CN105722992A

CN105722992A - 用于检测和定量细胞系和重组多肽产物中的宿主细胞蛋白的组合物和方法

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Publication number: CN105722992A
Application number: CN201480061885.4A
Authority: CN
Inventors: F·古纳万; Y-C·肖; D·C·可拉维茨; M·S·林; M·范德兰; R·维吉; I·H·尤克; J·朱-希莫尼
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-09-12
Also published as: EP4163633A1; KR102332302B1; EP3044323A4; PL3044323T3; US20160320391A1; RU2016107435A; MX2016002799A; EP3044323B1; ES2915378T3; CN105722992B; CA2920686A1; CA3174012A1; US20180364235A1; WO2015038884A2; US9945858B2; MX2020001227A; JP2016531304A; BR112016004437A2; WO2015038884A3; JP2019197059A

Abstract

提供了结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体和多克隆抗体。还提供了用于检测和定量仓鼠磷脂酶B-样2的方法，例如，重组多肽制品中的仓鼠磷脂酶B-样2，以及用于执行此类方法的试剂盒。还提供了筛选或选择表达低水平的仓鼠磷脂酶B-样2的宿主细胞系或表达重组多肽的细胞系的方法。

Description

用于检测和定量细胞系和重组多肽产物中的宿主细胞蛋白的组合物和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2014年5月9日提交的美国临时申请号61/991,228和2013年9月13日提交的美国临时申请号61/877,503的优先权的利益，这两者在此均通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web提交，并且在此通过引用整体并入本文。2014年8月28日创建的所述ASCII副本被命名为P5701R1WO_PCTSequenceListing.txt，大小为28,965字节。

技术领域

背景技术

为了重组生物药学蛋白质可被接受用于施用给人类患者，从最终生物产物中去除来自制造和纯化过程的残余杂质是重要的。这些过程组分包括培养基蛋白质、免疫球蛋白亲合配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白。这些宿主细胞杂质包括过程特异性的宿主细胞蛋白(HCP)，其是源自重组DNA技术的生物制品中的过程相关的杂质/污染物。虽然HCP通常少量(百万分数或每毫克预期重组蛋白中有若干纳克)存在于最终药物物质中，认为HCP是不合需要的并且它们的量应当最小化。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求打算供人类体内使用的生物药物应当尽可能地不含外来杂质，并且需要用于检测和定量潜在污染物/杂质(如HCP)的测试。此外，国际协调会议(ICH)提供了有关用于生物技术/生物产品的测试程序和接受标准的指导方针。该指导方针建议针对HCP使用能够检测宽范围的蛋白质杂质的敏感免疫测定。虽然我们和其他人已经开发了用于检测免疫球蛋白、DNA、内毒素、病毒和总HCP(例如，总中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP))的测定和试剂(综述于ChenAB,JBiotechnolinHealthcare3:70-80(1996)；Krawitz等人,Proteomics6:94-110(2006))，但是目前还没有用于检测和定量重组蛋白制品,如免疫球蛋白产物,包括与重组蛋白制品共纯化的那些中的单个过程特异性的HCP的、具有足够特异性和灵敏度的商业试剂或分析方法。

在某些情况下，当使用免疫测定来检测和定量总HCP(例如，总CHOP)时，可以观察到显著的稀释依赖性，表明这类测定并非用于准确定量特定产品中HCP杂质的合适的测试方法。研究这类稀释依赖性是很重要的，这使得能够开发更合适的测试方法。在某些情况下，稀释依赖性可以由“抗原过量”所引起，其中存在的单个HCP种类超过了可用的抗体，这解释了测定性能方面所观察到的效应(Anicetti等人,J.Immunol.Methods91:213-224(1986)；ChenAB,JBiotechnolinHealthcare3:70-80(1996),WangX等人,BiotechnolBioeng.103(3):446-58(2009))。

灵敏的分析方法(如LC-MS/MS)可用于鉴定和定量超过可用抗体存在的单个HCP种类。关于鉴定这样的单个HCP种类，需要开发具有足够灵敏度和特异性的、并且能够被监管当局批准证实的、并且可用作跨多种重组蛋白产物的平台的备选测定。

在我们的产生于CHO细胞的某些重组蛋白制品中，我们将酶，磷脂酶B-样2，鉴定为总CHOPELISA测定中超过可用抗体存在的单个CHOP种类。如本文所使用的，“PLB2”和“PLBL2”和“PLBD2”可互换使用，并且是指酶“磷脂酶B-样2”或其同义词“磷脂酶B-结构域-样2”。关于PLBL2的某些科学出版物包括Lakomek,K.等人,BMCStructuralBiology9:56(2009)；Deuschi等人,FEBSLett580:5747-5752(2006)。PLBL2作为前-原-酶(pre-pro-enzyme)合成，其具有大约为66,000的母MW。有初始前导序列，其在翻译后修饰过程中被去除，以及有潜在的6甘露糖-6-磷酸(M-6-P)基团，其在翻译后修饰过程中被添加。M-6-P是靶向修饰，其通过M-6-P受体将该酶引导至溶酶体。PLBL2包含6个半胱氨酸，其中两个有自由巯基，而四个形成二硫键。在酸性环境中，PLBL2进一步剪切成N-端和C-端片段，分别有32,000和45,000MW。通过与其它溶酶体酶类比，该切割是活化步骤，允许并且使得底物进入活性位点。

仓鼠和人形式的PLBL2酶之间大约有80％的PLBL2氨基酸序列同源性。该酶的活性被认为是从组成细胞膜的磷脂上切割任意一个脂肪酸链。存在具有不同底物切割特异性的其它磷脂酶。在微生物中存在类似的酶活性，其中它们通常是毒力因子。尽管微生物具有类似的酶促活性，产生该活性的蛋白质是不同的，并且，微生物和哺乳动物PLBL2酶之间的序列同源性低。磷脂酶产生游离脂肪酸(FFA)，作为底物水解的产物之一。游离脂肪酸本身是潜在的免疫信号传导因子。脱氢将FFA转换为花生四烯酸，其潜在地参与涉及类花生酸的炎症级联。

已经将PLBL2鉴定为某些重组蛋白制品中的单个HCP(CHOP)，具有在细胞系中或者在多种产物中以及在纯化的多个阶段进行PLBL2水平的特异、灵敏和定量测定的试剂、方法和试剂盒将是非常有利和令人满意的。在不存在具有足够一致性、灵敏度、特异性或有效性的现有测定时，尤其需要这样的试剂、方法和试剂盒。本文所描述的发明满足了某些上述需求，并提供其它益处。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入。

发明概述

本发明至少部分基于抗仓鼠磷脂酶B-样2(PLBL2)抗体和这类抗体在用于检测和定量仓鼠PLBL2蛋白，例如，在获自重组多肽制品或宿主细胞系的样品中的仓鼠PLBL2蛋白的免疫测定方法中的用途。

因此，在一个方面，提供了结合仓鼠磷脂酶B-样2的抗体。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆的。在某些实施方案中，所述抗体显示特异性结合至仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变轻链区，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变重链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变轻链区，该可变轻链区包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列，该可变轻链区包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，该重链包括SEQIDNO.:13的氨基酸序列，该轻链包括SEQIDNO.:18的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体是19C10。

在另一个方面，提供了另一种结合仓鼠磷脂酶B-样2的抗体。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆的。在某些实施方案中，所述抗体显示特异性结合至仓鼠PLBL2。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变轻链区，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变重链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变轻链区，该可变轻链区包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列，该可变轻链区包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体包括重链和轻链，该重链包括SEQIDNO.:3的氨基酸序列，该轻链包括SEQIDNO.:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体是15G11。

在又一个方面，提供了结合仓鼠磷脂酶B-样2蛋白的多克隆抗体。在某些实施方案中，所述多克隆抗体是兔抗体。

在又一个方面，提供了用于检测仓鼠磷脂酶B-样2蛋白(PLBL2)的免疫测定方法。在某些实施方案中，获取来自重组多肽制品或宿主细胞系的样品。在某些实施方案中，所述方法包括(a)将结合仓鼠PLBL2的第一捕获抗体与所述样品接触，从而产生样品-捕获抗体组合物质；(b)将结合仓鼠PLBL2的第二检测抗体与所述样品-捕获抗体组合物质接触；以及(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合物质的第二抗体。在一些实施方案中，捕获抗体不与检测抗体竞争结合。在一些实施方案中，捕获抗体结合不同于检测抗体的表位。在某些实施方案中，使用标准滴定曲线对所结合的第二检测抗体的水平进行定量。在某些实施方案中，基于所结合的第二检测抗体的水平计算样品中存在的仓鼠PLBL2的量。在一些实施方案中，所述免疫测定是电化学发光(ECL)测定。在一些实施方案中，所述免疫测定是夹心测定。在一些实施方案中，所述夹心测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施方案中，捕获抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体包括可变区，该可变区包括可变轻链区，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体包括可变重链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体包括可变轻链区，该可变轻链区包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列，该可变轻链区包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体包括重链和轻链，该重链包括SEQIDNO.:13的氨基酸序列，该轻链包括SEQIDNO.:18的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述捕获抗体是19C10。在某些实施方案中，所述捕获抗体是多克隆的。在某些实施方案中，所述多克隆捕获抗体是兔抗体。在某些实施方案中，所述检测抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述检测抗体包括可变区，该可变区包括可变轻链区，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述检测抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，该CDRH1包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列，该CDRH2包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列，并且，该CDRH3包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列，该可变轻链区包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列，该CDRL2包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列，并且，该CDRL3包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述检测抗体包括可变重链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述检测抗体包括可变轻链区，该可变轻链区包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述检测抗体包括可变区，该可变区包括可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列，该可变轻链区包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述检测抗体包括重链和轻链，该重链包括SEQIDNO.:3的氨基酸序列，该轻链包括SEQIDNO.:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述检测抗体是15G11。在某些实施方案中，所述检测抗体是多克隆的。在某些实施方案中，所述多克隆检测抗体是兔抗体。在某些实施方案中，所述检测抗体缀合至生物素。在某些实施方案中，所述检测抗体缀合至辣根过氧化物酶。

在上述方法的某些实施方案中，重组多肽制品或宿主细胞系获自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。在某些实施方案中，所述重组多肽制品是收获的细胞培养液(HCCF)。在某些实施方案中，所述重组多肽制品已经历一个或多个层析纯化步骤。在某些实施方案中，所述重组多肽制品是最终纯化产物。在一些实施方案中，所述最终纯化产物是药物物质。

在上述方法的某些另外的实施方案中，所述重组多肽制品中的重组多肽是抗体或免疫粘附素。在某些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述重组多肽是IgG。在一些实施方案中，所述重组多肽选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，所述重组多肽是IgG1。在一些实施方案中，所述重组多肽是IgG4。

在又一个方面，提供了用于检测仓鼠PLBL2的免疫测定试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括根据上述捕获抗体中任一种的捕获抗体和根据上述检测抗体中任一种的检测抗体。在一些实施方案中，所述免疫测定是ECL免疫测定。在一些实施方案中，所述免疫测定是ELISA免疫测定。

在一个方面，提供了筛选用于表达仓鼠PLBL2的宿主细胞系的方法，所述方法包括检测获自所述宿主细胞系的样品中的PLBL2。在某些实施方案中，通过使用上述用于检测仓鼠PLBL2的免疫测定方法中的任一种，在样品中检测PLBL2。在一些实施方案中，所述样品是收获的细胞培养液。在一些实施方案中，所述样品是全细胞培养液。在某些实施方案中，所述方法还包括使用上述免疫测定和计算方法计算样品中的仓鼠PLBL2的量。

在另一个方面，提供了从两个或更多个宿主细胞系的组中选择表达低量仓鼠PLBL2的最佳宿主细胞系的方法。在一些实施方案中，最佳宿主细胞系选自三个或更多个宿主细胞系的组，或者五个或更多个宿主细胞系的组，或者10个或更多个宿主细胞系的组，或者20个或更多个宿主细胞系的组。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)从两个或更多个宿主细胞系中的每一个获取宿主细胞系样品；(ii)使用上述免疫测定和计算方法计算每一个宿主细胞系样品中的PLBL2的量；(iii)将每一个宿主细胞系样品中的PLBL2的量与该组的每一个宿主细胞系样品中的PLBL2的量进行比较；(iv)鉴定与该组的每一个宿主细胞系样品相比具有最低量PLBL2的宿主细胞系样品，从而从该组中生成鉴定的具有最低量PLBL2的宿主细胞系；以及，选择(iv)中的经鉴定的宿主细胞系作为最佳宿主细胞系。在一些实施方案中，所述两个或更多个宿主细胞系中的每一个是CHO细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞系样品中的每一个是收获的细胞培养液。在一些实施方案中，所述宿主细胞系样品中的每一个是全细胞培养液。

在又一个方面，提供了筛选用于表达仓鼠PLBL2的表达重组多肽的细胞系的方法，其中所述表达重组多肽的细胞系是产物细胞系，所述方法包括检测获自所述产物细胞系的样品中的PLBL2。在某些实施方案中，通过使用上述用于检测仓鼠PLBL2的免疫测定方法中的任一种，在样品中检测PLBL2。在某些实施方案中，所述方法还包括使用上述免疫测定和计算方法。在一些实施方案中，所述方法还包括通过检测样品中的产物和定量样品中的产物的量来筛选产物的表达。在一些实施方案中，产物的检测和产物的量的定量包括分光光度法或亲和层析法。

在又一个方面，提供了从两个或更多个表达重组多肽的细胞系的组中选择表达低量仓鼠PLBL2和高量产物的最佳表达重组多肽的细胞系的方法，其中所述两个或更多个表达重组多肽的细胞系中的每一个是表达相同产物的产物细胞系。在一些实施方案中，最佳表达重组多肽的细胞系选自三个或更多个表达重组多肽的细胞系的组，或者五个或更多个表达重组多肽的细胞系的组，或者10个或更多个表达重组多肽的细胞系的组，或者20个或更多个表达重组多肽的细胞系的组，或者40个或更多个表达重组多肽的细胞系的组。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)从两个或更多个产物细胞系中的每一个获取产物细胞系样品；(ii)使用上述免疫测定和计算方法计算每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量；(iii)检测每一个产物细胞系样品中的产物和定量每一个产物细胞系样品中的产物的量；(iv)将每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量与该组的每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量进行比较；(v)将每一个产物细胞系样品中的产物的量与该组的每一个产物细胞系样品中的产物的量进行比较；(vi)鉴定与该组的每一个产物细胞系样品相比具有最低量PLBL2和最高量产物的产物细胞系样品，从而从该组中生成鉴定的具有最低量PLBL2和最高量产物的产物细胞系；以及，选择(vi)中的经鉴定的产物细胞系作为最佳产物细胞系。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)从两个或更多个产物细胞系中的每一个获取产物细胞系样品；(ii)使用上述免疫测定和计算方法计算每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量；(iii)检测每一个产物细胞系样品中的产物和定量每一个产物细胞系样品中的产物的量；(iv)针对每一个产物细胞系样品，计算PLBL2的量与产物的量的比率；(v)将针对每一个产物细胞系样品计算的比率与该组的每一个产物细胞系样品进行比较；(vi)鉴定具有该组中最低比率的产物细胞系样品，从而从该组中生成鉴定的具有最低量PLBL2和最高量产物的产物细胞系；以及，选择(vi)中的经鉴定的产物细胞系作为最佳产物细胞系。在一些实施方案中，两个或更多个产物细胞系中的每一个是CHO细胞系。在一些实施方案中，所述产物细胞系样品中的每一个是收获的细胞培养液。

