CN101481406B

CN101481406B - H5亚型禽流感病毒中和表位模拟肽及其用途

Info

Publication number: CN101481406B
Application number: CN2008101337055A
Authority: CN
Inventors: 罗文新; 陈瑛炜; 王明桥; 陈毅歆; 张军; 夏宁邵
Original assignee: YANGSHENGTANG CO Ltd; Xiamen University
Current assignee: Xiamen University; Beijing WanTai Biological Pharmacy Enterprise Co Ltd
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: CN101481406A; CN101353371A

Abstract

本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白中和表位模拟肽，及其保守性变异体或活性片段或突变序列，及其相关编码序列，及应用该模拟肽或保守性变异体或活性片段或突变序列于预防或诊断的用途。

Description

H5亚型禽流感病毒中和表位模拟肽及其用途

发明领域

本发明涉及H5亚型禽流感病毒中和表位模拟肽，及其保守性变异体或活性片段，或模拟肽及其类似物的相关编码序列，及应用该模拟肽或类似物于预防或诊断的用途。

背景技术

自H5型禽流感于1996年首先在我国广东省农场的鹅群暴发以来(Xu X et al.，1999，Virology)，由此病毒演生出来的另一株H5病毒在香港的禽鸟农场(1997年4月)及市场(1997年11月)暴发，引起了历史上禽流感病毒第一次直接由禽传人事件，前后共18例确诊病例中有6人死亡。2003年以来，H5病毒株在整个东亚及东南亚国家的相继暴发，WHO及流感专家预测H5禽流感病毒将最有可能成为下一次人类大流感暴发的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我国十几个省暴发，并在中国香港、泰国、荷兰等发现H5型禽流感传染鸡、鸭、苍鹭、虎、猫等多种动物的事件。更令人担忧的是，在泰国已经出现疑似人传染人事件，马来西亚也有多例报道。进入2005年，罗马尼亚、俄罗斯、土耳其等欧洲国家相继发现禽类感染H5型禽流感病毒致死事件，专家认为此乃带毒候鸟迁移的结果，这使得控制高致病性H5型禽流感病毒的进一步扩散传播变得更为困难。专家预测，随着侯鸟的传播，H5型禽流感病毒有可能通过欧亚、亚非大陆桥进一步传播到卫生条件极差的非洲国家，使得H5型禽流感病毒获得和其它人流感病毒充分重组的机会和时间，届时将很可能形成一种对人类高度致命的全新流感病毒，其给人类带来的各种损失将难以估计。根据WHO统计结果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人类个案已达80例，给全球公共卫生安全带来极大的考验。

最新研究结果(Li，K.S.et al.，2004，Nature)表明，华南水禽(家鸭)为H5型禽流感病毒的主要携带者及传播者，H5型禽流感的爆发有明显的季节性，并伴随着生物多态型(多种基因型)的演变。然而，分子流行病学研究表明，目前鸭群中大约有30％的阳性感染并无任何症状，鸡群中也有达10％的流行且无症状带毒。这些受感染的动物又能够不断使人受到新的感染，对人类的健康构成巨大的威胁。有关专家一致认为要控制好H5型高致病性禽流感病毒在整个东亚、东南亚以及欧洲各国的流行，早期诊断是先决条件，然后才能做到早隔离、早处理，对人做到早治疗。

由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96为代表株)属高致病性病毒，对目前常用的动物模型均有致死性，而采用基因工程方法表达的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多个著名实验室先后尝试制备针对该病毒系的单克隆抗体均未获成功。目前对该病毒抗原性分析不得不采用特异性及反应性均明显达不到诊断试剂要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制备的单克隆抗体。

本实验室利用不同时间、不同地点、不同宿主分离到的多个禽流感病毒H5N1代表株免疫小鼠，持续进行单克隆抗体的制备，已制备出了包含388株具有血凝抑制(HI)活性的H5特异性单克隆抗体的H5单抗库。

根据对近千株全球各地H5N1病毒基因组序列进行的系统进化分析，我们筛选出34株不同地域、不同进化分支、不同宿主来源的H5N1代表株，加上2006年最新分离出的7个毒株共41个毒株组成代表性H5N1病毒库。对这41株H5N1病毒进行各单抗的HI活性测定，可根据HI活性的差异将这388株单抗分为10个类型，同时可将这41株代表性病毒分为八个HI活性分支。初步筛选出69株对60％以上病毒株有强反应(HI滴度大于1600)的单抗，对34株H5N1代表株进行病毒微量中和实验，证实这些单抗均可对数目不同的毒株具有不同程度的中和活性，为治疗性抗体研究奠定了基础。

血凝素(HA)抗原是禽流感病毒疫苗的最主要靶标，但同时也是病毒变异最活跃的抗原。现有流感疫苗必须不断根据最新的病毒流行株的抗原变异特征的变化而更新用于疫苗制备的毒株，而且由于各地流行病毒株并不一定完全一致，造成疫苗株选择的巨大困难。同时，由于新疫苗的制备必须经一定的时间，为应对流感疫情，必须提前对病毒流行趋势进行预测，这种预测也不能保证每次都正确。因此，发现禽流感病毒高保守中和表位并进行针对性的通用疫苗研究开发具有极大的吸引力。

在我们制备的H5N1单抗库中，已发现有4株单抗对目前所检测的全部H5N1变异株都有很强的中和活性，提示H5N1病毒HA上可能存在重要的高保守性中和位点，从而提供了一个克服H5N1禽流感病毒高变异这一巨大障碍的重要突破口。我们利用其中的1个保守中和单抗(8H5)，从噬菌体肽库中筛选特异结合的表位模拟肽。

多肽表面展示是一种新的基因操作技术，它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体，细胞或某些载体表面，保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用，并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制，以及生物分子实验定向进化等研究。

近年来噬菌体肽库技术应用范围很广，日益受到人们的重视，此肽库技术也日趋成熟，根据应用目的不同而构建了各种不同的肽库，且成功地应用到了很多领域(Parmley，S.F.and Smith，G.F.，1988，Gene；Cwirla，S.E.et al.，1990，Proc Natl Acad Sci USA；Scott，J.K.andSmith，G.P.，1990，Science；；Smith，G.P.and Scott，J.K.，1993，Methods Enzymol)。如根据载体种类可分为丝状噬菌体肽库、T4噬菌体肽库、λ噬菌体肽库；根据用途不同可分为随机短肽库、天然肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。

用噬菌体随机肽库从事蛋白质抗原表位的分析，在研究线性短肽、折叠的蛋白质，甚至非蛋白质分子等受体的相应配体时，噬菌体随机肽库被认为是配体的“万能库”。这些配体不一定和天然的配体完全相同，但它能模拟天然配体的结合特性。基于此理论，在抗原-抗体的识别研究中，人们不必使用天然抗原，就可以从随机肽库里直接筛选出能和抗体结合的表位。这些表位既可以是线性表位，也可以是构象型表位，而且不必预先确定蛋白质的氨基酸序列。

噬菌体随机肽库是模拟肽筛选技术中的强有力的武器。它由特定长度的随机短肽序列组成，理论上文库中包括某一固定长度短肽所有的氨基酸排列组合方式，即这一长度的所有表位。用抗体筛选随机肽库得到与其高亲和力结合的小分子模拟肽，进行短肽的序列确定后，可根据此序列进行短肽重组合成和进一步修饰，以获得最佳的抗原呈递，得到高特异性的新型疫苗，刺激机体产生有效的细胞和体液免疫反应。但应避免用某一单克隆抗体筛选随机肽库，那样虽可得到具有与目标蛋白相同抗原性的表位模拟肽(mimotope)，但该表位模拟肽也可能结合于同一抗体中的不同CDR区。所以，可视为候选疫苗的模拟表位肽必须具有与识别天然表位的抗体结合的抗原性及诱导与天然表位有交叉反应的抗体的免疫原性。

发明内容

在第一方面，本发明提供了能特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体的表位模拟肽，其氨基酸序列为SEQ ID NOs：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23，或者所述模拟肽经氨基酸插入、延伸、替换、删除而得到的保守性变异体或活性片段，其氨基酸序列为SEQ ID NOs：25-144之一，所述变异体或活性片段仍保持与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和性单克隆抗体特异结合的能力。

在第二方面，本发明提供了一种能特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体模拟肽，经氨基酸替换而得到的突变序列，其通用氨基酸序列为(E/D/Q)T(P/A/Q/E)LTXX(A/G)L(K/R)XX，其中X代表任意氨基酸，第2、4、5、9位氨基酸分别为T、L、T、L，第1位氨基酸有E、D、Q三种替换方式，第3位氨基酸有P/A/Q/E四种替换方式，第8位氨基酸有A/G两种替换方式，第10位有K/R两种替换方式。所述通用氨基酸序列仍可经氨基酸插入、延伸、删除而得到的新的突变序列，突变序列仍保持与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和性单克隆抗体特异结合的能力。

在第三方面，本发明提供上述禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC-C200607的杂交瘤细胞系所分泌的抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体8H5，或其抗体片段，如Fab、Fab′或F(ab)2。

在第四方面，本发明提供的禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体可以是其基因工程抗体形式，如小分子抗体、嵌合抗体、人源化抗体。

在第五方面，本发明提供了编码权利要求1所述模拟肽或其保守性变异体或活性片段的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24。

在第六方面，本发明提供了包含上述模拟肽或其保守性变异体或活性片段或突变序列的融合蛋白，其具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。优选地，其中所述模拟肽或保守性变异体或活性片段与其它蛋白或毒素等载体融合。更优选地，所述其它蛋白为239蛋白或HBc。

在第七方面，本发明提供了展示上述模拟肽或保守性变异体或活性片段或类似物或突变序列的类病毒颗粒，仍具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。

在第八方面，本发明提供了包含本发明核苷酸序列的核酸载体。

在第九方面，本发明提供了用上述核酸载体转化的宿主细胞。

在第十方面，本发明提供了上述模拟肽及其保守性变异体或活性片段或类似物或突变序列、上述融合蛋白或类病毒颗粒用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途。

在第十一方面，本发明提供了上述模拟肽及其保守性变异体或活性片段或类似物或突变序列、上述融合蛋白或类病毒颗粒在制备用于诊断禽流感疾病的组合物中的用途。

在第十二方面，本发明提供了药物组合物，包含本发明所述模拟肽或保守性变异体或活性片段或其类似物或突变序列，或所述融合蛋白或所述类病毒颗粒。

在第十三方面，本发明提供了抗体，其特异于本发明的模拟肽或保守性变异体或活性片段或其类似物或突变序列。本发明也提供了所述特异性抗体在制备用于诊断和治疗禽流感疾病的组合物中的用途。

本发明申请中涉及的有关术语的定义如下：

本发明中的“血凝素”一词指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介导流感病毒针对宿主细胞的吸附和进入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16个血清学亚型，即HA1-HA16，分别对应于16个病毒亚型，即H1-H16。

本发明中的“抗体”一词指任意一种免疫球蛋白，包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三等三个恒定区；每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区，其通过二硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区，和一条轻链的可变区和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIHPublication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，主要是：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些类还进一步分成亚类，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。

本发明中的“抗体”一词，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段)，如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、单链抗体分子或由含有一个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明涉及的抗体也可以是由一个特定的人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。

抗体相关的“Fab”片段是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。

本发明中的“单抗”一词指的是来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除仅在少数情况下可能出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。虽然传统的单抗是由杂交瘤细胞分泌的，但本发明涉及的单抗并不仅限于此制备方法。如，本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

