CN106146625B - H5亚型禽流感病毒ha蛋白b细胞抗原表位多肽及其应用 - Google Patents

H5亚型禽流感病毒ha蛋白b细胞抗原表位多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用。本发明以H5亚型AIV的HA氨基酸序列作为模板，在固相载体上原位合成抗原表位多肽，每条多肽含有15个氨基酸，并且后一条多肽与前一条重叠14个氨基酸。将合成的H5 AIV HA抗原表位与已知H5亚型阳性血清反应，通过肽扫描技术，最终筛选出一条能够与抗H5 AIV鸡血清特异性反应的抗原表位多肽(H5‑1)。将该抗原表位多肽用于H5亚型禽流感病毒的检测，结果表明由该抗原表位多肽建立的ELISA方法适合检测1:200倍稀释的血清样品，符合率试验证明该方法对于H5AIV阴性血清的检测结果均为阴性，对血凝抑制价在log2‑log4之间样本检测符合率为87.6％，对血凝抑制价在log5及以上的样品检测符合率为98.3％。

Description

H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用
技术领域
本发明涉及抗原表位多肽，尤其涉及H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，本发明还涉及该抗原表位多肽在制备诊断或检测禽流感病毒感染药物中的应用，属于分子免疫学领域。
背景技术
禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种主要在禽类中传播的感染性疾病。AIV感染家禽后可引发呼吸道疾病，造成产蛋下降，严重时可造成100％的死亡率。
近年来AIV频繁变异，使得某些突变毒株可直接感染人类并导致人死亡，严重危害公共卫生，并且造成巨大经济损失，因此受到密切关注。现地检测主要通过ELISA试验鸡抗血清中的AIV抗体的存在与否判断鸡群的免疫情况及是否有AIV野毒感染，目前ELISA试验的包被抗原主要为灭活的H5亚型全病毒或纯化的H5亚型HA蛋白。不同亚型之间存在较为严重的交叉反应。因此很多研究开始关注对H5亚型禽流感病毒的抗体检测。
AIV为单股负链RNA病毒，分8个节段，有囊膜，病毒粒子呈现多形态，在实验室中多次传代培养后AIV的病毒粒子一般呈球形，直径约为80-120nm。不同亚型的病毒或因宿主的不同，流感病毒粒子也可呈现杆状或丝状结构。AIV病毒囊膜表面镶嵌着两种糖蛋白纤突，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，还嵌有非糖基化的质子通道蛋白(M2)。根据HA蛋白和NA蛋白的区别可以将AIV分为16个HA亚型和9个NA亚型，其中高致病性禽流感仅存在于部分H5和H7亚型中，HA是影响禽流感病毒致病力和宿主范围的关键因素，其一，HA裂解位点处氨基酸的性质影响禽流感病毒对宿主细胞的侵入能力，裂解位点处的氨基酸为碱性氨基酸(Arg或Lys)时HA三聚体可以被水解为HA1和HA2的两部分，其中由HA1构成的头部与宿主细胞唾液酸结合，并进一步介导病毒进入细胞。高致病性禽流感病毒HA裂解为HA1和HA2的裂解位点处的氨基酸为碱性氨基酸，一般由四个或四个以上的碱性氨基酸构成，可以被宿主体内的蛋白酶裂解为HA1和HA2(Skehel,2000；Harrison,2008)。其二，HA头部的受体结合位点与宿主细胞表面SA特异性吸附受到二者结构的影响，HA受体结合位点影响禽流感病毒感染宿主的范围。哺乳动物细胞表面的SA分为α-2,6型SA和α-2,3SA，人呼吸道主要分布α-2,6型SA，禽呼吸道主要分布α-2,3型SA，猪呼吸道α-2,6型SA和α-2,3型SA均有分布。人流感病毒H1、H2、H3亚型的HA受体结合位点特异识别α-2,6型SA受体，禽流感病毒H5、H7、H9亚型的HA受体识别位点特异性吸附α-2,3型SA受体，不同亚型HA蛋白的不同受体结合能力形成了人流感和禽流感病毒的种间屏障，因此宿主细胞是否具有α-2,3型SA受体及病毒HA蛋白是否能有效的吸附该受体决定了病毒对此宿主是否具有感染力。但α-2,6受体和α-2,3受体在猪体内均有分布，故可导致人流感和禽流感同时感染猪，并在猪体内发生重组，产生新的毒株，大了对禽流感的防控难度。
抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原蛋白表面能够识别抗体的区域。通常蛋白抗原的表位根据它们的结构和与抗体结合部位的相互作用分为两种类型，即构象表位和线性表位。多肽芯片扫描技术能够通过将已知氨基酸序列原位合成在芯片等固相载体上，肽与肽之间重叠一个或多个氨基酸，通过抗体与多肽反应，选择合适的二抗孵育后，进行信号收集，进而直接获得反应片段的方法，是获得线性表位的最高效、快捷且精准的方法。有研究通过单克隆抗体结合多肽芯片扫描的方法获得了禽流感病毒NS1蛋白的抗原表位(Sun,Wang,Wen,et al.)。
