CN107422020A - 用于高通量聚糖分析的装置、方法、计算机程序产品和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于高通量聚糖分析的装置、方法、计算机程序产品和试剂盒。公开了用于聚糖分析的装置。所述装置包括适合接收多个样品的多个上样孔；与上样孔对应排列的多个毛细管，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；和与毛细管对应排列且适合接收已穿过毛细管的样品部分的多个洗脱孔。

Description

用于高通量聚糖分析的装置、方法、计算机程序产品和试剂盒
本申请是申请号为201280050173.3母案的分案申请。该母案的申请日为2012年8月10日；发明名称为“用于高通量聚糖分析的装置、方法、计算机程序产品和试剂盒”。
背景
1. 技术领域
本申请主要涉及用于高通量聚糖分析的装置、方法和计算机程序产品。
2. 背景技术
与蛋白质表面相连的碳水化合物或聚糖在确保正确的细胞和蛋白功能以及介导蛋白折叠、信号传导和其它重要细胞系统中发挥重要作用。然而，聚糖分析是富有挑战性的，涉及耗时的样品制备和复杂的低通量分析技术。存在对有效和简单允许实施聚糖高通量分析同时保持足够的分辨率和灵敏度的新的和改进的装置、方法和计算机程序产品的需求。这样的需求特别适用于多个领域，包括例如其中需要快速有效分析大量聚糖的学术研究和工业研究以及生物生产和制药工业。
发明内容
提供用于高通量聚糖分析的装置、系统、方法和计算机程序产品。
在一个方面，提供用于聚糖分析的装置。所述装置包括：(1)适合接收多个样品的多个上样孔；(2)与上样孔对应排列的多个毛细管，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；和(3)与毛细管对应排列且适合接收已穿过毛细管的样品部分的多个洗脱孔。
在一个方面，提供用于聚糖分析的毛细管阵列。该毛细管阵列包括：(1)至少五个基本上相互平行排列的毛细管，每个毛细管包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶和排列在毛细管第二部分的预灌注分离胶，和(2)排列在至少五个毛细管的对侧使得该至少五个毛细管形成单一单元的第一和第二支撑结构。
在一个方面，提供了存储在计算机可读媒体中的信息元素文库。所述信息文库包括：(1)当毛细管经受电场时迁移穿过毛细管(包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分)的多个单个带电、荧光标记聚糖所对应的多个由实验得出的毛细管迁移时间；和(2)葡聚糖阶梯所对应的迁移时间。
在一个方面，提供用于高通量聚糖分析的方法。所述方法包括：(1)将多个糖蛋白样品加入多个上样孔中；(2)使用变性溶液变性上样孔中的糖蛋白样品；(3)使用聚糖裂解酶从上样孔中的每个变性糖蛋白样品上裂解聚糖；(4)用带电荧光标签标记所裂解的聚糖；和(5)施用电场，该电场配置为使标记聚糖从上样孔穿过离子渗透膜并进入且沿着与上样孔对应排列的多个毛细管中的一个迁移，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；(6)用适合导致标记聚糖发射荧光辐射的光源激发沿着毛细管迁移的标记聚糖；(7)检测标记聚糖所发射的荧光辐射；和(8)基于所检测的荧光辐射分析标记聚糖。
在一个方面，提供制造用于高通量聚糖分析的毛细管阵列的方法。所述方法包括：(1)提供多个毛细管；(2)向每个毛细管中预灌注第一部分的成层胶和第二部分的分离胶；和(3)在对侧将毛细管结构性连接，使得毛细管基本上相互平行排列并形成单一单元。
在一个方面，提供用于产生聚糖数据库的方法。所述方法包括：(1)通过实验获得当毛细管经受电场时已迁移穿过毛细管(包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分)的多个单个带电、荧光标记聚糖所对应的多个由实验得出的迁移时间；和(2)将所收集的与已迁移穿过毛细管的多个单个带电、荧光标记聚糖中的每一个的识别信息相对应的多个由实验得出的迁移时间排列进入配置为计算机可访问的数据库。
在一个方面，提供用于鉴定多个聚糖的方法。所述方法包括：(1)用带电荧光标签标记聚糖；(2)使标记聚糖沿着多个毛细管(沿基本平行的方向进入电场)迁移，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；(3)基于检测的标记聚糖所发射的荧光辐射，确定每种标记聚糖相对于荧光标记葡糖糖标准阶梯的迁移时间；和(4)比较相对迁移时间与当毛细管经受电场时已迁移穿过毛细管(包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分)的多个单个带电、荧光标记聚糖所对应的由实验得出的迁移时间的数据库。
在一个方面，提供用于聚糖分析的试剂盒。所述试剂盒包括：(1)用于聚糖分析的毛细管阵列，包括至少五个基本上相互平行排列的毛细管，每个毛细管包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶和排列在毛细管第二部分的预灌注分离胶，和排列在至少五个毛细管的对侧使得该至少五个毛细管形成单一单元的第一和第二支撑结构；(2)适于变性糖蛋白的变性溶液；(3)适于裂解聚糖的聚糖裂解酶溶液；和(4)适于标记所裂解聚糖的荧光标记溶液。
在一个方面，提供用于聚糖分析的试剂盒。所述试剂盒包括：(1)适于变性糖蛋白的变性溶液；(2)适于裂解聚糖的聚糖裂解酶溶液；和(3)适于标记所裂解聚糖的荧光标记溶液。
上述概括描述和下列详细描述仅为示例性的，并且不以任何方式限制本发明的范围。可从下列详细描述中认识到或可通过实践本发明了解到本文所具体论述的其它实施方案或实施方案的变化，包括本文所论述的实施方案的特征的各种组合。
附图说明
附图阐明了本文所公开的各种示例性实施方案。这些附图仅为示例性的，并且不以任何方式限制本发明的范围。
