CN101472947A - 用于高通量筛选细胞系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高通量筛选在某些制药、药物开发和生物技术方法中用于蛋白质表达的细胞系的方法，通过该方法可以依据细胞系产生期望蛋白质表达水平和合适性质的目的蛋白质的能力，鉴定高产细胞系。

Description

用于高通量筛选细胞系的方法

本申请要求2006年4月21日提交的美国临时申请60/793,991的优先权，该临时申请的说明书通过引用整体地并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及制药领域。更具体地，本发明涉及就细胞系能够在工业规模上生产足够数量和相当性质的蛋白质的能力而言筛选细胞系的方法。

背景技术

高通量技术已成为制药和生物技术研究中的重要工具。高通量分析方法利用自动化程序快速分析蛋白质的活性、蛋白质表达的水平、基因表达和在生物系统中发生的众多化学相互作用。通过这些方法和技术产生的数据已被应用于广泛的领域例如癌症研究、药物开发和晶体学(参见，例如Abramovitz等人(2006)Proteome Sci.4(1)：5[出版前电子公布(Epubahead of print)])。

高通量分析依赖于从系统中发生的大量化学反应中读出特定化学相互作用或化合物的能力。高通量技术已用于在短期内探测数千种基因的特定化学相互作用和表达水平。为了完成此艰巨的任务，开发了利用分子信号(例如，荧光团)和以极快的速度处理信息的自动化分析手段的某些技术(参见，例如，Pinhasov等人(2004)Comb.Chem.High Throughput Screen.7(2)：133-40)。例如，微阵列技术已广泛用于同时探测数千种基因的相互作用，提供有关特定基因的有价值的信息(参见，例如，Mocellin和Rossi(2007)Adv.Exp.Med.Biol.593：19-30).

在过去的数年中，自动化和人工高通量蛋白质表达和纯化已成为易获得的快速筛选和产生可溶性蛋白质用于结构和功能性研究的方法(参见Cabrita等人(2006)BMC Biotechnol.6：12)。已将各种进展，例如用于克隆、表达和纯化、连接不依赖性克隆(LIC)及蛋白质表达的自诱导的基于滤板(filterplate)的试验，与自动化系统结合起来，以产生简单划算的蛋白质并行生产技术(参见Cabrita等人(2006)BMC Biotechnol.6：12；Aslanidis等人(1990)Nucleic Acids Res.18(20)：6069-6074)。这些方法为研究者提供了在工业规模水平生产蛋白质用于制药和药物开发的强大工具。

然而，从特定细胞中纯化和表达蛋白质存在特别的困难。在鉴定到目的蛋白后，以纯化的形式获得显著量的该蛋白质相当困难。因此，为了以充足的数量生产蛋白质用于工业开发，使用产生重组蛋白质的细胞系。

尽管细胞系可为研究者提供产生大量特定蛋白质的机会，但它们并非总是蛋白质的有效生产者。某些细胞系克隆可能以次最佳的水平生产蛋白质。其他细胞系克隆可能产生最佳的蛋白质表达水平，但由于蛋白质的结构畸形或不适当的翻译后修饰而不能产生完全功能的蛋白质混合物。在生物相关化合物的开发过程中这些问题将导致时间和资源的浪费。因此，需要能够快速和可靠地提供有关特定细胞系中表达的蛋白质的性质和数量的信息的高通量筛选方法。本发明涉及这些和其他重要目的。

发明概述

通过在开始目的蛋白的全面规模的生产之前分析细胞系中目的蛋白的表达水平，将可以节约浪费在不具有用于高通量蛋白质表达的充足品质的细胞系上的大量时间和资源。本发明部分地基于如下发现，即，可以通过实施高通量筛选方法和高通量纯化方法以确定能够产生足够数量的目的蛋白的细胞系。此外，这些方法可用于筛选候选细胞系以确定它们是否能够产生具有期望性质，例如生物学活性的目的蛋白。因此这些高通量筛选和高通量纯化技术(在下文中统称为“高通量筛选”)是用于确定合适细胞系以用于工业规模蛋白质表达的有价值方法。该发现已用于提供允许使用高通量筛选方法鉴定可以用于工业规模生产目的蛋白的细胞系的发明。

在一个方面，本发明提供了高通量筛选用于蛋白质表达的细胞系的方法。该方法包括高通量滴定筛选(high-throughput titer screening)细胞系以确定各细胞系中蛋白质的表达水平。选择产生期望的蛋白质表达水平的细胞系以用于随后该蛋白质的高通量纯化。如果细胞系产生期望的蛋白质表达水平且其具有合适的性质，则选择该细胞系用于蛋白质表达。

在一些实施方案中，蛋白质是抗体、配体、受体、蛋白质的亚基、蛋白质的片段、融合蛋白、重组蛋白质和它们的片段。在某些实施方案中，蛋白质是抗体、重组抗体或F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和它们的片段。在特定的实施方案中，第一结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。在其他实施方案中，可将结合剂附着至固相支持物例如珠、板和微阵列芯片上。在许多实施方案中，固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。

在其他实施方案中，第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和它们的片段。在特定的实施方案中，第二结合剂是抗体或其片段。在更特定的实施方案中，抗体是F(ab’)2片段，甚至更特别地是与抗体的Fc部分特异性结合的F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，可检测的标记物是荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁结合剂、亲磁(promagnetic)结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶、产生磁性产物的酶。在非常特定的实施方案中，可检测的标记物是钌或多重钌标记(multiple ruthenium labels)。

在一些实施方案中，试剂包括树脂，所述树脂在特定的实施方案中具有附着至其的第三结合剂。在某些实施方案中，第三结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和它们的片段。在特定的实施方案中，第三结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，使用真空从试剂中洗脱蛋白质。在其他实施方案中，通过离心洗脱蛋白质。在其他实施方案中，蛋白质借助重力流通过树脂而被洗脱。在许多实施方案中，对孵育的细胞系的筛选使用自动化工作站(automatedworkstation)进行。

在另一个方面，本发明提供了高通量筛选用于蛋白质表达的细胞系的方法。该方法包括步骤：在培养基中孵育细胞系和将固相支持物与来自各孵育的细胞系的样品接触。在该方面，所述固相支持物在其表面附着可以结合各样品中的蛋白质的第一结合剂。将与第一结合剂结合的蛋白质与能够结合该蛋白质的第二结合剂接触，所述第二结合剂与可检测的标记物有效连接。通过检测与结合蛋白质的第二结合剂有效连接的标记物来确定各样品中的蛋白质表达水平。该方法还包括选择具有期望的蛋白质表达水平的细胞系。在一些情况下，这可通过将各细胞系中的蛋白质表达水平与所有细胞系中的平均蛋白质表达水平比较来确定。例如，与所有细胞系中的平均表达水平相比增加的蛋白质表达水平可能是期望的蛋白质表达水平。或者，降低的蛋白质表达水平可能是期望的蛋白质表达水平，该表达水平也可以通过将各筛选的细胞系中的蛋白质表达水平与所有细胞系中的平均蛋白质表达水平相比来确定。

本发明该方面的方法可以进一步需要从选择的细胞系分离上清液，将各上清液分配至多孔板的小孔中。然后将上清液与结合蛋白质的试剂接触。将蛋白质从试剂中洗脱并且分析其是否具有合适的性质。根据本发明的该方面，如果在步骤e)中选择细胞系并且由该细胞系表达的蛋白质具有合适的性质，则选择该细胞系用于蛋白质表达。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、配体、受体、蛋白质的亚基、蛋白质的片段、融合蛋白、重组蛋白质和它们的片段。在某些实施方案中，蛋白质是抗体、重组抗体或F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第一结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。在其他实施方案中，结合剂可附着至固相支持物例如珠、板和微阵列芯片上。在许多实施方案中，固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。

在其他实施方案中，第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第二结合剂是抗体和其片段。在更特别的实施方案中，抗体是F(ab’)2片段，甚至更特别地是与抗体的Fc部分特异性结合的F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，可检测的标记物是荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁结合剂、亲磁结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶、产生磁性产物的酶。在非常特定的实施方案中，可检测的标记物是钌或多重钌标记。

在一些实施方案中，试剂包括树脂，所述树脂在特定的实施方案中具有附着至其的第三结合剂。在某些实施方案中，第三结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第三结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，使用真空从试剂中洗脱蛋白质。在许多实施方案中，孵育的细胞系的筛选使用自动化工作站进行。

