CN101979404B - H5亚型禽流感病毒保守中和表位模拟肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白中和表位模拟肽,及其保守性变异体或活性片段或突变序列,及其相关编码序列,及应用该模拟肽或保守性变异体或活性片段或突变序列于预防或诊断的用途。
Description
发明领域
本发明涉及H5亚型禽流感病毒中和表位模拟肽,及其保守性变异体或活性片段,或模拟肽及其类似物的相关编码序列,及应用该模拟肽或类似物于预防或诊断的用途。
背景技术
自H5型禽流感于1996年首先在我国广东省农场的鹅群暴发以来(Xu X et al.,1999,Virology),由此病毒演生出来的另一株H5病毒在香港的禽鸟农场(1997年4月)及市场(1997年11月)暴发,引起了历史上禽流感病毒第一次直接由禽传人事件,前后共18例确诊病例中有6人死亡。2003年以来,H5病毒株在整个东亚及东南亚国家的相继暴发,WHO及流感专家预测H5禽流感病毒将最有可能成为下一次人类大流感暴发的流行株。2004年初,H5型高致病性禽流感也先后在我国十几个省暴发,并在中国香港、泰国、荷兰等发现H5型禽流感传染鸡、鸭、苍鹭、虎、猫等多种动物的事件。更令人担忧的是,在泰国已经出现疑似人传染人事件,马来西亚也有多例报道。进入2005年,罗马尼亚、俄罗斯、土耳其等欧洲国家相继发现禽类感染H5型禽流感病毒致死事件,专家认为此乃带毒候鸟迁移的结果,这使得控制高致病性H5型禽流感病毒的进一步扩散传播变得更为困难。专家预测,随着侯鸟的传播,H5型禽流感病毒有可能通过欧亚、亚非大陆桥进一步传播到卫生条件极差的非洲国家,使得H5型禽流感病毒获得和其它人流感病毒充分重组的机会和时间,届时将很可能形成一种对人类高度致命的全新流感病毒,其给人类带来的各种损失将难以估计。根据WHO统计结果,截止2006年1月19日,全球因感染H5N1病毒死亡的人类个案已达80例,给全球公共卫生安全带来极大的考验。
本实验室利用不同时间、不同地点、不同宿主分离到的多个禽流感病毒H5N1代表株免疫小鼠,持续进行单克隆抗体的制备,已制备出了包含400多株具有血凝抑制(HI)活性的H5特异性单克隆抗体的H5单抗库。
根据对近千株全球各地H5N1病毒基因组序列进行的系统进化分析,我们筛选出34株不同地域、不同进化分支、不同宿主来源的H5N1代表株,加上2006年最新分离出的7个毒株共41个毒株组成代表性H5N1病毒库。对这41株H5N1病毒进行各单抗的HI活性测定,可根据HI活性的差异将这400多株单抗分为10个类型,同时可将这41株代表性病毒分为八个HI活性分支。初步筛选出17株单抗对2002以来的H5N1病毒株的抗原多样性进行分析。根据血凝抑制实验和细胞中和实验的结果,可将7种H5N1亚型分成4个抗原群。其中13D4、16F13等单抗均可对绝大部分毒株具有很高的中和活性,为治疗性抗体研究奠定了基础(Wu,W.L.,Chen,Y.,Wang,P.,Song,W.,Lau,S.Y.,Rayner,J.M.,Smith,G.J.,Webster,R.G.,Peiris,J.S.,Lin,T.,Xia,N.,Guan,Y.and Chen,H.2008,J Virol.82(4),1798-1807)。
血凝素(HA)抗原是禽流感病毒疫苗的最主要靶标,但同时也是病毒变异最活跃的抗原。现有流感疫苗必须不断根据最新的病毒流行株的抗原变异特征的变化而更新用于疫苗制备的毒株,而且由于各地流行病毒株并不一定完全一致,造成疫苗株选择的巨大困难。同时,由于新疫苗的制备必须经一定的时间,为应对流感疫情,必须提前对病毒流行趋势进行预测,这种预测也不能保证每次都正确。因此,发现禽流感病毒高保守中和表位并进行针对性的通用疫苗研究开发具有极大的吸引力。
在我们制备的H5N1单抗库中,已发现有4株单抗对目前所检测的全部H5N1变异株都有很强的中和活性,提示H5N1病毒HA上可能存在重要的高保守性中和位点,从而提供了一个克服H5N1禽流感病毒高变异这一巨大障碍的重要突破口。我们利用其中的1个保守中和单抗(13D4),从噬菌体肽库中筛选特异结合的表位模拟肽。
多肽表面展示是一种新的基因操作技术,它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体,细胞或某些载体表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用,并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制,以及生物分子实验定向进化等研究。
近年来噬菌体肽库技术应用范围很广,日益受到人们的重视,此肽库技术也日趋成熟,根据应用目的不同而构建了各种不同的肽库,且成功地应用到了很多领域(Parmley,S.F.and Smith,G.F.,1988,Gene;Cwirla,S.E.et al.,1990,Proc Natl Acad Sci USA;Scott,J.K.andSmith,G.P.,1990,Science;Smith,G.P.and Scott,J.K.,1993,Methods Enzymol)。如根据载体种类可分为丝状噬菌体肽库、T4噬菌体肽库、λ噬菌体肽库;根据用途不同可分为随机短肽库、天然肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。
用噬菌体随机肽库从事蛋白质抗原表位的分析,在研究线性短肽、折叠的蛋白质,甚至非蛋白质分子等受体的相应配体时,噬菌体随机肽库被认为是配体的“万能库”。这些配体不一定和天然的配体完全相同,但它能模拟天然配体的结合特性。基于此理论,在抗原-抗体的识别研究中,人们不必使用天然抗原,就可以从随机肽库里直接筛选出能和抗体结合的表位。这些表位既可以是线性表位,也可以是构象型表位,而且不必预先确定蛋白质的氨基酸序列。
噬菌体随机肽库是模拟肽筛选技术中的强有力的武器。它由特定长度的随机短肽序列组成,理论上文库中包括某一固定长度短肽所有的氨基酸排列组合方式,即这一长度的所有表位。用抗体筛选随机肽库得到与其高亲和力结合的小分子模拟肽,进行短肽的序列确定后,可根据此序列进行短肽重组合成和进一步修饰,以获得最佳的抗原呈递,得到高特异性的新型疫苗,刺激机体产生有效的细胞和体液免疫反应。但应避免用某一单克隆抗体筛选随机肽库,那样虽可得到具有与目标蛋白相同抗原性的表位模拟肽(mimotope),但该表位模拟肽也可能结合于同一抗体中的不同CDR区。所以,可视为候选疫苗的模拟表位肽必须具有与识别天然表位的抗体结合的抗原性及诱导与天然表位有交叉反应的抗体的免疫原性。
发明内容
在第一方面,本发明提供了能特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体的表位模拟肽,其氨基酸序列为SEQ ID NOs:1-211之一,或者所述模拟肽经氨基酸插入、延伸、替换、删除而得到的保守性变异体或活性片段,所述变异体或活性片段仍保持与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和性单克隆抗体特异结合的能力。
在第二方面,本发明提供上述禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体,是由保藏号为CCTCC-C200721的杂交瘤细胞系所分泌的抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体13D4,或其抗体片段,如Fab、Fab′或F(ab)2。
在第三方面,本发明提供的禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体可以是其基因工程抗体形式,如小分子抗体、嵌合抗体、人源化抗体。
在第四方面,本发明提供了包含上述模拟肽或其保守性变异体或活性片段或突变序列的融合蛋白,其具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。优选地,其中所述模拟肽或保守性变异体或活性片段与其它蛋白或毒素等载体融合。更优选地,所述其它蛋白为239蛋白或HBc。
在第五方面,本发明提供了展示上述模拟肽或保守性变异体或活性片段或类似物或突变序列的类病毒颗粒,仍具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。
在第六方面,本发明提供了包含本发明核苷酸序列的核酸载体。
在第七方面,本发明提供了上述模拟肽及其保守性变异体或活性片段或类似物或突变序列、上述融合蛋白或类病毒颗粒用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途。
在第八方面,本发明提供了上述模拟肽及其保守性变异体或活性片段或类似物或突变序列、上述融合蛋白或类病毒颗粒在制备用于诊断禽流感疾病的组合物中的用途。
在第九方面,本发明提供了药物组合物,包含本发明所述模拟肽或保守性变异体或活性片段或其类似物或突变序列,或所述融合蛋白或所述类病毒颗粒。
在第十方面,本发明提供了抗体,其特异于本发明的模拟肽或保守性变异体或活性片段或其类似物或突变序列。本发明也提供了所述特异性抗体在制备用于诊断和治疗禽流感疾病的组合物中的用途。
在本发明任何方面或者实施方案中,如果适用的话,优选地,所述禽流感病毒是H5亚型禽流感病毒,特别是H5N1禽流感病毒。
本发明还涉及上述表位模拟肽用于预测禽流感病毒广谱中和表位的用途。
本发明还涉及基于上述表位模拟肽预测到的禽流感病毒广谱中和表位,优选SEQ ID NO:212所示的中和表位,或者SEQ ID NO:212的经一个或者几个(例如1-5个,1-4个,1-3个,1-2个,或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体。本发明还涉及包含该禽流感病毒广谱中和表位的多肽或融合蛋白质。
本发明还涉及所述广谱中和表位、多肽或融合蛋白质用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途。
本发明还涉及药物组合物或诊断用组合物,包含本发明的表位模拟肽包,含该表位模拟肽的多肽、本发明所述融合蛋白或复合物、或本发明广谱中和表位、多肽或融合蛋白质。
本发明还涉及抗体,其特异结合权利要求本发明的广谱中和表位。
本发明还涉及编码广谱中和表位、多肽或融合蛋白质的分离的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该多核苷酸或核酸构建体的载体、或者包含该载体的分离的细胞。
本发明还涉及抗体,其是由单克隆抗体13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7,或其(抗原结合性)抗体片段,如Fab、Fab′或F(ab)2,或者单克隆抗体13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的基因工程抗体形式,如小分子抗体、嵌合抗体、人源化抗体,或者单克隆抗体13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7经一个或者几个(例如1-5个,1-4个,1-3个,1-2个,或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体。
本发明还涉及抗体13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的CDR1、CDR2、或CDR3或者重链可变区或者轻链可变区或它们经一个或者几个(例如1-5个,1-4个,1-3个,1-2个,或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体。
