CN107109423A

CN107109423A - 用于生产双特异性抗体的细胞的制备和挑选

Info

Publication number: CN107109423A
Application number: CN201480081550.9A
Authority: CN
Inventors: 周鹏飞; 张敬; 王瑞; 周祥; 刘晓燕; 胡伶俐; 付思思; 钟慧
Original assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2017-08-29
Also published as: WO2015184626A1; US20170088604A1; US10793619B2

Abstract

本发明提供了适于生产双特异性抗体的细胞的组合物和制备方法。在一定条件下多个真核细胞与一种试剂孵育以使细胞停留在G1/S期。然后从细胞中去除该试剂，该细胞转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元的序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元的序列的第二载体。从多个细胞中鉴别出同时表达第一和第二抗原结合单元的细胞。

Description

用于生产双特异性抗体的细胞的制备和挑选

技术领域

本申请为关于产生和挑选适于生产双特异性抗体的细胞的组合物和方法。

背景技术

治疗性蛋白产品如抗体的有效生产，需要进行适于该产品的细胞系的开发和鉴别。多年以来，细胞系开发经历了几次改进，特别是为了满足使用如此复杂的宿主作为生产平台时，缩减时间和成本的需求。在细胞系开发和细胞工程方法中产生的改进能够用于增加产量，促进细胞代谢，控制增殖和凋亡，以及降低不稳定性。

考虑到抗体的相对大的尺寸和复杂的翻译后修饰，抗体的生产存在独特的挑战性。尤其是那些包含两个独立结合单元的，需要在一个细胞中同时表达两个单元的双特异性抗体，更难以生产。

发明内容

技术问题

本申请，在一个实施例中，提供适于生产双特异性抗体的细胞的制备方法和组合物。一方面，多个真核细胞在与一种试剂孵育的条件下使细胞停留在G1/S期。然后该试剂从细胞中去除，，细胞转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体。从多个细胞中鉴别出同时表达第一和第二抗原结合单元的细胞。

问题解决方案

技术解决方案

在一个实施例中，提供一种用于制备适于生产双特异性抗体的细胞的方法，所述方法包括：(a)多个真核细胞与一种试剂孵育，在此条件下使细胞停留在G1/S期；(b)从该细胞中去除该试剂；(c)该细胞转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体；和(d)从多个细胞中鉴别出同时表达第一和第二抗原结合单元的细胞。在某些方面，所述试剂为胸苷。

在某些方面，所述第一或第二载体进一步包含编码荧光蛋白的序列。

在某些方面，每个载体进一步包含编码显示不同荧光的荧光蛋白的序列。

在一个实施例中，还提供细胞生产和分泌双特异性抗体的测定方法，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元的序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元的序列的第二载体，所述方法包括：(a)将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和第一抗原和(ii)第二抗原接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至第一抗原结合单元，第二抗原结合至第二抗原结合单元；和(b)第二抗原连接到细胞的检测，由此测定该细胞生产和分泌包含该第一抗原结合单元和该第二抗原结合单元的双特异性抗体。

在某些方面，第二抗原是由第一荧光颜色荧光标记的，其中所述检测包括鉴别显示该第一荧光颜色的细胞颗粒。

在某些方面，第二抗原是由第一荧光颜色荧光标记的，且所述载体的至少之一包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白的序列，其中所述检测包括鉴别同时显示第一荧光颜色和第二荧光颜色的细胞颗粒。

在一个实施例中，还提供一种方法，测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的单价抗原结合单元、单链可变片段(scFv)序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的重链和轻链两者共同形成单价抗原结合单元序列的第二载体，所述方法包括：(a)将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和第一抗原，和(ii)具有轻链特异性的抗体接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至第一抗原结合单元，并且该抗体结合至轻链；和(b)检测该抗体连接至细胞，由此测定该细胞生产和分泌双特异性抗体，该抗体包含scFv和具有重链和轻链的抗原结合单元。

在某些方面，该抗体由第一荧光颜色所荧光标记，并且其中该检测包括鉴别显示第一荧光颜色的细胞颗粒。在某些方面，该抗体由第一荧光颜色所荧光标记，并且第一载体进一步包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白的序列，其中该检测包括鉴别同时显示第一荧光颜色和第二荧光颜色的细胞颗粒。

在一个实施例中，提供一种方法，用于测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码具有第一抗原特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和编码具有第二抗原特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体，并且其中第一抗原结合单元和第二抗原结合单元能形成具有Fc片段的双特异性抗体，所述方法包括：(a)将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和特异性结合Fc片段的蛋白，(ii)第一抗原，和(iii)第二抗原接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述蛋白结合至Fc片段，第一抗原结合至第一抗原结合单元，以及第二抗原结合至第二抗原结合单元；和(b)检测第一抗原和第二抗原连接至细胞，由此测定该细胞生产和分泌包含第一抗原结合单元和第二抗原结合单元的双特异性抗体。

