KR20200133021A - 세포주에서 숙주 세포 단백질 및 재조합 폴리펩티드 생성물을 검출 및 정량화하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

세포주에서 숙주 세포 단백질 및 재조합 폴리펩티드 생성물을 검출 및 정량화하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

햄스터 포스포리파제 B-유사 2에 결합하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 제공된다. 또한, 예를 들어 재조합 폴리펩티드 제제에서 햄스터 포스포리파제 B-유사 2를 검출 및 정량화하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 또한, 낮은 수준의 햄스터 포스포리파제 B-유사 2를 발현하는 숙주 세포주 또는 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 스크리닝 또는 선택하는 방법이 제공된다.

Description

세포주에서 숙주 세포 단백질 및 재조합 폴리펩티드 생성물을 검출 및 정량화하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AND QUANTIFYING HOST CELL PROTEIN IN CELL LINES AND RECOMBINANT POLYPEPTIDE PRODUCTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2014년 5월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 61/991,228 및 2013년 9월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 61/877,503의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 EFS-웹을 통해 제출되고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2014년 8월 28일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 P5701R1WO_PCTSequenceListing.txt로 명명되고, 크기는 28,965 바이트이다.
기술분야
햄스터 포스포리파제 B-유사 2에 결합하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 제공된다. 또한, 예를 들어 재조합 폴리펩티드 제제에서 햄스터 포스포리파제 B-유사 2를 검출 및 정량화하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 또한, 낮은 수준의 햄스터 포스포리파제 B-유사 2를 발현하는 숙주 세포주 또는 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 스크리닝 또는 선택하는 방법이 제공된다.
인간 환자에게의 투여가 허용될 재조합 생물제약 단백질의 경우에, 제조 및 정제 공정으로부터 생성된 잔여 불순물이 최종 생물학적 생성물로부터 제거되는 것이 중요하다. 이들 공정의 성분은 배양 배지 단백질, 이뮤노글로불린 친화성 리간드, 바이러스, 내독소, DNA, 및 숙주 세포 단백질을 포함한다. 이들 숙주 세포 불순물은 재조합 DNA 기술로부터 유래된 생물제제 중의 공정-관련 불순물/오염물인 공정-특이적 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함한다. HCP는 전형적으로 최종 약물 물질 중에 소량으로 (의도되는 재조합 단백질의 백만분의 몇 또는 밀리그램당 몇 나노그램으로) 존재하지만, HCP는 바람직하지 않고 그의 양은 최소화되어야 하는 것으로 인식된다. 예를 들어, 미국 식품 의약품국 (FDA)은 생체내 인간 용도로 의도되는 생물제약에 가능한 한 이질 불순물이 없을 것을 요구하고, 잠재적 오염물/불순물, 예컨대 HCP의 검출 및 정량화에 대한 시험을 요구한다. 또한, 국제 조화 회의 (ICH)는 생물공학적/생물학적 생성물에 대한 시험 절차 및 수용 기준에 대한 지침을 제공한다. 상기 지침은 HCP의 경우에, 광범위한 단백질 불순물을 검출할 수 있는 민감한 면역검정을 사용할 것을 제시한다. 본 발명자들 등은 이뮤노글로불린, DNA, 내독소, 바이러스, 및 총 HCP, 예를 들어 총 차이니즈 햄스터 난소 단백질 (CHOP)을 검출하기 위한 검정 및 시약을 개발하였지만 (문헌 [Chen AB, J Biotechnol in Healthcare 3:70-80 (1996); Krawitz et al., Proteomics 6:94-110 (2006)]에서 검토됨), 재조합 단백질 제제와 공동-정제되는 것을 비롯한 재조합 단백질 제제, 예컨대 이뮤노글로불린 생성물 중의 단일 공정-특이적 HCP의 검출 및 정량화를 위한 충분한 특이성 및 감도의 상업용 시약 또는 분석 방법은 현재 존재하지 않는다.
특정 경우에, 총 HCP, 예를 들어 총 CHOP의 검출 및 정량화를 위해 면역검정을 사용할 경우에 유의한 희석 의존성이 관찰될 수 있고, 이는 이러한 검정이 특정한 생성물 중의 HCP 불순물의 정확한 정량화를 위한 적절한 시험 절차가 아님을 시사한다. 이러한 희석 의존성의 조사는 보다 적절한 시험 절차의 개발을 가능하게 하기 위해 중요하다. 특정 경우에, 희석 의존성은 "항원 과잉"에 의해 유발될 수 있고, 여기서 이용가능한 항체보다 많은 양으로 존재하는 단일 HCP 종은 검정 수행 시 관찰되는 효과의 원인이 된다 (Anicetti et al., J. Immunol. Methods 91:213-224 (1986); Chen AB, J Biotechnol in Healthcare 3:70-80 (1996), Wang X, et al., Biotechnol Bioeng. 103(3):446-58 (2009)).
감도 분석 방법, 예컨대 LC-MS/MS는 이용가능한 항체보다 많은 양으로 존재하는 단일 HCP 종을 확인 및 정량화하는데 사용될 수 있다. 이러한 단일 HCP 종이 확인되면, 규제 기관에 의한 승인에 유효할 수 있고 다중 재조합 단백질 생성물에 걸쳐 플랫폼으로서 사용될 수 있는 충분한 감도 및 특이성의 대안적 검정을 개발하는 것이 필요하다.
CHO 세포에서 생산된 본 발명자들의 특정 재조합 단백질 제제에서, 본 발명자들은 총 CHOP ELISA 검정에서 이용가능한 항체보다 많은 양으로 존재하는 단일 CHOP 종으로서 효소, 포스포리파제 B-유사 2를 확인하였다. 본원에 사용된 "PLB2" 및 "PLBL2" 및 "PLBD2"는 상호교환가능하게 사용되고, 효소 "포스포리파제 B-유사 2" 또는 그의 동의어, "포스포리파제 B-도메인-유사 2"를 지칭한다. PLBL2에 대한 특정 과학 간행물은 문헌 [Lakomek, K. et al., BMC Structural Biology 9:56 (2009); Deuschi, et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006)]을 포함한다. PLBL2는 약 66,000의 모 MW를 갖는 프리-프로-효소로서 합성된다. 제거되는 초기 리더 서열이 존재하고, 잠재적 6 만노스-6-포스페이트 (M-6-P) 기는 번역후 변형 동안 부가된다. M-6-P는 이러한 효소를 M-6-P 수용체를 통해 리소솜으로 지시하는 표적화 변형이다. PLBL2는 6개의 시스테인을 함유하고, 그 중 2개는 유리 술프히드랄을 갖고, 4개는 디술피드 결합을 형성한다. 산성 환경에서, PLBL2는 각각 32,000 및 45,000 MW를 갖는 N- 및 C-말단 단편으로 추가로 클리핑된다. 다른 리소솜 효소로 유추하면, 이러한 절단은 활성화 단계이며, 기질의 활성 부위에의 접근을 가능하게 한다.
효소의 햄스터 및 인간 형태 사이에는 약 80% PLBL2 아미노산 서열 상동성이 존재한다. 효소 활성은 세포 막을 구성하는 인지질로부터 어느 하나의 지방산 쇄를 절단하는 것으로 생각된다. 상이한 기질 절단 특이성을 갖는 다른 포스포리파제가 존재한다. 미생물에서 유사한 효소적 활성이 존재하고, 여기서 이는 종종 병독성 인자이다. 미생물이 유사한 효소적 활성을 갖더라도 이러한 활성을 생성하는 단백질은 상이하며, 미생물과 포유동물 PLBL2 효소 사이에는 낮은 서열 상동성이 존재한다. 포스포리파제는 기질 가수분해의 한 생성물로서 유리 지방산 (FFA)을 생산한다. 유리 지방산은 그 자체가 잠재적 면역-신호전달 인자이다. 탈수소화는 FFA를 아라키돈산으로 전환시키고, 이는 에이코사노이드를 수반하는 염증 캐스케이드에 잠재적으로 참여한다.
특정 재조합 단백질 제제에서 단일 HCP (CHOP)로서 PLBL2가 확인되면, 세포주에서 또는 다중 생성물에서 및 다양한 정제 단계에서 PLBL2 수준의 특이적이고, 민감하며, 정량적인 결정을 위한 시약, 방법 및 키트를 갖는 것은 매우 유익하고 바람직할 것이다. 이러한 시약, 방법 및 키트는 충분한 일관성, 감도, 특이성 또는 효율의 기존 검정이 존재하지 않는 경우에 특히 필요하다. 본원에 기재된 본 발명은 특정의 상기-기재된 필요를 충족시키고, 다른 이익을 제공한다.
특허 출원 및 간행물을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 항-햄스터 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2) 항체, 및 예를 들어 재조합 폴리펩티드 제제 또는 숙주 세포주로부터 수득된 샘플에서 햄스터 PLBL2 단백질의 검출 및 정량화를 위한 면역검정 방법에서의 이러한 항체의 용도를 기반으로 한다.
따라서, 한 측면에서, 햄스터 포스포리파제 B-유사 2에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날이다. 특정 실시양태에서, 항체는 햄스터 PLBL2에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 19C10이다.
또 다른 측면에서, 햄스터 포스포리파제 B-유사 2에 결합하는 또 다른 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날이다. 특정 실시양태에서, 항체는 햄스터 PLBL2에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 15G11이다.
또 다른 측면에서, 햄스터 포스포리파제 B-유사 2 단백질에 결합하는 폴리클로날 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 토끼 항체이다.
또 다른 측면에서, 햄스터 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2)을 검출하는 면역검정 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 제제 또는 숙주 세포주로부터 샘플이 수득된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제1 포획 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플-포획 항체 조합 물질을 생성하는 단계; (b) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제2 검출 항체를 샘플-포획 항체 조합 물질과 접촉시키는 단계; 및 (c) 샘플-포획 항체 조합 물질에 결합된 제2 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포획 항체는 검출 항체와 결합에서 경쟁하지 않는다. 일부 실시양태에서, 포획 항체는 검출 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 결합된 제2 검출 항체의 수준은 표준 적정 곡선을 사용하여 정량화된다. 특정 실시양태에서, 샘플 중에 존재하는 햄스터 PLBL2의 양은 결합된 제2 검출 항체의 수준에 기초하여 계산된다. 일부 실시양태에서, 면역검정은 전기화학발광 (ECL) 검정이다. 일부 실시양태에서, 면역검정은 샌드위치 검정이다. 일부 실시양태에서, 샌드위치 검정은 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)이다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 19C10이다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 폴리클로날이다. 특정 실시양태에서, 폴리클로날 포획 항체는 토끼 항체이다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 항체는 15G11이다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 폴리클로날이다. 특정 실시양태에서, 폴리클로날 검출 항체는 토끼 항체이다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 비오틴에 접합된다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 제제 또는 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 제제는 수거된 세포 배양 유체 (HCCF)이다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 제제는 하나 이상의 크로마토그래피 정제 단계를 거친다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 제제는 최종 정제된 생성물이다. 일부 실시양태에서, 최종 정제된 생성물은 약물 물질이다.
상기 방법의 특정의 추가 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 제제 중 재조합 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신이다. 특정 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG4이다.
또 다른 측면에서, 햄스터 PLBL2의 검출을 위한 면역검정 키트가 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 상기 기재된 임의의 포획 항체에 따른 포획 항체 및 상기 기재된 임의의 검출 항체에 따른 검출 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역검정은 ECL 면역검정이다. 일부 실시양태에서, 면역검정은 ELISA 면역검정이다.
한 측면에서, 숙주 세포주로부터 수득된 샘플에서 PLBL2를 검출하는 단계를 포함하는, 숙주 세포주를 햄스터 PLBL2의 발현에 대해 스크리닝하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, PLBL2는 상기 기재된 햄스터 PLBL2의 검출을 위한 임의의 면역검정 방법을 사용하는 것에 의해 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 수거된 세포 배양 유체이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 전세포 배양 유체이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 기재된 면역검정 및 계산 방법을 사용하여 샘플에서 햄스터 PLBL2의 양을 계산하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 2종 이상의 숙주 세포주의 군으로부터 적은 양의 햄스터 PLBL2를 발현하는 최적 숙주 세포주를 선택하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 최적 숙주 세포주는 3종 이상의 숙주 세포주의 군, 또는 5종 이상의 숙주 세포주의 군, 또는 10종 이상의 숙주 세포주의 군, 또는 20종 이상의 숙주 세포주의 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은: (i) 각각의 2종 이상의 숙주 세포주로부터 숙주 세포주 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 기재된 면역검정 및 계산 방법을 사용하여 각각의 숙주 세포주 샘플에서 PLBL2의 양을 계산하는 단계; (iii) 각각의 숙주 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양을 군의 각각의 숙주 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양과 비교하는 단계; (iv) 군의 각각의 숙주 세포주 샘플과 비교하여 최저량의 PLBL2를 갖는 숙주 세포주 샘플을 확인하여, 최저량의 PLBL2를 갖는 군으로부터 확인된 숙주 세포주를 생성하는 단계; 및 (v) (iv)의 확인된 숙주 세포주를 최적 숙주 세포주로서 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종 이상의 숙주 세포주는 CHO 세포주이다. 일부 실시양태에서, 각각의 숙주 세포주 샘플은 수거된 세포 배양 유체이다. 일부 실시양태에서, 각각의 숙주 세포주 샘플은 전세포 배양 유체이다.
또 다른 측면에서, 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 햄스터 PLBL2의 발현에 대해 스크리닝하는 방법이며, 여기서 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 생성물 세포주이고, 생성물 세포주로부터 수득된 샘플에서 PLBL2를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, PLBL2는 샘플에서 상기 기재된 햄스터 PLBL2의 검출을 위한 임의의 면역검정 방법을 사용하는 것에 의해 검출된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 기재된 면역검정 및 계산 방법을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 샘플에서 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 것에 의해 생성물의 발현에 대해 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 것은 분광광도측정 방법 또는 친화성 크로마토그래피 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서, 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주의 군으로부터 적은 양의 햄스터 PLBL2 및 많은 양의 생성물을 발현하는 최적 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 선택하는 방법이며, 여기서 각각의 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 동일한 생성물을 발현하는 생성물 세포주인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 최적 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 3종 이상의 군, 또는 5종 이상의 군, 또는 10종 이상의 군, 또는 20종 이상의 군, 또는 40종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주의 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은: (i) 각각의 2종 이상의 생성물 세포주로부터 생성물 세포주 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 기재된 면역검정 및 계산 방법을 사용하여 각각의 생성물 세포주 샘플에서 PLBL2의 양을 계산하는 단계; (iii) 각각의 생성물 세포주 샘플에서 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 단계; (iv) 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양을 군의 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양과 비교하는 단계; (v) 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 생성물의 양을 군의 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 생성물의 양과 비교하는 단계; (vi) 군의 각각의 생성물 세포주 샘플과 비교하여 최저량의 PLBL2 및 최고량의 생성물을 갖는 생성물 세포주 샘플을 확인하여, 최저량의 PLBL2 및 최고량의 생성물을 갖는 군으로부터 확인된 생성물 세포주를 생성하는 단계; 및 (vii) (vi)의 확인된 생성물 세포주를 최적 생성물 세포주로서 선택하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은: (i) 각각의 2종 이상의 생성물 세포주로부터 생성물 세포주 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 기재된 면역검정 및 계산 방법을 사용하여 각각의 생성물 세포주 샘플에서 PLBL2의 양을 계산하는 단계; (iii) 각각의 생성물 세포주 샘플에서 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 단계; (iv) 각각의 생성물 세포주 샘플에 대해 PLBL2의 양 대 생성물의 양의 비를 계산하는 단계; (v) 각각의 생성물 세포주 샘플에 대해 계산된 비를 군의 각각의 생성물 세포주 샘플과 비교하는 단계; (vi) 군의 최저비를 갖는 생성물 세포주 샘플을 확인하여, 최저량의 PLBL2 및 최고량의 생성물을 갖는 군으로부터 확인된 생성물 세포주를 생성하는 단계; 및 (vii) (vi)의 확인된 생성물 세포주를 최적 생성물 세포주로서 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종 이상의 생성물 세포주는 CHO 세포주이다. 일부 실시양태에서, 각각의 생성물 세포주 샘플은 수거된 세포 배양 유체이다.
