CN1220776C - 新的基因工程抗体真核高效表达系统、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备基因工程抗体真核高效表达系统的方法，以及由此方法构建的一种基因工程抗体真核高效表达系统，称为pYR-GKES表达系统，包括8个独立的克隆载体和表达载体，本发明还涉及由该方法制备的表达系统在制备和高产量生产嵌合抗体、改形抗体、全人源化抗体、小分子抗体、胞内抗体、双特异性抗体及其它的类似物、突变物、合成物以及衍生物中的应用。

Description

新的基因工程抗体真核高效表达系统、其制备方法及其应用
本发明涉及一种新的构建基因工程抗体真核高效表达系统的方法，以及由此方法构建的一种基因工程抗体真核高效表达系统及其应用。确切地说是本发明涉及一种用现代生物学技术构建并建立在真核细胞中高产量表达各种基因工程抗体的表达系统方法，以及由此方法制备的表达系统在多种基因工程抗体的制备和高产量生产中的应用。
自1975年Kohler和Milstein创立杂交瘤技术生产单克隆抗体(简称单抗)以来，众多单抗被研制成功并广泛地应用于医学临床的诊断和治疗疾病中。但在广泛的临床应用中发现，鼠单抗用于人体治疗疾病疗效不佳，且出现严重的副作用，其主要原因有两个：(1)因鼠单抗对人体的异源性，用于人体会产生人抗鼠抗体反应(HAMA)。(2)抗体分子较大，难以进入肿瘤组织发挥治疗作用。随着现代分子生物学及免疫学的迅速发展，以及DNA重组技术的突起及日趋成熟，80年代初，人们可根据所需要的特性，采用基因工程技术改造鼠单抗或创造新的抗体及抗体片段，这些经过基因工程技术改造或创造的抗体及抗体片段通称为基因工程抗体。基因工程抗体可分成两大类：即全分子抗体和小分子抗体。到目前为止全分子抗体包括有嵌合抗体、改形抗体、全人源化抗体、双特异性抗体及它们被修饰的类似物、衍生物、突变物和合成物。小分子抗体种类繁多，包括Fv(单域抗体)、scFv(单链抗体)、dsFv(双价单链抗体)、Fab、Fab′、F(ab′)2、胞内抗体以及它们与其它效应分子的融合蛋白、衍生物等。研制基因工程抗体，无论是全分子还是小分子抗体，首先是从鼠单抗中克隆、鉴定有功能的单抗抗体基因(也可通过其它途径获得抗体基因，如抗体库技术)，再将抗体基因采用DNA重组技术克隆到能使其表达出蛋白质即抗体的表达载体中(称为抗体重组表达载体)，再将抗体重组表达载体转导到特定的宿主工程细胞中，培养并筛选生产抗体的工程细胞，从而获得所需的被改造或新创造的抗体。由上可见，基因工程抗体的生产最重要的是需要有基因工程抗体的表达系统，目前能表达和生产基因工程抗体的表达系统主要分为两类：一类是原核表达系统，在如大肠杆菌这样的原核细胞中表达生产抗体；另一类是真核表达系统，多在哺乳动物细胞如CHO、sp2/0、NSO等细胞中表达生产抗体。这两种表达系统具有各自的特点，原核表达系统成本低、表达产量高，但无糖基化、生物活性低、难以表达全分子抗体，因此原核表达的抗体不能用于临床治疗疾病；真核表达系统表达抗体有糖基化、生物活性高、既能表达全分子抗体也能表达小分子抗体，因而用于医学临床上治疗疾病的抗体必须是真核表达系统表达生产的，但真核表达系统表达抗体产量低，因而成本高，难以获得大量的抗体，而临床治疗疾病所需抗体量较大，因此真核表达系统表达抗体产量低严重阻碍了基因工程抗体应用于临床治疗疾病。为了使有临床应用价值的单抗能更广泛地用于人类疾病的治疗，自90年代，科学家们和商家均致力于研制能高产量表达基因工程抗体的真核表达系统，到目前为止国外有5种能高表达基因工程抗体的真核表达系统构建成功，并用于数种基因工程抗体的生产，而国内尚无一例基因工程真核高效表达系统研制成功。美国目前已批准7种基因工程抗体产业化上市销售，用于临床治疗疾病，还有数十种在II、III期临床试用，这些基因工程抗体的生产多采用以上5种真核表达系统，因此基因工程抗体真核高效表达系统的研制成功，大大地推动了基因工程抗体的发展和产业化，同时以上情况也显示出基因工程抗体在医学临床治疗疾病中有着广泛的应用前景和重要的应用价值。但目前国外研制成功的5种基因工程抗体真核表达系统还存在着各种问题，都不够理想。第一种由Beidler等人(BeidlerCB等人，J Immunol 1988；141：4053)研制成功的抗体真核表达系统是采用小鼠骨髓瘤细胞sp2/0作为表达细胞，采用人抗体基因组恒定区基因序列和鼠单抗基因组可变区基因序列组成的真核表达载体，后者自带有小鼠抗体的启动子、增强子、分泌信号肽、剪接位点等调控表达的序列。这种表达系统表达抗体的产量可达32μg/ml，但这种系统的缺陷是抗体可变区基因基因组序列个体差异大，不同的抗体表达产量相差很大，采用这种载体系统只有1-2家报道可较高水平表达抗体，其余绝大多数报道其产量仅达2μg/ml，因此该载体系统缺乏通用性和普遍性，其原因可能是鼠单抗自带的表达调控序列并非都能实现高表达。其次这种载体构建操作复杂、成本高、周期长、所用的表达细胞sp2/0不适宜于产业化生产。第二种基因工程抗体真核高效表达系统由Bebbington等人报道(Bebbington FD等人，Biotechnology1992；10：169)，该系统选用GS基因(谷氨酰胺合成酶基因)作为可扩增选择标志基因，用MSX(Methionine Sulphoximine)加压扩增表达，用小鼠骨髓瘤细胞NSO细胞作为表达细胞，其表达产量可达10-15μg/ml。但该表达系统中GS基因对目的基因的共扩增倍数有限，故产量不是太高，最高值能达15μg/ml，此外这种载体系统筛选产生抗体的阳性克隆的筛选条件严格，阳性克隆数量较少，难以获得高产量阳性克隆。