KR20230129481A - Cd47과 특이적으로 결합하는 항체 및 그 항원 결합단편 - Google Patents

Cd47과 특이적으로 결합하는 항체 및 그 항원 결합단편 Download PDF

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Abstract

CD47과 특이적으로 결합하는 항체 및 그 항원 결합 단편에 관한 것이다. 해당 CD47과 특이적으로 결합하는 항체 및 그 항원 결합 단편은 특이성 및 안정성이 높아 CD47-SIPRα 경로를 특이적으로 차단할 수 있으며 일정한 농도 범위 내에서 적혈구 응집을 일으키지 않으며 생체 내에서 종양의 성장을 현저하게 억제할 수 있다.

Description

CD47과 특이적으로 결합하는 항체 및 그 항원 결합 단편
본 발명은 항체 및 항체 인간화 개조 연구분야에 관한 것이며, 구체적으로, 본 발명은 CD47과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 그 항원 결합 단편에 관한 것이다.
CD47은 인테그린 관련 단백질 (integrin associated protein, IAP)이라고도 불리며, 면역글로불린 슈퍼 패밀리에 속하고, 그 구조는 주로 세포 외 면역글로불린 가변 영역 유사 도메인, 소수성이 높은 5회 막관통 영역 및 세포내에서 선택적으로 접합된 카르복실단 세포질 꼬리 영역을 포함한다. CD47은 세포 표면에 널리 발현되어, 신호 조절 단백질 SIPRα, 인테그린 및 혈소판 반응성 단백질 TSP1에 결합될 수 있으며, 다양한 생리 기능과 관련되고, 탐식세포 표면의 SIPRα에 결합함으로써 대식세포의 탐식작용을 억제하는 것을 주요 작용으로 한다. SIPRα도 면역글로불린 슈퍼패밀리 중의 하나로서 세포 내 영역에 티로신이 풍부한 면역 억제성 모티프 (ITIM)를 포함한다. CD47이 대식세포 표면의 SIPRα에 결합되면, ITIM은 인산화되어 다운스트림 분자 SHP1/SHP2와 결합하여 시냅스 서브필름에 미오신이 축적되는 것을 방지하여 탐식 작용을 억제한다. 정상적인 상황에서, CD47은 "자가" 신호이며, "나를 먹지마"를 나타내고, 탐식 작용의 자가공격을 저해하고; 병리적 상황에서, CD47은 종양세포에서 고도로 발현되어 종양세포가 탐식세포의 모니터링으로부터 벗어나는 데 기여한다 (Science, 2000, 288(5473): 2051-2054; Trends in Cell Biology, 2001, 11(3):130-135.).
종양 연구에 따르면, CD47은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암 및 다른 고형종양을 포함하는 다양한 인간 종양 종류에서 발현되는 것을 발견하였다. 종양세포는 고도로 발현된 CD47을 상향 조절하고 SIPRα에 결합하여 대식세포의 면역 모니터링에서 벗어난다. 따라서, CD47-SIPRα간의 상호작용 (CD47 항체 또는 SIPRα-Fc)을 차단함으로써 종양에 대한 대식세포의 탐식작용을 활성화하고, DC 세포를 통해 CD8+T 세포에 항원을 전달하여 종양에 대한 CD8+T 세포의 특이적 살상작용을 발휘할 수 있다 (Current Opinion in Immunology, 2012, 24(2): 225-232; Nature Medicine, 2015, 21(10): 1209.).
거의 모든 종양세포 종류가 CD47을 발현하여 항종양에서 광역성이 있으므로, CD47-SIPRα 경로를 차단하는 항체의 응용 전망이 넓고; 연구에 따르면 CD47은 면역 체크포인트로서, CD47 항체가 다른 면역 체크포인트 CTLA4/PD-1 약제와 병용하면 약효를 증가시킬 수 있다. 그러나 적혈구도 CD47을 발현하여 CD47 항체의 안전성을 고려해야 한다. 연구에 따르면, 대식세포가 탐식작용을 발휘하려면 CD47을 차단하는 "나를 먹지마"라는 신호외에도 칼레티크린 (CRT)을 매개로 하는 "나를 먹어"라는 신호가 있어야 한다. 통상적인 경우, 종양세포에서 칼레티크린이 고도로 발현되지만 정상세포에서 발현되지 않는다. 또한 CD47 항체를 선별할 때 적혈구 응집을 일으키지 않는 항체를 선택하고, IgG4 형태의 항체를 이용하면 적혈구에 대한 대식세포의 탐식을 활성화할 수 없다. 당업계에는 여전히 항CD47 항체에 대한 수요가 있다.
일 형태에 있어서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체에 관한 것이며, 여기서,
경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2, LCDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 표시되는 바와 같고; 및/또는
중쇄 가변 영역의 HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 4로 표시되는 바와 같고; 중쇄 가변 영역의 HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 5 또는 6과 적어도 약 94%의 동일성을 가지고; 중쇄 가변 영역의 HCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 7 또는 8과 적어도 약 78%의 동일성을 가지거나; 또는
상기 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID No. 1-8로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 또는 그 이상의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이거나; 또는
상기 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1-8로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이고;
여기서 상기 변이체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체로부터 선택되는 하나이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 항체의 중쇄 불변 영역 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중의 어느 하나의 불변 영역 서열로부터 선택되고, 및/또는, 상기 항체의 경쇄 불변 영역 서열은 κ 사슬 또는 λ 사슬로부터 선택된다. 바람직하게는 중쇄 불변 영역 서열은 IgG1 또는 IgG4의 불변 영역 서열로부터 선택되고, 및/또는 경쇄 불변 영역 서열은 경쇄 κ 사슬의 불변 영역 서열로부터 선택된다.
일부 실시형태에 있어서, CD47 키메라 항체 또는 그 기능성 단편의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 바와 같거나; SEQ ID No. 9 또는 10으로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유하거나; SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이고; 및/또는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 11 또는 12로 표시되는 바와 같거나; SEQ ID No. 11 또는 12로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유하거나; SEQ ID NO. 11 또는 12로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이고; 및/또는
상기 CD47 키메라 항체 및 그 기능성 단편의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 13 및 SEQ ID NO. 14-16으로 표시되는 바와 같거나; 각각 SEQ ID No. 13 및 SEQ ID NO. 14-16으로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.2%, 약 99.5% 또는 그 이상의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유하거나; SEQ ID NO. 13 및 SEQ ID NO. 14-16으로 표시되는 서열에 각각 하나 또는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체의 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4를 포함하며, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역은 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하고, 및/또는, 여기서,
상기 FR-L1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 17로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-L2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 18로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
12번 아미노산 R의 T로의 치환;
상기 FR-L3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 19로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
31번 아미노산 Y의 F로의 치환;
상기 FR-L4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 20으로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-H1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 21로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-H2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 22로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-H3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 23으로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
8번 아미노산 E의 T로의 치환,
11번 아미노산 S의 N으로의 치환;
31번 아미노산 A의 V로의 치환; 및/또는
상기 FR-H4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 24로 표시되는 바와 같다.
일부 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 25-27 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같고, 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 28-33 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같거나; 또는 SEQ ID NO. 25-27 또는 28-33으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이거나; 또는 SEQ ID NO. 25-27 또는 28-33으로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이다.
바람직하게는, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO. 26 또는 27로 표시되는 바와 같고, 및/또는 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO. 33으로 표시되는 바와 같다.
당업계에 공지된 바와 같이, 동일성이 언급될 때, 아미노산 서열의 길이는 자연수여야 하므로 실제로 계산하여 얻은 동일성 수치는 95%와 같은 유한소수의 백분수가 아니라 95%와 같은 백분수에 가까운 수일 수 있다. 예를 들어, 위치 117의 아미노산 잔기의 가변 영역 서열에 있어서, 하나의 위치의 아미노산 잔기만 변화할 때, 이에 대응하는 동일성 백분수는 실제로 99.15%에 가까운 백분수이나, 편의상 이러한 수는 본 명세서에서 99%로만 표기된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fd, Fv, scFv, 이중특이성 항체, 낙타 항체, CDR 및 항체 최소 인식 단위 (dAb)로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이며, 바람직하게는 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 또는 scFv이다.
본 발명의 다른 형태는,
(1) 전술한 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체를 코딩하는 DNA 또는 RNA;
(2) (1)에 정의된 핵산과 완전히 상보적인 핵산으로부터 선택되는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 형태는 효과적으로 연결된 전술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명의 일 형태는 전술한 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 형태는 전술한 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 전술한 바와 같은 핵산 분자, 전술한 바와 같은 벡터 또는 전술한 바와 같은 숙주세포 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 형태는 전술한 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체를 생산하는 방법에 관한 것으로서,
전술한 바와 같은 숙주세포를 상기 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체 발현에 적합한 배양 조건에서 발현하고 얻어진 산물을 선택적으로 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 형태는 자가 면역 질환, 이식물에 대한 면역응답, 알레르기반응, 감염성 질환, 신경퇴행성 질환 및 종양과 같은 CD47에 매개되는 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 전술한 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 전술한 바와 같은 핵산 분자, 전술한 바와 같은 벡터 또는 전술한 바와 같은 숙주세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 형태는 자가 면역 질환, 이식물에 대한 면역응답, 알레르기반응, 감염성 질환, 신경퇴행성 질환 및 종양과 같은 CD47에 매개되는 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 전술한 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 전술한 바와 같은 핵산 분자, 전술한 바와 같은 벡터 또는 전술한 바와 같은 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 형태는 필요로 하는 피험자에게 전술한 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 전술한 바와 같은 핵산 분자, 전술한 바와 같은 벡터 또는 전술한 바와 같은 숙주세포를 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환, 이식물에 대한 면역응답, 알레르기반응, 감염성 질환, 신경퇴행성 질환 및 종양과 같은 CD47에 매개되는 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 다발성경화증, 궤양성대장염, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 사구체신염, 확장성심근증후군과 유사한 질환, 쇼그렌 증후군, 과민성접촉성 피부염, 다발성근염, 경피병, 동맥주위성 다발동맥염, 류마티스열, 백반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 베체트 증후군 및 만성 갑상선염으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 바람직하게는 상기 자가 면역 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 다발성경화증, 궤양성대장염, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 사구체신염, 류마티스열, 백반증, 인슐린 의존성 당뇨병 및 만성 갑상선염으로 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 더 바람직하게는 상기 자가 면역 질환은 류마티스 관절염, 건선, 다발성경화증, 궤양성대장염, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 당뇨병 및 만성 갑상선염으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 이식물에 대한 면역응답은 예를 들어 이식편대 숙주병을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 알레르기반응은 두드러기, 습진, 혈관신경성 부종, 알레르기 비염, 기관지 천식, 후두 부종, 식품 알레르기 위장염, 아나필락시스 쇼크로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 바람직하게는 상기 알레르기반응은 두드러기, 습진, 알레르기 비염, 기관지 천식, 아나필락시스 쇼크로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 더 바람직하게는 상기 알레르기반응은 알레르기 비염, 기관지 천식, 아나필락시스 쇼크로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균, 기생충 등 병원체 및 특정 독소가 인체에 침입하여 생기는 국부 조직 및 전신성 염증 반응을 말한다. 병원성 바이러스의 예로서, 예를 들어 HIV, (A형, B형 및 C형) 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및 CMV, EB 바이러스), 아데노 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비 바이러스, 에코 바이러스, 라이노 바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡도합포체 바이러스, 이하선염 바이러스, 로타 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보 바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종, 연속종 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보 바이러스를 포함한다. 병원성 세균은 예를 들어 매독균, 클라미디아, 리케치아, 마이코박테리움, 포도상구균, 연쇄상 구균, 폐렴구균, 뇌수막구균과 임구균 (conococci), 크레브시에라, 변형균, 세라티아, 슈우도모나드, 레지오넬라균, 디프테리아균, 살모넬라균, 바실러스, 콜레라균, 파상풍균, 보툴리누스, 탄저균, 페스트균, 렙토스피라균 및 라임병균을 포함한다. 병원성 진균은 예를 들어 칸디다 (칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 글라브라타 (Candidaglabrata), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 등), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcusneoformans), 아스페르길루스 (Aspergillus) (아스페르길루스 후미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 등), 모균목 (Mucorales) (모균 (mucor), 압시디아 (absidia), 리조푸스 (rhizopus)), 스포로트릭스 셴키 (Sporothrix schenkii), 블라스토미세스 더마티티디스 (Blastomycesdermatitidis), 파라콕시디오이디즈 브라질리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼 (Histoplasma capsulatum)을 포함한다. 병원성 기생충은 예를 들어 이질아메바 (Entamoeba histolytica), 대장발란티듐 (Balantidium coli), 파울러 자유아메바 (Naegleria fowleri), 가시아메바종 (Acanthamoeba sp.), 람블편모충 (Giardialambia), 크립토스포리듐종 (Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니 (Pneumocystis carinii), 심일열말라리아원충 (Plasmodium vivax), 바베스열원충 (Babesia microti), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosomabrucei), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 도너반리슈만편모충 (Leishmania donovani), 톡소플라스마원충 (Toxoplasma gondi) 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 마카도-조셉병, 근위축성 측삭경화증, 크로이츠펠트-야콥병으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다. 바람직하게는 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 더 바람직하게는 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병 및 헌팅턴병으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 종양은 백혈병, 림프종, 골수종, 뇌종양, 두경부 편평세포암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 비인두 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담낭암, 간암, 대장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 방광암, 요로상피암, 신장세포암, 골육종, 흑색종양 및 메르켈 세포암으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 바람직하게는 상기 종양은 림프종, 골수종, 두경부 편평세포암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 비인두 암종, 식도암, 위암, 간암, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 요로상피암, 신장세포암, 골육종, 흑색종양으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이고, 더 바람직하게는 상기 종양은 림프종, 두경부 편평세포암, 비소세포 폐암, 위암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 요로상피암, 신장세포암, 흑색종양으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 피험자는 포유동물로부터 선택되어 인간 및/또는 다른 영장류 동물을 포함하지만, 이에 한정되지 않고; 포유동물은 소, 돼지, 말, 염소, 고양이, 개, 마우스 및/또는 생쥐 등 상업적으로 관련된 포유동물을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주세포는 당업계의 통상적인 투여방법, 예를 들어 정맥 내 주사와 같은 비경구 경로에 의해 사용된다.