在某些方面，第一抗原是由第一荧光颜色荧光标记的，并且第二抗原是由第二荧光颜色荧光标记的，其中所述检测包括鉴别同时显示第一荧光颜色和第二荧光颜色的细胞颗粒。

在一个实施例中，还提供一种方法，用于测定生产和分泌双特异性抗体的细胞，其中该细胞已转染包含编码具有第一抗原特异性的单价抗原结合，单链片段(scFv)序列的第一载体和包含编码具有第二抗原特异性的重链和轻链共同形成单价抗原结合单元序列的第二载体，所述方法包括：(a)将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和特异性结合Fc片段的蛋白，(ii)第一抗原，和(iii)具有轻链特异性的抗体接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述蛋白结合至Fc片段，该第一抗原结合至ScFv，以及该抗体结合至轻链；和(b)检测连接至细胞的第一抗原和抗体，由此测定该细胞生产和分泌包含scFv和具有重链和轻链抗原结合单元的双特异性抗体。

发明有利功效

有利功效

在某些方面，第一抗原是由第一荧光颜色荧光标记的，并且抗体是由第二荧光颜色荧光标记的，其中所述检测包括鉴别同时显示第一荧光颜色和第二荧光颜色的细胞颗粒。

简要附图说明

附图说明

本申请的实施例提供的附图，仅为举例说明，并无限制，其中：

图1说明常规的细胞系开发技术的一般时间轴，和本技术的其中一个实施例的时间轴；

图2-6显示用于筛选细胞的复合体的不同形成方式，该复合体包括细胞和该细胞分泌的双特异性抗体；

图7说明如何分选同时表达双特异性抗体结合单元的阳性细胞；

图8说明半固体培养基克隆机制；

图9显示用于定量双特异性抗体用途的双抗原/双特异性抗体夹心的形成；

图10A-C说明细胞系稳定性测定方法；

图11显示实例1里使用的工艺流程图；

图12A-B包括用于表达双特异性抗体的两个构建的质粒图谱；

图13A-B比较有或者无细胞同步化的转染效率和蛋白表达；和

图14A-B显示14天和5天产量评估的相关性。

部分或所有的附图为实例的示意性代表；因此，它们不必描绘所显示的元件的实际的相对尺寸或者位置。所述附图用于清楚的理解一个或更多的实施例的说明，它们将不用于限制后述的权利要求的范围或者含义。

发明方式

在本申请的所有方面，该文本提及各种不同的营养物，组合物，和方法的实施例。所描述的这些不同的实施例对于提供多种说明的实例很重要，并且不应被解释为可替换物种的描述。在一定程度上应该注意本文的不同的实施例的描述可能属于重叠范围。本文讨论的所述实施例仅为说明且不限制本申请的范围。

还有，在整篇的本申请中，不同的出版物，专利和发表的专利说明书都是通过标识引证被引用。这些出版物，专利和发表的专利说明书的公开文本在此通过引用结合至本申请到更多的完全描述本领域有关本申请的情况。

定义

用于说明书和权利要求的，单数形式“一”包括复数参数，除非在其他地方的语境中清楚地规定。例如，术语“一个电极”包括多个电极，含它的混合状态。

本文使用的，术语“包含”规定为设备和方法包括详述的部件或者步骤，但不排除其他。”组成本质上用于定义设备和步骤，应该表示为排除任何属于组合必要重要性的其他部件或者步骤。”组成应该表示为排除其他部件或步骤。由这些过渡术语中任何一个定义的实施例都在本申请的范围内。

所有数值的名称，例如，距离，尺寸，温度，时间，电压和浓度，包括方位，是0.1幅度变化(+)或(-)的近似。可以理解，尽管不是一直明确陈述的所有数值名称之前有术语“大约”。还可以理解，尽管不是一直明确陈述，本文描述的部件仅是典型的并且其等价物技术上是已知的。

本文使用的，术语“多肽”用于包括单数“多肽”和复数“多肽”，并且也指由通过酰胺键(也认为是肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两或者多个氨基酸的任一条或多条链，而不是指特异长度的该产物。因此，多肽，二肽，三肽，寡聚肽，“蛋白”，“氨基酸链”，或者是指两或者多个氨基酸的链或链们的任何其他术语，是包括于“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可能用于代替，或者与任何这些术语可互换的。术语“多肽”也规定为是指多肽的表达后修饰的产物，包括不限通过已知的保护/封闭基团，蛋白水解切割的糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，衍生化，或者通过非天然存在氨基酸的修饰。一个多肽可能获得于天然的生物学资源或者重组技术生产，但并非必须翻译于一段指定的核酸序列。它可能产生于任何方式，包括化学合成。

“同源性”或“一致性”或“相似性”是指两个多肽或者两个核酸分子的序列的相似性。同源性能够通过比较每段序列的位置而确定，该序列可能是用于比较而比对。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或者氨基酸占据，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是共享的序列的匹配或者同源位置数量的函数。“非相关的”或“非同源的”序列，与本申请的其中一段序列，共享低于40％一致性，虽然优选地为低于25％一致性。

一个多核苷酸或者多核苷酸区域(或者多肽或者多肽区域)对另一序列具有一定的百分比(例如，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％)的“序列一致性”，即为比对时，在这比较两段序列中碱基(或氨基酸)的百分比相同。比对和百分比同源性或者序列一致性能通过技术上已知的软件程序确定，例如那些说明于Ausubel等编(2007)Current Protocols in Molecular Biology。生物学上等价的多核苷酸是具有如上所示的特异性百分比同源性和编码的多肽具有相同或相似生物学活性。