第三种，由Shitara等人(Shitara K等人，J ImmunolMethods 1994；167：271)报道的高效表达系统，该表达系统是选择大鼠骨髓瘤细胞YB2/0作为表达细胞，dhfr(二氢叶酸还原酶)基因为可扩增选择标志基因，用Moloney病毒的长末端重复序列为驱动目的基因表达的启动子，该系统的最大优点是采用了非常适合表达抗体类外源基因的YB2/0细胞，配合强启动子，可实现较高的基础表达量，但经MTX(氨甲喋呤)加压扩增目的基因表达的扩增倍数较少，只有10倍左右，因此该载体系统的产量表达主要依赖于基础表达水平，但大多数抗体并不能在此载体系统实现高基础表达水平，因此有的抗体能高产量表达，有的则不能高产量表达，其次YB2/0细胞也不适合大规模的产业化生产。第四种是由Dorai等人(Dorai H等人，J Immunol1987；139：4232)报道的抗体真核高效表达系统，采用sp2/0作为表达细胞，dhfr作为可扩增选择标志基因，通过MTX加压到10-5mol/L扩增目的基因拷贝数，但此高浓度MTX已达到表达细胞的毒性剂量，致使表达细胞生长缓慢、状态差、不适宜规模化生产，同时细胞易发生突变，退化成不产抗体的细胞，因而不能长期培养、收获抗体，同时扩增表达的倍数也不高。第五种表达系统是由Page等人报道的(Page MJ等人，Biotechnology 1991；9：64)，该系统选择dhfr缺陷型的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)作为表达细胞，dhfr基因作为可扩增选择标志基因，采用受专利保护的强启动子β-肌动蛋白基因启动子作为表达目的基因的启动子，采用删除驱动dhfr的SV40启动子中的143bp序列单弱化可扩增选择标志基因等措施实现抗体的高表达。该系统采用了最强的启动子，可实现抗体的高产量表达，但仅在抗体表达的基因剂量和转录效率水平采取了高表达的措施，尚可通过在抗体表达的其它环节(如翻译水平、分泌水平等)采取措施进一步提高表达产量。综上所述，可知目前已研制成功的基因工程真核高效表达系统虽然已提高了抗体的表达产量，达到了能实现产业化的表达水平10μg/ml以上，但还不是理想的表达系统，还存在着各种问题。首先，它们仅用一种或最多3种提高抗体表达水平的措施，而对外源基因表达水平高低所涉及的因素至少包括6个方面，即表达细胞的选择、基因剂量的扩增、基因转录效率的高低、翻译水平效率的高低、加工水平的效率以及分泌水平的效率等等，目前已研制成功的5种抗体表达系统仅在选择表达细胞、提高抗体基因剂量以及转录效率这三个方面采取某些措施来提高表达产量。其次，抗体基因转导表达细胞，整合于细胞染色体后，易缺失筛选标志，不易获得正确的阳性克隆。另外，现有的表达系统缺乏与之配套的抗体基因克隆载体，构建抗体重组表达载体进行抗体表达时操作复杂、耗时、耗力、成本高。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种制备本发明的基因工程抗体真核高效表达系统的方法，所述方法能进一步提高基因工程抗体的表达产量，进一步简化构建基因工程抗体重组表达载体、制备、高产量生产抗体的操作程序。
本发明的第二个目的在于提供一个能高产量表达各种基因工程抗体(包括全分子和小分子抗体)的真核高效表达系统。
本发明的第三个目的在于所述的基因工程抗体真核高效表达系统在制备和生产各种基因工程抗体中的应用。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种制备基因工程抗体真核高效表达系统的方法，所述的方法包括分别制备抗体可变区基因克隆载体，抗体基因真核表达的中间表达载体以及抗体真核高效表达载体以构成基因工程抗体真核高效表达系统，所述方法的特征在于：
1)将选择标志基因和可扩增选择标志基因分别包括在抗体轻、重链表达载体中，
2)在表达载体中同时采用弱化的启动子驱动选择标志基因和可扩增选择标志基因的表达，
3)在表达载体中应用氨基酸序列为NH3-Met-Tyr-Phe-Ser-Ala-Ile-Val-Ser-Ala-Ser-Leu-Ser-COOH的肽作为抗体分泌信号肽，
4)在表达载体中使用翻译型增强子序列，
5)在表达载体中包括强启动子以驱动目的基因的表达，同时在表达载体中还包括人抗体恒定区基因组序列和强转录终止子。
本发明方法中，所述的抗体可变区基因克隆载体包括抗体重链可变区基因克隆载体和抗体轻链可变区基因克隆载体，所述的两种载体均含有翻译型增强子序列、优化的抗体分泌信号肽、用于克隆抗体重链或轻链可变区基因的通用克隆位点以及5′内含子剪接位点。
所述的抗体基因真核表达的中间表达载体含有可扩增选择标志基因和被弱化的驱动所述选择标志基因表达的启动子序列；
所述的抗体真核高效表达载体是基于所述的克隆载体和所述的中间表达载体构建的，所述载体包括小分子抗体真核高效表达载体和全分子抗体真核高效表达载体，其中所述的小分子抗体真核高效表达载体含有选择标志基因序列、驱动选择标志基因的表达的弱化了的启动子序列以及驱动目的抗体基因表达的强启动子序列、强转录终止子序列和用于克隆抗体基因的多克隆位点，所述的全分子抗体真核表达载体包括全分子抗体重链真核表达载体和全分子抗体轻链真核表达载体，所述全分子抗体重链真核表达载体含有选择标志基因序列、驱动选择标志基因的表达的弱化了的启动子序列以及驱动目的抗体基因表达的强启动子序列、强转录终止子序列，用于克隆抗体基因的多克隆位点以及人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任一种抗体重链的基因组恒定区序列，包括人的Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4基因组恒定区序列，所述全分子抗体轻链真核表达载体含有选择标志基因序列、驱动选择标志基因的表达的弱化了的启动子序列以及驱动目的抗体基因表达的强启动子序列、强转录终止子序列，用于克隆抗体基因的多克隆位点以及人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任一种抗体轻链的基因组恒定区序列，包括人的Cλ和Cκ基因组恒定区序列。