다시 말해, 본 발명은 하이브리도마수단에 의해 항CD47 모노클론 항체를 얻고, 적혈구 응집을 일으키지 않는 항체를 선별하였다. IgG4의 항체형태를 사용하여 CD47-SIPRα 경로를 특이적으로 차단할 수 있고 일정 농도 범위 내에서 적혈구 응집을 일으키지 않는 IgG4 항체를 얻었다.
본 발명에 제공되는 항체 및 그 기능성 단편은 1nM 또는 그 이하의 KD로 인간 CD47에 특이적으로 결합하여 CD47과 수용체 결합의 활성을 차단하고, 대식세포가 종양세포를 탐식하는 것을 매개 및/또는 적혈구 응집을 일으키지 않을 수 있어, 자가 면역 질환, 이식물에 대한 면역응답, 알레르기반응, 감염성 질환, 신경퇴행성 질환 및 종양 등을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용된다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시형태 또는 종래기술에서의 기술방안을 보다 명확하게 설명하기 위하여 구체적인 실시형태 또는 종래기술의 기재에 사용할 필요가 있는 도면에 대해 간단히 소개한다. 이하에 설명된 도면은 본 발명의 일부 실시형태이고, 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자에 있어서 창조적인 노동을 부여하지 아니하는 전제에서 이 도면들에 의하여 다른 도면을 얻을 수도 있는 것은 명백하다.
도 1은 실시예 1에서 항인간 CD47 양성 클론이 분비하는 항인간 CD47 마우스 유래 모노클론 항체의 시험관 내 활성을 보여준다. 여기서 A는 마우스 유래모노클론 항체와 CD47의 결합 활성이고; B는 CD47/SIRPα 결합에 대한 마우스 유래 모노클론 항체의 블로킹 활성이다.
도 2는 실시예 1에서 항인간 CD47 양성 클론이 분비하는 항인간 CD47 마우스 유래 모노클론 항체가 적혈구에 대한 영향을 보여준다.
도 3은 실시예 3에서 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체와 인간 CD47의 결합 활성을 보여준다.
도 4는 실시예 4에서 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체의 특이성을 보여준다. 여기서 A는 종속 특이성이고; B는 결합 특이성이다.
도 5는 실시예 5에서 CD47/SIRPα 결합에 대한 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체의 블로킹 활성을 보여준다.
도 6은 실시예 6에서 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 매개의 종양세포 탐식활성을 보여준다.
도 7은 실시예 7에서 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체가 적혈구에 대한 영향을 보여준다.
도 8은 실시예 8에서 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체의 생체 내 항종양 효과를 보여준다.
도 9는 실시예 10에서 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체의 항원 결합 활성을 보여준다.
도 10은 실시예 11에서 CD47/SIRPα 결합에 대한 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체에 대한 블로킹 활성을 보여준다.
도 11은 실시예 13에서 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체가 적혈구에 대한 영향을 보여준다.
도 12는 실시예 16에서 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체의 생체 내 항종양 효과를 보여준다.
정의
용어 "CD47"이란 인테그린 관련 단백질 (integrin associated protein, IAP)을 말하며 임의의 포유동물 유래의 CD47 분자일 수 있고, 일부 실시형태에서는 영장류 동물 유래의 CD47 분자이고, 일부 실시형태에서는 인간 유래 CD47 분자이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항CD47 항체", "항CD47", "CD47 항체" 또는 "CD47이 결합된 항체"는 상기 항체가 CD47을 표적으로 하는 진단제 및/또는 치료제로 사용될 수 있도록 CD47 단백질 또는 그 단편의 항체와 충분한 친화력으로 결합될 수 있는 항체를 말한다. 일부 실시형태에서, 항CD47 항체는 다른 종의 CD47에서 보존된 CD47의 에피토프에 결합된다.
용어 "항체"란 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 항원의 에피토프에 결합될 수 있는 능력을 가진 단편을 말한다. 천연적으로 존재하는 항체는 전형적으로 사합체를 포함하고, 일반적으로 적어도 2개의 중(H) 쇄와 적어도 2개의 경(L)쇄로 구성된다. 면역글로불린은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE와 같은 아이소타입을 포함하고, 대응되는 중쇄는 각각 μ 사슬, δ 사슬, γ 사슬, α 사슬 및 ε 사슬이다. 동일한 타입의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성과 중쇄 디술피드 결합의 수량 및 위치 차이에 따라 서로 다른 아형으로도 나눌 수 있으며, 예를 들어 IgG는 아형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 나눌 수 있고, IgA는 아형 IgA1 및 IgA2로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변 영역에 따라 κ 사슬 및 λ 사슬로 나눌 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 가리키고, 다양한 구조의 천연항체와 인공항체를 포괄하며, 온전한 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄 중에서 항체와 그 항원의 결합에 참여하는 도메인을 가리킨다. 항체의 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역 (본 명세서에서 CH로 약칭함)으로 구성되고, 중쇄 불변 영역은 일반적으로 3개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VL로 약기함) 및 경쇄 불변 영역 (본 명세서에서 CL로 약기함)으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 전형적으로 항원인식을 담당하고, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 면역글로불린과 숙주조직 또는 인자 (면역 시스템의 각종 세포 (예를 들어, 효응세포), Fc 수용체 및 고전보체시스템의 제1 구성 성분 (C1q)을 포함)의 결합을 매개할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 추가로 "상보성 결정 영역 (CDR)"으로 불리는 초가변 영역 (HVR)으로 세분할 수 있고, 이들 사이에는 더 보수적인 "프레임워크 영역" (FR)이라 불리는 영역이 개재되어 있다. 각각의 VH 및 VL는 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성되고, FR1 - CDR1 -FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 배열된다.
용어 "상보성 결정영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR" (본 명세서에서 초가변 영역 "HVR"과 호환적으로 사용될 수 있음)은 항체 가변 도메인에서 서열적으로 고도로 변이되고 구조적으로 확정된 고리 ("초가변 루프") 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉점")를 포함하는 영역을 가리킨다. CDR은 주로 항원 에피토프와의 결합을 담당한다. 본 명세서에서, 중쇄의 3개의 CDR을 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이라 하고, 경쇄의 3개의 CDR을 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이라 칭한다.
서로 다른 할당 시스템을 기반으로 얻어진 동일한 항체의 가변 영역의 CDR 경계는 다를 수 있다는 점에 유의해야 한다. 즉 서로 다른 할당 시스템에서 정의되는 동일한 항체 가변 영역의 CDR 서열은 다르다. 따라서, 본 발명에서 정의되는 구체적인 CDR 서열로 항체를 한정하는 경우, 상기 항체의 범위는 가변 영역 서열에 상기 구체적인 CDR 서열이 포함된 항체를 더 포함하나, 서로 다른 방안 (예를 들어 서로 다른 할당 시스템 규칙 또는 조합)을 이용하여 소위 CDR 경계는 본 발명에서 정의하는 구체적인 CDR 경계와 다르다.
용어 "모노클론 항체", "모노클론 항체" 또는 "모노클론 항체 조성물"이란 단분자 조성물의 항체 분자 제제로서, 기본적으로 동질의 항체군으로부터 얻어진 항체를 말하며, 즉 개체 항체를 포함하는 군은 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 발생하는 돌연변이 이외에 동일하다. 일반적인 모노클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화력을 나타낸다. 일부 실시형태에서 모노클론 항체는 하나 이상의 Fab 도메인으로 구성될 수 있으며, 이에 따라 하나 이상의 타겟에 대한 특이성을 증가시킨다. 용어 "모노클론 항체" 또는 "모노클론 항체 조성물"은 임의의 구체적인 생산 방법 (예를 들어, 재조합, 유전자 변형, 하이브리도마 등)에 한정되지 않는다.
용어 "이중 항체", "이중기능적 항체", "이중특이성 항체", "bispecific antibody" 또는 "BsAb"는 2개의 서로 다른 항원 결합 부위를 가져 2개의 타겟 항원과 동시에 결합할 수 있고 항체의 표적성을 발휘함과 동시에 또 다른 특수한 기능을 매개하는 작용을 가지는 것을 말하고, 매개되는 특수 기능 효과 분자는 독소, 효소, 사이토카인, 방사성 핵종 등 일 수도 있고, 이중특이성 항체가 결합하는 항원의 두 암은 각각 Fab, Fv, ScFv 또는 dSFv 등에서 제공될 수 있다.
용어 "다클론 항체"란 서로 다른 디터미넌트 ("에피토프")에 대한 다른 항체의 제조물을 말한다.
용어 "항체의 항원 결합 단편"란 에피토프와 결합할 수 있는 항체의 단편, 부분, 영역 또는 도메인 (예를 들어 절단, 재조합, 합성 등에 의해 얻을 수 있음)을 말한다. 항원 결합 단편은 이러한 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 모든 6개의 CDR 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 에피토프에 결합할 수 있음에도 상이한 특이성, 친화력 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는 항원 결합 단편은 상기 항체의 모든 6개의 CDR 도메인을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬 (예를 들어, scFv)의 일부이거나 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있고, 또는 2개 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬 (각각 아미노 말단 및 카르복실 말단을 가짐) (예를 들어, 이중 항체, Fab 단편, F(ab')2단편 등)의 일부이거나 2개 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명에 포함되는 항원 결합 단편의 예로서, (a) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab' 또는 Fab 단편; (b) 2개의 디술피드 결합에 의해 힌지 도메인으로 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (c) VH 영역 및 CHl 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (d) 항체 중 단암의 VL 영역 및 VH 영역으로 이루어진 Fv단편; (e) 유전공학방법으로 항체 VH 및 VL을 결합 펩타이드 세그먼트로 연결한 재조합 단백질인 단쇄 항체 (single chain Fv, scFv); (f) 기본적으로 VH 영역으로 이루어지며 도메인 항체 (Holt 등, Trends Biotechnol., 2i(ll): 484-90)로도 불리는 dAb단편 (Ward 등, Nature, 341, 544-546 (1989)); (g) 낙타 또는 나노 항체 (Revets 등, Expert Opin Biol Ther., 5 (l): 111-24); 및 (h) 분리된 상보성 결정영역 (CDR)을 포함한다.
용어 "키메라 항체"란, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부와 특정 종에서 유래되거나 특정 클래스에 속하는 항체의 대응 서열이 동일하거나 동종이고, 사슬의 나머지 부분과 다른 종에서 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체 및 이러한 항체의 대응 서열이 동일하거나 동종인 것을 말한다. 본 발명은 인간 유래 항체의 가변 영역 항원 결합 서열을 제공한다. 따라서, 본 명세서에서 주목한 키메라 항체는 하나 또는 복수의 인간 항원 결합 서열 (예를 들어 CDR)을 가지며 하나 또는 복수의 비인간 유래의 항체의 서열, 예를 들어 FR 또는 C 영역 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 그리고, 본 명세서에 기재된 키메라 항체는 항체 클래스 또는 서브 클래스의 인간 가변 영역 항원 결합 서열 및 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스의 다른 서열, 예를 들어 FR 또는 C 영역 서열을 포함하는 항체이다.
용어 "인간화 항체"란 마우스의 종과 같은 다른 포유동물 종에서 유래한 CDR 서열이 인간 프레임 서열에 이식된 항체를 말한다. 인간 프레임 서열에서 별도의 프레임 영역 수식을 진행할 수 있다.
용어 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체" ("humAb" 또는 "HuMab")란 인간계 면역글로불린 서열에서 파생된 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 항체를 말한다. 본 발명의 인간 항체는 인간계 면역글로불린 서열로 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 유도에 의하거나 유전자 재구성 기간 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
변이체 항체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본원에서 언급된 서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 당업계에 알려진 방법을 사용하여 개선된 친화성을 갖는 항체 서열의 다른 변이체를 얻을 수 있으며 이러한 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 아미노산의 치환은 더욱 개선된 친화성을 갖는 항체를 얻기 위해 이용될 수 있다. 또는 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 항체 생산에서 발현계 번역 효율을 개선하기 위해 이용될 수 있다.
이러한 변이체 항체 서열은 宅본원에서 언급된 서열과 70％ 또는 그 이상 (예를 들어 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상)의 서열 상동성을 갖는다. 이러한 서열 상동성은 참조 서열 (즉, 본원에서 언급된 서열)의 전체 길이에 대해 계산하여 얻은 것이다.