术语“等价的核酸或者多核苷酸”是指与核酸或者其互补的核苷酸序列的具有一定程度的同源性，或序列一致性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物规定为包括具有与其或其互补有一定程度同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸同源物能杂交于核酸或其互补。同样地，“等价的多肽”称为与参照多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性或序列一致性的多肽。在某些方面，序列一致性至少约为70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或者99％。在某些方面，等价的序列保留参照序列的活性{例如，抗原表位-结合}或结果{例如，盐-桥}。

杂交反应能在不同的“严格度”条件下进行。一般来说，低的严格度杂交反应在约40℃的10×SSC或者等价的离子强度/温度的溶液中进行。中等严格度杂交典型地进行在约50℃的6×SSC中，以及高的严格度杂交反应通常进行在约60℃的约1×SSC中。杂交反应还能进行在所属技术领域专业人员众所周知的“生理学条件”下。一种生理学条件的非限制性实例是在细胞中正常发现的温度，离子强度，pH和Mg²⁺浓度。

本文使用的，术语“检测标记”规定直接或间接的检测性混合物或者组合物被直接或者间接偶联至该组合物以被检测，例如，多核苷酸或者蛋白如抗体为了产生“标记的”组合物。该术语还包括，结合至该多核苷酸的序列，其通过插入序列的表达提供信号，如绿色荧光蛋白(GFP)等。该标记可能是通过它自身(例如放射性同位素标记或荧光标记)或者，就酶的标记来说，可能催化可检测的底物混合物或者组合物的化学变换。该标记能适用于小规模检测或者更适用于高通量筛选。就其本身而言，合适的标记包括，但不限于放射性同位素，荧光物，化学发光混合物，染料，和蛋白，包括酶。标记可能易于被检测或者被定量。一种反应易于被检测一般包含其存在仅为确认的反应，然而定量的反应一般包含具有定量性的(可报告数量的)值，如强度，极性，和/或其他特性。发光或荧光分析中，检测性反应可能直接产生于使用与分析成分相关的实际涉及到结合的一种发光体或荧光基团，或者间接使用与另一种(例如报告物或指示物)成分连接的一种发光体或荧光基团。

本文使用的，“抗体”或“抗原结合多肽”是指多肽或多肽复合体，其特异地鉴别和结合一种抗原。抗体可为整个抗体和任何抗原结合片段或由此而来的单链。因此术语“抗体包括含有包含至少一部分具有结合该抗原的生物学活性的免疫球蛋白分子的任何蛋白或肽。此类实例包括，但不限于重链或轻链的互补决定区(CDR)或由此而来的配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架(FR)区，或任何由此而来的部分，或至少结合蛋白的一部分。

术语“抗体片段”或“抗原结合片段”，本文使用的，是如F(ab’)₂，F(ab)₂，Fab’，Fab，Fv，scFv和类似物的一部分。不考虑结构，抗体片段结合于被完整抗体鉴别的相同的抗原。术语“抗体片段”包括适配体，适配体对映体(spiegelmers)，和双体(diabodies)。术语“抗体片段”还包括任何合成的或遗传学的工程化的蛋白，其表现类似通过结合至特异性抗原以形成复合体的抗体。

“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(V_H)和轻链(V_L)可变区的融合蛋白。在某些方面，这些区由10到约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，以及能将VH的N-末端连接至VL的C-末端，反之亦然。该蛋白保留原初免疫球蛋白的特异性，只是去除恒定区并引入接头。ScFv分子在本领域已知且描述于美国专利5,892,019中。

术语“抗体”含有各种宽泛的多肽类型，其能从生物化学上区分。该技术领域的专业人员应理解重链分为gamma，mu，alpha，delta，或epsilon以及其中一些亚型。该链的天然属性决定抗体的“类型”分别为IgG，IgM，IgA，IgD，或IgE。免疫球蛋白亚型(同型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgG5，等特征明确并且已知被赋予功能的特化。这些类型和亚型的每一种的修饰版本易于被查看本申请的专业人员鉴别和，相应地，属于本申请的范围。所有免疫球蛋白类型明确地属于本申请的范围，下列讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG类型。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两条相同的分子量大概是23，000道尔顿的轻链多肽，和两条相同的分子量是53000-70000道尔顿的重链多肽。这四条链通常由二硫键连接成“Y”构型，其中轻链于“Y”的开口处托架重链并延伸穿过可变区。

本申请的抗体，抗原结合多肽，变体，或由此而来的衍生物包括，但不限于，多克隆的，单克隆的，多特异性的，人的，人源化的，灵长类化的，或嵌合的抗体，单链抗体，抗原表位-结合片段，例如，Fab，Fab’和F(ab’)₂，Fd，Fvs，单连Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，片段包含VL或VH结构域，由Fab表达文库产生的片段，和抗-个体基因型的(anti-Id)抗体(包括，例如，本文所述的anti-Id抗体到轻抗体)。本申请的免疫球蛋白或者抗体分子能属于免疫球蛋白分子的任何种类(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA，和IgY)，类型(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚型。

轻链分为kappa或lambda。每一重链类型可能与一种kappa或lambda轻链结合。一般的，轻链和重链互相共价结合，并且当免疫球蛋白均产生于杂交瘤，B细胞或遗传学工程宿主细胞时两条重链的“尾”部通过共价二硫连接或者非共价连接互相结合。重链中，氨基酸序列为从Y构型的分叉末梢的N-末端到每条链底部的C-末端。