本发明还涉及抗体,其包含13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的CDR1、CDR2、或CDR3或它们经一个或者几个(例如1-5个,1-4个,1-3个,1-2个,或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体。
本发明还涉及抗体,包含13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的CDR1(或其变异体)、CDR2(或其变异体)和CDR3(或其变异体),其中所述变异体是经一个或者几个(例如1-5个,1-4个,1-3个,1-2个,或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体。
本发明还涉及抗体,其包含13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的重链可变区(或其变异体)和/或轻链可变区(或其变异体),其中所述变异体是经一个或者几个(例如1-5个,1-4个,1-3个,1-2个,或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体。
本发明申请中涉及的有关术语的定义如下:
本发明中的“血凝素”一词指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介导流感病毒针对宿主细胞的吸附和进入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16个血清学亚型,即HA1-HA16,分别对应于16个病毒亚型,即H1-H16。
本发明中的“抗体”一词指任意一种免疫球蛋白,包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三等三个恒定区;每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型,“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区,其通过二硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区,和一条轻链的可变区和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合;每条链的可变区均含有三个高变区,称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名,见Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition(1991),第1-3卷,NIHPublication 91-3242,Bethesda Md)。其中,三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关,但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类,主要是:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些类还进一步分成亚类,如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。
本发明中的“抗体”一词,除特指完整的免疫球蛋白外,也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段),如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、单链抗体分子或由含有一个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外,本发明涉及的抗体也可以是由一个特定的人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。
抗体相关的“Fab”片段是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。
本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。
本发明中的“单抗”一词指的是来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断,也即除仅在少数情况下可能出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。单抗与多抗不同,多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。虽然传统的单抗是由杂交瘤细胞分泌的,但本发明涉及的单抗并不仅限于此制备方法。如,本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975),也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
本发明中“载体”一词指的是,可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说,载体包括:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。
本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞,包括如下许多细胞类型,如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
“中和抗体”一词指的是能清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。
“特异性结合”一词指的是,两分子间的非随机结合反应,如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处,结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中,一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原,其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon),其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。
本发明在如下段落中进行举例说明:
抗体
本发明所述单抗能够特异性结合H5亚型禽流感病毒。本发明的一个方面涉及能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗及其相应的抗原结合片段。
本发明所述H5亚型禽流感病毒广谱中和单抗是指这样一种单克隆抗体,其针对多种(至少两种)不同亚型的H5禽流感病毒株都具有中和活性。
本发明所述抗H5单抗是由小鼠杂交瘤细胞株13D4所分泌的。单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是,抗H5单抗由杂交瘤细胞株13D4产生,并命名为13D4。单抗13D4能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠杂交瘤细胞株13D4已在2007年5月29日于中国典型培养物保藏中心(CCTCC,位于武汉的武汉大学)进行保藏,保藏号是CCTCC-C200721(杂交瘤细胞株13D4)。
可以采用Kohler等在Nature 256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先偶联到某些已知蛋白,如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上,可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后,体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外,淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髓瘤细胞并用合适的融合剂,如PEG,进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,pp.59-103,Academic Press,1996)。
上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长,培养液中最好含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如,对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞,在培养液中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
利用传统的免疫球蛋白纯化方法,如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等,可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
本发明所述单抗还可以是通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增,可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞,如大肠杆菌细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。
本发明的单抗可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另外,所述抗体也可以是保持了对血凝素蛋白亲和力的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab′、F(ab)2、Fv、或其它类型的部分片段,其结合血凝素蛋白的亲和力可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。
本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外,这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(综述见Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999);Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如,Fab′片段可以直接从大肠杆菌细胞中获得或化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。再如,F(ab′)2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外,Fv、Fab或F(ab′)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。
中和抗体