图1说明了用于聚糖制备和分析的示例性装置。
图2说明了用于聚糖制备和分析的示例性系统。
图3说明了示例性聚糖制备和分析工作流。
图4A-4D说明了示例性毛细管阵列和相关的聚糖分辨率和灵敏度数据。
图5说明了七种碳水化合物的毛细管凝胶电泳和聚糖分辨率及灵敏度数据。
图6说明了用于聚糖制备和分析的示例性装置。
图7说明了示例性系统及相关的聚糖分析数据。
图8-10说明了关于在毛细管阵列系统上低聚麦芽糖标准和来自IgG及其它糖蛋白的聚糖的分离的各种数据和电泳图谱；Applied Biosystems3130 Genetic Analyzer。
具体实施方式
如本文所使用的，术语“抗体”指(a)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即，免疫球蛋白家族多肽，或其片段，其包含与特异性抗原(例如CD70)免疫特异性结合的抗原结合部位和包含复杂的N-糖苷-连接糖链的Fc结构域，或(b)这些免疫球蛋白多肽或与抗原(例如CD70)免疫特异性结合的片段的保守取代衍生物。抗体在例如，Harlow &Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (抗体：实验室手册) (冷泉港实验室出版社，1988)中概述。除非另外在上下文中显而易见，提到抗体还包括如下文中更详细描述的抗体衍生物。
如本文所使用的，“抗体衍生物”意指如上所定义的抗体(包括抗体片段)或包含复杂的N-糖苷连接糖链的抗体Fc结构域或区域，其通过共价连接异源分子修饰，例如通过连接异源多肽(例如异源蛋白的配体结合结构域)，或通过糖基化(核心岩藻糖基化除外)、去糖基化(非核心岩藻糖基化除外)、乙酰化、磷酸化或通常与抗体或Fc结构域或区域无关的其它修饰。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”指从单细胞克隆(包括任何真核或原核细胞克隆)或噬菌体克隆衍生的抗体，而非其生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。
如本文所使用的，术语“Fc区域”指抗体的恒定区，例如，CH1-铰链-CH2-CH3结构域，任选具有CH4结构域，或这样的Fc区域的保守取代衍生物。
如本文所使用的，术语“Fc结构域”指抗体的恒定区结构域，例如，CH1、铰链、CH2、CH3或CH4结构域，或这样的Fc结构域的保守取代衍生物。
如本文所使用的，术语“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”并非指具有较少岩藻糖残基与其连接的单个糖蛋白。而是指从细胞或从包含细胞所分泌的糖蛋白的细胞培养基制备物中制备的“糖蛋白制备物”。所述糖蛋白制备物包含一群单个的糖蛋白分子，且该群体的成员具有不同的糖基化特征。为了说明而非限制的目的，对于修饰的CHO细胞所表达的IgG1抗体，“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”指在Fc的第297位聚糖的N-连接GlcNAc残基上具有岩藻糖残基的较少量的单个糖蛋白。所述“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”指与从缺乏修饰的细胞系或在含有(比如说)岩藻糖类似物(其减少岩藻糖基化)的培养基中生长的细胞系中制备的相同糖蛋白的群体相比，相对低(或减少)数目的其上具有岩藻糖残基的糖蛋白群体。举例说明，如果与由野生型细胞或在不含(比如说)岩藻糖基化抑制剂的细胞培养基中制备的相同糖蛋白相比糖蛋白为1%岩藻糖基化的，则与在相应野生型细胞中所观察到的岩藻糖基化的量(强制设置为100%，无论在相同条件下野生型细胞中是否所有的含Fc蛋白分子均被岩藻糖基化)相比，仅1%的含Fc蛋白分子被岩藻糖基化。
因此，在“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”的糖蛋白中，与不包含修饰的细胞或未在岩藻糖基化修饰剂(例如，岩藻糖类似物样的小分子)存在情况下生长的细胞相比，岩藻糖基化减少了约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个具体的实施方案中，与不包含修饰或无岩藻糖抑制剂下生长的细胞相比，减少了约99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。在另一个具体的实施方案中，与不包含修饰或无岩藻糖抑制剂下生长的细胞相比，减少了约98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%或98.9%。在另一个具体的实施方案中，与不包含修饰或无岩藻糖抑制剂下生长的细胞相比，减少了约97.1%、97.2%、97.3%、97.4%、97.5%、97.6%、97.7%、97.8%或97.9%。在另一个具体的实施方案中，与不包含修饰或无岩藻糖抑制剂下生长的细胞相比，减少了约96.1%、96.2%、96.3%、96.4%、96.5%、96.6%、96.7%、96.8%或96.9%。在另一个具体的实施方案中，与不包含修饰或无岩藻糖抑制剂下生长的细胞相比，减少了约95.1%、95.2%、95.3%、95.4%、95.5%、95.6%、95.7%、95.8%或95.9%。在另一个具体的实施方案中，与不包含修饰或无岩藻糖抑制剂下生长的细胞相比，减少了约94.1%、94.2%、94.3%、94.4%、94.5%、94.6%、94.7%、94.8%或94.9%。
图1说明了用于聚糖制备和分析的示例性装置，其可通过使用用于复杂糖形的高通量阵列筛选技术和高分辨率分析技术进行样品制备和分析两者以简化聚糖分析。所述装置可纯化单个的聚糖，并且还可用于蛋白分离。图2说明了用于聚糖制备和分析的示例性系统，其在与具有聚糖数据库和识别软件的计算机相联的装置内包含毛细管阵列。