轻链和重链都分为结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”是指功能性。在这点上，轻链可变结构域(VL)部分和重链可变结构域(VH)部分在确定抗原识别和特异性方面是重要的。相反地，轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1，CH2和CH3)具有重要的生物学特性，如分泌，经胎盘的移动，Fc受体结合，补体结合，及类似特性。根据惯例，恒定区结构域编号增加是由于其距离抗原结合位点或抗体氨基-末端更远。N-末端部分为可变区并且C-末端部分为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基-末端。

如上所述，可变区使抗体挑选性鉴别和特异性结合抗原表位。就是说，抗体的VL结构域和VH结构域，或者互补决定区(CDRs)的子集，组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。该四元抗体结构形成呈现于Y的每一条臂末梢的抗原结合位点。更特别的是，抗原结合位点由每一VH和VL链的三个互补决定区(即CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3)确定。在某些实例中，例如，特定的免疫球蛋白分子来自骆驼种或基于骆驼免疫球蛋白的工程化，一个完整的免疫求蛋白分子可能仅由重链组成，没有轻链。参见例如：Hamers-Casterman et al.,Nature 363：446-448(1993)。

天然产生的抗体中，在每个抗原结合结构域中的6个“互补决定区”或“CDR”是短的，非连续的氨基酸序列，当抗体在水环境中呈现其三维结构时该序列被特别地定位以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中氨基酸的剩余部分，为“框架”区，显示更低的分子间可变性。框架区主要采用一种β-折叠构象，并且CDR形成环以连接，及在某些情况下形成部分的，β-折叠结构。因此，框架区表现为形成一种支架，以保证通过链间的，非共价的相互作用而正确定向的CDR的定位。通过定位的CDR形成的抗原结合结构域决定免疫反应抗原对抗原表位的表面互补。该互补表面促进抗体非共价结合于其同源抗原表位。分别包含CDR和框架区的氨基酸，对于任何给定的重或轻链可变区，能易于被本领域的专业人员鉴别，因其已被精确定义(见“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,Kabat,E.,等,美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol,196:901-917(1987)，其在此通过引用以全文形式结合至本文)。

例如在本领域中使用和/或接受的有两个或者多个定义的术语，本文用到的术语定义倾向于包括所有此类意义，除非精确描述了对立之处。一个具体实例为术语“互补决定区”(“CDR”)用于说明重链和轻链的可变区中的非邻近抗原结合位点。该特定区域已说明于Kabat等，美国卫生和公共服务部，“Sequences of proteins of ImmunologicalInterest”(1983)和Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其在此通过引用以全文形式结合至本文。当相互比较时，根据Kabat和Chothia的CDR定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，每个适用于抗体或由此而来的变体的CDR定义的应用在本文定义和使用的术语范围内。含有特定CDR的精确残基数量将依CDR的序列和尺寸而变化。本领域的专业人员通常能确定包含提供抗体的可变区氨基酸的特定CDR的残基。

本文所述的抗体可能来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人，小鼠，驴，兔，山羊，天竺鼠，骆驼，美洲驼，马，或鸡的抗体。在另一个实施例中，可变区来自软骨鱼(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。

本文使用的术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下其中一种：CH1结构域，铰链(例如，上部，中部，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或由此而来的变体或片段。例如，用于本申请中的抗原结合多肽可能包含含有CH1结构域的多肽；含有CH1结构域的多肽链，铰链结构域的至少一部分，和CH2结构域；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽；含有CH1结构域的多肽链，铰链结构域的至少一部分，和CH3结构域，或含有CH1结构域的多肽链，铰链结构域的至少一部分，CH2结构域，和CH3结构域。在另一个实施例中，本申请的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。另外，用于本申请中的抗体可能缺失至少一部分的CH2结构域(例如，所有或部分的CH2结构域)。如上文所述，本领域的一般技术人员应理解重链恒定区可能被修饰以至于它们与来自天然产生的免疫球蛋白分子的氨基酸序列不同。

本申请的抗体重链恒定区可能来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可能包含来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3的铰链区。在另一个实例中，重链恒定区可包含部分来自IgG1分子且部分来自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来自IgG1分子且部分来自IgG4分子的嵌合铰链。

本文使用的，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区至少包含恒定kappa结构域或恒定lambda结构域之一。

“轻链-重链对”是可形成二聚体的轻链和重链的集合，该二聚体通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成。

如前所述，各种免疫球蛋白类型的恒定区的亚基结构和三维结构是已知的。本文使用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端的)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域并且为免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端。

本文使用的术语“CH2结构域”包括重链分子的一部分，其范围，例如，从使用常规编号方案(残基244到360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；见Kabat等，美国卫生和公共服务部，“Sequence of proteins of Immunological Interest”(1983)。)的抗体的约残基244到残基360。CH2结构域是独特的因其与另一个结构域不是紧密配对。相反，两条N-连接的支链糖链插入至完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。有文献记载CH3结构域的范围是从CH2结构域到IgG分子的C-末端且包含大约108个残基。

本文使用的，术语“铰链区”包括重链分子的一部分，连接CH1结构域和CH2结构域。该铰链区包含约25个残基且是柔性的，因此使两个N-末端的抗原结合区独立地活动。铰链区可分成三个不同的结构域：上部，中部，和下部铰链结构域(Roux等，J.Immunol 161：4083(1998))。

本文使用的术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含巯基，可与第二个巯基形成二硫键或桥连。在多数天然产生的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过用Kabat编号系统定位于239和242(位于226或229，EU编号系统)的两个二硫键连接。