在另一个方面，本发明提供了细胞培养工艺改进的方法。该方法包括在受试的不同条件下孵育各细胞系的步骤。然后将来自各不同条件的各细胞系的细胞系样品与固相支持物接触。在该方面，固相支持物在其表面附着能够结合各样品中的蛋白质的第一结合剂。将与第一结合剂结合的蛋白质与能够和该蛋白质结合的第二结合剂接触，所述第二结合剂与可检测的标记物有效连接。通过检测与结合蛋白质的第二结合剂有效连接的标记物来确定各样品中的蛋白质表达水平。该方法还包括选择具有期望的蛋白质表达水平的细胞系。在一些情况下，这可通过将各细胞系中的蛋白质表达水平与所有细胞系中的平均蛋白质表达水平比较来确定。例如，与所有细胞系中的平均表达水平相比增加的蛋白质表达水平可能是期望的蛋白质表达水平。或者，降低的蛋白质表达水平可能是期望的蛋白质表达水平，该水平也可通过将各筛选的细胞系中的蛋白质表达水平与所有细胞系中的平均蛋白质表达水平比较来确定。

本发明该方面的方法可以进一步需要从选择的细胞系分离上清液，将各上清液分配至多孔板的小孔中。然后将上清液与结合蛋白质的试剂接触。将蛋白质从试剂中洗脱并且分析其是否具有合适的性质。根据本发明的该方面，如果蛋白质的数量和性质与其他受试条件相比得到改善，则鉴定到合适的细胞培养条件。

在其他实施方案中，第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第一结合剂是A蛋白质或链霉抗生物素蛋白。在其他实施方案中，可将结合剂附着至固相支持物例如珠、板和微阵列芯片。在许多实施方案中，固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。

在其他实施方案中，第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第二结合剂是抗体或其片段。在更特别的实施方案中，抗体是F(ab’)2片段，甚至更特别地是特异性结合抗体的Fc部分的F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，可检测的标记物是荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁结合剂、亲磁结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶、产生磁性产物的酶。在非常特定的实施方案中，可检测的标记物是钌或多重钌标记。

在一些实施方案中，试剂包括树脂，所述树脂在特定的实施方案中具有附着至其的第三结合剂。在某些实施方案中，第三结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第三结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，使用真空从试剂中洗脱蛋白质。在许多实施方案中，对孵育的细胞系的筛选使用自动化工作站进行。

在某些实施方案中，受试条件是细胞生长培养基。在其他实施方案中，受试条件是温度。在其他实施方案中，受试条件是湿度。在其它实施方案中，受试条件是压力。在再其它实施方案中，受试条件是氧压。

在另一个方面，本发明提供了高通量筛选用于生产蛋白质的细胞系的方法。该方法包括在培养基中孵育细胞系的第一步骤。将来自各细胞系的样品置于固相支持物上，即，使固体支持物与各样品接触。应当注意，固相支持物在其表面附着可以与各样品中的蛋白质结合的第一给合剂。第一结合剂结合细胞样品中的蛋白质。将蛋白质与能够和该蛋白质结合的第二结合剂接触，所述第二结合剂与可检测的标记物有效连接。通过检测与结合蛋白质的第二结合剂有效连接的标记物来确定各样品中的蛋白质表达水平。基于与筛选的细胞系中的平均蛋白质表达水平相比细胞系是否具有期望的蛋白质表达水平，而选择用于生产蛋白质的细胞系。

在一些实施方案中，蛋白质是抗体、配体、受体、蛋白质的亚基、蛋白质片段、融合蛋白、重组蛋白质和它们的片段。在某些实施方案中，蛋白质是抗体、重组抗体或F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第一结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。在其他实施方案中，可将结合剂附着至固相支持物例如珠、板和微阵列芯片上。在许多实施方案中，固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯

在其他实施方案中，第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白质和其片段。在特定的实施方案中，第二结合剂是抗体或其片段。在更特别的实施方案中，抗体是F(ab’)2片段，甚至更特别地是与抗体的Fc部分特异性结合的F(ab’)2片段。

在其他实施方案中，可检测的标记物是荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁结合剂、亲磁结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶、产生磁性产物的酶。在非常特定的实施方案中，可检测的标记物是钌或多重钌标记。在某些实施方案中，该方法还包括唾液酸测定试验。

附图简述

当与附图一起阅读下列描述时，可更全面地理解本发明的上述和其他目的、其各种特征以及本发明本身，其中：

图1是高通量蛋白质表达试验的图示，显示了在细胞样品中检测抗体。

图2是高通量筛选试验的图示，显示了使用缀合至钌的不同F(ab’)₂片段的信号背景比。

图3是高通量筛选试验的图示，显示了使用缀合至钌的不同F(ab’)₂片段的信号背景比。

图4的曲线显示检测不同浓度的GP1bα、IL13受体和TNFR融合蛋白的高通量筛选试验的灵敏度。

图5的曲线显示检测不同浓度的抗GDF8、抗CD22和抗Lewis Y抗体的高通量筛选试验的灵敏度。

图6的曲线显示进行高通量滴定筛选试验和HPLC试验所需的试验时间。

图7显示就确定样品中的TNFR融合蛋白水平而言在高通量筛选试验和HPLC之间进行的比较。

图8显示通过高通量滴定筛选试验确定的克隆中的表达水平。

图9显示就确定样品中的抗Lewis Y抗体的水平而言在高通量筛选试验和HPLC之间进行的比较。

图10显示就确定样品中的PSGL和GP1bα的水平而言在高通量筛选试验和HPLC之间进行的比较。

图11显示就确定样品中的抗Aβ抗体的水平而言在高通量筛选试验和HPLC之间进行的比较。

图12显示在使用不同纯化方法纯化的样品中发现的高分子量蛋白质的百分数。

图13显示在使用不同纯化方法纯化的样品中发现的高分子量蛋白质的百分数。

图14的柱形图显示在样品中发现的高分子量蛋白质的量，其中所述样品分离自生长在不同条件下的不同细胞系。

发明详述

此处提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。此处引用的公开的美国专利、授权的申请、公布的外国专利和参考资料，包括GenBank数据库序列，特此并入本文作为参考，其引用程度就如同将其各自特别地且单独地指出并入作为参考一样。

1.1.概述

本发明的实施方案部分提供筛选具有生产目的蛋白的能力的细胞系的方法。本发明还描述用于提高工业规模生产制药和生物研究用蛋白质的功效的方法。特别地，本发明允许有效地生产可用于疾病例如癌症、阿尔茨海默氏病和糖尿病的药物治疗的蛋白质。此外，本发明的实施方案提供了用于高通量筛选细胞系以确定由细胞系生产的目的蛋白的数量和性质的方法。

因此，本发明的一个方面提供了高通量筛选用于蛋白质表达的细胞系的方法。该方法使用可以结合目的蛋白的第一结合剂和可以结合目的蛋白的与可检测的标记物有效连接的第二结合剂。在一些实施方案中，将第一结合剂附着至固相支持物例如珠、磁珠、板或微阵列芯片上。该方法还可使用能结合目的蛋白、并允许从来源于细胞系的样品纯化该蛋白质的试剂。在本发明的一些实施方案中，利用真空从试剂中抽吸洗脱的蛋白质并通过过滤器而从试剂中纯化蛋白质。在其他实施方案中，借助重力流，使溶液流过试剂。

如此处所使用的，术语“治疗性蛋白”是对其所作用的身体区域或对其通过媒介物远程作用的身体区域具有生物学效应的蛋白质或肽。治疗性蛋白质可以是例如分泌蛋白质，例如抗体、抗体的抗原结合片段、可溶性受体、受体融合物、细胞因子、生长因子、酶或凝血因子，下文对此有更详细描述。上述蛋白质在本质上只是示例性的，并不意欲构成限制。本领域技术人员将理解任何蛋白质均可以用于本发明，并且本领域技术人员可以根据需要选择待生产的特定蛋白质。

如本说明书中所使用的，术语多肽、蛋白质和肽是同义的且可互换使用。因此，如此处所使用的，蛋白质、肽或多肽的大小通常包含2个以上氨基酸。例如，蛋白质、肽或多肽可包含大约2至大约20个氨基酸、大约20至40个氨基酸、大约40至大约100个氨基酸、大约100个氨基酸至大约200个氨基酸、大约200个氨基酸至大约300个氨基酸等。

如此处所使用的，氨基酸是指本领域内已知的任何天然氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或多肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基序列。在其他实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基酸结构部分。在特定的实施方案中，可通过一个或多个非氨基酸结构部分中断蛋白质或肽的残基序列。

