KR20030031503A

KR20030031503A - 변형된 당단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR20030031503A
Application number: KR1020027017911A
Authority: KR
Inventors: 유. 게른그로스틸만
Original assignee: 글리코파이, 인크.
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2003-04-21
Also published as: ES2252261T3; US7029872B2; CA2412701A1; WO2002000879A3; MXPA03000105A; ATE309385T1; EP2339013A1; CY1109639T1; US20120322100A1; US20070105127A1; NZ523476A; EP1297172B1; JP2011167194A; DK1522590T3; US20060148035A1; US8211691B2; ATE440959T1; ES2330330T3; AU7684201A; US7981660B2

Abstract

본 발명은 세포주로 하여금 인간에서 당단백질의 프로세싱을 의태하는 일련의 효소 반응을 수행할 수 있게하는 유전적으로 변형된 당단백질 경로를 보유하는 세포주에 관한 것이다. 이들 조작된 숙주 내에서 발현된 재조합 단백질은, 그들의 대응하는 인단 당단백질과 실질적으로 동일하지 않은 경우, 더 유사한 당단백질을 산출한다. 통상적으로 만노즈 함량이 높은 N-글리칸을 생성하는, 단세포 및 다세포 균류를 포함하는 하등 진핵 생물을 변형하여 인간 글리코실화 경로를 따라 Man₅GlcNAc₂와 같은 N-글리칸 또는 다른 구조물을 생성한다. 이는 균주의 조작 및/또는 선택의 조합을 이용하여 획득되는데, 상기 균주는 균류 당단백질에 특징적인 바람직하지 않은 복합 구조를 생성하는 특정 효소를 발현하지 않으며, 활성이 요망되는 균류 내에 존재하는 조건 하에서 최적 활성을 보유하거나, 최적 활성이 획득되는 기관에 표적화된 선택된 외인성 효소를 발현하거나 이의 조합인 균주인데, 이때 유전자 조작된 진핵 생물은 "인간-유사" 당단백질을 제조하는데 필요한 다수의 외인성 효소를 발현한다.

Description

변형된 당단백질의 제조 방법{METHODS FOR PRODUCING MODIFIED GLYCOPROTEINS}

글리코실화 경로

드 노보(De novo) 합성된 단백질은 세포내에서 추가로 프로세싱될 수 있는데, 이는 번역후 변형으로 공지되어 있다. 구체적으로, 당 잔기가 효소적으로 첨가될 수 있는데, 이는 글리코실화라 공지된 과정이다. 공유 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유하는 생성 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질이라 알려져 있다. 박테리아는 전형적으로 단백질을 글리코실화하지 않는데; 글리코실화가 일어나는 경우, 이는 보통 단백질 내의 비특정 위치에서 발생한다[참조: Moens 및Vanderleyden, Arch. Microbiol. 1997 168(3): 169-175].

진핵 생물은 일반적으로 단백질 아스파라긴 잔기, 구체적으로 서열 Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys(이때, Xaa는 임의의 아미노산임)내의 아스파라긴의 측쇄에 특정 올리고사카라이드를 부착시킨다. N-글리칸이라 공지된 사카라이드 부분의 부착후, 생체 내에서 추가의 변형이 일어날 수 있다. 전형적으로 이들 변형은 캐스케이드로 알려진 순서가 정해진 효소 반응에 의해 일어난다. 다른 유기체는 상이한 글리코실화 효소(글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제) 및 상이한 글리코실 기질을 제공하여 당 측쇄의 최종 조성은 숙주에 따라 현저하게 달라진다.

예를 들어, 균사가 있는 사상 균류 및 효모(하등 진핵 생물)와 같은 미생물은 전형적으로 추가의 만노즈 및/또는 만노실포스페이트 당을 첨가한다. 생성된 글리칸은 "고급-만노즈" 유형 또는 만난으로 공지되어 있다. 대조적으로, 동물 세포에서, 신생 올리고사카라이드 측쇄는 잘라져 몇몇 만노즈 잔기를 제거하고, 하등 진핵생물의 N-글리칸 내에서 전형적으로 발생하지 않는 추가의 당 잔기로 신장된다[참조: R.K. Bretthauer 등, Biotechnology and Applied Biochemistry, 1999, 30, 193-200; W. Martinet 등, Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; S. Weikert 등, Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; M. Malissard 등, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis 등, 1998 Engineering N-glycosylation pathways in the baculovirus-insect cell systems, Current Opinion in Biotechnology, 9: 528-533; 및 M. Takeuchi, 1997 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35].

인간 및 동물에서 생성된 N-글리칸은 복합 N-글리칸으로 통칭된다. 복합 N-글리칸은 전형적으로 2 내지 6개의 외부 가지와 내부 코어 구조인 Man₃GlcNAc₂에 연결된 시알락토즈아민 서열을 가진 구조물을 의미한다. 복합 N-글리칸은 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 가지를 보유하며, 다음과 같은 올리고사카라이드 내에서 종결되는 갈락토즈(Gal) 잔기와 GlcNAc가 교호하는 구조이다: NeuNAc-; NeuAcα2-6GalNAcα1-; NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα1-; NeuAcα2-3/6Galβ1-4GalNAcβ1-; GlcNAcα1-4Galβ1-(단지 뮤신); Fucα1-2Galβ1-(혈액군 H). 설페이트 에스테르는 갈락토즈, GalNAc 및 GlaNAc 잔기에서 일어나며, 포스페이트 에스테르는 만노즈 잔기에서 일어난다. NeuAc(Neu: 뉴라민산; Ac: 아세틸)은 NeuGl(N-글리콜릴뉴라민산)에 의해 대체되거나, O-아세틸화된다. 복합 N-글리칸은 또한 양분성 GlcNAc와 코어 푸코즈(Fuc)의 사슬내 치환을 보유할 수도 있다.

인간 글리코실화는 소포체(ER) 내에서 코어 올리고사카라이드 구조에 이르는 일련의 순서가 정해진 반응을 개시하는데, 이는 서열 Asn-Xaa-Ser/Thr(도 1A) 내의 아스파라긴 잔기에서 드노보 합성된 단백질에 전달된다. 신생 당단백질이 초기 골지 장치에 전달되기 이전에 ER 내에서 글루코시다제 및 만노시다제에 의한 추가의 프로세싱이 일어나는데, 여기서 추가의 만노즈 잔기는 골지-특이성 1,2-만노시다제에 의해 제거된다. 프로세싱은 단백질이 상기 골지를 통해 진행할 때 계속된다. 중간 골지에서 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제(GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), 만노시다제 II, 푸코실트랜스퍼라제를 포함하는 다수의 변형 효소는 특정 당 잔기를 첨가하고 제거한다(도 1B). 최종적으로 트랜스 골지에서, N-글리칸에는 갈락토실 트랜스퍼라제 및 시알릴크랜스퍼라제(ST)가 작용하며, 마무리된 당단백질은 고리 장치로부터 방출된다. 동물 당단백질의 단백질 N-글리칸은 2-, 3- 또는 4-안테나형 구조를 보유하며, 전형적으로 갈락토즈, 푸코즈 및 N-아세틸글루코사민을 포함할 수 있다. 통상적으로 N-글리칸의 말단 잔기는 시알산으로 구성된다. 인간 N-글리칸의 전형적인 구조는 도 1B에 도시되어 있다.

당 뉴클레오티드 전구체

동물 당단백질의 N-글리칸은 전형적으로 갈락토즈, 푸코즈, 및 말단 시알산을 포함한다. 이들 당은 일반적으로 효모 및 사상 균류에서 제조된 당단백질에서는 발견되지 않는다. 인간에서, 전장 뉴클레오티드 당 전구체(예를 들어, UDP-N-아세틸글루코사민, UDP-N-아세틸갈락토사민, CMP-N-아세틸뉴라민산, UDP-갈락토즈, GDP-푸코즈 등)은 일반적으로 세포질에서 합성되어 골지내로 수송되는데, 여기서 이들은 글리코실트랜스퍼라제에 의해 코어 올리고사카라이드에 부착된다[참조: Sommers 및 Hirschberg, 1981, J. Cell Biol. 91(2): A406-A406; Sommers 및 Hieschberg, 1982 J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez 및 Hirschberg 1987 Mrthods in Enzymology 138: 709-715].

글리코실 전이 반응은 전형적으로 뉴클레오시드 디포스페이트 또는 모노포스페이트인 부산물을 생성한다. 모노포스페이트는 앤티포트 메카니즘에 의한 뉴클레오시드 트리포스페이트 당과의 교환에 의해 직접 방출될 수 있지만, 디포스포뉴클레오시드(예를 들어, GDP)는 방출되기 이전에 포스파타제(예를 들어, GDPase)에 의해 절단되어 뉴클레오시드 모노포스페이트 및 무기 포스페이트를 생성하여야만 한다. 이 반응은 효율적인 글리코실화를 위해 중요한데; 예를 들어, 에스. 세레비제에서 유래하는 GDPase는 만노실화를 위해 필요한 것으로 확인되어 왔다. 그러나, GDPase는 UDP에 대해 90% 감소된 활성을 나타낸다[참조: Berninsone 등, 1994, J. Biol. Chem. 269(1): 207-211α]. 하등 진핵 생물은 전형적으로 골지 장치내에 UDP-특이 디포스파타제 할성이 결여되어 있는데, 그 이유는 이들이 골지에 기초한 당단백질 합성을 위해 UDP-당 전구체를 이용하지 못하기 때문이다. 세포벽 폴리사카라이드에 갈락토즈 잔기를 (UDP-갈락토즈로부터) 첨가하는 것으로 확인된 효모인 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccaromyces pombe)는 특히 UDPase 활성을 보유하는 것으로 확인되었으며, 이는 이러한 효소의 필요성을 나타내는 것이다(Berninsone 등, 1994). UDP는 글리코실트랜스퍼라제의 강력한 억제제로 알려져 있으며, 이 글리코실화 부산물의 제거는 골지의 루멘 내에서 글리코실트랜스퍼라제 억제를 예방하기 위해중요하다(Khatara 등, 1994)[참조: Berninsone, P. 등, 1995, J. Biol. Chem. 270(24): 14564-14567; Beaudet, L. 등, 1998, Abc Transporters: Biochemical, Cellular and Molecular Aspects. 292: 397-413].

글리코실화 효소의 구획화

글리코실트랜스퍼라제 및 만노시다제는 ER 및 골지 장치의 내면(내강)을 라이닝함으로써 당단백질이 ER 및 골지 네트웍을 통해 프로세싱될 때 당단백질의 정해진 순서의 프로세싱을 가능하게하는 촉매 표면을 제공한다. 시스, 중간 및 트랜스 골지와 트랜스 골지 네트웍(TGN)의 다중 구획은 정해진 순서의 글리코실화 반응이 일어날 수 있는 상이한 위치를 제공한다. 당단백질은 ER 내에서의 합성으로부터후기 골지 또는 TGN 내에서의 완전 성숙에 까지 프로세싱되기 때문에, 이는 상이한 글리코시다제, 만노시다제 및 글리코실트랜스퍼라제에 순서에 따라 노출됨으로써 특정 N-글리칸 구조를 합성할 수 있다. 상기 효소들은 전형적으로 촉매 도메인, 스템 영역, 막 걸침 영역 및 N-말단 세포질성 꼬리를 포함한다. 후자의 3개의 구조적 성분은 글리코실화 효소가 적절한 위치로 유도되도록 한다.

한 유기체로부터의 국부화 순서는 다른 유기체에서도 기능할 수 있다. 예를 들어, 래트로부터 유래한, 래트 트랜스 골지에서 국부화하는 것으로 공지된 효소인 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(α-2,6-ST)의 막 걸침 영역은 효모 골지 내에서 리포터 유전자(인버타제)를 국부화하는 것으로 확인되었다(Schwientek 등, 1995). 그러나, 전장 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 일부분과 매우 동일한 막 걸침 영역은 ER내에 보유되며, 효모의 골지 내로 더이상 수송되지 않는다(Krezdom 등, 1994). 인간으로부터 유래한 전장 GalT는 입증할 수 있게 높은 전사 수준에도 불구하고 효모 내에서 합성조차되지 않는다. 한편, 인버타제 리포터에 융합된 동일한 인간 GalT의 경막 영역은, 비록 그의 생성 수준은 저조하지만, 효모 골지내로 직접 국부화된다. Schwientek 및 동역자들은 인간 GalT의 촉매 도메인에 융합하는 효모 만노실트랜스퍼라제(Mnt1)의 28개의 아미노산, N-말단 세포질성 꼬리, 경막 영역 및 스템 영역의 8개의 아미노산이 활성 GalT의 골지 국부화를 위해 충분함을 확인하였다[참조: Schwientek 등, 1995 J. Biol. Chem. 270(10): 5483-5489]. 다른 갈락토실트랜스퍼라제는 특정 기관내의 효소와의 상호작용에 의존하는 것으로 생각되는데, 그 이유는 그들의 경막 영역의 제거후에도, 그들은 여전히 적절하게 국부화될 수 있기 때문이다.

글리코실화 효소의 부적절한 국부화는 상기 경로에서 효소의 적합한 작용을 방해할 수 있다. 예를 들어, 다수의 α-1,2-만노시다제를 보유하는 아스퍼길러스 니둘란스[참조: Eades 및 Hintz, 2000, Gene 255(1): 25-34]는, 토끼 GnT I 유전자로 형질전환시 GnT I 활성의 전체적으로 높은 수준에도 불구하고 Man₅GlcNAc₂에 GlcNAc를 첨가하지 않는다(Kalsner 등, 1995). 활성적으로 발현됨에도 불구하고, GnT I은 올바르게 국부화되지 않아 상기 효소는 그의 기질, 즉 당단백질의 신생 N-글리칸 및 UDP-GlcNAc와 접촉하지 않을 수 있다. 또는, 숙주 유기체는 골지 내에서 적절한 수준의 UDP-GlcNAc를 제공하지 않을 수 있다.