根据各种示例性实施方案，可使用PNG酶将N-连接聚糖酶裂解，并且可使用包含酰肼官能团或羟基胺官能团(例如，羰基反应基)的修饰染料(例如，ALEXA FLUOR 448等)在100微升样品孔中在聚糖的还原末端对其进行在线荧光标记。标记可涉及在糖羰基和荧光团酰肼之间形成腙或在糖羰基和荧光团羟胺之间形成肟。由于染料中可存在的磺酸，标记聚糖可继承负电荷，因此，其可在电场中迁移。所述标记聚糖接着可通过毛细管凝胶电泳分离并可使用例如用于激发的激光二极管(例如，488 nm)和用于检测的CCD相机(包括，例如，510 nm带通滤波器)通过荧光检测。由于其迁移通过激光/检测器，检测可产生显示代表单个聚糖的峰的电泳图谱。ALEXA FLUOR 448可提供足够线性范围内的荧光以用于定量。
如图1中所示，聚糖可使用经受约200-400 V/cm、运行时间约10-15分钟的电场(通过连接在毛细管10相对末端的正极3和负极1产生)的毛细管10分离。毛细管10可包括由约4%-8%丙烯酰胺(或相当的凝胶基质)组成的成层毛细管凝胶部分5和分离(分析)毛细管凝胶部分6。在各个不同的实施方案中，分离毛细管凝胶部分6可在成层毛细管凝胶部分5之后填装至毛细管10。分离毛细管部分可由约25%-35%的丙烯酰胺(或相当的凝胶基质)组成。整个毛细管10的长度(成层部分5和分离部分6)可在约5 cm至约15 cm之间，并且毛细管可按多达约20个毛细管10的阵列12排列。每个毛细管10内径约200微米，以确保足够的分辨率和灵敏度分析复杂的样品。所述系统的检测极限可为约1飞摩尔至100阿摩尔之间的聚糖。为了更高的灵敏度和分辨率，可使用50-100微米的更小内径的毛细管。
根据各个不同的实施方案，上述装置、系统和程序可用于制备和纯化单个聚糖。具体地，紧接着荧光检测，聚糖可从毛细管阵列12的末端洗脱进入取样孔，在此其可被技术员/研究者移走(纯化)用于进一步分析(例如，质谱)。这有利地允许开发用于聚糖鉴定的保留时间数据库。为了更高通量或更大量聚糖的纯化，可有利地使用更大的毛细管阵列，该阵列可具有约1 mm的较大内径。
根据各个不同的实施方案，可通过比较聚糖的保留时间(在电泳图谱上)与葡聚糖阶梯标准(例如，相差一个葡萄糖分子的荧光标记碳水化合物低聚体)鉴定聚糖。葡聚糖阶梯可与聚糖样品平行运行，然后可通过定位特定聚糖相对于葡萄糖阶梯洗脱的时间点将其鉴定。特定聚糖结构和分子量的已知保留时间可预先记录在由实验得出的数据库中，然后可搜索该数据库。分析软件可接着比较未知聚糖电泳谱图上峰的保留时间(相对于葡聚糖阶梯)与保留时间数据库，以鉴定聚糖。所述软件可包括对IgG聚糖以及其它聚糖和糖形具有特异性的数据库。
根据各个不同的实施方案，上述系统和程序可不仅用于聚糖分离和检测，还用于使用SDS-PAGE毛细管的蛋白分离/纯化。在这种情况下，毛细管内径可为约1 mm，并且可包含4-12%梯度的丙烯酰胺。
根据各个不同的实施方案，上述系统和程序可用于较容易的样品制备(例如，在线标记)以及用于可能在几小时而非数天、可能甚至最终在几分钟内更迅速地完成从糖蛋白到识别聚糖的分析。
根据各个不同的实施方案，上述系统和程序可与多个ALEXA FLUOR荧光团(例如，ALEXA FLUOR 350酰肼、ALEXA FLUOR 488酰肼、ALEXA FLUOR 647酰肼、ALEXA FLUOR 594酰肼和ALEXA FLUOR 555酰肼等)一起使用。ALEXA FLUOR荧光团的亮度可允许较高的灵敏度，多个颜色的ALEXA FLUOR的使用可允许不同样品之间聚糖的相对定量。
根据各个不同的实施方案，上述系统和程序可用于简化样品制备。所述凝胶基质可处理相对“脏的”包含蛋白和盐污染物的样品，这可减少样品制备时间，肼ALEXA FLUOR可有助于在线且不使用酸的标记。聚糖结构极为复杂时，制定合成标准是不切实际的。
根据各个不同的实施方案，上述系统和程序的纯化能力可允许开发用于聚糖识别的数据库。该聚糖保留时间数据库和聚糖识别软件将有利地允许不熟悉质谱的普通生物学家/科学家能够进行高端聚糖分析。
根据一个示例性实施方案，提供了用于聚糖分析的装置，包括：(1)适于接收多个样品的多个上样孔2；(2)与上样孔2对应排列的多个毛细管10，每个毛细管2包括包含成层胶5的第一部分和包含分离胶6的第二部分；和(3)与毛细管10对应排列并且适于接收已穿过毛细管10的样品部分的多个洗脱孔4。
在所述装置中，每个上样孔2可为通往毛细管10中的一个的导管。每个上样孔2可为一个通过离子渗透膜8与毛细管10中的一个流体连通的容器。每个上样孔2可具有例如约10 μl至约500 μl之间、或约50 μl至约150 μl之间的体积容量。每个洗脱孔4可具有例如约10 μl至约500 μl之间、或约50 μl至约150 μl之间的体积容量。所述装置还可包括包含缓冲溶液的储液器，储液器15通过离子渗透膜8与上样孔2流体连通。缓冲溶液可为TBE。所述装置还可包括配置为将样品加入上样孔的上样器。
毛细管10可基本上相互平行。毛细管10例如可具有基本上圆的横截面，或可具有基本上为矩形的横截面。毛细管10可在结构上连接以形成可作为整体移动的毛细管阵列单元12。毛细管阵列单元12可配置为单次使用和一次性的。每个毛细管10可配置为单次使用和一次性的。成层胶部分5可为预灌注成层胶，并且可包含例如约4%至约8%之间的丙烯酰胺，或约6%的丙烯酰胺。分离胶部分6可为预灌注分离胶，并且可包含例如约25%的丙烯酰胺至约35%的丙烯酰胺，或约30%的丙烯酰胺。在各个不同的实施方案中，成层胶部分5可包含约6%的丙烯酰胺，而分离胶部分6可包含约30%的丙烯酰胺。
每个毛细管10第一部分(即，成层胶部分5)的长度可在约5 cm至约15 cm之间，每个毛细管10第二部分(即，分离胶部分6)的长度可在约5 cm至约15 cm之间。每个毛细管第一和第二部分的总长例如可在约10 cm至约30 cm之间，或可为约10 cm。毛细管10可包括例如至少5个毛细管10、至少10个毛细管10或至少20个毛细管10。多个毛细管10可包括至少5个基本上相互平行排列的毛细管10，每个毛细管10包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶和排列在毛细管第二部分的预灌注分离胶，毛细管10还包括排列在对侧以形成单一毛细管阵列单元的第一和第二支撑结构。毛细管可具有例如约150微米至约250微米之间、或约50微米至约100微米之间、或约0.1毫米至约2.5毫米之间、或约0.5毫米至约1.5毫米之间的内径。