상기 방법의 특정의 추가 실시양태에서, 재조합 단백질-발현 세포주에 의해 발현된 생성물은 항체 또는 이뮤노어드헤신이다. 특정 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 생성물은 IgG이다. 일부 실시양태에서, 생성물은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 생성물은 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 생성물은 IgG4이다.
도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같은 상업적으로 입수가능한 PLBL2 ELISA 키트에 대한 대표적인 표준 곡선을 보여준다. (a) USCN ELISA 키트를 사용하여 생성된 표준 곡선; (b) 쿠사바이오(CUSABIO) ELISA 키트를 사용하여 생성된 표준 곡선.
도 2는 실시예 3에 기재된 바와 같은 마우스 모노클로날 PLBL2 ELISA 검정에 대한 대표적인 표준 곡선을 보여준다.
도 3은 실시예 4에 기재된 바와 같은 LC-MS/MS에 의해 모니터링된 각각의 PLBL2 펩티드에 대한 대표적인 표준 곡선을 보여준다. 각각의 표준 곡선의 선형성 (R)은 > 0.99이다.
도 4는 실시예 4에 기재된 바와 같은 상이한 mAb HCCF 샘플에서의 PLBL2 비 (ppm 단위)를 보여준다. 동일한 mAb 실행으로부터의 반복 실행을 R1, R2, R3으로 나타낸다.
도 5는 실시예 4에 기재된 바와 같은 mAb G의 공정중 풀 샘플에서 측정된 바와 같은 PLBL2 클리어런스를 보여준다.
도 6은 실시예 5에 기재된 바와 같은 토끼 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정에 대한 대표적인 표준 곡선을 보여준다.
도 7은 실시예 6에 기재된 바와 같은 mAb G의 공정중 풀 샘플에서 측정된 바와 같은 PLBL2 클리어런스를 보여준다.
도 8은 실시예 7에 기재된 바와 같은 (a) 생성물 J, (b) 생성물 K, (c) 생성물 L, (d) 생성물 M, (e) 생성물 N, 및 (f) 생성물 O를 발현하는 재조합 CHO 세포주에서의 총 CHOP (g/L), PLBL2 (mg/L) 및 생성물 농도 (g/L)의 수준을 보여주며; 클론 세포주 번호는 수평축을 따라 나타낸다. 모든 측정값은 제14일 HCCF 샘플을 사용하여 수득하였다. 오차 막대는 이중 2 L 생물반응기 배양물로부터 수득된 최대 및 최소 측정값을 나타낸다.
도 9는 실시예 7에 기재된 바와 같은 (a) 생성물 J, (b) 생성물 K, (c) 생성물 L, (d) 생성물 M, (e) 생성물 N, 및 (f) 생성물 O를 발현하는 재조합 CHO 세포주에서의 PLBL2 (mg/L) 대 생성물 농도 (g/L)의 비를 보여주며; 클론 세포주 번호는 수평축을 따라 나타낸다. 비는 PLBL2 ng 대 생성물 mg에 해당되며, 백만분율 (ppm)로서 보고된다. 오차 막대는 이중 2L 생물반응기 배양물로부터의 제14일 HCCF로부터 수득된 최대 및 최소 측정값을 나타낸다.
도 10은 실시예 7에 기재된 바와 같은 생성물 P를 발현하는 48종의 세포주의 단독 진탕 플라스크 배양물에서의 PLBL2/생성물 비 (ppm)를 보여주며; 클론 세포주 번호는 수평축을 따라 나타낸다. 비는 PLBL2 ng 대 생성물 mg에 해당되며, 백만분율 (ppm)로서 보고된다. 모든 측정값은 제14일 HCCF 샘플을 사용하여 수득하였다.
도 11은 실시예 7에 기재된 바와 같은 생성물 P를 발현하는 48종의 세포주 배양물에서의 PLBL2 (mg/L), 총 CHOP (g/L), 및 생성물 농도 (g/L)를 보여준다. 이들 3종의 측정값 사이의 상관관계는 (a) PLBL2 대 생성물 농도, (b) 총 CHOP 대 생성물 농도, 및 (c) PLBL2 대 총 CHOP 농도를 플롯팅하여 평가하였다. 모든 측정값은 제14일 HCCF 샘플을 사용하여 수득하였다. 각각의 세포주를 단독 진탕 플라스크에서 배양하였다. 방정식은 선형 회귀 및 결정 계수 (R2)를 제공한다.
도 12는 실시예 7에 기재된 바와 같은 임의의 생성물 유전자를 발현하지 않는 3종의 CHO 숙주 세포주 (숙주 1, 숙주 2, 및 숙주 3)의 2 L 생물반응기 배양물에서의 PLBL2 농도를 보여준다. PLBL2 수준을 이들 블랭크 실행으로부터 수득한 (a) HCCF 및 (b) WCCF 샘플 둘 다에서 측정하였다.
도 13은 실시예 7에 기재된 바와 같은 부피측정상 통합 생존 충전 세포 부피 (IVPCV)의 함수로서 3종의 CHO 숙주 세포주 (숙주 1, 숙주 2, 및 숙주 3)의 2 L 생물반응기 배양물에서의 PLBL2 농도를 보여준다. PLBL2 수준을 이들 블랭크 실행으로부터 수득한 (a) HCCF 및 (b) WCCF 샘플 둘 다에서 측정하였다. 방정식은 선형 회귀 및 결정 계수 (R2)를 제공한다. 선형 회귀의 기울기는 1일 기준으로 단위 생존 세포 부피당 세포-특이적 PLBL2 생산성의 추정값을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다.
특정 정의
본 명세서를 해석하고자 하는 목적상, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우에는 언제라도 단수형으로 사용된 용어는 복수형을 또한 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 하기 제시된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 상충되는 경우에, 하기 제시된 정의가 우선할 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "단백질" 또는 "항체"에 대한 언급은 각각 복수의 단백질 또는 항체를 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물 등을 포함한다.
용어 "검출하는 것"은 본원에서 표적 분자의 정성적 및 정량적 측정 둘 다를 포함하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 검출하는 것은 단순히 샘플 중의 표적 분자의 존재를 확인하는 것 뿐만 아니라 표적 분자가 샘플 중에 검출가능한 수준으로 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.
"샘플"은 보다 많은 양의 물질 중 작은 부분을 지칭한다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법에 따라 시험하는 것은 샘플에 대해 수행된다. 샘플은 전형적으로, 예를 들어 본원에서 "생성물 세포주"로도 지칭되는 배양된 재조합 폴리펩티드-발현 세포주로부터 또는 배양된 숙주 세포로부터 수득된 재조합 폴리펩티드 제제로부터 수득된다. 본원에 사용된 "숙주 세포"는 관심 재조합 폴리펩티드 또는 생성물의 발현을 위한 유전자를 함유하지 않는다. 샘플은, 예를 들어 비제한적으로 수거된 세포 배양 유체로부터, 정제 공정 중 특정 단계에서의 공정중 풀로부터, 또는 최종 정제된 생성물로부터 수득될 수 있다.
"포획 항체"는 샘플 중의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 조건 하에서, 포획 항체는 표적 분자와 복합체를 형성하여, 항체-표적 분자 복합체가 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 분리는 포획 항체가 결합하지 않는 샘플 중의 성분 또는 물질을 세척해내는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 포획 항체는 예를 들어 비제한적으로 플레이트 또는 비드와 같은 고체 지지체 표면에 부착될 수 있다.
"검출 항체"는 샘플 또는 샘플-포획 항체 조합 물질 중의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 조건 하에, 검출 항체는 표적 분자 또는 표적 분자-포획 항체 복합체와 복합체를 형성한다. 검출 항체는 증폭될 수 있는 표지를 통해 직접적으로 검출될 수 있거나, 또는 예를 들어 표지되고 검출 항체에 결합하는 또 다른 항체의 사용을 통해 간접적으로 검출될 수 있다. 직접 표지를 위해, 검출 항체는 전형적으로, 예를 들어 비오틴 또는 루테늄을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 일부 방법에 의해 검출될 수 있는 모이어티에 접합된다.
용어 "표지" 또는 "검출가능한 표지"는 검출 또는 정량화하고자 하는 물질, 예를 들어 항체에 연결될 수 있는 임의의 화학적 기 또는 모이어티를 지칭한다. 전형적으로, 표지는 물질의 민감한 검출 또는 정량화에 적합한 검출가능한 표지이다. 검출가능한 표지의 예는 발광 표지, 예를 들어 형광, 인광, 화학발광, 생물발광 및 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소, 입자, 자기 물질, 전기활성 종 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 검출가능한 표지는 특이적 결합 반응에 참여함으로써 그의 존재를 신호전달할 수 있다. 이러한 표지의 예는 합텐, 항체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 니트릴로트리아세트산, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 글루타티온 등을 포함한다.
용어 "검출 수단"은 신호 리포팅에 이어 검정에서의 판독을 통해 검출가능한 항체의 존재를 검출하는데 사용되는 모이어티 또는 기술을 지칭한다. 전형적으로, 검출 수단은 고정된 표지, 예컨대 마이크로타이터 플레이트 상에 포획된 표지를 증폭시키는 시약, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP를 사용한다.
"광발광"은 물질 발광에 이어 그러한 물질에 의한 빛 (대안적으로 전자기 방사선으로 불림)의 흡수 공정을 지칭한다. 형광 및 인광은 2종의 상이한 유형의 광발광이다. "화학발광" 공정은 화학 반응에 의한 발광 종의 생성을 수반한다. "전기-화학발광" 또는 "ECL"은 종, 예를 들어 항체가 적절한 주위 화학 환경에서 전기화학 에너지에의 노출 시 발광하는 공정이다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특히 항체를 포괄한다.
"정제된" 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)는 폴리펩티드가 순도 면에서 증가된 것을 의미하며, 이러한 폴립펩티드는 그것이 그의 자연 환경에서 존재하는 경우 및/또는 실험실 조건 하에 최초로 합성 및/또는 증폭된 경우보다 더 순수한 형태로 존재한다. 순도는 상대적 용어이고, 반드시 절대 순도를 의미하지는 않는다.
관심 항원, 예를 들어 숙주 세포 단백질에 "결합하는" 항체는 항체가 검정 시약으로서, 예를 들어 포획 항체로서 또는 검출 항체로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하는 것이다. 전형적으로, 이러한 항체는 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차-반응하지 않는다.
표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합과 관련하여, 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 그에 "특이적으로 결합하다" 또는 그에 "특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 표적 분자의 결합을 대조 분자 (일반적으로 유사한 구조이나 결합 활성을 갖지 않음)의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정될 수 있다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다.
용어 "항-PLBL2 항체" 및 "PLBL2에 결합하는 항체"는 항체가 PLBL2를 표적화하는데 있어서 작용제로서, 예를 들어 본원에 기재된 검정에서 작용제로서 유용하도록 충분한 친화도로 PLBL2, 예를 들어 햄스터 PLBL2에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항-PLBL2 항체의 비관련 비-PLBL2 단백질에 대한 결합 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의한 측정 시, 항체의 PLBL2에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, PLBL2에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
항체는 모두 이뮤노글로불린 폴드를 기반으로 하여 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 2개의 "중"쇄 및 2개의 "경"쇄를 갖고, 이는 디술피드-결합되어 기능적 항체를 형성한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 그 자체는 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, C 영역은 구조 지지체를 제공하고, 면역 이펙터와 비-항원-특이적 상호작용으로 기능한다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 가변 또는 V 영역의 구조적 특성에 의해 결정된다. 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열상 광범위하게 상이하며, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형상을 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 아주 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에의 항체의 참여를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL에서 대략적으로 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서 대략적으로 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 그러한 잔기 (예를 들어, VL에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH에서 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3)) (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 포함하고, 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 바이-scFv, 또는 탠덤 (디,트리)-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않음); 및 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 치밀한 비-공유 회합 상태의, 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 형상에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역 3개만을 포함하는 Fv의 절반)은 비록 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이기는 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 명백하게 구분되는 2가지 유형 중의 하나로 할당될 수 있다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5종의 주요 부류의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 다수는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH - VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 (즉, 1개의 생물학적 분자 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 2개 이상의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 항원-결합 도메인을 포함하는 항체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체)의 항원-결합 도메인은 2개의 VH/VL 유닛을 포함하며, 여기서 제1 VH/VL 유닛은 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고 제2 VH/VL 유닛은 제2 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 각각의 VH/VL 유닛은 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 중쇄 불변 영역의 적어도 일부 및/또는 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 추가로 포함하는 VH/VL 유닛은 또한 "반량체" 또는 "절반 항체"로도 지칭될 수 있다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각각의 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
"이중특이적 항체"는 1개의 생물학적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 2개의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 "이중 특이성"을 갖는 것 또는 "이중 특이적"인 것으로 본원에서 지칭될 수 있다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생성 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의해 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열, 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780).
본원의 목적상, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에서 인터페이스를 형성하는 것으로 여겨진다.
"네이키드 항체"는 검출 모이어티 또는 표지와 같은 이종 분자에 접합되지 않은 항체 (본원에 정의된 바와 같음)이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
용어 "오염물" 및 "불순물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 목적하는 폴리펩티드 생성물과 상이한 물질 또는 성분을 지칭한다. 오염물은 제한 없이 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 목적하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등을 포함한다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-PLBL2 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 1개 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 1개 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성 부분으로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 내의 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공중 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 구동 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우에, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭으로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 그에 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 그러한 값 또는 파라미터 그 자체에 대해 지시된 변동을 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 언급되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변경은 측면 및 변경으로 "이루어지는 것" 및/또는 "본질적으로 이루어지는 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
검정 방법
햄스터 PLBL2의 검출 및 정량화를 위한 면역검정 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 숙주 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드 제제에서의 햄스터 PLBL2의 검출 및 정량화에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 본원에 기재된 포획 및 검출 항-PLBL2 항체를 사용한다. 일부 실시양태에서, 항체는 샌드위치 검정, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 검정, 전기화학 검정 (ECL) 검정, 자기 면역검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 면역검정 방법에 사용된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 재조합 폴리펩티드 제제의 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-PLBL2 항체와, 항-PLBL2 항체가 햄스터 PLBL2에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 항-PLBL2 항체 및 햄스터 PLBL2 사이의 복합체 형성 유무를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-PLBL2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색, 전자-고밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 포획 항-PLBL2 항체는 고체 상 위에 고정된다. 일부 실시양태에서, 고정화에 사용되는 고체 상은, 예를 들어 표면, 입자, 다공성 매트릭스, 비드 등의 형태의 지지체를 비롯하여, 본질적으로 수불용성이고 면역측정 검정에 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 담체이다. 통상적으로 사용되는 지지체의 예는 소형 시트, 세파덱스(SEPHADEX)®, 겔, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드, 및 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 비롯한 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로 제조된 검정 플레이트 또는 시험 튜브, 뿐만 아니라 특정한 물질, 예컨대 여과지, 아가로스, 가교 덱스트란, 및 다른 폴리사카라이드를 포함한다. 대안적으로, 미국 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에 기재된 반응성 수불용성 매트릭스, 예컨대 시아노겐-브로마이드-활성화 탄수화물 및 반응성 기판이 포획-시약 고정화에 적합하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 고정된 포획 시약은 여러 샘플을 한 번에 분석하는데 사용될 수 있는 마이크로타이터 플레이터 상에 코팅된다. 예시적인 마이크로타이터 플레이트는 마이크로테스트(MICROTEST)®, 맥시소르프(MAXISORP)®, 눈크 맥시소르브(NUNC MAXISORB)®, 및 이뮬론(IMMULON)®을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고체 상은 상기 정의된 바와 같은 포획 시약으로 코팅되고, 이는 목적하는 바와 같이 비-공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 연결에 의해 연결될 수 있다. 부착 기술은 미국 특허 번호 4,376,110 및 그에 인용된 참고문헌에 기재된 것을 포함한다. 공유일 경우에, 플레이트 또는 다른 고체 상을 포획 시약과 함께 가교제와, 관련 기술분야에 널리 공지된 조건 하에, 예컨대 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 일부 실시양태에서, 플레이트를 검정에 앞서 그 자체를 길게 적층 및 코팅한 다음, 수동, 반-자동, 또는 자동 방식으로, 예컨대 로봇공학을 사용함으로써 여러 샘플에 대해 동시에 검정을 수행한다.