치료적으로 사용된 당단백질

인간 또는 다른 동물로부터 분리된 단백질중 상당량은 글리코실화된다. 치료적으로 사용된 단배질 중에서 약 70%가 글리코실화된다. 그러나, 치료적 단백질이 효모와 같은 미생물에서 제조되고, 내재하는 경로를 이용하여 글리코실화되는 경우, 그의 치료적 유효성은 전형적으로 크게 감소된다. 이러한 당단백질은 전형적으로 인간에서 면역원성이며, 투여후 생체 내에서 감소된 수명을 나타낸다(Takeuchi, 1997).

인간 및 동물에서 특이 수용체는 말단 만노즈 잔기를 인식하고 혈류로부터 단백질의 신속한 클리어런스를 촉진한다. 이외의 역효과는 단백질 폴딩, 용해도, 프로테아제에 대한 감수성, 트래픽킹, 트랜스포트, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식, 항원성 또는 알러지유발성에서의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 동물 숙주 시스템에서 치료적 당단백질을 생성하여 글리코실화 패턴을 인간 또는 의도된 수용체 종에서의 그것과 동일하거나 적어도 유사하게할 필요가 있었다. 대부분의 경우, 포유류 숙주 시스템, 예를 들어 포유류 세포 배양을 사용한다.

치료적 당단백질의 생성 시스템

적합한 당형태를 보유하고, 만족스러운 치료 효과를 보유하는 치료 단백질을 생성하기 위해, 동물 또는 식물계 발현 시스템을 사용하여 왔다. 이용할 수 있는 시스템은 다음과 같다:

1. 차이니즈 햄스터 난 세포(CHO), 마우스 섬유아세포 및 마우스 골수종 세포[참조: Arzneimittelforschung. 1988. 8; 48(8): 870-880]

2. 트랜스게닉 동물, 예를 들어 염소, 양, 마우스 및 기타[참조: Dente Prog. Clin. Biol. 1989 Res. 300: 85-98, Ruther 등, 1988 ㅊ디ㅣ 53(6): 847-856; Ware, J. 등, 1993 Thrombosis and Haemostasis 69(6): 1194-1194; Cole, E. S. 등, 1994, J. Cell. Biochem. 265-265]

3. 식물(아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 담배 등)[참조: Staub 등, 2000, Nature Biotechnology 18(3): 333-338)(McGarvey, P.B.등, 1995, BioTechnology 13(13): 1484-1487; Bardor, M. 등, 1999 Trends in Plant Scince 4(9): 376-380];

4. 곤충 세포(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9, Sf21, 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni) 등, 재조합 바쿨로바이러스, 예를 들어 레피도프테란 세로를 감염하는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 다중핵 폴리헤드로시스 바이러스)(Altmans 등, 1999 Glycoconj. J. 16(2): 109-123)].

상기 숙주 시스템 내에서 발현된 재조합 인간 단백질은 여전히 비인간 당형태를 포함할 수 있다[참조: Raju 등, 2000 Annals Biochem. 283(2): 123-132]. 구체적으로, N-글리칸의 분획에는 인간 당단백질에서 전형적으로 확인되는 말단 시알산이 결여되어 있다. 인간 형태와 구조적으로 가능하면 유사한 구조를 보유하거나 다른 치료적 잇점을 보유하는 당단백질을 얻기위한 개발 과정에 실질적인 노력이 집중되었다. 특정 당형태를 보유하는 당단백질은 예를 들어, 치료 단백질의 표적화에서 특히 유용하다. 예를 들어, 글리칸에 대한 하나 이상의 시알산 잔기의 첨가는 투여후 생체 내에서 치료적 당단백질의 수명을 증가시킬 수 있다. 따라서, 포유류 숙주 세포는 유전적으로 조작하여 상기 세포 내에서 발현된 당단백질에서 말단 시알산의 양을 증가시킬 수 있다. 또는, 시알산은 투여전에 시알산 트랜스퍼라제 및 적합한 기질을 이용하여 시험관 내에서 소정의 단백질에 접합시킬 수 있다. 또한, 성장 배지 조성의 변화 또는 인간 글리코실화에 연루된 효소의 발현에서의 변화를 이용하여 더욱 유사한 인간 형태의 당단백질을 생성할 수 있다[참조: S. Weikert 등, Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; Werner, Noe 등, 1999; Andersen 및 Goochee 1994 Cur. Opin. Biotechnol. Bioengin. 68(4): 370-380]. 또는, 배양된 인간 세포를 사용할 수도 있다.

그러나, 기존의 모든 시스템은 심각한 단점을 보유하고 있다. 단지 특정 치료 단백질이 동물 또는 식물 시스템(예를 들어, 임의의 세포독성 효과 또는 성장에유해한 다른 효과가 결여된 것)에서의 발현에 적합하다. 동물 및 식물 세포 배양 시스템은 일반적으로 매우 느리며, 왕왕 주의깊게 조절된 조건 하에서 소정의 단백질을 임의의 유효량으로 생성하기 위해서는 일주일 이상이 필요할 수도 있다. 그럼에도 불구하고 단백질 수율은 미생물 발효 과정을 통해 얻은 수율과는 비교되지 않는다. 또한, 세포 배양 시스템은 일반적으로 복잡하고 고가의 영양소 및 보조인자, 예를 들어 태아 소 혈청을 필요로 한다. 또한, 성장은 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스)에 의해 제한될 수 있다.

또한, 동물 세포(특히, 포유류 세포)는 바이러스 감염 또는 오염에 매우 민감하다. 몇몇 경우에서, 바이러스 또는 기타 감염제가 배양물의 성장을 손상시킬 수 있는 한편, 다른 경우에서, 상기 제제는 인간 병원체일 수 있어 치료 단백질을 의도된 용도로 이용하기에 부적당한 것으로 만든다. 또한, 많은 세포 배양 과정은 복잡하고, 온도에 민감하며, 동물에서 유래한 성장 배지 성분의 이용을 필요로할 수 있는데, 이들은 소 해면상 뇌질환(BSE) 프리온과 같은 병원체를 보유할 수 있다. 이러한 병원체는 검출하기 어렵고/어렵거나 성장 배지를 손상시키기 않고 제거 또는 멸균하기가 어렵다. 임의 경우, 치료 단백질을 생성하기 위해 동물 세포의 이용은 생성물 안정성을 담보하기 위해 고가의 품질 조절이 요구된다.

또한, 트랜스게닉 동물을 사용하여 다량의 치료 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 조직 플라스미노겐 활성제, 모노클로날 항체, 헤모글로빈, 콜라겐, 피브리노겐 및 기타 물질을 제조할 수 있다. 트랜스게닉 염소 및 기타 트랜스게닉 동물(마우스, 양, 소 등)은 유전적으로 조작되어 밀크 내에서 고농도의 치료 단백질을 생성할 수 있지만, 이러한 과정은 모든 배치가 엄격한 품질 조절을 수행해야 하기 때문에 비용이 많이 든다. 동물은 여러가지 동물 또는 인간 병원체, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 균류 및 프리온을 호스팅할 수 있다. 스크라피 및 소 해면상 뇌질환의 경우, 테스트는 감염을 배제하기 위해 약 1년에 걸쳐 수행될 수도 있다. 따라서, 치료 화합물의 생성은 잘 조절된 멸균 환경, 예를 들어 GMP(Good Manufactiring Practice) 조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 그러나, 일반적으로 이러한 환경에서 동물을 유지하는 것은 불가능하다. 또한, 발효기 내에서 성장한 세포는 하나의 잘 특정화된 MCB(Master Cell Bank)로부터 유래하는 반면, 트랜스게닉 동물 기술은 상이한 동물에 의존하며, 따라서 본질적으로 균일하지 않다. 또한, 외부 요인, 예를 들어 상이한 양분 흡수, 질병 및 무리내의 균질성의 결여가 최종 생성물의 글리코실화 패턴에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 인간에서 상이한 식이 습관은 상이한 글리코실화 패턴을 유발하는 것으로 공지되어 있다.

트랜스게닉 식물은 치료적 가치가 있는 단백질을 얻기 위한 잠재 공급원으로서 개발되어 왔다. 그러나, 식물에서 매우 높은 수준의 발현은 유전자 침묵(높게 발현된 단백질에 대한 유전자가 후속 식물 세대에서 하향 조절되는 기작)을 겪게된다. 또한, 식물은 단백질인 N-글리칸에 자일로즈 및/또는 α-1,3-연결된 푸코즈를 첨가하여 동물에서와는 구조가 다른 당단백질을 생성하는데, 이는 동물에서 면역원성이 있다[참조:Altmann, Marz 등, 1995, Glycoconj. J. 12(2); 150-155]. 또한, 멸균 환경 또는 GMP 환경에서 식물을 성장시키는 것은 일반적으로 실용적이지 않으며, 식물 조직으로부터 단백질의 회수는 발효된 미생물로부터 회수하는 것보다 비용이 더 많이 든다.

진핵 미생물을 이용하는 당단백질 생성

따라서, 적합한 발현 시스템의 결여는 재조합 인간 당단백질을 저렴한 비용으로 안전하게 생성하는데 있어 심각한 장애물이다. 미생물의 발효를 통한 당단백질의 생성은 기존 시스템에 비해 다수의 잇점을 제공한다. 예를 들어, 발효를 통한 단백질의 생성은

(a) 고 농도 단백질의 신속한 생성하고;

(b) 멸균되고, 잘 조절 생성 조건(예를 들어, GMP 조건)을 이용할 수 있고;

(c) 단순하고, 화학적으로 한정된 성장 배지를 이용할 수 있고;

(d) 유전자 조작이 용이하고;

(e) 인간 또는 동물 병원체의 감염이 없으며;

(f) 다양한 종류의 단백질, 예를 들어 독성 등으로 인해 세포 배양에서 잘 발현되지 않은 단백질을 발현할 수 있으며;

(g) 단백질 회수(예를 들어, 배지로의 분비)가 용이하다

는 장점을 제공한다. 또한, 발효 설비는 일반적으로 세포 배양 설비 보다 저렴하게 구성할 수 있다.

그러나, 상기한 바와 같이, 통상적으로 재조합 단백질을 생성하기 위해 사용된 에스케리치이 콜리와 같은 종을 포함하는 박테리아는 진핵생물과 같이 특정 방식으로 단백질을 글리코실화하지 않는다. 여러가지 메틸로트로픽 효소, 예를 들어 피치아 파스토리스, 피치아 메탄올리카 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenulapolymorpha)는 진핵세포 발현 시스템으로 특히 유용한데, 그 이유는 이들이 높은 세포 밀도로 성장할 수 있고/있거나 다량의 재조합 단백질을 분비할 수 있기 때문이다. 그러나, 상기한 바와 같이, 이들 진핵세포 미생물 내에서 발현된 당단백질은 동물 내에서 발현된 것과는 N-글리칸 구조에서 실질적으로 상이하다. 이는 효모 또는 사상 균류를 다수의 유용한 당단백질 생성을 위한 숙주로서 사용하는 것을 방해한다.

진핵 미생물의 글리코실화 경로를 변경하여 포유류 치료제로서 사용하기에 더욱 적합한 당단백질을 제공하기 위한 몇몇 노력이 수행되었다. 예를 들어, 몇몇 글리코실트랜스퍼라제는 별로도 클로닝하고 에스. 세레비제(GalT, GnT I), 아스퍼길러스 니둘란스(GnT I) 및 다른 균류에서 발현되어 왔다[참조: Yoshida 등, 1999, Kalsner 등, 1995 Glycoconj. J. 12(3): 360-370, Schwientek 등, 1995]. 그러나, 인간 특성을 보유한 N-글리칸은 얻어지지 않았다.

효모는 여러가지 만노실트랜스퍼라제, 예를 들어 1,3-만노실트랜스퍼라제(예를 들어, 에스. 세레비제내의 MNN1)[참조: Graham 및 Emr, 1991, J. Cell. Biol. 114(2): 207-218], 1,2-만노실트랜스퍼라제(예를 들어, 에스. 세레비제로부터 유래한 KTR/KRE 패필리), 1,6-만노실트랜스퍼라제(에스. 세레비제로부터 유래한 OCH1), 만노실포스페이트 트랜스퍼라제(에스. 세레비제로부터 유래한 MNN4 및 MNN6) 및 내인성 글리코실화 반응에 연루된 추가의 효소를 생성한다. 이들 다수의 유전자는 개별적으로 결실되어 변경된 글리코실화 프로필을 보유하는 생육가능한 유기체를 유발시킨다. 예들은 하기 표 1에 나타냈다.

변경된 만노실화를 보유하는 효모 균주의 예

균주	N-글리칸(야생형)	돌연변이	N-글리칸(돌연변이형)	참조
에스. 폼브	Man_>9GlcNAc₂	OCH1	Man₈GlcNAc₂	Yoko-o 등, 2001 FEBS Lett. 489(1): 75-80
에스. 세레비제	Man_>9GlcNAc₂	OCH1/MAN1	Man₈GlcNAc₂	Nakanishi-Shindo 등, 1993 J. Biol. Chem. 268(35): 26338-26345
에스. 세레비제	Man_>9GlcNAc₂	OCH1/MNN1/MNN4	Man₈GlcNAc₂	Chiba 등, 1998 J. Biol. Chem. 273, 26298-26304

또한, 일본 특허 출원 공고 8-336387호는 피치아 파스토리스의 OCH1 돌연변이 균주를 개시하고 있다. OCH1 유전자는 1,6-만노실트랜스퍼라제를 암호화하는데, 이 효소는 글리칸 구조 Man₈GlcNAc₂에 만노즈를 첨가하여 Man₉GlcNAc₂를 생성한다. 이어서, Man₉GlcNAc₂구조는 생체 내에서 추가의 만노실화를 위한 기질이며, 효모의 특징인 과만노실화된 당단백질을 생성하는데, 이는 정형적으로 N-글리칸 당 30-40 이상의 만노즈 잔기를 보유할 수 있다. OCH1 돌연변이 균주에서, Man₈GlcNAc₂로 글리코실화된 단백질은 동물 글리코실화 효소, 예를 들어 인간 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제 I을 위한 기질이 아니며, 따라서 상기 방법은 인간 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생성하는데 유용하지 않다.