如此处所使用的，术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括抗体片段例如Fab′、Fab、F(ab′)₂、单域抗体(single domainantibody)(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域内是已知的。用于制备和表征抗体的方法在本领域内也是熟知的(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；通过引用并入本文)。例如，抗体可包括至少一个，优选两个全长重链和至少一个，优选两个轻链。此处使用的术语“抗体”包括抗体片段或变体分子例如抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段、重链片段(例如，camelidVHH)和结合结构域-免疫球蛋白融合物(例如，SMIP^TM)。抗体可以是单克隆或单特异性抗体。抗体还可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体或体外产生的抗体。在其他实施方案中，抗体具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体具有选自例如κ和λ的轻链。在一个实施方案中，改变，例如突变恒定区以改变抗体的特性(例如，增加或减少下列之一或多个方面：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能)。通常，抗体特异性结合预先确定的抗原，例如与病症例如神经变性病、代谢病症、炎症、自身免疫病症和/或恶性肿瘤病症相关的抗原。

Small Modular ImmunoPharmaceuticals(SMIP^TM)提供包含结合结构域多肽的变体分子的实例。SMIP及其用途和应用公开于例如美国公开的专利申请号2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646，和其相关专利家族成员，它们全部整体地并入本文作为参考。

单域抗体(single domain antibody)可包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括，但不限于，重链抗体、天然不含轻链的抗体、源于常规4链抗体的单域抗体、工程化抗体和非源于抗体的单域构架。单域抗体可以是本领域现有的任何单域抗体或任何将来的单域抗体。单域抗体可来源于任何物种，包括，但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔子、牛。根据本发明的一个方面，此处所使用的单域抗体是称为不含轻链的重链抗体的天然单域抗体。此类单域抗体公开于例如WO 9404678。为了清楚起见，来源于天然不含轻链的重链抗体的可变区此处称为VHH或纳米抗体(nanobody)，以区别于四链免疫球蛋白的常规VH。此类VHH分子可源于在驼科物种例如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和原驼(guanaco)中产生的抗体。除驼科外的其他物种也可产生天然不含轻链的重链抗体；此类VHH在本发明的范围内。

术语抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；(vi)camelid或camelized可变区，例如VHH结构域；(vii)单链Fv(scFv)；(viii)双特异性抗体；和(ix)融合至Fc区的免疫球蛋白分子的一个或多个片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH可以由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成接头将它们连接起来，以使它们形成其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-26；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-83)。该单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗体片段，并且可以以等同于完整抗体的方式评估片段的功能。

除了“双特异性”或“双功能性”抗体外，抗体应理解为其每一个结合位点都是相同的。“双特异性”或“双功能性抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人造杂交抗体。可通过多种方法，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接来产生双特异性抗体。参见，例如，Songsivilai &Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992).

如此处所使用的，术语“细胞系”是指在培养中保持的并已获得在离体条件下生长的能力的细胞。可使细胞系永生化或可将其短暂地建立为“原代细胞系”。在某些实施方案中，可通过本领域内已知的技术建立细胞系(参见，例如，Kwak等人(2006)Anim.Biotechnol.17(1)：51-8)。在一些实施方案中，细胞系是抗体生产性细胞系，可通过本领域内已知的技术产生所述细胞系(参见，例如，Dessain等人(2004)J.Immunol.Methods.291(1-2)：109-22.)。还可从商业来源例如ATCC细胞生物学保藏中心(AmericanType Culture Collections，Mannassas，VA)获得细胞系。

如此处所使用的，术语“结合剂”是指可通过共价键、氢键、离子键、范德瓦尔斯力、伦敦力或所述力的任何组合与任何其他分子结合的分子。结合剂包括，但不限于，蛋白质和其片段、拟肽化合物(peptidomimeticcompound)、抗体和其片段、核酸、毒素和小分子。

可通过本领域内熟知的方法将结合剂置于经衍生化的固相支持物上。固相支持物包括，但不限于，珠、磁珠、微阵列芯片、硝酸纤维素膜、尼龙膜、多孔板和PVDF膜。在一些实施方案中，固相支持物是板，其中电极被置于板下以产生吸引结合磁性材料的结合剂的磁场。可以按照厂商的方案使用板(参见Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)。

固相支持物可以由玻璃、聚苯乙烯、塑料、磁性金属例如铁、聚丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素或不影响结合剂结合蛋白质的能力的任何惰性支持物组成。可从例如Applied Biosystems，(Foster City，CA)商购获得固相支持物。

此外，在一些实施方案中，可以使用本领域技术人员实施的方法，通过称为“印刷”的方式(参见，例如，Schena等人，(1995)Science，270(5235)：467-470)，将结合剂置于固相支持物，例如微阵列芯片上。此处所使用的术语“印刷”是指将点以非常靠近的方式置于固相支持物上，从而使得可以在固相支持物上放置最大数目的点。可通过例如机器人印刷机(roboticprinter)实施印刷方法。使用Stealth Micro Spotting针(TelechemInternational，Inc，Sunnyvale，CA)的VersArray CHIP Writer Prosystem(BioRad Laboratories)是可用于产生用于该方面的聚焦微阵列(focusedmicroarray)的芯片印刷装置的非限定性实例。

如此处所使用的，术语“合适的性质”是指与目的蛋白尤其相关的性质。合适的性质包括，但不限于，酶促反应、抗体-表位相互作用和核酸-蛋白质相互作用。可通过分析目的蛋白的特定物理化学方面来测定合适的性质。例如，不旨在限制可使用的测定试验的类型，合适的性质可以与蛋白质的大小、电荷、碳水化物含量、结合活性和酶活性相关。可使用物理结构分析，例如NMR确定蛋白质的总体三级和二级结构。此外，基于凝集素的测定试验和唾液酸测定试验(下面将更详细地描述)可用于确定目的蛋白的物理化学方面。换句话说，可以通过观察目的蛋白的化学活性以及目的蛋白的物理结构来确定合适的性质。

如此处所使用的，术语“洗脱”是指通过使用溶剂从树脂或结合剂中进行提取。从树脂或结合剂上洗脱目的蛋白的方法可涉及包含能够将目的蛋白从结合剂上移走的分子的溶液。此外，溶剂可以具有改变树脂或结合剂的结合特性从而使目的蛋白不再与目的蛋白结合的pH。应当指出，任何溶液均可在本发明中用于洗脱蛋白质，只要该过程不影响目的蛋白的总体功能或性质。

如此处所使用的，术语“树脂”是指天然或合成来源的任何固体或半固体有机产物。树脂包括可与允许从复杂混合物中纯化分子的结构部分缀合的任何材料。用于本发明的结构部分包括阳离子分子、阴离子分子、金属、准金属、多糖、多肽、蛋白质、核酸、肽、有机小分子和拟肽化合物。特别地，树脂本身可由任何惰性化合物，包括但不限于交联葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺或中性多糖组成。可从例如Clontech Laboratories，Inc.(Mountain View，CA)商购获得树脂。

此处所使用的术语“高通量”是指允许以快速和简单的方法确定细胞系中存在期望的蛋白质表达的手段。期望的蛋白质表达既指通过高通量技术筛选的细胞系表达的生物分子的数量也指其性质。高通量方法还可包括用于处理生物分子的自动化系统和用于大规模筛选的自动化数据处理。

如此处所使用的，术语“高通量滴定筛选”是指用于确定由细胞表达的蛋白质的数量的方法。高通量滴定筛选包括使用结合剂鉴定来源于细胞的样品中的目的蛋白。结合剂可以与可检测的标记物或固相支持物有效连接，下面将对其全部进行更详细地描述。

如此处所使用的，术语“高通量纯化”是指同时或基本上同时地从多个细胞样品纯化蛋白质的方法。

如此处所使用，术语“细胞培养工艺改进”是指导致蛋白质生产所需条件得到优化的过程，其中所述条件为在工业规模生产中或在小规模生产中以足够的数量和性质生产蛋白质所需的条件。可通过细胞培养工艺改进方法测试的条件包括，但不限于，盐浓度、培养基内容、生长温度、大气压、大气氧含量、培养物的搅拌和二氧化碳含量。细胞培养工艺改进包括确定蛋白质的数量(高通量滴定筛选)和蛋白质的性质(高通量纯化)的步骤。

为了细胞培养工艺改进的目的，确定蛋白质的性质的方法包括但不限于，结合测定试验、凝集素测定试验、唾液酸测定试验、NMR、圆二色性、质谱、MALDI-TOF、酶测定法、比色测定法和氨基酸测序。可在细胞培养工艺改进方法的过程中于任何时间上使用这些测定试验。在某些实施方案中，在完成目的蛋白的高通量纯化后实施这些测定试验。

