % de homología de secuencia de aminoácidos de PLBL2 entre las formas de hámster y humana de la enzima. Se cree que la actividad enzimática se basa en escindir cualquier cadena de ácido graso de los fosfolípidos que forman las membranas celulares. Existen otras fosfolipasas con diferentes especificidades de escisión de sustrato. Existen actividades enzimáticas similares en microorganismos, donde, a menudo, son un factor de virulencia. Aunque los microorganismos tienen una actividad enzimática similar, la proteína que genera esta actividad es diferente, y existe una baja homología de secuencia entre las enzimas PLBL2 microbianas y de mamífero. Las fosfolipasas producen ácidos grasos libres (FFA) como un producto de la hidrólisis del sustrato. Los ácidos grasos libres son por sí mismos un potencial factor de señalización inmunitaria. La deshidrogenación convierte los FFA en ácido araquidónico, que potencialmente participa en las cascadas de inflamación que implican a los eicosanoides.

Habiendo identificado PLBL2 como una HCP única (CHOP) en determinadas preparaciones de proteínas recombinantes, sería muy ventajoso y deseable tener reactivos, procedimientos y kits para la determinación específica, sensible y cuantitativa de los niveles de PLBL2 en líneas celulares o en múltiples productos y en diversas fases de purificación. Dichos reactivos, procedimientos y kits son, en particular, necesarios cuando no existe ningún ensayo de suficiente consistencia, sensibilidad, especificidad o eficacia. La invención descrita en el presente documento cumple determinadas necesidades descritas anteriormente y proporciona otros beneficios.

Sumario

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La invención se basa, al menos en parte, en anticuerpos anti-fosfolipasa de tipo B 2 (PLBL2) de hámster y el uso de dichos anticuerpos en procedimientos de inmunoanálisis para la detección y cuantificación de la proteína PLBL2 de hámster, por ejemplo, en muestras obtenidas de preparaciones de polipéptidos recombinantes o líneas de células huésped.

En consecuencia, en un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster. En determinados modos de realización, el anticuerpo es monoclonal. En determinados modos de realización, el anticuerpo demuestra unión específica a PLBL2 de hámster. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 20, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 20, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 14. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No .: 19. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 14 y una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 19. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 13 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 18. En determinados modos de realización, el anticuerpo es 19C10.

En otro aspecto, se proporciona otro anticuerpo que se une a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster. En determinados modos de realización, el anticuerpo es monoclonal. En determinados modos de realización, el anticuerpo demuestra unión específica a PLBL2 de hámster. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 10, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO.: 10, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4 y una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9. En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 8. En algunos modos de realización, el anticuerpo es 15G11.

Todavía en otro aspecto, se proporcionan anticuerpos policlonales que se unen a la proteína fosfolipasa de tipo B 2 de hámster. En determinados modos de realización, el anticuerpo policlonal es de conejo.

Aún en otro aspecto, se proporciona un procedimiento de inmunoanálisis para detectar la proteína fosfolipasa de tipo B 2 (PLBL2) de hámster. En determinados modos de realización, se obtiene una muestra de una preparación de polipéptidos recombinantes o una línea de células huésped. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende (a) poner en contacto un primer anticuerpo de captura que se une a PLBL2 de hámster con la muestra, generando, de este modo, un material de combinación muestra-anticuerpo de captura; (b) poner en contacto un segundo anticuerpo de detección que se une a PLBL2 de hámster con el material de combinación muestra-anticuerpo de captura; y (c) detectar el segundo anticuerpo unido al material de combinación muestra-anticuerpo de captura. En algunos modos de realización, el anticuerpo de captura no compite por su unión con el anticuerpo de detección. En algunos modos de realización, el anticuerpo de captura se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de detección. En determinados modos de realización, el nivel del segundo anticuerpo de detección unido se cuantifica usando una curva de valoración patrón. En determinados modos de realización, una cantidad de PLBL2 de hámster presente en la muestra se calcula en base al nivel del segundo anticuerpo de detección unido. En algunos modos de realización, el inmunoanálisis es un ensayo electroquimioluminiscente (EQL). En algunos modos de realización, el inmunoanálisis es un ensayo no competitivo. En algunos modos de realización, el ensayo no competitivo es un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una región variable que comprende una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 20, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO.: 20, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 14. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 19. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 14 y una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 19. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 13 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 18. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura es 19C10. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura es policlonal. En determinados modos de realización, el anticuerpo de captura policlonal es de conejo. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una región variable que comprende una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 10, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 10, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4 y una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 8. En algunos modos de realización, el anticuerpo de detección es 15G11. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección es policlonal. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección policlonal es de conejo. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección se conjuga a biotina. En determinados modos de realización, el anticuerpo de detección se conjuga a peroxidasa de rábano picante.

En determinados modos de realización de los procedimientos anteriores, la preparación de polipéptidos recombinantes o la línea de células huésped se obtiene de una línea de células de ovario de hámster chino (CHO). En determinados modos de realización, la preparación de polipéptidos recombinantes es caldo de cultivo celular obtenido (HCCF). En determinados modos de realización, la preparación de polipéptidos recombinantes se ha sometido a una o más etapas de purificación cromatográfica. En determinados modos de realización, la preparación de polipéptidos recombinantes es el producto purificado final. En algunos modos de realización, el producto purificado final es una sustancia farmacéutica.

En determinados otros modos de realización de los procedimientos anteriores, el polipéptido recombinante en la preparación de polipéptidos recombinantes es un anticuerpo o una inmunoadhesina. En determinados modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un semianticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido recombinante es IgG. En algunos modos de realización, el polipéptido recombinante se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunos modos de realización, el polipéptido recombinante es IgG1. En algunos modos de realización, el polipéptido recombinante es IgG4.

Aún en otro aspecto, se proporcionan kits de inmunoanálisis para la detección de PLBL2 de hámster. En determinados modos de realización, el kit comprende un anticuerpo de captura de acuerdo con cualquiera de los anticuerpos de captura descritos anteriormente y un anticuerpo de detección de acuerdo con cualquiera de los anticuerpos de detección descritos anteriormente. En algunos modos de realización, el inmunoanálisis es un inmunoanálisis EQL. En algunos modos de realización, el inmunoanálisis es un inmunoanálisis ELISA.

En un aspecto, se proporcionan procedimientos de cribado de una línea de células huésped para determinar la expresión de PLBL2 de hámster que comprenden detectar PLBL2 en una muestra obtenida de la línea de células huésped. En determinados modos de realización, PLBL2 se detecta en la muestra usando cualquiera de los procedimientos de inmunoanálisis para la detección de PLBL2 de hámster descritos anteriormente. En algunos modos de realización, la muestra es caldo de cultivo celular obtenido. En algunos modos de realización, la muestra es caldo de cultivo celular completo. En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden además calcular la cantidad de PLBL2 de hámster en la muestra usando los procedimientos de inmunoanálisis y cálculo descritos anteriormente.

En otro aspecto, se proporcionan procedimientos de selección de una línea de células huésped óptima que expresa una baja cantidad de PLBL2 de hámster de un grupo de dos o más líneas de células huésped. En algunos modos de realización, una línea de células huésped óptima se selecciona de un grupo de tres o más líneas de células huésped, o de un grupo de cinco o más líneas de células huésped, o de un grupo de 10 o más líneas de células huésped, o de un grupo de 20 o más líneas de células huésped. En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden: (i) obtener una muestra de línea de células huésped de cada una de las dos o más líneas de células huésped; (ii) calcular la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped usando los procedimientos de inmunoanálisis y cálculo descritos anteriormente; (iii) comparar la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped con la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped del grupo; (iv) identificar la muestra de línea de células huésped que tiene la cantidad más baja de PLBL2 en comparación con cada una de las muestras de línea de células huésped del grupo, generando, de este modo, una línea de células huésped identificada del grupo que tiene la cantidad más baja de PLBL2; y seleccionar la línea de células huésped identificada de (iv) como la línea de células huésped óptima. En algunos modos de realización, cada una de las dos o más líneas de células huésped son líneas de células CHO. En algunos modos de realización, cada una de las muestras de línea de células huésped es caldo de cultivo celular obtenido. En algunos modos de realización, cada una de las muestras de línea de células huésped es caldo de cultivo celular completo.

Todavía en otro aspecto, se proporcionan procedimientos de cribado de una línea celular que expresa el polipéptido recombinante para determinar la expresión de PLBL2 de hámster, en los que la línea celular que expresa el polipéptido recombinante es una línea celular de producto, que comprende detectar PLBL2 en una muestra obtenida de la línea celular de producto. En determinados modos de realización, PLBL2 se detecta en la muestra usando cualquiera de los procedimientos de inmunoanálisis para la detección de PLBL2 de hámster descritos anteriormente. En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden además usar los procedimientos de inmunoanálisis y cálculo descritos anteriormente. En algunos modos de realización, los procedimientos comprenden además el cribado para determinar la expresión del producto detectando el producto y cuantificando una cantidad de producto en la muestra. En algunos modos de realización, la detección de producto y la cuantificación de la cantidad de producto comprende un procedimiento espectrofotométrico o un procedimiento de cromatografía de afinidad.

Aún en todavía otro aspecto, los procedimientos de selección de una línea celular que expresa el polipéptido recombinante óptima que expresa una baja cantidad de PLBL2 de hámster y una alta cantidad de producto de un grupo de dos o más líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante, donde se proporcionan cada una de las dos o más líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante como líneas celulares de producto que expresan el mismo producto. En algunos modos de realización, una línea celular que expresa el polipéptido recombinante óptima se selecciona de un grupo de tres o más, o de un grupo de cinco o más, o de un grupo de 10 o más, o de un grupo de 20 o más líneas, o de un grupo de 40 o más líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante. En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden: (i) obtener una muestra de línea celular de producto de cada una de las dos o más líneas celulares de producto; (ii) calcular la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea celular de producto usando los procedimientos de inmunoanálisis y cálculo descritos anteriormente; (iii) detectar el producto y cuantificar una cantidad de producto en cada una de las muestras de línea celular de producto; (iv) comparar la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea celular de producto con la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea celular de producto del grupo; (v) comparar la cantidad de producto en cada una de las muestras de línea celular de producto con la cantidad de producto en cada una de las muestras de línea celular de producto del grupo; (vi) identificar la muestra de línea celular de producto que tiene la cantidad más baja de PLBL2 y la cantidad más alta de producto en comparación con cada una de las muestras de línea celular de producto del grupo, generando, de este modo, una línea celular de producto identificada del grupo que tiene la cantidad más baja de PLBL2 y la cantidad más alta de producto; y seleccionar la línea celular de producto identificada de (vi) como la línea celular de producto óptima. En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden: (i) obtener una muestra de línea celular de producto de cada una de las dos o más líneas celulares de producto; (ii) calcular la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea celular de producto usando los procedimientos de inmunoanálisis y cálculo descritos anteriormente; (iii) detectar el producto y cuantificar una cantidad de producto en cada una de las muestras de línea celular de producto; (iv) calcular una proporción de la cantidad de PLBL2 con respecto a la cantidad de producto para cada una de las muestras de línea celular de producto; (v) comparar la proporción calculada para cada una de las muestras de línea celular de producto con respecto a cada una de las muestras de línea celular de producto del grupo; (vi) identificar la muestra de línea celular de producto que tiene la proporción más baja del grupo, generando, de este modo, una línea celular de producto identificada del grupo que tiene la cantidad más baja de PLBL2 y la cantidad más alta de producto; y seleccionar la línea celular de producto identificada de (vi) como la línea celular de producto óptima. En algunos modos de realización, cada una de las dos o más líneas celulares de producto son líneas de células CHO. En algunos modos de realización, cada una de las muestras de línea celular de producto es caldo de cultivo celular obtenido.

En determinados otros modos de realización de los procedimientos anteriores, el producto expresado por la línea celular que expresa la proteína recombinante es un anticuerpo o una inmunoadhesina. En determinados modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un semianticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, el producto es IgG. En algunos modos de realización, el producto se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunos modos de realización, el producto es IgG1. En algunos modos de realización, el producto es IgG4.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra curvas patrón representativas para kits de ELISA para PLBL2 disponibles comercialmente como se describe en el ejemplo 1. (A) curva patrón generada usando el kit de ELISA de USCN; (B) curva patrón generada usando el kit de ELISA de CUSABIO.

La figura 2 muestra una curva patrón representativa para el ensayo ELISA para PLBL2 monoclonal de ratón como se describe en el ejemplo 3.

La figura 3 muestra curvas patrón representativas para cada uno de los péptidos PLBL2 supervisados por CL-EM/EM como se describe en el ejemplo 4. La linealidad (R) de cada una de las curvas patrón es > 0,99.

La figura 4 muestra la proporción de PLBL2 (en ppm) en diferentes muestras de HCCF con mAb como se describe en el ejemplo 4. Las determinaciones replicadas de las mismas determinaciones para mAb se indican por R1, R2, R3.

La figura 5 muestra el aclaramiento de PLBL2 como se mide en muestras de mezclas en curso de mAb G como se describe en el ejemplo 4.

La figura 6 muestra una curva patrón representativa para el ensayo ELISA para PLBL2 policlonal de conejo como se describe en el ejemplo 5.

La figura 7 muestra el aclaramiento de PLBL2 como se mide en muestras de mezclas en curso de mAb G como se describe en el ejemplo 6.

La figura 8 muestra los niveles de CHOP total (g/l), PLBL2 (mg/l) y concentración de producto (g/l) en líneas de células CHO recombinantes que expresan (A) producto J, (B) producto K, (C) producto L, (D) producto M, (E) producto N y (F) producto O como se describe en el ejemplo 7; los números de líneas celulares clonales se indican a lo largo del eje horizontal. Todas las mediciones se tomaron usando muestras de HCCF del día 14. Las barras de error representan las mediciones máximas y mínimas obtenidas de cultivos de biorreactor de 2 l por duplicado.

La figura 9 muestra la proporción de PLBL2 (mg/l) con respecto a la concentración de producto (g/l) en líneas de células CHO recombinantes que expresan (A) producto J, (B) producto K, (C) producto L, (D) producto M, (E) producto N y (F) producto O como se describe en el ejemplo 7; los números de líneas celulares clonales se indican a lo largo del eje horizontal. La proporción se informa como partes por millón (ppm), lo que es equivalente a ng de PLBL2 por mg de producto. Las barras de error representan mediciones máximas y mínimas obtenidas de HCCF del día 14 de cultivos de biorreactor de 2 l por duplicado.

La figura 10 muestra la proporción PLBL2/producto (ppm) en cultivos en matraz de agitación individualizado de 48 líneas celulares que expresan el producto P como se describe en el ejemplo 7; los números de líneas celulares clonales se indican a lo largo del eje horizontal. La proporción se informa como partes por millón (ppm), lo que es equivalente a ng de PLBL2 por mg de producto. Todas las mediciones se obtuvieron usando muestras de HCCF del día 14.