본 발명에서의 아미노산 잔기의 번호 할당은 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system)® 또는 Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5 판, NIH 공개번호 91-3242, 미국보건 및 공공 복지부; Chothia, C. & Lesk, A. M., (1987), Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins., J. Mol. Biol., 196, 901-917에 따라 진행하였다. 명확하게 명시되어 있지 않은 경우, 본 발명에서의 아미노산 잔기의 번호는 Kabat 번호 체계에 따라 진행한다.
항체 또는 그 항원 결합 단편이 "특이적으로" 다른 분자의 영역 (즉, 에피토프)에 결합한다는 것은, 다른 에피토프보다 더 빈번하고, 더 빠르고 더 긴 지속시간 및/또는 더 큰 친화력 또는 친합력으로 이 에피토프와 반응 또는 결합하는 것을 말한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편은 적어도 10-7M, 예를 들어 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 또는 그 이상의 친화력으로 인간 PD-L1에 결합한다. 바람직하게는 항체 또는 그 항원 결합 단편은 생리 조건에서 (예를 들어, 생체 내에서) 결합한다. 따라서, PD-L1에 특이적으로 결합한다는 것은 이 항체 또는 그 항원 결합 단편이 상술한 특이성 및/또는 이러한 조건에서 PD-L1에 결합하는 능력을 가리킨다. 상기 결합을 결정하는 데 적합한 방법은 당업계에 알려져 있는 것이다.
항체와 지정된 항원이 결합한다는 배경 하에서, 용어 "결합"이란 통상적으로 약 10-6M 또는 그 이하의 KD의 친화력으로 결합하는 것을 말하며, 이 KD는 지정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이성 항원 (예를 들어, BSA, 카제인)에 대한 이 항체의 결합 친화력보다 적어도 10배, 예를 들어 적어도 100배, 적어도 1,000배 낮다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "kd" (sec -1 또는 1/s)란 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 가리킨다. 상기 값은 koff 값이라고도 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "ka" (M-1 x sec-1 또는 1/Msec)란 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "KD" (M)란 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 가리키며, kd를 ka로 나눔으로써 얻는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "KA" (M-1 또는 1/M)란 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수를 가리키며, ka를 kd로 나눔으로써 얻는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편은 CDR의 일부 (즉 결합에 필요한 CDR 잔기 아군, SDR이라 불림)만이 인간화 항체에서 결합을 유지하면 된다. 분자 모델링 및/또는 경험에 따라 또는 Gonzales, N.R. 등, (2004), SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity, Mol. Immunol., 41:863-872에 기재된 바와 같이, 선행연구 (예를 들어 CDR H2에서의 잔기 H60-H65는 통상적으로 불필요함)를 바탕으로 Chothia 초가변 루프 외에 위치한 Kabat CDR 영역 (Kabat 등, (1992), Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, 공개번호 91-3242; Chothia, C. 등, (1987), Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196:901-917을 참조)에서 관련 에피토프와 접촉하지 않고 SDR에 존재하지 않는 CDR 잔기를 검정할 수 있다. 이러한 인간화 항체에 있어서, 하나 또는 복수의 도너 CDR 잔기가 존재하지 않거나 도너 CDR 전체가 생략되는 위치에서, 이 위치를 차지하는 아미노산은 수용체 항체 서열에서 해당 위치 (Kabat에 의해 번호 매김)를 차지하는 아미노산일 수 있다. 이러한 치환은 인간화 항체에서 마우스 아미노산의 수를 줄이고 이로 인해 잠재적 면역원성을 저하시키는 점에서 잠재적으로 유리하다. 그러나 치환은 친화력의 변화를 일으킬 수도 있으며, 친화력이 현저하게 저하되는 것을 피하는 것이 바람직하다. 경험에 따라 CDR 내 치환 위치 및 치환될 아미노산을 선택할 수도 있다.
CDR 잔기의 단일 아미노산 변화에 기능성 결합이 상실될 수 있는 사실을 이용하여 (Rudikoff, S. 등, (1982), Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA))79(6):1979-1983), 대체 가능한 기능성 CDR 서열을 계통적으로 검정할 수 있다. 이러한 변이체 CDR을 얻기 위한 바람직한 방법에 있어서, CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이를 유발하여 (예를 들어, 랜덤 변이 유발 또는 부위 특이적 변이 유발에 의해), 치환된 아미노산 잔기를 갖는 CDR을 생성한다. 원래의 (기능성) CDR 서열에서의 관련 잔기의 신원과 치환된 (비기능성) 변이체CDR 서열의 신원을 비교함으로써, 해당 치환된 BLOSUM62.iij의 치환 점수가 검정될 수 있다. BLOSUM 시스템은 서열 데이터베이스를 분석하여 작성된 아미노산 치환 행렬을 제공하여 신뢰적인 비교에 사용한다 (Eddy, S.R., (2004), Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?, Nature Biotech., 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G., (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89:10915-10919; Karlin, S. 등, (1990), Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes), PNAS, 87:2264-2268; Altschul, S.F., (1991), Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective, J. Mol. Biol., 219, 555-565. 현재 가장 선진적인 BLOSUM 데이터베이스는 BLOSUM62 데이터베이스 (BLOSUM62.iij)이다. 표 1은 BLOSUM62.iij 치환 점수를 나타낸다 (점수가 높을수록 치환이 보수적이므로 해당 치환이 기능에 영향을 주지 않을 가능성이 더 높아진다). 예를 들어, 얻어진 CDR을 포함하는 항원 결합 단편이 PD-L1에 결합할 수 없으면, BLOSUM62.iij 치환 점수는 충분히 보수적이지 않다고 생각되어 보다 높은 치환 점수를 갖는 새로운 후보 치환을 선택하여 생성한다. 따라서, 예를 들어, 원래의 잔기가 글루타민산 (E)이고 비기능성 치환 잔기가 히스티딘 (H)이면, BLOSUM62.iij 치환 점수는 0이게 되며, 보다 보수적인 변화 (예를 들면 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민 또는 리신으로)가 바람직하다.
본 발명은 이로 인해 개선된 CDR의 검정에 있어서의 랜덤 변이의 용도를 고려하였다. 본 발명의 배경 하에서 보수적 치환은 아래 3개의 표에 반영된 하나 또는 복수의 아미노산 종류 내의 치환에 의 해 정의될 수 있다.
보다 보수적인 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 친수성 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Tyr 및 Lys로부터 선택된다.
예를 들어 Creighton, (1984), Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Company)에 기술된 원리를 이용하여 다른 아미노산 그룹을 만들 수도 있다.
따라서, 포함하는 항체 또는 그 항원 결합 단편의 CDR 변이체의 서열은 치환에 의해 모 항체의 CDR의 서열과 다를 수 있으며, 예를 들어 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기의 치환이다. 본 발명의 실시형태에 따르면, CDR 영역에서의 아미노산은 상기 3개의 표에 정의된 바와 같은 보수적 치환으로 치환될 수 있다.
"상동성" 또는 "서열 동일성"이란 서열 정렬 및 갭 도입 후, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열 변이체의 잔기가 비변이체 서열과 같은 백분율을 가리킨다. 구체적인 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드 변이체는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드와 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 98％ 또는 적어도 99％의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 상동성을 갖는다.
이러한 변이체 폴리펩타이드 서열은 본원에 나열된 서열과 70％ 또는 그 이상 (즉 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상)의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 공개된 아미노산 서열의 다양한 길이의 연속적인 연장 세그먼트를 포함하는 폴리펩타이드 단편을 제공한다. 예를 들어, 적용 가능한 경우, 본 발명에 제공되는 펩타이드 서열은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150 또는 그 이상의 본 발명에 공개된 하나 또는 복수의 서열의 연속 펩타이드 및 그들 사이의 모든 중간 길이의 펩타이드를 포함한다.
용어 "치료"란 질환 또는 병세의 진전 또는 중증도를 개선, 완화, 감약 또는 역전시키거나 이러한 질환 또는 병세의 하나 또는 복수 이상의 병증 또는 부작용을 개선, 완화, 감약 또는 역전시키는 것을 말한다. 본 발명에서 "치료"는 유익하거나 원하는 임상결과를 얻기 위한 방법을 말하며, 여기서 "유익하거나 원하는 임상결과"는 부분적 또는 전부적이고, 검출 가능하거나 검출 불가능한 것임에도 불구하고 증상의 완화, 병세 또는 질환 정도의 감소, 안정화된 (즉 악화되지 않은) 질환 또는 병세 상태, 질환 또는 병세 상태 진전의 지연 또는 완화, 질환 또는 병세 상태의 개선 또는 경감 및 병세의 완화를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "예방"이란 본 발명의 항체 및 그 기능성 단편을 투여하여, 질환 또는 병세의 적어도 하나의 증상의 발전을 저지하거나 저해하는 것을 말한다. 이 용어는 완화 중인 피험자를 치료하여 재발을 예방 또는 저해하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 항체는 DNA 재조합에 의해 생성된 모노클론 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 아이소타입을 가질 수 있다. 아이소타입의 선택은 보통 원하는 이펙터 기능 (예를 들어 ADCC 유도)에 의해 결정된다. 예시적인 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 도메인 κ 또는 λ 중의 어느 하나를 사용할 수 있다. 필요하다면, 공지된 방법으로 본 발명의 항CD47 항체의 클래스로 변환할 수 있다. 예를 들어, 최초로 IgG인 본 발명의 항체는 본 발명의 IgM 항체로 클래스 변환할 수 있다. 또한, 클래스 변환 기술은 하나의 IgG 서브 클래스를 다른 서브 클래스로 전환하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 IgGl을 IgG2로 변환할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 이펙터 기능은 다양한 치료 용도를 위해 아이소타입 전환에 의해 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체로 전환될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 IgG4 항체이다. 항체의 아미노산 서열이 다른 아이소타입에 대해 이 아이소타입과 거의 같으면, 이 항체는 특정 아이소타입에 속한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 전체 길이 항체이고, 바람직하게는 IgG항체이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 항체 항원 결합 단편 또는 단쇄 항체이다.
일부 실시형태에 있어서, 항CD47 항체는 일가 항체이며, 바람직하게는 WO 2007059782 (인용을 통해 그 전문을 여기에 원용)에 기재된 바와 같이 힌지 영역에 결실을 갖는 일가 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 항체는 상기 항CD47 항체가 다음과 같은 방법으로 구축되는 일가 항체이다. i) 일가 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 구축물을 제공하고, 상기 구축물은 선택된 항원 특이성 항CD47 항체의 VL 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 코딩 Ig의 불변 CL 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 선택된 항원 특이성 항체의 VL 영역을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 및 Ig의 CL 영역을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 효과적으로 연결되어 있으며, IgG1 서브타입의 경우, CL 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이미 수식되어 있어 다클론 인간 IgG의 존재하에서 또는 동물 또는 인간에게 투여할 때, 이 CL 영역에는 해당 CL 영역의 일치 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 디술피드 결합 또는 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산을 포함하지 않고; ii) 일가 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 구축물을 제공하고, 상기 구축물은 선택된 항원 특이성 항체의 VH 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 코딩 인간 Ig의 불변 CH 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 코딩 CH 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이미 수식되어 있어 다클론 인간 IgG의 존재하에서 또는 동물 또는 인간에게 투여할 때, 힌지 영역 및 (예를 들어 Ig서브타입에 요구되는) CH 영역에 대응하는 다른 영역 (예를 들어 CH3 영역)의 영역은 인간 Ig를 포함하는 CH 영역의 일치 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 디술피드 결합 또는 공유 또는 안정한 비공유 중쇄간 결합을 형성하는 것을 참여하는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않고, 선택된 항원 특이성 항체의 VH 영역을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 및 상기 Ig의 CH 영역을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 효과적으로 연결되어 있고; iii) 일가 항체를 생산하기 위한 세포 발현 시스템을 제공하고; iv) (iii)의 세포 발현 시스템의 세포에서 (i) 및 (ii)의 핵산구축물을 공발현시켜 상기 일가 항체를 생성한다.
마찬가지로, 일부 실시형태에 있어서, 항CD47 항체는 일가 항체이고,
(i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 영역 또는 상기 도메인의 항원 결합부분, 및
(ii) 면역글로불린의 CH 영역 또는 그 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 도메인을 포함하며, 여기서 해당 CH 영역 또는 그 도메인은 이미 수식되어 있어, 힌지 영역 및 (해당 면역글로불린이 IgG4 서브타입이 아니라면) CH 영역의 다른 도메인 (예를 들어 CH3 도메인)에 대응하는 도메인은 임의의 아미노산 잔기가 포함되어 있지 않으며, 이러한 임의의 아미노산 잔기는 동일한 CH 영역과 디술피드 결합을 형성하거나 다클론 인간 IgG의 존재하에서 동일한 CH 영역과 다른 공유 또는 안정한 비공유 중쇄간 결합을 형성할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 일가 항체의 중쇄는 수식되어 힌지 영역 전체가 결실되어 있다.
다른 실시형태에 있어서, 일가 항체의 서열은 수식되어 N-연결된 글리코실화를 위한 임의의 수용체 사이트를 포함하지 않는다.