所述装置还可包括排列在上样孔2和毛细管10之间的离子渗透膜8。所述装置还可包括至少两个排列在毛细管对侧的电极，所述至少两个电极可为铂电极，并且可包括排列在毛细管10和洗脱孔4之间的正极1和排列在毛细管和上样孔2之间的负极3。所述装置还可包括与至少两个电极连接的电源，并且该电源配置为使至少部分毛细管经受电场。该电场的强度可例如在约200 V/cm至约400 V/cm之间、或约250 V/cm至约350 V/cm之间。所述装置还可包括配置为使毛细管经受电磁辐射的光源19，该光源可例如为二极管激光器、蓝色氩离子激光器或黄色氪离子激光器。电磁辐射可为波长在例如约400-500 nm范围内或约500-600 nm范围内的辐射。所述装置还可包括配置为检测从毛细管发射的荧光的荧光检测器14，该荧光检测器可为CCD相机或CMOS相机。所述装置还可包括排列在毛细管和CCD相机之间并且配置为允许波长为约510 nm的辐射通过的带通滤波器16。所述装置可为台式装置，并且可具有不超过约十二英寸的最大宽度、深度或高度。
所述装置还可包括配置为处理荧光检测器所检测荧光相关信号的信号处理器，所述信号处理器可配置为产生显示代表已经迁移穿过毛细管10的单个聚糖的峰的电泳谱图，以显示每个聚糖从毛细管10末端洗脱前通过荧光检测器16的时间点。所述装置还可包括与荧光检测器14相连的计算机20，该计算机20配置为处理荧光检测器14所检测荧光相关的信号。计算机20可配置为产生显示代表已经迁移穿过毛细管10的单个聚糖的峰的电泳谱图，以显示每个聚糖从毛细管10末端洗脱前通过荧光检测器14的时间点。计算机20可包含或配置为访问由实验得出的聚糖迁移时间的数据库，并且可包含或配置为访问和运行这样的计算机程序产品，其配置为查询所述由实验得出的聚糖迁移时间数据库，以比较通过用该装置进行实验所得的迁移时间从而识别在实验中已迁移通过毛细管10的单个聚糖。
根据一个示例性实施方案，提供了用于聚糖分析的毛细管阵列12，包括：(1)至少五个基本上相互平行排列的毛细管，每个毛细管包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶5和排列在毛细管第二部分的预灌注分离胶6，和(2)排列在至少五个毛细管的对侧使得所述至少五个毛细管形成单一单元的第一和第二支撑结构。
所述毛细管阵列单元12可配置为单次使用和一次性的。成层胶部分5可包含例如约4%至约8%之间的丙烯酰胺，或约6%的丙烯酰胺。分离胶部分6可包含例如约25%的丙烯酰胺至约35%的丙烯酰胺，或约30%的丙烯酰胺。在各个不同的实施方案中，例如，成层胶部分5可包含约6%的丙烯酰胺，而分离胶部分6可包含约30%的丙烯酰胺。
每个毛细管10第一部分的长度可在约5 cm至约15 cm之间，每个毛细管10第二部分的长度可在约5 cm至约15 cm之间。每个毛细管10第一和第二部分的总长例如，可在约10cm至约30 cm之间，或可为约10 cm。毛细管阵列12可包括例如至少5个毛细管、至少10个毛细管或至少20个毛细管。该阵列12可包括例如，至少10个基本上相互平行排列的基本圆筒状的毛细管(每个毛细管包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶5和排列在毛细管10第二部分的预灌注分离胶6)，或至少20个基本上相互平行排列的基本圆筒状的毛细管(每个毛细管包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶5和排列在毛细管10第二部分的预灌注分离胶6)。
所述毛细管可具有例如约100微米至约300微米之间、或约150微米至约250微米之间、或约50微米至约100微米之间、或约0.1毫米至约2.5毫米之间、或约0.5毫米至约1.5毫米之间的内径。所述阵列12还可包括排列在每个毛细管至少一个末端上的离子渗透膜8。
根据一个示例性实施方案，提供了存储在计算机可访问媒体中的信息元素文库，包括：(1)当毛细管经受电场时已迁移穿过毛细管(包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分)的多个单个带电、荧光标记聚糖所对应的多个由实验得出的毛细管迁移时间；和(2)葡聚糖阶梯所对应的迁移时间。
所述葡聚糖阶梯可例如包括含有数量递增的葡萄糖分子的低聚体(递增的数量从一个葡萄糖分子出发至约20个葡萄糖分子)，或可包括具有多个合成麦芽糖的线性低聚体。葡聚糖阶梯可从消化的淀粉中提取。多个单个聚糖所对应的由实验得出的迁移时间可包括例如多个多糖、或多个寡糖、或多个蛋白聚糖、或多个糖蛋白、或多个糖脂、或多个O-连接聚糖、或多个N-连接聚糖所对应的由实验得出的迁移时间。所述文库还可包含多个由实验得出的显示代表单个聚糖的峰的电泳图谱，并且还可包含由实验得出的显示峰的电泳图谱，所述峰包括至少一个对应于葡聚糖阶梯的峰。
图3说明了根据各个不同实施方案的示例性聚糖制备和分析工作流。所述方法可包括下列工作流步骤：(步骤32)将多个糖蛋白样品加入多个上样孔中；(步骤34)使用变性溶液变性上样孔中的糖蛋白样品；(步骤36)使用聚糖裂解酶从上样孔中的每个变性糖蛋白样品上裂解聚糖；(步骤38)用带电的荧光标签标记所裂解的聚糖；(步骤40)施用配置为使标记聚糖从上样孔通过离子渗透膜进入并沿着与上样孔对应排列的多个毛细管中的一个迁移的电场，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分，并用适合导致标记聚糖发射荧光辐射的光源激发沿着毛细管迁移的标记聚糖；和(步骤42)检测由标记聚糖发射的荧光辐射；并基于所检测的荧光辐射分析标记聚糖。
