CN116234826A - Btla抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明整体涉及与人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)结合的抗体及其用途。更具体地，本发明涉及与人BTLA结合并调节其活性的激动性抗体，以及这些激动性抗体在治疗炎性、自身免疫和增生性疾病和障碍中的用途。合适地，这些抗体还具有增强通过FcγR2B的信号传导的Fc修饰。

Description

BTLA抗体
技术领域
本发明整体涉及与人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)结合的抗体及其用途，这些抗体包括抗原结合片段。更具体地，本发明涉及与人BTLA结合并调节其活性以及具有增强的与FcγR2B的结合和通过该FcγR2B的信号传导的激动性抗体，以及这些激动性抗体在治疗炎性、自身免疫和增生性疾病和障碍中的用途。
背景技术
免疫系统必须实现病原体或危险突变细胞的破坏与健康自体组织和无害共生体的耐受之间的平衡。为了促进这种平衡，通过整合来自多种刺激性受体和抑制性受体的信号来影响免疫细胞的活性，这些受体使细胞适应细胞所处的环境。这些表面表达的受体为免疫应答的治疗性调节呈现了有吸引力的靶标。许多人类疾病是由免疫系统的异常或不需要的活化(包括自身免疫疾病、移植排斥和移植物抗宿主病)引起的。能够诱导通过抑制性受体的信号传导的激动剂可抑制这些不需要的免疫应答。
B和T淋巴细胞衰减子(BTLA；也称为CD272)是CD28受体家族的抑制性成员，该受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和PD-1(Watanabe等人，Nat Immunol.，第4卷：第670-679页，2003年)。该B和T淋巴细胞衰减子在整个免疫系统的骨髓细胞和淋巴细胞两者上广泛表达(Han等人，J Immunol.，第172卷：第5931-5939页，2004年)。在被其配体疱疹病毒进入介质(HVEM)接合后，BTLA将磷酸酶SHP-1和SHP-2募集至其细胞质结构域(Sedy等人，NatImmunol.，第6卷：第90-98页，2005年)，其继而抑制活化性受体的信号传导级联。缺乏完整BTLA基因的小鼠显示出体外的过度增殖性B和T细胞应答、免疫后对DNP-KLH的滴度升高以及对EAE的敏感性增加(Watanabe等人，Nat.Immunol，第4卷：第670-679页，2003年)。如果观察到直到老年BTLA敲除小鼠自发地产生自身抗体，则会出现自身免疫肝炎样疾病以及炎性细胞浸润于多个器官中(Oya等人，Arthritis Rheum，第58卷：第2498-2510页，2008年)。这一证据表明BTLA抑制性受体在保持免疫稳态以及抑制自身免疫中起关键作用。此外，HVEM-BTLA信号传导参与对粘膜炎症和感染免疫的调节(Shui等人，J Leukoc Biol.，第89卷：第517-523页，2011年)。
在患有自身免疫障碍的情况下，能够调节BTLA功能以抑制自身反应性淋巴细胞的治疗剂将是非常需要的。
先前已表明与小鼠BTLA结合的单克隆抗体可充当激动剂，诱导通过受体的信号传导以抑制免疫细胞应答。在激动剂抗BTLA抗体(mAb)的存在下，抗CD3和抗CD28活化的T细胞显示IL-2产生和增殖减少(Kreig等人，J.Immunol.，第175卷，第6420-6472页，2005年)。
此外，抗小鼠BTLA激动剂抗体已表明移植物抗宿主病的鼠模型中的疾病得到改善(Sakoda等人，Blood.，第117卷：第2506-2514页；Albring等人，J Exp Med.，第207卷：第2551-2559页，2010年)。靶向人BTLA受体的激动剂抗体已表明在体外抑制T细胞应答(参见Otsuki等人，Biochem Biophys Res Commun，第344卷：第1121-1127页，2006年；和WO2011/014438)，但尚未被应用于临床。
WO 2018/213113(礼来公司(Eli Lilly&Co.))公开了针对BTLA的某些抗体。
2020年6月25日公布的WO2020128446(牛津大学创新有限公司(OxfordUniversity Innovation Limited)和MiroBio有限公司)公开了针对BTLA的某些抗体。
在人体中存在一种抑制性Fcγ受体(FcγR2B)，而其他Fcγ受体(FcγR1A、FcγR2A、FcγR3A和FcγR3B)都在传递免疫活化信号。FcγR2B的重要调节作用已通过对具有对自身免疫疾病增加的易感性的FcγR2B敲除小鼠的研究得到证实(Nakamura等人，Journalof Experimental Medicine，第191卷第5期：第899–906页，2000年)。此外，人体中的FcγR2B基因中的多态性与自身免疫疾病(特别是系统性红斑狼疮)的风险相关(Floto等人，Nature Medicine，第11卷第10期，第2005年)。因此认为FcγR2B在控制免疫应答中起关键作用，并且是用于控制自身免疫和炎性疾病的有希望的靶分子。
已报道了具有Fc的抗体具有改善的FcγR2B结合活性(Chu等人，MolecularImmunology，第45卷第15期：第3926–3933页，2008年)。在该文献中，通过向抗体Fc区添加改变诸如S267E/L328F、G236D/S267E和S239D/S267E来改善FcγR2B结合活性。其中，引入了S267E/L328F突变的抗体与FcγR2B的结合最强，并且将与FcγR1A和FcγR2A(131H同种异型)的结合水平保持与天然存在的IgG1的结合水平相同。然而，另一个报道表明这种改变使与FcγR2A 131R的结合增强数百倍，达到与FcγR2B结合水平相同的水平，这意味着与FcγR2A 131R相比，FcγR2B结合选择性未得到改善(美国专利公布号2009/0136485)。
为了使BTLA激动剂抗体有效抑制免疫应答而不引发炎性FcγR信号传导，本发明人提出对抗体进行调节以使选择性Fc与FcγR2B结合。与FcγR2B更具选择性结合的分子将促进通过BTLA表达细胞上的BTLA和通过FcγR2B表达细胞上的FcγR2B的双向抑制性信号传导，这将增强抗体的免疫抑制作用。这将是旨在用于治疗免疫过度活化疾病的治疗性抗体中所期望的。
发明内容
本发明涉及具有以下一种或多种期望性质的BTLA激动剂抗体，包括其抗体片段：包括在人类受试者中的高结合亲和力、高激动剂效力、高激动剂功效、良好药代动力学和低抗原性。在某些实施方案中，此类分子不仅具有增加的与FcγR2B的结合并因此驱动该FcγR2B的信号传导，还具有足以用于适当治疗用途的体内半衰期。因此，本发明的抗体促进通过BTLA表达细胞上的BTLA和通过FcγR2B表达细胞上的FcγR2B的双向抑制性信号传导。在某些实施方案中，与亲本多肽相比，此类分子具有减少的与一种或多种活化性Fcγ受体(诸如FcγR2A或FcγR1A)的结合。在某些实施方案中，与亲本多肽相比，此类分子具有增加的与FcγR2B/FcγR2A的结合率。在某些实施方案中，与亲本多肽相比，此类分子具有增加的与FcγR2B/FcγR1A的结合率。本发明还涉及本发明的抗体在治疗疾病诸如自身免疫和/或炎性疾病中的用途。
根据本发明第一方面，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含与缺乏取代的亲本分子相比导致与FcγR2B的结合增加的取代。
在一些实施方案中，与亲本分子相比，抗体具有增加的与FcγR2B的结合，使得[亲本多肽对FcγR2B的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值大于1，诸如大于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100。
在一些实施方案中，抗体对结合FcγR2B的选择性优于对结合FcγR2A的选择性。
在一些实施方案中，与亲本多肽相比，抗体具有增强的FcγR2B结合活性并且保持或降低对FcγR2A(R型)和/或FcγR2A(H型)的结合活性。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR2A(R型)的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10或更大。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR2A(H型)的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150或更大。
在一些实施方案中，与亲本多肽相比，抗体具有增强的FcγR2B结合活性并且保持或降低对FcγR1A的结合活性。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR1A的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值为0.05或更大，诸如至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4或更大。
在一些实施方案中，与亲本多肽相比，抗体具有降低的Fcγ1结合活性。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR1A的KD值]/[亲本多肽对FcγR1A的KD值]的值为至少10、20、50、100、200。
在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：
(i)D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO:225的位置)。
(ii)Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)；