본 발명은 "이중특이성 항체"를 더 포함하고, 여기서 항CD47 결합 영역 (예를 들어, 항CD47 모노클론 항체의 CD47 결합 영역)은 하나 이상의 에피토프를 표적으로 하는 2가 또는 다가 이중특이성 프레임워크의 일부이다 (예를 들어 제2 에피토프는 해당 이중특이성 항체가 생물학적 장벽 (예를 들어 혈액 및 뇌 장벽)을 넘는 개선된 세포 전이 작용을 표현하도록 수용체를 능동적으로 수송하는 에피토프를 포함할 수 있다). 따라서, 다른 실시형태에 있어서, 항CD47 항체의 일가 Fab는 다른 단백질을 표적으로 하는 다른 Fab 또는 scfv에 연결되어 이중특이성 항체를 생성할 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들어 항CD47 결합 영역에 의해 부여되는 치료기능 및 수용체 분자에 결합되어 생물학적 장벽 (예를 들어 혈액 및 뇌 장벽)을 넘어 전이되는 수송기능을 증강시킬 수 있는 이중기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 및 그 항원 결합 단편은 단쇄 항체를 더 포함한다. 단쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv도메인이 연결된 펩타이드이다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 단쇄 Fv (scFv)를 제공하며, 여기서 본 발명의 항CD47 항체의 Fv 중의 중쇄 및 경쇄는 플렉시블 펩타이드 링커 (전형적으로는 약 10, 12, 15 또는 그 이상의 아미노산 잔기)로 연결되어 하나의 펩타이드 사슬을 형성한다. 이러한 항체를 생성하는 방법은 예를 들어 US 4,946,778; Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer-Verlag, New York, pages: 269-315 (1994); Bird 등, Science, 242, 423-426 (1988); Huston 등, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 및 McCafferty 등, Nature, 348, 552-554 (1990)에 기재되어 있다. 단일 VH 및 VL만을 사용하면, 단쇄 항체는 일가이고; 2개의 VH 및 VL을 사용하면, 2가이거나; 또는 2개 이상의 VH 및 VL을 사용하면, 다가이다.
당업계에 공지된 임의의 기술로 본 발명의 항체를 생산하고, 예를 들어 임의의 화학적, 생물학적, 유적학적 또는 효소학적인 기술에 한정되지 않으며, 단독적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로 원하는 서열의 아미노산 서열이 알려져 있으며, 당업자들은 폴리펩타이드를 생산하기 위한 표준적인 기술에 의해 상기 항체를 용의하게 생산할 수 있다. 예를 들어, 공지된 고상방법으로 이러한 항체를 합성할 수 있으며, 바람직하게는 시판되는 펩타이드 합성장치 (예를 들어 Applied Biosystems, Foster City, California에서 제조된 장치)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 이러한 항체를 합성한다. 또는 당업계에 숙지된 DNA 재조합 기술에 의해 본 발명의 항체를 합성할 수 있다. 예를 들어, 항체를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터에 병합하고 이러한 벡터를 적절한 발현에 필요한 항체의 진핵 또는 원핵 숙주에 도입한 후, DNA 발현 산물로서의 항체를 얻을 수 있고, 그 후 알려진 기술을 이용하여 숙주로부터 항체를 분리할 수 있다.
임의의 "적합한” 수의 수식된 아미노산을 포함하고, 및/또는 커플링 치환기와 결합함으로써, 본 발명의 항체 및 그 항원 결합 단편을 수식할 수 있다. 이러한 경우, "적합"은 일반적으로 비유도화 모 항CD47 항체와 관련된 CD47 선택성 및/또는 CD47 특이성을 적어도 기본적으로 보유한 능력에 의해 결정된다. 하나 또는 복수의 수식된 아미노산을 포함하는 것은 예를 들어 폴리펩타이드 혈청 반감기 증가, 폴리펩타이드 항원성 저감 또는 폴리펩타이드 저장 안정성 향상에 유리하다. 하나 또는 복수의 아미노산에 대한 수식을 진행한다. 예를 들어, 재조합 생산 과정에서 번역과 동시에 진행하거나 번역 후에 진행하거나 (예를 들어, 포유동물 세포 발현 과정에서 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결된 글리코실화 작용), 합성 수단으로 수식을 진행한다. 수식된 아미노산의 비한정적인 예는 글리코실화된 아미노산, 황산화된 아미노산, 이소프렌화 (예를 들어, 파르네실화, 게라닐-게라닐화)된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 아실화된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜화된 아미노산, 비오틴아실화된 아미노산, 카르복실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 등을 포함한다. 아미노산 수식을 진행하는 참고문헌은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Walker, (1998), Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, New Jersey를 참고한다. 수식된 아미노산은 예를 들어 글리코실화된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴아실화된 아미노산, 지질 부분에 커플링된 아미노산 또는 유기 유도화제에 커플링된 아미노산으로부터 선택된다.
본 발명의 항체 및 그 항원 결합 단편은 순환 반감기를 증가시키기 위해 폴리머에 공유 결합함으로써 화학적으로 수식할 수도 있다. 예시적인 폴리머 및 이들을 펩타이드에 연결하는 방법은 예를 들어 US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 및 US 4,609,546을 참조한다. 다른 예시적인 폴리머는 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG) (예를 들어, 분자량이 약 1,000~40,000D 사이, 예를 들어 약 2,000~20,000D 사이, 예를 들어 약 3,000~12,000D의 PEG)을 포함한다.
용어 "피험자"란 온혈동물을 가리키며, 바람직하게는 포유동물 (인간, 가축 및 농장동물, 동물원 동물, 운동동물 또는 애완동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 면양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함)이며, 더 바람직하게는 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 피험자는 "환자", 즉 온혈동물일 수 있고, 더 바람직하게는 접수 대기 중이거나 의료 간호를 받고 있거나 의료 절차 또는 질환 발전 모니터링 대상인 인간이다. 일 실시형태에 있어서, 피험자는 성인 (예를 들어 18세 이상의 피험자)이다. 다른 실시형태에 있어서, 피험자는 아동 (예를 들어, 18세 이하의 피험자)이다. 일 실시형태에 있어서, 피험자는 남성이다. 다른 실시형태에 있어서, 피험자는 여성이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 샘플은 생체샘플이다. 생체샘플의 예는 질환조직, 체액, 바람직하게는 혈액, 더 바람직하게는 혈청, 혈장, 활액, 기관지폐포세정액, 가래, 림프액, 복수, 소변, 양수, 복막액, 뇌척수액, 흉막액, 심낭액 및 폐포 대식세포으로부터 제조된 조직 용해물 및 추출물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 용어 "샘플"은 임의의 분석 전에 개체로부터 채취한 샘플을 의미한다.
따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CD47 항체 및 그 항원 결합 단편은 완전 항체, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입), IgM 및 IgE; 항원 결합 단편, 예를 들어 SDR, CDR, Fv, dAb, Fab, Fab2, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, 낙타 항체 또는 나노 항체; 항체 또는 그 항원 결합 단편의 변이체 서열, 예를 들어 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 항CD47 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 유도체, 예를 들어 완전 항체에서 유래된 키메라 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체, 재조합 항체, 이중특이성 항체를 더 포함한다.
다른 형태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편의 하나 또는 복수의 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 항체 및 그 항원 결합 단편을 생성하는 재조합에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 발현 벡터는 염색체 벡터, 비염색체 벡터 및 합성 핵산 벡터 (1조의 적합한 발현 제어 요소의 핵산 서열을 포함)를 포함하는 임의의 적합한 DNA 또는 RNA이다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 세균플라스미드, 박테리오파지DNA, 바큐로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 박테리오파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터 및 바이러스핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 항CD47 항체를 코딩하는 핵산은 벌거벗은 DNA 또는 RNA 벡터에 포함되며, 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어 Sykes and Johnston, Nat Biotech, 12, 355-59 (1997)에 기재된 바와 같음), 콤팩트형 핵산 벡터 (예를 들어 US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 플라스미드 벡터 (예를 들어 pBR322, pUC 19/18 또는 pUC 118/119), 최소 크기의 핵산벡터 (예를 들어 Schakowski 등, MoI Ther, 3, 793-800 (2001)에 기재된 바와 같음), 또는 CaPO4 침전형 구축물과 같은 침전형 핵산 벡터인 구축물 (예를 들어 WO 00/46147; Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986); Wigler 등, Cell, 14, 725 (1978) 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics, 2, 603 (1981)에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 이러한 핵산 벡터 및 그 사용은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어 US 5,589,466 및 US 5,973,972를 참조).
일부 실시형태에 있어서, 벡터는 세균 세포에서 항CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편을 발현시키는데 적용된다. 이러한 벡터의 예는 예를 들어 BlueScript (Stratagene), pIN벡터 (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem, 264, 5503-5509 (1989)), pET벡터 (Novagen, Madison, Wisconsin) 등을 포함한다.
발현 벡터는 효모계에서 발현하는 데 적용되는 벡터일 수도 있다. 효모계에서 발현하는 데 적용되는 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들어 조성형 또는 유도형 프로머터 (예를 들어 α인자, 알코올 산화효소 및 PGH)를 포함하는 벡터를 포함한다 (F. Ausubel 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience, New York (1987); Grant 등, Methods in Enzymol, 153, 516-544 (1987); Mattanovich, D. 등, Methods Mol. Biol., 824, 329-358 (2012); Celik, E. 등, Biotechnol. Adv., 30(5), 1108-1118 (2012); Li, P. 등, Appl. Biochem. Biotechnol., 142(2), 105-124 (2007); Bφer, E. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 77(3), 513-523 (2007); van der Vaart, J.M., Methods Mol. Biol., 178, 359-366 (2002) 및 Holliger, P., Methods Mol. Biol., 178, 349-357 (2002)에 요약되어 있다).
본 발명의 발현 벡터에서, 항CD47 항체를 코딩하는 핵산은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서 및 발현에 도움이 되는 다른 요소 또는 이들의 결합을 포함할 수 있다. 이러한 요소의 예는 강발현형 프로모터 (예를 들어, 인간CMV IE프로모터/인핸서 및 RSV, SV40, SL3-3, MMTV와 HIV LTR 프로모터), 유효한 폴리 (A) 종결 서열, 대장균에서 플라스미드를 생산하기 위한 복제 기점, 선택적으로 표기로서의 항생소 내성 유전자 및/또는 편리한 클론 사이트 (예를 들어, 폴리 링커)를 포함한다. 핵산은 조성형 프로모터 (예를 들어, CMV IE)와 상대적인 유도형 프로모터를 더 포함할 수 있다.
다른 형태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편 또는 본 발명의 이중특이성 분자를 생성하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주세포 (예를 들어 트랜스펙트머)에 관한 것이다. 숙주세포의 예는 효모, 세균 및 포유동물 세포 (예를 들어 CHO 또는 HEK 세포)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 게놈에 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 비통합형 핵산 (예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 요소)을 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 항체 및 그 항원 결합 단편은 인간세포계, 비인간 포유동물세포계 및 곤충세포계와 같은 서로 다른 세포계, 예를 들어 CHO세포계, HEK세포계, BHK-21세포계, 마우스세포계 (예를 들어 골수종세포계), 섬유육종 세포계, PER.C6세포계, HKB-11세포계, CAP세포계 및 HuH-7 인간세포계에서 생산할 수 있다 (Dumont 등, 2015, Crit Rev Biotechnol., Sep. 18, 1-13., 그 내용이 인용에 의해 본 명세서에 원용된다).