此处所使用的术语“目的蛋白”是指为生物学、医学、药学或制药目的而生产的任何蛋白质或蛋白质样分子。例如，目的蛋白可以是治疗性蛋白质。可从核酸序列(无论是染色体还是染色体外)产生目的蛋白，所述核酸序列包括但不限于前信使RNA、信使RNA、转运RNA、核内异质RNA(“HnRNA”)、核糖体RNA、单链DNA和双链RNA。核酸序列的染色体外来源可包括双链DNA病毒基因组、单链DNA病毒基因组、双链RNA病毒基因组、单链RNA病毒基因组、细菌DNA、线粒体基因组DNA、cDNA或能够产生目的蛋白的任何其他外来核酸来源。目的蛋白可以是任何结构或结构的组合。例如，目的蛋白包括但不限于重组蛋白质、包含四级结构的蛋白质、糖基化蛋白、脂质化蛋白、寡肽、肽、蛋白质结构域、蛋白质亚基、抗体或其片段和抗体样分子。目的蛋白还包括例如融合蛋白。融合蛋白通常具有引导肽的全部或实质上部分，所述肽在N或C端连接第二多肽或蛋白质的全部或部分。例如，融合蛋白可使用来自其他物种的前导序列，以允许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一种有用的融合包括加入免疫学活性结构域，例如抗体表位，以帮助融合蛋白的纯化。融合蛋白可包括靶向性结构部分，例如可溶性受体片段或配体，和免疫球蛋白链、Fc片段、各种同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)的重链恒定区。例如，融合蛋白可包含受体的细胞外结构域和(例如融合至)人免疫球蛋白Fc链(例如，人IgG，例如，人IgG1或人IgG4，或其突变形式)。在一个实施方案中，在一个或多个氨基酸上，例如在野生型序列的残基254和257上突变人Fc序列以减少Fc受体的结合。融合蛋白可额外地包括连接第一结构部分和第二结构部分例如免疫球蛋白片段的接头序列。例如，融合蛋白可包括肽接头，例如长度为大约4至20个，更优选5至10个氨基酸的肽接头；肽接头长度可以为8个氨基酸。例如，融合蛋白可包括具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y(其中y为1、2、3、4、5、6、7或8)的肽接头。在其他实施方案中，可将额外的氨基酸残基加至融合蛋白的N或C末端，以促进表达、空间柔性、检测和/或分离或纯化。

在融合接合处或附近包含切割位点可利于在纯化后去除外来多肽。其他有用的融合包括功能性结构域例如来自酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区的连接。可并入融合蛋白的蛋白质或肽的实例包括细胞生长抑制蛋白、杀细胞蛋白、促细胞凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽类药物、抗体、Fab片段抗体、抗原、受体蛋白、酶、凝激素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白和结合蛋白。产生融合蛋白的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。可以例如通过如下方式产生此类蛋白质：使用双官能交联剂进行化学连接，从头合成完整的融合蛋白、或将编码引导肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列连接然后表达完整的融合蛋白。

在某些实施方案中，融合蛋白是例如肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；1991年3月20日公布的EP 417,563；和TNFR-2，1991年3月20日公布的EP 417,014，其各自通过以其全文引用合并入本文)形式的肿瘤坏死因子抑制剂，可以按照本发明对其进行分析(关于综述，参见Naismith和Sprang，J Inflamm.47(1-2)：1-7，1995-96，通过以其全文引用合并入本文)。根据一些实施方案，肿瘤坏死因子抑制剂包含可溶性TNF受体。在某些实施方案中，肿瘤坏死因子抑制剂包含融合至免疫球蛋白的任何部分，包括免疫球蛋白的Fc区的可溶性TNFR。在某些实施方案中，本发明的TNF抑制剂是TNFR I和TNFR II的可溶性形式。在某些实施方案中，本发明的TNF抑制剂是可溶性TNF结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的TNF抑制剂是TNFR-Fc，例如，依那西普(etanercept)。如此处所使用的，“依那西普”是指形式为两个分子的p75TNF-α受体的细胞外部分的二聚体(每个分子包含235个氨基酸的人IgG1的Fc部分)的TNFR-Fc。根据本发明，可以使用抗衰老化合物例如肌肽在TNFR-Fc的生产过程中减少错折叠和/或聚集的蛋白质的量。

可通过本领域技术人员已知的任何技术制备蛋白质或肽，包括利用标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽、自天然来源分离蛋白质或肽、或化学合成蛋白质或肽。可使用此处公开的技术或本领域技术人员已知的技术，扩增和/或表达已知基因的编码区(参见，例如，Kaleeba等人(2006)Science 311(5769)：1921-4)。可选择地，蛋白质、多肽和肽的各种商业制品对于本领域技术人员来说是熟知的。

此外，如此处所使用的，术语“期望的表达水平”是指取决于蛋白质的物理化学特征，为了允许蛋白质的随后纯化所必需的蛋白质的数量。目的蛋白的期望表达水平取决于许多与待使用的生产方法相关的因素。例如，特定细胞系中的表达水平将允许进行蛋白质的性质和数量分析以及蛋白质的有效纯化。因此可以由本领域技术人员根据蛋白质的特性和待用于该蛋白质的纯化和分析测定方法，确定细胞系的期望蛋白质表达水平。

在某些实施方案中，基于对目的蛋白的特定要求，选择期望的蛋白质表达水平。例如本领域技术人员可以将期望的蛋白质表达水平选择为增加的目的蛋白表达水平，以使产生的蛋白质的量最大化。在其他实施方案中，对于在生产其的细胞中具有高水平毒性的蛋白质，例如毒素而言，可以将减少的目的蛋白的表达水平选择为期望的蛋白质表达水平。此外，在目的蛋白以高浓度水平形成包涵体的情况下，也可以选择减少的蛋白质表达水平。因此，由本领域技术人员选择的蛋白质表达水平取决于目的蛋白的特征。

在确定细胞系产生的蛋白质的数量和性质时，通常需要细胞系样品用于评估蛋白质的表达和蛋白质的性质。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的方法，例如细胞裂解和上清液分离法(参见，例如，Vara等人(2005)Biomaterials 26(18)：3987-93；Iyer等人(1998)J.Biol.Chem.273(5)：2692-7)，分离细胞系样品。可选择地，可以从具有分泌蛋白例如抗体、细胞外基质蛋白或血清蛋白的培养基中分离细胞系样品。在这样的实施方案中，培养基是待就蛋白质的数量和性质接受检测的样品。在一个实施方案中，如本文中进一步描述的，在任何之前的纯化步骤不存在的情况下，将培养基样品用于测定试验中检测蛋白质的数量。

本发明的另一个方面提供了高通量筛选用于蛋白质生产的细胞系的方法。在该方法中，通过将固相支持物与包含蛋白质的细胞系样品接触来确定蛋白质的表达水平。在一个实施方案中，细胞系样品是细胞培养基。固相支持物在其表面附着有能够和蛋白质结合的第一结合剂。该方法还包括可以和第一结合剂所结合并固定在固相支持物上的蛋白质结合的第二结合剂。第二结合剂与可检测的标记物有效连接。基于蛋白质所需要的期望表达水平选择细胞系。

可通过“点印迹法”(参见，例如，Heinicke等人(1992)J.Immunol.Methods.152(2)：227-36.)测量特定蛋白质的表达水平，其中将第一结合剂固定在膜例如硝酸纤维素、尼龙或PVDF膜上。还可使用蛋白质微阵列技术确定样品中蛋白质的表达。或者，可以将样品置于多孔板的包含第一结合剂的小孔中。在这样的实施方案中，类似的技术例如ELISA分析是本领域常规的(参见，例如，Ausubel，等人(1996)Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，pp.4.2.1-4.2.9，John Wiley & Sons，Inc.)。

在一些实施方案中，使用自动化工作站进行细胞系样品的高通量筛选和/或纯化。此外，可使用自动化工作站进行细胞培养工艺改进。通常在本领域中使用自动化工作站以在短时间内进行许多实验。自动化工作站的实例包括，但不限于，TECAN Genesis工作站(TECAN Schweiz AG，Mannedorf，CH)和Biomek FX工作站(Beckman Coulter，Fullerton，CA)。可从自动化工作站的厂商获得使用的方法，所述方法在本领域内是熟知的。

1.2.结合剂

本发明的方面使用结合目的蛋白的结合剂。在某些实施方案中，结合剂是抗体或其片段。当特异性结合蛋白质的结合剂是抗体时，抗体可以是，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、遗传工程化抗体、双特异性抗体(其中双特异性抗体的特异性之一可以特异地结合丙糖磷酸异构酶蛋白质)、抗体片段(包括但不限于“Fv”、“F(ab’)₂”、“F(ab)”和“Dab”)；和表现为是抗体的反应性部分的单链(“SC-MAb”)。用于制造抗体和其他结合剂的方法是熟知的(参见，例如，Coligan等人(1991)Current Protocols in Immunology，John Wiley和Sons，Inc.；Jones等人(1986)Nature 321：522-525；Marx(1985)Science 229：455-456；Rodwell(1989)Nature 342：99-100；Clackson(1991)Br.J.Rheumatol.3052：36-39；Reichman等人(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen，等人(1988)Science 239：1534-1536)。