(iii)D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO：225的位置)；
(iv)N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)；或
(v)H68(根据SEQ ID NO：225的位置)。
在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)或位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
合适地，抗体是具有一个或多个氨基酸取代的人IgG1或IgG4，该一个或多个氨基酸取代选自由以下项组成的组：hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A和hIgG4L235A。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置237(EU索引)处的天冬氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置236(EU索引)处的天冬氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置235(EU索引)处的丙氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置234(EU索引)处的丙氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置271(EU索引)处的甘氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置267(EU索引)处的谷氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置265(EU索引)处的丙氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置297(EU索引)处的丙氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置322(EU索引)处的丙氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置330(EU索引)处的精氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含位置237(EU索引)处的天冬氨酸、位置238(EU索引)处的天冬氨酸、位置271(EU索引)处的甘氨酸和位置330(EU索引)处的精氨酸。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
在具体实施方案中，抗体具有带至少一个互补决定区(CDR)的重链和/或轻链，该至少一个CDR存在于选自由以下项组成的组的抗体中：6.2、2.8.6、3E8、11.5.1、12F11、14D4、15B6、15C6、16E1、16F10、16H2、1H6、21C7、24H7、26B1、26F3、27G9、3A9、4B1、4D3、4D5、4E8、4H4、6G8、7A1、8B4、8C4和831，如表1或表2中所鉴定和本文所述。合适地，所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)或位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。
在另外的实施方案中，结合人BTLA的抗体选自由以下项组成的组：6.2、2.8.6、3E8，或者是与6.2、2.8.6或3E8中的任一者竞争结合人BTLA的抗体，其中抗体特异性结合BTLA并诱导通过受体的信号传导。所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)或位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，该重链和该轻链包含分别公开于SEQ ID NO:1、17、3、4、12和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR序列以及Fc区，该Fc区包含与缺乏取代的亲本分子相比导致与FcγR2B的结合增加的取代。合适地，所述抗体包含分别公开于SEQ ID NO:18和14的VH和VL序列。合适地，所述抗体包含重链和轻链，其中该重链包含公开于SEQ ID NO：19的氨基酸序列，并且/或者该轻链包含公开于SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置236(EU索引)处的天冬氨酸。合适地，抗体是激动性抗体。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置237(EU索引)处的天冬氨酸。合适地，抗体是激动性抗体。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。合适地，抗体是激动性抗体。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置235(EU索引)处的丙氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置234(EU索引)处的丙氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置265(EU索引)处的丙氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置267(EU索引)处的谷氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置271(EU索引)处的甘氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置297(EU索引)处的丙氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置322(EU索引)处的丙氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置330(EU索引)处的精氨酸。
在具体实施方案中，所述抗体包含Fc区，该Fc区包含位置237(EU索引)处的天冬氨酸、位置238(EU索引)处的天冬氨酸、位置271(EU索引)处的甘氨酸和位置330(EU索引)处的精氨酸。
在本发明第一方面的具体实施方案中，与缺乏Fc区取代的亲本分子相比，抗体具有增加的与FcγR2B的结合，该Fc区取代即以下项中的一者或多者：hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A和hIgG4L235A。
在本发明第一方面的具体实施方案中，与缺乏Fc区取代的亲本分子相比，抗体具有增加的与FcγR2B的结合并且具有减少的与一种或多种活化性Fcγ受体诸如FcγR2A或FcγR1A的结合。
在本发明第一方面的具体实施方案中，与缺乏Fc区取代的亲本分子相比，抗体具有增加的与FcγR2B/FcγR2A的结合率。合适地，与缺乏Fc区取代的亲本分子相比，FcγR2B/FcγR2A结合率增加到至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.8、2、2.2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9或10倍。
在本发明第一方面的具体实施方案中，与相对于野生型序列缺乏Fc区取代的亲本分子相比，抗体具有增加的与FcγR2B/FcγR1A的结合率。合适地，与缺乏Fc区取代的亲本分子相比，FcγR2B/FcγR1A结合率增加到至少1.1、1.2、1.5、2、5、10、50、100、150、200、250倍。
与缺乏Fc区取代的亲本分子相比，我们是指与除了权利要求中所述的表示相对于野生型Fc的Fc取代的氨基酸之外具有相同氨基酸序列的抗体分子相比。例如，包括任何以下取代中的任一者：hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A和hIgG4L235A。因此，可测量具有或不具有所述Fc取代的抗体分子与FcγR2B的结合，并且任选地可测量具有或不具有所述Fc取代的抗体分子与活化性Fcγ受体(诸如FcγR2A或FcγR1A)的结合。因此，例如，如果与不具有取代的亲本分子相比，对FcγR2B的结合增加到1.5倍，则与亲本相比，该抗体显示出增加到150％的结合效力。如果与不具有取代的亲本分子相比，对FcγR2A的结合减少到2/3，则与亲本相比，该抗体显示出67％的结合效力。对于该示例性抗体分子，FcγR2B/FcγR2A结合率的变化将为150/67＝2.24倍。超过1的任何值表明，与亲本分子相比，该抗体分子相对于结合FcγR2A，对结合FcγR2B具有增强的选择性。
在本发明第一方面的具体实施方案中，与相对于野生型序列缺乏Fc区取代的亲本分子相比，该抗体具有增加的[结合FcγR1A的KD值]/[结合FcγR2B的KD值]比率。合适地，变体分子的[结合FcγR1A的KD值]/[结合FcγR2B的KD值]的比率为缺乏Fc区取代的亲本分子的[结合FcγR1A的KD值]/[结合FcγR2B的KD值]的比率的至少1.1、1.2、1.5、2、5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000倍。
在本发明第一方面的具体实施方案中，与相对于野生型序列缺乏Fc区取代的亲本分子相比，抗体具有增加的[结合FcγR2A 131R的KD值]/[结合FcγR2B的KD值]比率。适当地，变体分子的[结合FcγR2A 131R的KD值]/[结合FcγR2B的KD值]的比率为缺乏Fc区取代的亲本分子的[结合FcγR1A的KD值]/[结合FcγR2B的KD值]的比率的至少1.1、1.2、1.5、2、5、10、50或100倍。