일반적인 면역글로불린 정제방법에 의해 본 발명의 항체와 배지를 적절히 분리하고, 상기 방법은 예를 들어 프로틴 A-세팔로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 어피니티 크로마토그래피이다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 항체를 포함하며 이로 이루어지거나 기본적으로 이로 이루어진 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조성물에 있어서, "기본적으로 ...으로 이루어지다"는 것은 적어도 하나의 전술한 바와 같은 본 발명의 항체가 상기 조성물에서 생물학적 활성을 갖는 유일한 치료제 또는 시약임을 의미한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 약제 조성물이며, 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 벡터를 더 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"란 동물, 바람직하게는 인간에게 투여했을 때 불리한 알레리기 또는 다른 불량 반응을 일으키지 않는 부형제를 가리킨다. 이는 임의의 모든 용매, 분산 매체, 코팅층, 항균 및 항진균제, 등삼투과 흡수 지연제 등을 포함한다. 인간 투여에 있어서, 제제는 감독기관 (예를 들어 FDA 사무실 또는 EMA)에 요구되는 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 만족해야 한다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 항체를 포함하며 이로 이루어지거나 기본적으로 이로 이루어진 약제에 관한 것이다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체의 글리코실화를 수식한다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체 (즉, 항체가 글리코실화되지 않음)를 제조할 수 있다. 글리코실화를 변화시켜 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시키거나 항체의 ADCC활성을 변화시킬 수 있다. 이러한 탄수화물에 대한 수식은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 또는 복수의 글리코실화 사이트를 변화시켜 실현될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 진행함으로써 하나 또는 복수의 가변 영역 프레임워크의 글리코실화 사이트를 해소하여 해당 사이트의 글리코실화를 해소할 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시킬 수 있다. Co 등의 미국 특허 No.5,714,350 및 No.6,350,861 (인용에 의해 본 명세서에 원용)에는 이러한 방법이 더 상세하게 기재되어 있다. 또한 대체 가능하게, 감소된 양의 푸코실 잔기가 있거나 없는 저프코실화 또는 비후코실화 항체 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은 변경된 글리코실화 종류의 항체를 제조할 수 있다. 이러한 변경된 푸코실화 모드가 항체의 ADCC 능력을 향상시킨다는 것이 이미 증명되었다. 이러한 탄수화물의 수식은 예를 들어 변경된 글리코실화 메커니즘을 갖는 숙주세포에서 항체를 발현시킴으로써 실현될 수 있다. 변경된 글리코실화 메커니즘을 갖는 세포는 이미 당업계에 기재되어 있고, 숙주세포로 사용될 수 있으며, 해당 숙주세포에 본 발명의 재조합 항체를 발현시겨, 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산한다. 예를 들어, Hang 등의 EP1176195 (인용에 의해 본 명세서에 원용)에는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포계가 기재되어 있으며, 해당 FUT8 유전자는 푸코실 전이효소를 코딩하여 이러한 세포계에 발현된 항체가 저프코실화 또는 푸코실 잔기 결여를 나타나도록 한다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 인간 항체 (바람직하게는 모노클론 항체)는 저프코실화 또는 비후코실화 모드를 나타내는 세포계, 예를 들어, 푸코실 전이효소를 코딩하는 FUT8 유전자 발현이 결여된 포유동물 세포계에서 재조합 발현에 의해 생산될 수 있다. Presta의 PCT 공개 WO 03/035835 (인용에 의해 본 명세서에 원용)에는 저하된 푸코스를 Asn (297)이 연결된 탄수화물에 부착시키는 능력을 가져 해당 숙주세포에서 발현된 항체의 저프코실화도 일으킨 변이체 CHO 세포계, Lecl3세포 (Shields, R.L. 등 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740도 참조)가 기재되어 있다. Umana 등의 PCT 공개 WO 99/54342 (인용에 의해 본 명세서에 원용)에는 당단백질로 수식된 글리코실 전이효소 (예를 들어, β(1,4)-N아세틸 글루코사미니르 전이효소III (GnTIII))를 발현시키기 위해 세포계를 공정화시켜, 공정화된 세포계에서 발현된 항체가 증가된 이등분 GlcNac구조를 나타내도록 하여 항체의 ADCC활성 증가를 일으키는 것이 기재되어 있다 (Umana 등 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180도 참조). Eureka Therapeutics에는 푸코스 잔기가 결여된 변경된 포유동물 글리코실화 모드를 가진 항체를 생산할 수 있는 유전자 공정화된 CHO포유동물 세포가 추가로 기재되어 있다 (http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html). 또는, 본 발명의 인간 항체 (바람직하게는 모노클론 항체)는 효모 또는 사상균에서 생산될 수 있으며, 상기 효모 또는 사상균은 포유동물 유사 글리코실화 모드에 이용되고, 글리코실화 모드로서 푸코스가 결여된 항체를 생산할 수 있다 (예를 들어 EP1297172B1을 참조).
본 발명의 항체는 인간 CD47에 작용하여 인간 종양세포 표면의 CD47 발현을 특이적으로 인식함으로써, CD47과 수용체SIRPα의 결합에 의해 전달되는 억제성 신호경로를 차단할 수 있어, 대식세포 매개의 종양 탐식반응을 촉진할 수 있으며, 이로써 종양 면역치료에 새로운 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 자가 면역 질환, 예를 들어 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 다발성경화증, 궤양성대장염, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 사구체신염, 확장성심근증후군과 유사한 질환, 쇼그렌 증후군, 과민성접촉성 피부염, 다발성근염, 경피병, 동맥주위성 다발동맥염, 류마티스열, 백반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 베체트 증후군 및 만성 갑상선염 등; 이식물에 대한 면역응답, 알레르기반응, 감염성 질환, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 파킨슨병, 헌팅턴병, 마카도-조셉병, 근위축성 측삭경화증 및 크로이츠펠트-야콥병 등; 및 종양, 예를 들어 백혈병, 림프종, 골수종, 뇌종양, 두경부 편평세포암, 비소세포 폐암, 비인두 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담낭암, 간암, 대장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 방광암, 신장세포암 및 흑색종양 등을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 다음과 같은 기술적 방안에 관한 것이다.
제1항, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 여기서,
경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2, LCDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID No. 1, 2 및 3으로 표시되는 바와 같고; 및/또는
중쇄 가변 영역의 HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 4로 표시되는 바와 같고, 중쇄 가변 영역의 HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 5 또는 6과 적어도 약 94%의 동일성을 가지고; 중쇄 가변 영역의 HCDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 7 또는 8과 적어도 약 78%의 동일성을 가지거나; 또는
상기 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID No. 1-8로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이거나; 또는
상기 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1-8로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이고;
여기서 상기 변이체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체로부터 선택되는 하나이다.
제2항, 제1항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 불변 영역 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중의 어느 하나의 불변 영역 서열로부터 선택되고, 및/또는, 상기 항체의 경쇄 불변 영역 서열은 κ 사슬 또는 λ 사슬로부터 선택되고,
바람직하게는 중쇄 불변 영역 서열은 IgG1 또는 IgG4의 불변 영역 서열로부터 선택되고, 및/또는 경쇄 불변 영역 서열은 경쇄 κ 사슬의 불변 영역 서열로부터 선택되는 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체.
제3항, 제1항 또는 제2항에 있어서, CD47 키메라 항체 또는 그 기능성 단편의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 바와 같거나 SEQ ID No. 9 또는 10으로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유하거나 SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열; 및/또는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 11 또는 12로 표시되는 바와 같거나 SEQ ID No. 11 또는 12로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유하거나 SEQ ID NO. 11 또는 12로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열; 및/또는
상기 CD47 키메라 항체 및 그 기능성 단편의 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 13 및 SEQ ID NO. 14-16으로 표시되는 바와 같거나 각각 SEQ ID No. 13 및 SEQ ID NO. 14-16으로 표시되는 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유하거나 SEQ ID NO. 13 및 SEQ ID NO. 14-16으로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열인 것을 특징으로 하는 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체.
제4항, 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체의 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4를 포함하며, 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하고, 및/또는 여기서,
상기 FR-L1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 17로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-L2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 18로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
12번 아미노산 R의 T로의 치환;
상기 FR-L3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 19로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
31번 아미노산 Y의 F로의 치환;
상기 FR-L4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 20으로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-H1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 21로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-H2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 22로 표시되는 바와 같고;
상기 FR-H3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 23으로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
8번 아미노산 E의 T로의 치환,
11번 아미노산 S의 N으로의 치환,
31번 아미노산A의 V로의 치환; 및/또는
상기 FR-H4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 24로 표시되는 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체.
제5항, 제1항 또는 제2항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 25-27 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같고, 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 28-33 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같거나; 또는 SEQ ID NO. 25-27 또는 28-33으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 가지며 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이고; 또는 SEQ ID NO. 25-27 또는 28-33으로 표시되는 서열에 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 삭제, 치환 및/또는 첨가된 후 얻은 대응하는 모체 서열의 생물학적 활성을 보유한 변이체 서열이고;
바람직하게는 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO. 26 또는 27로 표시되는 바와 같고, 및/또는 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO. 33으로 표시되는 바와 같은 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체.
제6항, 제1-5 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fd, Fv, scFv, 이중특이성 항체, 낙타 항체, CDR 및 항체 최소 인식 단위(dAb)로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이며, 바람직하게는 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 또는 scFv인 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체.
제7항, 분리된 핵산 분자로서,
(1) 제1-6항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체를 코딩하는 DNA 또는 RNA;
(2) (1)에 정의된 핵산과 완전히 상보적인 핵산으로부터 선택된다.
제8항, 효과적으로 연결된 제7항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 바람직하게는 상기 벡터는 발현 벡터이다.
제9항, 제7항에 기재된 핵산 분자 또는 제8항에 기재된 벡터를 포함하는 숙주세포.
제10항, 제1-6항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 제7항에 기재된 핵산 분자, 제8항에 기재된 벡터 또는 제9항에 기재된 숙주세포 및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 및/또는 벡터를 포함하는, 조성물.
제11항, 제1-6항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체를 생산하는 방법으로서,
제9항에 기재된 숙주세포를 상기 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체 발현에 적합한 배양 조건에서 배양하고 얻어진 산물을 선택적으로 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.
제12항, 자가 면역 질환, 이식물에 대한 면역응답, 알레르기반응, 감염성 질환, 신경퇴행성 질환 및 종양을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1-6항 중의 어느 한 한의 항인간 CD47 항체, 그 항원 결합 단편 또는 그 변이체, 제7항에 기재된 핵산 분자, 제8항에 기재된 벡터 또는 제9항에 기재된 숙주세포의 용도;
바람직하게는, 상기 자가 면역 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 다발성경화증, 궤양성대장염, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 사구체신염, 확장성심근증후군과 유사한 질환, 쇼그렌 증후군, 과민성접촉성 피부염, 다발성근염, 경피병, 동맥주위성 다발동맥염, 류마티스열, 백반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 베체트 증후군 및 만성 갑상선염으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
바람직하게는, 상기 이식물에 대한 면역응답은 이식편대 숙주병이고; 바람직하게는, 상기 알레르기반응은 두드러기, 습진, 혈관신경성 부종, 알레르기 비염, 기관지 천식, 후두 부종, 식품 알레르기 위장염, 아나필락시스 쇼크로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
바람직하게는, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균, 기생충 등 병원체 및 특정 독소가 인체에 침입하여 생기는 국부 조직 및 전신성 염증 반응을 말한다.
바람직하게는, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 마카도-조셉병, 근위축성 측삭경화증, 크로이츠펠트-야콥병으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
바람직하게는, 상기 종양은 백혈병, 림프종, 골수종, 뇌종양, 두경부 편평세포암, 비소세포 폐암, 비인두 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담낭암, 간암, 대장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 방광암, 신장세포암, 흑색종양으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이다.
범위의 값을 제공할 때, 본문에 달리 명시되지 않는 한, 각 삽입 값, 하한까지의 단위의 10분의 1, 해당 범위의 상한과 하한 사이 및 해당 범위 내에서 설명된 다른 값 또는 삽입 값이 본 발명의 범위에 포함된다는 것을 이해해야 합니다. 특별히 제외된 한계 범위 내에서 특정 제외된 한계를 제거하면 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한도 본 발명에 포함됩니다. 범위가 한계 중 하나 또는 두 개를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 두 개를 제외하는 범위도 본 발명에 포함됩니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료도 본 발명의 구현 또는 테스트에서 사용할 수 있으나 현재 바람직한 방법 및 재료가 개시된다. 본 명세서에서 언급된 모든 출판물은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 원용된다.
일 측면에서 본 발명에 제공되는 실시예는 본 발명의 항체의 제조과정을 설명하기 위한 것이며, 이 제조과정은 관련된 방법을 설명하기 위한 것일 뿐 한정적이지 않으며, 본 발명의 정신에서 벗어나지 않으면서 본 발명에 대해 다양한 수정을 수행할 수 있다는 것은 당업자에게 알려져 있다. 이러한 수정도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 다른 측면에서 본 발명에 제공되는 실시예는 본 발명 항체의 특징 및 장점을 나타내기 위한 것이나, 본 발명은 이러한 특징 및 이점에 한정되지 않는다.
이하에서는 본 발명의 실시형태를 상세하게 설명하되, 당업자에게 있어서 이하의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 됨을 이해하기 바란다. 실시예에 구체적인 조건이 명시되어 있지 않은 경우, 통상의 조건 또는 제조업체가 제안하는 조건에 따라 실시한다. 사용되는 시약 또는 기기에 제조업체가 명기되어 있지 않은 것은 시판으로부터 입수할 수 있는 통상적인 제품이다.
실시예
실시예 1 마우스 유래 항인간 CD47 모노클론 항체의 제조
1.1. 동물 면역
실험동물은 베이징 바이탈 리버 실험동물 기술유한공사에서 구입한 6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였다. 마우스를 일주일간 환경을 적응시킨 후, 면역을 시작하였다. 최초 면역은 50μg의 재조합 인간 CD47-Fc 단백질 (베이징아크로바이오시스템즈, 카탈로그 번호 CD7-H5256) 및 프로인드 완전 아주반트 (Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 F5881)를 사용하고, 양자를 충분히 혼합하여 에멀젼을 형성하고 복강 내로 마우스에 주사하였다. 2주 뒤, 추가 면역을 진행하였다. 추가 면역은 25μg의 재조합 인간 CD47-Fc 단백질 및 프로인드 불완전 아주반트 (Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 F5806)를 사용하고, 양자를 충분히 혼합하여 에멀젼을 형성하고 복강 내로 마우스에 주사하였다. 2주마다 동일한 방법으로 추가 면역을 총 3회 실시하였다. 마지막 면역 후 10일째에 마우스 눈가 후정맥총에서 채혈하여 원심에 의해 혈청을 분리하고 재조합 인간 CD47-Fc 단백질에 대해 ELISA로 항체 역가를 측정하였다. 역가가 높은 마우스를 선택하여 융합을 통해 하이브리도마를 제조하였다. 융합 3일 전에 복강 내로 아주반트를 포함하지 않는 50μg의 재조합 인간 CD47-Fc 단백질을 주사하였다. 융합 당일에 무균으로 비장을 제거하고, DMEM 배지 (Dulbecco 개량 Eagle 배지, Gibco, 카탈로그 번호 11965)에 15%의 황소 태아 혈청 (FBS) (Corning, 카탈로그 번호 35-076-CV)을 첨가하여 단일 비장 세포 현탁액을 제조하고, 0.25μM의 CpG ODN (InvivoGen, 카탈로그 번호 tlrl-1826-1)를 첨가하여 24h 동안 자극하여 BTX ECM2001 전기융합장치 (Harvard Apparatus, 카탈로그 번호 45-0010)를 이용하여 전기 융합을 준비하였다.
