JP4092194B2 - ピキアパストリス(PichiaPastoris)におけるタンパク質糖鎖修飾 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するためのメチロトローフ酵母のグリコシル化過程の遺伝子改変に有用な方法及びベクターに関する。本発明は、さらに、本発明の方法を使用して作製したメチロトローフ酵母株及びこのような遺伝子改変株から産生された糖タンパク質に関する。
【0002】
(発明の背景)
ピキアパストリス(Pichia pastoris)を含むメチロトローフ酵母は、商業的または医学的に重要な組換えタンパク質の産生に広く使用されている。しかし、いくつかの治療用糖タンパク質の産生及び医学への適用は、これらの酵母と哺乳動物被験体などの標的生物との間のタンパク質結合炭水化物生合成の相違によって妨害され得る。
【0003】
タンパク質のNグリコシル化は、ドリコール(脂質運搬中間体)上で組み立てられたN結合少糖類(Glc3Man9GlcNAc2)を新生タンパク質の適切なAsnに移行する小胞体(ER)で開始される。これは、全ての真核生物N結合糖タンパク質に共通の事象である。3つのグルコース残基及び1つの特定のα−1,2−結合マンノース残基がER中で特定のグルコシダーゼ及びα−1,2−マンノシダーゼによって除去されて少糖類のコア構造Man8GlcNAc2が得られる。この糖コア構造を有するタンパク質が、ゴルジ装置に輸送され、糖部分が種々の修飾を受ける。酵母と高等真核生物との間でゴルジ装置での糖鎖修飾が有意に異なる。
【0004】
哺乳動物細胞では、糖鎖修飾は付加されるタンパク質部分に依存した3つの異なる経路を介して進行する。したがって、(1)糖コア鎖が変化しない;(2)糖コア鎖中のマンノースの第6位へのUDP−N−アセチルグルコサミン(UDP−GlcNAc)中のN−アセチルグルコサミン−1−リン酸部分(GlcNAc−1−P)の付加及びその後のGlcNAc部分の除去により糖コア鎖が変化し、糖タンパク質中に酸性糖鎖が形成される;(3)最初に、マンノシダーゼIでの3つのマンノース残基の除去により糖鎖がMan5GlcNAc2に変換され;GlcNAcの付加及び2つのさらなるマンノース残基の除去によりMan5GlcNAc2がさらに修飾され、その後のGlcNAc、ガラクトース(Gal)、及びN−アセチルノイラミン酸(シアリン酸(NeuNAc)とも呼ばれる)の連続的付加により種々のハイブリッドまたは複合体糖鎖が形成される(R.Kornfeld and S.Kornfeld、Ann.Rev.Biochem.、54、631から664、1985;Chiaら、J.Biol.Chem.、273、26298から26304、1998)。
【0005】
酵母では、ゴルジ装置での糖鎖修飾は、異なるマンノシルトランスフェラーゼによる一連のマンノース残基の付加を含む(「外部鎖グリコシル化」)。外部鎖グリコシル化の構造は生物に特異的であり、典型的には、S.セレビシエ(S.cerevisiae)では50個を超えるマンノース残基、最も一般的にはピキアパストリス(Pichia pastoris)ではMan14GlcNAc2より小さな構造を有する。高マンノース型のこの酵母特異的外部鎖グリコシル化は、超グリコシル化とも示される。
【0006】
超グリコシル化は、炭水化物組成及び分子量の両方において組換えタンパク質産物が不均一になり、タンパク質精製を複雑にし得るので、望ましくない場合がある。超グリコシル化酵素の比活性(単位/重量)は、炭水化物部分の増加によって減少し得る。さらに、外部鎖のグリコシル化は強力な免疫原性を示し、治療には望ましくない。さらに、より大きな外部糖鎖は、治療タンパク質の免疫決定基をマスクし得る。例えば、P.パストリス(P.pastoris)で発現したインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)は、30から40個までのマンノース残基を含むN−グリカンでグリコシル化される。NA分子先端上の可変性且つ免疫優性の表面ループがN−グリカンでマスクされるので、マウスでは超グリコシル化NAは免疫原性が減少する(Martinetら、Eur J.Biochem.、247、332から338、1997)。
【0007】
したがって、一般に、タンパク質のグリコシル化を操作することができ、構造または機能が巨大N−グリカン側鎖に影響を及ぼされない組換えタンパク質を産生することができるメチロトローフ酵母株を遺伝子操作することが望ましい。
【0008】
(発明の要約)
本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するためのメチロトローフ酵母株におけるグリコシル化工程の遺伝子改変に有用な方法及びベクターに関する。本発明の方法及びベクターを使用して作製されたメチロトローフ酵母株ならびにこのような遺伝子改変株から産生された糖タンパク質もまた提供する。
【0009】
1つの実施形態では、本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生することができる遺伝子操作メチロトローフ酵母株の作製に有用なベクターを提供する。
【0010】
1つの態様では、本発明は、酵素活性によりメチロトローフ酵母株によって産生された糖タンパク質のグリコシル化が減少する1つまたは複数のタンパク質をメチロトローフ酵母株において発現することができる「ノックイン」ベクターを提供する。
【0011】
好ましい実施形態では、本発明のノックインベクターは、α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含み、メチロトローフ酵母株においてα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分を発現することができる。好ましいヌクレオチド配列は、真菌種のα−1,2−マンノシダーゼ、より好ましくはトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼをコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、α−1,2−マンノシダーゼ発現ベクターを、ベクターから発現したα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分がER保持シグナルを含むように操作する。好ましいER保持シグナルはHDELである。α−1,2−マンノシダーゼコード配列は、構成性または誘導プロモーター、及び3’末端配列に作動可能に連結することができる。ベクターは、組み込みベクターまたは複製ベクターであり得る。特に好ましいα−1,2−マンノシダーゼ発現ベクターには、pGAPZMFManHDEL、pGAPZMFManMycHDEL、pPICZBMFManMycHDEL、pGAPZmManHDEL、pGAPZmMycManHDEL、pPIC9mMycManHDEL、及びpGAPZmMycManHDELが含まれる。
【0012】
別の好ましい実施形態では、本発明のノックインベクターは、グルコシダーゼIIまたはその機能的部分をコードする配列を含み、メチロトローフ酵母株においてグルコシダーゼII及びその機能的部分を発現することができる。好ましいヌクレオチド配列は、真菌種、より好ましくはサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のグルコシダーゼIIをコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、グルコシダーゼII発現ベクターを、ベクターから発現したグルコシダーゼIIまたはその機能的部分がER保持シグナルを含むように操作する。好ましいER保持シグナルはHDELである。グルコシダーゼIIコード配列は、構成性または誘導プロモーター及び3’末端配列に作動可能に連結することができる。ベクターは組み込みベクターまたは複製ベクターであり得る。特に好ましいグルコシダーゼII発現ベクターには、pGAPZAGLSII、pPICZAGLSII、pAOX2ZAGLSII、pYPTIZAGLSII、pGAPADEglsII、pPICADEglsII、pAOX2ADEglsII、pYPTIADEglsII、pGAPZAglsIIHDEL、及びpGAPADEglsIIHDELが含まれる。
【0013】
α−1,2−マンノシダーゼ発現単位及びグルコシダーゼII発現単位の両方を含む発現ベクターもまた、本発明によって得られる。
【0014】
別の態様では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、遺伝子を不活化するか破壊することによりメチロトローフ酵母株で産生された糖タンパク質のグリコシル化の減少を容易にする「ノックアウト」ベクターを提供する。
【0015】
1つの実施形態では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、Och1遺伝子を不活化するか破壊する「ノックアウト」ベクターを提供する。好ましいOch1ノックアウトベクターは、pBLURA5’PpOCH1である。
【0016】
本発明のさらに別の実施形態は、ノックイン単位及びノックアウト単位の両方を含むベクターを提供する。
【0017】
さらに、本発明の任意のノックインまたはノックアウトベクターはまた、メチロトローフ酵母において目的の異種タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【0018】
本発明の別の実施形態は、本発明の1つまたは複数のベクターでの酵母の形質転換によるメチロトローフ酵母におけるグリコシル化の修飾法を提供する。
【0019】
本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株には、カンジダ属(Cnadida)、ハンセヌラ属(Hansenula)、トルロプシス属(Torulopsis)、及びピキア属(Pichia)の酵母などのメタノールで増殖することができる酵母株が含まれるが、これらに限定されない。好ましいメチロトローフ酵母は、ピキア属(Pichia)である。ピキアパストリス(Pichia pastoris)株GS115(NRRL Y−15851)、GS190(NRRL Y−18014)、PPF1(NRRL Y−18017)、PPY120H、yGC4、及びそれから誘導される株が特に好ましい。本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株はまた、1つまたは複数の目的の異種タンパク質を発現するように操作されているメチロトローフ酵母株が含まれる。これらの先に遺伝子操作した株から発現した異種タンパク質のグリコシル化を、このような株の1つまたは複数の本発明のベクターでの形質転換によって減少させることができる。
【0020】
本発明の方法の実施によって改変されるメチロトローフ酵母株は、本発明の別の実施形態によって得られる。
【0021】
本発明のさらなる態様は、グリコシル化が減少した糖タンパク質の産生法に関する。
【0022】
このような方法によれば、糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、1つまたは複数の本発明のベクターで先に形質転換したメチロトローフ酵母株に移入することができる。あるいは、糖タンパク質を発現するように遺伝子操作したメチロトローフ酵母株を、1つまたは複数の本発明のベクターで形質転換することができる。しかし、メチロトローフ酵母株を目的の糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列または本発明の任意のベクターで形質転換しない場合、このような酵母株を糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列及び1つまたは複数の本発明のベクターの両方で連続的または同時に形質転換することができる。さらに、メチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株内で糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列も含む1つまたは複数の本発明のノックイン及び/またはノックアウトベクターで形質転換することができる。
【0023】
本発明の方法の使用によって産生された糖タンパク質産物(すなわち、N−グリコシル化が減少した糖タンパク質)もまた、本発明の一部である。
【0024】
1つまたは複数の本発明のベクターまたはグリコシル化が減少した糖タンパクを作製する様に改変された1つまたは複数の株もまた得られる。
【0025】
(発明の詳細な説明)
ピキア属(Pichia)の小胞体(ER)から放出された糖タンパク質上のN−グリカンの体部分が、Man8GlcNAc2オリゴ糖コア構造を有することが確立されている。タンパク質がERからゴルジ装置に輸送された後、異なるマンノシルトランスフェラーゼによってさらなるマンノース残基がこのコア糖部分に付加され、巨大なマンノース側鎖を有する糖タンパク質が得られる。このような組換え糖タンパク質の超グリコシル化は、多くの例で望ましくない。したがって、本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するための遺伝子改変メチロトローフ酵母株の産生法及びベクターを提供する。本発明の方法及びベクターを使用して作製したメチロトローフ酵母株及びこのような遺伝子改変株から産生した糖タンパク質もまた得られる。
【0026】
1つの実施形態では、本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するための遺伝子改変メチロトローフ酵母株に有用なベクターを提供する。
【0027】
1つの態様では、本発明は、酵素活性によりメチロトローフ酵母株によって産生された糖タンパク質のグリコシル化が減少する1つまたは複数のタンパク質をメチロトローフ酵母株において発現することができる「ノックイン」ベクターを提供する。本発明によれば、このようなタンパク質には、例えば、α−1,2−マンノシダーゼ、グルコシダーゼII、またはその機能的部分が含まれる。
【0028】
好ましい実施形態では、本発明のベクターには、α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするが含まれ、メチロトローフ酵母株においてα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分を発現することができる。
【0029】
α−1,2−マンノシダーゼは、Man8GlcNAc2の非還元末端でα−1,2結合マンノース残基を切断し、糖タンパク質上のこのコアオリゴ糖をMan5GlcNAc2に変換する。インビトロでは、Man5GlcNAc2は任意のピキア属(Pichia)ゴルジマンノシルトランスフェラーゼの非常に不十分な基質である(すなわち、マンノース残基をこの糖構造に付加することができない)。それに対して、Man5GlcNAc2は、哺乳動物N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの受容体基質であり、哺乳動物糖タンパク質に特徴的なハイブリッド型及び複合体型糖鎖の中間体である。したがって、α−1,2−マンノシダーゼのピキア属(Pichia)などのメチロトローフ酵母への移入法により、マンノースが減少した糖タンパク質を産生することができる。