在上述方法的某些另外的实施方案中，由表达重组蛋白的细胞系表达的产物是抗体或免疫粘附素。在某些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，产物是IgG。在一些实施方案中，产物选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，产物是IgG1。在一些实施方案中，产物是IgG4。

附图的简要说明

图1示出了关于如实施例1中所描述的市售PLBL2ELISA试剂盒的代表性标准曲线。(A)使用USCNELISA试剂盒生成的标准曲线；(B)使用CUSABIOELISA试剂盒生成的标准曲线。

图2示出了关于如实施例3中所描述的小鼠单克隆PLBL2ELISA测定的代表性标准曲线。

图3示出了关于通过如实施例4中所描述的LC-MS/MS所监测的各PLBL2肽的代表性标准曲线。各标准曲线的线性度(R)>0.99。

图4示出了如实施例4中所描述的不同单抗(mAbHCCF样品中的PLBL2比率(以ppm计)。来自相同单抗运行的重复运行由R1、R2、R3表示。

图5示出了如实施例4中所描述的MabG的生产中汇集样品中测量的PLBL2清除。

图6示出了关于如实施例5中所描述的兔多克隆PLBL2ELISA测定的代表性标准曲线。

图7示出了如实施例6中所描述的、MabG的生产中汇集样品中测量的PLBL2清除。

图8示出了如实施例7中所描述的表达(A)产物J、(B)产物K、(C)产物L、(D)产物M、(E)产物N和(F)产物O的重组CHO细胞系中的总CHOP水平(g/L)、PLBL2(mg/L)和产物浓度(g/L)；沿着横轴指示克隆细胞系编号。使用第14天HCCF样品进行所有测量。误差线表示获自重复的2L生物反应器培养物的最大和最小测量值。

图9示出了如实施例7中所描述的表达(A)产物J、(B)产物K、(C)产物L、(D)产物M、(E)产物N和(F)产物O的重组CHO细胞系中的PLBL2浓度(mg/L)与产物浓度(g/L)的比率；沿着横轴指示克隆细胞系编号。所述比率报告为百万分数(ppm)，这相当于纳克(ng)PLBL2比上毫克(mg)产物。误差线表示从来自重复的2L生物反应器培养物的第14天HCCF获得的最大和最小测量值。

图10示出了如实施例7中所描述的表达产物P的48个细胞系的单份(singlicate)摇瓶培养物中的PLBL2/产物比率(ppm)；沿着横轴指示克隆细胞系编号。所述比率报告为百万分数(ppm)，这相当于纳克PLBL2比上毫克产物。使用第14天HCCF样品获得所有测量值。

图11示出了如实施例7中所描述的表达产物P的48个细胞系的培养物中的PLBL2(mg/L)、总CHOP(g/L)和产物浓度(g/L)。这三个测量值之间的关联通过对(A)PLBL2相对于产物浓度、(B)总CHOP相对于产物浓度和(C)PLBL2相对于总CHOP浓度绘图进行评估。使用第14天HCCF样品获得所有测量值。各细胞系在单份(singlicate)摇瓶中培养。公式提供线性回归和决定系数(R²)。

图12示出了如实施例7中所描述的不表达任何产物基因的3种CHO宿主细胞系(宿主1，宿主2，和宿主3)的2L生物反应器培养物中的PLBL2浓度。在采集自这些空白运行的(A)HCCF和(B)WCCF这两种样品中测量PLBL2水平。

图13示出了如实施例7中所描述的3种CHO宿主细胞系(宿主1，宿主2，和宿主3)的2L生物反应器培养物中的PLBL2浓度作为体积积分的活细胞压积(IVPCV)的函数。在采集自这些空白运行的(A)HCCF和(B)WCCF这两种样品中测量PLBL2水平。公式提供线性回归和决定系数(R²)。线性回归的斜率提供了每天基础上的每单位活细胞体积上的细胞比PCLB2产率的估计。

详细说明

除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第二版,J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1994)，和March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure第四版,JohnWiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)，为本领域技术人员提供了针对本申请中使用的许多术语的一般性指南。

某些定义

出于解释本说明书的目的，下列定义将应用，并且，任何适当的时候，以单数使用的术语将同样包括复数，反之亦然。下面所提出的定义与任何通过引用并入本文的文件相冲突的情况下，以下面所提出的定义为准。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数对象，除非上下文明确指出。因此，例如，提及“蛋白质”或“抗体”分别包括多个蛋白质或多个抗体；提及“细胞”包括多个细胞的混合物，等等。

术语“检测”在本文中以最广泛的意义使用，以包括目标分子的定性和定量测量两者。检测包括鉴定样品中目标分子的仅仅存在以及确定目标分子是否以可检测的水平存在于样品中。

“样品”指的是较大量材料的一小部分。通常，根据本文所描述的方法的测试针对样品进行。样品典型地获自所获得的重组多肽制品，例如，获自培养的表达重组多肽的细胞系(在本文中也称作“产物细胞系”)，或者获自培养的宿主细胞。如本文所使用的，“宿主细胞”不包含用于表达感兴趣的重组多肽或产物的基因。样品可以获自，例如但不限于，收获的细胞培养液，其来自纯化过程中的某些步骤的生产中的汇集物，或者来自最终纯化产物。

“捕获抗体”指的是特异性结合样品中的目标分子的抗体。在一定条件下，捕获抗体与目标分子形成复合物，这样一来，抗体-目标分子复合物可以从样品的其余部分分离。在某些实施方案中，该分离可以包括洗去样品中不结合捕获抗体的物质或材料。在某些实施方案中，捕获抗体可以附着到固体支持物表面上，例如，举例来说，但不限于，板或珠。

“检测抗体”指的是特异性结合样品中或样品-捕获抗体组合物质中的目标分子的抗体。在一定条件下，检测抗体与目标分子或者与目标分子-捕获抗体复合物形成复合物。检测抗体能够通过标记(其可以被放大)而直接地或者例如通过使用被标记的且结合该检测抗体的另一抗体而间接地被检测。关于直接标记，检测抗体典型地缀合至可通过一些手段检测的部分，例如，包括但不限于，生物素或钌。

术语“标记”或“可检测标记”指的是，可以连接至要检测或定量的物质(例如，抗体)的任何化学基团或部分。典型地，标记是适合于物质的灵敏检测或定量的可检测标记。可检测标记的例子包括，但不限于，发光标记(例如，荧光，磷光，化学发光，生物发光和电化学发光标记)，放射性标记，酶，颗粒，磁性物质，电活性种类等。备选地，可检测标记可以通过参与特异性结合反应而表明其存在。这样的标记的例子包括半抗原，抗体，生物素，链霉亲和素，his-标签，次氮基三乙酸，谷胱甘肽S-转移酶，谷胱甘肽等。

术语“检测手段”指的是用于通过信号报告(其随后在测定中读出)检测可检测抗体的存在的部分或技术。典型地，检测手段采用放大固定化的标记(如，被捕获到微量滴定板上的标记)的试剂，例如，亲和素或链霉亲和素-HRP)。

“光致发光”指的是其中材料吸收光(或者称之为电磁辐射)并且随后该材料发光的过程。荧光和磷光是两种不同类型的光致发光。“化学发光”过程涉及通过化学反应产生发光种类。“电化学发光”或“ECL”是这样一个过程，其中，在合适的周围化学环境中，将种类(例如，抗体)暴露于电化学能量的时候，该种类发光。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，它们指的是任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链的或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被天然地修饰或受干预地修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记成分缀合。还包括在定义中的有，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸，等等)，以及本领域已知的其它修饰的多肽。如本文所使用的术语“多肽”和“蛋白质”特别地包括抗体。

“纯化的”多肽(例如，抗体或免疫粘附素)是指纯度上已经提高的多肽，使得与其在它的天然环境中存在时和/或当在实验室条件下最初合成和/或扩增时相比，其以更纯的形式存在。纯度是相对而言的，并且，不一定意味着绝对纯。

“结合”感兴趣抗原(例如宿主细胞蛋白)的抗体，是以足够亲和力结合该抗原的抗体，这样，该抗体可以作为测定试剂使用，例如，作为捕获抗体或作为检测抗体。典型地，这样的抗体不与其它多肽显著地交叉反应。

关于多肽与目标分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽目标上的表位是指与非特异性相互作用具有可测量的不同的结合。特异性结合可以例如通过确定与对照分子(其通常是不具有结合活性的相似结构的分子)的结合相比目标分子的结合来测量。

“亲和力”指的是分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合搭档(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指明，如本文中所使用的，“结合亲和力”指的是反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X关于其搭档Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所描述的那些方法)来测量。

术语“抗PLBL2抗体”和“结合至PLBL2的抗体”指的是能够以足够亲和力结合PLBL2(例如，仓鼠PLBL2)的抗体，这样，该抗体可以作为靶向PLBL2中的活性剂使用，例如，作为本文所描述的测定中的活性剂。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗PLBL2抗体与不相关的、非PLBL2蛋白的结合程度小于该抗体与PLBL2的结合的10％。在某些实施方案中，结合至PLBL2的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或者≤0.001nM(例如，10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如从10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用，并涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。

抗体是具有变化的结构的、天然存在的免疫球蛋白分子，全部基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，它们通过二硫键键合以形成功能性抗体。各重链和轻链自身包括“恒定”(C)和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支撑和发挥与免疫效应子的非抗原特异性相互作用的功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合至特定抗原的能力。

抗体的抗原结合特异性由可变区或V区的结构特性决定。术语“可变的”指的是这样一个事实，即，抗体之间可变结构域的某些部分在序列上广泛不同，并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布。它集中于轻链和重链可变结构域两者的三个区段中，这三个区段被称为高变区。可变结构域中更加高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR(主要采用β折叠构象)，这四个FR由三个高变区连接，它们形成这样的环，所述环连接β折叠结构，并且，所述环在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高变区通过FR与来自其它链的高变区非常接近地保持在一起，促使抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。

当在本文中使用时，术语“高变区”指的是负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区可以包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，V_L中大约24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)残基周围，以及V_H中大约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)残基周围(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，V_L中的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)残基，以及V_H中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)残基(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。

“框架”或“FR”残基是如本文所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地，包括其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)，线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体，单可变结构域抗体，微抗体(minibodies)，单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于，Db-Fc，taDb-Fc，taDb-CH3，(scFV)4-Fc，di-scFv，bi-scFv或串联(di,tri)-scFv)；和双特异性T细胞衔接器(Bi-specificT-cellengager)(BiTE)。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，以及残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。

“F_V”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由以紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变结构域的三个高变区相互作用从而在V_H-V_L二聚体的表面上定义抗原结合位点。总的来说，六个高变区为抗体赋予了抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或者Fv的一半，其仅包含三个抗原特异性的高变区)也具有识别和结合抗原的能力，虽然与完整结合位点相比，其亲和力较低。

Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带至少一个自由硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')₂抗体片段最初是作为成对Fab'片段(它们之间有铰链半胱氨酸)产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以归入两种截然不同的类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以归入不同的类。完整抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链上。在一些实施方案中，Fv多肽还包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun于Rosenburg和Moore编的ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Springer-Verlag,NewYork,269-315页(1994)。

术语“双抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)。通过使用接头(该接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对)，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整地描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。

术语“多特异性抗体”以最广泛的意义使用，并特别涵盖包含具有多表位特异性(即，能够与一个生物分子上两个或更多个不同的表位特异性结合，或者，能够与两个或更多个不同的生物分子上的表位特异性结合)的抗原结合结构域的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体(如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元与第一表位特异性结合并且第二VH/VL单元与第二表位特异性结合，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。这样的多特异性抗体包括，但不限于，全长抗体，具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，抗体片段，如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗体，双特异性双抗体和三抗体，已共价或非共价连接的抗体片段。还包含至少一部分重链恒定区和/或至少一部分轻链恒定区的VH/VL单元也可以被称为“hemimer”或“半抗体”。“多表位特异性”指的是与相同或不同的(多个)目标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。“单特异性”指的是仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM，3μM至0.001pM，1μM至0.001pM，0.5μM至0.001pM，或0.1μM至0.001pM的亲和力与各表位结合的IgG抗体。

“双特异性抗体”是包含这样的抗原结合结构域的多特异性抗体，所述抗原结合结构域能够与一个生物分子上的两个不同表位特异性结合，或者能够与两个不同生物分子上的表位特异性结合。双特异性抗体在本文中也可以称为具有“双特异性”或者称为是“双特异的”。

表述“单结构域抗体”(sdAb)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常指的是这样的抗体，在该抗体中单可变结构域(VH或VL)可以赋予抗原结合。换句话说，所述单可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以便识别目标抗原。单结构域抗体的例子包括源自骆驼科动物(美洲驼和骆驼)和软骨鱼类(例如，护士鲨)的那些抗体和由重组方法源自人和小鼠抗体的那些抗体(Nature(1989)341:544-546；DevCompImmunol(2006)30:43-56；TrendBiochemSci(2001)26:230-235；TrendsBiotechnol(2003):21:484-490；WO2005/035572；WO03/035694；FebsLett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO02/051870)。

在本文中使用的术语“单克隆抗体”指的是从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即，除了在产生单克隆抗体的过程中可能发生的可能的变异体(这样的变异体通常以极小量存在)外，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品形成对照，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优势在于它们不受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,Nature256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

在本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一个或多个链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括这样的“灵长类化(primatized)”抗体，所述“灵长类化”抗体包含源自非人灵长类动物(例如，旧世界猴，如狒狒，恒河猴或猕猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。

关于本文的目的，“完整抗体”是包含重链可变结构域和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。

“天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的、大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(V_H)，接着是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(V_L)，而在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域排列在一起，并且，轻链可变结构域与重链的可变结构域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。

“裸抗体”是这样的抗体(如本文所定义的)，其没有缀合至异源分子，如检测部分或标记。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可以互换使用，并且指的是已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代与亲本细胞在核酸内容上可能不完全相同，而可以含有突变。具有与关于最初转化细胞所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代也包括在本文中。