La figura 11 muestra las concentraciones de PLBL2 (mg/l), CHOP total (g/l) y producto (g/l) en cultivos de 48 líneas celulares que expresan el producto P como se describe en el ejemplo 7. Las correlaciones entre estas tres mediciones se evaluaron representando (A) la concentración de PLBL2 frente a la de producto, (B) la concentración de CHOP total frente a la de producto y (C) la concentración de PLBL2 frente a la de CHOP total. Todas las mediciones se obtuvieron usando muestras de HCCF del día 14. Cada línea celular se cultivó en un matraz de agitación individualizado. Las ecuaciones proporcionan la regresión lineal y el coeficiente de determinación (R2).

La figura 12 muestra las concentraciones de PLBL2 en cultivos de biorreactor de 2 l de 3 líneas de células huésped CHO (huésped 1, huésped 2 y huésped 3) que no expresan ningún gen de producto como se describe en el ejemplo 7. Los niveles de PLBL2 se midieron tanto en muestras de (A) HCCF como (B) WCCF tomadas de estas determinaciones en blanco.

La figura 13 muestra las concentraciones de PLBL2 en cultivos de biorreactor de 2 l de 3 líneas de células huésped CHO (huésped 1, huésped 2 y huésped 3) en función del hematocrito viable integrado (IVPCV) volumétrico como se describe en el ejemplo 7. Los niveles de PLBL2 se midieron tanto en muestras de (A) HCCF como (B) WCCF tomadas de estas determinaciones en blanco. Las ecuaciones proporcionan la regresión lineal y el coeficiente de determinación (R2). La pendiente de la regresión lineal proporciona una estimación de la productividad de PLBL2 específica de célula por volumen de células viables unitario por día.

Descripción detallada

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2.a ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4.a ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Determinadas definiciones

Para los propósitos de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que cualquier definición expuesta a continuación entre en conflicto con cualquier documento, prevalecerá la definición expuesta a continuación.

Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "uno/a", "un" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una proteína" o a un "anticuerpo" incluye una pluralidad de proteínas o anticuerpos, respectivamente; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células y similares.

El término "detección" se usa en el presente documento en el sentido más amplio para incluir mediciones tanto cualitativas como cuantitativas de una molécula diana. La detección incluye identificar la mera presencia de la molécula diana en una muestra, así como determinar si la molécula diana está presente en la muestra a niveles detectables.

Una "muestra" se refiere a una pequeña porción de una cantidad más grande de material. En general, las pruebas de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento se realizan en una muestra. La muestra típicamente se obtiene de una preparación de polipéptidos recombinantes obtenida, por ejemplo, de líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante cultivadas, también denominadas en el presente documento "líneas celulares de producto", o de células huésped cultivadas. Como se usa en el presente documento, las "células huésped" no contienen genes para la expresión de polipéptidos recombinantes de interés o productos. Se puede obtener una muestra de, por ejemplo, pero sin limitarse a, caldo de cultivo celular obtenido, de una mezcla en curso en una determinada etapa en un procedimiento de purificación, o del producto purificado final.

Un "anticuerpo de captura" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a una molécula diana en una muestra. En determinadas condiciones, el anticuerpo de captura forma un complejo con la molécula diana de modo que el complejo anticuerpo-molécula diana se pueda separar del resto de la muestra. En determinados modos de realización, dicha separación puede incluir eliminar por lavado sustancias o material en la muestra que no se unen al anticuerpo de captura. En determinados modos de realización, un anticuerpo de captura se puede fijar a una superficie de soporte sólida, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, una placa o una microesfera.

Un "anticuerpo de detección" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a una molécula diana en una muestra o en un material de combinación muestra-anticuerpo de captura. En determinadas condiciones, el anticuerpo de detección forma un complejo con la molécula diana o con un complejo molécula diana-anticuerpo de captura. Un anticuerpo de detección se puede detectar directamente a través de un marcador, que se puede amplificar, o bien indirectamente, por ejemplo, a través del uso de otro anticuerpo que se marca y que se une al anticuerpo de detección. Para el marcado directo, el anticuerpo de detección se conjuga típicamente a un resto que sea detectable por algún medio, por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, biotina o rutenio.

Los términos "marcador" o "marcador detectable" se refieren a cualquier grupo o resto químico que se pueda enlazar a una sustancia que se vaya a detectar o cuantificar, por ejemplo, un anticuerpo. Típicamente, un marcador es un marcador detectable que es adecuado para la detección o cuantificación sensible de una sustancia. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, marcadores luminiscentes, por ejemplo, marcadores fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes y electroquimioluminiscentes, marcadores radioactivos, enzimas, partículas, sustancias magnéticas, especies electroactivas y similares. De forma alternativa, un marcador detectable puede señalar su presencia participando en reacciones de unión específica. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen haptenos, anticuerpos, biotina, estreptavidina, marca de his, ácido nitrilotriacético, glutatión S-transferasa, glutatión y similares.

El término "medios de detección" se refiere a un resto o técnica usada para detectar la presencia del anticuerpo detectable a través de la indicación de una señal que a continuación se lee en un ensayo. Típicamente, los medios de detección emplean reactivos que amplifican un marcador inmovilizado, tal como el marcador capturado sobre una placa de microvaloración, por ejemplo, avidina o estreptavidina-HRP.

"Fotoluminiscencia" se refiere a un procedimiento con el que un material se vuelve luminiscente posteriormente a la absorción de luz por ese material (denominada de forma alternativa radiación electromagnética). La fluorescencia y la fosforescencia son dos tipos diferentes de fotoluminiscencia. Los procedimientos "quimioluminiscentes" implican la creación de especies luminiscentes por una reacción química. "Electroquimioluminiscencia" o "EQL" es un procedimiento con el que una especie, por ejemplo, un anticuerpo, se vuelve luminiscente tras la exposición de esa especie a energía electroquímica en un entorno químico circundante apropiado.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y se puede interrumpir por moléculas distintas a aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácido que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los términos "polipéptido" y "proteína" como se usa en el presente documento engloban específicamente anticuerpos.

Polipéptido "purificado" (por ejemplo, anticuerpo o inmunoadhesina) significa que el polipéptido se ha incrementado en pureza, de modo que exista en una forma que sea más pura de la que existe en su entorno natural y/o cuando inicialmente se sintetiza y/o amplifica en condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no significa necesariamente pureza absoluta.

Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo, una proteína de célula huésped, es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como reactivo de ensayo, por ejemplo, como un anticuerpo de captura o como un anticuerpo de detección. Típicamente, un anticuerpo de este tipo no reacciona de forma cruzada significativamente con otros polipéptidos.

Con respecto a la unión de un polipéptido a una molécula diana, el término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específica para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular significa que la unión es diferente de forma mensurable de una interacción no específica. Se puede medir la unión específica, por ejemplo, determinando la unión de una molécula diana en comparación con la unión de una molécula de control, que, en general, es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión.

"Afinidad" se refiere a la intensidad de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar, en general, por la constante de disociación (Kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento.

Los términos "anticuerpo anti-PLBL2" y "un anticuerpo que se une a PLBL2" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a PLBL2, por ejemplo, PLBL2 de hámster, con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente para seleccionar como diana PLBL2, por ejemplo, como un agente en los ensayos descritos en el presente documento. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-PLBL2 a una proteína distinta de PLBL2 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a PLBL2 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a PLBL2 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |j M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

Se usa el término "anticuerpo" en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina naturales que tienen estructuras variables, todas basadas en el plegamiento de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras" que se unen por enlaces disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y ligera comprende por sí misma una región "constante" (C) y una región "variable" (V). Las regiones V determinan la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo, y las regiones C proporcionan soporte y función estructurales en las interacciones no específicas de antígeno con efectores inmunitarios. La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo es la capacidad de un anticuerpo de unirse específicamente a un antígeno particular.

La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo está determinada por las características estructurales de la región variable o V. El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

El término "región hipervariable", cuando se usa en el presente documento, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable puede comprender residuos de aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el V^l, y alrededor de aproximadamente 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el V^h (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el V^l, y 26-32 (H1), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en el V^h (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Los residuos de la "región estructural" o "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable, como se define en el presente documento.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')² y Fv; diacuerpos; diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.641.870, ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos de un solo brazo, anticuerpos de dominio variable único, minicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenario; anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo,incluyendo pero sin limitarse a, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv o (di,tri)-scFv en tándem); y captadores biespecíficos de linfocitos T (BiTE).

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, en el que su nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')² que tiene dos sitios de unión a antígeno y todavía puede reticular el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y de uno de la cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V^h-V^l. Conjuntamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de unión.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes tiene(n) al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')² se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas de bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Se pueden asignar las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar anticuerpos a clases diferentes. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, 5, £, y y |J, respectivamente. Son bien conocidas las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios V^h y V^l del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En algunos modos de realización, el polipéptido de Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V^h y V^l que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.

269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (V^h) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptídica (V^h-V^l). Usando un conector que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Se describen más completamente diacuerpos, por ejemplo, en el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno que tiene especificidad poliepitópica (es decir, se puede unir específicamente a dos o más epítopos diferentes en una molécula biológica o se puede unir específicamente a epítopos en dos o más moléculas biológicas diferentes). En algunos modos de realización, un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo multiespecífico (tal como un anticuerpo biespecífico) comprende dos unidades VH/VL, en el que una primera unidad VH/Vl se une específicamente a un primer epítopo y una segunda unidad VH/VL se une específicamente a un segundo epítopo, en el que cada unidad VH/v L comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (V^l). Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalente o no covalentemente. Una unidad VH/VL que además comprende al menos una porción de una región constante de cadena pesada y/o al menos una porción de una región constante de cadena ligera también se puede denominar "hemímero" o "semianticuerpo". "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) diana(s) o diferente(s). "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solo a un epítopo. De acuerdo con un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |jM a 0,001 pM, de 3 |jM a 0,001 pM, de 1 |jM a 0,001 pM, de 0,5 |jM a 0,001 pM o de 0,1 |jM a 0,001 pM.

Un "anticuerpo biespecífico" es un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno que se puede unir específicamente a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o se puede unir específicamente a epítopos en dos moléculas biológicas diferentes. Un anticuerpo biespecífico también se puede denominar en el presente documento como que tiene "doble especificidad" o como "doblemente específico".

La expresión "anticuerpos de dominio único" (sdAb) o "anticuerpos de dominio variable único (SVD)" se refiere, en general, a anticuerpos en los que un dominio variable único (VH o VL) puede conferir unión a antígeno. En otras palabras, el dominio variable único no necesita interactuar con otro dominio variable para reconocer el antígeno diana. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen los derivados de camélidos (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburones nodriza) y los derivados de procedimientos recombinantes de anticuerpos humanos y de ratón (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; documento WO 2005/035572; documento WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; documento WO 00/29004; documento WO 02/051870).

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades despreciables. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en tanto que no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento por el procedimiento de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature256:495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de colecciones de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, tal como babuino, macaco de la India o macaco cangrejero) y secuencias de la región constante humanas (patente de EE. UU. n.° 5.693.780).

Para los propósitos en el presente documento, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros, así como una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Los "anticuerpos naturales" normalmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V^l) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

Un "anticuerpo no marcado" es un anticuerpo (como se define en el presente documento) que no está conjugado a una molécula heteróloga, tal como un resto o marcador de detección.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la que se criba o selecciona en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Los términos "contaminantes" e "impurezas" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a materiales o sustancias que son diferentes del producto de polipéptido deseado. El contaminante incluye, sin limitación: materiales de célula huésped, tales como CHOP; proteína A lixiviada; ácido nucleico; una variante, fragmento, añadido o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante vírico; componente de medio de cultivo celular, etc. En algunos ejemplos, el contaminante puede ser una proteína de célula huésped (HCP) de, por ejemplo, pero sin limitarse a, una célula bacteriana, tal como una célula de E. coli, una célula de insecto, una célula procariota, una célula eucariota, una célula de levadura, una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino, una célula aviar, una célula fúngica.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PLBL2" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. En determinados modos de realización, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derecho de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. Se debe compilar el programa ALIGN-2 para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Se ajustan todos los parámetros de comparación de secuencias por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature, 352:624-628 (1991).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

La referencia a "aproximadamente" de un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "uno/a", "o" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invención descrita en el presente documento incluyen "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en" aspectos y variaciones.

Procedimientos de ensayo

En el presente documento se proporcionan procedimientos de inmunoanálisis para la detección y cuantificación de PLBL2 de hámster. Dichos procedimientos se pueden usar para la detección y cuantificación de PLBL2 de hámster en preparaciones de polipéptidos recombinantes producidas en células huésped, por ejemplo, células de ovario de hámster chino. En algunos modos de realización, dichos procedimientos usan anticuerpos anti-PLBL2 de captura y detección descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, los anticuerpos se usan en cualquier procedimiento de inmunoanálisis conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, ensayo no competitivo, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayo electroquímico (EQL), inmunoanálisis magnético. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de la preparación de polipéptidos recombinantes con un anticuerpo anti-PLBL2 como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-PLBL2 a PLBL2 de hámster, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-PLBL2 y PLBL2 de hámster.

En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos anti-PLBL2 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 de captura se inmoviliza en una fase sólida. En algunos modos de realización, la fase sólida usada para la inmovilización es cualquier soporte o vehículo inerte que sea esencialmente insoluble en agua y útil en ensayos inmunométricos, incluyendo soportes en forma, por ejemplo, de superficies, partículas, matrices porosas, microesferas y similares. Los ejemplos de soportes comúnmente usados incluyen láminas pequeñas, SEPHADEX®, geles, poli(cloruro de vinilo), microesferas de plástico y placas de ensayo o tubos de ensayo fabricados con polietileno, polipropileno, poliestireno y similares, incluyendo placas de microvaloración de 96 pocillos, así como materiales particulados, tales como papel de filtro, agarosa, dextrano reticulado y otros polisacáridos. De forma alternativa, se emplean adecuadamente matrices insolubles en agua reactivas, tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las pat. de EE. UU. n.os 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 para la inmovilización del reactivo de captura. En algunos modos de realización, los reactivos de captura inmovilizados se recubren en una placa de microvaloración que se puede usar para analizar varias muestras a la vez. Las placas de microvaloración ejemplares incluyen, pero no se limitan a, MICROTEST®, MAXISORP®, NUNC MAXISORB® e IMMULON®. La fase sólida se recubre con los reactivos de captura como se define anteriormente, que se pueden enlazar por una interacción no covalente o covalente o un enlace físico según se desee. Las técnicas de fijación incluyen las descritas en la pat. de EE. UU. n.° 4.376.110 y las referencias citadas en la misma. Si es covalente, la placa u otra fase sólida se incuba con un agente de reticulación conjuntamente con el reactivo de captura en condiciones bien conocidas en la técnica, tal como durante una hora a temperatura ambiente. En algunos modos de realización, las placas se apilan y recubren mucho antes del propio ensayo, y, a continuación, el ensayo se lleva a cabo simultáneamente en varias muestras de forma manual, semiautomática o automática, tal como usando robótica.