“中和抗体”一词指的是能清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。

“特异性结合”一词指的是，两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10^-5M(如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon)，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。

本发明在如下段落中进行举例说明：

1、一种能特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体的表位模拟肽，其氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NOs：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23或145所示的氨基酸序列，或者

(2)(1)中所述氨基酸序列经一个或者几个(例如1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，或1个)氨基酸的插入、延伸、替换、和/或删除(例如保守替换)而得到的变异体，或者

(3)(1)或(2)所述氨基酸序列的活性片段，

所述变异体或活性片段的氨基酸序列优选为SEQ ID NOs：25-144之一，所述变异体或活性片段仍保持与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和性单克隆抗体特异结合的能力。

2、段落1所述的肽，其氨基酸序列为(E/D/Q)T(P/A/Q/E)LTXX(A/G)L(K/R)XX，其中X代表任意氨基酸，第2、4、5、9位氨基酸分别为T、L、T、L，第1位氨基酸为E、D或Q，第3位氨基酸为P、A、Q或E，第8位氨基酸为A或G，第10位为K或R，优选该肽仍保持与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和性单克隆抗体特异结合的能力。

3、段落1或2所述的肽，其中所述广谱中和单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C200607的杂交瘤细胞系所分泌的抗H5型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体8H5，或其(抗原结合性)抗体片段，如Fab、Fab′或F(ab)2。

4、段落1、2和3之一所述的肽，其中广谱中和单克隆抗体可以是保藏号为CCTCC-C200607的杂交瘤细胞系所分泌抗体的基因工程抗体形式，如小分子抗体、嵌合抗体、人源化抗体。

5、包含段落1-4任一项的肽的多肽。

6、编码段落1-5任一项所述肽的多核苷酸。

7、段落6的多核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24。

8、包含段落1或2或3或4所述肽的融合蛋白，其具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。

9、段落1或2或3或4所述肽与其它蛋白或毒素或脂类等大分子载体或重组载体偶联或融合而得到的复合物。

10、段落8的融合蛋白，其中所述蛋白为239蛋白或HBcAg。

11、展示段落1或2或3或4所述肽的类病毒颗粒，仍具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。

12、包含段落6或7所述多核苷酸的核酸载体。

13、段落12所述核酸载体转化的分离的宿主细胞。

14、段落1或2或3或4所述肽，段落5的多肽，段落8-10任一项所述融合蛋白或复合物或段落11所述类病毒颗粒用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途。

15、段落1或2或3或4所述肽，段落5的多肽，段落8-10任一项所述融合蛋白或或复合物或段落11所述类病毒颗粒在制备用于诊断禽流感疾病的组合物中的用途。

16、一种药物组合物，包含段落1-4任一项所述肽，段落5的多肽，或段落8-10任一项所述融合蛋白或复合物或段落11所述类病毒颗粒。

17、一种抗体，其特异于段落1-4任一项所述的肽。

18、段落17所述抗体在制备用于诊断或治疗禽流感疾病的组合物中的用途。

19、前述段落任一项的发明，其中所述禽流感病毒是H5亚型禽流感病毒，特别是H5N1禽流感病毒。

抗体

本发明所述单抗能够特异性结合H5亚型禽流感病毒。本发明的一个方面涉及能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗及其相应的抗原结合片段。

本发明所述H5亚型禽流感病毒广谱中和单抗是指这样一种单克隆抗体，其针对多种(至少两种)不同亚型的H5禽流感病毒株都具有中和活性。

本发明所述抗H5单抗是由小鼠杂交瘤细胞株8H5所分泌的。单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，抗H5单抗由杂交瘤细胞株8H5产生，并命名为8H5。单抗8H5能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠杂交瘤细胞株8H5已在2006年1月17日于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，位于武汉的武汉大学)进行保藏，保藏号是CCTCC-C200607(杂交瘤细胞株8H5)。

可以采用Kohler等在Nature 256：495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后，体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髓瘤细胞并用合适的融合剂，如PEG，进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，pp.59-103，Academic Press，1996)。

上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中最好含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。

本发明所述单抗还可以是通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。

本发明的单抗可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另外，所述抗体也可以是保持了对血凝素蛋白亲和力的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab′、F(ab)₂、Fv、或其它类型的部分片段，其结合血凝素蛋白的亲和力可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。

本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117(1992)and Brennan et al.，Science 229：81(1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(综述见Hudson，Curr.Opin.Immunol.11：548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21：364-370(2000))。比如，Fab′片段可以直接从大肠杆菌细胞中获得或化学偶联形成F(ab′)₂片段(Carter et al.，Bio/Technology，10：163-167(1992))。再如，F(ab′)₂片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab或F(ab′)₂片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。

中和抗体

另一方面，本发明提供了能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗体。在一实施方式中，这种中和抗体能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的至少60％，或至少70％，或优选至少75％，或优选至少80％，或优选至少85％，或优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％。

本领域普通技术人员完全知晓利用传统的技术方法可以测定抗体中和H5亚型禽流感病毒的病毒活性。如本发明的实施例1中所描述的中和试验的方法即可用于测定本发明中的某一个特定H5单抗的中和活性。

表位模拟肽

本发明还提供了一种模拟单克隆抗体识别表位的模拟肽。

本发明还提供了144个与单克隆抗体8H5结合有特异性的含12或16个氨基酸的短肽即模拟肽(表1，SEQ ID NOs：1-24，表8，SEQ IDNOs：25-45，表9，SEQ ID NOs：46-48，表11，SEQ ID NOs：49-144)。

本发明还提供了一个通用突变序列(E/D/Q)T(P/A/Q/E)LTXX(A/G)L(K/R)XX，其中X代表任意氨基酸，第2、4、5、9位氨基酸分别为T、L、T、L，第1位氨基酸有E、D、Q三种替换方式，第3位氨基酸有P/A/Q/E四种替换方式，第8位氨基酸有A/G两种替换方式，第10位有K/R两种替换方式。这些不同氨基酸的组合方式理论上可达到7.68×10⁶，均可与8H5单抗特异性结合。在通用突变序列的基础上，还可经氨基酸插入、延伸、删除而得到新的突变序列，仍保持与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和性单克隆抗体特异结合的能力。

通过动物保护实验，从这些通用突变序列中可以筛选出能诱导产生与8H5单抗功能类似抗体的模拟肽，这些模拟肽即可以进一步作为通用禽流感表位疫苗的研究基础。

该模拟肽123或125可用于制成融合蛋白239-123和239-125，该融合蛋白分别和8C11及8H5单克隆抗体结合得很好。该12肽123或125可用于和HBVcAg制成融合蛋白，该融合蛋白和8H5单克隆抗体而非其他抗体结合有特异性。融合蛋白HBc-122，HBc-124，HBc-128，HBc-129和8H5单克隆抗体而非其他抗体结合有特异性。融合蛋白HBc-122，HBc-124，HBc-128，HBc-129还可模拟单克隆抗体识别表位而形成类似病毒颗粒的组装。

本发明所指的肽含有天然或非天然氨基酸，包括D型氨基酸及氨基酸衍生物及氨基酸类似物，只要肽保持带有希望的活性和功能。肽也可以被环化。肽骨架及肽键也可以被修饰。氨基酸及其衍生物都可以被修饰。非天然氨基酸及氨基酸类似物的替换可能增强肽的活性或特征，比如增强肽的稳定性和生物学活性。

本领域的技术人员可以很容易地对模拟肽进行多种方法的修饰，以获得最佳的抗原呈递，有效刺激机体产生细胞或体液免疫反应。此近几年对重组肽疫苗的研究主要着重于通过构型的改建、增添分子等修饰，以提高其免疫原性及在体内的稳定性。

其中一种方法是将模拟肽连接到大分子载体上，一般用MBS法、戊二醛法、碳二亚胺法、活泼酯法、亚胺酸脂法及卤代硝基苯法等偶联载体与重组肽疫苗。蛋白类载体有人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)或其他γ球蛋白。重组载体有多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。

也可以修饰模拟肽的空间结构以增强免疫原性，如将抗体重链第三互补决定区(CDR3)用外源小肽替代，借助CDR3环结构两侧的β片层的空间限构作用，成功实现了原表位的空间限构，使具有抗原性的外源小肽获得与相应天然蛋白相似的稳定构象，增强了抗原呈递效率和诱导机体免疫应答的能力。还可以用化学方法将模拟肽构建成四价多抗原性肽。对模拟肽进行修饰可以降低蛋白酶的水解。

提高重组肽免疫原性的另一方法是构建表达出融合蛋白，作为载体的大蛋白分子可以作为免疫载体，提供T细胞位点。一些病毒衣壳蛋白在原核或者真核系统中表达后，在一定条件下形成的类病毒颗粒(virus-like particles，VLPs)。可以VLP作为表位展示载体上，即将模拟肽融合表达到病毒衣壳蛋白上。将模拟肽融合到环区，就能很好的展示在VLP表面。再通过一个柔性的氨基酸连接体序列，模拟肽就能不受病毒衣壳蛋白的约束，自由的形成构像。乙肝HBcAg、苜蓿花叶病毒、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、人乳头瘤病毒HPV衣壳蛋白L1、L2等都可以作为展示模拟肽的蛋白载体。

本领域的技术人员可以很容易地合成本发明的模拟肽。制备合成肽的标准过程为本领域技术人员知晓。

检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原或抗体。

竞争法是比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合本发明所述单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把本发明所述单抗包被到固相支持物上而得以进行的。同时加入预定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后，冲洗固相支持物，检测结合到该支持物上的标记物的活性。

治疗方法和药物组合物

本发明提供了一种预防和治疗禽流感病毒相关病毒感染患者的方法，包括对患者施用一定量的包含了一种或多种本发明所述模拟肽的有药物活性的药物成分。本发明还提供了一种含有本发明所述的一种或多种模拟肽的药物成分或在此基础上得到的盐类药物。

本发明所述药物成分的干预方式可以是传统的干预途径，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径，但不仅局限于此。

适合肠胃外途径注射的药物成分可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性。如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。

本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，苯酚，山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。

口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(C)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。

固相剂型可以通过做成改良释放或脉冲释放剂型，是在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或一组具有改良释放速率的赋形剂。

本发明所述药物成分还可由快速的雾化剂或消溶剂(FDDFs)组成，包含如下成分：天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺钾，柠檬酸，交联羧甲基纤维素钠，交聚维酮，抗坏血酸，乙烷基丙烯酸盐，乙烷基纤维素，明胶，氢氧基丙基甲基纤维素，硬脂酸镁，甘露醇，甲基乙丁烯酸盐，调味薄荷，聚乙二醇，气化硅胶，二氧化硅，乙醇酸淀粉钠，硬脂酸延胡索酸钠，山梨醇，木糖醇。这里用于描述FDDFs的“雾化和消溶”一词，依赖于所用药物的溶解性，如药物是不可溶的，可制成快速的雾化剂型，如药物是可溶的，则可制成快速的溶剂型。

类似形式的固相成分也使用诸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及类似的赋形剂制成软明胶或硬明胶的填充剂型。

诸如片剂、糖衣剂、胶囊剂和颗粒剂等之类的固体剂型可以通过诸如肠衣或其它本领域普通人员均知晓的外包衣壳的方式制成。也可以是含有乳浊剂、也可以是含有能起缓慢、延迟、控制活性药物释放的类似的成分。也可以使用多聚物和石蜡等成分进行包埋。如果合适，也可用上述一种或多种赋形剂把活性成分制成微囊的形式的剂型。