根据本发明第二方面，提供了一种分离核酸，该分离核酸包含编码本发明第一方面的分离抗体的重链多肽和/或轻链多肽的核苷酸序列。
根据本发明第三方面，提供了一种载体，该载体包含本发明第二方面的核酸。
根据本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据本发明第二方面的核酸序列或根据本发明第三方面的载体。
根据本发明第五方面，提供了产生根据本发明第一方面的抗体的方法，该方法包括在产生所述抗体的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞的步骤，以及任选地分离和/或纯化所述抗体。
根据本发明第六方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的本发明第一方面的抗体或由本发明第五方面产生的抗体。
根据本发明第七方面，提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将根据本发明第一方面的抗体或根据本发明第五方面产生的抗体配制成包含至少一种附加组分的组合物。在具体实施方案中，该至少一种附加组分是药学上可接受的赋形剂。
根据本发明第八方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明第一方面的抗体或根据本发明第六方面的药物组合物。合适地，此类试剂盒包括包含使用说明的包装说明书。
根据本发明第九方面，提供了治疗患者体内BTLA相关疾病的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本发明第一方面的抗体或本发明第六方面的药物组合物。
合适地，BTLA相关疾病是自身免疫或炎性疾病。
具体实施方式
本发明人已鉴定出特别强的针对BTLA的激动剂抗体，这些激动剂抗体被预测在抑制T细胞应答方面比现有抗体更有效，并因此在免疫介导的障碍的治疗中特别有用。与亲本多肽相比，此类抗体在选择性增强与FcγR2B的结合的分子的Fc部分中的某一位置处包含至少一个取代。合适地，抗体包含在以下位置(EU索引位置)中的一个或多个位置处的取代：234、235、236、237、238、265、267、271、297、330和322。合适地，抗体是具有一个或多个氨基酸取代的人IgG1或IgG4，该一个或多个氨基酸取代选自由以下项组成的组：hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A和hIgG4L235A，全部使用EU索引编号。
在以下位置中的一个或多个位置处的修饰：236、237、238和267(EU索引)是特别合适的。
Fc修饰的组合也是合适的。在具体实施方案中，使用称为V9的修饰组，其中抗体重链包含Fc区，该Fc区包含位置237处的天冬氨酸、位置238处的天冬氨酸、位置271处的甘氨酸和位置330处的精氨酸(编号根据EU索引)。
通过将P238D(EU索引)取代引入分子(即抗体或其抗原结合片段)的Fc部分，该分子具有增强的与FcγR2B的结合和该FcγR2B的信号传导，但其水平确保抗体保持足够的体内半衰期。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种此类分子的组合，等等。
应当理解，无论本文在何处用语言“包括”描述各方面，都提供了按照“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。
应当理解，本文所述的各种实施方案的一个、一些或所有性质可应用于任何方面，除非内容另有明确规定。此外，该各种实施方案可组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些方面和其他方面对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本发明的这些实施方案和其他实施方案通过下文的具体实施方式来进一步描述。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，“生物医学与分子生物学简明词典(The ConciseDictionary of Biomedicine and Molecular Biology)”，Juo,Pei-Show，第2版，2002年，CRC出版社(CRC Press)；“细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell andMolecular Biology)”，第3版，1999年，学术出版社(Academic Press)；以及“牛津生物化学与分子生物学词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)”，修订版，2000年，牛津大学出版社(Oxford University Press)为普通技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常见误差范围。本文提及的“约”值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
氨基酸在本文中可由其通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单个字母符号表示。同样地，核苷酸可由其普遍接受的单个字母代码表示。
每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。每条链的氨基末端部分限定了负责与抗原结合的可变区。Kabat等人(NIH出版号91/3242，第679-687页，1991年)收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守程度，他们将各个一级序列分类为CDR和框架并列出了它们的列表(参见Kabat等人，“免疫学目的序列(SEQUENCES OFIMMUNOLOGICAL INTEREST)”，第5版，NIH出版号91-3242，1991年)。
除非另有说明，否则抗体的经鉴定的CDR遵循Kabat等人(“免疫学目的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，第5版，国家卫生研究院公共卫生服务，马里兰州，贝塞斯达，1991年)所示的Kabat定义。可变结构域中氨基酸的编号是基于序列表中提供的序列的序数。
除非另有说明，否则恒定结构域中氨基酸(诸如CL、CH1、CH2和CH3)的编号遵循公开于Kabat等人(NIH出版号91/3242，第679-687页，1991年)的EU索引编号，本文称为“EU索引”。例如，EU索引用于定位本发明的抗体/其抗原结合片段的Fc区中的取代。例如，甘氨酸(G)在位置236处转变为天冬氨酸(D)(鉴定为G236D)，或脯氨酸(P)在位置238处转变为天冬氨酸(D)(鉴定为P238D)。抗体领域的技术人员将会知道，这种编号惯例由免疫球蛋白序列的特定区域中的非连续编号组成，使得能够对免疫球蛋白家族中的保守位置进行归一化参考。因此，由EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置将不一定对应于其连续序列。
术语“B和T淋巴细胞衰减子”和“BTLA”可互换使用，除非上下文另有规定，否则关于蛋白质或基因(或编码全部或部分BTLA的其他核酸)。人BTLA序列包括所有人同种型和变体形式。全长人BTLA的代表性示例以登录号：AJ717664.1公开于Genbank中。人BTLA的另一代表性多肽序列公开于SEQ ID NO：225中，该代表性多肽序列与AJ717664.1的区别仅在于两个天然变体单核苷酸多态性。尽管存在等位基因变异，但人BTLA多肽序列将通常与SEQID NO：225中的人BTLA具有至少90％的序列同一性(诸如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
全长食蟹猴(cynomolgus/cyno)BTLA的代表性示例以登录号：XP_005548224公开于Genbank中。食蟹猴BTLA的参考多肽序列公开于SEQ ID NO：226中。食蟹猴BTLA多肽序列将通常与公开于SEQ ID NO:226中的食蟹猴BTLA具有至少90％的序列同一性(诸如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
术语序列同一性是本领域熟知的。出于本发明的目的，在确定靶序列是否满足所定义的极限(例如90％同一性)时，如果使用BLAST(基本局部比对搜索工具)算法(参见Altschul等人，J Mol Biol，第215卷：第403-410页，1990年)或Smith-Waterman算法(参见Smith和Waterman，J Mol.Biol.第147卷：第195-197页，1981年)将该靶序列鉴定为满足所定义的限度，则认为该靶序列满足所定义的限度。
抗体(包括抗体的抗原结合片段)
抗体是能够通过位于免疫球蛋白分子可变结构域中的至少一个抗原识别位点与靶标(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)特异性结合的免疫球蛋白分子。具体地，如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、多特异性抗体(诸如由至少两个完整抗体产生的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、任何其他经修饰的免疫球蛋白分子以及它们的包含抗原识别位点的任何片段，只要这些抗体表现出所期望的生物活性。抗体可来自任何物种。合适地，抗体是人抗体。
