ES2330330T3 - Procedimiento de produccion de glucoproteinas modificadas. - Google Patents

Procedimiento de produccion de glucoproteinas modificadas. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de cribar una adenoteca para detectar una célula huésped capaz de producir una glucoproteína diana con más del 30% molar de Man5GlcNAc2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) proporcionar una célula huésped unicelular o de hongo filamentoso que no presente actividad de alfa-1,6manosiltransferasa con respecto al N-glucano de la glucoproteína diana; (b) introducir un gen en dicha célula huésped que codifica una enzima híbrida que comprende un dominio catalítico de alfa-1,2 manosidasa fusionado a un péptido de señalización celular en el extremo N que dirige y ancla dicho dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi; y (c) determinar el nivel de Man5GlcNAc2 en la proteína diana.

Description

Procedimiento de producción de glucoproteínas modificadas.
Antecedentes de la invención Rutas de glucosilación
Las proteínas sintetizadas de novo pueden sufrir un procesamiento posterior en las células, conocido como modificación postraduccional. En particular, pueden añadirse restos de azúcares enzimáticamente, un proceso conocido como glucosilación. Las proteínas resultantes que portan cadenas laterales de oligosacáridos unidos covalentemente se conocen como proteínas glucosiladas o glucoproteínas. Las bacterias habitualmente no glucosilan las proteínas; en los casos en los que sí se produce glucosilación, habitualmente se produce en sitios no específicos de la proteína (Moens y Vanderleyden, Arch. Microbiol. 1997 168(3):169-175).
Los eucariotas comúnmente unen un oligosacárido específico a la cadena lateral de un resto asparragina de una proteína, en particular una asparragina que se presenta en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys (donde Xaa representa cualquier amino ácido). Tras la unión del resto sacárido, conocido como N-glucano, pueden producirse otras modificaciones in vivo. Habitualmente estas se producen mediante una secuencia ordenada de reacciones enzimáticas, conocida como cascada. Los diferentes organismos proporcionan diferentes enzimas de glucosilación (glucosiltransferasas y glucosidasas) y diferentes sustratos glucosílicos, de forma que la composición final de una cadena lateral de azúcares puede variar notablemente dependiendo del huésped
Por ejemplo, los microorganismos como por ejemplo los hongos filamentosos y las levaduras (eucariotas inferiores) habitualmente añaden azúcares de manosa y/o manosilfosfato adicionales. El glucano resultante se conoce como de tipo "con alto contenido en manosa" o manano. Por el contrario, en las células animales, la cadena lateral del oligosacárido en desarrollo puede recortarse para eliminar diversos restos de manosa y alargarse con restos de azúcares adicionales que habitualmente no se encuentran en los N-glucanos de eucariotas inferiores. Véase R. K. Bretthauer, et al. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1999, 30,193-200; W. Martinet, et al. Biotechnology Letters, 1998, 20,1171-1177; S. Weikert, et al. Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; M. Malissard, et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis, et al. 1998 Engineering N-glycosylation pathways in the baculovirus-insect cell system, Current Opinion in Biotechnology, 9: 528-533; y M. Takeuchi, 1997 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35.
Los N-glucanos que se producen en los seres humanos y en los animales habitualmente se denominan N-glucanos complejos. Un N-glucano complejo quiere decir una estructura que habitualmente tiene de dos a seis ramificaciones exteriores con una secuencia de sialil-lactosamina ligada a una estructura del núcleo interno Man_{3}GlcNAc_{2}. Un N-glucano complejo tiene al menos una ramificación, y preferiblemente al menos dos, restos de GlcNAc y galactosa (Gal) alternantes que terminan en oligosacáridos como por ejemplo: NeuNAc-; NeuAc\alpha2-6GalNAc\alpha1-; NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-3GalNAc\alpha1-; NeuAc\alpha2-3/6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-; GlcNAc\alpha1-4Gal\beta1-(sólo mucinas); Fuc\alpha1-2Gal\beta1- (grupo sanguíneo H). Los ésteres de sulfatos pueden aparecer sobre restos de galactosa, GalNAc, y GlcNAc, y los ésteres de fosfatos pueden aparecer sobre restos de manosa. El NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo) puede estar acetilado en O o ser reemplazado por NeuGI (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glucanos complejos también pueden tener sustituciones intracatenarias de GlcNAc y fucosa nuclear (Fuc) intercalados.
La glucosilación humana comienza por un conjunto secuencial de reacciones del retículo endoplasmático (RE) que producen una estructura de oligosacárido nuclear, que se transfiere sobre las proteínas sintetizadas de novo en el resto de asparragina de la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (véase la Figura 1A). Se produce un procesamiento adicional mediante glucosidasas y manosidasas en el RE antes de que la glucoproteína en formación sea transferida al aparato de Golgi cis, donde los restos adicionales de manosa son eliminados por las 1,2-manosidasas específicas del aparato de Golgi. El procesamiento continúa mientras las proteínas pasan a través del aparato de Golgi. En el aparato de Golgi medio, numerosas enzimas de modificación que incluyen N-acetilglucosamina transferasas (GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV GnT V, GnT VI), manosidasa II, fucosiltransferasas añaden y eliminan restos de azúcares específicos (véase la Figura 1B). Finalmente, en el aparato de Golgi trans, las galactosil transferasas y sialiltransferasas (ST) actúan sobre los N-glucanos y la glucoproteína terminada es liberada del aparato de Golgi. Los N-glucanos proteínicos de las glucoproteínas animales tienen estructuras biantenarias, triantenarias o tetraantenarias, y habitualmente pueden incluir galactosa, fucosa, y N-acetilglucosamina. Habitualmente, los restos terminales de los N-glucanos están formados por ácido siálico. Una estructura típica de un N-glucano humano se muestra en la Figura 1B.
Precursores de nucleótidos con azúcares
Los N-glucanos de las glucoproteínas animales habitualmente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal. Estos azúcares generalmente no se encuentran en las glucoproteínas producidas en levaduras ni en hongos filamentosos. En los seres humanos, generalmente se sintetiza todo el abanico de azúcares de los nucleótidos (por ejemplo UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) en el citosol y se transportan al aparato de Golgi, donde se unen al oligosacárido nuclear mediante glucosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, 1981 J. Cell Biol. 91 (2): A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez and Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138: 709-715).
Las reacciones de transferencia de glucosilo habitualmente proporcionan un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras que los monofosfatos pueden exportarse directamente en un intercambio con los nucleósido trifosfato azúcares mediante un mecanismo antiporte, los difosfonucleósidos (por ejemplo GDP) tienen que ser escindidos por las fosfatasas (por ejemplo GDPasa) proporcionando nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de ser exportados. Esta reacción es importante para la glucosilación eficaz; por ejemplo, se ha encontrado que la GDPasa de S. cerevisiae es necesaria para la manosilación. Sin embargo, la GDPasa tiene una actividad un 90% menor hacia UDP (Berninsone et al., 1994 J. Biol. Chem. 269(1): 207-211 a). Los eucariotas inferiores habitualmente carecen de actividad de difosfatasa específica de UDP en el aparato de Golgi dado que no utilizan precursores de azúcares UDP para la síntesis de las glucoproteínas con base en el aparato de Golgi. Se ha encontrado que Schizosaccharomyces pombe, una levadura que añade restos de galactosa a los polisacáridos de la pared celular (de UDP-galactosa) tiene una actividad específica de UDPasa, lo que indica la necesidad de dicha enzima (Berninsone et al., 1994). Es sabido que el UDP es un inhibidor potente de las glucosiltransferasas y la eliminación de este subproducto de la glucosilación es importante para evitar la inhibición de la glucosiltransferasa en la luz del aparato de Golgi (Khatara et al., 1974). Véae Berninsone, P., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270(24): 14564-14567; Beaudet, L, et al. 1998 Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects. 292:397-413.
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Compartimentalización de las enzimas de glucosilación
Las glucosiltransferasas y las manosidasas tapizan la superficie interna (luz) del RE y del aparato de Golgi y así proporcionan una superficie catalítica que permite el procesamiento secuencial de las glucoproteínas al ir pasando a través de la red del RE y del aparato de Golgi. Los múltiples compartimientos del aparato de Golgi cis, medio, y trans y la red trans del aparato de Golgi (TGN), proporcionan las diferentes localizaciones en las que puede tener lugar la secuencia ordenada de reacciones de glucosilación. Cuando una glucoproteína pasa de la síntesis en el RE a la maduración completa en el aparato de Golgi trans o TGN, se ve expuesta secuencialmente a diferentes glucosidasas, manosidasas y glucosiltransferasas de tal forma que puede sintetizarse una estructura de N-glucano específica. Las enzimas habitualmente incluyen un dominio catalítico, una región de tallo, una región que atraviesa la membrana y una cola citoplásmica en el extremo N. Los tres últimos componentes estructurales son responsables de dirigir la enzima de glucosilación al lugar apropiado.
Las secuencias de localización de un organismo pueden funcionar en otros organismos. Por ejemplo se demostró que la región que atraviesa la membrana de \alpha-2,6-sialiltransferasa (\alpha-2,6-ST) de las ratas, una enzima que se sabe que se localiza en el aparato de Golgi trans de la rata, localiza también un gen testigo (invertasa) en el aparato de Golgi de la levadura (Schwientek, et al., 1995). Sin embargo, la misma región que atraviesa la membrana como parte de una \alpha-2,6-sialiltransferasa de longitud completa se mantenía en el RE y no se transportaba al aparato de Golgi de la levadura (Krezdom et al., 1994). Una GalT de longitud completa humana ni siquiera se sintetiza en las levaduras, a pesar de los elevados niveles de transcripción que podían demostrarse. Por otra parte, la región transmembrana de la misma GalT humana fusionada a un testigo de invertasa fue capaz de dirigir la localización al aparato de Golgi de la levadura, aunque con niveles bajos de producción. Schwientek y colaboradores han demostrado que fusionar 28 aminoácidos de una manosiltransferasa (Mnt1) de levadura, una región que contiene una cola citoplasmática en el extremo N, una región transmembrana y ocho aminoácidos de la región del tallo, al dominio catalítico de una GalT humana es suficiente para la localización en el aparato de Golgi de una GalT activa (Schwientek et al. 1995 J. Biol. Chem. 270(10): 5483-5489). Otras galactosiltransferasas parecen depender de interacciones con enzimas que residen en organelos particulares dado que después de eliminar su región transmembrana, todavía son capaces de localizarse adecuadamente.
La localización inadecuada de una enzima de glucosilación puede evitar el funcionamiento adecuado de la enzima en la ruta. Por ejemplo Aspergillus nidulans, que tiene numerosas \alpha-1,2-manosidasas (Eades y Hintz, 2000 gen 255(1): 25-34), no añade GlcNAc a MansGlcNAc_{2} cuando está transformado con el gen GnT I de conejo, a pesar de un nivel elevado global de actividad de GaT I (Kalsner et al., 1995). GnT I, aunque se exprese de forma activa, puede estar localizado incorrectamente de tal forma que la enzima no esté en contacto con ambos de sus sustratos: el N-glucano en formación de la glucoproteína y UDP-GlcNAc. De forma alternativa, el organismo huésped puede no proporcionar un nivel adecuado de UDP-GleNAc en el aparato de Golgi.