1.2. 하이브리도마 세포의 제조
대수로 성장하는 골수종 세포 SP2/0 (중국과학원 세포뱅크로부터 구입)를 취하여 1000rpm에서 5min간 원심분리하고, 상청액을 버리고, 불완전 DMEM 배양액으로 세포를 현탁시킨 후 카운트하여 필요한 세포수를 0.3M의 만니톨 (Sigma, 카탈로그 번호 M8429), 0.1mM의 황산암모늄 (Sigma, 카탈로그 번호 M7774), 0.1mM의 염화칼슘 (Sigma, 카탈로그 번호 C5670)으로 이루어진 E-fusion 완충액으로 2회 세척하고, 1000rpm에서 5min간 원심분리하였다. 동시에 E-fusion 완충액으로 비장 세포를 2회 세척하고, 240g으로 6min간 원심분리하였다. 골수종 세포와 비장 세포를 일정한 비율로 혼합하여 50ml의 플라스틱 원심관 내에서 E-fusion 완충액으로 1회 세척하고, 240g으로 6min간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 손바닥에서 원심관 바닥을 가볍게 두드려 침전된 세포를 느슨하고 균일하게 만들고; 2ml의 E-fusion 완충액/(1-1.5)*10E7 비장 세포에 따라 E-fusion 완충액을 첨가하고, 각 10mm 간격의 융합풀 (Harvard Apparatus, 카탈로그 번호 45-0107)에 2ml의 세포 혼합액을 첨가하여 파라미터 설정을 체크하고, Automatic Start를 누르면 된다. 융합 후 멸균 조건에서 피펫으로 세포 현탁액을 융합조로부터 28ml의 HAT 배지 (DMEM+HAT, Sigma, 카탈로그 번호: H0262- 10VL)를 포함하는 50ml의 원심관으로 조심스럽게 옮기고, 37℃에서 10min 정치하고, 웰당 세포수(3-5)*10E4에 따라 HAT 배지를 첨가하여 플레이트를 깔고, 37℃, 5%의 CO2 배양기 내에 넣고 배양하였다. 5일 후 HAT 배지로 1/2의 배지를 교체하였다. 7~10일 후 HT 배지 (DMEM + HT, Sigma, 카탈로그 번호 H0137-10VL)로 HAT 배지를 교체하였다. 정기적으로 하이브리도마 세포의 성장 상황을 관찰하고 구멍 바닥 면적의 1/10 이상으로 자라면 상청액을 흡입하여 항체 검출에 제공하였다. 양성 클론의 세포를 확대 배양하여 동결 보존하였다.
1.3. 클론의 선별 및 검정
ELISA를 사용하여 하이브리도마 배양 상청액의 항인간 CD47 항체를 선별하였다. pH=9.6의 탄산염 완충 용액으로 96웰 고흡착성 ELISA 플레이트 (Coster, 카탈로그 번호 42592)에서 재조합 인간 CD47 (베이징 시노 바이오로지컬사로부터 구입)을 코팅하였다. 코팅 농도는 1μg/mL이며, 코팅량은 100μL/웰이고, 코팅은 4℃에서 하룻밤 진행하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBST 완충액으로 300μL/웰로 블로킹하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 배양 상청액 샘플 및 양성 혈청 대조를 100μL/웰로 첨가하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 다음 1:10000으로 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 희석된 고추냉이 과산화효소로 표지한 항마우스IgG 항체 (Abcam, 카탈로그 번호 Ab7068)를 100μL/웰로 첨가하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 발색 기질 TMB를 100μL/웰로 첨가하여 실온에서 10min 발색시켰다. 1M의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 발색을 정지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 읽어냈다. OD450nm의 강약에 따라 항인간 CD47 선택 항체를 분비할 수 있는 양성 클론을 선택하였다.
ELISA로 양성 클론에서 분비되는 항인간 CD47 선택 항체가 CD47/SIRPα의 결합을 차단할 수 있는지를 측정하였다. pH=9.6의 탄산염 완충 용액으로 96웰 고흡착성 ELISA 플레이트에서 재조합 인간 CD47-Fc (베이징 아크로바이오시스템즈로부터 구입)를 코팅하였다. 코팅 농도는 1μg/mL이고, 코팅량은 100μL/웰이고, 코팅은 4℃에서 하룻밤 진행하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액으로 300μL/웰로 블로킹하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 항인간 CD47 선택 항체 샘플을 50μL/웰로 첨가하고 농도가 4nM (최종 농도는 2nM)인 비오틴으로 표지된 SIRPα (베이징 아크로바이오시스템즈로부터 구입)를 50μL/웰로 첨가하여 25℃에서 90min간 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 다음 1:1000으로 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 희석된 Streptavidin-HRP (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 554066)를 100μL/웰로 첨가하여 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 발색 기질 TMB를 100μL/웰로 첨가하여 실온에서 10min 발색시켰다. 1M의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 발색을 정지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 읽어냈다. 인간 CD47-Fc/비오틴으로 표지된 SIRPα와 결합하는 항인간 CD47 선택 항체를 억제할 수 있으며, 즉 중화활성을 갖는다. 블로킹 능력의 강약에 따라 항인간 CD47 중화 항체를 분비할 수 있는 양성 클론을 선택하였다.
적혈구 (RBC)에서 CD47이 고도로 발현되고, 일부 항CD47 항체는 적혈구의 응집을 일으킬 수 있다. 양성 클론에서 분비되는 항인간 CD47 중화 항체가 적혈구의 응집을 일으키는 지를 측정하였다. 내부에서 기부된 건강한 항응고 인간 전혈을 DPBS (Gibco, 카탈로그 번호: 14190250)에 첨가한 후 원심분리하여 상청액을 버리고, 관 바닥의 적혈구를 수집하고, 3회 반복 세척한 후, 적혈구를 DPBS에 재현탁시켜 2%의 적혈구 현탁액을 만들었다. 이 현탁액을 저흡착 96웰 플레이트 (Coster, 카탈로그 번호 3879)에 50μL/웰로 첨가하고 단계 희석된 항인간 CD47 항체 샘플 및 양성 대조 (클론 번호가 CC2C6인 항CD47 항체, Biolegend, 카탈로그 번호 323102)를 50μL/웰로 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 플레이트를 37℃배양기에 넣고 2hr 배양한 다음 관찰하여 촬영하였다.
결과는 표 5로 표시되는 바와 같이, 복수의 항인간 CD47 클론은 강한 CD47 결합 활성 및 CD47/SIRPα 블로킹 활성을 가지며, 그 중 CD47-18-5클론 마우스 유래 모노클론 항체의 시험관 내 활성은 도 1에 나타냈다. 적혈구 응집의 결과는 도 2로 표시되는 바와 같이, CD47-5-65, CD47-8-21, CD47-16-5클론은 인간 적혈구 응집을 일으킬 수 있고, CD47-5-191, CD47-18-5, CD47-18-10 클론은 적혈구 응집을 일으키지 않는다.
1.4. 모노클론 항체 서열의 측정
선별하여 얻은 항원 결합 활성, 항원 중화 활성을 동시에 가지며 시험관 내에서 적혈구가 응집되지 않도록 하는 클론에 대해 항체DNA 서열의 측정을 진행하였다. 우선 세포mRNA를 추출하고, RNA prep Pure 시트 (Tiangen, DP419)를 사용하였다. 다음 SMART 5'RACE시트 (Clontech카탈로그 번호 634849)를 사용하여 하이브리도마에서 추출한 총 RNA를 역전사하여 인간 CD47 cDNA의 제1 사슬을 합성하고 각각 PCR 증폭 가변 영역의 프라이머 VHGSP: GATTACGCCAAGCTTGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT (SEQ ID NO: 36) 및 VLGSP: GATTACGCCAAG CTTGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC (SEQ ID NO: 37)를 설계하였다. PCR 증폭으로 얻은 목적밴드를 in-fusion 방식으로 선형화된 pRACE 벡터 (Clontech, 카탈로그 번호: 634859)에 클론하고 모노클론을 골라 DNA 시퀀싱을 진행하였다.
실시예 2 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체의 제조
CD47-18-5 클론이 PCR 증폭되어 얻은 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 바와 같고, 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 바와 같다. 마우스 가변 영역 서열에 기초하여 프레임워크 영역 서열을 배제하면 그 상보성 결정영역 서열을 얻은 수 있고; 여기서 경쇄의 3개의 상보성 결정영역 LCDR1, LCDR2, LCDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3으로 표시되는 바와 같고; 중쇄의 3개의 상보성 결정영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 7로 표시되는 바와 같다. CD47-18-5 클론으로 구축된 키메라 CD47 모노클론 항체를 각각 mAb-18-5, mAb-18-5 N297A로 명명하고, 두 항체의 경쇄는 모두 CD47-18-5 클론 경쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 9)과 경쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 13)이 연결된 것이고, mAb-18-5 항체의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 11)과 중쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 14)이 연결된 것이며, mAb-18-5 N297A 항체의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 11)과 중쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 15)이 연결된 것이다. CD47-18-10 클론이 PCR 증폭되어 얻은 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 바와 같고, 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 12로 표시되는 바와 같다. 마우스 가변 영역 서열에 기초하여 프레임워크 영역 서열을 배제하며 그 상보성 결정영역 서열을 얻을 수 있고; 여기서 경쇄의 3개의 상보성 결정영역 LCDR1, LCDR2, LCDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3으로 표시되는 바와 같고; 중쇄의 3개의 상보성 결정영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 4, 6 및 8로 표시되는 바와 같다. CD47-18-10 클론으로 구축된 키메라 CD47 모노클론 항체를 각각 mAb-18-10, mAb-18-10 N297A로 명명하고, 두 항체의 경쇄는 모두 CD47-18-10 클론 경쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 10)과 경쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 13)이 연결된 것이고, mAb-18-10 항체의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 12)과 중쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 14)이 연결된 것이며, mAb-18-10 N297A 항체의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (SEQ ID NO: 12)과 중쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 15)이 연결된 것이다. 얻은 키메라 항체의 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역의 서열 정보를 표 6에 나타냈다.
상기 항체의 경중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 유전자 합성 (쑤저우 제네위즈 (GENEWIZ) 바이오테크놀로지에 넘김)시겨 뉴클레오티드 서열을 얻고 진핵 세포 발현 벡터 X0GC로 클론닝한 후, 발현 벡터를 ExpiCHO세포계 (ExpiCHOTM, 카탈로그 번호 A29133, invitrogen)로 형질감염하였다. 형질감염 전날에 세포를 접종하고, 세포를 신선한 ExpiCHOTM 발현배지 (ExpiCHOTM Expression Medium, 카탈로그 번호 A29100, invitrogen)에 35Х105세포/mL의 세포밀도로 재현탁시키고 형질감염 당일에 카운트하였으며, 세포밀도는 (70-200)Х105세포/mL 범위 내에 있고, 생존율은 95%보다 높아야 하며, 예열된 ExpiCHOTM 발현배지로 세포를 희석하여 최종 밀도는 60Х105세포/mL이다. 형질감염의 체적에 따라 OptiPROTM 배지 (카탈로그 번호 12309, invitrogen)로 플라스미드 및 형질감염 시약 ExpiFectamineTM CHO시약 (카탈로그 번호 A29131, invitrogen)을 각각 희석하고, 플라스미드의 최종 농도는 0.5μg/ml이다. 희석된 형질감염 시약을 플라스미드에 부드럽게 첨가하고 1-5min 동안 정치한 후 플라스미드 형질감염 시약 복합체를 세포에 첨가하고, 세포 배양기에 넣고 125rpm 셰이커에서 37℃, 8%의 CO2로 배양하였다. 형질감염 다음날에 ExpiFectamineTM CHO Enhancer (카탈로그 번호 A29131, invitrogen) 및 ExpiCHOTM Feed (카탈로그 번호 A29101-02, invitrogen)를 추가하고, 세포 배양기를 125rpm 셰이커에서 32℃, 5%의 CO2로 조정하고, 원심분리하여 10일 동안 형질감염된 세포 배양 상청액을 수집하였다.
실시예 3 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체와 인간 CD47의 결합 활성 및 동역학 상수
pH=9.6의 탄산염 완충 용액으로 96웰 고흡착성 ELISA 플레이트에서 재조합 인간 CD47 (베이징 시노 바이오로지컬사로부터 구입)를 코팅하고, 코팅 농도는 1μg/mL이며, 코팅양은 100μL/웰이고, 코팅은 4℃에서 하룻밤 진행하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액으로 300μL/웰로 블로킹하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 항인간 CD47 항체 샘플 및 대조 CC-90002 (특허 서열 WO2016109415에서 유래)를 100μL/웰로 첨가하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 다음 1:10000으로 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 희석된 고추냉이 과산화효소로 표지한 항마우스IgG 항체 (Abcam, 카탈로그 번호 Ab7068)를 100μL/웰로 첨가하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 발색 기질 TMB를 100μL/웰로 첨가하여 실온에서 10min 발색시켰다. 1M의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 발색을 정지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 읽어냈다. 결과는 도 3으로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 mAb-18-5, mAb-18-5 N297A, mAb-18-10, mAb-18-10 N297A는 양호한 인간 CD47 결합친화력을 가지며 대조 CC-90002보다 결합 활성이 강하다.