【0030】
本発明によれば、本発明の発現ベクターで使用するα−1,2−マンノシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、任意の種由来であり得る。多数のα−1,2−マンノシダーゼ遺伝子がクローン化されており、当業者が利用可能であり、例えば、マウスα−1,2−マンノシダーゼ(Herscovicsら、J.Biol.Chem.、269、9864から9871、1994)、ウサギα−1,2−マンノシダーゼ(Lalら、J.Biol.Chem.、269、9872から9881、1994)、またはヒトα−1,2−マンノシダーゼ(Tremblayら、Glycobiology、8、585から595、1998)をコードする哺乳動物遺伝子及び例えばコウジカビ属(Aspergillus)α−1,2−マンノシダーゼ(msdS遺伝子)、トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼ(Marasら、J.Biotechnol.、77、255から263、2000)、またはサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のα−1,2−マンノシダーゼをコードする遺伝子が含まれる。タンパク質配列分析により、現段階で同定されている真核生物α−1,2−マンノシダーゼの間には保存性が高いことが明らかとなっている。
【0031】
好ましくは、本発明で使用されるヌクレオチド配列は、真菌α−1,2−マンノシダーゼ、より好ましくはトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼ、より詳細にはMarasら、J.Biotechnol.、77、255から63、2000に記載のトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼをコードする。
【0032】
本発明によれば、ヌクレオチド配列はまた、α−1,2−マンノシダーゼの機能的部分のみをコードすることができる。
【0033】
「機能的部分」は、実質的に全長タンパク質の酵素活性を保持するα−1,2−マンノシダーゼのポリペプチドフラグメントを意味する。「実質的に」は、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも50%またはそれ以上の全長α−1,2−マンノシダーゼの酵素活性を保持することを意味する。例えば、本発明で例示するように、マウスα−1,2−マンノシダーゼIBの触媒ドメインは、マウスα−1,2−マンノシダーゼIBの「機能的部分」を構成する。当業者は、当該分野で公知の技術の組み合わせを使用してα−1,2−マンノシダーゼの機能的部分を容易に同定及び作製することができる。酵素活性の付与に不可欠であるか十分であるα−1,2−マンノシダーゼ部分を、タンパク質配列分析に基づいて予想することができる。適切な発現系から発現及び精製された目的のα−1,2−マンノシダーゼの一部の活性を、以下に記載のインビトロまたはインビボアッセイを使用して評価することができる。
【0034】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株で発現されたα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分は、好ましくは、Man8GlcNAc2(α−1,2−マンノシダーゼの基質)が糖タンパク質上に既に形成されているが、さらなるマンノース残基で糖鎖を伸長させるゴルジグリコトランスフェラーゼに達していない分泌経路中の部位を標的とする。
【0035】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、α−1,2−マンノシダーゼ発現ベクターを、ベクターから発現したα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分がER保持シグナルを含むように操作する。
【0036】
「ER保持シグナル」は、輸送すべきこのようなペプチド配列を有するタンパク質を支持し、ER中で保持されるペプチド配列をいう。このようなER保持配列は、ER中に存在して機能するタンパク質中でしばしば認められる。
【0037】
当業者は多数のER保持シグナルの選択を利用可能である(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のERタンパク質MNS1の最初の21アミノ酸残基)(Martinetら、Biotechnology Letters、20、1171から1177、1998)。本発明で使用される好ましいER保持シグナルは、ペプチドHDEL(配列番号1)である。多数の酵母タンパク質のC末端で見出されるHDELペプチド配列は、ERの保持/回復シグナルとして作用する(Pelham、EMBO J.、7、913から918、1988)。HDEL配列を有するタンパク質は、膜結合受容体(Erd2p)によって結合され、その後ゴルジ装置からERへの回復のための逆行経路に入る。
【0038】
本発明によれば、ER保持シグナルを、α−1,2−マンノシダーゼのタンパク質配列の任意の場所、しかし好ましくはα−1,2−マンノシダーゼのC末端に置くことができる。
【0039】
本発明で使用されるα−1,2−マンノシダーゼを、例えば、抗体を利用可能なエピトープタグ(当該分野で周知のMyc、HA、FLAG、及びHis6タグなど)の挿入によってさらに改変することができる。エピトープタグ化α−1,2−マンノシダーゼを都合よく精製するか、発現及び細胞内局在化の両方についてモニターすることができる。
【0040】
ER保持シグナル及びエピトープタグを、当該分野で公知の任意の分子生物学的技術を使用したこのようなシグナルの目的のタンパク質をコードするヌクレオチドへの挿入によって目的のタンパク質に容易に移入することができる。
【0041】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、グルコシダーゼIIまたはその機能的部分をコードする配列を含み、メチロトローフ酵母株においてグルコシダーゼIIまたはその機能的部分を発現することができる。
【0042】
ER中のタンパク質上に移行された最初のN結合オリゴ糖(Glc3Man9GlcNAc2)を、特異的グルコシダーゼによってER中で切断して、グルコース残基を除去し、マンノシダーゼによって切断して1つの特異的α−1,2結合マンノースを除去することが確立されている。ピキア属(Pichia)で発現したいくつかの組換えタンパク質が、このようなタンパク質がERからゴルジ装置へ放出された場合に糖部分上に残存グルコース残基を有することが本発明で認められた。この糖構造上に存在する残存グルコース分子により、α−1,2−マンノシダーゼによる糖部分の完全な消化が防止され、外因性グルコシダーゼの移入により、これらのグルコース残基の除去を促進することができる。
【0043】
本発明によれば、グルコシダーゼIIをコードするヌクレオチド配列は、任意の種に由来し得る。グルコシダーゼII遺伝子が、ラット、マウス、ブタ、及びヒトを含む多数の哺乳動物種からクローン化されている。これらの哺乳動物種由来のグルコシダーゼIIタンパク質は、αよびβサブユニットからなる。αサブユニットは約110kDaであり、且つ酵素触媒活性を含み、βサブユニットはC末端HDEL ER保持シグナルを有し、且つ酵素のER局在化に重要であると考えられている。S.セレビシエ(S.cerevisiae)由来のグルコシダーゼII遺伝子がクローン化されている(第2番染色体上に存在するORFYBR229c)。この遺伝子は、哺乳動物αサブユニットと高い相同性を示す約110kDaのタンパク質をコードする。
【0044】
本発明で使用される好ましいグルコシダーゼII遺伝子は、ピキアパストリス(Pichia pastoris)及びS.セレビシエ(S.cerevisiae)などの真菌種由来である。真菌グルコシダーゼII遺伝子の例は、S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコシダーゼIIαサブユニット遺伝子である。
【0045】
本発明によれば、ヌクレオチド配列はまた、グルコシダーゼIIの機能的部分のみをコードすることができる。「機能的部分」は、実質的に全長タンパク質の酵素活性を保持するグルコシダーゼIIのポリペプチドフラグメントを意味する。「実質的に」は、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも50%またはそれ以上の全長グルコシダーゼIIの酵素活性を保持することを意味する。グルコシダーゼIIの機能的部分を同定し、当業者は当該分野で公知の種々の技術を使用して作製することができる。
【0046】
本発明の好ましい実施形態では、メチロトローフ酵母株をERに標的化し、その中で機能を保持するようなER保持シグナルを含むようにグルコシダーゼIIタンパク質を操作する。ER保持シグナルは、上記に記載している(例えば、HDELペプチド配列)。
【0047】
本発明で使用するグルコシダーゼIIを、例えば、抗体を利用可能なエピトープタグ(当該分野で周知のMyc、HA、FLAG、及びHis6タグなど)の挿入によってさらに改変することができる。
【0048】
本発明によれば、「ノックイン」ベクターは、α−1,2−マンノシダーゼコード配列及びグルコシダーゼIIコード配列のいずれかまたは両方を含み得る。
【0049】
さらに、本発明によれば、発現すべき酵素(例えば、α−1,2−マンノシダーゼもしくはその機能的部分またはグルコシダーゼIIもしくはその機能的部分)をコードするヌクレオチド配列を、プロモーター及び3’末端配列への作動可能な結合中に置くことができる。
【0050】
メチロトローフ酵母におけるタンパク質発現に適切なプロモーターは、構成性プロモーター及び誘導プロモーターの両方を含むことができる。構成性プロモーターには、例えば、ピキアパストリス(Pichia pastoris)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター(「GAPプロモーター」)が含まれる。誘導プロモーターの例には、例えば、ピキアパストリス(Pichia pastoris)アルコールオキシダーゼプロモーター(AOXIプロモーター)(米国特許第4,855,231)またはピキアパストリス(Pichia pastoris)ホルムアルデヒドデヒドロギナーゼプロモーター(「FLDプロモーター」)が含まれる(Shenら、Gene、216、93から102、1998)。
【0051】
3’末端配列は、前記配列がポリアデニル化を誘発する配列などに作動可能に連結された遺伝子のmRNA転写産物を安定化するように機能する構造遺伝子の終止コドンに対して3’の配列である。3’末端配列を、ピキア属(Pichia)または他のメチロトローフ酵母から得ることができる。本発明の実施に有用なピキアパストリス(Pichia pastoris)の3’末端配列には、AOX1遺伝子、p40遺伝子、HIS4遺伝子、及びFLD1遺伝子由来の末端配列が含まれる。
【0052】
本発明のベクターは、好ましくは、選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、メチロトローフ酵母に選択可能な表現型を付与し、且つ形質転換細胞を非形質転換細胞から同定及び選択可能な任意の遺伝子であり得る。選択マーカー系には、栄養要求性変異メチロトローフ酵母株及び宿主の欠失を補足する野生型遺伝子を含み得る。このような系の例には、ピキア属(Pichia)のhis4株の補足に使用することができるサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピキアパストリス(Pichia pastroris)のHIS4遺伝子またはピキアパストリス(Pichia pastoris)のarg変異体の補足に使用することができるS.セレビシエ(S.cerevisiae)またはピキアパストリス(Pichia pastoris)のARG4遺伝子が含まれる。ピキアパストリス(Pichia pastoris)で機能する他の選択マーカー遺伝子には、ZeoR遺伝子、G418R遺伝子などが含まれる。
【0053】
本発明のベクターには、自律複製配列(ARS)も含み得る。例えば、米国特許第4,837,148号は、ピキアパストリス(Pichia pastoris)における適切なプラスミドの維持手段を提供する自律複製配列を記載している。米国特許第4,837,148号の開示は、本明細書中で参考として援用される。
【0054】
ベクターはまた、細菌中で機能する選択マーカー遺伝子ならびに細菌における複製及び染色体外維持を担う配列を含むことができる。細菌選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tetr)、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びゼオシン耐性遺伝子(ZeoR)が含まれる。
【0055】
本発明によれば、メチロトローフ酵母において発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、組み込みベクターまたは複製ベクター(複製環状プラスミドなど)に置くことができる。
【0056】
組み込みベクターは、例えば、米国特許第4,882,279号(本明細書中で参考として援用される)で開示されている。組み込みベクターには、一般に、少なくとも第1の挿入可能なDNAフラグメント、選択マーカー遺伝子、及び第2の挿入可能なDNAフラグメントの連続的に配置された配列が含まれる。第1及び第2の挿入可能なDNAフラグメントは、それぞれ約200ヌクレオチド長であり、形質転換される種のゲノムDNAのいびつに相同なヌクレオチド配列を有する。発現用の目的の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列を、このベクター中のマーカー遺伝子の前後いずれかの第1と第2の挿入可能なDNAフラグメントとの間に挿入する。組み込みベクターを酵母形質転換前に線状化して、目的にヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを容易にすることができる。
【0057】
α−1,2−マンノシダーゼコード配列またはグルコシダーゼIIコード配列のいずれかまたは両方を保有する複製ベクター及び組み込みベクターを、当業者に公知であり、例えば、Sambrookら、1989、「分子クローニング:実験マニュアル」または広く利用可能な組換えDNA技術についての任意の多数の実験マニュアルに見出される標準的技術によって構築することができる。
【0058】
α−1,2−マンノシダーゼ発現配列を保有する本発明の好ましいベクターには、pGAPZMFManHDEL、pGAPZMFManMycHDEL、pPICZBMFManMycHDEL、pGAPZmManHDEL、pGAPZmMycManHDEL、pPIC9mMycManHDEL、及びpGAPZmMycManHDELが含まれ、以下の実施例でさらに説明する。