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Glucoproteínas que se usan terapéuticamente
Una fracción significativa de proteínas aisladas de los seres humanos o otros animales está glucosilada. Entre las proteínas que se usan terapéuticamente, aproximadamente 70% están glucosiladas. Si se produce una proteína terapéutica en un microorganismo huésped como por ejemplo una levadura, sin embargo, y se glucosila utilizando la vía endógena, su eficacia terapéutica habitualmente se reduce mucho. Dichas glucoproteínas son habitualmente inmunógenas en los seres humanos y demuestran una semivida reducida in vivo después de la administración (Takeuchi, 1997).
Los receptores específicos en los seres humanos y animales pueden reconocer los restos de manosa terminales y promover el rápido aclaramiento de la proteína en el torrente sanguíneo. Los efectos adversos adicionales pueden incluir cambios en el plegamiento de las proteínas, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, capacidad antigénica o capacidad alérgena. Por consiguiente, se ha hecho necesario producir glucoproteínas terapéuticas en sistemas de huéspedes animales, de forma que el patrón de glucosilación sea idéntico o al menos similar al de los seres humanos o de la especie que se pretenda como receptora. En la mayoría de los casos, se usa un sistema huésped mamífero, como por ejemplo un cultivo celular de mamífero.
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Sistemas de producción de glucoproteínas terapéuticas
Para producir proteínas terapéuticas que tengan glucoformas apropiadas y que tengan efectos terapéuticos satisfactorios, se han usado sistemas de expresión con base animal o vegetal. Los sistemas disponibles incluyen:
1. células ováricas de hámster chino (CHO), fibroblastos de ratón y células de mieloma de ratón (Arzneimittelforschung. Agosto de 1998; 48(8): 870-880);
2. animales transgénicos como por ejemplo cabras, ovejas, ratones y otros (Dente Prog. Clin. Biol. 1989 Res. 300:85-98, Ruther et al., 1988 Cell 53(6):847-856; Ware, J., et al. 1993 Thrombosis and Haemostasis 69(6): 1194-1194; Cole, E. S., et al. 1994 J. Cell. Biochem 265-265);
3. plantas (Arabidopsis thaliana, tabaco etc.) (Staub, et al. 2000 Nature Biotechnology 18(3): 333-338) (McGarvey, P. B., et al. 1995 Bio-Technology 13(13): 1484-1487; Bardor, M., et al. 1999 Trends in Plant Science 4(9): 376-380);
4. células de insectos (Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, etc. combinadas con baculovirus recombinantes como por ejemplo el virus de la polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica que infecta las células de los lepidópteros) (Altmans et al., 1999 Glycoconj. J. 16(2): 109-123).
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Las proteínas humanas recombinantes expresadas en los sistemas huésped mencionados anteriormente pueden incluir todavía glucoformas no humanas (Raju et al., 2000 Annals Biochem. 283(2): 123-132). En particular, la fracción de los N-glucanos puede carecer de ácido siálico en el extremo, que habitualmente se encuentra en las glucoproteínas humanas. Se ha realizado un esfuerzo considerable dirigido a desarrollar procesos para obtener glucoproteínas que sean lo más parecidas posible en estructura a las formas humanas, o que tengan otras ventajas terapéuticas. Las glucoproteínas que tienen glucoformas específicas pueden ser de utilidad especial, por ejemplo en la dirección de proteínas terapéuticas. Por ejemplo, la adición de uno o más restos de ácido siálico a una cadena lateral de glucano puede aumentar la vida de una glucoproteína terapéutica in vivo después de la administración. Por consiguiente, las células huésped de mamífero pueden diseñarse genéticamente para aumentar la cantidad de ácido siálico terminal en las glucoproteínas expresadas en las células. De forma alternativa, el ácido siálico puede conjugarse a la proteína de interés in vitro antes de la administración usando una ácido siálico transferasa y un sustrato apropiado. Además, se han empleado cambios en la composición de medio de cultivo o la expresión de enzimas implicada en la glucosilación en seres humanos para producir glucoproteínas que se parezcan más a las formas humanas (S. Weikert, et al., Nature Biotechnology, 1999, 17,1116-1121; Wemer, Noe, et al 1998 Arzneimittelforschung 48(8):870-880; Weikert, Papac et al., 1999; Andersen y Goochee 1994 Cur. Opin. Biotechnol. 5: 546-549; Yang y Butler 2000 Biotechnol. Bioengin 68(4): 370-380). De forma alternativa, pueden usarse células humanas cultivadas.
Sin embargo, todos los sistemas existentes tienen desventajas considerables. Únicamente ciertas proteínas terapéuticas son adecuadas para la expresión en sistemas animales o vegetales (por ejemplo los que carecen de efecto citotóxico u otros efectos adversos para el crecimiento). Los sistemas de cultivo de células animales y vegetales son habitualmente muy lentos, y con frecuencia requieren más de una semana de cultivo en condiciones cuidadosamente controladas para producir una cantidad útil de la proteína de interés. Los rendimientos de proteínas, sin embargo, son peores que con los procesos de fermentación microbiana. Además, los sistemas de cultivo celular habitualmente requieren nutrientes y cofactores complejos y caros, como por ejemplo suero bovino fetal. Además, el crecimiento puede verse limitado por la muerte celular programada (apóptosis).
Además, las células animales (en particular las células de mamífero) son muy susceptibles a la infección vírica y a la contaminación. En algunos casos, los virus u otros agentes infecciosos pueden poner en peligro el desarrollo del cultivo, mientras que en otros casos el agente puede ser un patógeno humano que hace que el producto proteínico terapéutico sea inadecuado para el uso que se pretenda de él. Además, muchos procesos para el cultivo celular necesitan componentes complejos para el medio, que son sensibles a la temperatura, derivados de animales, que pueden portar patógenos como por ejemplo priones de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Dichos patógenos son difíciles de detectar y/o difíciles de eliminar o esterilizar sin poner en peligro el medio de cultivo. En cualquier caso, el uso de células animales para producir proteínas terapéuticas requiere controles de calidad costosos para asegurar la seguridad del producto.
También pueden usarse animales transgénicos para fabricar proteínas terapéuticas en volúmenes grandes como por ejemplo albúmina serosa humana, activador de plasminógeno tisular, anticuerpos monoclonales, hemoglobina, colágeno, fibrinógeno y otros. Aunque las cabras trangénicas y otros animales trangénicos (ratones, ovejas, vacas, etc.) pueden diseñarse genéticamente para producir proteínas terapéuticas en concentraciones elevadas en la leche, el proceso es costoso dado que cada lote tiene que someterse a un control de calidad riguroso. Los animales pueden albergar una variedad de patógenos animales o humanos, que incluyen bacterias, virus, hongos, y priones. En el caso de la encefalopatía espongiforme ovina y bovina, las pruebas pueden llevar aproximadamente un año para descartar la infección. La producción de compuestos terapéuticos, por lo tanto preferiblemente se realiza en un ambiente estéril bien controlado, por ejemplo en condiciones de Buenas prácticas manufactureras (GMP). Sin embargo, generalmente no es factible mantener a los animales en entornos así. Además, mientras que las células que se cultivan en un fermentador se derivan de un Banco de células maestras (MCB) bien caracterizadas, la tecnología de animales trangénicos depende de diferentes animales y así inherentemente no es uniforme. Además, los factores externos como por ejemplo diferente ingesta de alimentos, enfermedades y falta de homogeneidad en una cabaña, pueden afectar a los patrones de glucosilación del producto final. Es sabido que en los seres humanos, por ejemplo, diferentes hábitos alimentarios producen patrones de glucosilación diferentes. Se han desarrollado plantas trangénicas como fuente potencial para obtener proteínas de valor terapéutico. Sin embargo, el alto nivel de expresión de las proteínas en las plantas adolece de silenciamiento génico, un mecanismo por el que los genes de las proteínas con alto nivel de expresión son reguladas por disminución en las posteriores generaciones de plantas. Además, las plantas añaden xilosa y/o fucosa ligada en \alpha-1,3 a los N-glucanos de las proteínas, produciendo glucoproteínas que difieren en estructura de los animales y son inmunógenas en los mamíferos (Altmann, Marz et al., 1995 Glycoconj. J. 12(2); 150-155). Además, generalmente no es práctico cultivar plantas en un entorno estéril o GMP, y la recuperación de las proteínas de los tejidos vegetales es más costosa que la recuperación de microorganismos fermentados.
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Producción de glucoproteínas usando microorganismos eucariotas
La falta de un sistema de expresión adecuado por lo tanto, es un obstáculo significativo al bajo coste y a la producción segura de glucoproteínas humanas recombinantes. La producción de glucoproteínas mediante la fermentación de microorganismos ofrecería numerosas ventajas con respecto a los sistemas existentes. Por ejemplo, los procesos con base de fermentación pueden ofrecer (a) producción rápida de altas concentraciones de proteína; (b) la capacidad de usar condiciones de producción estériles y bien controladas (por ejemplo condiciones GMP); (c) la capacidad de usar medio de cultivo simple y químicamente definido; (d) facilidad de manipulación genética; (e) ausencia de patógenos contaminantes humanos o animales; (f) la capacidad de expresar una amplia variedad de proteínas, que incluyen las que tienen una mala expresión en cultivo celular debido a la toxicidad etc.; (g) facilidad de recuperación de las proteína (por ejemplo por secreción al medio). Además, las instalaciones de fermentación generalmente son mucho menos costosas de construir que las instalaciones de cultivo celular.
Como se ha indicado anteriormente, sin embargo, las bacterias, que incluyen especies como por ejemplo Escherichia coli que se usan habitualmente para producir proteínas recombinantes, no glucosilan las proteínas de forma específico como los eucariotas. Diversas levaduras metilotróficas como por ejemplo Pichia pastoris, Pichia metanolica y Hansenula polimorfa, son particularmente útiles como sistemas de expresión eucariotas, dado que son capaces de crecer en altas densidades celulares y/o de segregar grandes cantidades de proteína recombinante. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, las glucoproteínas que se expresan en estos microorganismos eucariotas difieren sustancialmente de las de los animales en la estructura de los N-glucanos. Esto ha evitado que usara levadura u hongos filamentosos como huéspedes para la producción de muchas glucoproteínas de utilidad.
Se han realizado varias tentativas para modificar las rutas de glucosilación de los microorganismos eucariotas para proporcionar glucoproteínas más adecuadas para usar como agentes terapéuticos en mamíferos. Por ejemplo, se han clonado y expresado varias glucosiltransferasas por separado en S. cerevisiae (GalT, GnT I), Aspergillus nidulans (GnT I) y otros hongos (Yoshida et al., 1999, Kalsner et al., 1995 Glycoconj. J. 12(3):360-370, Schwientek et al., 1995). Sin embargo, no se obtuvieron N-glucanos con características humanas.
Las levaduras producen una variedad de manosiltransferasas por ejemplo 1,3-manosiltransferasas (por ejemplo MNN1 en S. cerevisiae) (Graham y Emr, 1991 J. Cell. Biol. 114(2):207-218),1,2-manosiltransferasas (por ejemplo la familia KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferasas (OCH1 de cerevislae), manosilfosfato transferasas (MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae), y enzimas adicionales que están implicadas en las reacciones de glucosilación endógenas. Muchos de estos genes se han suprimido de forma individual, dando lugar a organismos viables que tienen perfiles de glucosilación alterados. Se muestran ejemplos en la Tabla 1.