本文使用的，术语“嵌合抗体”应用于指下述任何抗体：获得或来自第一物种的免疫反应区和获得自第二物种的恒定区(该恒定区可能为完整的，部分的或者根据本申请修饰过的)。在特定的实施例中，目标结合区或位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类)且恒定区为人的。

所谓“特异性结合”或“对…有特异性”，通常意为抗体通过其抗原结合结构域结合至抗原表位，且该结合使得抗原结合结构域和抗原表位之间有互补性。根据该定义，抗体被认为“特异性结合”至抗原表位，是抗体通过其抗原结合结构域结合至所述抗原表位时，比其结合至随机的，无关的抗原表位更容易。本文使用的术语“特异性”以确定特定的抗体结合至特定抗原表位的相对亲和力。例如，抗体“A”可能被视为对一给定抗原比抗体“B”具有更高的特异性，或者抗体“A”可能被认为结合至抗原表位“C”比其对于相关抗原表位“D”具有更高的特异性。

本文使用的术语“融合的”，“连接的”和“偶联的”是双特异性抗体中的第一抗原结合的基元和第二抗原结合的基元之间的连接。该连接可能通过重组(例如重组的融合蛋白)或化学方式介导。合适的化学方式的非限制实例包括共价键，二硫键，氢键，静电键，和构象键以及可能涉及同源双功能的或异源双功能的交叉接头。合适的交叉连接和偶联方法公开于Sen等，J.Hemato.Stem Cell Res.2001，10：247-260；美国专利号6,642,363和美国申请号200600002852.

细胞系开发

本申请提供用于产生和挑选适合双特异性抗体生产的细胞系的组合物和方法。总的来说，该技术应用于任何包括靶向不同抗原或抗原表位的两个不同的结合结构域的双特异性抗体。然而该技术的某些方面，能尤其适合含有分别位于不同肽链的两个结合结构域的双特异性抗体。

常规的抗体生产技术中，通常需要6-8个月产生和挑选合适的细胞系。常规步骤包括I期细胞系挑选(1个月)，II期细胞系挑选(1个月)，单克隆鉴定和生产评估(0.5个月)，稳定性评估(1个月)，以及亚克隆挑选(3.5个月)。但使用本技术，稳定生产双特异性抗体的细胞系能在约100天内建立。这些时间轴的对比已在图1中说明。说明那个本申请的更多细节的流程图在图11中。

1.细胞同步化和转染

本文发现转染前的细胞周期同步化能极大地提高转染效率，尤其当两个不同的核苷酸构建体需要转染进细胞时(见实例1和图13A)。没有联系任何理论，预计同步化的细胞可确保平衡两个构建体的引入，导致正确配对的双特异性抗体产物的更高产量，该产物为异源二聚体。此外，特定的细胞周期，尤其是G1/S之后，可能更利于细胞转染和染色体整合。

因此，在一个实施例中，细胞群体在细胞-周期停留试剂的条件下处理，使细胞停留在特定的细胞周期。一方面，细胞为真核细胞，如酵母细胞和哺乳动物细胞(例如CHO细胞或其他人类细胞)。另一方面，细胞为原核细胞如E.coli细胞。

“细胞-周期停留试剂”为一种试剂，能停留细胞周期于特定时期。许多已知的细胞-周期停留试剂，包括许多商业上可获得的，如胸苷(thymidine)，甲氨蝶呤(methotrexate)，和羟基脲(hydroxyurea)。在一个特定的实施例中，细胞周期停留试剂为胸苷。

一方面，在大约室温下5％CO₂条件下孵育8至24小时。但该孵育条件，对于每种试剂和细胞系可微调。一方面，胸苷使用浓度为从约0.5mM至约5mM。一方面，胸苷浓度至少为约0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，0.9mM，1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM或4mM。另一方面，胸苷浓度不能超过约5mM，4.5mM，4mM，3.5mM，3mM，2.5mM，或2mM。

不同的试剂可能抑制细胞于不同的时期，但仍可达到相同的同步化结果。例如，如果试剂停留细胞于G1期，在试剂去除后，细胞可生长至G2，M，或S期。并且，所有的细胞处于相同的时期，达到同步化目标。一方面，去除细胞-周期停留试剂之后，细胞在转染前至少孵育2小时。另一方面，细胞至少孵育3，4，5，6，7，8，9，10或12小时。另一方面，孵育时间不能超过18，16，15，14，13，12，10，9，8，7，6，5，或4小时。

同步化的细胞，例如在G1/S，G2或M期，然后与核苷酸构建体一起孵育以开始转染。在某些方面，使用至少两个不同的构建体，每一个编码一个单独的抗原结合单元。一方面，每个构建体包括一种抗生素抗性基因用于基于抗生素的细胞挑选(I期挑选)。

2.细胞表面双特异性抗体鉴别

基于抗生素的I期细胞挑选之后，细胞可被筛选用于双特异性抗体的真实表达和分泌。一方面，细胞与能结合细胞和抗体的复合体孵育于培养基中。

图2-6说明用于生产和分泌期望的双特异性抗体的细胞鉴别方法。参考图2，细胞(1)与复合体(注释为2，“B-N-A复合体”)。该复合体包括能结合细胞(“细胞-结合单元”)的单元和可结合双特异性抗体的单元。