문헌[참조: Martinet 등, Biotechnol. Lett. 1988, 20(12), 1171-1177]에는 피. 파스토리스내의 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)로부터 α-1,2-만노시다제의 발현이 보고되어 있다. 모델 단백질의 N-글리칸으로부터 절단된 몇몇 만노즈가 관찰되었다. 그러나, 상기 모델 단백질은 복합 N-글리칸의 생성을 위한 중간체인 Man₅GlcNAc₂구조를 보유하는 N-글리칸은 보유하지 않았다. 따라서, 상기 방법은 인간 또는 동물 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생성하는데에는 유용하지 않다.

유사하게, Chiba 등(1998)은 효모 사카로마이세스 세레비제내에서 아스퍼길러스 사이토이로부터 α-1,2-만노시다제를 발현하였다. 단일 펩티드 서열(His-Asp-Glu-Leu)은 외인성 만노시다제로 조작되어 ER 내에서의 체류를 촉진시켰다. 또한, 효모 숙주는 단백질의 과만노실화와 관련된 3가지 효소 할성, 즉 1,6-만노실트랜스퍼라제(OCH1), 1,3-만노실트랜스퍼라제(MNN1) 및 만노실포스페이트트랜스퍼라제 (MNN4) 효소 활성이 결여된 돌연변이주이다. 따라서, 삼중 돌연변이 숙주의 N-글리칸은 야생형 에스. 세레비제에서 확인된 고 만노즈 형태라기 보다는 오히려 Man₈GlcNAc₂구조로 이루어져 있다. 조작된 만노시다제의 존재 하에서, 모델 단백질(카르복시펩티다제 Y)의 N-글리칸은 절단되어 27 몰%의 Man₅GlcNAc₂, 22 몰%의 Man₆GlcNAc₂, 22 몰%의 Man₇GlcNAc₂, 및 29 몰%의 Man₈GlcNAc₂로 이루어진 혼합물을 생성한다. 내인성 세포 벽 당단백질의 절단은 덜 효율적이며, 소정 Man₅GlcNAc₂를 보유하는 N-글리칸을 단지 10 몰% 보유한다.

단지 Man₅GlcNAc₂글리칸이 인간 당형태로의 추가 효소적 전환에 민감하기 때문에, 상기 방법은 인간 글리코실화 패턴을 보유하는 단백질의 생성에는 효율적이지 못하다. 단일 N-글리코실화 위치를 보유하는 단백질에서, 73 몰% 이상이 부적절한 구조를 보유한다. 2 또는 3개의 N-글리코실화 위치를 보유하는 단백질에서, 각각 93 몰% 또는 98 몰% 이상이 부적절한 구조를 보유한다. 이렇게 낮은 전환 효율은 치료제의 생성에는 만족스럽지 못한데, 그 이유는 특히 상이한 당형태를 보유하는 단백질의 분리는 비용이 많이 들고 어렵기 때문이다.

균류 숙주로부터 유도된 더 인간에 유사한 당단백질을 제공할 목적으로 미국 특허 제5,834,251호(Maras 및 Contreras)는 트리코더마 리세이로부터 유도된 하이브리드 당단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 하이브리드 N-글리칸은 코어의 Manα1-6 팔 상에 단지 만노즈 잔기 및 Manα1-3 팔 상에 하나 또는 두개의 복합 안테나를 보유한다. 이러한 구조는 유용성을 갖지만, 상기 방법은 시험관 내에서 수행되어야만 하는 다수의 효소 처리 단계가 비용이 많이 들고 시간 소모적이라는 단점이 있다. 분리된 효소는 제조 및 유지에 비용이 많이 소요되며, 통상적이지 않고 고가의 기질(예를 들어, UDP-GlcNAc)를 필요로할 수도 있으며, 사용 조건 하에서 활성을 상실하고/하거나 단백질 분해되는 경향이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 피치아 파스토리스 및 다른 하등 진핵생물, 예를 들어 한세눌라 폴리모르파, 피치아 스팁티스, 피치아 메탄올리카, 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 캔디다 알비칸스, 아스퍼길러스 니둘란스 및 트리코더마 리세이 내에서 발현된 재조합 당단백질의 글리코실화를 인간화하는 방법을 제공한다.

관련 출원

본원은 미국 가출원 60/214,358호(2000년 6월 28일), 60/215,638호(2000년 6월 30일) 및 60/279,997호(2001년 3월 30일)의 우선권주장 출원이다.

본 발명은 인간 또는 동물 치료제로서 유용한, 동물 세포, 특히 인간 세포에 의해 생성된 당단백질에 유사한 글리코실화 패턴을 보유하는 글리코실화된 단백질(당단백질)을 제조하기 위해 유전적으로 변형될 수 있는 균류 또는 기타 진핵 미생물에 의한 변형된 당단백질의 제조 방법 및 제조된 당단백질에 관한 것이다.

도 1A는 전형적인 균류 N-글리코실화 경로의 모식도이다.

도 1B는 전형적인 인간 N-글리코실화 경로의 모식도이다.

발명의 상세한 설명

본원에 기재된 방법 및 재조합 하등 진핵 균주는 "인간화된 당단백질"을 제조하기 위해 사용하였다. 재조합 하등 진핵생물은 인간형 당을 생성하기 위해 필요한 효소를 발현하기 위해 고 만노즈 구조물의 생성에 연루된 1종 이상의 효소를 발현하지 않는 하등 진핵생물을 조작함으로써 제조하였다. 본원에 사용한 용어 "하등 진행생물"은 단세포 균주 또는 사상 균주이다. 본원에 사용한 용어 "인간화된 당단백질"은 4개 미만의 만노즈 잔기를 포함하는 거기에 부착된 N-글리칸, 및 5개 이상의 만노즈 잔기를 보유하는 합성 중간체(유용하며, 시험관 내에서 추가 조작될 수 있음)를 보유하는 단백질을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 재조합 하등 진핵생물에서 생성된 당단백질은 27 몰% 이상의 Man5 중간체를 함유한다. 이는 더 좋은 만노시다제, 즉 단백질이 글리코실화되는 위치에서 유기체 내에 존재하는 조건 하에서 최적 활성을 보유하도록 선택된 효소내에 클로닝하거나, 활성이 요구되는 기관으로 상기 효소를 표적화함으로써 획득된다.

바람직한 구체예에서, 고 만노즈 구조물을 생성에 연루된 하나 이상의 효소를 발현하지 않는 진핵 균주를 사용한다. 이들 균주는 조작된 것이거나, 효모내의 이미 기술한 다수의 돌연변이체중 하나 일 수 있는데, 피치아 파스토리스내의 과만노실화-부재(OCH1) 돌연변이체를 포함한다.

상기 균주들은 일시에 한 효소 또는 잠재적으로 유용한 효소를 암호화하는 유전자의 라이브러리를 생성하도록 조작될 수 있고, 최적 활성을 갖는 효소를 보유하거나, 가장 "인간형" 당단백질을 생성하는 이들 균주가 선택된다.

부착된 N-글리칸 Man₅GlcNAc₂를 보유하는 당단백질을 생성할 수 있는 하등 진핵생물이 특히 유용한데, 그 이유는 (a) 이들은 높은 정도의 만노실화가 결핍되어 있어(예를 들어, N-글리칸당 8개 이상의 만노즈, 또는 특히 30-40개의 만노즈), 인간에서 감소된 면역원성을 나타내며; (b) N-글리칸은 추가의 글리코실화반응을 위한 기질이어서 더욱 더 인간형 당형태를 형성, 예를 들어 GlcNAc 트랜스퍼라제 I의 작용에 의해 GlcNAcMan₅GlcNAc₂를 형성하기 때문이다. Man₅GlcNAc₂는 생체 내에서 적어도 일시적으로 고수율로 형성되어야만 하는데, 그 이유는 모든 후속 글리코실화 반응은 Man₅GlcNAc₂또는 그의 유도체를 필요로하기 때문이다. 따라서, N-글리칸의 높은 비율이 Man₅GlcNAc₂를 보유하는 수율은 27 몰% 이상, 더 바람직하게는 50 내지 100 몰% 이상으로 얻어진다. 이어서, 예를 들어 미국 특허 제5,834,251호(Maras 및 Contreras)의 방법을 이용하여 시험관 내에서 추가의 글리코실화 반응을 수행한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 추가의 글리코실화 반응은 생체 내에서 수행된다. 이의 매우 바람직한 구체예에서, 글리코실화 효소의 할성형은 소포체 및/또는 골지 장치에서 발현된다.

숙주 미생물

효모 및 사상 균류는 둘다 내세포성 및 분비된 재조합 단백질의 생성을 위해 성공적으로 사용되어 왔다[참조: Cerehino, J. L. 및 J. M. Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45-66; Harkki, A. 등, 1989 Bio-Technology 7(6): 596; Berka, R. M. 등, 1992 Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203: 121-BIOT; Svetina, M. 등, 2000 J. Biotechnol. 76(2-3): 245-251].

효모 및 균류에서의 글리코실화는 인간에서의 그것과 매우 다름에도 불구하고, 서로에게 공유되는 몇몇 공통점이 존재한다. 첫번째 단계인 신생 단백질로 코어 올리고사카라이드 구조의 전달은 효모, 균류, 식물 및 인간을 포함하는 모든 진핵생물에서 매우 보전되어 있다(도 1A와 1B를 비교). 그러나, 코어 올리고사카라이드의 후속 프로세싱은 효소에서는 현저히 다르며, 몇몇 만노즈 당의 첨가를 포함한다. 이러한 단계는 정해진 순서에 따라 수개의 만노즈 당을 코어 올리고사카라이드에 첨가하는, 골지 내에 있는 만노실트랜스퍼라제(예를 들어, OCH1, MNT1, MNN1 등)에 의해 촉매된다. 생성되는 구조는 인간 단백질의 생성에는 바람직하지 않으며, 따라서 만노실트랜스퍼라제 활성을 감소 또는 제거하는 것이 요구된다. 만노실트랜스퍼라제 활성이 결핍된 에스. 세레비제의 돌연변이체(och1 또는 mnn9 돌연변이체)는 비치사이고, 효모 당단백질내 올리고사카라이드내에서 만노즈 함량을 감소시킨다. 다른 올리고사카라이드 프로세싱 효소, 예를 들어 만노실포스페이트 트랜스퍼라제는 또한 숙주의 특정 내인성 글리코실화 패턴에 따라 제거될 필요성이 있을 수 있다. 바람직하지 않은 내인성 글리코실화 반응을 감소시킨 후, 복합 N-글리칸의 형성되도록 숙주 시스템을 조작하여야 한다. 이는 몇몇 효소 및 당-뉴클레오티드 트랜스포터의 안정한 발현을 위해 필요하다. 또한, 이들 효소는 성숙 글리코실화 구조의 정해진 순서에 따른 프로세싱이 보장되는 방식으로 위치되어야만 한다.

표적 글리코실화

본원에 기술한 방법은 당단백질, 구체적으로 인간에서 치료적으로 사용된 당단백질을 생성하기 위해 유용하다. 이러한 치료 단백질은 전형적으로 주사, 경구 투여, 폐 투여 또는 기타 투여 방식에 의해 투여된다.

적합한 표적 당단백질의 예로는 에리트로포이에틴, 시토킨(예를 들어, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-ω, 및 과립구-CSF), 응집 인자(예를 들어, VIII 인자, IX 인자, 및 인간 단백질 C), 가용성 IgE 수용체 α-사슬, IgG, IgM, 유로키나제, 키마제 및 우레아 트립신 억제제, IGF-결합 단백질, 내피 성장 인자, 성장 호르몬 방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 앤지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수양 후대 억제 인자-1, 및 오스테오프로테게린을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

N-글리칸 Man ₅ GlcNAc ₂ 를 포함하는 당단백질의 제조 방법

첫번째 단계는 GlcNAc 트랜스퍼라제 I의 작용에 의해 생체 내에서 GlcNAc를 받아들일 수 있는, Man₅GlcNAc₂의 특이성 전구체 구조물을 생성할 수 있는 하등 진핵생물의 선택 또는 형성과 관련되어 있다. 이 단계는 Man₅GlcNAc₂의 특정 이성체 구조의 형성을 필요로 한다. 이 구조는 높은 수율(30% 상회)로 세포 내에서 형성되어야 하는데, 그 이유는 모든 후속 조작은 상기 전구체의 존재를 조건으로 하기 때문이다. 그러나, Man₅GlcNAc₂구조물은 복합 N-글리칸 형성을 위해 필요하며, 이들의 존재는 결코 충분하지 않은데, 그 이유는 Man₅GlcNAc₂는 GlcNAc 트랜스퍼라제 I을 위한 기질로서 기능하거나 기능하지 않을 수 있는 상이한 이성체로 발생할 수 있기 때문이다. 대부분의 글리코실화 반응은 불완전하며, 따라서 특정 단백질은 일반적으로 그의 표면 상에 일정 범위의 상이한 탄수화물 구조(즉, 당형태)를 함유한다. 단지 미량(5% 미만)의 Man₅GlcNAc₂와 같은 특정 구조의 존재는 실용적인 관련성이 거의 없다. 필요한 것은 고수율(30% 이상)로 특이적인 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 수용 중간체(구조 I)를 형성시키는 것이다. 이러한 중간체의 형성이 필요하며, 이는 후속적으로 복합 N-글리칸의 생체내 합성을 가능하게 한다.

