CN107619819A - 一种稳定表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的重组细胞系、疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系、疫苗和应用，该重组细胞系是采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK‑293T细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染HEK‑293T细胞从而构建得到的，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。本发明的稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，具有容易培养、增殖快速、可无限扩大、性质稳定和蛋白表达量高的特点，其表达蛋白与佐剂制备成疫苗后免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪流行性腹泻病毒中和抗体，仔猪可抵抗猪流行性腹泻病毒强毒攻击。

Description

一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系、疫苗 和应用

技术领域

本发明涉及生物医药基因工程与免疫学领域，尤其涉及猪流行性腹泻病毒的免疫研究，具体涉及一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系、疫苗和应用。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的传染性肠道疾病，临床上以猪的急性肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。1978年本病首次发生于比利时和英国，1984年，宣华等通过荧光抗体试验和血清中和试验证实该病在我国的存在，目前在我国广泛流行。

PEDV能破坏感染猪空肠和回肠上皮细胞和肠绒毛，使所有日龄的猪发生肠炎，导致腹泻，引起仔猪死亡，并使肥育猪增重减少，从而引起严重的经济损失。因此，研制有效的PEDV疫苗势在必行。

PEDV具有典型的冠状病毒结构，主要结构蛋白有S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白。其中，纤突蛋白（S）可以辨别靶细胞及促进病毒和细胞膜的融合，故被认为是发展有效抵抗冠状病毒的主要靶抗原。PEDV不能像其他冠状病毒一样切割成S1和S2亚基，根据其他冠状病毒S蛋白保守的基序可以将PEDV S蛋白人为分为S1蛋白和S2蛋白，其中S1蛋白存在识别宿主细胞上的入胞受体表位，能够促进病毒囊膜与细胞膜的融合，从而介导病毒的入侵。此外，S1蛋白还包含PEDV主要的中和抗原表位和受体结合域，是研究开发猪流行性腹泻基因工程疫苗的重要靶蛋白。

目前国内PEDV的免疫防控主要是用灭活疫苗和弱毒疫苗，国内对于这两种疫苗的研究也较多；虽然灭活疫苗和弱毒疫苗在防控PEDV的发生上起到一定的作用，但是由于这两种疫苗本身存在一定的不足，因此市场上亟需一种生物安全性高、免疫效果好的新型疫苗。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能够稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白，且表达量高的重组细胞系。

本发明的另一个目的是提供上述重组细胞系在制备预防猪流行性腹泻病毒疫苗药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供由上述重组细胞系和佐剂制备猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的方法。

本发明的另一个目的是提供由上述方法制备得到的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，该重组细胞系的制备方法包括如下步骤：

步骤1

构建慢病毒重组载体，该慢病毒重组载体包括编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列，所述编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

步骤2

将所述慢病毒重组载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

步骤3

用上述病毒液感染人胚胎肾细胞HEK-293T后培养，将培养的细胞进行稀释克隆，收集克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪流行性腹泻病毒S1蛋白的表达量，获得稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系。

上述步骤1中，编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列的制备方法是：

将猪流行性腹泻病毒PEDV流行毒株CH/GDZQ/2014的S1蛋白核苷酸序列（GenBank:KM242131.1）先进行序列优化和表达设计，具体序列优化和表达设计内容是：将该S1蛋白核苷酸序列（GenBank:KM242131.1）的起始密码子前加Kozak序列与Nhe I酶切位点与保护性碱基，在S1蛋白基因编码末端加终止子与Nhe I酶切位点与保护性碱基，在5’端加入IgK信号肽，3’端加入组氨酸标签，则得到本发明所需编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明重组细胞系经Western blotting鉴定和RT-PCR 鉴定，证明其能稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白。

本发明还提供上述重组细胞系在制备预防猪流行性腹泻病毒疫苗药物中的应用。

本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

步骤1

将本发明的重组细胞系正常传代后长至融合度达到90%以上时，换无血清培养基继续培养4d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液，该上清液即为疫苗抗原液；

步骤2：

将步骤1制备的疫苗抗原液与佐剂按1：1~1：3重量比进行乳化，则制备得到所需猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗。