【0059】
グルコシダーゼII発現配列を保有する本発明の好ましいベクターには、pGAPZAGLSII、pPICZAGLSII、pAOX2ZAGLSII、pYPTIZAGLSII、pGAPADE1glsII、pPICADE1glsII、pAOX2ADE1glsII、pYPTIADE1glsII、pGAPZAglsIIHDEL、及びpGAPADE1glsIIHDELが含まれる。
【0060】
別の態様では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、遺伝子を不活化するか破壊することによりメチロトローフ酵母株で産生された糖タンパク質のグリコシル化の減少を容易にする「ノックアウト」ベクターを提供する。
【0061】
1つの実施形態では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、Och1遺伝子を不活化するか破壊する「ノックアウト」ベクターを提供する。
【0062】
S.セレビシエ(S.cerevisiae)のOCH1遺伝子はクローン化されている(Nakayamaら、EMBO J.、11、2511から2519、1992)。これは、初期ゴルジ複合体中に存在し、N結合コアオリゴサッカリド(Man5GlcNAc2及びMan8GlcNAc2)へのα−1,6−ポリマンノース外部鎖添加の開始において機能的な膜結合α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼをコードする(Nakanisi−Shindoら、J.Biol.Chem.、268、26338から26345、1993)。
【0063】
日本国特願平07−145005にS.セレビシエ(S.cerevisiae)のOCH1に高い相同性を示すタンパク質をコードするピキア属(Pichia)配列が記載されている。本発明の目的のために、本明細書中では、この配列を「ピキア属(Pichia) OCH1遺伝子」と命名する。当業者は、当該分野で周知の技術を使用して、他のメチロトローフ酵母からOH1遺伝子を単離することができる。
【0064】
本発明によれば、メチロトローフ酵母のOCH1遺伝子の破壊により、不活性タンパク質産物を産生することができるか産物を産生しない。破壊は、異種DNA配列のコード配列への挿入及び/またはいくつかまたは全てのコード配列の欠失の形態を取ることができる。本質的にRothstein(Methods in Enzymology、Wuら編、第101巻、202から211、1983)に記載の相同組換えによって遺伝子を破壊することができる。
【0065】
相同組換えによってOch1遺伝子を破壊するために、選択マーカー遺伝子を含むような方法でOch1ノックアウトベクターを構築することができる。選択マーカー遺伝子を、5’及び3’末端で相同組換えの媒介に十分な長さのOch1遺伝子の一部に作動可能に連結する。選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補足するか抗生物質耐性が得られる任意の多数の遺伝子(URA3、LEU2、及びHIS3遺伝子を含む)のうちの1つであり得る。他の適切な選択マーカーには、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するCAT遺伝子または活性β−ガラクトシダーゼ発現による青色コロニーが得られるlacZ遺伝子が含まれる。次いで、Och1ノックアウトベクターの線状化DNAフラグメントを、当該分野で周知の方法を使用して宿主メチロトローフ酵母細胞に移入する。線状フラグメントのゲノムへの組み込み及びOch1遺伝子の破壊を選択マーカーに基づいて同定し、例えば、サザンブロット分析によって評価することができる。
【0066】
あるいは、Och1ノックアウトベクターを、いかなるOch1プロモーター配列も欠き、且つOch1タンパク質をコードしないか不活性なフラグメントをコードする破壊すべきOch1遺伝子の一部を含むような方法で構築することができる。「不活性フラグメント」は、好ましくは約10%未満、より好ましくは0%の全長OCH1タンパク質活性を有するOch1タンパク質のフラグメントを意味する。このようなOCH1遺伝子の一部を、公知のプロモーター配列がOCH1配列に作動可能に連結されないが、終止コドン及び転写終結配列がOch1遺伝子の一部に作動可能に連結されるような方法でベクター中に挿入する。その後、このベクターを、OCH1配列の一部に線状化し、当該分野で公知の任意の方法を使用してメチロトローフ酵母株に形質転換する。1つの相同組換えにより、この線状化ベクターをOCH1遺伝子に組み込む。1つの相同組換えの結果として、染色体中に2つのOch1配列が産生される。第1のOch1配列は、ベクター由来のOch1遺伝子一部であり、宿主メチロトローフ酵母のOCH1プロモーターの調節下にあり、さらに上記のように活性OCH1タンパク質を産生することができないので、Och1配列がOCH1タンパク質をコードしないかその不活性フラグメントをコードする。第2のOch1配列は全長OCH1コード配列であるが、任意の公知のプロモーター配列に作動可能に連結しておらず、活性OCH1タンパク質の合成のために活性メッセンジャーが形成されないと予想される。好ましくは、不活性変異体を、OCH1配列中の線状化ベクターの5’末端及びOCH1の転写開始コドンの3’末端に移入する。「不活性化変異」は、終止コドンが移入された変異、フレームシフト変異、または読み取り枠を破壊する任意の他の変異を意味する。このような変異を、当該分野で公知の任意の部位特異的変異誘発法を使用してOch1配列に移入することができる。このような不活性化変異により、ノックアウトベクター中のOch1配列の5’にいくつかのプロモーター配列が存在する場合でさえ、機能的OCH1タンパク質を確実に形成することができない。
【0067】
本発明の好ましいOch1ノックアウトベクターは、pBLURA5’PpOCH1である。
【0068】
所望ならば、マンノシダーゼ発現配列及びグルコシダーゼ発現配列のいずれかまたは両方を、OCH1遺伝子を破壊して「ノックイン及びノックアウト」ベクターを作製するために使用する同一のプラスミド上に保有させることができる。
【0069】
さらに、任意の上記のベクターは、メチロトローフ酵母株において目的の糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【0070】
本発明の別の態様は、メチロトローフ酵母株によって産生されたタンパク質上のグリコシル化を減少させるようにメチロトローフ酵母株を改変する方法に関する。本発明の方法によれば、メチロトローフ酵母株を、これらの酵母株への1つまたは複数の(すなわち、少なくとも1つの)上記の本発明のノックイン及び/またはノックアウトベクターへの形質転換によって改変する。
【0071】
本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株には、カンジダ属(Cnadida)、ハンセヌラ属(Hansenula)、トルロプシス属(Torulopsis)、及びピキア属(Pichia)の酵母などのメタノールで増殖することができる酵母が含まれるが、これらの限定されない。このクラスの酵母の例である種のリストを、C.Anthony、1982、TheBiochemistry of Methylotrophs、269に見出すことができる。ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ピキアメタノリカ(Pichia methanolica)、ピキアアノモラ(Pichia anomola)、ハンセヌラポリモーファ(Hansenula polymorpha)、及びカンジダボイジニ(Candida boidinii)は、本発明の実施に有用なメチロトローフ酵母の例である。好ましいメチロトローフ酵母は、ピキア属(Pichia)のものである。ピキアパストリス(Phichia pastoris)のGS115株(NRRL Y−15851);米国特許第4,818,700号に開示のGS190株(NRRL Y−18014);米国特許第4,812,405号に開示のPPF1株(NRRL Y−18017);PPY120H及びyGC4株;ならびにこれらに由来する株が特に好ましい。
【0072】
本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株はまた、1つまたは複数の目的異種糖タンパク質を発現するように遺伝子操作されているメチロトローフ酵母株を含む。これらの先に操作した株から発現した異種糖タンパク質上のグリコシル化を、このような株の1つまたは複数の本発明のベクターでの形質転換によって減少させることができる。
【0073】
本発明のベクターを、Creggら、1985に記載のスフェロプラスト技術または欧州特許第312,934号に記載のピキア属(Pichia)で使用するために改変したItoら、Agric.Biol.Chem.、48、341の全細胞塩化リチウム酵母形質転換などの公知の方法を使用してメチロトローフ酵母株の細胞に移入することができる。プラスミドまたは線状ベクターの形質転換に有用な他の公表されている方法には、米国特許第4,929,555号;Hinnenら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、75、1929、1978;Itoら、J.Bacteriol.、153、163、1983;米国特許第4,879,231号;Sreekrishnaら、Gene、59、115、1987が含まれる。エレクトロポレーション及びPEG1000全細胞形質転換法を使用することもできる。Cregg and Russel、分子生物学法:ピキア属プロトコル(Pichia Protocols)、第3章、Humana Press、Totowa,N.J.、27から39、1998。
【0074】
形質転換酵母を、任意の適切な技術((細胞の栄養要求性によって)必要な生化学産物の非存在下での形質転換後の栄養要求細胞の培養、新規の表現型の検出、または形質転換体における耐性遺伝子の非存在下で酵母に有毒な抗生物質の存在下での培養が含まれるが、これらに限定されない)の使用によって選択することができる。形質転換体を、例えば、サザンブロットまたはPCR分析によって評価することができるゲノムへの発現カセットの組み込みによって選択及び/または評価することができる。
【0075】
1つの実施形態では、メチロトローフ酵母株を、α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列含むベクターで形質転換する。ヌクレオチド配列は、メチロトローフ酵母株においてα−1,2−マンノシダーゼまたは機能的部分を発現することができ、好ましくは、メチロトローフ酵母株に組み込まれる。
【0076】
メチロトローフ酵母株に移入されたα−1,2−マンノシダーゼの発現を、例えば、ノーザンブロット分析によるmRNAレベル及びウェスタンブロット分析によるタンパク質レベルの両方で評価することができる。タンパク質の細胞内局在化を、細胞下分画及び免疫蛍光実験を含む多数の技術の使用によって分析することができる。α−1,2−マンノシダーゼのER局在化を、細胞下分画実験におけるこの酵素と公知のER常駐タンパク質(例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ)との共沈によって同定することができる。ER局在化を、ER常駐タンパク質に特徴的な免疫蛍光染色パターン(典型的には、核周囲の染色パターン)によって同定することもできる。
【0077】
メチロトローフ酵母株において発現したα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分はマンノーストリミング活性を有することが予想され、インビトロ及びインビボアッセイを使用することができる。典型的には、インビトロアッセイは、メチロトローフ酵母株から発現及び精製された酵素でのインビトロ合成基質(例えば、Man8GlcNAc2)の消化、及びこのような酵素のMan8GlcNAc2を例えばMan5GlcNAc2にトリミングする能力の評価を含む。インビボアッセイでは、α−1,2−マンノシダーゼまたはその一部を、メチロトローフ酵母において、このような酵母中にN−グリカン保有末端α−1,2結合マンノース残基でグリコシル化されることが公知の糖タンパク質と同時発現させる。このようなα−1,2−マンノシダーゼまたはその一部の酵素活性を、糖タンパク質のN−グリカン構造中のα−1,2結合マンノース残基数の減少に基づいて測定することができる。インビトロ及びインビボアッセイの両方では、炭水化物基の組み合わせを、当該分野で周知の技術を使用して同定することができ、これを以下の実施例に例示する。
【0078】
別の実施形態では、メチロトローフ酵母株を、グルコシダーゼIIまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換する。ヌクレオチド配列は、メチロトローフ酵母株においてグルコシダーゼIIまたはその機能的部分を発現することができ、好ましくは、メチロトローフ酵母株のゲノムに組み込まれる。
【0079】
形質転換メチロトローフ酵母株で発現したグルコシダーゼIIまたはその機能的部分の酵素活性を、種々のアッセイを使用して評価することができる。例えば、グルコシダーゼIIまたはその一部をコードする配列で形質転換したメチロトローフ酵母細胞を、グルコシダーゼ基質(例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドールイル−α−D−グルコピラノシドまたは4−MU−α−D−Glc)を含む固体培地上で増殖させるように設定することができる。酵素がピキア属(Pichia)によって発現されて細胞外に分泌された場合、酵素によって基質が作用し、コロニー周囲に青色または蛍光発光などの検出可能なシグナルを発生する。あるいは、発現タンパク質分子を含む脂質培養培地を回収し、基質(例えば、p−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシド)を含む試験管中でインキュベートすることができる。酵素活性を、放出された特定の生成物の測定によって同定することができる。さらに、グルコシダーゼIIが、酵母中でグルコース残基とN−グリコシル化することが知られている糖タンパク質(例えば、インフルエンザノイラミニダーゼ)と同時に発現する場合、インビボアッセイを使用することができる。グルコシダーゼIIの酵素活性を、糖タンパク質の糖鎖中のグルコース含量の減少に基づいて測定することができる。
【0080】
本発明のさらに別の実施形態では、メチロトローフ酵母株を、Och1ノックアウトベクターで形質転換する。ベクターの形質転換及び組み込みの結果として、酵母株中のゲノムOch1遺伝子が破壊される。
【0081】
本発明のさらなる実施形態では、メチロトローフ酵母株を、α−1,2−マンノシダーゼ発現ベクターと、グルコシダーゼII発現ベクターと、及びOch1ノックアウトベクターとの任意の組み合わせで形質転換する。このような改変を、連続的形質転換(すなわち、一度に1つのベクターの移入)または同時形質転換(すなわち、ベクターの同時移入)によって行うことができる。