자연발생하거나, 또는 유전자 조작된 균류로부터 이러한 하등 진핵생물을 선택하거나, 생체 내에서 상기 구조를 제공하는 다른 하등 진핵생물을 선택할 수 있다. 전체 N-글리칸의 1.8%를 상회하여 이러한 구조를 제공하는 것으로 확인된 하등 진핵생물은 없으며(Maras 등, 1997), 따라서 유전적으로 조작된 유기체가 바람직하다. 미국 특허 제5,595,900호에 기술된 것과 같은 방법을 이용하여 소정의 표적 유유기체 내에서 특정 글리코실트랜스퍼라제, 만노시다제 및 당 뉴클레오티드 트랜스포터의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.

1,2-α-만노시다제와 같은 균류 글리코실화 효소의 불활성화

본원에 기술된 방법을 이용하여 넓은 범위의 하등 진핵생물(예를 들어, 한세눌라 폴리모르파, 피치아 스팁티스, 피치아 메탄올리카, 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 캔디다 알비칸스, 아스퍼길러스 니둘란스, 트리코더마 리세이 등)의 글리코실화 패턴을 조작할 수 있다. 피치아 파스토리스를 사용하여 필요한 조작 단계를 예시한다. 다른 하등 진핵생물과 유사하게, 피. 파스토리스는 ER 내에 1,2-α-만노시다제와 함께 Man₉GlcNAc₂를 보유하여 Man₈GlcNAc₂를 생성한다. 몇몇 만노실트랜스퍼라제의 작용을 통해, 이 구조는 만난으로 공지된 과만노실화된 구조(Man_>9GlcNAc₂)로 전환된다. 또한, 피. 파스토리스는 만노실포스페이트 트랜스퍼라제의 작용을 통해 카르보히드레이트 구조에 비말단 포스페이트기를 첨가할 수 있다. 이는 포유동물에서 확인된 반응에 대응되는 것이며, 그들의 첨가에 대응하여 만노즈 당의 제거와 관련되어 있다. 특히 중요한 것은 기존의 Man₈GlcNAc₂구조를 과만노실화하는 균류의 능력을 제거하는 것이다. 이는 과만노실화하지 않는 균류를 선택하거나, 이러한 균류를 유전적으로 조작함으로써 획득할 수 있다.

이러한 과정과 관련된 유전자는 피. 파스토리스에서 동정되어 왔으며, 이들 유전자 내에 돌연변이를 생성시켜 "바람직하지않은" 당형태의 생성을 감소시킬 수 있다. 이러한 유전자는 다른 하등 진핵생물, 예를 들어 씨. 알비칸스, 피치아 안구스타 또는 에스. 세레비제 내에서 발견되는 기존의 만노실트랜스퍼라제(예를 들어, OCH1, MNN4, MNN6, MNN1)에 대한 상동성에 의해 확인하거나, 숙주 균주에 돌연변이를 유발시키고 감소된 만노실화를 가진 표현형에 대해 선택함으로써 확인할 수 있다. 상동성에 기초하여 공지된 만노실트랜스퍼라제 및 만노실포스페이트 트랜스퍼라제 중에서, 하나는 표 2에 나타낸 것과 같은 PCR 프라이머를 구성하거나, 표적 유기체의 DNA 라이브러리 내에서 상동체를 확인하기 위한 프로브로서 이러한 효소를 암호화하는 유전자 또는 유전자 단편을 이용할 수 있다. 또는, 관련된 유기체 내에서 특정 표현형을 보충할 수 있다. 예를 들어, 피. 파스토리스 내에서 1,6-만노실트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 얻기 위해, 다음 단계를 수행할 수 있다. 에스. 세레비제의 OCH1 돌연변이체는 온도 민감성이며, 높은 온도에서 늦게 성장한다. 따라서, 피. 파스토리스 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 이용하여 에스. 세레비제의 OCH1 돌연변이주를 보충함으로써 피. 파스토리스 내에 OCH1의 기능적인 상동체를 확인할 수 있다. 이러한 에스. 세레비제의 돌연변이주는 http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/에서 확인할 수 있고, http://www.resgen.com/products/YEASTD.php3에서 판매되고 있다. 피. 파스토리스 DNA 라이브러리를 이용하여 형질전환한 후, 높은 온도에서 정상적인 성장 표현형을 나타내는 돌연변이주는 피. 파스토리스의 OCH1 상동체를 보유할 것이다. 이러한 라이브러리는 적합한 제한 효소를 이용하여 피. 파스토리스의 염색체 DNA를 부분적으로 분해하고, 제한효소를 불활성화시킨 후, 상용하는 제한 효소로 분해된 적합한 벡터 내로 분해된 DNA를 연결함으로써 생성할 수 있다. 적합한 벡터는 pRS314, Trp1 마커를 함유하는 p블루스크립트에 기초한 저 사본(CEN6/ARS4) 플라스미드[참조: Sikorski, R. S. 및 Hieter, P. 1989, Genetics 122, pp 19-27] 또는 pFL44S, URA3 마커를 함유하는 변형된 pUC19에 기초한 고 사본(2μ) 플라스미드[참조: Nobbeaud, N. 등, 1991, Yeast 7, pp. 609-615]이다. 이러한 벡터는 학원 연구가들에 의해 통상적으로 사용되어 왔거나, 유사한 벡터는 인비트로겐(캘리포니아, 칼스배드), 파마시아(뉴저지 피스카타웨이), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(메사추세츠 비버리)와 같은 다수의 다른 제조사에서 시판되고 있다. 그 예로는 인비트로겐에서 시판되는 효모 발현 플라스미드에 기초한 복제 2μ원점인 pYES/GS 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 시판되는 Yep24 클로닝 비히클을 들 수 있다. 염색체 DNA 및 벡터의 결찰 후, 상기 벡터는 상기 DNA 라이브러리를 특정 돌연변이를 가진 에스. 세레비제 균주내로 형질전환하고 상응하는 표현형의 정정에 대해 선택할 수 있다. 야생 표현형을 회복할 수 있는 DNA 단편의 서브클로닝 및 서열결정후, 이 단편을 이용하여 피. 파스토리스내의 OCH1에 의해 암호화되는 유전자 생성물의 할성을 제거할 수 있다.

또는, 관심있는 특정 균류의 전체 게놈 서열을 알고 있는 경우, 공중의 이용이 가능한 DNA 데이타베이스를 서치하여 간단히 이러한 유전자를 확인할 수 있다. 이러한 데이타베이스는 NCBI, 스위스포트 등과 같은 몇몇 소스를 이용할 수 있다. 예를 들어, 에스. 세레비제로부터 유래한 공지된 1,6-만노실트랜스퍼라제 유전자(OCH1)를 이용하여 소정의 게놈 서열 또는 데이타베이스를 조사하여, 1,6-만노실트랜스퍼라제 활성을 보유하는 유전자를 높은 확실성으로 암호화하는, 이러한 게놈 내에서 상동성이 높은 유전자를 확인할 수 있다. 이들 유전자는 에스. 세레비제내의 단백질의 만노실화에 관련된 유전자와 유사한 기능을 보유하며, 따라서 그들의 결손은 피. 파스토리스 또는 유사한 글리코실화 경로를 가진 다른 균류 내에서 글리코실화 패턴을 조작하는데 사용할 수 있다.

일단 소정의 표적 유전자 서열이 결정되면, 유전자 녹-아웃의 생성은 효모 및 균류 분자 생물학 분야에서는 잘 확립된 기법이며, 당업자에 의해 수행될 수 있다[참조: R. Rothsteins (1991) Methods in Enzymology, vol. 194, p. 281]. 실제로, 숙주 유기체의 선택은 이러한 숙주에 대한 양호한 형질전환 및 유전자 분열 기법의 이용가능성에 의해 영향받을 수 있다. 몇몇 만노실트랜스퍼라제가 녹아웃되어야 한다면, Alani 및 Klechner에 의해 개발된 방법은 바람직하지 않은 모든 내인성 만노실트랜스퍼라제 활성을 정해진 순서로 제거하는 URA3 마커의 반복 이용을 가능하게 한다. 이 기법은 다른 연구자들에 의해 더욱 개발되었으나, 대응하는 선택가능한 마커에 인접하는 2개의 반복하는 DNA 서열의 이용과 관련되어 있다. 예를들어, URA3은 구성물을 통합하는 형질전환체의 선택을 보장하는 마커로서 사용될 수 있다. 직접적인 반복부와 URA3 마커가 인접하게 함으로써, 구성물을 통합하여 표적 유전자를 분열시키는 형질전환체를 일차로 선택할 수 있다. 형질전환체의 분리 및 그들의 특정화후, 제2 라운드에서 5'FOA에 대해 저항성인 것에 대해 대응 선택할 수 있다. 5'FOA를 함유하는 평판 상에서 생존할 수 있는 콜로니는 상기한 반복부를 포함하는 교차 이벤트를 통해 다시 URA3 마커를 상실시킨다. 따라서, 이 방법은 동일한 마커의 반복된 이용을 가능하게 하며, 추가의 마커를 필요로하지 않고 다수의 유전자의 분열을 용이하게 수행할 수 있다.

피. 파스토리스 내에서 특정 만노실트랜스퍼라제, 예를 들어 1,6-만노실트랜스퍼라제(OCH1), 만노실포스페이트 트랜스퍼라제(MNN4, MNN6 또는lbd돌연변이체를 보충하는 유전자)의 제거는 일차적으로 Man₈GlcNAc₂를 합성하는 상기 유기체의조작된 균주의 생성을 가능하게 하며, 따라서 글리코실화 패턴을 추가로 변형하여 더 복잡한 인간 당형태 구조를 더 가깝게 모방하는 것을 가능하게 한다. 상기 방법의 바람직한 구체예는 피. 파스토리스 내에서 유사하거나 동일한 생화학적 기능을 제거하는 공지된 생화학적 글리코실화 활성을 암호화하는 DNA 서열을 이용하여 생성된 유전적으로 변경된 피. 파스토리스의 글리코실화 구조를 변경하는 것이다.

PCR 프라이머 A	PCR 프라이머 B	피. 파스토리스내표적 유전자(들)	상동체
ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT	TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC	1,6-만노실트랜스퍼라제	OCH1에스. 세레비제피치아 알비칸스
TAYTGGMGNGTNGARCYNGAYATHAA	GCRTCNCCCCANCKYTCRTA	1,2-만노실트랜스퍼라제	KTR/KRE 과에스. 세레비제
주: M = A 또는 C, R = A 또는 G, W = A 또는 T, S = C 또는 G, Y = C 또는 T, K = G 또는 T, V = A 또는 C 또는 G, H = A 또는 C 또는 T, D = A 또는 G 또는 T, B = C 또는 G 또는 T, N = G 또는 A 또는 T 또는 C.

유전자 조작된 숙주내로 만노시다제의 투입

본원에 기술한 프로세스를 통해 변경할 목적으로 높은 수율로 이러한 구조물을 생성하고, 복합 N-글리칸을 산출한다. 적합한 Man₈GlcNAc₂를 얻기 위한 성공적인 스켐은 두가지의 병행 기법을 포함하여야 한다: (1) 내인성 만노실트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 방법 및 (2) 만노시다제에 의해 1,2-α-만노즈를 제거하여 높은 레벨로 적합한 Man₈GlcNAc₂구조를 산출하는 방법. 이 방법이 종래 기술과 구별되는 점은 상기 적시한 두가지 사항을 직접적으로 처리한다는 것이다. Chiba 및 그 동역자들이 밝혀낸 바와 같이, ER내로 에이. 사이토이로부터 유래한 균류 만노시다제의존재 하에서 조작에 의해 에스. 세레비제내에서 Man₈GlcNAc₂구조를 Man₅GlcNAc₂이성체로 감소시킬 수 있다. 상기 방법은 단점을 갖고 있는데, 이는 (1) 불충분한 양의 Man₅GlcNAc₂이 외세포성 당단백질 분획(10%)내에서 형성된다는 것과; (2) 생체 내에서 형성된 Man₅GlcNAc₂구조가 실제로 GlcNAc 트랜스퍼라제 I의 작용에 의해 GlcNAc를 수용할 수 있을지 명확하지 않다는 것이다. 몇몇 글리코실화 부위가 목적 단백질 내에 존재하는 경우, 올바른 형태로 이러한 단백질을 얻을 확률(P)은 P = (F)ⁿ(이때, n은 글리코실화 부위의 수이고, F는 목적하는 당형태의 분획임)이라는 관계식에 따른다. 글리코실화 부위가 3개인 당단백질은 그의 모든 글리코실화 부위에서 복합 및 하이브리드 N-글리칸 프로세싱에 대한 적절한 전구체를 제공할 가능성이 0.1% 인데, 이러한 점이 상기 방법의 상업적 가치를 제한하고 있다.

에스. 세레비제의 ER 및 골지 장치에서 활성이 있는 대부분의 효소는 최적 pH로 6.5 내지 7.5 범위의 값을 갖는다(표 3 참조). 재조합 만노시다제의 작용에 의해 만노실화를 감소시키는 이전의 모든 방법들은, 이들 효소의 활성이 pH 7.0에서 10% 미만으로 감소되어 피. 파스토리스 및 에스. 세레비제의 그들의 사용 지점, ER 및 초기 골지에서 불충분한 활성을 제공할 것임에도 불구하고, pH 5.0 주위의 최적 pH를 갖는 효소에 집중된다(참조: Martinet 등, 1998 및 Chiba 등, 1998). 바람직한 프로세스는 만노시다제의 최적 pH가 동일한 기관(들)내에 국부화된 기타 대표적인 마커 효소의 평균 최적 pH의 1.4 pH 단위 내인 생체 내에서 α-만노시다제를 이용한다. 특정 기관으로 표적화되는 효소의 최적 pH는 동일한 기관 내에서 확인되는 다른 효소의 최적 pH에 상응하여야 하는데, 이때 단위 효소당 최대 활성이 얻어진다. 표 3에는 여러가지 소스의 만노시다제의 활성 및 그들 각각의 최적 pH를 요약하였다. 표 4에는 이들의 위치가 요약되어 있다.