“细胞-结合单元”是分子或基元，能结合至细胞，例如通过结合细胞表面受体或细胞膜蛋白。例如，细胞-结合单元可为鉴别细胞膜蛋白的抗体或结合至所述细胞表面受体的配体。图2中说明，细胞-结合单元为伴刀豆球蛋白(concanavalin)A(Con A)。Con A(或琥珀酰-Con A)通过膜表面糖蛋白的糖基非特异地结合至所述细胞表面。

复合体还包括结合至双特异性抗体的单元。图2中说明，该单元为双特异性抗体靶向的抗原(抗原1)之一。

两个结合单元通过两个生物素和一个中性亲和素(neutravidin)聚合于复合体。因此，一旦与细胞接触，复合体能够通过细胞-结合单元/细胞膜连接结合至细胞。同时，如果细胞分泌双特异性抗体(3)，该复合体也会结合抗体，形成“细胞-复合体-抗体”复合体。

由于抗体的双特异性，这样的细胞-复合体-抗体容易通过结合抗体的第二抗原(抗原2)所检测，尤其当抗原2标记了荧光染料时(图2)。在某些实施例中，转染至细胞的构建体至少之一会编码荧光蛋白，以至于自身为荧光标记的。在某些方面，细胞和抗原2显示不同的荧光以至于双染色进一步确定形成含细胞和双特异性抗体的大的复合体。

本文的细胞中的荧光，不是必须的。图3中显示，包括细胞，双特异性抗体和两种抗原的大的复合体易于通过抗原2体的荧光和复合体的大尺寸所鉴别，例如。

在某些方面，双特异性抗体是单价和单链抗体(MSBODY)，其包括来自具有第一特异性的完全抗体的轻链-重链配对，连接至具有第二特异性的单链单元(ScFv)。更多MSBODY的描述可在PCT/CN2012/084982中查找，其中的内容在此通过引用以全文形式结合至本文。对于特定的双特异性抗体，在图4A-B中说明的该检测方法也可使用。

图4A中，相同的B-N-A复合体可用于图2。但不同于抗原2，鉴别免疫球蛋白(Ig)轻链的抗体可被使用，假如抗体的scFv单元特异于抗原1。而且，图4B中，容易理解抗-轻链抗体可取代复合体(称为B-N-B复合体)中的抗原1，当抗原1可独立，选择性地标记荧光染料。还有一方面，细胞可无荧光或由构建体之一编码的荧光蛋白所标记。

在某些实施例中，连接细胞和双特异性抗体的复合体能产生其他形式，如图5和6中说明的。例如，如图5所示，复合体(称为B-N-P复合体)包括连接至Fc结合单元的细胞结合单元。“Fc结合单元”是任何分子或基元，可结合至免疫球蛋白的Fc片段。此类结合分子的实例在本领域是众所周知的，例如蛋白A，是56kDa表面蛋白，最早发现于细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中。蛋白A由spa基因编码并结合至免疫球蛋白的Fc片段。如图6所示，“抗人Ig CL抗体”为抗人免疫球蛋白(Ig)轻链恒定区抗体。

B-N-P复合体能结合至细胞和双特异性抗体。为检测确认这些结合，抗体靶向的两种抗原(抗原1和抗原2)可加入至孵育中。在某些方面，抗原的至少其中一种是用荧光染料标记。在某些方面，两种抗原都被标记，优选的用不同颜色的染料(图5)。

另外，对于MSBODY，除了使用两种抗原，复合体还能用鉴别轻链的抗体及scFv鉴别的抗原检测(图6)。

在上述的某些实施例中，最终的复合体为用单荧光染料或两种不同的荧光染料标记的细胞。这些复合体可用这些染料分选出来。例如，用两种不同的染料，图7说明FACS(荧光激活细胞分选)机制，其中双荧光复合体被分选和收集。

以上实验可在常规细胞培养基中进行。在某些方面，孵育和检测在半固体培养基中进行，该培养基可能因其限制细胞运动并能便于复合体形成而有效。另外，如果细胞，复合体和抗原在半固体培养基中孵育，克隆，而不是细胞，可挑选出用于进一步培养。

图8说明半固体培养基中的此类克隆挑选过程。复合体和抗原或抗体已在上述图2-7中解释。半固体培养基可由，例如，基本培养基中加入1％甲基纤维素来制备。

图8的左图说明细胞-抗体双荧光克隆化。细胞为荧光标记并在半固体培养基中与荧光抗人Ig CL抗体共孵育，因此右边的克隆为双荧光。双荧光都高强度的细胞克隆被挑至96孔板用于II期挑选。

在中图，抗原(Ag)-抗体(Ab)双荧光克隆被挑选。荧光抗原和荧光抗人Ig CL抗体加至含1％甲基纤维素的基本培养基中。可观察到双荧光，如果克隆分泌MSBODY。这些克隆被挑至96孔板用于II期挑选。

右图显示单荧光克隆化。这里，抗人Ig CL抗体和荧光抗原加至半固体培养基(基本培养基+1％甲基纤维素)。有高荧光强度的克隆被挑至96孔板用于II期挑选。

3.II期挑选和ELISA筛选

挑选的细胞或细胞克隆可进行II期挑选。例如，每一个细胞或克隆置于96孔板的一孔中。抗生素，尤其是浓度大于I期所使用的，可用于挑选细胞。

II期挑选后，细胞可进一步用基于ELISA的筛选方法以确认，该方法的更多细节描述如下。96孔板的每一个样品可选择性地处理以去除培养基中的细胞。然后，样品置于固相(例如板，孔或珠)上，该固相包被有双特异性抗体靶向的第一抗原(抗原1)。