另一方面,本发明提供了能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗体。在一实施方式中,这种中和抗体能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的至少60%,或至少70%,或优选至少75%,或优选至少80%,或优选至少85%,或优选至少90%,更优选至少95%,最优选至少99%。
本领域普通技术人员完全知晓利用传统的技术方法可以测定抗体中和H5亚型禽流感病毒的病毒活性。如本发明的实施例1中所描述的中和试验的方法即可用于测定本发明中的某一个特定H5单抗的中和活性。
表位模拟肽
本发明还提供了一种模拟单克隆抗体识别表位的模拟肽。
本发明还提供了88个与单克隆抗体13D4结合有特异性的含12或7个氨基酸的短肽即模拟肽(表1,SEQ ID NOs:188)。
通过动物免疫实验,从这些通用突变序列中可以筛选出能诱导产生与13D4单抗功能类似抗体的模拟肽,这些模拟肽即可以进一步作为通用禽流感表位疫苗的研究基础。
本发明所指的肽含有天然或非天然氨基酸,包括D型氨基酸及氨基酸衍生物及氨基酸类似物,只要肽保持带有希望的活性和功能。肽也可以被环化。肽骨架及肽键也可以被修饰。氨基酸及其衍生物都可以被修饰。非天然氨基酸及氨基酸类似物的替换可能增强肽的活性或特征,比如增强肽的稳定性和生物学活性。
本领域的技术人员可以很容易地对模拟肽进行多种方法的修饰,以获得最佳的抗原呈递,有效刺激机体产生细胞或体液免疫反应。此近几年对重组肽疫苗的研究主要着重于通过构型的改建、增添分子等修饰,以提高其免疫原性及在体内的稳定性。
其中一种方法是将模拟肽连接到大分子载体上,一般用MBS法、戊二醛法、碳二亚胺法、活泼酯法、亚胺酸脂法及卤代硝基苯法等偶联载体与重组肽疫苗。蛋白类载体有人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)或其他γ球蛋白。重组载体有多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。
也可以修饰模拟肽的空间结构以增强免疫原性,如将抗体重链第三互补决定区(CDR 3)用外源小肽替代,借助CDR3环结构两侧的β片层的空间限构作用,成功实现了原表位的空间限构,使具有抗原性的外源小肽获得与相应天然蛋白相似的稳定构象,增强了抗原呈递效率和诱导机体免疫应答的能力。还可以用化学方法将模拟肽构建成四价多抗原性肽。对模拟肽进行修饰可以降低蛋白酶的水解。
提高重组肽免疫原性的另一方法是构建表达出融合蛋白,作为载体的大蛋白分子可以作为免疫载体,提供T细胞位点。一些病毒衣壳蛋白在原核或者真核系统中表达后,在一定条件下形成的类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)。可以VLP作为表位展示载体上,即将模拟肽融合表达到病毒衣壳蛋白上。将模拟肽融合到环区,就能很好的展示在VLP表面。再通过一个柔性的氨基酸连接体序列,模拟肽就能不受病毒衣壳蛋白的约束,自由的形成构像。乙肝HBcAg、苜蓿花叶病毒、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、人乳头瘤病毒HPV衣壳蛋白L1、L2等都可以作为展示模拟肽的蛋白载体。
本领域的技术人员可以很容易地合成本发明的模拟肽。制备合成肽的标准过程为本领域技术人员知晓。
检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式,上述检测方法可以用于检测目标抗原或抗体。
竞争法是比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合本发明所述单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把本发明所述单抗包被到固相支持物上而得以进行的。同时加入预定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后,冲洗固相支持物,检测结合到该支持物上的标记物的活性。
治疗方法和药物组合物
本发明提供了一种预防和治疗禽流感病毒相关病毒感染患者的方法,包括对患者施用一定量的包含了一种或多种本发明所述模拟肽的有药物活性的药物成分。本发明还提供了一种含有本发明所述的一种或多种模拟肽的药物成分或在此基础上得到的盐类药物。
本发明所述药物成分的干预方式可以是传统的干预途径,包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如,粉剂、药膏或滴剂),或鼻腔途径,但不仅局限于此。
适合肠胃外途径注射的药物成分可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂,可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体,工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙二醇、丙三醇及其类似物),合适的混合物,菜油(如橄榄油),和可用于注射的有机脂,如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性。如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。
本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂,也可以含有预防微生物污染的速溶成分,如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂,如对羟基苯甲酸酯类,氯丁醇,苯酚,山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂,如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间,如单硬脂酸盐和凝胶等。
口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙,或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸;(b)粘合剂,如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶;(C)湿润剂,如甘油;(d)碎裂剂,如琼脂,碳酸钙,马铃薯粉或木薯粉;(e)缓凝剂,如石蜡;(f)促吸收剂,如四氨基混合物;(g)保湿剂,如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯;(h)吸附剂,如高岭土和斑脱土;(i)润滑剂,如滑石,硬脂酸钙,硬脂酸镁,固体聚乙二醇,硫酸十二烷醇钠,或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中,可能还含有缓冲剂。
固相剂型可以通过做成改良释放或脉冲释放剂型,是在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成,可以包含在剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素,甲基纤维素,碳甲基纤维素钠,纤维素乙烷,醋酸纤维素,聚乙烯氧化物,黄原胶糖,异丙烯酸氨共聚物,氢化调味油,巴西棕榈蜡,石蜡,邻苯二酸醋酸纤维素,邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素,甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或一组具有改良释放速率的赋形剂。
本发明所述药物成分还可由快速的雾化剂或消溶剂(FDDFs)组成,包含如下成分:天冬氨酰苯丙氨酸甲酯,磺胺钾,柠檬酸,交联羧甲基纤维素钠,交聚维酮,抗坏血酸,乙烷基丙烯酸盐,乙烷基纤维素,明胶,氢氧基丙基甲基纤维素,硬脂酸镁,甘露醇,甲基乙丁烯酸盐,调味薄荷,聚乙二醇,气化硅胶,二氧化硅,乙醇酸淀粉钠,硬脂酸延胡索酸钠,山梨醇,木糖醇。这里用于描述FDDFs的“雾化和消溶”一词,依赖于所用药物的溶解性,如药物是不可溶的,可制成快速的雾化剂型,如药物是可溶的,则可制成快速的溶剂型。
类似形式的固相成分也使用诸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及类似的赋形剂制成软明胶或硬明胶的填充剂型。
诸如片剂、糖衣剂、胶囊剂和颗粒剂等之类的固体剂型可以通过诸如肠衣或其它本领域普通人员均知晓的外包衣壳的方式制成。也可以是含有乳浊剂、也可以是含有能起缓慢、延迟、控制活性药物释放的类似的成分。也可以使用多聚物和石蜡等成分进行包埋。如果合适,也可用上述一种或多种赋形剂把活性成分制成微囊的形式的剂型。
用于口服的液体剂型,包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂等。除了活性成分,液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液,如水或其它溶剂,可溶性试剂和乳化剂,如乙烷基醇,异丙基醇,乙烷基碳酸盐,苯基安息香酸盐,丙烯乙二醇,1,3-丁烯乙二醇,油,特别是,棉籽油,落花生油,玉米油,橄榄油,调味油和芝麻油,甘油,氢糠基醇,聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯,以及上述物质的混合物或类似的物质。
除了这些惰性稀释液,药物成分也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外,药物成分还可包括乙氧基化均聚乙醇,聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂,微晶纤维素,间氢氧化铝,膨润土,琼脂聚合物和黄芪胶,或这些物质的混合物之类的悬浮剂。
本发明所述药物成分也制成适合兽用治疗的混合物,或符合兽用的盐类,或符合兽用的溶剂或初成药,并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成一种最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。
本发明所述一个或多个模拟肽可以结合其它抗病毒试剂用于预防和/或治疗H5禽流感病毒感染相关疾病。模拟肽可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。其它抗病毒试剂包括利巴韦林,金刚烷,羧基脲,IL-2,IL-12和五羧链胞酸,但不仅限于这些。
多肽筛选方法和抗体识别的多肽及疫苗
本发明提供了一种筛选本发明所述单抗识别的表位模拟肽的检测方法。而且,本发明也提供了本发明所述单抗识别的表位模拟肽。一方面,本发明公布的模拟肽含有氨基酸序列SEQ ID Nos:1-88。这些模拟肽能够结合本发明所述单抗。因此,这些模拟肽拥有和H5血凝素相同的抗原特异性。这些模拟肽也可用于制备H5亚型禽流感疫苗,也可以用于诊断抗H5血凝素抗体的存在。
另一方面,本发明所述的筛选方法包括如下步骤:(i)在特定条件下培养一个适合多肽表达的多肽展示文库;(ii)把培养溶液和本发明的单抗混合;(iii)筛选特异性结合上述单抗的噬菌体克隆。用于筛选的单克隆抗体不仅限于单抗13D4。本申请实施例1中详细描述了一种利用噬菌体展示多肽文库成功筛选结合本发明所述单抗的模拟肽检测方法。
附图说明
图1-3为噬菌体多肽的ELISA检测值OD(450/620)的矩形图。图1显示的是ELISA检测展示12肽的噬菌体与抗体的反应。图2显示的是ELISA检测展示环七肽的噬菌体与单抗的反应。图3显示的是ELISA检测展示七肽的噬菌体与单抗的反应。