结合剂可以是能与抗体的Fc部分结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，结合剂允许检测细胞系样品中的抗体。在特定的实施方案中，使用电化学发光可检测标记物，例如钌，可检测地标记作为第二结合剂的抗体。此外，第二结合剂可以是使用电化学发光可检测标记物例如钌可检测地标记的F(ab’)₂片段。

图1中显示了使用F(ab’)₂片段检测目的蛋白。该F(ab’)₂片段与可检测的标记物例如Ori-Tag有效连接。在图1中，F(ab’)₂片段识别在该图示实例中作为目的蛋白的抗体的Fc部分。所述抗体已被固定在其上缀合有A蛋白或链霉抗生物素蛋白的珠上(图1)。通过光的产生，观察F(ab’)₂片段的结合(图1)。

重要地应注意，可将在本发明的方面中用作第一结合剂的抗体偶联至固相支持物的表面。第一结合剂的偶联可以提高反应的信号强度和产生改善的结果。常用偶联剂包括但不限于，使用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的硅烷化、琼脂糖包衣和多聚-L-赖氨酸膜。此外，可对重组抗体进行工程改造以包含有助于偶联支持物的标签(tag)。例如，可将具有组氨酸标签的重组抗体偶联至用镍包被的支持物。

此外，化合物例如肽、拟肽化合物和小分子可用作结合剂。可从肽或其他生物分子，包括但不限于，糖、脂肪酸、固醇、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述物质的衍生物或结构类似物、或其组合等，合成结合剂。可使用噬菌体展示文库和化学重组文库开发和选择对于目的蛋白而言是可接受的结合剂的合成化合物。本发明还考虑使用从如下物质制备的潜在结合剂：拟肽(peptoid)、随机生物寡聚物(美国专利号5,650,489)、苯并二氮杂卓类、diversomer例如dydantoin、苯并二氮杂卓类和二肽、具有β-D-葡萄糖骨架的非肽拟肽物、寡聚氨基甲酸酯或肽基磷酸酯(peptidyl phosphonate)。

在某些实施方案中，结合剂可以是设计与蛋白质特异性相互作用、结合或连接的肽。肽结合剂也可与任何其他蛋白质的氨基酸序列相互作用、连接或结合。可使肽接受定向或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化(amidification)等。

通过确定目的蛋白的结构特征，例如使用X射线晶体学、中子衍射、核磁共振光谱和用于结构确定的其他技术，可以进一步帮助肽结合剂的鉴定和筛选。计算机算法可进一步帮助结合剂的鉴定。可以使用能够扫描具有已知三维结构的肽和小分子的数据库从而鉴定在几何形状上适合靶蛋白质的位点的候选物的此类计算机算法(参见，例如，Chen和Kellogg(2005)J.Comput.Aided Mol.Des.19(2)：69-82)。该类型的大多数算法提供了可以用于发现与蛋白质的结合口袋或结构域区域形状互补的类型广泛的化学结构的方法。可将来自特定数据库的一组肽中的每一个肽进行比较，以确定最有与目的蛋白相互作用的潜力的特定肽。

本发明的化合物还可以是拟肽化合物，该拟肽化合物可以至少部分地是非天然的。拟肽化合物可以是具有任何期望的氨基酸序列的部分的小分子模拟物。该化合物由于是模拟物从而可能具有增加的稳定性、功效、效力和生物利用度。此外，该化合物可具有减少的毒性。拟肽化合物可具有增强的肠粘膜通透性。可通过合成制备该化合物。本发明的化合物可包括L-、D-或非天然氨基酸、α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸(丙氨酸的等电子类似物)。化合物的肽主链可具有至少一个用PSI-[CH＝CH]替代的键(Kempf等人(1991)Int.J.Pept.Protein Res.38(3)：237-41)。化合物还可包括三氟酪氨酸、对-CI-苯丙氨酸、对-Br-苯丙氨酸、聚-L-炔丙基甘氨酸、聚-D，L-烯丙基甘氨酸或聚-L-烯丙基甘氨酸。

本发明的一个实例是拟肽化合物，其中化合物具有被合适的模拟物替代的键、肽主链或氨基酸组分。可以是合适的氨基酸模拟物的非天然氨基酸的实例包括，但不限于β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸、L-γ-氨基丁酸、L-α-氨基异丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、半胱氨酸(乙酰氨基甲基)、N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-赖氨酸、N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-赖氨酸、L-甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸、N-α-Boc-N-δ-CBZ-L-鸟氨酸、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鸟氨酸、Boc-对-硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羟脯氨酸、Boc-L-硫代脯氨酸。(Blondelle，等人(1994)Antimicrob.AgentsChemother.38(10)：2280-6；Pinilla，等人(1995)Biopolymers.37(3)：221-40)。

有时，结合剂可以是能与蛋白质结合、相互作用或连接的小分子。这样的小分子可以是能够穿透细胞的脂双层的有机分子。小分子包括，但不限于，毒素、螯合剂、金属和准金属化合物。可将小分子附着至或缀合至靶向试剂，以便将小分子特异地引导至特定细胞。

在一些实施方案中，结合剂是核酸序列，所述核酸序列可以是在生物条件下能够与蛋白质例如转录因子结合的全长序列、全长序列的片段或合成的寡核苷酸。“核酸”是指包含两个或更多个核苷酸的聚合物，其包括单链、双链和三链聚合物。“核苷酸”是指天然和非天然化合物，其包含杂环碱基、糖和连接基团例如磷酸酯。例如，可将结构基团加至核苷酸的核糖基或脱氧核糖基单位，例如2’-O位置上的甲基或烯丙基或替代2’-O基团的氟基。可以例如用甲基膦酸酯或O-甲基磷酸酯替代或修饰核酸的连接基团例如核酸的磷酸二酯。还可修饰碱基和糖，这在本领域中是已知的。为了本公开内容的目的，“核酸”还包括其中天然或修饰的核酸碱基附着至聚酰胺主链上的“肽核酸”。

可将本发明的结合剂与可检测的标记物缀合。根据本发明，“可检测的标记物”是可被感知的结构部分。在一些实施方案中，可检测的标记物与结合剂有效连接。“有效连接”是指通过共价键或非共价键(例如，离子键)将可检测的标记物附着至结合剂上。用于产生共价键的方法是已知的(参见例如Wong，S.S.(1991)Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking，CRC Press；Burkhart等人(1999)The Chemistry andApplication of Amino Crosslinking Agents or Aminoplasts，John Wiley &Sons Inc.中的一般方案)。

根据本发明，可检测地标记的结合剂包括与可检测的结构部分缀合的结合剂。本发明的另一种可检测地标记的结合剂是融合蛋白，其中一个配偶体是结合剂，另一个配偶体是可检测的标记物。可检测地标记的结合剂的再一非限定性实例是包含结合剂和对第二结构部分具有高亲和力的第一结构部分的第一融合蛋白和包含第二结构部分和可检测标记物的第二融合蛋白。例如，特异性结合蛋白质的结合剂可以与链霉抗生物素蛋白结构部分有效连接。向结合剂-链霉抗生物素蛋白融合蛋白中加入包含与荧光素结构部分有效连接的生物素结构部分的第二融合蛋白，其中第二融合蛋白与结合剂-链霉抗生物素蛋白融合蛋白的组合导致产生可检测地标记的结合剂(即，与可检测的标记物有效连接的结合剂)。在特定的实施方案中，可通过医学成像装置或系统检测可检测标记物。例如，当医学成像系统是X光机时，可通过X光机检测的可检测标记物是放射性标记物(例如，³²P)。注意，结合剂不必直接缀合可检测结构部分。例如，对于本身可以被第二可检测的结合剂(例如，FITC标记的山羊抗小鼠第二抗体)特异性结合的结合剂(例如，抗体)，其是与可检测的结构部分(即，FITC结构部分)有效连接的。

可检测标记物可以是，但不限于，荧光团(例如，荧光素(FITC)、藻红蛋白、罗丹明)、化学染料、或放射性的、化学发光的、电化学发光的、磁性的、顺磁性的、亲磁性的化合物、或产生可以是有色的、化学发光的或磁性的产物的酶。可通过任何合适的手段，包括分光术、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测信号。在某些情况下，可通过两种或更多种手段检测信号。在某些实施方案中，蛋白质标记物包括荧光染料、放射性标记物、电化学发光和化学发光标记物。