一旦双特异性抗体接触抗原1，它将结合抗原1并固定于固相上(图9)。同时，如果双特异性抗体的另一个靶标，抗原2，也出现在溶液中，该双特异性抗体也将结合抗原2，形成固相-抗原1-双特异性抗体-抗原2复合体。这样的复合体易于检测且通过，例如，偶联的信号放大器(例如，辣根过氧化物酶，或HRP)定量。

这样的抗体定量方法通常应用于任何的双特异性抗体。该方法是快速，精确和划算的，因为它甚至不需要任何抗体或者第二抗体。

因此，在一个实施例中提供了用于检测或对于第一抗原和第二抗原具有特异性的双特异性抗体的一种方法。该方法需要用第一抗原和第二抗原接触含双特异性抗体的样品，在此条件下，使第一和第二抗原结合至该抗体。一方面，抗原的至少其中之一贴附或固定于固定支持物，例如板，孔或珠。一方面，另一抗原包含检测标记。

一方面，检测标记为荧光染料。另一方面，检测标记与产生荧光的试剂反应。

4.产量评估和稳定性测定

基于分泌的双特异性抗体的定量和培养条件及时间，产量评估可开展，如实例1和图14A-B中说明的。

为测定挑选的细胞系的稳定性，细胞可固定，透膜及用抗hIg CL抗体染色(见，例如，图2-6)，该抗体用不同于细胞内源荧光的荧光标记。然后染色的细胞可用流式细胞学分析。图10A显示两种有代表性的荧光图谱，其可用于确定细胞系的稳定性。在上图中，15代之后，流式细胞学显示相同的单峰，表明该细胞系是稳定的。与此相对的，在下图中，所有流式细胞学图谱显示两个更多峰以及一些峰在传代后偏移。这些说明是不稳定细胞系。

在某些实施例中，本申请提供包含使用成分的试剂盒，和使用说明。

实施例

实例1生产双特异性抗体的稳定细胞系的产生，挑选和评估

该实例在图11中流程图所说明的过程之后。构建了两个都具有双启动子的质粒，每个编码了双特异性抗体的一个结合单元。图12A显示了双特异性抗体的单链单元(scFv-Fc融合肽)的图谱。除了scFv-Fc融合肽，该图谱还包括编码红色荧光蛋白(RFP)的序列和抗生素抗性基因(潮霉素hygromycin)。

图12B中的质粒编码双特异性抗体的单价单元的轻链和重链。这里，没有显示荧光蛋白序列但该质粒也包括抗生素抗性基因(嘌呤霉素puromycin)。双抗性的使用利于确保两种质粒的整合。

在步骤II，胸苷加至细胞悬液(CHO细胞)并在37℃，5％CO₂孵育过夜。胸苷浓度为2mM但可改变在0.5mM到5mM之间。去除胸苷，细胞生长6小时，在进行转染之前。转染之前细胞同步化于G1/S期。

双抗体ELISA用于转染两天后的定量。如图13B所示，胸苷处理组的产量显著高于未处理组的，表明细胞周期同步化有利于提高转染效率(图13A)。这里，组1和组2表达不同的双特异性抗体。

转染后两天，细胞换液至新鲜培养基，添加潮霉素和嘌呤霉素并在37℃，5％CO₂中培养若干天，经历I期抗生素选择。

两周后，用抗原1表面处理细胞并于半固体培养基在在37℃，5％CO₂孵育过夜；然后用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗原2对细胞染色。接下来，双阳性细胞(RFP和FITC)通过流式细胞仪分选至96孔板中，再用更高浓度的抗生素进行II期抗生素选择。分选的细胞在37℃，5％CO₂中培养两周。

双抗原夹心ELISA(图9)用于克隆筛选，放弃阴性克隆。

克隆扩增及接种于6孔板，密度为0.3×10⁶/mL，并在37℃，5％CO₂中培养5天。克隆上清通过双抗原夹心ELISA定量并挑选阳性克隆。

常规上，扩增后产量评估进行14天。但是，如图14A-B所示，第14天的产量和第5天的产量之间有良好的相关性。由此，本文发现5天评估足够用于评估细胞系的产量。这能缩短细胞系开发的时间轴。

为测定细胞系的稳定性，细胞被固定，透膜和由FITC偶联的抗人CL抗体染色。染色的细胞用流式细胞仪分析，通过涉及RFP和FITC的两种荧光通道，两种荧光都是单峰的表明是稳定细胞系(图10B)。

常规技术中，细胞连续培养60代，然后比较原始细胞和60代细胞的14天产量(图10C)。如果产量的降低少于20％，则认为该细胞系稳定。图10C中，根据60代产量评估结果，克隆1稳定，克隆2不稳定。这里，用染色和改进的转染方法，仅15代后即可评估细胞系稳定性(图10B)。

可以理解，当本申请描述于与上述实施例的联系中时，前述的说明和实例将阐明且不限于本申请的范围。其他方面，本申请的范围中的优点和修改对于与本申请相关的本领域专业人员是显而易见的。