图4显示10组噬菌体肽抗血清与H5N1禽流感病毒的Dot blot反应结果。13D4为阳性对照,control(-)为M13噬菌体阴性对照,control(0)为未加血清的阴性对照。有3组抗血清(P1、P5和P10)显示出较明显的特异性与H5病毒的结合反应。
图5显示3组噬菌体肽抗血清与不同亚型禽流感病毒的Dot blot反应结果。P1-1和P1-2为来自两只不同小鼠的P1组抗血清,同样P5-1和P5-2为来自两只不同小鼠的P5组抗血清,P10-1和P10-2为来自两只不同小鼠的P10组抗血清。P6-1和P6-2为来自两只不同小鼠的P6组抗血清,作为阴性对照。H1 mAb和H3 mAb分别为H1和H3禽流感病毒的单抗,13D4为H5亚型禽流感病毒的单抗。M13-1和M13-2为M13噬菌体的阴性对照血清。Control serum为未经免疫的阴性对照鼠血清。No serum为未加血清的阴性对照。有两种H1亚型的禽流感病毒ST/517/2005/2(517)和ST/104/2005/2(104),有两种H3亚型的禽流感病毒ST/798/2005/2(798)和ST/177/2005/2(177)。六种H5亚型禽流感病毒DK/FJ/897/05(897)、VNM/1194/04(1194)、CK/Malang/BBVet-I/04(Y1)、Shenzhen/406H/06(406H)、Ck/Jx/6151/03(6151)、A/Ck/HK/Yu22/02(Yu22)。结果显示3组抗血清(P1、P5和P10)有明显的特异性与H5亚型病毒的结合反应。
图6显示Pep-3D-Seaerch预测区域在HA1上的空间位置。
图7显示交叉反应的模拟肽。
图8显示Mapitope预测的“Cluster 300”交叉表位。A:“cluster300”的空间结构;B:“cluster 300”的在HA上的位置;C:“cluster300”的突变位点选择。
实施例
下面结合具体实施例与附图,对本发明进一步加以描述,但这些描述并不构成对本发明的限制。
实施例1从噬菌体12肽库、七肽库和环七肽库中筛选模拟13D4识别表位的短肽
选用New England Biolabs公司的12肽噬菌体展示文库(ph.D.12peptide library)、七肽噬菌体展示文库(ph.D.7peptide library)及环七肽噬菌体展示文库(ph.D.C7C peptide library)筛选与单克隆抗体13D4结合的模拟肽,按操作说明书进行筛选。
吸取50μl Protein A-琼脂糖介质(50%的水悬液)于微量离心管中,加1ml TBS+0.1%Tween(TBST)溶液。轻弹管壁或温和震荡重悬介质。低速离心30秒,沉淀介质,小心吸去上清。介质重悬于1ml封阻缓冲液中,4℃作用60分钟,偶尔混匀。在此期间,用TBS缓冲液将2×1011个噬菌体粒子(相当于10μl的原始文库)和300ng抗体稀释至终体积200μl,抗体终浓度为10nM。室温作用20分钟。封阻反应后,低速离心沉淀介质,并用1ml TBS洗4次,每次均需沉淀介质。将噬菌体-抗体混合物加入洗过的介质中,温和混匀,室温作用15分钟并不时混匀。低速离心沉淀介质,弃上清,用1ml TBTS洗10次。重悬沉淀介质于1ml 0.2M的Glycine-HCl(pH 2.2),1mg/ml BSA中,室温作用10分钟,洗脱结合的噬菌体。离心洗脱混合液1分钟,小心将上清转入另一新的微量离心管中。立即用150μl 1M Tris-HCl,pH9.1的缓冲液中和洗脱液。取出约1μL滴定噬菌体滴度。将剩余的噬菌体溶液加入20mL对数生长前期的ER2738宿主菌液中,37℃震荡培养4.5h。将菌液移入50mL离心管中,10000rpm离心10min。吸取上部80%上清,加入1/6体积的PEG/NaCl(20%PEG-8000,2.5M NaCl)溶液,4℃静置过夜。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清,用1mL PBS溶解沉淀噬菌体。4℃离心5min,吸取上清,加入1/6体积的PEG/NaCl溶液,4℃静置1h。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清,用200μL PBS溶解沉淀噬菌体,4℃保存。重复上述步骤,进行再一轮的筛选。
第三轮筛选后,取出约1ul洗脱下来的噬菌体进行滴定。挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中,37℃培养4.5-5h,离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被10ug/ml浓度的鼠单抗13D4,以噬菌体上清为一抗,Anti-M13/HRP抗体(Amersham Phmarcia Biotech,UK)以1∶5000稀释为二抗,取禽流感相关单克隆抗体8G9、8H5、9B2、10F7以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11、8H3、16D7为鼠单抗对照。
图1-3显示噬菌体多肽的检测结果。由图中结果可知,大部分噬菌体肽针对目标抗体13D4的读值高于对照抗体3倍以上,有较好的特异性。
根据噬菌体ssDNA抽提试剂盒(Omega,USA)的常规操作抽提DNA,以该DNA模板进行测序(Invitrogen,Shanghai,China),获得以上噬菌体展示肽的核苷酸及推测的氨基酸序列(见表1)。
表1与单抗隆抗体13D4特异结合的模拟肽氨基酸序列
噬菌体肽编号 | 模拟肽序列 | 序列编号SEQ IDNO | 噬菌体肽编号 | 模拟肽序列 | 序列编号SEQ IDNO |
A1 | QMSSENWTKFRL | 1 | C-1 | PIYRLHQ | 48 |
A2 | VSHKLRPWDVPP | 2 | C-2 | PPYRWHH | 49 |
A3 | HGYVSRPWDPPT | 3 | C-3 | PPWRYHL | 50 |
A5 | KTVLPPWQRDLY | 4 | C-4 | PPWRSHL | 51 |
A9 | SVAPWLIWSATT | 5 | C-5 | APWQSKY | 52 |
A10 | APPIPPWRVHLL | 6 | C-6 | PPWRLNF | 53 |
A12 | HPGPHPLFRSQW | 7 | C-7 | FHPLPHV | 54 |
A13 | IPPWHQDYYFSR | 8 | C-8 | PPWRQLF | 55 |
A18 | SHLMRPWDIAYY | 9 | C-9 | APWQWRY | 56 |
A19 | HYDWMSHHHATL | 10 | C-10 | PPWRYSF | 57 |
A21 | APRIPPWRVHLL | 11 | C-12 | RPWDGPL | 58 |
A22 | YVIRPWDVQPPL | 12 | C-13 | PPWRAIF | 59 |
C3 | KAPTEWWYSTIY | 13 | C-15 | PPWRTSF | 60 |
C10 | HWRPMEMSQWGL | 14 | C-17 | YGRPWDK | 61 |
C12 | THSKIPPWRLPM | 15 | C-18 | PWYRLQQ | 62 |
C14 | QGKSPHDYMIPY | 16 | C-20 | PPWRIAF | 63 |
C15 | VHRDWSDPRIRC | 17 | C-23 | PPWRQPF | 64 |
C16 | HSTHHARPWDTR | 18 | C-24 | APWRLSW | 65 |
C17 | TSPVAWWRYTTS | 19 | C-25 | PWYRMSQ | 66 |
H1 | FTLRPWDATGPT | 20 | C-26 | PPWRLPW | 67 |
H6 | NPPWLYWQRTTT | 21 | C-28 | PSYRLHQ | 68 |
H7 | SPPWMQWKLSMA | 22 | C-29 | GPWQKHY | 69 |
H9 | TWDGCQWRNCRQ | 23 | C-30 | APWQTLY | 70 |
H10 | NHGSTRPPWLML | 24 | C-31 | APWQTSY | 71 |
H13 | HNNPVSIWRNSM | 25 | C-32 | APWQQSY | 72 |
H14 | APFEHLYPEKRN | 26 | C-33 | FGRPASV | 73 |
H15 | SISFPPRPWDYK | 27 | C-34 | LWRPVAV | 74 |
H16 | TSPIEAWRSGLL | 28 | C-35 | RPWDPPS | 75 |
H17 | LNPVDRWRSSWL | 29 | C-36 | PYYRLHH | 76 |
H20 | NPPRLYRQRTTT | 30 | C-37 | PPWRSHF | 77 |
H21 | HLGDHKPFRNHH | 31 | C-38 | PPWRSHL | 78 |
H22 | HNQPSPHHHTGI | 32 | C-39 | RPWDGTW | 79 |
H28 | HHSHEFMTRRPP | 33 | C-40 | WHRLPWV | 80 |
H44 | FQLRPWDQRSPG | 34 | C-41 | WHRLPQV | 81 |
B4 | YTPVDKWRSTYT | 35 | C-42 | APWQKNY | 82 |
B5 | GHMNDGFLRWEP | 36 | C-43 | PPWRLQF | 83 |
B6 | WHQAPSPTPMPS | 37 | C-44 | PWYRLHQ | 84 |
B9 | ENSTHHRRPPDR | 38 | C-45 | PPWRAAF | 85 |
B10 | KIITTSERFLAI | 39 | C-46 | PPWRVSW | 86 |
B13 | WHPPRHYRHGTV | 40 | C-47 | PPWRHLF | 87 |
B16 | HYPLRPWDLDIP | 41 | C-48 | PIYRMHH | 88 |
B18 | VTRDWSDPRIRY | 42 | |||
B20 | SVAPWLIWSANT | 43 | |||
B21 | QYPWMTWRESLL | 44 | |||
B22 | SHCPSHALPWCL | 45 | |||
B23 | YPQHMLRWQHTW | 46 | |||
B25 | TPPWLHWRLSWP | 47 |
实施例2.噬菌体肽的分组免疫及抗血清对病毒的Dot blot检测结果
对以上各种噬菌体肽分别进行大量扩增。各挑取1个噬菌体斑至4ml对数期的ER2738中,37℃震荡培养4.5ml,再转接至100mL对数生长前期的ER2738宿主菌液中,37℃震荡培养4.5h。将菌液移入50mL离心管中,10000rpm离心10min。吸取上部80%上清,加入1/6体积的PEG/NaCl(20%PEG-8000,2.5M NaCl)溶液,4℃静置过夜。10000rpm4℃离心15min。倒掉上清,用10mL PBS溶解沉淀噬菌体。4℃离心5min,吸取上清,加入1/6体积的PEG/NaC l溶液,4℃静置1h。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清,用1mL PBS溶解沉淀噬菌体,4℃保存。然后用对数期的ER2738菌滴定噬菌体肽的浓度。
以上筛选到的特异性结合13D4的噬菌体肽按照几个克隆混合后免疫的方式进行免疫。具体方法是,按照序列相似性或随机的形式把阳性噬菌体肽分成10组,见表2。