TABLA 1 Ejemplos de cepas de levadura que tienen manosilación alterada
1
Además, la solicitud de patente japonesa pública con n.º 8-336387 describe una cepa mutante de OCH1 de Pichia pastoris. El gen OCH1 codifica 1,6-manosiltransferasa, que añade una manosa a la estructura del glucano de Man_{8}GlcNAc_{2} proporcionando Man_{9}GlcNAc_{2}. La estructura del Man_{9}GlcNAc_{2} después es el sustrato para la mamosilación adicional in vivo, dando glucoproteínas hipermanosiladas que son características de las levaduras y que habitualmente pueden tener al menos 30-40 restos de manosa por N-glucano. En la cepa mutante OCH1, las proteínas glucosiladas con Man_{8}GlcNAc_{2} se acumulan y no se produce hipermanosilación. Sin embargo, la estructura Man_{8}GlcNAc_{2} no es sustrato para las enzimas de glucosilación animales, como por ejemplo UDP-GlcNAc transferasa I humana, y por consiguiente el procedimiento no es de utilidad para producir proteínas con patrones de glucosilación humanos.
Martinat et al. (Biotechnol. Lett.1998, 20(12), 1171-1177) reseñó la expresión de \alpha-1,2-manosidasa a partir de Trichoderma reesei en P. pastoris. Se observaban algunos recortes en la manosa con respecto a los N-glucanos de una proteína modelo. Sin embargo, la proteína modelo no tenía N-glucanos con la estructura Man_{5}GlcNAc_{2}, que serían necesarios como intermedio para la generación de N-glucanos complejos. Por consiguiente, el procedimiento no es de utilidad para producir proteínas con patrones de glucosilación humanos o animales.
De forma similar, Chiba et al. 1998 expresaron \alpha-1,2-manosidasa de Aspergillus saitoi en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una secuencia peptídica de señal (His-Asp-Glu-Leu) en la manosidasa exógena para promover la retención en el retículo endoplasmático. Además, la levadura huésped era un mutante que carecía de tres actividades enzimáticas asociadas a la hipermanosilación de las proteínas: 1,6-manosiltransferasa (OCH1); 1,3-manosiltransferasa (MNN1); y manosilfosfatotransferasa (MNN4). Los N-glucanos del huésped con triple mutación así estaban formados por la estructura Man_{8}GlcNAc_{2}, y no por las formas altas en manosa que se encontraban en S. cerevisiae de tipo silvestre. En presencia de la manosidasa diseñada de alta expresión, se recortaron los N-glucanos de una proteína modelo (carboxipeptidasa Y) proporcionando una mezcla constituida por 27% molar de Man_{5}GlcNAc_{2}, 22% molar de Man_{6}GlcNAc_{2}, 22% molar de Man_{7}GlcNAc_{2}; 29% molar de Man_{8}GlcNAc_{2}. El recorte de las glucoproteínas de la pared celular endógena fue menos eficiente, solo 10% molar de los N-glucanos que tienen la estructura Man_{5}GlcNAc_{2} deseada. El trabajo de Chiba también se reseña en el documento EP-A 1 1 211 311. Aunque Chiba expresó un gran número de copias con una cantidad más que saturante de su manosidasa y obtuvo rendimientos relativamente bajos, sugiere que se debe expresar más enzima para resolver el problema del bajo rendimiento. Nunca sugiere que la enzima diana debería elegirse de forma que trabaje óptimamente en la célula huésped seleccionada en el entorno subcelular donde debe convertir su sustrato.
Dado que solo los glucanos Man_{5}GlcAc_{2} serían susceptibles de conversión enzimática posterior a glucoformas humanas, el procedimiento no es eficiente para la producción de proteínas que tienen patrones de glucosilación humanos. En las proteínas, que tienen un único sitio de N-glucosilación, al menos el 73% molar tendría una estructura incorrecta. En las proteínas que tienen dos o tres sitios de N-glucosilación, respectivamente al menos 93 o 98% molar tendría una estructura incorrecta. Esas bajas eficacias de conversión son insatisfactorias para la producción de agentes terapéuticos, en particular dado que la separación de proteínas que tienen diferentes glucoformas es habitualmente costosa y difícil.
Con el objetivo de proporcionar una glucoproteína más humanoide derivada de un huésped fúngico, la patente de Estados Unidos n.º 5.834.251 de Maras y Contreras desvela un procedimiento para producir una glucoproteína híbrida derivada de Trichoderma reesei. Un N-glucano híbrido tiene sólo restos de manosa en la ramificación Mana 1-6 del núcleo y una o dos antenas complejas en la ramificación Mana 1-3. Aunque esta estructura es útil, el procedimiento tiene la desventaja de que deben realizarse numerosas etapas enzimáticas in vitro, lo que es costoso y lleva mucho tiempo. Las enzimas aisladas son caras de preparar y de mantener, pueden necesitar sustratos poco habituales y caros (por ejemplo UDP-GlcNAc), y tienen tendencia a perder la actividad y/o a sufrir proteólisis en las condiciones de uso.
Por lo tanto es un objeto de la presente invención proporcionar un sistema y procedimientos para humanizar la glucosilación de glucoproteínas recombinantes expresadas en Pichia pastoris y otros eucariotas inferiores como por ejemplo Hansenula polimorfa, Pichia stiptis, Pichia metanolica, Pichia sp, Kluyveromyces sp, Candida albicans, Aspergillus nidulans, y Trichoderma reseei.
Sumario de la invención
Se han desarrollado líneas celulares que tienen rutas de glucosilación genéticamente modificadas que les permite llevar a cabo una secuencia de reacciones enzimáticas, que imitan el procesamiento de las glucoproteínas en los seres humanos. Las proteínas recombinantes expresadas en estos huéspedes genomanipulados proporcionan glucoproteínas más similares, si no sustancialmente idénticas, a sus homólogas humanas. Los eucariotas inferiores, que habitualmente producen N-glucanos que contienen mucha manosa, que incluyen los hongos unicelulares y multicelulares como por ejemplo Pichia pastoris, Hansenula polimorfa, Pichia stiptis, Pichia metanolica, Pichia sp., Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, y Trichoderma reseei, se modifican para que produzcan N-glucanos como por ejemplo Man_{5}GlcNAc_{2} u otras estructuras en rutas de glucosilación humanas. Esto se logra usando una combinación de manipulación genética y/o selección de cepas que: no expresan ciertas enzimas que crean las indeseables estructuras complejas características de las glucoproteínas fúngicas, que expresan enzimas exógenas que se seleccionan o bien para que tenga una actividad óptima en las condiciones presentes en los hongos en los que se desea la actividad, o que se dirigen a un organelo en el que se logra una actividad óptima, y sus combinaciones en las que el eucariota genéticamente manipulado expresa múltiples enzimas exógenas necesarias para producir glucoproteínas "humanoides".
En una primera realización, la invención se refiere a un procedimiento de cribar una adenoteca para detectar una célula huésped capaz de producir una glucoproteína diana con más del 30% molar de Man_{5}GlcNAc_{2}, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) proporcionar una célula huésped unicelular o de hongo filamentoso que no presente actividad de alfa-1,6-manosiltransferasa con respecto al N-glucano de la glucoproteína diana;
(b) introducir un gen en dicha célula huésped que codifica una enzima híbrida que comprende un dominio catalítico de alfa-1,2 manosidasa fusionado a un péptido de señalización celular en el extremo N que dirige y ancla dicho dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi; y
(c) determinar el nivel de Man_{5}GlcNAc_{2} en la proteína diana.
Además, la presente invención se refiere a una célula huésped que puede obtenerse mediante los procedimientos de la presente invención. Así, la invención se refiere a un microorganismo que se diseña para que exprese una enzima exógena \alpha-1,2 manosidasa exógena que tiene preferiblemente un pH óptimo entre 5,1 y 8,0, preferiblemente entre 5,9 y 7,5. Por consiguiente, la enzima exógena se dirige al retículo endoplasmático o al aparato de Golgi, del organismo huésped, donde recorta los N-glucanos como por ejemplo Man_{8}GlcNAc_{2} proporcionando Man_{5}GlcNAc_{2}. Esta última estructura es de utilidad porque es idéntica a una estructura que se forma en los mamíferos, especialmente en los seres humanos; es un sustrato para reacciones de glucosilación posteriores in vivo y/o in vitro que produce un N-glucano terminado que es similar o idéntico al formado en mamíferos, especialmente en los seres humanos; y no es sustrato para las reacciones de hipermanosilación que se producen in vivo en levaduras y otros microorganismos y que hacen que la glucoproteína sea muy inmunógena en los animales.
En una segunda realización, la presente invención se refiere a una célula huésped que es unicelular o de hongo filamentoso que
(a) no presenta actividad de alfa-1,6-manosiltransferasa con respecto al N-glucano en una glucoproteína; y (b) tiene en su retículo endoplasmático (RE) o aparato de Golgi una enzima híbrida que se selecciona para que tenga una actividad óptima en el RE o en el aparato de Golgi que comprende:
(ba) un dominio catalítico de alfa-1,2-manosidasa; fusionado a
(bb) un péptido de señalización de direccionamiento celular, en el extremo N quimérico con respecto al dominio catalítico de (ba) que dirige y ancla el dominio catalítico de (ba) a dicho RE o aparato de Golgi.
Dicha célula huésped además
(c) tiene en su RE o aparato de Golgi una enzima híbrida que se selecciona para que tenga una actividad óptima en el RE o aparato de Golgi que comprende:
(can) un dominio catalítico de GnT I; fusionado a
(cb) un péptido de señalización de direccionamiento celular, en el extremo N quimérico con respecto al dominio catalítico de (ca) que dirige y ancla el dominio catalítico de (ca) a dicho RE o aparato de Golgi.
Por consiguiente, la ruta de glucosilación de un microorganismo eucariota se modifica (a) construyendo una adenoteca que incluye al menos dos genes que codifican enzimas de glucosilación exógenas; (b) transformando el microorganismo con la adenoteca para producir una población mixta que exprese al menos dos enzimas de glucosilación exógenas distintas; (c) seleccionando de la población un microorganismo que tenga el fenotipo de glucosilación deseado. Preferiblemente, la adenoteca incluye genes quiméricos que cada uno de los cuales codifica un secuencia de localización de la proteína y una actividad catalítica relacionada con la glucosilación. Los organismos modificados que usan el procedimiento son de utilidad para producir glucoproteínas que tienen un patrón de glucosilación similar o idéntico al de los mamíferos, especialmente al de los seres humanos.
En una tercera realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una glucoproteína recombinante que comprende (a) introducir un ácido nucleico que codifica la glucoproteína recombinante en una célula huésped de la invención; (b) expresar el ácido nucleico en una célula huésped para producir la glucoproteína; y (c) aislar la glucoproteína recombinante de la célula huésped. En una realización adicional, la ruta de glucosilación se modifica para que exprese una enzima transportadora de un nucleótido con azúcar. En una realización preferida, también se expresa una enzima nucleótido difosfatasa. También se expresa el transportador y la enzima difosfatasa. El transportador y la difosfatasa mejoran la eficacia de las etapas de glucosilación diseñadas, al proporcionar los compartimientos apropiados, reducir la inhibición competitiva del producto, y promover la eliminación de nucleósido difosfatos.
Descripción de las figuras
La Figura 1A es un diagrama esquemático de una ruta de N-glucosilación fúngica típica.
La Figura 1B es un diagrama esquemático de una ruta de N-glucosilación humana típica.