En algunos modos de realización, las placas recubiertas se tratan con un agente de bloqueo que se une de forma no específica a y satura los sitios de unión para evitar la unión no deseada del ligando libre a los sitios en exceso en los pocillos de la placa. Los ejemplos de agentes de bloqueo apropiados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, gelatina, seroalbúmina bovina, albúmina de huevo, caseína y leche desnatada. El tratamiento de bloqueo típicamente tiene lugar en condiciones de temperatura ambiente durante un periodo de tiempo, típicamente de aproximadamente 1-4 horas.

En algunos modos de realización, después de recubrir y bloquear, la muestra que se va a analizar, apropiadamente diluida, se añade a la fase inmovilizada. Los tampones ejemplares que se pueden usar para la dilución para este propósito incluyen, pero no se limitan a, (a) solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene BSA al 0,5 %, detergente TWEEN 20® (P20) al 0,05 %, antibiótico PROCLIN® 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM, tensioactivo 3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propanosulfonato (CHAPS) al 0,25 %, beta-gamma globulina al 0,2 % y NaCl 0,35 M; (b) p Bs que contiene seroalbúmina bovina (BSA) al 0,5 %, P20 al 0,05 % y PROCLIN® 300 al 0,05 %, pH 7; (c) PBS que contiene BSA al 0,5 %, P20 al 0,05 %, PROCLIN® 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM y NaCl 0,35 M, pH 6,35; (d) PBS que contiene BSA al 0,5 %, P20 al 0,05 %, PROCLIN® 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM, beta-gamma globulina al 0,2 % y NaCl 0,35 M; y (e) PBS que contiene BSA al 0,5 %, P20 al 0,05 %, PROCLIN® 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM, CHAPS al 0,25 % y NaCl 0,35 M.

Las condiciones para la incubación de la muestra y el reactivo de captura inmovilizado se seleccionan para maximizar la sensibilidad del ensayo y para minimizar la disociación, y para garantizar que cualquier analito de interés presente en la muestra (tal como PLBL2 de hámster) se una al reactivo de captura inmovilizado. Opcionalmente, la muestra se separa (por ejemplo, por lavado) de los reactivos de captura inmovilizados para retirar el material no capturado. La solución usada para lavar, en general, es un tampón (por ejemplo, "tampón de lavado"). También se puede añadir un agente de reticulación u otro agente adecuado en esta fase para permitir que el material de interés ahora unido (por ejemplo, PLBL2 de hámster) se fije covalentemente a los reactivos de captura si existe alguna preocupación de que el material de interés capturado se pueda disociar hasta cierto punto en las etapas posteriores.

Los reactivos de captura inmovilizados con cualquier material de interés unido presente se ponen en contacto con un anticuerpo anti-PLBL2 de detección. En algunos modos de realización, el anticuerpo de detección está biotinilado. En algunos modos de realización, el medio de detección para el marcador biotinilado es avidina o estreptavidina-HRP. En algunos modos de realización, la lectura de los medios de detección es fluorimétrica o colorimétrica.

El nivel de cualquier material de interés libre de la muestra (por ejemplo, PLBL2 de hámster) que ahora está unido a los reactivos de captura se mide o cuantifica usando un medio de detección para el anticuerpo de detección. En algunos modos de realización, la medición o cuantificación comprende comparar la reacción que se produce como resultado de las etapas anteriores con una curva patrón para determinar el nivel de material de interés (por ejemplo, PLBL2 de hámster) en comparación con una cantidad conocida.

El anticuerpo añadido a los reactivos de captura inmovilizados se marcará directamente o bien se detectará indirectamente por adición, después de eliminar por lavado el primer anticuerpo en exceso, de un exceso molar de un segundo anticuerpo marcado dirigido frente a IgG de la especie animal del primer anticuerpo. En el último ensayo indirecto, se añaden a la muestra antisueros marcados frente al primer anticuerpo para producir el anticuerpo marcado in situ.

El marcador usado para el primer o bien segundo anticuerpo es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del material de interés libre (por ejemplo, PLBL2 de hámster) al primer o segundo anticuerpos. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen los conocidos para su uso en inmunoanálisis, tales como los enumerados anteriormente.

Están disponibles procedimientos convencionales para unir covalentemente estos marcadores a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, se pueden usar agentes de acoplamiento, tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bisimidatos, bencidina bisdiazotizada y similares, para marcar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos anteriormente. Véanse, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 3.940.475 (fluorimetría) y la pat. de EE. UU. n.° 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, l3 :1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982). En algunos modos de realización, el marcador es biotina usando estreptavidina-HRP para el medio de detección.

La conjugación de dicho marcador, incluyendo las enzimas, al anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para un experto en técnicas de inmunoanálisis. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone y H. Van Vunakis, vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166.

Tras la adición del último anticuerpo marcado, la cantidad de anticuerpo unido se determina retirando el anticuerpo marcado no unido en exceso a través de lavado y, a continuación, midiendo o cuantificando la cantidad del marcador fijado usando un procedimiento de detección apropiado para el marcador y correlacionando la cantidad medida con la cantidad del anticuerpo de interés en la muestra biológica. Por ejemplo, en el caso de las enzimas, la cantidad de color desarrollado y medido será una medición directa que permitirá la cuantificación de la cantidad del anticuerpo de interés presente. En un modo de realización, HRP es el marcador y el color se detecta usando el sustrato OPD a una absorbancia de 490 nm.

En un ejemplo, después de que un segundo anticuerpo marcado con enzima dirigido frente al primer anticuerpo no marcado se lave de la fase inmovilizada, se desarrolla color o quimioluminiscencia y se mide incubando el reactivo de captura inmovilizado con un sustrato de la enzima. A continuación, se calcula la concentración del material de interés (por ejemplo, PLBL2 de hámster) por comparación con el color o quimioluminiscencia generada por la determinación patrón en paralelo.

Polipéptidos

Anticuerpos anti-PLBL2 de hámster ejemplares

Se proporcionan polipéptidos para su uso en cualquiera de los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento. En un aspecto, se proporcionan anticuerpos aislados que se unen a PLBL2 de hámster. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a) CDRH1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15; (b) CDRH2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16; (c) CDRH3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17; (d) CDRL1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 20; (e) CDRL2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21; y (f) CDRL3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 14. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 19. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 ("19C10") comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 13 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 18. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de CDR que son un 95 % o más idénticas a las secuencias de CDR de SEQ ID NO.: 13 y SEQ ID NO.: 18.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:14. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PLBL2 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a PLBL2. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.: 14. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-PLBL2 comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO.: 14, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PLBL2, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 19. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PLBL2 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a PLBL2. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.: 19. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-PLBL2 comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO.:19, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de (a) CDRH1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5; (b) CDRH2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6; (c) CDRH3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7; (d) CDRL1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 10; (e) CDRL2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11; y (f) CDRL3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9. En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 ("15G11") comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 8. En otro modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de CDR que son un 95 % o más idénticas a las secuencias de CDR de SEQ ID NO.: 3 y SEQ ID NO.: 8.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-PLBL2 comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:4. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PLBL2 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a PLBL2. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.: 4. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-PLBL2 comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO.:4, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PLBL2, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PLBL2 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a PLBL2. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.: 9. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-PLBL2 comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO:9, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PLBL2, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente.

En otro aspecto, también se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PLBL2 descrito en el presente documento. Por ejemplo, en determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PLBL2 que comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO.: 14 y una secuencia de VL de SEQ ID NO.:19. Por ejemplo, en determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PLBL2 que comprende una secuencia de VH de Se Q ID NO.: 4 y una secuencia de Vl de SEQ ID NO.:9.

En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-PLBL2 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, un anticuerpo anti-PLBL2 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')². En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento. En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un semianticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

Polipéptidos recombinantes ejemplares

También se proporcionan polipéptidos recombinantes y preparaciones de los mismos, pudiéndose someter a ensayo sus muestras por los procedimientos descritos en el presente documento. Los ejemplos de dichos polipéptidos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, inmunoadhesinas, anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas de fusión, proteínas que contienen Fc, inmunoconjugados, citocinas e interleucinas, proteínas de mamífero, tales como, por ejemplo, renina; una hormona; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de Von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana, o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada por activación, expresada y secretada por linfocitos T normales); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una enzima; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado de hueso (b Dn F), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor crecimiento nervioso, tal como NGF-b; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico (IGFBP); una citocina; proteínas CD, tales como Cd 3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; un polipéptido de fusión, es decir, un polipéptido comprendido en dos o más polipéptidos heterólogos o fragmentos de los mismos y codificado por un ácido nucleico recombinante; un polipéptido que contiene Fc, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una región Fc de inmunoglobulina, o fragmento de la misma, fusionada a un segundo polipéptido; un inmunoconjugado; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del sida; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como CA125 (antígeno del cáncer de ovario) o receptor HER2, HER3 o HER4; inmunoadhesinas; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente, así como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, que se unen a una proteína, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente.

En algunos modos de realización, la preparación de polipéptidos para su uso en cualquiera de los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento contiene un anticuerpo de interés, es decir, el polipéptido recombinante producido por una célula huésped es un anticuerpo.

Las dianas moleculares para dichos anticuerpos incluyen las proteínas CD y sus ligandos, tales como, pero sin limitarse a: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11 a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a) y CD79p (CD79b); (ii) miembros de la familia de receptores ErbB, tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; (iii) moléculas de adhesión celular, tales como LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICa M-1, VCAM e integrina av/p3, incluyendo las subunidades alfa o bien beta de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); (iv) factores de crecimiento, tales como VEGF; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor tisular, p7, etc.; y (v) antígenos asociados a tumor (TAA) de superficie celular y transmembranarios, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

Otros anticuerpos ejemplares incluyen los seleccionados de, y sin limitación, anticuerpo anti-receptor de estrógeno, anticuerpo anti-receptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-catepsina D, anticuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-cadherina E, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo anti-CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo anti-glucoproteína P, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo anti-proteína de retinoblastoma, anticuerpo anti-oncoproteína ras, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD9/p24, anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CD11a, anticuerpo anti-CD11c, anticuerpo anti-CD13, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD41, anticuerpo anti-LCA/CD45, anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anticuerpo anti-CD39, anticuerpo anti-CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-ubicuitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti-citoqueratinas, anticuerpo anti-vimentinas, anticuerpo anti-proteínas del PVH, anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa, anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda, anticuerpo anti-melanosomas, anticuerpo anti-antígeno prostético específico, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo anti-antígeno tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratinas y anticuerpo anti-antígeno Tn.

Anticuerpos policlonales

En algunos modos de realización, los anticuerpos son anticuerpos policlonales. Se producen preferentemente anticuerpos policlonales en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a un polipéptido que sea inmunógeno en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de la soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunógenos o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg o 5 |jg del polipéptido o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes més tarde, se administra una dosis de refuerzo a los animales de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días més tarde, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para determinar el valor de anticuerpos. Se administra una dosis de refuerzo a los animales hasta la meseta del valor. En algunos modos de realización, se administra una dosis de refuerzo al animal del conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a un polipéptido diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden preparar en cultivo celular recombinante como fusiones polipeptídicas. También se usan adecuadamente agentes de agregación, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos monoclonales

En algunos modos de realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Se obtienen anticuerpos monoclonales de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles variantes que surjan durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades despreciables. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales.

Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (patente de EE. UU n.° 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado se inmuniza como se describe en el presente documento para inducir linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente al polipéptido usado para la inmunización. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, MonoclonalAntibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas así se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), evitando dichas sustancias el crecimiento de células desprovistas de HGPRT.

En algunos modos de realización, las células de mieloma son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, en algunos modos de realización, las líneas de células de mieloma son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se somete a ensayo para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. En algunos modos de realización, se determina la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, polipéptido A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se puedan unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). En algunos modos de realización, las células de hibridoma sirven como una fuente de dicho ADN. Una vez aislado, se puede disponer el ADN en vectores de expresión, que, a continuación, se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de riñón embrionario humano (HEK) 293, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otro modo no producen polipéptido inmunoglobulínico, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

En otro modo de realización, se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo a partir de colecciones de fagos con anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

También se puede modificar el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulínico.

Típicamente, dichos polipéptidos no inmunoglobulínicos se sustituyen con los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen con los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación con antígeno que tenga especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígeno que tenga especificidad por un antígeno diferente.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el anticuerpo es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgG.

Fragmentos de anticuerpo

En algunos modos de realización, un anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpo de las colecciones de fagos con anticuerpos analizadas anteriormente. De forma alternativa, se pueden recuperar directamente los fragmentos Fab'-SH de E. co liy acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')² (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')² directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto en la técnica. En otros modos de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185; la patente de EE. UU. n.° 5.571.894 y la patente de EE. UU. n.° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

En algunos modos de realización, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno. En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')² , un scFv, un Fv y un diacuerpo.

Variantes y modificaciones de polipéptido

Se puede(n) usar la(s) modificación/modificaciones de los polipéptidos, incluyendo anticuerpos, descrita(s) en el presente documento en los procedimientos de ensayo de preparaciones de polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) descritos en el presente documento.

Polipéptidos variantes

"Variante de polipéptido" significa un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido activo, como se define en el presente documento, que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia natural de longitud completa del polipéptido, una secuencia polipeptídica que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido señal. Dichas variantes de polipéptido incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden o delecionan uno o más residuos de aminoácido en el extremo N o C de la secuencia de aminoácidos natural de longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa, al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con respecto a una secuencia polipeptídica de secuencia natural de longitud completa, una secuencia polipeptídica que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido señal. Opcionalmente, los polipéptidos variantes no tendrán más de una sustitución aminoacídica conservadora en comparación con la secuencia polipeptídica natural, de forma alternativa, no más de aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas conservadoras en comparación con la secuencia polipeptídica natural.

El polipéptido variante se puede truncar en el extremo N o en el extremo C, o puede carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con un polipéptido natural de longitud completa. Determinados polipéptidos variantes pueden carecer de residuos de aminoácido que no sean esenciales para una actividad biológica deseada. Se pueden preparar estos polipéptidos variantes con truncamientos, deleciones e inserciones por cualquiera de una serie de técnicas convencionales. Los polipéptidos variantes deseados se pueden sintetizar químicamente. Otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ácido nucleico que codifique un polipéptido variante deseado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se emplean oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ácido nucleico en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los polipéptidos variantes comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido natural divulgado en el presente documento.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amínico y/o carboxílico que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones en los extremos incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo en el extremo N o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo a una enzima o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del polipéptido. Las variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo o por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del polipéptido. Se realiza cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procedimientos postraduccionales del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo), tales como el cambio del número o posición de los sitios de glucosilación.