만노시다제와 이들의 최적 pH

소스	효소	최적 pH	참조
아스퍼길러스 사이토이	1,2-α-만노시다제	5.0	Ichishima 등, 1999, Biochem. J. 339(Pt3): 589-597
트리코더마 리세이	1,2-α-만노시다제	5.0	Maras 등, 2000 J. Biotechnol. 77(2-3): 255-263
페니실륨 시트리넘	1,2-α-D-만노시다제	5.0	Yoshida 등, 1993 Biochem. J. 290(Pt2): 349-354
아스퍼길러스 니둘란스	1,2-α-만노시다제	6.0	Eades 및 Hintz, 2000
호모 사피엔스IA(골지)	1,2-α-만노시다제	6.0
호모 사피엔스IB(골지)	1,2-α-만노시다제	6.0
레피도프테라 곤충세포	I형 1,2-α-Man₆-만노시다제	6.0	Ren 등, 1995 Biochem. 34(8): 2489-2495
호모 사피엔스	α-D-만노시다제	6.0	Chandrasekaran 등, 1984 Cancer Res. 44(9): 4059-68
잔토모나스 마니호티스	1,2,3-α-만노시다제	6.0
마우스 IB(골지)	1,2-α-만노시다제	6.5	Schneikert 및 Herscovics, 1994 Glycobiology. 4(4): 445-50
바실러스 속(분비됨)	1,2-α-D-만노시다제	7.0	Maruyama 등, 1994 Carbohydrate Res. 251: 89-98

에스. 세레비제의 ER 또는 골지 장치 내에서 Man₅GlcNAc₂를 산출하기 위해, 고 만노즈 구조를 절단하려고 시도하는 경우, (1) 최적 pH에 충분히 근접한 pH(즉,pH 5.2 내지 pH 7.8)를 보유하고, (2) 단독으로 또는 협력하여 GnT I에 의해 GlcNAc의 후속 첨가를 수용하기 위해 필요한 특정 이성체성 Man₅GlcNAc₂를 생성하는 것으로 알려진 임의의 효소 또는 이들 효소의 조합을 선택할 수 있다. 시험관 내에서 GnT I에 의해 GlcNAcMan₅GlcNAc₂로 전환될 수 있는 구조를 형성하는 것으로 밝혀진 임의의 효소 또는 이들 효소의 조합은 적절한 선택을 구성한다. 이러한 지식은 과학 문헌 또는 잠재적인 만노시다제가 Man₈GlcNAc₂-PA를 Man₈GlcNAc₂-PA로 전환시킬 수 있는지를 결정하고, 이어서 얻어진 Man₅GlcNAc₂-PA가 GnT I 및 UDP-GlcNAc를 위한 기질로 작용하여 시험관 내에서 GlcNAcMan₅GlcNAc₂를 생성할 수 있는지를 테스트함으로써 실험적으로 알 수 있다.

ER 및 골지 내에서 1,2-만노시다제 활성

클로닝된 외인성 만노시다제의 작용에 의해 만노실화를 감소시키는 이전의 방법은 Man₅GlcNAc₂구조를 보유하는 N-글리칸의 충분한 분획(예를 들어, >27 몰%)을 보유한 당단백질을 산출하지 못했다(Martinet 등, 1998 및 Chiba 등, 1998). 이들 효소는 ER 또는 골지 장치 내에서 충분히 기능하여 신생 당단백질을 전환시키는데 효과적이어야 한다. 종래에 이용된 2개의 만노시다제(에이. 사이토이 및 티. 리세이)의 최적 pH는 5.0인 반면, 효소(예를 들어, 에스. 세레비제)의 ER 및 골지 장치 내에서 활성인 대부분의 효소는 최적 pH가 6.5 내지 7.5이다(참조 표 3). 단백질의 글리코실화는 매우 진화되었으며, 효과적인 프로세싱은 약 6 내지 8 범위내인ER과 골지 내의 내부 pH에서 수행할 수 있게 되었다. pH 7.0에서, 이전에 사용된 만노시다제의 활성은 10% 미만으로 감소되는데, 이는 생체 내에서 Man₅GlcNAc₂의 효율적인 생성을 위해서는 불충분한 것이다.

에스. 세레비제의 여러가지 글리코실화 관련 효소의 세포 위치 및 최적 pH

유전자	활성	위치	최적 pH	저자(들)
Ktr1	α-1,2-만노실트랜스퍼라제	골지	7.0	Romero 등, 1997 Biochem. J. 321(Pt 2): 289-295
Mns1	α-1,2-만노시다제	ER	6.5
CWH41	글루코시다제 I	ER	6.8
-	만노실트랜스퍼라제	골지	7-8	Lehele 및 Tanner, 1974 Biochem. Biophys. Acta 350(1): 225-235
Kre2	α-1,2-만노실트랜스퍼라제	골지	6.5-9.0	Romero 등, 1997

α-1,2-만노시다제 효소는 pH 5.1 내지 8.0에서 최적 활성을 가져야만 한다. 바람직한 구체예에서, 상기 효소의 최적 활성은 pH 5.9 내지 7.5에서 나타난다. 최적 pH는 시험관내 분석 조건 하에서 결정할 수 있다. 바람직한 만노시다제는 표 3에 나타낸 것들로 적절한 최적 pH를 보유하는 것들인데, 이의 예로는 아스퍼길러스 니둘란스, 호모 사피엔스 IA(골지), 호모 사피엔스 IB(골지), 레피도프테란(Lepidopteran) 곤충 세포(IPLB-SF21AE), 호모 사피엔스, 마우스 IB(골지), 및 잔토모나스 만니호티스(Xanthomonas manihotis)를 들 수 있다. 바람직한 구체예에서, 단일 클로닝된 만노시다제 유전자는 숙주 유기체 내에서 발현된다. 그러나, 몇몇 경우에서, 몇몇 상이한 만노시다제 유전자를 발현하거나, 특정 유전자의 몇몇 카피를 발현하여 Man₅GlcNAc₂의 적절한 생성을 획득하는 것이 바람직하다. 다중 유전자가 사용되는 경우, 암호화된 만노시다제는 모두 최적 pH 범위로 5.1 내지 8.0 또는 구체적으로 5.9 내지 7.5를 가져야 한다. 특히 바람직한 구체예에서, 만노시다제 활성은 ER 또는 시스 골지로 표적화되는데, 여기서 초기 글리코실화 반응이 일어난다.

복합 N-글리칸의 형성

상기 프로세스의 두번째 단계는 골지 장치 내로의 글루코실트랜스퍼라제의 발현을 조작함으로써 신생 탄수화물 구조에 정해진 순서로 당을 첨가하는 것과 관련되어 있다. 이 프로세스는 먼저 초기 또는 중간 골지 장치 내에서 GnT I의 기능적인 발현을 필요로 할 뿐만 아니라 UDP-GlcNAc의 충분한 공급을 보장할 필요가 있다.

통합 위치

이러한 유전자 조작 노력의 궁극적인 목표는 산업 발효 과정에 양호하게 수행할 수 있는 강력한 단백질 생성 균주이기 때문에, 균류 염색체 내로 다수의 유전자의 통합은 사려깊은 계획과 관련되어 있다. 조작된 균주는 일정 범위의 상이한 유전자로 형질전환되어만 할 것으로 생각되며, 이들 유전자는 안정한 방식으로 형질전환되어 목적하는 활성이 발효 과정 전체를 통해 유지될 수 있도록 하여야 한다. 후술하는 효소 활성의 임의 조합은 균류 단백질 발현 숙주내로 조작되어야 할 것이다: 시알릴트랜스퍼라제, 만노시다제, 푸코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, GlcNAc 트랜스퍼라제, ER 및 골지 특이성트랜스포터(예를 들어, UDP-갈락토즈 및 기타 전구체에 대한 sym 및 antiport 트랜스포터), 올리고사카라이드의 프로세싱과 관련된 기타 효소, 및 UDP-갈락토즈, CMP-N-아세틸뉴라민산과 같은 활성화된 올리고사카라이드 전구체의 합성과 관련된 효소. 동시에, 비인간 글리코실화 반응의 특징으로 공지된 효소를 암호화하는 다수의 유전자를 결실시켜야만 할 것이다.

특정 기관으로의 글리코실트랜스퍼라제의 표적화

글리코실트랜스퍼라제와 만노시다제는 ER 및 골지 장치의 내부(내강) 표면을 라이닝함으로써 ER 및 골지 네트웍을 통해 당단백질이 통과하는 경우 당단백질의 정해진 순서에 따른 프로세싱을 가능하게 하는 "촉매" 표면을 제공한다. 시스, 중간 및 트랜스 골지와 트랜스 골지 네트웍(TGN)의 다수의 구획은 순서가 정해진 글리코실화 반응이 일어날 수 있는 상이한 위치를 제공한다. 당단백질이 ER 내에서 합성으로부터 후기 골지 또는 TGN 내에서의 완전한 성숙으로 진행됨에 따라, 이는 상이한 글리코시다제, 만노시다제 및 글리코실트랜스퍼라제에 정해진 순서에 따라 노출되어 특정 탄수화물 구조가 합성될 수 있다. 이들 효소가 유지되고 그들 각각의 기관내에 고정되는 정확한 기작을 밝혀내기 위해 많은 노력이 있어 왔다. 진화적 설명은 복잡하나, 스템 영역, 막 걸침 영역 및 세포질 꼬리가 각각 또는 협력하여 효소를 개개 기관의 막에 유도함으로써 적소에 관련 촉매 도메인을 국부화시키는 증거를 제시한다.

서열을 표적화시키는 것은 널리 알려져 있으며, 서열의 표적화 및 표적화된 효소의 선택을 위하 라이브러리 부분에서 상세히 설명한 바와 같이, 여러가지 과학문헌 및 공중 데이타베이스에 기술되어 있다.

변형된 글리코실화 경로를 생성하는 라이브러리의 생성 방법

외인성 글리코실화 단백질을 암호화하는 2개 이상의 유전자를 포함하는 라이브러리는 숙주 유기체 내로 형질전환하여 유전적으로 혼합된 군집을 생성한다. 이어서, 목적하는 글리코실화 표현형을 보유하는 형질전환체는 상기 혼합 군집으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 숙주 유기체는 효모, 구체적으로 피. 파스토리스이며, 숙주 글리코실화 경로는 하나 이상의 인간 또는 동물 글리코실화 효소의 작동성 발현에 의해 변형되어 인간 당형태와 유사하거나 동일한 단백질 N-글리칸을 생성한다. 특히 바람직한 구체예에서, DNA 라이브러리는 글리코실화 효소와 구체적으로 ER, 시스 골지, 중간 골지, 또는 트랜스 골지내 글리코실화와 관련된 여러가지 세포 위치에 대한 표적화 서열과의 융합물을 암호화하는 유전 구성물을 포함한다.

상기 방법을 이용하여 수행할 수 있는 글리코실화에 대한 변형의 예로는 (1) 만노즈 잔기를 절단하여 Man₈GlcNAc₂로부터 단백질 N-글리칸으로서 Man₅GlcNAc₂를 생성하기 위한 진핵 미생물의 조작; (2) GlcNAc 트랜스퍼라제 I의 작용에 의해 Man₅GlcNAc₂에 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 첨가하기 위한 진핵 미생물의 조작; (3) N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제(GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), 만노시다제 II, 푸코실트랜스퍼라제, 갈락토실 트랜스퍼라제(GalT) 또는 시알릴트랜스퍼라제(ST)와 같은 효소를 기능적으로 발현시키기 위한 진핵 미생물의 조작을 들 수 있다.

상기 방법을 반복함으로써, 복잡성이 증가하는 더욱 복잡한 글리코실화 경로를 표적 미생물 내에 조작할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 숙주 유기체는 글리코실화 활성을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 라이브러리를 이용하여 2배 이상 형질전환된다. 목적하는 표현형의 선택은 1 라운드의 형질전환후, 또는 수 라운드의 형질전환이 발생한 후에 수행할 수 있다. 복잡한 글리코실화 경로는 이러한 방식으로 신속하게 조작할 수 있다.

DNA 라이브러리

글리코실화 효소를 암호화하는 2개 이상의 외인성 유전자를 포함하는 DNA 라이브러리를 구성하는 것이 필요하다. 오픈 리딩 프레임 서열 이외에, 일반적으로 프로모터, 전사 종결자, 인핸서, 리보좀 결합 위치, 및 기타 기능적 서열을 보유하는 각각의 라이브러리 구성물을 제공하여 숙주 유기체내로 형질전환시 유전자의 효과적인 전사 및 번역을 보장하는 것이 바람직하다. 상기 숙주가 피치아 파스토리스인 경우, 적합한 프로모터로는 예를 들어,AOX1,AOX2,DAS및P40프로모터를 들 수 있다. 또한, 1종 이상의 선택가능한 마커, 예를 들어 약제 내성을 부여하는 유전자 또는 숙주 대사 장애를 보충하는 유전자를 보유하는 각각의 구성물을 제공하는 것이 바람직하다. 상기 마커의 존재는 후속적으로 수행되는 형질전환체의 선택에 유용하다: 예를 들어, 효소에서URA3,HIS4,SUC2,G418,BLA또는SH BLE유전자를 사용할 수 있다.