Biacore X100 기기 (GE로부터 구입)로 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체와 그 항원 인간 CD47 결합의 동역학 상수를 검출하였다. 이 기기는 광확 표면 플라즈마 공명기술을 이용하여 바이오칩에 결합 및 코팅된 분자와 피험분자 사이의 결합 및 해리를 검출하였다. 사용된 주요 시약은 Protein A 칩 (GE Healthcare, 29-1275-57)이다. 실험 과정을 간단히 설명하면 아래와 같다. 항인간 CD47 키메라 항체를 러닝 완충액 (1ХHBS-EP + 10mM의 HEPES, 150mM의 NaCl, 3mM의 EDTA, 0.05%의 계면활성제 P20, pH7.4)에 희석시켰다. 포착 결합 단계에서 농도가 2μg/mL인 항체를 10μL/min의 속도로 60sec 주입하였다. 결합 단계에서 항원 CD47을 러닝 완충액으로 여러 농도로 희석하고 각각 30μL/min의 속도로 120sec 주입하였다. 해리 단계에서 러닝 완충액으로 10μL/min의 속도로 600sec 주입하였다. 재생조건은 10mM의 글로신염용액, pH1.5이다. 결합 동역학 상수 및 해리 동역학 상수는 Biacore X100 평가 소프트웨어로 분석 및 계산하였다. 항인간 CD47 키메라 항체의 결합 동역학 상수, 해리 동역학 상수 및 해리 평형 상수는 표 7에 나타냈다. 데이터에서는 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체가 CC-90002의 결합 해리 파라미터와 동등하거나 그 이상임의 나타냈다.
실시예 4 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체의 종속 특이성 및 결합 특이성
ELISA로 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체의 종속 특이성을 측정하였다. pH=9.6의 탄산염 완충 용액으로 96웰 고흡착성 ELISA 플레이트에서 재조합 인간 CD47, 원숭이 CD47, 래트 CD47 및 마우스 CD47 (모두 베이징 시노 바이오로지컬사로부터 구입)을 코딩하고. 코팅 농도는 1μg/mL이며, 코팅양은 100μL/웰이고, 코팅은 4℃에서 하룻밤 진행하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액으로 300μL/웰로 블로킹하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 단계 희석된 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체샘플을 100μL/웰로 첨가하여 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 다음 1:10000으로 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 희석된 고추냉이 과산화효소로 표지한 항인간 IgG 항체 (Chemicon, 카탈로그 번호 AP309P)를 100μL/웰로 첨가하여 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 발색 기질 TMB을 100μL/웰로 첨가하여 실온에서 10min 발색시켰다. 1M의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 발색을 정지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 읽어냈다.
플로사이트메트리 FACS로 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체의 종속 특이성을 확인하였다. 내부에서 기부된 정상 인간 RBC, 게먹이 원숭이 RBC, 래트 RBC 및 마우스 RBC 세포를 수집하였다. 2%의 FBS (Hyclone, 카탈로그 번호 SH30084.03)를 포함하는 차가운 PBS (GIBCO, 카탈로그 번호 14190)로 1회 체척하였다. RBC를 관마다 2Х106개의 세포로 2%의 FBS를 포함하는 차가운 PBS 100μL에 재현탁시키고, 100μL의 단계 희석된 항인간 CD47 항체 샘플 및 대조 CC-90002를 첨가하여 이소타입 대조하였다. 플로우 튜브를 얼음 위에서 30 min 배양하였다. 2%의 FBS를 포함하는 PBS로 2회 세척하였다. 2%의 FBS및 1:1000으로 희석된 FITC 표기된 항인간 IgG 항체 (베이징 ZSGB-BIO, 카탈로그 번호 ZF0306)를 포함하는 차가운 PBS 200μL에 재현탁시켰다. 얼음 위에서 광을 피하여 30min 동안 배양하였다. 2%의 FBS를 포함하는 PBS로 2회 세척하였다. 500μL의 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 플로사이트메트리 (BD, FACS Calibur)로 검출 분석하여 RBC 세포의 형광 강도를 읽어냈다.
ELISA로 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체의 결합 특이성를 측정하였다. pH=9.6의 탄산염 완충 용액으로 96웰 고흡착성 ELISA 플레이트에서 재조합 인간 PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, CD47, PD-L2, CD80, CD86, B7-H2, CD47, SIRPα, SIRPγ(모두 Sino Biological Inc.로부터 구입)를 코팅하고, 코팅 농도는 1μg/mL이며, 코팅양은 100μL/웰이고, 코팅은 4℃에서 하룻밤 진행하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액으로 300μL/웰로 블로킹하고, 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 단계 희석된 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 샘플 및 대조 CC-90002를 첨가하여 이소타입 대조하고, 100μL/웰로 참가하여 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 다음 1:10000으로 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 희석된 고추냉이 과산화효소로 표지한 항인간 IgG 항체 (Chemicon, 카탈로그 번호 AP309P)를 100μL/웰로 첨가하여 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 발색 기질 TMB를 100μL/웰로 첨가하여 실온에서 10min 발색시켰다. 1M의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 발색을 정지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 읽어냈다.
결과는 도 4의 A 및 표 8로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체는 인간 CD47 및 원숭이 CD47에 결합될 수 있으며 친화력이 유사하나 래트, 마우스 CD47과 결합하지 않아 종속 특이성을 갖는다. 동시에 도 4의 B로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체는 또한 강한 결합 특이성을 가지며 CD47 만과 결합하고 B7 패밀리 멤버, CD28 패밀리 멤버 및 SIRPγ와 결합하지 않는다.
실시예 5 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체의 CD47과 수용체 결합을 블로킹하는 활성
pH=9.6의 탄산염 완충 용액으로 96웰 고흡착성 ELISA 플레이트에서 재조합 인간 CD47-Fc (베이징아크로바이오시스템즈로부터 구입)를 코팅하고, 코팅 농도는 1μg/mL이며, 코팅양은 100μL/웰이고, 4℃에서 하룻밤 진행하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액으로 300μL/웰로 블로킹하고, 25℃에서 1hr동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 항인간 CD47 항체샘플를 50μL/웰로 첨가하고 4nM (최종 농도는 2nM)의 농도로 비오틴으로 표지된 SIRPα (베이징아크로바이오시스템즈로부터 구입)를 50μL/웰로 첨가하여 25℃에서 90min 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 다음 1:1000으로 1%의 BSA를 포함하는 PBST 완충액에 희석된 스트렙토아비딘-HRP (Streptavidin-HRP) (BD Pharmingen, 카탈로그 번호 554066)을 100μL/웰로 첨가하여 25℃에서 1hr 동안 배양하였다. PBST 완충액으로 5회 세척하였다. 발색 기질 TMB를 100μL/웰로 첨가하여 실온에서 10min 발색시켰다. 1M의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 발색을 정지시켰다. 450nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 읽어냈다.
결과는 도 5로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체는 CC-90002와 유사한 CD47/SIRPα 블로킹 활성을 갖는다.
실시예 6 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체 매개의 종양세포 탐식 활성
성숙 인간 대식세포의 제조: 인간 PBMC 세포 (Lonza, 카탈로그 번호 CC-2702)를 소생시켜 수집하였다. 인간 PBMC 세포를 5Х106/mL의 세포밀도로 무혈청의 RPMI 1640 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 11875)에 재현탁시키고 세포 배양병에 접종하여 37℃의 이산화탄소 배양기에서 90min 동안 배양하였다. 배양 상청액 및 현탁 세포를 제거하고, 부착세포를 완전배지 (10%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640)에서 배양하고 25ng/ml의 M-CSF (베이징 시노 바이오로지컬사, 카탈로그 번호 11792-HNAN)를 첨가하여 7일간 배양하였다. 다음 대식세포를 수납하고, 25ng/ml의 M-CSF 및 50ng/ml의 IFN-γ (베이징 시노 바이오로지컬사, 카탈로그 번호 11725-HNAS)를 포함하는 완전배지 (10%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640)에 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 48웰 세포 배양 플레이트에 50000개의 세포/웰로 접종하여 1일간 배양하여 대식세포를 성숙시켜 준비하였다.
CFSE시트 (Life technology, 카탈로그 번호 C34554) 사용설명서를 참조하여 Raji종양세포 (베이징 협화세포자원센터에서 구입, 자원번호: 3111C0001CCC000046)를 염색하였다. 간단히 말하면, PBS로 CFSE를 작업농도 5μM까지 희석하고 37℃에서 예열하고, 1000rpm에서 5min 원심분리하여 Raji 세포를 수집하여 예열된 CFSE 작업용액으로 Raji를 재현탁시키고, 37℃에서 15min 동안 배양하였다. 완전배지로 1회 세척하고 다시 완전배지에 재현탁시키켜 30min 동안 배양하고, 다시 완전배지로 2회 세탁하고 다시 완전배지에 재현탁시켜 준비하였다.
48웰 플레이트를 완전배지로 3회 세척하였다. CFSE 염색 후의 Raji 세포와 피험 항인간 CD47 항체 샘플 및 대조 CC-90002를 아이소타입 대조로 미리 15min 배양하고, 다음 48웰 배양 플레이트에 첨가하여 37℃의 이산화탄소 배양기에서 2hr 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 48웰 플레이트를 완전배지로 3회 세척하고, 완전배지에 희석된 밀배아 응집소 (wheat germ agglutinin), alexa fluor 555 (Life technologies, 카탈로그 번호 W32464)를 10μg/ml로 첨가하여 광을 피하여 15min 배양하였다. 48웰 플레이트를 다시 완전배지로 3회 세척하고, 4%의 파라포름알데히드를 첨가하여 15min 고정하였다. 48웰 플레이트를 다시 완전배지로 3회 세척하고 완전배지를 첨가하였다. 형광현미경으로 촬영하여 세포수를 카운팅하였다. 탐식지수 (%)의 계산 방법은 탐식되는 녹색으로 표지된 Raji 세포의 수/존재하는 적색으로 표지된 대식세포수×100이다.
결과는 도 6으로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체는 대식세포에 의한 Raji 종양세포의 탐식을 매개할 수 있고, CC-90002의 활성과 동등하거나 그 이상이다.
실시예 7 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체가 적혈구에 대한 영향
적혈구 (RBC)에서 CD47이 고도로 발현되고, 일부 항CD47 항체는 적혈구의 응집을 일으킬 수 있다. 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체가 적혈구의 응집을 일으킬 수 있는지 측정하였다. 내부에서 기부된 항응고 인간 전혈에 DPBS를 첨가하여 재현탁시키고, 다음 원심분리하여 상청액을 제거하고 관 바닥의 적혈구를 수집하여 3회 반복 세척한 후, 적혈구를 DPBS에 재현탁시켜 2%의 적혈구 현탁액을 만들었다. 이 현탁액을 저흡착 96웰 플레이트에 50μL/웰로 첨가하고, 단계 희석된 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 샘플 및 양성 대조 (클론 번호CC2C6의 항CD47 항체, Biolegend, 카탈로그 번호 323102)를 50μL/웰로 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 플레이트를 37℃의 배양기에 넣고 2hr 동안 배양한 후 관찰하여 촬영하였다.
결과는 도 7로 표시되는 바와 같이, 양성 대조만 인간 적혈구 응집을 일으켰으나 mAb-18-5, mAb-18-10은 적혈구 응집을 일으키지 않는다.
실시예 8 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체의 항종양 효과에 대한 연구
본 실시예에서 키메라 항인간 CD47 모노클론 항체의 NCG 마우스에 접종한 Raji 종양 이식물에 대한 성장 억제 작용을 검출하였다. 6~8 주령 암컷 NCG마우스 (난징생물의약연구원에서 구입)를 실험재료로 선택하여 사용하였다. 마우스를 일주일간 환경을 적응시킨 후, 마우스마다 5Х106개의 인간 Raji 림프종세포를 접종하였다. 종양 체적이 약 150mm3까지 커지면, 종양 체적에 따라 매조당 6마리의 마우스로 조를 나누고, 각각 용매 대조군, CC-90002 대조군, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 mAb-18-5 투여군, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 mAb-18-5 N297A 투여군으로 설정하였다. 복강 내 주사로 35 nmol/kg의 투여량으로 주 2회, 2주 연속 투여하였다. 투여일로부터 매주마다 종양 체적을 2회씩 측정하고, 그 장경 a, 단경 b를 측정하며 종양 체적의 계산 공식은 종양 체적 (mm3)=(aХb2)/2이다.
결과는 도 8로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 키메라 모노클론 항체 mAb-18-5는 항종양 활성을 가지며, NCG마우스에 접종된 Raji 이식 종양의 성장을 현저하게 억제하였으며 약효는 CC-90002와 동등하다.
실시예 9 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 제조
인간화 항인간 CD47 모노클론 항체는 Leung 등 (1995, Molecule Immunol 32:1413-27)에 기재된 방법에 의해 얻어진 것이다.