在本发明方法中，所述的选择标志基因可以是本领域已知的任何合适的选择标志基因，例如，氨基糖苷磷酸转移酶(neo)基因、胸苷激酶(tk)基因、潮霉素B磷酸转移酶(hyg)基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因、天冬酰胺合成酶(AS)基因。
所述的可扩增选择标志基因例如为二氢叶酸还原酶(dhfr)基因或谷氨酰胺合成酶(GS)基因。
所述的弱化的启动子优选为弱化的SV40启动子，所述的弱化的SV40启动子例如是通过删除SV40启动子72bp大小的一段序列获得，该72bp大小序列的核苷酸序列如下：
5'-ATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC-3’(SEQ ID NO：1)
所述的翻译型增强子优选为核苷酸长度为163bp的鼠VEGF基因5’-非翻译区的SP163序列。该163bp大小的SP163翻译型增强子序列的核苷酸序列如下：
5'-AGCGCAGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACC-3’(SEQ ID NO：2)。
所述的强启动子可以是本领域已知的任何合适的强启动子，例如人巨细胞病毒立早基因启动子PhCMV-IE、SV40早期基因启动子PSV40-E、Rous肉瘤病毒LTR启动子PRSV-LTR。
本发明方法所用的强转录终止子例如选自牛生长激素基因聚腺苷化位点BGH polyA或SV40聚腺苷化位点SV40 polyA。所述的人抗体恒定区基因组序列选自Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4或Cκ、Cλ。
根据本发明的第二个方面，提供了采用本发明所述的方法制备的基因工程抗体真核高效表达系统。
在本发明的一个实施方案中，本发明的基因工程抗体真核高效表达系统命名为pYR-GKES表达系统，其是由克隆载体pYR-GCVH和pYR-GCVL、表达载体pYR-GSEVH、pYR-GSEVL、pYR-GCEVH和pYR-GCEVL以及中间表达载体pYR-SV2-rdhfr和pYR-SV2-meo组成。pYR-GKES表达系统的组成及其构建在以下实施例中有详细描述，但是应理解的是本发明并非限于这一表达系统。例如，本领域技术人员根据现有技术的描述可以很容易地选择所述表达系统中各个载体中的弱化的启动子以及强启动子、翻译增强子、抗体分泌信号肽、转录终止子、选择标志和宿主细胞等。
根据本发明的第三方面，本发明涉及本发明的第一方面的表达系统在制备各种基因工程抗体中的应用，所述的基因工程抗体包括全分子抗体和小分子抗体。到目前为止全分子抗体包括有嵌合抗体、改形抗体、全人源化抗体、双特异性抗体及它们被修饰的类似物、衍生物、突变物和合成物。小分子抗体种类繁多，包括Fv(单域抗体)、scFv(单链抗体)、dsFv(双价单链抗体)、Fab、Fab′、F(ab′)2、胞内抗体以及它们与其它效应分子的融合蛋白、衍生物等。
现有技术中，抗人VEGF鼠单抗已被证明在体外能抑制血管内皮细胞的增殖，在体内能阻断肿瘤血管的形成，截断肿瘤的血供，从而抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的，因此该鼠单抗有着重要的医学临床应用价值。但鼠单抗用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA反应)不仅会有明显的毒副作用，而且疗效也差，限制了鼠单抗用于人体治疗肿瘤。为了解决此困难，采用基因工程法可将VEGF鼠单抗的鼠源恒定区用人抗体的恒定区替代，从而减少HAMA反应；鼠单抗可变区保留不变，从而保持原单抗的特异性、亲和性和治疗作用，这样改造的新抗体称为鼠-人嵌合抗体。目前国外已有这类嵌合抗体被批准上市用于治疗人类疾病，国内因无真核高效表达系统，尚无一例基因工程抗体包括嵌合抗体能产业化，一直不能用于临床应用。本发明中的高效表达系统实现了高产量表达各类基因工程抗体(包括抗人VEGF嵌合抗体)的目的，下面实施例2中以VEGF嵌合抗体真核高效表达系统的构建、表达为例，说明应用本发明中的高效表达系统高产量表达全分子基因工程抗体实施的具体方式和做法。
以下将参照附图和实施例详细描述本发明，其中：
图1是构建实施例1所述的抗体重链可变区基因克隆载体pYR-GCVH的示意图。
图2是构建实施例1所述的抗体轻链可变区基因克隆载体pYR-GCVL的示意图。
图3是构建实施例1所述的小分子抗体真核高效表达载体pYR-GSEVH的示意图。
图4是构建实施例1所述的小分子抗体真核高效表达载体pYR-GSEVL的示意图。
图5是构建实施例1所述的全分子抗体重链真核高效表达载体pYR-GCEVH的示意图。
图6是构建实施例1所述的全分子抗体轻链真核高效表达载体pYR-GCEVL的示意图。
图7是实施例2和实施例3中所用到的PCR引物的核苷酸序列。
实施例1
(一)抗体可变区基因配套克隆载体的构建
1.抗体重链可变区基因克隆载体的构建