Se pueden encontrar directrices para determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o delecionar sin afectar negativamente a la actividad deseada comparando la secuencia del polipéptido con la de moléculas de polipéptido conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de homología alta.

Un procedimiento útil para la identificación de determinados residuos o regiones del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) que sean localizaciones preferentes para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifica y remplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferentemente alanina o polialanina) para que afecten a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Esas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan, a continuación, introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se realiza una mutagénesis aleatoria o por barrido de Ala en el codón o región diana y se criban las variantes de anticuerpo expresadas para determinar la actividad deseada.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, se pueden introducir, a continuación, cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 1, o como se describe además a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, y cribar los productos.

Tabla 1.

Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del polipéptido seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) ácidos: Asp (D), Glu (E)

(4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H)

De forma alternativa, los residuos naturales se pueden dividir en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína que no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también se puede sustituir, en general, con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación anómala. Por el contrario, se puede(n) añadir (un) enlace(s) de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad (en particular, si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Un ejemplo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del que se generan. Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución implica la maduración en afinidad usando presentación en fagos. En resumen, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones aminoacídicas en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas así se presentan de una forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetadas en cada partícula. A continuación, se criban las variantes de presentación en fagos para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en el presente documento. Para identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar mutagénesis por barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. De forma alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y la diana. Dichos residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas detalladas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en el presente documento y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes para su desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácidos del polipéptido altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. El polipéptido puede comprender restos distintos a aminoácidos. Por ejemplo, se puede glucosilar el polipéptido. Dicha glucosilación se puede producir de forma natural durante la expresión del polipéptido en la célula huésped u organismo huésped, o puede ser una modificación intencionada que surja de la intervención humana. Por alteración se entiende delecionar uno o más restos glucídicos encontrados en el polipéptido y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el polipéptido.

La glucosilación del polipéptido es típicamente con enlace N o bien con enlace O. Con enlace N se refiere a la fijación del resto glucídico a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto glucídico a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación con enlace O se refiere a la fijación de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al polipéptido se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación con enlace N). La alteración también se puede realizar por la adición de, o sustitución con, uno o más residuos de serina o treonina con respecto a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación con enlace O).

Se puede conseguir la retirada de los restos glucídicos presentes en el polipéptido química o enzimáticamente o por sustitución por mutación de codones que codifican residuos de aminoácido que sirven como dianas para la glucosilación. Se puede lograr la escisión enzimática de restos glucídicos en polipéptidos por el uso de una variedad de endo- y exoglucosidasas.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo en los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, la acetilación de la amina del extremo N y la amidación de cualquier grupo carboxilo del extremo C.

Polipéptidos quiméricos

El polipéptido descrito en el presente documento se puede modificar de manera que forme moléculas quiméricas que comprendan el polipéptido fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, una molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido con un polipéptido de marca que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca de epítopo se dispone, en general, en el extremo amínico o carboxílico del polipéptido. La presencia de dichas formas con marca de epítopo del polipéptido se puede detectar usando un anticuerpo frente al polipéptido de marca. Además, la provisión de la marca de epítopo posibilita que el polipéptido se purifique fácilmente por purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la marca de epítopo.

Obtención de polipéptidos para su uso en los procedimientos de ensayo

Los polipéptidos usados en los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento se pueden obtener usando procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo los procedimientos de recombinación. Las siguientes secciones proporcionan directrices con respecto a estos procedimientos.

(A) Polinucleótidos

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN.

Se pueden obtener polinucleótidos que codifican polipéptidos de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitarse a, una colección de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del polipéptido y lo expresa a un nivel detectable. En consecuencia, se pueden obtener convenientemente polinucleótidos que codifican polipéptidos de una colección de ADNc preparada a partir de tejido humano. También se puede obtener el gen que codifica el polipéptido de una colección genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis automatizada de ácidos nucleicos).

Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar toda una cadena de molécula de inmunoglobulina, tal como una cadena ligera o una cadena pesada. Una cadena pesada completa no solo incluye una región variable de cadena pesada (V^h), sino también una región constante de cadena pesada (C^h), que típicamente comprenderá tres dominios constantes: C^h1, C^h2 y C^h3 y una región "bisagra". En algunas situaciones, es deseable la presencia de una región constante.

Otros polipéptidos que se pueden codificar por el polinucleótido incluyen fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, tales como anticuerpos de dominio único ("dAb"), Fv, scFv, Fab' y F(ab')² y "minicuerpos". Los minicuerpos son (típicamente) fragmentos de anticuerpo bivalente a partir de los que se ha extraído el dominio C^h1 y C^k o C^l. Como los minicuerpos son más pequeños que los anticuerpos convencionales, deberían lograr una mejor penetración en el tejido en el uso clínico/diagnóstico, aunque al ser bivalentes deberían retener una afinidad de unión más alta que los fragmentos de anticuerpo monovalentes, tales como dAb. En consecuencia, a menos que el contexto lo indique de otro modo, el término "anticuerpo" como se usa en el presente documento no solo engloba moléculas de anticuerpo entero, sino también fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno del tipo analizado anteriormente. Preferentemente, cada región estructural presente en el polipéptido codificado comprenderá al menos una sustitución aminoacídica en relación con la región estructural aceptora humana correspondiente. Por tanto, por ejemplo, las regiones estructurales pueden comprender, en total, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones aminoacídicas en relación con las regiones estructurales aceptoras.

Adecuadamente, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden aislar y/o purificar. En algunos modos de realización, los polinucleótidos son polinucleótidos aislados.

Se pretende que el término "polinucleótido aislado" indique que la molécula se retira o separa de su entorno normal o natural o se ha producido de tal manera que no esté presente en su entorno normal o natural. En algunos modos de realización, los polinucleótidos son polinucleótidos purificados. Se pretende que el término purificado indique que se han retirado al menos algunas moléculas o sustancias contaminantes.

Adecuadamente, los polinucleótidos están sustancialmente purificados, de modo que los polinucleótidos pertinentes constituyan los polinucleótidos dominantes (es decir, más abundantes) presentes en una composición.

(B) Expresión de polinucleótidos

La descripción a continuación se refiere principalmente a la producción de polipéptidos cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene polinucleótidos que codifican polipéptidos. Se contempla, por supuesto, que se puedan emplear procedimientos alternativos, que sean bien conocidos en la técnica, para preparar polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o porciones de la misma, se puede producir por síntesis de péptidos directa usando técnicas en fase sólida (véanse, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.

85:2149-2154 (1963)). Se puede realizar la síntesis de proteínas in vitro usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, Calif.) usando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente por separado diversas porciones del polipéptido y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido deseado.

Los polinucleótidos como se describe en el presente documento se insertan en (un) vector(es) de expresión para la producción de los polipéptidos. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores asociados de forma natural o heterólogos), secuencias señal, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción.

Un ácido nucleico está "enlazado de forma funcional" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de polinucleótido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos para una presecuencia o líder secretor están enlazados de forma funcional a ácidos nucleicos para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está enlazado de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está enlazado de forma funcional a una secuencia codificante si se sitúa para que facilite la traducción. En general, "enlazado de forma funcional" significa que las secuencias de ácido nucleico que están enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se consigue por fijación en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o conectores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Para los anticuerpos, las cadenas ligera y pesada se pueden clonar en el mismo o en diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ácido nucleico que codifican las cadenas de inmunoglobulina están enlazados de forma funcional a secuencias de control en el/los vector(es) de expresión que garantiza(n) la expresión de polipéptidos inmunoglobulínicos.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótido (por ejemplo, las secuencias que codifican la cadena pesada variable y/o ligera variable y secuencias de control de expresión opcionales) se pueden transferir a una célula huésped por procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus se pueden usar para otros huéspedes celulares. (Véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2.a ed., 1989). Otros procedimientos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección. Para la producción de animales transgénicos, los transgenes se pueden microinyectar en ovocitos fertilizados, o se pueden incorporar al genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de dichas células se pueden transferir a ovocitos desnucleados.

(C) Vectores

El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación y vectores transportadores.

El término "vector de expresión" significa una construcción que se puede expresar in vivo o in vitro.

El término "vector de transformación" significa una construcción que se puede transferir de una entidad a otra entidad, que puede ser de la especie o puede ser de una especie diferente. Si la construcción se puede transferir de una especie a otra, tal como de un plásmido de Escherichia coli a una bacteria, tal como del género Bacillus, entonces el vector de transformación se llama a veces "vector transportador". Incluso puede ser una construcción que se pueda transferir de un plásmido de E. coli a una Agrobacterium a una planta.

Los vectores se pueden transformar en una célula huésped adecuada como se describe a continuación para proporcionar la expresión de un polipéptido. Diversos vectores están disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en (un) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) usando técnicas conocidas en la técnica. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de fijación estándar que son conocidas por el experto en la técnica.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos, de virus o fagos provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables que son bien conocidos en la técnica.

Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped, como episomas o bien como parte integrante del ADN cromosómico del huésped.

(D) Células huésped

La célula huésped puede ser una bacteria, una levadura u otra célula fúngica, célula de insecto, una célula vegetal, o una célula de mamífero, por ejemplo. Típicamente, las células huésped no contienen ácidos nucleicos exógenos que codifiquen polipéptidos recombinantes de interés o productos, aunque las células huésped pueden contener ácidos nucleicos exógenos que codifiquen polipéptidos, confiriendo su expresión rasgos deseables a las células en determinadas condiciones, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que confieren resistencia a antibióticos.

Se puede usar un organismo huésped multicelular transgénico que se haya manipulado genéticamente para producir un polipéptido. El organismo puede ser, por ejemplo, un organismo mamífero transgénico (por ejemplo, una línea de cabra o ratón transgénico).

Los procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacterias, tales como E. coli. Diversas cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como E. coli K12, cepa MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli, cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (At Cc 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen enterobacterias, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos, tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P), Pseudomonas, tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped original preferente en particular porque es una cepa huésped común para fermentaciones de producto de polinucleótido recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para efectuar una mutación genética en los genes que codifican polipéptidos endógenos al huésped, incluyendo los ejemplos de dichos huéspedes E. coli W3110, cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. co liW3110, cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; E. co liW3110, cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan'; E. coli W3110, cepa 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; E. coli W3110, cepa 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción en degP no resistente a kanamicina y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante. De forma alternativa, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, p Cr u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.

En estos huéspedes procariotas se pueden preparar vectores de expresión, que típicamente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estarán presentes muchos de una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador, y tendrán secuencias de sitios de unión a ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.

Se pueden usar microbios eucariotas para la expresión. Los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromycesluyveromyces, tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris; Candida, Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. niger. Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levaduras que pueden crecer en metanol, seleccionadas de los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Saccharomyces es un huésped de levadura preferente, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glucolíticas. Los promotores de levaduras inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de microorganismos, también se puede usar el cultivo de células de tejido de mamífero para expresar y producir los polipéptidos como se describe en el presente documento y, en algunos casos, es preferente (véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Para algunos modos de realización, pueden ser preferentes las células eucariotas, porque se han desarrollado en la técnica una serie de líneas de células huésped adecuadas que pueden secretar polipéptidos heterólogos (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas), e incluyen líneas de células CHO, diversas líneas de células COS, células HeLa, preferentemente, líneas de células de mieloma o linfocitos B transformados o hibridomas. En algunos modos de realización, la célula huésped de mamífero es una célula CHO.

En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped de vertebrado. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para su cultivo en cultivo en suspensión); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/DHFR-(línea CHO o CHO-DP-12); células de Sertoli de ratón; células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI; células MRC 5; células Fs4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Procedimientos recombinantes

Los polipéptidos recombinantes de interés, también denominados en el presente documento productos, tales como anticuerpos, se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En algunos modos de realización, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido recombinante, tal como un anticuerpo. Dichos ácidos nucleicos pueden codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En algunos modos de realización se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En algunos modos de realización, una célula huésped se transforma o transfecta con dicho ácido nucleico para generar una célula o célula de producto que exprese el polipéptido recombinante. En un modo de realización de este tipo, una célula que expresa el polipéptido recombinante comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo.

En algunos modos de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO). En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido recombinante, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula que expresa el polipéptido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el producto, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del producto y, opcionalmente, recuperar el producto de la célula (o medio de cultivo celular).

Artículos de fabricación

Los polipéptidos usados en los procedimientos descritos en el presente documento pueden estar contenidos dentro de un artículo de fabricación. El artículo de fabricación puede comprender un recipiente que contenga el/los polipéptido(s). En algunos modos de realización, el artículo de fabricación comprende: (a) un recipiente que comprende una composición que comprende el/los polipéptido(s) descrito(s) en el presente documento dentro del recipiente; y (b) un prospecto del envase con instrucciones para usar el/los polipéptido(s) en el procedimiento de ensayo.

El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, tubos de ensayo, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente sostiene o contiene una composición de polipéptidos. Al menos un agente activo de la composición es el polipéptido. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa en un ensayo con directrices específicas con respecto a cantidades y tiempos de incubación. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros.

Todos los rasgos característicos divulgados en la presente memoria descriptiva se pueden combinar en cualquier combinación. Cada rasgo característico divulgado en la presente memoria descriptiva se puede reemplazar por un rasgo característico alternativo que cumpla un propósito igual, equivalente o similar. Por tanto, a menos que se establezca expresamente de otro modo, cada rasgo característico divulgado es solo un ejemplo de una serie genérica de rasgos característicos equivalentes o similares.

EJEMPLOS

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Como se usa en los ejemplos a continuación y en otra parte en el presente documento, "PLB2" y "PLBL2" y "PLBD2" se usan de manera intercambiable y se refieren a la enzima "fosfolipasa de tipo B 2" o a su sinónimo, "dominio de fosfolipasa de tipo B 2".

EJEMPLO 1 - Procedimientos generales

Materia prima de MAb

La materia prima de MAb para todos los ejemplos se seleccionó de lotes de cultivo celular a escala industrial, piloto o pequeña en Genentech (South San Francisco, CA, EE. UU.). Después de un periodo de fermentación del cultivo celular, las células se separaron y, en determinados casos, el caldo clarificado (caldo de cultivo celular obtenido, HCCF) se purificó por cromatografía de proteína A y una o más etapas de cromatografía y etapas de filtración adicionales como se indica en los ejemplos a continuación. Se usaron HCCF o mezclas en curso en diversas etapas de purificación para investigar el funcionamiento del ensayo ELISA descrito en los ejemplos 3 y 5. Los resultados de uso del ensayo ELISA del ejemplo 3 se describen en el ejemplo 4 y los resultados de uso del ensayo ELISA del ejemplo 5 se describen en el ejemplo 6.