术语“污染物”和“杂质”在本文中可以互换使用，并且指的是的与期望的多肽产物不同的材料或物质。污染物包括，但不限于：宿主细胞材料，如CHOP；滤出的蛋白A；核酸；期望的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一种多肽；内毒素、病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些实施例中，污染物可以是来自，例如但不限于，细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli)细胞)，昆虫细胞，原核细胞，真核细胞，酵母细胞，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)，禽类细胞，真菌细胞的宿主细胞蛋白(HCP)。

“分离的”核酸指的是已经分离自其天然环境组分的核酸分子。分离的核酸包括包含在细胞中的核酸分子，所述细胞通常包含该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或位于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。

“编码抗PLBL2抗体的分离的核酸”指的是一种或多种编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括单个载体或单独的载体中该(一种或多种)核酸分子，以及，存在于宿主细胞中一个或多个位置处的该(一种或多种)核酸分子。

相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为进行序列比对并引入缺口(如果需要的话)以达到最大百分比的序列同一性并且不将任何保守取代考虑为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以确定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式(例如，使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件)来实现。本领域技术人员可以确定关于序列比对的适当的参数，包括实现所比较的序列全长上的最大比对所需的任何算法。在某些实施方案中，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司授权，并且其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，其中，其在美国版权注册登记号TXU510087下注册登记。ALIGN-2程序可以从Genentech公司(南圣弗朗西斯科，加利福尼亚(SouthSanFrancisco,California))公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当在UNIX操作系统(包括数字UNIXV4.0D(digitalUNIXV4.0D))上编译使用。所有的序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且不变。

在其中ALIGN-2被用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A对、与、或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(这可以备选地表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：

100乘以分数X/Y

其中X是：在A和B的程序比对中，被序列比对程序ALIGN-2记为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且，其中Y是：B中的氨基酸残基的总数。应当认识到，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确声明，否则本文所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是使用ALIGN-2计算机程序如紧挨的前段所描述的那样获得的。

术语“可变区”或“可变结构域”指的是涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包括四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.,第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来分离，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。

如本文所使用的术语“载体”指的是能够增殖与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入到宿主细胞(载体已被引入该宿主细胞中)的基因组中的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

本文提及“约”一个值或参数时包括(并且描述了)涉及该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括描述“X”。

当本文中使用时，以及在所附权利要求书中，单数形式“a”、“or”和“the”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。应当理解，本文所描述的本发明的方面和变化包括由这些方面和变化“组成”和/或“基本上组成”。

测定方法

本文提供了用于检测和定量仓鼠PLBL2的免疫测定方法。该方法可以用于检测和定量宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中产生的重组多肽制品中的仓鼠PLBL2。在一些实施方案中，该方法使用本文所描述的捕获和检测抗PLBL2抗体。在一些实施方案中，抗体用在本领域已知的任何免疫测定方法中，包括但不限于，夹心测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)测定，电化学测定(ECL)测定，磁性免疫测定。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗PLBL2抗体与仓鼠PLBL2结合的条件下，使重组多肽制品的样品与本文所述的抗PLBL2抗体接触，并且检测抗PLBL2抗体与仓鼠PLBL2之间是否形成复合物。

在某些实施方案中，提供了标记的抗PLBL2抗体。标记包括，但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及被间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性的标记包括，但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团(如稀土螯合物或荧光素及其衍生物)，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，荧光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

在某些实施方案中，捕获抗PLBL2抗体被固定在固相上。在一些实施方案中，用于固定化的固相是本质上不溶于水并且在免疫计量测定中可用的任何惰性支持物或载体，包括例如表面、颗粒、多孔基质、珠等形式的支持物。常用载体的例子包括小板，凝胶，聚氯乙烯，塑料珠，以及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的测定板或测试管，包括96孔微量滴定板，以及颗粒材料，如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其它多糖。备选地，反应性水不溶性基质，如溴化氰活化的碳水化合物和描述于美国专利号3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440的反应性底物适用于捕获试剂固定化。在一些实施方案中，固定的捕获试剂被包被在微量滴定板上，这样的微量滴定板可用于一次分析若干个样品。示例性的微量滴定板包括，但不限于， NUNC和固相用如上定义的捕获试剂包被，其可以根据要求通过非共价或共价相互作用或物理连接来进行连接。用于附着的技术包括美国专利号4,376,110和其中所引用的参考文献中所描述的那些技术。如果是共价连接，在本领域公知的条件(如室温下1小时)下用交联剂连同捕获试剂一起孵育板或其它固相。在一些实施方案中，板堆叠起来并在测定本身之前长久地包被，并且，随后以手动、半自动或自动方式对若干个样品同时进行测定，如通过使用机器人技术。

在一些实施方案中，用封闭剂对包被的板进行处理，封闭剂非特异性地结合至结合位点并使得结合位点饱和，从而防止游离配体与板孔上的过量位点的不希望的结合。用于此目的的适当的封闭剂的例子包括但不限于，例如，明胶，牛血清白蛋白，卵清蛋白，酪蛋白，以及无脂奶。封闭处理通常在环境温度条件下进行一段时间，通常约1-4小时。

在一些实施方案中，包被和封闭后，将适当稀释的待分析样品加到固定相。用于此目的的可用于稀释的示例性缓冲液包括，但不限于，(a)含有0.5％BSA，0.05％TWEEN洗涤剂(P20)，0.05％300抗生素，5mMEDTA，0.25％3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基)-1-丙磺酸(CHAPS)表面活性剂，0.2％β-γ球蛋白，以及0.35MNaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)；(b)含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％P20，以及0.05％300的PBS，pH值为7；(c)含有0.5％BSA，0.05％P20，0.05％300，5mMEDTA，以及0.35MNaCl的PBS，pH值为6.35；(d)含有0.5％BSA，0.05％P20，0.05％300，5mMEDTA，0.2％β-γ球蛋白，以及0.35MNaCl的PBS；和(e)含有0.5％BSA，0.05％P20，0.05％300，5mMEDTA，0.25％CHAPS，以及0.35MNaCl的PBS。

对样品和固定的捕获试剂的孵育条件进行选择，以使得测定灵敏度最大化并使得解离最小化，并且确保样品中存在的任何感兴趣的分析物(如仓鼠PLBL2)结合至固定的捕获试剂。任选地，将样品与固定的捕获试剂分开(例如，通过洗涤)从而去除未捕获的物质。用于洗涤的溶液通常是缓冲液(例如，“洗涤缓冲液”)。如果对于被捕获的感兴趣物质在后续步骤可能以某种程度解离有任何担心，那么，在这个阶段，还可以加入交联剂或其它合适的试剂，以允许此时结合的感兴趣物质(例如，仓鼠PLBL2)共价附接至捕获试剂。

将固定的捕获试剂与存在的任何结合的感兴趣物质与检测抗PLBL2抗体接触。在一些实施方案中，检测抗体是生物素化的。在一些实施方案中，用于生物素化的标记的检测手段是亲和素或链霉亲和素-HRP。在一些实施方案中，检测手段的读出是荧光或比色。

使用用于检测抗体的检测手段测量或定量此时结合至捕获试剂的、来自样品的任何游离的感兴趣物质(例如，仓鼠PLBL2)的水平。在一些实施方案中，测量或定量包括将作为以上步骤的结果所发生的反应与标准曲线进行比较，以确定相比起已知量感兴趣物质(例如，仓鼠PLBL2)的水平。

加到固定的捕获试剂的抗体将被直接标记，或者通过以下方法进行间接检测：洗去过量的第一抗体后，加入摩尔过量的第二标记抗体，该第二标记抗体针对第一抗体的动物种类的IgG。在后者的间接测定中，针对第一抗体的、标记的抗血清被加到样品中，从而在原位产生标记的抗体。

用于第一抗体或第二抗体的标记是不干扰游离的感兴趣物质(例如，仓鼠PLBL2)与第一抗体或第二抗体的结合的任何可检测功能。合适的标记的例子包括已知用于免疫测定中的那些标记，如上面列举的那些标记。

可以使用常规方法将这些标记共价地结合至蛋白质或多肽。例如，偶联剂，如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双-亚氨酸酯、双-重氮化联苯胺等可用于将上述的荧光、化学发光和酶标记标记到抗体上。参见，例如，美国专利号3,940,475(荧光测定法)和美国专利号3,645,090(酶)；Hunter等人,Nature144:945(1962)；David等人,Biochemistry,13:1014-1021(1974)；Pain等人,J.Immunol.Methods40:219-230(1981)；以及Nygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407-412(1982)。在一些实施方案中，标记是生物素，使用链霉亲和素-HRP作为检测手段。

对于免疫测定技术领域中的普通技术人员来说，该标记(包括酶)与抗体的缀合是标准操作程序。参见，例如，O'Sullivan等人，"MethodsforthePreparationofEnzyme-antibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay,"收录于MethodsinEnzymology，J.J.Langone和H.VanVunakis编，第73卷(AcademicPress,NewYork,N.Y.,1981),147-166页。

加入最后的标记的抗体后，通过以下方法来确定结合的抗体的量：通过洗涤去除过量的未结合的标记的抗体，并且随后使用适合于该标记的检测方法来测量或定量附着的标记的量，并且将测量的量与生物样品中感兴趣抗体的量相关联。例如，在酶的情况下，显现并测量的颜色的量将是允许定量所存在的感兴趣抗体的量的直接度量。在一个实施方案中，HRP是标记，并且使用底物OPD、以490nm处的吸光度来检测颜色。

在一个实施例中，从固定相中洗去针对未标记的第一抗体的酶标记的第二抗体后，通过使固定的捕获试剂与酶的底物孵育而产生并测量颜色或化学发光。然后，通过与平行进行的标准试验所产生的颜色或化学发光进行比较，计算感兴趣物质(例如，仓鼠PLBL2)的浓度。

多肽

示例性的抗仓鼠PLBL2抗体

提供了用在本文所描述的任何测定方法中的多肽。在一个方面，提供了结合仓鼠PLBL2的分离的抗体。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，所述CDR选自(a)包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列的CDRH1；(b)包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列的CDRH2；(c)包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列的CDRH3；(d)包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列的CDRL1；(e)包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列的CDRL2；和(f)包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列的CDRL3。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体包括可变重链区，所述可变重链区包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体包括可变轻链区，所述可变轻链区包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体(“19C10”)包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO.:13的氨基酸序列，所述轻链包括SEQIDNO.:18的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括与SEQIDNO.:13和SEQIDNO.:18的CDR序列有95％或更多相同的CDR序列。

在另一个方面，抗PLBL2抗体包括与SEQIDNO.:14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包括该序列的抗PLBL2抗体保留了与PLBL2结合的能力。在某些实施方案中，SEQIDNO.:14中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PLBL2抗体包括SEQIDNO.:14中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，提供了抗PLBL2抗体，其中所述抗体包括与SEQIDNO.:19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包括该序列的抗PLBL2抗体保留了与PLBL2结合的能力。在某些实施方案中，SEQIDNO.:19中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PLBL2抗体包括SEQIDNO.:19中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。

在某些实施方案中，抗PLBL2抗体包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，所述CDR选自(a)包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDRH1；(b)包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDRH2；(c)包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列的CDRH3；(d)包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列的CDRL1；(e)包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列的CDRL2；和(f)包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列的CDRL3。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体包括可变重链区，所述可变重链区包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体包括可变轻链区，所述可变轻链区包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PLBL2抗体(“15G11”)包括重链和轻链，所述重链包括SEQIDNO.:3的氨基酸序列，所述轻链包括SEQIDNO.:8的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括与SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:8的CDR序列有95％或更多相同的CDR序列。

在另一个方面，抗PLBL2抗体包括与SEQIDNO.:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包括该序列的抗PLBL2抗体保留了与PLBL2结合的能力。在某些实施方案中，SEQIDNO.:4中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PLBL2抗体包括SEQIDNO.:4中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，提供了抗PLBL2抗体，其中所述抗体包括与SEQIDNO.:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包括该序列的抗PLBL2抗体保留了与PLBL2结合的能力。在某些实施方案中，SEQIDNO.:9中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PLBL2抗体包括SEQIDNO.:9中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，提供了抗PLBL2抗体，其中所述抗体包括如以上提供的任一个实施方案中的VH，以及如以上提供的任一个实施方案中的VL。

在另一个方面，还提供了与本文所描述的抗PLBL2抗体结合至相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包括SEQIDNO.:14的VH序列和SEQIDNO.:19的VL序列的抗PLBL2抗体结合至相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包括SEQIDNO.:4的VH序列和SEQIDNO.:9的VL序列的抗PLBL2抗体结合至相同表位的抗体。

在本发明的另一个方面，根据以上实施方案中任一个的抗PLBL2抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗PLBL2抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1抗体或本文所定义的其它抗体种类或同种型。在另一个实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。

示例性的重组多肽

还提供了重组多肽及其制品，其样品可以通过本文所描述的方法进行测定。该重组多肽的例子包括但不限于，免疫球蛋白，免疫粘附素，抗体，酶，激素，融合蛋白，包含Fc的蛋白，免疫缀合物，细胞因子和白细胞介素，哺乳动物蛋白，如，举例来说，肾素；激素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC，因子IX，组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子，如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽；RANTES(正常T细胞表达和分泌的活化调节，regulatedonactivationnormallyT-cellexpressedandsecreted)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；穆氏抑制物质(Muellerian-inhibitingsubstance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；酶；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；细胞因子；CD蛋白，如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，即包括两个或更多个异源多肽或其片段并且由重组核酸编码的多肽；包含Fc的多肽，例如，包含与第二多肽融合的免疫球蛋白Fc区或其片段的融合蛋白；免疫缀合物；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α，干扰素-β，和干扰素-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如，举例来说，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受体；免疫粘附素；以及任何以上所列蛋白质的片段和/或变体，以及与蛋白质(包括，例如，任何以上所列蛋白质)结合的抗体，包括抗体片段。

在一些实施方案中，用于在本文所描述的任何测定方法中使用的多肽制品包含感兴趣抗体，即，由宿主细胞所产生的重组多肽是抗体。

这样的抗体的分子目标包括CD蛋白及其配体，诸如，但不限于：(i)CD3，CD4，CD8，CD19，CD11a，CD20，CD22，CD34，CD40，CD79α(CD79a)，和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族的成员，诸如，EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；(iii)细胞粘附分子，诸如，LFA-1，Mac1，p150,95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和αv/β3整合素，包括它们的α或β亚基(例如，抗CD11a，抗CD18或者抗CD11b抗体)；(iv)生长因子，诸如，VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C，BR3，c-met，组织因子，β7等；以及(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，诸如美国专利号7,521,541中描述的那些。