每组噬菌体肽免疫3只BALB/C小鼠,1×1011pfu/只。噬菌体肽溶于TBS缓冲液中,加入等倍体积的弗氏完全佐剂(第一次免疫)或弗氏不完全佐剂(第二次及以后的加强免疫),混匀,100ul皮下多点注射。每两周免疫一次,第三次加强后一周眼眶采血,分离血清。
表2用于免疫的噬菌体肽分组情况
噬菌体肽分组 | 噬菌体肽编号 |
P1 | A1、A2、A18、H13、C16、B16 |
P2 | A5、A13、B25、C12、C17 |
P3 | A24、C2、C3、C9、B11 |
P4 | H16、H17、H20、B10、C15 |
P5 | H21、H22、B4、B5、B21 |
P6 | A9、B9、B18、B20、B23 |
P7 | B13、B22、C10、C14、H14、H28、A22 |
P8 | C-29、C-5、C-9、C-24 |
P9 | C-3、C-10、C-14、C-13、C-20 |
P10 | C-11、C-17、C-27、C-21 |
进一步用Dot blot来检测抗血清与H5N1病毒的反应性。采用禽流感H5型的Chicken/Hong Kong/YU22/2002(YU22),Indonesia/2A/2004(2A)和CK/VNM/568/2005(568)三株病毒,以1μ点于硝酸纤维素膜上,风干后再点加1ul,风干后用5%脱脂奶(溶于TN缓冲液)封阻没有结合病毒的非特异性位点,封阻2小时。期间用5%脱脂奶稀释抗血清(采用1∶100,1∶200和1∶500共3个稀释度)。封闭完后,把相应标记的条带加入相应的稀释血清中室温反应1小时。后用0.5‰Tween(TNT)溶液洗涤条带,洗涤3次(每隔5min换一次洗液)。再加二抗GAM-AP(5%脱脂奶稀释成1∶5000)反应1小时,后用0.5‰Tween(TNT)溶液洗涤条带,洗涤3次(每隔5min换一次洗液)。配置反应底物(33μl BCIP,66μl NBT混溶于10ml AP底物缓冲液中)。把条带置于其中反应,室温摇床上缓慢摇20分钟显色。10组免疫抗血清的Dot blot检测结果见图4。由图可知当抗血清稀释100倍时,P1、P5和P10组的抗血清显示与三株H5N1病毒有较明显的阳性反应。当抗血清稀释100倍时,P1组抗血清仍显示与三株H5N1病毒有明显的阳性反应。
进一步检测这3组噬菌体肽抗血清与不同亚型禽流感病毒的Dotblot反应情况,实验过程如上所述。结果如图5所示,其中P1-1和P1-2为来自两只不同小鼠的P1组抗血清,同样P5-1和P5-2为来自两只不同小鼠的P5组抗血清,P10-1和P10-2为来自两只不同小鼠的P10组抗血清。P6-1和P6-2为来自两只不同小鼠的P6组抗血清,作为阴性对照。H1 mAb和H3 mAb分别为H1和H3禽流感病毒的单抗,13D4为H5亚型禽流感病毒的单抗。M13-1和M13-2为M13噬菌体的阴性对照血清。Control serum为未经免疫的阴性对照鼠血清。No serum为未加血清的阴性对照。有两种H1亚型的禽流感病毒ST/517/2005/2(517)和ST/104/2005/2(104),有两种H3亚型的禽流感病毒ST/798/2005/2(798)和ST/177/2005/2(177)。六种H5亚型禽流感病毒DK/FJ/897/05(897)、VNM/1194/04(1194)、CK/Malang/BBVet-I/04(Y1)、Shenzhen/406H/06(406H)、Ck/Jx/6151/03(6151)、A/Ck/HK/Yu22/02(Yu22)。结果显示3组抗血清(P1、P5和P10)有明显的特异性与H5亚型病毒的结合反应。
因此,进一步将这三组噬菌体肽分开来单独免疫小鼠,以确定能诱导H5亚型病毒交叉反应的噬菌体肽。
实施例3合成肽活性检测
合成肽与禽流感病毒的竞争ELISA实验
混合包被禽流感H5亚型单抗2F2、3G4各200ng/孔;与1∶50稀释的H5N1病毒Ck/HKYU22/02于37℃孵育1h,弃去未结合的病毒上清;将1∶1000稀释的13D4mAb/HRP分别与50ug、25ug、12.5ug合成肽混合,加入孔中37℃孵育0.5h,以不相关12肽P 35为阴性对照;常规洗板显色后,以1∶1000稀释的13D4mAb/HRP读值为对照,考察合成肽与病毒的竞争性。
合成肽阻断HI实验
按常规HI方法调整病毒Ck/HKYU22/02至合适的滴度;取25ug合成肽,倍比稀释至1/28,各稀释梯度均与1∶500稀释的13D4腹水混合,双孔重复;该混合物与病毒Ck/HKYU22/02在孔中室温孵育0.5h后,加入50ul鸡红细胞;室温孵育0.5h后,观察合成肽对HI的阻断。
实施例413D4、8H5、8G9、20H2、17E6、4A7的交叉阻断
按常规ELISA方法混合包被鼠单抗2F2与3G4(包含在以前公开的专利中)各2ug/ml,捕获4HA的病毒Ck/HKYU22/02(来源于香港大学新发传染病国家重点实验室,也可以使用其它病毒),1∶500稀释的13D4鼠单抗与1∶1000稀释的各鼠单抗HRP标记抗体混合,按常规ELISA方法反应及显色。阻断率计算为:阻断率(%)=100-(OD450/620(单抗与单抗/HRP混合物)/OD450/620(单抗/HRP))x100.其余单抗按上述方法计算其与各个单抗间的交叉阻断率,结果如表3所示,所选抗体间可以高效的相互阻断与病毒的结合。
表3所选抗体的交叉阻断率
实施例5单克隆抗体轻链基因和重链基因可变区的分离。
半贴壁培养107个杂交瘤细胞,吹管吹起贴壁细胞使悬浮,转移到新的4ml离心管中,1500rpm离心3min,收集沉淀的细胞,重悬于100ul无菌PBS(pH7.45)中,转移到一新的1.5ml离心管中。加入800ul Trizol(Roche,Germany),轻轻颠倒混匀,静置10min。加入200ul氯仿,剧烈振荡15s,静置10min,4℃12000rpm离心15min,转移上层液体至一新的1.5ml离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,静置10min。4℃12000rpm离心10min,弃上清,加入600ul 75%乙醇洗涤,4℃12000rpm离心5min,弃上清,沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70ul DEPC H2O中,分装成两管。每管加入1ul反转录引物,其中一管加入的反转录引物为MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAgCTT ggT(g/C)CC-3’),用于扩增轻链可变区基因,另一管加入的反转录引物为MVDJhR(5’-C ggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CC TTg(g/A)CCCCA-3’),用于扩增重链可变区基因。每管再加入1ul dNTP(上海生工),置72℃水浴10min,立即放到冰浴中置5min,加入10ul 5x反转录缓冲液,1ul AMV(10u/ul,Pormega),1ul Rnasin(40u/ul,Promega),混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。
抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应(PCR)法,使用根据Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物组以及另外设计合成的两条下游引物MVJkR、MVDJhR(上海博亚公司合成),MVJkR为轻链可变区基因扩增的下游引物,MVDJhR为重链可变区基因扩增的下游引物。模板即为以上合成的两种cDNA。PCR条件为:94℃5min,94℃40s 53℃1min72℃50s 35cycles,72℃15min。回收目的片段并克隆至pMD 18-T载体,送至上海博亚公司测序,序列经blast比对后确定抗体可变区序列,并推测出相应的氨基酸序列。
依上述方法从6株禽流感单抗杂交瘤细胞株中克隆出其抗体可变区基因,并推测出相应的氨基酸序列。表4所示为6株单克隆抗体可变区氨基酸序列。互补决定区(complementary determinant region,CDR)通过IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)进行确定。
实施例6单抗模拟肽的筛选及评价
各个单抗特异结合的噬菌体展示多肽筛选方法参见实施例1。为平行比较这些模拟肽对其相应抗体的活性,以及模拟肽与该组其他抗体是否存在交叉反应性,将以上所有阳性序列重新大量扩增、纯化并滴定,以一致的起始滴度进行检测和比较。取噬菌体上清感染50ml宿主菌ER2566,培养扩增后用PEG 8000进行两次的纯化和浓缩,收获纯度和滴度较高的噬菌体样品;以1011、1013、1015的稀释度对每个样品进行滴定,直至有效计数,确定每个克隆的滴度。每组序列以同样的起始滴度与所有检测抗体反应,通过不同的检测OD值,确定各个序列的活性高低及交叉反应的强弱,表5-10列出了各个阳性克隆的反应水平、特异性、交叉反应性、序列及出现的次数。该结果表明,13D4与20H2,8H5与17E6,8G9与4A7的模拟肽之间存在明显的交叉反应。
表5 13D4模拟肽的交叉反应
“++++”:OD>2.5;“+++”:OD 1.5~2.5;“++”:OD 0.5~1.5;“+”OD 0.1~0.5;“-”:OD<0.1;目标抗体;交叉反应。
表6 20H2模拟肽的交叉反应
“++++”:OD>2.5;“+++”:OD 1.5-2.5;“++”:OD 0.5-1.5;“+”OD 0.1-0.5;“-”:OD<0.1;目标抗体;交叉反应。
表7 17E6模拟肽的交叉反应
“++++”:OD>2.5;“+++”:OD 1.5-2.5;“++”:OD 0.5-1.5;“+”OD 0.1-0.5;“-”:OD<0.1;目标抗体;交叉反应。
表8 8H5模拟肽的交叉反应
“++++”:OD>2.5;“+++”:OD 1.5-2.5;“++”:OD 0.5-1.5;“+”OD 0.1-0.5;“-”:OD<0.1;目标抗体;交叉反应。
表9 4A7模拟肽的交叉反应
“++++”:OD>2.5;“+++”:OD 1.5-2.5;“++”:OD 0.5-1.5;“+”OD 0.1-0.5;“-”:OD<0.1;目标抗体;交叉反应。
表10 8G9模拟肽的交叉反应
“++++”:OD>2.5;“+++”:OD 1.5-2.5;“++”:OD 0.5-1.5;“+”OD 0.1-0.5;“-”:OD<0.1;目标抗体;交叉反应。
实施例7Pep-3D-Search软件预测HA表位
表位预测选用的H5的HA蛋白晶体结构为2ibx(Vietnam/1194/2004(H5N1)),该结构的HA基因与Ck/HKYU22/02病毒的HA基因,即突变研究中的HA蛋白基因同源性为98.8%。该方法的预测过程如下:(1)分离目标蛋白的结构,以单链形式进行预测。(2)寻找蛋白质表面暴露残基。(3)输入各个抗体相应模拟肽序列,并在蛋白质表面残基中寻找相似区域。(4)输出表位定位的Cluster。预测结果如图6所示,各个抗体模拟肽的HA表位预测区域包含了A~H的交叉表位区。选择各个区域中保守的表面氨基酸:H28A、S84A、S120A、W122A、S128A、K140A、K152A、N182A、K189A、K307A进行rHA1的点突变验证,各点均替换为丙氨酸。
实施例8Mapitope软件预测HA表位
