KR20030074117A - 피히아 파스토리스에서의 단백질 글리코실화 변형 - Google Patents

피히아 파스토리스에서의 단백질 글리코실화 변형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리코실화가 감소된 단백질을 생산할 수 있도록 유전적으로 조작된 피히아(Pichia) 균주를 제공한다. 특히, 본 발명의 유전적으로 조작된 균주는 α-1,2-만노시다제 및 글루코시다제 II 중 어느 하나 또는 이들 모두를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 유전적으로 조작된 균주를 OCH1 유전자를 파괴시키도록 추가적으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 유전적으로 조작된 피히아(Pichia) 균주를 사용하여 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

피히아 파스토리스에서의 단백질 글리코실화 변형{PROTEIN GLYCOSYLATION MODIFICATION IN PICHIA PASTORIS}
피히아 파스토리스(Pichia Pastoris)를 포함하는 메틸요구성 효모는 상업적 또는 의약적으로 중요한 재조합 단백질을 생산하기 위하여 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 몇 몇 치료적 당단백질의 생산 및 의약적 적용은 이들 효모와 포유 동물과 같은 표적 생물 사이의 단백질-결합(protein-linked) 탄수화물 생분해에 있어서의 차이점들에 의하여 제한될 수 있다.
단백질 N-글리코실화는 돌리콜(dolichol, 지질 담체 중간체) 상에 조립된 N-결합 올리고사카라이드(Glc3Man9GlcNAc2)가 발생기 단백질(nascent protein)의 적절한 아스파라긴(Asn)에 전달되는 장소인 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 유래한다. 이는 모든 진핵 생물 N-결합 당단백질에 공통적인 현상이다. ER 내의 특정 글루코시다아제 및 α-1,2-결합 만노시다제에 의하여 3 개의 글루코스 잔기 및 하나의 특정 α-1,2-결합 만노스 잔기가 제거되어, 중심(core) 올리고사카라이드 구조, Man8GIcNAc2가 된다. 이러한 중심 당 구조가 당 부분이 다양한 변형을 거치는 골지체로 운반된다. 효모와 고등 진핵 생물 간의 골지체 내 당 사슬의 변형에 있어서 상당한 차이점이 있다.
표유류 세포에 있어서, 당 사슬의 변형은 그것이 첨가될 단백질 부분에 따라 3 가지의 다른 경로를 거쳐서 진행된다. 즉, (1) 중심 당 사슬을 변형시키지 않거나; (2) UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-GlcNAc) 내의 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 부분(GlcNAc-1-P)을 중심 당 사슬 내 만노스의 6-위치에 첨가하여 중심 당 사슬을 변형시킨 후, GIcNAc 부분을 제거하여, 당 단백질 내에 산성 당 사슬을 형성시키거나; 또는 (3) 우선 만노시다제 I로 3 개의 만노스 잔기를 제거하여 중심 당 사슬이 Man5GlcNAc2로 전환시키고; GIcNAc를 첨가하고 2 개의 만노스 잔기를 추가적으로 제거한 후, GIcNAc, 칼락토오스(Gal) 및 N-아세틸뉴라민산((NeuNAc, 시알산이라고도 불림)을 연속적으로 첨가하여 다양한 혼성(hybrid) 또는 복합(complex) 당 사슬을 형성함으로써 Man5GlcNAc2를 추가적으로 변형시킨다(R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664,1985; ChibaetalJ. Biol. Chem. 273: 26298-26304,1998).
효모에 있어서, 골지체 내에서의 당 사슬의 변형은 상이한 만노실트랜스퍼라제(mannosyltransferases)에 의한 일련의 만노스 잔기의 추가를 수반한다("외부 사슬(outer chain)" 글리코실화). 외부 사슬 글리코실화의 구조는 생물에 따라 특유하여, S. cerevisiae에서는 전형적으로 50 개 이상의 만노스 잔기를 가지며, Pichia pastoris에서는 가장 일반적으로 Manl4GlcNAc2보다 작은 구조를 갖는다. 이러한 고 만노스 타입의 효모-특이적 외부 사슬 글리코실화는 또한 과글리코실화(hyperglycosylation)를 나타낸다.
과글리코실화는 탄수화물 조성과 분자량 모두에 있어서 재조합 단백질 산물의 이질성을 초래하여 단백질 정제를 복잡하게 할 것이기 때문에 종종 바람직하지 못하다. 과글리코실화된 효소의 특유한 활성(유니트/중량)이 탄수화물의 증가된 부분에 의하여 감소될 수 있다.
또한, 외부 사슬 글리코실화는 강력한 면역성이어서 치료적 적용에 바람직하지 못하다. 게다가, 많은 외부 사슬 당은 치료적 단백질의 면역성 결정자(determinant)를 마스킹(mask) 할 수 있다. 예컨대, 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 발현되는 인플루엔자 뉴라미니다아제(influenza neuraminidase, NA)는 만노오스 잔기를 30-40개 까지 포함하는 N-클리칸으로 글리코실화된다. 과글리코실화된 NA는, NA 분자 위에 가변성의 면역우성 표면 루프가 N-글리칸에 의하여 마스킹되어 있어서, 쥐에서 감소된 면역원성(immunogenicity)을 갖는다(Martinet et al. Eur J. Biochem. 247: 332-338,1997).
따라서, 단백질의 글리코실화가 조절될 수 있고, 많은 N-글리칸 측쇄들에 의하여 구조 또는 기능이 손상되지 않은 재조합 단백질이 생성될 수 있는 메틸요구성 효모 균주를 유전적으로 조작하는 것이 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 메틸요구성 효모 균주에서의 글리코실화 과정을 유전적으로 변형시켜 글리코실화가 감소된 당단백질을 제조하기 위하여 사용되는 방법 및 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법 및 벡터를 사용하여 생성된 메틸요구성 효모 균주 및 이러한 유전적으로 변형된 균주로부터 생산되는 당단백질을 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 메틸요구성 효모 균주를 제조하는데 유용한 벡터를 제공한다.
한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 메틸요구성 효모 균주에 의하여 생산되는 당단백질에서의 글리코실화의 감소를 초래하는 효소활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질을 메틸요구성 효모균주에서 발현시킬 수 있는 녹-인(knock-in) 벡터를 제공한다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 녹-인 벡터는 α-1,2-만노시다제 또는 그것의 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, α-1,2-만노시다제 또는 그것의 기능적 부분을 메틸요구성 효모 균주 내에서 발현시킬 수 있다. 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 진균류(fungal species)의 α-1,2-만노시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이며, 보다 바람직하게는, 트리코데르마레세이(Trichoderma reesei)의 α-1,2-만노시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 바람직하게, α-1,2-만노시다제 발현 벡터는 벡터로부터 발현되는 α-1,2-만노시다제 또는 그것의 기능적 부분이 ER-체류 신호(ER-retention signal)를 포함하도록 조작된다. 바람직한 ER-체류 신호는 HDEL이다. α-1,2-만노시다제 코딩 서열은 구성성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터, 및 3' 종결 서열과 연결되어 조작될 수 있다. 벡터는 통합성(integrative) 벡터 또는 복제성(replicative) 벡터일 수 있다. 특히, α-1,2-만노시다제 발현 벡터는 pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL, pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL 및 pGAPZmMycManHDEL를 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 녹-인 벡터는 글루코시다제 II 또는 그것의 기능적 부분을 코딩하는 서열을 포함하고, 메틸요구성 효모 균주에서 글루코시다제 II 또는 그것의 기능적 부분을 발현시킬 수 있다. 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 진균류의 글루코시다제 II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이며, 보다 바람직하게는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 글루코시다제 II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 바람직하게, 글루코시다제 II 발현 벡터는 벡터로부터 발현된 글루코시다제 II 또는 그것의 기능적 부분이 ER-체류 신호를 포함하도록 조작된다. 바람직한 ER-체류 신호는 HDEL이다. 글루코시다제 II 코딩 서열은 구성성 또는 유도성 프로모터, 및 3' 종결 서열과 연결되어 조작될 수 있다. 벡터는 통합성(integrative) 벡터 또는 복제성(replicative) 벡터일 수 있다. 특히 바람직한 글루코시다제 II 발현벡터는 pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII, pGAPADEglsII, pPICADEglsII, pAOX2ADEglsII, pYPTIADEglsII, pGAPZAgIsIIHDEL 및 pGAPADEglsIIHDEL를 포함한다.
또한, 본 발명은 α-1,2-만노시다제 발현 단위와 글루코시다제 II 발현 단위를 모두 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은, 메틸요구성 효모 균주 내로 도입되었을 때, 유전자를 불활성화시키거나 파괴하고, 이에 의하여 메틸요구성 효모 균주에서 생산된 당단백질의 글리코실화의 감소를 용이하게 하는, 녹-아웃(Knock-out) 벡터를 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 메틸요구성 효모 균주 내로 도입되었을 때, Och1 유전자를 불활성화시키거나 파괴시키는 녹-아웃 벡터를 제공한다. 바람직한 Och1 녹-아웃 벡터는 pBLURA5'PpOCHl이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 녹-인 단위와 녹-아웃 단위를 모두 포함하는 벡터를 제공한다.
게다가, 본 발명의 모든 녹-인 또는 녹-아웃 벡터는 메틸요구성 효모에 있어서 중요한 이종 단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 효모를 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터로 형질전환시킴으로써, 메틸요구성 효모에서의 글리코실화를 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법을 사용하여 변형될 수 있는 메틸요구성 효모 균주는, 칸디다속(genusCandida), 한세눌라속(genusHansenula), 토룰롭시스속(genusTorulopsis), 및 피히아속(genusPichia)효모와 같이, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모 균주들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 메틸요구성 효모는 피히아속(genusPichia)이다. 특히 바람직한 균주는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주 GS115(NRRL Y-15851), GS190(NRRL Y-18014), PPFI(NRRL Y18017), PPY120H, yGC4, 및 이들로부터 유래되는 균주이다. 본 발명의 방법에 의하여 변형된 메틸요구성 효모 균주는 하나 이상의 중요한 이종 단백질을 발현시키도록 조작된 이들 메틸요구성 효모 균주들을 또한 포함한다. 미리 유전적으로 조작된 이들 균주들로부터 발현되는 이종 단백질 상에서의 글리코실화는 이러한 균주들을 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터로 형질전환시킴으로써 감소될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 방법의 수행으로 변형된 메틸요구성 효모 균주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
이러한 방법에 따른면, 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터를 이용하여 미리 형질전환시킨 메틸요구성 효모 균주 내로 도입시킬 수 있다. 또한, 당단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 메틸요구성 효모 균주를 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터를 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 게다가, 메틸요구성 효모 균주가 발현시키고자 하는 당단백질을 코딩하는뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명에 따른 벡터 중 어떤 것을 사용하여서도 형질전환되지 않았다면, 이러한 효모 균주를, 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열과 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터 모두를 사용하여, 연속적으로 또는 동시에, 형질전환시킬 수 있다. 또한, 메틸요구성 효모 균주에서 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함하는 하나 이상의 본 발명의 녹-인 및/또는 녹-아웃 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여 생산된 당단백질 산물, 즉, N-글리코실화가 감소된 당단백질 또한 본 발명의 일부분이다.
본 발명은 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터, 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하도록 변형된 하나 이상의 균주를 포함하는 키트도 또한 제공한다.
본 발명은 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하기 위하여 메틸요구성(methylotrophic) 효모 균주의 글리코실화 과정을 유전적으로 변형시키는데 유용한 벡터 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법 및 벡터를 사용하여 생성된 메틸요구성 효모 균주와 이러한 유전적으로 변형된 균주로부터 생산된 당단백질에 관한 것이다.
도 1은 HDEL-표지된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제 발현 카세트를 운반하는 벡터를 나타내고, 이들 벡터를 이 발명이 속하는 기술분야에 공지된 방법에 따라서 제작하는 방법을 설명하는 것이다. 구조 개략도에 사용된 약어는 다음과 같다: 5'AOX1 또는 AOX1 P: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX1 프로모터 서열; Amp R: 암피실린 저항 유전자; ColEl: ColEl의 복제기원(origin of replication); 3'AOX1: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX1 유전자의 3' 서열; HIS4: 피히아 파스토리스의 HIS4 유전자; AOX TT: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX1 유전자의 전자 종결 서열; ORF:오픈 리딩 프레임; S: 분비 신호; P TEF1: 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 전사 연장 인자 1 유전자의 프로모터 서열; P EM7: 합성 구성성 원핵생물 프로모터 EM7; 제오신(Zeocin): 제오신 저항 유전자; CYC1 TT: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) CYC1 유전자의 3' 말단; GAP: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자의 프로모터 서열; PpURA3: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) URA3 유전자. 이 그림에서 알 수 있는 바와 같이, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자(α-mating factor) 분비 신호 서열을 코딩하는 서열에 조작가능하게 연결되어 있고, HDEL 펩타이드의 코딩 서열과도 또한 코딩 서열의 3' 말단 위치에서 조작가능하게 연결되어 있다. 전체적인 융합 구조가 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 프로모터(pPIC9MFManHDEL 내) 또는 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 프로모터(pGAPZMFManHDEL 내)에 조작가능하게 연결되어 있다.
도 2는 HDEL-표지된 무스 무스큘러스(Mus musculus) α-1,2-만노시다제 IB 발현 카세트를 운반하는 벡터를 나타내고, 이들 벡터를 이 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 방법에 따라서 제작하는 방법을 설명하고 있다. 이 그림에서 알 수 있는 바와 같이, 무스 무스큘러스(Mus musculus) α-1,2-만노시다제 IB의 촉매활성 도메인이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자 분비 신호 서열을 코딩하는 서열에 조작가능하게 연결되어 있고, HDEL 펩타이드의 코딩 서열에도 또한 코딩 서열의 3' 말단 위치에서 조작가능하게 연결되어 있다. 전체적인 융합 구조물이 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 프로모터(pPIC9mManHDEL 내) 또는 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 프로모터(pGAPZmManHDEL 내)에 조작가능하게 연결되어 있다. 또한, cMyc 에피토프 표지(tag)가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자 분비 신호 서열의 코딩 서열 및 무스 무스큘러스(Mus musculus) α-1,2-만노시다제 IB의 촉매활성 도메인 사이에 삽입되어 있는 발현 카세트의 변이체들이 만들어졌다. 이러한 발현 카세트는 또한 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 프로모터(pPIC9mMycManHDEL 내) 또는 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 프로모터(pGAPZmMycManHDEL 내)에 조작가능하게 연결되어 있다.
도 3은 MycHDEL 표지된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제를 운반하는 벡터 및 이들 벡터를 얻기위한 방법을 나타낸 것이다. 얻어진 융합 구조물은 다시 한번 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1프로모터(pPICZBMFManMycHDEL 내) 또는 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 프로모터(pGAPZMFManMycHDEL 내)와 조작가능하게 연결되어 있다.