Descripción detallada de la invención
Los procedimientos y cepas de eucariotas inferiores recombinantes que se describen en el presente documento se usan para preparar "glucoproteínas humanizadas". Los eucariotas inferiores recombinantes se preparan genomanipulando eucariotas inferiores que no expresan una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras con alto contenido en manosa para expresar las enzimas necesarias para producir azúcares humanoides. Tal como se usa en el presente documento, un eucariota inferior es uno unicelular o un hongo filamentoso. Tal como se usa en el presente documento, una "glucoproteína humanizada" se refiere a una proteína que tiene unida a ella N-glucanos que incluyen menos de cuatro restos de manosa, y los intermedios sintéticos (que también son de utilidad y pueden manipularse adicionalmente in vitro) que tiene al menos cinco restos de manosa. En una realización preferida, las glucoproteínas que se producen en las cepas de eucariotas inferiores recombinantes contienen al menos 27% molar del intermedio Man5. Esto se logra introduciendo por clonación una mejor manosidasa, es decir, una enzima que se selecciona para que tenga una actividad óptima en las condiciones presentes en los organismos en el sitio donde las proteínas se glucosilan, o dirigiendo la enzima al organelo en el que se desea la actividad.
En una realización preferida, se usan cepas de eucariotas que no expresan una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras con alto contenido en manosa. Pueden genomanipularse estas cepas o una de los muchos mutantes que ya se han descrito en las levaduras, que incluyen un mutante que carece de hipermanosilación (OCH1) en Pichia pastoris.
Las cepas pueden genomanipularse una enzima cada vez, o puede crearse una adenoteca de genes que codifican enzimas que son potencialmente de utilidad, y seleccionar aquellas cepas que tienen enzimas con actividades óptimas o que producen la mayor cantidad de glucoproteínas "humanoides".
Los eucariotas inferiores que pueden producir glucoproteínas que tienen el N-glucano Man_{5}GlcNAc_{2} unido son de particular utilidad dado que (a) carecen de un alto grado de manosilación (por ejemplo más de 8 manosas por N-glucano, o especialmente 30-40 manosas), muestran una capacidad inmunógena reducida en los seres humanos; y (b) el N-glucano es un sustrato para reacciones de glucosilación posteriores formando una glucoforma incluso más humanoide, por ejemplo mediante la acción de GlcNAc transferasa I formando GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Man_{5}GlcNAc_{2} debe formarse in vivo con un rendimiento elevado, al menos de forma transitoria, dado que todas las reacciones de glucosilación posteriores requieren Man_{5}GlcNAc_{2} o un derivado del mismo. Por consiguiente, se obtiene un rendimiento superior a 27% molar, más preferiblemente un rendimiento de 50-100% molar de glucoproteínas en las que una elevada proporción de N-glucanos tienen Man_{5}GlcNAc_{2}. Entonces es posible realizar reacciones de glucosilación adicionales in vitro, usando por ejemplo el procedimiento de la patente de Estados Unidos n.º 5.834.251 de Maras y Contreras. En una realización preferida, se realiza al menos una reacción de glucosilación adicional in vivo. En una realización muy preferida de la misma, las formas activas de enzimas de glucosilación se expresan en el retículo endoplasmático y/o en el aparato de Golgi.
Microorganismos huésped
Las levaduras y los hongos filamentosos se han usado ambos con éxito para la producción de proteínas recombinantes, tanto intracelulares como segregadas (Cereghino, J. L. y J. M. Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45-66; Harkki, A., et al. 1989 Bio-Technology 7(6): 596; Berka, R M., et al. 1992 Abstr. Papers Amer. Chem.Soc. 203: 121-BIOT; Svetina, M., et al. 2000 J. Biotechnol. 76(2-3): 245-251.
Aunque la glucosilación en las levaduras y hongos es muy diferente a la de los seres humanos, comparten algunos elementos comunes. La primera etapa, la transferencia de la estructura nuclear del oligosacárido a la proteína en formación, está muy conservada en todos los eucariotas incluidas las levaduras, hongos, plantas y los seres humanos (compárense las Figuras 1A y 1B). El procesamiento posterior del oligosacárido nuclear, sin embargo, difiere considerablemente en las levaduras y supone la adición de varias azúcares de manosa. Esta etapa es catalizada por manosiltransferasas situadas en el aparato de Golgi (por ejemplo: OCH1, MNT1, MNN1, etc.), que secuencialmente añaden azúcares de manosa al oligosacárido nuclear. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas humanoides y por lo tanto es deseable reducir o eliminar la actividad de la manosil transferasa. Mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad de manosil transferasa (por ejemplo mutantes de och1 o mnn9) han demostrado que no son letales y presentan un menor contenido en manosa en el oligosacárido de las glucoproteínas de levaduras. También podrían tener que eliminarse otros enzimas para el procesamiento de oligosacáridos, como por ejemplo manosilfosfato transferasa dependiendo del patrón de glucosilación endógeno particular del huésped. Después de reducir las reacciones de glucosilación endógenas no deseadas, debe genomanipularse la sanción de N-glucanos complejos en el sistema del huésped. Esto requiere la expresión estable de varias enzimas y transportadores de azúcares-nucleótidos. Además, deben localizarse estas enzimas de forma tal que se asegure un procesamiento secuencial de la estructura con glucosilación en maduración.
Glucoproteínas diana
Los procedimientos que se describen en el presente documento son de utilidad para producir glucoproteínas, especialmente glucoproteínas que se usan terapéuticamente en los seres humanos. Dichas proteínas terapéuticas habitualmente se administran mediante inyección, por vía oral, pulmonar o por otros medios.
Los ejemplos de glucoproteínas diana adecuadas incluyen, sin limitación: eritropoyetina, citocinas como por ejemplo interferón-\alpha, interferón-\beta, interferón-\gamma, interferón-\omega, y CSF granulocítico, factores de coagulación como por ejemplo factor VIII, factor IX, y proteína C humana, cadena \alpha del receptor de IgE soluble, IgG, IgM, urocinasa, quimasa e inhibidor de urea tripsina, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor liberador de hormonas del crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular-2, factor inhibidor progenitor mieloide-1, y osteoprotegerina.
Procedimiento para producir glucoproteínas que comprenden el N-glucano Man_{5}GlcNAc_{2}
La primera etapa supone la selección o creación de un eucariota inferior que es capaz de producir una estructura precursora específica de Man_{5}GlcNAc_{2}, que sea capaz de aceptar GlcNAc in vivo mediante la acción de una GlcNAc transferasa I. Esta etapa requiere la formación de una estructura isomérica particular de Man_{5}GlcNAc_{2}. Esta estructura tiene que formarse dentro de la célula con rendimiento alto (superior al 30%) dado que todas las posteriores manipulaciones dependen de la presencia de este precursor. Son necesarias estructuras Man_{5}GlcNAc_{2} para la formación de complejos de N-glucanos, sin embargo, su presencia en modo alguno es suficiente, dado que Man_{5}GlcNAc_{2} puede darse en diferentes formas isoméricas, que pueden o no servir como sustrato para la GlcNAc transferasa I. La mayoría de las reacciones de glucosilación no son completas y por lo tanto una proteína particular generalmente contiene un abanico de diferentes estructuras carbohidratadas (es decir, glucoformas) sobre su superficie. La mera presencia de cantidades traza (menos de 5%) de una estructura carbohidratada como Man_{5}GlcNAc_{2} tiene poca relevancia práctica. Lo que se necesita es la formación de un intermedio que acepte GlcNAc transferasa I particular (estructura I) con alto rendimiento (superior a 30%). La formación de este intermedio es necesaria y posteriormente permite la síntesis in vivo de N-glucanos complejos.
Los eucariotas inferiores de ese tipo pueden seleccionarse a partir de hongos naturales o de forma alternativa, a partir de hongos u otros eucariotas inferiores genomanipulados proporcionando la estructura in vivo. No se ha demostrado que ningún eucariota inferior proporcione dichas estructuras in vivo en más de 1,8% de los N-glucanos totales (Maras et al., 1997), así que se prefiere un organismo genéticamente manipulado. Pueden usarse procedimientos como los que se describen por ejemplo en la patente de Estados Unidos n.º 5.595.900, para identificar la ausencia o presencia de glucosiltransferasas, manosidasas y transportadores de azúcares-nucleótidos particulares en un organismo diana de interés.
Inactivación de enzimas de glucosilación fúngicas como por ejemplo 1,6-manosiltransferasa
El procedimiento que se describe en el presente documento puede usarse para genomanipular el patrón de glucosilación de un amplio abanico de eucariotas inferiores (por ejemplo Hansenula polymorfa, Pichia stiptis, Pichia metanolica, Pichia sp, Kluyveromyces sp, Candida albicans, Aspergillus ridulans, Trichoderma reseei etc.). Pichia pastoris se usa como ejemplo de las etapas de manipulación requeridas. Del forma similar a otros eucariotas inferiores, P. pastoris procesa las estructuras de Man_{9}GlcNAc_{2} en el RE con una 1,2-\alpha-manosidasa proporcionando Man_{8}GlcNAc_{2}. A través de la acción de varias manosiltransferasas, esta estructura se convierte después en estructuras hipermanosiladas (Man_{9}GlcNAc_{2}), también conocidas como mananos. Además, se ha encontrado que P. pastoris es capaz de añadir grupos fosfato no en los extremos, a través de la acción de manosilfosfato transferasas a la estructura de carbohidratos. Esto es al contrario que con las reacciones que se encuentran en las células de mamífero, que eliminan las azúcares de manosa en vez de añadirlas. Es de importancia particular eliminar la capacidad del hongo de hipermanosilar la estructura de Man_{8}GlcNAc2 existente. Esto puede lograrse o bien seleccionando un hongo que no hipermanosile, o diseñando genéticamente un hongo así.
Se han identificado los genes que están implicados en este proceso en Pichia pastoris y creando mutaciones en estos genes se peude reducir la producción de glucoformas "indeseable". Dichos genes pueden identificarse por homología con manosiltransferasas existentes (por ejemplo OCH1, MNN4, MNN6, MNN1), que se encuentran en otros eucariotas inferiores como por ejemplo C. albicans, Pichia angusta o S. cerevisiae o mutando la cepa huésped y seleccionando un fenotipo con manosilación reducida. Basándose en las homologías entre manosiltransferasas y manosilfosfato transferasas conocidas, se pueden diseñar cebadores de PCR, ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 2, o usar genes o fragmentos de genes que codifican dichas enzimas como sondas para identificar homólogos en adenotecas del organismo diana. De forma alternativa, puede ser posible complementar fenotipos particulares en organismos relacionados. Por ejemplo, para obtener el gen o genes que codifican la actividad de 1,6-manosiltransferasa en P. pastoris, se realizarían las siguientes etapas. Los mutantes en OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a la temperatura y crecen despacio a temperaturas elevadas. Así pueden identificarse homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante en OCH1 de S. cerevisiae con una adenoteca de ADN o ADNc de P. pastoris. Dichos mutantes de S. cerevisiae pueden encontrarse en http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/ y están comercialmente disponibles en http://www.resgen.com/products/YFASTD.php3. Los mutantes que presentan un fenotipo de desarrollo normal a temperatura elevada, después de haber sido transformados con una adenoteca de P. pastoris, con probabilidad portan un homólogo de OCH1 de P. pastoris. Dicha adenoteca puede crearse digiriendo parcialmente ADN cromosómico de P. pastoris con una enzima de restricción adecuada y después inactivando la enzima de restricción que liga el ADN digerido en un vector adecuado, que se ha digerido con enzimas de restricción compatibles. Los vectores adecuados son pRS314, un plásmido de pocas copias (CEN6/ARS4) basado en pBluescript que contiene el marcador Trp1 (Sikorski, R. S., y Hieter, P., 1989, Genetics 122, pg 19-27) o pFL44S, un plásmido de muchas copias (2 \mu) basado en un pUC19 modificado que contiene el marcador URA3 (Bonneaud, N., et al., 1991, Yeast 7, pg. 609-615). Dichos vectores habitualmente son empleados por investigadores académicos o hay vectores similares disponibles en numerosos proveedores como por ejemplo Invitrogen (Carlsbad, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), New England Biolabs (Beverly, MA). Los ejemplos son el plásmido de expresión en levaduras basado en el origen de replicación 2 \mu pYES/GS, de Invitrogen, o el vehículo de clonación Yep24 de New England Biolabs. Después de ligar el ADN cromosómico y el vector, se puede transformar la adenoteca en la cepa de S. cerevisiae con una mutación específica y seleccionar la corrección del fenotipo correspondiente. Después de subclonar y secuenciar el fragmento de ADN que es capaz de restaurar el fenotipo silvestre, puede usarse este fragmento para eliminar la actividad del producto génico codificado por OCH1 en P. pastoris.