因此，本发明人开展了HA抗原表位的鉴定工作，以期能够为进一步建立高效的检测禽流感的方法提供理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供AIV-HA蛋白B细胞抗原表位多肽以及能够区分H5亚型血清抗体的ELISA检测方法。为此，本发明通过将H5亚型AIV(A/DuTurkey/England/N28/1973)的HA氨基酸序列以15个氨基酸为单位，每条与前一条重叠14个氨基酸，将多肽采用原位合成方法固定于芯片，用抗H5亚型禽流感病毒鸡血清与其进行孵育后得到有反应的氨基酸区域，反应值最高的4个片段为H5-1(303NSSMPFHNIHPLTIG317，SEQ ID NO.1所示)、H5-2(38KNVTVTHAQDILEKT52，SEQ ID NO.2所示)、H5-3(443VLMENERTLDFHDSN457，SEQ ID NO.3所示)以及H5-4(83CDEFIDVPEWSYIVE97，SEQ ID NO.4所示)。
进一步挑取反应值高的4个片段进行评价。合成4个肽段并偶联BSA，分别作为包被抗原将4个多肽包被ELISA板，通过与H1-H15的单因子血清以及新城疫病毒F48E9毒株的免疫鸡血清进行反应发现H5-1抗原表位多肽与抗H5亚型AIV鸡血清能够发生特异性反应，且不受其他亚型流感病毒抗体的影响。H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽均与其他亚型禽流感阳性血清发生交叉反应，干扰试验结果，不能有效分辨抗H5亚型AIV鸡血清。提示H5-1(303NSSMPFHNIHPLTIG317，SEQ ID NO.1所示)为能够区分H5亚型AIV与其他AIV亚型抗体的抗原表位多肽。
因此，本发明提出了一种能够用来区分H5亚型AIV与其他亚型的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种偶联多肽，其含有本发明所述的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽。
进一步的，本发明还提供了编码所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。其中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
含有该核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
更进一步的，本发明还提供了所述的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽在制备诊断H5亚型禽流感病毒感染试剂中的用途。
本发明提出的禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽的鉴定为进一步建立高效检测禽流感的方法提供了依据，同时也为研究HA蛋白的结构和功能奠定了基础。以此抗原表位多肽为基础建立的H5亚型AIV抗体检测方法可用于对H5亚型AIV抗体的监测及免疫保护的评价。
附图说明
图1为HA抗原表位多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应扫描结果；
图2为HA抗原表位多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应强度图；
图3为4段抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测。
A：H5-1抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测；B：H5-2抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测；C：H5-3抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测；D：H5-4抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽的鉴定
1.材料和方法
1.1 主要实验材料
H5亚型禽流感病毒鸡血清由本实验室制备；合成H5亚型禽流感病毒HA基因多肽序列参照(A/DuTurkey/England/N28/1973)；抗原表位多肽芯片合成服务由PEPperPRINTGmbH公司提供。
1.2 主要试剂
洗液：pH 7.4的PBS中加入0.05％Tween 20；封闭缓冲液：Rockland blockingbuffer MB-070；孵育缓冲液：pH 7.4的PBS中加入0.05％Tween 20及10％Rocklandblocking buffer；山羊抗鸡二抗：Goat anti-chicken IgG-H+L-DyLight680；对照抗体1：HA(12CA5)-LL-DyLight680；对照抗体2：FLAG(M2)-LL-DyLight800。
1.3 多肽芯片矩阵的制备