도 4는 MycHDEL 표지된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제의 세포내 위치(localization)를 보여주고, 면역형광 분석에 의한 ER-표적화를 나다낸 것이다. 패널 A 웨스턴 블라팅; 효모 균주를 10 ml YPG 컬쳐에서 OD600= 10이 될 때까지 배양하고, 5배 희석시키고, YPG에서 48 시간동안 성장시켰다. 배양액의 1/50 및 세포의 1/65를 마우스 모노클로날 9E10 항-Myc 항체를 이용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블라팅으로 분석하였다. 분자량 표지(marker) 단백질을 화살표로 나타내었다. 레인 1-5: 세포 용해물. 1,2: pGAPZMFManMycHDEL 형질전환체. 3: 형질전환되지 않은 PPY120H (음성 대조군). 4,5: pPICZBMFManMycHDEL 형질전환체. Lanes 6-10: 배양액. 6: 형질전환되지 않은 PPY120H (음성 대조군). 7,8: pGAPZMKFManMycHDEL 형질전환체. 9,10: pPICZBMFManMycHDEL 형질전환체. 패널 B 면역형광 현미경법; 1: 피. 파스토리스(P. pastoris) 세포(pGAPZMFManHDEL로 형질전환된 균주 PPY120H)의 x1000 배율의 위상차 상(phase contrast image). 핵은 세포 사분면의 오른쪽 아래에 타원형으로 보인다. 2: 1과 동일한 세포를 티. 레세이(T. reesei) 만노시다제-Myc-HDEL 단백질의 위치를 나타내기 위하여 형광 현미경 모드로 나타낸 것이다. 단백질은 주로 핵 주위(핵막(nuclear envelope))에 원형 분포로 위치하며, 이는 소포체 정상적(steady-state) 분포에 있어서 전형적인 형태이다. 3: 피. 파스토리스(P. pastoris) 세포(pGAPZMFManHDEL로 형질전환된 균주 PPY120H)의 x1000 배율의 위상차 상. 4: 동일한 세포를 피. 파스토리스(P. pastoris) 균주 PPY120H 내의 골지 마커 단백질 OCH1-HA의 위치를 나타내기 위하여 형광 현미경법으로 나타낸 것이다 티. 레세이(T. reesei) 만노시다제-Myc-HDEL 단백질의 위치를 나타내기 위하여 형광 현미경 모드로 나타낸 것이다. 세포질 전체에 걸쳐서, 세포당 3-4 개의 점이 분포하는 점상(dot-like) 분포는 피. 파스토리스(P. pastoris) 내 시스-골지 분포에 있어서 전형적인 것이다.
도 5는 수크로스 밀도 구배 원심분리에 있어서 단백질 디설파이드 이소머라제(Protein Disulfide Isomerase)를 이용한 만노시다제-MycHDEL의 공-침강(co-sedimentation)을 나타낸 것이다. 가장 위의 패널은 상이한 수크로스 구배 구획들에서의 OCH1-HA 골지 마커 단백질의 분포를 보여주는 것이다. 중간 패널은 단백질 디설파이드 이소머라제 소포체 마커 단백질에 대한 이러한 분포를 보여주는 것이다. 마지막으로, 가장 아래 패널은 동일한 구획들에서의 MycHDEL-표지된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제의 분포를 보여주는 것이다. 이것은 만노시다제-MycHDEL이 대부분 정확하게 ER 마커 PDI 분포에 부합하고, 따라서, 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 세포의 ER에 주로 분포한다는 것을 보여주는 것이라 할 수 있다.
도 6은 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 만노시다제-HDEL와 공동발현되는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 트랜스-시알리다제의 N-글리칸 분석을 나타낸 것이다. 패널 A: 말토-올리고사카라이드 크기 기준 래더(ladder). 글리칸의 크기는 이들의 전기영동 이동도를 말토-올리고사카라이드의 이동도와 비교하여 글루코스 단위(GU)로 나타내었다. 패널 B: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 재조합 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 트랜스-시알리다제로부터 유래하는 N-글리칸. GU=9.2에서의 피크는 Man8GlcNAc2에 해당한다. 패널 C: 나중에 3 U/ml의 정제된 재조합 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제로 하룻밤동안 처리된 것을 제외하고 패널 2와 동일한 분석물. 패널 D: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 티. 레세이(T. reesei) 만노시다제-HDEL와 (GAP 프로모터으 조절 하에서) 공동-발현되는 재조합 트랜스-시알리다제로부터 유래하는 N-글리칸. GU=7.6에서의 피크는 RNase B의 분석도(패널 F)에서의 Man5GIcNAc2피크에 해당한다. 패널 E: 나중에 3 U/ml의 정제된 재조합 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제로 하룻밤동안 처리된 것을 제외하고 패널 D와 동일한 분석물. 패널 F: 소의 RNase B로부터 유래하는 N-글리칸. 이들 글리칸은 Man5GIcNAc2내지 Man8GIcNAc2로 구성되어 있다. Man7GlcNAc2에 대한 피크의 숫자를 설명하면서, 상이한 이소머들을 분석하였다.
도 7은 HDEL-표지된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제 및 쥐의 α-1,2-만노시다제 IB의 HDEL-표지된 촉매활성 도메인에 의한 인플루엔자 적혈구 응집소(influenza haemagglutinin) N-글리칸의 프로세싱을 나타낸 것이다. 이 분석에 있어서, Man5GlcNAc2기준 올리고사카라이드는 스캔 1850 지점에서 나타난다(도시하지 않음). 패널 1: 말토-올리고사카라이드 크기 기준 래더. 패널 2: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 재조합 인플루엔자 적혈구응집소로부터 유래하는 N-글리칸. 스캔 2250에서의 피크는 Man9GlcNAc2에 해당한다. 패널 3: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 티. 레세이(T. reesei)만노시다제-HDEL과 함께 (GAP 프로모터의 조절하에서) 공동발현되는 재조합 적혈구 응집소로부터 유래하는 N-글리칸. 스캔 1950에서의 피크는 Man6GlcNAc2에 해당한다. 패널 4: 나중에 30 mU의 정제된 재조합 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제로 하룻밤동안 처리된 것을 제외하고 패널 3과 동일한 분석물. 패널 5: 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 마우스 만노시다제 IB-HDEL과 함께 (GAP 프로모터의 조절하에서) 공동-발현되는 재조합 적혈구응집소로부터 유래하는 N-글리칸. 패널 6: 나중에 30 mU의 정제된 재조합 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제로 하룻밤동안 처리된 것을 제외하고 패널 5와 동일한 분석물.
도 8은 벡터 pBLURA5'PpOCH1과 그것의 제작방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 9는 pBLURA5'PpOCHl를 사용하여 단일 동종 재조합(single homologous recombination)에 의하여 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) OCH1 유전자를 파괴시키는 것을 보여주는 개략도이다.
도 10은 Ochl-불활성화된 클론 및 pGAPZMFManHDEL를 사용하는 형질전환에 의한 이들 Och1-불활성화된 클론으로부터 유래하는 3 개의 클론의 세포벽 당단백질 N-글리칸 분석을 나타낸 것이다. 패널 1은 말토-올리고사카라이드 혼합물의 분석을나타낸 것으로, 그것의 중합도가 그림의 바로 위에 숫자로 주어져 있다. 이 분석은 다른 패널들을 위한 크기 기준으로서 사용된다. 모든 패널의 세로축 상에, 상대적 형광 단위에서의 피크 강도가 주어진다. 패널 2-6: 다음의 균주의 세포벽 당단백질 N-글리칸의 분석: 패널 2는 조작되지 않은 피. 파스토리스(P. pastoris) 균주 yGC4; 패널 3은 pBLURA5'PpOch1를 사용하여 형질전환된 yGC4; 패널 4-6은 pGAPZMFManHDEL를 사용하여 추가적으로 형질전환된 패널 3의 3 가지 클론. 패널 7: Man5-9GlcNAc2혼합물로 구성되는, 소의 RNaseB로부터 유래되는 N-글리칸. 패널 2와 3의 비교 및 패널 7로부터 알 수 있는 바와 같이, pBLURA5'PpOchl를 사용하는 형질전환은 강력하게 증가된 많은 OCHlp의 Man8GlcNAc2기질 N-글리칸 (패널 2에서 피크 1로 표시됨)을 초래한다. 피크 2는 OCHlp의 Man9GlcNAc2산물을 나타내는 것이다. 또한, pGAPZMFManHDEL의 추가적인 형질전환시에, 3 개의 독립적인 클론의 세포벽 당단백질 상의 주된 글리칸은 Man8GlcNAc2기질의 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제 분해(digestion)의 Man5GlcNAc2최종 산물(패널 4의 피크 3)이다.
도 11은 나중에 pH=5.0인 소듐 아세테이트 20 mM 내에서 3 mU/ml의 정제된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제를 사용하여 하룻밤동안 생체외(in vitro) 분해시키는 것을 제외하고, 도 10에서의 글리칸 혼합물과 완전히 동일한 분석을 나타낸 것이다. 축의 할당은 도 10과 동일하다. 모 균주(parent strain, 패널 2)에서 보다 pBLURA5'PpOchl 형질전환 균주(패널 3)에서더 많은 Man5GlcNAc2이 생성되었다. 모든 패널에서의 스캔 3900 이전의 피크는 오염물질에 기인하는 것이며, 본 분석에서 고려되지 않아야 한다.
도 12는 발현벡터 pGAPZAGLSII(SEQ ID NO: 18)를 나타낸 것이다. P TEF1: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 전사 연장 인자 유전자의 프로모터. P Em7: 합성 원핵생물 프로모터. Zeocin: 제오신 저항 마커 유전자. CYC1 TT: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 시토크롬 C1 유전자의 전사 종결서열. Col El: 박테리아의 복제기원. GAP: 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 13은 발현벡터 pAOX2ZAGLSII(SEQ ID NO: 16)를 나타낸 것이다. P TEF1: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 전사 연장 인자 유전자의 프로모터. P Em7: 합성 원핵생물 프로모터. Zeocin: 제오신 저항 마커 유전자. CYC1 TT: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 시토크롬 C1 유전자의 전사 종결서열. Col El: 박테리아의 복제기원. AOX2 P: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX2 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 14 발현벡터 pPICZAGLSII(SEQ ID NO: 20)를 나타낸 것이다. P TEF1: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 전사 연장 인자 유전자의 프로모터. P Em7: 합성 원핵생물 프로모터. Zeocin: 제오신 저항 마커 유전자. CYC1 TT: 에스.세레비시애(S. cerevisiae) 시토크롬 C1 유전자의 전사 종결서열. Col El: 박테리아의 복제기원. AOX1 P: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 15는 발현벡터 pYPTlZAGLSII (SEQ ID NO: 22)를 나타낸 것이다. P TEF1: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 전사 연장 인자 유전자의 프로모터. P Em7: 합성 원핵생물 프로모터. Zeocin: 제오신 저항 마커 유전자. CYC1 TT: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 시토크롬 C1 유전자의 전사 종결서열. Col El: 박테리아의 복제기원. P YPT1: 피. 파스토리스(P. pastoris) YPT1 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 16은 발현벡터 pGAPADElglsII(SEQ ID NO: 19)를 난타낸 것이다. Amp R: 암피실린 저항 마커 유전자. ADE1: 피. 파스토리스(P. pastoris) ADE1 선별 마커 유전자. GAP: 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 17은 발현벡터 pAOX2ADElglsII(SEQ ID NO: 17)를 나타낸 것이다. Amp R: 암피실린 저항 마커 유전자. ADE1: 피. 파스토리스(P. pastoris) ADE1 선별 마커 유전자. AOX2 P: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX2 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피.파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 18은 발현벡터 pPICADElgIsII(SEQ ID NO: 21)를 나타낸 것이다. Amp R: 암피실린 저항 마커 유전자. ADE1: 피. 파스토리스(P. pastoris) ADE1 선별 마커 유전자. AOX1 P: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 19는 발현벡터 pYPT1ADE1glsII (SEQ ID NO: 23)를 나타낸 것이다. Amp R: 암피실린 저항 마커 유전자. ADE1: 피. 파스토리스(P. pastoris) ADE1 선별 마커 유전자. P YPT1: 피. 파스토리스(P. pastoris) YPT1 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 20은 발현벡터 pGAPZAglsIIHDEL(SEQ ID NO: 24)를 나타낸 것이다. Amp R: 암피실린 저항 마커 유전자. ADE1: 피. 파스토리스(P. pastoris) ADE1 선별 마커 유전자. GAP: 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 21은 발현벡터 pGAPADElgIsIIHDEL(SEQ ID NO: 25)를 나타낸 것이다. P TEF1: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 전사 연장 인자 유전자의 프로모터. P Em7: 합성 원핵생물 프로모터. Zeocin: 제오신 저항 마커 유전자. CYC1 TT: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 시토크롬 C1 유전자의 전사 종결서열. Col E1: 박테리아의 복제기원. GAP: 피. 파스토리스(P. pastoris) GAP 유전자의 프로모터. GLS2: 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 유전자. AOX1 TT: 피. 파스토리스(P. pastoris) AOX1 유전자의 전사 종결서열.
도 22는 상업적으로 입수가능한 효모 알파-글루코시다제(Sigma사: Cat. No. G-5003)를 사용하는 GLSII 활성 분석 테스트를 나타낸 것이다. 이 분석 혼합물은 pH 6.8의 포스페이트-시트레이트 버퍼, 만노스, 2-데옥시-D-글루코스, 기질 4-메틸움벨리페릴-알파-D-글루코시다제(4-methylumbellyferyl-alpha-D-glucopyranoside and alpha-glucosidase, Sigma사)를 포함한다. 1: 37℃에서 하룻밤 동안 배양시킨 후 자외선을 조사한 분석 혼합물; 2: 알파-글루코시다제를 포함하고 있지 않는 것을 제외하고 1과 동일한 분석 혼합물; 3: 기질을 포함하고 있지 않은 것을 제외하고 1과 동일한 분석 혼합물.
도 23은 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 재조합적으로 발현되는 GLSII의 활성 결과를 나타낸 것이다. 모든 분석 혼합물을 37℃에서 하룻밤 동안 배양시키고 나서, 자외선을 조사하였다. 1: 효모 알파-글루코시다제(Sigma: Cat. No. G-5003)를 사용한 분석; 2: 균주 18(pGAPZAGLSII로 형질전환된 PPY12-OH)의 정제된 배양액; 3: WT PPY12-OH 균주의 정제된 배양액; 균주 H3 (pGAPZAglsIIHDEL로 형질전환된 PPY12-OH)의 정제된 배양액.
피히아속(Pichia)의 소포체(ER)에서 운반되는 당단백질 상의 N-글리칸의 대부분은 중심 Man8GlcNAc2올리고사카라이드 구조를 갖는다는 것이 확립되어 있다. 단백질이 소포체에서 골지체로 운반된 후, 서로 다른 만노실트랜스퍼라제(mannosyltransferases)에 의하여 추가적인 만노스 잔기가 이들 중심 당 부분에 첨가되어 많은 만노스 측쇄를 갖는 당단백질을 만든다. 이러한 재조합 당단백질의 과글리코실화는 많은 경우에 있어서 바람직하지 못하다. 따라서, 본 발명은 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하도록 메틸요구성 효모 균주를 유전적으로 변형시키기 위한 방법 및 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의방법과 벡터들을 사용하여 생성된 메틸요구성 효모 뿐만 아니라, 이러한 유전적으로 변형된 균주로부터 생산되는 당단백질을 제공한다.