De forma alternativa, si se conoce toda la secuencia genómica de un hongo particular de interés, se pueden identificar dichos genes simplemente buscando en bases de datos de ADN disponibles al público, que están disponibles en varias fuentes como por ejemplo NCBI, Swissprot etc. Por ejemplo buscando una secuencia genómica o base de datos dada con un gen gen de 1,6-manosiltransferasa (OCH1) conocido de S. cerevisiae, es posible identificar genes de elevada homología en dicho genoma, que con un elevado grado de certidumbre codifica un gen que tiene actividad de 1,6-manosiltransferasa. Se han identificado homólogos de varias manosiltransferasas conocidas de S. cerevisiae en P. pastoris usando una cualquiera de estas estrategias. Estos genes tienen funciones similares a las de los genes implicados en la manosilación de las proteínas de S. cerevisiae y así su deleción puede usarse para manipular el patrón de glucosilación de P. pastoris o cualquier otro hongo con rutas de glucosilación similares.
La creación de inactivaciones génicas, una vez se ha determinado una secuencia génica diana, es una técnica bien establecida en la comunidad de biología molecular en levaduras y hongos, y puede ser adquirida por cualquiera de experiencia ordinaria en la técnica (R. Rothsteins, (1991) Methods in Enzymology, vol. 194, p. 281). De hecho, la elección de un organismo huésped puede verse influenciada por la disponibilidad de buenas técnicas de transformación y de alteración génica para dicho huésped. Si deben inactivarse varias manosil transferasas, el procedimiento desarrollado por Alani y Kleckner permite usar repetidamente los marcadores URA3 para eliminar secuencialmente toda la actividad de manosiltransferasa endógena indeseable. Esta técnica ha sido refinada por otros, pero básicamente supone el uso de dos secuencias de ADN repetidas, flanqueando un marcador contraseleccionable. Por ejemplo: puede usarse URA3 como marcador para asegurar la selección de transformantes que tienen una construcción integrada. Al flanquear el marcador URA3 con repeticiones directas, uno podría seleccionar primero los transformantes que tengan la construcción integrada y que hayan alterado así el gen diana. Después de aislar los transformantes, y de su caracterización, se puede volver a realizar una selección en una segunda ronda los que son resistentes a 5'FOA. Las colonias que pueden sobrevivir sobre las placas que contienen 5'FOA han perdido su marcador URA3 de nuevo por un evento de cruzamiento que afecta a las repeticiones mencionadas anteriormente. Esta estrategia permite así el uso repetido del mismo marcador y facilita la alteración de múltiples genes sin requerir marcadores adicionales.
La eliminación de manosiltransferasas específicas, como por ejemplo 1,6-manosiltransferasa (OCH1), manosilfosfato transferasas (MNN4, MNN6, o genes que complementan mutantes en Ibd) en P. pastoris, permite crear cepas genomanipuladas de este organismo que sintetizan principalmente Man_{8}GlcNAc_{2} y así pueden usarse para modificar adicionalmente el patrón de glucosilación de forma que se asemeje lo más posible a estructuras de glucoformas humanas más complejas. Una realización preferida de este procedimiento utiliza secuencias de ADN conocidas, que codifican actividades de glucosilación bioquímicas para eliminar funciones bioquímicas similares o idénticas en P. pastoris, de
tal forma que la estructura de glucosilación de la cepa resultante genéticamente alterada de P. pastoris sea modificada.
TABLA 2
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Incorporación de una manosidasa en el huésped genéticamente manipulado
El proceso que se describe en el presente documento permite obtener una estructura así con rendimiento elevado con el fin de modificarla proporcionando N-glucanos complejos. Un esquema exitoso para obtener estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas debe incluir dos estrategias paralelas: (1) reducir la actividad de manosiltransferasa endógena y (2) eliminar 1,2-\alpha-manosa mediante manosidasas proporcionando niveles altos de estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas. Lo que distingue este procedimiento de la técnica anterior es que resuelve directamente esos dos problemas. Como demuestra el trabajo de Chiba y colaboradores, se pueden reducir las estructuras de Man_{8}GlcNAc_{2} a un isómero de Man_{5}GlcNAc_{2} en S. cerevisiae, genomanipulando la presencia de una manosidasa fúngica de A. saitoi en el RE. Los inconvenientes de su estrategia son dobles: (1) se forman cantidades insuficientes de Man_{5}GlcNAc_{2} en la fracción de glucoproteína extracelular (10%) y (2) no está claro que la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo sea de hecho capaz de aceptar GlcNAc mediante la acción de GlcNAc transferasa I. Si hay presentes varios sitios de glucosilación en una proteína deseada, la probabilidad (P) de obtener dicha proteína en una forma correcta sigue la relación P=(F)^{n}, donde n es igual al número de sitios de glucosilación, y F es igual a la fracción de glucoformas deseadas. Una glucoproteína con tres sitios de glucosilación tendría una probabilidad de 0,1% de proporcionar los precursores apropiados para el procesamiento de N-glucanos complejos e híbridos en todos sus sitios de glucosilación, lo que limita el valor comercial de dicha estrategia.
La mayoría de las enzimas que están activadas en el RE y en el aparato de Golgi de S. cerevisiae tienen un pH óptimo que está entre 6,5 y 7,5 (véase la Tabla 3). Todas las estrategias previas para reducir la manosilación por la acción de las manosidasas recombinantes se han concentrado en enzimas que tienen un pH óptimo alrededor de pH 5,0 (Martinet et al., 1998, y Chiba et al., 1998), aunque la actividad de estas enzimas se reduzca a menos del 10% a pH 7,0 y así muy probablemente proporcionen una actividad insuficiente en su entorno de uso, el RE y el aparato de Golgi cis de P. pastoris y S. cerevisiae. Un procedimiento preferido utiliza una \alpha-manosidasa in vivo, donde el pH óptimo de la manosidasa está entre 1,4 unidades de pH en el pH óptimo medio de otras enzimas marcadoras representativas localizadas en el mismo organelo(s). El pH óptimo de la enzima que va a dirigirse contra un organelo específico debería corresponder al pH óptimo de otras enzimas que se encuentran en el mismo organelo, de tal forma que se obtenga la actividad máxima por unidad de enzima. La Tabla 3 resume la actividad de las manosidasas de diversas fuentes y sus pH óptimos respectivos. La Tabla 4 resume su localización.
TABLA 3 Manosidasas y su pH óptimo
3
4 
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Cuando se intenta recortar las estructuras con alto contenido en manosa para obtener Man_{5}GlcNAc_{2} en el RE o en el aparato de Golgi de S. cerevisiae, se puede elegir cualquier enzima o combinación de enzimas que (1) tenga un pH óptimo lo suficientemente cercano (es decir entre pH 5,2 y pH 7,8), y (2) se sepa que generan, solas o juntas, la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} isomérica específica necesaria para aceptar la posterior adición de GlcNAc por GnT I. Cualquier enzima o combinación de enzimas que haya demostrado que genera una estructura que puede convertirse en GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} mediante GnT I in vitro constituiría una elección apropiada. Este conocimiento puede obtenerse en la bibliografía científica o experimentalmente determinand que una manosidasa potencial pueda convertir Man_{8}GlcNAc_{2}-PA en Man_{5}GlcNAc_{2}-PA y después analizando, si la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}-PA obtenida puede servir como sustrato para GnT I y UDP-GlcNAc proporcionando GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} in vitro. Por ejemplo, la manosidasa IA de una fuente humana o murina sería una elección apropiada.
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Actividad de 1,2-manosidasa en el RE y aparato de Golgi
Las anteriores estrategias para reducir la manosilación mediante la acción de manosidasas exógenas clonadas no han conseguido proporcionar glucoproteínas que tengan una fracción suficiente (por ejemplo >27% molar) de N-glucanos que tengan la estructura Man_{5}GlcNAc_{2} (Martinet et al., 1998, y Chiba et al., 1998). Estas enzimas deberían funcionar de forma eficaz en el RE o en el aparato de Golgi para que fueran eficaces para convertir las glucoproteínas en formación. Aunque las dos manosidasas que se utilizaron en la técnica anterior (de A. saitoi y T. reesei tienen óptimos de pH de 5,0, la mayoría de las enzimas que son activas en el RE y en el aparato de Golgi de levaduras (por ejemplo S. cerevisiae) tienen un pH óptimo que está entre 6,5 y 7,5 (véase la Tabla 3). Dado que la glucosilación de proteínas es un proceso muy evolucionado y eficiente, puede concluirse que el pH interno en el RE y en el aparato de Golgi también está en el intervalo de aproximadamente 6-8. A pH 7,0, la actividad de la manosidasa que se usa en la técnica anterior se reduce a menos del 10%, que es insuficiente para la producción eficaz de Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo. El trabajo de Chiba también se reseñó en el documento EP-A 1 1 211 310. Anteriormente en el presente documento se incluyen comentarios adicionales.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Localización celular y pH óptimo de diversas enzimas relacionadas con la glucosilación de S. cerevisiae
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La enzima \alpha-1,2-manosidasa debería tener una actividad óptima a un pH entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, la enzima tiene una actividad óptima a un pH entre 5,9 y 7,5. El pH óptimo puede determinarse en condiciones de ensayo in vitro. Las manosidasas preferidas incluyen las que se recogen en la Tabla 3 que tienen pH óptimos apropiados, por ejemplo IA de Aspergillus nidulans, Homo sapiens (aparato de Golgi), IB de Homo sapiens (aparato de Golgi), células de insectos lepidópteros (IPLB-SF21AE), Ib de Homo sapiens, y de ratón (aparato de Golgi), y
Xanthomonas manihotis. En una realización preferida, se expresa un único gen de manosidasa clonado en el organismo huésped. Sin embargo, en algunos casos, puede ser deseable expresar varios genes diferentes de manosidasa, o varias copias de un gen particular, para lograr una producción adecuada de Man_{5}GlcNAc_{2}. En los casos en los que se usan múltiples genes, las manosidasas codificadas deberían tener todas pH óptimos dentro del intervalo preferido de 5,1 a 8,0, o especialmente entre 5,9 y 7,5. En una realización especialmente preferida, la actividad de manosidasa se dirige al RE o al aparato de Golgi cis, donde se producen las reacciones de glucosilación tempranas.