上述猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗为双相油佐剂疫苗，所述佐剂为矿物油佐剂。

上述步骤2中，乳化操作的参数为：乳化温度30℃，乳化转速为350转/分钟（r/min），乳化时间为5min。

本发明还保护由上述方法制备的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗。

本发明的稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，具有容易培养、增殖快速、可无限扩大、性质稳定和蛋白表达量高的特点，其表达蛋白与佐剂制备成疫苗后免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪流行性腹泻病毒中和抗体，仔猪可抵抗猪流行性腹泻病毒强毒攻击。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.现有技术大多采用原核表达或酵母表达蛋白，而本发明方法制备的蛋白与天然蛋白在高级结构方法存在较大差异，本发明所选用的表达系统为HEK-293T细胞，得到的重组细胞系HEK-293T-S1具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；本发明构建的重组细胞系产生的表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；本发明构建的重组细胞系可以用转瓶高密度发酵培养，易于大量生产；

2.现有技术中采用质粒转染细胞后克隆筛选最终获得的细胞系，其重组基因表达不稳定，不易获得高水平细胞株；而本发明采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK-293T细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染HEK-293T细胞从而构建得到的重组细胞系，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平；

3.本发明在对PEDV S1基因哺乳动物细胞密码子偏嗜性基础上，首次利用慢病毒表达系统表达S1蛋白，此外序列中还含有组氨酸标签序列，有利于后期纯化；

4.本发明构建的重组细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低疫苗生产成本；

5. 本发明构建的重组细胞系其猪流行性腹泻S1病毒的表达量高，利用普通细胞培养瓶皿培养，产量可达100mg/L；

6. 本发明制备的疫苗可以诱导动物机体产生针对PEDV的高效价抗体，仔猪可获得高效价的中和抗体，抵抗病毒感染；

7.本发明的疫苗免疫动物不产生猪流行性腹泻病毒ORF3、E、N蛋白抗体以及非结构蛋白抗体，可以利用检测猪流行性腹泻病毒N蛋白抗体或非结构蛋白抗体来对疫苗免疫与病毒感染动物进行鉴别；

8.本发明所制备的疫苗不含病毒核酸，不能复制，无致病性，具有极高的生物安全性。

附图说明

图1为慢病毒重组载体pLV-CMV-S1构建示意图；

图2为慢病毒重组载体pLV-CMV-S1酶切鉴定；

图中，Ladder为1 kb ladder，A为载体对照，B为重组载体；

图3为不同阳性克隆细胞中S1蛋白表达上清Western blot电泳图；

图中，1、2、3、4为随机挑选的四个重组阳性克隆细胞；

图4为重组细胞系293T-S1不同代次细胞S1蛋白表达Western Blot电泳图；

图中，1为阴性对照，2-9分别为第1、5、10、15、20，25，30，35代细胞培养上清WesternBlot电泳结果；

图5为重组细胞系不同代次细胞S1基因RT-PCR电泳图；

图中，M为Marker DL2000，1为阴性对照，2-9分别为第1、5、10、15、20，25，30，35代细胞基因RT-PCR结果；

图6为重组细胞系239T-S1表达的S1蛋白的纯化监测图；

图7为重组细胞系239T-S1表达的S1蛋白的纯化各步留样SDS-PAGE电泳图；

图中，M为170kD蛋白Marker，1为上样前样品，2为穿透峰样品，3为洗脱峰样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例所涉及的材料及其来源如下所示：

FUGW质粒、pCDNA3.0质粒和Roche ligation kit均为市售。

HEK-293T细胞由广州伯尼兹生物科技有限公司保存；

stab3感受态细胞购自广州复能基因有限公司；

DL 2000 Marker、DL 3000 Marker 、DL 5000 Marker 、DL10000 Marker、Premix ExTaq和去磷酸化试剂盒购自Takara公司；

限制性内切酶PacⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、Sal I﹑Xho I﹑BamH I﹑NheI、T4DNA 连接酶均为NEB公司产品；