以质粒pGEM-3Z-f(+)载体(购自美国Promega公司)为骨架，用限制性内切酶Pst I酶切该载体质粒DNA后，以Klenow酶补平其两端，重新用T4 DNA连接酶连接该质粒DNA，去掉原载体中的Pst I酶切点，筛选正确的阳性克隆，所获得的重组克隆称为质粒载体pRGH。再用内切酶EcoR I酶切重组质粒载体pRGH后，与一个0.96kb大小的EcoR I片段(通过Over Lap PCR自行合成后酶切)连接，该片段依次含有一个翻译型增强子序列(SP163，鼠VEGF基因的翻译型增强子)、优化的抗体分泌信号肽、用于克隆抗体重链可变区基因的通用克隆位点Pst I和BstE II以及5′内含子剪接位点。连接转化后筛选正确的重组克隆所获重组克隆载体称为pYR-GCVH克隆载体，该载体为抗体重链可变区基因克隆载体，可将任何一种抗体的重链可变区基因插入该载体的Pst I和BstE II酶切位点而构建成重组克隆载体，便于抗体重链可变区基因的核苷酸序列测定，并为构建抗体重链真核高效表达载体提供抗体重链可变区基因序列、翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽序列以及5′内含子剪接位点(构建示意图见图1)。
2.抗体轻链可变区基因克隆载体的构建
以质粒pGEM-3Z-f(+)载体为骨架，用内切酶Pvu II酶切该载体，分离大片段，加一平端的12bp的Hind III连接子再重新连接这一大片段，从而抹去了原载体的2个Pvu II酶切位点。筛选正确的重组克隆，获得的重组克隆称为pRGL。用内切酶Hind III酶切pRGL重组载体DNA，再与一个0.76kb大小的Hind III片段(通过Over Lap PCR自行合成后酶切)连接，该片段依次含有翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、用于克隆抗体轻链可变区基因的通用克隆位点Pvu II和BglII以及5′内含子剪接位点。连接转化后，筛选正确的重组克隆，所获得的重组克隆称为pYR-GCVL克隆载体，该载体为抗体轻链可变区基因克隆载体，可将任何一种抗体的轻链可变区基因插入该载体的PvuII和Bgl II酶切位点构建成重组克隆载体，便于抗体轻链可变区基因的核苷酸序列测定，并为构建抗体轻链真核高效表达载体提供了抗体轻链可变区基因序列、翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽以及5′内含子剪接位点(构建示意图见图2)。
(二)抗体真核高效表达载体的构建
1.双选择标志基因的双弱化
以pSV2-dhfr质粒载体(本申请人保存)为骨架，用内切酶Sph I酶切该质粒载体，回收大片段后连接转化，从而删除了pSV2-dhfr质粒载体中驱动dhfr基因表达的SV40启动子中的增强子序列中72bp的重复序列，筛选不含72bp重复序列单元的正确的重组克隆，所获得重组克隆称为pYR-SV2-rdhfr表达质粒载体。删除SV40启动子中增强子72bp序列的目的是适当程度地弱化SV40启动子驱动dfhr基因的表达，因此该重组表达载体是被弱化了可扩增选择标志基因dhfr表达的真核表达载体，这将有利于以后构建的小分子抗体真核表达载体和全分子抗体重链真核表达载体提高目的抗体基因的表达产量。
用Hind III和BamH I内切酶酶切质粒载体pSV2-neo(本申请人保存)，回收含有选择标志基因neo基因的小片段，与经Hind III和BamH I内切酶酶切的pYR-SV2-rdhfr表达质粒载体回收后的大片段(不含rdhfr基因，但SV40启动子已被弱化)连接，转化后筛选含有neo基因的正确的重组克隆。所获得的重组克隆称pYR-SV2-rneo表达质粒载体，该表达载体含有选择标志基因neo基因，其上游为已被删除SV40启动子中的增强子的72bp重复序列单元的SV40启动子，即该载体中是被弱化了的启动子驱动neo基因的表达，这将有利于以后构建的小分子抗体真核表达载体和全分子抗体轻链真核表达载体提高目的抗体基因的表达产量。
2.小分子抗体真核高效表达载体的构建
用BamHI和EcoRI酶切上面被弱化了启动子的pYR-SV2-rdhfr表达质粒载体，分离回收大片段，再用Klenow补平其末端，与一末端为平端的片段(酶切并补平自pcDNA3，本所保存)连接，该片段含有人巨细胞病毒立早基因启动子(PhCMV-IE)序列、多克隆酶切位点和强转录终止子牛生长激素基因的poly A位点(BGH poly A)。转化后筛选插入的PhCMV-IE启动子方向与dhfr基因方向相同的重组克隆，所获重组克隆称为pYR-GSEVH表达载体。该载体含有被弱化的驱动可扩增选择标志基因dhfr的SV40启动子和增强子、可扩增选择标志基因dhfr、驱动抗体基因高表达的强启动子PhCMV-IE，强的转录终止子BGH poly A以及用于克隆抗体基因于PhCMV-IE启动子下游的多克隆酶切位点。因此任何小分子抗体基因在克隆到克隆载体pYR-GCVH后，再用BamH I和Not I酶切该克隆载体，获得含有翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、小分子抗体基因以及5′-内含子剪接位点的片段后，再插入经BamH I和Not I酶切pYR-GSEVH表达载体中，即构建成功小分子抗体真核高效表达重组载体，从而可在真核细胞中高产量表达小分子抗体(构建示意图见图3)。
小分子抗体真核高效表达载体pYR-GSEVL的构建是用BamH I和EcoR I内切酶酶切前面构建的表达质粒载体pYR-SV2-rneo后，分离回收大片段，用Klenow酶补平其两个末端，再与一平端片段连接，该平端片段含有PhCMV-IE启动子、BGH poly A、多克隆位点。转化后筛选插入的PhCMV-IE启动子方向与neo基因方向相同的正确重组克隆，所获重组克隆称为pYR-GSEVL表达载体。该载体含有被弱化的驱动选择基因neo的SV40启动子和增强子、选择标志基因neo、驱动目的抗体基因表达的强启动子PhCMV-IE、BGH poly A以及用于克隆抗体基因于PhCMV-IE启动子下游的多克隆酶切位点。因此，任何小分子抗体在克隆到克隆载体pYR-GCVL后，用BamH I和Not I内切酶酶切，获得含有翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、小分子抗体基因以及5′内含子剪接位点的片段后，再插入经BamH I和Not I酶切的pYR-GSEVL表达载体中，即构建成小分子抗体真核高效表达重组载体，从而可在真核细胞中高产量表达小分子抗体(构建示意图见图4)。