表位预测选用的H5的HA蛋白晶体结构仍为2ibx(Vietnam/1194/2004(H5N1)),该软件的预测过程参见Pepitope Server(http://pepitope.tau.ac.il/)界面的提示进行。将各组模拟肽分别输入运算,获得各个抗体表位区域的预测结果。在该方法中,两两交叉的抗体组,即13D4/20H2、8H5/17E6和8G9/4A7中发生交叉反应的模拟肽选出(见图7),构成每组抗体的交叉反应模拟肽,将这些序列再进行定位,获得三组交叉序列的表位定位。从表11可见,预测结果包含了共同的定位区段,即HA1的275aa~311aa区,命名为“Cluster 300”,序列如表12所示。从空间位置上看(图8),该区域的一级序列与模拟肽一致序列相似(图8,A),在HA1上位于茎部区域,有别于通常报道的头部受体结合区(图8,B),选取该区域的表面氨基酸:H295,P296,L297,I285,C302,Q279进行rHA1点突变验证(图8,C)。由于该区段接近HA1蛋白C端末尾,因此截取HA1末端至该表位的结束位置,构建C端缺失11个氨基酸(缺失aa312~aa322)的C11蛋白,以及HA1末端至该表位起始位置的C端缺失47个氨基酸(缺失aa276~aa322)的C47蛋白,从而大致判断该区段与抗体结合的关系。
表11Mapitope预测的模拟肽表位定位区域
表12HA1“Cluster 300”区域的氨基酸序列
区域名称 | 氨基酸序(275aa~311aa) | 序列编号SEQ ID NO |
“Cluster 300” | NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRL | 212 |
实施例9重组HA1(rHA1)蛋白突变体的酵母表达
突变位点通过酵母表达的重组HA1(rHA1)蛋白来验证。利用Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit,将yu22HA1基因通过PCR拼接的方式完成点突变,构建到毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9K上,总共构建了18个HA1突变蛋白:rHA1-H28、rHA1-S84、rHA1-S120、rHA1-W122、rHA1-S128、rHA1-K140、rHA1-K152、rHA1-N182、rHA1-K189、rHA1-K307、rHA1-Q279、rHA1-I285、rHA1-H295、rHA1-P296、rHA1-L297、rHA1-C302、rHA1-C11和rHA1-C47。将各表达质粒分别线性化,电转化P.pastoris菌株GS115,通过酵母染色体总DNA的提取和PCR扩增,确定目的基因整合到酵母染色体上;经过20ml小量表达,与3G4、13H8和1A6抗体反应,验证突变蛋白的活性。所选的初检抗体为H5HA抗体诊断试剂盒的配对抗体,其表位具有免疫优势,易识别,ELISA灵敏度较高,该方法未检出活性的突变蛋白,认为该突变导致蛋白构象改变,此位点的影响无法验证。如表13所示,各个重组HA1突变蛋白的表达情况和活性有所差别,W122、K140、K152、N182、N189、H295、I285、P295、L297和C302的突变体初筛无活性。将所选择的突变位点与1997至今的禽流感H5N1HA的同一位点氨基酸进行比对,结果表明,大部分位点为保守氨基酸,同源性较高。
表13突变蛋白的酵母表达
实施例10 rHA1突变蛋白的活性及HA1的表位分析
对有活性的突变蛋白进行抗体反应谱的ELISA测定,蛋白以100ng/孔包被,选取47株H5HA特异的鼠单抗与各个重组蛋白反应,并以未突变的酵母表达HA1蛋白为对照,操作按照常规的ELISA过程进行。将各个抗体对突变蛋白的反应活性换算为相对于rHA1蛋白反应的百分比进行平行比较。突变蛋白反应水平为HA1活性的70%以上视为无明显影响,低于30%视为显著差别,30%~70%之间的反应视为有影响。从各个抗体的反应变化可见。由表14和表15的结果可见,H28,K307对大部分抗体的活性影响很小,仅对极少部分包括13D4、20H2在内的抗体的活性显著下降,120、128位点的突变影响了大部分抗体的活性,可能与该位点位于头部受体结合区,为HA1的优势表位有关。13D4、20H2的HA1活性极易受到各种突变的影响,提示了广谱中和抗体13D4结合结构可能具有特殊性。C11的缺失几乎不影响抗体活性,而C47的缺失使大部分抗体活性显著影响。
表14各抗体突变蛋白活性与HA1活性的百分比
表15抗体与rHA1突变蛋白的反应变化
从序列比对来看,将NCBI Influenza Virus Resource中检索的1997至今的所有H1、H3和H5禽流感病毒HA序列,利用Mega软件比对271~312区段基因,计算其基因差异,该百分比越小表明距离越近(表16)。该段基因在H5亚型中非常保守,型内差异为4.5%;H1的型内差异为6.9%,与H5的差异为28.8%;H3的型内差异为3.6%,与H1、H5的差别都在70%附近,认为该区域在不同亚型病毒内均为HA1上的保守区段,但在H1、H3和H5亚型间差异较大,H5与H1较为接近,与H3相距较远,该段保守序列具有型特异性。从空间结构上看,H28、K307与“Cluster 300”(aa275~aa311)相近,均位于茎部保守区,该区域缺失的HA1蛋白,对几乎所有检测抗体的结合活性均明显影响,包括13D4和20H2。该区域可能参与了13D4等抗体的广谱中和表位,或者与抗体在HA1上的表位区域重叠或密切相关,对维持抗体结合的结构有重要作用。
表16流感病毒H1、H3、H5亚型HA1271aa~312aa的基因差异
序列表
<110>厦门大学
<120>H5亚型禽流感病毒保守中和表位模拟肽及其用途
<130>IDC080136
<150>CN200810182618.9
<151>2008-12-09
<160>248
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Gln Met Ser Ser Glu Asn Trp Thr Lys Phe Arg Leu
1 5 10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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Val Ser His Lys Leu Arg Pro Trp Asp Val Pro Pro
1 5 10
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<212>PRT
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His Gly Tyr Val Ser Arg Pro Trp Asp Pro Pro Thr
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Lys Thr Val Leu Pro Pro Trp Gln Arg Asp Leu Tyr
1 5 10
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
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1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
His Pro Gly Pro His Pro Leu Phe Arg Ser Gln Trp
1 5 10
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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Ile Pro Pro Trp His Gln Asp Tyr Tyr Phe Ser Arg
1 5 10
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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Ser His Leu Met Arg Pro Trp Asp Ile Ala Tyr Tyr
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<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
His Tyr Asp Trp Met Ser His His His Ala Thr Leu
1 5 10
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<212>PRT
<213>人工序列
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Ala Pro Arg Ile Pro Pro Trp Arg Val His Leu Leu
1 5 10
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Tyr Val Ile Arg Pro Trp Asp Val Gln Pro Pro Leu
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<210>13
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
Lys Ala Pro Thr Glu Trp Trp Tyr Ser Thr Ile Tyr
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<212>PRT
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<212>PRT
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Thr His Ser Lys Ile Pro Pro Trp Arg Leu Pro Met
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>16
Gln Gly Lys Ser Pro His Asp Tyr Met Ile Pro Tyr
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<211>12
<212>PRT
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<211>12
<212>PRT
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<212>PRT
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Thr Ser Pro Val Ala Trp Trp Arg Tyr Thr Thr Ser
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Ser Pro Pro Trp Met Gln Trp Lys Leu Ser Met Ala
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<212>PRT
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Thr Trp Asp Gly Cys Gln Trp Arg Asn Cys Arg Gln
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
Asn His Gly Ser Thr Arg Pro Pro Trp Leu Met Leu