如本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合并包含FcR结合位点的免疫球蛋白分子，该FcR结合位点可以是功能性的，也可以不是功能性的。该术语涵盖完整抗体(诸如IgG1、IgG4等等)及其抗原结合片段。
如本文所用，BTLA激动剂抗体是指与BTLA结合并增强其对T和/或B细胞的共抑制信号的抗体(包括完整抗体的抗原结合片段)。
抗原结合位点是指与全部或部分靶抗原结合的分子的部分。在抗体分子中，可将其称为抗体抗原结合位点，并且包含与全部或部分靶抗原特异性结合的抗体的部分。当抗原较大时，抗体可仅与该抗原的特定部分结合，该部分被称为表位。抗体抗原结合位点可由一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗体抗原结合位点包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
本发明还涵盖包含抗原结合位点的抗体片段。因此，当涉及抗体时，术语“其抗原结合片段”是指具有抗原识别位点并因此具有与抗原结合的能力的抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、双体、Fv片段和单链Fv(scFv)突变体。抗原结合免疫球蛋白(抗体)片段是本领域熟知的。此类片段不需要具有功能性Fc受体结合位点。在具体实施方案中，其抗原结合片段包含具有选自以下氨基酸中的一者或多者的取代的Fc部分：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)和位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。在具体实施方案中，其抗原结合片段包含具有G236D(EU索引)取代的Fc部分。在具体实施方案中，其抗原结合片段包含具有P238D(EU索引)取代的Fc部分。在具体实施方案中，其抗原结合片段包含具有位置237(EU索引)处的天冬氨酸、位置238(EU索引)处的天冬氨酸、位置271(EU索引)处的甘氨酸和位置330(EU索引)处的精氨酸的Fc部分。
如本文所用，术语“本发明的抗体片段分子”、“抗体片段”和“其抗原结合片段”在本文中可互换使用。抗体或其抗原结合片段可统称为抗原结合分子。
如本文所用的术语“BTLA结合分子”是指能够与BTLA结合的抗体及其结合片段两者。
存在五种主要类别(即同种型)的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些免疫球蛋白中的若干种可进一步分为亚类(亚型)，例如IgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA1和lgA2。与不同类别的免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。除非上下文限制另有规定，否则本发明的抗体可来自这些抗体类别或亚类中的一种。与不同类别的抗体对应的重链恒定结构域通常分别由对应的小写希腊字母α、δ、ε、γ和μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同的类型(称为卡帕(κ)和拉姆达(λ))中的一种。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体Y形糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间有所不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有一个可变结构域(VL)并且在其另一端具有一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。据信特定的氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成分界面。每条重链包含一个可变结构域(VH)和一个恒定区，就IgG、IgA和IgD抗体而言，该恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分开，该柔性铰链区是具有可变长度(在各种IgG亚类中为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。轻链和重链两者中的可变结构域通过为约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定结构域连接，并且重链还具有为约10个附加氨基酸的“D”区。每种类别的抗体还包含由成对的半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)可各自进一步细分为高变区(称为CDR)，散布有更保守的区域(称为框架区(FR))。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，其从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本发明的抗体可来自任何动物物种，包括鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合抗体或人源化抗体)。在一些实施方案中，抗体是单克隆的，例如单克隆抗体。在一些实施方案中，其抗体是人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。非人抗体或其抗原结合片段可通过重组方法进行人源化，以降低其在人中的免疫原性。
如本文所用的术语“单克隆抗体”(“mAb”)是指从基本上同源的抗体群体获得的抗体，例如除了可能的突变(例如可能少量存在的天然存在的突变)之外，构成该群体的单个抗体都是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体或其片段的特征，而不是离散抗体或抗原结合片段的混合物。mAb通常是高度特异性的，即针对单一抗原位点/表位，然而单克隆抗体还可指基本上同源的双特异性抗体分子群体。
mAb可通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术产生。例如，根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可通过Kohler和Milstein(Nature，第256卷，第495页，1975年)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法(诸如美国专利号4,816,567和6,331,415中描述的)制备。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等人(Nature，1991年，第352卷，第624-628页)和Marks等人(J.Mol.Biol.1991年，第222卷：第581-597页)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
术语单克隆还可归因于本发明的抗体的抗原结合片段。这仅仅意味着该分子以单一克隆形式产生或存在。
“人”抗体(HumAb)是指具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或位点特异性诱变引入或通过体内的体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并非旨在包括其中已将来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列移植到人框架序列上的抗体。
可通过向转基因动物施用免疫原/抗原来制备人抗体，该转基因动物已被修饰以产生具有响应于抗原攻击的人可变区的完整人抗体或完整抗体，但该转基因动物的内源基因座已被禁用，例如免疫的异种小鼠(参见例如关于XENOMOUSE(商标)技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还可参见例如关于经由人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体的Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第103卷：第3557-3562页，2006年。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座或者其存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.，第23卷：第1117-1125页(2005年)。还可参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述HUMABTM技术的美国专利号5,770,429；描述K-M MOUSETM技术的美国专利号7,041,870，以及描述VELOCIMOUSETM技术的美国专利申请公布号US2007/0061900。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可进一步被修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。