例如，可将结合剂的氨基酸与Cy5/Cy3荧光染料缀合。这些染料常用于本领域(参见，例如，Linder等人(2002)Electrophoresis.23(5)：740-9)。荧光标记物可选自多种结构类型，包括非限定性实例，例如1-和2-氨基萘、p，p’-二氨基芪、芘、菲啶季铵盐、9-氨基吖啶、p，p’-二氨基二苯甲酮亚胺、蒽、氧杂羰花青、部花青(marocyanine)、3-氨基马萘雌酮、二萘嵌苯、二苯并噁唑、二-对-噁唑基苯、1，2-苯并吩嗪、视黄醇、二-3-氨基吡啶嗡盐、嚏根苷配基、四环素、sterophenol、苯并咪唑基苯胺、2-氧代-3-色烯(chromen)、吲哚、呫吨、7-羟基香豆素、吩噁嗪、水杨酸盐、毒毛旋花苷配基、卟啉、三芳基甲烷、黄素、呫吨染料(例如，荧光素和罗丹明染料)、花青染料、4，4-二氟-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-环戊二烯并茚(indacene)染料和荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、藻胆蛋白)。

其他有用的染料是化学发光染料，其可包括，但不限于，生物素缀合的氨基酸。在特定的实施方案中，将电化学发光探针缀合至结合剂。如此处所使用的，“电化学发光”是在电化学反应后发生的化学发光反应。电化学发光探针包括，但不限于，鲁米诺、二氢化吖啶酯、钌、钌螯合剂和三联吡啶钌、NHS酯。可从例如BioVeris Corp.(Gaithersburg，MD)商购获得电化学发光探针。

1.3 分析测定试验

本发明的方面还使用蛋白质性质的测定试验。可在目的蛋白的高通量滴定筛选过程中使用这些测定试验。还可在细胞培养工艺改进期间确定蛋白质的性质。蛋白质结构作为蛋白质性质的一个部分，包括蛋白质的一级、二级、三级和四级结构以及翻译后修饰，例如糖基化、脂质化和磷酸化。此外，蛋白质的大小、形状和电荷也影响蛋白质的性质。蛋白质的物理结构对蛋白质行使其正常功能的能力具有显著影响。在酶反应的情况下，蛋白质结构实际上对于整个酶性质是重要的。在抗体或其片段的情况下，抗体的氨基酸的大小、形状、表面电荷、糖基化和磷酸化对抗体的表位特异性具有显著的影响。

在一些实施方案中，使用NMR、基质辅助激光解吸/飞行时间(“MALDI-TOF”)分析和圆二色性确定蛋白质的物理结构(参见，例如，美国专利号6,930,305、7,005,272和7,029,872)。此类技术提供了对蛋白质的总体物理结构的详细分析。这些技术在本领域内是熟知的。

在特定的实施方案中，使用大小排阻层析确定目的蛋白的大小(参见，例如，Brooks等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97(13)：7064-7067)。此外，可使用阳离子交换层析确定蛋白质的电荷(参见，例如，Zhang和Glatz(1999)Biotechnol.Prog.15(1)：12-18)。可用于鉴定目的蛋白的结构的其他技术包括但不限于，反相HPLC、毛细管电泳SDS、毛细管区带电泳和高pH阴离子交换HPLC。可使用本领域内熟知的程序实施这些技术。

其他结构测定试验包括唾液酸测定试验和凝集素测定试验。这些测定试验鉴定蛋白质表面上的糖基化水平，所述糖基化水平可以提供有关蛋白质性质的信息。已使用唾液酸测定试验确定样品中碳水化合物存在的程度，这些技术在本领域内是已知的(参见，例如，美国专利号5,807,553和5,855,901)。基于凝集素的测定试验也检测样品中碳水化合物的存在，但通过蛋白质-碳水化合物相互作用的机制进行(参见，例如，美国专利号5,633,148)。凝集素测定试验已在本领域中广泛用于碳水化合物的结合，并在例如美国专利6,331,319中进行了描述。

除了确定蛋白质的物理结构，还可以测定蛋白质行使某些功能的能力(参见，例如，美国专利号7,029,862)。此外，可在结合测定试验或结合抑制测定试验中，使用例如包含受体的膜级分或表达受体的细胞，检测蛋白质或多肽(例如，由杂交核酸编码)的结合功能(参见，例如Van Riper等人(1993)J.Exp.Med.，177：851-856；Sledziewski等人，美国专利号5,284,746)。由此，可估量编码的蛋白质或多肽结合配体、抑制剂和/或启动子的能力。可使用结合蛋白质的抗体通过免疫学方法，例如免疫印迹法、免疫沉淀法和免疫测定法(例如，放射免疫测定法、ELISA)，确定由本发明的核酸编码的蛋白质或多肽的抗原特性。

可通过酶测定试验检测蛋白质或多肽(例如，由杂交核酸编码)的信号转导功能。可使用表达蛋白质或多肽的细胞，通过用于趋化性或介质释放的标准测定试验(例如，监测响应配体或启动子的趋化性、胞吐作用(例如，酶例如酯酶(例如丝氨酸酯酶)、穿孔蛋白、粒酶的脱粒)或介质释放(例如，组胺、白细胞三烯)的测定试验)(参见，例如，Taub等人(1995)J.Immunol.，155：3877-3888；Baggliolini，M.和C.A.Dahinden(1994)Immunology Today，15：127-133和此处引用的参考资料)，检测蛋白质或多肽(例如，由杂交核酸编码)的刺激功能。还可通过其他合适的方法估量蛋白质受体的功能特征。

为例证本发明的方法，在各种细胞系上实施了上述筛选方法以鉴定产生足够数量的蛋白质和足够质量的蛋白质的那些细胞系。

实施例

本领域技术人员将认识到或只通过常规实验即能够确认此处描述的具体物质和方法的大量等同方案。此类等同方案意欲包括在下列实施例之后的权利要求书的范围内。

实施例1

人Fc蛋白质测定的高通量筛选

1.抗Aβ标准品的制备

通过将20ul的培养基R5CD1和24ml测定缓冲液(PBS w/0.05％Tween 20和1％牛血清白蛋白)混合，在16块测定板(Corning/Costar，Corning，NY)中预备标准曲线缓冲液(SCB)。使用6ul 32.5mg/ml参照标准和644ul SCB制备0.3mg/ml中间标准(每次新鲜制备)。将1ug/ml标准置于2ml深孔板的称为A1的小孔中和称为H1的另外的小孔中。在16块测定板中，小孔A1包含6ul 0.3mg/ml中间标准和1794ul SCB。对于小孔H1，重复该过程。对于16块测定板之每一块，通过在孔中取900ul溶液并加入900ul SCB来制备系列稀释物。以每标准孔50ul分配稀释物。

2.对照的制备

制备对照以产生浓度为120ug/ml的中间对照。简而言之，将6ul 32.5mg/ml参照标准与1619ul培养基R5CD1混合。通过将5ul 120ug/ml中间对照和195ul测定缓冲液混合，制备1:40的稀释物；而通过将20ul 1:40稀释的对照和180ul测定缓冲液混合，制备1:400的稀释物。通过取80ul1:400稀释的对照并混合在160ul测定缓冲液中，每两块测定板制备一份1:1200稀释的稀释物。以每0.1对照孔50ul的量分配1:1200的稀释物。

此外，通过如下方式制备包含0.01μg/ml对照的对照物：将150ul 120ug/ml中间对照(如上所制备的)在1350ul培养基中混合。通过将5ul12ug/ml中间对照在195ul测定缓冲液中混合来制备1:40的稀释物。通过将20ul 1:40稀释的对照混合在180ul测定缓冲液中来制备1:400的稀释物，通过将80ul 1:400稀释的对照混合在160ul测定缓冲液中，每2块测定板制备一份1:1200的稀释物。以每0.01对照孔50ul 1:1200稀释的对照等分试样，分配对照。

2.带ORI-标签的F(ab’) ₂ 片段的制备

使用下列方案完成带ORI-标签的抗Fc F(ab’)₂片段的制备(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)。简而言之，向1小瓶ORITAG NHS酯(BioVeris，Gaithersburg，MD)中加入50μl DMSO。以最大的设置涡旋混合物直至小瓶底部的ORITAG溶解。然后，向50μl溶解的ORITAG NHS酯中加入1638μl affiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG抗体至1638ul。涡旋混合物，在黑色包裹中室温孵育所述混合物60分钟。在孵育期间，在振荡器上旋转小瓶。

通过加入20μl 2M甘氨酸来终止反应，用箔纸包住试管，室温孵育10分钟。在孵育期，用0.1％ NaN₃平衡两个具有PBS的PD10(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱，并且按照厂商的方案进行使用。将反应试管离心5秒以收集管中的所有体积。然后，向各PD10柱中加入854ul反应物。将样品加载至柱上，最终从每个柱子收集了8管0.5ml等分试样。