其它的示例性抗体包括选自以下列出的那些抗体，但不限于，抗雌激素受体抗体，抗孕酮受体抗体，抗p53抗体，抗HER-2/neu抗体，抗EGFR抗体，抗组织蛋白酶D抗体，抗Bcl-2抗体，抗E-钙粘蛋白抗体，抗CA125抗体，抗CA15-3抗体，抗CA19-9抗体，抗c-erbB-2的抗体，抗P-糖蛋白抗体，抗CEA抗体，抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体，抗ras癌蛋白抗体，抗路易斯X抗体，抗Ki-67的抗体，抗PCNA抗体，抗CD3抗体，抗CD4抗体，抗CD5抗体，抗CD7抗体，抗CD8抗体，抗CD9/p24的抗体，抗CD10抗体，抗CD11a抗体，抗CD11c抗体，抗CD13抗体，抗CD14抗体，抗CD15抗体，抗CD19抗体，抗CD20抗体，抗CD22抗体，抗CD23抗体，抗CD30抗体，抗CD31抗体，抗CD33抗体，抗CD34抗体，抗CD35抗体，抗CD38抗体，抗CD41抗体，抗LCA/CD45抗体，抗CD45RO抗体，抗CD45RA抗体，抗CD39抗体，抗CD100抗体，抗CD95/Fas抗体，抗CD99抗体，抗CD106抗体，抗泛素抗体，抗CD71抗体，抗c-myc抗体，抗细胞角蛋白抗体，抗波形蛋白抗体，抗HPV蛋白抗体，抗κ轻链抗体，抗λ轻链抗体，抗黑素体抗体，抗前列腺特异性抗原抗体，抗S-100抗体，抗τ抗原抗体，抗血纤蛋白抗体，抗角蛋白抗体和抗Tn抗原抗体。

多克隆抗体

在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。多克隆抗体优选通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射而在动物中产生。使用双功能试剂或衍生剂(例如，马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl₂，或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烷基)将相关抗原缀合至在将被免疫的物种中是免疫原性的多肽(例如，钥孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂)可以是有用的。

通过以下方法对动物进行针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物的免疫：将例如100μg或5μg多肽或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂混合，并将该溶液皮内注射于多个部位。一个月后，用弗氏完全佐剂中的1/5至1/10初始量的肽或缀合物，通过多个部位的皮下注射对动物进行加强。7至14天后，采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强直至滴度达到平台。在一些实施方案中，用同一抗原的缀合物对动物进行加强，但缀合至不同的多肽和/或通过不同的交联试剂缀合。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为多肽融合物来制备。同样地，聚集剂(如明矾)也适用于增强免疫应答。

单克隆抗体

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是从一群基本上同质的抗体获得的，即，除了在产生单克隆抗体的过程中所发生的可能的变体(这样的变体通常以极小量存在)外，构成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，因此，修饰语“单克隆”指明该抗体的这样的特征，即该抗体不是分立的或多克隆的抗体的混合物。

例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler等人,Nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，如本文所描述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合至用于免疫的多肽。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,59-103页(AcademicPress,1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基典型地将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是高效融合、支持由所选的产生抗体的细胞稳定高水平产生抗体、并对培养基(如HAT培养基)敏感的那些细胞。在这些之中，在一些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的那些细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MarylandUSA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。

对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施方案中，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，来确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等人,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来确定。

在鉴定产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释程序进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice59-103页(AcademicPress,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤进行体内培养。

通过常规免疫球蛋白纯化程序，如，举例来说，多肽A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当地分离。

编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，以杂交瘤细胞作为此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，该表达载体随后被转染到原本不产生免疫球蛋白多肽的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、人胚肾(HEK)293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等人,Curr.OpinioninImmunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

在又一个实施方案中，可以从抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段，所述抗体噬菌体文库使用McCafferty等人,Nature348:552-554(1990)中描述的技术生成。Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组来产生高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等人,Bio/Technology10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

DNA还可以通过以下方法进行修饰，例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源的鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA81:6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。

典型的是，将此类非免疫球蛋白多肽替代为抗体的恒定结构域，或者将它们替代为抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以生成嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包括对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

在本文所描述的任一种方法的一些实施方案中，所述抗体是IgA，IgD，IgE，IgG，或IgM。在一些实施方案中，所述抗体是IgG单克隆抗体。

抗体片段

在一些实施方案中，抗体是抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见，例如，Morimoto等人,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)和Brennan等人,Science229:81(1985))。然而，现在可以直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可以从上面所讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌(E.coli)回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')₂片段(Carter等人,Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练的从业人员来说将是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；以及美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

在一些实施方案中，提供了本文所描述的抗体的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自由Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，scFv，Fv和双抗体组成的组。

多肽变体和修饰

本文所描述的多肽(包括抗体)的(一种或多种)氨基酸序列修饰可以用在测定本文所描述的多肽制品(例如，抗体)的方法中。

变体多肽

“多肽变体”意指这样的多肽，例如，活性多肽，所述多肽如本文定义，与多肽的全长天然序列、缺少信号肽的多肽序列、具有或不具有信号肽的多肽的胞外结构域具有至少约80％的氨基酸序列同一性。这类多肽变体包括例如这样的多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基。通常，多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺少信号肽的多肽序列、具有或不具有信号肽的多肽的胞外结构域具有至少约80％氨基酸序列同一性，可选地至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一的氨基酸序列同一性。任选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸替换，可选的，与天然多肽序列相比，不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10个中任一的保守氨基酸替换。

变体多肽可以在N端或C端截短，或者可缺少内部残基，例如，与全长天然多肽相比时。某些变体多肽可缺少对于期望的生物活性来说不必需的氨基酸残基。可以通过多种常规技术中的任一种来制备这些具有截短、缺失和插入的变体多肽。所期望的变体多肽可以是化学合成的。另一种合适的技术涉及分离和通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码所期望的变体多肽的核酸片段。定义所述核酸片段的期望末端的寡核苷酸用在PCR中的5'和3'引物处。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。

氨基酸序列插入包括氨基末端的融合物和/或羧基末端的融合物，长度范围从一个残基至含有上百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶或多肽的融合体，所述酶或多肽增加了抗体的血清半寿期。

例如，改善多肽的结合亲和力和/或其它生物学特性可以是令人满意的。通过向抗体核酸中引入适当的核苷酸改变，或者通过肽合成，制备多肽的氨基酸序列变体。这类修饰包括，例如，在多肽的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或替换残基。进行缺失、插入和替换的任意组合以得到最终构建体，只要最终构建体具有期望的特征。氨基酸改变也可以改变多肽(例如，抗体)的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。

可以通过将多肽的序列与同源的已知多肽分子的序列进行比较，并且使得在高同源性区域中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，从而发现用于确定可以插入、替换或缺失哪个氨基酸残基而对期望的活性没有负面影响的指导准则。

用于鉴别多肽(例如，抗体)的某些残基或区域是用于诱变的优选位置的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989)所描述的。在本文中，残基或目标残基组(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定，并且由中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在替换位点处或关于替换位点引入另外的或其它的变体，细化对替换表现出功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点突变的表现，在目标密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变，并就期望的活性筛选表达的抗体变体。

另一种变体类型是氨基酸替换变体。这些变体的抗体分子中至少有一个氨基酸残基被不同的残基取代。替换诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑FR改变。下面的表1在“优选替换”的标题下显示了保守替换。如果这类替换导致生物学活性的改变，则可以引入更实质性的改变，在表1中命名为“示例性替换”，或如下文关于氨基酸类别所进一步描述的那样，并且筛选产物。

表1

通过选择其维持以下方面(a-c)的效果显著不同的替换来实现多肽生物学特性的实质性修饰：(a)替换区域中的多肽骨架结构，举例来说，作为片层或螺旋构象；(b)该分子在目标位点处的电荷或疏水性；或者(c)侧链的体积。可以根据其侧链特性的相似性对氨基酸进行分组(收录于A.L.Lehninger,Biochemistry第二版,73-75页,WorthPublishers,NewYork(1975))：

(1)非极性：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)

(2)不带电荷、极性：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)

(3)酸性：Asp(D),Glu(E)

(4)碱性：Lys(K)，Arg(R)，His(H)

可选的，可以基于共同的侧链特性，将天然存在的残基分组：

(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性：Asp，Glu；

(4)碱性：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。

非保守替换将限定为将这些类别之一的成员交换为另一种类别。

不参与维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以被替换，一般用丝氨酸来替换，以改善分子的氧化稳定性，并防止异常交联。相反，可以向多肽添加一个或多个半胱氨酸键，以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段(如Fv片段)时)。

替换性变体的一个例子涉及替换亲本抗体(例如，人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所获得的选定用于进一步研发的一个或多个变体将相对于生成其的亲本抗体具有改善的生物学特性。用于生成这类替换变体的便利的方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，对若干高变区位点(例如，6-7个位点)进行突变，以在每个位点生成所有的可能的氨基替换。如此生成的抗体变体由丝状噬菌体颗粒以单价形式展示为与包装在每个颗粒中的M13的基因III产物的融合物。然后，如本文所公开的那样，筛选经噬菌体展示的变体的生物学活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可选地，或者额外地，有利的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和目标之间的接触点。这类接触残基和邻近的残基是根据本文所述技术进行替换的候选者。一旦生成这类变体，就对变体组进行本文所描述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优秀特性的抗体用于进一步研发。

多肽的另一种类型的氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这类糖基化可以在宿主细胞或宿主生物体中的多肽表达期间天然地发生，或者可以是由人为干预所产生的故意的修饰。改变意指删除多肽中可见的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列之一的存在建立了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指的是将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列中的一种或多种，方便地实现向多肽添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。还可以通过对原始抗体的序列添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。

可以化学地、或酶促地、或通过突变性替换编码作为糖基化目标的氨基酸残基的密码子，实现去除存在于多肽上的碳水化合物部分。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶，实现酶促切割多肽上的碳水化合物部分。

其它修饰包括分别将谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰和苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化，N-末端胺的乙酰化，以及任何C-末端羧基的酰胺化。

嵌合多肽

可以以形成嵌合分子的方式修饰本文所描述的多肽，所述嵌合分子包括与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可以选择性结合的表位。表位标签一般位于多肽的氨基末端或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体检测这类经表位标记的形式的多肽的存在。此外，提供表位标签使多肽能够通过亲和纯化而容易地纯化，所述亲和纯化使用抗标签抗体或结合表位标签的另一种类型的亲和基质。

获得在测定方法中使用的多肽

可以用本领域公知的方法(包括重组方法)获得在本文所描述的测定方法中使用的多肽。以下部分提供关于这些方法的指导。

(A)多核苷酸

如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指的是任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。

编码多肽的多核苷酸可以获自任何来源，包括，但不限于，从被认为具有多肽mRNA并以可检测的水平表达它的组织制备的cDNA文库。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地获自从人组织制备的cDNA文库。还可以从基因组文库或通过已知的合成方法(例如，自动化核酸合成)获得编码多肽的基因。

例如，多核苷酸可以编码整条免疫球蛋白分子链，如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(V_H)，还包括重链恒定区(C_H)，该重链恒定区通常将包含三个恒定结构域：C_H1、C_H2和C_H3；以及“铰链”区。在一些情况下，希望存在恒定区。

可以由多核苷酸编码的其它多肽包括结合抗原的抗体片段，如单结构域抗体(“dAb”)，Fv，scFv，Fab'和F(ab')₂以及“微抗体(minibodies)”。微抗体(通常)是已从其切除了C_H1和C_K或C_L结构域的二价抗体片段。由于微抗体比常规抗体小，它们在临床/诊断用途中将实现更好的组织穿透，但由于是二价，它们应保持比单价抗体片段(如dAb)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有说明，本文使用的术语“抗体”不仅涵盖完整的抗体分子，还涵盖上文所讨论的类型的结合抗原的抗体片段。优选地，相对于对应的人受体框架，存在于所编码的多肽中的每个框架区将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体框架区，框架区可以包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。

适宜地，可以分离和/或纯化本文所描述的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的多核苷酸。

术语“分离的多核苷酸”旨在表明该分子已经从它的正常或天然环境移出或分离，或者已经以这样的方式产生，使得它不存在于它的正常或天然环境中。在一些实施方案中，该多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语纯化的旨在表明至少一些污染分子或物质已被去除。

适宜地，多核苷酸是基本上纯化的，使得相关多核苷酸构成组合物中存在的优势(即，最丰富的)多核苷酸。

(B)多核苷酸的表达

以下描述主要涉及通过培养用包含编码多肽的多核苷酸的载体转化或转染的细胞来产生多肽。当然，预期可采用本领域公知的备选方法来制备多肽。例如，可以使用固相技术(参见，例如，Stewart等人,Solid-PhasePeptideSynthesisW.H.FreemanCo.,SanFrancisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))，通过直接肽合成来产生合适的氨基酸序列或它的一部分。可以使用手动技术或通过自动化来进行体外蛋白质合成。可以例如使用制造商的说明、使用应用生物系统肽合成仪(AppliedBiosystemsPeptideSynthesizer)(FosterCity,Calif.)来实现自动化合成。可以单独化学合成多肽的多个部分并使用化学方法或酶促方法组合以产生期望的多肽。

将本文所描述的多核苷酸插入用于产生多肽的一个或多个表达载体中。术语“控制序列”指的是在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。控制序列包括，但不限于，启动子(例如，天然相关的启动子或异源启动子)，信号序列，增强子元件和转录终止序列。

当将多核苷酸置于与另一多核苷酸序列的功能关系中时，该多核苷酸与该另一多核苷酸序列“有效连接”。例如，前序列或分泌前导序列的核酸与多肽的核酸有效连接如果它表达为参与该多肽分泌的前蛋白的话；启动子或增强子与编码序列有效连接，如果它影响该序列的转录的话；或者，核糖体结合位点与编码序列有效连接，如果它被放置以便促进翻译的话。通常，“有效连接”意指所连接的核酸序列是连续的，并且，在分泌前导序列的情况下，是连续的且在阅读相中。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这类位点不存在，则按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接物或接头。

对于抗体，可以将轻链和重链克隆在相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的核酸区段与一个或多个表达载体中确保免疫球蛋白多肽表达的控制序列有效连接。

可以通过公知的方法将包含多核苷酸序列(例如，可变重链和/或可变轻链编码序列和任选的表达控制序列)的载体转入宿主细胞中，该方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质体转染、基因枪(biolistics)或基于病毒的转染可以用于其它细胞宿主。(通常参见Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress，第2版，1989))。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。对于转基因动物的产生，转基因可以显微注射入受精的卵母细胞，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组，并将这类细胞的细胞核转入无核的卵母细胞。