3.全分子抗体真核高效表达载体的构建
(1).全分子抗体重链真核高效表达载体的构建
用Xho I内切酶酶切小分子抗体表达载体pYR-GSEVH，用Klenow酶补平其两个末端，与一末端为平端的片段(酶切并补平自本所保存的质粒)连接，该片段含人抗体恒定区Cγ1、或Cγ2、或Cγ3、或Cγ4的基因组序列，筛选含有人抗体重链恒定区基因组序列，并且其插入方向与PhCMV-IE启动方向相同的正确的重组克隆，所获重组克隆称为pYR-GCEVH表达载体。该表达载体除含有小分子抗体载体pYR-GSEVH中含有的被弱化了的驱动可扩增选择基因表达的SV40启动子和增强子、可扩增选择基因dhfr、驱动目的抗体基因表达的强启动子PhCMV-IE、强转录终止子BGH poly A、用于克隆抗体重链可变区基因于PhCMV-IE下游的多克隆位点等序列外，还含有人抗体重链恒定区基因组序列。因此，任何抗体的重链可变区基因，包括改造后或从其它途径获得的人源化抗体可变区基因，克隆到抗体重链可变区基因克隆载体pYR-GCVH后，再用BamH I和Not I内切酶酶切，获得的含有翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、抗体重链可变区基因及5′内含子剪接位点的片段可直接插入该表达载体pYR-GCEVH的BamH I和Not I酶切位点中，即构建成功全分子抗体重链基因真核高效重组表达载体。与相应的全分子抗体轻链基因真核高效重组表达载体共转染真核细胞后，可在真核细胞中高产量表达全分子抗体(构建示意图见图5)。
(2)全分子抗体轻链真核高效表达载体的构建
用Xho I内切酶酶切小分子表达载体pYR-GSEVL，用Klenow酶补平其两个末端，与一末端为平端的片段(酶切并补平自本所保存的质粒)连接，该片段含有人抗体轻链恒定区Cκ或Cλ基因组序列。转化后筛选含有与PhCMV-IE启动子方向相同的人抗体轻链恒定区基因组序列的重组克隆，所获重组克隆称为pYR-GCEVL表达载体。该表达载体除含有小分子抗体载体pYR-GSEVL中含有的被弱化的驱动选择标志基因neo基因表达的SV40的启动子和增强子、选择标志基因neo、驱动目的抗体基因表达的强启动子PhCMV-IE、强转录终止子BGH polyA、用于克隆抗体轻链可变区基因于PhCMV-IE启动子下游的多克隆位点等序列外，还含有人抗体轻链恒定区基因组序列。因此，任何抗体的轻链可变区基因，包括改造后或从其它途径获得的人源化抗体可变区基因，克隆到抗体轻链可变区基因克隆载体pYR-GCVL后，再用BamHI和Not I内切酶酶切，获得的含有翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、抗体轻链可变区基因及5′内含子剪接位点的片段可直接插入该表达载体pYR-GCEVL的BamH I和Not I酶切位点中，即构建成功全分子抗体轻链基因真核高效重组表达载体。与相应的全分子抗体重链基因真核高效重组表达载体共转染真核细胞后，可在真核细胞中高产量表达全分子抗体(构建示意图见图6)。
实施例2：
抗人VEGF(血管内皮生长因子)嵌合抗体在真核高效表达系统pYR-GKES中的高产量表达
(一)抗人VEGF鼠单抗轻、重链可变区基因的克隆及核苷酸序列测定
1.收集分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞(本申请人制备并保存)，PBS洗涤3次。
2.采用Trizol一步法提取杂交瘤细胞总RNA或mRNA后，用Gibco BRL公司生产的MMLV-反转录酶合成cDNA。
3.以合成的cDNA为模板采用P1和P2引物在高精度DNA聚合酶Taq+pfu作用下进行聚合酶链式反应(PCR)扩增VEGF抗体轻链可变区基因(VL)，约320bp大小；用同样方法，采用P3和P4引物扩增VEGF抗体重链可变区基因(VH)，约360bp大小。
4.分别回收PCR扩增获得的抗体VL和VH基因后，用内切酶Pvu II和Bgl II酶切VL基因，用内切酶PstI和BstE II酶切VH基因。
5.将酶切后的VL基因与已经内切酶Pvu II和Bgl II酶切过的该真核高效表达系统pYR-GKES中的克隆载体pYR-GCVL的大片段在T4 DNA连接酶(New England公司)作用下连接后，转化大肠杆菌DH5α的感受态细菌。
6.将酶切后的VH基因与已经内切酶Pst I和BstE II酶切过的克隆载体pYR-GCVH大片段在T4 DNA连接酶作用下连接作用下连接后，转化大肠杆菌DH5α的感受态细菌。
7.从VL和VH转化后的细菌平板中分别各挑取12个细菌克隆，采用小量快速质粒提取法，提取质粒DNA用Pvu II和Bgl II酶切筛选鉴定分析已插入有抗体VL基因的正确的重组克隆，用Pst I和BstEII酶切筛选鉴定分析已插入有抗体VH基因的正确的重组克隆。
8.用Qiagen公司的中量质粒提取试剂盒，分别提取纯化2个上一步所获得正确的VL和VH重组克隆的质粒DNA。
9.采用荧光标记Sanger双脱氧末端终止法对2个VL和2个VH重组克隆进行核苷酸序列测定，结果2个VL基因的核苷酸序列完全相同，经与Kabat抗体数据库对比分析发现属小鼠第V亚群，证明为重排的功能性基因。2个VH基因仅在第21位核苷酸不同，但不影响推导出的氨基酸序列的一致。经与Kabat抗体数据库对比分析发现属小鼠第II(B)亚群，证明为重排的功能性基因。此至获得了正确的功能性的抗体VL和VH基因。该VL和VH基因含有翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽以及5′内含子剪接位点序列，重组克隆载体称为含有VEGF抗体VL和VH的克隆重组载体。