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25
His Asn Asn Pro Val Ser Ile Trp Arg Asn Ser Met
1 5 10
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
Ala Pro Phe Glu His Leu Tyr Pro Glu Lys Arg Asn
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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Ser Ile Ser Phe Pro Pro Arg Pro Trp Asp Tyr Lys
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<212>PRT
<213>人工序列
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Thr Ser Pro Ile Glu Ala Trp Arg Ser Gly Leu Leu
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>29
Leu Asn Pro Val Asp Arg Trp Arg Ser Ser Trp Leu
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
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His Leu Gly Asp His Lys Pro Phe Arg Asn His His
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>32
His Asn Gln Pro Ser Pro His His His Thr Gly Ile
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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His His Ser His Glu Phe Met Thr Arg Arg Pro Pro
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<212>PRT
<213>人工序列
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Phe Gln Leu Arg Pro Trp Asp Gln Arg Ser Pro Gly
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<211>12
<212>PRT
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<212>PRT
<213>人工序列
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Gly His Met Asn Asp Gly Phe Leu Arg Trp Glu Pro
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<212>PRT
<213>人工序列
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Trp His Gln Ala Pro Ser Pro Thr Pro Met Pro Ser
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<212>PRT
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<212>PRT
<213>人工序列
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Lys Ile Ile Thr Thr Ser Glu Arg Phe Leu Ala Ile
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>41
His Tyr Pro Leu Arg Pro Trp Asp Leu Asp Ile Pro
1 5 10
<210>42
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>42
Val Thr Arg Asp Trp Ser Asp Pro Arg Ile Arg Tyr
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>44
Gln Tyr Pro Trp Met Thr Trp Arg Glu Ser Leu Leu
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>45
Ser His Cys Pro Ser His Ala Leu Pro Trp Cys Leu
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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Tyr Pro Gln His Met Leu Arg Trp Gln His Thr Trp
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<212>PRT
<213>人工序列
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Thr Pro Pro Trp Leu His Trp Arg Leu Ser Trp Pro
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<212>PRT
<213>人工序列
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Pro Ile Tyr Arg Leu His Gln
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人工序列
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Phe His Pro Leu Pro His Val
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<212>PRT
<213>人工序列
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<212>PRT
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<213>人工序列
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Cys Gly Asp Leu Thr Ser Val Arg Phe Gly Ala Cys
1 5 10
<210>204
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>204
Cys Arg Val Val Gly Asp Leu Ser Arg Gly Gln Cys
1 5 10
<210>205
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>205
Cys Ala Lys Gly Gly Asp Trp Phe Arg Gly Lys Cys
1 5 10
<210>206
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>206
Cys Gly Leu Ser Gly Asp Tyr Ile Arg Gly Ala Cys
1 5 10
<210>207
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>207
Cys Trp Gly Arg Val Arg Arg Arg Gly Ile Ile
1 5 10
<210>208
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>208
Cys Leu Val Glu Gly Asp Leu Phe Arg Gly Thr Cys
1 5 10
<210>209
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>209
Cys Ala Ser Leu Asn Gly Ala Arg Tyr Arg Val Cys
1 5 10
<210>210
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>210
Cys Trp Ser Pro Gly Asp Tyr Phe Arg Gly Val Cys
1 5 10
<210>211
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>211
Cys Ser Gly Ala Trp Gly Leu Arg Leu Glu Val Cys
1 5 10
<210>212
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<400>212
Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro
1 5 10 15
Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val
20 25 30
Lys Ser Asn Arg Leu
35
<210>213
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>213
Gly His Trp Ile Glu
1 5
<210>214
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>214
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His
1 5 10
<210>215
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<400>215
Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210>216
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>216
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His Leu Ala
1 5 10
<210>217
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>217
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210>218