Formación de N-glucanos complejos
Una segunda etapa del proceso supone la adición secuencial de azúcares a la estructura carbohidratada en formación, genomanipulando la expresión de glucosiltransferasas en el aparato de Golgi. Este proceso requiere primero la expresión funcional de GnT I en el aparato de Golgi temprano o medio, además de asegurar una provisión suficiente de UDP-GlcNAc.
Sitos de integración
Dado que el objetivo final de esta tentativa de genomanipulación es una cepa con producción potente de proteínas que sea capaz de funcionar bien en un proceso de fermentación industrial, la integración de los múltiples genes en el cromosoma fúngico supone una planificación cuidadosa. La cepa genomanipulada con toda probabilidad tendrá que ser transformada con un abanico de genes diferentes, y estos genes tendrán que ser transformados de forma estable para asegurar que se mantiene la actividad deseada durante todo el proceso de fermentación. De cualquier modo, la combinación de las siguientes actividades enzimáticas tendrá que genomanipularse en el huésped fúngico para la expresión de las proteínas: sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos del RE y del aparato de Golgi (por ejemplo transportadores simporte y antiporte para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de los oligosacáridos, y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacáridos activados como por ejemplo UDP-galactosa, CMP-N-ácido acetilneuramínico. Al mismo tiempo, habrá que eliminar un número de genes que codifican enzimas que se sabe son características de las reacciones de glucosilación no humanas.
Direccionamiento de glucosiltransferasas a organelos específicos
Las glucosiltransferasas y las manosidasas tapizan la superficie interna (luz) del RE y del aparato de Golgi y así proporcionan una superficie "catalítica" que permite el procesamiento secuencial de las glucoproteínas al ir pasando a través de la red del RE y del aparato de Golgi. De hecho los múltiples compartimientos del aparato de Golgi cis, medio, y trans y la red trans del aparato de Golgi (TGN), proporcionan las diferentes localizaciones en las que puede tener lugar la secuencia ordenada de reacciones de glucosilación. Cuando una glucoproteína pasa de la síntesis en el RE a la maduración completa en el aparato de Golgi trans o TGN, se ve expuesta secuencialmente a diferentes glucosidasas, manosidasas y glucosiltransferasas de tal forma que puede sintetizarse una estructura de carbohidrato específica. Se ha dedicado mucho trabajo a revelar el mecanismo exacto por el cual estas enzimas son retenidas y ancladas a su organelo respectivo. La imagen que se está obteniendo es compleja, pero los indicios sugieren que la región del tallo, la región que atraviesa la membrana y la cola citoplasmática de forma individual o conjunta dirigen las enzimas a la membrana de los organelos individuales y así localizan el dominio catalítico asociado a ese sitio.
Las secuencias de direccionamiento son notorias y se han descrito en la bibliografía científica y en bases de datos públicas, que se describen en más detalle a continuación con respecto a adenotecas para la selección de secuencias de direccionamiento y enzimas dirigidas.
Procedimiento para producir una adenoteca para producir rutas de glicosilación modificadas
Un organismo huésped es transformado con una adenoteca que incluye al menos dos genes que codifican enzimas de glucosilación exógenas, produciendo una población genéticamente mixta. Los transformantes que tienen los fenotipos de glucosilación deseados se seleccionan después de la población mixta. En una realización preferida, el organismo huésped es una levadura, especialmente P. pastoris, y la ruta de glucosilación del huésped se modifica mediante la expresión operativa de una o más enzimas de glucosilación humanas o animales, proporcionando N-glucanos de proteínas similares o idénticas a las glucoformas humanas. En una realización especialmente preferida, la adenoteca incluye construcciones genéticas que codifican fusiones de enzimas de glucosilación con secuencias directoras para diversos locus celulares implicados en la glucosilación especialmente el RE, el aparato de Golgi cis, el aparato de Golgi medio, o el aparato de Golgi trans.
Los ejemplos de modificaciones a la glucosilación que pueden efectuarse usando el procedimiento son: (1) genomanipular un microorganismo eucariota para recortar los restos de manosa de Man_{8}GlcNAc_{2} proporcionando Man_{5}GlcNAc_{2} en forma de un N-glucano de proteína; (2) genomanipular un microorganismo eucariota para añadir un resto N-acetilglucosamina (GlcNAc) a Man_{5}GlcNAc_{2} mediante la acción de GlcNAc transferasa I; (3) genomanipular un microorganismo eucariota para que exprese funcionalmente una enzima como por ejemplo una N-acetilglucosamina transferasa (GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), manosidasa II, fucosiltransferasa, galactosil tranferasa (GalT) o sialiltransferasas (ST).
Al repetir el procedimiento, pueden genomanipularse rutas de glucosilación cada vez más complejas en el microorganismo diana. En una realización preferida, el organismo huésped se transforma dos o más veces con adenotecas que incluyen secuencias que codifican actividades de glucosilación. La selección de los fenotipos deseados puede realizarse después de cada ronda de transformación o de forma alternativa después de que se hayan producido varias transformaciones. De este modo pueden genomanipularse rápidamente rutas de glucosilación complejas.
Adenotecas
Es necesario componer una adenoteca que incluya al menos dos genes exógenos que codifican enzimas de glucosilación. Además de las secuencias con marco de lectura abierto, generalmente es preferible proporcionar a cada construcción de adenoteca los promotores, terminadores de la transcripción, potenciadores, sitios de unión de ribosomas, y otras secuencias funcionales que puedan ser necesarios para asegurar una transcripción y traducción eficaces de los genes al ser transformados en el organismo huésped. Cuando el huésped es Pichia pastoris, los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores AOXl, AOX2, DAS, y P40. También es preferible proporcionar a cada construcción al menos un marcador seleccionable, como por ejemplo un gen que confiera resistencia a fármacos o para complementar una carencia metabólica en el huésped. La presencia del marcador es de utilidad en la posterior selección
de transformantes; por ejemplo, en las levadura, pueden usarse los genes URA3, HIS4, SUC2, G418, BLA, o SH BLE.
En algunos casos, la adenoteca puede componerse directamente con genes existentes o de tipo silvestre. En una realización preferida, sin embargo, la adenoteca se compone a partir de la fusión de dos o más subadenotecas. Mediante el ligado en marco de subadenotecas, es posible crear un gran número de construcciones genéticas novedosas que codifican actividades de glucosilación dirigidas de utilidad. Por ejemplo, una subadenoteca de utilidad incluye secuencias de ADN que codifican cualquier combinación de enzimas como por ejemplo sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas, y GlcNAc transferasas. Preferiblemente, las enzimas son de origen humano, aunque también son de utilidad otras enzimas mamíferas, animales, o fúngicas. En una realización preferida, los genes se truncan proporcionando fragmentos que codifican los dominios catalíticos de las enzimas. Al eliminar las secuencias de direccionamiento endógenas, las enzimas pueden redirigirse y expresarse después en otros locus celulares. La elección de dichos dominios catalíticos pueden guiarse por el conocimiento del entorno particular en el que el dominio catalítico estará activo posteriormente. Por ejemplo, si una enzima de glucosilación particular va a estar activa en el aparato de Golgi trans, y todas las enzimas conocidas del organismo huésped del aparato de Golgi trans
tienen un cierto pH óptimo, entonces se elige un dominio catalítico que muestre una actividad adecuada a ese pH.
Otra subadenoteca huésped incluye secuencias de ADN que codifican péptidos de señalización que provocan la localización de una proteína en una localización particular dentro del entramado del RE, del aparato de Golgi, o del aparato de Golgi trans. Estas secuencias de señalización pueden seleccionarse en el organismo huésped así como en otros organismos relacionados o no relacionados. Las proteínas unidas a la membrana del RE o del aparato de Golgi habitualmente pueden incluir, por ejemplo, secuencias del extremo N que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd), y una región de horquilla (sr). Las secuencias de ct, tmd, y sr son suficientes de forma individual o combinada para anclar las proteínas a la membrana interna (la luz) del organelo. Por consiguiente, una realización preferida de la subadenoteca de secuencias de señalización incluye secuencias de ct, tmd, y/o sr de estas proteínas. En algunos casos, es deseable proporcionar a la subadenoteca longitudes variables de secuencias de sr. Esto puede lograrse mediante PCR usando cebadores que se unen al extremo 5' del ADN que codifica la región citosólica y empleando una serie de cebadores opuestos que se unen a diversas partes de la región del tallo. Todavía otras fuentes de utilidad de secuencias de señalización incluyen péptidos de señalización de recuperación, por ejemplo los tetrapéptidos HDEL o KDEL, que habitualmente se encuentran en el extremo C de las proteínas que se transportadas de vuelta al RE o al aparato de Golgi. Todavía otras fuentes de secuencias de señalización incluyen (a) proteínas membrana de tipo II, (b) las enzimas que se enumeran en la Tabla 3, (c) transportadores de nucleótidos que atraviesan la membrana y azúcares que están localizados en el aparato de Golgi, y (d) secuencias a las que se hace referencia en la Tabla 5.
TABLA 5 Fuentes de secuencias de direccionamiento a compartimientos de utilidad
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En cualquier caso, es muy preferible que se seleccionen secuencias de señalización que sean apropiadas para la actividad o actividades enzimáticas que deben genomanipularse en el huésped. Por ejemplo, para desarrollar un microorganismo modificado con capacidad de sialilación terminal de N-glucanos en formación, un proceso que se produce en el aparato de Golgi trans en los seres humanos, es deseable utilizar una subadenoteca de secuencias de señalización derivada de proteínas del aparato de Golgi trans. De forma similar, el recorte de Man_{8}GlcNAc_{2} mediante una \alpha-1,2-manosidasa para dar Man_{5}ClcNAc_{2} es una etapa temprana en la formación de N-glucanos complejos en los seres humanos. Por lo tanto es deseable que esta reacción se produzca en el RE o en el aparato de Golgi cis de un microorganismo huésped genomanipulado. Se usa una subadenoteca que codifica señales de retención en el RE y en el aparato de Golgi cis.
En una realización preferida, entonces se construye una adenoteca mediante el ligado en marco de una subadenoteca que incluye ADN que codifica secuencias de señalización con una subadenoteca que incluye ADN que codifica enzimas de glucosilación o sus fragmentos catalíticamente activos. La adenoteca resultante incluye genes sintéticos que codifican proteínas de fusión. En algunos casos, es deseable proporcionar una secuencia de señalización en el extremo N de una proteína de fusión, o en otros casos en el extremo C. En algunos casos las secuencias de señalización pueden estar insertadas en el marco de lectura abierto de una enzima, con la condición de que no se altere la estructura de la proteína de los dominios plegados individualmente.
El procedimiento es más eficaz cuando una adenoteca que se transforma en el huésped contiene una gran diversidad de secuencias, aumentando así la probabilidad de que al menos un transformante muestre el fenotipo deseado. Por consiguiente, antes de la transformación, puede someterse una adenoteca o un constituyente de una subadenoteca a una o más tandas de transposiciones génicas, PCR mutagénica, o mutagénesis in vitro.