在各个不同的实施方案中，任选的(步骤44)可插入聚糖分析工作流中。(步骤44)涉及聚糖在(步骤38)中标记后向上样孔中加入外切糖苷酶。
在各个不同的实施方案中，将糖蛋白样品加入上样孔中可包括将每个糖蛋白样品加入通向一个毛细管的导管中。在各个不同的实施方案中，变性上样孔中的糖蛋白样品可包括使用SDS变性糖蛋白样品。在各个不同的实施方案中，将糖蛋白样品加入上样孔中可包括将每个糖蛋白样品加入与一个毛细管流体连通的容器中，并且可包括例如，将约10μl至约500μl之间的每个糖蛋白样品加入一个上样孔中，或将约50μl至约150μl之间的每个糖蛋白样品加入一个上样孔中。在各个不同的实施方案中，所述方法还可包括将每个糖蛋白样品与缓冲溶液混合，该缓冲溶液可为TBE。
在各个不同的实施方案中，从每个变性糖蛋白样品裂解聚糖可包括例如，使用PNGase F，或使用内切糖苷酶H，或使用Endo D、Endo Fl、Endo F2和Endo F3中的一种或多种，或使用ABS (产脲节杆菌唾液酸酶)、NAN1 (重组唾液酸酶)、AMF (杏仁粉α-岩藻糖苷酶)、BKF (牛肾α-岩藻糖苷酶)、BTG (牛睾丸β-半乳糖苷酶)、SPG (肺炎链球菌β-半乳糖苷酶)、GUH (肺炎链球菌己糖胺酶，大肠杆菌重组体)和JBM (刀豆甘露糖苷酶)中的一种或多种，或使用肽-N-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶裂解聚糖。使用肽-N-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶裂解聚糖可包括裂解N-连接聚糖。
在各个不同的实施方案中，用带电荧光标签标记所裂解的聚糖可包括例如，用8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠，或用7-氨基-1,3-萘二磺酸钾，或用4-氨基-萘磺酸钠，或用包含酰肼官能团的带电荧光标签，或用包含ALEXA FLUOR 350酰肼、ALEXA FLUOR 488酰肼、ALEXA FLUOR 647酰肼、ALEXA FLUOR 594酰肼和ALEXA FLUOR 555酰肼中的一种或多种的带电荧光标签，或用包含ALEXA FLUOR 350羟胺、ALEXA FLUOR 488羟胺和ALEXA FLUOR 647羟胺中的一种或多种所包括的羟胺官能团的带电荧光标签，或用包含8-酰肼-芘-3,6,8-三磺酸盐(8-hydrazide-pyene-3,6,8-trisulfonate)中所包括的酰肼官能团的带电荧光标签，或用包含8-羟胺-芘-3,6,8-三磺酸盐(8-hydroxylamine pyrene-3,6,8-trisulfonate)中所包括的羟胺官能团的带电荧光标签在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。用带电荧光标签标记所裂解的聚糖可包括使用APTS、ANTS、ANDA和ANSA中的一种或多种在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。所述带电荧光标签可包含磺酸。标记可涉及在糖羰基和荧光团酰肼之间形成腙或在糖羰基和荧光团羟胺之间形成肟。
在各个不同的实施方案中，施用电场可包括施用例如强度在约200 V/cm至约400V/cm之间或约250 V/cm至约350 V/cm之间的电场，并且该电场可施用例如约10分钟至约15分钟内的一段时间。激发标记聚糖可包括例如用可为激光器二极管并且可具有约400-500nm范围内或约500-600范围内波长的光源激发标记聚糖。检测荧光辐射可包括使用荧光检测器检测荧光辐射，并且可包括使用带通滤波器(可为510 nm带通滤波器)将定向至荧光检测器的荧光辐射过滤。
在各个不同的实施方案中，分析标记聚糖可包括基于荧光检测器或配置为处理获自荧光检测器的一个或多个信号的信号处理器或计算机所产生的电泳图谱分析标记的聚糖，所述电泳图谱显示这样的峰，其代表沿着毛细管迁移并且被荧光检测器检测到的单个聚糖。在各个不同的实施方案中，分析标记聚糖可包括将所测量的迁移时间与荧光标记葡聚糖标准阶梯的迁移时间和对于预先记录在由实验得出的数据库中的特定聚糖结构及分子量的已知迁移时间相比较。
在各个不同的实施方案中，将糖蛋白样品加入上样孔中还可包括上样葡聚糖标准阶梯，分析标记的聚糖可依赖其相对于葡聚糖标准阶梯的迁移时间。葡聚糖阶梯标准可包括荧光标记的由葡萄糖分子组成的线性多糖，其包括具有从1个葡萄糖分子至约23个葡萄糖分子按单位增加改变的葡萄糖分子数目的多糖链。葡聚糖阶梯标准可例如用包含荧光团ALEXA FLUOR 350羟胺中所包括的羟胺官能团或包含荧光团ALEXA FLUOR 647羟胺中所包括的羟胺官能团的带电荧光标签在糖链的还原末端荧光标记。所述方法还可包括从每个毛细管的末端将标记聚糖洗脱入与毛细管对应排列的多个取样孔中，并且还可包括纯化洗脱的聚糖。方法还可包括在变性、裂解和标记聚糖后，使该聚糖经受外切糖苷酶。
根据一个示例性实施方案，提供了制造用于高通量聚糖分析的毛细管阵列的方法，包括：(1)提供多个毛细管；(2)向每个毛细管内预灌注第一部分的成层胶和第二部分的分离胶；和(3)将毛细管在对侧结构性连接，使得毛细管基本上相互平行排列并形成单一单元。
在所述方法中，预灌注成层胶可包括预灌注包含例如约4%至约8%之间的丙烯酰胺、或约6%丙烯酰胺的成层胶。预灌注分离胶可包括预灌注包含例如约25%的丙烯酰胺至约35%的丙烯酰胺、或约30%丙烯酰胺的分离胶。每个毛细管第一部分的长度可在约5 cm至约15 cm之间，每个毛细管第二部分的长度可在约5 cm至约15 cm之间。每个毛细管第一部分和第二部分的总长可在约10 cm至约30 cm之间。
提供多个毛细管还可包括提供例如至少5个毛细管，或至少10个毛细管，或至少20个毛细管。毛细管可具有例如约100微米至约300微米之间、约50微米至约100微米之间、或约0.1毫米至约2.5毫米之间、或约0.5毫米至约1.5毫米之间的内径。