(二)抗人VEGF鼠-人嵌合抗体的真核高效表达载体的构建
1.以上面获得的经核苷酸序列测定证明是含有重排的、有功能的VL基因的重组克隆质粒DNA为模板，采用P5和P6引物，在Taq-pfu聚合酶的作用下进行PCR扩增反应，从含有VEGF抗体VL基因的克隆载体中扩增含翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、VEGF抗体VL基因以及5′内含子剪接位点的片段，且该片段两端分别带有BamHI和Not I内切酶酶切位点，大小约0.76kb。分离回收PCR扩增的该0.76kb片段，用内切酶BamH I和Not I酶切该片段。
2.用BamH I和Not I内切酶酶切全分子抗体轻链表达载体pYR-GCEVL质粒DNA(该载体含PhCMV-IE强启动子、BGH poly A强终止子、多克隆酶切位点、选择标志基因neo基因、被弱化的驱动选择标志基因neo表达的SV40启动子和增强子以及人抗体轻链恒定区基因组序列Cκ，分离回收酶切后的大片段。
3.在T4 DNA连接酶的作用下，经过BamH I和Not I酶切过的0.76kb的VL PCR片段与用同样内切酶酶切回收的pYR-GCEVL的DNA片段连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细菌。用内切酶BamHI和Not I酶切筛选分析鉴定含有0.76kb的VL片段的重组克隆，这时所获得正确重组克隆即为完整的VEGF鼠-人嵌合抗体轻链真核高效表达重组载体，称为pYR-GCEVL-VEGF。它含选择标志基因neo、被弱化了的驱动选择标志基因表达的启动子SV40启动子和增强子、翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、5′内含子剪接位点序列、VEGF鼠单抗的VL基因、人抗体轻链恒定区基因组序列Cκ和3′内含子剪接位点序列、驱动嵌合抗体轻链基因高表达的强启动子PhCMV-IE、强转录终止子BGH poly A。提取纯化该重组克隆的质粒DNA。
4.与VEGF嵌合抗体轻链真核高效表达重组载体的构建程序相同，以获得的经核苷酸序列测定证明是含有已重排的、具有功能的VH基因的重组克隆载体质粒DNA为模板，采用P7和P8引物，在Taq-pfu DNA聚合酶作用下进行PCR扩增反应，扩增含翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、VEGF抗体VH基因及5′内含子剪接位点序列的约0.96kb的DNA片段，分离回收该0.96kb的片段后，用内切酶BamH I和Not I酶切该片段。
5.用内切酶BamH I和Not I酶切本发明的全分子抗体重链表达载体pYR-GCEVH质粒DNA(该载体含有PhCMV-IE启动子、强转录终止子BGH poly A、多克隆酶切位点、可扩增选择标志基因dhfr、被弱化的驱动dhfr基因表达的SV40启动子和增强子以及人抗体重链恒定区基因组序列Cγ1，分离回收酶切后的大片段DNA。
6.用T4 DNA连接酶连接经BamH I和Not I酶切后的0.96kb的VH PCR片段和pYR-GCEVH的大片段，转化DH5α感受态细菌，用内切酶BamH I和Not I酶切筛选分析鉴定含有0.96kb大小的VH片段的重组克隆，这时所获得的正确重组克隆即为完整的VEGF鼠-人嵌合抗体重链真核高效表达重组载体，称为pYR-GCEVH-VEGF。它含有可扩增选择标志基因dhfr基因、被弱化的驱动dhfr基因表达的SV40启动子和增强子、翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、5′内含子剪接位点序列、VEGF鼠单抗VH基因、人抗体重链恒定区基因组序列Cγ1和3′内含子剪接位点序列、驱动嵌合抗体重链基因高表达的强启动子PhCMV-IE、强转录终止子BGH poly A。提取纯化该重组克隆的质粒DNA。
(三)  抗人VEGF鼠-人嵌合抗体的真核高效表达
1.VEGF嵌合抗体基因转染CHO-dhfr-细胞
将含有抗人VEGF抗体VL基因以及人抗体轻链恒定区基因组序列Cκ的嵌合抗体轻链基因的真核高效表达重组克隆pYR-GCEVL-VEGF的质粒DNA与含有抗人VEGF抗体VH基因及人抗体重链恒定区基因组序列Cγ1的嵌合抗体重链基因的真核高效表达重组克隆pYR-GCEVH-VEGF的质粒DNA，在LipofectAMINE的作用下共转染CHO-dhfr-细胞，然后在含10％胎牛血清的DMEM培养基中5％CO2、37℃培养72小时。
2.选择性培养
转染并培养72小时后的CHO-dhfr-细胞，采用含200μg/ml G418和撤除HT(H，次黄嘌呤；T，是胸腺嘧啶)的培养基选择培养，以筛选neo基因和dhfr基因表型均阳性的抗性细胞。这些抗性细胞既含有带选择标志基因neo的嵌合抗体轻链基因，也含有带有可扩增选择标志基因dhfr的嵌合抗体重链基因，故能表达完整的嵌合抗体。待抗性细胞生长良好后，用夹心ELISA法检测抗性克隆细胞上清中抗人VEGF嵌合抗体的表达量，结果表达产量可达0.19μg/ml，与用普通的抗体真核表达载体系统表达VEGF嵌合抗体的产量(20ng/ml)相比，该高效表达系统pYR-GKES的表达产量提高了9.5倍。
3.转染后抗性细胞在递增的MTX浓度下的加压扩增培养