Procedimiento espectrofotométrico para la cuantificación de MAb

La concentración de anticuerpo se determinó por medio de absorbancia a 280 y 320 nm usando un espectrofotómetro UV-visible (modelo 8453 G1103A; Agilent Technologies; Santa Clara, Ca , EE. UU.) o modelo n D-1000 de NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE. UU.). Las especies distintas de anticuerpo (es decir, impurezas) fueron demasiado bajas en concentración para tener un efecto apreciable sobre la absorbancia UV. Cuando fue necesario, las muestras se diluyeron con un diluyente no interferente apropiado en el intervalo de 0,1-1,0 unidades de absorbancia. La preparación de la muestra y las mediciones UV se realizaron por duplicado y se registró el valor promedio. Los coeficientes de absorción de mAb variaron de 1,42 a 1,645/mgmlcm.

Procedimiento cromatográfico de afinidad/de HPLC para la cuantificación del producto (ensayo de concentración de producto)

El ensayo de concentración de producto es un procedimiento cromatográfico de afinidad para la medición de polipéptidos que se unen a la proteína A. El procedimiento puede usar HPLC como medio para llevar a cabo la cromatografía de afinidad. Los productos que se pueden medir por este ensayo incluyen cualquier polipéptido que contenga Fc e incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, fragmentos de anticuerpo, incluyendo semianticuerpos e inmunoadhesinas. En el procedimiento se usó una columna de cromatografía de afinidad (2,1 mm de diámetro x 30 mm de longitud, tamaño de partícula de 20 |jm) que contenía proteína A inmovilizada (aproximadamente 1 mg) y un volumen aproximado de 0,1 ml. Las columnas de cromatografía de afinidad con proteína A se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica y también están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Life Technologies. Se aplicaron muestras y cuatro patrones de diferente concentración de IgG a la columna (volumen de inyección de patrón de 20 ul) en un tampón de carga de solución salina tamponada con fosfato. Típicamente, las muestras eran caldo de cultivo celular obtenido (HCCF) y el producto se eluyó de la columna con ácido acético al 2 %/glicina 100 mM (pH 2,5) a un caudal de 2 ml/min. El área de pico del material eluido se comparó con las áreas de pico de la curva patrón de IgG de cuatro puntos, usando el coeficiente de extinción del producto apropiado, para calcular la cantidad de analito de producto. El intervalo del ensayo típicamente fue de 0,025 mg/ml - 4,0 mg/ml. La concentración de producto se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula: mg/ml de IgG = valor de HPLC (mg/ml) x (coeficiente de extinción del material de patrón/coeficiente de extinción del material de muestra).

Cuantificación de proteínas de célula huésped CHO (CHOP) totales

Se usó un ELISA para cuantificar los niveles de las proteínas de célula huésped, llamadas CHOP, totales. Los ELISA usados para detectar proteínas CHO en productos se basaron en un formato de ELISA no competitivo. El anticuerpo policlonal para CHOP purificado por afinidad se recubrió sobre una placa de microvaloración de 96 pocillos. A continuación, se cargaron por duplicado los patrones, los controles y las muestras en pocillos separados. CHOP, si está presente en la muestra, se unirá al anticuerpo de recubrimiento (anti-CHOP policlonal). Después de una etapa de incubación, se añadió a la placa el anticuerpo policlonal anti-CHOP conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de una etapa de lavado final, se cuantificó CHOP añadiendo una solución de tetrametilbencidina (Tm B), también disponible como SUREBLUE RESERVE™ de KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, n.° de cat. 53-00-03), que, cuando actúa sobre la enzima HRP, produce una señal colorimétrica. En cada pocillo se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm. Se usó un programa de ajuste de curvas de cinco parámetros (SOFTMAX® Pro, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) para generar una curva patrón y las concentraciones de CHOP de muestra se calcularon a partir de la curva patrón. El intervalo de ensayo para el ELISA para CHOP total fue de 5 a 320 ng/ml. La concentración de CHOP, en ng/ml, se refiere a la cantidad de CHOP en una muestra usando el patrón de CHOP como calibrador. La proporción de CHOP (en ng/mg o ppm) se refiere a la proporción calculada de la concentración de CHOP con respecto a la concentración de producto y, en determinados casos, fue el valor informado para los procedimientos de prueba. El ELISA para CHOP total se puede usar para cuantificar los niveles de CHOP total en una muestra, pero no cuantifica la concentración de proteínas individuales.

Kits de ensayo ELISA para PLBL2 disponibles comercialmente

Se sometió a prueba si alguno de los dos kits disponibles comercialmente comercializados para el propósito de detectar PLBL2 podría detectar PLBL2 en preparaciones de anticuerpos recombinantes y, de ser así, si proporcionarían una cuantificación adecuada. El primer kit sometido a prueba fue el kit de ensayo ELISA para fosfolipasa B (PLB) humana E92048Hu de USCN Life Science Inc. Este kit se describe como un ELISA no competitivo para la medición cuantitativa in vitro de PLB en homogeneizados tisulares humanos y otros líquidos biológicos. Las muestras sometidas a prueba en este ensayo incluyeron una fuente positiva conocida (una preparación de anticuerpos recombinantes purificada de células CHO) de PLBL2 de hámster donde el nivel de impureza de PLBL2 se había determinado usando un ensayo de espectrometría de masas (descrito más adelante) para que fuera aproximadamente de 300 ng/mg. También se sometió a prueba una segunda preparación de anticuerpos recombinantes purificada de células CHO y que se sabe que no tiene PLBL2 detectable. Aunque se generó una curva patrón que mostraba la detección del patrón de PLBL2 humana incluido en el kit en el intervalo de 0,3-20 ng/ml (fig. 1A), no se detectó ninguna reactividad de las muestras de prueba. Ambas preparaciones de anticuerpos se sometieron a prueba a 10 mg/ml (equivalentes a aproximadamente 3000 ng/ml de PLBL2 en la muestra positiva) y en cuatro diluciones en serie de dos veces de 10 mg/ml a aproximadamente 1,3 mg/ml (equivalentes a 375 ng/ml de PLBL2 en la muestra positiva). Ambas preparaciones de anticuerpos dieron el mismo resultado, una DO de aproximadamente 0,1 UA, por ejemplo, fondo, en todas las diluciones. No existió ninguna diferencia entre la muestra que se sabía que contenía PLBL2 de hámster y la que se sabía que no contenía esta impureza. No existió ninguna diferencia en función de la dilución de muestra, lo que indica ausencia de capacidad de cuantificar PLBL2 de hámster en la presente muestra. Se llegó a la conclusión de que los anticuerpos en este kit no reconocieron la impureza de PLBL2 de hámster en la presente muestra.

El otro kit sometido a prueba fue el kit de ELISA para la supuesta fosfolipasa de tipo B 2 (PLBD2) de hámster, catálogo CSB-EL018125Ha de CUSABIO. Este kit reivindica proporcionar una determinación cuantitativa de las concentraciones de la supuesta fosfolipasa de tipo B (PLBD2) de hámster en suero, plasma, homogeneizado tisular y lisados celulares. Las mismas muestras que se someten a prueba en el kit de USCN Life Science Inc. también se sometieron a ensayo en este kit. Aunque se generó una curva patrón que mostraba la detección del patrón de PLBL2 de hámster incluido en el kit en el intervalo de 0,12-8 ng/ml (fig. 1B), no se detectó ninguna reactividad de las muestras de prueba. Como se describe anteriormente, ambas preparaciones de anticuerpos se sometieron a prueba a 10 mg/ml (equivalentes a aproximadamente 3000 ng/ml de PLBL2 en la muestra positiva) y en cinco diluciones en serie de dos veces de 10 mg/ml a aproximadamente 625 pg/ml (equivalentes a 188 ng/ml de PLBL2 en la muestra positiva). Ambas preparaciones de anticuerpos dieron el mismo resultado, una DO de aproximadamente 0,4 Ua , por ejemplo, fondo, en todas las diluciones. No existió ninguna diferencia entre la muestra que se sabía que contenía PLBL2 de hámster y la que se sabía que no contenía esta impureza. No existió ninguna diferencia en función de la dilución de muestra, lo que indica ausencia de capacidad de cuantificar PLBL2 de hámster en la presente muestra. Se llegó a la conclusión de que los anticuerpos en este kit no reconocieron la impureza de PLBL2 de hámster en la presente muestra.

Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que estos ensayos disponibles comercialmente no cuantificaron PLBL2 de hámster en muestras que se sabía que eran positivas para PLBL2 de hámster. Una explicación es que los anticuerpos anti-PLBL2 en estos ensayos tienen poca afinidad por la (CHO)-PLBL2 de hámster encontrada en las presentes muestras. Otra explicación es que los anticuerpos anti-PLBL2 no pudieron detectar CHO-PLBL2 cuando apareció en la matriz de muestra que contenía altos niveles de IgG humana recombinante, como en las presentes muestras. Estos resultados indicaron la necesidad de desarrollar nuevos anticuerpos anti-PLBL2 y nuevas condiciones de ensayo para posibilitar la detección y cuantificación exacta de la impureza de PLBL2 en las presentes preparaciones de anticuerpos recombinantes. Esos esfuerzos se describen en los ejemplos a continuación.

EJEMPLO 2 - Generación de anticuerpos que se unen a PLBL2 de hámster

La identificación de PLBL2 como una impureza en una preparación de anticuerpos promovió la síntesis del gen y, a continuación, la expresión y purificación de PLBL2 de hámster. La literatura sobre PLBL2 la describe como una enzima lisosómica de peso molecular de aproximadamente 66 kD (F. Deuschl et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006)). Al igual que con otras enzimas lisosómicas, esta proteína contiene múltiples modificaciones postraduccionales con manosa-6-fosfato y se sintetiza originalmente como una preproenzima. Durante el procesamiento, se recorta una secuencia líder y se produce un recorte proteolítico, dando como resultado que la proteína aparezca como tres bandas en geles SDS-PAGE: PLBL2 intacta (PM de 66 kD), un dominio N terminal (28 kD) y un dominio C terminal (40 kD). El recorte se produce a niveles de pH ácidos. Aunque el dominio en N y los dominios en C se separan en SDS-PAGE, los fragmentos probablemente no se separan en condiciones naturales, puesto que se ha observado que se necesitaban disolventes fuertes (por ejemplo, urea, guanidina o etanol) para separar los fragmentos. Adicionalmente, otros laboratorios que han purificado PLBL2 para estudios de cristalografía también han observado este recorte y no han podido separar las proteínas intactas de las recortadas con procedimientos cromatográficos (F. Deuschl et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006); A. Jensen et al., Biochem Journal 402, 449-458 (2007), F. Lakomek et al., BMC Structural Biology 9:56 (2009)).

Se sintetizó ADN que codificaba PLBL2 de hámster (Cricetulus griseus) soluble a partir de la información de secuencia disponible públicamente (véase la tabla de secuencias a continuación para secuencias de ácido nucleico y aminoácidos ejemplares) y se clonó en un vector de expresión de mamífero estándar usando procedimientos típicos conocidos en la técnica, incluyendo la adición de una marca de histidina (his). La PLBL2 soluble se expresó de forma transitoria en células CHO-K1 (ATCC® CRL9618™). Se obtuvieron sobrenadantes de cultivo celular (denominados HCCF) y se purificó PLBL2 usando los siguientes procedimientos.

El caldo de cultivo celular obtenido (HCCF) se ultrafiltró (UF) 10 veces por filtración con flujo tangencial (TFF), usando membranas con un peso molecular de corte (PMC) de 10 kDa. El HCCF UF se diafiltró (DF) frente a 10 volúmenes de una solución salina tamponada con fosfato (PBS), tampón NaCl. E1HCCF UF/DF se aplicó a una columna de cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) de Ni-NTA (QIAGEN, n.° de cat. 30622) y se eluyó con un gradiente de imidazol creciente. La mezcla de Ni-NTA se acondicionó con un tampón que contenía sulfato de sodio y, a continuación, se aplicó a una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) CL-4B de Octyl-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences, producto n.° 17-0790-01). La columna de Octyl-Sepharose se eluyó con un gradiente de sulfato de sodio decreciente. La mezcla de Octyl-Sepharose se cromatografió de nuevo en una columna de Ni-NTA y se eluyó por etapas con una alta concentración de imidazol. La mezcla cromatografiada de nuevo de Ni-NTA se concentró usando unidades de filtración centrífuga equipadas con membranas con un peso molecular de corte de 10 kDa (Millipore). La mezcla cromatografiada de nuevo de Ni-NTA concentrada se formuló en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences, producto n.° 17-1043-02). Las fracciones de la columna Superdex 200 se recogieron y analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) y por procedimientos de inmunoelectrotransferencia (usando anticuerpos frente a proteínas de ovario de hámster chino, CHOP (Genentech, Inc.), totales, y anticuerpos disponibles comercialmente frente a fosfolipasa B2) para determinar la pureza.

Para generar anticuerpos monoclonales, se inmunizaron cinco ratones Balb/c (Charles River Laboratories International, Inc., Hollister, CA) con PLBL2 soluble recombinante purificada en intervalos de 3-4 días, en cada almohadilla plantar y por vía intraperitoneal, en un adyuvante que contenía escualeno metabolizable (4 % v/v), Tween 80 (0,2 % v/v), 6,6-dimicolato de trehalosa (0,05 % p/v) y monofosforil lípido A (0,05 % p/v; todos los componentes obtenidos de Sigma Aldrich, EE. UU.). Después de 6 inyecciones, los valores séricos se evaluaron por ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) estándar para identificar ratones con valores séricos positivos para PLBL2. Se fusionaron linfocitos B de bazo y ganglios linfáticos de dos ratones, que demostraron los valores más altos, con células de mieloma de ratón por electrofusión (Hybrimune; Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA). Después de 7 días, se tomaron aproximadamente 5000 colonias en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio de cultivo de hibridoma usando Clonepix-FL (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los sobrenadantes de hibridoma se obtuvieron y cribaron para determinar la producción de anticuerpos específicos para PLBL2 por ELISA directo. 25 clones que mostraban unión específica a la proteína PLBL2 por ELISA se clasificaron además en base a su afinidad como se mide por OCTET® (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA). Los sobrenadantes de hibridoma de ratón se diluyeron a 5 |jg/ml en tampón cinético (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) o se usaron puros (si la concentración era de menos de 5 mg/ml) y se capturaron en puntas de sensor de anti-I gG (Fv) de ratón (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA), seguido de inmersión de los sensores en proteína PLBL2 a 10 jg/ml. Las mediciones cinéticas de asociación y disociación se determinaron usando el programa informático de análisis de datos ForteBio. Los 25 clones se caracterizaron además por inmunoelectrotransferencia para determinar la unión C terminal, N terminal y PLBL2 completa. Los sobrenadantes de hibridoma para los clones 1.26G6, 1.20B5, 1.19C10, 1.15G11, 1.4E2, 1.39C10 y 1.30F3 que muestran inmunounión a la proteína PLBL2 C o bien N terminal o intacta se purificaron por cromatografía de afinidad (MabSelect SuRe; GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), se filtraron de forma estéril y almacenaron a 4 °C en PBS. Cuatro de los 7 anticuerpos con alto rendimiento se seleccionaron para la biotinilación. La actividad de unión tanto para los anticuerpos biotinilados como no biotinilados se confirmó por Octet. A continuación, se evaluaron los anticuerpos purificados para su posible uso en el desarrollo de un ensayo ELISA. Se seleccionaron dos anticuerpos, 1.19C10 y 1.15G11, para el desarrollo del ensayo ELISA.