预染蛋白Marker购自SunShineBio公司；

牛血清白蛋白和琼脂糖购自Amresco公司；

二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；

DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；

质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司；

二甲基亚砜、聚凝胺购自Sigma公司；

胰蛋白胨及酵母提取物为Oxiod公司产品；

0.25%胰蛋白酶、DMEM培养基及南美胎牛血清为Hyclon公司产品；

抗猪流行性腹泻病毒多克隆抗体为广州伯尼兹生物科技有限公司制备。

实施例1 稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系的构建及检测

1、编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列设计及制备

1.1编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列设计

根据猪流行性腹泻病毒流行毒株CH/GDZQ/2014株的S1蛋白基因（GenBank:KM242131.1），进行如下序列优化和表达设计：

（1）序列优化

根据猪流行性腹泻病毒流行毒株CH/GDZQ/2014株的S1蛋白基因核苷酸序列（GenBank:KM242131.1），在S1蛋白基因的起始密码子前加Kozak序列与Nhe I酶切位点与保护性碱基，在S1蛋白基因编码末端加终止子与Nhe I酶切位点与保护性碱基，同时在5’端加入IgK信号肽，3’端加入组氨酸标签。

经上述序列优化和表达设计后得到的猪流行性腹泻病毒S1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1翻译后的氨基酸序列。

1.2编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列制备

如SEQ ID NO.1所示猪流行性腹泻病毒S1蛋白的核苷酸序列由中美太和生物技术有限公司合成，质粒命名为pMD19-S1。

2、慢病毒重组载体的构建及检测

慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP的获得：将FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段；将pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，再用Roche ligation kit 将上述回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP。

将上述慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP用Nhe I酶切处理回收大片段，将质粒pMD19-S1经Nhe I酶切回收后在T4DNA连接酶作用下与前述大片段连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用Nhe I酶切和测序对其进行鉴定，鉴定的阳性质粒即为本实施例所需慢病毒重组载体，将其命名为pLV-CMV-S1。

上述含氨苄的LB平板，其培养基配方为100毫升量：胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水溶解，高压灭菌20分钟，待液体冷却到55℃加入氨苄，摇匀后立刻倒板；所述氨苄浓度为100mg/mL，加入量为每100mL培养基加入100ul氨苄。

本实施例慢病毒重组载体的构建示意图如图1所示。

慢病毒重组载体pLV-CMV-S1经NheI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，Nhe I酶切结果如图2所示，电泳显示发现两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致，同时测序结果也与我们的目的基因一致。

3、慢病毒包装及滴度检测

3.1、细胞铺板

细胞铺板采用本领域技术人员的常规操作，具体步骤如下所示：

倒掉HEK-293T细胞培养瓶中的培养上清，用1-3ml PBS洗涤一遍，吸净；加入1ml 0.25%的胰酶，室温作用1-2min；待细胞都变圆，加入2-3ml DMEM完全培养基把细胞吹打下来，收集到离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；用DMEM完全培养基将细胞沉淀充分重悬，使细胞形成单细胞悬液；

向100mm细胞培养皿加入10ml DMEM完全培养基，用细胞计数板进行细胞计数，每个皿约加入6×10⁶细胞，37℃、5% CO₂培养箱内培养过夜。

DMEM完全培养基的配方为：含10%FBS（胎牛血清）、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基。

细胞状态对于病毒包装至关重要，细胞生长良好的状态有利于病毒包装，因此需要保证良好的细胞状态。

3.2 慢病毒包装及感染

所述慢病毒包装就是将前述制备的慢病毒重组载体pLV-CMV-S1与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，转染方法采用PEI（聚乙烯亚胺）方法，具体步骤如下所示。

3.2.1转染体系

所述PEI转染法为本领域技术人员的常规操作，其转染体系分为A液和B液，具体如下所示：

A液

PEI储存液 24 μl；

1×HBS 补至1ml；

B液

pLV-CMV- S1 3μg；

gag/pol 3.8 μg；

Rev 3.75μg；

VSVG 1.8 μg；

1×HBS 补至1ml。

上述PEI储存液的配方是：称取1.25mg PEI粉末溶解于50ml×HBS（pH7.4）中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。

上述1×HBS的配方为：将8.76g NaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用。

上述慢病毒包装系统质粒gag/pol、Rev、VSVG购自Invitrogen公司（货号： K4975-00），这些包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。