用于口服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂等。除了活性成分，液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如乙烷基醇，异丙基醇，乙烷基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙烯乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。

除了这些惰性稀释液，药物成分也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，药物成分还可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。

本发明所述药物成分也制成适合兽用治疗的混合物，或符合兽用的盐类，或符合兽用的溶剂或初成药，并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成一种最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。

本发明所述一个或多个模拟肽可以结合其它抗病毒试剂用于预防和/或治疗H5禽流感病毒感染相关疾病。模拟肽可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。其它抗病毒试剂包括利巴韦林，金刚烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧链胞酸，但不仅限于这些。

多肽筛选方法和抗体识别的多肽及疫苗

本发明提供了一种筛选本发明所述单抗识别的表位模拟肽的检测方法。而且，本发明也提供了本发明所述单抗识别的表位模拟肽。一方面，本发明公布的模拟肽含有氨基酸序列SEQ ID Nos：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25-48。这些模拟肽能够结合本发明所述单抗。因此，这些模拟肽拥有和H5血凝素相同的抗原特异性。这些模拟肽也可用于制备H5亚型禽流感疫苗，也可以用于诊断抗H5血凝素抗体的存在。

另一方面，本发明所述的筛选方法包括如下步骤：(i)在特定条件下培养一个适合多肽表达的多肽展示文库；(ii)把培养溶液和本发明的单抗混合；(iii)筛选特异性结合上述单抗的噬菌体克隆。用于筛选的单克隆抗体不仅限于单抗8H5。本申请实施例11-13中详细描述了一种利用噬菌体展示多肽文库成功筛选结合本发明所述单抗的模拟肽检测方法。

附图说明

图1为噬菌体多肽的ELISA检测值OD(450/620)的矩形图。

图2为pTO-T7与pTO-T7-239-123的质粒示意图。

图3为pTO-T7与pTO-T7-239-125的质粒示意图。

图4为融合蛋白239-123纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中，1：分子重量标签；2：表达239-123的大肠杆菌(E.coli)全部溶胞产物；3：239-123之超声溶胞产物的上清；4：缓冲液I中的239-123；5：2M尿素中的239-123纯化融合蛋白；6：4M尿素中的239-123的纯化融合蛋白；7：8M尿素中的239-123的纯化融合蛋白。

图5为融合蛋白239-125纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中，1：分子重量标签；2：表达239-125的大肠杆菌全部溶胞产物；3：全部溶胞产物之离心分离上清；4：缓冲液I中的239-125；5：2M尿素中的239-125的纯化融合蛋白；6：4M尿素中的239-125的纯化融合蛋白；7：8M尿素中的239-125的纯化融合蛋白。

图6显示了239-123融合蛋白的结合特性：其ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图，其中，239-123融合蛋白结合到水平轴所标识的各种毒株上。

图7显示了239-125融合蛋白的结合特性：其ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图，其中，239-125融合蛋白结合到水平轴所标识的各种毒株上。

图8为在各种mAb稀释下，239-123融合蛋白结合到8H5 mAb(三角形点线)或8C11 mAb(方点线)的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度。

图9为pC149-mut与pC149-mut-123的质粒图。

图10为pC149-mut与pC149-mut-125的质粒图。

图11为小量表达的重组蛋白的全细胞溶胞产物的SDS-PAGE电泳图，其中，1：D123；2：T123；3：F123；4：Q123；5：D125；6：T125；7：F125；8：Q125。

图12为纯化重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，1：D123；2：T123；3：F123；4：Q123；5：D125；6：T125；7：F125；8：Q125。

图13为类病毒颗粒的电镜图，该类病毒颗粒是由HBV cAg片段的融合蛋白和结合抗体的多肽组装而成的。

图14为显示融合蛋白HBc-123/125与单抗8H5之间结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图。

图15为显示融合蛋白HBc-Q123或HBc-D125与各种单抗之间结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图；结果表明，融合蛋白HBc-Q123和HBc-D125T特异性地结合单抗8H5。

图16显示了ELISA检测HBc-123融合蛋白免疫鼠血清抗体滴度上升曲线，其中，时间为0-4周，抗体滴度通过ELISA检测。

图17显示了ELISA检测HBc-125融合蛋白免疫鼠血清抗体滴度上升曲线，其中，时间为0-4周，抗体滴度通过ELISA检测。

图18显示了免疫荧光检测免疫鼠血清与SF21细胞中表达的HA蛋白的反应。

图19为HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图。

图20为显示融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129与各种单抗之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图；结果表明，融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129特异性地结合到单抗8H5。

图21显示了由12肽融合蛋白组装的类病毒颗粒与H5N1病毒竞争结合8H5酶标抗体的结果，其中，纵轴是色彩强度(以OD(450/620)值表示)，水平轴是实验中所用的各种类病毒颗粒和PBS对照物。

图22显示了239-D122和239-D129融合蛋白与各种单抗结合活性的ELISA检测结果。结果表明239-D122和239-D129融合蛋白特异性结合8H5单抗。

图23显示12肽融合蛋白与8H5抗体的结合活性的Dot-blot检测结果。A1：239-125；A2：HBc-D125；A3：HBc-T125；A4：HBc-F12；A5：HBc-Q125；B1：239-D122；B2：HBc-D123；B3：HBc-T123；B4：HBc-F123；B5：HBc-Q123；C1：239-123；C2：239-D124；C3：239-D128；C4：239-D129；C5：239；D1：HBc-D122；D2：HBc-D124；D3：HBc-D128；D4：HBc-D129；D5：HBcAg

图24显示HBc-12肽融合蛋白与8H5反应的Western blot结果。1.HBcAg；2.HBc-D122；3.HBc-D123；4.HBc-D124；5.HBc-D125；6.HBc-D128；7.HBc-D129。只有HBc-D125的二聚体与8H5单抗有反应活性。

图25显示239-12肽融合蛋白与8H5反应的Western blot结果。1.239蛋白；2.239-D122；3.239-123；4.239-D124；5.239-125；6.239-D128；7.239-D129。239-D122和239-125的二聚体有很强的针对目标抗体8H5活性，而239-D124和239-D129的二聚体有较弱的针对目标抗体8H5活性。

图26显示噬菌体多肽的ELISA检测值OD(450/620)的矩形图。

图27显示噬菌体多肽的ELISA检测值OD(450/620)的矩形图。

图28显示噬菌体16肽抗血清与禽流感病毒反应的Dot blot反应结果。其中P125为125噬菌体肽的抗血清，m1和m2为M13噬菌体免疫得到的抗血清，均为抗血清的阴性对照。Control为未加血清的阴性对照。H1mAb和H3mAb分别为H1和H3型禽流感病毒特异的单克隆抗体。H1型禽流感病毒株有517和104，H3型禽流感病毒株有798和177，H5型禽流感病毒株有897、1194、Y1和406H。P1组噬菌体肽抗血清显示出与H5型禽流感病毒有特异性结合反应。

图29显示9种噬菌体12肽抗血清与禽流感病毒的Dot blot反应结果。其中phage-peptide为不相关噬菌体肽的阴性对照，m13为M13噬菌体阴性对照，control为为未加血清的阴性对照。H1mAb和H3mAb分别为H1和H3型禽流感病毒特异的单克隆抗体。8株禽流感病毒株同图28的Dot blot测定。有3种显示出较明显的特异性与H5病毒的结合反应，这3种12肽的序列分别为DTPLTRQALKLV(SEQ ID NO：73)、DTALTKAALKLV(SEQ ID NO：74)、DTPLTIAGLKLV(SEQ ID NO：77)。

图30显示HBc-D125-10融合蛋白与8H5单抗特异性结合的ELISA检测结果。融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，每孔加入100μL8H5-HRP(1∶1000)酶标抗体，同时以五种禽流感特异抗体(3G4、8G9、4D1、10F7、3C8)和一种HBV特异抗体(3C11)的HRP酶标抗体为对照。结果显示模拟肽125的前1-10个氨基酸就可以保留与8H5单抗的特异反应性。

实施例

下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。

实施例1从噬菌体12肽库中筛选模拟8H5识别表位的短肽

选用New England Biolabs公司的12肽噬菌体展示文库(ph.D.12peptide library)筛选与单克隆抗体8H5结合的12肽，按操作说明书进行筛选。

吸取50μl Protein A-琼脂糖介质(50％的水悬液)于微量离心管中，加1ml TBS+0.1％Tween(TBST)溶液。轻弹管壁或温和震荡重悬介质。低速离心30秒，沉淀介质，小心吸去上清。介质重悬于1ml封阻缓冲液中，4℃作用60分钟，偶尔混匀。在此期间，用TBS缓冲液将2×10¹¹个噬菌体粒子(相当于10μl的原始文库)和300ng抗体稀释至终体积200μl，抗体终浓度为10nM。室温作用20分钟。封阻反应后，低速离心沉淀介质，并用1ml TBS洗4次，每次均需沉淀介质。将噬菌体-抗体混合物加入洗过的介质中，温和混匀，室温作用15分钟并不时混匀。低速离心沉淀介质，弃上清，用1ml TBTS洗10次。重悬沉淀介质于1ml 0.2M的Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA中，室温作用10分钟，洗脱结合的噬菌体。离心洗脱混合液1分钟，小心将上清转入另一新的微量离心管中。立即用150μl 1M Tris-HCl，pH9.1的缓冲液中和洗脱液。取出约1μL滴定噬菌体滴度。将剩余的噬菌体溶液加入20mL对数生长前期的ER2738宿主菌液中，37℃震荡培养4.5h。将菌液移入50mL离心管中，10000rpm离心10min。吸取上部80％上清，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃静置过夜。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清，用1mL PBS溶解沉淀噬菌体。4℃离心5min，吸取上清，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置1h。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清，用200μL PBS溶解沉淀噬菌体，4℃保存。重复上述步骤，进行再一轮的筛选。

第三轮筛选后，取出约1ul洗脱下来的噬菌体进行滴定。挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中，37℃培养4.5-5h，离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被10ug/ml浓度的鼠单抗8H5，以噬菌体上清为一抗，Anti-M13/HRP抗体(Amersham Phmarcia Biotech，UK)以1∶5000稀释为二抗，取禽流感相关抗体4D1mAb、10F7mAb以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11mAb为鼠单抗对照。图1显示其中较好的12个噬菌体多肽的检测结果。由图中结果可知，大部分噬菌体肽针对目标抗体8H5的读值高于对照抗体3倍以上，有较好的特异性。

根据噬菌体ssDNA抽提试剂盒(Omega，USA)的常规操作抽提DNA，以该DNA模板进行测序(Invitrogen，Shanghai，China)，获得以上12株噬菌体展示12肽的核苷酸及氨基酸序列(见表1)。

表1与单抗隆抗体8H5结合的12肽序列

实施例2.12肽123和125与239蛋白融合表达及活性检测

239-123和239-125融合表达载体的构建

本实验室在大肠杆菌中表达了HEV ORF2的一个片段(a.a.368-606)，即蛋白239，获得的重组蛋白239可组装成为类病毒颗粒，具有良好的免疫原性。我们通过PCR方法，构建出239序列的C端融合12肽序列的原核表达载体pTO-T7-239-123(图2)和pTO-T7-239-125(图3)。首先，针对239序列和12肽序列设计引物(表2)，以239基因为模板，应用引物239-123F/239-123R1和239-125F/239-125R1进行第一轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物239-123F/239-123R2和239-125F/239-125R2进行第二轮PCR扩增，扩增出239-123和239-125片段。然后，分别回收PCR产物239-123和239-125，Nde I和EcoR I双酶切后克隆入载体pTO-T7中。连接物转化大肠杆菌ER2566，小量表达及质粒酶切鉴定，阳性克隆即为重组原核表达载体pTO-T7-239-123和pTO-T7-239-125。