根据一个示例性实施方案，提供了用于产生聚糖数据库的方法，包括：(1)通过实验获得当毛细管经受电场时已迁移穿过毛细管(包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分)的多个单个带电、荧光标记聚糖所对应的多个由实验得出的迁移时间；和(2)按照已迁移穿过毛细管的多个单个带电、荧光标记聚糖中的每个的鉴定信息，将所收集的多个由实验得出的迁移时间编排入配置为计算机可存取的数据库。
根据一个示例性实施方案，提供了用于识别多个聚糖的方法，包括：(1)用带电的荧光标签标记聚糖；(2)使标记聚糖沿着多个毛细管迁移，所述毛细管沿基本平行的方向定向进入电场，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；(3)基于检测到的由标记聚糖发射的荧光辐射，确定每个标记聚糖相对于荧光标记葡聚糖标准阶梯的迁移时间；和(4)比较相对迁移时间与当毛细管经受电场时已迁移穿过毛细管(包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分)的多个单个带电、荧光标记聚糖所对应的由实验得出的迁移时间的数据库。
根据各个不同的示例性实施方案，用于聚糖分析的装置、阵列或数据库还可识别重组蛋白或糖蛋白的岩藻糖基化状态(例如，其是岩藻糖基化还是非岩藻糖基化)或糖蛋白的岩藻糖基化百分比。
重组治疗蛋白，例如抗体，可经受各种不同的翻译后修饰，包括糖基化，并且在大型生物反应器中在宿主细胞内商业化生产。具有减少或低核心岩藻糖基化水平(下文描述)的抗体在治疗工业中是所期需的，并且已经显示改变Fc效应子功能，特别是Fc γ受体结合和ADCC活性。连接到抗体上Asn297的聚糖，通常被称为具有高水平的“核心岩藻糖基化”。单克隆抗体，例如IgG1，在每个重链的天冬酰胺297 (Asn297)处具有N-连接的糖基化位点。可选地，在糖基化途径中作为酶起作用的小分子抑制剂例如catanospermine导致抗体缺乏复杂的N-连接聚糖结构，因此具有低岩藻糖基化水平。近来，小分子，例如岩藻糖类似物，已经用于生产具有复杂的N-连接聚糖但具有减少核心岩藻糖基化的重组抗体及衍生物(见美国公布号2009/0317869，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)。甚至更最近，已经产生具有岩藻糖基化蛋白能力降低但未敲除岩藻糖基化基因的遗传修饰细胞系(即，修饰的细胞可有条件地岩藻糖基化蛋白，比如说在不同的温度下) (见美国公布号2010/0304436，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)。这些观察结果导致了以下方面的兴趣：鉴定抗体在某些条件下是否具有减少核心岩藻糖基化；以及如果这样的话，糖基化或岩藻糖基化减少的百分比是多少。本发明装置、阵列和方法提供鉴定、表征和分析糖蛋白例如抗体的岩藻糖基化状态的方法。
根据各个不同的示例性实施方案，本文所提出及上文所述系统和程序的纯化能力可允许开发用于岩藻糖基化或非岩藻糖基化聚糖识别的数据库。这样的岩藻糖基化对非岩藻糖基化聚糖保留时间数据库和岩藻糖基化对非岩藻糖基化聚糖识别软件将有利地允许不熟悉质谱的普通生物学家/科学家能够进行高端聚糖分析。岩藻糖基化或非岩藻糖基化聚糖可通过与葡萄糖阶梯标准(例如，相差一个葡萄糖分子的荧光标记碳水化合物低聚体)比较其(电泳图谱上的)保留时间来识别。葡聚糖阶梯可与聚糖样品平行运行，然后可通过定位特定聚糖相对于葡萄糖阶梯的洗脱时间点将其识别。特定岩藻糖基化对非岩藻糖基化聚糖结构和分子量的已知保留时间可预先记录在由实验得出的数据库中，之后可检索该数据库。分析软件可接着比较未知聚糖电泳图谱上峰的保留时间(相对于葡聚糖阶梯)与保留时间数据库，以识别特定的岩藻糖基化对非岩藻糖基化聚糖。该软件可包含IgG岩藻糖基化对非岩藻糖基化聚糖特异性数据库。
根据一个示例性实施方案，提供了用于在重组细胞中表达重组糖蛋白的细胞或细胞系。在一个实施方案中，所述细胞表达含Fc蛋白或糖蛋白。在一个实施方案中，所述含Fc蛋白或糖蛋白为抗体。在某些实施方案中，糖蛋白可在未修饰或修饰的细胞中制备。修饰细胞的实例为敲除FUT基因的细胞、或有条件地岩藻糖基化蛋白的细胞、或生长在用糖类似物例如岩藻糖类似物处理的细胞培养基中的细胞。岩藻糖类似物意指，如下文所述抑制岩藻糖基化的小分子。示例性的小分子包括，但不限于，岩藻糖炔、岩藻糖叠氮化物等，其在美国公布号2009/0317869中描述，其关于各种小分子类似物的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。因此在细胞足以表达蛋白或糖蛋白的条件下在培养基中培养细胞。在某些实施方案中，细胞本身为包含所表达的糖蛋白的样品，在其它实施方案中，包含表达和/或分泌的糖蛋白的培养基为样品。
根据一个示例性实施方案，提供了用于聚糖分析的毛细管阵列，其可识别重组蛋白的岩藻糖基化状态(岩藻糖基化还是非岩藻糖基化)或糖蛋白的岩藻糖基化百分比。此外，在本发明的一个特别的示例性实施方案中，提供了存储在计算机可读媒体中的信息元素文库，其可识别蛋白的岩藻糖基化状态或糖蛋白的岩藻糖基化百分比。
根据另一个示例性实施方案，本文提供了用于高通量聚糖分析的方法，以识别岩藻糖基化对非岩藻糖基化蛋白，所述方法包括：(1)将多个糖蛋白样品加入多个上样孔中；(2)使用变性溶液变性上样孔中的糖蛋白样品；(3)使用聚糖裂解酶从上样孔中的每个变性糖蛋白样品上裂解聚糖；(4)用带电荧光标签标记所裂解的聚糖；和(5)施用电场，该电场配置为使标记聚糖从上样孔穿过离子渗透膜进入并沿着与上样孔对应排列的多个毛细管中的一个迁移，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；(6)用适合导致标记聚糖发射荧光辐射的光源激发沿着毛细管迁移的标记聚糖；(7)检测由标记聚糖发射的荧光辐射；和(8)基于所检测的荧光辐射分析标记聚糖。在这些方法中，岩藻糖基化状态或岩藻糖基化百分比的识别有时还可包括经由HPLC的寡糖分析步骤，其中含岩藻糖基的聚糖或寡糖可通过聚糖峰面积的积分定量，并且例如，蛋白岩藻糖基化可基于聚糖峰面积计算。在一些实施方案中，使用可从Invitrogen市售获得的基于click的糖类似物标记糖蛋白。