(C)载体

术语“载体”包括表达载体和转化载体和穿梭载体。

术语“表达载体”意指能够在体内或在体外表达的构建体。

术语“转化载体”意指能够从一个实体转移至另一实体(其可以属于该物种或者可以属于不同物种)的构建体。如果构建体能够从一个物种转移至另一物种(如从大肠杆菌(Escherichiacoli)质粒至如芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌)，那么该转化载体有时被称为“穿梭载体”。它甚至可以是能够从大肠杆菌(E.coli)质粒转移至土壤杆菌属(Agrobacterium)至植物的构建体。

可以将载体转化入下文所述的适宜宿主细胞以提供多肽的表达。多种载体是公开可得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法来将适当的核酸序列插入载体中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入一个或多个适当的限制性核酸内切酶位点。包含这些成分中的一种或多种的适宜载体的构建采用本领域技术人员已知的标准连接技术。

载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，其提供有复制起点，任选地，用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地该启动子的调节基因。载体可以包含一个或多个本领域公知的选择标志物基因。

这些表达载体通常作为附加体或者作为宿主染色体DNA的整体部分在宿主生物体中复制。

(D)宿主细胞

宿主细胞可以是例如细菌、酵母或其它真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。通常，宿主细胞不包含编码感兴趣的重组多肽或产物的外源核酸，尽管宿主细胞可以包含编码多肽的外源核酸，在某些条件下，这样的外源核酸的表达赋予细胞期望的性状，例如，编码赋予抗生素抗性的多肽的核酸。

可以用已进行了遗传操作的转基因多细胞宿主生物体来产生多肽。该生物体可以是，例如，转基因哺乳动物生物体(例如，转基因山羊或小鼠品系)。

适宜的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌(E.coli)。多种大肠杆菌菌株是公开可得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它适宜的原核宿主细胞包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，地衣芽孢杆菌41P(B.licheniformis41P))，假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是说明性的而不是限制性的。菌株W3110是一种尤其优选的宿主或亲本宿主，因为它是进行重组多核苷酸产物发酵的常用宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110从而在编码宿主内源多肽的基因中产生遗传突变，这类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonAptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)，其具有完整基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degPompTkan'；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degPompTrbs7ilvGkan'；大肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6；以及具有突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。可选地，体外克隆方法，例如，PCR或其它核酸聚合酶反应是适宜的。

在这些原核宿主中，可以制备这样的表达载体，所述表达载体通常将包含与该宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任意数目的多种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或者来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常将控制表达(任选地使用操纵基因序列)，并且具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。

可以使用真核微生物来进行表达。诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是适合用于编码多肽的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它宿主包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属宿主(Kluyveromyceshosts)，如，举例来说，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)，威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)，瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia)；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如，举例来说，脉孢霉属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)，和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养酵母在本文中是适宜的，并且包括，但不限于，选自由汉森酵母属(Hansenula)，假丝酵母属(Candida)，克勒克酵母属(Kloeckera)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)，和红酵母属(Rhodotorula)组成的属的、能够在甲醇上生长的酵母。酵母属(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，具有如期望的那样具有表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等的适宜载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括，尤其是，来自醇脱氢酶、异细胞色素C及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

除微生物外，还可以用哺乳动物组织细胞培养物来表达和产生本文所描述的多肽，并且在一些情况下是优选的(参见Winnacker,FromGenestoClonesVCHPublishers,N.Y.,N.Y.(1987))。对于一些实施方案，可以优选真核细胞，因为本领域已开发了许多适宜的能够分泌异源多肽(例如，完整的免疫球蛋白)的宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，该哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞是脊椎动物宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子为：用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCCCRL1651)；人胚肾细胞系(293或为在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12细胞系)；小鼠支持细胞；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138,ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51)；TRI细胞；MRC5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。

重组方法

感兴趣的重组多肽(在本文中也称为产物)，如抗体，可以使用例如美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物来产生。在一些实施方案中，提供了编码重组多肽(如抗体)的分离的核酸。这样的核酸可以编码包括抗体VL的氨基酸序列，和/或编码包括抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，提供了一种或多种包括这类核酸的载体(例如，表达载体)。在一些实施方案中，用这类核酸转化或转染宿主细胞以生成重组多肽表达细胞或产物细胞。在一个这类实施方案中，重组多肽表达细胞包括(例如，已被转化有)：(1)包括核酸的载体，所述核酸编码包括抗体VL的氨基酸序列和包括抗体VH的氨基酸序列，或(2)包括核酸的第一载体，所述核酸编码包括抗体VL的氨基酸序列，和包括核酸的第二载体，所述核酸编码包括抗体VH的氨基酸序列。

在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，提供了产生重组多肽的方法，其中所述方法包括在适合于产物表达的条件下培养重组多肽表达细胞，所述重组多肽表达细胞包括编码如上文所提供的产物的核酸，以及，任选地，从细胞(或细胞培养基)回收产物。

制成品

在本文所描述的方法中使用的多肽可以包含在制成品内。该制成品可以包括含有一种或多种多肽的容器。在一些实施方案中，该制成品包括：(a)包括组合物的容器，所述组合物在容器内包括本文所描述的一种或多种多肽；和(b)具有关于在测定方法中使用所述一种或多种多肽的说明的包装说明书。

制成品包括容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括，例如，瓶子、小瓶、试管等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。容器容纳或包含多肽组合物。组合物中的至少一种活性剂是多肽。标签或包装说明书指示该组合物在测定中的用途，具有关于量和孵育时间的具体指导。制成品还可以包括商业和用户立场希望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释液、过滤器

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合相结合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等效或类似目的的可选特征来代替。因此，除非另有明确声明，否则所公开的每个特征仅仅是通用的一系列等效或类似特征的例子。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的例子。应当理解，考虑到上文提供的一般描述，可以实践多种其它实施方案。

如下面的实施例和本文其它地方中所使用的，“PLB2”和“PLBL2”和“PLBD2”可以互换使用并且指的是酶“磷脂酶B-样2”或其同义词“磷脂酶B-结构域-样2”。

实施例

实施例1–一般方法

单抗原料

用于所有实施例的单抗原料选自Genentech(SouthSanFrancisco,CA,U.S.A.)的工业、中试或小规模细胞培养批次。一段时间的细胞培养发酵后，将细胞分离，并且，在某些情况下，通过蛋白A层析和如下面的实施例所指示的一个或多个额外的层析步骤和过滤步骤，来纯化澄清的液体(收获的细胞培养液，HCCF)。HCCF或纯化的多个步骤的生产中混合物被用来研究实施例3和实施例5中描述的ELISA测定的性能。使用实施例3的ELISA测定的结果在实施例4中进行描述，并且，使用实施例5的ELISA测定的结果在实施例6中进行描述。

用于单抗定量的分光光度法

使用紫外可见分光光度计(8453型号G1103A；AgilentTechnologies；SantaClara,CA,U.S.A.)，或NanoDrop1000型号ND-1000(ThermoFisherScientific；Waltham,MA,U.S.A.)，通过280nm和320nm处的吸光度来确定抗体的浓度。除抗体外的物质(即，杂质)的浓度很低，因此对紫外吸光度不具有明显影响。根据需要，用合适的非干扰性稀释剂稀释样品至范围为0.1–1.0吸光度单位。样品制备和紫外测量双份进行，并记录平均值。单抗吸收系数范围从1.42至1.645/mg·ml·cm。

用于产物定量(产物浓度测定)的亲和层析/HPLC法

产物浓度测定是用于测量结合蛋白A的多肽的亲和层析法。该方法可以使用HPLC作为进行亲和层析的手段。可以由该测定测量的产物包括任何含Fc的多肽，并且包括，例如，但不限于，单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，抗体片段(包括半抗体)，和免疫粘附素。在该方法中，使用含有固定的蛋白A(大约1mg)以及体积大约为0.1mL的亲和层析柱(2.1mm直径×30mm长度，20μm颗粒大小)。蛋白A亲和层析柱可以通过本领域已知的方法制造，并且也可以商购，例如，购自LifeTechnologies。将样品和四种不同IgG浓度的标准品在磷酸盐缓冲盐水加样缓冲液中施加到柱子上(20uL标准注射体积)。通常，样品是收获的细胞培养液(HCCF)，并且，用2％的乙酸/100mM甘氨酸(pH2.5)以2mL/分钟的流速从该柱子洗脱产物。将洗脱的物质的峰面积与四点IgG标准曲线峰面积进行比较，使用适当产物的消光系数，来计算产物分析物的量。测定的范围通常是0.025mg/mL-4.0mg/mL。按照以下公式确定产物浓度：mg/mLIgG＝HPLC值(mg/mL)×(标准物质的消光系数/样品物质的消光系数)。

总CHO宿主细胞蛋白(CHOP)定量

使用ELISA来对总宿主细胞蛋白(称为CHOP)的水平进行定量。用来检测产物中的CHO蛋白的ELISA基于夹心ELISA形式。将亲和纯化的CHOP的多克隆抗体包被在96孔微量滴定板上。然后将标准品、对照和样品一式两份加到不同的孔中。如果CHOP存在于样品中，它将与包被抗体(多克隆抗CHOP)结合。孵育步骤后，将缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗CHOP多克隆抗体加到板上。最终的洗涤步骤后，通过添加四甲基联苯胺(TMB)的溶液来定量CHOP，TMB也可以作为来自KPL,Kirkegaard&PerryLaboratories公司,Gaithersburg,MD的SUREBLUERESERVETM(目录号53-00-03)而可得，当HRP酶作用于它的时候，产生比色信号。在各孔中测量450nm处的光密度(OD)。使用五参数曲线拟合程序(Pro,MolecularDevices,Sunnyvale,CA)来生成标准曲线，并从标准曲线计算样品CHOP浓度。总CHOPELISA的测定范围是从5ng/ml至320ng/ml。以ng/mL计的CHOP浓度是指用CHOP标准品作为校准物的样品中CHOP的量。CHOP比率(以ng/mg或ppm计)是指CHOP浓度与产物浓度的所计算的比率，并且，在某些情况下，是用于测试方法的报告值。总CHOPELISA可用于定量样品中的总CHOP水平，但不定量个别蛋白质的浓度。

市售PLBL2ELISA测定试剂盒

我们测试了市场上销售的、以检测PLBL2为目的的两种市售试剂盒中的任一种是否能够检测重组抗体制品中的PLBL2，并且，如果能，它们是否将提供足够的量化。所测试的第一个试剂盒是来自USCNLifeScience公司的人磷脂酶B(PLB)的ELISA测定试剂盒E92048Hu。该试剂盒被描述为用于体外定量测量人组织匀浆和其它生物流体中的PLB的夹心ELISA。在该测定中测试的样品包括仓鼠PLBL2的一种已知阳性来源(从CHO细胞纯化的重组抗体制品)，其中PLBL2杂质的水平已经使用质谱测定(下面进一步描述)确定为大约300ng/mg。从CHO细胞纯化并且已知不具有可检测PLBL2的第二种重组抗体制品也进行了测试。虽然所生成的标准曲线显示检测包括在试剂盒中的人PLBL2标准品范围在0.3-20ng/ml(图1A)，但是没有检测到测试样品的反应性。在10mg/mL处(等同于阳性样品中大约3,000ng/mLPLBL2)和从10mg/mL下降到大约1.3mg/mL(相当于阳性样品中375ng/mLPLBL2)的四次2倍连续稀释中，测试两种抗体制品。两种抗体制品在所有稀释中给出了相同的结果，OD值大约为0.1AU，例如，背景。已知包含仓鼠PLBL2的样品和已知不包含该杂质的样品之间没有差异。随着样品稀释，不存在差异，这表明没有定量我们的样品中的仓鼠PLBL2的能力。我们得出的结论是，该试剂盒中的抗体不能识别我们的样品中的仓鼠PLBL2杂质。

所测试的另一种试剂盒是来自CUSABIO、目录CSB-EL018125Ha的仓鼠推定磷脂酶B-样2(PLBD2)ELISA试剂盒。该试剂盒声称提供血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解物中的仓鼠推定磷脂酶B-样(PLBD2)浓度的定量确定。与在USCNLifeScience公司试剂盒中所测试的样品相同的样品也在该试剂盒中进行测定。虽然所生成的标准曲线显示检测包括在试剂盒中的仓鼠PLBL2标准品范围在0.12-8ng/ml(图1B)，但是没有检测到测试样品的反应性。如上文所描述的，在10mg/mL处(等同于阳性样品中大约3,000ng/mLPLBL2)和从10mg/mL下降到大约625μg/mL(相当于阳性样品中188ng/mLPLBL2)的五次2倍连续稀释中测试两种抗体制品。两种抗体制品在所有稀释中给出了相同的结果，OD值大约为0.4AU，例如，背景。已知包含仓鼠PLBL2的样品和已知不包含该杂质的样品之间没有差异。随着样品稀释，不存在差异，这表明没有定量我们的样品中的仓鼠PLBL2的能力。我们得出的结论是，该试剂盒中的抗体不能识别我们的样品中的仓鼠PLBL2杂质。

因此，我们得出结论，这些市售测定不能定量已知关于仓鼠PLBL2是阳性的样品中的仓鼠PLBL2。一种解释是，这些测定中的抗PLBL2抗体对于我们的样品中所见的仓鼠(CHO)-PLBL2亲和力低。另一种解释是，当CHO-PLBL2出现在包含高水平重组人IgG的样品基质中时(正如我们的样品中那样)，这些抗PLBL2抗体不能检测所述CHO-PLBL2。这些结果表明，需要开发新的抗PLBL2抗体和新的测定条件，以使得能够检测和准确定量我们的重组抗体制品中的PLBL2杂质。这些努力在以下实施例中描述。

实施例2–产生结合仓鼠PLBL2的抗体

将PLBL2鉴定为抗体制品中的杂质促使我们合成基因，并随后表达和纯化仓鼠PLBL2。有关PLBL2的文献将其描述为一种分子量大约为66kD的溶酶体酶(F.Deuschl等人,FEBSLett580:5747-5752(2006))。与其它溶酶体酶一样，该蛋白质含有具有甘露糖-6-磷酸的多个翻译后修饰，并且，其最初合成为前原酶。在处理过程中，前导序列被剪去，并且，发生蛋白水解剪切，导致该蛋白质在SDS-PAGE凝胶上跑出三个条带：完整PLBL2(MW66kD)、N-末端结构域(28kD)和C-末端结构域(40kD)。剪切发生于酸性pH水平。虽然N-结构域和C-结构域在SDS-PAGE上是分开的，这些片段在天然条件下可能不分开，因为我们已经观察到需要强溶剂(例如，尿素，胍，或乙醇)来分开这些片段。此外，已经纯化PLBL2用于结晶学研究的其他实验室也已经观察到该剪切并且无法用层析法从剪切的蛋白质中分离完整蛋白质(F.Deuschl等人,FEBSLett580:5747-5752(2006)；A.Jensen等人,BiochemJournal402,449-458(2007),F.Lakomek等人,BMCStructuralBiology9:56(2009))。