还可通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor，J.Immunol，第133卷：第3001页(1984年)；Brodeur等人，“单克隆抗体生产技术及应用(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications)”，第51-63页(马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，1987年)；以及Boerner等人，J.Immunol.，第147卷：第86页(1991年))。经由人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第103卷：第3557-3562页(2006年)。附加方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue，第26卷：第265-268页(2006年)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)还描述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，第20卷：第927-937页(2005年)以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology，第27卷：第185-191页(2005年)。
术语“人”抗体和“完全人”抗体可同义使用。人抗体的这种定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用，“人源化抗体”是指其中在非人抗体的CDR之外的一些、大多数或所有氨基酸被来源于人免疫球蛋白的对应氨基酸替代的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的CDR的残基被来自具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔子的CDR的残基替代。人源化抗体可包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基，但包含这些残基是为了进一步改进和优化抗体性能。在Ab的人源化形式的一个实施方案中，在CDR之外的一些、大多数或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替代，而一个或多个CDR区内的一些、大多数或所有氨基酸未发生改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们不消除抗体与特定抗原结合的能力。“人源化”抗体保留了与原始抗体类似的抗原特异性。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。对于进一步的细节，参见例如Jones等人，Nature，第321卷：第522-525页(1986年)；Riechmann等人，Nature，第332卷：第323-329页(1988年)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.第2卷：第593-596页(1992年)。还可参见例如Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy,Asthma&Immunol.，第1卷：第105-115页(1998年)；Harris，Biochem.Soc.Transactions，第23卷：第1035-1038页(1995年)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.，第5卷：第428-433页(1994年)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。合适地，Fc将包含P238D取代突变(使用“EU索引”编号)以增强结合FcγR2B的特异性。
如本文所用，Fc、Fc部分或Fc区是指除了第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体或抗体样分子的恒定区。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE、IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N末端。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及Cgamma1(Cγ1)与Cγ2之间的铰链。对于IgA和IgM，Fc可包含J链。
如本文所用，“工程化抗体”是指抗体，其可以是人源化抗体，其中特定残基已被其他残基取代以便减少不良作用或特性。此类取代可位于CD结构域内。例如，如本文所述(参见实施例21)，人源化抗体3E8的CDRH2用N57Q取代进行修饰以去除脱酰胺可能性，以及/或者用K63S取代进行修饰以降低预测的免疫原性。在这种情况下，编号是关于所提供的序列标识符的序数。
“嵌合抗体”是指其中可变区来源于一个物种且恒定区来源于另一物种的抗体，诸如其中可变区来源于小鼠抗体且恒定区来源于人抗体或反之亦然的抗体。该术语还涵盖包含来自一个物种的一个个体(例如，第一只小鼠)的V区和来自相同物种的另一个体(例如，第二只小鼠)的恒定区的抗体。术语“抗原(Ag)”是指用于对免疫活性脊椎动物进行免疫以产生识别Ag的抗体(Ab)或筛选表达文库(例如噬菌体、酵母或核糖体展示文库等)的分子实体。在本文中，Ag被更广泛地命名，并且通常旨在包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括用于产生Ab的免疫过程中或用于选择Ab的文库筛选中使用的分子的部分或模拟物。
“双特异性”或“双功能”抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein和Cuello，Nature，第305卷：第537-539页(1983年))。制备双特异性抗体的方法在本领域技术人员的能力范围内。例如，双特异性抗体可通过多种方法产生，这些方法包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai等人(1990年)，J.Biol.Exp.Immunol.第79卷：第315-321页；Kostelny等人(1992)，J Immunol.，第148卷：第1547-1553页。此外，双特异性抗体可形成为“双抗体”(Holliger等人(1993年)，PNAS USA，第90卷：第6444-6448页)，或者形成为“双特异性单链分子(Janusins)”(Traunecker等人(1991年)，EMBO J.，第10卷：第3655-3659页和Traunecker等人(1992年)，Int.J.Cancer Suppl.，第7卷：第51-52页)。全长双特异性抗体可例如通过以下方法产生：在两个单特异性二价抗体之间使用Fab臂交换(或半分子交换)，通过在每个半分子中的重链CH3界面处引入取代，以在体外的无细胞环境中或使用共表达促进具有不同特异性的两个抗体半分子的异二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体中的一个亲本单特异性抗体的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合进行释放和重新形成。Fab臂的CH3结构域可被工程化以促进异源二聚化超过同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这些Fab臂或半分子各自结合不同表位。“杵臼结构(knob-in-hole)”策略(参见例如PCT国际公布号WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简言之，形成人IgG中CH3结构域的界面的所选氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处发生突变以促进异二聚体形成。将具有小侧链(臼状结构(hole))的氨基酸引入特异性结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(杵状结构(knob))的氨基酸引入特异性结合第二抗原的抗体的重链中。共表达两种抗体后，由于具有“臼状结构”的重链与具有“杵状结构”的重链的优先相互作用而形成异二聚体。形成杵状结构和臼状结构的示例性CH3取代对是(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
双特异性抗体还可根据国际专利公布号WO2011/131746中描述的方法在体外的无细胞环境中产生：通过在两个单特异性同源二聚体抗体的CH3区中引入不对称突变，并在还原条件下从两个亲本单特异性同源二聚体抗体形成双特异性异源二聚体抗体以允许二硫键异构化。用于产生双特异性抗体的另一策略涉及使用静电相互作用通过在一个CH3表面取代带正电荷残基并且在第二CH3表面取代带负电荷残基来促进重链异源二聚化，如描述于以下文献：美国专利公布号US2010/0015133；美国专利公布号US2009/0182127；美国专利公布号US2010/028637或美国专利公布号US2011/0123532。
适当地，双特异性分子中的两个抗体半分子中的一个抗体半分子是本发明的抗BTLA抗体。合适地，双特异性抗体包含一个结合臂和第二结合臂，该一个结合臂包含如本文所公开的BTLA抗原结合区，该第二结合臂包含针对另一抗原(例如针对不同的BTLA抗原表位或完全不同的蛋白)的结合区，并且其中该分子包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)和位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。
通常，术语“表位”是指与抗体特异性结合的抗原的区域或区，即与抗体物理接触的区域或区。因此，术语“表位”是指在抗体的一个或多个抗原结合区能够被抗体识别并与该抗体结合的分子部分。通常，表位在抗体或其抗原结合部分(Ab)与其对应抗原之间的分子相互作用的上下文中被定义。表位通常由分子(诸如氨基酸或糖侧链)的表面基团组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，表位可以是蛋白质表位。蛋白质表位可以是线性表位或构象表位。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点都沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。“非线性表位”或“构象表位”包括对该表位具有特异性的抗体所结合的抗原蛋白内的非连续多肽(或氨基酸)。如本文所用，术语“抗原表位”被定义为抗体可特异性结合的抗原的一部分，如通过本领域熟知的任何方法(例如通过常规免疫测定法)所测定的。