【0082】
所望ならば、上記の改変メチロトローフ酵母株をさらに改変することができる。例えば、任意の他のピキア属(Pichia)マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに破壊することができる。所望ならば、哺乳動物酵素をコードする遺伝子を移入して、ハイブリッドまたは複合体型N−グリカンを有する糖タンパク質を産生することもできる。
【0083】
本発明の方法の使用(すなわち、1つまたは複数の本発明のベクターでの形質転換)によって改変したメチロトローフ酵母株は、本発明の別の実施形態を形成する。
【0084】
本発明の一定の態様、特に細胞内発現α−1,2−マンノシダーゼ活性の移入はまた、O結合グリカンが主にα−1,2−結合マンノース残基からなるので、メチロトローフ酵母で産生された糖タンパク質上のO結合グリカンのグリコシル化の減少に有用であると理解すべきである。本明細書中で使用されるO結合グリカンは、糖タンパク質のセリンまたはトレオニン残基に結合した炭水化物構造をいう。
【0085】
本発明のさらなる態様は、メチロトローフ酵母におけるグリコシル化が減少した糖タンパク質、特に、メチロトローフ酵母と異種の糖タンパク質の産生法に関する。
【0086】
本明細書中で使用される、「糖タンパク質」は、メチロトローフ酵母において、1つまたは複数のアスパラギン残基または1つまたは複数のセリンもしくはトレオニン残基、またはアスパラギン及びセリンもしくはトレオニン残基の両方がグリコシル化されたタンパク質をいう。
【0087】
用語「グリコシル化の減少」は、野生型の未改変メチロトローフ酵母株と比較して本発明によって改変されているメチロトローフ酵母株において糖タンパク質が発現される場合、特により少ないマンノース残基を有する糖タンパク質上の炭水化物部分のサイズの減少をいう。
【0088】
本発明によれば、グリコシル化が減少した目的の糖タンパク質の産生を、多数の方法で行うことができる。糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、本発明にしたがって先に改変しているメチロトローフ酵母株(すなわち、1つまたは複数の本発明のベクターで形質転換された株)に移入し、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生することができる。あるいは、糖タンパク質を発現するように既に遺伝子操作されているメチロトローフ酵母株を、1つまたは複数の本発明のベクターで形質転換することができる。さもなければ、メチロトローフ酵母株が目的の糖タンパク質を発現せず、本発明の任意のベクターで形質転換された株でもない場合、このような酵素株を、連続的または同時に糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列及び1つまたは複数の本発明のベクターで形質転換することができる。さらに、メチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株において糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列もまた含む1つまたは複数の本発明のノックイン及び/またはノックアウトベクターで形質転換することができる。
【0089】
メチロトローフ酵母において糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、5’から3’方向に、プロモーター、糖タンパク質をコードする配列、及び3’末端配列を含むように作製することができる。糖タンパク質の発現に適切なプロモーター及び3’末端配列は、上記の任意のプロモーター及び3’末端配列を含み得る。
【0090】
糖タンパク質発現用ヌクレオチド配列は、さらなる配列(例えば、タンパク質産物の分泌を所望する場合、一過性ペプチドをコードするシグナル配列)を含み得る。このような配列は、広く知られており、容易に利用可能であり、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のα交配因子プレプロ(αmf)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)酸ホスファターゼ(PHO1)シグナル配列などが含まれる。
【0091】
糖タンパク質発現用のヌクレオチド配列を、複製ベクターまたは組み込みベクターに置くことができる。このようなベクターの選択及び構築は上に記載されている。
【0092】
糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、プラスミド保有α−1,2−マンノシダーゼまたはグルコシダーゼII発現単位と同一の複製プラスミド上に保有させることができる。あるいは、糖タンパク質コード配列を含むヌクレオチド配列を、別のプラスミドに保有させるか宿主ゲノムに組み込む。
【0093】
産生された糖タンパク質を、従来の方法によって精製することができる。精製プロトコールを、精製すべき特異的タンパク質の性質によって同定することができる。このような同定は当業者の範囲内である。例えば、細胞培養培地を細胞から分離し、細胞から分泌されたタンパク質を沈殿、免疫吸着、分画、または種々のクロマトグラフィー法によって培地から単離することができる。
【0094】
本発明の方法によって産生することができる糖タンパク質には、例えば、バシラスアミロリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のα−アミラーゼ、S.セレビシエ(S.cerevisiae)インベルターゼ、トリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)のトランスシアリダーゼ、HIVエンベロープタンパク質、インフルエンザウイルスA血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、ウシヘルペスウイルス1型糖タンパク質D、ヒトアンギオスタチン、ヒトB7−1、B7−2,及びB−7受容体CTLA−4、ヒト組織因子、成長因子(例えば、血小板由来成長因子)、組織プラスミノゲンアクチベーター、プラスミノゲンアクチベーターインヒビターI、ウロキナーゼ、ヒトリソソームタンパク質(α−ガラクトシダーゼなど)、プラスミノゲン、トロンビン、第XIII因子、及び免疫グロブリンが含まれる。本発明の、遺伝子操作ピキア属(Pichia)株において発現することができるさらに有用な糖タンパク質については、Bretthauer andCastellino、Biotechnol.、Appl.Biochem.、30、193から200、1999及びKukuruzinskaら、Ann.Rev.Biochem.、56、915から44、1987を参照のこと。
【0095】
本発明の方法によって産生された糖タンパク質(すなわち、グリコシル化が減少した糖タンパク質)は、本発明の一部である。
【0096】
本発明のさらに別の態様は、上記の本発明の1つまたは複数のノックインベクター、ノックアウトベクター、またはノックイン・ノックアウトベクターを含むキットを提供する。より詳細には、本発明のキットは、メチロトローフ酵母においてαマンノシダーゼIを発現することができるベクター、メチロトローフ酵母においてグルコシダーゼIIを発現することができるベクター、メチロトローフ酵母においてOch1遺伝子を破壊することができるベクター、グルコシダーゼII及びαマンノシダーゼの両方を発現することができるベクター、Och1遺伝子を破壊することができ、且つグルコースII及びα−マンノシダーゼのいずれかもしくは両方またはその組み合わせを発現することができるベクターを含む。
【0097】
キットはまた、目的の異種糖タンパク質をコードし、発現することができるヌクレオチド配列を含み得る。このようなヌクレオチド配列を、上記のノックインまたはノックアウト用の配列を含む異なるベクター中または同一のベクターにおいて得ることができる。
【0098】
さらに、キットは、目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、その後メチロトローフ酵母における形質転換及び発現のために挿入することができるプラスミドベクターを含み得る。あるいは、キット中のノックインまたはノックアウトは、目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列挿入に都合の良いクローニング部位を有する。
【0099】
キットはまた、上記の任意のノックイン、ノックアウト、ノックイン・ノックアウトベクターでその後形質転換することができるメチロトローフ酵母株を含み得る。キットはまた、1つまたは複数のノックインまたはノックアウトベクターで形質転換されているメチロトローフ酵母株を含み得る。さらに、キットは、目的の異種糖タンパク質をコードし、且つ発現することができるヌクレオチド配列で形質転換されているメチロトローフ酵母株を含み得る。
【0100】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。
【0101】
実施例1
ER−ゴルジ境界へのα−1,2−マンノシダーゼの移入
1.1 プラスミド
【表1】
トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼ遺伝子が単離されており、これはMarasら(J.Biotechnol.、77、255から263、2000)に記載されている。この遺伝子配列は、NCBIGenbankの受け入れ番号AF212153で利用可能である。構築フラグメントを、テンプレートとしてpPIC9MFmanaseプラスミド及び以下のオリゴヌクレオチドプライマー:5’−GACTGGTTCCAATTGACAAGC−3’(配列番号2)及び5’−AGTCTAGATTACAACTCGTCGTGAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCG−3’(配列番号3)を使用したPCRによって作製した。得られた産物は、ピキアパストリス(Pichia pastoris)のAOXIプロモーターの3’末端、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配因子のプレプロシグナル配列、シグナル配列でインフレームでクローン化されたトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼの読み取り枠、HDELのコード配列、終止コドン、及びXbaI制限部位を含んでいた。このフラグメントを、EcoRI及びXbaIで消化し、マンノシダーゼORFまでの5’配列を除去し、EcoRI及びXbaIで消化したベクターpGAPZαA(Invitrogen、Baarn、The Netherlands)にクローン化し、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配シグナル配列と再び融合した。得られたプラスミドを、pGAPZMFManHDELと命名し、図1に図示する。pGAPZMFManHDEL中のMFManHDEL融合物のORF配列を、配列番号14に示す。
【0102】
触媒ドメインとHDELシグナルとの間にc−Mycタグのコード配列を移入するために、T.レーセイ(T.ressei)のα −1,2−マンノシダーゼのORFの3’末端を、センスプライマー5’−CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC−3’(配列番号4)(SphI制限部位を含む)及びアンチセンスプライマーGTATCTAGATTACAACTCGTCGTGCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCGTGATGATGAA(配列番号5)(c−Mycタグ及びHDELシグナルのコード配列、その後の終止コドン及びXbaI制限部位を含む)を使用してPCR増幅した。得られたPCR産物を、SphI及びXbaIで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、同一の制限酵素で切断したpGAPZMFManHDELに挿入し、プラスミドpGAPZMFManMycHDELを得た。誘導性AOXIプロモーターの調節下でpGAPZMFManMycHDELのORFを配置するために、全ORFを、BstBI及びXbaIを用いてpGAPZMFManMycHDELから遊離し、pPICZB(Invitrogen、Baarn、The Netherlands)にクローン化し、pPICZBMFManMycHDELを得た。
【0103】
マウスcDNAライブラリー(シクロヘキシミド及びマウス腫瘍壊死因子で誘導したL929細胞株から単離したmRNA、cDNAライブラリーの平均挿入長は2000bpであった)のPCRによって、C末端HDEL−タグのコード配列の同時付加でのマウスマンノシダーゼIB触媒ドメインのクローニングを行った。使用したPCRオリゴヌクレオチドプライマーは以下であった:5’AACTCGAGATGGACTCTTCAAAACACAAACGC3’(配列番号6)及び5’TTGCGGCCGCTTACAACTCGTCGTGTCGGACAGCAGGATTACCTGA3’(配列番号7)。産物は、5’XhoI部位及びC末端HDEL部位、その後に終止コドン及び3’末端のNotI部位を含んでいた。産物を、PCR産物及びベクター中でXhoI/NotI部位を介してpGAPZαAにクローン化し、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配シグナル配列を有するマウスマンノシダーゼ触媒ドメインの融合物をインフレームで得た。作製された全読み取り枠の配列を、配列番号5に示す。
【0104】
1.2 酵母形質転換及びゲノム組み込み
【表2】
ピキアパストリス(Pichia pastoris)の全形質転換を、Invitorgenの説明にしたがったエレクトロポレーションを用いて行った。ゼオシン耐性遺伝子を保有するベクターの形質転換体を、100μg/mlのゼオシン(Invitrogen、Baarn、the Netherlands)及び1Mソルビトールを含むYPD上で選択した。pPIC9誘導体の形質転換体の選択を、ヒスチジンを欠き、且つ1Mソルビトールを含む最小培地で行った。発現カセットのゲノム組み込みを、酵母ミニプレップ法(Nucleon)を使用してピキア属(Pichia)株から精製したゲノムDNAに対するPCRを使用して評価した。トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)遺伝子融合に関する全ての場合、使用したプライマーは、マンノシダーゼORFの3’半分にアニーリングしたセンスプライマー5’−CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC−3’(配列番号8)及び本発明者らの全ての構築物中に存在するAOXI転写ターミネーターにアニーリングしたアンチセンスプライマー3’AOXI5’−GCAAATGGCATTCTGACATCCT−3’(配列番号9)であった。マウスマンノシダーゼ導入遺伝子のゲノム組み込みの調節のために、GAPプロモーターにアニーリングしたセンスプライマー5’GAP5’GTCCCTATTTCAATCAATTGAA3’(配列番号10)またはAOXIにアニーリングした5’AOXI 5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’、及びアンチセンスプライマー3’AOXI(上記)を使用しPCRを行った。Mycタグ化トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)α−1,2−マンノシダーゼ発現単位を含む発現構築物のために、プローブとして全MFManMycHDEL ORF(HighPrime、Boehringer Mannheimを使用して標識した32P)を使用したサザンブロッティングを使用してゲノム組み込みのさらなる証拠を得た。