3.2.2 转染

细胞铺板后第二天，待细胞融合度达到70%-90%时，将转染体系的A液加入到B液，充分混匀，室温静置20min后，轻轻滴加到100mm皿的细胞培养上清中，轻晃培养皿混匀，放37℃，5%CO₂孵箱中培养48h后收集上清液，然后再向细胞培养皿中加入10mlDMEM完全培养基，继续培养48h后收集上清液，合并两次上清液，然后3000rpm 离心5min后去除细胞碎片，则得到所需病毒液。

将该病毒液取100µl用于检测病毒滴度，其余的分装后放于-80℃冰箱保存或用于后续的细胞感染。

3.3病毒滴度检测

病毒滴度检测采用RT-QPCR测定病毒滴度，其操作方法采用本领域技术人员的常规操作和所用试剂盒说明步骤即可，检测结果显示病毒滴度为1.5×10⁸copies/ml，说明病毒包装成功，能感染细胞并将基因插入到细胞基因组中。

3.4细胞感染

将上述得到的病毒液感染HEK-293T细胞，具体步骤如下所示：

（1）将生长状态良好的HEK-293T细胞消化计数后用DMEM完全培养基稀释至1×10⁵/mL，加入24孔板，500µL/孔，准备2个复孔，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养24小时；

（2）在DMEM完全培养基中加入polybrene（聚凝胺），制备含polybrene的培养基（培养基中Polybrene的终浓度为6-8µg/mL）；

将3.2.2制备的病毒液取10μl加入到上述含polybrene的培养基中，使终体积为300μl并轻吹混匀，制备得到含病毒培养基；

（3）将步骤1培养24 h后的HEK-293T细胞的旧培养基倒掉，每个孔内加入300µl含病毒培养基，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养；

培养24小时后，将孔里的培养基倒掉，换上500µl DMEM完全培养基，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养。

4、基因稳定表达细胞系的建立

培养到第3-5天后，将长满培养孔的细胞用胰酶消化后，用有限稀释法传代于96孔板中继续培养，15天后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目；挑选含有1个细胞集落（即1个细胞团块）的孔，将克隆细胞在24孔板中培养3d后，收集上清液，10倍浓缩后加入电泳上样缓冲液制离心后吸取上清进行SDS-PAGE 电泳，转膜后采用5%脱脂奶（BioRad公司）封闭2h，采用抗his一抗孵育过夜（天根生化科技(北京)有限公司，1：5000稀释），TBST洗涤3次，每次10 min，孵育HRP标记的兔抗小鼠二抗（天根生化科技(北京)有限公司，1：10000稀释），37℃1h，之后曝光。

Western blotting结果如图3所示，结果表明我们筛选得到的4个克隆都能表达目的蛋白S1，但表达量有差异，我们选取表达量最高的4号细胞克隆继续扩大培养后保存，并将其命名293T-S1，并且对其进行稳定性检测。

5、本发明重组细胞系的稳定性检测

5.1克隆细胞不同代次细胞的Western blotting鉴定

将上述筛选得到的重组细胞系293T-S1正常传代并收集不同代次（第1、5、10、15、20，25，30，35代）细胞培养上清进行Western blotting鉴定，鉴定结果如图4所示，结果表明不同代次的细胞均能稳定表达目的蛋白S1。

5.2克隆细胞不同代次细胞的 RT-PCR 鉴定

根据本领域常规技术和相关试剂盒说明书，采用RT-PCR对重组细胞系293T-S1第1、5、10、15、20，25，30，35代细胞进行目的基因的扩增后，结果如图5所示，重组细胞系293T-S1的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一致的目的条带，标明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。

从上述检测结果可以看出，本实施例确实获得能够稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，将其命名为239T-S1。

实施例2 重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白的纯化和分析

1、猪流行性腹泻病毒S1蛋白的纯化

将猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组细胞系239T-S1的细胞培养上清经0.45μm滤膜过滤得到预处理样品；