根据公开可得的序列信息(参见下文关于示例性核酸和氨基酸序列的序列表)合成编码可溶性仓鼠(灰仓鼠(Cricetulusgriseus))PLBL2的DNA，并使用本领域已知的典型方法克隆到标准哺乳动物表达载体中，包括添加组氨酸(his)标签。在CHO-K1细胞(CRL9618^TM)中瞬时表达可溶性PLBL2。收获细胞培养物上清(称为HCCF)并使用如下方法纯化PLBL2。

用10kDa分子量截留(MWCO)膜，通过正切流动过滤(TangentialFlowFiltration，TFF)将收获的细胞培养液(HCCF)超滤(UF)10倍。将UFHCCF对10倍体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、NaCl缓冲液渗滤(DF)。将UF/DFHCCF施加到Ni-NTA固定化的金属亲和层析(IMAC)柱(QIAGEN，目录号30622)上，并且用递增的咪唑梯度洗脱。用包含硫酸钠的缓冲液调节Ni-NTA池，并随后施加到辛基琼脂糖凝胶(Octyl-Sepharose)CL-4B疏水相互作用层析(HIC)柱(GEHealthcareLifeSciences，产品编号17-0790-01)。用递减的硫酸钠梯度洗脱该辛基琼脂糖凝胶柱。在Ni-NTA柱上重新层析辛基琼脂糖凝胶池，并且用高浓度咪唑分步洗脱。用装备有10kDa分子量截留膜(Millipore)的离心过滤单元浓缩Ni-NTA再层析混合物。在Superdex200尺寸排阻层析(SEC)柱(GEHealthcareLifeSciences，产品编号17-1043-02)上配制经浓缩的Ni-NTA再层析混合物。收集来自Superdex200柱的级分，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高压液相色谱(HPLC)进行分析，并通过WesternBlot法(使用抗总中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)抗体(Genentech公司)，以及针对磷脂酶B2的市售抗体)来确定纯度。

为了产生单克隆抗体，用佐剂中的纯化的重组可溶性PLBL2按3-4天的时间间隔在各脚垫中和腹膜内免疫五只Balb/c小鼠(CharlesRiverLaboratoriesInternational公司,Hollister,CA)，所述佐剂含有可代谢角鲨烯(4％v/v)、吐温80(0.2％v/v)、海藻糖6,6-二霉菌酸酯(0.05％w/v)和单磷酰脂质A(0.05％w/v；所有组分均获自SigmaAldrich,USA)。6次注射后，通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来评价血清滴度，以鉴定具有针对PLBL2的阳性血清滴度的小鼠。有两只小鼠显示了最高滴度，通过电融合(Hybrimune；HarvardApparatus公司,Holliston,MA)将来自这两只小鼠的脾脏和淋巴结的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。7天后，通过使用Clonepix-FL(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)挑选大约5000个克隆到含有杂交瘤培养基的96孔组织培养板内。收获杂交瘤上清液，并通过直接ELISA筛选PLBL2特异性抗体产品。通过ELISA显示出特异性结合PLBL2蛋白的25个克隆基于它们的亲和力进一步排序，所述亲和力通过(ForteBio公司,MenloPark,CA)测量。将小鼠杂交瘤上清液在动力学缓冲液(ForteBio公司,MenloPark,CA)中稀释至5μg/ml，或者不经稀释地使用(如果浓度低于5mg/ml)，并捕获于抗小鼠IgG(Fv)传感器尖端(ForteBio公司,MenloPark,CA)上，然后将传感器浸入10μg/ml的PLBL2蛋白中。通过使用ForteBio数据分析软件来确定缔合和解离动力学测量值。通过Westernblot进一步表征所有25个克隆与C端、N端和完整PLBL2的结合。显示与C或N端或完整PLBL2蛋白的免疫结合的克隆1.26G6、1.20B5、1.19C10、1.15G11、1.4E2、1.39C10和1.30F3的杂交瘤细胞上清液通过亲和层析(MabSelectSuRe；GEHealthcareBio-Sciences,Piscataway,NJ)进行纯化，无菌过滤，并在PBS中保存于4℃。这7株抗体中高产的4个被选出用于生物素化。通过Octet确认生物素化的抗体和未生物素化的抗体的结合活性。然后，关于ELISA测定的研发中的可能用途评价纯化的抗体。两株抗体，1.19C10和1.15G11，被选出用于ELISA测定的研发。

使用Isostrip小鼠单抗分型试剂盒(IsostripMousemAbIsotypingKit)(RocheAppliedBiosciences,Indianapolis,IN)，鉴定出抗体1.19C10和1.15G11均为IgG1、κ。在293细胞或CHO细胞中克隆并瞬时表达编码这些抗体中的每一个的DNA。为了获得来自克隆1.15G11和1.19C10的抗体可变序列用于在CHO细胞中瞬时表达，使用cDNA末端的5’快速扩增(5’RACE)方法，其基于以前所描述的那些方法(参见，例如，NatureMethods2,629-630(2005)和"Rapidamplificationof5'cDNAends,"收录于MolecularCloning:ALaboratoryManual(编辑：Sambrook,J.&Russell,D.W.)第8章规程9，8.54-8.60(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,USA,2001))。用RNeasyPlus试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从培养的杂交瘤细胞(至少10⁶个细胞)中提取总RNA，并且用SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒(Clontech公司,MountainView,CA)制备cDNA。为了扩增重链和轻链的可变区，在聚合酶链式反应(PCR)中分别使用靶向cDNA5’端寡核苷酸标签的通用引物A混合物(包含在SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒中)和靶向小鼠IgG重链和κ轻链的恒定区的反向引物。PCR条件设定如下：1μLcDNA，5μL10×通用引物混合物，1μL10uM反向引物，45μLPCR预混合液(LifeTechnologies公司,FosterCity,CA)；94℃，2分钟，然后94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环，以及72℃10分钟。在DNA琼脂糖凝胶中解析PCR产物，并且，从凝胶中纯化预期大小(重链为700bp，并且，轻链为500bp)的PCR产物，用于测序分析，以确定重链和轻链可变区(VH和VK)的DNA序列。

为了将上文所描述的VH/VK区域克隆入抗体表达载体，我们使用了克隆方法(Clontech公司)和下列引物：1.15G11重链，正向引物5’-ACTGGAGCGTACGCTGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCT-3’(SEQIDNO.:23)，反向引物5’-AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC-3’(SEQIDNO.:24)；1.19C10重链，正向引物5’-ACTGGAGCGTACGCTGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCA-3’(SEQIDNO.:25)，反向引物5’-AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3’(SEQIDNO.:26)。对于1.15G11和1.19C10两者的轻链，正向引物5’-GCAACTGCAACCGGTGTACATTCAGACATTGTGATGACCCAGTCT-3’(SEQIDNO.:27)，反向引物5’-GGTGCAGCCACGGTCCGCTTCAGCTCCAGCTTGGTACC-3’(SEQIDNO.:28)。使用1μL的cDNA作为前述相同条件下的PCR中的模板。然后，用PCR净化试剂盒(Qiagen公司)纯化PCR产物，用于亚克隆入抗体表达载体。用BsiWI和ApaI消化使小鼠IgG1表达载体线性化，并且，用AgeI和BssHII消化小鼠κ表达载体。对于克隆反应，将50ng线性化载体DNA和50ngVH或VKPCR产物连同酶混合在一起，并随后在50℃下孵育15分钟。3μL的反应物用于转化，并且涂布在羧苄青霉素(50μg/mL)选择性LB琼脂平板上。挑取单克隆并培养，用于质粒DNA纯化。用序列分析鉴定具有符合读框的VH或VK插入片段的克隆。

如上文所述纯化重组抗体并与纯化的杂交瘤衍生的抗体进行比较，并通过直接ELISA和(ForteBio公司,MenloPark,CA)(如上文所述进行测定)两者均发现它们是可比较的。如上文所述产生的重组抗体分别被称为19C10和5G11。在序列表中提供了关于19C10和5G11的氨基酸序列信息。

为了产生多克隆抗体，用佐剂中的纯化的重组PLBL2(如上文所述)按两周时间间隔在颈背处皮下免疫三只无血清病原体的新西兰白色雌兔(AntibodySolutions,MountainView,CA)，所述佐剂含有水凝胶和胞壁酰二肽(MDP)。每次注射含有150ug的纯化的重组可溶性PLBL2。在第0、21、49、63、84和112天共施加6次注射。每只兔子在第42、70、77、91、98、119和126天共采血7次以测试抗体滴度。在第134天对兔子进行放血。作为对照，来自每只兔子的免疫前血清在第0天于注射前采集。

为了确定抗体对PLBL2的反应性，在溶液相捕获方法中使用抗血清。在溶液相捕获方法中，来自三只不同的兔子(兔子A、B和C)的免疫前血清和抗血清从1/1000的初始稀释度连续稀释。将稀释的血清与3ug/mL的固定浓度的生物素化PLBL2在非结合96孔板中孵育2小时。然后，将溶液转移到具有Superblock封闭缓冲液(Pierce产品编号15129)的PierceNeutrAvidin包被的干净96孔板中，并且孵育1小时以捕获生物素化的PLBL2。孵育步骤后，用洗涤缓冲液(0.05％聚山梨醇酯20/PBS[CorningCellgro目录号99-717-CM])将未结合的物质洗去。将缀合过氧化物酶的AffiniPure山羊抗兔IgG(JacksonImmunoresearch目录号111-035-144)在测定稀释液中按1/20,000稀释因子稀释，并加到微量滴定板的孔中。在室温下与缀合过氧化物酶的山羊抗兔IgG的2小时孵育步骤后，用洗涤缓冲液(上述)进行最终洗涤步骤。随后，通过加入TMB溶液(50ul/孔)(SUREBLUERESERVE^TM，来自KPL，Kirkegaard&PerryLaboratories公司，Gaithersburg,MD,目录号53-00-03)并随后在室温下孵育10-20分钟进行显色。通过使用MolecularDevicesSpectraMaxM5e评估各孔中的450nm处的光密度(OD)进行检测。使用五参数曲线拟合程序(SoftMaxProv5.2revC)来处理数据。

基于上述溶液相捕获实验，发现来自所有三只兔子的抗血清已产生良好品质的针对PLBL2的抗体。所有三只兔子的免疫前血清不具有针对PLBL2的亲和力。由于所有三只兔子对PLBL2具有类似的响应曲线，所有三只兔子放血得到的抗血清被合并成一批，用于多克隆PLBL2ELISA测定(下文在实施例5中描述)。

首先，用60％硫酸铵对合并的兔抗血清进行分离，其将血清中的所有抗体沉淀下来。使用亲和层析选择所产生的针对PLBL2的抗体。将PLBL2固定在甘油基-CPG上，并将该凝胶填充到层析柱内。将60％硫酸铵沉淀物溶解于pH7.2的PBS中，并加载到PLBL2-CPG柱中。加载完成后，用pH7.2的PBS+0.02％NaN₃洗涤该柱。用pH2.0的PBS从亲和柱洗脱针对PLBL2的抗体，将洗脱混合物收集到pH7.5-8.0的1.0MTris溶液中。最后，用尺寸排阻色谱将纯化的抗PLBL2抗体进行浓缩，并随后更换缓冲液到pH7.2的PBS+0.02％NaN₃中。将亲和纯化的兔多克隆抗体用在下文的实施例5中所描述的多克隆PLBL2ELISA中。

实施例3–鼠单克隆抗仓鼠PLBL2ELISA测定

开发了检测和定量重组多肽样品(如重组抗体或免疫粘附素制品)中的CHOP杂质PLBL2的ELISA测定。程序如下：将碳酸盐缓冲液(0.05M碳酸钠，pH9.6)中的浓度为0.5μg/mL的鼠单克隆抗体19C10包被到半区域96孔微量滴定板上，2-8℃下过夜。包被后，用封闭缓冲液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨醇酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich]；也称为测定稀释液)封闭该板以防止蛋白质的非特异性粘附。在测定稀释液(0.15MNaCl,0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨醇酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich])中稀释标准品、对照和样品，然后一式两份加载到不同的孔中，并在室温(22-27℃)下孵育2小时。PLBL2(如果存在于样品中)将结合至包被(在本文中也称为，捕获)抗体。上述孵育步骤后，用洗涤缓冲液(0.05％聚山梨醇酯20/PBS[Corningcellgro目录号99-717-CM])洗去未结合物质，并且，在测定稀释液中将缀合生物素的15G11抗PLBL2鼠单克隆抗体稀释到浓度为0.03125μg/mL，并加到微量滴定板的孔中。

生物素缀合如下进行。生物素化试剂盒购自PierceThermoScientific，(P/N20217,E-ZLinkNHS-Biotin)，并且，链霉亲和素-HRP(SA-HRP)购自JacksonImmuno，目录号016-030-084。按照Pierce试剂盒中的使用说明进行操作。简单地说，将IgG透析到pH7.4的PBS中，并将生物素加到蛋白质中并在室温下混合1小时。然后，标记的抗体针对pH7.4的PBS进行透析，以去除过量的生物素，过滤，并通过A280确定蛋白质浓度。

在室温下与生物素化的15G11的2小时孵育步骤后，链霉亲和素HRP(在测定稀释液中1:200,000稀释)被加到微量滴定板的孔中。用洗涤缓冲液(上述)的最终洗涤步骤后，通过加入TMB溶液(50μl/孔)(SUREBLUERESERVE^TM来自KPL,Kirkegaard&PerryLaboratories公司,Gaithersburg,MD,目录号53-00-03)并随后在室温下孵育10-20分钟进行显色(用于PLBL2定量)。通过使用MolecularDevicesSpectraMaxM5e评估各孔中的450nm处的光密度(OD)进行检测。使用四参数曲线拟合程序(SoftMaxProv5.2revC)生成标准曲线，并由标准曲线的线性范围计算样品PLBL2浓度。

如图2所示，使用19C10和15G11单克隆抗体的PLBL2测定具有用4-pt参数拟合的S形曲线。标准曲线的线性范围内的值用来计算名义PLBL2(ng/mg或ppm)。线性范围大约是EC₁₀–EC₈₅或1.5–40ng/mL，因该范围在板与板之间略有不同。用该ELISA对于PLBL2所得到的值与其它方法(例如，LC-MS/MS、多克隆PLBL2ELISA或总CHOPELISA，当稀释到测定的LOQ时[参见表3和表4])所得的估计值是可比较的。

实施例4–使用单克隆PLBL2ELISA测定的结果

使用上文实施例3中所述的仓鼠PLBL2ELISA测定，我们评估了CHO细胞中产生的多种单克隆抗体(mAb)制品，以定量不同条件下污染性PLBL2的量。我们评估了多次运行的纯化制品以及未纯化的收获的细胞培养液(HCCF)。为了比较，在某些情况下，我们还通过LC-MS/MS定量了PLBL2肽的量。LC-MS/MS方法如下进行。