Transformación
La adenoteca se transforma después en el organismo huésped. En la levadura, puede usarse cualquier procedimiento conveniente de transferencia de ADN, como por ejemplo electroporación, el procedimiento con cloruro de litio, o el procedimiento con esferoplastos. Para producir una cepa estable adecuada para la fermentación a alta densidad, es deseable integrar las construcciones de las adenotecas en el cromosoma del huésped. En una realización preferida, la integración se produce por recombinación homóloga, usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se proporcionan elementos de la adenoteca con secuencias flanqueantes homólogas a secuencias del organismo huésped. De este modo, la integración se produce en un sitio definido en el genoma del huésped, sin alteración de genes deseables o esenciales. En una realización especialmente preferida, el ADN de la adenoteca se integra en el sitio de un gen no deseado en un cromosoma de un huésped, logrando la alteración o deleción del gen. Por ejemplo, la integración en los sitios de los genes OCH1, MNN1, o MNN4 permite la expresión del ADN deseado de la adenoteca a la vez que se evita la expresión de enzimas implicadas en la hipermanosilación de glucoproteínas en las levaduras. En otras realizaciones, el ADN de la adenoteca puede ser introducido en el huésped mediante un cromosoma, plásmido, vector retrovírico, o integración aleatoria en el genoma del huésped. En cualquier caso, generalmente es deseable incluir con cada construcción de ADN de la adenoteca al menos un gen marcador seleccionable para permitir una rápida selección de organismos huésped que han sido transformados de forma estable. Los genes marcadores reciclables, como por ejemplo ura3, que pueden seleccionarse para determinar su presencia o ausencia, son especialmente adecuados.
Proceso de selección
Después de la transformación de la cepa huésped con la adenoteca, se seleccionan los transformantes que presentan el fenotipo de glucosilación deseado. La selección puede realizarse en una única etapa o mediante una serie de etapas de enriquecimiento fenotípico y/o depleción usando cualquiera de una variedad de ensayos o procedimientos de detección. La caracterización fenotípica puede realizarse manualmente o usando equipo de cribado de alto rendimiento. Habitualmente un microorganismo huésped presenta N-glucanos de proteínas sobre la superficie celular, donde están localizadas diversas glucoproteínas. Por consiguiente, pueden seleccionarse células intactas para determinar un fenotipo de glucosilación deseado exponiendo las células a una lectina o anticuerpo que se une de forma específica al N-glucano deseado. Hay disponible comercialmente una amplia variedad de lectinas específicas de oligosacáridos (EY Laboratories, San Mateo, CA). De forma alternativa, los anticuerpos contra N-glucanos humanos o animales específicos están disponibles comercialmente o pueden producirse usando técnicas estándar. Una lectina o anticuerpo apropiado puede conjugarse con una molécula testigo, como por ejemplo un cromófor, fluoróforo, radioisótopo, o una enzima que tiene un sustrato cromógeno (Guillen et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892). La selección puede realizarse después usando procedimientos analíticos como por ejemplo espectrofotometría, fluorimetría, selección de células activada por fluorescencia o recuento de centelleo. En otros casos, puede ser necesario analizar glucoproteínas o N-glucanos aislados de células transformadas. El aislamiento de proteínas puede realizarse mediante técnicas conocidas en la técnica. En los casos en los que es necesario un N-glucano aislado, puede usarse una enzima como por ejemplo endo-\beta-N-acetilglucosaminidasa (Genzima Co., Boston, MA) para escindir los N-glucanos de las glucoproteínas. Las proteínas o N-glucanos aislados pueden analizarse después mediante cromatografía de líquidos (por ejemplo HPLC), espectroscopia de masas u otros medios adecuados. La patente de Estados Unidos n.º 5.595.900 enseña varios procedimientos por los que pueden identificarse las células con estructuras extracelulares de carbohidratos deseadas. Antes de la selección de un transformante deseado, puede ser deseable eliminar de la población de células transformadas las que tienen fenotipos no deseados. Por ejemplo, cuando se usa el procedimiento para diseñar una actividad de manosidasa funcional en las células, los transformantes deseados tendrán niveles menores de manosa en la glucoproteína celular. La exposición de la población transformada a un radioisótopo letal de manosa en el medio elimina de la población los transformantes que tienen los fenotipos no deseados, es decir los que tienen niveles altos de manosa incorporada. De forma alternativa, puede usarse una lectina o anticuerpo citotóxicos, dirigidos contra un N-glucano indeseable, para eliminar los fenotipos no deseados de la población transformada.
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Procedimientos para proporcionar precursores de azúcares-nucleótidos al aparato de Golgi
Para que una glucosiltransferasa funcione de forma satisfactoria en el aparato de Golgi, es necesario que la enzima esté provista de una concentración suficiente de un azúcar nucleotídica apropiada, que es el donante con gran cantidad de energía del resto de azúcar añadido a una glucoproteína en formación. Estas azúcares nucleotídicas se proporcionan a los compartimientos apropiados expresando un gen exógeno que codifica un transportador de azúcares-nucleótidos en el microorganismo huésped. La elección de la enzima transportadora se ve influenciada por la naturaleza de la glucosiltransferasa exógena que se esté usando. Por ejemplo, una GlcNAc transferasa puede requerir un transportador de UDP-GlcNAc, una fucosiltransferasa puede requerir un transportador de GDP-fucosa, una galactosiltransferasa puede requerir un transportador de UDP-galactosa, o una sialiltransferasa puede requerir un transportador de CMP-ácido siálico.
La proteína transportadora añadida transporta una azúcar nucleotídica del citosol al aparato de Golgi, donde el azúcar nucleotídica puede hacerse reaccionar mediante la glucosiltransferasa, por ejemplo para alargar un N-glucano. La reacción libera un nucleósido difosfato o monofosfato, por ejemplo UDP, GDP, o CMP. Dado que la acumulación de un nucleósido difosfato inhibe la actividad posterior de una glucosiltransferasa, con frecuencia también es deseable proporcionar una copia expresada de un gen que codifica una nucleótido difosfatasa. La difosfatasa (específica para UDP o GDP según sea apropiado) hidroliza el difosfonucleósido proporcionando nucleósido monofosfato y fosfato inorgánico. El nucleósido monofosfato no inhibe la glucotransferasa y en cualquier caso es exportado del aparato de Golgi mediante un sistema celular endógeno. A continuación se describen las enzimas transportadoras adecuadas, que habitualmente son de origen mamífero.
Ejemplos
El uso del procedimiento general anterior puede entenderse haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. En la Tabla 6 también se resumen ejemplos de realizaciones preferidas.
Ejemplo 1 Genomanipulación de P. pastoris con \alpha-1,2-manosidasa para producir interferón
Es necesaria una \alpha-1,2-manosidasa para recortar Man_{8}GlcNAc_{2} proporcionando Man_{5}GlcNAc_{2}, un intermedio esencial para la formación de N-glucanos complejos. Se genomanipula un mutante en OCH1 de P. pastoris para que exprese interferón-\beta controlado por un promotor aox. Se construye una adenoteca mediante el ligado en marco del dominio catalítico de manosidasa IB humana (una \alpha-1,2-manosidasa) con una subadenoteca que incluye secuencias que codifican péptidos de localización en el aparato de Golgi cis. El organismo huésped se transforma después con la adenoteca, lo que produce una población genéticamente mixta en la que los transformantes individuales expresan cada uno interferón-\beta así como un gen sintético de manosidasa gen de la adenoteca. Se cultivan colonias individuales de transformantes y se induce la producción de interferón mediante la adición de metanol. En estas condiciones, más del 90% de la proteína segregada incluye interferón-\beta. Los sobrenadantes se purifican para eliminar las sales y los contaminantes de bajo peso molecular mediante cromatografía de fase inversa sobre sílice en C18. Los transformantes deseados que expresan una \alpha-1,2-manosidasa activa, dirigida de forma apropiada producen interferón-\beta que incluye N-glucanos de la estructura Man_{5}GlcNAc_{2}, que tiene una masa molecular reducida comparada con el interferón de la cepa parental. Los sobrenadantes purificados que incluyen interferón-\beta se analizan mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y se identifican las colonias que expresan la forma deseada de interferón-\beta.
Ejemplo 2 Genomanipulación de una cepa para que exprese GlcNAc transferasa I
Es necesaria la actividad de GlcNAc transferasa I para la maduración de N-glucanos complejos. Man_{5}GlcNAc_{2} únicamente pueden ser recortadas por manosidasa II, una etapa necesaria en la formación de glucoformas humanas, después de la adición de GlcNAc al resto de \alpha-1,3 manosa terminal mediante GlcNAc transferasa I (Schachter, 1991 Glycobiology 1 (5):453-461). Por consiguiente, se prepara una adenoteca que incluye fragmentos de ADN que codifican genes de GlcNAc transferasa I dirigidos de forma apropiada. El organismo huésped que es una cepa, por ejemplo una levadura, que es deficiente en hipermanosilación (por ejemplo un mutante en OCH1), proporciona un sustrato UDP-GlcNAc en el aparato de Golgi y/o RE, y proporciona N-glucanos de la estructura Man5GlcNAc2 en el aparato de Golgi y/o RE. Después de la transformación del huésped con la adenoteca, se seleccionan los transformantes para determinar los que tienen la mayor concentración de GlcNAc terminal sobre la superficie celular, o de forma alternativa los que segregan la proteína que tiene el mayor contenido en GlcNAc terminal. Dicha selección se realiza usando un procedimiento visual (por ejemplo un procedimiento de tinción), un anticuerpo específico que se une a GlcNAc terminal, o una lectina. De forma alternativa, los transformantes deseados muestran una menor unión de ciertas lectinas específicas para los restos de manosa terminales.
Ejemplo 3 Genomanipulación de cepas con una manosidasa II
En otro ejemplo, para generar una glucoforma humana en un microorganismo es deseable eliminar las dos manosas terminales que quedan en la estructura GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} mediante la acción de una manosidasa II. Una adenoteca que incluye secuencias que codifican señales de localización en el aparato de Golgi cis y medio se fusiona en marco a una adenoteca que codifica dominios catalíticos de manosidasa II. El organismo huésped que es una cepa, por ejemplo una levadura, que es deficiente en hipermanosilación (por ejemplo un mutante en OCH1), y proporciona N-glucanos que tienen la estructura GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en el aparato de Golgi y/o RE. Después de la transformación, se seleccionan los organismos que tienen el fenotipo de glucosilación deseado. En un procedimiento se usa un ensayo in vitro. La estructura GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} deseada (pero no la no deseada GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}) es sustrato para la enzima GlcNAc transferasa II. Por consiguiente, pueden ensayarse colonias únicas usando esta enzima in vitro en presencia del sustrato, UDP-GlcNAc. La liberación de UDP se determina o bien por HPLC o por un ensayo enzimático para determinar UDP. De forma alternativa, se usa UDP-GlcNAc marcado radioactivamente.
Los anteriores ensayos in vitro se realizan de forma conveniente en colonias individuales usando equipo de cribado de alto rendimiento. De forma alternativa se usa un ensayo de unión de lectina. En este caso, la menor unión de las lectinas específicas para las manosas terminales permite seleccionar transformantes que tienen el fenotipo deseado. Por ejemplo, la lectina de Galantus nivalis se une de forma específica a \alpha-1,3-manosa terminal, cuya concentración se reduce en presencia de actividad de manosidasa II expresada operativamente. En un procedimiento adecuado, se usa la lectina de G. nivalis unida a un soporte de agarosa sólida (disponible en Sigma Chemical, St Louis, MO) para eliminar de la población de células transformadas las que tienen niveles elevados de \alpha-1,3-manosa terminal.