表2 239-123和239-125克隆引物序列

239-123和239-125融合蛋白的表达和纯化

挑取转化pTO-T7-239-123或pTO-T7-239-125质粒的ER2566单菌落，于2mL含有Kn抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按照1∶1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有Kn抗性)中，培养至OD600约1.0时，加入IPTG 500μL，37℃诱导4h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用20mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件如下：工作时间：10min；脉冲：打2sec，停5sec；输出功率：70％。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 2％Triton重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL Buffer I重悬，震荡30min。重复Triton/Buffer I处理一次。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 2M脲/Buffer I(20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 4M脲/Buffer I重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 8M脲/Buffer I重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清。各保留上清制成蛋白上样样品以进行SDS-PAGE分析(图4、图5)。由SDS-PAGE分析得知，蛋白主要溶解于8M脲中，纯度可达90％。将8M脲中的蛋白梯度透析至PBS中(8M脲-4M脲-2M脲-PBS)。

239-123和239-125融合蛋白的活性检测

直接ELISA法检测

初步纯化的239-123和239-125融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃ 2h。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃ 2h后4℃过夜。去封闭液后，每孔加入100μL不同的鼠单抗，包括：8C11、7H8、3C8、8H5、1A6、13E1、1D8、1G2、3G41、13A2、11H8、4D1、10HD4、14H12、6CF3、7D1、7E8、10DE2、16A12、3FC1、8E2、3D2、10D122、13E7共24株单抗。其中8C11为239蛋白特异单抗，8H5为12肽筛选所用单抗，其余22株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗。37℃孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1∶10000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。由图6、图7结果可知，239-123和239-125融合蛋白只与抗体8C11和8H5反应，与其它单抗均无反应。说明239-123和239-125融合蛋白的反应特异性非常好。

初步纯化的239-123和239-125融合蛋白分别以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃ 2h。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃ 2h后4℃过夜。每孔加入100μL倍比稀释的8H5抗体(同时带有阳性对照8C11抗体)，37℃孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1∶10000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。图8的结果表明，随着8H5抗体浓度的降低，8H5与239-125融合蛋白的结合活性也随之降低。这与阳性对照抗体8C11与239蛋白的结合活性变化一致。239-123融合蛋白检测结果与此一致。进一步说明239-123和239-125这两种融合蛋白与抗体8H5的结合是特异性反应。

实施例3 12肽123和125与HBV cAg蛋白融合表达

[0411]融合表达载体的构建

[0412]利用HBcAg的a.a.1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本实验室将该149个氨基酸插入大肠杆菌表达载体pTO-T7中，并以连接子替代HBcAg B细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸，构建了突变型HBc表达质粒pC149-mut。HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayor immunodominantregion，a.a.78-83)的融合不会改变其颗粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于颗粒表面。

[0413]将123和125分别以1至5个拷贝插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到系列融合蛋白，分别统称为HBc-123、HBc-125。根据12肽序列，以及pC149-mut的载体序列，分别设计含12肽序列的正向引物及通用反向引物149MRP(表3，下划线表示插入的多肽序列)。以pC149-mut为模板，应用引物HBc123F2/HBcR和HBc123F2/HBcR进行第一轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物HBc123F1/HBcR和HBc123F1/HBcR进行第二轮PCR扩增，扩增出连有12肽序列的C149a.a.81-149，经Bgl II和EcoR I酶切后回收纯化得到片段。同时以BamH I和EcoR I双酶切载体pC149-MUT，回收载体后与片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566进行表达鉴定及质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒即插入了一个12肽，分别命名为pC149-mut-123和pC149-mut-125。此质粒再用BamH I和EcoR I双酶切得载体，与之前经Bgl II和EcoR I酶切的含有12肽序列的片断连接，阳性克隆即为含有2个12肽拷贝数的重组原核表达质粒，分别命名为pC149-mut-D123和pC149-mut-D125。用类似方法，构建出分别含有3个拷贝、4个拷贝及5个拷贝数的重组原核表达载体pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123和pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125。构建质粒图如图9、图10所示(仅以pC149-mut-123和pC149-mut-125为例)。

表3 123、125与HBV cAg融合蛋白表达的克隆引物序列

(下划线为12肽序列)

融合蛋白的表达及纯化

将pC149-mut-D123、pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123、pC149-mut-D125、pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125表达质粒表达出来的融合蛋白分别称为D123、T123、F123、Q123、D125、T125、F125、Q125。分别将含有八种表达质粒的ER2566菌种，接种于2mL含有Kn抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按照1∶1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有Kn抗性)中，培养至OD₆₀₀约0.8时，加入IPTG 500μL，18℃诱导20h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用20mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件如下：工作时间：10min；脉冲：打2sec，停5sec；输出功率：70％。12000rpm离心10min，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白主要表达在上清中(图11)。

由于上清表达蛋白比较杂，故需要对其进行纯化。并且此类蛋白在适宜的条件下可以自发组装形成颗粒，所以对蛋白进行纯化的同时，应考虑其自发组装形成颗粒的条件。我们采用以下方法对蛋白进行纯化以及促进蛋白自发组装形成颗粒：以总体积20％的量加入饱和硫酸铵进行蛋白沉淀，冰浴反应30min。12000rpm离心10min，弃上清。沉淀用含有5％β-巯基乙醇的CB Buffer(0.29g NaHCO₃，1.6g Na₂CO₃，定容至1000mL)吹起，37℃震荡30min，12000rpm离心10min，上清透析至PB5.8(含有300mM NaCl和50mM EDTA)的缓冲液体系中。每8h换液一次，换液6次后收集透析液，12000rpm离心10min，上清样品进行SDS-PAGE鉴定纯度。此方法中，先以20％饱和硫酸铵对蛋白进行初步纯化，再以含有5％β-巯基乙醇的CB Buffer促使蛋白形成颗粒组装引发二聚体，然后在低PH值及高盐的条件下促进蛋白自发组装形成颗粒。同时此条件下，目的蛋白可以得到进一步的纯化(图12)。

以上表达的8种融合蛋白均以上述方法初步纯化后，样品用2％磷酸钨负染，直接进行电镜观察(图13)。组装成功的颗粒呈均匀的空心球形(部分颗粒为实心状)，有大小两种，直径分别约为35nm及20nm。

实施例4ELISA检测HBc-123和HBc-125融合蛋白活性

将八种融合蛋白分别以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃ 2h。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃2h后4℃过夜。每孔加入100μL 8H5抗体，37℃孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1∶10000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。由图14的结果可知，八种融合蛋白均具有与8H5抗体结合的活性。

以Q123和D125蛋白为例，进行抗体特异性的检测。10μg/mL的蛋白浓度包被96孔板，37℃ 2h。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃ 2h后4℃过夜。每孔加入100μL不同抗体，包括：8H5、8G9、3C8、4D1、10F7、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF 3、7H8、10DE2、13E7、16A12共14株单抗。其中8H5为12肽筛选所用单抗，其余13株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗，37℃孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1∶10000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。对ELISA结果分析(图15)，Q123和D125融合蛋白只与抗体8H5反应，与其它禽流感单抗均无反应。说明Q123和D125融合蛋白的反应特异性非常好。

实施例5HBc-123和HBc-125融合蛋白的免疫源性分析

将上述经过纯化的八种HBc-123和HBc-125融合蛋白分别与等体积的弗氏佐剂混合(初次免疫时与完全弗氏佐剂混合，加强免疫时与不完全弗氏佐剂混合)，以肌肉多点注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量为100μg蛋白，3-4只小鼠为一组。初次免疫后，每隔一周加强免疫一次，同时采取眼球血。进行抗血清分离：将血悬液置37℃2hr，再移入4℃过夜，令血球凝集。4000g离心10min，吸取上清，即得到抗血清。存放于-20℃备用。

以1μg/孔包被239-123和239-125融合蛋白，HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗，建立抗12肽123或125特异抗体检测的间接法ELISA，用来检测动物抗血清的123肽或125肽特异抗体与12肽反应性以及抗体产生滴度情况。HBc-123的各融合蛋白免疫血清以1∶1000稀释后，ELISA检测结果如图16。HBc-125的各融合蛋白免疫血清以1∶2000稀释后，ELISA检测结果如图17。

实施例6免疫小鼠血清的免疫荧光检测

在24孔细胞培养板中放置盖玻片，在其中培养昆虫细胞SF21，通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统，在SF21细胞中表达禽流感病毒的HA蛋白。表达后的细胞经过PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封闭后，与1∶20稀释的T123和F125免疫鼠血清室温孵育1小时，以HBc免疫鼠血清为阴性对照。以荧光标记的羊抗鼠抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)为二抗，室温反应半小时，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染细胞核，室温10分钟，然后制片于正置荧光显微镜(Nikon)下观察。由图18的结果可知，T123和F125免疫鼠血清均能特异地与SF21细胞中表达禽流感病毒的HA蛋白结合。进一步表明123和125较好的模拟了HA的抗原表位。

实施例7 12肽122、124、128、129与HBV cAg蛋白融合表达及活性检测

4种12肽122、124、128、129，分别以两个拷贝插入HBV cAg蛋白中，得到的融合蛋白分别称为HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129。

HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表达载体的构建方法与HBc-123、HBc-125融合蛋白表达载体的构建方法相同，所用引物如表19。第一轮的上游引物为F3，第二轮的上游引物为F2，第三轮的上游引物为F1，下游引物均为HBcR。通过3轮PCR，将目的12肽片断与C149-mut片段相连，并以Bgl II和EcoR I双酶切后，与BamH I和EcoR I双酶切的pC149-mut载体连接，构建成表达质粒(具体方法详见实施例3)。

表4HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白克隆引物序列

HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表达和纯化与上述HBc-123、HBc-125融合蛋白的表达、纯化方法相同(具体方法详见实施例3)。HBc与12肽融合蛋白的表达情况以及颗粒组装情况如表5所示。颗粒的电镜观察图片如图19。

表5HBc与12肽融合蛋白的表达及VLP形成

间接ELISA检测HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白活性

HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃2h后4℃过夜。每孔加入100μL不同抗体，包括：8H5、8G9、3C8、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF 3、7H8、10DE2、13E7、16A12共12株单抗。其中8H5为12肽筛选所用单抗，其余11株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗，37℃孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1∶10000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。由图20的结果可知，HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白只与抗体8H5反应，与其它禽流感单抗均无反应，说明HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白与8H5单抗的反应特异性非常好。

实施例8展示12肽的类病毒颗粒与禽流感病毒的竞争ELISA实验

取禽流感病毒H5N1特异鼠单抗2F2以10ug/ml包板，病毒株Ck/HK/Yu22/02以1∶40稀释后加入孔板中孵育，37℃，1h；弃去孔中病毒，将10ug初纯的类病毒颗粒与1∶1000稀释的8H5/HRP共同加入孔板中孵育，37℃，30min。126和127并不与H5单抗结合，但同样展示于VLP上作为阴性对照，另又以PBS为不加VLP的阴性对照。结果如图21所示，上述5个待测的类病毒颗粒均能与病毒竞争结合8H5酶标抗体，进一步提示这5个12肽均有可能模拟了8H5抗原表位的部分空间结构。

实施例912肽122和129与239蛋白融合表达及活性检测

将实施例7中的第三轮PCR产物(目的12肽片断与C149-mut片段相连的片段)进行Bgl II和Sal I双酶切，然后与经BamH I和SalI双酶切的pTO-T7-239相连，构建出在239序列的C端融合两段相同12肽序列的pTO-T7-239-D122和pTO-T7-239-D129表达质粒。

239-D122和239-D129融合蛋白表达和纯化与实施例2中的239-123和239-125融合蛋白相同(具体方法详见实施例2)。目标蛋白以包涵体的形式存在，纯化后239-D122的浓度为2.8ug/ul，239-D129的浓度为0.222ug/ul.