HisTrap^TM HP柱与BioLogic LP蛋白纯化仪正确连接后，用3倍柱床体积的上样缓冲液（20mM pH7.4 磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl），1ml/min平衡柱子，将上述预处理样品以1ml/min的速度上样，结束后用上样缓冲液进行流洗（流速为1ml/min，5倍柱床体积），随后用20mM pH7.4 磷酸盐缓冲液（含200mM咪唑）洗脱重组蛋白，同时用BioLogic LP进行监测，当观察到基线上升，即出现洗脱峰时开始收集，收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡3～5倍柱床体积，流速调至1ml/min，再用5倍柱床体积的20%乙醇平衡。

2、蛋白纯化分析

重组细胞系239T-S1表达的猪流行性腹泻病毒S1蛋白的纯化监测图如图6所示。从图6可以看出，上样峰是随着磷酸盐缓冲液被分离出来，此峰280 nm波长OD值为0.5AU～0.6AU；洗脱峰为目的峰，是采用200 mM咪唑洗脱液洗脱时下从柱子上解离下来，此峰最大的280nm波长OD值为0.75AU。

收集蛋白纯化各步留样进行SDS-PAGE电泳，如图7所示，图中1泳道为上样前样品，2泳道为穿透峰样品，3泳道为洗脱峰样品，收集的洗脱液的电泳结果为一条清晰的条带，Western blotting采用抗猪流行性腹泻病毒多克隆抗体，结果表明重组的S1蛋白大小约为130kD。

实施例3 猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗

本实施例的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗是由实施例1所构建筛选的重组细胞系293T-S1和佐剂组成，具体实验步骤如下所示：

将实施例1所构建筛选的重组细胞系293T-S1正常传代后长至融合度达到90%以上时，换无血清培养基继续培养4d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液；

将上述培养上清液与矿物油佐剂按重量比1：1进行乳化，乳化温度30℃，乳化转速为350转/分钟，乳化时间为5min，制备得到本实施例的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗。

上述无血清培养基为本领域技术人员的常用试剂，采用市售产品即可。

实施例4 猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗对猪的免疫效力实验

本实施例是对实施例3制备的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗进行的猪的免疫效力实验。

1、实验分组和免疫操作

10头PEDV抗体阴性妊娠母猪，随机分成2组（即对照组和实验组），每组5头，具体免疫操作如下所示：

对照组：在母猪妊娠前5周时给每头母猪注射250μg生理盐水，然后采集母猪血清；在母猪妊娠前2周时给每头母猪注射250μg生理盐水，然后采集母猪血清；在母猪分娩时采集母猪血清，同时采集母猪的初乳和仔猪的血清。

实验组：在母猪妊娠前5周时给每头母猪注射250μg实施例2制备的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，然后采集母猪血清；在母猪妊娠前2周时给每头母猪注射250μg实施例2制备的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，然后采集母猪血清；在母猪分娩时采集母猪血清，同时采集母猪的初乳和仔猪的血清。

2、母猪血清抗体、初乳及新生仔猪血清抗体测定

采用本领域技术人员常用的ELISA法检测抗原滴度，具体步骤如下所示：

将实施例2纯化的猪流行性腹泻病毒S1蛋白用ELISA包被液稀释成10µg/mL，100µl/孔4℃冰箱包被过夜；倒尽板孔中液体，每空加300µl洗涤液，静置1min，反复洗涤三次，最后将反应板在吸水纸上吸干；加封闭液300µl，37℃放置2h；倒尽板孔中液体，加洗涤液静置1min，反复洗涤三次，最后一次在吸水纸上将洗涤液吸干；将步骤1采集的对照组所有血清和初乳以及实验组所有血清和初乳经分别经2倍梯度稀释后加入，同时加入阴性和阳性对照，阴性对照为阴性猪血清，阳性对照则为猪PEDV高免血清，每孔100µl，37℃ 1h；倒尽板孔中液体，加洗涤液静置1min，反复洗涤三次，最后一次在吸水纸上将洗涤液吸干；二抗为羊抗猪HRP-IgG抗体，每孔100µl，37℃ 30min；加底物：加TMB100µl/孔，避光放置15min；加终止液：50µl/孔；读取结果：酶标仪读取OD450值；结果判定：样品孔/阴性孔≥2.2为阳性。