Ejemplo 4 Genomanipulación de organismos para que expresen sialiltransferasa
Las enzimas \alpha-2,3-sialiltransferasa y \alpha-2,6-sialiltransferasa añaden ácido siálico terminal a los restos de galactosa en los N-glucanos humanos en desarrollo, produciendo glucoproteínas maduras. En los seres humanos, las reacciones se producen en el aparato de Golgi trans o TGN. Por consiguiente se construye una adenoteca mediante la fusión en marco de secuencias que codifican dominios catalíticos de sialiltransferasa con secuencias que codifican señales de localización en el aparato de Golgi trans o TGN. El organismo huésped es una cepa, por ejemplo una levadura, que es deficiente en hipermanosilación (por ejemplo un mutante en OCH1), que proporciona N-glucanos que tienen restos terminales de galactosa en el aparato de Golgi trans o TGN, y proporciona una concentración suficiente de CMP-ácido siálico en el aparato de Golgi trans o TGN. Tras la transformación, se seleccionan los transformantes que tienen el fenotipo deseado usando un anticuerpo específico fluorescente para N-glucanos que tiene un ácido siálico terminal.
Ejemplo 5 Procedimiento de genomanipulación de cepas para que expresen un transportador de UDP-GlcNAc
El ADNc del transportador de UDP-GlcNAc humano del aparato de Golgi ha sido clonado por Ishida y colaboradores. (Ishida, N., et al. 1999 J. Biochem. 126(1): 68-77). Guillen y colaboradores han clonado el transportador de UDP-GlcNAc del aparato de Golgi renal canino mediante corrección fenotípica de un mutante de Kluyveromyces lactis deficiente en el transportador de UDP-GlcNAc del aparato de Golgi. (Guillen. E., et al. 1998). Así, un gen de transportador de UDP-GlcNAc mamífero del aparato de Golgi tiene toda la información necesaria para que la proteína sea expresada y se dirija funcionalmente al aparato de Golgi de levaduras.
Ejemplo 6 Procedimiento de genomanipulación de cepas para que expresen el transportador de GDP-fucosa
El transportador de GDP-fucosa de la membrana del aparato de Golgi en el hígado de la rata, ha sido identificado y purificado por Puglielli, L. y C. B. Hirschberg 1999 J. Biol. Chem. 274(50): 35596-35600. El gen correspondiente puede identificarse usando técnicas estándar, como por ejemplo secuenciación del extremo N y transferencia Southern usando una sonda de ADN degenerada. Después puede expresarse el gen intacto en un microorganismo huésped que también exprese una fucosiltransferasa.
Ejemplo 7 Procedimiento de genomanipulación de cepas para que expresen el transportador de UDP-galactosa
El transportador de UDP-galactosa (UDP-Gal) humano ha sido clonado y se ha demostrado que es activo en S. cerevisiae. (Kainuma, M., et al 1999 Glycobiology 9(2): 133-141). Se ha clonado un segundo transportador de UDP-galactosa (hUGT1) humano y se ha expresado funcionalmente en células de ovario de hámster chino. Aoki, K., et al. 1999 J. Biochem. 126(5): 940-950. Del mismo modo Segawa y colaboradores han clonado un transportador de UDP-galactosa de Schizosaccharomyces pombe (Segawa, H., et al. 1999 Febs letters 451 (3): 295-298).
Transportador de CMP-ácido siálico
El transportador de CMP-ácido siálico humano (hCST) ha sido clonado y expresado en células CHO Lee 8 por Aoki y colaboradores (1999). También se ha logrado la clonación molecular del transportador de P-ácido siálico de hámster CM (Eckhardt y Gerardy Schahn 1997 Eur. J. Biochem 248(1): 187-192). La expresión funcional del transportador de CMP-ácido siálico murino fue lograda en Saccharomyces cerevisiae por Berninsone, P., et al. 1997 J. Biol. Chem. 272(19): 12616-12619.
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TABLA 6 Ejemplos de realizaciones preferidas de los procedimientos para modificar la glucosilación en un microorganismo eucariota, por ejemplo Pichia pastoris
8
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11
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TABLA 7 Recursos de Secuencias de ADN y proteínas
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14
15 
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En la bibliografía se describen procedimientos y reactivos adicionales que pueden usarse en los procedimientos para modificar la glucosilación, como por ejemplo en La patente de Estados Unidos n.º 5.955.422, la patente de Estados Unidos n.º 4.775.622, La patente de Estados Unidos n.º 6.017.743, La patente de Estados Unidos n.º 4.925.796, La patente de Estados Unidos n.º 5.766.910, La patente de Estados Unidos n.º 5.834.251, La patente de Estados Unidos n.º 5.910.570, La patente de Estados Unidos n.º 5.849.904, La patente de Estados Unidos n.º 5.955.347, La patente de Estados Unidos n.º 5.962.294, La patente de Estados Unidos n.º 5.135.854, La patente de Estados Unidos n.º 4.935.349, la patente de Estados Unidos n.º 5.707.828, y La patente de Estados Unidos n.º 5.047.335.
Los sistemas de expresión en levaduras apropiados pueden obtenerse de fuentes como por ejemplo la American Type Culture Collection, Rockville, MD. Los vectores están disponibles comercialmente de una variedad de fuentes.
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<110> Gerngross, Tillman U.
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<120> PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCIÓN DE GLUCOPROTEÍNAS MODIFICADAS
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<130> GFI 100
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/892.591
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<141> 27-06-2001
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/214.358
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 28-06-2000
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/215.638
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 30-06-2000
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/279.997
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<151> 30-03-2001
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<160> 6
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador A para el gen diana en P. pastoris (1,6-manosiltransferasa)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
atggcgaagg cagatggcag t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador B para el gen diana en P. pastoris (1,6-manosiltransferasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttagtccttc caacttcctt c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador A para el gen diana en P. pastoris (1,2-manosiltransferasas).
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (3).. (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> donde "n" es igual a "c" o "t"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (7).. (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "c"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (9).. (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "t" o "g" o "c".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (12).. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "t" o "g" o "c".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (15).. (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "g".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (17).. (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "c" o "t".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (18).. (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "t" o "c" o "g".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
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<222> (21 ).. (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> donde "n" es igual a "c" o "t".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (24).. (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "c" o "t".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tantggngng tngancnnga natnaa 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador para el gen diana en P. pastoris (1,2-manosiltransferasas).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (3).. (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "g".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (6).. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "t" o "g" o "c".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (12).. (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "t" o "g" o "c".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (14).. (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "g" o "t".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (15).. (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "c" o "t".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc <222> (18).. (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que "n" es igual a "a" o "g".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcntcncccc ancnntcnta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tetrapéptido de señalización
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\sa{His Asp Glu Leu}
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<210> 6
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<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tetrapéptido de señalización
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Glu Leu}

Claims (22)

1. Un procedimiento de cribar una adenoteca para detectar una célula huésped capaz de producir una glucoproteína diana con más del 30% molar de Man_{5}GlcNAc_{2}, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) proporcionar una célula huésped unicelular o de hongo filamentoso que no presente actividad de alfa-1,6-manosiltransferasa con respecto al N-glucano de la glucoproteína diana;
(b) introducir un gen en dicha célula huésped que codifica una enzima híbrida que comprende un dominio catalítico de alfa-1,2 manosidasa fusionado a un péptido de señalización celular en el extremo N que dirige y ancla dicho dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi; y
(c) determinar el nivel de Man_{5}GlcNAc_{2} en la proteína diana.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1 que además comprende:
(i) introducir un gen en dicha célula huésped que codifica una enzima híbrida que comprende un dominio catalítico de GnT I fusionado a un péptido de señalización celular en el extremo N que la dirige y la ancla a dicho RE o aparato de Golgi; y
(ii) determinar el nivel de Man_{5}GlcNAc_{2} convertido por dicho GnT I en GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2 que además comprende introducir uno o más genes en dicha célula huésped que codifica una enzima híbrida que comprende una dominio catalítico de manosidasa, glucosiltransferasa o glucosidasa fusionado a un péptido de señalización celular en el extremo N que la dirige y la ancla a dicho RE o aparato de Golgi.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el dominio catalítico de glucosiltransferasa se selecciona a partir del grupo constituido por GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI, GalT, fucosiltransferasa y sialiltransferasa.
5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la manosidasa es una manosidasa II.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además comprende introducir un gen en dicha célula huésped que codifica transportadores de nucleótidos y azúcares o nucleótido difosfatasas.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el transportador de nucleótidos y azúcares se selecciona a partir del grupo constituido por transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa y transportador de CMP-ácido siálico.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la nucleótido difosfatasa es una difosfatasa específica de UDP o GDP.
9. Una célula huésped que puede obtenerse mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Una célula huésped que es unicelular o un hongo filamentoso que
(a) no presenta actividad de alfa-1,6-manosiltransferasa con respecto al N-glucano de una glucoproteína; y
(b) tiene en su retículo endoplasmático (RE) o aparato de Golgi una enzima híbrida que se selecciona para que tenga una actividad óptima en el RE o en el aparato de Golgi que comprende:
(ba) un dominio catalítico de alfa-1,2-manosidasa; fusionado a
(bb) un péptido de señalización de direccionamiento celular, en el extremo N quimérico con respecto al dominio catalítico de (ba) que dirige y ancla el dominio catalítico de (ba) a dicho RE o aparato de Golgi.
\vskip1.000000\baselineskip
11. La célula huésped de la reivindicación 10 que además tiene
(c) en su RE o aparato de Golgi una enzima híbrida que se selecciona para que tenga una actividad óptima en el RE o aparato de Golgi que comprende:
(ca) un dominio catalítico de GnT I; fusionado a
(bb) un péptido de señalización de direccionamiento celular, en el extremo N quimérico con respecto al dominio catalítico de (ca) que dirige y ancla el dominio catalítico de (ca) a dicho RE o aparato de Golgi.
\vskip1.000000\baselineskip
12. La célula huésped de la reivindicación 10, en la que los dominios catalíticos de la alfa-1,2 manosidasa tiene una actividad óptima en el RE o en el aparato de Golgi a un pH entre 5,1 y 8,0.
13. La célula huésped de la reivindicación 12, en la que el dominio catalítico de la alfa-1,2 manosidasa tiene una actividad óptima a un pH de entre 5,9 y 7,5.
14. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que además expresa una o más enzimas híbridas que comprenden un dominio catalítico de manosidasa, glucosiltransferasa o glucosidasa fusionado a un péptido de señalización celular del extremo N que lo dirige y lo ancla a dicho RE o aparato de Golgi.
15. La célula huésped de la reivindicación 14, en la que el dominio catalítico de LA glucosiltransferasa se selecciona a partir del grupo constituido por GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI, GalT, fucosiltransferasa y sialiltransferasa.
16. La célula huésped de la reivindicación 14, en la que la manosidasa es una manosidasa II.
17. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que además expresa transportadores de nucleótidos y azúcares o nucleótido difosfatasas.
18. La célula huésped de la reivindicación 17, en la que el transportador de nucleótidos y azúcares se selecciona a partir del grupo constituido por transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa y transportador de CMP-ácido siálico.
19. La célula huésped de la reivindicación 17, en la que la nucleótido difosfatasa es una difosfatasa específica de UDP o GDP.
20. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19, que además es deficiente en la actividad de una o más enzimas que se seleccionan a partir del grupo constituido por manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas.
21. La célula huésped de la reivindicación 20, que además no expresa una enzima que se selecciona a partir del grupo constituido por 1,6-manosiltransferasa, 1,3-manosiltransferasa y 1,2-manosiltransferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un procedimiento para producir una glucoproteína recombinante que comprende:
(a) introducir un ácido nucleico que codifica la glucoproteína recombinante en una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 21;
(b) expresar el ácido nucleico en la célula huésped para producir la glucoproteína; y
(c) aislar la glucoproteína recombinante de la célula huésped.
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