한 구체예에 있어서, 본 발명은 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하도록 메틸요구성 효모 균주를 유전적으로 변형시키는데 유용한 벡터를 제공한다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 메틸요구성 효모 균주에서 이 메틸요구성 효모 균주에 의하여 생산되는 당단백질의 글리코실화의 감소를 초래하는 효소활성을 갖는 하나 이상의 단백질을 발현시킬 수 있는 "녹-인(knock-in)" 벡터를 제공한다. 본 발명에 따르면, 이러한 단백질은, 예컨대, α-1,2-만노시다제, 글루코시다제 II 또는 이들의 기능적 부분들을 포함한다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 벡터는 α-1,2-만노시다제 또는 이들의 기능적 부분을 코딩하는 서열을 포함하며, 메틸요구성 효모 균주에서 α-1,2-만노시다제 또는 그 기능적 부분을 발현시킬 수 있다.
α-1,2-만노시다제는 Man8GlcNAc2의 비-환원(non-reducing) 말단의 α-1,2-결합 만노스 잔기를 절단하고, 이러한 당단백질 상의 중심 올리고사카라이드를 Man5GlcNAc2로 변환시킨다. 생체외에서, Man5GlcNAc2는 모든 피히아(Pichia) 골지 만노실트랜스퍼라제에 대하여 매우 열등한 기질이다. 즉, 만노스 잔기는 이러한 당 구조에 첨가될 수 없다. 이에 반해서, Man5GlcNAc2는 포유류 N-아세틸글루코사미닐-트랜스퍼라제 I에 대한 수용체 기질이며 포유류 당단백질의 혼성(hybrid)- 및 복합(complex)-형태 당 사슬 특성을 위한 중간체이다. 따라서, α-1,2-만노시다제를 피히아속과 같은 메틸요구성 효모 내로 도입시킴으로써, 감소된 만노스 함량을 갖는 당단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 발현벡터에 사용되기 위한 α-1,2-만노시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 모든 종에서 유래할 수 있다. 예컨대, 아스퍼질루스(Aspergillus) α-1,2-만노시다제(msdS gene), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제(Maras et al.J. Biotechnol. 77: 255-263,2000), 또는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) α-1,2-만노시다제를 코딩하는 진균류 유전자 뿐만 아니라, 예컨대, 쥐의 α-1,2-만노시다제(Herscovics et al.J. Biol. Chem.269: 9864-9871,1994), 토끼의 α-1,2-만노시다제(Lal et al.J Biol. Chem.269: 9872-9881,1994) 또는 인간 α-1,2-만노시다제(Tremblay et al.Glycobiology8: 585-595,1998)를 코딩하는 포유류 유전자를 포함하는, 많은 α-1,2-만노시다제 유전자가 클로닝되었고, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 입수 가능하다. 단백질 서열 분석은 지금까지 동정된 진핵동물의 α-1,2-만노시다제 서열들이 고도로 보존적이라는 것을 나타낸다.
바람직하게, 본 발명의 벡터에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 진균류 α-1,2-만노시다제, 보다 바람직하게는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제, 더욱 바람직하게는 "Maras et al.J. Biotechnol.77: 255-63 (2000)"에 기재된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제를 코딩한다.
본 발명에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 서열은 또한 α-1,2-만노시다제의 기능적 부분만을 코딩할 수 있다.
"기능적 부분(functional part)"는 전장 단백질(full-length protein)의 효소적 활성을 실질적으로 보유하는 α-1,2-만노시다제의 폴리펩타이드 단편을 의미하는 것이다. "실질적으로(substantially)"는 전장 α-1,2-만노시다제 효소활성의 적어도 약 40%, 또는, 바람직하게는, 적어도 50% 또는 그 이상이 보유되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명에 설명된 바와 같이, 쥐의 α-1,2-만노시다제 IB의 효소활성 도메인(catalytic domain)이 쥐의 α-1,2-만노시다제 IB의 "기능적 부분"을 구성한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 이 기술분야에 공지된 기술들을 조합하여 α-1,2-만노시다제의 기능적 부분을 용이하게 동정하고 제조할 수 있다. 효소 활성의 부여에 필수적이거나 충분한 α-1,2-만노시다제의 부분은 단백질 서열 분석에 기초하여 예측할 수 있다. 적절한 발현 시스템으로부터 발현되고 정제되는 얻고자 하는 α-1,2-만노시다제 일부분의 활성은 하기에 설명된 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 분석을 사용하여 검증될 수 있다.
본 발명에 따르면, 메틸요구성 효모 균주에서 발현되는 α-1,2-만노시다제 또는 이들의 기능적 부분은, Man8GIcNAc2(α-1,2-만노시다제의 기질)이 이미 당단백질 상에 생성되어 있지만 추가적인 만노스 잔기를 사용하여 당 사슬을 신장시키는 골지 글리코실트랜스퍼라제(Golgi glycosyltransferase)에는 도달하지 않은, 분비 경로 내의 한 부위에 표적화되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 한 바람직한 구체예에 있어서, α-1,2-만노시다제 발현 벡터는 그 벡터로부터 발현되는 α-1,2-만노시다제 또는 이들의 기능적 부분이 ER-체류(ER-retention) 신호를 포함하도록 조작된다.
"ER 체류 신호"는 이러한 펩타이드 서열을 포함하는 단백질이 소포체(ER)로 운반되고 머무르게하는 단백질 서열을 의미한다. 이러한 ER 체류 서열은 종종 ER 내에서 존재하고 작용하는 단백질에서 발견할 수 있다.
예컨대, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) ER 단백질 MNS1(Martinet et al.Biotechnology Letters20: 1171-1177,1998)과 같은, ER 체류 신호의 다양한 선정은 이 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 가능하다. 본 발명에 사용되기 위하여 바람직한 ER 체류 신호는 펩타이드 HDEL(SEQ ID NO: 1)이다. 많은 효모 단백질의 C-말단에서 발견되는 HDEL 펩타이드 서열은 ER에 대한 체류/회복(retention/retrieval) 신호로서 작용한다(PelhamEMBO J.7: 913-918,1988). HDEL 서열을 포함하는 단백질은 멤브레인-결합 수용체(Erd2p)에 의하여 결합되고, 그리고 나서, 골지체로부터 ER로 되돌아오기 위한 역방향 수송 경로(retrograde transport pathway)에 진입한다.
본 발명에 따르면, ER 체류 신호는 α-1,2-만노시다제의 단백질 서열 중 어디에도 위치할 수 있지만, α-1,2-만노시다제의 C-말단에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 α-1,2-만노시다제는, 예컨대, 기술분야에 공지된 Myc, HA, FLAG 및 His6 택(tags)과 같은 에피토프 택을 항체가 이용가능한 위치로 삽입시키는 것과 같이, 추가적으로 변형될 수 있다. 에피토프 표지된(epitope-tagged) α-1,2-만노시다제는 간편하게 정제할 수 있고, 발현과 세포내 위치화(localization) 모두에 대하여 간편하게 모니터링할 수 있다.
ER 체류 신호 및 에피토프 택은, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 분자생물학 기술을 사용하여, 이러한 신호 또는 택을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 원하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열내로 삽입시킴으로써, 원하는 단백질 내로 용이하게 도입시킬 수 있다. .
또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 벡터는 글루코시다제 II 또는 이들의 기능적 부분을 코딩하는 서열을 포함하고, 메틸요구성 효모 균주에서 글루코시다제 II 또는 그 기능적 부분을 발현시킬 수 있다.
ER 내에서 단백질 상으로 전달되는 개시 N-결합 올리고사카라이드 (Glc3Man9GlcNAc2)는 ER 내에서 특정 글루코시다제에 의하여 절단되어 글루코스 잔기가 제거되고, 만노시다제에 의하여 절단되어 특정 α-1,2-결합 만노스가 제거된다는 것이 입증되어 있다. 본 발명자들은 피히아속(Pichia)에서 발현되는 몇 몇 재조합 단백질이, 이러한 단백질이 ER을 떠나서 골지체로 이동할 때, 잔여의 글루코스 잔기를 당 부분(moiety) 상에 가지고 있다는 것을 관찰하였다. 당 구조 상에 존재하는 잔여 글루코스는 α-1,2-만노시다제에 의한 당 부분의 완전한 분해를 방해하며, 외인성(exogenous) 글루코시다제의 도입에 의하여 이러한 글루코스 잔기들이 용이하게 제거될 수 있다.
본 발명에 있어서, 글루코시다제 II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 모든 종(species)로부터 유래할 수 있다. 글루코시다제 II 유전자는 래트, 마우스, 돼지 및 인간을 포함하여 많은 포유류 종들로부터 클로닝되어 왔다. 이들 포유류 종들로부터 얻은 글루코시다제 II 단백질은 알파 및 베타 서브유니트(subunit)로 구성되어 있다. 알파 서브유니트는 약 110 kDa이고 효소의 촉매 활성을 가지고 있는 반면, 베타 서브유니트는 C-말단 HDEL ER-체류 서열을 포함하고 있으며 효소의 ER 위치화에 중요한 역할을 할 것으로 생각되어 진다. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)로부터 얻은 글루코시다제 II 유전자 또한 클로닝되어 있다(ORF YBR229c, 염색체 II 상에 위치). 이 유전자는 약 110 kDa이고, 포유류 알파 서브유니트와 고도의 상동성을 보인다.
본 발명의 벡터로 사용되기 위하여 바람직한 글루코시다제 II는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)와 같은 진균류로부터 유래한 것이다. 진균 글루코시다제 II 유전자의 일례로서 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 글루코시다제 II 알파 서브유니트 유전자를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 또한 글루코시다제 II의 기능적 부분만을 코딩할 수 있다. "기능적 부분"은 전장 단백질의 효소 활성을 실질적으로 보유하고 있는 폴리펩타이드 단편을 의미한다. "실질적으로"는 전장 글루코시다제 효소 활성의 적어도 약 40%, 또는 적어도 50% 또는 그 이상이 보유되는 것을 의미한다. 글루코시다제 II의 기능적 부분은 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 기술분야의 통상의 지식을 가진자에 의하여 동정되고 제조될수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 글루코시다제 II 단백질을 ER 체류 신호를 포함하도록 조작하여 메틸요구성 효모 균주에서 발현되는 단백질이 ER로 표적화시키고 거기에서 기능을 유지하도록 할 수 있다. 예컨대, HDEL 펩타이드 서열과 같은, ER 체류 신호를 아래에 기재하였다.
본 발명에 사용되는 글루코시다제 II는, 예컨대, 기술분야에 잘 알려진 Myc, HA, FLAG, 및 His6 택과 같은 에피토프 택을 항체가 사용가능한 곳에 삽입하는 것과 같이, 추가적으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에 따른면, "녹-인" 벡터가 α-1,2-만노시다제 코딩 서열 및 글루코시다제 II 코딩 서열 중 어느 하나 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 발현될 효소(예컨대, α-1,2-만노시다제 또는 이의 기능적 부분, 또는 글루코시다제 II 또는 이의 기능적 부분)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터와 3' 종결 서열과의 조작적인 결합 내에 위치할 수 있다.
메틸요구성 효모에서의 단백질 발현을 위하여 적합한 프로모터는 구성성 프로모터 및 유도성 프로모터 모두를 포함할 수 있다. 구성성 프로모터는, 예컨대, 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 프로모터("GAP 프로모터")를 포함할 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 옥시다제 I 프로모터("AOXI 프로모터")(미국특허 제4,855,231호), 또는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 포름알데히드 탈수소효소 프로모터("FLD 프로모터")(Shen et al. Gene 216: 93-102,1998)를 포함한다.
3' 종결 서열은, 폴리아데닐화를 유도하는 서열과 같이, 서열이 조작가능하게 연결되어 있는 유전자의 mRNA 전사 산물을 안정화시키는 작용을 하는 구조 유전자의 종결 코돈까지의 3' 서열들이다. 3' 종결 서열은 피히아속 또는 다른 메틸요구성 효모로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 수행에 유용한 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 3' 종결 서열의 예는AOX1유전자,p40유전자,HIS4유전자 및FLD1유전자를 포함한다.
본 발명의 벡터는 선별 마커(selectable marker) 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 선별 마커는 메틸요구성 효모 균주에 선별적인 표현형을 부여하고 형질전환된 세포가 형질전환되지 않은 세포들로부터 동정되고 선별될 수 있도록 하는 모든 유전자일 수 있다. 선별 마커 시스템은 숙주의 결함을 보완하는 야생형 유전자 및 영양요구(auxotrophic) 변이체 메틸요구성 효모 균주 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 시스템의 예는his4피히아(Pichia) 균주를 보완하기 위하여 사용되는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)HIS4유전자, 또는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)arg변이체를 보완하기 위하여 사용되는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 또는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)ARG4유전자를 포함한다. 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 작용하는 다른 선별마커들은Zeo R 유전자,G418 R 유전자 등을 포함한다.
또한, 본 발명의 벡터는 자기 복제 서열(autonomous replication sequence,ARS)을 포함할 수 있다. 예컨대, 미국특허 제4,837,148호는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 내에 플라스미드를 보존시키기 위한 적절한 수단을 제공하는 자기 복제 서열을 개시하고 있다. 상기 미국특허 제4,837,148호의 기재는 여기에 참조로서 포함된다.
벡터는 또한 박테리아에서의 복제 및 염색체외 보존을 담당하는 서열 뿐 아니라, 박테리아에서 작용하는 선별마커 유전자를 포함할 수 있다. 박테리아 선별 마커 유전자의 예는 암피실린 저항 유전자 (Amp R ), 테트라사이클린 저항 유전자(Tet R ), 네오마이신 저항 유전자, 히그로마이신 저항 유전자 및 제오신 저항 유전자(Zeo R )를 포함한다.
본 발명에 따르면, 메틸요구성 효모에서 발현될 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 통합성 벡터 또는 복제성 벡터(예컨대, 복제 원형 플라스미드) 내에 위치할 수 있다.
통합성 벡터는, 예컨대, 여기에 참조로서 포함된 미국특허 제4,882,279호에 개시되어 있다. 통합성 벡터는 일반적으로 적어도 첫 번째 삽입가능 DNA 단편, 선별 마커 유전자 및 두 번째 삽입가능 DNA 단편이 연속적으로 배열된 서열을 포함한다. 첫 번째 및 두 번째 삽입가능 DNA 단편은 길이에 있어서 각각 약 200 뉴클레오타이드이며, 형질전환될 종의 게놈 DNA의 일부분과 상동인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 발현에 있어서 중요한 구조 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터 내 선별마커 앞 뒤 상관없이 첫 번째 및 두 번째 삽입가능 DNA 단편 사이에 삽입한다. 통합성 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 원하는 뉴클레오타이드 서열을 용이하게 통합시키기 위하여 효모 형질전환에 앞서 선형화될 수 있다.
α-1,2-만노시다제 코딩 서열 또는 글루코시다제 II 코딩 서열 중 어느 하나 또는 이들 모두를 운반하는 복제성 벡터 및 통합성 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 표준적인 기술에 의하여 제작될 수 있고, 예컨대, "Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning: ALaboratory Manual" 또는 널리 입수가능한 재조합 DNA 기술에 대한 모든 수 많은 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 α-1,2-만노시다제 발현 서열을 운반하는 바람직한 벡터는, 하기의 실시예에 보다 상세히 설명되어 있는, pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL, pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL 및 pGAPZmMycManHDEL를 포함한다.