直接ELISA法检测239-D122和239-D129融合蛋白的活性

初步纯化的239-D122和239-D129融合蛋白用CB溶液稀释后以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，ED封闭液封闭，37℃2h。倒封闭液，96孔板充分扣干，每孔分别加入100μL不同的鼠单抗，包括：8H5、8C11、8G9、1A6、1G2、3C8、4D11、10F7共8株单抗。其中8C11为239蛋白特异单抗，8H5为12肽筛选所用单抗，其余6株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗。37℃孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1∶20000)100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入A、B显色液显色，37℃孵育10min。终止液终止，酶标仪读值。由图22结果可知，239-D122和239-D129融合蛋白只与抗体8C11和8H5反应，与其他单抗均无反应。说明239-D122和239-D129融合蛋白的反应特异性非常好。

实施例10 Dot-blot检测12肽融合蛋白与8H5抗体的结合活性

Dot blot检测12肽与HBcAg和239的融合蛋白与8H5单抗反应性。待测分别为：HBc-D123、HBc-T123、HBc-F123、HBc-Q123、HBc-D125、HBc-T125、HBc-F125、HBc-Q125、HBc-D122、HBc-D124、HBc-D128、HBc-D129及239-D123、239-125、239-D122、239-D124、239-D128、239-D129，并以HBcAg蛋白和239蛋白为阴性对照。样品浓度均调整为10ug/ul，分别经过(1)沸水煮10min、(2)沸水煮20min和(3)4M尿素变性三种方式处理。处理过的样品以及未处理过的样品各取4ul点在硝酸纤维素膜上，室温(25℃)放置20min，使蛋白被膜充分吸附；加20ml的5％的脱脂奶，37℃封闭2h；加50ul 8H5腹水抗体，37℃反应2h；用15ml的1×TNT洗膜三次，每次10分钟，晾干；加20ml酶标二抗AP-GAM(用封闭液以1∶5000稀释使用)，37℃反应30min；用15ml的1×TNT再洗膜三次，每次10分钟，晾干；加AP底物显色液，37℃显色10min；弃去显色液，用纯水清洗3次，终止显色反应；观察结果，扫描。结果如下(图23)，239-125和239-123融合蛋白经煮沸或尿素处理后，与8H5单抗的结合活性减弱或近乎丧失。HBc-D124和HBc-D128经煮沸后活性丧失。123、125、124、128、129与HBcAg的融合蛋白经4M尿素变性后，其活性没有明显变化。123、125、129与HBcAg的融合蛋白经煮沸处理，与8H5的结合活性也没有明显变化。说明123、125、124、128模拟肽是构象表位，经变性处理易丧失活性。而展示在HBcAg的类病毒颗粒上时则相对比较难破坏其空间构象。

实施案例11：Western blot检测12肽融合蛋白与8H5单抗的结合活性

Western blot检测初步纯化的12肽与HBcAg和239的融合蛋白与8H5单抗的结合活性。蛋白样品进行12％SDS-PAGE胶电泳，一份进行考马斯亮兰染色，另一份用于Western blot检测。电转法将SDS-PAGE上的蛋白转到硝酸纤维素膜上，封闭后与8H5单抗反应，二抗为由GAM-AP(按原始浓度1∶3000使用)，以NBT/BCIP溶液系统显色。由图24和25的结果可知，在六种12肽与HBcAg的融合蛋白中，只有HBc-D125的二聚体与8H5单抗有反应活性。在六种12肽与239的融合蛋白中，239-D122和239-125的二聚体有很强的针对目标抗体8H5活性，而239-D124和239-D129的二聚体有较弱的针对目标抗体8H5活性。

实施例1212肽融合蛋白阻断血凝抑制的检测

病毒血凝素效价的确定、抗体效价的确定、血凝抑制实验、蛋白阻断血凝抑制实验、细胞选择、细胞微孔板中和实验均按照WHO流感实验标准方法操作(http://www.who.int/csr/resources/publications /csrpublications/en/index8.html)。病毒血凝素效价的确定：静脉取血获得正常健康鸡血，添加千分之一肝素，摇匀置4℃保存。以PBS洗3次，末次经2000g离心10分钟，将红细胞用PBS配成1％浓度。灭活病毒液在微孔血凝板中用PBS作1∶2系列倍比稀释，每孔加入50μL后加入等量1％鸡血红细胞，摇匀，室温静置30min后观察。以出现完全血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位。经检测血凝素效价为1∶256，为1个单位，4个单位即为1∶64稀释。

8H5抗体效价的确定(血凝抑制实验)：取前一实验校对过的4个血凝单位病毒用于本实验。将实验样品单抗8H5用PBS做系列倍比稀释，在微孔血凝板上每孔加入25μL，加入等量已配好的4个血凝单位灭活病毒稀释液，混匀置室温30min，然后每孔加入50μL 1％鸡红细胞，混匀置室温30min后观察。以出现完全抑制的样品最高稀释度的倒数为样品中抗体的效价。经检测8H5抗体效价为1∶8192。以上所有实验都重复进行3次。

12肽融合蛋白阻断血凝抑制实验：取前面实验确定的4个血凝单位病毒(1∶64)和2倍抗体效价的单抗8H5(1∶4096)进行本实验。具体步骤如下：将实验样品蛋白239-D122(2.8mg/mL)和239-125(2.0mg/mL)用PBS做系列倍比稀释，在微孔血凝板上每孔加入15μL，然后再加入10μL单抗8H5稀释液和25μL灭活病毒稀释液，混匀置室温30min，然后每孔加入50μL 1％鸡红细胞，混匀置室温30min，观察是否出现红细胞凝集。对结果分析(如图)：239-D122蛋白1-16倍稀释(浓度：2.8mg/ml--0.175mg/ml)；239-125蛋白1-8倍稀释(浓度2.0mg/ml--0.25mg/ml)时，可以有效阻断单抗8H5与YU22、A6、B5、C1、C3、D2、E1、A5共七株病毒的血凝抑制实验。

实施例13 12肽融合蛋白阻断抗体对H5N1病毒的中和实验

用MEM细胞培养液对239-D122(2.8mg/mL)和239-125(2.0mg/mL)蛋白进行倍比稀释，稀释后每一浓度体积为20μL，再加入20μL适当稀释的8H5抗体，然后与40μL适当滴度的AIV于37℃孵育2h。前一天接种至96孔细胞培养板的MDCK细胞，以培养液洗涤一次，每孔加入35μL上述混合物，37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，弃去上清，加入正常MEM培养液，37℃、5％CO2培养72h。取上清，血凝抑制实验检测是否有病毒存在。如果没有出现血凝抑制，说明融合蛋白能与8H5抗体结合，所以不能阻断病毒进入细胞。

实施例14 122和125短肽单克隆抗体的制备和筛选

经过纯化的融合蛋白239-D122、239-125分别与等体积的弗氏佐剂混合(初次免疫时与完全弗氏佐剂混合，加强免疫时与不完全弗氏佐剂混合)，以肌肉多点注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量为100μg蛋白，3～4只小鼠为一组。初次免疫后，每隔一周加强免疫一次，免疫五周后，在融合前72hr对待融合鼠进行最后一次免疫加强，采用脾脏免疫。脾脏免疫时，先用乙醚麻醉小鼠，然后剖开腹腔外皮取出脾脏，沿脾脏丛向注射100μL蛋白，最后用手术针线缝合腹皮切口。

取待融合的BALB/C小鼠，摘除眼球放血致小鼠死亡，收集的血液制成抗血清，作为抗体检测的阳性对照。自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，右侧卧位。无菌手术打开腹腔取出脾脏，用剪刀剪成小块放于200目细胞筛网上，再用研磨棒挤压研磨，同时用吹管滴加无血清RPMI-1640培养液(Invitrogen，USA)。补加适量无血清RPMI-1640培养液，静置3～5min，取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中，上述过程反复2～3次。取无血清RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm/min×10min)，之后重悬细胞。将制备的骨髓瘤细胞Sp2/0与脾细胞混合于50mL离心管内(1×10⁸脾细胞+1×10⁷骨髓瘤细胞，约10∶1)，离心1500rpm/min×8min。离心后，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。用吸管吸取0.8mL 50％聚乙二醇(Mr1500)溶液(按1×10⁸脾细胞+0.8mL PEG)加入离心管内，边加边轻轻搅拌，PEG平均在60s内加完，随即加入10mL预温至37℃的RPMI-1640培养液，温和搅拌。最后补加RPMI-1640培养液至40mL，离心1000rpm/min×5min。弃上清液，取少量HT培养液(100×HT稀释至RPMI-1640培养液中)将细胞小心吹散，将细胞移入准备好的HT培养液中。加入96孔细胞培养板，每孔0.1mL，放入CO₂孵育箱中培养。12hr后，配置适量的HAT培养液(100×HT，100×A稀释至RPMI-1640培养液中)，每个孔中滴加0.1mL。5天后，用HT培养液给孔中的细胞上清进行50-100％的换液。

融合细胞培养约9-14天后，吸取上清检测。采用Yu22灭活病毒进行血凝抑制法(HI)筛选。初筛获得的阳性上清的培养孔中通常会有二个以上的杂交瘤集落，进一步通过有限稀释法进行克隆化培养方法。把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板的每个孔中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。细胞培养7～10天后，再次进行HI检测。重复克隆2～3次，直到100％阳性后认为获得了稳定克隆株。将获得的模拟肽特异的单克隆抗体对禽流感病毒进行血凝抑制实验、细胞中和实验。

100×HT溶液：称取黄嘌呤(hypoxanthn，H)136.1mg+胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)38.8mg，ddH2O加至100mL；45～50℃条件下溶解后，过滤除菌；分装，每支5mL，于-20℃保存。

100×A溶液：称取氨基蝶呤(aminopterin，A)1.76mg，ddH₂O加至90mL，再加1mol/L NaOH 0.5mL；溶解后加0.5mL 1mol/L HCl中和NaOH，并补加ddH₂O至100mL；过滤除菌，分装，每支5mL，于-20℃保存。

实施例15 122和125模拟肽氨基酸序列的突变

模拟肽122(ETQLTTAGLRLL)和125(DTPLTTAALRLV)与239融合蛋白可以阻断8H5单抗对病毒的血凝抑制。122和125的氨基酸序列非常相似，只有第1、3、8和12位氨基酸有差异，而第1和12位的氨基酸又属于同一类型的氨基酸。因此在125的基础上，针对第3和8位氨基酸进行定点突变，每个位点进行15种氨基酸的替换。含突变位点的引物序列见表6。依据实施例2所述方法，以239基因为模板，以239-123F为上游引物，表6所列引物各为下游引物，扩增出突变后的肽段，重新克隆至pT0-T7载体表达融合蛋白。初步纯化融合蛋白，检测与8H5的反应，进一步检测对血凝抑制的阻断效果，并免疫小鼠，检测产生的抗体与病毒的反应性。