일부 실시양태에서, 플레이트의 웰 상의 과다 부위에 유리 리간드가 원치않게 결합하는 것을 방지하기 위해, 코팅된 플레이트는 결합 부위에 비-특이적으로 결합하고 이를 포화시키는 차단제로 처리된다. 이러한 목적을 위한 적절한 차단제의 예는, 예를 들어 젤라틴, 소 혈청 알부민, 난 알부민, 카세인 및 탈지유를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 차단 처리는 전형적으로 주위 온도의 조건 하에 전형적으로 약 1-4시간의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 코팅 및 차단 후에, 적절하게 희석된 분석하고자 하는 샘플을 고정된 상에 첨가한다. 이러한 목적을 위해 희석에 사용될 수 있는 예시적인 완충제는, (a) 0.5% BSA, 0.05% 트윈(TWEEN) 20® 세제 (P20), 0.05% 프로클린(PROCLIN)® 300 항생제, 5 mM EDTA, 0.25% 3-((3-콜아미도프로필)디메틸암모니오)-1-프로판술포네이트 (CHAPS) 계면활성제, 0.2% 베타-감마 글로불린, 및 0.35M NaCl을 함유하는 포스페이트-완충 염수 (PBS); (b) 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.05% P20, 및 0.05% 프로클린® 300을 함유하는 PBS, pH 7; (c) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% 프로클린® 300, 5 mM EDTA, 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS, pH 6.35; (d) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% 프로클린® 300, 5 mM EDTA, 0.2% 베타-감마 글로불린, 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS; 및 (e) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% 프로클린® 300, 5 mM EDTA, 0.25% CHAPS, 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
샘플 및 고정된 포획 시약의 인큐베이션을 위한 조건은 검정의 감도를 최대화하고, 해리를 최소화하고, 샘플 중에 존재하는 임의의 관심 분석물 (예컨대 햄스터 PLBL2)이 고정된 포획 시약에 결합하는 것을 확실하게 하기 위해 선택된다. 임의로, 샘플은 비포획된 물질을 제거하기 위해 고정된 포획 시약으로부터 분리된다 (예를 들어, 세척에 의함). 세척에 사용되는 용액은 일반적으로 완충제 (예를 들어, "세척 완충제")이다. 포획된 관심 물질이 후속 단계에서 어느 정도 해리될 수 있는 임의의 우려가 존재하는 경우에, 현재-결합된 관심 물질 (예를 들어, 햄스터 PLBL2)이 포획 시약에 공유적으로 부착되게 하는 가교제 또는 다른 적합한 작용제가 또한 이 단계에 첨가될 수 있다.
임의의 결합된 관심 물질이 존재하는 고정된 포획 시약을 검출 항-PLBL2 항체와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 검출 항체는 비오티닐화된다. 일부 실시양태에서, 비오티닐화 표지의 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP이다. 일부 실시양태에서, 검출 수단의 판독은 형광측정 또는 비색측정에 의한다.
검출 항체에 대한 검출 수단을 사용하여, 현재 포획 시약에 결합되어 있는 샘플로부터의 임의의 유리 관심 물질 (예를 들어, 햄스터 PLBL2)의 수준을 측정하거나 정량화한다. 일부 실시양태에서, 측정 또는 정량화는 상기 단계의 결과로서 발생한 반응을 표준 곡선과 비교하여 공지된 양 대비 관심 물질 (예를 들어, 햄스터 PLBL2)의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
고정된 포획 시약에 첨가된 항체는 직접적으로 표지되거나, 또는 과잉의 제1 항체의 세척 후, 제1 항체의 동물 종의 IgG에 대해 지시되는 몰 과잉의 제2, 표지된 항체의 첨가에 의해 간접적으로 검출될 것이다. 후자의 간접 검정에서, 표지된 항체를 계내 생산하도록 제1 항체에 대한 표지된 항혈청을 샘플에 첨가한다.
제1 또는 제2 항체에 대해 사용되는 표지는 제1 또는 제2 항체에 대한 유리 관심 물질 (예를 들어, 햄스터 PLBL2)의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 적합한 표지의 예는 면역검정에서의 사용에 대해 공지되어 있는 것, 예컨대 상기 열거된 것을 포함한다.
이들 표지를 단백질 또는 폴리펩티드에 공유 결합시키기 위해 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체를 상기-기재된 형광, 화학발광 및 효소 표지로 태그부착하기 위해 커플링제, 예컨대 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,940,475 (형광측정법) 및 미국 특허 번호 3,645,090 (효소); 문헌 [Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 표지는 검출 수단을 위해 스트렙타비딘-HRP를 사용하는 비오틴이다.
효소를 비롯한 이러한 표지를 항체에 접합시키는 것은 면역검정 기술에서 통상의 기술자에게 표준 조작 절차이다. 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166]을 참조한다.
마지막 표지된 항체를 첨가한 후에, 과잉의 결합되지 않은 표지된 항체를 세척을 통해 제거한 다음, 표지에 적절한 검출 방법을 사용하여 부착된 표지의 양을 측정 또는 정량화하고, 측정된 양을 생물학적 샘플 중의 관심 항체의 양과 상호관련시킴으로써, 결합된 항체의 양을 결정한다. 예를 들어, 효소의 경우에, 발색되고 측정되는 색의 양은 존재하는 관심 항체의 양의 정량화를 가능하게 하는 직접적인 척도일 것이다. 한 실시양태에서, HRP는 표지이고, 색은 기질 OPD를 사용하여 490-nm 흡광도에서 검출된다.
한 예에서, 제1 비표지된 항체에 대해 지시되는 효소-표지된 제2 항체를 고정된 상으로부터 세척한 후에, 고정된 포획 시약을 효소의 기질과 함께 인큐베이션시킴으로써 색 또는 화학발광을 발색시키고 측정한다. 이어서, 표준 실행에 의해 생성된 색 또는 화학발광을 평행하게 비교함으로써 관심 물질 (예를 들어, 햄스터 PLBL2)의 농도를 계산한다.
폴리펩티드
예시적인 항-햄스터 PLBL2 항체
본원에 기재된 임의의 검정 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드가 제공된다. 한 측면에서, 햄스터 PLBL2에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 (a) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; (b) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; (c) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; (d) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; (e) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 (f) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체 ("19C10")는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 13 및 서열 18의 CDR 서열과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-PLBL2 항체는 서열 14의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-PLBL2 항체는 PLBL2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 14에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PLBL2 항체는 서열 14의 VH 서열을 포함하며, 그러한 서열의 번역후 변형을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 항-PLBL2 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-PLBL2 항체는 PLBL2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 19에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PLBL2 항체는 서열 19의 VL 서열을 포함하며, 그러한 서열의 번역후 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 (a) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; (b) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; (c) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; (d) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; (e) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 (f) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PLBL2 항체 ("15G11")는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 3 및 서열 8의 CDR 서열과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-PLBL2 항체는 서열 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-PLBL2 항체는 PLBL2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 4에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PLBL2 항체는 서열 4의 VH 서열을 포함하며, 그러한 서열의 번역후 변형을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 항-PLBL2 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-PLBL2 항체는 PLBL2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 9에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PLBL2 항체는 서열 9의 VL 서열을 포함하며, 그러한 서열의 번역후 변형을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-PLBL2 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 본원에 기재된 항-PLBL2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 또한 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 14의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함하는, 항-PLBL2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 4의 VH 서열 및 서열 9의 VL 서열을 포함하는, 항-PLBL2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-PLBL2 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-PLBL2 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편이다.
예시적인 재조합 폴리펩티드
또한, 재조합 폴리펩티드 및 그의 제제가 제공되며, 그의 샘플은 본원에 기재된 방법에 의해 검정될 수 있다. 이러한 재조합 폴리펩티드의 예는 이뮤노글로불린, 이뮤노어드헤신, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 및 인터류킨, 포유동물 단백질, 예컨대 예를 들어 레닌; 호르몬; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 정상 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 효소; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); 시토카인; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 융합 폴리펩티드, 즉 2개 이상의 이종 폴리펩티드 또는 그의 단편으로 구성되고 재조합 핵산으로 코딩된 폴리펩티드; Fc-함유 폴리펩티드, 예를 들어 제2 폴리펩티드에 융합된 이뮤노글로불린 Fc 영역 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질; 면역접합체; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어 AIDS 외피 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 CA125 (난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 이뮤노어드헤신; 및 임의의 상기 열거된 단백질의 단편 및/또는 변이체, 뿐만 아니라 예를 들어 임의의 상기 열거된 단백질을 비롯한 단백질에 결합하는 항체 단편을 비롯한 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 검정 방법에서의 사용을 위한 폴리펩티드 제제는 관심 항체를 함유하며, 즉 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드는 항체이다.
이러한 항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 그의 리간드, 예컨대 비제한적으로: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a), 및 CD79β (CD79b); (ii) ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 알파 또는 베타 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 및 (v) 세포 표면 및 막횡단 종양-연관 항원 (TAA), 예컨대 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 것을 포함한다.
다른 예시적인 항체는 제한 없이, 항에스트로겐 수용체 항체, 항프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체로부터 선택된 것을 포함한다.
폴리클로날 항체
일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 폴리펩티드, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 폴리펩티드 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 다중 부위에 피내로 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 중 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 일부 실시양태에서, 상이한 폴리펩티드에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합되었으나 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 폴리펩티드 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반이 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.
모노클로날 항체
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체 또는 폴리클로날 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 비융합 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시양태에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고, 배지, 예컨대 HAT 배지에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 일부 실시양태에서 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 식별한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어, 폴리펩티드 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의해) 용이하게 단리 및 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 위치시킬 수 있고, 이어서 달리 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리를 각각 기재한다. 이후의 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))을 기재한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 또한 예를 들어 상동 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결시킴으로써 변형될 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 치환시키거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환시켜 항원에 대한 특이성을 갖는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 모노클로날 항체이다.
항체 단편
일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 예를 들어 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
폴리펩티드 변이체 및 변형
본원에 기재된, 항체를 비롯한 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형(들)이 본원에 기재된 폴리펩티드 제제 (예를 들어, 항체)를 검정하는 방법에 사용될 수 있다.
변이체 폴리펩티드
"폴리펩티드 변이체"는 폴리펩티드의 전장 천연 서열, 신호 펩티드가 결여된 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 예를 들어 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 폴리펩티드 변이체는 전장 천연 서열 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 결여된 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대해 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 임의의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 임의로, 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
변이체 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장 천연 폴리펩티드와 비교하여 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 변이체 폴리펩티드는 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여될 수 있다. 말단절단, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩티드는 임의의 다수의 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 목적하는 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 적합한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한, 목적하는 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 단편의 단리 및 증폭을 수반한다. 핵산 단편의 목적하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 천연 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
예를 들어, 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달하고, 단 최종 구축물은 목적하는 특징을 보유한다. 아미노산 변화는 또한 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 번역후 공정을 변경시킬 수 있고, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
어느 아미노산 잔기가 목적하는 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지 결정하는데 있어서의 지침은 폴리펩티드의 서열을 공지된 상동 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 발견할 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu), 이는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치가, 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입하는 것에 의해 정밀화된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되며, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 항체 변이체를 목적 활성에 대해 스크리닝한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 상이한 잔기에 의해 대체된다. 치환 돌연변이유발을 위한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환은 하기 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서 변화를 발생시키는 경우에, 표 1에서 "예시적인 치환"이라 명명된, 또는 아미노산 부류에 관하여 하기에 추가로 기재된 바와 같은, 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
Figure pat00001
폴리펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 폴리펩티드에 부가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
치환 변이체의 한 예는 모 항체 (예를 들어, 인간화 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 수반한다. 간략하게, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)를 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 식별하기 위해, 알라닌-스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체 및 표적 사이의 접촉점을 식별하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체 패널은 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝에 적용되고, 하나 이상의 관련 검정에서 뛰어난 특성을 갖는 항체가 추가 개발을 위해 선택될 수 있다.
폴리펩티드의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 폴리펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 이러한 글리코실화는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드가 발현되는 동안 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 인간 개입에서 비롯되는 의도적 변형일 수 있다. 변경은 폴리펩티드에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 및/또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 측쇄에의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착된 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.
폴리펩티드에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 1개 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).
폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화의 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성할 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
키메라 폴리펩티드
본원에 기재된 폴리펩티드는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 폴리펩티드가 용이하게 정제되게 할 수 있다.
검정 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드의 수득
본원에 기재된 검정 방법에 사용되는 폴리펩티드는 재조합 방법을 비롯한, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 하기 섹션은 이들 방법에 대한 지침을 제공한다.
(A) 폴리뉴클레오티드
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된, cDNA 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 편리하게는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 이뮤노글로불린 분자 쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하고, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 바람직할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 (전형적으로) CH1 및 CK 또는 CL 도메인이 절제된 2가 항체 단편이다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 이들은 임상/진단 용도에서 보다 우수한 조직 침투를 달성할 것이지만, 2가이기 때문에 이들은 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 높은 결합 친화도를 보유할 것이다. 따라서, 문맥상 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자 뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포괄한다. 바람직하게는 코딩된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크와 관련하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역과 관련하여 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 분자가 그의 정상 또는 자연 환경에서 제거 또는 분리되거나, 또는 그것이 그의 정상 또는 자연 환경에 존재하지 않는 방식으로 생산되는 것을 나타내도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 정제된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 정제된은 적어도 일부 오염 분자 또는 물질이 제거된 것을 나타내도록 의도된다.
적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 관련 폴리뉴클레오티드가 조성물에 존재하는 우세한 (즉, 가장 풍부한) 폴리뉴클레오티드를 구성하도록 실질적으로 정제된다.
(B) 폴리뉴클레오티드의 발현
하기 설명은 주로 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, 폴리펩티드를 제조하기 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 대안적 방법을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 그의 부분은 고체-상 기술을 사용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하거나 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 다양한 부분은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 목적하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 벡터(들) 내에 삽입된다. 용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체 내에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 제어 서열은 프로모터 (예를 들어, 자연-회합 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 기능적 관계로 배치된 경우에 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 핵산은 그것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 핵산에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 핵산 서열이 인접한 것을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
항체의 경우에, 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 핵산 절편은 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 코딩 서열 및 임의적인 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에 대해서는 통상적으로 염화칼슘 형질감염이 사용되고, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱 또는 바이러스-기반 형질감염이 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. (일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)] 참조). 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미세주사의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물의 생산을 위해, 트랜스진은 수정된 난모세포 내에 미세주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 이러한 세포의 핵은 제핵 난모세포 내로 전달될 수 있다.