본 발명의 글루코시다제 II 발현 서열을 운반하는 바람직한 벡터는, 하기의 실시예에서 보다 상세히 설명되어 있는 pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII, pGAPADEIgIsII, pPICADElgIsII, pAOX2ADElgIsII, pYPTIADElgIsII, pGAPZAglsIIHDEL 및 pGAPADElglsIIHDEL을 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 메틸요구성 효모 균주 내로 도입되었을 때 유전자를 불활성화시키거나 파괴시켜서 메틸요구성 효모 균주에서 생산되는 당단백질의 글리코실화를 용이하게 감소시킬 수 있는 "녹-아웃" 벡터를 제공한다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 메틸요구성 효모 균주 내에 도입되었을때 Och1 유전자를 불활성화시키거나 파괴시키는 "녹-아웃" 벡터를 제공한다.
에스. 세레비시애(S. cerevisiae) OCH1 유전자가 클로닝되어 있다(Nakayama et al.EMBO J.11 : 2511-2519,1992). 이는 초기 골지 복합체에 위치하고 N-결합 중심 올리고사카라이드(Man5GlcNAc2및 Man8GlcNAc2)에의 α-1,6-폴리만노스 외부 사슬의 첨가를 개시하는 작용을 하는 막 결합 α-1,6-만노실트랜스퍼라제를 코딩한다(Nakanishi-Shindo et al.J. Biol. Chem.268: 26338-26345,1993).
일본특허출원 제07145005호에 어떤 피히아(Pichia) 서열은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) OCH1과 고도로 상동인 단백질을 코딩한다고 기재되어 있다. 본 발명을 위하여, 여기서는 이러한 서열을 "피히아(Pichia) OCH1 유전자"라고 나타내었다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들은 기술분야에 잘 알려진 기술들을 사용하여 OCH1 유전자를 다른 메틸요구성 효모로부터 분리해낼 수 있다.
본 발명에 따르면, 메틸요구성 효모의 OCH1 유전자 내의 파괴는 불활성 단백질 산물의 생산 또는 이들을 생산하지 못하게 되는 결과를 초래할 수 있다. 이러한 파괴는 이종 DNA 서열의 코딩 서열 내로의 삽입 및/또는 코딩 서열 중 일부 또는 모두의 결실의 형태로 나타날 수 있다. 유전자 파괴는, Rothstein (in Methods in Enzymology, Wu et al., eds., vol 101 : 202-211,1983)에 기재된 바와 같이, 본래 동성 재조합(homologous recombination)에 의하여 생성될 수 있다.
동성 재조합에 의하여 Ochl 유전자를 피괴시키기 위하여, Ochl 녹-아웃 벡터를 선별마커 유전자를 포함하도록 하여 제작할 수 있다. 선별마커 유전자는 동성 재조합을 매개하기 위한 충분한 길이의 Ochl 유전자 부위의 5' 및 3' 말단 모두에 조작가능하게 연결되어 있다. 선별마커는,URA3, LEU2및HIS3유전자를 포함하여, 항생제 저항성을 제공하거나 숙주세포 영양요구성을 보완하는 모든 많은 유전자 중 하나일 수 있다. 다른 적절한 선별마커는 효모 세포에 클로람페니콜 저항성을 부여하는CAT유전자, 또는 활성 β-갈락토시다제의 발현에 기인하는 푸른색 콜로니가 생기게 하는lacZ유전자를 포함한다. 그리고 나서, 이 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 Och1 녹-아웃 벡터의 선형화된 DNA 단편을 숙주 메틸요구성 효모 내로 도입시킨다. 선형 단현의 게놈 내로의 통합 및 Och1 유전자의 파괴 여부는 선별마커에 기초하여 측정될 수 있으며, 예컨대, 서던 블라트 분석에 의하여 검증될 수 있다.
선택적으로, Ochl 녹-아웃 벡터는 파괴될 Och1 유전자 부위를 포함하도록 하여 제작될 수 있는데, 상기 부위는 어떠한 Och1 프로모터 서열도 포함하지 않고 Och1 단백질의 불활성 단편을 코딩하거나 아무것도 코딩하지 않는 부위이다. "불활성 단편(inactive fragment)"은 전장 OCH1 단백질의 바람직하게는 약 10%보다 적은, 가장 바람직하게는 약 0%의, 활성을 갖는 Och1 단백질의 단편을 의미한다. OCH1 유전자의 이러한 부위를, OCH1 서열에 어떠한 공지의 프로모터도 조작가능하게 연결시키지 않고, Och1 유전자의 상기 부위에 종료 코돈과 전사 종결 서열을 조작가능하게 연결시켜서 벡터 내로 삽입할 수 있다. 그리고 나서, 이러한 벡터를 OCH1의 상기 부위에서 선형화시키고 기술분야에 알려진 어떠한 방법이든 사용하여메틸요구성 효모 균주 내로 형질전환시킬 수 있다. 그리고 나서, 단일 동성 재조합(single homologous recombination)을 위하여, 이와 같이 선형화된 벡터를 OCH1 유전자 내로 통합시킨다. 단일 동성 재조합의 결과로서 두 개의 Ochl 서열이 염색체 내에 생성된다. 첫 번째 Och1 서열은 벡터로부터 유래하는 Och1 유전자 부위이며, 이는 지금은 숙주 메틸요구성 효모의 OCH1 프로모터의 조절하에 있고, 상기한 바와 같이, OCH1 단백질의 불활성 단편을 코딩하거나 OCH1 단백질을 코딩하지 않는 Och1 서열과 같이 아직 활성 OCH1 단백질을 제조할 수 없다. 두 번째 Ochl 서열은 전체 OCH1 코딩 서열이며, 어떠한 공지된 프로모터 서열과도 조작가능하게 연결되어 있지 아니하여, 활성 OCH1 단백질 합성을 위한 어떠한 활성 메신저의 생성도 기대할 수 없다. 바람직하게, 불활성화 돌연변이를 OCH1 서열 내, 벡터의 선형화 자리의 5' 말단 및 OCH1의 번역 개시 코돈의 3' 말단 위치에 도입할 수 있다. "불활성화 돌연변이(inactivating mutation)"는 종결 코돈, 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이 또는 리딩 프레임의 파괴를 야기하는 다른 모든 돌연변이를 도입시키는 돌연변이를 의미한다. 이러한 돌연변이는 이 발명이 속하는 기술분야에 공지된 모든 부위 특이적 돌연변이유발 방법을 사용하여 Och1 서열 내로 도입될 수 있다. 이러한 불활성화 돌연변이는, 녹-아웃 벡터 내 Och1 서열의 5' 위치에 몇 몇 프로모터 서열이 존재하는 경우라도, 어떠한 기능적 OCH1 단백질도 생성될 수 없다는 것을 보장한다.
본 발명의 바람직한 Och1 녹-아웃 벡터는 pBLURA5'PpOCHl이다.
원하는 경우, 만노시다제 발현 서열 및 글루코시다제 발현 서열 중 어느 하나 또는 이들 모두를 OCH1 유전자를 파괴하여 "녹-인-및-녹-아웃" 벡터를 생성시키는데 사용되는 동일한 플라스미드 상에서 운반할 수 있다.
또한, 상기한 모든 벡터들은 메틸요구성 효모 균주에서 원하는 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 메틸요구성 효모 균주에 의하여 생산되는 단백질 상에서의 글리코실화를 감소시키기 위하여 메틸요구성 효모 균주를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 하나 이상의, 즉 적어도 하나의, 상기한 바와 같은 본 발명의 녹-인 및/또는 녹-아웃 벡터를 사용하여 메틸요구성 효모 균주내로 형질전환시킴으로써 메틸요구성 효모 균주를 변형시킨다.
본 발명의 방법을 사용하여 변형될 수 있는 메틸요구성 효모 균주는 칸디다속(genus Candida), 한세눌라속(genus Hansenula), 토룰롭시스속(genus Torulopsis) 및 피히아속(genus Pichia)과 같이 메탄올 상에서 자랄 수 있는 효모를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 부류의 효모의 대표적인 종의 목록이 "C. Anthony (1982),The Biochemistry of Methylotrophs, 269"에 나타나 있다. 본 발명의 수행에 필요한 메틸요구성 효모의 예로서, 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 피히아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피히아 아노몰라(Pichia anomola), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 칸디다 보이디니(Candida boidinii)를 들 수 있다. 피하아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주 GS115 (NRRL Y-15851); 미국특허 제4,818,700호에 개시된 GS190 (NRRL Y-18014); 미국특허 제4,812,405호에 개시된 PPF1 (NRR1 Y-18017); PPY120H, yGC4 또는 이들로부터 유래된 균주들이 특히 바람직하다.
본 발명의 방법을 사용하여 변형될 수 있는 메틸요구성 효모 균주는 또한 원하는 이종 당단백질을 하나 이상 발현시킬 수 있도록 유전적으로 조작된 이들 메틸요구성 효모 균주를 포함할 수 있다. 미리 조작된 이들 균주로부터 발현되는 이종 당단백질 상의 글리코실화는 하나 이상의 본 발명의 벡터를 사용하여 이러한 균주들을 형질전환시킴으로써 감소시킬 수 있다.
본 발명의 벡터는, "Cregg et al. 1985"에 기재된 바와 같은 스페로플라스트 기술(spheroplast technique), 또는 유럽특허 제312,934호에 기재된 바와 같이 피히아속(Pichia)에서의 사용을 위하여 변형된, "Ito et al.Agric. Biol. Chem.48 : 341"의 전-세포 리튬 클로라이드 효모 형질전환 시스템과 같은 공지의 방법을 사용하여, 메틸요구성 효모 균주 세포 내로 도입될 수 있다. 플라스미드 또는 선형 벡터의 형질전환에 유용한 다른 공개된 방법들은 미국특허 제4,929,555호; "Hinnen et al.Proc. Nat. Acad. Sci. USA75: 1929 (1978)"; "Ito et al.J. Bacteriol.153: 163 (1983)"; 미국특허 제4,879,231호; "Sreekrishna et al.Gene59: 115 (1987)"에 기재된 방법들을 포함한다. 일렉트로포레이션(electroporation) 및 PEG1000 전세포 형질전환 공정 또한 사용될 수 있다(Cregg and RusselMethods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N. J., pp. 2739 (1998)).
형질전환된 효모 세포는, (세포의 영양요구성 때문에) 요구되는 생화학 산물의 부재하에서의 형질전환, 새로운 표현형에 대한 선별 및 검출 후 영양요구성 세포를 배양하거나, 형질전환체 내 포함된 저항 유전자가 부재하는 효모에 대하여 독성이 있는 항생제의 존재하에서 배양시키는 것을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 적절한 기술을 이용함으로써, 선별될 수 있다. 형질전환체는 또한, 예컨대, 서던 블라트 또는 PCR 분석에 의하여 평가될 수 있는, 발현 카세트의 게놈 내로의 통합에 의하여 선별 및/또는 검증될 수 있다.
한 구체예에 있어서, 메틸요구성 효모 균주를 α-1,2-만노시다제 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 형질전환시킨다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 메틸요구성 효모 균주 내에서 α-1,2-만노시다제 또는 이의 기능적 부분을 발현시킬 수 있으며, 바람직하게는, 메틸요구성 효모 균주 게놈 내로 통합시킬 수 있다.
메틸요구성 효모 균주 내로 도입된 α-1,2-만노시다제의 발현을 mRAN 수준 및 단백질 수준 모두의 측면에서 검사할 수 있는데, mRAN 수준은, 예컨대, 노던 블라트 분석에 의하며, 단백질 수준은, 예컨대, 웨스턴 블라트 분석에 의한다. 단백질의 세포내 위치화는, 세포 하부의 분획화(fractionation) 및 면역형광 실험을 포함하여, 다양한 기술들을 사용하여 분석할 수 있다. 세포 하부 분획화 실험에 있어서, 공지된 ER 정주 단백질(예컨대, 단백질 디설파이드 이소머라제)과 함께 이들 효소를 공-침강시킴으로써, α-1,2-만노시다제의 ER 위치화를 측정할 수 있다. ER 위치화는 또한, 전형적으로는 핵주위 염색 패턴인, ER의 면역형광 염색 패턴 특성에 의하여 측정할 수 있다.
메틸요구성 효모 균주에서 발현되는 α-1,2-만노시다제 또는 이의 기능적 부분이 기대되는 만노스-트리밍(trimming) 활성을 갖는다는 것을 확인하기 위하여, 생체외 및 생체내 분석을 모두 사용할 수 있다. 전형적으로, 생체외 분석은, 예컨대, Man8GlcNAc2와 같은 생체외 합성 기질을 메틸요구성 효모 균주로부터 발현되고 정제된 효소를 사용하여 분해시키는 것과 Man8GlcNAc2를 예컨대 Man5GIcNAc2로 트리밍하는 이러한 효소 활성을 검사하는 것을 수반한다. 생체내 분석에 있어서, α-1,2-만노시다제 또는 그의 부분은 메틸요구성 효모 내 말단 α-1,2-결합 만노스 잔기를 포함하여 N-글리칸으로 글리코실화되는 것으로 알려진 당단백질과 함께 메틸요구성 효모에서 공동-발현된다. 생체외 및 생체내 분석 모두에 있어서, 탄수화물기의 조성은 기술분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 측정되고, 하기되는 실시예들에 의하여 설명될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 글루코시다제 II 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 메틸요구성 효모 균주를 형질변환시킨다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 메틸요구성 효모 균주 내에서 글루코시다제 II 또는 기능적 부분을 발현시킬 수 있으며, 바람직하게는, 메틸요구성 효모 균주의 게놈 내로 통합된다.
형질전환된 메틸요구성 효모 균주에서 발현되는 글루코시다제 II 또는 이의 기능적 부분의 효소 활성을 다양한 분석을 사용하여 검사할 수 있다. 예컨대, 글루코시다제 II 및 이의 일부분을 코딩하는 서열로 형질전환된 메틸요구성 효모 세포를, 예컨대, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-α-D-글루코피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside) 또는 4-MU-α-D-Glc와 같은, 글루코시다제의 기질을 포함하는 고형 배지 상에서 키울수 있다. 상기 효소가 피히아(Pichia)에 의하여 발현되고 세포외 분비될 때, 상기 효소는, 예컨대, 푸른색 또는 형광빛과 같이 콜로니 주위에 탐지 가능한 신호를 발생시키면서, 기질에 작용한다. 선택적으로, 발현된 단백질 분자를 포함하는 액체 배양액을 수집하여, 예컨대, p-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)와 같은 기질과 함께 시험관 안에서 배양할 수 있다. 방출되는 특정 산물을 측정함으로써 효소 활성을 측정할 수 있다. 게다가, 예컨대, 인플루엔자 뉴라미니다제와 같은 글루코시다제 II가 글루코스 잔기로 N-글리코실화되는 것으로 알려진 당단백질과 함께 효모내에서 공동 발현되는 경우, 생체내 분석을 사용할 수 있다. 글루코시다제 II의 효소 활성은 당단백질의 당 사슬(들) 내의 글루코스 함량의 감소에 기초하여 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 메틸요구성 효모 균주를 Och1 벡터를 사용하여 형질전환시킨다. 형질전환 및 상기 벡터의 통합의 결과로, 효모 균주 내 게놈 Och1 유전자가 파괴된다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, α-만노시다제 발현 벡터, 글루코시다제 II 발현 벡터 및 Och1 녹-아웃 벡터의 모든 조합을 사용하여 메틸요구성 효모 균주를 형질전환시킬 수 있다. 이러한 변형은 한 번에 하나의 벡터를 도입시키는 일련의 연속적인 형질전환, 또는, 선택적으로, 벡터들을 동시에 도입시키는 동시-형질전환(co-transformation)에 의하여 성취될 수 있다.