表6 125肽段点突变与239蛋白融合表达的克隆引物序列

实施例16亚肽库的构建及针对8H5单抗的筛选

选用New England Biolabs公司的ph.D多肽展示克隆系统(ph.D.peptide display cloning library)，以125肽段为基础，向两端各随机延伸两个氨基酸，构建16肽亚肽库。以125肽段为基础，对第3、5、7、10位氨基酸进行随机突变，构建12肽亚肽库。构建过程按操作说明书进行。

16肽亚肽库的建库引物设计如表7所示。取5ug引物lib125-16merR1与3倍量的Extension primer于50ulTE(含100mMNaCl)体系中退火，退火条件：95℃，5min，逐渐冷却至37℃以下。取Klenow fragment(NEB)补平片段，37℃温育10min，之后于65℃下15min灭活。取该补平片段与lib125-16merR2进行PCR扩增，获得包含125肽段及两端随机肽段的目的片段。将目的片段与M13KE载体同时EagI与Acc65I(NEB)双酶切，酶切产物与载体经过酚：氯仿抽提，1/10(V/V)3M NaAC，2倍体积无水乙醇于-20℃沉淀后，进行连接反应，获得由随机肽段和建库载体构成的连接物。

12肽亚肽库的建库引物为lib125-14mutR(表7)。取5ug引物lib125-16merR1与3倍量的Extension primer于50ulTE(含100mMNaCl)体系中退火，并用Klenow fragment补平，以EagI与Acc65I(NEB)双酶切，连至M13KE载体，具体过程同上。

表7构建亚肽库的引物序列

引物名称	序列
		延伸引物	5’---CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTC---3’
lib125-16merR1	5’---CCGTCGTCAGCGGAGTATCMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG---3’
		lib125-16merR2	5’---CATGTTTCGGCCGAMNNMNNAACCAGCCGAAGAGCCGCCGTCGTCAGCGGAGTATC---3’
lib125-14mutR	5’---CATGTTTCGGCCGAAACCAGMNNAAGAGCMNNCGTMNNCAGMNNAGTATCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG---3’

M：A或T，N：A，T，G，C

电转化感受态的制备

用枪头挑取ER2738单克隆菌落，投入盛有5ml LB的试管中，37度，220rpm培养12-14小时，同时做阴性对照；培养至对数期，取3ml菌液倒入300ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养；将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，2500rpm离心10分钟；弃上清，离心杯中加入少量ddH₂O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4000rpm离心10分钟；重复ddH₂O洗涤一次；弃上清，往离心杯中加入少量10％甘油，使沉淀悬浮后，再加满10％甘油，4000rpm离心10分钟；弃上清，在离心杯中加入300ul 10％甘油，使沉淀悬浮后，将菌液分装于1.5ml离心管中，100ul/管。

电转化连接物及收获亚库

取3ul连接物与100ul现制备的ER2738感受态细胞于冰上混合，加入0.1cm的电转杯中(Bio-rad)进行电转化，电转仪(Bio-rad)条件设定为：2.5kV，25μF，20mΩ，电转时间为4.94～5.02ms。每个电转杯电转后立即加入1ml SOC，轻轻重悬菌体，转至37℃，振荡培养30min。

取1μl上清稀释100倍，于LB/IPTG/Xgal培养板上培养，测定文库中噬菌体的滴度。其余电转化菌体转入1L对数生长前期的ER2738宿主菌液中，37℃震荡培养4.5h。将菌液移入离心管中，10000rpm离心15min。吸取上部80％上清，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃静置过夜。10000rpm 4℃离心15min。弃上清，加入100mL TBS重悬沉淀，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置重复沉淀噬菌体。再以10000rpm 4℃离心15min。弃上清，加入10ml TBS，4℃振荡重悬沉淀噬菌体。测定文库扩增滴度，以50％甘油于-20℃冻存。

从亚肽库中筛选模拟8H5单抗识别表位的短肽，筛选流程参照实施例1进行。第三轮筛选后，取出约1ul洗脱下来的噬菌体进行滴定。挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中，37℃培养4.5-5h，离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被10ug/ml浓度的鼠单抗8H5，以噬菌体上清为一抗，Anti-M13/HRP抗体(Amersham PhmarciaBiotech，UK)以1∶3000稀释为二抗，取禽流感相关抗体8G9mAb以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11mAb，12A10mAb为鼠单抗对照。图26表示了23个噬菌体多肽的检测结果。由图中结果可知，大部分噬菌体肽针对目标抗体8H5的读值高于对照抗体3倍以上，有较好的特异性。

根据噬菌体ssDNA抽提试剂盒(Omega，USA)的常规操作抽提DNA，以该DNA模板进行测序(Invitrogen，Shanghai，China)，获得21株噬菌体展示16肽的氨基酸序列(见表8)。

表8与单抗隆抗体8H5结合的16肽序列

突变12肽库的筛选流程同样参照实施例1进行。

第三轮筛选后，取出约1ul洗脱下来的噬菌体进行滴定。挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中，37℃培养4.5-5h，离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被10ug/ml浓度的鼠单抗8H5，以噬菌体上清为一抗，Anti-M13/HRP抗体(Amersham Phmarcia Biotech，UK)以1∶3000稀释为二抗，取禽流感相关抗体8G9mAb以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11mAb，6F8mAb为鼠单抗对照。图27表示了23个噬菌体多肽的检测结果。由图中结果可知，大部分噬菌体肽针对目标抗体8H5的读值高于对照抗体3倍以上，有较好的特异性。

根据噬菌体ssDNA抽提试剂盒(Omega，USA)的常规操作抽提DNA，以该DNA模板进行测序(Invitrogen，Shanghai，China)，获得3株噬菌体展示12肽的氨基酸序列(见表9)。

表9与单抗隆抗体8H5结合的12肽序列

挑选与8H5单抗特异结合的肽段，与HBcAg融合表达，检测与8H5反应性，检测对血凝抑制的阻断效果，检测阻断8H5单抗的中和活性。进一步免疫小鼠，检测产生的抗体与病毒的反应性。

SOC：溶解20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5gNaCl于950ml去离子水，加入10ml 250mM KCl，以NaOH调节pH至7.0，定容至1L，灭菌。用前补加无菌MgCl₂至10mM，补加无菌葡萄糖至20mM。

实施例17模拟肽125氨基酸序列突变及分析

进一步对模拟肽125(DTPLTTAALRLV)的各个氨基酸进行随机突变与定点突变组合及多位点组合的突变，建成第二至第五个亚肽库，再在第五个亚肽库的两端各加一个半胱氨酸，建成第六个亚肽库。这六个亚肽库分别命名为12MHI、12MHII、12MHIII、12MHIV、12MHV、12MHVC。其中第一个亚肽库12MHI即在实施例16中所建的125突变12肽库。具体各个亚肽库的突变引物及相应突变氨基酸位点见表10。亚肽库的构建过程及筛选检测方法具体参见实施例16。取5ug突变引物与3倍量的Extension primer于50ulTE(含100mM NaCl)体系中退火，并用Klenow fragment补平，以EagI与Acc65I(NEB)双酶切，连至M13KE载体，连接物电转至ER2738宿主菌，使库容达到5×10⁶左右。

亚肽库名称	下游引物序列	突变氨基酸位点
			12MHI	5’-CATGTTTCGGCCGAAACCAGMNNAAGAGCMNNCGTMNNCAGMNNAGTATCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3’	3、5、7、10
12MHII	5’-CATGTTTCGGCCGAAACCAGMNNAAGMNNCKSMNNCGTMNNTKSAGTATCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3’	3、4、6、7、10
			12MHIII	5’-CATGTTTCGGCCGAAACCAGTYTAAGMNNCKSMNNCGTMNNTKSMNNATCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3’	2、3、4、6、7、8、10
12MHIV	5’-CATGTTTCGGCCGAAACMNNTYTMNNCSCCKSMNNCGTCAGTKSAGTKTCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3’	1、3、6、7、8、9、10、11
			12MHV	5’-CATGTTTCGGCCGAMNNCAGTTTAAGCSCMNNMNNCGTCAGMNNAGTMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3’	1、3、6、7、8、12
12MHVC	5’-CATGTTTCGGCCGAGCAMNNCAGTTTAAGCSCMNNMNNCGTCAGMNNAGTMNNACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3’	1、3、6、7、8、12

表10模拟肽125突变亚肽库构建的引物及突变氨基酸位点

注：M：(A/C)R：(A/G)W(A/T)S：(C/G)Y(C/T)K(G/T)V：(A/C/G)H：(A/C/T)D：(A/G/T)B：(C/G/T)N(A/G/C/T)

噬菌体肽库在ER2738宿主菌中进行大量扩增后，针对8H5单抗进行三轮筛选，最后ELISA检测单克隆噬菌体肽与8H5单抗的结合反应，取禽流感相关抗体8G9mAb以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11mAb，12A10mAb为鼠单抗对照。从各个肽库中筛选到的12肽序列见表11，共105条不同的序列。

表11从六个125突变亚肽库中筛选出的12肽序列

肽库名称	12肽氨基酸序列	序列编号SEQ IDNO：	肽库名称	12肽氨基酸序列	序列编号SEQ ID NO：
						12MHI	DTELTTQALKLVDTELTTIALKLVDTSLMTIALNLVDTMLTTMALKLVDTPLTTHALKLVDTELTTHALKLVDTELTTMALSLVDTQLTTAALKLVDTLLTTYALRLVDTQLTTAALKLVDTELTTLALKLV	4950515253545556575859	12MHV	ETALTVHGLKLHHTPLTIAGLKLHDTALTNAGLKLHDTQLTKEGLKLHETPLTHSGLKLHQTPLTIAGLKLNDTPLTKEGLKLHETALTLAGLKLN	145146147148149150151152
12MHII	DTPLTTAALRLVDTALTREALRLIDTALTRQALKLIDTALTKQALKLIDTALTIQGLKLIDTALTIQGLKVMDTALTHQGLKLIDTALTHQGLTLIVTALTHVQGTKIVTQLTLEQGKKIDTALTKAALKLVDTALTKAALKLIDLPDDSSCTAGIDTPLTRQALKLVDTALTKAALKLVDTPLTYAGLRLVDTALTREALRLVDTPLTIAGLKLVDTQLTLEALKLV	60616263646566676869707172737475767778	12MHVC	DTPLTIQALKLHDTQLTIQGLKLNLTPLTIEGLKLKETPLSIQGLKLNDTPLTTAGLKLYETPLTLHALKLNDTALTRAGLKLHETPLTIQGLKLYDTPLTINALKLHLTQLTIDALKLK	153154155156157158159160161162
						12MHIII	DTPLTAQALKLVDTELTKQGLKLVDTYLTGQGLKLVDTALTRQGLKLVDTALTKQGLNLV	7980818283	12MHIV	ETALTKEGLKYVDTPLTLQALKKVETELTRQALKNVETPLTMAGRRYVETPLTNQALKHV	103104105106107

DTELTKQGLKLVDTELTKQGLKLVDTELTKQGLKLVDTALTIQALALVDTELTKQGLKLVDTQLTKQALKLVDTQLTKQALALVDTQLTVQALKLVDTSETVIALLKVDTQVIRQALKLVDTEVIKQALKLVDTAVIVQALKLVDTQVIYQALKLVDTEVIYEALKLVDTQVIKEALKLVQTQKEALKLKLVDTALTIQALKLVDTQLTYAGLKLVDTALTYAGLKLV