通过BCA蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度。此外，来自第二步骤的未标记的剩余抗体用作确定蛋白质浓度的标准。在455nm处测量蛋白质样品的吸光度。

将具有合适的蛋白质浓度和良好的ORI-TAG:蛋白质比例的级分混合。向最终的小瓶中加入牛血清白蛋白，从而制备1％BSA溶液。将小瓶在40℃贮存。

3.细胞系样品的制备和反应

通过将5ul来自产生GP1bα、IL13R、抗CD22抗体、抗Lewis Y抗体、抗Aβ抗体或TNFR融合蛋白的细胞系的样品与195ul测定缓冲液混合以制备1:40的稀释物，通过将20ul 1:40稀释的样品与180ul测定缓冲液混合以制备样品的1:400稀释物。最后，通过取出70ul 1:400稀释的样品并且将该样品与140ul测定缓冲液混合来制备1:1200稀释物。以50ul将该终稀释物分配至每一个样品孔中。也将1:400稀释物分配入另一块测定板的样品孔中。

以5350μl等分试样(在5344ul缓冲液中包含6ul F(ab’)₂片段)将带标签的F(ab’)₂片段分配至每一块测定板。每孔50ul溶液。

从Dynal Biotech(Carlsbad，CA)获得A蛋白珠。以每板5ml测定缓冲液中30ul的量分配A蛋白珠。以每孔50ul的体积分配此溶液。

如下将所有试剂和样品分配至板中：首先将加样标准品(loadstandard)、对照和样品加入小孔中。然后加入抗Fc的带ORI标签的F(ab’)₂片段。最后，加入A蛋白珠。

在混合的情况下，室温孵育混合物2小时，使用方法“FcHuman150”在M8或M384分析仪上进行读数。

4.数据分析

用于本实验的标准的接受方针是10个标准中至少8个的标准点复本之间的读数CV应当为大约20％。此外，对照的接受方针必须是80％至120％之内。此外，样品的接受方针要求样品复本之间的读数CV为大约20％。只有落在这些范围内的读数才被考虑。

5.结果

使用钌标记的抗PSGL的F(ab’)₂片段显示出显著更高的信噪比(图2)。将0.1μg/ml和0.4μg/ml F(ab’)₂片段的数据相对于噪声进行标准化并且将其制成柱形图。当用钌标记时，Jackson 1、Jackson 2、Rockland 1和Southern Biotech F(ab’)₂片段具有增加的信噪比(图2)。使用抗抗CD22的F(ab’)₂片段证实了这些实验(图3)。

这些结果在使用抗Fc融合蛋白GP1bα、IL13受体和TNFR融合蛋白的F(ab’)₂片段的实验中进一步详述(图4)。曲线显示当靶融合蛋白的浓度增加时，以F(ab’)₂片段对蛋白质的检测增加(图4)。使用抗GDF8、抗CD22和抗Lewis Y抗体而非Fc融合蛋白作为靶，也获得了相似的结果(图5)。

通过使用标记的F(ab’)₂片段鉴定样品中蛋白质的数量，相对于标准柱方法例如HPLC，检查了滴定筛选法。结果显示对于确定蛋白质的滴度，滴定筛选法远比HPLC色谱法的速度快得多(图6)。当分析高达700多个样品时，HPLC与高通量滴定筛选相比，获得蛋白质数量读数所需的时间超过10倍以上(图6)。

除了高通量筛选比标准柱方法更快外，其在确定蛋白质的数量方面同样准确(图7、9、10和11)。当比较HPLC和上述滴定筛选法时，对于抗Lewis Y蛋白、PSGL、抗Aβ和TNFR融合蛋白，鉴定到了几乎相同的滴度数量(图7、9、10和11)。因此，此处描述的滴定筛选测定法在确定蛋白质的数量方面比标准柱技术快并且具有与标准柱技术相似的功效。

上面使用的高通量筛选能够鉴定表达合适数量的抗体的细胞系(图8)。如图8中所示，高通量滴定筛选法允许鉴定目的抗体的最高生产者(由每克隆递增的滴度(μg/ml)表明)。在这些实验中，最高滴度克隆编号为1，第二高滴度克隆编号为2，以此类推。因此，通过该测定法快速地鉴定到了最高克隆。

实施例2

高通量纯化和鉴定合适的细胞培养条件

1.使用离心进行的蛋白质手工纯化

可将实施例1的高通量滴定筛选法与下面详述的高通量纯化法结合起来以促进对细胞培养的潜在改进。

薄层树脂在20％乙醇中。加入另外的20％乙醇溶液以占终体积的50％。将溶液充分混合并且以滤板(Whatman 7700-2804，长滴注器(longdrip)，25um，96孔 x 800uL，Whatman LabSciences，Orange，NJ)每孔200uL等分试样进行分配。将滤板叠在空的微量培养板(Corning/Costar，Corning，NY)顶部，然后以700rpm(大约等于104G)离心(Sorvall LegendRT)3分钟以除去20％的乙醇。然后，加入每孔200uL的RODI水，以空微量滴定板在下方对这些板子离心3分钟。重复该过程2次。

以每孔200uL等分试样加入清洗缓冲液。在将空的微量培养板置于下面的情况下，对板离心3分钟。再重复该过程两次。当所有样品为至少170ug/mL时，进行最小稀释以使相同组的样品的滴度在大致相同的范围(+/-20％)。将样品稀释至接近该最低浓度。对低于170ug/mL的任何样品，加样一次以上。当需要多次加样时，仅为了确保加样的蛋白质总量在相同的范围(+/-20％)内而稀释样品。当实施多次加样时，首先加入所需的样品，并在空的小孔中加入200uL清洗缓冲液。按需要对滤板进行离心。

照例，将所有样品与参照物spike(添加标准品)和培养基空白一起加样。以500uL的加样体积将样品加载至A蛋白树脂上(Protein A MabSelect，Amersham Biosciences)。用接近整套受试样品的浓度在培养基中制备添加标准品(spiking standard)。以500ul/孔加样添加标准品和培养基空白。

通过用多通道移液器混合将树脂与样品一起重悬浮。将树脂和样品在室温孵育5至10分钟。然后以700rpm将混合物离心3分钟，在深孔微量培养板(Whatman 7710-5750，Whatman LabSciences，Orange，NJ)中收集样品流出物(flow-through)。然后，每孔加入200uL清洗缓冲液(5mM Tris，20，50或100mM NaCl，pH7.5)，在将空的微量培养板置于下面的情况下，离心混合物3分钟。以每孔200uL加入清洗缓冲液。在将空的微量培养板置于下面的情况下，离心样品3分钟。然后，在进行洗脱前，为了中和，在混合物中加入4uL Tris(2.0M Tris，pH8.5，或1.0M Tris pH8.5)至UV收集板(Corning/Costar，Corning，NY)。以每孔200uL的体积向滤板中加入洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，20或50或100mM NaCl，pH2.5或3.0)。用多通道移液器混合树脂和洗脱缓冲液。然后，在将收集板置于下面的情况下，离心滤板3分钟。在Spectra Max读板器(Molecular Devices)上在A₂₈₀处读板。

2.使用柱层析进行的蛋白质性质测定

对于CEX测定试验：以50uL等分试样将洗脱物转移入包含100uLCEX流动相A的Agilent板。混合溶液。使用标准方法进行柱纯化操作。

对于SEC测定试验：以130uL的体积将洗脱物转移至Agilent板。混合溶液。使用标准方法进行柱纯化操作。

对于HIC和唾液酸测定试验：向UV板中加入4微升2M Tris，然后直接洗脱入UV板。混合溶液并且在Spectra Max读板器上在A₂₈₀进行读数。.