상기된 변형 메틸요구성 효모 균주를, 원한다면, 추가적으로 변형시킬 수 있다. 예컨대, 다른 어떤 피히아(Pichia) 만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 추가적으로 파괴시킬 수 있다. 또한, 원한다면, 표유류 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 혼성형 또는 복합형 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하도록 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는, 본 발명의 방법을 사용하여, 예컨대, 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터를 사용하여 형질전환시킴으로써, 변형된 메틸요구성 효모 균주에 관한 것이다.
본 발명의 어떤 측면, 특히 세포내 발현되는 α-1,2-만노시다제 활성의 도입은, O-결합 글리칸이 주로 α-1,2-결합 만노스 잔기들로 구성되어 있다고 기술분야에 공지된 바와 같이, 메틸요구성 효모 내에서 생산되는 당단백질 상의 O-결합 글리칸의 글리코실화를 감소시키는데 또한 유용하다는 것을 이해하여야 한다. 여기서 사용되는 0-결합 글리칸은 당단백질의 세린 또는 트레오닌에 결합된 탄수화물 구조를 의미한다
본 발명의 또 다른 측면은 글리코실화가 감소된 당단백질, 특히 메틸요구성 효모에 대하여 이종(heterologous) 당단백질을 메틸요구성 효모 내에서 생산하는 방법에 관한 것이다.
여기에서 사용된 "당단백질(glycoprotein)"은, 메틸요구성 효모 내에서, 하나 이상의 아스파라긴 잔기 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기 상에서 글리코실화되거나, 아스파라긴 및 세린 또는 트레오닌 잔기 상에서 글리코실화된 단백질을 의미한다.
"글리코실화가 감소된(reduced glycosylation)"이라는 표현은, 본 발명에 따라서 변형된 메틸요구성 효모 균주 내에서 당단백질이 발현될 때, 변형되지 않은 야생형의 메틸요구성 효모와 비교하여, 당단백질 상에서의 탄수화물 부분의 감소된 크기, 특히 보다 적은 만노스 잔기를 갖는 것을 의미한다..
본 발명에 따르면, 많은 방법으로 글리코실화가 감소된 원하는 당단백질을 생산할 수 있다. 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 본 발명에 따라서 미리 변형된 메틸요구성 효모 균주, 예컨대, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 사용하여 변형되고 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산할 수 있는 균주 내로 도입시킬 수 있다. 선택적으로, 당단백질을 발현하도록 미리 유전적으로 조작된 메틸요구성 효모 균주를 하나 이상의 본 발명에 따른 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 이와 달리, 메틸요구성 효모 균주가 원하는 당단백질을 발현시키지 않거나, 본 발명의 벡터 중 어느 것으로도 형질전환되지 않은 균주인 경우, 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열 및 하나 이상의 본 발명의 벡터를 모두 사용하여, 연속적으로 또는 동시에, 이러한 효모 균주를 형질전환시킬 수 있다. 또한, 메틸요구성 효모 균주 내에서 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 본 발명의 녹-인 및/또는 녹-아웃 벡터를 사용하여 메틸요구성 효모 균주를 형질전환시킬 수 있다.
메틸요구성 효모 내에서 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열이 5' 에서 3'까지, 프로모터, 당단백질을 코딩하는 서열 및 3' 종결 서열을 포함하도록 제작할 수 있다. 당단백질의 발현에 적절한 프로모터와 3' 종결 서열은 상기한 모든 프로모터와 3' 종결 서열들을 포함할 수 있다.
당단백질을 발현시키기 위한 뉴클레오타이드 서열은, 단백질 산물의 분비를 원하는 경우, 예컨대, 통과 펩타이드(transit peptide)를 코딩하는 신호 서열과 같은 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 널리 알려져 있으며, 용이하게 입수가능하고, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 알파 교배 인자 프리프로(αmf prepro), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 산성 포스파타제 (PHO1) 신호 서열 등을 포함한다.
당단백질의 발현을 위한 뉴클레오타이드 서열은 복제성 벡터 또는 통합성 벡터 상에 위치할 수 있다. 이러한 벡터의 선택 및 구조는 상기한 바와 같다.
당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드-포함 α-1,2-만노시다제 또는 글루코시다제 II 발현 단위와 같이 동일한 복제성 플라스미드 상에서 운반될 수 있다. 선택적으로, 당단백질 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 별개의 플라스미드 상에서 운반되거나 숙주 게놈 내로 통합된다.
생산된 당단백질은 통상적인 방법에 의하여 정제될 수 있다. 정제될 특정 단백질의 본질에 의하여 정제 프로토콜을 결정한다. 이러한 결정은 이 발명이 속하는 기술분야의 기술의 통상적인 수준 내이다. 예컨대, 침전, 면역흡착(immunoadsorption), 분획화 또는 다양한 크로마토그래피법과 같은 전형적인 분리 기술에 의하여, 세포로부터 세포 배양액을 분리하고, 세포로부터 분비된 단백질을 배지로부터 분리해 낼 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있는 당단백질은, 예컨대, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 α-아밀라제(Bacillus amyloliquefaciensα-amylase), 에스. 세레비시애 인버타제(S. cerevisiaeinvertase), 티파노소마 크루지 트랜스-시알리다제(Typanosoma cruzi trans-sialidase), HIV 외피 단백질(HIV envelope protein), 인플루엔자 바이러스 A 적혈구 응집소(influenza virus A haemagglutinin), 인플루엔자 뉴라미니다제(influenza neuraminidase), 소의 포진 바이러스 타입-1 당단백질 D(Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D), 인간 안지오스타틴(human angiostatin), 인간 B7-1, B7-2 및 B-7 수용체 CTLA-4, 인간 조직 인자(human tissue factor), 성장 인자(예컨대, 혈소판-유래 성장 인자), 조직 플라즈미노겐 활성화인자(tissue plasminogen activator), 프라즈미노겐 활성화인자 억제인자-1(plasminogen activator inhibitor-1), 우로키나제(urokinase), α-갈락토시다제(α-galactosidase)와 같은 인간 라이소좀 단백질, 플라즈미노겐, 트롬빈, 인자 XIII 및 면역글로불린(immunoglobulins)을 포함한다. 유전적으로 조작된 본 발명의 피히아(Pichia) 균주에서 발현될 수 있는 유용한 다른 당단백질이 "Bretthauer and Castellino,Biotechnol. Appl. Biochem.30: 193-200 (1999)" 및 "Kukuruzinska et al.Ann Rev. Biochem.56: 915-44 (1987)"에 나타나 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 생산된 당단백질, 즉, 글라이코실화가 감소된 당단백질 또한 본 발명의 일부분이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기된 본 발명의 녹-인 벡터, 녹-아웃 벡터, 또는 녹-인-및-녹-아웃(knock-in-and-knock-out) 벡터를 한 가지 이상 포함하는 키트를 제공한다. 보다 상세하게, 본 발명의 키트는 메틸요구성 효모에서 α-만노시다제를 발현시킬 수 있는 벡터, 메틸요구성 효모에서 글루코시다제 II를 발현시킬 수 있는 벡터, 메틸요구성 효모 내 Och1 유전자를 파괴시킬 수 있는 벡터, 글루코시다제 및 α-만노시다제 모두를 발현시킬 수 있는 벡터, Och1 유전자를 파괴시킬 수 있고 글루코시다제 II, α-만노시다제 또는 이들의 조합 중 어느 하나 또는 이들 모두를 발현시킬 수 있는 벡터를 한 가지 이상 포함한다..
상기 키트는 또한 원하는 이종 단백질을 코딩하고 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 상기한 바와 같이 노킹-인(knocking-in) 또는 노킹-아웃(knocking-out)을 위한 서열을 포함하는, 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 내에서 제공될 수 있다.
또한, 상기 키트는 원하는 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 연속적으로 삽입되어 메틸요구성 효모를 형질전환시키고 이를 메틸요구성 효모에서 발현시킬 수 있는 플라스미드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 키트 내의 녹-인 또는 녹-아웃 벡터는 원하는 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 위한 간편한 클로닝 사이트를 갖는다.
상기 키트는 또한 상기된 녹-인 벡터, 녹-아웃 벡터, 또는 녹-인-및-녹-아웃 벡터 중 어느 것을 사용하여 연속적으로 형질전환된 메틸요구성 효모 균주를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기된 본 발명의 녹-인 벡터 또는 녹-아웃 벡터를 한 가지 이상 사용하여 형질전환된 메틸요구성 효모 균주를 포함할 수 있다. 게다가, 상기 키트는 원하는 이종 당단백질을 코딩하고 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 형질전환된 메틸요구성 효모 균주를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예들에 의하여 보다 상세히 설명한다.
실시예 1
ER-골지 경계(ER-Golgi Border)로의 α-1,2-만노시다제의 도입
1.1 플라스미드
플라스미드 프로모터 효소 택(tag)
pGAPZMFManHDEL GAP 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제 --
pGAPZMFManMycHDEL GAP 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제 Myc
pPICZBMFManMycHDEL AOX1 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제 Myc
pGAPZMFmManHDEL GAP 마우스 만노시다제 IB 촉매활성 도메인 --
pGAPZMFmMycManHDEL GAP 마우스 만노시다제 IB 촉매활성 도메인 Myc
트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제 유전자가 Maraset al.에 의하여 분리되고 설명되었다(J. Biotechnol. 77 ; 255-263,2000). 이 유전자의 서열은 NCBI Genbank에서 입수 가능하다(Accession No. AF212153). pPIC9MFmanase 플라스미드(Maras et al. (2000)에 기재된 pPPlMFmdsl과 동일)를 주형으로 사용하고 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 구조물 단편을 생성하였다: 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'(SEQ ID NO:2) 및 5'-AGTCTAGATTACAACTCGTCGTGAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCG-3'(SEQ ID N0:3). 얻어진 산물은 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) AOXI 프로모터의 3' 말단, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자의 프리프로-신호 서열(prepro-signal sequence), 신호 서열과 함께 프레임 내에서 클로닝된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제의 오픈 리딩 프레임, HDEL의 코딩 서열, 종결 코돈 및XbaI 절단 부위를 포함하였다. 이러한 단편을EcoRI andXbaI으로 분해시켜, 만노시다제 ORF까지의 5' 서열을 제거한 후,EcoRI 및XbaI로 처리한 pGAPZαA (Invitrogen, Baarn, The Netherlands) 내로 클로닝시켜, 에스.세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자 신호 서열과의 융합을 회복시켰다. 얻어진 플라스미드를 pGAPZMFManHDEL이라 명명하고, 도 1에 도식적으로 나타내었다. pGAPZMFManHDEL 내의 MFManHDEL 융합의 ORF 서열을 SEQ ID NO: 14에 나타내었다.
c-Myc 택을 코딩하는 서열을 촉매활성 도메인과 HDEL-신호 사이에 도입하기 위하여, 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 3' 말단을 센스 프라이머 5' CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC-3'(SEQ ID NO: 4) (SphI 절단 부위를 포함함) 및 안티센스 프라이머 GTATCTAGATTACAACTCGTCGTGCAGATCCTCTTCT GAGATGAGTTTTTGTTCAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCGTGATGATGAA(SEQ ID NO: 5) (c-Myc 택 및 HDEL 신호의 코딩 서열, 그 다음에 종결코돈 및XbaI 절단부위를 포함함)를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을SphI 및XbaI로 처리하고, 아가로스 겔 전기영동에 의하여 정제하고, 동일한 제한 효소로 절단된 pGAPZMFManHDEL 내로 삽입하여, 플라스미드 pGAPZMFManMycHDEL를 얻었다. pGAPZMFManMycHDEL의 ORF을 유도성 AOXI 프로모터 조절하에 놓이게 하기 위하여,BstBI 및XbaI으로 완전한 ORF을 pGAPZMFManMycHDEL로부터 유리시키고, pPICZB(Invitrogen, Baarn, The Netherlands) 내로 클로닝하여, pPICZBMFManMycHDEL을 얻었다.
PCR를 이용하여 마우스 cDNA 라이브러리(시클로헥시마이드(cycloheximide) 및 마우스 종양 네크로시스 인자(mouse Tumor Necrosis Factor)로 유도된 L929 세포주로부터 분리한 mRNA. cDNA 라이브러리의 평균 삽입 길이는 2000 bp임) 상에서 C-말단 HDEL-택의 코딩 서열의 첨가를 수반하는 마우스 만노시다제 IB 촉매활성 도메인의 클로닝을 수행하였다. 사용된 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 다음과같다: 5'AACTCGAGATGGACTCTTCAAAACACAAACGC3'(SEQ ID NO: 6) 및 5'TTGCGGCCGCTTACAACTCGTCGTGTCGGACAGCAGGATTACCTGA3'(SEQ ID NO: 7). 얻어진 산물은 5'XhoI 부위 및 C-말단 HDEL-부위의 코딩서열, 그 다음에 3' 말단 쪽에 종결 코돈 및NotI 부위를 포함하였다. 이 산물을 PCR 산물 및 벡터 내의XhoI/NotI 부위를 통하여 pGAPZαA 내로 클로닝시키고, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자 신호 서열을 갖는 마우스 만노시다제 효소활성 도메인의 프레임 융합을 얻었다. 생성된 완전한 오픈 리딩 프레임의 서열을 SEQ ID NO: 15에 나타내었다.
1.2 효모 형질전환 및 게놈 통합
모 균주(Parental strain) 형질전환된 DNA
GS 115 (his4) pGAPZMFManHDEL
pPIC9MFManHDEL
pPIC9mManHDEL
pPIC9mMycManHDEL
pGAPZmManHDEL
pGAPZmMycManHDEL
GS 115 (pPIC9InfluenzaHA에 의하여 보완된 his4) pGAPZMFManHDEL
pGAPZmManHDEL
pGAPZmMycManHDEL
PPY120H (pPIC9sOCH1에 의하여 보완된 his4) pGAPZMFManMycHDEL
pPICZBMFManMycHDEL
yGC4 (pBLURA5'PpOCHl에 의하여 보완된 his4 argl ade2 ura3) pPIC9InfluenzaNeuraminidase
pGAPZMFManHDEL
pPIC9Glucoseoxidase
피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대한 모든 형질전환은 일렉트로포레이션으로 Invitrogen의 사용법에 따라서 수행하였다. 100 ㎍/ml의 제오신(Invitrogen, Baarn, the Netherlands) 및 1 M의 소르비톨을 포함하는 YPD상에서 제오신(Zeocin) 저항 유전자를 운반하는 벡터의 형질전환체를 선별하였다. pPIC9 유도체의 형질전환체의 선별을 히스티딘이 결핍되고 1 M의 소르비톨을 포함하는 최소배지 상에서 수행하였다. 효모 미니프렙법(Yeast Miniprep method, Nucleon)을 이용하여 피히아(Pichia) 균주로부터 정제된 게놈 DNA 상에서 PCR을 이용하여 발현 카세트의 게놈 통합을 검증하였다. 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 유전자 융합과 관련된 모든 경우에 있어서, 사용된 프라이머는 다음과 같다: 만노시다제 ORF의 3' 절반 부분에 대하여 아닐링된(annealed) 센스 프라이머 5'-CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC-3' (SEQ ID NO: 8), 및 본 발명의 모든 발현 구조물들에 존재하는 AOXI 종결 서열에 대하여 아닐링된 안티센스 프라이머 3' AOXI 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCCT-3' (SEQ ID NO: 9). 마우스 만노시다제 트랜스유전자(transgenes)의 게놈 통합을 조절하기 위하여, 다음과 같은 프라미어를 사용하여 PCR 하였다: 센스 프라이머 5'GAP 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA3' (SEQ ID NO: 10, GAP 프로모터에 대하여 아닐링됨) 또는 5'AOXI 5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC3' (SEQ ID NO : 11, AOXI 프로모터에 대하여 아닐링됨), 및 상기한 안티센스 프라이머 3'AOXI. Myc 표지된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제 발현 유니트를 포함하는 발현 구조물에 대하여, 게놈 통합에 대한 추가적인 증거를 프로브로서 완전한 MFManMycHDEL ORF (HighPrime을 이용하여32P 표지됨, Boehringer Mannheim)를 사용하는 서던 블라팅에 의하여 얻었다.