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>218
Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu Thr
1 5
<210>219
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>219
Phe Trp Met Asn
1
<210>220
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>220
Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His
1 5 10
<210>221
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>221
Gly Ile Ala Thr Leu Met Val Leu Pro Asp Tyr
1 5 10
<210>222
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>222
His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asn Met Gly
1 5 10
<210>223
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>223
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210>224
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>224
Val Gln Tyr Ile Gln Phe Pro Trp Thr
1 5
<210>225
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>225
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp
1 5
<210>226
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>226
Ile Leu Pro Gly Ser Asp Arg Thr
1 5
<210>227
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>227
Ala Asn Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210>228
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>228
Ser Ser Val Asn Phe
1 5
<210>229
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>229
Tyr Ser Ser
1
<210>230
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>230
Gln His Phe Thr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210>231
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>231
Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His Trp
1 5
<210>232
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>232
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile
1 5
<210>233
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>233
Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210>234
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>234
Gln Asn Val Gly Thr His
1 5
<210>235
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>235
Ser Ala Ser
1
<210>236
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>236
Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Phe Thr
1 5
<210>237
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>237
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn His Trp
1 5
<210>238
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>238
Ile Leu Pro Gly Ser Asp Glu Thr
1 5
<210>239
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>239
Ala Asn Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210>240
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>240
Asp Ile Ser Ser Asn Phe
1 5
<210>241
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>241
Tyr Ser Ser
1
<210>242
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>242
Gln His Phe Thr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210>243
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>243
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Trp
1 5
<210>244
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>244
Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr
1 5
<210>245
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>245
Arg Gly Ile Ala Thr Leu Met Val Leu Pro Asp Tyr
1 5 10
<210>246
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>246
Gln Asp Ile Ser Ser Asn
1 5
<210>247
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>247
His Gly Thr
1
<210>248
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>248
Val Gln Tyr Ile Gln Phe Pro Trp Thr
1 5
Claims (16)
1.一组能特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体的表位模拟肽,其由下列肽组成:
氨基酸序列为SEQ ID NO:31的肽,
氨基酸序列为SEQ ID NO:32的肽,
氨基酸序列为SEQ ID NO:35的肽,
氨基酸序列为SEQ ID NO:36的肽,和
氨基酸序列为SEQ ID NO:44的肽。
2.权利要求1所述的一组表位模拟肽,其中所述广谱中和单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C200721的杂交瘤细胞系所分泌的抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体13D4,或其抗原结合性抗体片段,其中所述抗原结合性抗体片段是Fab、Fab′或F(ab)2。
3.权利要求1所述的一组表位模拟肽,其中广谱中和单克隆抗体是单克隆抗体13D4的基因工程抗体形式。
4.权利要求3所述的一组表位模拟肽,其中所述基因工程抗体形式是小分子抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
5.包含权利要求1-4任一项的一组表位模拟肽的多肽,其具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。
6.编码权利要求5的多肽的分离的多核苷酸。
7.包含权利要求6的多核苷酸的核酸构建体。
8.包含权利要求6的多核苷酸或权利要求7的核酸构建体的载体。
9.包含权利要求8的载体的分离的细胞。
10.包含权利要求5的多肽的融合蛋白,其具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。
11.权利要求1-4任一项的一组表位模拟肽或权利要求5的多肽与大分子载体或重组载体偶联或融合而得到的复合物。
12.权利要求11的复合物,其中所述大分子载体是蛋白质或毒素或脂类。
13.权利要求1-4任一项所述的一组表位模拟肽,权利要求5的多肽,或权利要求10所述的融合蛋白或权利要求11或12所述的复合物用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途。
14.权利要求1-4任一项所述的一组表位模拟肽,权利要求5的多肽,或权利要求10任一项所述的融合蛋白或权利要求11或12所述的复合物在制备用于诊断禽流感疾病的组合物或诊断剂或试剂盒中的用途。
15.权利要求1-4任一项所述的一组表位模拟肽用于禽流感病毒广谱中和表位预测的用途。
16.一种药物组合物或诊断用组合物,包含权利要求1-4任一项所述的一组表位模拟肽,权利要求5的多肽,或权利要求10任一项所述的融合蛋白或权利要求11或12所述的复合物。
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Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of a Highly Pathogenic H5N1 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibodies;Nikolai V. Kaverin et al;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20071231;第81卷(第23期);12911-12917 * |
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