3.结果

使用上述技术进行的样品的高通量纯化允许快速纯化多达每板96个样品。该纯化技术导致样品的快速纯化而不降低纯化水平(图12和13)。如通过每个样品中存在的高分子量蛋白的量所确定的，高通量纯化技术和其他技术一样的好(图12和13)。尤其是当将高通量纯化与标准的A蛋白纯化比较时(图12和13)。

此外，使用高分子量蛋白的量可以确定由在不同细胞培养条件下生长的细胞产生的蛋白质的性质(图14)。如图14中所显示的，不同的受试培养基显示出似乎取决于培养基的纯化后不同数量的高分子量蛋白。特别地，某些培养基条件显示出与其他培养基相比在高分子量蛋白的数量上有统计学显著的改善(图14，大箭头)。因此，以上使用的细胞培养工艺改进方法鉴定到了对于下游纯化而言显示出改进的生长特征的培养基。

等同方案

本领域技术人员将认识到、或只使用常规实验即能够确定此处描述的具体组合物和方法的许多等同方案。此类等同方案被认为在本发明的范围内，且被下列权利要求所涵盖。

Claims (69)

1、高通量筛选用于蛋白质表达的细胞系的方法，该方法包括：

a)通过使从细胞系获得的样品与第一结合剂接触，筛选样品以确定各细胞系中目的蛋白的表达水平；

b)使目的蛋白和有效连接了可检测的标记物的第二结合剂接触；

c)确定目的蛋白的表达水平；

d)确定目的蛋白的合适性质；

e)选择用于目的蛋白的高通量蛋白质表达的细胞系；

其中如果细胞系产生期望表达水平和合适性质的目的蛋白，则选择该细胞系。

2、权利要求1的方法，其中目的蛋白选自抗体、配体、受体、蛋白质的亚基、蛋白质的片段、融合蛋白、重组蛋白、和它们的片段。

3、权利要求2的方法，其中目的蛋白是抗体、重组抗体或F(ab’)2片段。

4、权利要求1的方法，其中第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

5、权利要求4的方法，其中第一结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。

6、权利要求4的方法，其中第一结合剂可附着至选自珠、板和微阵列芯片的固相支持物上。

7、权利要求6的方法，其中固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。

8、权利要求1的方法，其中目的蛋白的合适性质选自电荷、大小、酶活性、抗体-表位相互作用、核酸结合、碳水化物含量、二级结构、三级结构和结合活性。

9、权利要求1的方法，其中第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

10、权利要求9的方法，其中第二结合剂是抗体或其片段。

11、权利要求10的方法，抗体是F(ab’)2片段。

12、权利要求11的方法，其中F(ab’)2片段特异性结合抗体的Fc部分。

13、权利要求1的方法，其中钌标记的第二结合剂用第二可检测的标记物标记，所述第二可检测的标记物选自荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁性结合剂、亲磁结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶和产生磁性产物的酶。

14、权利要求12的方法，其中F(ab’)2片段与两个或更多个钌标记物有效连接。

15、权利要求1的方法，其中将样品与附着至树脂的第三结合剂接触。

16、权利要求15的方法，其中第三结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

17、权利要求16的方法，其中第三结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。

18、权利要求17的方法，其中第三结合剂附着在固相支持物上。

19、权利要求1的方法，其中从混合物中分离树脂并且从第三结合剂中洗脱表达的目的蛋白。

20、权利要求19的方法，其中通过选自真空洗脱和重力流的方法洗脱目的蛋白。

21、权利要求1的方法，其中使用自动化工作站筛选细胞系。

22、高通量筛选用于表达和生产蛋白质的细胞系的方法，该方法包括：

a)将固相支持物与从细胞系分离的样品接触，该固相支持物在其表面上附着有第一结合剂，该第一结合剂能够结合目的蛋白；

b)将样品与能结合目的蛋白的第二结合剂接触，该第二结合剂与可检测的标记物有效连接；

c)通过检测与结合目的蛋白的第二结合剂有效连接的标记物，确定目的蛋白的表达水平；和

d)将各细胞系中的目的蛋白的表达水平与目的蛋白的平均表达水平比较，并基于比较来选择细胞系，

其中如果细胞系中目的蛋白的表达水平比所有细胞系中的目的蛋白平均表达水平高或低，则选择该细胞系用于生产蛋白质。

23、权利要求22的方法，还包括从选择的细胞系分离上清液，然后将上清液与能够结合目的蛋白的试剂接触。

24、利要求23的方法，其中试剂附着在固相支持物上。

25、权利要求24的方法，其中固相支持物是多孔板。

26、权利要求23的方法，其中从试剂中洗脱结合的目的蛋白，并且分析其是否具有合适的性质。

27、权利要求26的方法，其中如果在步骤e)中选择细胞系并且所表达的目的蛋白具有合适的性质，则选择该细胞系用于表达蛋白质。

28、权利要求22的方法，其中目的蛋白选自抗体、配体、受体、蛋白质的亚基、蛋白质的片段、融合蛋白、重组蛋白、和它们的片段。

29、权利要求28的方法，其中目的蛋白是抗体、重组抗体或F(ab’)2片段。

30、权利要求22的方法，其中第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

31、权利要求30的方法，其中第一结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。

32、权利要求22的方法，其中可将结合剂附着至选自珠、板和微阵列芯片的固相支持物上。

33、权利要求24的方法，其中固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。

34、权利要求22的方法，其中第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

35、权利要求34的方法，其中第二结合剂是抗体或其片段。

36、权利要求35的方法，其中抗体是F(ab’)2片段。

37、权利要求35的方法，其中抗体是与抗体的Fc部分特异性结合的F(ab’)2片段。

38、权利要求22的方法，其中可选择标记物选自荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁性结合剂、亲磁结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶和产生磁性产物的酶。

39、权利要求38的方法，其中可检测的标记物是钌。

40、权利要求22的方法，其中试剂包括附着有第三结合剂的树脂，该第三结合剂能够结合目的蛋白。

41、权利要求40的方法，其中第三结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

42、权利要求41的方法，其中第三结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。

43、权利要求40的方法，其中分离树脂，并从第三结合剂中洗脱目的蛋白。

44、权利要求43的方法，其中使用选自真空洗脱和重力流的方法从第三结合剂洗脱目的蛋白。

45、权利要求22的方法，其中对孵育的细胞系的筛选使用自动化工作站进行。

46、细胞培养工艺改进的方法，该方法包括：

a)在不同的细胞培养条件中孵育各细胞系；

b)将各细胞系样品与附着至固相支持物的第一结合剂接触，该第一结合剂结合细胞系样品中的目的蛋白；

c)使被第一结合剂结合的目的蛋白与第二结合剂接触，所述第二结合剂与可检测的标记物有效连接；

d)通过检测与结合目的蛋白的第二结合剂有效连接的标记物，确定目的蛋白的表达水平；和

e)基于检测到的目的蛋白的表达水平选择细胞系，

其中如果细胞系中目的蛋白的表达水平高于或低于所有细胞系中的目的蛋白平均表达水平，则选择该细胞系。

47、权利要求46的方法，还包括从选择的细胞系分离上清液，和将上清液与结合目的蛋白的试剂接触。

48、权利要求47的方法，其中试剂附着在固相支持物上。

49、权利要求48的方法，其中固相支持物是多孔板。

50、权利要求47的方法，其中从试剂中洗脱结合的目的蛋白，然后分析其是否具有合适的性质。

51、权利要求50的方法，其中如果在步骤e)中选择细胞系，且所表达的目的蛋白具有合适的性质，则选择该细胞系用于表达蛋白质。

52、权利要求46的方法，其中目的蛋白选自抗体、配体、受体、蛋白质的亚基、蛋白质的片段、融合蛋白、重组蛋白、和它们的片段。

53、权利要求52的方法，其中目的蛋白是抗体、重组抗体或F(ab’)2片段。

54、权利要求46的方法，其中第一结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

55、权利要求54的方法，其中第一结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。

56、权利要求46的方法，其中可将结合剂附着至选自珠、板和微阵列芯片的固相支持物上。

57、权利要求48的方法，其中固相支持物包括纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、玻璃或聚苯乙烯。

58、权利要求46的方法，其中第二结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

59、权利要求58的方法，其中第二结合剂是抗体或其片段。

60、权利要求59的方法，其中抗体是F(ab’)2片段。

61、权利要求59的方法，其中抗体是与抗体的Fc部分特异性结合的F(ab’)2片段。

62、权利要求46的方法，其中可检测的标记物选自荧光团、化学染料、放射性结合剂、化学发光结合剂、电化学发光剂、磁性结合剂、顺磁性结合剂、亲磁结合剂、产生有色产物的酶、产生化学发光产物的酶和产生磁性产物的酶。

63、权利要求62的方法，其中可检测的标记物是钌。

64、权利要求46的方法，其中试剂包括附着有第三结合剂的树脂，该第三结合剂能够结合目的蛋白。

65、权利要求64的方法，其中第三结合剂选自抗体、配体、受体、融合蛋白、蛋白质的亚基、重组蛋白、和它们的片段。

66、权利要求65的方法，其中第三结合剂是A蛋白或链霉抗生物素蛋白。

67、权利要求64的方法，其中分离树脂，和从第三结合剂洗脱目的蛋白。

68、权利要求67的方法，其中使用选自真空洗脱和重力流的方法从第三结合剂洗脱目的蛋白。

69、权利要求46的方法，其中对孵育的细胞系的筛选使用自动化工作站进行。

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