1.3 α-1,2-만노시다제의 발현
인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소를 발현시키는 GS115 균주에서의 α-1,2-만노시다제의 발현을 정성적 노던 블라트를 사용하여 검증하였다. PPY120H 균주에서의 α-1,2-만노시다제의 발현은 항-Myc 웨스턴 블라트에 의하여 검증하였다.
정성적 노던 블라트(Qualitative Northern Blot) -- 피히아(Pichia) 균주로부터 전체 RNA를 정제하고 수율을 분광광도측정으로 측정하였다. 노던 블라팅은 표준적 절차에 의하여 수행하였으며, 부하된 RNA의 양은 블라트를 메틸렌 블루 염색하여 rRNA 밴드를 가시화시킴으로써 측정하였다. HighPrime(Boehringer Mannheim)을 사용하여32P 표지된 만노시다제의Clal/NarI 단편으로 블라트를 검사하였다.
SDS PAGE 및 웨스턴 블라팅-- 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 2x 농축 Laemmli 로딩 버퍼 1 volume 에서 5분 동안 끓여서 전체 효모 세포 용해물을 얻었다. 겔 로딩시키기 전에 상기 용해물을 미량원심분리기(microcentrifuge)에서 잠시동안 회전시킨 후 상청액만을 로딩시켰다. 성장 배지 내로 분비된 단백질의 분석을 위하여, 표준 절차에 따라서 데스옥시콜레이트/트리클로로아세트산(desoxycholate /trichloroacetic acid)을 사용하여 이들 배지 200 ㎕로부터 단백질을 침전시켰다. 펠렛을 2x 농축 Laemmli 로딩 버퍼에 재용해시키고, Tris를 사용하여 상기 용액을 pH-보정하였다. SDS-PAGE를 수행하고 나서, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 반건조 일렉트로블라팅시켰다. 웨스턴 블라팅을 위하여, 9E10 항-Myc 및 항-HA 마우스 모노클로날(Boehringer Mannheim)을 1 ㎍/㎖의 농도로 사용하고, 래빗 항-PDI항혈청(Stressgen)을 1/500 희석하여 사용하였다. 이차 항체는 모노클로날에 대한 알칼라인 포스파타제에 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 및 폴리클로날(Sigma로부터 입수한 이차 항체)에 대한 페록시다제에 콘쥬게이트된 염소 항-래빗 IgG 이었다. 알칼라인 포스파타제에 대해서는 NBT/BCIP 시스템을 사용하고 페록시다제에 대해서는 Renaissance 기질(NENBiosciences)을 사용하여 검출하였다. 루미라거 이미지화 장치(Lumilager imaging device, Boehringer Mannheim) 상에서 후자의 블라트 결과를 이미지화하였다.
도 4에 나타난 결과는, 강력한 구성성 GAP 프로모터로부터 발현되거나 강력한 유도성 AOXI 프로모터로부터 발현되는 경우 모두에 있어서, 대부분의 HDEL-표지된 단백질이 세포내에 남아있다는 것을 보여준다..
1.4 α-1,2-만노시다제의 위치화
수크로스 등밀도 구배 원심법(Isopycnic sucrose density gradient centrifugation) -- HDEL-표지 만노시다제의 위치화를 측정하기 위하여, 강력한 구성성 GAP 프로모터로부터 만노시다제-Myc-HDEL를 발현시키는 세포를 사용하여 세포 하부 분획화를 수행하였다.
간단히 말해서, 습윤 중량 0.5 g의 효모 세포를 1 ml 용해-버퍼(0.6 M 소르비톨, 10 mM β-메르캅토에탄올 및 5 mM MgCl2을 포함하는 50 mM Tris-HCL pH 7.5)에서 4.5 g 글래스 비드로 4 x 1 min 볼텍싱하여 용해시켰다. 볼텍싱 주기 사이에, 상기 혼합물을 얼음위에 5분동안 놓아두었다. 상청액을 취하고 글래스 비드를용해-버퍼로 세척하고, 이러한 세척 단계의 상청액을 상기 첫 번째 상청액에 첨가하였다. 이러한 용해물에 대하여 서로 다른 원심분리 절차를 수행하였다. 용해 버퍼에서 P10000 펠렛을 60% 수크로스 용액 0.5 ml에 용해시켰다. 이 용액을 14 x 89 mm 울트라클리어 초원심분리관(Ultraclear ultracentrifuge tube, Beckman)의 바닥에 넣었다. 이어서, 각각 1.5 ml의 55%, 50%, 45%, 42.5%, 40% 및 37.5%의 수크로스 용액을 서로 층을 이루도록 조심스럽게 넣었다. 관의 나머지를 35% 수크로스로 채웠다. Beckman 모델 L8-70 예비 초원심분리기 내의 Beckman SW 41 회전통 내에서 180,000g으로 14 시간동안 수크로스 등밀도 구배 원심분리를 수행하였다. 다 마친 후, 윗부분에서 l ml 분획물을 취하고, 과량의 수크로스로부터 부분적으로 투석시키고, 진공 원심분리기에서 건조해질 때까지 증발시켰다. 펠렛을 Laemmli 버퍼에 재용해시킨 후, 시료를 3중으로 SDS-PAGE 수행하고, 웨스턴 블라트를 각각 항-HA, 항-Myc 또는 항-PDI(단백질 디설파이드 이소머라제를 위한 "PDI")로 처리하였다.
결과는 MFManMycHDEL가 단백질 디설파이드 이소머라제 마커 단백질(또한 HDEL 신호 서열과 함께 표적화됨)과 거의 정확하게 공-침강한다는 것을 보여준다(도 5). 동일한 분석에 있어서, HA-표지된 OCHI가, 만노시다제 및 PDI를 포함하는 분획물의 밀도 보다 낮은 밀도를 갖는 분획 내 가장 많은 양으로, 전체 구배에 걸쳐서 분포하였다. 이러한 결과는 HDEL 신호를 첨가함으로써 만노시다제가 원하는 위치(ER-골지 경계부분)로 표적화되었다는 것을 나타낸다. 이와 반대로, 유도성 알코올 옥시다제 I 프로모터(GAP 프로모터에 유사하게 강력함)로부터 발현되는, HDEL을 갖지 않는 만노시다제가 약 20 mg/l의 높은 수준으로 분비된다.
면역형광 현미경법(Immunofluorescence microscopy) -- 만노시다제Myc-HDEL이 정확하게 표적화되었는지 확인하기 위하여, 면역형광 현미경 실험을 수행하였다.
간단히 말해서, 효모 배양물을 YDP(pGAPZMFManMycHDEL의 경우) 또는 pPICZBMFManMycHDEL의 YPGlycerol 증식기 이후에는 YMP에서 OD600까지 성장시켰다. 포름알데히드를 최종 농도 4%가 되게 하여 배양물에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 세포들을 펠레팅시키고, 1mM MgCl2및 4% 포름알데히드를 함유하는 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 pH 6.5에 재현탁시키고, 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 펠레팅 후, 세포들을 1mM MgCl2및 무-EDTA 컴플리트TM프로테아제 억제제 칵테일(EDTA-free CompleteTMprotease inhibitor cocktail, Boehringer Mannheim)를 함유하는 100 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 pH 7.5에 OD600=10이 될 때까지 재현탁시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액에 0.6 ㎕의 β-메르캅토-에탄올 및 20 ㎕의 20,000 U/ml 자이몰리아제(Zymolyase) 100T(ICN)을 첨가하고, 이어서 부드럽게 흔들면서 25분 동안 배양하였다. 이들 세포를 인큐베이션 버퍼에서 2 번 세척하고, 폴리-라이신 코팅된 커버 슬립(이들은 종이에서의 천공(perforation)을 강화하기 위하여 일반적으로 사용되는 점착성 링을 사용하여 제조됨)에 첨가하였다. 과량의 액체를 면봉으로 빨아들이고 이들 세포를 20 ℃에서 건조시켰다. 모든 블로킹, 항체 배양 및 세척 단계를 0.05% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 내에서 수행하였다. 1차 항체를 2㎍/㎕ 사용하고, 플루로포어(flurophores, 분자 프루브)와 콘쥬게이트된 이차 항체를 5 ㎍/㎕ 사용하였다. 핵을 핵산 염료 HOECHST 33258로 염색하였다. 고정시킨 후, 세포벽 투과성(permeabilization), 효모 세포 형태의 보전을 위상차 현미경법으로 체크하고, 면역염색(immunostaining) 후, 코닥 디지털 카메라를 갖춘 Zeiss Axiophot 형광 현미경 하에서 슬라이드를 검사하였다. 상을 Macprobe 4.0 소프트웨어를 사용하여 처리하고, 코렐 포토페인트(Corel Photopaint) 9.0으로 제작하였다.
골지 마커 단백질 OCH1-HA은 문헌에 기재된 전형적인 골지 염색 패턴(반점 모양(speckle-like) 염색)을 나타내었다. 9E10 모노클로날 항-Myc 항체를 사용하는 염색은 만노시다제-Myc-HDEL를 인지하여 세포질 내에서 몇 몇 이질적인 염색 패턴을 갖는 핵주위 염색 패턴을 보였고, 이는 ER 표적화를 매우 잘 나타내는 것이다(도 4).
상기한 실험들에 기초하여, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 만노시다제-Myc-HDEL이 ER-골지 경계 부분으로 표적화되었다고 결론지을 수 있다.
실시예 2
재조합 당단백질과 만노시다제-HDEL의 공동-발현
트리파노소마 크루지 트랜스-시알리다제( Trypanosoma cruzi trans -Sialidase)와 만노시다제-HDEL의 공동-발현
C-말단 반복 도메인을 갖지 않는 활성 트랜스 시알리다제 구성원을 코딩하는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 트랜스-시알리다제 유전자가 여기에 참조로서 포함되어 있는 Laroy et al.(Protein Expression and Purification20: 389,2000)에 기재되어 있다. 이러한 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 트랜스-시알리다제 유전자는 NCBI Genbank를 통하여 입수가능하다(Accession No. AJ276679). 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 발현시키기 위하여, 전체 유전자를 pHILD2 (Invitrogen, San Diego, CA)에서 클로닝하여, pHILD2-TS를 제조하였다. 보다 잘 분비되게 하기 위하여, 트랜스-시알리다제가 효모 α-교배 인자의 프리프로 분비 신호와 결합되어 있는 pPIC9-TS를 제작하였다. 트랜스-시알리다제의 C-말단에 에피토프 E-택이 첨가되어 있어서 탐지 및 정제가 용이한 플라스미드pPIC9-TSE 및 pCAGGS-프리프로-TSE를 제작하였다. pHILD2-TS, pPIC9-TSE 및 pCAGGS-프리프로-TSE의 구조는 여기에 참조로서 포함되어 있는 Laroy et al. (2000)에 기재되어 있다. 상기 제작에 사용된 벡터 중 pCAGGS는 http://www.belspo.be/bccm/lmbp.htm#main (No. LMBP 2453)을 통하여, pHILD2 및 pPIC9는 Invitrogen, San Diego, CA를 통하여, pCANTAB-5E는 Pharmacia Biotech를 통하여 입수가능하다.
플라스미드 pPIC9-TSE를 SstI로 선형화시키고 제조자의 사용설명서(Invitrogen)에 따른 일렉트로포레이션에 의하여 피. 파스토리스(P. pastoris) GS115 (his4) 균주 내로 형질전환시켰다. 형질전환체 중 하나를 플라스미드 pGAPZMFManHDEL로 추가적으로 형질전환시켜서, 만노시다제-HDEL 및 트리파노소마 크루지(Tiypanosoma cruzi) 트랜스-시알리다제를 공동-발현시키는 균주를 제작하였다.
발효 및 단백질 정제는 "Laroy et al. (2000)"에 기재된 바에 따랐다.
정제된 트랜스-시알리다제를 "Callewaert et al.,Glycobiology11, 4, 275-281, 2001"에 따라 탄수화물 분석하였다. 간단하게 말해서, 96-웰 플레이트의 벽에서 당단백질을 PVDF 멤브레인에 결합시키고, 환원시키고, 알킬화시키고 펩타이드-N-글루코시다제 F 탈글리코실화(peptide-N-glycosidase F deglycosylation) 시켰다. 환원성 아미노화에 의하여 글리칸이 8-아미-1,3,6-파이렌트리술폰산과 함께 유도되었다. 이어서, 과량의 유리 표지(label)을 세파덱스 G10-packed 스핀 컬럼을 사용하여 제거하고, 클리칸을 ABI 377A DNA-시퀀서 상의 36 cm 시퀀싱 겔 상에서의 일렉트로포레이션에 의하여 분석하고 빌트-인 아르곤 레이저를 사용하여 검출하였다. 20 mM 소듐 아세테이트 pH=5.0에서 3 mU/ml의 정제된 티. 레세이(T. reesei) α-1,2-만노시다제(Maras et al.,J. Biotechnol.77, 255-63,2000에 기재됨)를 사용하여 분해하였다. 1 ㎍의 정제된 재조합 당단백질로부터 유래한 글리칸을 기질로 사용하였다. α-1,2-만노시다제 1U를 37 ℃ 및 pH=5.0에서 1 분당 빵 효모 만난으로부터 1 μmol의 만노스를 방출하는 효소의 양으로 정의하였다.
도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 패널 B, 트랜스-시알리다제 상의 주요한 N-글리칸은 Man8GlcNAc2(소의 RNAseB의 N-글리칸 분석을 나타낸 패널 F와 비교. 이 분석표의 하나의 마지막 피크가 Man8GlcNAc2이며, 첫 번째 피크가 Man5GlcNAc2임) 이었다. 생체 외에서, 이러한 글리칸은 α-1,2-만노시다제에 의하여 Man5GlcNAc2로 분해가능하였다(도 6, 패널 C). 만노시다제-HDEL와 공동-발현된 트랜스-시알리다제의 N-글리칸 분석표에 있어서, 주된 피크는 Man5GIcNAc2에 해당한다(도 6, 패널 D).