몇몇 경우에, 상기 라이브러리는 기존의 유전자 또는 야생형 유전자로부터직접 구성할 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에서, DNA 라이브러리는 2개 이상의 서브 라이브러리의 융합으로부터 구성된다. 서브 라이브러리의 프레임내 결찰에 의해, 유용한 표적화된 글리코실화 활성을 암호화하는 다수의 신규한 유전자 구성물을 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 임의의 유용한 서브 라이브러리는 시알릴트랜스퍼라제, 만노시다제, 푸코실트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제 및 GlcNAc 트랜스퍼라제와 같은 효소의 임의의 조합을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 상기 효소들은, 기타 포유동물, 동물 또는 균류 효소도 유용함에도 불구하고, 인간에서 유래한 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 유전자는 절단되어 상기 효소들의 촉매 도메인을 암호화하는 단편을 생성한다. 내인성 표적화 서열을 제거함으로써, 상기 효소들은 다른 세포 위치내로 재유도되고, 발현된다. 이러한 촉매 도메인의 선택은 상기 촉매 도메인이 후속적으로 활성을 갖게되는 특정 환경에 대한 지식을 기초로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 글리코실화 효소가 후기 골지 내에서 활성이 있는 경우, 후기 골지 내의 숙주 유기체의 모든 공지된 효소는 임의의 최적 pH를 보유하며, 이어서 촉매 도메인은 그 pH에서 적절한 활성을 나타내는 것이 선택된다.

다른 유용한 서브 라이브러리는 ER, 골지 또는 트랜스 골지 네트웍 내에서 특정 위치로 단백질을 국부화하는 신호 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 이들 신호 서열은 숙주 유기체 뿐만 아니라 기타 관련된 또는 관련되지 않은 유기체로부터 선택된다. ER 또는 골지의 막 결합 단백질은 전형적으로 예를들어, 세포질 꼬리(ct), 경막 도메인(tmd), 및 스템 영역(sr)을 암호화하는 N-말단 서열을 포함한다. 상기 ct, tmd, 및 sr 서열은 개별적으로 충분하거나 연합하여 단백질을 기관의 내부(내강) 막에 고정시킨다. 따라서, 신호 서열의 서브 라이브러리의 바람직한 구체예는 이들 단백질로부터 유래한 ct, tmd 및/또는 sr 서열을 포함한다. 몇몇 경우에서, 길이가 가변하는 sr 서열을 보유하는 서브 라이브러리를 제공하는 것이 바람직하다. 이는 세포질 영역을 암호화하는 DNA의 5' 단부에 결합하는 프라이머를 이용하고, 스템 영역의 여러가지 부분에 결합하는 일련의 대향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행될 수 있다. 신호 서열의 여전히 다른 유용한 소스로는 검색 신호 펩티드, 예를 들어 테트라펩티드 HDEL 또는 KDEL을 포함하는데, 이들은 전형적으로 ER 또는 골지내로 역수송되는 단백질의 C-말단에서 확인된다. 신호 서열의 여전히 다른 소스로는 (a) II형 막 단백질, (b) 표 3에 적시한 효소, (c) 골지 내에 국부화되는 막 걸침 뉴클레오티드 당 트랜스포터 및 (d) 표 5에 적시한 서열을 포함한다.

유용한 구획 표적 서열의 소스

유전자 또는서열	유기체	기능	유전자 생성물의 위치
MnsI	에스. 세레비제	α-1,2-만노시다제	ER
OCH1	에스. 세레비제	1,6-만노실트랜스퍼라제	골지(시스)
MNN2	에스. 세레비제	1,2-만노실트랜스퍼라제	골지(메디알)
MNN1	에스. 세레비제	1,3-만노실트랜스퍼라제	골지(트랜스)
OCH1	피. 파스토리스	1,6-만노실트랜스퍼라제	골지(시스)
2,6 ST	에이치. 사피엔스	2,6-시알릴트랜스퍼라제	트랜스 골지 네트웍
UDT-Gal T	에스. 폼브	UDP-Gal 트랜스포터	골지
Mnt1	에스. 세레비제	1,2-만노실트랜스퍼라제	골지(시스)
C-말단에서 HDEL	에스. 세레비제	검색 신호	ER

임의의 경우에서, 신호 서열은 숙주 내로 조작되는 효소 활성 또는 활성들에 적합한 신호 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 신생 N-글리칸의 말단 시알화가 가능한 변형된 미생물의 개발에서, 후기 골지 단백질로부터 유도된 신호 서열의 서브 라이브러리를 이용하는 것이 바람직하다. 유사하게, Man₅GlcNAc₂를 생성하기 위한 α-1,2-만노시다제에 의한 Man₈GlcNAc₂의 절단은 인간에서 일어나는 복합 N-글리칸 형성의 초기 단계이다. 따라서, 상기 반응은 조작된 숙주 미생물의 ER 또는 초기 골지 내에서 일어나는 것이 바람직하다. ER 및 초기 골지 체류 신호를 암호화하는 서브 라이브러리가 사용된다.

바람직한 구체예에서, DNA 라이브러리는 신호 서열을 암호화하는 DNA를 포함하는 서브 라이브러리와 글리코실화 효소 또는 이의 촉매적으로 활성인 단편을 암호화하는 DNA를 포함하는 서브 라이브러리를 프레임내 결찰함으로써 구성한다. 생성되는 라이브러리는 융합 단백질을 암호화하는 합성 유전자를 포함한다. 몇몇 경우, 융합 단백질의 N-말단에 또는 다른 경우 C-말단에 신호 서열을 제공하는 것이 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 신호 서열은 효소의 오픈 리딩 프레임 내에 삽입될 수 있는데, 단 개개의 폴딩된 도메인의 단백질 구조는 붕괴되지 않아야 한다.

상기 방법은, 숙주 내로 형질전환된 DNA 라이브러리가 매우 다양한 서열을 함유함으로써 하나 이상의 형질전환체가 목적하는 표현형을 나타낼 확률을 증가시키는 경우, 가장 효과적이다. 따라서, 형질전환 이전에, DNA 라이브러리 또는 구성적 서브 라이브러리는 1회 이상의 유전자 셔플링, 에러 프론 PCR 또는 시험관내 돌연변이유발 라운드를 수행할 수 있다.

형질전환

이어서, DNA 라이브러리는 숙주 유기체 내로 형질전환된다. 효모에서, 임의의 유용한 DNA 전달 방법, 예를 들어 전기적천공법, 염화리튬법, 또는 스페로플라스트법을 사용할 수 있다. 고밀도 발효를 위해 적합한 균주를 생성하기 위해서는, 숙주 염색체 내로 DNA 라이브러리를 통합시키는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 통합은 당업계에 공지된 기법을 이용하는 상동성 재조합에 의해 일어난다. 예를 들어, DNA 라이브러리 요소는 숙주 유기체의 서열에 상동성인 인접 서열을 보유한다. 이러한 방식에서, 통합은 숙주 유기체 내의 정해진 위치에 발생하는데, 이때 바람직한 유전자나 필수 유전자의 붕괴는 일어나지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서, 라이브러리 DNA는 숙주 유기체 내의 바람직하지 않은 위치 내로 통합되는데, 이는 유전자의 붕괴 또는 결실을 초래한다. 예를 들어, OCH1, MNN1 또는 MNN4 유전자의 위치 내로의 통합은 효모 내에서 당단백질의 과만노실화에 관련된 효모의 발현을 예방하면서 목적하는 라이브러리 DNA의 발현을 가능하게 한다. 다른 구체예에서, 라이브러리 DNA는 염색체, 플라스미드, 레트로바이러스 벡터, 또는 숙주 게놈 내로의 무작위 통합에 의해 투입될 수 있다. 임의의 경우에서, 각각의 라이브러리 DNA 구성물과 함께 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함하여 안정하게 형질전환되는 숙주 유기체의 준비된 선택을 가능하게 하는 것이 바람직하다. 마커 유전자를 위해 또는 마커 유전자에 대해 선택할 수 있는, 재활용할 수 있는 마커 유전자, 예를 들어ura3이 특히 적합하다.

선택 과정

DNA 라이브러리를 이용한 숙주 균주의 형질전환후, 목적하는 글리코실화 표현형을 나타내는 형질전환체를 선택한다. 선택은 단일 단계 또는 여러가지 분석 방법 또는 검출 방법중 임의의 방법을 이용하는 일련의 표현형 농축 및/또는 감손에 의해 수행할 수 있다. 표현형 특정화는 수동으로 또는 자동화 고처리량 스크리닝 장비를 이용하여 수행할 수 있다. 통상적으로, 숙주 미생물은 세포 표면 상에서 단백질 N-글리칸을 나타내는데, 여기서 여러 가지 당단백질이 국부화된다. 따라서, 손상되지 않은 완전한 세포는 목적 N-글리칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 또는 항체에 세포를 노출시킴으로써 목적하는 글리코실화 표현형에 대해 스크리닝할 수 있다. 여러가지 당양한 올리고사카라이드 특이성 렉틴은 시판되고 있다(캘리포니아샌 마테오이 EY 래보러토리즈). 또한, 특정 인간 또는 동물 N-글리칸에 대한 항체는 시판되거나 표준 기법으로 제조할 수 있다. 적합한 렉틴 또는 항체는 리포터 분자, 예를 들어 크로모포어, 프루오로포어, 방사성동위원소 또는 발색성 기질을 보유하는 효소에 접합할 수 있다[참조: Guillen 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892]. 이어서, 스크리닝은 분광광도법, 형광측정법, 형광 활성화된 세포 분류, 또는 섬광계수법과 같은 분석 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 다른 경우에서, 형질전환된 세포로부터 분리된 당단백질 또는 N-글리칸을 분석할 필요가 있을 수 있다. 단백질 분리는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 분리된 N-글리칸이 필요한 경우, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(메사추세츠 보스톤 겐자임 컴퍼니)와 같은 효소를 사용하여 당단백질로부터 N-글리칸을 절단할 수 있다. 이어서, 분리된 단백질 또는 N-글리칸은 액체 크로마토그래피(예를 들어, HPLC), 질량 분광광도법, 또는 기타 적합한 수단을 이용하여 분석할 수 있다. 미국 특허 제5,595,900호는 목적하는 외세포성 탄수화물 구조를 보유하는 세포를 동정하는 몇가지 방법을 교시하고 있다. 목적하는 형질전환체의 선택 이전에 바람직하지 않은 표현형을 보유하는 형질전환된 세포 군집을 제거하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 방법을 이용하여 세포 내로 기능적 만노시다제 활성을 조작하는 경우, 목적하는 형질전환체는 세포성 당단백질 내에 낮은 수준의 만노즈를 보유할 것이다. 배지내의 만노즈의 치사 방사성동위원소에 형질전환된 군집을 노출시키면 바람직하지 않은 표현형을 보유하는 형질전환체, 즉 혼입된 만노즈의 수준이 높은 형질전환체의 군집을 제거할 수 있다. 또는, 바람직하지않은 N-글리칸에 대해유도된 세포 독성 또는 항체를 이용하여 바람직하지 않은 표현형의 형질전환된 군집을 제거할 수 있다.

골지 장치에 당 뉴클레오티드 전구체를 제공하는 방법

골지 내에서 만족스럽게 기능하는 글리코실트랜스퍼라제에 있어서, 상기 효소는 신생 당단백질에 첨가된 당 부분의 고에너지 공여체인 적합한 뉴클레오티드 당을 충분한 농도로 보유하는 것이 필요하다. 적합한 구획에 대해 이들 뉴클레오티드 당은 숙주 유기체 내에서 당 뉴클레오티드 트랜스포터를 암호화하는 외인성 유전자를 발현함으로써 제공된다. 트랜스포터 효소의 선택은 사용되는 외인성 글리코실트랜스퍼라제의 특성에 영향을 받는다. 예를 들어, GlcNAc 트랜스퍼라제는 UDP-GlcNAc 트랜스포터를 필요로하며, 푸코실트랜스퍼라제는 GDP-푸코즈 트랜스포터를 필요로하며, 갈락토실트랜스퍼라제는 UDP-갈락토즈 트랜스포터를 필요로하거나, 시알릴트랜스퍼라제는 CMP-시알산 트랜스포터를 필요로할 수 있다.

첨가된 트랜스포터 단백질은 세포질로부터 골지 장치로 뉴클레오티드 당을 운반하며, 여기서 뉴클레오티드 당은 글리코실트랜스퍼라제와 반응하여 예를 들어 N-글리칸을 신장시킬 수 있다. 상기 반응은 뉴클레오시드 디포스페이트 또는 모노포스페이트, 예를 들어 UDP, GDP 또는 CMP를 유리시킨다. 뉴클레오시드 디포스페이트의 축적은 글리코실트랜스퍼라제의 추가 활성을 억제하기 때문에, 이는 종종 뉴클레오티드 디포스파타제를 암호화하는 유전자의 발현된 사본을 제공하는 것이 바람직하다. 상기 디포스파타제(적합하게 UDP 또는 GDP에 특이적임)는 디포스포뉴클레오시드를 가수분해하여 뉴클레오시드 모노모스페이트 및 무기 포스페이트를 산출한다. 뉴클레오시드 모노포스페이트는 글리코실트랜스퍼라제를 억제하지 않으며, 임의의 경우 내인성 세포 시스템에 의해 골지로부터 방출된다. 포유동물 기원의 적합한 트랜스포터 효소는 후술한다.