将生长良好的抗性细胞用有限稀释法进行亚克隆，抗性细胞按1.5个细胞/孔接种96孔培养板，共接种5-10块板，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，约2-3周长出单个抗性克隆。用夹心ELISA法检测单个抗性克隆上清中VEGF嵌合抗体的表达量，选择表达产量最高(0.25μg/ml)的单个克隆扩大培养，加含3×10-8mol/L的MTX(氨甲喋呤)的DMEM培养基进行加压扩增培养，待细胞适应3×10-8mol/LMTX的培养后，采用夹心ELISA法检测细胞培养上清中嵌合抗体产量为4.8μg/ml，扩增表达产量近20倍。按前述方法再进行亚克隆，选择表达产量最高(9μg/ml)的克隆细胞，再加含1×10-7mol/L的MTX的培养基进一步加压扩增表达培养，培养上清中嵌合抗体产量为20μg/ml，亚克隆后，最高表达产量的克隆的抗体表达量为28μg/ml。同前再进行1×10-6mol/L MTX的加压扩增表达培养，培养上清中嵌合抗体产量为32μg/ml，最高表达量的克隆细胞的抗体产量为41μg/ml，同前再进行1×10-5mol/L MTX加压扩增表达培养，细胞生长变得极其缓慢，抗体表达产量未进一步提高，故完成了抗人VEGF嵌合抗体的高效表达。
抗人VEGF嵌合抗体用本发明的真核高效表达系统pYR-GKES表达，其抗体产量达41μg/ml，较用普通载体系统表达的产量20ng/ml高约2000倍，也远高于国际公认的基因工程抗体产业化表达水平的标准10μg/ml。
(四)该表达系统表达的抗人VEGF嵌合抗体生物活性鉴定
为证明应用本发明中的真核高效表达系统pYR-GKES表达的基因工程抗体仍具有良好的生物活性，对该系统所表达的抗人VEGF嵌合抗体的各种生物活性进行以下分析鉴定。
1.夹心ELISA法分析抗人VEGF嵌合抗体的人源性
用羊抗人κ链多抗包被96孔酶标板，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG Fc片段作为二抗检测表达的抗人VEGF嵌合抗体是否含有人抗体轻、重链恒定区，结果转染细胞培养上清中所表达抗人VEGF嵌合抗体发生阳性结合反应，而未转染抗人VEGF嵌合抗体基因的CHO-dhfr-细胞上清阴性。证明所表达的抗体确实是含有人抗体恒定区的鼠-人嵌合抗体。
2.间接ELISA法分析所表达的抗体的特异性和人源性
用人VEGF抗原包被96孔酶标板，用HRP-羊抗人IgG Fc片段为二抗，采用间接ELISA法检测所表达的抗体是否能与相应的抗原人VEGF特异结合。结果所表达的抗体即能与人VEGF抗原特异结合，又能与抗人IgG Fc结合，呈阳性反应，而未转染抗人VEGF鼠-人嵌合抗体基因的CHO-dhfr-细胞上清则呈阴性反应，表明所表达的抗体是既能特异识别人VEGF又含有人抗体恒定区的抗人VEGF嵌合抗体。
3.竞争抑制实验分析所表达的抗体的抗原结合特异性
为进一步证明表达抗体与原来的VEGF鼠单抗有相同的抗原结合活性，将用基因工程法改造了的、用本发明的真核表达系统pYR-GKES表达的抗人VEGF嵌合抗体与原亲本鼠源的VEGF单抗按不同比例混合后，再与人的VEGF抗原反应，再用ELISA分析嵌合VEGF抗体对其亲本鼠源VEGF单抗结合人VEGF抗原的抑制作用，结果显示嵌合VEGF抗体可竞争抑制亲本鼠源VEGF单抗与VEGF的结合，这是因为嵌合VEGF抗体已与人VEGF抗原结合后，鼠单抗就不能再与人VEGF结合，因而结合受到嵌合抗体的竞争抑制。这表明嵌合VEGF抗体与原亲本鼠单抗与人VEGF抗原具有相同的特异结合能力，而无关抗体则不影响鼠VEGF单抗与人VEGF结合，从而证明所表达的抗体具有与人VEGF特异结合的能力。
4.所表达的抗体对血管内皮细胞增殖的抑制作用
抗人VEGF鼠单抗被证明具有抑制血管内皮细胞增殖的生物活性，为了证明所表达的抗体是否仍有此活性，采用MTT法测定，首先培养牛血管内皮细胞或人脐带静脉血管内皮细胞于96孔培养板中，再分别加入所表达的抗体、亲本鼠单抗、无关抗体以及不加任何抗体培养液(均含人VEGF)培养4天后，加0.5mg/ml MTT，再培养4小时，再加DMSO溶解细胞，测OD570，计算对血管内皮细胞增殖的抑制率。结果所表达的抗体在3μg/ml浓度能抑制血管内皮细胞增殖23％，27μg/ml浓度时完全抑制其增殖，鼠VEGF单抗在3μg/ml浓度抑制率为10.2％，在27μg/ml浓度是抑制率95％，略低于表达的嵌合VEGF抗体。这表明所表达的VEGF嵌合抗体仍保持原来的生物活性。证明本发明的真核高效表达系统pYR-GKES能在真核细胞中高产量表达全分子抗体，所表达的抗体具有良好的生物活性，具有可用性。
实施例3：
抗人CEA F(ab)′2小分子抗体的真核高效表达
为了证明本发明的真核高效表达系统的通用性，即可用于不同种类基因工程抗体的表达，本实例叙述了用本发明的真核高效表达系统pYR-GKES表达小分子抗体抗人癌胚抗原(CEA)F(ab)′2抗体。
(一)抗人CEA鼠单抗VL和VH基因的克隆及核苷酸序列测定采用与实施例2相同的方法步骤分离克隆抗CEA鼠单抗C50的VL和VH基因，用荧光标记Sanger双脱氧末端终止法对2个VL和VH重组克隆的质粒DNA进行核苷酸序列测定，结果2个VL和2个VH基因序列完全相同，并证明为重排的功能性抗体可变区基因。
(二)抗CEA F(ab)′2的通用性配套轻链重组克隆载体的构建
1.在抗CEA抗体VL基因的3′-端连接人抗体轻链恒定区Cκ基因，构建抗CEA F(ab)′2轻链重组克隆载体。
2.在抗CEA抗体VH基因的3′-端连接人抗体重链恒定区CH1-铰链区片段基因，构建抗CEA F(ab)′2重链重组克隆载体。
(三)抗CEA F(ab)′2真核高效表达载体的构建
1.从抗CEAF(ab)′2配套轻链重组克隆载体中用内切酶BamH I和Not I切下含翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、抗CEA F(ab)′2轻链基因的一个片段，与本发明中的小分子抗体真核高效表达载体pYR-GSEVL(经过BamH I和Not I酶切)在T4 DNA连接酶作用下连接，再转化DH5α感受态细菌，采用与全分子抗体构建相同的方法筛选鉴定正确的重组载体克隆，提取纯化筛选分离的重组克隆的质粒DNA准备转染真核细胞。