인플루엔자 A 바이러스 적혈구 응집소와 만노시다제-HDEL의 공동-발현
인플루엔자 A 바이러스 적혈구 응집소는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 9 내지 12 개의 만노스 잔기를 포함하는 고-만노스 N-글리칸으로 글리코실화된다고 알려져 있다(Saelens et al. Eur. J. Biochem. 260: 166-175,1999). 적혈구 응집소의 N-글리칸 상에서 공동발현된 만노시다제의 효과를 하기되는 N-글리칸 프로파일링(profiling)법으로 검사하였다. 또한, 트리코데르마(Trichoderma) 효소(최적온도 60 ℃)의 효능을 최적온도 37 ℃인포유류 만노시다제와 비교하기 위하여, 마우스 cDNA-라이브러리로부터 얻은 마우스 만노시다제 IB를 클로닝하고, PCR 증폭을 이용하여 HDEL 신호로 표지하였다. 이러한 ORF을 GAP 프로모터 조절하의 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) α-교배 인자의 프리프로-신호 서열 다음에 클로닝하였다. mRNA 수준에서의 만노시다제-HDEL 트랜스유전자의 발현을 정성적 노던 블라팅에 의하여 확인하였다.
적혈구 응집소를 발현시키고 만노시다제를 발현시키지 않는 대조군 균주 및 "Kulakosky et al.Glycobiology8: 741-745 (1998)"에 기재된 절차에 따라서 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 만노시다제-HDEL 또는 마우스 만노시다제 IB-HDEL를 공동 발현시키는 균주로부터 정제하였다. 정제된 적혈구 응집소를 "Saelens et al.Eur. J, Biochem. 260 : 166-175,1999"에 기재된 바와 같이 PNGase F 분해하였다. 단백질과 글리칸을 냉각(ice-cold) 아세톤 3 volumes으로 침전시키고, 60% 메탄올로 펠렛으로부터 글리칸을 추출하였다. 진공 증발 후, 1.2M 시트르산 내 20 mM APTS 및 DMSO 내 1M NaCNBH3의 1:1 혼합물 1 ㎕를 첨가하고 37 ℃의 250 ㎕ PCR-튜브의 바닥에서 16 시간동안 배양함으로써 글리칸을 8-아미노-1,3,6-파이렌트리술폰산으로 라벨링하였다. 10 ㎕의 탈이온수를 첨가하여 반응을 종결시키고, 혼합물을 진동 버킷 회전기 내에서 원심분리하여 마이크로스핀-컬럼 내 건조상태로 패킹된 1.2 cm 세파덱스 G10 베드 상에 로딩시켜서, 평평한 레진 표면을 제공하였다. 로딩 후, 50 ㎕의 탈이온수를 조심스럽게 레진 베드에 첨가하고 스핀 컬럼을 테이블탑 원심분리기에서 750g으로 5초동안 간단하게 원심분리시켰다. 이러한 용리 공정을 두 번 반복하고 모든 용리액을 모아서 Speedvac 진공 원심분리기(Savant)에서 건조상태가 될 때까지 증발시켰다. 내부적 참조 기준으로 소용이 있는, 로다민(rhodamine, Perkin Elmer Bioscience)으로 라벨링된, 50% 포름아미드 및 0.5㎕ Genescan 500TM을 포함하는 겔 로딩 버퍼 1.5 ㎕에서 상기 라벨링된 글리칸을 재구성하였다. 이러한 혼합물을 아크릴아미드:바이사크릴아미드(Biorad, Hercules, CA, USA)가 19:1인 혼합물 10%를 포함하고 표준 DNA-시퀀싱 버퍼(89 mM Tris, 89 mM 보레이트, 2.2 mM EDTA)로 메이크업된 DNA-시퀀싱 겔 상에 로딩시켰다. 물 내의 10% 암모노늄퍼설페이트(ammononiumpersulfate) 용액 200 ㎕와 TEMED 20 ㎕를 첨가함으로써 겔의 중합화를 촉진하였다. 상기 겔은 표준 36 cm well-to-read 길이였고, Applied Biosystems Model 373A DNA-시퀀싱 장치상에 런닝시켰다. 상기 겔의 프리런닝(prerunning)을 1000 V에서 15분 동안 수행하고, 로딩 후, 상기 겔을 가열하지 않고 1250 V에서 8시간 동안 전기영동하였다. 이러한 방법은 피크당 10 fmol의 검출 제한을 나타냈다. 상기 데이타를 Genescan 3.0 소프트웨어로 분석하였다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제는 N-글리칸 상에 존재하는 α-1,2-만노스의 수에 있어서 가장 완벽한 감소를 제공하엿다. 마우스 만노시다제 IB-HDEL에 의한 N-글리칸 처리는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제보다 덜 효과적이었다.
적혈구 응집소의 N-글리칸으로부터의 효율적인 α-1,2-만노스 제거에도 불구하고, Man5GIcNAc2는 얻어지지 않았다. N-글리칸을 정제된 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제로 분해한 다음에도, 가장 작은 당 사슬로서 오직 Man6GlcNAc2만이 얻어졌다. 이러한 결과는 잔존하는 잔기들이 개시 OCH1 α-1,6-만노실트랜스퍼라제 효소 활성에서 유래하는, α-1,6-결합 만노스일 가능성을 나타낸다. OCH1는 골지의 매우 앞부분에 위치화하고, 만노시다제-HDEL에 의하여 Man8GIcNAc2전구체가 Man5GlcNAc2로 완전하게 분해되기 전에 적혈구 응집소의 N-글리칸에 작용할 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 글리칸이 α-1,6-만노실트랜스퍼라제에 의하여 유효하게 변형된 단백질에 있어서, 트랜스퍼라제를 코딩하는 OCH1 유전자의 불활성화는 Man5GlcNAc2을 갖는 단백질을 얻기 위하여 바람직할 것이다.
실시예 3
피히아( Pichia ) Och1 유전자의 불활성화:
피히아 파스토리스(Pichia pastoris)의 한 서열을 GenBank(Accession No. E12456)에서 찾을 수 있으며, 여기에 참조로서 포함되어 있는 일본특허출원제07145005호에 개시되어 있다. 이 서열은 α-1,6-만노실트랜스퍼라제의 모든 특성을 보여주고, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) OCH1과 가장 상동성이 있어서, 여기서는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) Och1 유전자라 칭한다.
우선, 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) Och1 유전자의 전체 ORF을 pUC 18 내에서 PCR 클로닝하여 플라스미드 pUC18pOchl를 얻었다. pUC18pOchl를 HindIII로 절단하고, T4 폴리머라제로 블런트 말단을 형성하고, 그리고 나서,XbaI로 절단하여, 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) Och1 유전자의 5' 부분을 포함하는 단편을 방출시켰다. 이러한 단편을,EcoRI으로 절단되고 T4 폴리머라제로 블런트 말단이 형성되고 나서NheI으로 절단된 벡터 pBLURA IX(Keck Graduate Institute, Dr. James Cregg, http://www.kgi.edu/html/noncore/faculty/cregg/cregg.htm로부터 입수가능)내로 연결시켰다. 도 8에 나타난 바와 같이, 이러한 연결에 의하여 pBLURA5'PpPCHl이 생성되었다.
이러한 피히아(Pichia) 게놈 내에서의 피히아(Pichia) Och1 유전자의 파괴는, 도 9에 나타낸 바와 같이, pBLURA5'PpOCHl을 사용하는 단일 동성 재조합에 의하여 달성될 수 있다. 단일 동성 재조합의 결과, 피히아(Pichia) 염색체 상의 Ochl 유전자를 2 개의 Ochl 서열로 대체시킬 수 있다: 하나는 단지 전체 Ochl ORF의 처음 약 1/3으로 구성되며, 다음 하나는 Ochl 프로모터 없이 전체 Ochl ORF로 구성된다. 단일 상동 재조합은 다음과 같이 수행한다. 피히아(Pichia) 균주 yGC4의 세포들을 단일 커터BstBI로 선형화된 pBLURA5'PpOCHl을 사용하여 일렉트로포레이션시킴으로써 형질전환시켰다. 약 500 개의 형질전환체를 1M 소르비톨, 비오틴, 아르기닌, 아데닌 및 히스티딘을 포함하는 최소 배지 상에서 얻어서 27 ℃에서 배양하였다. 이들 형질전환체 중 32개를 골라서 동일한 조건 하에서 재-선별하였다. PCR에 의하여 카세트의 정확한 게놈 통합을 위하여 12 개의 클론을 추가적으로 분석하였다. 12 개의 URA 독립영양 클론 중 7개가 정확한 자리에 카세트를 포함하고 있었다.
Ochl-불활성화된 클론 중 하나를 또한 pGAPZMFManHDEL를 사용하여 추가적으로 형질전환시켜서 "초형질전환체(supertransformants)"를 제조하였다. ManHDEL를 또한 발현시키는 3 개의 초형질전환체 및 Ochl-불활성화된 클론 모두 다음과 같은 세포벽 글리칸 분석에서 평가하였다. 효모 세포를 10 ml YPD에서 OD600=2까지 성장시키고, 효모 세포를 120 ℃, 20 mM 소듐 시트레이트 버퍼 pH 7에서 90 분동안 오토클레이빙하고 원심분리 후 상청액을 회수하여 만노단백질(mannoproteins)을 제조하였다. 찬 메탄올 3 volumes을 사용하여 단백질을 상기 상청액으로부터 침전시켰다. 이러한 방법으로 얻어진 단백질 표본을 "Callewaert et al. (2001)Glycobiology11, 275-281"에 기재된 바와 같이 DSA-FACE를 사용하는 N-글리칸 분석에 사용하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 모 균주 yGC4와 비교하여, Ochl-불활성화된 클론에서 Man8GIcNAc2글리칸의 양이 증가하였으며, 이는 Och1 효소의 활성이 감소하였음을 나타낸다. HDEL-표지된 α-1,2-만노시다제를 또한 발현시키는 3 개의 초형질전환체에 있어서, Man5GlcNAc2의 생산이 관찰되었다. 게다가, 정제된 재조합 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다제 3 mU/ml를 이용한 동일한 글리칸 혼합물의 분해에 있어서, 모 균주보다 pBLURA5'PpOCH1로 형질전환된 균주에서 보다 많은 Man5GlcNAc2가 생성되었다(도 11, 패널 2와 3 비교).
이러한 결과는 α-1,2-만노시다제를 발현시키는 세포들로부터 얻은 적혈구 응집소와 같이 재조합적으로 생산된 단백질 상에서의 Man5글리칸의 생산의 결여는 Och1 단백질의 활성에 기인한다는것을 확인시키는 것이다. 또한. 이러한 결과는 Man5글리칸을 갖는 당단백질의 생산이 Och1 유전자의 불활성화에 의하여 촉진된다는 것을 나타낸다.
실시예 4
피히아 파스토리스( Pichia pastoris )에서의 글루코시다제 II의 발현
4.1 에스. 세레비시애( S. cerevisiae )로부터 GLSII 알파-서브유니트 ORF의 증폭
Nucleon 키트(Amersham)를 사용하여 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 INVS(α, leu2-3, 112 his3Δl, trpl-289, ura3-52)로부터 게놈 DNA를 제작하였다. 상기 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 LA TaKaRa 폴리머라제(ImTec Diagnostics)를 사용하여 터치-다운 PCR 반응을 수행하였다. PCR 프라이머의 서열은 공지된 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) GLSII ORF 서열을 기초로 하였다:
4.2 피히아 파스토리스( Pichia pastoris ) 발현 벡터 내로의 에스. 세레비시애( S. cerevisiae ) 글루코시다제 II ORF의 클로닝
글루코시다제 II 발현 벡터의 제작-- 상기 PCR 단편을XhoI/ApaI로 분해시키고 pGAPZA 벡터(Invitrogen) 내로 연결시킴으로써, OFR을 GAP 프로모터의 전사 조절 하에 위치시켰다. 이러한 방법을 사용하여, myc 및 His6 택을 글루코시다제 II에 대한 프레임 내에 위치시키고, pGAPZAGLSII를 생성시켰다. 그리고 나서, pGAPZAGLSII의 완전한 ORF을 시퀀싱하여 PCR 반응 중에 돌연변이가 발생하지 않았음을 확인하였다. 벡터 pGAPZAGLSII의 서열을 SEQ ID NO: 18에 나타내었다. pGAPZAGLSII 벡터의 GLSII ORF을 벡터 pPICZA(Invitrogen) 내로 클로닝하여 pPICZAGLSII를 제조함으로써, ORF을 AOXI 프로모터의 전사 조절 하에 위치시켰다. pGAPZAGLSII 벡터의 GLSII ORF 벡터 pAOX2ZA 내로 클로닝함으로써, ORF을 AOX2 프로모터의 전사 조절 하에 위치시켰다. 이 벡터는 pAOX2ZB 벡터의 멀티 클로닝 사이트를 pPICZA의 멀티 클로닝 사이트로 대체시켜서 제조하였다. AOX2 유전자의 AOX2 프로모터 부위에 의하여 pPICZB의 AOX1 프로모터를 대체시킴으로써 벡터 pAOX2ZB를 만들었다(Martinet et al., Biotechnology Letters 21). AOX2 프로모터 부위를 피히아(Pichia) 게놈 DNA 상에서 센스 프라이머 5'GACGAGATCTTTTTTTCAGACCATATGACCGG 3' (SEQ ID NO: 26) 및 안티센스 프라이머 5'GCGGAATTCTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGT 3' (SEQ ID NO: 27)를 사용하는 PCR에 의하여 생성시켰다. pGAPZGLSII 벡터의 GLSII ORF를 벡터 pYPTlZA 내로 클로닝하여 pYPTIZAGLSII를 생성시킴으로써, ORF을 YPT1 프로모터의 전사 조절 하에 위치시켰다. pPICZA의 AOX1 프로모터를 플라스미드pIB3 (GenBank accession number AF027960) 상에 존재하는 YPT1 프로모터로 대체시킴으로써 벡터 pYPTZA를 제조하였다(Sears et al., Yeast 14, pg 783790,1998). 모든 구조체는 플레오마이신(phleomycin) 저항 유전자를 포함한다. 얻어진 최종 발현 벡터(pGAPZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pPICZAGLSII 및 pYPTIZAGLSII)를 도 12 내지 15에 나타내었다.
암피실린 저항 마커 및 피히아(Pichia) ADE1 선별 마커를 운반하는, 유사한 발현 벡터를 제작하였다. 원칙적으로, 플라스미드 pAOX2ZAGLSII, pGAPZAGLSII 및 pYPTIZAGLSII의 제오신 저항 발현 카세트를 벡터 pBLADE IX (Cregg, J. M.)의 암피실린 및 피히아(Pichia) ADE1 카세트로 대체하여, 벡터 pAOX2ADElglsII, pGAPADElglsII 및 pYPTlADElglsII을 얻었다. 글루코시다제 II 오픈 리딩 프레임을 벡터 pBLADE IX (Cregg, J. M.)의 멀티플 클로닝 사이트 내로 삽입시킴으로써 벡터 pPICADElgIsII를 얻었다. 얻어진 최종 발현 벡터(pGAPADElglsII, pAOX2ADElglsII, pPICADElglsII 및 pYPTlADElglsII)를 도 16 내지 20에 나타내었다.