【0105】
1.3 α−1,2−マンノシダーゼ発現
インフルエンザウイルス赤血球凝集素を発現するGS115株におけるα−1,2−マンノシダーゼ発現を、定量的ノーザンブロットによって評価した。PPY120H株におけるα−1,2−マンノシダーゼ発現を、抗Mycウェスタンブロットによって評価した。
【0106】
定量的ノーザンブロット−全RNAを、ピキア属(Pichia)株から精製し、収量を分光学的に同定した。標準的な手順にしたがってノーザンブロッティングを行い、ロードしたRNAの量をブロットのメチレンブルー染色の使用、rRNAバンドの視覚化によって評価した。ブロットを、マンノシダーゼのClaI/NarIフラグメントで探索し、HighPrime(Boehringer Mannheim)を使用して32Pで標識した。
【0107】
SDS−PAGE及びウェスタンブロッティング−全酵母細胞溶解物を、細胞のPBSでの2回洗浄、その後の1倍体積の2×濃縮Laemmliローディング緩衝液中で5分間のボイルによって調製した。溶解物をゲルローディング前に遠心分離機で短時間スピンし、上清のみをロードした。成長培地に分泌されたタンパク質の分析のために、標準的な手順に従ったデオキシコール酸/トリクロロ酢酸を使用して、200μlのこれらの培地からタンパク質を沈殿させた。このペレットを2×濃縮Laemmliローディング緩衝液に再溶解し、溶液をTrisを使用してpHを較正した。SDS−PAGEを行い、その後セミドライエレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に移した。ウェスタンブロッティングのために、9E10抗Myc及び抗HAマウスモノクローナル(Boehringer Mannheim)を、1μg/mlの濃度で使用し、ウサギ抗PI抗血清(Stressgen)を500倍希釈で使用した。二次抗体は、モノクローナルについてはアルカリホスファターゼに接合したヤギ抗マウスIgGであり、ポリクローナルについてはペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ウサギIgGであった(Sigmaの二次抗体)。アルカリホスファターゼについてはNBT/BCIPシステム、ペルオキシダーゼについてはルネサンス基質(NENBiosciences)を使用して検出を行った。Lumilager画像化装置(Boehringer Mannheim)によって後者のブロットの画像化を行った。
【0108】
図4に示した結果は、強力構成性GAPプロモーターから発現した場合及び誘導性AOXIプロモーターから発現した場合のいずれにおいても大部分のHDELタグ化タンパク質は細胞内に保持されることを示す。
【0109】
1.4 α−1,2−マンノシダーゼの局在化
糖密度ショ糖密度勾配遠心分離−HDELタグ化マンノシダーゼの局在化を同定するために、強力構成性GAPプロモーター由来のマンノシダーゼ−Myc−HDELを発現する細胞を使用して細胞下分画を行った。
【0110】
簡単に述べれば、湿重量0.5gの酵母細胞を、1mlの溶解緩衝液(0.6Mソルビトール、10mMのβ−メルカプトエタノール、及び5mM MgCl2を含む50mM Tris−HCL(pH7.5))中の4.5gのガラスビーズとの4×1分間のボルテックスを使用して溶解した。ボルテックスの合間に、混合物を氷上に5分間に置いた。上清を回収し、ガラスビーズを溶解緩衝液で1回洗浄し、この洗浄工程の上清を第1の上清に添加した。この溶解物を、分画遠心法に供した。P10000ペレットを、溶解緩衝液に溶解した0.5mlの60%スクロース溶液中で溶解した。この溶液を、14×89mmのUltraclear超遠心分離チューブ(Beckman)の底に置いた。次いで、1.5mlの各スクロース溶液(55、50、45、42.5、40、及び37.5%)を、互いに伸長に重層した。チューブを、35%スクロースで端まで満たした。Beckman SW41ローターを備えたBeckmanモデルL8−70分離用超遠心分離機にて、180,000gで14時間糖密度ショ糖勾配遠心分離を行った。完了後、上部から1mlの画分を回収し、過剰なスクロースで部分透析し、真空遠心分離で蒸発乾燥させた。Laemmli緩衝液でのペレットの再溶解後、サンプルを3連でSDS−PAGEに供し、ウェスタンブロットをそれぞれ抗HA、抗Myc、または抗PDI(タンパク質ジスルフィドイソメラーゼについては「PDI」)で処理した。
【0111】
結果は、ほぼ正確にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼマーカータンパク質を有するMFManMycHDELタンパク質の共沈を示した(HDELシグナル配列でも標的化している)(図5)。同一のアッセイでは、HAタグ化OCH1は、全勾配に分布し、画分中で最も豊富な存在量は、マンノシダーゼ及びPDIを含む画分の存在量よりも低い密度であった。この結果は、マンノシダーゼがHDELシグナルの付加によって予想される位置(ER−ゴルジ境界)に標的されたことを示す。それに対して、誘導性アルコールキナーゼIプロモーター(GAPプロモーターと類似の強度である)から発現したHDELを含まないマンノシダーゼは、約20mg/lの高レベルで分泌された。
【0112】
免疫蛍光顕微鏡−マンノシダーゼ−Myc−HDELの標的化を正確に確認するために、免疫蛍光顕微鏡実験を行った。
【0113】
簡単に述べれば、酵母培養物を、YPD(pGAPZMFManMycHDELについて)またはpPICZBMFManMycHDELについてはYPグリセロール成長期の後でYMP中でOD600まで増殖させた。酵母培養物に最終濃度4%のホルムアルデヒドを添加し、室温で10分間インキュベートした。細胞をペレット化し、1mM MgCl2及び4%ホルムアルデヒドを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に再懸濁し、室温で2時間インキュベートした。ペレット化後、細胞を1mM MgCl2及びEDTA−free Complete(商標)プロテアーゼインヒビターカクテル(Boehringer Mannheim)を含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)でOD600=10に再懸濁した。100μlの細胞懸濁液に、0.6μlのβ−メルカプトエタノール及び20μlの20,000U/mlザイモリアーゼ 100T(ICN)を添加し、その後穏やかに震盪しながら25分間インキュベートした。細胞をインキュベーション緩衝液で2回洗浄し、ポリリジンコードカバースリップ(通常紙の穿孔の強化で使用される接着リングを使用してこれらを調製する)に添加した。過剰な液体を綿棒でブロットし、細胞を20℃で乾燥させた。全てのブロッキング、抗体インキュベーション、及び洗浄工程を、0.05%ウシ血清アルブミンを含むPBS中で行う。2μg/μlの一次抗体を使用し、5μg/μlの発蛍光団(Molecular probes)に接合した二次抗体を使用した。各を核酸色素HOECHST33258で染色した。固定及び細胞壁透過化後、酵母細胞形態学の完全性を位相差顕微鏡でチェックし、免疫染色後、スライドを、Kodakデジタルカメラを具備したZeiss Axiophot蛍光顕微鏡で実験した。画像をMcprobe4.0ソフトウェアで処理し、Corel Photopaint9.0で調製した。
【0114】
ゴルジマーカータンパク質OCH1−HAにより、文献に記載の典型的なゴルジ染色パターン(スペックル様染色)が得られた。マンノシダーゼ−Myc−HDELを認識する9E10モノクローナル抗Myc抗体での染色により、細胞質中のいくつかの異質染色を有する核周囲染色パターンが得られ、これはER標的を示す(図4)。
【0115】
上記実験に基づいて、トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)マンノシダーゼ−Myc−HDELがER−ゴルジ境界に標的化されたと結論付けられる。
【0116】
実施例2
組換え糖タンパク質でのマンノシダーゼ−HDELの同時発現。
【0117】
トリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)トランスシアリダーゼでのマンノシダーゼ−HDELの同時発現
C末端反復ドメインを含まない活性トランスシアリダーゼメンバーをコードするトリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)トランスシアリダーゼ遺伝子のクローニングは、Laroyら(Protein Expression and Purification、20、389、2000)(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。トリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)トランスシアリダーゼ遺伝子の配列は、NCBIGenbankの受け入れ番号AJ276679で利用可能である。P.パストリス(P.pastoris)での発現のために、全遺伝子を、pHILD2(Invitorogen、San Diego、CA)にクローン化して、pHILD2−TSを作製した。より良好に分泌させるために、トランスシアリダーゼを酵母α交配因子のプレプロ分泌シグナルに連結したpPIC9−TSを作製した。容易に検出及び精製するためにエピトープEタグをトランスシアリダーゼのC末端に付加したプラスミドpPIC9−TSE及びpCAGGS−プレプロ−TSEを作製した。pHILD2−TS、pPIC9−TSE、及びpCAGGS−プレプロ−TSEの構築は、Laroyら(2000)(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。構築で使用したベクターは、pCAGGSについてはhttp://www.belspo.be/bccm/lmbp.htm#main(番号LMBP2453)、pHILD2及びpPIC9についてはInvitrogen、San Diego、CA、ならびにpCANTAB−5EについてはPharmacia Biotechから利用可能であった。
【0118】
プラスミドpPIC9−TSEをSstIで線状化し、製造者の説明書に従ったエレクトロポレーションによって、P.パストリス(P.pastoris)GS115(his4)株に形質転換した。形質転換体の1つを、プラスミドpGAPZMFManHDELでさらに形質転換し、マンノシダーゼ−HDEL及びトリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)トランスシアリダーゼを同時発現する株を確立した。
【0119】
発酵及びタンパク質精製を、Laroyら(2000)に記載の手順に従って行った。
【0120】
精製トランスシアリダーゼを、Callwaertら、Glycobiology11、4、275から281、2001に従った炭水化物分析に供した。簡単に述べれば、糖タンパク質を、96ウェルプレートのウェル中のPVDF膜に結合させ、還元し、アルキル化し、ペプチド−N−グルコシダーゼF脱グリコシル化に供した。8−アミノ−1,3,6−ピレンスルホン酸を使用した還元的アミン化によってグリカンを誘導した。その後、過剰な遊離標識をSephadexG10パックスピンカラムを使用して除去し、グリカンをABI377A DNAシークエンサーの36cm配列決定ゲルでの電気泳動によって分析し、内蔵のアルゴンレーザーを使用して検出した。3mU/mlの精製T.レーセイ(T.reesei)のα−1,2−マンノシダーゼでの消化(Marasら、J.Biotechnol.、77、255から63、2000に記載)もまた、20mM酢酸ナトリウム(pH=5.0)中で行った。1μgの精製組換え糖タンパク質由来のグリカンを、基質として使用した。1Uのα−1,2−マンノシダーゼを、37℃でpH=5.0での1分あたりのパン酵母マンナンからの1μモルのマンノースを放出する酵素の量と定義する。
【0121】
図6で認められるように、パネルB、トランスシアリダーゼ上の主要なN−グリカンはMan8GlcNAc2(パネルFと比較して、ウシRNAseBのN−グリカン分析を示す。このプロフィール中の1つであるが最後のピークはMan8GlcNAc2であり、最初のピークはMan5GlcNAc2である)であった。インビトロでは、このグリカンは、αー1,2−マンノシダーゼでMan5GlcNAc2に消化可能であった(図6、パネルC)。マンノシダーゼ−HDELで同時発現したトランスシアリダーゼのN−グリカンプロフィールでは、主要ピークは、Man5GlcNAc2に対応する(図6、パネルD)。
【0122】
インフルエンザAウイルス赤血球凝集素とのマンノシダーゼ−HDELの同時発現
インフルエンザAウイルス赤血球凝集素は、ピキアパストリス(Pichiapastoris)において9から12個のマンノース残基を含む高マンノースN−グリカンでグリコシル化することが知られていた(Saelensら、Eur.J.Biochem.、260:166から175、1999)。赤血球凝集素のN−グリカンに対する同時発現マンノシダーゼの効果を、下記のN−グリカンプロファイリング法でアッセイした。さらに、トリコデルマ属(Trichoderma)酵素(至適温度60℃)と至適温度37℃の哺乳動物マンノシダーゼとの有効性を比較するために、マウスcDNAライブラリー由来のマウスマンノシダーゼIBの触媒ドメインをクローン化し、PCR増幅によってHDELシグナルでタグ化した。GAPプロモーターの存在下で、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配因子の後にプレプロシグナル配列このORFをクローン化した。mRNAレベルでのマンノシダーゼ−HDEL導入遺伝子の発現を、定量的ノーザンブロッティングによって確認した。
【0123】