与表位“特异性结合”的抗体是本领域熟知的术语，并且确定此类特异性结合的方法也是本领域熟知的。如果分子与特定细胞、蛋白质或物质比其与替代的细胞、蛋白质或物质更频繁地、更快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力发生反应或缔合，则称该分子表现出“特异性结合”。
可使用多种测定形式来选择特异性结合目的分子的抗体或肽。例如，固相ELISA免疫测定法、免疫沉淀法、BiacoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、KinExA、荧光激活细胞分选(FACS)、OctetTM(ForteBio，Inc.，Menlo Park，CA)和Western印迹分析是可用于鉴定与抗原发生特异性反应的抗体，或与同源配体或结合伴侣特异性结合的受体或其配体结合部分的许多测定方法之一。典型地，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍，更典型地大于背景的10倍，甚至更典型地大于背景的50倍，更典型地大于背景的100倍，还更典型地大于背景的500倍，甚至更典型地大于背景的1000倍，并且甚至更典型地大于背景的10,000倍。另外，当平衡解离常数(KD或KD，如本文可互换使用的)<7nM时，称抗体“特异性结合”抗原。
在一些实施方案中，本公开提供了嵌合抗原受体，其包含本文所公开的BTLA结合抗体的抗原结合片段、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。如本文所用的术语“嵌合抗原受体”(CAR)、“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”是指经工程化的受体，其可将任意的特异性移植到免疫效应细胞上。CAR通常具有细胞外结构域(胞外域)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域(胞内域)。术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递信息以经由限定的信号传导途径调节细胞活性而起作用，这些限定的信号传导途径是通过产生第二信使或通过响应此类信使而起到效应子的作用。
Fcγ修饰
在人体中，FcγR1A(CD64A)、FcγR2A(CD32A)、FcγR2B(CD32B)、FcγR3A(CD16A)和FcγR3B(CD16B)同种型已被报道为FcγR蛋白家族，并且还报道了这些受体的不同同种异型(Jefferis和Lund，Immunology Letters，第82卷第1-2期：第57-65页，2002年)。FcγR1A、FcγR2A和FcγR3A由于具有免疫活性功能而被称为活化性FcγR，FcγR2B由于具有免疫抑制功能而被称为抑制性FcγR(Smith和Clatworthy，Nat Rev Immunol，第10卷第5期，第328-343页，2010年)。在文献和本文中，FcγR1A还可称为FcγR1。
当通过与抗体Fc区结合而触发活化性FcγR时，这导致胞内结构域或FcR共同γ链(相互作用配偶体)中包含的基于免疫受体酪氨酸的活化性基序(ITAM)发生磷酸化，并通过启动活化信号级联来触发炎性免疫应答(Nimmerjahn和Ravetch，Nat Rev Immunol，第8卷第1期：第34-47页，2008年)。当抑制性受体FcγR2B通过与抗体Fc区结合而被触发时，这导致细胞质尾部中基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)发生磷酸化，随后募集含SH2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SHIP1)，其继而抑制其他活化信号级联的转导，并因此抑制炎性免疫应答(Ravetch和Lanier，Science，第290卷第5489期：第84-89页，2000年)。
FcγR2B是在B细胞上表达的唯一FcγR(Amigorena等人，European Journal ofImmunology，第19卷第8期：第1379-1385页，1989年)。已报道抗体Fc区与FcγR2B的相互作用抑制通过B细胞受体的信号传导，抑制B细胞增殖和抗体生产(Nimmerjahn和Ravetch，Advances in immunology，第96卷：第179-204页，2007年)。在表达活化性FcγR和抑制性FcγR两者的细胞类型(诸如巨噬细胞、DC、嗜中性粒细胞、肥大细胞和嗜碱细胞)中，FcγR参与的信号传导阈值和结果取决于活化性FcγR和抑制性FcγR活化的平衡(Nimmerjahn和Ravetch，Science，第310卷第5753期：第1510-1512页，2005年)。
FcγR2B的重要调节作用已通过对具有对自身免疫疾病增加的易感性的FcγR2B敲除小鼠的研究得到证实(Nakamura等人，Journal ofExperimental Medicine，第191卷第5期：第899–906页，2000年)。此外，人体中的FcγR2B基因中的多态性与自身免疫疾病(特别是系统性红斑狼疮)的风险相关(Floto等人，Nature Medicine，第11卷第10期，第2005年)。因此认为FcγR2B在控制免疫应答中起关键作用，并且是用于控制自身免疫和炎性疾病的有希望的靶分子。
已知IgG1和IgG4(即可商购获得的抗体药物中最常用的同种型)不仅与FcγR2B结合，还与活化性FcγR强烈结合(Bruhns等人，Blood，第113卷第16期：第3716-3725页，2009年)。通过利用与活化性FcyR相比具有增强的FcγR2B结合或改善的FcγR2B结合选择性的Fc区，可开发与IgG1或IgG4相比具有更强的免疫抑制特性的抗体药物。
已报道了具有Fc的抗体具有改善的FcγR2B结合活性(Chu等人，MolecularImmunology，第45卷第15期：第3926–3933页，2008年)。在该文献中，通过向抗体Fc区添加改变诸如S267E/L328F、G236D/S267E和S239D/S267E来改善FcγR2B结合活性。其中，引入了S267E/L328F突变的抗体与FcγR2B的结合最强，并且将与FcγR1A和FcγR2A(131H同种异型)的结合水平保持与天然存在的IgG1的结合水平相同。然而，另一个报道表明这种改变使与FcγR2A 131R的结合增强数百倍，达到与FcγR2B结合水平相同的水平，这意味着与FcγR2A 131R相比，FcγR2B结合选择性未得到改善(美国专利公布号2009/0136485)。除了其促炎作用之外，抗体与FcγR2A结合可导致血小板的活化，从而导致血栓栓塞事件，如利用治疗性抗体贝伐珠单抗(Bevacizumab)所示(Meyer等人，Journal of Thrombosis andHaemostasis，第7卷第1期：第171-181页，2009年；Scapmacalcci等人，Journal of theNational Cancer Institute，第99卷第16期：第1232-1239页，2007年)，以及如利用靶向CD40配体的抗体所示(Boumpas等人，Arthritis and rheumatism，第48卷第3期：第719-727页，2003年；Robles-Carrillo等人，Journal of immunology(Baltimore,Md.:1950)，第185卷第3期：第1577-1583页，2010年)。此外，已报道了具有增强的FcγR2A结合的抗体增强了巨噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(Richards等人，Molecular CancerTherapeutics，第7卷第8期：第2517-2527页，2008年)。当抗体的抗原被巨噬细胞吞噬时，抗体本身也会同时被吞噬。在这种情况下，来源于这些抗体的肽片段还被呈现为抗原，并且抗原性可能变得更高，从而增加产生针对抗体的抗体(抗药物抗体)的风险。更具体地，增强FcγR2A结合将增加产生针对抗体的抗体的风险，并且这将显著降低它们作为药物的价值。因此，与FcγR2B选择性结合并减少与FcγR2A结合的抗体可能是更有效的免疫抑制剂并且还是耐受性更好的治疗剂，该抗体具有较低的诱导血栓栓塞事件的风险和较低的免疫原性。
因此，为了使BTLA激动剂抗体有效抑制免疫应答而不引发炎性FcR信号传导，本发明人提出对抗体进行调节以使选择性Fc与FcγR2B结合。
与FcγR2B更具选择性结合的分子将促进通过BTLA表达细胞上的BTLA和通过FcγR2B表达细胞上的FcγR2B的双向抑制性信号传导，这将增强抗体的免疫抑制作用。这将是旨在用于治疗免疫过度活化疾病的治疗性抗体中所期望的。