对筛选出的H5亚型HA核酸序列进行分析优化，添加柔性肽GSGSGSG以保护序列起始端和尾端。将融合后的氨基酸序列送至德国海登堡PEPperPRINT GmbH公司合成HA抗原表位多肽。HA抗原表位多肽合成要求为以融合氨基酸序列的起始端为起点向后延伸14个氨基酸，合成含有15个氨基酸的多肽，后一条多肽与前一条多肽重叠14个氨基酸。
1.4 多肽芯片矩阵背景值的测定
将合成的HA抗原表位多肽，按照其在融合氨基酸序列中的位置固定于固相载体上，每条多肽重复固定2个位点，周围固定以标识多肽Flag(DYKDDDDKGG)和阳性对照多肽HA(YPYDVPDYAG)作为HA抗原表位多肽芯片矩阵的外边框，形成HA抗原表位多肽芯片矩阵。将固定有HA抗原表位多肽矩阵的固相载体置于PBS中平衡10min，洗液清洗两次，60r/min，每次1min。室温条件下以封闭缓冲液封闭60min，洗液清洗两次，60r/min，每次1min。以孵育缓冲液将二抗按照1:5000的比例进行稀释后与HA抗原表位多肽矩阵在室温条件反应60min。LI-COR Odyssey扫描系统扫反应描结果，该数值即为多肽矩阵与山羊抗鸡抗体之间的背景值。
1.5 多肽芯片矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应值得测定
将固定有HA抗原表位多肽矩阵的固相载体置于PBS中平衡10min，洗液清洗两次，60r/min，每次1min。室温条件下以封闭缓冲液封闭60min，洗液清洗两次，60r/min，每次1min。H5亚型禽流感病毒的鸡抗血清以孵育缓冲液按照1:1000的比例进行稀释后孵育HA抗原表位多肽矩阵固相载体，孵育条件为4℃、16h，500r/min。洗液清洗两次，60r/min,每次1min。山羊抗鸡抗体以孵育缓冲液按照1:5000的比例稀释后与HA抗原表位多肽矩阵固相载体在室温条件下与反应60min。洗液清洗两次，60r/min,每次1min。通过LI-COR Odyssey扫描系统对反应结果进行扫描。将对照抗体1和对照抗体2以孵育缓冲液按照1:1000的比例进行稀释后，于室温条件下孵育HA抗原表位多肽矩阵，孵育60min，洗液清洗两次，60r/min,每次1min。通过LI-COR Odyssey扫描系统对反应结果进行扫描。
以多HA抗原表位多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清的反应值减去其与山羊抗鸡抗体间的背景值得到多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清间的结合值，并根据该数值选出可与H5亚型流感病毒抗体特异结合的抗原表位多肽。
2 结果
2.1 H5亚型HA抗原表位多肽的合成及矩阵的生成
公司合成HA抗原表位多肽，每条多肽含有15个氨基酸，后一条多肽与前一条多肽重合14个氨基酸，共合成579条不同序列的HA抗原表位多肽，产生1158个HA抗原表位多肽位点。
2.2 HA抗原表位多肽矩阵与二抗间的背景值
HA抗原表位多肽矩阵经二抗孵育后，以LI-COR Odyssey扫描系统进行扫描，在扫描强度为7的条件下，发现H5亚型HA抗原表位多肽芯片矩阵中个别位点与二抗发生非特异反应，其信号较弱，肉眼几乎不可辨别。
2.3 多肽芯片矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应扫描结果
通过LI-COR Odyssey扫描系统将扫描结果定位并做量化处理，将HA抗原表位多肽矩阵与山羊抗鸡抗体反应作为该矩阵的反应背景值。HA抗原表位多肽矩阵中与抗H5亚型AIV鸡血清发生反应的HA抗原表位多肽集中分布于4个区域，将该4个区域中与抗H5亚型AIV鸡血清反应强值度最高的HA抗原表位多肽挑选出来，按照强度高低依次命名为H5-1(303NSSMPFHNIHPLTIG317，SEQ ID NO.1所示)、H5-2(38KNVTVTHAQDILEKT52，SEQ ID NO.2所示)、H5-3(443VLMENERTLDFHDSN457，SEQ ID NO.3所示)以及H5-4(83CDEFIDVPEWSYIVE97，SEQID NO.4所示)，HA抗原表位多肽矩阵与抗H5亚型AIV鸡血清反应扫描结果及反应强度图分别如图1和图2所示。
实施例2本发明的禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽在诊断或检测H5亚型禽流感病毒中的用途
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
BSA偶联多肽服务由上海生工生物工程(上海)股份有限公司提供；H1-H15HA单因子鸡血清由本实验室制备；高吸附度酶标板购自Coster公司。
1.2 主要试剂
牛血清白蛋白(BSA)购自美国MP Biomedicals公司；HRP标记的山羊抗鸡抗体购自美国Sigma公司；TMB显色液购自美国ABM公司。
1.3 H5-1、H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽的合成