对于通过LC-MS/MS定量PLBL2，使用WatersAcquityH-ClassBioUPLC和ABSciexTripleTOF5600+质谱仪。还原并通过胰蛋白酶消化样品和校准标准品(重组PLBL2掺入获自小鼠NS0细胞系[NS0细胞系不包含仓鼠PLBL2]的重组人源化单克隆抗体制品中)。将总共40μg消化的样品注入UPLC，使用WatersBEH300C18柱，粒径1.7μm。用线性梯度的乙腈洗脱肽，流速为300μl/min并且柱温为60℃。

从UPLC洗脱的肽以正电离模式通过电喷雾离子化被引入质谱仪。离子源温度设定为400℃，离子喷雾(IonSpray)电压为5500v，并且，去簇电压为76v。碰撞能量设置为32，用于所选肽离子的破碎。质谱仪以多反应监测高分辨率(MRM^HR)模式操作，使用四个特异性的PLBL2肽和它们的碎片离子过渡。由具有1.2amu的质荷(m/z)选择窗口的四极质谱仪选择亲本离子。通过飞行时间质谱仪分离各亲本离子的碎片离子，并用0.025amu的选择窗口选择用于数据采集后的量化。

通过测量四个过渡的特异性信号响应(其使用线性拟合由来自范围为2-500ppm的标准品的那些进行校准)来确定样品中的PLBL2浓度。下面的表2示出了由LC-MS/MS监测的PLBL2肽的列表。由LC-MS/MS监测的各肽的代表性标准曲线示出于图3。

表2.由LC-MS/MS监测的PLBL2肽的列表

下面的表3和表4示出了两种不同的单抗制品(MabA和MabB)的多个纯化运行中的PLBL2比率，其通过LC-MS/MS和通过实施例3中所描述的仓鼠PLBL2ELISA测定这两者确定。正如上文所述的CHOP比率，PLBL2比率被提供为ng/mg或百万分数(ppm)，并且是指PLBL2浓度与产物(单抗)浓度的所计算的比率。表3和表4中示出的结果表明PLBL2ELISA测定能够在宽范围内和在不同的纯化过程中对两种不同的单抗制品中的PLBL2水平进行定量(每个运行编号表示不同的纯化过程)。

表3.多个批次的MabA中的PLBL2比率

表4.多个批次的MabB中的PLBL2比率

我们还评估了实施例3中所描述的PLBL2ELISA测定确定多种单抗制品的未纯化HCCF中的污染性PLBL2水平的能力，在所述单抗制品中，其中一些是IgG1并且其中一些是IgG4。那些结果示出于图4。从图4可见，PLBL2ELISA测定能够对HCCF中宽范围的PLBL2进行定量。虽然不同的单抗HCCF样品之间PLBL2水平实质不同，重复的HCCF制品(运行)中对于任何给定单抗的再现性较好。我们没有观察到同种型(IgG1或IgG4)和HCCF中的PLBL2水平之间有任何清楚的关联(数据未示出)。

另外，使用实施例3中所描述的单克隆PLBL2ELISA测定，我们评估了通过具有最终超滤/渗滤(UFDF)MabG的步骤的三柱层析纯化过程的PLBL2清除。结果示出于图5。PLBL2水平在HCCF中最高，并且纯化过程有效地从最终的MabG制品去除PLBL2。单克隆PLBL2ELISA测定显示出良好的灵敏度和特异性，并且有效定量未纯化的HCCF中以及纯化各阶段的PLBL2水平。我们在多种产物稀释度中观察到线性，这表明单克隆PLBL2ELISA测定不具有我们在总CHOP测定中观察到的“抗原过量”问题。

实施例5–兔多克隆抗仓鼠PLBL2ELISA测定

开发了一种对重组多肽样品(如重组抗体或免疫粘附素制品)中的CHOP杂质PLBL2进行检测和定量的ELISA测定。程序如下。将碳酸盐缓冲液(0.05M碳酸钠，pH9.6)中的浓度为0.5ug/mL的亲和纯化的兔多克隆抗体包被到半区域96孔微量滴定板上，2-8℃下过夜。包被后，用封闭缓冲液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨醇酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich])封闭该板以防止蛋白质的非特异性粘附。在测定稀释液(0.15MNaCl，0.1M磷酸钠，0.1％鱼明胶，0.05％聚山梨醇酯20，0.05％300[Sigma-Aldrich])中稀释标准品、对照和样品，然后一式两份加载到不同的孔中，并在室温(22-27℃)下孵育2小时。PLBL2(如果存在于样品中)将结合至包被(在本文中也称为捕获)抗体。上述孵育步骤后，用洗涤缓冲液(0.05％聚山梨醇酯20/PBS[Corningcellgro目录号99-717-CM])洗去未结合物质，并且，在测定稀释液中将缀合辣根过氧化物酶(HRP)的亲和纯化的兔多克隆抗体稀释到浓度为40ng/mL，并加到微量滴定板的孔中。

HRP缀合如下进行。HRP缀合试剂盒购自PierceThermoScientific，(P/N31489,E-ZLinkPlus活化过氧化物酶和试剂盒)。按照Pierce试剂盒中的使用说明进行操作。简单地说，将IgG透析到pH9.4的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，并将E-ZLinkPlus活化过氧化物酶加到蛋白质中并在室温下混合1小时。随后加入氰基硼氢化钠和淬灭缓冲液以稳定缀合和淬灭反应。然后，标记的抗体针对pH7.4的PBS进行透析，过滤，并通过A280确定蛋白质浓度。

在室温下与缀合HRP的兔多克隆抗体的2小时孵育步骤后，用洗涤缓冲液(上述)进行最终洗涤步骤。然后，通过加入TMB溶液(50ul/孔)(SUREBLUERESERVE^TM来自KPL,Kirkegaard&PerryLaboratories公司,Gaithersburg,MD,目录号53-00-03)并随后在室温下孵育10-20分钟进行显色(用于PLBL2定量)。通过使用MolecularDevicesSpectraMaxM5e评估各孔中的450nm处的光密度(OD)进行检测。使用五参数曲线拟合程序(SoftMaxProv5.2revC)生成标准曲线，并从标准曲线的线性范围计算样品PLBL2浓度。

如图6所示，使用亲和纯化的兔多克隆抗体的PLBL2测定具有用5-pt参数拟合的S形曲线。标准曲线的线性范围内的值用来计算名义PLBL2(ng/mg或ppm)。测定的定量范围是0.5-50ng/mL。用该ELISA获得的PLBL2的值与通过其它方法(例如，鼠单克隆PLBL2ELISA、LC-MS/MS或总CHOPELISA，当稀释到测定的LOQ时)所得的估计值是可比较的。

实施例6-使用多克隆PLBL2ELISA测定的结果

我们使用实施例5中所描述的多克隆PLBL2ELISA测定，评估了通过具有MabG的最终超滤/渗滤(UFDF)步骤的三柱层析纯化过程的PLBL2清除。结果示出于图7。正如用单克隆PLBL2ELISA测定所观察到的，PLBL2水平在HCCF中最高，并且纯化过程有效地从最终的MabG制品去除PLBL2。多克隆PLBL2ELISA测定显示出良好的灵敏度和特异性，并且能够有效定量未纯化HCCF中以及纯化各阶段的PLBL2水平。我们在多种产物稀释中观察到线性，这表明PLBL2ELISA测定不受“抗原过量”问题的困扰，我们在总CHOP测定中观察到该问题。

另外，我们在MabA的七次不同运行(包括不同的纯化阶段，如表5所示)和MabB的一次运行中比较了用单克隆测定检测的PLBL2量和用多克隆测定检测的PLBL2量。结果列于表5。可以看出，用各测定获得的结果之间的相对％差异表明两种测定得到可比较的结果。

表5.单克隆PLBL2测定结果与多克隆PLBL2测定结果的比较

相对％差异＝[(Mab-pAb)/((Mab+pAb)/2)]*100

结论

合起来，这些数据表明，本文所描述的单克隆和多克隆PLBL2ELISA测定中的每一种都是健壮的、特异的和灵敏的。我们已经显示每一种测定都能够准确定量表现出宽范围PLBL2水平和各种纯化条件下的许多不同单抗制品中的污染性仓鼠PLBL2CHOP。我们还显示了PLBL2ELISA测定可以用来在纯化过程的每个步骤期间监测杂质清除。因此，本文所描述的单克隆和多克隆PLBL2ELISA测定中的每一种均是用于监测纯化过程发展期间的清除以及用于定量最终产品中的PLBL2水平的有效工具。

实施例7–使用PLBL2ELISA测定筛选或选择细胞系

如上面所讨论以及如图4中所示出的，我们在不同的单抗生产细胞系之间观察到HCCF中PLBL2水平的实质性差异，其中一些与其它相比具有高达20倍的PLBL2水平。这样的实质性差异表明，理想的是，鉴定例如在HCCF中产生低水平PLBL2的生产细胞系和甚至可能宿主细胞系(即，不产生任何产物的宿主细胞)，从而降低下游纯化过程的负担。关于产物细胞系，理想的是，鉴定同时产生高量产物和低量PLBL2的细胞系。关键问题是，筛选产物细胞系的不同克隆以选出产生高量产物和低量PLBL2的克隆是否是可能或可行的。

在生成下文所述结果之前，我们不认为这种克隆选择策略是可行的。这是因为，我们假设在不同产物系之间所观察到的PLBL2水平差异(参见图4)是所产生的产物(例如，单抗)的特定特征的结果。例如，我们预期，MabA细胞系的所有克隆将产生大致相当的PLBL2水平，并且，该水平将实质性地高于由MabG细胞系的所有克隆产生的PLBL2水平(参见图4)。该假设与我们关于多种单抗产物细胞系的先前经验是一致的，其中我们已经观察到某些单抗产物细胞系相对于产生不同单抗的细胞系来说产生更高水平的单抗，即，单抗生产看上去依赖于所产生的单抗的特性。此外，我们预期具有高生长性和生存力谱的细胞系将具有更高效的蛋白质生产机械，并因此将不但关于特定单抗也关于PLBL2水平都具有更高生产力。简单地说，我们因此预期，跨任何特定产物细胞系的不同克隆，PLBL2与产物的比例从一个克隆到另一个克隆将相对一致。

为了探索低PLBL2/高产物浓度克隆选择策略的可行性，我们采用上述方法来测量来自六个不同重组蛋白产物CHO细胞系(产物J、产物K、产物L、产物M、产物N和产物O)的多个克隆系的第14天HCCF样品中的PLBL2水平、总CHOP水平和产物浓度。来自关于各克隆细胞系的一式两份2L生物反应器培养物的结果示出于图8。正如所预期的，跨特定产物细胞系的克隆的产物浓度从一个到另一个没有实质性变化，并且，跨特定产物细胞系的克隆的产物浓度平均水平看上去依赖于所产生的产物。例如，产物N的最高生产者(图8E)的产物浓度比产物L的最高生产者(图8C)至少高1.5倍。

然而，令人惊讶的是，关于上述产物浓度的观察对于PLBL2水平来说并非如此。如在图8中可以看出，特定产物细胞系的不同克隆之间的PLBL2水平有实质性变化，并且，在六个不同的产物细胞系中的每一个中均能看到这种克隆变化性。换句话说，产物浓度和PLBL2水平之间不存在强相关性。例如，如图8E所示(产物N)，产物N细胞系的克隆系1-4中的每一个产生类似的产物浓度，范围为大约3.5-4.5g/L，然而，它们产生的PLBL2浓度相差超过5倍(范围为大约0.75mg/L至大约4.5mg/L)。从图8E示出的结果可以清楚地得知，与其它产物N细胞系中的任一个相比，产物N细胞系3号产生最少的PLBL2水平和最高的产物浓度，这指示了选择具有这些期望属性的产物克隆的可行性。此外，该结果显示了这种评估PLBL2和产物浓度并选择产生低PLBL2水平和高产物浓度的产物克隆的选择策略的普遍适用性。

执行这种选择策略的有效性可以例如通过检查产物L克隆细胞系的结果(图8C)看出。所有克隆细胞系都是相对低的产物生产者，然而，PLBL2水平却有实质性差异。如果产物浓度是筛选所针对的唯一属性，人们可能会选择产物L细胞系6号，因为它产生最高产物浓度。然而产物L细胞系6号同样产生比任何其它克隆实质更高的PLBL2，在一些情况下，超过3倍更高水平。在期望所选出用于放大和进一步开发工作的产物细胞系中的PLBL2水平最小化的情况下，PLBL2水平的额外筛选由此变得重要，并使得能够选择具有低PLBL2和高产物浓度的期望的组合属性的产物细胞系。

分析图8中所呈现的数据的另一种方式是计算PLBL2水平与产物浓度的比率。我们对上文关于图8所讨论的各细胞系计算了这样的比率，并如图9所示将数据绘图。从图9中所示数据可以看出，来自特定产物细胞系的克隆细胞系产生的PLBL2/产物浓度比率的变化高达2-10倍。

这样的分析允许快速比较跨特定产物细胞系的多个克隆细胞系的期望属性，并简单选择具有最低比率的细胞系，即，最低水平的PLBL2和最高水平的产物浓度。例如，对于产物L，从图8C所示数据并不清楚哪个细胞系编号产生最低水平的PLBL2和最高的产物浓度。然而，图9C所示数据(其呈现PLBL2/产物浓度比率)清楚地显示了产物L细胞系1号具有最低比率并因此具有期望的属性的最佳组合。

为了进一步研究跨特定产物细胞系的多个克隆细胞系的变化性程度，我们分析了表达产物P的48个不同的重组CHO细胞系。产物P的48个细胞系中的每一个的PLBL2/产物比率示出于图10。跨这48个不同的产物P细胞系，PLBL2/产物比率变化高达10倍。另外，快速回顾图10所示数据指示产物P细胞系34号具有最低比率，从而强调了可以选择具有低PLBL2和高产物浓度的期望的属性的产物细胞系的容易性。