然而，对FcγR2B的极高亲和力可能会由于受体在肝窦上皮细胞中的代谢周转而对抗体半衰期产生不利影响(Ganesan等人，The Journal of Immunology，第189卷第10期：第4981-4988页，2012年)，如FcγR2B增强的IgG1抗体XmAb7195所示，该抗体以7.74nM的KD与FcγR2B结合(Chu等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology，第129卷第4期：第1102-1115页，2012年；https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0091674911018343(2020年5月13日)，并且据Xencor报道，与野生型IgG1的平均半衰期为约21天相比(Morell，Terry和Waldmann.，Journal of Clinical Investigation，第49卷第4期：第673-680页，1970年；http://www.jci.org/articles/view/106279(2020年5月16日))，在1a期试验中，该抗体的平均体内半衰期为3.9天(美国胸腔学会(ATS)，2016年加利福尼亚州旧金山国际会议-A6476：展板编号407)。因此，在本发明的上下文中，虽然对FcγR2B的选择性以及与支持激动剂的充分结合对于BTLA激动剂抗体来说可能是期望的，但FcγR2B的过高亲和力在治疗中可能是不期望的，因为由此缩短的半衰期将可能需要更频繁的给药。
可将各种突变(包括氨基酸取代)掺入抗体的重链恒定区中，以便修饰通过一种或多种Fcγ受体的信号传导。WO2006/019447(Xencor)公开了通过Fc区中的氨基酸取代而具有改变的效应子功能的各种Fc变体分子(例如抗体)。
本发明人已发现，将P238D取代突变掺入本发明的BTLA激动剂中增强了对与FcγR2B结合的选择性和通过该FcγR2B的信号传导，而不会显著减少该抗体的体内半衰期。
虽然Fc部分可容纳其他修饰(诸如氨基酸取代)，但在具体实施方案中，P238D修饰是被引入本发明的BTLA结合分子中并且相对于野生型Ig Fc序列的唯一修饰。
在一个实施方案中，抗体包含与IgG1的位置238对应的位置处的天冬氨酸(使用EU索引)。合适地，本发明的抗体包含公开于SEQ ID NO：227的hIgG1恒定区，或者具有多达5个氨基酸修饰的恒定区，条件是存在P238D取代。
在一个实施方案中，抗体包含与IgG4的位置238对应的位置处的天冬氨酸(使用EU索引)。合适地，本发明的抗体包含公开于SEQ ID NO:235的hIgG4恒定区，或者具有多达5个氨基酸修饰的恒定区，条件是存在P238D取代。
本发明的抗体促进通过BTLA表达细胞上的BTLA和通过FcγR2B表达细胞上的FcγR2B的双向抑制性信号传导，并且具有足以用于适当治疗用途的体内半衰期。合适地，人体的体内半衰期为至少5天，诸如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24天或更多天。在具体实施方案中，人的体内半衰期为至少10天，这将允许合适的给药方案，例如每周3次。合适地，体内半衰期为约10至30天，诸如约12至20天或14至25天。
在本发明的具体实施方案中，本发明的抗体表现出的体内半衰期在包含野生型Fc区的可比较对照抗体的半衰期的±3天内。可比较对照抗体是除了增加与FcγR2B结合的Fc修饰之外具有相同重链和轻链的对照抗体，如本文所述。
在本发明的具体实施方案中，本发明的抗体表现出的体内半衰期保留了包含野生型Fc区的可比较对照抗体的半衰期的至少50％，诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。可比较对照抗体是除了增加与FcγR2B结合的Fc修饰之外具有相同重链和轻链的对照抗体，如本文所述。
当增加与FcγR2B结合的Fc修饰是P238D取代时，在具体实施方案中，本发明的抗体表现出的体内半衰期在可比较对照抗体的半衰期的±3天内，该可比较对照抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
在另一具体实施方案中，当增加与FcγR2B结合的Fc修饰是P238D取代时，本发明的抗体表现出的体内半衰期保留了亲本抗体的半衰期的至少50％，诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，该亲本抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
半衰期越长，则实现良好受体占据的时间段就越长。这意味着剂量之间的间隔越长，或者在更长的剂量间隔的替代方案中，更长的半衰期将允许给予更低的剂量—如果在较高峰值剂量下存在剂量限制性毒性，则这可能是重要的。
产生具有长半衰期的抗体还可具有一定益处，诸如降低商品成本、减少患者的治疗负担以及增加患者依从性。
合适地，本发明的分子能够在10mg/kg的单剂量后使受体占据＞80％持续至少10天，诸如14、21、28、35、42或更多天。
适当地，本发明的分子能够以3周、理想地4周或更多周(诸如6周或8周)的剂量间隔施用。
根据本发明第一方面，提供了一种抗体，该抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含与缺乏取代的亲本分子相比导致与FcγR2B的结合增加的取代。合适地，抗体是分离抗体。
在一些实施方案中，与亲本分子相比，抗体具有增加的与FcγR2B的结合，使得[亲本多肽对FcγR2B的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值大于1，诸如大于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100。
在一些实施方案中，抗体对结合FcγR2B的选择性优于对结合FcγR2A的选择性。
在一些实施方案中，与亲本多肽相比，抗体具有增强的FcγR2B结合活性并且保持或降低对FcγR2A(R型)和/或FcγR2A(H型)的结合活性。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR2A(R型)的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10或更大。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR2A(H型)的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150或更大。
在一些实施方案中，与亲本多肽相比，抗体具有增强的FcγR2B结合活性并且保持或降低对FcγR1A的结合活性。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR1A的KD值]/[变体多肽对FcγR2B的KD值]的值为0.05或更大，诸如至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4或更大。
在一些实施方案中，与亲本多肽相比，抗体具有降低的Fcγ1结合活性。在一些实施方案中，[变体多肽对FcγR1A的KD值]/[亲本多肽对FcγR1A的KD值]的值为至少10、20、50、100、200。
在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)。
在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)和位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。合适地，与人BTLA特异性结合的抗体是激动性抗体/抗原结合片段。
合适地，抗体是具有一个或多个氨基酸取代的人IgG1或IgG4，该一个或多个氨基酸取代选自由以下项组成的组：hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A和hIgG4L235A。在具体实施方案中，与人BTLA结合的抗体具有带至少一个CDR的重链和/或轻链，该至少一个CDR来自选自以下项的抗体：6.2、2.8.6、3E8、11.5.1、12F11、14D4、15B6、15C6、16E1、16F10、16H2、1H6、21C7、24H7、26B1、26F3、27G9、3A9、4B1、4D3、4D5、4E8、4H4、6G8、7A1、8B4、8C4和831，如表1或表2所公开和本文所述。在一个实施方案中，抗体与其天然配体HVEM竞争结合BTLA。在另一个实施方案中，抗体不干扰HVEM的结合。
在具体实施方案中，结合人BTLA的分离抗体选自由以下项组成的组：6.2、2.8.6、3E8，或者是与6.2、2.8.6或3E8中的任一者竞争结合人BTLA的抗体，其中抗体特异性结合BTLA并诱导通过受体的信号传导。所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
如表1所公开和本文所述，选自由以下项组成的组：6.2、2.8.6、3E8、11.5.1、12F11、14D4、15B6、15C6、16E1、16F10、16H2、1H6、21C7、24H7、26B1、26F3、27G9、3A9、4B1、4D3、4D5、4E8、4H4、6G8、7A1、8B4、8C4和831的抗体意指包含来自表1或2所公开的任何抗体(无论是鼠源的、人源化的，还是人源化/工程化的)中的一者或多者(诸如VH CDR 1、2和3，或VL CDR 1、2和3，或VH CDR 1、2和3以及VL CDR 1、2和3)的任何抗体或其抗原结合片段。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VH CDR，该至少一个VH CDR具有如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，诸如0、1、2或3个氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰包括但不限于氨基酸取代、添加、缺失或化学修饰，与未经修饰的氨基酸序列相比，经修饰的氨基酸序列的抗体结合亲和力或T细胞抑制作用不会消除。