84858687888990919293949596979899100101102

ETALTLAGLKKVETALTKEGLKYVETPLTRAGLKMVETELTKQALKRVETELTIQALKQVETALTIQALKNVDTPLTLEGLRRVETELTHAGLKYVETELTMQALKNVETELTKQALKMVETELTMQGLKMVETELTKAGLKHVETELTKQALKYVETELTKQGLRIVDTALTIEGLKHVETELTIAALKYVETALTNAGLKYVETALTIEGLKKVETALTYQGLKHVETELTSAGLKFVETELTKQALKIVETALTKQALKFVETALTLQALKKVETELTIAALKFVETALTIEGLKTVETELTIAALKNVETPLTIEALKNVETALTYAGLKTADTELTLQALKKVETQLTYAGLKYVETALTYQALKIVETALTRQGLKIVETALTIQALKSVETELTRAALKAVETELTWQGLKIVETELTKQGLKYVETALTIAGMKHV

108109110111112113114115116117118119120121122123124125126127128129130131132133134135136137138139140141142143144

总结模拟肽125各个氨基酸随机突变或定点突变的结果，发现第2、4、5、9位氨基酸分别为T、L、T、L，始终没有改变。第1位氨基酸有E、D、Q三种替换方式，第3位氨基酸有P/A/Q/E四种替换方式，第8位氨基酸有A/G两种替换方式，第10位有K/R两种替换方式。其余第6、7、11、12位氨基酸可替换为任一种氨基酸。模拟肽125各位点氨基酸的替换方式见表12。因此模拟肽125的突变结果可总结为一条通用序列(E/D/Q)T(P/A/Q/E)LTXX(A/G)L(K/R)XX，其中X代表任意氨基酸，这些不同氨基酸的组合方式理论上可达到7.68×10⁶，均可与8H5单抗特异性结合。

表12模拟肽125各位点氨基酸的替换方式

氨基酸位点	可替换氨基酸种类	氨基酸位点	可替换氨基酸种类
				1	E/D/Q	10	K/R
3	P/A/Q/E	6、7、11、12	任意氨基酸
				8	A/G

实施例18噬菌体肽抗血清的获得及抗血清与禽流感病毒的反应性

挑选ELISA检测中与8H5单抗反应性强且特异很好的噬菌体肽，感染ER2738菌，于250ml体系中于37°大量扩增4-5小时，之后经两次PEG沉淀纯化回收，将沉淀重悬于1ml TBS缓冲液中，得到约3×10¹³的噬菌体肽粒子。三只老鼠一组，每只每次免疫量；加强免疫三周后隔周采血。

约3×10¹¹pfu的噬菌体肽分别与等体积的弗氏佐剂混合(初次免疫时与完全弗氏佐剂混合，加强免疫时与不完全弗氏佐剂混合)，以肌肉多点注射的方式，免疫BALB/c小鼠，3只小鼠为一组。初次免疫后，每隔一周加强免疫一次。三次加强免疫后进行抗血清分离：将血悬液置37℃2hr，再移入4℃过夜，令血球凝集。4000g离心10min，吸取上清，即得到抗血清。存放于-20℃备用。

从16肽库筛选的21个噬菌体肽中挑选出13种噬菌体肽，分成P1、P2、P3共三个组，各组的噬菌体肽等量混合后进行免疫。P1组包括SEQID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：41，P2组包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43，P3组包括SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：37。另外，从125突变库筛选的105条噬菌体肽中挑选出9条噬菌体12肽单独免疫小鼠。这9条噬菌体肽分别是：SEQ ID NO：73-78，SEQ ID NO：100-102。将得到的抗血清进一步以Dot bot的方法检测与禽流感病毒的反应性及特异性。

将6ul禽流感病毒分两次直接点在醋酸纤维膜上，膜干以后用脱脂奶封闭1h。噬菌体16肽抗血清以1∶100稀释，12肽抗血清以1∶200稀释，鼠单抗以1∶1000稀释，稀释液为脱脂奶，分别与禽流感病毒反应1.5h。接下来用1X TNT洗膜3次，再与1∶5000稀释的GAM-AP反应30min。1X TNT洗膜3次后，显色液(10ml AP底物+66ul NBT+33ul BIPC)显色20min，终止反应。

图28为噬菌体16肽抗血清与禽流感病毒的Dot blot反应结果。其中P125为125噬菌体肽的抗血清，m1和m2为M13噬菌体免疫得到的抗血清，均为抗血清的阴性对照。Control为未加血清的阴性对照。H1mAb和H3 mAb分别为H1和H3型禽流感病毒特异的单克隆抗体。H1型禽流感病毒株有517和104，H3型禽流感病毒株有798和177，H5型禽流感病毒株有897、1194、Y1和406H。由图可知，与P2、P3和P125的反应结果相比，P1组的噬菌体抗血清能特异性识别4种H5型禽流感病毒，其中P1组包括SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：41共四种16肽序列。将四种噬菌体肽分开扩增并免疫小鼠，再检测与H5禽流感病毒的特异反应性，就可最终找到模拟8H5表位的模拟肽。

图29为9种噬菌体12肽抗血清与禽流感病毒的Dot blot反应结果。其中phage-peptide为不相关噬菌体肽的阴性对照，m13为M13噬菌体阴性对照，control为为未加血清的阴性对照。H1 mAb和H3 mAb分别为H1和H3型禽流感病毒特异的单克隆抗体。8株禽流感病毒株同上述Dot blot测定。由图可知，9种噬菌体肽抗血清中有3种显示出较明显的特异性与H5病毒的结合反应。这3种12肽的序列分别为DTPLTRQALKLV(SEQ ID NO：73)、DTALTKAALKLV(SEQ ID NO：74)、DTPLTIAGLKLV(SEQ ID NO：77)。以上实验说明这3种12肽能较好的模拟8H5识别的HA中和表位。

进一步将这些模拟肽展示在类病毒颗粒上，增强免疫源性，提高抗血清的效价，使抗血清能用于HI和体外中和实验，以及直接用于动物保护实验。这些工作将为深入的表位疫苗研究奠定基础。

实施例19截短两个氨基酸的模拟肽125与HBVcAg蛋白融合表达

将模拟肽125的第1-10个氨基酸以2个拷贝串联的方式插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到的融合蛋白，称为HBc-D125-10。重组质粒的构建及蛋白表达纯化过程参见实施例7。含有2个10肽拷贝数的重组表达质粒，命名为pC149-mut-D125-10。

将含有重组表达质粒的ER2566菌种，培养至OD600约0.8时，加入IPTG在18℃诱导20h。采用超声破碎仪处理破碎细胞，收集上清，以饱和硫酸铵蛋白沉淀法纯化出融合蛋白。将融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2h。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃2h后4℃过夜。每孔加入100μL 8H5-HRP(1∶1000)酶标抗体，37℃孵育1h。同时以五种禽流感特异抗体(3G4、8G9、4D1、10F7、3C8)和一种HBV特异抗体(3C11)的HRP酶标抗体为对照。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。结果见图30，可见模拟肽125的前1-10个氨基酸就可以保留与8H5单抗的反应性。

序列表

<110>厦门大学

<120>H5亚型禽流感病毒中和表位模拟肽及其用途

<130>IDC080

<160>145

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Glu Pro Val Lys Lys Tyr Pro Thr Arg Ser Pro

1 5 10

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atggagccgg tgaagaagta tccgacgcgt tctcct 36

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Glu Thr Gln Leu Thr Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu

1 5 10

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gagactcagc tgactacggc gggtcttcgg ctgctt 36

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Glu Thr Pro Leu Thr Glu Thr Ala Leu Lys Trp His

1 5 10

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gagacgcctc ttacggagac ggctttgaag tggcat 36

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Gln Thr Pro Leu Thr Met Ala Ala Leu Glu Leu Phe

1 5 10

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cagacgccgc tgactatggc tgctcttgag cttttt 36

<210>9

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val

1 5 10

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gatactccgc tgacgacggc ggctcttcgg ctggtt 36

<210>11

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

Thr Pro Leu Thr Leu Trp Ala Leu Ser Gly Leu Arg

1 5 10

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

acgccgctta cgctttgggc tctttctggg ctgagg 36

<210>13

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>13

Gln Thr Pro Leu Thr Glu Thr Ala Leu Lys Trp His

1 5 10

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cagacgcctc ttacggagac ggctttgaag tggcat 36

<210>15

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>15

Gln Thr Pro Leu Thr Met Ala Ala Leu Glu Leu Leu

1 5 10

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cagacgcctc tgactatggc ggctcttgag cttctt 36

<210>17

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>17

His Leu Gln Asp Gly Ser Pro Pro Ser Ser Pro His

1 5 10

<210>18

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cagacgcctc tgactatggc ggctcttgag cttctt 36

<210>19

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>19

Gly His Val Thr Thr Leu Ser Leu Leu Ser Leu Arg

1 5 10

<210>20

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gggcatgtga cgactctttc tcttctgtcg ctgcgg 36

<210>21

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>21

Phe Pro Asn Phe Asp Trp Pro Leu Ser Pro Trp Thr

1 5 10

<210>22

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

tttccgaatt ttgattggcc tctgtctccg tggacg 36

<210>23

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>23

Glu Thr Pro Leu Thr Glu Pro Ala Phe Lys Arg His

1 5 10

<210>24

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

gagacgcctc ttacggagcc ggcttttaag cggcat 36

<210>25

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>25

Thr Ala Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Lys Tyr

1 5 10 15

<210>26

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>26

MetIle Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Ala Gln

1 5 10 15

<210>27

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>27

Asp Leu Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val His Asp

1 5 10 15

<210>28

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>28

Arg Phe Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Asn Gly

1 5 10 15

<210>29

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>29

Gly Leu Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Gly Lys

1 5 10 15

<210>30

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>30

Thr Gly Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val His Asn

1 5 10 15

<210>31

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>31

Asp Ser Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val His Phe

1 5 10 15

<210>32

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>32

Asn Ala Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Arg Met

1 5 10 15

<210>33

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>33

Gln Glu Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Asn Asn

1 5 10 15

<210>34

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>34

Met Pro Asp Thr Pro Leu Thr Thr Glu Ala Leu Arg Leu Val Tyr Gln

1 5 10 15

<210>35

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>35

Gly Arg Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val His Ser

1 5 10 15

<210>36

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>36

Thr Gln Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Asn Asn

1 5 10 15

<210>37

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>37

Asn Val Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Ser Lys

1 5 10 15

<210>38

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>38

Tyr Asn Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Gln Thr

1 5 10 15

<210>39

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>39

Phe Pro Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val His Arg

1 5 10 15

<210>40

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>40

Tyr Lys Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Thr Arg

1 5 10 15

<210>41

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>41

Arg Met Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Asn Arg

1 5 10 15

<210>42

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>42

Ala Ile Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Arg Asn

1 5 10 15

<210>43

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>43

Thr Leu Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Lys Tyr

1 5 10 15

<210>44

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>44

Gly Met Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Gln Lys

1 5 10 15

<210>45

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<400>45

Asn Leu Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val Ser Ile

1 5 10 15

<210>46

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>46

Asp Thr Ser Leu Met Thr Ile Ala Leu Asn Leu Val

1 5 10

<210>47

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>47

Asp Thr Glu Leu Thr Thr Ile Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>48

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>48

Asp Thr Glu Leu Thr Thr Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>49

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>49

Asp Thr Glu Leu Thr Thr Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>50

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>50

Asp Thr Glu Leu Thr Thr Ile Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>51