接下来，通过测量来自上述48个产物P细胞系的摇瓶培养物的第14天HCCF样品中的总CHOP水平、PLBL2水平和产物浓度，我们研究了PLBL2浓度和产物浓度之间的关联的明显缺乏。使用该涉及单个产物的实质上更大的数据集，我们可以更精确地定量这三个测量结果之间的关联。图11A显示，PLBL2浓度和产物浓度之间具有弱线性关联：与线性回归相关的决定系数(R²)低(<0.12)。这种弱关联表明选择相对于其它细胞系来说具有高重组蛋白生产率和低PLBL2水平的期望性状的细胞系的可行性。与之形成对照，图11B显示，总CHOP浓度和产物浓度之间具有中等强度线性关联(R²>0.45)。该关联与我们的初始假设一致，即一般而言，关于期望的产物是高生产性的细胞系很可能关于宿主细胞蛋白也是高生产性的，因为预期它们生长良好、保持高生存力并具有强劲的蛋白质生产机械。图11C显示的PLBL2浓度和总CHOP浓度之间缺乏强线性关联(R²<0.29)是一个令人惊讶的发现。因为PLBL2是单个CHOP种类，我们曾预期，产生更多的总CHOP的细胞系将同样产生更多的PLBL2使得PLBL2与总CHOP的比率跨不同的细胞系将保持相对一致。跨48个细胞系的HCCF中，PLBL2和总CHOP水平之间未预料到的缺乏强正关联表明，不能依靠总CHOP测量作为PLBL2测量的替代。因此，不能假定具有低的总CHOP水平的细胞系也将具有低的PLBL2水平。因此，直接测量HCCF中的PLBL2对于选择具有低PLBL2水平的细胞系来说重要。

为了确定不同的CHO宿主细胞系是否产生不同水平的PLBL2，以及，为了区分重组蛋白对细胞培养物中的PLBL2水平的影响的任何差异，我们使用PLBL2ELISA来测量不表达任何产物基因的三种不同的CHO宿主细胞系(宿主1、宿主2和宿主3)的2L生物反应器培养物中的PLBL2水平。使用Vi-CellXR(目录号731050,BeckmanCoulter公司,Brea,CA,USA)分析这些生物反应器培养物(也称为空白运行，因为不生成任何产物)的活细胞密度和生存力。在整个培养期间，还通过在KIMAX校准沉降管(目录号45225-10,KimbleChase,Vineland,NJ,USA)中离心(820g，10分钟)培养物样品，基于细胞压积(PCV)来评估细胞生长。对于这些空白运行，我们测量了HCCF和全细胞培养液(WCCF)两者中的PLBL2水平。WCCF样品由细胞和HCCF这两者组成。因此，WCCF样品中测量的PLBL2水平反映了培养物中PLBL2的总的细胞内和细胞外浓度的组合。使用PLBL2ELISA测定，我们定量了三种CHO宿主细胞系中关于HCCF(图12A)和WCCF(图12B)中的PLBL2谱的差异。通过这种方式，我们鉴定出宿主1产生最高水平的PLBL2，HCCF中和WCCF中均是如此。相比之下，我们将宿主3鉴定为在收获时间(第14天)产生最低水平的PLBL2的CHO细胞系。

虽然宿主3在HCCF和WCCF两者中产生整体最低水平的PLBL2，所有三种CHO宿主细胞系显示出不同的生长谱(数据未示出)。因此，为了消除细胞生长的差异对PLBL2水平的影响，我们通过以每天为基础将PLBL2生产对活细胞体积进行归一化，进一步分析了这三种细胞系。为了计算宿主1、宿主2和宿主3中的细胞特定的PLBL2生产率，我们将PLBL2浓度对相应的体积性积分的活细胞压积(IVPCV)绘图。为了使来自细胞死亡和相关的细胞溶解所致的PLBL2释放的复杂化最小，我们将数据的使用限制为其中培养物生存力超过70％。由线性回归所得的结果斜率提供了细胞特定的PLBL2生产率的估计值，其单位为每天每单位活细胞体积的PLBL2mg数。如图13所示，宿主1的线性回归的斜率最高，而宿主3最低，进一步表明宿主3每天每单位活细胞体积平均产生的PLBL2少若干倍，无论测量是使用HCCF(图13A)或WCCF(图13B)得到。基于这些发现，人们可以优先选择产生低PLBL2的宿主(如宿主3)作为CHO亲本宿主用于稳定转染，以生成生产细胞系。这样的方法可以产生与基于其它CHO宿主细胞的重组细胞系相比也显示较低PLBL2水平的稳定转染的重组细胞系。

上文所讨论的结果表明，本文所述的PLBL2ELISA测定可用于跨多个重组产物CHO细胞系以及多个CHO宿主细胞系评估PLBL2水平，因此，使得能够选择具有期望的属性，如，低PLBL2浓度，以及，在重组产物CHO细胞系的情况下，高产物浓度的重组系或宿主系。用于细胞系选择的这种方法对于优化重组生产过程，例如，减小下游纯化过程的负担是重要的。

序列表

Claims

1.用于检测样品中的仓鼠磷脂酶B-样2蛋白(PLBL2)的免疫测定方法，其中样品获自重组多肽制品或宿主细胞系，所述方法包括：

(a)将结合仓鼠PLBL2的第一捕获抗体与样品接触，从而产生样品-捕获抗体组合物质；

(b)将结合仓鼠PLBL2的第二检测抗体与样品-捕获抗体组合物质接触；以及

(c)检测结合至样品-捕获抗体组合物质的第二抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中捕获抗体不与检测抗体竞争结合并且其中捕获抗体结合不同于检测抗体的表位。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括使用标准滴定曲线对所结合的第二检测抗体的水平进行定量。

4.根据权利要求3所述的方法，还包括基于所结合的第二检测抗体的水平计算样品中存在的仓鼠PLBL2的量。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中免疫测定是电化学发光(ECL)测定。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中免疫测定是夹心测定。

7.根据权利要求6所述的方法，其中夹心测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中重组多肽制品或宿主细胞系获自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

9.根据权利要求8所述的方法，其中样品是收获的细胞培养液。

10.根据权利要求8所述的方法，其中样品获自重组多肽制品并且其中重组多肽制品已经历一个或多个层析纯化步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中重组多肽制品是最终纯化的产物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中重组多肽制品中包含的重组多肽是抗体或免疫粘附素。

13.根据权利要求12所述的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。

14.根据权利要求12所述的方法，其中重组多肽是IgG。

15.根据权利要求14所述的方法，其中重组多肽选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

16.根据权利要求15所述的方法，其中重组多肽是IgG1。

17.根据权利要求16所述的方法，其中重组多肽是IgG4。

18.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体包含包括可变重链区的可变区，所述可变重链区包含包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列的CDRH1、包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列的CDRH2和包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列的CDRH3。

19.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体包含包括可变轻链区的可变区，所述可变轻链区包含包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列的CDRL1、包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列的CDRL2和包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列的CDRL3。

20.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体包含包括可变重链区和可变轻链区的可变区，所述可变重链区包含包括SEQIDNO.:15的氨基酸序列的CDRH1、包括SEQIDNO.:16的氨基酸序列的CDRH2和包括SEQIDNO.:17的氨基酸序列的CDRH3，所述可变轻链区包含包括SEQIDNO.:20的氨基酸序列的CDRL1、包括SEQIDNO.:21的氨基酸序列的CDRL2和包括SEQIDNO.:22的氨基酸序列的CDRL3。

21.根据权利要求18所述的抗体，包含包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列的可变重链区。

22.根据权利要求19所述的抗体，包含包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列的可变轻链区。

23.根据权利要求20所述的抗体，包含包括可变重链区和可变轻链区的可变区，所述可变重链区包括SEQIDNO.:14的氨基酸序列，所述可变轻链区包括SEQIDNO.:19的氨基酸序列。

24.根据权利要求23所述的抗体，包含包括SEQIDNO.:13的氨基酸序列的重链和包括SEQIDNO.:18的氨基酸序列的轻链。

25.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体是19C10。

26.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体包含包括可变重链区的可变区，所述可变重链区包含包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDRH1、包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDRH2和包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列的CDRH3。

27.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体包含包括可变轻链区的可变区，所述可变轻链区包含包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列的CDRL1、包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列的CDRL2和包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列的CDRL3。

28.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体包含包括可变重链区和可变轻链区的可变区，所述可变重链区包含包括SEQIDNO.:5的氨基酸序列的CDRH1、包括SEQIDNO.:6的氨基酸序列的CDRH2和包括SEQIDNO.:7的氨基酸序列的CDRH3，所述可变轻链区包含包括SEQIDNO.:10的氨基酸序列的CDRL1、包括SEQIDNO.:11的氨基酸序列的CDRL2和包括SEQIDNO.:12的氨基酸序列的CDRL3。

29.根据权利要求26所述的抗体，包含包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列的可变重链区。

30.根据权利要求27所述的抗体，包含包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列的可变轻链区。

31.根据权利要求28所述的抗体，包括可变区，所述可变区包含包括SEQIDNO.:4的氨基酸序列的可变重链区和包括SEQIDNO.:9的氨基酸序列的可变轻链区。

32.根据权利要求31所述的抗体，包含包括SEQIDNO.:3的氨基酸序列的重链和包括SEQIDNO.:8的氨基酸序列的轻链。

33.结合仓鼠磷脂酶B-样2的单克隆抗体，其中抗体是15G11。

34.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中捕获抗体包括权利要求18-25中任一项的抗体。

35.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中检测抗体包括权利要求26-33中任一项的抗体。

36.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中捕获抗体包括权利要求18-25中任一项的抗体并且其中检测抗体包括权利要求26-33中任一项的抗体。

37.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中捕获抗体是多克隆的。

38.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中检测抗体是多克隆的。

39.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中捕获抗体是多克隆的并且检测抗体是多克隆的。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述多克隆抗体是兔的。

41.根据权利要求1-17或34-36中任一项所述的方法，其中检测抗体缀合至生物素。

42.根据权利要求1-17或38-40中任一项所述的方法，其中检测抗体缀合至辣根过氧化物酶。

43.用于检测仓鼠磷脂酶B-样2蛋白的免疫测定试剂盒，包括权利要求18-25中任一项的捕获抗体和权利要求26-33中任一项的检测抗体。

44.用于检测仓鼠磷脂酶B-样2蛋白的免疫测定试剂盒，包括多克隆捕获抗体和多克隆检测抗体。

45.根据权利要求43或权利要求44所述的免疫测定试剂盒，其中免疫测定是ECL免疫测定。

46.根据权利要求43或权利要求44所述的免疫测定试剂盒，其中免疫测定是ELISA免疫测定。

47.筛选用于表达仓鼠PLBL2的宿主细胞系的方法，包括检测获自宿主细胞系的样品中的PLBL2。

48.根据权利要求47所述的方法，其中检测PLBL2包括权利要求1-2或8-9中任一项的免疫测定方法。

49.根据权利要求48所述的方法，其中样品是全细胞培养液。

50.根据权利要求48所述的方法，还包括根据权利要求4-7中任一项的方法计算样品中的仓鼠PLBL2的量。

51.从两个或更多个宿主细胞系的组中选择最佳宿主细胞系的方法，其中最佳宿主细胞系表达低量仓鼠PLBL2，所述方法包括：

(i)从两个或更多个宿主细胞系中的每一个获取宿主细胞系样品；

(ii)根据权利要求4-7中任一项的方法计算每一个宿主细胞系样品中的PLBL2的量；

(iii)将每一个宿主细胞系样品中的PLBL2的量与组中每一个宿主细胞系样品中的PLBL2的量进行比较；

(iv)鉴定与所述组的每一个宿主细胞系样品相比具有最低量PLBL2的宿主细胞系样品，从而从组中生成鉴定的具有最低量PLBL2的宿主细胞系；以及，

选择(iv)中鉴定的宿主细胞系作为最佳宿主细胞系。

52.根据权利要求51所述的方法，其中两个或更多个宿主细胞系中的每一个是CHO细胞系。

53.根据权利要求52所述的方法，其中宿主细胞系样品中的每一个是收获的细胞培养液。

54.根据权利要求52所述的方法，其中宿主细胞系样品中的每一个是全细胞培养液。

55.筛选用于表达仓鼠PLBL2的表达重组多肽的细胞系的方法，其中表达重组多肽的细胞系是产物细胞系，所述方法包括检测获自产物细胞系的样品中的PLBL2。

56.根据权利要求55所述的方法，其中检测PLBL2包括权利要求1-2或8-17中任一项的免疫测定方法。

57.根据权利要求56所述的方法，还包括根据权利要求4-7中任一项的方法计算样品中的仓鼠PLBL2的量。

58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，还包括筛选产物的表达，包括检测样品中的产物和定量样品中的产物的量。

59.根据权利要求58所述的方法，其中检测产物和定量产物的量包括分光光度法或亲和层析法。

60.从两个或更多个表达重组多肽的细胞系的组中选择最佳表达重组多肽的细胞系的方法，其中两个或更多个表达重组多肽的细胞系中的每一个是产物细胞系并且其中最佳表达重组多肽的细胞系是最佳产物细胞系，其中每一个产物细胞系表达相同产物，并且其中最佳产物细胞系表达低量仓鼠PLBL2和高量产物，所述方法包括：

(i)从两个或更多个产物细胞系中的每一个获取产物细胞系样品；

(ii)根据权利要求4-7中任一项的方法计算每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量；

(iii)检测每一个产物细胞系样品中的产物和定量产物的量；

(iv)将每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量与所述组的每一个产物细胞系样品中的PLBL2的量进行比较；

(v)将每一个产物细胞系样品中的产物的量与所述组的每一个产物细胞系样品中的产物的量进行比较；

(vi)鉴定与所述组的每一个产物细胞系样品相比具有最低量PLBL2和最高量产物的产物细胞系样品，从而从组中生成鉴定的具有最低量PLBL2和最高量产物的产物细胞系；以及

选择(vi)中经鉴定的产物细胞系作为最佳产物细胞系。

61.从两个或更多个表达重组多肽的细胞系的组中选择最佳表达重组多肽的细胞系的方法，其中两个或更多个表达重组多肽的细胞系中的每一个是产物细胞系，并且其中最佳表达重组多肽的细胞系是最佳产物细胞系，其中每一个产物细胞系表达相同产物，并且其中最佳产物细胞系表达低量仓鼠PLBL2和高量产物，所述方法包括：

(iii)检测每一个产物细胞系样品中的产物和定量产物的量；

(iv)针对每一个产物细胞系样品，计算PLBL2的量与产物的量的比率；

(v)将针对每一个产物细胞系样品计算的比率与所述组的每一个产物细胞系样品进行比较；

(vi)鉴定所述组中具有最低比率的产物细胞系样品，从而从组中生成鉴定的具有最低量PLBL2和最高量产物的产物细胞系；以及

选择(vi)中经鉴定的产物细胞系作为最佳产物细胞系。

62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中两个或更多个产物细胞系中的每一个是CHO细胞系。

63.根据权利要求62所述的方法，其中产物细胞系样品中的每一个是收获的细胞培养液。

64.权利要求55、60或61中任一项所述的方法，其中产物是抗体或免疫粘附素。

65.根据权利要求64所述的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。

66.根据权利要求64所述的方法，其中产物是IgG。

67.根据权利要求65所述的方法，其中产物选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

68.根据权利要求67所述的方法，其中产物是IgG1。

69.根据权利要求67所述的方法，其中产物是IgG4。