本申请不限于所描述的具体实施例的范围内，这些具体实施例作为本申请的各个方面的单独描述，并且任何在功能上等同的组合物和方法都在本申请的范围内。对于本领域专业人员显而易见的是，可以对本申请的方法和组合物进行各种修改和变化而不脱离本申请的精神或范围。因此，应理解本申请覆盖了本申请的修改和变化，只要它们在所附权利要求及其等同物的范围内。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请在本文中均引用至此，其引用程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地通过引用结合至此。

Claims

1.一种方法，用于制备适合生产双特异性抗体的细胞，所述方法包括：

用一种试剂孵育多个真核细胞，在此条件下使细胞停留于G1/S期；

从该细胞中去除该试剂；

转染该细胞，用含有编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和含有编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体；和

鉴别来自所述多个细胞中同时表达所述第一和第二抗原结合单元的细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂为胸苷。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一或第二载体进一步包含编码荧光蛋白的序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中每一载体进一步包含编码荧光蛋白的序列以显示不同的荧光。

5.一种方法，用于测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元的序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元的序列的第二载体，所述方法包括：

将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和第一抗原，和(ii)第二抗原接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至所述第一抗原结合单元，所述第二抗原结合至所述第二抗原结合单元；和

检测所述第二抗原连接到所述细胞，由此测定该细胞生产和分泌包含所述第一抗原结合单元和所述第二抗原结合单元的所述双特异性抗体。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第二抗原是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且其中所述检测包括鉴别显示所述第一荧光颜色的细胞颗粒。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述第二抗原是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且所述载体的至少之一包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白序列，并且其中所述检测包括鉴别同时显示所述第一荧光颜色和所述第二荧光颜色的细胞颗粒。

8.一种方法，用于测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的单价抗原结合，单链可变片段(scFv)序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的重链和轻链共同形成的单价抗原结合单元序列的第二载体，所述方法包括：

将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和第一抗原，和(ii)对轻链具有特异性的抗体接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至所述第一抗原结合单元，所述抗体结合至轻链；和

检测抗体连接到细胞，由此测定该细胞生产和分泌包含所述scFv和具有重链和轻链的抗原结合单元的所述双特异性抗体。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且其中所述检测包括鉴别显示该第一荧光颜色的细胞颗粒。

10.如权利要求9所述的方法，其中该抗体是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且该第一载体进一步包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白的序列，及其中所述检测包括鉴别同时显示所述第一荧光颜色和所述第二荧光颜色的细胞颗粒。

11.一种方法，用于测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的单价抗原结合、单链可变片段(scFv)序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的重链和轻链共同形成的单价抗原结合单元序列的第二载体，所述方法包括：

将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和对轻链具有特异性的抗体，和(ii)第一抗原接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述第一抗原结合至所述第一抗原结合单元，所述抗体结合至轻链；和

检测所述第一抗原连接到细胞，

由此测定该细胞生产和分泌包含所述scFv和具有重链和轻链的所述抗原结合单元的双特异性抗体。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一抗原用第一荧光颜色所标记，并且其中所述检测包括鉴别显示第一荧光颜色的细胞颗粒。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一抗原是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且该第一载体进一步包含编码具有第二荧光颜色的荧光蛋白序列，以及其中所述检测包括鉴别第一荧光颜色和第二荧光颜色都显示的细胞颗粒。

14.一种方法，用于测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的第一单价抗原结合单元序列的第一载体和包含编码针对第二抗原具有特异性的第二单价抗原结合单元序列的第二载体，其中该第一抗原结合单元和该第二抗原结合单元可形成具有Fc片段的双特异性抗体，所述方法包括：

将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和特异性结合Fc片段的蛋白，(ii)所述第一抗原，和(iii)所述第二抗原接触，在此条件下使复合体结合至所述细胞表面，所述蛋白结合至Fc片段，所述第一抗原结合至第一抗原结合单元，以及所述第二抗原结合至第二抗原结合单元；并且检测所述第一抗原和所述第二抗原连接至细胞，

由此测定该细胞生产和分泌包含所述第一抗原结合单元和所述第二抗原结合单元的双特异性抗体。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一抗原是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且所述第二抗原是用第二荧光颜色所荧光标记的，其中所述检测包括鉴别第一荧光颜色和第二荧光颜色都显示的细胞颗粒。

16.一种方法，用于测定细胞生产和分泌双特异性抗体，其中该细胞已转染包含编码针对第一抗原具有特异性的单价抗原结合，单链可变片段(scFv)序列的第一载体和包含编码重链和轻链共同形成的针对第二抗原具有特异性的单价抗原结合单元序列的第二载体，所述方法包括：

将所述细胞与(i)一种复合体，包含细胞结合试剂和特异性结合Fc片段的蛋白，(ii)所述第一抗原，和(iii)对轻链具有特异性的抗体接触，在此条件下使该复合体结合至所述细胞表面，所述蛋白结合至Fc片段，所述第一抗原结合至scFv，以及所述抗体结合至轻链；并且检测所述第一抗原和所述抗体连接至该细胞，由此测定该细胞生产和分泌包含所述scFv和具有重链和轻链的所述抗原结合单元的双特异性抗体。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述第一抗原是用第一荧光颜色所荧光标记的，并且所述抗体是用第二荧光颜色所荧光标记的，其中所述检测包括鉴别同时显示所述第一荧光颜色和所述第二荧光颜色的细胞颗粒。