(C) 벡터
용어 "벡터"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터 및 셔틀 벡터를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 구축물을 의미한다.
용어 "형질전환 벡터"는 하나의 엔티티에서 또 다른 엔티티로 전달될 수 있는 구축물을 의미하고 - 이는 해당 종의 것일 수 있거나 상이한 종의 것일 수 있다. 구축물이 하나의 종에서 또 다른 종으로 - 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 플라스미드에서 박테리아, 예컨대 바실루스(Bacillus) 속으로 전달될 수 있는 경우에, 형질전환 벡터는 때때로 "셔틀 벡터"로 불린다. 이는 심지어 이. 콜라이 플라스미드에서 아그로박테리움(Agrobacterium)까지, 식물까지 전달될 수 있는 구축물일 수 있다.
벡터는 하기 기재된 바와 같은 적합한 숙주 세포를 형질전환시켜 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있다. 다양한 벡터가 공중 이용가능하다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열을 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 관련 기술분야 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입한다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 통상의 기술자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
벡터는, 복제 기점, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절제를 갖는 한, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 1개 이상의 선택 마커 유전자를 함유할 수 있다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다.
(D) 숙주 세포
숙주 세포는 예를 들어 박테리아, 효모 또는 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 관심 재조합 폴리펩티드 또는 생성물을 코딩하는 외인성 핵산을 함유하지 않지만, 숙주 세포는 그의 발현이 특정 조건 하에서 세포에 바람직한 형질을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산, 예를 들어 항생제 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다.
유전자 조작된 트랜스제닉 다세포 숙주 유기체는 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 유기체는 예를 들어 트랜스제닉 포유동물 유기체 (예를 들어, 트랜스제닉 염소 또는 마우스 계통)일 수 있다.
적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공중 이용가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아, 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스(Bacilli), 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 폴리뉴클레오티드 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 1종의 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이가 발생하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 저항성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
진핵 미생물이 발현에 사용될 수 있다. 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것은 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans), 및 에이. 니거(A. niger)를 포함한다. 메틸영양 효모가 본원에 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피키아, 사카로미세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사카로미세스는 목적하는 바와 같은 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등이 존재하는 적합한 벡터를 갖는 바람직한 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히 알콜 데히드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물 뿐만 아니라, 또한 포유동물 조직 세포 배양물을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 발현 및 생산할 수 있고, 이는 일부 경우에 바람직하다 (문헌 [Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)] 참조). 일부 실시양태의 경우에, 이종 폴리펩티드 (예를 들어, 무손상 이뮤노글로불린)를 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 관련 기술분야에서 개발되어 왔기 때문에, 진핵 세포가 바람직할 수 있고, 이는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO 또는 CHO-DP-12 세포주); 마우스 세르톨리 세포; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
재조합 방법
본원에서 생성물, 예컨대 항체로도 지칭되는 관심 재조합 폴리펩티드는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드, 예컨대 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 이러한 핵산에 의해 형질전환 또는 형질감염되어 재조합 폴리펩티드-발현 세포 또는 생성물 세포가 생성된다. 한 이러한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드-발현 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 그에 의해 형질전환된다).
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 생성물을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 폴리펩티드-발현 세포를 생성물의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 임의로 세포 (또는 세포 배양 배지)로부터 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.
제조 물품
본원에 기재된 방법에 사용되는 폴리펩티드는 제조 물품 내에 함유될 수 있다. 제조 물품은 폴리펩티드(들)를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은: (a) 용기 내에 본원에 기재된 폴리펩티드(들)를 포함하는 조성물을 포함하는 용기; 및 (b) 폴리펩티드(들)를 검정 방법에서 사용하는 것에 대한 지침이 담긴 패키지 삽입물을 포함한다.
제조 물품은 용기, 및 용기 위에 있거나 용기에 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시험 튜브 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 폴리펩티드 조성물을 수용하거나 함유한다. 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 폴리펩티드이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 검정에서의 조성물의 용도를 양 및 인큐베이션 시간에 관한 구체적 지침과 함께 나타낸다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터를 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다. 따라서, 분명하게 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 일련의 포괄적인 동등하거나 유사한 특색의 예이다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
하기 실시예 및 본원의 다른 부분에 사용된, "PLB2" 및 "PLBL2" 및 "PLBD2"는 상호교환가능하게 사용되고, 효소 "포스포리파제 B-유사 2" 또는 그의 동의어, "포스포리파제 B-도메인-유사 2"를 지칭한다.
실시예 1 - 일반적 방법
MAb 공급원료
모든 실시예를 위한 MAb 공급원료를 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 산업적, 파일럿 또는 소규모 세포 배양 배치로부터 선택하였다. 세포 배양 발효 기간 후에 세포를 분리하고, 특정 경우에 정화된 유체 (수거된 세포 배양 유체, HCCF)를 하기 실시예에 제시된 바와 같은 단백질 A 크로마토그래피 및 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 단계 및 여과 단계에 의해 정제하였다. 다양한 정제 단계에서의 HCCF 또는 공정중 풀을 사용하여 실시예 3 및 5에 기재된 ELISA 검정의 성능을 조사하였다. 실시예 3 ELISA 검정을 사용한 결과를 실시예 4에 기재하고, 실시예 5 ELISA 검정을 사용한 결과를 실시예 6에 기재한다.
MAb 정량화를 위한 분광광도측정 방법
항체의 농도를 UV-가시 분광광도계 (8453 모델 G1103A; 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 또는 나노드롭(NanoDrop) 1000 모델 ND-1000 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific); 미국 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 280 및 320 nm에서의 흡광도를 통해 결정하였다. 항체 이외의 종 (즉, 불순물)은 UV 흡광도에 대해 인지가능한 효과를 갖기에는 농도가 너무 낮았다. 필요에 따라, 샘플을 0.1-1.0 흡광도 단위 범위의 적절한 비-간섭 희석제로 희석하였다. 샘플 제조 및 UV 측정을 이중으로 수행하고, 평균 값을 기록하였다. mAb 흡광 계수는 1.42 내지 1.645/mg·ml·cm 범위였다.
생성물 정량화 (생성물 농도 검정)를 위한 친화성 크로마토그래피/HPLC 방법
생성물 농도 검정은 단백질 A에 결합하는 폴리펩티드의 측정을 위한 친화성 크로마토그래피 방법이다. 상기 방법은 친화성 크로마토그래피를 수행하기 위한 수단으로서 HPLC를 사용할 수 있다. 이러한 검정에 의해 측정될 수 있는 생성물은 임의의 Fc-함유 폴리펩티드를 포함하고, 예를 들어 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 절반 항체를 비롯한 항체 단편, 및 이뮤노어드헤신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 고정된 단백질 A (대략 1 mg)를 함유하고 대략 0.1 mL 부피의 친화성 크로마토그래피 칼럼 (2.1-mm 직경 x 30-mm 길이, 20-μm 입자 크기)을 상기 방법에 사용하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼은 관련 기술분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있고, 또한 예를 들어 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 상업적으로 입수가능하다. 샘플, 및 상이한 IgG 농도의 4종의 표준물을 포스페이트 완충 염수 로딩 완충제 중에서 칼럼에 적용하였다 (20 uL 표준 주입 부피). 전형적으로, 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF)이고, 생성물은 칼럼으로부터 2% 아세트산/100 mM 글리신 (pH 2.5)에 의해 2 mL/분의 유량으로 용리시켰다. 적절한 생성물의 흡광 계수를 사용하여 용리된 물질의 피크 면적을 4개 지점 IgG 표준 곡선의 피크 면적과 비교하여, 생성물 분석물의 양을 계산하였다. 검정의 범위는 전형적으로 0.025 mg/mL - 4.0 mg/mL였다. 생성물 농도를 하기 식에 따라 결정하였다: mg/mL IgG = HPLC 값 (mg/mL) x (표준 물질의 흡광 계수/샘플 물질의 흡광 계수).
총 CHO 숙주 세포 단백질 (CHOP) 정량화
ELISA를 사용하여 CHOP으로 불리는 총 숙주 세포 단백질의 수준을 정량화하였다. 생성물 중 CHO 단백질을 검출하는데 사용된 ELISA는 샌드위치 ELISA 포맷을 기반으로 하였다. CHOP에 대한 친화도-정제된 폴리클로날 항체를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 이어서 표준물, 대조군, 및 샘플을 개별 웰에 이중으로 로딩하였다. CHOP이 샘플 중에 존재한다면, 이는 코팅된 항체 (폴리클로날 항-CHOP)에 결합할 것이다. 인큐베이션 단계 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된-항-CHOP 폴리클로날 항체를 플레이트에 첨가하였다. 최종 세척 단계 후에, KPL (키르케가드 & 페리 래보러토리즈, 인크.(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.), 메릴랜드주 게이더스버그, 카탈로그 번호 53-00-03)로부터 슈어블루 리저브(SUREBLUE RESERVE)™로서 또한 입수가능한 테트라메틸 벤지딘 (TMB) 용액 (이는 HRP 효소에 의해 영향을 받는 경우에 비색 신호를 생성함)을 첨가하여 CHOP를 정량화하였다. 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 각각의 웰에서 측정하였다. 5-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스(SOFTMAX)® 프로, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 샘플 CHOP 농도를 표준 곡선으로부터 산출하였다. 총 CHOP ELISA에 대한 검정 범위는 5 내지 320 ng/ml였다. ng/mL 단위의 CHOP 농도는 보정물로서 CHOP 표준물을 사용한 샘플에서의 CHOP의 양을 지칭한다. CHOP 비 (ng/mg 또는 ppm 단위)는 CHOP 농도 대 생성물 농도의 계산된 비를 지칭하고, 특정 경우에 시험 방법에 대해 보고된 값이다. 총 CHOP ELISA를 사용하여 샘플 중 총 CHOP 수준을 정량화할 수는 있지만, 개개의 단백질의 농도를 정량화할 수는 없다.
상업적으로 입수가능한 PLBL2 ELISA 검정 키트
본 발명자들은 PLBL2를 검출하기 위한 목적으로 시판되는 2종의 상업적으로 입수가능한 키트 중 어떤 것이 재조합 항체 제제에서 PLBL2를 검출할 수 있을 것인지, 그렇다면 그것이 적절한 정량화를 제공할 것인지 여부를 시험하였다. 시험된 첫번째 키트는 USCN 라이프 사이언스 인크.(USCN Life Science Inc.)로부터의 인간 포스포리파제 B (PLB) E92048Hu에 대한 ELISA 검정 키트였다. 이 키트는 인간 조직 균질물 및 다른 생물학적 유체에서의 PLB의 시험관내 정량적 측정을 위한 샌드위치 ELISA로서 기재되어 있다. 본 검정에서 시험된 샘플은 질량 분광측정 검정 (하기 추가로 기재됨)에 의해 PLBL2 불순물의 수준이 대략 300 ng/mg인 것으로 결정된 1종의 공지된 햄스터 PLBL2의 양성 공급원 (CHO 세포로부터 정제된 재조합 항체 제제)을 포함하였다. CHO 세포로부터 정제되고 어떠한 검출가능한 PLBL2도 없는 것으로 공지된 제2 재조합 항체 제제를 또한 시험하였다. 키트에 포함된 인간 PLBL2 표준물이 0.3-20 ng/ml의 범위에 걸쳐 검출되었음을 보여주는 표준 곡선이 생성되었지만 (도 1a), 시험 샘플의 반응성은 전혀 검출되지 않았다. 항체 제제 둘 다는 10 mg/mL (양성 샘플에서 약 3,000 ng/mL PLBL2에 해당함)에서 시험되었고, 10 mg/mL에서 약 1.3 mg/mL (양성 샘플에서 375 ng/mL PLBL2에 해당함)로 하향 4회 2-배 연속 희석되어 시험되었다. 항체 제제 둘 다는 모든 희석에서 동일한 결과, 약 0.1 AU, 예를 들어 배경 OD를 나타내었다. 햄스터 PLBL2를 함유하는 것으로 공지된 샘플과, 이러한 불순물을 함유하지 않는 것으로 공지된 것 사이에 어떠한 차이도 존재하지 않았다. 샘플 희석의 함수로서 어떠한 차이도 존재하지 않았고, 이는 본 발명자들의 샘플에서 햄스터 PLBL2를 정량화하는 능력이 없음을 나타낸다. 본 발명자들은 이러한 키트 내의 항체가 본 발명자들의 샘플에서 햄스터 PLBL2 불순물을 인식하지 못하는 것으로 결론내렸다.
시험된 다른 키트는 쿠사바이오로부터의 햄스터 추정 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) ELISA 키트, 카탈로그 CSB-EL018125Ha였다. 이 키트는 혈청, 혈장, 조직 균질물, 세포 용해물에서 햄스터 추정 포스포리파제 B-유사 (PLBD2) 농도의 정량적 결정을 제공한다고 주장하였다. USCN 라이프 사이언스 인크. 키트로 시험한 것과 동일한 샘플을 또한 이 키트로 검정하였다. 키트에 포함된 햄스터 PLBL2 표준물이 0.12-8 ng/ml의 범위에 걸쳐 검출되었음을 보여주는 표준 곡선이 생성되었지만 (도 1b), 시험 샘플의 반응성은 전혀 검출되지 않았다. 상기 기재된 바와 같이, 항체 제제 둘 다는 10 mg/mL (양성 샘플에서 약 3,000 ng/mL PLBL2에 해당함)에서 시험되었고, 10 mg/mL에서 약 625 μg/mL (양성 샘플에서 188 ng/mL PLBL2에 해당함)로 하향 5회 2-배 연속 희석되어 시험되었다. 항체 제제 둘 다는 모든 희석에서 동일한 결과, 약 0.4 AU, 예를 들어 배경 OD를 나타내었다. 햄스터 PLBL2를 함유하는 것으로 공지된 샘플과, 이러한 불순물을 함유하지 않는 것으로 공지된 것 사이에 어떠한 차이도 존재하지 않았다. 샘플 희석의 함수로서 어떠한 차이도 존재하지 않았고, 이는 본 발명자들의 샘플에서 햄스터 PLBL2를 정량화하는 능력이 없음을 나타낸다. 본 발명자들은 이러한 키트 내의 항체가 본 발명자들의 샘플에서 햄스터 PLBL2 불순물을 인식하지 못하는 것으로 결론내렸다.
본 발명자들은 따라서, 이들 상업적으로 입수가능한 검정이 햄스터 PLBL2에 대해 양성인 것으로 공지된 샘플에서 햄스터 PLBL2를 정량화하지 못하는 것으로 결론내렸다. 한 가지 설명은 이들 검정에서의 항-PLBL2 항체가 본 발명자들의 샘플에서 발견되는 햄스터 (CHO)-PLBL2에 대해 친화도가 낮다는 것이다. 또 다른 설명은 본 발명자들의 샘플에서와 같이 높은 수준의 재조합 인간 IgG를 함유하는 샘플 매트릭스 중에 CHO-PLBL2가 존재하는 경우에, 항-PLBL2 항체는 이를 검출하지 못한다는 것이다. 이들 결과는 본 발명자들의 재조합 항체 제제에서 PLBL2 불순물의 검출 및 정확한 정량화를 가능하게 하는 새로운 항-PLBL2 항체 및 새로운 검정 조건을 개발할 필요성을 나타낸다. 그러한 노력이 하기 실시예에 기재된다.