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>51

Asp Thr Ser Leu Met Thr Ile Ala Leu Asn Leu Val

1 5 10

<210>52

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>52

Asp Thr Met Leu Thr Thr Met Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>53

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>53

Asp Thr Pro Leu Thr Thr His Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>54

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>54

Asp Thr Glu Leu Thr Thr His Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>55

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>55

Asp Thr Glu Leu Thr Thr Met Ala Leu Ser Leu Val

1 5 10

<210>56

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>56

Asp Thr Gln Leu Thr Thr Ala Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>57

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>57

Asp Thr Leu Leu Thr Thr Tyr Ala Leu Arg Leu Val

1 5 10

<210>58

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>58

Asp Thr Gln Leu Thr Thr Ala Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>59

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>59

Asp Thr Glu Leu Thr Thr Leu Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>60

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>60

Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val

1 5 10

<210>61

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>61

Asp Thr Ala Leu Thr Arg Glu Ala Leu Arg Leu Ile

1 5 10

<210>62

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>62

Asp Thr Ala Leu Thr Arg Gln Ala Leu Lys Leu Ile

1 5 10

<210>63

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>63

Asp Thr Ala Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Leu Ile

1 5 10

<210>64

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>64

Asp Thr Ala Leu Thr Ile Gln Gly Leu Lys Leu Ile

1 5 10

<210>65

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>65

Asp Thr Ala Leu Thr Ile Gln Gly Leu Lys Val Met

1 5 10

<210>66

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>66

Asp Thr Ala Leu Thr His Gln Gly Leu Lys Leu Ile

1 5 10

<210>67

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>67

Asp Thr Ala Leu Thr His Gln Gly Leu Thr Leu Ile

1 5 10

<210>68

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>68

Val Thr Ala Leu Thr His Val Gln Gly Thr Lys Ile

1 5 10

<210>69

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>69

Val Thr Gln Leu Thr Leu Glu Gln Gly Lys Lys Ile

1 5 10

<210>70

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>70

Asp Thr Ala Leu Thr Lys Ala Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>71

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>71

Asp Thr Ala Leu Thr Lys Ala Ala Leu Lys Leu Ile

1 5 10

<210>72

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>72

Asp Leu Pro Asp Asp Ser Ser Cys Thr Ala Gly Ile

1 5 10

<210>73

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>73

Asp Thr Pro Leu Thr Arg Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>74

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>74

Asp Thr Ala Leu Thr Lys Ala Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>75

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>75

Asp Thr Pro Leu Thr Tyr Ala Gly Leu Arg Leu Val

1 5 10

<210>76

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>76

Asp Thr Ala Leu Thr Arg Glu Ala Leu Arg Leu Val

1 5 10

<210>77

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>77

Asp Thr Pro Leu Thr Ile Ala Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>78

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>78

Asp Thr Gln Leu Thr Leu Glu Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>79

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>79

Asp Thr Pro Leu Thr Ala Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>80

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>80

Asp Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>81

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>81

Asp Thr Tyr Leu Thr Gly Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>82

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>82

Asp Thr Ala Leu Thr Arg Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>83

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>83

Asp Thr Ala Leu Thr Lys Gln Gly Leu Asn Leu Val

1 5 10

<210>84

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>84

Asp Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>85

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>85

Asp Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>86

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>86

Asp Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>87

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>87

Asp Thr Ala Leu Thr Ile Gln Ala Leu Ala Leu Val

1 5 10

<210>88

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>88

Asp Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>89

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>89

Asp Thr Gln Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>90

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>90

Asp Thr Gln Leu Thr Lys Gln Ala Leu Ala Leu Val

1 5 10

<210>91

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>91

Asp Thr Gln Leu Thr Val Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>92

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>92

Asp Thr Ser Glu Thr Val Ile Ala Leu Leu Lys Val

1 5 10

<210>93

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>93

Asp Thr Gln Val Ile Arg Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>94

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>94

Asp Thr Glu Val Ile Lys Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>95

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>95

Asp Thr Ala Val Ile Val Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>96

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>96

Asp Thr Gln Val Ile Tyr Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>97

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>97

Asp Thr Glu Val Ile Tyr Glu Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>98

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>98

Asp Thr Gln Val Ile Lys Glu Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>99

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>99

Gln Thr Gln Lys Glu Ala Leu Lys Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>100

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>100

Asp Thr Ala Leu Thr Ile Gln Ala Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>101

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>101

Asp Thr Gln Leu Thr Tyr Ala Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>102

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>102

Asp Thr Ala Leu Thr Tyr Ala Gly Leu Lys Leu Val

1 5 10

<210>103

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>103

Glu Thr Ala Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>104

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>104

Asp Thr Pro Leu Thr Leu Gln Ala Leu Lys Lys Val

1 5 10

<210>105

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>105

Glu Thr Glu Leu Thr Arg Gln Ala Leu Lys Asn Val

1 5 10

<210>106

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>106

Glu Thr Pro Leu Thr Met Ala Gly Arg Arg Tyr Val

1 5 10

<210>107

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>107

Glu Thr Pro Leu Thr Asn Gln Ala Leu Lys His Val

1 5 10

<210>108

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>108

Glu Thr Ala Leu Thr Leu Ala Gly Leu Lys Lys Val

1 5 10

<210>109

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>109

Glu Thr Ala Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>110

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>110

Glu Thr Pro Leu Thr Arg Ala Gly Leu Lys Met Val

1 5 10

<210>111

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>111

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Arg Val

1 5 10

<210>112

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>112

Glu Thr Glu Leu Thr Ile Gln Ala Leu Lys Gln Val

1 5 10

<210>113

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>113

Glu Thr Ala Leu Thr Ile Gln Ala Leu Lys Asn Val

1 5 10

<210>114

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>114

Asp Thr Pro Leu Thr Leu Glu Gly Leu Arg Arg Val

1 5 10

<210>115

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>115

Glu Thr Glu Leu Thr His Ala Gly Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>116

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>116

Glu Thr Glu Leu Thr Met Gln Ala Leu Lys Asn Val

1 5 10

<210>117

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>117

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Met Val

1 5 10

<210>118

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>118

Glu Thr Glu Leu Thr Met Gln Gly Leu Lys Met Val

1 5 10

<210>119

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>119

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Ala Gly Leu Lys His Val

1 5 10

<210>120

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>120

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>121

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>121

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Arg Ile Val

1 5 10

<210>122

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>122

Asp Thr Ala Leu Thr Ile Glu Gly Leu Lys His Val

1 5 10

<210>123

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>123

Glu Thr Glu Leu Thr Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>124

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>124

Glu Thr Ala Leu Thr Asn Ala Gly Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>125

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>125

Glu Thr Ala Leu Thr Ile Glu Gly Leu Lys Lys Val

1 5 10

<210>126

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>126

Glu Thr Ala Leu Thr Tyr Gln Gly Leu Lys His Val

1 5 10

<210>127

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>127

Glu Thr Glu Leu Thr Ser Ala Gly Leu Lys Phe Val

1 5 10

<210>128

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>128

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Ile Val

1 5 10

<210>129

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>129

Glu Thr Ala Leu Thr Lys Gln Ala Leu Lys Phe Val

1 5 10

<210>130

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>130

Glu Thr Ala Leu Thr Leu Gln Ala Leu Lys Lys Val

1 5 10

<210>131

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>131

Glu Thr Glu Leu Thr Ile Ala Ala Leu Lys Phe Val

1 5 10

<210>132

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>132

Glu Thr Ala Leu Thr Ile Glu Gly Leu Lys Thr Val

1 5 10

<210>133

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>133

Glu Thr Glu Leu Thr Ile Ala Ala Leu Lys Asn Val

1 5 10

<210>134

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>134

Glu Thr Pro Leu Thr Ile Glu Ala Leu Lys Asn Val

1 5 10

<210>135

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>135

Glu Thr Ala Leu Thr Tyr Ala Gly Leu Lys Thr Ala

1 5 10

<210>136

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>136

Asp Thr Glu Leu Thr Leu Gln Ala Leu Lys Lys Val

1 5 10

<210>137

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>137

Glu Thr Gln Leu Thr Tyr Ala Gly Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>138

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>138

Glu Thr Ala Leu Thr Tyr Gln Ala Leu Lys Ile Val

1 5 10

<210>139

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>139

Glu Thr Ala Leu Thr Arg Gln Gly Leu Lys Ile Val

1 5 10

<210>140

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>140

Glu Thr Ala Leu Thr Ile Gln Ala Leu Lys Ser Val

1 5 10

<210>141

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>141

Glu Thr Glu Leu Thr Arg Ala Ala Leu Lys Ala Val

1 5 10

<210>142

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>142

Glu Thr Glu Leu Thr Trp Gln Gly Leu Lys Ile Val

1 5 10

<210>143

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>143

Glu Thr Glu Leu Thr Lys Gln Gly Leu Lys Tyr Val

1 5 10

<210>144

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>144

Glu Thr Ala Leu Thr Ile Ala Gly Met Lys His Val

1 5 10

<210>145

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝E，D，或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa＝P，A，Q，或E

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(7)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa＝A或G

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>Xaa＝K或R

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400>145

Xaa Thr Xaa Leu Thr Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa

1 5 10

Claims

1.一种能特异性结合禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体的表位模拟肽，其氨基酸序列为SEQ ID NOs：3或9所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的肽，其氨基酸序列为SEQ ID NOs：25-144之一。

3.权利要求1所述的肽，其中所述广谱中和单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C200607的杂交瘤细胞系所分泌的抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体8H5，或其抗原结合性抗体片段，其中所述抗体片段是Fab、Fab′或F(ab)2。

4.权利要求1所述的肽，其中广谱中和单克隆抗体是保藏号为CCTCC-C200607的杂交瘤细胞系所分泌抗体的基因工程抗体形式，其中所述基因工程抗体形式是小分子抗体、嵌合抗体、人源化抗体。

5.编码权利要求1-4任一项所述肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体。

6.权利要求5的多核苷酸，其序列为SEQ ID NO：4或10。

7.包含权利要求1或2或3或4所述肽的融合蛋白，其具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力，其中所述融合蛋白是权利要求1或2或3或4所述肽与HEV ORF2的氨基酸368-606的片段即239蛋白或与HbcAg的融合蛋白。

8.权利要求1或2或3所述肽与其它蛋白或毒素或脂类等大分子载体或重组载体偶联或融合而得到的复合物。

9.展示权利要求1或2或3或4所述肽的类病毒颗粒，仍具有与禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和单克隆抗体特异结合的能力。

10.包含权利要求5或6所述多核苷酸的核酸载体。

11.权利要求10所述核酸载体转化的分离的宿主细胞。

12.权利要求1或2或3或4所述肽，权利要求7所述融合蛋白、权利要求8所述复合物或权利要求9所述类病毒颗粒用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途。

13.权利要求1或2或3或4所述肽，权利要求7所述融合蛋白、权利要求8所述复合物或权利要求9所述类病毒颗粒在制备用于诊断禽流感疾病的组合物中的用途。

14.一种药物组合物，包含权利要求1-4任一项所述肽，权利要求7所述融合蛋白、权利要求8所述复合物或权利要求9所述类病毒颗粒。

15.一种抗体，其特异性结合权利要求1-4任一项所述的肽。

16.权利要求15所述抗体在制备用于诊断或治疗禽流感疾病的组合物中的用途。

17.权利要求1或2或3或4所述肽，其中所述禽流感病毒是H5亚型禽流感病毒。

18.权利要求1或2或3或4所述肽，其中所述禽流感病毒是H5N1禽流感病毒。