Los anticuerpos 1.19C10 y 1.15G11 se identificaron ambos como IgG1, kappa, usando el kit de isotipado de mAb de ratón Isostrip (Roche Applied Biosciences, Indianápolis, IN). El ADN que codifica cada uno de estos anticuerpos se clonó y expresó de forma transitoria en células 293 o bien células CHO. Para obtener secuencias variables de anticuerpo del clon 1.15G11 y 1.19C10 para la expresión transitoria en células CHO, se usó un procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc en 5' (5'RACE), que se basó en los procedimientos descritos previamente (véanse, por ejemplo, Nature Methods 2, 629 - 630 (2005) y "Rapid amplification of 5' cDNA ends" en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (eds. Sambrook, J. & Russell, D.W.), capítulo 8, protocolo 9, 8.54-8.60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE. UU., 2001)). El ARN total se extrajo de células de hibridoma cultivadas (al menos 106 células) con el kit RNeasy Plus (Qiagen, Valencia, CA) y el ADNc se preparó con el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech Inc., Mountain View, CA). Para amplificar las regiones variables de cadena pesada y ligera, se usó respectivamente en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) una mezcla de cebadores universales A que seleccionan como diana los oligonucleótidos marcados en el extremo 5' de ADNc (incluidos en el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE) y un cebador inverso que selecciona como diana la región constante de cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG de ratón. La condición de PCR se ajustó como sigue: 1 |jl de ADNc, 5 |jl de 10x mezcla de cebadores universales, 1 |jl de cebadores inversos 10 uM, 45 jil de premezcla de PCR (Life Technologies Inc. Foster City, CA); 94 °C, 2 min seguido de 94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 30 s para 30 ciclos y 72 °C 10 min. Los productos de Pc R se separaron en gel de agarosa para ADN y los productos de PCR con el tamaño esperado (700 pb para la cadena pesada y 500 pb para la cadena ligera) se purificaron del gel para el análisis de secuenciación para determinar las secuencias de ADN de la región variable de cadena pesada y ligera (VH y VK).

Para clonar las regiones VH/VK descritas anteriormente en vectores de expresión de anticuerpos, se usó el procedimiento de clonación de In-Fusion® (Clontech Inc.) y los siguientes cebadores: cadena pesada de 1.15G11, cebador directo 5'- ACT GGA GCG TAC GCT G AA GTG AAG CTT GAG GAGTCT-3' (SEQ ID NO.:23), cebador inverso 5' -A A G ACC G A T G GG CCC T T G G TG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GTT C-3' (SEQ ID NO.:24); cadena pesada de 1.19C10, cebador directo 5 '-ACT G G A GCG T A C GCT G A G G TG C AG C TT C A G G A G TCA.-3' (SEQ ID NO.:25), cebador inverso 5'-AAG ACC GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT G A G G A G AC T GTG AG A GTG GTG C-3' (SEQ ID NO.:26). Tanto para la cadena ligera de 1.15G11 como 1.19C10, cebador directo 5'-■GCA ACT GCA ACC GGT GTA CAT TCA GAC A T T G TG A T G A C C C A G T C T -3' (SEQ ID NO.:27), cebador inverso 5'-GGT G CA GCC ACG GTC CGC TTC AGC TCC AGC TTG GTA CC-3' (SEQ ID NO.:28). Se usó 1 pl de ADNc como molde en la PCR en la misma condición descrita previamente. A continuación, los productos de PCR se purificaron con un kit de limpieza de PCR (Qiagen Inc.) para su subclonación en vectores de expresión de anticuerpos. El vector de expresión de IgG1 de ratón se linealizó con digestión con BsiWI y Apal, y el vector de expresión de kappa de ratón se digirió con Agel y BssHII. Para la reacción de clonación de In-Fusion®, se mezclaron entre sí 50 ng de ADN en vector linealizado y 50 ng de productos de PCR para VH o VK con 5x enzimas de In-Fusion® y, a continuación, se incubaron a 50 °C durante 15 min. Se usaron 3 j l de reacción de In-Fusion® para la transformación y siembra en placas de LB-agar selectivas con carbenicilina (50 jg/ml). Se tomaron colonias individuales y se cultivaron para la purificación del ADN plasmídico. Los clones con inserción de VH o VK sin cambio de pauta de lectura se identificaron con análisis de secuenciación.

Los anticuerpos recombinantes se purificaron como se describe anteriormente y se compararon con los anticuerpos derivados de hibridomas purificados y se descubrió que eran comparables tanto por ELISA directo como por OCTET® (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) (sometidos a ensayo como se describe anteriormente). Los anticuerpos recombinantes producidos como se describe anteriormente se denominan, respectivamente, 19C10 y 5G11. La información de secuencia de aminoácidos para 19C10 y 5G11 se proporciona en la tabla de secuencias.

Para generar anticuerpos policlonales, se inmunizaron tres conejos hembra blancos de Nueva Zelanda libres de patógenos séricos (Antibody Solutions, Mountain View, CA) con PLBL2 recombinante purificada (como se describe anteriormente) en intervalos de dos semanas, por vía subcutánea en la nuca, en un hidrogel que contenía adyuvante y muramil dipéptido (MDP). Cada inyección contenía 150 ug de PLBL2 soluble recombinante purificada. Se administraron un total de seis inyecciones los días 0, 21,49, 63, 84 y 112. Se extrajo sangre de cada conejo un total de 7 veces los días 42, 70, 77, 91, 98, 119 y 126 para someter a prueba los valores de anticuerpos. Los conejos se desangraron el día 134. Como control, se recogió suero preinmunitario de cada conejo el día 0 antes de la inyección.

Para determinar la reactividad del anticuerpo con respecto a PLBL2, se usó antisuero en un procedimiento de captura en fase de solución. En el procedimiento de captura en fase de solución, los sueros preinmunitarios y antisueros de los tres conejos diferentes (conejo A, B y C) se diluyeron en serie a partir de una dilución inicial de 1/1000. Los sueros diluidos se incubaron con una concentración fija de PLBL2 biotinilada a 3 ug/ml durante 2 h en una placa de 96 pocillos de no unión. A continuación, la solución se transfirió a una placa de 96 pocillos transparente recubierta con NeutrAvidin de Pierce con tampón de bloqueo Superblock (Pierce, n.° de prod. 15129) y se incubó durante 1 hora para capturar la PLBL2 biotinilada. Después de la etapa de incubación, los materiales no unidos se eliminaron por lavado usando tampón de lavado (polisorbato 20 al 0,05 %/PBS [Corning Cellgro, n.° de cat. 99-717-CM]). Se diluyó anti-IgG de conejo caprino AffniPure conjugado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, n.° de cat. 111-035-144) en diluyente de ensayo a un factor de dilución de 1/20.000 y se añadió a los pocillos de la placa de microvaloración. Después de 2 h de etapa de incubación con anti-IgG de conejo caprino conjugado con peroxidasa a temperatura ambiente, se realizó una etapa de lavado final con tampón de lavado (descrito anteriormente). Posteriormente, se desarrolló el color añadiendo una solución de TMB (50 ul/pocillo) (SUREBLUE RESERVE™ de KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, n.° de cat. 53-00-03) seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. La detección se llevó a cabo por la evaluación de la densidad óptica (DO) a 450 nm en cada pocillo usando un Molecular Devices SpectraMax M5e. Se usó un programa de ajuste de curvas de cinco parámetros (SoftMax Pro v5.2 rev C) para procesar los datos.

En base al experimento de captura en fase de solución descrito anteriormente, se encontró que los antisueros de los tres conejos habían desarrollado anticuerpos de buena calidad frente a PLBL2. El suero preinmunitario para los tres conejos no tenía afinidad por PLBL2. Puesto que los tres conejos tenían una curva de respuesta similar para PLBL2, los antisueros de las extracciones de sangre por desangre de los tres conejos se combinaron en un único lote para el ensayo ELISA para PLBL2 policlonal (descrito a continuación en el ejemplo 5).

El antisuero de conejo mezclado se fraccionó inicialmente con sulfato de amonio al 60 %, lo que precipitó todos los anticuerpos en el suero. Se usó cromatografía de afinidad para seleccionar los anticuerpos producidos frente a PLBL2. PLBL2 se inmovilizó en Glyceryl-CPG y el gel se empaquetó en una columna de cromatografía. El sedimento de sulfato de amonio al 60 % se disolvió en PBS, pH 7,2, y se cargó en la columna de PLBL2-CPG. Después de que se completara la carga, la columna se lavó con PBS NaN3 al 0,02 %, pH 7,2. Los anticuerpos frente a PLBL2 se eluyeron de la columna de afinidad con PBS, pH 2,0, recogiendo la mezcla de elución en una solución de Tris 1,0 M, pH 7,5 - 8,0. Por último, los anticuerpos anti-PLBL2 purificados se concentraron y, a continuación, se intercambió el tampón en PBS NaN3 al 0,02 %, pH 7,2, usando cromatografía de exclusión por tamaño. Los anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad se usaron en el ELISA para PLBL2 policlonal descrito a continuación en el ejemplo 5.

EJEMPLO 3 - Ensayo ELISA para anti-PLBL2 de hámster monoclonal murino

Se desarrolló un ensayo ELISA para detectar y cuantificar la impureza de CHOP, PLBL2, en muestras de polipéptidos recombinantes, tales como preparaciones de inmunoadhesinas o anticuerpos recombinantes. El procedimiento es como sigue. El anticuerpo monoclonal murino 19C10 se recubrió sobre una placa de microvaloración de 96 pocillos de semiárea a una concentración de 0,5 |jg/ml en tampón carbonato (carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6), durante la noche a 2-8 °C. Después del recubrimiento, la placa se bloqueó con tampón de bloqueo (NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,1 M, gelatina de pescado al 0,1 %, polisorbato 20 al 0,05 %, Proclin® 300 al 0,05 % [Sigma-Aldrich]; también denominado diluyente de ensayo) para evitar la adherencia no específica de las proteínas. Los patrones, los controles y las muestras se diluyeron en diluyente de ensayo (NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,1 M, gelatina de pescado al 0,1 %, polisorbato 20 al 0,05 %, Proclin® 300 al 0,05 % [Sigma-Aldrich]), a continuación, se cargaron por duplicado en pocillos separados y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente (22-27 °C). PLBL2, si está presente en la muestra, se uniría al anticuerpo de recubrimiento (también denominado en el presente documento de captura). Después de la etapa de incubación descrita anteriormente, los materiales no unidos se eliminaron por lavado usando tampón de lavado (polisorbato 20 al 0,05 %/PBS [Corning cellgro, n.° de cat. 99-717-CM]) y se diluyó el anticuerpo monoclonal murino 15G11 anti-PLBL2 conjugado a biotina en diluyente de ensayo a una concentración de 0,03125 jg/m l y se añadió a los pocillos de la placa de microvaloración.

La conjugación a biotina se llevó a cabo como sigue. Se adquirió un kit de biotinilación de Pierce Thermo Scientific, (P/N 20217, E-Z Link NHS-Biotin), y estreptavidina-HRP (SA-HRP) de Jackson Immuno, n.° de cat. 016-030-084. Se siguieron las instrucciones del kit de Pierce. En resumen, se dializó IgG en PBS, pH 7,4, y se añadió biotina a la proteína y se mezcló a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, el anticuerpo marcado se dializó frente a PBS, pH 7,4, para retirar la biotina en exceso, se filtró y se determinó la concentración de proteínas por A280.

Después de 2 h de etapa de incubación con 15G11 biotinilado a temperatura ambiente, se añadió estreptavidina-HRP (dilución 1:200.000 en diluyente de ensayo) a los pocillos de la placa de microvaloración. Después de una etapa de lavado final con tampón de lavado (descrito anteriormente), se desarrolló el color (para la cuantificación de PLBL2) añadiendo una solución de Tm B (50 |jl/pocillo) (SUr Eb LUE RESERVE™ de KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, n.° de cat. 53-00-03) seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. La detección se llevó a cabo por la evaluación de la densidad óptica (DO) a 450 nm en cada pocillo usando un Molecular Devices SpectraMax M5e. Se usó un programa de ajuste de curvas de cuatro parámetros (SoftMax Pro v5.2 rev C) para generar una curva patrón y las concentraciones de PLBL2 de muestra se calcularon a partir del intervalo lineal de la curva patrón.

Como se muestra en la figura 2, el ensayo para PLBL2 que usaba los anticuerpos monoclonales 19C10 y 15G11 tenía una curva sigmoidea usando un ajuste de parámetros de 4 puntos. Se usaron valores en el intervalo lineal de la curva patrón para calcular la PLBL2 nominal (ng/mg o ppm). El intervalo lineal fue de aproximadamente CE¹⁰ -CE85 o 1,5 - 40 ng/ml ya que el intervalo varió ligeramente de una placa a otra. Los valores obtenidos para PLBL2 usando este ELISA fueron comparables con las estimaciones realizadas por otros procedimientos (por ejemplo, CL-EM/EM, ELISA para PLBL2 policlonal o ELISA para CHOP total cuando se diluyó al LC del ensayo [véanse las tablas 3 y 4]).

EJEMPLO 4 - Resultados usando el ensayo ELISA para PLBL2 monoclonal

Usando el ensayo ELISA para PLBL2 de hámster descrito anteriormente en el ejemplo 3, se evaluó una variedad de preparaciones de anticuerpos monoclonales (mAb) producidas en células CHO para cuantificar la cantidad de PLBL2 contaminante en diferentes condiciones. Se evaluaron múltiples determinaciones de preparaciones purificadas, así como caldo de cultivo celular obtenido (HCCF), que no estaba purificado. Para la comparación, en determinados casos, también se cuantificó la cantidad de péptidos PLBL2 por CL-EM/EM. El procedimiento CL-EM/EM se realizó como sigue.