在一些实施方案中，可使用本发明装置、阵列或各个不同示例性实施方案研究或比较一个或多个糖蛋白的岩藻糖基化百分比与其它糖蛋白的岩藻糖基化百分比。在一个实施方案中，本发明装置或毛细管阵列可识别不超过约5%岩藻糖基化的表达糖蛋白，或在其它实施方案中，不超过约4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%岩藻糖基化的糖蛋白。在一个特别的实施方案中，岩藻糖基化百分比为岩藻糖对聚糖的摩尔百分比。在一些实施方案中，细胞使含Fc的蛋白糖基化，但基本上不使糖基化的含Fc蛋白岩藻糖基化。在一个特别的实施方案中，与修饰细胞或缺乏岩藻糖基化能力的细胞相比，岩藻糖基化为约不超过糖基化含Fc蛋白的岩藻糖基化的约10%、5%、4%、3%、2%、1%或0.1%。在又一个特别的实施方案中，岩藻糖基化的百分比为岩藻糖对糖蛋白的摩尔百分比。在一个特别的实施方案中，非岩藻糖基化对岩藻糖基化蛋白的摩尔比率为约0.90-0.10、约0.91-0.09、约0.92-0.08、约0.93-0.07、约0.94-0.06、约0.95-0.05、约0.96-0.04、约0.97-0.03、约0.98-0.02或约0.99-0.01。
根据一个示例性实施方案，提供了用于聚糖分析的试剂盒，包括：(1)用于聚糖分析的毛细管阵列，包括至少五个基本上相互平行排列的毛细管(每个毛细管包括排列在毛细管第一部分的预灌注成层胶和排列在毛细管第二部分的预灌注分离胶)和排列在所述至少五个毛细管的对侧使得该至少五个毛细管形成单一单元的第一和第二支撑结构；(2)适于变性糖蛋白的变性溶液；(3)适于裂解聚糖的聚糖裂解酶溶液；和(4)适于标记所裂解聚糖的荧光标记溶液。
根据一个示例性实施方案，提供了用于聚糖分析的试剂盒，包括：(1)适于变性糖蛋白的变性溶液；(2)适于裂解聚糖的聚糖裂解酶溶液；和(3)适于标记所裂解聚糖的荧光标记溶液。
变性溶液可包含SDS。聚糖裂解酶溶液可包含例如PNGase F和内切糖苷酶-H中的一种或多种，或Endo D、Endo Fl、Endo F2、Endo F3、ABS (产脲节杆菌唾液酸酶)、NAN1 (重组唾液酸酶)、AMF (杏仁粉α-岩藻糖苷酶)、BKF (牛肾α-岩藻糖苷酶)、BTG (牛睾丸β-半乳糖苷酶)、SPG (肺炎链球菌β-半乳糖苷酶)、GUH (肺炎链球菌己糖胺酶，大肠杆菌重组体)和JBM (刀豆甘露糖苷酶)中的一种或多种。
荧光标记溶液可包含例如8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠、7-氨基-1,3-萘二磺酸钾、4-氨基-萘磺酸钠、包含酰肼官能团的带电荧光标签、ALEXA FLUOR 350酰肼、ALEXAFLUOR 488酰肼、ALEXA FLUOR 647酰肼、ALEXA FLUOR 594酰肼、ALEXA FLUOR 555酰肼、ALEXA FLUOR 350羟胺、ALEXA FLUOR 488羟胺、ALEXA FLUOR 647羟胺、8-酰肼-芘-3,6,8-三磺酸盐、8-羟胺-芘-3,6,8-三磺酸盐、APTS、ANTS、ANDA和ANSA中的一种或多种。
根据本文所述各个不同的示例性实施方案，一个或多个上述示例性实施方案的一个或多个方面可例如使用DNA测序仪例如APPLIED BIOSYSTEMS 3130遗传分析仪整体或部分进行。
图4A说明了示例性毛细管阵列。图4B-4D说明了相关的聚糖分辨率和灵敏度数据。图5说明了七个碳水化合物的毛细管凝胶电泳和聚糖分辨率及灵敏度数据。图6说明了用于聚糖制备和分析的示例性装置。图7说明了示例性系统和相关的聚糖分析数据。图8-10说明了关于在毛细管阵列系统上分离低聚麦芽糖标准以及来自IgG和其它糖蛋白的聚糖的各种不同数据和电泳图谱；Applied Biosystems3130遗传分析仪。
本发明的其它实施方案对于已经得益于本说明书和/或已经实践本发明一个或多个实施方案的本领域普通技术人员而言将是显而易见的。此外，本说明书(包括附图)均为示例性的，并且不以任何方式限制本发明范围，本发明范围将由权利要求书确定。

Claims (36)

1.用于高通量聚糖分析的方法，包括：
将多个糖蛋白样品加入多个上样孔中；
使用变性溶液变性上样孔中的糖蛋白样品；
使用聚糖裂解酶从上样孔中的每个变性糖蛋白样品上裂解聚糖；
用带电的荧光标签标记所裂解的聚糖；
施用配置为使标记聚糖从上样孔穿过离子渗透膜进入并沿着与上样孔对应排列的多个毛细管中的一个迁移的电场，每个毛细管包括包含成层胶的第一部分和包含分离胶的第二部分；
用适合导致标记聚糖发射荧光辐射的光源激发沿着毛细管迁移的标记聚糖；
检测由标记聚糖所发射的荧光辐射；和
基于所检测的荧光辐射分析标记聚糖。
2.权利要求1的方法，其中变性上样孔中的糖蛋白样品包括使用SDS变性糖蛋白样品。
3.权利要求1的方法，还包括将每个糖蛋白样品与TBE缓冲溶液混合。
4.权利要求1的方法，其中从每个变性糖蛋白样品裂解聚糖包括使用PNGase F裂解聚糖。
5.权利要求1的方法，其中从每个变性糖蛋白样品裂解聚糖包括使用内切糖苷酶H裂解聚糖。
6.权利要求1的方法，其中从每个变性糖蛋白样品裂解聚糖包括使用Endo D、Endo Fl、Endo F2和Endo F3中的一种或多种裂解聚糖。
7.权利要求1的方法，其中从每个变性糖蛋白样品裂解聚糖包括使用ABS (产脲节杆菌唾液酸酶)、NAN 1 (重组唾液酸酶)、AMF (杏仁粉α-岩藻糖苷酶)、BKF (牛肾α-岩藻糖苷酶)、BTG (牛睾丸β-半乳糖苷酶)、SPG (肺炎链球菌β-半乳糖苷酶)、GUH (肺炎链球菌己糖胺酶，大肠杆菌重组体)和JBM (刀豆甘露糖苷酶)中的一种或多种裂解聚糖。