结果表明，实验组的母猪1免和2免后血清抗体滴度分别为1：1024和1：16384，母猪初乳抗体滴度为1：2048，仔猪血清抗体滴度为1：1024。而对照组抗体均为阴性。

3、仔猪攻毒试验

每组随机挑选5头仔猪进行攻毒，攻毒方法为口服新鲜采集的发病猪小肠内容物，观察并记录仔猪疾病临床情况。

仔猪攻毒后对照组5头仔猪均出现严重腹泻，其中4头在攻毒后48h内发生死亡，而实验组的5头仔猪无典型临床症状，说明实施例2制备的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗均能产生保护，仔猪无典型临床症状。

剖解观察对照组仔猪肠道变化明显，主要表现为肠壁变薄、肠内鼓气、内容物水样，肠道粘膜脱落、肠系膜淋巴结充血，出血严重，而实验组未见典型临床病变。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州伯尼兹生物科技有限公司

<120> 一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系、疫苗和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2457

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60

gacaagagcc tgacctactt ctggctgttc ctgcccgtgc tgagcaccct gagcctgccc 120

caggacgtga cccgctgcag cgccaacacc aacttccgcc gcttcttcag caagttcaac 180

gtgcaggccc ccgccgtggt ggtggtgggc ggctacctgc ccatcggcga gaaccagggc 240

gtgaacagca cctggtactg cgccggccag caccccaccg ccagcggcgt gcacggcatc 300

ttcctgagcc acatccgcgg cggccacggc ttcgagatcg gcatcagcca ggagcccttc 360

gaccccagcg gctaccagct gtacctgcac aaggccacca acggcaacac caacgccacc 420

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cacagcgtgg tgggcatcac ctgggacaac gaccgcgtga ccgtgttcag cgacaagatc 600