Para la cuantificación de PLBL2 por CL-EM/EM, se usaron una UPLC de Waters Acquity H-Class Bio y un espectrómetro de masas AB Sciex TripleTOF 5600+. Las muestras y los patrones de calibración (PLBL2 recombinante agregada a una preparación de anticuerpos monoclonales humanizados recombinantes obtenida de una línea de células NS0 de ratón [la línea de células NS0 no contiene PLBL2 de hámster]) se redujeron y digirieron con tripsina. Se inyectaron un total de 40 jg de muestra digerida sobre la UPLC, usando una columna Waters BEH300 C18, tamaño de partícula de 1,7 jm . Se usó un gradiente lineal de acetonitrilo para eluir los péptidos, a un caudal de 300 jl/m in y una temperatura de columna de 60 °C.

Los péptidos que se eluyeron de la UPLC se introdujeron en el espectrómetro de masas por ionización por electropulverización en modo de ionización positiva. La temperatura de la fuente de iones se ajustó en 400 °C, con un voltaje de IonSpray de 5500 V y un potencial de desagrupamiento de 76 V. Se usó un ajuste de energía de colisión de 32 para la fragmentación de iones peptídicos seleccionados. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo a alta resolución de supervisión de reacción múltiple (MRMHR), usando cuatro péptidos PLBL2 específicos y sus transiciones en iones fragmento. Los iones originales se seleccionaron por el espectrómetro de masas cuadripolar con un margen de selección de masa con respecto a carga (m/z) de 1,2 uma. Los iones fragmento de cada ion original se separaron por el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y se seleccionaron para determinar la cuantificación posterior a la adquisición de datos con un margen de selección de 0,025 uma.

La concentración de PLBL2 en las muestras se determinó midiendo las respuestas de señales específicas de las cuatro transiciones, calibradas por las de los patrones en el intervalo de 2-500 ppm usando un ajuste lineal. La tabla 2 a continuación muestra la lista de péptidos PLBL2 supervisados por CL-EM/EM. Las curvas patrón representativas para cada uno de los péptidos supervisados por CL-EM/EM se muestran en la fig. 3.

Tabla 2. Lista de péptidos PLBL2 supervisados por CL-EM/EM

Las tablas 3 y 4 a continuación muestran la proporción de PLBL2 en diversas determinaciones de purificación de dos preparaciones de mAb diferentes, mAb A y mAb B, como se determina tanto por CL-EM/e M como por el ensayo ELISA para PLBL2 de hámster descrito en el ejemplo 3. Al igual que para la proporción de CHOP descrita anteriormente, la proporción de PLBL2 se proporciona como ng/mg o partes por millón (ppm) y se refiere a la proporción calculada de la concentración de PLBL2 con respecto a concentración de producto (mAb). Los resultados mostrados en las tablas 3 y 4 indican que el ensayo ELISA para PLBL2 pudo cuantificar los niveles de PLBL2 en dos preparaciones de mAb diferentes en un amplio intervalo y en diferentes procedimientos de purificación (cada número de determinación indica un procedimiento de purificación diferente).

Tabla 3. Proporción de PLBL2 en diversos lotes de mAb A

Tabla 4. Proporción de PLBL2 en diversos lotes de mAb B

También se evaluó la capacidad del ensayo ELISA para PLBL2 descrito en el ejemplo 3 de determinar los niveles de PLBL2 contaminante en HCCF no purificado para un amplio número de preparaciones de mAb, siendo algunas IgG1 y siendo algunas IgG4. Esos resultados se muestran en la fig. 4. Como se puede ver en la fig. 4, el ensayo ELISA para PLBL2 pudo cuantificar un amplio intervalo de PLBL2 en HCCF. Aunque los niveles de PLBL2 variaron sustancialmente entre diferentes muestras de HCCF con mAb, la reproducibilidad dentro de las preparaciones de HCCF replicadas (determinaciones) para cualquier mAb dado fue buena. No se observó ninguna correlación clara entre el isotipo (IgG1 o IgG4) y el nivel de PLBL2 en HCCF (datos no mostrados).

Además, se evaluó el aclaramiento de PLBL2 a través de un procedimiento de purificación de cromatografía en tres columnas con una etapa final de ultrafiltración/diafiltración (UFDF) de mAb G usando el ensayo ELISA para PLBL2 monoclonal descrito en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en la fig. 5. Los niveles de PLBL2 fueron los más altos en el HCCF y el procedimiento de purificación fue eficaz para retirar PLBL2 de la preparación de mAb G final. El ensayo ELISA para PLBL2 monoclonal demostró una buena sensibilidad y especificidad y fue eficaz para cuantificar los niveles de PLBL2 en HCCF no purificado y en cada fase de purificación. Se observó linealidad en diversas diluciones de producto, lo que indica que el ensayo ELISA para PLBL2 monoclonal no está sometido al problema de "exceso de antígeno" que se observó con el ensayo para CHOP total.

EJEMPLO 5 - Ensayo ELISA para anti-PLBL2 de hámster policlonal de conejo

Se desarrolló un ensayo ELISA para detectar y cuantificar la impureza de CHOP, PLBL2, en muestras de polipéptidos recombinantes, tales como preparaciones de inmunoadhesinas o anticuerpos recombinantes. El procedimiento fue como sigue. El anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad se recubrió sobre una placa de microvaloración de 96 pocillos de semiárea a una concentración de 0,5 ug/ml en tampón carbonato (carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6), durante la noche a 2-8 °C. Después del recubrimiento, la placa se bloqueó con tampón de bloqueo (NaCI 0,15 M, fosfato de sodio 0,1 M, gelatina de pescado al 0,1 %, polisorbato 20 al 0,05 %, Proclin® 300 al 0,05 % [Sigma-Aldrich]) para evitar la adherencia no específica de las proteínas. Los patrones, los controles y las muestras se diluyeron en diluyente de ensayo (NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,1 M, gelatina de pescado al 0,1 %, polisorbato 20 al 0,05 %, Proclin® 300 al 0,05 % [Sigma-Aldrich]), a continuación, se cargaron por duplicado en pocillos separados y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente (22-27 °C). PLBL2, si está presente en la muestra, se uniría al anticuerpo de recubrimiento (también denominado en el presente documento de captura). Después de la etapa de incubación descrita anteriormente, los materiales no unidos se eliminaron por lavado usando tampón de lavado (polisorbato 20 al 0,05 %/PBS [Corning Cellgro, n.° de cat. 99-717-CM]) y el anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) se diluyó en diluyente de ensayo a una concentración de 40 ng/ml y se añadió a los pocillos de la placa de microvaloración.

La conjugación a HRP se llevó a cabo como sigue. Se adquirió un kit de conjugación a HRP de Pierce Thermo Scientific, (P/N 31489, kit y peroxidasa activada E-Z Link Plus). Se siguieron las instrucciones del kit de Pierce. En resumen, se dializó IgG en tampón carbonato-bicarbonato, pH 9,4, y se añadió peroxidasa activada E-Z Link Plus a la proteína y se mezcló a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente se añadieron cianoborohidruro de sodio y tampón de desactivación para estabilizar la conjugación y desactivar la reacción. A continuación, el anticuerpo marcado se dializó frente a PBS, pH 7,4, se filtró y se determinó la concentración de proteínas por A280.

Después de 2 h de etapa de incubación con anticuerpo policlonal de conejo conjugado a HRP a temperatura ambiente, se realizó una etapa de lavado final con tampón de lavado (descrito anteriormente). Posteriormente, se desarrolló el color (para la cuantificación de PLBL2) añadiendo una solución de TMB (50 ul/pocillo) (SUREBLUE RESERVE™ de k Pl , Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, n.° de cat. 53-00-03) seguido de incubación a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. La detección se llevó a cabo por la evaluación de la densidad óptica (DO) a 450 nm en cada pocillo usando un Molecular Devices SpectraMax M5e. Se usó un programa de ajuste de curvas de cinco parámetros (SoftMax Pro v5.2 rev C) para generar una curva patrón y las concentraciones de PLBL2 de muestra se calcularon a partir del intervalo lineal de la curva patrón.

Como se muestra en la figura 6, el ensayo para PLBL2 que usaba anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad tenía una curva sigmoidea usando un ajuste de parámetros de 5 puntos. Se usaron valores en el intervalo lineal de la curva patrón para calcular la PLBL2 nominal (ng/mg o ppm). El intervalo cuantitativo del ensayo fue de 0,5 - 50 ng/ml. Los valores obtenidos para PLBL2 usando este ELISA fueron comparables con las estimaciones realizadas por otros procedimientos (por ejemplo, ELISA para PLBL2 monoclonal murina, CL-EM/EM o ELISA para CHOP total cuando se diluyó al LC del ensayo).

EJEMPLO 6 - Resultados usando el ensayo ELISA para PLBL2 policlonal

Se evaluó el aclaramiento de PLBL2 a través de un procedimiento de purificación de cromatografía en tres columnas con una etapa final de ultrafiltración/diafiltración (UFDF) de mAb G usando el ensayo ELISA para PLBL2 policlonal descrito en el ejemplo 5. Los resultados se muestran en la fig. 7. Como se observó con el ensayo ELISA para PLBL2 monoclonal, los niveles de PLBL2 fueron los más altos en el HCCF y el procedimiento de purificación fue eficaz para retirar PLBL2 de la preparación de mAb G final. El ensayo ELISA para PLBL2 policlonal demostró una buena sensibilidad y especificidad y fue eficaz para cuantificar los niveles de PLBL2 en HCCF no purificado y en cada fase de purificación. Se observó linealidad en diversas diluciones de producto, lo que indica que el ensayo ELISA para PLBL2 no está sometido al problema de "exceso de antígeno" que se observó con el ensayo para CHOP total.

Además, se compararon las cantidades de PLBL2 detectadas usando el ensayo monoclonal con las cantidades de PLBL2 detectadas usando el ensayo policlonal en siete determinaciones diferentes de mAb A (incluyendo diferentes fases de purificación como se indica en la tabla 5) y una determinación de mAb B. Los resultados se presentan en la tabla 5. Como se puede ver, la diferencia en % relativa entre los resultados obtenidos usando cada ensayo indica que los dos ensayos proporcionan resultados comparables.

Tabla 5. Comparación de los resultados del ensayo para PLBL2 monoclonal con los resultados del ensayo para PLBL2 policlonal.

Diferencia en % relativa = [(MAb-pAb)/ ((Mab+pAb)/2)]*100

Conclusión

Tomados conjuntamente, estos datos indican que cada uno de los ensayos ELISA para PLBL2 monoclonal y policlonal descritos en el presente documento es sólido, específico y sensible. Se ha demostrado que cada ensayo puede cuantificar con exactitud CHOP PLBL2 de hámster contaminante en numerosas preparaciones de MAb diferentes que representan un amplio intervalo de niveles de PLBL2 y en una variedad de condiciones de purificación. También se ha demostrado que el ensayo ELISA para PLBL2 se puede usar para supervisar el aclaramiento de impurezas durante cada etapa del procedimiento de purificación. Por lo tanto, cada uno de los ensayos ELISA para PLBL2 monoclonal y policlonal descritos en el presente documento es una herramienta eficaz para supervisar el aclaramiento durante el desarrollo de los procedimientos de purificación, así como para cuantificar los niveles de PLBL2 en el producto final.

EJEMPLO 7 - Uso de ensayos ELISA para PLBL2 para cribar o seleccionar líneas celulares

Como se analiza anteriormente y como se muestra en la fig. 4, se observaron diferencias sustanciales en los niveles de PLBL2 en HCCF entre diferentes líneas celulares de producción de mAb, teniendo algunas niveles de PLBL2 hasta 20 veces más altos en comparación con otras. Dichas diferencias sustanciales sugieren que sería deseable identificar líneas celulares de producto, y posiblemente incluso líneas de células huésped (es decir, células huésped que no producen ningún producto), que produzcan bajos niveles de PLBL2 en e1HCCF, por ejemplo, para reducir la carga en los procedimientos de purificación posteriores. Con respecto a las líneas celulares de producto, sería deseable identificar líneas que produzcan simultáneamente altas cantidades de producto y bajas cantidades de PLBL2. Una pregunta clave es si es posible o factible cribar diferentes clones de una línea celular de producto para seleccionar un clon que produzca altas cantidades de producto y bajas cantidades de PLBL2.

Antes de generar los resultados descritos a continuación, no se pensó que una estrategia de selección de clones de este tipo sería factible. Esto se debe a que se planteó la hipótesis de que las diferencias en los niveles de PLBL2 observadas entre diferentes líneas de producto (véase la fig. 4) fueron el resultado de los rasgos característicos particulares del producto (por ejemplo, MAb) producido. Por ejemplo, se esperaba que todos los clones de la línea MAb A proporcionaran niveles aproximadamente equivalentes de PLBL2 y que esos niveles fueran sustancialmente más altos que los niveles de PLBL2 producidos por todos los clones de la línea MAb G (véase la fig. 4). Esta hipótesis era consecuente con la experiencia anterior con diversas líneas de producto MAb en las que se han observado que determinadas líneas de producto MAb producen niveles más altos de MAb en relación con líneas que producen diferentes MAb, es decir, la producción de MAb parece ser dependiente de las características del MAb producido. Además, se esperaba que las líneas celulares con altos perfiles de crecimiento y viabilidad tuvieran una maquinaria de producción de proteínas más eficaz y, por lo tanto, no solo fueran más productivas con respecto al MAb particular sino también con respecto a los niveles de PLBL2. En resumen, por tanto, se esperaba que las proporciones de PLBL2 con respecto a producto en diferentes clones de cualquier línea celular de producto particular fueran relativamente consecuentes de un clon a otro.

Para explorar la factibilidad de una estrategia de selección de clones de baja concentración de PLBL2/alta de producto, se usaron los procedimientos descritos anteriormente para medir los niveles de PLBL2, niveles de CHOP total y concentración de producto en muestras de HCCF del día 14 de múltiples líneas clonales de seis líneas de células CHO de productos de proteínas recombinantes diferentes (producto J, producto K, producto L, producto M, producto N y producto O). En la figura 8 se muestran los resultados de cultivos de biorreactor de 2 l por duplicado para cada línea celular clonal. Como se esperaba, las concentraciones de producto entre clones de una línea celular de producto particular no variaron sustancialmente de una a otra y el nivel promedio de concentración de producto entre clones de una línea celular de producto particular parecía depender del producto producido. Por ejemplo, el principal productor de producto N (fig. 8E) tuvo una concentración de producto al menos 1,5 veces más alta que el principal productor de producto L (fig. 8C).