발명의 개요

세포주로 하여금 사람에서 당단백질의 프로세싱을 의태하는 정해진 순서의 효소 반응을 수행하게 하는 유전적으로 변형된 글리코실화 경로를 보유하는 세포를 개발하였다. 이들 유전자 조작된 숙주에서 발현된 재조합 단백질은 그들의 사람 당단백질과 더 유사한(실질적으로 동일하지 않다면) 당단백질을 생성한다. 보통 N-글리칸을 함유하는 고 만노즈를 생성하는 하등 진핵생물, 예를 들어 단세포 및 다세포 균류, 예를 들어 피치아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 피치아 스팁티스, 피치아 메탄올리카, 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 캔디다 알비칸스, 아스퍼길러스 니둘란스 및 트리코더마 리세이는 변형되어 인간 글리코실화 경로를 따라 Man₅GlcNAc₂와 같은 N-글리칸 또는 기타 구조물을 생성한다. 이는 균류 당단백질에 특징적인 바람직하지 않은 복합 구조물을 생성하는 특정 효소를 발현하지 않는 균주, 활성이 요구되는 균류 내에 존재하는 조건 하에서 최적 활성을 보유하도록 선택된 외인성 효소를 발현하는 균주 또는 최적 활성이 획득되는 기관에 표적화되도록 선택된 외인성 효소를 발현하는 숙주 및 이의 조합의 선택 및/또는 조작을 병용하여 획득되는데, 이때 유전자 조작된 진핵생물은 "인간-유사" 당단백질을 생성하는 데 필요한 다수의 외인성 효소를 발현한다.

제1 구체예에서, 상기 미생물은 조작되어 최적 pH가 5.1 내지 8.0, 바람직하게는 5.9 내지 7.5인 외인성 α-1,2-만노시다제 효소를 발현한다. 다른 바람직한 구체예에서, 외인성 효소는 숙주 유기체의 소포체 또는 골지 장치에 표적화되는데,이는 N-글리칸, 예를 들어 Man₈GlcNAc₂를 절단하여 Man₅GlcNAc₂를 생성한다. 후자의 구조가 유용한데, 그 이유는 이것이 포유동물, 특히 인간에서 형성된 구조와 동일하며, 이것이 포유동물, 특히 인간에서 형성된 것와 유사한 또는 동일한 마무리된 N-글리칸을 생성하는 생체내 및/또는 시험관내에서의 추가 글리코실화 반응을 위한 기질이며; 이것이 동물에서 당단백질을 매우 면역원성으로 만드는 다른 미생물 및 효소의 생체 내에서 발생하는 과만노실화 반응을 위한 기질은 아니기 때문이다.

제2 구체예에서, 진핵 미생물의 글리코실화 반응은 (a) 외인성 글리코실화 효소를 암호화하는 2개 이상의 유전자를 포함하는 DNA 라이브러리를 구성하고; (b) 상기 라이브러리를 이용하여 미생물을 형질전환시켜 2개 이상의 별개의 외인성 글리코실화 효소를 발현하는 유전적으로 혼합된 군집을 생성하고; (c) 상기 군집으로부터 목적하는 글리코실화 표현형을 보유하는 미생물을 선택함으로써 변형된다. 바람직한 구체예에서, DNA 라이브러리는 각각 단백질 국부화 서열을 암호하하는 키메라 유전자 및 글리코실화에 대한 촉매 활성을 포함한다. 상기 방법으로 변형된 유기체는 포유동물, 특히 인간과 유사하거나 동일한 글리코실화 패턴을 보유하는 당단백질을 생성하는데 유용하다.

제3 구체예에서, 글리코실화 경로를 변형하여 당 뉴클레오티드 트랜스포터 효소를 발현한다. 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드 디포스파타제 효소도 발현된다. 트랜스포터 및 디포스파타제는 조작된 글리코실화 단계의 효율을 개선시키는데, 이러한 효율 개선은 적합한 구획 내에서 글리코실화 효소를 위한 적합한 기질을 제공하고, 경쟁적 생성물 억제를 감소시키며, 뉴클레오시드 디포스파타제의 제거를 촉진함으로써 이루어진다.

실시예 1: 인슐린을 생산하기 위한 α-1,2-만노시다제를 이용한 피. 파리스토리스의 조작

α-1,2-만노시다제는 Man₈GlcNAc₂를 절단하여 복합 N-글리칸 형성을 위해 필수적인 중간체인 Man₅GlcNAc₂를 생성하는데 필요하다. 피.파스토리스의 OCH1 돌연변이주는 조작하여aox프로모터의 조절 하에서 분비된 인간 인터페론-α를 발현시켰다. DNA 라이브러리는 인간 만노시다제 IB(α-1,2-만노시다제)의 촉매 도메인과 초기 골지 국부화 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 서브라이브러리를 프레임내 결찰시킴으로써 구성하였다. 이어서, DNA 라이브러리는 숙주 유기체 내로 형질전환하여 유전적으로 혼합된 군집을 형성하는데, 이때 개개의 형질전환체는 각각 인터페론-β뿐만 아니라 라이브러리로부터 합성 만노시다제 유전자를 발현한다. 개개의 형질전환체 콜로니를 배양하고, 인터페론의 군집은 메탈올을 첨가하여 유도하였다. 이들 조건 하에서, 분비된 단백질의 90% 이상은 인터페론-β를 포함하였다. 상청액은 C₁₈실리카 역상 크로마토그래피로 정제하여 염 및 저분자량 오염물을 제거하였다. 적절히 표적화된 활성 α-1,2-만노시다제를 발현하는 목적하는 형질전환체는 Man₅GlcNAc₂구조물의 N-글리칸을 포함하는 인터페론-β를 생성하는데, 이의 분자량은 모체 균주의 인터페론에 비해 감소하였다. 인터페론-β를 포함하는 정제된 상청액은 MALDI-TOF 질량 분광광도법으로 분석하고, 목적하는 형태의 인터페론-β를 발현하는 콜로니를 동정하였다.

실시예 2: GlcNAc 트랜스퍼라제 I을 발현하는 균주의 조작

GlcNAc 트랜스퍼라제 I 활성은 복합 N-글리칸의 성숙을 위해 필요하였다. Man₅GlcNAc₂는 단지 만노시다제 II에 의해 절단될 수 있으며, 이는 GlcNAc 트랜스퍼라제 I에 의해 말단 α-1,3 만노즈 잔기에 대한 GlcNAc의 첨가 이후에 이루어지는 인간 당형태의 형성에서 필요한 단계이다[참조: Schachter, 1991 Glycobiology 1(5): 453-461]. 따라서, 라이브러리는 적절히 표적화된 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 포함하도록 제조한다. 숙주 유기체는 균주, 예를 들어 효모인데, 과만노실화가 결핍되어 있어(예를 들어, OCH1 돌연변이체) 골지 및/또는 ER 내에서 기질 UDP-GlcNAc를 제공하고, 골지 및/또는 ER 내에서 Man₅GlcNAc₂구조의 N-글리칸을 제공한다. 상기 DNA 라이브러리를 이용하는 숙주의 형질전환후, 형질전환체는 세포 표면 상에서 최고 농도의 말단 GlcNAc를 보유하는 것을 스크리닝하거나, 또는 최고 함량의 말단 GlcNAc를 보유하는 단백질을 분비한다. 이러한 스크리닝은 시가적인 방법(예를 들어, 염색 기법), 특정 말단 GlcNAc 결합 항체, 또는 렉틴을 이용하여 수행하였다. 또는, 목적 형질전환체는 말단 만노즈 잔기에 특이적인 특정 렉틴의 결합을 감소시켰다.

실시예 3: 만노시다제 II를 이용하는 균주의 조작

다른 예에서, 미생물 내에서 인간 당형태를 생성하기 위해 만노시다제 II의 작용에 의해 GlcNAcMan₅GlcNAc₂구조물로부터 2개의 잔류하는 말단 만노즈를 제거하는 것이 바람직하다. 시스 및 중간 골지 국부화 신호를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 라이브러리는 프레임내에서 만노시다제 II 촉매 도메인을 암호화하는 라이브러리에 융합되는 것이 바람직하다. 숙주 유기체는 균주, 예를 들어 효모인데, 이들은 과만노실화가 결핍된 균주(예를 들어, OCH1 돌연변이체)이며, 골지 및/또는 ER 내에서 GlcNAcMan₅GlcNAc₂구조물을 보유하는 N-글리칸을 제공한다. 형질전환후, 목적하는 글리코실화 표현형을 보유하는 유기체를 선택하였다. 한 방법에서 시험관내 분석을 사용하였다. 목적 구조물 GlcNAcMan₃GlcNAc₂(GlcNAcMan₅GlcNAc₂가 바람직하지 않은 것은 아님)는 효소 GlcNAc 트랜스퍼라제 II의 기질이다. 따라서, 단일 콜로니는 상기 기질 UDP-GlcNAc가 존재하는 시험관 내에서 상기 효소를 이용하여 분석할 수 있다. UDP의 방출은 HPLC 또는 UDP에 대한 효소 분석에 의해 결정할 수 있다. 또는, 방사능 표지된 UDP-GlaNAc를 사용하였다.

전술한 시험관내 분석은 고처리량 스크리닝 장비를 이용하여 개개의 콜로니에 대해 용이하게 수행하였다. 또는, 렉틴 결합 분석법을 사용하였다. 이 경우, 말단 만노즈에 특이적인 렉틴의 감소된 결합은 목적하는 표현형을 보유하는 형질전환체의 선택을 가능하게 하였다. 예를 들어, 갈란터스 니발리스(Galantus nivalis) 렉틴은 말단 α-1,3-만노즈에 특이적으로 결합하는데, 그 농도는 작동가능하게 발현된 만노시다제 II 활성의 존재하에서 감소하였다. 한 적합한 방법에서, 고체 아가로즈 지지체에 부착된 지. 니발리스 렉틴을 사용하여 높은 레벨의 말단 α-1,3-만노즈를 보유하는 세포의 형질전환된 군집을 감손시켰다.

실시예 4: 시알릴트랜스퍼라제를 발현하는 유기체의 조작

효소 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 말단 시알산을 신생 인간 N-글리칸내의 갈락토즈 잔기에 첨가하여 성숙한 당단백질을 유도한다. 인간에서, 상기 반응은 트랜스 골지 또는 TGN에서 발생한다. 따라서, DNA 라이브러리는 시알릴트랜스퍼라제 촉매 도메인을 암호화하는 서열과 트랜스 골지 또는 TGN 국부화 신호를 암호화하는 서열의 프레임내 융합에 의해 구성된다. 숙주 유기체는 균주, 예를 들어 효모인데, 이들은 과만노실화가 결핀된 균주(예를 들어, OCH1 돌연변이체)이며, 트내스 골지 또는 TGN 내에서 말단 갈락토즈 잔기를 보유하는 N-글리칸을 제공하며, 트랜스 골지 또는 TGN 내에서 충분한 농도의 CMP-시알산을 제공한다. 형질전환에 이어, 목적하는 표현형을 보유하는 형질전환체는 말단 시알산을 보유하는 N-글리칸에 특이적인 형광 항체를 이용하여 선택한다.

실시예 5: UDP-GlcNAc 트랜스포터를 발현하는 균주의 조작 방법

인간 골지 UDP-GlaNAc 트랜스포터의 cDNA는 Ishida와 그 동역자들에 의해 클로닝되었다[참조: Ishida, N. 등, 1999, Biochem. 126(1): 68-77]. Guillen 및 그 동역자들은 골지 UDP-GlcNAc가 결핍된 클루이베로마이세스 락티스 돌연변이체의 표현형 정정에 의해 개 신장 골지 UDP-GlaNAc 트랜스포터를 클로닝하였다(Guillen, E. 등, 1998). 따라서, 포유동물 골지 UDP-GlcNAc 트랜스포터 유전자는 효모의 골지 장치에 기능적으로 발현되고 표적화될 단백질에 대한 모든 필요한 정보를 보유한다.

실시예 6: GDP-푸코즈 트랜스포터를 발현하는 균주의 조작 방법

래트 간 골지 막 GDP-푸코즈 트랜스포터는 Puglielli, L. 및 C. B. Hirschberg에 의해 동정되고 정제되었다[참조: Puglielli, L. 및 C. B. Hirschberg, 1999, J. Biol. Chem. 274(50): 35596-35600]. 상응하는 유전자는 표준 기법, 예를 들어, N-말단 서열 및 축퇴성 DNA 프로브를 이용하는 서던 블로팅을 이용하여 동정할 수 있다. 이어서, 손상되지 않은 유전자는 푸코실트랜스퍼라제를 발현하는 숙주 미생물 내에서 발현할 수 있다.

실시예 7: UDP-갈락토즈 트랜스포터를 발현하는 균주의 조작 방법

인간 UDP-갈락토즈(UDP-Gal) 트랜스포터는 동정되었으며, 에스. 세레비제 내에서 활성인 것으로 공지되어 있다[참조: Kainuma, M. 등, 1999 Glycibiology 9(2): 133-141]. 제2 인간 UDP-갈락토즈 트랜스포터(hUGT1)은 클로닝되었으며, 차이니즈 햄스터 난세포에서 기즐적으로 발현되었다[참조: Aoki, K. 등, 1999, J. BioChem. 126(5): 940-950]. 유사하게, Segawa 및 그 동역자들은 스키조사카로마이세스 폼브로부터 UDP-갈락토즈 트랜스포터를 클로닝하였다[참조: Segawa, H. 등, 1999, Febs Letters 451(3): 295-298].