실시예 2 - 햄스터 PLBL2에 결합하는 항체의 생성
항체 제제에서 불순물로서 PLBL2의 확인은 본 발명자들로 하여금 유전자를 합성하고, 이어서 햄스터 PLBL2를 발현시키고 정제하도록 유도하였다. PLBL2에 대한 문헌은 그것이 대략 66 kD 분자량의 리소솜 효소인 것으로 기재한다 (F. Deuschl et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006)). 다른 리소솜 효소와 마찬가지로, 이 단백질은 만노스-6-포스페이트에 의한 다중 번역후 변형을 함유하고, 원래 프리-프로효소로서 합성된다. 프로세싱 동안 리더 서열이 클리핑되고, 단백질분해 클립이 생성되며, 이는 SDS-PAGE 겔 상에서 3개의 밴드: 무손상 PLBL2 (MW 66 kD), N-말단 도메인 (28 kD) 및 C-말단 도메인 (40 kD)으로서의 단백질 전개를 생성한다. 클리핑은 산성 pH 수준에서 일어난다. N-도메인 및 C-도메인이 SDS-PAGE 상에서 분리되기는 하지만, 본 발명자들은 단편을 분리시키는데 강력한 용매 (예를 들어, 우레아, 구아니딘, 또는 에탄올)가 필요하다는 것을 관찰했기 때문에, 단편은 자연 조건에서는 아마도 분리되지 않을 것이다. 추가로, 결정학 연구를 위해 PLBL2를 정제한 다른 실험실에서도 또한 이러한 클립을 관찰하였고, 클리핑된 단백질로부터 무손상 단백질을 크로마토그래피 방법에 의해 분리할 수 없었다 (F. Deuschl et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006); A. Jensen et al., Biochem Journal 402, 449-458 (2007), F. Lakomek et al., BMC Structural Biology 9:56 (2009)).
가용성 햄스터 (크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)) PLBL2를 코딩하는 DNA를 공중 이용가능한 서열 정보로부터 합성하고 (하기 예시적인 핵산 및 아미노산 서열에 대한 서열 표 참조), 히스티딘 (his) 태그의 첨가를 비롯한 관련 기술분야에 공지된 전형적인 방법을 사용하여 표준 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 가용성 PLBL2는 CHO-K1 세포 (ATCC® CRL9618™)에서 일시적으로 발현되었다. 세포 배양 상청액을 수거하고 (HCCF로 지칭함), 하기 방법을 사용하여 PLBL2를 정제하였다.
수거된 세포 배양 유체 (HCCF)를 10 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 막을 사용하여 접선 흐름 여과 (TFF)에 의해 10-배 한외여과 (UF)하였다. UF HCCF를 10 부피의 포스페이트-완충 염수 (PBS), NaCl 완충제에 대해 투석여과 (DF)하였다. UF/DF HCCF를 Ni-NTA 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 칼럼 (퀴아젠(QIAGEN), 카탈로그 번호 30622)에 적용하고, 증가하는 이미다졸 구배로 용리시켰다. Ni-NTA 풀을 황산나트륨을 함유하는 완충제로 조건화한 다음, 옥틸-세파로스 CL-4B 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 칼럼 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 제품 번호 17-0790-01)에 적용하였다. 옥틸-세파로스 칼럼을 감소하는 황산나트륨 구배로 용리시켰다. 옥틸-세파로스 풀을 Ni-NTA 칼럼 상에서 재-크로마토그래피하고, 고농도의 이미다졸로 단계-용리시켰다. Ni-NTA 재-크로마토그래피 풀을 10 kDa 분자량 컷오프 막이 구비된 원심 여과 유닛 (밀리포어(Millipore))을 사용하여 농축시켰다. 농축된 Ni-NTA 재-크로마토그래피 풀을 슈퍼덱스(Superdex) 200 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 칼럼 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스, 제품 번호 17-1043-02) 상에서 제제화하였다. 슈퍼덱스 200 칼럼으로부터의 분획을 수집하고, 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 웨스턴 블롯 방법 (총 차이니즈 햄스터 난소 단백질, CHOP에 대한 항체 (제넨테크, 인크.), 및 포스포리파제 B2에 대한 상업적으로 입수가능한 항체 사용)에 의해 분석하여 순도를 결정하였다.
모노클로날 항체를 생성하기 위해, 5마리의 Balb/c 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈 인터내셔널, 인크.(Charles River Laboratories International, Inc.), 캘리포니아주 홀리스터)를 대사가능한 스쿠알렌 (4% v/v), 트윈 80 (0.2% v/v), 트레할로스 6,6-디미콜레이트 (0.05% w/v) 및 모노포스포릴 지질 A (0.05% w/v; 모든 성분은 미국 소재의 시그마 알드리치로부터 수득함)를 함유하는 아주반트 중의 정제된 재조합 가용성 PLBL2로 3-4일 간격으로 각각 발바닥 및 복강내로 면역화하였다. 6회 주사 후에, 표준 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 혈청 역가를 평가하여 PLBL2에 대해 양성 혈청 역가를 갖는 마우스를 확인하였다. 가장 높은 역가를 나타낸 2마리의 마우스로부터의 비장 및 림프절의 B 세포를 전기융합 (하이브리뮨(Hybrimune); 하버드 어패러투스, 인크.(Harvard Apparatus, Inc.), 매사추세츠주 홀리스톤)에 의해 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 7일 후에, 대략 5000개의 콜로니를 클론픽스-FL(Clonepix-FL) (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)을 사용하여 하이브리도마 배양 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트로 떼어내었다. 하이브리도마 상청액을 수거하고, 직접 ELISA에 의해 PLBL2 특이적 항체 생산에 대해 스크리닝하였다. ELISA에 의해 PLBL2 단백질에 대해 특이적 결합을 보이는 25개의 클론을, 옥테트(OCTET)® (포르테바이오, 인크.(ForteBio, Inc.), 캘리포니아주 멘로 파크)에 의해 측정된 바와 같은 그의 친화도를 기반으로 하여 추가로 등급화하였다. 마우스 하이브리도마 상청액을 동역학 완충제 (포르테바이오, 인크, 캘리포니아주 멘로 파크) 중에 5 μg/ml로 희석시키거나 그대로 사용하고 (농도가 5 mg/ml 미만인 경우), 항-마우스 IgG (Fv) 센서 팁 (포르테바이오, 인크. 캘리포니아주 멘로 파크) 상에 포획시킨 다음, 센서를 10 μg/ml의 PLBL2 단백질 중에 침지시켰다. 회합 및 해리 동역학 측정은 포르테바이오 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 모든 25개의 클론을 C 말단, N 말단 및 전체 PLBL2에 대한 결합에 대해 웨스턴 블롯에 의해 추가로 특성화하였다. C 또는 N 말단 또는 무손상 PLBL2 단백질에 대해 면역결합을 보인 클론 1.26G6, 1.20B5, 1.19C10, 1.15G11, 1.4E2, 1.39C10 및 1.30F3에 대한 하이브리도마 상청액을 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe); 지이 헬스케어 바이오-사이언시스, 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 정제하고, 멸균-여과하고, PBS 중 4℃에서 저장하였다. 고수율을 갖는 7개의 항체 중 4개를 비오티닐화를 위해 선택하였다. 비오티닐화 및 비-비오티닐화 항체 둘 다에 대한 결합 활성을 옥테트에 의해 확인하였다. 이어서 정제된 항체에 대해 ELISA 검정을 개발하는데 있어서 가능한 용도를 평가하였다. 2개의 항체, 1.19C10 및 1.15G11을 ELISA 검정 개발을 위해 선택하였다.
이소스트립(Isostrip) 마우스 mAb 이소형 결정 키트 (로슈 어플라이드 바이오사이언시스(Roche Applied Biosciences), 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 항체 1.19C10 및 1.15G11을 둘 다 IgG1, 카파로서 확인하였다. 각각의 이들 항체를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 293 세포 또는 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다. CHO 세포에서의 일시적 발현 동안 클론 1.15G11 및 1.19C10으로부터 항체 가변 서열을 수득하기 위해, 이전에 기재된 방법을 기반으로 한 cDNA 말단의 5' 신속 증폭 (5'RACE) 방법을 사용하였다 (예를 들어, 문헌 [Nature Methods 2, 629 - 630 (2005) 및 "Rapid amplification of 5' cDNA ends," in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (eds. Sambrook, J. & Russell, D.W.) Chapter 8 Protocol 9, 8.54-8.60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2001)] 참조). RNeasy 플러스 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 총 RNA를 배양된 하이브리도마 세포 (적어도 106개의 세포)로부터 추출하고, 스마터 레이스(SMARTer RACE) cDNA 증폭 키트 (클론테크 인크.(Clontech Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 증폭시키기 위해, cDNA의 5' 말단에 태그부착된 올리고를 표적으로 하는 범용 프라이머 A 믹스 (스마터 레이스 cDNA 증폭 키트에 포함됨) 및 마우스 IgG 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역을 표적으로 하는 역방향 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 각각 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같이 설정하였다: 1 μL cDNA, 5 μL 10x 범용 프라이머 믹스, 1 μL 10 uM 역방향 프라이머, 45 μL PCR 프리믹스 (라이프 테크놀로지스 인크., 캘리포니아주 포스터 시티); 94℃, 2분, 이어서 30 사이클 동안 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초, 및 72℃ 10분. PCR 생성물을 DNA 아가로스 겔 상에서 해상하고, 예상되는 크기 (중쇄의 경우에 700 bp 및 경쇄의 경우에 500 bp)를 갖는 PCR 생성물을 서열분석을 위해 겔로부터 정제하여 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 (VH 및 VK)의 DNA 서열을 결정하였다.
상기 기재된 VH/VK 영역을 항체 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 본 발명자들은 인-퓨전(In-Fusion)® 클로닝 방법 (클론테크, 인크.) 및 하기 프라이머를 사용하였다: 1.15G11 중쇄, 정방향 프라이머 5'-ACT GGA GCG TAC GCT GAA GTG AAG CTT GAG GAG TCT-3'(서열 23), 역방향 프라이머 5'-AAG ACC GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GTT C-3' (서열 24); 1.19C10 중쇄, 정방향 프라이머 5'-ACT GGA GCG TAC GCT GAG GTG CAG CTT CAG GAG TCA-3' (서열 25), 역방향 프라이머 5'-AAG ACC GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACT GTG AGA GTG GTG C-3'(서열 26). 1.15G11 및 1.19C10 경쇄 둘 다를 위해, 정방향 프라이머 5'-GCA ACT GCA ACC GGT GTA CAT TCA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT-3' (서열 27), 역방향 프라이머 5'-GGT GCA GCC ACG GTC CGC TTC AGC TCC AGC TTG GTA CC-3' (서열 28). 1 μL의 cDNA를 이전에 기재된 것과 동일한 조건 하의 PCR에 주형으로서 사용하였다. 이어서 항체 발현 벡터 내로의 서브클로닝을 위해 PCR 생성물을 PCR 클린-업 키트 (퀴아젠 인크.)를 사용하여 정제하였다. 마우스 IgG1 발현 벡터를 BsiWI 및 ApaI 소화에 의해 선형화하고, 마우스 카파 발현 벡터를 AgeI 및 BssHII으로 소화시켰다. 인-퓨전® 클로닝 반응을 위해, 50 ng 선형화 벡터 DNA 및 50 ng VH 또는 VK PCR 생성물을 5x 인-퓨전® 효소와 함께 혼합한 다음, 50℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 3 μL의 인-퓨전® 반응물을 형질전환을 위해 카르베니실린 (50 μg/mL) 선택 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 사용하였다. 단일 콜로니를 떼어내고, 플라스미드 DNA 정제를 위해 배양하였다. 인-프레임 VH 또는 VK 삽입물을 갖는 클론을 서열 분석에 의해 확인하였다.
재조합 항체를 상기 기재된 바와 같이 정제하고, 정제된 하이브리도마-유래 항체와 비교하였고, 직접 ELISA 및 옥테트® (포르테바이오, 인크, 캘리포니아주 멘로 파크) (상기 기재된 바와 같이 검정됨) 둘 다에 의해 대등한 것으로 확인되었다. 상기 기재된 바와 같이 생산된 재조합 항체를 각각 19C10 및 5G11로 칭하였다. 19C10 및 5G11에 대한 아미노산 서열 정보를 하기 서열 표에 제공한다.
폴리클로날 항체를 생성하기 위해, 3마리의 혈청 병원체-무함유 뉴질랜드 백색 암컷 토끼 (안티바디 솔루션스(Antibody Solutions), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 히드로겔 및 뮤라밀 디펩티드 (MDP)를 함유하는 아주반트 중의 정제된 재조합 PLBL2 (상기 기재된 바와 같음)로 2-주 간격으로, 목 뒤의 피하로 면역화하였다. 각각의 주사는 150 ug의 정제된 재조합 가용성 PLBL2를 함유하였다. 총 6회의 주사를 제0일, 제21일, 제49일, 제63일, 제84일, 및 제112일에 투여하였다. 각각의 토끼에서 제42일, 제70일, 제77일, 제91일, 제98일, 제119일 및 제126일에 총 7회 채혈하여 항체 역가를 시험하였다. 토끼를 제134일에 방혈시켰다. 대조군으로서, 각각의 토끼로부터의 면역-전 혈청을 주사 전 제0일에 수집하였다.
PLBL2에 대한 항체 반응성을 결정하기 위해, 용액 상 포획 방법에 항혈청을 사용하였다. 용액 상 포획 방법에서 3마리의 상이한 토끼 (토끼 A, B 및 C)로부터의 면역-전 및 항혈청을 1/1000 초기 희석으로부터 연속 희석시켰다. 희석된 혈청을 3ug/mL의 고정 농도의 비오티닐화 PLBL2와 2시간 동안 비-결합 96-웰 플레이트에서 인큐베이션시켰다. 이어서 용액을 슈퍼블록(Superblock) 차단 완충제 (피어스(Pierce) Prod# 15129)가 담긴 피어스 뉴트라비딘 코팅된 투명 96-웰 플레이트로 옮기고, 1시간 동안 인큐베이션시켜 비오티닐화 PLBL2를 포획시켰다. 인큐베이션 단계 후에, 미결합 물질을 세척 완충제 (0.05% 폴리소르베이트 20/PBS [코닝 셀그로(Corning Cellgro) 카탈로그 번호 99-717-CM])로 세척하였다. 퍼옥시다제 접합된 아피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-토끼 IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) 카탈로그 번호 111-035-144)를 검정 희석제 중에 1/20,000의 희석 배율로 희석하고, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 실온에서 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 IgG와의 2시간 인큐베이션 단계 후에, 세척 완충제 (상기 기재됨)에 의한 최종 세척 단계를 수행하였다. 이어서, TMB 용액 (50 ul/웰) (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL, 키르케가드 & 페리 래보러토리즈, 인크.로부터의 슈어블루 리저브™, 카탈로그 번호 53-00-03)을 첨가한 다음 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션시켜 색을 발색시켰다. 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 M5e를 사용하여 각각의 웰에서 450 nm에서 광학 밀도 (OD)를 평가하여 검출을 수행하였다. 5-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스 프로 v5.2 rev C)을 사용하여 데이터를 프로세싱하였다.
상기 기재된 용액 상 포획 실험에 기초하여, 모든 3마리의 토끼로부터의 항혈청이 PLBL2에 대해 양호한 품질의 항체를 발생시킨다는 것을 발견하였다. 모든 3마리의 토끼에 대한 면역-전 혈청은 PLBL2에 대해 친화도를 갖지 않았다. 모든 3마리의 토끼가 PLBL2에 대해 유사한 반응 곡선을 가졌기 때문에, 모든 3마리의 토끼로부터의 방혈 채혈로부터의 항혈청을 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정 (하기 실시예 5에 기재됨)을 위한 단일 로트로 합하였다.