글루코시다제 II 발현 벡터에 ER 체류 택 HDEL의 첨가-- 다음과 같은 프라이머를 HDEL-포함 PCR 단편의 제작에 사용하였다:
프라이머 1: 5'GCG GGT CGA C/ CA C/GA C/GA A/CT G/TG A/GT TTT AGC CTT
SalI H D E L stop
AGA CAT GAC 3' (SEQ ID NO : 28)
프라이머 2: 5'CAG GAG CAAA GCTCGT ACGAG 3' (SEQ ID NO : 29)
SplI
60 ℃에서 Taq pol.을 사용하여 pGAPZAGLSII 상에서 PCR을 수행하였다. 225 bp의 PCR 단편을SalI/SplI으로 절단하고SalI/SplI 개방 pGAPZAGLSII 벡터 내로 연결시켜서, 플라스미드 pGAPZAglsIIHDEL를 제작하였다. 플라스미드 pGAPZAglsIIHDEL의 서열을 SEQ ID NO: 24에 나타내었다. 제작 방법 및 얻어진 최종 발현 벡터(pGAPZAglsIIHDEL 및 pGAPADElglsIIHDEL)를 도 20 내지 21에 나타내었다.
4.3 피히아 파스토리스( Pichia pastoris ) 균주의 형질전환
Invitrogen에 기재된 바와 같은, 통상적인 일렉트로포레이션 기술을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주 PPY12-OH의 세포들을 단일 커터AvrII로 절단된 pGAPZGLSII를 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환체들을 그들의 제오신 저항성에 기초하여 선별하였다.
형질전환체의 게놈 분석-- 몇 몇 제오신 저항성 피히아(Pichia) 형질전환체로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 글루코시다제 II 유전자가 효모 게놈 내로 통합되었는지 아닌지를 결정하기 위하여 게놈 DNA 상에서 PCR 반응을 수행하였다. Taq DNA 폴리머라제(Boehinger)(2.5 mM MgCl2, 55 ℃ 에서 아닐링)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈 DNA 상의 ORF의 증폭에 사용하였던 것과 동일한 프라이머를 사용하였다. 글루코시다제 II ORF을 나타내는 특정 PCR 산물의 존재에 의하여 pGAPZAGLSII 형질전환체를 확인하였다.
4.4 피히아 파스토리스( Pichia pastoris )에서의 에스. 세레비시애( S. cerevisiae ) 글루코시다제 II 알파 서브유니트의 발현 및 분비
전사 수준의 분석-- 게놈 분석 후 양성으로 평가된 형질전환체로부터 RNA를 제조하였다. RNA는 페놀을 사용하여 제조하였다. 각각의 시료로부터, 15 ㎍의 RNA를 포름알데히드 아가로스 겔 상에 로딩시켰다. 전기영동 후, RNA를 Hybond N 멤브레인 상에 빨아들였다. 글루코시다제 TT ORF의 3' 부위에 해당하는 344bp 글루코시다제 II 특이적 단편으로 구성된 방사성 프로브를 사용하여 상기 멤브레인을 혼성화시켰다. 형질전환체에 대해서는 뚜렷한 신호가 관찰되었지만, 형질전환되지 않은 대조군 균주에서는 신호가 검출되지 않았다.
이중 멤브레인 에세이를 사용하는 단백질 수준 분석-- 니트로셀룰로오스 멤브레인을 완충된 덱스트로스 메디아(BMDY) 상에 올려놓았다. 이 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 놓았다. pGAPZAGLSII의 피히아(Pichia) 형질전환체를 셀룰로오스 아세테이트 상에 도말(streaked)하고, 몇일 정도 배양하였다. 분비된 단백질은 이 멤브레인을 통과했지만, 효모 세포는 셀룰로오스 아세테이트 상에 남아있었다. 이와 같이, 분비된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 모았다. 며칠 후, 효모 콜로니를 포함하는 셀룰로오스 아세테이트를 제거하였다. 항-myc 항체를 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 글루코시다제 II가 존재하는지를 분석하였다. 형질전환되지 않은 균주, WT, 에서 희미하고 거의 보이지 않는 신호가 나타난 것과 비교하여, 대부분의 형질전환체에서는 뚜렷한 신호가 나타났다.
세포외 발현- 구조물 pGAPZAGLSII(mychis6) (균주 12,14 및 18)의 PPY12-OH 형질전환체 및 구조물 pGAPZAGLSII(myc)HDEL (균주 H1, H2 및 H3)의 형질전환체를2x10 ml BMDY 배지 상에서 2 일동안 배양하였다. 이들 6 개의 형질전환체는 게놈 수준(gDNA 상에서의 PCR) 및 RNA 수준(노던 블라트) 모두에 있어서 양성으로 측정되었다. 원심분리하여 배양액을 취하고, Vivaspin 컬럼으로 약 1 ml까지 농축하였다. 이러한 농축물로부터 얻은 단백질을 TCA로 침전시키고, Laemmli 버퍼에서 재현탁시키고 SDS-PAGE 분석을 위하여 로딩시켰다. 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 블라팅하였다. 블라트를 항-myc Ab와 함께 하룻밤동안 배양하였다. 이차 Ab를 페록시다제에 결합시켰다. Renaissance luminiscence 검출 키트(NEN) 및 감광 필름(light sensitive film, Kodak)을 사용하여, 형질전환체 12, 14 및 18에 대하여 약 110 kDa에서 강한 밴드를 관찰하였으며, 이는 GLSII가 이들 형질전환체로부터 발현되고 분비된다는 것을 나타낸다. 형질전환체 H1-3에서는 신호가 관찰되지 않았으며, 이는 GLSII ORF의 C-말단에 첨가된 HDEL 택이 단백질의 ER 위치화를 초래하여 GLSII가 성장 배지로 분비되는 것을 억제한다는 것을 나타낸다.
세포내 발현- 상기 6 개의 형질전환체 및 WT 균주를 500 ml의 BMDY에서 2 일동안 배양하였다. 세포를 원심분리하여 수집하고, 세척하고, 최소 부피(50 mM Tris. HCl pH 7.5,5% 글리세롤)에 재현탁시키고, 글래스 비드를 사용하여 파쇄하였다. 몇 가지 원심분리 단계(저속 원심분리(2000 내지 3000g))를 통하여 세포 파편들을 제거하였다. 초원심분리를 통한 상청액으로부터 멤브레인을 얻었다. 펠렛을 Laemmli 버퍼에 재현탁시키고, SDS-PAGE 분석을 위하여 로딩시켰다. 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에서 블라팅하였다. 항-myc Ab와 이차 Ab와 콘쥬게이트된 페록시다제를 사용하여 세포내 GLSII 발현을 체크하였다. 발광 검출 후, GLSIIHDEL형질전환체(H1 및 H3, H2에 대해서는 희미한 신호)에 대하여 약 110 kDa에서 밴드가 관찰되었지만, WT 및 GLSII 발현 균주에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 C-말단 HDEL 택과 함께 발현 시, 재조합 GLSII의 세포내 존재를 분명하게 나타낸다. 이러한 택이 존재하지 않을 때 GLSII는 세포내에서 검출되지 않았다.
4.5 재조합 글루코시다제 II 알파 서브유니트의 정제 및 활성 분석
GLSII를 다음과 같이 분석하고 양성 대조로서 상업적으로 입수가능한 효모 알파-글루코시다제(Sigma)를 사용하여 테스트하였다.
조성: 70 ㎕의 80 mM 포스페이트-시트레이트 버퍼 pH 6.8, 7 ㎕의 250 mM 만노스, 3.5 ㎕의 250 mM 2-데옥시-D-글루코스, 0.8 ㎕의 4-MeUmbelliferyl-알파-D- 글루코피라노시드(l μM). 3 가지 분석을 수행하였다: 한 가지는 1 단위의 상업적으로 입수가능한 효소를 사용하고, 한 가지는 효소를 사용하지 않고, 또 한 가지는 효소는 사용하지만 기질은 사용하지 않는다. 분석 혼합물을 30 ℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 자외선 조사 시, 효소와 기질을 모두 포함하는 반응 혼합물만이 형광을 나타내었다(도 22). 이는 상기 분석이 알파-글루코시다제의 활성 검출에 있어서 매우 특이적이라는 것을 나타낸다.
WT PPY12-OH, 균주 18 및 균주 H3를 2 일동안 2x10 ml 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 회전시키고 배지를 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸로 조정하고 Vivaspin 컬럼으로 0.5-l ml까지 농축시켰다. 배지를 Ni-NTA 회전 컬럼(Qiagen) 상에 로딩시키고 제조자 사용법에 따라서 정제를 수행하였다. Protein was elutedfrom the column in 2x100 ㎕ 용리 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 pH 8.0)에서 컬럼으로부터 단백질을 용리시켰다. 각각의 용리액으부터, 20 ㎕를 취하여 글루코시다제 II 활성을 검사하였다. 20 ㎕의 용리 버퍼 내에서 희석된 상업적으로 입수가능한 효소 0.33 유니트를 양성 대조군으로 사용하였다. 양성 대조군 및 효소를 성장 배지로 분비하는 균주 18의 용리액에서 형광이 관찰되었다. 이러한 결과는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에 의하여 분비되는 재조합 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) GLSII 알파 서브유니트가 기능적으로 활성인 효소라는 것을 보여준다. GLSII가 세포내 발현되었기 때문에 이러한 활성은 WT(형질전환되지 않음) 균주, 및 균주 H3 모두에서 나타나지 않았다(도 23). 이러한 결과는 또한 베타 서브유니트가 단백질의 알파 부분의 작용(functionality)에 필요하지 않다는 것을 보여준다.
실시예 5
글루코시다제 II 및 만노시다제를 모두 발현시키는 피히아( Pichia ) 균주의 제작
균주 GS115를 pGAPZGLSII와 pGAPZglsIIHDEL로 형질전환시켰다. 형질전환체를 YPDSzeo 상에서 선별하였다.
균주 yGC4를 다음의 구조물들로 각각 형질전환시켰다:
(1) pGAPADEglslI 및 pGAPADEglsIIHDEL, 아데닌을 포함하지 않는 합성 소르비톨 배지 상에서 선별;
(2) pGAPZMFManHDEL: YPDSzeo 상에서 선별; 및
(3) pGAPZMFManHDEL/pGAPADEglsIIHDEL: 아데닌을 포함하지 않고 제오신을 포함하는 합성 소르비톨 배지 상에서 선별.
OCH1 녹-인을 포함하고 MFmannosidaseHDEL를 발현시키는 균주 yGC4를 pGAPADEglsII 및 pGAPADEgIsIIHDEL로 형질전환시켰다. 아데닌과 우라실을 포함하는 합성 소르비톨 배지 상에서 형질전환체를 선별하였다.
모든 형질전환에 대하여, 콜로니를 얻었다. PCR에 의하여 결정되고, 게놈 내로 통합된 발현 벡터(들)을 포함하는 형질전환체를 얻었다. 이들 형질전환체 중 몇몇으로부터 GLSII 발현이 관찰되었다.

Claims (34)

  1. α-1,2-만노시다제 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 메틸요구성 효모 균주에서 α-1,2-만노시다제 또는 상기 기능적 부분을 발현시킬 수 있는 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 α-1,2-만노시다제가 진균류로부터 유래하는 단백질인 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 진균이 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)인 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 α-1,2-만노시다제가 포유류로부터 유래하는 단백질인 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 α-1,2-만노시다제가 쥐의 α-1,2-만노시다제 IA 또는 IB인 벡터.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 α-1,2-만노시다제 또는 상기 기능적 부분이 ER-체류 신호(ER-retention signal)로 표지된 벡터.
  7. 제 6 항에 있어서 상기 ER-체류 신호가 펩타이드 HDEL을 포함하는 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 α-1,2-만노시다제 또는 상기 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 프로모터 및 3' 종결 서열에 조작가능하게 연결된 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 프로모터가 AOXI, AOXII, GAP 및 FLD로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자의 프로모터인 벡터.
  10. pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL, pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL 및 pGAPZmMycManHDEL로 이루어진 군 중에서 선택되는 벡터.
  11. 글루코시다제 II 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 메틸요구성 효모 균주에서 글루코시다제 II 또는 이의 기능적 부분을 발현시킬 수 있는 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 글루코시다제 II가 진균류로부터 유래한 단백질인 벡터.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 진균류가 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 벡터.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 글루코시다제 II가 포유류로부터 유래하는 단백질인 벡터.
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 글루코시다제 II 또는 이의 기능적 부분이 ER-체류 신호로 표지된 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 ER-체류 신호가 펩타이드 HDEL을 포함하는 벡터.
  17. 제 11 항에 있어서, 상기 α-1,2-만노시다제 또는 상기 기능적 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 프로모터 및 3' 종결 서열과 조작가능하게 연결되어 있는 벡터.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 프로모터가 AOXI, AOXII, GAP 및 FLD로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자의 프로모터인 벡터.
  19. pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII, pGAPADEglsII, pPICADEglsII, pAOX2ADEglsII, pYPTIADEgIsII, pGAPZAglsIIHDEL 또는pGAPADEglsIIHDEL를 포함하는 벡터.
  20. Och1 유전자 부분과 선별 마커 유전자를 포함하고, 상기 Och1 유전자 부분과 상기 선별 마커 유전자가 메틸요구성 효모 균주에서 게놈 Och1 유전자의 파괴를 초래하도록 연결되어 있는, 메틸요구성 효모 균주 내 Och1 유전자를 파괴하기 위한 벡터.
  21. pBLURA5'PpOCHl을 포함하는 벡터.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항의 벡터 중 어느 한 가지를 사용하여 메틸요구성 효모를 형질전환시키는 것을 포함하는, 메틸요구성 효모로부터 생산되는 단백질 상에서의 글리코실화를 감소시키는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 효모가 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 효모가 GS115(NRRL Y-15851), GS190(NRRL Y-18014), PPF1(NRRL Y-18017), PPY12-OH, yGC4, 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)인 방법.
  25. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모가 이종 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작되어 있는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 21 항의 벡터 중 적어도 하나를 사용하여 형질전환된, 메틸요구성 효모 균주의 유전적으로 조작된 균주.
  27. 제 1 항 내지 제 21 항의 벡터 중 적어도 하나를 사용하여 메틸요구성 효모 세포를 형질전환시키고, 형질전환시킨 세포로부터 당단백질을 생산하는 것을 포함하는, 메틸요구성 효모로부터 발현되는 이종 당단백질의 글리코실화를 감소시키는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 21 항의 벡터 중 한 가지 이상 및 메틸요구성 효모 내에서 당단백질을 발현시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열로 메틸요구성 효모 세포를 형질전환시키고, 형질전환시킨 세포로부터 상기 당단백질을 생산하는 것을 포함하는, 메틸요구성 효모 내에서 글리코실화가 감소된 당단백질을 생산하는 방법.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항의 방법에 의하여 생산된 당단백질.
  30. 제 29 항에 있어서, 메틸요구성 효모의 야생형 균주로부터 생산된 당단백질과 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 당단백질.
  31. 제 29 항에 있어서, 인간 치료에의 사용에 적합한 당단백질.
  32. 제 1 항 내지 제 21 항의 벡터 중 어느 하나를 포함하는 키트.
  33. 제 32 항에 있어서, 메틸요구성 효모 균주를 추가적으로 포함하는 키트.
  34. 제 26 항의 메틸요구성 효모 균주를 포함하는 키트.
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