Kulakoskyら、Glycobiology、8、741から745、1998に記載の手順に従って、赤血球凝集素を、非マンノシダーゼ発現コントロール株及びトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)マンノシダーゼ−HDELまたはマウスマンノシダーゼIB−HDELを同時発現する株から発現及び精製した。精製赤血球凝集素を、Saelensら、Eur.J.Biochem.、260、166から175、1999に記載のPNGaseF消化に供した。タンパク質及びグリカンを、3倍体積の氷冷アセトンで沈殿させ、グリカンを60%メタノールでペレットから抽出した。真空蒸発後、グリカンを、1μlの20mM APTSの1.2Mクエン酸溶液及び1M NaCNBH3のDMSO溶液の1:1混合物の添加及び250μlのPCRチューブの底での37℃で16時間のインキュベーションによって8−アミノ−1,3,6−ピレントリスルホン酸で標識した。10μlの脱イオン水の添加によって反応を停止させ、混合物を1.2cmのSephadex G10ベッド上にロードし、スイングバケットローター中での遠心分離によってマイクロスピンカラム中で乾燥させて、平らな樹脂表面を得た。ローディング後、50μlの脱イオン水を樹脂ベッドに慎重に添加し、スピンカラムを卓上遠心分離機にて750gで5分間簡単に遠心分離した。溶出工程を2回繰り返し、全ての溶出物をプールし、Speedvac真空遠心分離機(Savant)で蒸発乾燥させた。標識グリカンを、50%ホルムアミド及び0.5μlのGenescan500(商標)を含む1.5μlのゲルローディング緩衝液で再構成し、ローダミン(Perkin Elmer Bioscience)で標識し、内部標準として使用した。この混合物を、10%のアクリルアミド:ビスアクリルアミド(Biorad、Hercules、CA、USA)の19:1混合物を含むDNA配列決定ゲル上にロードし、標準DNA配列決定緩衝液(89mM Tris、89mM ホウ酸塩、2.2mM EDTA)中で作製した。ゲルの重合を、200μlの10%過硫酸アンモニウム水溶液及び20μlのTEMEDの添加によって触媒した。標準的な36cmの読み取りやすい長さであり、Applied Biosystemsモデル373A DNA配列決定装置で運転した。1000Vで15分間、ゲルの試運転を行い、ローディング後、ゲルを1250Vで8時間非加熱の電気泳動を行った。この方法の検出限度は、ピークあたり10fmolである。データを、Genescan3.0ソフトウェアで分析した。
【0124】
図7に示すように、トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼにおいては、N−グリカン上のα−1,2−マンノシダーゼ数がほとんど完全に減少した。マウスマンノシダーゼIB−HDELによって処理したN−グリカンは、トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)α−1,2−マンノシダーゼよりも有効性が低かった。
【0125】
赤血球凝集素のN−グリカンからのα−1,2−マンノシダーゼの有効な除去にもかかわらず、Man5GlcNAc2は得られなかった。3mUの精製トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼでのN−グリカンの消化後でさえも、最も小さな糖鎖としてMan6GlcNAc2は得られなかった。これらの結果は、おそらく残存する残基は、OCH1 α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性の開始に由来する、α−1,6結合マンノースであることを示した。OCH1はゴルジ装置の非常に初期の部分に局在し、Man8GlcNAc2前駆体のMan5GlcNAc2への完全な消化の前に赤血球凝集素のN−グリカンに作用し得る。したがって、グリカンがα−1,6−マンノシルトランスフェラーゼによって有効に修飾されたタンパク質については、トランスフェラーゼをコードするOCH1遺伝子の不活化は、Man5GlcNAc2を得るために望ましい。
【0126】
実施例3
ピキア属(Pichia) Och1遺伝子の不活化
ピキアパストリス(Pichia pastoris)配列は、Genbankの受け入れ番号E12456に見出され、日本国特願平07−145005(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。この配列は全てα−1,6−マンノシルトランスフェラーゼの典型的な特徴を示し、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のOCH1にほとんど相同であるので、本明細書中ではピキアパストリス(Pichia pastoris)のOch1遺伝子と呼ぶ。
【0127】
第1に、ピキアパストリス(Pichia pastoris)のOch1遺伝子の全長ORFをpUC18にPCRクローニングし、プラスミドpUC18pOch1を得た。pUC18pOch1を、HindIIIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端にし、XbaIで切断し、ピキアパストリス(Pichia pastoris)のOch1遺伝子の5’部分を含むフラグメントを遊離させた。このフラグメントを、EcoRIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端にし、NheIで切断したベクターpBLURA IX(Keck Graduate Institute、James Cregg博士、http:/www.kgi.edu/html/noncore/faculty/cregg/cregg.htm)にライゲーションした。このライゲーションにより、図8に記載のpBLURA5’PpPCH1が作製された。
【0128】
ピキア属(Pichia)ゲノム中でのこのピキア属(Pichia) OCH1遺伝子の破壊を、図9に例示のように、pBLURA5’PpOCH1を使用した1つの相同組換えによって行った。1つの相同組換えの結果として、ピキア属(Pichia)染色体上のOch1遺伝子は、以下の2つのOch1配列に置換された:一方は第1の1/3の長さのOch1 ORFからなり、他方はプロモーターを含まない全長Och1 ORFを有していた。1つの相同組換えを以下のように行った。ピキア属(Pichia)のyGC4株を、1つのカッターBstBIで線状化したpBLURA5’PpOCH1を使用したエレクトロポレーションによって形質転換した。1Mソルビトール、ビオチン、アルギニン、アデニン、及びヒスチジンを含み、27℃でインキュベートした最小培地に約500個の形質転換体が得られた。これらの形質転換体のうちの32個を取り出し、同一条件下で再選択した。PCRによってカセットの正確なゲノム組み込みについて12個のクローンをさらに分析した。12個のうち7個のURA栄養要求性クローンが正しい遺伝子座中にカセットを含んでいた。
【0129】
1つのOch1不活化クローンを、pGAPZMFManHDELで形質転換して、「超形質転換体」も作製した。Och1不活化クローン及びManHDELも発現する3つの超形質転換体の両方を、以下のように細胞壁グリカン分析で評価した。酵母細胞を10mlのYPDでOD600=2まで増殖させ、マンノタンパク質を、20mMクエン酸ナトリウム(pH7)中での120℃で90分間の酵母細胞のオートクレーブ及び遠心分離での上清の回収によって調整した。タンパク質を、この上清から3倍体積の冷メタノールで沈殿させた。この方法で得たタンパク質調製物を、Callewaertら、2001、Glycobiology、11、275から281に記載のDSA−FACEを使用したN−グリカン分析に使用した。図10に示すように、親yGC4株と比較してOch1不活化クローン中のMan8GlcNAc2グリカン量が増加し、これはOch1酵素活性の減少を示す。HDELタグ化α−1,2−マンノシダーゼも発現する3つ全ての超形質転換体では、Man5GlcNAc2の産生が認められた。さらに、3mU/mlの精製組換えトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼとのこのグリカン混合物消化の際、親株よりもpBLURA5’PpOCH1で形質転換した株えより多くのMan5GlcNAc2が形成された(図11、パネル2及び3との比較)。
【0130】
これらの結果により、α−1,2−マンノシダーゼを発現する細胞由来の赤血球凝集素などの組換え作製タンパク質におけるMan5グリカンの産生の欠如はOch1タンパク質の活性に起因することが確認された。これらの結果は、Man5グリカンでの糖タンパク質の産生を、Och1遺伝子の不活化によって容易にすることができることをさらに示す。
【0131】
実施例4
ピキアパストリス(Pichia pastoris)でのグルコシダーゼIIの発現
4.1 S.セレビシエ(S.cerevisiae)由来のGLSIIαサブユニットの増幅
Nucleonキット(Amersham)を使用して、S.セレビシエ(S.cerevisiae)INVS鎖(α、leu2−3、112 his3Δ1、trpl−289、ura3−52)からゲノムDNAを調製した。テンプレートとしてのこのゲノムDNA及びLA TaKaRaポリメラーゼ(ImTec Diagnostics)を使用して、タッチダウンPCR反応を行った。PCRプライマー配列は、以下の公知のS.セレビシエ(S.cerevisiae)GLSIIORF配列に基づいた:
【化1】
4.2 ピキアパストリス(Pichia pastoris)発現ベクターへのS.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコシダーゼII ORFのクローニング
グルコシダーゼII発現ベクターの構築−PCRフラグメントをXhoI/ApaIで消化し、pGAPZAベクター(Invitorgen)にライゲーションすることにより、GAPプロモーターの転写調節下にORFを置いた。このストラテジーを使用して、myc及びHis6タグを、グルコシダーゼIIのC末端にインフレームで置き、pGAPZAGLSIIを作製した。次いで、pGAPZAGLSIIの完全なORFを配列決定して、PCR反応物に変異が起こっていないことを確認した。ベクターpGAPZAGLSII配列を、配列番号18に示す。pGAPZAGLSII由来のGLSIIORFを、ベクターpPICZA(Invitrogen)にクローン化してpPICZAGLSIIを作製することにより、AOXIプロモーターの転写調節下にORFを置いた。pGAPZAGLSIIベクター由来のGLSII ORFを、ベクターpAOX2ZAにクローン化することにより、AOX2プロモーターの転写調節下にORFを置いた。ベクターpAOX2ZBのマルチクローニング部位のpPICZAのマルチクローニング部位への置換によって、このベクターを作製した。ベクターpAOX2ZBを、pPICZBのAOX1プロモーターのAOX2遺伝子のAOX2プロモーター起点の置換によって作製した(Martinetら、Biotechnology Letters、21)。AOX2プロモーター領域を、センスプライマー5’GACGAGATCTTTTTTTCAGACCATATGACCGG3’(配列番号26)及びアンチセンスプライマー5’GCGGAATTCTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGT3’(配列番号27)を使用したピキア属(Pichia)DNAについてのPCRによって作製した。pGAPZGLSIIベクター由来のGLSII ORFをベクターpYPT1ZAにクローン化して、pYPTIZAGLSIIを作製することによって、YPT1プロモーターの転写調節下にORFを置いた。ベクターpYPTZAを、pPICZAのAOX1プロモーターのプラスミドpIB3(Genbank受け入れ番号AF027960)に存在するYPT1プロモーターへの置換によって作製した(Searsら、Yeast14、783から790頁、1998)。全ての構築物は、フレオマイシン耐性遺伝子を含む。得られた最終発現ベクター(pGAPZAGLSII、pAOX2ZAGLSII、pPICZAGLSII、及びpYPT1ZAGLSII)を、図12から図15に示す。
【0132】
アンピシリン耐性マーカー及びピキア属(Pichia)ADE1選択マーカーを保有する類似の発現ベクターを構築した。原理的には、プラスミドpAOX2ZAGLSII、pGAPZAGLSII、及びpYPT1ZAGLSIIのゼオシン耐性発現カセットを、ベクターpBLADE IX(Cregg,J.M.)のアンピシリン及びピキア属(Pichia)ADEIカセットに置換して、ベクターpAOX2ADE1glsII、pGAPADE1glsII、及びpYPT1ADE1glsIIを得た。ベクターpPICADE1glsIIを、ベクターpBLADE IX(Cregg,J.M.)のマルチクローニング部位への挿入によってグルコシダーゼII読み取り枠の挿入によって得た。得られた最終発現ベクター(pGAPADE1glsII、pAOX2ADE1glsII、pPICADE1glsII、及びpYPT1ADE1glsII)を、図16から図20に示す。
【0133】
グルコシダーゼII発現ベクターへのER保持タグHDELの付加−以下のプライマーを使用して、HDEL含有PCRフラグメントを作製した:
【化2】
60℃でTaq polを使用して、pGAPZAGLSIIについてPCRを行った。225bpのPCRフラグメントを、SalI/SplIで切断し、SalI/SplI開環pGAPZAGLSIIベクターにライゲーションして、プラスミドpGAPZAglsIIHDELを作製した。プラスミドpGAPZAglsIIHDELを、配列番号24に示す。構築ストラテジー及び得られた最終発現ベクター(pGAPZAglsIIHDEL及びpGAPADE1glsIIHDEL)を、図20から図21に示す。
【0134】
4.3 ピキアパストリス(Picia pastoris)株の形質転換
Invitrogenに記載の従来のエレクトロポレーション技術を使用して、形質転換を行った。ピキアパストリス(Pichia pastoris)PPY12−OH株の細胞を、1つのカッターAvrIIで切断したpGAPZGLSIIで形質転換した。形質円歓待を、そのゼオシン耐性に基づいて選択した。
【0135】
形質転換体のゲノム分析−ゲノムDNAを、いくつかのゼオシン耐性ピキア属(Pichia)形質転換体から調製した。ゲノムDNAについてPCR反応を行って、グルコシダーゼII遺伝子が酵母ゲノムに組み込まれたかを同定した。Taq DNAポリメラーゼ(Boehinger)(アニーリングのために2.5mM MgCl2、55℃)を使用してPCRを行った。プライマーは、S.セレビシエ(S.cerevisiae)ゲノムDNAのORFの増幅で使用したものと同一であった。pGAPZAGLSII形質転換体を、グルコシダーゼIIのORFを示す特異的PCR産物の存在によって確認した。
【0136】
4.4 ピキアパストリス(Pichia pastoris)におけるS.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコシダーゼIαサブユニットの発現及び分泌
転写レベルでの分析−ゲノム分析後に陽性と記録された形質転換体からRNAを調製した。各サンプルから、15μgのRNAをホルムアルデヒドアガロースゲルにロードした。電気泳動後、RNAをHybond N膜にブロットした。膜を、グルコシダーゼII ORFの3’領域に対応する344bpのグルコシダーゼII特異的フラグメントからなる放射性プローブを使用してハブリッド形成させた。非形質転換株でシグナルは検出されなかったが、形質転換体では明白なシグナルが認められた。