풀링된 토끼 항혈청을, 혈청 중 모든 항체를 침전시키는 60% 황산암모늄으로 초기 분획화하였다. 친화성 크로마토그래피를 사용하여 PLBL2에 대해 생산된 항체를 선택하였다. PLBL2를 글리세릴-CPG 상에 고정시키고, 겔을 크로마토그래피 칼럼 내에 패킹시켰다. 60% 황산암모늄 펠릿을 PBS, pH 7.2 중에 용해시키고, PLBL2-CPG 칼럼에 로딩하였다. 로딩을 완료한 후에, 칼럼을 PBS + 0.02% NaN3, pH 7.2로 세척하였다. PLBL2에 대한 항체를 PBS, pH 2.0에 의해 친화성 칼럼으로부터 용리시켜, 용리 풀을 1.0 M 트리스, pH 7.5 - 8.0 용액 중에 수집하였다. 마지막으로, 정제된 항-PLBL2 항체를 농축시킨 다음, 크기-배재 크로마토그래피를 사용하여 PBS + 0.02% NaN3, pH 7.2로 완충제-교환하였다. 친화도 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 하기 실시예 5에 기재된 폴리클로날 PLBL2 ELISA에 사용하였다.
실시예 3 - 뮤린 모노클로날 항-햄스터 PLBL2 ELISA 검정
재조합 폴리펩티드 샘플, 예컨대 재조합 항체 또는 이뮤노어드헤신 제제에서 CHOP 불순물, PLBL2를 검출 및 정량화하기 위한 ELISA 검정을 개발하였다. 절차는 다음과 같다. 뮤린 모노클로날 항체 19C10을 절반 면적의 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 카르보네이트 완충제 (0.05M 탄산나트륨, pH 9.6) 중 0.5 μg/mL의 농도로 2-8℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후에, 플레이트를 차단 완충제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린(Proclin)® 300 [시그마-알드리치]; 검정 희석제로도 지칭됨)로 차단하여 단백질의 비-특이적 점착을 방지하였다. 표준물, 대조군, 및 샘플을 검정 희석제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린® 300 [시그마-알드리치]) 중에 희석시킨 다음, 개별 웰에 이중으로 로딩하고, 실온 (22-27℃)에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PLBL2가 샘플 중에 존재한다면, 이는 코트 (본원에서 포획으로도 지칭됨) 항체에 결합할 것이다. 상기 기재된 인큐베이션 단계 후에, 미결합 물질을 세척 완충제 (0.05% 폴리소르베이트 20/PBS [코닝 셀그로 카탈로그 번호 99-717-CM])를 사용하여 세척하고, 비오틴에 접합된 15G11 항-PLBL2 뮤린 모노클로날 항체를 검정 희석제 중에 0.03125 μg/mL의 농도로 희석시키고, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다.
비오틴 접합은 다음과 같이 수행하였다. 비오티닐화 키트를 피어스 써모 사이언티픽 (P/N 20217, E-Z 링크 NHS-비오틴)으로부터 구입하고, 스트렙타비딘-HRP (SA-HRP)를 잭슨 이뮤노 카탈로그 번호 016-030-084로부터 구입하였다. 피어스 키트 내의 지침에 따랐다. 간략하게, IgG를 PBS, pH 7.4로 투석하고, 비오틴을 단백질에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 이어서 표지된 항체를 PBS, pH 7.4에 대해 투석하여 잉여량의 비오틴을 제거하고, 여과하고, A280에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
실온에서 비오티닐화 15G11과의 2시간 인큐베이션 단계 후에, 스트렙타비딘 HRP (검정 희석제 중 1:200,000 희석)를 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하였다. 세척 완충제 (상기 기재됨)에 의한 최종 세척 단계 후에, TMB 용액 (50 μl/웰) (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL, 키르케가드 & 페리 래보러토리즈, 인크.로부터의 슈어블루 리저브™, 카탈로그 번호 53-00-03)을 첨가한 다음 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션시켜 색을 발색시켰다 (PLBL2 정량화를 위함). 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 M5e를 사용하여 각각의 웰에서 450 nm에서 광학 밀도 (OD)를 평가하여 검출을 수행하였다. 4-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스 프로 v5.2 rev C)을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 표준 곡선의 선형 범위로부터 샘플 PLBL2 농도를 산출하였다.
도 2에 제시된 바와 같이, 19C10 및 15G11 모노클로날 항체를 사용한 PLBL2 검정은 4-pt 파라미터 피트에 의해 S자형 곡선을 가졌다. 표준 곡선의 선형 범위에서의 값을 사용하여 공칭 PLBL2 (ng/mg 또는 ppm)를 계산하였다. 선형 범위는 플레이트마다 약간 달라지는 범위로서 대략 EC10 - EC85 또는 1.5 - 40 ng/mL였다. 이러한 ELISA를 사용하여 PLBL2에 대해 수득된 값은 다른 방법 (예를 들어, LC-MS/MS, 폴리클로날 PLBL2 ELISA 또는 총 CHOP ELISA (검정의 LOQ로 희석된 경우) [표 3 및 4 참조])에 의해 생성된 추정값과 대등하였다.
실시예 4 - 모노클로날 PLBL2 ELISA 검정을 사용한 결과
상기 실시예 3에 기재된 햄스터 PLBL2 ELISA 검정을 사용하여, 본 발명자들은 CHO 세포에서 생산된 다양한 모노클로날 항체 (mAb) 제제를 평가하여 상이한 조건 하에서 오염 PLBL2의 양을 정량화하였다. 본 발명자들은 정제된 제제 뿐만 아니라, 정제되지 않은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF)의 다중 실행을 평가하였다. 비교를 위해, 특정 경우에, 본 발명자들은 또한 LC-MS/MS에 의해 PLBL2 펩티드의 양을 정량화하였다. LC-MS/MS 방법은 다음과 같이 수행하였다.
LC-MS/MS에 의한 PLBL2의 정량화를 위해, 워터스 액퀴티(Waters Acquity) H-클래스 바이오 UPLC 및 AB 사이엑스 트리플TOF(Sciex TripleTOF) 5600+ 질량 분광계를 사용하였다. 샘플 및 보정 표준물 (마우스 NS0 세포주 [NS0 세포주는 햄스터 PLBL2를 함유하지 않음]로부터 수득된 재조합 인간화 모노클로날 항체 제제에 첨가한 재조합 PLBL2)을 트립신에 의해 환원 및 소화시켰다. 총 40 μg의 소화된 샘플을 워터스 BEH300 C18 칼럼, 입자 크기 1.7 μm를 사용하는 UPLC에 주입하였다. 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 300 μl/분의 유량 및 60℃의 칼럼 온도에서 펩티드를 용리시켰다.
UPLC로부터 용리된 펩티드를 전기분무 이온화에 의해 양성 이온화 모드로 질량 분광계에 도입하였다. 이온 공급원 온도는 400℃로, 이온분무 전압은 5500 v로, 디클러스터링 전위는 76 v로 설정하였다. 선택된 펩티드 이온의 단편화를 위해 32의 충돌 에너지 설정을 사용하였다. 4종의 특이적 PLBL2 펩티드 및 그의 단편 이온 전이를 사용하여 질량 분광계를 다중 반응 모니터링 고해상도 (MRMHR) 모드로 작동시켰다. 모 이온을 사중극자 질량 분광계에 의해 1.2 amu의 질량 대 전하 (m/z) 선택 윈도우로 선택하였다. 각각의 모 이온의 단편 이온을 비행 시간 질량 분광계에 의해 분리하고, 정량화 후 데이터 획득을 위해 0.025 amu의 선택 윈도우로 선택하였다.
선형 피트를 사용하여 2-500 ppm의 범위에서 표준물로부터의 그것으로 보정한, 4개 전이의 특이적 신호 반응을 측정함으로써 샘플 중 PLBL2의 농도를 결정하였다. 하기 표 2는 LC-MS/MS에 의해 모니터링된 PLBL2 펩티드의 목록을 보여준다. LC-MS/MS에 의해 모니터링된 각각의 펩티드에 대한 대표적인 표준 곡선을 도 3에 제시한다.
<표 2> LC-MS/MS에 의해 모니터링된 PLBL2 펩티드의 목록
Figure pat00002
하기 표 3 및 4는 실시예 3에 기재된 LC-MS/MS 및 햄스터 PLBL2 ELISA 검정 둘 다에 의해 결정된 바와 같은, 2종의 상이한 mAb 제제, mAb A 및 mAb B의 다양한 정제 실행에서의 PLBL2 비를 보여준다. 상기 기재된 CHOP 비와 마찬가지로, PLBL2 비를 ng/mg 또는 백만분율 (ppm)로 제공하며, PLBL2 농도 대 생성물 (mAb) 농도의 계산된 비를 지칭한다. 표 3 및 4에 제시된 결과는 PLBL2 ELISA 검정이 2종의 상이한 mAb 제제에서 넓은 범위에 걸쳐 상이한 정제 공정 하에 (각각의 실행 번호는 상이한 정제 공정을 나타냄) PLBL2 수준을 정량화할 수 있음을 나타낸다.
<표 3> mAb A의 다양한 로트에서의 PLBL2 비
Figure pat00003
<표 4> mAb B의 다양한 로트에서의 PLBL2 비
Figure pat00004
본 발명자들은 또한 실시예 3에 기재된 PLBL2 ELISA 검정이 일부는 IgG1이고 일부는 IgG4인 광범위한 수의 mAb 제제에 대해 비정제된 HCCF에서 오염 PLBL2의 수준을 결정할 수 있는지를 평가하였다. 결과를 도 4에 제시한다. 도 4에서 관찰할 수 있는 바와 같이, PLBL2 ELISA 검정은 HCCF에서 광범위한 PLBL2를 정량화할 수 있었다. PLBL2의 수준이 상이한 mAb HCCF 샘플들 사이에서 실질적으로 달랐지만, 임의의 주어진 mAb에 대한 반복 HCCF 제제 (실행) 내에서의 재현성은 양호하였다. 본 발명자들은 이소형 (IgG1 또는 IgG4)과 HCCF에서의 PLBL2의 수준 사이에 어떠한 분명한 상관관계도 관찰하지 못했다 (데이터는 제시하지 않음).
또한, 본 발명자들은 실시예 3에 기재된 모노클로날 PLBL2 ELISA 검정을 사용하여, mAb G의 최종 한외여과/투석여과 (UFDF) 단계를 병행하는 3-칼럼 크로마토그래피 정제 공정을 통해 PLBL2 클리어런스를 평가하였다. 결과를 도 5에 제시한다. PLBL2 수준은 HCCF에서 가장 높았고, 정제 공정은 최종 mAb G 제제로부터 PLBL2를 제거하는데 효과적이었다. 모노클로날 PLBL2 ELISA 검정은 양호한 감도 및 특이성을 나타내었고, 비정제된 HCCF에서 및 각각의 정제 단계에서 PLBL2 수준을 정량화하는데 효과적이었다. 본 발명자들은 다양한 생성물 희석물에서 선형성을 관찰하였고, 이는 모노클로날 PLBL2 ELISA 검정이, 본 발명자들이 총 CHOP 검정에서 관찰했던 "항원 과잉" 문제를 거치지 않음을 나타낸다.
실시예 5 - 토끼 폴리클로날 항-햄스터 PLBL2 ELISA 검정
재조합 폴리펩티드 샘플, 예컨대 재조합 항체 또는 이뮤노어드헤신 제제에서 CHOP 불순물, PLBL2를 검출 및 정량화하기 위한 ELISA 검정을 개발하였다. 절차는 다음과 같다. 친화도 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 절반 면적의 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 카르보네이트 완충제 (0.05M 탄산나트륨, pH 9.6) 중 0.5 ug/mL의 농도로 2-8℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후에, 플레이트를 차단 완충제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린® 300 [시그마-알드리치])로 차단하여 단백질의 비-특이적 점착을 방지하였다. 표준물, 대조군, 및 샘플을 검정 희석제 (0.15M NaCl, 0.1M 인산나트륨, 0.1% 어류 젤라틴, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린® 300 [시그마-알드리치]) 중에 희석시킨 다음, 개별 웰에 이중으로 로딩하고, 실온 (22-27℃)에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. PLBL2가 샘플 중에 존재한다면, 이는 코트 (본원에서 포획으로도 지칭됨) 항체에 결합할 것이다. 상기 기재된 인큐베이션 단계 후에, 미결합 물질을 세척 완충제 (0.05% 폴리소르베이트 20/PBS [코닝 셀그로 카탈로그 번호 99-717-CM])를 사용하여 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 친화도 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 검정 희석제 중에 40 ng/mL의 농도로 희석시키고, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다.
HRP 접합은 다음과 같이 수행하였다. HRP 접합 키트를 피어스 써모 사이언티픽 (P/N 31489, E-Z 링크 플러스 활성화 퍼옥시다제 및 키트)으로부터 구입하였다. 피어스 키트 내의 지침에 따랐다. 간략하게, IgG를 카르보네이트-비카르보네이트 완충제, pH 9.4로 투석하고, EZ-링크 플러스 활성화 퍼옥시다제를 단백질에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 이어서 소듐 시아노보로히드라이드 및 켄칭 완충제를 첨가하여 접합을 안정화시키고 반응을 켄칭시켰다. 이어서 표지된 항체를 PBS, pH 7.4에 대해 투석하고, 여과하고, A280에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
실온에서 HRP 접합된 토끼 폴리클로날 항체와의 2시간 인큐베이션 단계 후에, 세척 완충제 (상기 기재됨)를 사용한 최종 세척 단계를 수행하였다. 그 후에, TMB 용액 (50 ul/웰) (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL, 키르케가드 & 페리 래보러토리즈, 인크.로부터의 슈어블루 리저브™, 카탈로그 번호 53-00-03)을 첨가한 다음 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션시켜 색을 발색시켰다 (PLBL2 정량화를 위함). 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 M5e를 사용하여 각각의 웰에서 450 nm에서 광학 밀도 (OD)를 평가하여 검출을 수행하였다. 5-파라미터 곡선-피팅 프로그램 (소프트맥스 프로 v5.2 rev C)을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 표준 곡선의 선형 범위로부터 샘플 PLBL2 농도를 산출하였다.
도 6에 제시된 바와 같이, 친화도 정제된 토끼 폴리클로날 항체를 사용한 PLBL2 검정은 5-pt 파라미터 피트에 의해 S자형 곡선을 가졌다. 표준 곡선의 선형 범위에서의 값을 사용하여 공칭 PLBL2 (ng/mg 또는 ppm)를 계산하였다. 검정의 정량적 범위는 0.5 -50 ng/mL였다. 이러한 ELISA를 사용하여 PLBL2에 대해 수득된 값은 다른 방법 (예를 들어, 뮤린 모노클로날 PLBL2 ELISA, LC-MS/MS 또는 총 CHOP ELISA (검정의 LOQ로 희석된 경우))에 의해 생성된 추정값과 대등하였다.
실시예 6 - 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정을 사용한 결과
본 발명자들은 실시예 5에 기재된 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정을 사용하여, mAb G의 최종 한외여과/투석여과 (UFDF) 단계를 병행하는 3-칼럼 크로마토그래피 정제 공정을 통해 PLBL2 클리어런스를 평가하였다. 결과를 도 7에 제시한다. 모노클로날 PLBL2 ELISA 검정에 의해 관찰된 바와 같이, PLBL2 수준은 HCCF에서 가장 높았고, 정제 공정은 최종 mAb G 제제로부터 PLBL2를 제거하는데 효과적이었다. 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정은 양호한 감도 및 특이성을 나타내었고, 비정제된 HCCF에서 및 각각의 정제 단계에서 PLBL2 수준을 정량화하는데 효과적이었다. 본 발명자들은 다양한 생성물 희석물에서 선형성을 관찰하였고, 이는 PLBL2 ELISA 검정이, 본 발명자들이 총 CHOP 검정에서 관찰했던 "항원 과잉" 문제를 거치지 않음을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 mAb A의 7회의 상이한 실행 (표 5에 제시된 바와 같은 상이한 정제 단계를 포함함) 및 mAb B의 1회의 실행에서 모노클로날 검정을 사용하여 검출된 PLBL2의 양을 폴리클로날 검정을 사용하여 검출된 PLBL2의 양과 비교하였다. 결과를 표 5에 제시한다. 관찰할 수 있는 바와 같이, 각각의 검정을 사용하여 수득된 결과들 사이의 상대 % 차이는 2가지의 검정이 대등한 결과를 생성함을 나타낸다.