2.从抗CEA F(ab)′2重链重组克隆载体中用BamH I和Not I酶切切下含翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、抗CEA F(ab)′2重链基因的一个片段，与本发明中的小分子抗体真核高效表达载体pYR-GSEVH(经过BamH I和Not I酶切)在T4 DNA连接酶作用下连接，再转化DH5α感受态细菌，采用与全分子抗体构建相同的方法筛选鉴定正确的重组载体克隆，提取纯化筛选分离的重组克隆的质粒DNA准备转染真核细胞。
(四)抗人CEA F(ab)′2小分子抗体的真核高效表达及活性鉴定
采用与全分子抗体相同的方法步骤，将抗人CEA F(ab)′2轻、重链基因的共转染CHO-dhfr-细胞，对转染细胞进行选择培养、MTX递增浓度梯度的加压扩增表达，ELISA测定抗体表达产量，以及采用ELISA，竞争抑制ELISA、Western Blot等方法鉴定所表达的小分子抗体的人源性、与CEA抗原结合的特异性、亲和性等。结果抗人CEAF(ab)′2小分子抗体的最终表达产量可达20μg/ml，超过国际公认的产业化表达水平，而且具有人源性，能与CEA抗原特异性结合，其特异性与原鼠单抗相同。该小分子抗体标记放射核素111In或99Tc后，可用于临床放射显像诊断多种肿瘤，为临床肿瘤诊断提供一种新的手段。
为证明本发明中真核高效表达系统pYR-GKES的广泛通用性，用该表达系统还表达了抗人癌蛋白HER2抗原的鼠-人嵌合抗体，抗人CEA鼠-人嵌合抗体。其具体操作方法与抗人VEGF鼠-人嵌合抗体完全相同，抗人HER2鼠-人嵌合抗体的最终表达产量(在1×10-6mol/LMTX加压扩增表达后)为40-60μg/ml。抗人CEA鼠-人嵌合抗体的最终表达产量(在1×10-6mol/L MTX加压扩增表达后)为50-60μg/ml，而且均有很好的生物活性这进一步证明本发明的基因工程抗体真核高效表达系统pYR-GKES有着显著的、广泛的通用性，其产量达国际水平，在国内属领先水平。

Claims (9)

1、一种制备基因工程抗体真核高效表达系统的方法，所述的方法包括分别制备抗体可变区基因克隆载体、抗体基因真核表达的中间表达载体及抗体真核高效表达载体以构成基因工程抗体真核高效表达系统，所述方法的特征在于：
1)将选择标志基因和可扩增选择标志基因分别包括在抗体轻、重链表达载体中，
2)在表达载体中同时采用弱化的启动子驱动选择标志基因和可扩增选择标志基因的表达，
3)在表达载体中应用氨基酸序列为NH3-Met-Tyr-Phe-Ser-Ala-Ile-Val-Ser-Ala-Ser-Leu-Ser-COOH的肽作为抗体分泌信号肽，
4)在表达载体中使用翻译型增强子序列，
5)在表达载体中包括强启动子以驱动目的基因的表达，同时在表达载体中还包括人抗体恒定区基因组序列和强转录终止子。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述的选择标志基因选自氨基糖苷磷酸转移酶neo基因或胸苷激酶tk基因、潮霉素B磷酸转移酶hyg基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶gpt基因、天冬酰胺合成酶AS基因，所述的可扩增选择标志基因选自二氢叶酸还原酶dhfr基因和谷氨酰胺合成酶GS基因。
3、如权利要求1所述的方法，其中所述的弱化的启动子为弱化的SV40启动子。
4、如权利要求3所述的方法，其中所述的弱化的SV40启动子是通过删除SV40启动子72bp大小的一段序列获得，该72bp大小的序列的核苷酸序列如下所示：
5’-ATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC-3’(SEQ ID NO：1)。
5、如权利要求1所述的方法，其中所述的翻译型增强子为核苷酸长度为163bp的鼠VEGF基因5’-非翻译区的SP163序列，该翻译型增强子核苷酸序列如下所示：
5’-AGCGCAGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACC-3’(SEQ ID NO：2)。
6、如权利要求1所述的方法，其中所述的强启动子选自人巨细胞病毒立早基因启动子PhCMV-IE或SV40早期基因启动子PSV40-E、Rous肉瘤病毒LTR启动子PRSV-LTR，强转录终止子选自牛生长激素基因聚腺苷化位点BGH polyA或SV40聚腺苷化位点SV40 polyA，人抗体恒定区基因组序列选自Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4或Cκ、Cλ。
7、由权利要求1-6任一项所述的方法制得的基因工程抗体真核高效表达载体系统。
8、如权利要求1所述的方法制得的基因工程抗体真核高效表达系统，其为pYR-GKES表达系统，其包括克隆载体pYR-GCVH、pYR-GCVL和表达载体pYR-SV2-rdhfr、pYR-SV2-rneo、pYR-GSEVH、pYR-GSEVL、pYR-GCEVH、pYR-GCEVL，各载体分别具有图1-图6所示的结构。
9、权利要求7或8所述的基因工程抗体真核高效表达系统在制备和生产各种基因工程抗体中的应用，其中所述的基因工程抗体包括各种类型的嵌合抗体、改形抗体、全人源化抗体、小分子抗体、胞内抗体、双特异性抗体及其它们与放射核素的偶联物。
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