【0137】
二重膜アッセイを使用したタンパク質レベルでの分析−ニトロセルロース膜を、緩衝化デキストロース培地(BMDY)に入れた。このニトロセルロース膜の上に、酢酸セルロース膜を置いた。pGAPZAGLSIIのピキア属(Pichia)形質転換体を、酢酸セルロース上に画線し、数日間増殖させた。酵母細胞は酢酸セルロース上にとどまるが、分泌タンパク質はこの膜を通過する。したがって、分泌タンパク質がニトロセルロース膜上に捕獲された。数日後、酵母コロニーを含む酢酸セルロースを取り出した。ニトロセルロース膜を、抗myc抗体を使用してグルコシダーゼIIの存在について分析した。野生型(WT)の非形質転換株のかすかで目視が困難なシグナルと比較して、ほとんどの形質転換体は明白なシグナルを発生した。
【0138】
細胞外発現−構築物pGAPZAGLSII(mychis6)のPPY12−OH形質転換体(12、14、及び18株)及び構築物pGAPZAGLSII(myc)HDELの形質転換体(H1、H2、及びH3株)を、2×10mlのBMDY培地上で2日間増殖させた。これらの6つの形質転換体は、ゲノムレベル(gDNAのPCR)おおびRNAレベル(ノーザンブロット)の両方でより早く陽性が記録された。培養培地を遠心分離によって回収し、ビバスピン(Vivaspin)カラムにて約1mlに濃縮した。この濃縮物由来のタンパク質をTCAで沈殿させ、Laemmli緩衝液で再懸濁し、SDS−PAGE分析のためにロードした。タンパク質を、ニトロセルロース膜にブロットした。ブロットを、抗myc抗体(Ab)と共に一晩インキュベートした。二次抗体(Ab)を、ペルオキシダーゼに結合させた。ルネッサンス発光検出キット(NEN)及び感光フィルム(Kodak)を使用して、形質転換体12、14、及び18において約110kDaの強力なバンドが認められ、GLSIIが発現し、これらの形質転換体から分泌されたことを示す。形質転換体H1から3についてはシグナルは得られず、これは、GLSII ORFにC末端を付加したHDELタグによりタンパク質のER局在化が得られ、成長培地へのGLSIIの分泌が阻止されたことを示す。
【0139】
細胞内発現−6つの形質転換体及びWT株を、500mlのBMDY中で2日間増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、洗浄し、最小体積(50mM Tris HCl(pH7.5)、5%グリセロール)に再懸濁し、ガラスビーズを使用して破壊した。細胞破片を、数回の遠心分離工程(低速遠心分離(2000から3000g))によって除去した。超遠心分離による上清から膜を得た。ペレットをLaemmli緩衝液に再懸濁し、SDS−PAGE分析のためにロードした。タンパク質を、ニトロセルロース膜上にブロットした。抗myc抗体(Ab)及びペルオキシダーゼ接合二次抗体(Ab)を使用して、細胞内GLSII発現をチェックした。発光検出後、GLSIIHDEL形質転換体(H1及びH3、H2はわずかなシグナル)については約110kDaのバンドが認められたが、WT及びGLSII発現株については認められなかった。これらの結果は、C末端HDELタグで発現した場合に組換えGLSIIが細胞内に存在することを示す。このタグが存在しない場合、GLSIIは検出されなかった。
【0140】
4.5 組換えグルコシダーゼIIαサブユニットの精製及び活性アッセイ
以下のようにGLSIIアッセイを準備し、ポジティブコントロールとして市販の酵母α−グルコシダーゼ(Sigma)を使用して試験した。
【0141】
組成:70μlの80mMリン酸−クエン酸緩衝液(pH6.8)、7μlの250mMマンノース、3.5μlの250mM 2−デオキシ−D−グルコース、0.8μlの4−メチルウンベリフェリル−α−D−グルコピラノシド(1μM)。以下の3つのアッセイを行った:1単位の市販の酵素を使用したアッセイ、酵素を使用しないアッセイ、及び酵素を使用するが基質を使用しないアッセイ。アッセイ混合物を30℃で一晩インキュベートした。UVで発光した場合、酵素及び基質の両方を含む反応混合物は、蛍光を示した(図22)。これは、アッセイはαグルコシダーゼ活性の検出に非常に特異的であることを示す。
【0142】
WTPPY12−OHの18株及びH3株を、2×10mlの成長培地で2日間増殖させた。細胞をスピンして沈殿させ、培地を30mMのNaCl及び10mMのイミダゾールで調整し、ビバスピン(Vivaspin)カラムで0.5から1mlに濃縮した。培地をNi−NTAスピンカラム(Qiagen)にロードし、製造者の説明にしたがって精製を行った。タンパク質を、2×100μlの溶出緩衝液(50mMのNaH2PO4、300mMのNaCl、250mMのイミダゾール(H8.0))にてカラムから溶出させた。各溶出物から、20μlをそのグルコシダーゼII活性についてアッセイした。20μlの溶出緩衝液で希釈した0.33単位の市販の酵素を、ポジティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロール及び18株(培地に酵素が分泌された株)の溶出物で蛍光が認められた。これらの結果は、ピキアパストリス(Pichia pastoris)から分泌された組換えS.セレビシエ(S.cerevisiae)のGLSIIαサブユニットが機能的に活性な酵素であることを示す。WT(非形質転換)株及びGLSIIが細胞内で発現されなかったH3株では活性は認められなかった(図23)。これらの結果はまた、βサブユニットは、タンパク質のα部分の機能性に必要ではないことを示す。
【0143】
実施例5
グルコシダーゼII及びマンノシダーゼの両方を発現するピキア属(Pichia)株の作製。
【0144】
GS115株を、pGAPZGLSII及びpGAPZglsIIHDELで形質転換した。形質転換体を、YPDSzeo上で選択した。
【0145】
yGC4株を、それぞれ以下の構築物で形質転換した。
【0146】
(1)pGAPADEglsII及びpGAPADEglsIIHDEL(アデニンを含まない合成ソルビトール培地での選択)、
(2)pGAPZMFManHDEL(YPDSzeoでの選択)、
(3)pGAPZMFManHDEL/pGAPADEglsIIHDEL(アデニン及びゼオシンを含まない合成ソルビトール培地での選択)。
【0147】
OCH1ノックインを有し、且つMFマンノシダーゼHDELを発現するyGC4株を、pGAPADEglsII及びpGAPADEglsIIHDELで形質転換した。形質転換体の選択を、アデニン及びウラシルを含まない合成ソルビトール培地で行った。
【0148】
全ての形質転換体について、クローンが得られた。PCRによって同定したゲノムに組み込まれた発現ベクターを含む形質転換対が得られた。これらのいくつかの形質転換体由来のGLSII発現が認められた。
【0149】
【化3】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1はHDELタグ化トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)α−1,2−マンノシダーゼ発現カセットを保有するベクター示し、これらのベクターを当該分野で公知の方法に従って構築する方法を説明している。構築スキームを通して使用した略語を以下に示す:5’AOX1またはAOX1P:ピキアパストリス(Pichia pastoris) AOX1プロモーター配列;AmpR:アンピシリン耐性遺伝子;ColE1:ColE1複製起点;3’AOX1:ピキアパストリス(Pichia pastoris)AOX1遺伝子の3’配列;HIS4:ピキアパストリス(Pichia pastoris)のHIS4遺伝子;AOX TT:ピキアパストリス(Pichia pastoris) AOX1遺伝子の転写終止配列;ORF:読み取り枠;S:分泌シグナル;P TEF1:サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)転写延長因子1遺伝子のプロモーター配列;P EM7:合成構成原核生物プロモーターEM7;Zeocin:ゼオシン耐性遺伝子;CYC1 TT:S.セレビシエ(S.cerevisiae) CYC1遺伝子の3’末端;GAP:ピキアパストリス(Pichia pastoris)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列;PpURA3:ピキアパストリス(Pichia pastoris)URA3遺伝子。この図で認められるように、トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)α−1,2−マンノシダーゼをS.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配因子分泌シグナル配列のコード配列に作動可能に連結させ、コード配列の3’末端でHDELペプチドのコード配列にさらに作動可能に連結させた。全融合構築物を、P.パストリス(P.pastoris) AOX1プロモーター(pPIC9MFManHDEL中)またはP.パストリス(P.pastoris)GAPプロモーター(pGAPZMFManHDEL中)のいずれかに作動可能に連結させた。
【図2】 図2はHDELタグ化マウス(Mus musculus)のα−1,2−マンノシダーゼIB発現カセットを保有するベクターを示し、これらのベクターを当該分野で公知の方法に従って構築する方法を説明している。この図で認められるように、マウス(Mus musculus)のα−1,2−マンノシダーゼIBをS.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配因子分泌シグナル配列のコード配列に作動可能に連結させ、コード配列の3’末端でHDELペプチドのコード配列にさらに作動可能に連結させた。全融合構築物を、P.パストリス(P.pastoris) AOX1プロモーター(pPIC9mManHDEL中)またはP.パストリス(P.pastoris)GAPプロモーター(pGAPZmManHDEL中)のいずれかに作動可能に連結させた。さらに、cMycエピトープタグのコード配列がS.セレビシエ(S.cerevisiae)のα交配因子分泌シグナル配列のコード配列とマウス(Mus musculus)のα−1,2−マンノシダーゼIBの触媒ドメインのコード配列との間に挿入された発現カセットの変異体を作製した。この発現カセットを、P.パストリス(P.pastoris) AOX1プロモーター(pPIC9mMycManHDEL中)またはP.パストリス(P.pastoris)GAPプロモーター(pGAPZmMycManHDEL中)のいずれかにも作動可能に連結させた。
【図3】 図3はMycHDELタグ化トリコデルマレーセイ(Trichodermareesei)のα−1,2−マンノシダーゼを保有するベクター及びこれらのベクターを得る方法を示す図である。得られた融合構築物物を、P.パストリス(P.pastoris) AOX1プロモーター(pPICZBMFManMycHDEL中)またはP.パストリス(P.pastoris)GAPプロモーター(pGAPZMFManMycHDEL中)のいずれかに再度作動可能に連結させた。
【図4】 図4はMycHDELタグ化トリコデルマレーセイ(Trichodermareesei)のα−1,2−マンノシダーゼの細胞内局在化及び免疫蛍光分析によるERタグ化を示す図である。パネルA:ウェスタンブロッティング。酵母株を10ml YPG培養にてOD600=10まで増殖させ、5倍希釈し、YPM中で48時間増殖させた。1/50の培養培地及び1/65の細胞を、SDS−PAGE及びマウスモノクローナル9E10抗Myc抗体を使用したウェスタンブロッティングで分析した。分子量マーカータンパク質の位置を、矢印で示す。レーン1から5:細胞溶解物。1,2;pGAPZMFManMycHDEL形質転換体。3:非形質転換PPY12OH(ネガティブコントロール)。4,5:pPICZBMFManMycHDEL形質転換体。レーン6から10:培養培地。6:非形質転換PPY12OH(ネガティブコントロール)。7,8:pGAPZMFManMycHDEL形質転換体。9,10:pPICZBMFManMycHDEL形質転換体。パネルB:免疫蛍光顕微鏡法。1:P.パストリス(P.pastoris)細胞(pGAPZMFManHDELで形質転換したPPY12OH株)の位相差画像(1000倍)。核は、細胞の右下の四分円中に楕円として認められる。2:1と同一であるが、T.レーセイ(T.reesei)マンノシダーゼ−Myc−HDELタンパク質の局在化を示すために蛍光顕微鏡モードで示した細胞である。このタンパク質は、主に、小胞体の静止期分布に典型的な核周囲(核包膜)に円形に分布して局在化している。3:P.パストリス(P.pastoris)細胞(pGAPZMFManHDELで形質転換したPPY12OH株)の位相差画像(1000倍)。4:P.パストリス(P.pastoris)PPY12OH株におけるゴルジマーカータンパク質OCH1−HAの局在化を示すための蛍光顕微鏡で示した同一の細胞。細胞あたり3から4個の点を含む細胞質を通した斑点様分布は、P.パストリス(P.pastoris)におけるシスゴルジ分布に典型的である。
【図5】 図5はショ糖密度勾配遠心分離におけるマンノシダーゼ−MycHDELのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時沈降を示す図である。上のパネルは、OCH1−HAゴルジマーカータンパク質のショ糖勾配の異なる画分での分布を示す。中央のパネルは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ小胞体マーカータンパク質の分布を示す。最後に、下のパネルは、同一の画分におけるMycHDELタグ化トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)α−1,2−マンノシダーゼの分布を示す。マンノシダーゼMycHDELは、ERマーカーPDIの分布と正確に一致するので、主にピキアパストリス(Pichia Pastoris)酵母細胞のER中に存在すると結論付ける。
【図6】 図6はトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)マンノシダーゼ−HDELと同時発現したトリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)トランスシアリダーゼのN−グリカン分析を示す図である。パネルA:マルト−オリゴサッカリドのサイズ基準ラダー。グリカンのサイズを、その電気泳動移動度とこれらのマルト−オリゴサッカリドの移動度との比較によるグルコース単位(GU)で示す。パネルB:ピキアパストリス(Pichia Pastoris)で発現した組換えトリパノソーマクルーズ(Trypanosoma cruzi)のトランス−シアリダーゼ由来のN−グリカン。GU=9,2でのピークは、Man8GlcNAc2に対応する。パネルC:パネル2と同一であるが、3U/mlの精製組換えT.レーセイ(T.reesei)のα−1,2−マンノシダーゼでの一晩の処理後の分析。パネルD:ピキアパストリス(Pichia pastoris)においてT.レーセイ(T.reesei)マンノシダーゼ−HDELと同時発現した組換えトランス−シアリダーゼ由来のN−グリカン(GAPプロモーターの調節下)。GU=7,6でのピークは、RNアーゼBのプロフィールにおけるMan5GlcNAc2ピークに対応する(パネルF)。パネルE:パネルDと同一であるが、3U/mlの精製組換えT.レーセイ(T.reesei)のα−1,2−マンノシダーゼでの一晩の処理後の分析。パネルF:ウシRNアーゼB由来のN−グリカン。これらのグリカンは、Man5GlcNAc2からMan8GlcNAc2からなる。異なる異性体は分割され、Man7GlcNAc2のピーク数が計上される。