<표 5> 모노클로날 PLBL2 검정 결과 대 폴리클로날 PLBL2 검정 결과의 비교
Figure pat00005
결론
종합하면, 이들 데이터는 본원에 기재된 각각의 모노클로날 및 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정이 강건하고, 특이적이며, 민감함을 나타낸다. 본 발명자들은 각각의 검정이 광범위한 PLBL2 수준을 나타내는, 다양한 정제 조건 하의 수많은 상이한 MAb 제제에서 오염 햄스터 PLBL2 CHOP를 정확하게 정량화할 수 있음을 보여준다. 본 발명자들은 또한 정제 공정의 각각의 단계 동안 불순물 클리어런스를 모니터링하는데 PLBL2 ELISA 검정이 사용될 수 있음을 보여준다. 따라서, 본원에 기재된 각각의 모노클로날 및 폴리클로날 PLBL2 ELISA 검정은 정제 공정의 개발 동안 클리어런스를 모니터링하기 위한 것으로서 뿐만 아니라 최종 생성물에서 PLBL2 수준을 정량화하기 위한 효과적인 도구이다.
실시예 7 - 세포주를 스크리닝 또는 선택하기 위한 PLBL2 ELISA 검정의 용도
상기 논의되고 도 4에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 상이한 mAb 생산 세포주 사이에서 HCCF 중 PLBL2 수준에서의 실질적인 차이를 관찰하였고, 그 중 일부는 다른 것에 비해 20-배만큼 더 높은 PLBL2 수준을 가졌다. 이러한 실질적인 차이는, 예를 들어 하류 정제 공정의 부담을 감소시키기 위해 HCCF 중 낮은 수준의 PLBL2를 생산하는 생성물 세포주, 가능한 한 심지어 숙주 세포주 (즉 어떠한 생성물도 생산하지 않는 숙주 세포)를 확인하는 것이 바람직할 것임을 시사한다. 생성물 세포주과 관련해서는, 많은 양의 생성물 및 적은 양의 PLBL2를 동시에 생산하는 세포주를 확인하는 것이 바람직할 것이다. 핵심 질문은 많은 양의 생성물 및 적은 양의 PLBL2를 생산하는 클론을 선택하기 위해 생성물 세포주의 상이한 클론을 스크리닝하는 것이 가능한지 또는 실현될 수 있는지의 여부이다.
하기 기재된 결과가 생성되기 전에, 본 발명자들은 이러한 클론 선택 전략이 실현될 것이라고는 생각하지 않았다. 이는 본 발명자들이 상이한 생성물 세포주 사이에서 관찰된 PLBL2 수준에서의 차이 (도 4 참조)가 생산된 생성물 (예를 들어, MAb)의 특정한 특색의 결과라고 가설을 세웠기 때문이다. 예를 들어, 본 발명자들은 MAb A 세포주의 모든 클론이 대략 등가 수준의 PLBL2를 생성할 것이고, 그러한 수준은 MAb G 세포주의 모든 클론에 의해 생산된 PLBL2 수준보다 실질적으로 더 높을 것이라고 예상하였다 (도 4 참조). 이러한 가설은 본 발명자들이 특정 MAb 생성물 세포주가 상이한 MAb를 생산하는 세포주에 비해 더 높은 수준의 MAb를 생산한다는 것, 즉 MAb 생산은 생산되는 MAb의 특성에 따라 달라지는 것으로 보인다는 것을 관찰했던 다양한 MAb 생성물 세포주를 사용한 본 발명자들의 이전 실험과 일치하였다. 또한, 본 발명자들은 높은 성장 및 생존율 프로파일을 갖는 세포주가 보다 효율적인 단백질-생산 기구를 가질 것이고, 따라서 특정한 MAb와 관련해서 뿐만 아니라 PLBL2 수준과 관련해서도 보다 생산적일 것으로 예상하였다. 요약하면, 본 발명자들은 따라서 임의의 특정한 생성물 세포주의 상이한 클론에 걸쳐 PLBL2 대 생성물의 비가 클론 사이에 비교적 일관적일 것으로 예상하였다.
낮은 PLBL2/높은 생성물 농도 클론 선택 전략의 실현가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 기재된 방법을 사용하여 6종의 상이한 재조합 단백질 생성물 CHO 세포주 (생성물 J, 생성물 K, 생성물 L, 생성물 M, 생성물 N, 및 생성물 O)의 다중 클론 세포주로부터의 제14일 HCCF 샘플에서 PLBL2 수준, 총 CHOP 수준, 및 생성물 농도를 측정하였다. 각각의 클론 세포주에 대한 이중 2L 생물반응기 배양물로부터의 결과를 도 8에 제시한다. 예상한 바와 같이, 특정한 생성물 세포주의 클론에 걸쳐 생성물 농도는 서로 실질적으로 다르지 않았고, 특정한 생성물 세포주의 클론에 걸쳐 생성물 농도의 평균 수준은 생산되는 생성물에 따라 달라지는 것으로 보였다. 예를 들어, 생성물 N의 최고 생산자 (도 8e)는 생성물 L의 최고 생산자 (도 8c)보다 적어도 1.5-배 더 높은 생성물 농도를 가졌다.
그러나, 놀랍게도 상기 기재된 생성물 농도에 대한 관찰은 PLBL2 수준에 대해서는 유효하지 않았다. 도 8에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 특정한 생성물 세포주의 상이한 클론 사이에 PLBL2 수준에서 실질적인 변동성이 존재하였고, 이러한 클론 변동성은 각각의 6종의 상이한 생성물 세포주에서 관찰되었다. 달리 말하면, 생성물 농도와 PLBL2 수준 사이에는 강력한 상관관계가 존재하지 않았다. 예를 들어, 도 8e (생성물 N)에 제시된 바와 같이, 생성물 N 세포주의 각각의 클론 세포주 1-4는 약 3.5-4.5 g/L 범위의 유사한 생성물 농도를 생성하였지만, 5-배를 초과하여 상이한 (약 0.75 mg/L에서 약 4.5 mg/L까지의 범위) PLBL2 농도를 생성하였다. 도 8e에 제시된 결과로부터, 생성물 N 세포주 번호 3은 임의의 다른 생성물 N 세포주와 비교하여 최저 PLBL2 수준 및 최고 생성물 농도를 생성한다는 것이 분명하며, 이는 이러한 바람직한 속성을 갖는 생성물 클론을 선택하는 것의 실현가능성을 나타낸다. 또한, 상기 결과는 PLBL2 및 생성물 농도를 평가하고 낮은 PLBL2 수준 및 높은 생성물 농도를 생성하는 생성물 클론을 선택하는 이러한 선택 전략의 일반적인 적용가능성을 보여준다.
이러한 선택 전략을 수행하는 것의 유용성은, 예를 들어 생성물 L 클론 세포주 (도 8c)에 대한 결과를 조사하는 것에 의해 관찰할 수 있다. 모든 클론 세포주는 비교적 낮은 생성물 생산자이지만, PLBL2 수준에서 실질적인 차이가 존재한다. 생성물 농도가 스크리닝된 유일한 속성일 경우에, 생성물 L 세포주 번호 6이 최고 생성물 농도를 생성하였기 때문에 이를 선택할 수 있다. 그러나 생성물 L 세포주 번호 6은 또한 임의의 다른 클론보다 실질적으로 높은, 일부 경우에는 3-배를 초과하여 더 높은 수준의 PLBL2를 생산하였다. 스케일-업 및 추가 개발 작업을 위해 선택된 생성물 세포주에서 PLBL2 수준을 최소화하는 것이 바람직한 경우에, PLBL2 수준의 추가 스크리닝은 따라서 중요하고, 낮은 PLBL2 및 높은 생성물 농도의 목적하는 조합 속성을 갖는 생성물 세포주의 선택을 가능하게 한다.
도 8에 제시된 데이터를 분석하기 위한 또 다른 방법은 PLBL2 수준 대 생성물 농도의 비를 계산하는 것이다. 본 발명자들은 도 8과 관련하여 상기 논의된 각각의 세포주에 대해 이러한 비를 계산하고, 데이터를 도 9에 제시된 바와 같이 플롯팅하였다. 도 9에 제시된 데이터에 의해 관찰할 수 있는 바와 같이, 특정한 생성물 세포주로부터의 클론 세포주는 2- 내지 10-배만큼 다른 PLBL2/생성물 농도 비를 생성하였다.
이러한 분석은 특정한 생성물 세포주의 다중 클론 세포주에 걸쳐 목적하는 속성의 신속한 비교, 및 최저비, 즉 최저 수준의 PLBL2 및 최고 수준의 생성물 농도를 갖는 세포주의 간단한 선택을 가능하게 한다. 예를 들어, 생성물 L의 경우에, 도 8c에 제시된 데이터로부터는 어떤 세포주 번호가 최저 수준의 PLBL2 및 최고 생성물 농도를 생성하는지 분명하지 않다. 그러나 PLBL2/생성물 농도의 비를 보여주는 도 9c에 제시된 데이터는 생성물 L 세포주 번호 1이 최저비를 갖고, 따라서 목적하는 속성의 최적 조합을 갖는다는 것을 분명하게 보여준다.
특정한 생성물 세포주의 다중 클론 세포주에 걸쳐 변동성의 정도를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 생성물 P를 발현하는 48종의 상이한 재조합 CHO 세포주를 분석하였다. 생성물 P의 48종의 세포주의 각각의 PLBL2/생성물 비를 도 10에 제시한다. 이들 48종의 상이한 생성물 P 세포주에 걸쳐, PLBL2/생성물 비는 10-배만큼 달랐다. 또한, 도 10에 제시된 데이터의 신속한 검토는 생성물 P 세포주 번호 34가 최저비를 갖는다는 것을 나타내고, 그에 의해 낮은 PLBL2 및 높은 생성물 농도의 목적하는 속성을 갖는 생성물 세포주를 선택할 수 있다는 용이성이 강조된다.
본 발명자들은 다음으로 상기 기재된 48종의 생성물 P 세포주의 진탕 플라스크 배양물로부터의 제14일 HCCF 샘플에서 총 CHOP, PLBL2, 및 생성물 농도의 수준을 측정함으로써 PLBL2 농도와 생성물 농도 사이의 상관관계의 명백한 결여를 조사하였다. 단일 생성물을 수반하는 이러한 실질적으로 보다 큰 데이터 세트를 사용하여, 본 발명자들은 이들 3종의 측정값 사이의 상관관계를 보다 정확하게 정량화할 수 있었다. 도 11a는 PLBL2 농도와 생성물 농도 사이에 약한 선형 상관관계가 존재함을 보여주고: 선형 회귀와 연관된 결정 계수 (R2)는 낮았다 (<0.12). 이러한 약한 상관관계는 다른 세포주에 비해 높은 재조합 단백질 생산성 및 낮은 PLBL2 수준의 목적하는 형질을 갖는 세포주를 선택하는 것의 실현가능성을 보여준다. 대조적으로, 도 11b는 총 CHOP 농도와 생성물 농도 사이에 중등도의 강력한 선형 상관관계가 존재함을 보여준다 (R2 > 0.45). 이러한 상관관계는 목적하는 생성물과 관련하여 매우 생산적인 세포주가, 잘 성장하고, 높은 생존율을 유지하고, 강력한 단백질 생산 기구를 보유할 것으로 예상되기 때문에, 이는 일반적으로 숙주 세포 단백질과 관련해서도 매우 생산적일 것이라는 본 발명자들의 원래의 가정과 일치한다. 도 11c에 제시된 PLBL2 농도와 총 CHOP 농도 사이의 강력한 선형 상관관계의 결여 (R2 < 0.29)는 놀라운 발견이다. PLBL2가 단일 CHOP 종이기 때문에, 본 발명자들은 보다 많은 총 CHOP를 생산하는 세포주가 보다 많은 PLBL2를 생산하여, PLBL2 대 총 CHOP의 비가 상이한 세포주에 걸쳐 비교적 일관되게 유지될 것이라고 예상하였다. 48종의 세포주에 걸쳐 HCCF에서의 PLBL2 및 총 CHOP 수준 사이의 이러한 예상치 못한 강력한 양성 상관관계의 결여는 총 CHOP 측정값이 PLBL2 측정값에 대한 대용물로서 신뢰할 수 없음을 나타낸다. 따라서, 낮은 총 CHOP 수준을 갖는 세포주가 또한 낮은 PLBL2 수준을 가질 것이라고 가정할 수 없다. 따라서, 낮은 PLBL2 수준을 갖는 세포주의 선택을 위해서는 HCCF에서의 PLBL2의 직접 측정이 중요하다.
상이한 CHO 숙주 세포주가 상이한 수준의 PLBL2를 생성하는지 여부를 결정하고, 세포 배양물 중 PLBL2 수준에 대한 재조합 단백질의 효과로부터의 임의의 이러한 차이를 구별하기 위해, 본 발명자들은 PLBL2 ELISA를 사용하여 임의의 생성물 유전자를 발현하지 않는 3종의 상이한 CHO 숙주 세포주 - 숙주 1, 숙주 2, 및 숙주 3의 2 L 생물반응기 배양물에서 PLBL2 수준을 측정하였다. 어떠한 생성물도 생성하지 않기 때문에 블랭크 실행으로도 공지된 이들 생물반응기 배양물에 대해 비-셀(Vi-Cell) XR (카탈로그 번호 731050, 베크만 쿨터, 인크.(Beckman Coulter, Inc.), 미국 캘리포니아주 브레아)을 사용하여 생존 세포 밀도 및 생존율을 분석하였다. 또한, 배양물 샘플을 키맥스(KIMAX) 보정 침강 튜브 (카탈로그 번호 45225-10, 킴블 체이스(Kimble Chase), 미국 뉴저지주 바인랜드) 내에서 원심분리 (820 g, 10분)함으로써 충전 세포 부피 (PCV)에 기초하여 배양 기간 내내 세포 성장을 평가하였다. 본 발명자들은 이들 블랭크 실행에 대해 HCCF 및 전세포 배양 유체 (WCCF) 둘 다에서 PLBL2 수준을 측정하였다. WCCF 샘플은 세포 및 HCCF 둘 다로 구성되었다. 따라서, WCCF 샘플에서 측정된 PLBL2 수준은 배양물 중 PLBL2의 총 세포내 및 세포외 농도의 합을 반영한다. PLBL2 ELISA 검정을 사용하여, 본 발명자들은 PLBL2 프로파일과 관련하여 HCCF (도 12a) 및 WCCF (도 12b) 둘 다에서의 3종의 CHO 숙주 세포주에 걸친 차이를 정량화하였다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 숙주 1이 HCCF 및 WCCF 둘 다에서 최고 수준의 PLBL2를 생성한다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 본 발명자들은 숙주 3을 수거 시점 (제14일)에 최저 수준의 PLBL2를 생성하는 CHO 세포주로서 확인하였다.