De forma sorprendente, sin embargo, la observación de la concentración de producto descrita anteriormente no se cumplió para los niveles de PLBL2. Como se puede ver en la fig. 8, existió una variabilidad sustancial en los niveles de PLBL2 entre los diferentes clones de una línea celular de producto particular y esta variabilidad clonal se vio en cada una de las seis líneas celulares de producto diferentes. Dicho de otra manera, no existió ninguna correlación fuerte entre la concentración de producto y los niveles de PLBL2. Por ejemplo, como se muestra en la fig. 8E (producto N), cada una de las líneas clónales 1-4 de la línea celular de producto N proporcionó concentraciones de producto similares que variaban de aproximadamente 3,5-4,5 g/l, pero proporcionó concentraciones de PLBL2 que diferían en más de cinco veces (variando de aproximadamente 0,75 mg/l a aproximadamente 4,5 mg/l). Queda claro a partir de los resultados mostrados en la fig. 8E que la línea celular de producto N número 3 proporcionó los niveles de PLBL2 más bajos y la concentración de producto más alta en comparación con cualquiera de las demás líneas celulares de producto N, lo que indica la factibilidad de seleccionar clones de producto con estos atributos deseables. Además, los resultados muestran la aplicabilidad general de esta estrategia de selección de evaluar las concentraciones de PLBL2 y de producto y seleccionar los clones de producto que proporcionan bajos niveles de PLBL2 y alta concentración de producto.

La utilidad de llevar a cabo esta estrategia de selección se puede ver, por ejemplo, examinando los resultados de las líneas celulares clonales de producto L (fig. 8C). Todas las líneas celulares clonales eran productoras de concentraciones de producto relativamente bajas, pero existían diferencias sustanciales en los niveles de PLBL2. Si la concentración de producto fuera el único atributo cribado, se podría seleccionar la línea celular de producto L número 6 porque proporcionó la concentración de producto más alta. Pero la línea celular de producto L número 6 también produjo sustancialmente más PLBL2 que cualquier otro clon, en algunos casos niveles tres veces más altos. En una situación donde sea deseable minimizar los niveles de PLBL2 en la línea celular de producto elegida para el aumento a escala y el trabajo de desarrollo adicional, el cribado adicional de los niveles de PLBL2 es, por tanto, importante y posibilita la selección de una línea celular de producto con los atributos combinados deseados de baja concentración de PLBL2 y alta de producto.

Otra manera de analizar los datos presentados en la fig. 8 es calcular una proporción del nivel de PLBL2 con respecto a la concentración de producto. Se calculó una proporción de este tipo para cada una de las líneas celulares analizadas anteriormente con respecto a la figura 8 y se representaron los datos como se muestra en la figura 9. Como se puede ver por los datos mostrados en la figura 9, las líneas celulares clonales de una línea celular de producto particular generaron proporciones de concentración de PLBL2/de producto que variaron hasta de dos a diez veces.

Un análisis de este tipo permite una comparación rápida de los atributos deseados en múltiples líneas celulares clonales de una línea celular de producto particular y una selección simple de la línea con la proporción más baja, es decir, el nivel más bajo de PLBL2 y el nivel más alto de concentración de producto. Por ejemplo, para el producto L, no quedó claro a partir de los datos presentados en la fig. 8C qué número de línea celular proporcionó el nivel más bajo de PLBL2 y la concentración de producto más alta. Pero los datos mostrados en la fig. 9C, que presenta la proporción de concentración de PLBL2/de producto, muestran claramente que la línea celular de producto L número 1 tenía la proporción más baja y, por lo tanto, la combinación óptima de los atributos deseados.

Para investigar además el grado de variabilidad en múltiples líneas celulares clonales de una línea celular de producto particular, se analizaron 48 líneas de células CHO recombinantes diferentes que expresaban el producto P. La proporción PLBL2/producto de cada una de las 48 líneas celulares de producto P se muestra en la fig. 10. En estas 48 líneas celulares de producto P diferentes, la proporción PLBL2/producto varió en hasta diez veces. Además, una revisión rápida de los datos mostrados en la fig. 10 indica que la línea celular de producto P número 34 tenía la proporción más baja, subrayando, de este modo, la facilidad con la que se puede seleccionar una línea celular de producto con los atributos deseados de baja concentración de PLBL2 y alta de producto.

Luego, se investigó la evidente carencia de correlación entre la concentración de PLBL2 y la concentración de producto midiendo los niveles de CHOP total, PLBL2 y concentraciones de producto en muestras de HCCF del día 14 de cultivos en matraz de agitación de las 48 líneas celulares de producto P descritas anteriormente. Con este conjunto de datos sustancialmente más grande que implica un único producto, se pudieron cuantificar con más exactitud las correlaciones entre estas tres mediciones. La fig. 11A muestra que existió una correlación lineal débil entre la concentración de PLBL2 y la concentración de producto: el coeficiente de determinación (R2) asociado con la regresión lineal fue bajo (<0,12). Esta débil correlación demuestra la factibilidad de seleccionar líneas celulares con los rasgos deseados de alta productividad de proteína recombinante y bajos niveles de PLBL2 en relación con otras líneas celulares. Por el contrario, la fig. 11B muestra que existió una correlación lineal moderadamente fuerte entre la concentración de CHOP total y la concentración de producto (R2 > 0,45). Esta correlación es consecuente con el presente postulado original de que es probable que las líneas celulares que son altamente productivas con respecto al producto deseado también sean altamente productivas con respecto a las proteínas de célula huésped en general porque se espera que crezcan bien, mantengan una alta viabilidad y posean una fuerte maquinaria de producción de proteínas. La carencia de una fuerte correlación lineal entre la concentración de PLBL2 y la concentración de CHOP total (R2 < 0,29) mostrada en la fig. 11C es un hallazgo sorprendente. Debido a que PLBL2 es una especie de CHOP única, se esperaba que las líneas celulares que producen más CHOP total también produjeran más PLBL2, de modo que la proporción de PLBL2 con respecto a CHOP total se mantuviera relativamente consecuente en diferentes líneas celulares. Esta inesperada carencia de una fuerte correlación positiva entre los niveles de PLBL2 y de CHOP total en el HCCF en 48 líneas celulares demuestra que no se puede confiar en las mediciones de CHOP total como un sustituto para las mediciones de PLBL2. Por lo tanto, no se puede suponer que las líneas celulares con bajos niveles de CHOP total también tengan bajos niveles de PLBL2. En consecuencia, las mediciones directas de PLBL2 en HCCF son importantes para la selección de líneas celulares con bajos niveles de PLBL2.

Para determinar si las diferentes líneas de células huésped CHO proporcionan diferentes niveles de PLBL2 y para distinguir cualquiera de dichas diferencias de los efectos de la proteína recombinante sobre los niveles de PLBL2 en cultivo celular, se usó el ELISA para PLBL2 para medir los niveles de PLBL2 en cultivos de biorreactor de 2 l de tres líneas de células huésped CHO diferentes — huésped 1, huésped 2 y huésped 3— que no expresaron ningún gen de producto. Estos cultivos de biorreactor, también conocidos como determinaciones en blanco porque no se generaron productos, se analizaron para determinar la densidad y viabilidad de células viables usando el Vi-Cell XR (n.° de catálogo 731050, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EE. UU.). El crecimiento celular también se evaluó a lo largo de la duración del cultivo en base al hematocrito (PCV) por centrifugación (820 g, 10 min) de muestras de cultivo en tubos de sedimentación calibrados KIMAX (n.° de catálogo 45225-10, Kimble Chase, Vineland, NJ, EE. UU). Se midieron los niveles de PLBL2 tanto en el HCCF como en el caldo de cultivo celular completo (WCCF) para estas determinaciones en blanco. Las muestras de WCCF estaban compuestas tanto por células como por HCCF. Por lo tanto, los niveles de PLBL2 medidos en muestras de WCCF reflejan una combinación de la concentración intracelular y extracelular total de PLBL2 en los cultivos. Usando el ensayo ELISA para PLBL2, se cuantificaron las diferencias en las tres líneas de células huésped CHO con respecto a los perfiles de PLBL2 tanto en HCCF (fig. 12A) como en WCCF (fig. 12B). De esta manera, se identificó que el huésped 1 generaba los niveles más altos de PLBL2, tanto en HCCF como en WCCF. Por el contrario, se identificó al huésped 3 como la línea de células CHO que generó los niveles más bajos de PLBL2 en el momento de la obtención (día 14).

Aunque el huésped 3 generó los niveles más bajos globales de PLBL2 tanto en HCCF como en WCCF, las tres líneas de células huésped CHO mostraron diferentes perfiles de crecimiento (datos no mostrados). Por lo tanto, para negar el impacto de las diferencias en el crecimiento celular sobre los niveles de PLBL2, se analizaron además estas tres líneas celulares normalizando la producción de PLBL2 al volumen de células viables por día. Para calcular la productividad de PLBL2 específica de célula en el huésped 1, huésped 2 y huésped 3, se representó la concentración de PLBL2 frente al correspondiente hematocrito viable integrado (IVPCV) volumétrico. Para minimizar las complicaciones de la muerte celular y liberación de PLBL2 de la lisis celular asociada, se limitó el uso de los datos a aquellos en los que las viabilidades del cultivo superaban un 70 %. La pendiente resultante obtenida de la regresión lineal proporcionó una estimación de la productividad de PLBL2 específica de célula, en unidades de mg de PLBL2 por volumen de células viables unitario por día. Como se muestra en la fig. 13, la pendiente de la regresión lineal fue más la alta para el huésped 1 y la más baja para el huésped 3, lo que demuestra además que el huésped 3 generó, en promedio, varias veces menos PLBL2 por volumen de células viables unitario por día, ya sea que las mediciones se obtuvieran usando HCCF (fig. 13A) o WCCF (fig. 13B). En base a estos hallazgos, se puede elegir preferentemente un huésped que produzca baja concentración de PLBL2, tal como el huésped 3, como huésped original de CHO para transfecciones estables para generar líneas celulares de producción. Un enfoque de este tipo puede dar lugar a líneas de células recombinantes transfectadas de forma estable que también muestren niveles de PLBL2 más bajos en comparación con líneas de células recombinantes basadas en otras células huésped CHO.

Los resultados analizados anteriormente muestran que los ensayos ELISA para PLBL2 descritos en el presente documento se pueden usar para evaluar los niveles de PLBL2 en múltiples líneas de células CHO de producto recombinantes, así como en múltiples líneas de células huésped CHO, posibilitando por tanto la selección de líneas recombinantes o líneas de huésped con atributos deseables, tales como bajas concentraciones de PLBL2 y, en el caso de líneas de células CHO de producto recombinantes, alta concentración de producto. Un enfoque de este tipo para la selección de líneas celulares es importante para la optimización de los procedimientos de fabricación recombinantes, por ejemplo, para reducir la carga de los procedimientos de purificación posteriores.

a a e secuencas

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de selección de una línea de células huésped óptima de un grupo de dos o más líneas de células huésped, en el que la línea de células huésped óptima expresa una baja cantidad de PLBL2 de hámster, que comprende:

(i) obtener una muestra de línea de células huésped de cada una de las dos o más líneas de células huésped; (ii) calcular la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped de acuerdo con un procedimiento para detectar la proteína fosfolipasa de tipo B 2 (PLBL2) de hámster en cada una de las muestras de línea de células huésped, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto un primer anticuerpo de captura que se une a PLBL2 de hámster con la muestra, generando, de este modo, un material de combinación muestra-anticuerpo de captura;

(b) poner en contacto un segundo anticuerpo de detección que se une a PLBL2 de hámster con el material de combinación muestra-anticuerpo de captura; y

(c) detectar el segundo anticuerpo unido al material de combinación muestra-anticuerpo de captura;

(d) cuantificar el nivel del segundo anticuerpo de detección unido usando una curva de valoración patrón, (e) calcular una cantidad de PLBL2 de hámster presente en la muestra en base al nivel del segundo anticuerpo de detección unido,

(iii) comparar la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped con la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea de células huésped del grupo;

(iv) identificar la muestra de línea de células huésped que tiene la cantidad más baja de PLBL2 en comparación con cada una de las muestras de línea de células huésped del grupo, generando, de este modo, una línea de células huésped identificada del grupo que tiene la cantidad más baja de PLBL2; y

(v) seleccionar la línea de células huésped identificada de (iv) como la línea de células huésped óptima, en el que el anticuerpo monoclonal de captura que se une a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster eomprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 17 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 20, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 21 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 22, y/o

en el que el anticuerpo monoclonal de detección que se une a fosfolipasa de tipo B 2 de hámster eomprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5, CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6 y CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 7 y una región de cadena ligera variable que comprende CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 10, CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 11 y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 12.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la línea de células huésped es una línea celular que expresa el polipéptido recombinante, en el que dicho procedimiento comprende seleccionar una línea celular que expresa el polipéptido recombinante óptima de un grupo de dos o más líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante, en el que cada una de las dos o más líneas celulares que expresan el polipéptido recombinante son líneas celulares de producto y en el que la línea celular que expresa el polipéptido recombinante óptima es una línea celular de producto óptima, en el que cada una de las líneas celulares de producto expresa el mismo producto, y en el que la línea celular de producto óptima expresa una baja cantidad de PLBL2 de hámster y una alta cantidad de producto, que comprende:

(i) obtener una muestra de línea celular de producto de cada una de las dos o más líneas celulares de producto; (ii) calcular la cantidad de PLBL2 en cada una de las muestras de línea celular de producto de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1;

(iii) detectar el producto y cuantificar una cantidad de producto en cada una de las muestras de línea celular de producto;

(iv) calcular una proporción de la cantidad de PLBL2 con respecto a la cantidad de producto para cada una de las muestras de línea celular de producto;

(v) comparar la proporción calculada para cada una de las muestras de línea celular de producto con cada una de las muestras de línea celular de producto del grupo;

(vi) identificar la muestra de línea celular de producto que tiene la proporción más baja del grupo, generando, de este modo, una línea celular de producto identificada del grupo que tiene la cantidad más baja de PLBL2 y la cantidad más alta de producto; y

(vii) seleccionar la línea celular de producto identificada de (vi) como la línea celular de producto óptima.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo de captura no compite por su unión con el anticuerpo de detección y en el que el anticuerpo de captura se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de detección.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inmunoanálisis se selecciona del grupo que consiste en un ensayo electroquimioluminiscente (EQL) o un ensayo no competitivo.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el ensayo no competitivo es un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

6. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1-5, en el que la preparación de polipéptidos recombinantes o la línea de células huésped se obtiene de una línea de células de ovario de hámster chino (CHO).

7. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1-6, en el que el polipéptido recombinante contenido en la preparación de polipéptidos recombinantes es un anticuerpo o una inmunoadhesina.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un semianticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el polipéptido recombinante es IgG.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el polipéptido recombinante se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

11. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1-10, en el que el anticuerpo de captura comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 14 y una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 19.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo de captura comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 13 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 18.

13. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1-10, en el que el anticuerpo de detección comprende una región variable que comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 4 y una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 9.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo de detección comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 8.