Germline 데이터베이스에서 마우스 유래 항체 가변 영역 서열과 가장 매칭되는 인간화 주형을 선택하고, 여기서 경쇄 가변 영역의 주형은 IGKV1-17*02이며 서열은 SEQ ID NO: 34로 표시되는 바와 같고; 중쇄 가변 영역의 주형은 IGHV1-69*01이며 서열은 SEQ ID NO: 35로 표시되는 바와 같다. 마우스 유래 항체 CDR 영역을 선택한 인간화 주형에 이식하고, 인간 주형의 CDR 영역과 치환하여 서열이 SEQ ID NO: 25로 표시되는 바와 같은 이식한 인간화 항체 경쇄 가변 영역, 서열이 SEQ ID NO: 28로 표시되는 바와 같은 이식한 인간화 항체 중쇄 가변 영역을 얻었다. SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 28에서 사이트를 선택하여 역돌연변이를 진행하여 서열이 SEQ ID NO: 26, 27로 표시되는 바와 같은 경쇄 가변 영역을 얻고, 서열이 SEQ ID NO: 29-33으로 표시되는 바와 같은 중쇄 가변 영역을 얻었다. 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 13)을 연결하여 각각 대응하는 경쇄 전체 길이 서열을 얻었고, 중쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 14)을 연결하여 각각 대응하는 중쇄전체 길이 서열을 얻었다. 친화력과 안정성 선별에 의해 사용 가능한 인간유래화 서열을 얻고, 얻어낸 인간유래화 서열의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 정보는 표 9에 나타냈다.
실시예 10 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 항원 결합 활성
인간화 CD47 모노클론 항체는 BH3008b, BH3011b로 명명되었으며, 여기서 가변 영역은 각각 Z11, Z12에 대응하고, 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 13)을 연결하고, 중쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역 (서열 SEQ ID NO: 16)을 연결하였다. 상기와 같이, 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 항원 결합 활성에 대해 검출하였다. 결과는 도 9로 표시되는 바와 같이, 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체 BH3008b, BH3011b는 양호한 인간 CD47 결합 친화력을 기지며 대조 CC-90002의 결합 활성과 동등하다.
실시예 11 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체가 CD47과 수용체 결합을 블로킹하는 활성
상기와 같이, 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체가 CD47과 수용체 결합을 블로킹하는 활성을 검출하였다.
결과는 도 10으로 표시되는 바와 같이, 인간화항인간 CD47 모노클론 항체 BH3008b, BH3011b는 CC-90002와 유사한 CD47/SIRPα 블로킹 활성을 갖는다.
실시예 12 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체와 인간 CD47의 결합 동역학 상수
상기와 같이, Biacore X100 기기로 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체와 그 항원 인간 CD47 결합의 동역학 상수를 검출하였다. 항인간 CD47 인간화 항체의 결합 동역학 상수, 해리 동역학 상수 및 해리 평형 상수는 표 10에 나타냈다. 데이터에 따르면, 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체 BH3008b, BH3011b는 CC-90002의 결합 해리 파라미터와 동등하다.
실시예 13 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체가 적혈구에 대한 영향
상기와 같이, 항인간 CD47 인간화 모노클론 항체 BH3008b, BH3011b 및 대조 CC-90002가 적혈구의 응집을 일으킬 수 있는지를 측정하였다. 여기서, 양성 대조는 클론 번호가 CC2C6인 항CD47 항체, Biolegend, 카탈로그 번호 323102이다.
결과는 도 11로 표시되는 바와 같이, 양성 대조만 인간 적혈구 응집을 일으켰지만 CC-90002, BH3008b, BH3011b는 적혈구 응집을 일으키지 않는다.
실시예 14 분자 배제 고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의한 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 순도 및 그 열안정성 검출
Waters Xbridge BEH200크로마토그래피 컬럼 (카탈로그 번호: 186007640)을 사용하며; 이동상은 0.1mol/L의 NaCl 완충액, pH 6.7이고; 유속은 0.8mL/min이고; 크로마토그래피 컬럼 온도는 25℃이고; 샘플폴 온도는 4℃이고; 검출 파장은 280nm이며; 샘플 완충액 DPBS로 샘플을 1mg/mL까지 희석시키고, 주입 체적은 10μL이다. Agilent 고속 액체 크로마토그래피1260 시스템 스테이션으로 실험 결과에 대해 데이터 처리를 수행하고, 면적 정규화법으로 순도인 주 피크 비율을 계산하였다. 상기 제조된 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체 BH3008b, BH3011b에 대하여 SE-HPLC 순도를 검출하였다. 이들 모노클론 항체의 열안정성을 확정하기 위해 상기 샘플을 40℃의 고온 조건하에 놓고, 2주차와 4주차에 각각 샘플링하여 SE-HPLC 검출을 수행함으로써 열안정성을 관찰하고, 결과는 하기 표 11로 표시되는 바와 같다. 인간화 항인간 CD47 항체는 모두 좋고 동등한 안정성을 나타냈다.
실시예 15 이온교환크로마토그래피 (IEX)에 의한 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 전하 변이체 검출
양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 MabPac SCX-10, 4mmХ250mm (Thermo, 카탈로그 번호: 78655)를 사용하여, 20mmol/L의 모르폴린에탄술폰산 (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid, MES) (pH5.6) 및 60mmol/L 염화나트륨을 이동상 A로 하며; 10mmol/L의 MES (pH5.6) 및 300mmol/L의 염화나트륨을 이동상 B로 하고; 유속은 0.6mL/min이며; 컬럼온도는 25℃이며; 샘플폴 온도는 4℃이며; 검출파장은 280nm이며; 샘플로드량은 40μL (1mg/mL)이며; 용출 방식은 10~55%의 선형 구배로 43min 동안 운행하였다. Agilent 고속 액체 크로마토그래피 1260시스템 스테이션으로 실험 결과에 대해 데이터 처리를 수행하고 면적 정규화법으로 피크 면적의 백분율을 계산하였다. 상기 제조된 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체 BH3008b, BH3011b에 대하여 IEX 검출을 진행하였다. 이러한 모노클론 항체의 화학적 안정성을 확정하기 위해 상기 샘플을 40℃의 고온 조건하에 놓고, 2주차와 4주차에 각각 샘플링하여 IEX 검출을 진행함으로써 전하 변이체 비율을 관찰하고, 결과는 표 12로 표시되는 바와 같다. 인간화 항인간 CD47 항체의 전하 변이체의 비율 변화는 모두 비교적 낮다.
실시예 16 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 항종양 효과에 대한 연구
본 실시예에서 인간화 항인간 CD47 모노클론 항체의 NCG 마우스에 접종한 Raji 종양 이식물에 대한 성장 억제 작용을 검출하였다. 6~8 주령 암컷 NCG 마우스 (난징생물의약연구원에서 구입)를 실험재료로 선택하여 사용하였다. 마우스를 일주일간 환경을 적응시킨 후, 마우스마다 5Х106개의 Raji 인간 림프종 세포를 접종하였다. 종양 체적이 약 150mm3까지 커지면, 종양 체적에 따라 매조당 6마리의 마우스로 각각 용매 대조군, CC-90002 대조군, 항인간 CD47 인간화모노클론 항체 BH3008b투여군, 항인간 CD47 인간화모노클론 항체BH3011b 투여군으로 설정하였다. 복강 내 주사로 17.5nmol/kg의 투여량으로 주 2회, 2주 연속 투여하였다. 투여일로부터 매주마다 종양 체적을 2회씩 측정하고, 그 장경 a, 단경 b를 측정하며 종양 체적의 계산 공식은 종양 체적 (mm3)=(aХb2)/2이다.
결과는 도 12로 표시되는 바와 같이, 항인간 CD47 인간화모노클론 항체 BH3008b, BH3011b는 항종양 활성을 가지며, NCG마우스에 접종된 Raji 이식 종양의 성장을 현저하게 억제하였으며 약효는 CC-90002와 동등하다.
마지막으로 설명해야 할 것은, 이상의 각 실시예는 본 발명의 기술방안을 설명하기 위한 것일 뿐 한정하려는 것은 아니다. 상기 각 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 상세하게 설명하였으나, 당업계에서 일반 지식을 가진 자들은 전술한 각 실시예에 기재되는 기술방안을 수정하거나 그 기술적 특징의 일부 또는 전부를 동등하게 대체하는 것은 여전히 가능하며, 이러한 수정 또는 대체는 대응하는 기술방안의 본질을 본 발명의 각 실시예와 관련된 기술안의 범위에서 벗어나게 하는 것이 아님을 이해해야 한다.
<110> BEIJING HANMI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO CD47 AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF <130> LZ2118354CN07 <160> 37 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 1 Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ser Ile Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 2 Leu Ala Ser Asn Arg His Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 3 Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 4 Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile Tyr Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 5 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 6 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 9 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Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Ile Thr Thr Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region <400> 13 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 14 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 15 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region <400> 15 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 16 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region <400> 16 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-L1 <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-L2 <400> 18 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-L3 <400> 19 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-L4 <400> 20 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H1 <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H2 <400> 22 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H3 <400> 23 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H4 <400> 24 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Pro Thr Asp Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Ile Pro Thr Asp Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Pro Thr Asp Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Pro Thr Asp Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Ile Pro Thr Asp Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Ile Pro Thr Asp Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV1-17*02 <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 35 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV1-69*01 <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 36 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VHGSP <400> 36 gattacgcca agcttgccag tggatagaca agcttgggtg tcgtttt 47 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer VLGSP <400> 37 gattacgcca agcttgatgg atccagttgg tgcagcatca gc 42

Claims (14)

  1. 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편으로서,
    경쇄 가변 영역은 아미노산 서열이 SEQ ID NO.1로 표시되는 바와 같은 LCDR1, 아미노산 서열이 SEQ ID NO.2로 표시되는 바와 같은 LCDR2, 아미노산 서열이 SEQ ID NO.3으로 표시되는 바와 같은 LCDR3을 포함하고; 및/또는
    중쇄 가변 영역은 아미노산 서열이 SEQ ID No. 4로 표시되는 바와 같은 HCDR1, 아미노산 서열이 SEQ ID No. 5 또는 6과 적어도 약 94%의 동일성을 갖는 HCDR2; 아미노산 서열이 SEQ ID No. 7 또는 8과 적어도 약 78%의 동일성을 갖는 HCDR3을 포함하는, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체인, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 불변 영역 서열은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중의 어느 하나의 불변 영역 서열로부터 선택되고, 및/또는, 상기 항체의 경쇄 불변 영역 서열은 κ 사슬 또는 λ 사슬로부터 선택되며; 바람직하게는 상기 중쇄 불변 영역 서열은 IgG1 또는 IgG4의 불변 영역 서열로부터 선택되고, 및/또는 상기 경쇄 불변 영역 서열은 κ 사슬의 불변 영역 서열로부터 선택되는, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지고, 및/또는 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 11 또는 12로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지고, 및/또는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 13 및 SEQ ID NO. 14-16 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같은, 항인간 CD47 항체 또는 그 기능성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4를 포함하며, 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역은 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하고,
    상기 FR-L1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 17로 표시되는 바와 같고;
    상기 FR-L2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 18로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
    12번 아미노산 R의 T로의 치환;
    상기 FR-L3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 19로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
    31번 아미노산 Y의 F로의 치환;
    상기 FR-L4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 20으로 표시되는 바와 같고;
    상기 FR-H1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 21로 표시되는 바와 같고;
    상기 FR-H2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 22로 표시되는 바와 같고;
    상기 FR-H3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 23으로 표시되는 바와 같거나 하기 치환 중 하나 또는 이들의 임의의 조합에 의해 추가로 얻은 아미노산 서열이고:
    8번 아미노산 E의 T로의 치환,
    11번 아미노산 S의 N으로의 치환,
    31번 아미노산 A의 V로의 치환; 및/또는
    상기 FR-H4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 24로 표시되는 바와 같은, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 SEQ ID No. 25-27 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지고; 및/또는
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID No. 28-33 중의 어느 하나로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지는, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 26 또는 27로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지고, 및/또는
    중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 33으로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지는, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fd, Fv, scFv, 이중특이성 항체, 낙타 항체, CDR 및 항체 최소 인식 단위 (dAb)로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상이며, 바람직하게는 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 또는 scFv인, 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  9. (1) 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA 또는 RNA;
    (2) (1)에 정의된 핵산과 완전히 상보적인 핵산으로부터 선택되는, 분리된 핵산 분자.
  10. 유효적으로 연결된 제9항에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  11. 제9항에 기재된 핵산 분자 또는 제10항에 기재된 발현 벡터를 포함하는, 숙주세포.
  12. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편, 제9항에 기재된 핵산 분자, 제10항에 기재된 발현 벡터 또는 제11항에 기재된 숙주세포 및 하나 또는 복수 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 조성물.
  13. 제11항에 기재된 숙주세포를 상기 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편 발현에 적합한 배양 조건에서 배양하고 얻어진 산물을 선택적으로 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
  14. CD47에 매개되는 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 기재된 항인간 CD47 항체 또는 그 항원 결합 단편, 제9항에 기재된 핵산 분자, 제10항에 기재된 발현 벡터 또는 제11항에 기재된 숙주세포의 용도로서, 바람직하게는 상기 질환 또는 병증은 종양이고; 더 바람직하게는 상기 종양은 백혈병, 림프종, 골수종, 뇌종양, 두경부 편평세포암, 비소세포 폐암, 비인두 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담낭암, 간암, 대장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 방광암, 신장세포암, 흑색종양으로부터 선택되는 하나 또는 복수 이상인, 용도.
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