8.权利要求1的方法，其中从每个变性糖蛋白样品裂解聚糖包括使用肽-N-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶裂解聚糖。
9.权利要求1的方法，其中使用肽-N-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶裂解聚糖包括裂解N-连接聚糖。
10.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
11.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用7-氨基-1,3-萘二磺酸钾在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
12.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用4-氨基-萘磺酸钠在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
13.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用包含酰肼官能团的带电荧光标签在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
14.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用包含ALEXAFLUOR 350酰肼、ALEXA FLUOR 488酰肼、ALEXA FLUOR 647酰肼、ALEXA FLUOR 594酰肼和ALEXA FLUOR 555酰肼中的一种或多种的带电荧光标签在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
15.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用包含ALEXAFLUOR 350羟胺、ALEXA FLUOR 488羟胺和ALEXA FLUOR 647羟胺中的一种或多种所包括的羟胺官能团的带电荧光标签在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
16.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用包含8-酰肼-芘-3,6,8-三磺酸盐中所包括的酰肼官能团的带电荧光标签在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
17.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括用包含8-羟胺-芘-3,6,8-三磺酸盐中所包括的羟胺官能团的带电荧光标签在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
18.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖包括使用APTS、ANTS、ANDA和ANSA中的一种或多种在聚糖的还原末端标记所裂解的聚糖。
19.权利要求1的方法，其中所述带电荧光标签包含磺酸。
20.权利要求1的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖还包括在酰肼官能团和聚糖的糖羰基之间形成腙。
21.权利要求20的方法，其中用带电荧光标签标记所裂解的聚糖还包括通过用氰基硼氢化钠还原来稳定腙。
22.权利要求1的方法，其中施用电场包括施用强度在约200 V/cm至约400 V/cm之间的电场。
23.权利要求1的方法，其中施用电场包括施用强度在约250 V/cm至约350 V/cm之间的电场。
24.权利要求1的方法，其中激发标记的聚糖包括用光源激发标记的聚糖。
25.权利要求24的方法，其中所述光源为激光器二极管。
26.权利要求24的方法，其中所述光源波长在约400-500 nm范围内或在约500-10 nm范围内。
27.权利要求1的方法，其中检测荧光辐射包括使用荧光检测器检测荧光辐射。
28.权利要求27的方法，其中检测荧光辐射包括使用带通滤波器将定向荧光检测器的荧光辐射过滤。
29.权利要求28的方法，其中所述带通滤波器为510 nm带通滤波器。
30.权利要求27的方法，其中分析标记聚糖包括基于通过荧光检测器或通过配置为处理获自荧光检测器的一个或多个信号的信号处理器或计算机所产生的电泳图谱分析标记聚糖，所述电泳图谱显示代表沿着毛细管迁移并且被荧光检测器检测到的单个聚糖的峰。
31.权利要求30的方法，其中分析标记聚糖包括将所测量的迁移时间与荧光标记葡聚糖标准阶梯的迁移时间比较，以及与预先记录在由实验得出的数据库中的特定聚糖结构和分子量所已知的迁移时间比较。
32.权利要求31的方法，其中将糖蛋白样品加入上样孔中还包括上样葡聚糖标准阶梯，并且其中分析标记聚糖依赖于其相对于葡聚糖标准阶梯的迁移时间。
33.权利要求32的方法，其中所述葡聚糖阶梯标准包括荧光标记的由葡萄糖分子组成的线性多糖，其包括具有从1个葡萄糖分子至约23个葡萄糖分子按单位增加改变的葡萄糖分子数目的多糖链。
34.权利要求33的方法，其中所述葡聚糖阶梯标准用包含荧光团ALEXA FLUOR 350羟胺中所包括的羟胺官能团的带电荧光标签在糖链的还原末端荧光标记。
35.权利要求33的方法，其中所述葡聚糖阶梯标准用包含荧光团ALEXA FLUOR 647羟胺中所包括的羟胺官能团的带电荧光标签在糖链的还原末端荧光标记。
36.权利要求35的方法，还包括在已变性、裂解和标记聚糖后，使该聚糖经受外切糖苷酶。
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