【図7】 図7はHDELタグ化トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)のα−1,2−マンノシダーゼ及びマウスα−1,2−マンノシダーゼIBのHDELタグ化触媒ドメインによるインフルエンザ赤血球凝集素N−グリカンのプロセシングを示す図である。Man5GlcNAc2基準オリゴサッカリドは、本分析においてスキャン1850で運転する(示さず)。パネル1:マルト−オリゴサッカリドサイズ基準ラダー。パネル2:ピキアパストリス(Pichia pastoris)で発現した組換えインフルエンザ赤血球凝集素由来のN−グリカン。スキャン2250でのピークは、Man9GlcNAc2に対応する。パネル3:ピキアパストリス(Pichia pastoris)においてT.レーセイ(T.reesei)マンノシダーゼ−HDELと同時発現した組換え赤血球凝集素由来のN−グリカン(GAPプロモーターの調節下)。スキャン1950でのピークは、Man6GlcNAc2に対応する。パネル4:パネル3と同一であるが、30mUの精製組換えT.レーセイ(T.reesei)のα−1,2−マンノシダーゼとの一晩の処理後の分析。パネル5:ピキアパストリス(Pichia pastoris)においてマウスマンノシダーゼIB−HDELと同時発現した組換え赤血球凝集素由来のN−グリカン(GAPプロモーターの調節下)。パネル6:パネル5と同一であるが、30mUの精製組換えT.レーセイ(T.reesei)のα−1,2−マンノシダーゼとの一晩の処理後の分析。
【図8】 図8はベクターpBLURA5’PpOCH1及びその構築法を示す図である。
【図9】 図9はpBLURA5’PpOCH1を使用した1つの相同組換えによるピキアパストリス(Pichia pastoris) OCH1遺伝子破壊のスキームである。
【図10】 図10はOch1不活化クローン及びpGAPZMFManHDELでの形質添加によるこのOch1不活化クローン由来の3つのクローンの細胞壁糖タンパク質N−グリカンの分析を示す図である。パネル1は、マルト−オリゴサッカリド混合物の分析を示し、その重合度を図の一番上に数字で示す。この分析は、他のパネルのサイズ基準として使用する。全てのパネルの縦軸に、相対蛍光単位におけるピーク強度を示す。パネル2から6:以下の株の細胞壁糖タンパク質N−グリカンの分析:パネル2、非操作P.パストリス(P.pastoris)yGC4株;パネル3、pBLURA5’PpOch1で形質転換したyGC4;4から6、pGAPZMFManHDELで補足的に形質転換した。パネル7:Man5−9GlcNAc2の混合物からなるウシRNアーゼB由来のN−グリカン。パネル2と3とパネル7の基準との比較から認められるように、pBLURA5’PpOch1での形質転換により、OCH1pのMan8GlcNAc2基質N−グリカン(パネル2ではピーク1と呼ぶ)存在量が非常に増加する。ピーク2は、OCH1pのMan9GlcNAc2産物を示す。さらに、pGAPZMFManHDELの補足的形質転換の際、3つの独立したクローンの細胞壁糖タンパク質の主要なグリカンは、Man8GlcNAc2基質のT.レーセイ(T.reesei)のα−1,2−マンノシダーゼ消化のMan5GlcNAc2最終生成物(パネル4のピーク3)である。
【図11】 図11は図10と同一のグリカン混合物であるが、20mM酢酸ナトリウム(pH=5.0)で一晩の3mU/mlの精製トリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei) アルファ−1,2−マンノシダーゼでのインビトロ消化後の分析。軸の割り当ては、図10と同一である。親株(パネル2)よりもpBLURA5’PpOch1形質転換株(パネル)の方がより多くのMan5GlcNAc2を形成する。スキャン3900前の全てのパネルのピークは汚染物質に由来し、分析では無視すべきである。
【図12】 図12は発現ベクターpGAPZAGLSII(配列番号18)を示す図である。P TEF1:S.セレビシエ(S.cerevisiae)転写伸長因子遺伝子のプロモーター。P Em7:合成原核プロモーター。Zeocin:ゼオシン耐性マーカー遺伝子。CYC1 TT:S.セレビシエ(S.cerevisiae)シトクロムCl遺伝子の転写ターミネーター。Col E1:細菌の複製起点。GAP:P.パストリス(P.pasttoris) GAP遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図13】 図13は発現ベクターpAOX2ZAGLSII(配列番号16)を示す図である。P TEF1:S.セレビシエ(S.cerevisiae)転写伸長因子遺伝子のプロモーター。P Em7:合成原核プロモーター。Zeocin:ゼオシン耐性マーカー遺伝子。CYC1 TT:S.セレビシエ(S.cerevisiae)シトクロムCl遺伝子の転写ターミネーター。Col E1:細菌の複製起点。AOX2 P:P.パストリス(P.pastoris) AOX2遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図14】 図14は発現ベクターpPICZAGLSII(配列番号20)を示す図である。P TEF1:S.セレビシエ(S.cerevisiae)転写伸長因子遺伝子のプロモーター。P Em7:合成原核プロモーター。Zeocin:ゼオシン耐性マーカー遺伝子。CYC1 TT:S.セレビシエ(S.cerevisiae)シトクロムCl遺伝子の転写ターミネーター。Col E1:細菌の複製起点。AOX1 P:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図15】 図15は発現ベクターpYPT1ZAGLSII(配列番号22)を示す図である。P TEF1:S.セレビシエ(S.cerevisiae)転写伸長因子遺伝子のプロモーター。P Em7:合成原核プロモーター。Zeocin:ゼオシン耐性マーカー遺伝子。CYC1 TT:S.セレビシエ(S.cerevisiae)シトクロムCl遺伝子の転写ターミネーター。Col E1:細菌の複製起点。P YPT1:P.パストリス(P.pastoris) YPT1遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図16】 図16は発現ベクターpGAPADE1glsII(配列番号19)を示す図である。Amp R:アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ADE1:P.パストリス(P.pastoris) ADE1選択マーカー遺伝子。GAP:P.パストリス(P.pasttoris) GAP遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図17】 図17は発現ベクターpAOX2ADE1glsII(配列番号17)を示す図である。Amp R:アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ADE1:P.パストリス(P.pastoris) ADE1選択マーカー遺伝子。AOX2 P:P.パストリス(P.pastoris) AOX2遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図18】 図18は発現ベクターpPICADE1glsII(配列番号21)を示す図である。Amp R:アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ADE1:P.パストリス(P.pastoris) ADE1選択マーカー遺伝子。AOX1 P:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図19】 図19は発現ベクターpYPT1ADE1glsII(配列番号23)を示す図である。Amp R:アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ADE1:P.パストリス(P.pastoris) ADE1選択マーカー遺伝子。P YPT1:P.パストリス(P.pastoris) YPT1遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図20】 図20は発現ベクターpGAPZAglsIIHDEL(配列番号24)を示す図である。Amp R:アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ADE1:P.パストリス(P.pastoris) ADE1選択マーカー遺伝子。GAP:P.パストリス(P.pastoris)GAP遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図21】 図21は発現ベクターpGAPADE1glsIIHDEL(配列番号25)を示す図である。P TEF1:S.セレビシエ(S.cerevisiae)転写伸長因子遺伝子のプロモーター。P Em7:合成原核プロモーター。Zeocin:ゼオシン耐性マーカー遺伝子。CYC1 TT:S.セレビシエ(S.cerevisiae)シトクロムCl遺伝子の転写ターミネーター。ColE1:細菌の複製起点。Co1 E1:細菌の複製起点。GAP:P.パストリス(P.pasttoris) GAP遺伝子のプロモーター。GLS2:S.セレビシエ(S.cerevisiae)グルコースII遺伝子。AOX1 TT:P.パストリス(P.pastoris) AOX1遺伝子の転写ターミネーター。
【図22】 図22は市販の酵母α−グルコース(Sigma:カタログ番号G−5003)を使用したGLSII活性アッセイ試験を示す図である。アッセイ混合物は、リン酸−クエン酸緩衝液(pH6.8)、マンノース、2−デオキシ−D−グルコース、基質4−メチルウンベリフェリル−α−D−グルコピラノシド、及びSigmaのα−グルコシダーゼを含む。1:37℃で一晩のインキュベーション後のUV光で発光させたアッセイ混合物。2:1と同一であるが、アッセイ混合物はα−グルコシダーゼ3を欠く。3:1と同一であるが、この場合、アッセイ混合物は基質を欠く。
【図23】 図23はピキアパストリス(Pichia pastoris)から組換え発現したGLSIIの活性の結果を示す図である。全てのアッセイ混合物を37℃でインキュベートし、その後UV光で発光させた。1:酵母α−グルコシダーゼ(Sigma:カタログ番号G−5003)を使用したあせい。2:株18(pGAPZAGLSIIで形質転換したPPY12−OH)の精製培地を使用したアッセイ。3:WT PPY12−OH株の精製培地を使用したアッセイ。4:株H3(pGAPZAglsIIHDELで形質転換したPPY12−OH)の精製培地を使用したアッセイ。
Claims (20)
- 遺伝子組換えされたメチロトローフ酵母株であって、前記酵母株においてα−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分の発現を可能にするベクターで形質転換されており、前記ベクターは前記α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含み、また前記酵母株における機能的Och1タンパク質の生産ができないように前記酵母株のゲノムOch1遺伝子が破壊されている、メチロトローフ酵母株。
- 前記α−1,2−マンノシダーゼが真菌種由来である、請求項1に記載の酵母株。
- 前記真菌類種がトリコデルマレーセイ(Trichoderma reesei)である、請求項2に記載の酵母株。
- 前記α−1,2−マンノシダーゼが哺乳動物種由来である、請求項1に記載の酵母株。
- 前記α−1,2−マンノシダーゼが、マウスα−1,2−マンノシダーゼIAまたはIBである、請求項4に記載の酵母株。
- 前記α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分がER保持シグナルでタグ化されている、請求項1に記載の酵母株。
- 前記ER保持シグナルがペプチドHDELを含む、請求項6に記載の酵母株。
- 前記α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列が、プロモーター及び3’末端配列に作動可能に連結されている、請求項1に記載の酵母株。
- 前記プロモーターが、AOXI、AOXII、GAP、及びFLDからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、請求項8に記載の酵母株。
- メチロトローフ酵母のグルコシダーゼIIまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターによってさらに形質転換されている、請求項1に記載の酵母株。
- 前記グルコシダーゼIIが真菌種由来である、請求項10に記載の酵母株。
- 前記真菌種がサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項11に記載の酵母株。
- 前記グルコシダーゼIIが哺乳動物種由来である、請求項10に記載の酵母株。
- 前記グルコシダーゼIIまたはその機能的部分がER保持シグナルでタグ化されている、請求項10に記載の酵母株。
- 前記ER保持シグナルがペプチドHDELを含む、請求項14に記載の酵母株。
- 前記α−1,2−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列がプロモーター及び3’末端配列に作動可能に連結されている、請求項10に記載の酵母株。
- 前記プロモーターが、AOXI、AOXII、GAP、及びFLDからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、請求項16に記載の酵母株。
- 異種糖タンパク質をコードし発現できる核酸配列でさらに形質転換されている、請求項1〜17のうちいずれか1項に記載の酵母株。
- 請求項1〜18のうちいずれか1項に記載の任意の酵母株を含む、キット。
- メチロトローフ酵母においてグリコシル化が減少した糖タンパク質を生産する方法であって、請求項1〜18のうちいずれか1項に記載の遺伝子組換えされた前記メチロトローフ酵母の株を得る工程と、前記酵母株から糖タンパク質を産生する工程とを含む方法。
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