CMP-시알산 트랜스포터

인간 CMP-시알산 트랜스포터(hCST)는 Aoki 및 그 동역자들에 의해 클로닝되었으며, Lec 8 CHO 세포 내에서 발현되었다(1999). 또한, 햄스터 CMP-시알산 트랜스포터의 분자 클로닝도 이루어졌다[참조: Eckhardt 및 Gerardy Schahn 1997 Eur.J. Biochem. 248(1): 187-192]. 쥐과동물 CMP-시알산 트랜스포터의 기증적 발현은 Berninsone에 의해 사카로마이세스 세레비제에서 이루어졌다[참조: Berninsone, P. 등, 1997 J. Biol. Chem. 272(19): 12616-12619]

진핵 미생물, 예를 들어 피치아 파스토리스 내에서 글리코실화를 변형시키는 방법의 바람직한 구체예

원하는 구조	적합한촉매 활성	국부화 서열의적합한 소스	적합한유전자 결실	적합한 트랜스포터및/또는포스파타제
Man₅GlcNAc₂	α-1,2-만노시다제(쥐과동물 , 인간, 바실러스 속, 에이. 니둘란스)	Mns1(N-말단,에스. 세레비제)Och1(N-말단,에스. 세레비제, 피. 파스토리스)Ktr1Mnn9Mnt1(에스. 세레비제)KDEL, HDEL(C-말단)	OCH1MNN4MNN6	없슴
GlcNAcMan₅GlcNAc₂	GlcNAc 트랜스퍼라제 I(인간 , 쥐과동물, 쥐 등)	Och1(N-말단,에스. 세레비제,피. 파스토리스)KTR1(N-말단)KDEL, HDEL(C-말단)Mnn1(N-말단,에스. 세레비제)Mnt1(N-말단,에스. 세레비제)GDPase(N-말단,에스. 세레비제)	OCH1MNN4MNN6	UDP-GlcNAc트랜스포터(인간,쥐과동물,케이. 락티스)UDPase(인간)
GlcNAcMan₃GlcNAc₂	만노시다제 II	Ktr1Mnn1(N-말단,에스-세레비제)Mnt1(N-말단,에스. 세레비제)Kre2/Mnt1(에스. 세레비제)Kre2(피. 파스토리스)Ktr1(에스. 세레비제)Ktr1(피. 파스토리스)Mnn1(에스. 세레비제)	OCH1MNN4MNN6	UDP-GlcNAc트랜스포터(인간,쥐과동물,케이. 락티스)UDPase(인간)

원하는 구조	적합한촉매 활성	국부화 서열의적합한 소스	적합한유전자 결실	적합한 트랜스포터및/또는포스파타제
GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂	GlcNAc 트랜스퍼라제 II, III, IV, V(인간,쥐과동물)	Mnn1(N-말단,에스. 세레비제)Mnt1(N-말단,에스. 세레비제)Kre2/Mnt1(에스. 세레비제)Kre2(피. 파스토리스)Ktr1(에스. 세레비제)Ktr1(피. 파스토리스)Mnn1(에스. 세레비제)	OCH1MNN4MNN6	UDP-GlcNAc트랜스포터(인간,쥐과동물,케이. 락티스)UDPase(인간)
Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)-Man₃GlcNAc₂	β-1,4-갈락토실 트랜스퍼라제(인간)	Mnn1(N-말단,에스. 세레비제)Mnt1(N-말단,에스. 세레비제)Kre2/Mnt1(에스. 세레비제)Kre2(피. 파스토리스)Ktr1(에스. 세레비제)Ktr1(피. 파스토리스)Mnn1(에스. 세레비제)	OCH1MNN4MNN6	UDP-갈락토즈트랜스포터(인간,에스. 폼브)
NANA_(1-4)-Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)-Man₃GlcNAc₂	α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(인간)α-2,3-시알릴트랜스퍼라제	KTR1Mnn1(N-말단,에스-세레비제)MNT1(N-말단,에스. 세레비제)Kre2/Mnt1(에스. 세레비제)Kre2(피. 파스토리스)Ktr1(에스. 세레비제)Ktr1(피. 파스토리스)MNN1(에스. 세레비제)	OCH1MNN4MNN6	CMP-시알산트랜스포터(인간)

[표 7]

DNA 및 단백질 서열 자료

1. European Bioinformatics Institute(EBI)는 bioinformatics내 연구 및 서비스 센터이다:http://www.ebi.ac.uk/

2. Swissprot 데이타베이스: http://www.expasy.ch/spr

3. 공지된 글리코실트랜스퍼라제 및 그들의 기원의 목록

β1,2///8GnT I)EC 2.4.1.101

4. 인간 cDNA, Kumar 등(1990) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 87:9948-9952

5. 인간 유전자, Hull 등(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:608-615

6. 마우스 cDNA, Kumar 등(1992) Glycobiology 2:383-393

7. 마우스 유전자, Pownall 등(1992) Genomics 12:699-704

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9. 래빗 cDNA, Sarkar 등(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:234-238

10. 래트 cDNA, Fukada 등(1994) Biosci.Biotechnol.Biochem. 58:200-201

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11. 인간 유전자, Tan 등(1995) Eur.J.Biochem. 231:317-328

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β1,4(GnT III) EC 2.4.1.144

14. cDNA, Ihara 등(1993) J.Biochem. 113:692-698

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β1,4(GnT IV) EC 2.4.1.145

17. 인간 cDNA, Yoshida 등(1998) Glycoconjugate Journal 15:1115-1123

18. 소 cDNA, Minowa 등., Eurpoean Patent EP 0 905 232

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20. 래트 cDNA, Shoreibah 등(1993) J. Biol. Chem. 268:15381-15385

β1,4 갈락토실트랜스퍼라제, EC 2.4.1.90(LacNAc 합성효소) EC

2.4.1.22(락토즈 합성효소)

21. 소 cDNA, D'Agostaro 등(1989) Eur.J.Biochem. 183:211-217

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2,6-시알릴트랜스퍼라제, (ST6Gal I) EC 2.4.99.1

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47. 마우스 cDNA, Hamamoto 등(1993) Bioorg.Med.Chem. 1:141-145

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49. 래트 cDNA(전사체 단편), Wang 등(1991). Glycobiology 1:25-31, Wang 등(1990) J.Biol.Chem. 265:17849-17853

50. 래트 cDNA(5' end), O'Hanlon 등(1989) J.Biol.Chem. 264:17389-17394; Wang 등(1991) Glycobiology 1:25-31

51. 래트 유전자(프로모터), Svensson 등(1990) J.Biol.Chem. 265:20863-20688

52. 래트 mRNA(단편), Wen 등(1992) J.Biol.Chem. 267:2512-2518

글리코실화를 변형하기 위한 방법에 사용할 수 있는 추가 방법 및 시약은 문헌, 예를 들어 미국 특허 제5,955,422호, 제4,775,622호, 제6,017,743호, 제4,925,796호, 제5,766,910호, 제5,834,251호, 제5,910,570호, 제5,849,904호, 5,955,347호, 제5,962,294호, 제5,135,854호, 제4,935,349호, 제5,707,828호 및 제5,047,335호에 기술되어 있다.

적합한 효소 발현 시스템은 미국 매릴랜드 록빌에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소와 같은 소스로부터 얻을 수 있다. 벡터는 여러 회사들에서 시판되고 있다.

Claims

하등 진핵생물 내에서 인간 세포에 의해 생성된 것과 유사한 탄수화물 구조를 보유하는 당단백질의 제조 방법으로서,

고 만노즈 구조의 생성에 연루된 1종 이상의 효소를 발현하지 않는 단세포 또는 다세포 균류 숙주를 제공하는 단계; 및

상기 숙주 내에 Man₅GlcNAc₂, Man₈GlcNAc₂및 Man₉GlcNAc₂로 구성되는 군으로부터 선택되는 탄수화물 구조의 생성을 위한 1종 이상의 효소를 도입하는 단계로서, 상기 효소는 상기 탄수화물 구조가 생성되는 숙주내 위치의 pH에서 최적 활성을 보유하거나 또는 탄수화물 구조를 생성하는 최적 활성을 보유할 숙주내 아세포성 위치에 표적화되는 것을 선택하는 것인 단계

를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주는 만노실트랜스퍼라제 및 포스포만노실트랜스퍼라제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 결핍된 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 숙주는 1,6-만노실트랜스퍼라제, 1,3-만노실트랜스퍼라제 및 1,2-만노실트랜스퍼라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소를 발현하지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코클라메(Pichia koclamae), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오푼티에(Pichia opuntiae), 피치아 테르모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살리크타리아(Pichia salictaria), 피치아 구에르컴(Pichia guercuum), 피치아 피페리(Pichia pijperi), 피치아 스팁티스(Pichia stiptis), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피치아속(Pichia sp.), 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스속(Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces sp.), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 및 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 숙주는 피. 파스토리스의 OCH1 돌연변이주인 방법.
제1항에 있어서, 숙주 내로 Man₈GlcNAc₂또는 Man₉GlcNAc₂로부터 Man₅GlcNAc₂의 생성에 연루된 1종 이상의 만노시다제를 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 1종 이상의 만노시다제의 최적 pH가 상기 만노시다제가 국부화되는 기관내의 다른 대표 효소의 평균 최적 pH의 1.4 pH 단위 이내이거나, pH 5.1 내지 8.0에서 최적 활성을 보유하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 만노시다제 효소는 pH 5.9 내지 7.5에서 최적 활성을 보유하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 만노시다제 효소는 마우스, 인간, 레피도프테라(Lepidoptera), 아스퍼길러스 니둘란스 또는 바실러스 속으로부터 유도된 α-1,2-만노시다제인 방법.
제1항에 있어서, GnT I 활성을 나타내며 UDP-Gn 트랜스포터 활성을 보유하는, Man₅GlcNAc₂구조를 형성할 수 있는 숙주를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, UDP 특이 디포스파타제 활성을 보유하는 숙주를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 숙주 내로 만노시다제, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 투입하는 단계로서, 이때 상기 효소는 소포체, 초기, 중기 및 후기 골지 또는 트랜스 골지 네트웍에 표적화되는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 만노시다제 효소는 골지 장치 또는 소포체 내에 현저하게 국부화되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 효소는 상기 효소의 촉매 도메인과 세포성 표적 신호 펩티드를 암호화하는 DNA 단편과, 글리코실화 효소 또는 이의 촉매적으로 활성인 단편을 암호화하는 DNA 단편의 프레임내 결찰에 의해 형성된 하나 이상의 유전자 구성물에 의해 암호화된 키메라 국부화 영역간에 융합 단백질을 형성함으로써 국부화되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 만노실트랜스퍼라제, 디포스포타제, 프로테아제, GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI, GalT, FT 및 ST로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소로부터 유래한 키메라 국부화 영역을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI, GalT, 푸코실트랜스퍼라제 및 ST로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 효소가 국부화되는 기관내의 다른 대표 효소의 평균 최적 pH의 1.4 pH 단위 이내의 최적 pH를 보유하거나, pH 5.1 내지 8.0에서 최적 활성을 보유하는 글리코시다제 또는 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 촉매 도메인을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 숙주 내로 UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제, UDP-갈락토실트랜스퍼라제, GDP-푸코실트랜스퍼라제, CMP-시알릴트랜스퍼라제, UDP-GlcNAc 트랜스포터, UDP-갈락토즈 트랜스포터, GDP-푸코즈 트랜스포터, CMP-시알산 트랜스포터 및 뉴클레오티드 디포스파타제로 구성되는 뉴클레오시드 당 트랜스포터의 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 디포스파타제의 작용에 의해 UDP 또는 GDP를 제거하도록 균류 균주를 유전적으로 조작하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 당단백질은 27 몰% 이상이 6개 미만의 만노즈 잔기를 포함하는 N-글리칸을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 당단백질이 갈락토즈, 시알산, 및 푸코즈로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 당단백질이 NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man 구조를 포함하는 1종 이상의 올리고사카라이드 가지를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 당단백질이 4개 미만의 만노즈 잔기를 보유하는 N-글리칸을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주로부터 분리한 후, 시험관 내에서 상기 당단백질에 대해 1종 이상의 추가 글리코실화 또는 카르복실화 반응을 수행하는 것인 방법.
제1항에 있어서,

(a) 외인성 글리코실화 효소를 암호화하는 2종 이상의 유전자를 포함하는 DNA 라이브러리를 제공하는 단계;

(b) 상기 라이브러리로 상기 숙주를 형질전환하여 2종 이상의 별개의 외인성 글리코실화 효소를 발현하는 유전적으로 혼합된 군집을 생성하는 단계;

(c) 상기 군집으로부터 목적하는 글리코실화 표현형을 생성하는 숙주를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 숙주는 목적하는 글리코실화 표현형의 선택 이전에 상기 라이브러리를 이용하여 2회 이상 형질전환되는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 라이브러리는 글리코실화 효소를 암호화하는 1종 이상의 야생형 유전자를 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 라이브러리는 글리코실화 효소를 암호화하는 1종 이상의 합성 유전자를 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 라이브러리는 유전자 셔플링, 시험관내 돌연변이유발 및 에러-프론 PCR로부터 선택되는 기법을 이전에 수행한 1종 이상의 유전자를 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 라이브러리는 글리코실화 효소 또는 이의 촉매적으로 활성인 단편을 암호화하는 DNA 단편을 이용하여 세포성 표적 신호 펩티드를 암호화하는 DNA 단편의 프레임내 연결에 의해 형성된 1종 이상의 유전 구성물을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 DNA 단편은 만노시다제, UDP-GlcNAc 트랜스퍼라제, UDP-갈락토실트랜스퍼라제 및 CMP-시알릴트랜스퍼라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 활성을 암호화하며, 상기 세포성 표적 신호 펩티드는 소포체, 시스 골지, 중간 골지 및 트랜스 골지로 구성되는 군으로부터 선택되는 기관내에 상기 효소를 현저하게 국부화하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 선택 단계는 질량 분광법, 액체 크로마토그래피, 형광 활성화된 세포 분류기를 이용하는 세포의 특정화, 분광광도계, 형광계 또는 섬광 계수기, 목적하는 올리고사카라이드 부분에 대한 특이 친화성을 보유하는 항체 또는 렉틴에 대한 숙주 세포의 노출 및 당, 항체 및 렉틴으로 구성되는 군으르부터 선택된 세포독성 분자 또는 방사능 분자에 대한 세포의 노출로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 글리코실화된 단백질 또는 분리된 N-글리칸을 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제31항중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 숙주.
제1항 내지 제31항중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당단백질.
제24항 내지 제30항의 라이브러리.