将实施例1通过HA抗原矩阵芯片筛选得到的四条H5亚型HA抗原表位多肽通过人工方法合成，并于每条多肽的氨基酸添加一个柔性氨基酸C，偶联BSA。该部分工作由上海生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.4 肽段ELISA试验条件的优化处理
对包被液，封闭液，血清稀释液，二抗稀释度，TMB显色条件进行确定，并通过对26份SPF鸡血清进行检测获得检测方法的cut-off值。
1.5 4段多肽作为包被抗原ELISA方法的特异性比较
将4段抗原表位多肽包被酶联免疫吸附板，同时包被本实验室纯化的禽流感病毒NP蛋白作为阳性对照，每孔2μg，4℃过夜包被。经PBST洗涤后分别孵育H1-H15亚型免疫鸡抗血清，经PBST洗涤后，孵育HRP标记的山羊抗鸡抗体，经PBST洗涤后加入TMB显色液进行显色，并以0.25％的HF终止显色。酶标仪于650nm波长进行读数。
1.6 建立的ELISA方法的符合率试验
对180份现地血清样品进行H5亚型HA抗原检测血凝抑制价，将血清按血凝抑制价分为阴性组(无血凝抑制价)、低血凝抑制价组(血凝抑制价为log2-log4)、高血凝抑制价组(血凝抑制价高于log4)。利用建立的抗H5亚型AIV鸡血清ELISA检测方法对，通过检测结果对该ELISA方法进行评价。
2 结果
2.1 ELISA试验条件的优化
对不同的包被液、封闭液、血清稀释液、二抗稀释度、TMB显色条件进行摸索，通过比较P/N值进行确定。结果显示包被液为碳酸盐缓冲液、5％脱脂乳封闭1h、PBS稀释血清、二抗最佳稀释度为1:5000、TMB(A+B)显色液显色10min时优化出的P/N值最大。利用优化的ELISA试验条件包被H5-1、H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽检测26份SPF鸡抗血清，利用软件SPSS并计算这些数据的平均值X和标准差SD，以公式>X+3SD作为阳性的判定标准，判定为阳性，反之判定为阴性。结果参见表1：
表1 H5-1、H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽阳性判定标准
2.2 4段多肽作为包被抗原ELISA方法的特异性比较
4段抗原表位多肽对H1-H15亚型禽流感病毒抗体特异性的检测结果如图3所示，实验结果分析发现H5-1(303NSSMPFHNIHPLTIG317，SEQ ID NO.1所示)抗原表位多肽与除抗H5亚型AIV鸡血清外的其他H1-H15亚型鸡抗血清发生反应的数值均小于cut-off值，因此H5-1抗原表位多肽与抗H5亚型AIV鸡血清发生特异性反应，且不受其他亚型流感病毒抗体的影响。而H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽均与其他亚型鸡抗血清发生交叉反应，干扰试验结果，不能有效分辨抗H5亚型AIV鸡血清。
2.3 ELISA检测与血凝抑制试验的符合率
对180份现地血清样品进行H5亚型HA抗体血凝抑制价检测，将血清按血凝抑制价分为阴性组(无血凝抑制价)、低血凝抑制价组(血凝抑制价为log2-log4)、高血凝抑制价组(血凝抑制价在log5及以上)。利用建立的抗H5亚型AIV鸡血清ELISA检测方法对180份现地血清样品进行检测，通过检测结果对该ELISA方法进行评价。分析试验结果可发现，该ELISA试验方法对阴性血清的检测结果均为阴性，符合率为100％；对血凝抑制价在log2-log4之间的检测符合率为87.6％、血凝抑制价在log5及以上的样品检测符合率为98.30％。

Claims (6)

1.H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1所述的H5亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位多肽在制备诊断或检测H5亚型禽流感病毒感染试剂中的用途。
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CN101979404A (zh) * 2008-12-09 2011-02-23 厦门大学 H5亚型禽流感病毒保守中和表位模拟肽及其用途
CN102279266A (zh) * 2010-06-09 2011-12-14 中国科学院动物研究所 用于检测h5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

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Title
人禽流感H5N1 病毒HA1 蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究;夏玉坤;《解放军医学杂志》;20090601;第34卷(第6期);第695-700、710页 *

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