tactacttct acttcaagaa cgactggagc cgcgtggcca ccaagtgcta caacagcggc 660

ggctgcgcca tgcagtacgt gtacgagccc acctactaca ccctgaacgt gaccagcgcc 720

ggcgaggacg gcatcagcta ccagccctgc accgccaact gcatcggcta cgccgccaac 780

gtgttcgcca ccgagcccaa cggccacatc cccgagggct tcagcttcaa caactggttc 840

ctgctgagca acgacagcac cctggtgcac ggcaaggtgg tgagcaacca gcccctgctg 900

gtgaactgcc tgctggccat ccccaagatc tacggcctgg gccagttctt cagcttcaac 960

aagaccatcg acggcgtgtg caacggcgcc gccgtgcagc gcgcccccga ggccctgcgc 1020

ttcaacatca acgacaccag cgtgatcctg gccgagggca gcatcgtgct gcacaccgcc 1080

ctgggcacca acttcagctt cgtgtgcggc aacagcagcg acccccacct ggccaccttc 1140

gccatccccc tgggcgccac ccaggtgccc tactactgct tcctgaaggt ggacacctac 1200

aacagcaccg tgtacaagtt cctggccgtg ctgcccccca ccgtgcgcga gatcgtgatc 1260

accaagtacg gcgacgtgta cgtgaacggc ctgggctacc tgcacctggg cctgctggac 1320

gccgtgacca tcaacttcac cggccacggc accgacgacg acgtgagcgg cttctggacc 1380

atcgccagca ccaacttcgt ggacgccctg atcgaggtgc agggcaccgc catccagcgc 1440

atcctgtact gcgacgaccc cgtgagccag ctgaagtgca gccaggtgag cttcgacctg 1500

gacgacggct tctaccccat cagcagccgc aacctgctga gccacgagca gcccaccagc 1560

ttcgtgaccc tgcccagctt caacgaccac agcttcgtga acatcaccgt gagcgccagc 1620

ttcggcggcc tgagcggcgc caacctgatc gccagcgaga ccaccatcaa cggcttcagc 1680

agcttctgcg tggacacccg ccagttcacc atcagcctgt tctacaacgt gaccaacagc 1740

tacggctacg tgagcaagag ccaggacagc aactgcccct tcaccctgca gagcgtgaac 1800

gactacctga gcttcagcaa gttctgcgtg agcaccagcc tgctggccag cgcctgcacc 1860

atcgacctga gcggctaccc cgagttcggc agcgtggtga agttcaccag cctgtacttc 1920

cagttcacca agggcgagct gatcaccggc acccccaagc ccctggaggg cgtgaccgac 1980

gtgagcttca tgaccctgga cgtgtgcacc aagtacacca tctacggctt caagggcgag 2040

ggcatcatca ccctgaccaa cagcagcttc ctggccggcg tgtactacac cagcgacagc 2100

ggccagctgc tggccttcaa gaacgtgacc agcggcgccg tgtacagcgt gaccccctgc 2160

agcttcagcg agcaggccgc ctacgtggac gacgacatcg tgggcgtgat cagcagcctg 2220

agcaacagca ccttcaacag cacccgcgag ctgcccggct tcttctacca cagcaacgac 2280

ggcagcaact gcaccgagcc cgtgctggtg tacagcaaca tcggcgtgtg caagagcggc 2340

agcatcggct acgtgcccag ccagagcggc caggtgaaga tcgcccccac cgtgaccggc 2400

aacatcagca tccccaccaa cttcagcatg agcatccacc accaccacca ccactaa 2457

<210> 2

<211> 818

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro

20 25 30

Val Leu Ser Thr Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala

35 40 45

Asn Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro

50 55 60

Ala Val Val Val Val Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly

65 70 75 80

Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly

85 90 95

Val His Gly Ile Phe Leu Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu

100 105 110

Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr

115 120 125

Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg

130 135 140

Ile Cys Gln Phe Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn

145 150 155 160

Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala

165 170 175

His Met Ser Glu His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg

180 185 190

Val Thr Val Phe Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp

195 200 205

Trp Ser Arg Val Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met

210 215 220

Gln Tyr Val Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr Thr Leu Asn Val Thr Ser Ala

225 230 235 240

Gly Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly

245 250 255

Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu

260 265 270

Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu

275 280 285

Val His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu

290 295 300

Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn

305 310 315 320

Lys Thr Ile Asp Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu

340 345 350

Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val

355 360 365

Cys Gly Asn Ser Ser Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu

370 375 380

Gly Ala Thr Gln Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr

385 390 395 400

Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg

405 410 415

Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Leu Gly

420 425 430

Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly

435 440 445

His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr

450 455 460

Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg

465 470 475 480

Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val

485 490 495

Ser Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu

500 505 510

Leu Ser His Glu Gln Pro Thr Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn

515 520 525

Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly Leu

530 535 540

Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Glu Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser

545 550 555 560

Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn

565 570 575

Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys

580 585 590

Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe

595 600 605

Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Ser

610 615 620

Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Val Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe

625 630 635 640

Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu

645 650 655

Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr

660 665 670

Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser

675 680 685

Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu

690 695 700

Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys

705 710 715 720

Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val

725 730 735

Ile Ser Ser Leu Ser Asn Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro

740 745 750

Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val

755 760 765

Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr

770 775 780

Val Pro Ser Gln Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly

785 790 795 800

Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile His His His His

805 810 815

His His

Claims (7)

1.一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，其特征在于该重组细胞系是由如下方法制备而得：

步骤1：

构建慢病毒重组载体，该慢病毒重组载体包括编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列，所述编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

步骤2：

将所述慢病毒重组载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

步骤3：

用上述病毒液感染人胚胎肾细胞HEK-293T后培养，将培养的细胞进行稀释克隆，收集克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪流行性腹泻病毒S1蛋白的表达量，获得稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系。

2.根据权利要求1所述稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，其特征在于所述编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系在制备预防猪流行性腹泻病毒疫苗药物中的应用。

4.一种猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

步骤1：

将权利要求1所述重组细胞系正常传代后长至融合度达到90%以上时，换无血清培养基继续培养4d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液，该上清液即为疫苗抗原液；

步骤2：

将步骤1制备的疫苗抗原液与佐剂按1：1~1：3重量比进行乳化，则制备得到所需猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述佐剂为矿物油佐剂。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述乳化温度为30℃，乳化转速为350转/分钟，乳化时间为5min。

7.一种猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于该疫苗是由权利要求4-6所述任一项制备方法制备得到的。