비록 숙주 3이 HCCF 및 WCCF 둘 다에서 전체적으로 최저 수준의 PLBL2를 생성하였지만, 모든 3종의 CHO 숙주 세포주는 상이한 성장 프로파일을 나타내었다 (데이터는 제시하지 않음). 따라서, PLBL2 수준에 대한 세포 성장에서의 차이의 영향을 무효화하기 위해, 본 발명자들은 1일 기준으로 PLBL2 생산을 생존 세포 부피에 대해 정규화함으로써 이들 3종의 세포주를 추가로 분석하였다. 숙주 1, 숙주 2 및 숙주 3에서의 세포-특이적 PLBL2 생산성을 계산하기 위해, 본 발명자들은 PLBL2 농도를 상응하는 부피측정상 통합 생존 충전 세포 부피 (IVPCV)에 대해 플롯팅하였다. 세포 사멸로부터의 혼선 및 연관된 세포 용해로부터의 PLBL2 방출을 최소화하기 위해, 본 발명자들은 데이터의 사용을 배양물 생존율이 70%를 초과하는 지점으로 제한하였다. 선형 회귀로부터 수득된 생성된 기울기는 세포-특이적 PLBL2 생산성의 추정값, 1일에 단위 생존 세포 부피당 mg 단위의 PLBL2를 제공하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 선형 회귀의 기울기는 숙주 1의 경우에 가장 높고 숙주 3의 경우에 가장 낮았으며, 이는 측정값이 HCCF (도 13a) 또는 WCCF (도 13b)를 사용하여 수득되었는지에 관계없이, 숙주 3이 1일에 단위 생존 세포 부피당 평균 수-배 더 적은 PLBL2를 생성한다는 것을 추가로 보여준다. 이러한 발견에 기초하여, 생산 세포주를 생성하기 위해 안정한 형질감염을 위한 CHO 모 숙주로서 낮은 PLBL2 생산 숙주, 예컨대 숙주 3을 우선적으로 선택할 수 있다. 이러한 접근법은 다른 CHO 숙주 세포를 기반으로 하는 재조합 세포주와 비교하여 또한 보다 낮은 PLBL2 수준을 나타내는 안정적으로 형질감염된 재조합 세포주를 생성할 수 있다.
상기 논의된 결과는 본원에 기재된 PLBL2 ELISA 검정을 사용하여 다중 재조합 생성물 CHO 세포주 뿐만 아니라 다중 CHO 숙주 세포주에 걸쳐 PLBL2 수준을 평가할 수 있으며, 따라서 낮은 PLBL2 농도, 및 재조합 생성물 CHO 세포주의 경우에는, 높은 생성물 농도와 같은 바람직한 속성을 갖는 재조합 세포주 또는 숙주 세포주의 선택이 가능할 수 있음을 보여준다. 세포주 선택에 대한 이러한 접근법은 재조합 제조 공정의 최적화를 위해, 예를 들어 하류 정제 공정의 부담을 감소시키기 위해 중요하다.
<서열 표>
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AND QUANTIFYING HOST CELL PROTEIN IN CELL LINES AND RECOMBINANT POLYPEPTIDE PRODUCTS <130> P5701R1-WO <140> <141> <150> 61/991,228 <151> 2014-05-09 <150> 61/877,503 <151> 2013-09-13 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1758 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 atggcggccc ccatggaccg gagccccggc ggccgggcgg tccgggcgct gaggctagcg 60 ctggcgctgg cctcgctgac tgaggtgttg ctgaattgcc cggcgggcgc cctccccacg 120 caggggcccg gcaggcggcg ccaaaacctc gacccgccgg tctcccgcgt ccgctcggtg 180 ctgctggacg ccgcgtcggg tcagctgcgc ctggtggacg gcatccatcc ctacgcggtg 240 gcctgggcca acctcaccaa cgccattcgc gagaccgggt gggcctatct ggacttgggt 300 acaaatggaa gctacaatga cagcctgcag gcctatgcag ctggtgtggt ggaggcttct 360 gtgtctgagg agctcatcta catgcactgg atgaacacaa tggtcaacta ctgtggcccc 420 ttcgagtatg aagttggcta ctgtgagaag ctcaagagct tcctggagat caacctggag 480 tggatgcaga gggagatgga actcagccag gactctccat attggcacca ggtgcggctg 540 accctcctgc agctgaaagg cctagaggac agctacgaag gccgtttgac cttcccaact 600 gggaggttca ccattaaacc cttggggttc ctcctgctgc agattgccgg agacctggaa 660 gacctagagc aagccctgaa taagaccagc accaagcttt ccctgggctc cggttcctgc 720 tccgctatca tcaagttgct gccaggcgca cgtgacctcc tggtggcaca caacacatgg 780 aactcctacc agaacatgct acgcatcatc aagaagtacc agctgcagtt ccggcagggg 840 cctcaagagg cgtaccccct gattgctggc aacaatttgg tcttttcgtc ttacccgggc 900 accatcttct ctggcgatga cttctacatc ctgggcagtg ggctggtcac cctggagacc 960 accattggca acaagaatcc agccctgtgg aagtacgtgc agccccaggg ctgtgtgctg 1020 gagtggattc gaaacatcgt ggccaaccgc ctggccttgg acggggccac ctgggcagac 1080 atcttcaagc agttcaatag tggcacgtat aataaccaat ggatgattgt ggactacaag 1140 gcattcatcc ccaacgggcc cagccctgga agccgagtgc ttaccatcct agaacagatc 1200 ccgggcatgg tggtggtggc cgacaagact gaagatctct acaagacaac ctactgggct 1260 agctacaaca tcccgttctt tgagattgtg ttcaacgcca gtgggctgca ggacttggtg 1320 gcccaatatg gagattggtt ttcctacact aagaaccctc gagctcagat cttccagagg 1380 gaccagtcgc tggtggagga catgaattcc atggtccggc tcataaggta caacaacttc 1440 cttcacgacc ctctgtcact gtgtgaagcc tgtatcccga agcccaatgc agagaatgcc 1500 atctctgccc gctctgacct caatcctgcc aatggctcct acccatttca agccctgtac 1560 cagcgtcccc acggtggcat cgatgtgaag gtgaccagct tttcactggc caagcgcatg 1620 agcatgctgg cagccagtgg cccaacgtgg gatcagttgc ccccattcca gtggagttta 1680 tcgccgttcc gcagcatgct tcacatgggc cagcctgatc tctggacatt ctcacccatc 1740 agtgtcccat gggactga 1758 <210> 2 <211> 585 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 2 Met Ala Ala Pro Met Asp Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Val Arg Ala 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Leu Thr Glu Val Leu Leu Asn 20 25 30 Cys Pro Ala Gly Ala Leu Pro Thr Gln Gly Pro Gly Arg Arg Arg Gln 35 40 45 Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu Val Asp Gly Ile His Pro Tyr Ala Val 65 70 75 80 Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr 85 90 95 Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr 100 105 110 Ala Ala Gly 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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Glu Ile Ser Ser Lys Ala Asn Asn Arg Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Thr Arg Arg Gly Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 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Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 13 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Cys Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Ser Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Ala Ser Trp Ile Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 210 215 220 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 260 265 270 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 290 295 300 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 305 310 315 320 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 340 345 350 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 355 360 365 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 370 375 380 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 405 410 415 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 420 425 430 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Cys Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Ser Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Ala Ser Trp Ile Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ala Arg Ile Ala Ser Trp Ile Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Arg Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Arg Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 actggagcgt acgctgaagt gaagcttgag gagtct 36 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 aagaccgatg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ctgaggttc 49 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 actggagcgt acgctgaggt gcagcttcag gagtca 36 <210> 26 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 aagaccgatg ggcccttggt ggaggctgag gagactgtga gagtggtgc 49 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 gcaactgcaa ccggtgtaca ttcagacatt gtgatgaccc agtct 45 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ggtgcagcca cggtccgctt cagctccagc ttggtacc 38 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 29 Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 30 Gly Leu Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg 1 5 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 31 Ala Phe Ile Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 32 Val Thr Ser Phe Ser Leu Ala Lys 1 5

Claims (28)

  1. (i) 각각의 2종 이상의 숙주 세포주로부터 숙주 세포주 샘플을 수득하는 단계;
    (ii) 하기를 포함하는 방법에 따라 각각의 숙주 세포주 샘플에서 햄스터 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2)의 양을 계산하는 단계:
    (a) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제1 포획 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플-포획 항체 조합 물질을 생성하는 단계;
    (b) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제2 검출 항체를 샘플-포획 항체 조합 물질과 접촉시키는 단계;
    (c) 샘플-포획 항체 조합 물질에 결합된 제2 검출 항체를 검출하는 단계;
    (d) 표준 적정 곡선을 사용하여 결합된 제2 검출 항체의 수준을 정량화하는 단계; 및
    (e) 결합된 제2 검출 항체의 수준에 기초하여 샘플 중에 존재하는 햄스터 PLBL2의 양을 계산하는 단계;
    (iii) 각각의 숙주 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양을 2종 이상의 숙주 세포주의 군의 각각의 숙주 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양과 비교하는 단계;
    (iv) 군의 각각의 숙주 세포주 샘플과 비교하여 최저량의 PLBL2를 갖는 숙주 세포주 샘플을 확인하여, 최저량의 PLBL2를 갖는 군으로부터 확인된 숙주 세포주를 생성하는 단계; 및
    (v) (iv)의 확인된 숙주 세포주를 적은 양의 햄스터 PLBL2를 발현하는 최적 숙주 세포주로서 선택하는 단계
    를 포함하는, 2종 이상의 숙주 세포주의 군으로부터 적은 양의 햄스터 PLBL2를 발현하는 최적 숙주 세포주를 선택하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 2종 이상의 숙주 세포주가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 각각의 숙주 세포주 샘플이 수거된 세포 배양 유체인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 각각의 숙주 세포주 샘플이 전세포 배양 유체인 방법.
  5. 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 햄스터 PLBL2의 발현에 대해 스크리닝하는 방법이며, 여기서 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 생성물 세포주이고, 생성물 세포주로부터 수득된 샘플에서 PLBL2를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, PLBL2를 검출하는 단계가
    (a) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제1 포획 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플-포획 항체 조합 물질을 생성하는 단계;
    (b) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제2 검출 항체를 샘플-포획 항체 조합 물질과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 샘플-포획 항체 조합 물질에 결합된 제2 검출 항체를 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    (d) 표준 적정 곡선을 사용하여 결합된 제2 검출 항체의 수준을 정량화하는 단계; 및
    (e) 결합된 제2 검출 항체의 수준에 기초하여 샘플 중에 존재하는 햄스터 PLBL2의 양을 계산하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 샘플에서 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 것을 포함하는, 생성물의 발현에 대해 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 것이 분광광도측정 방법 또는 친화성 크로마토그래피 방법을 포함하는 것인 방법.
  10. (i) 각각의 2종 이상의 생성물 세포주로부터 생성물 세포주 샘플을 수득하는 단계;
    (ii) 하기를 포함하는 방법에 따라 각각의 생성물 세포주 샘플에서 PLBL2의 양을 계산하는 단계:
    (a) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제1 포획 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플-포획 항체 조합 물질을 생성하는 단계;
    (b) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제2 검출 항체를 샘플-포획 항체 조합 물질과 접촉시키는 단계;
    (c) 샘플-포획 항체 조합 물질에 결합된 제2 검출 항체를 검출하는 단계;
    (d) 표준 적정 곡선을 사용하여 결합된 제2 검출 항체의 수준을 정량화하는 단계; 및
    (e) 결합된 제2 검출 항체의 수준에 기초하여 샘플 중에 존재하는 햄스터 PLBL2의 양을 계산하는 단계;
    (iii) 각각의 생성물 세포주 샘플에서 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 단계;
    (iv) 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양을 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주의 군의 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 PLBL2의 양과 비교하는 단계;
    (v) 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 생성물의 양을 군의 각각의 생성물 세포주 샘플에서의 생성물의 양과 비교하는 단계;
    (vi) 군의 각각의 생성물 세포주 샘플과 비교하여 최저량의 PLBL2 및 최고량의 생성물을 갖는 생성물 세포주 샘플을 확인하여, 최저량의 PLBL2 및 최고량의 생성물을 갖는 군으로부터 확인된 생성물 세포주를 생성하는 단계; 및
    (vii) (vi)의 확인된 생성물 세포주를 최적 생성물 세포주로서 선택하는 단계
    를 포함하는, 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주의 군으로부터 최적 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 선택하는 방법이며, 여기서 각각의 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 생성물 세포주이고, 최적 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 최적 생성물 세포주이고, 각각의 생성물 세포주는 동일한 생성물을 발현하고, 최적 생성물 세포주는 적은 양의 햄스터 PLBL2 및 많은 양의 생성물을 발현하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 각각의 2종 이상 생성물 세포주가 CHO 세포주인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 각각의 생성물 세포주 샘플이 수거된 세포 배양 유체인 방법.
  13. (i) 각각의 2종 이상의 생성물 세포주로부터 생성물 세포주 샘플을 수득하는 단계;
    (ii) 하기를 포함하는 방법에 따라 각각의 생성물 세포주 샘플에서 PLBL2의 양을 계산하는 단계:
    (a) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제1 포획 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플-포획 항체 조합 물질을 생성하는 단계;
    (b) 햄스터 PLBL2에 결합하는 제2 검출 항체를 샘플-포획 항체 조합 물질과 접촉시키는 단계;
    (c) 샘플-포획 항체 조합 물질에 결합된 제2 검출 항체를 검출하는 단계;
    (d) 표준 적정 곡선을 사용하여 결합된 제2 검출 항체의 수준을 정량화하는 단계; 및
    (e) 결합된 제2 검출 항체의 수준에 기초하여 샘플 중에 존재하는 햄스터 PLBL2의 양을 계산하는 단계;
    (iii) 각각의 생성물 세포주 샘플에서 생성물을 검출하고 생성물의 양을 정량화하는 단계;
    (iv) 각각의 생성물 세포주 샘플에 대해 PLBL2의 양 대 생성물의 양의 비를 계산하는 단계;
    (v) 각각의 생성물 세포주 샘플에 대해 계산된 비를 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주의 군의 각각의 생성물 세포주 샘플과 비교하는 단계;
    (vi) 군의 최저비를 갖는 생성물 세포주 샘플을 확인하여, 최저량의 PLBL2 및 최고량의 생성물을 갖는 군으로부터 확인된 생성물 세포주를 생성하는 단계; 및
    (vii) (vi)의 확인된 생성물 세포주를 최적 생성물 세포주로서 선택하는 단계
    를 포함하는, 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주의 군으로부터 최적 재조합 폴리펩티드-발현 세포주를 선택하는 방법이며, 여기서 각각의 2종 이상의 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 생성물 세포주이고, 최적 재조합 폴리펩티드-발현 세포주는 최적 생성물 세포주이고, 각각의 생성물 세포주는 동일한 생성물을 발현하고, 최적 생성물 세포주는 적은 양의 햄스터 PLBL2 및 많은 양의 생성물을 발현하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 각각의 2종 이상의 생성물 세포주가 CHO 세포주인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 각각의 생성물 세포주 샘플이 수거된 세포 배양 유체인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물이 항체 또는 이뮤노어드헤신인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 항체가 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 생성물이 IgG인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 생성물이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 생성물이 IgG1인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 생성물이 IgG4인 방법.
  22. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 포획 항체가 제2 검출 항체와 결합에서 경쟁하지 않고, 제1 포획 항체가 제2 검출 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 포획 항체가 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하거나;
    상기 제2 검출 항체가 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하거나; 또는
    상기 제1 포획 항체가 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하고, 상기 제2 검출 항체가 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 포획 항체가 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 제2 검출 항체가 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역검정이 사용되고 면역검정이 전기화학발광 (ECL) 검정인 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역검정이 사용되고 면역검정이 샌드위치 검정인 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 샌드위치 검정이 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)인 방법.
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