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO：2、11或17所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VL CDR，该至少一个VL CDR具有如SEQ ID NO：4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：5或12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO：2、11或17所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:5或12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；并且其中所述重链包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VH CDR，该至少一个VH CDR具有如SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21或SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VL CDR，该至少一个VL CDR具有如SEQ ID NO:23、SEQ IDNO：24或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VH CDR，该至少一个VH CDR具有如SEQ ID NO:30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO：31，40或48所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VL CDR，该至少一个VL CDR具有如SEQ ID NO:33、SEQ IDNO：34或SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:31，40或48所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在这些方面的每个方面中，抗体具有包含至少一个氨基酸取代的Fc区，与缺乏取代的亲本分子相比，该至少一个氨基酸取代导致增加的与FcγR2B的结合。在一些实施方案中，与缺乏取代的亲本分子相比，抗体对结合FcγR2B的选择性优于对结合FcγR2A的选择性。在一些实施方案中，与缺乏取代的亲本分子相比，抗体对结合FcγR2B的选择性优于对结合FcγR1A的选择性。
在具体实施方案中，抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
在具体实施方案中，抗体包含Fc区，该Fc区包含位置237(EU索引)处的天冬氨酸、位置238(EU索引)处的天冬氨酸、位置271(EU索引)处的甘氨酸和位置330(EU索引)处的精氨酸。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中：该重链包含Fc区和重链可变区，该重链可变区包含三个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3；其中(1)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者(2)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者(3)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：30、SEQ IDNO:31和SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且其中Fc区部分包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
典型的抗体包含2条重链和2条轻链，其中成对的重链包含Fc区，因此如本文所用，“包含Fc区的重链”是指H链多肽上与另一H链Fc区一起形成功能性Fc区的区域。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VH CDR，该至少一个VH CDR具有如以下所示的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45、46或47，具有0至3个氨基酸修饰；(2)SEQ ID NO:53、54或55，具有0至3个氨基酸修饰；(3)SEQ ID NO:61、62或63，具有0至3个氨基酸修饰；(4)SEQ ID NO:61、69或70，具有0至3个氨基酸修饰；(5)SEQ ID NO:76、77或78，具有0至3个氨基酸修饰；(6)SEQ ID NO:45、46或84，具有0至3个氨基酸修饰；(7)SEQ ID NO：88、89或90，具有0至3个氨基酸修饰；(8)SEQ ID NO:95、96或97，具有0至3个氨基酸修饰；(9)SEQ ID NO:103、104或105，具有0至3个氨基酸修饰；(10)SEQ ID NO:76、111或112，具有0至3个氨基酸修饰；(11)SEQ ID NO:118、119或120，具有0至3个氨基酸修饰；(12)SEQ ID NO:126、127或128，具有0至3个氨基酸修饰；(13)SEQ ID NO：133、134或135，具有0至3个氨基酸修饰；(14)SEQ IDNO：103、134或139，具有0至3个氨基酸修饰；(15)SEQ ID NO:143、144或145，具有0至3个氨基酸修饰；(16)SEQ ID NO:151、152或153，具有0至3个氨基酸修饰；(17)SEQ ID NO：159、160或161，具有0至3个氨基酸修饰；(18)SEQ ID NO：167、168或169，具有0至3个氨基酸修饰；(19)SEQ ID NO:45、46或177，具有0至3个氨基酸修饰；(20)SEQ ID NO:181、182或183，具有0至3个氨基酸修饰；(21)SEQ ID NO:45、191或192，具有0至3个氨基酸修饰；(22)SEQID NO:196、197或198，具有0至3个氨基酸修饰；(23)SEQ ID NO：204、205或206，具有0至3个氨基酸修饰；(24)SEQ ID NO:212、213或214，具有0至3个氨基酸修饰；(25)SEQ ID NO:1、2或3，具有0至3个氨基酸修饰；(26)SEQ ID NO:20、163或22，具有0至3个氨基酸修饰；(27)SEQ ID NO:30、48或32，具有0至3个氨基酸修饰；(28)SEQ ID NO:1、11或3，具有0至3个氨基酸修饰；(29)SEQ ID NO：1、17或3，具有0至3个氨基酸修饰；(30)SEQ ID NO：20、21或22，具有0至3个氨基酸修饰；(33)SEQ ID NO：30、31或32，具有0至3个氨基酸修饰；或(34)SEQ IDNO:30、40或32，具有0至3个氨基酸修饰。所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3具有以下氨基酸序列：(1)分别为SEQID NO:45、46和47；(2)分别为SEQ ID NO:53、54和55；(3)分别为SEQ ID NO：61、62和63；(4)分别为SEQ ID NO:61、69和70；(5)分别为SEQ ID NO：76、77和78；(6)分别为SEQ ID NO:45、46和84；(7)分别为SEQ ID NO：88、89和90；(8)分别为SEQ ID NO:95、96和97；(9)分别为SEQID NO:103、104和105；(10)分别为SEQ ID NO:76、111和112；(11)分别为SEQ ID NO:118、119和120；(12)分别为SEQ ID NO:126、127和128；(13)分别为SEQ ID NO:133、134和135；(14)分别为SEQ ID NO:103、134和139；(15)分别为SEQ ID NO:143、144和145；(16)分别为SEQ ID NO:151、152和153；(17)分别为SEQ ID NO:159、160和161；(18)分别为SEQ ID NO:167、168和169；(19)分别为SEQ ID NO:45、46和177；(20)分别为SEQ ID NO:181、182和183；(21)分别为SEQ ID NO:45、191和192；(22)分别为SEQ ID NO：196、197和198；(23)分别为SEQ ID NO:204、205和206；(24)分别为SEQ ID NO：212、213和214；(25)分别为SEQ ID NO：1、2和3；(26)分别为SEQ ID NO：20、163和22；(27)分别为SEQ ID NO：30、48和32；(28)分别为SEQ ID NO:1、11和3；(29)分别为SEQ ID NO:1、17和3；(30)分别为SEQ ID NO:20、21和22；(33)分别为SEQ ID NO:30、31和32；或(34)分别为SEQ ID NO:30、40和32；其中0至3个氨基酸修饰可存在于任何CDR/SEQ ID NO:中。所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含至少一个VL CDR，该至少一个VL CDR具有如以下所示的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:33、34或35；(2)SEQ ID NO:56、57或58；(3)SEQ ID NO:64、65或66；(4)SEQ ID NO:71、72或73；(5)SEQ ID NO:79、80或81；(6)SEQ ID NO:33、34或85；(7)SEQ IDNO:91、65或92；(8)SEQ ID NO:98、99或100；(9)SEQ ID NO:106、107或108；(10)SEQ ID NO:113、114或115；(11)SEQ ID NO:121、122或123；(12)SEQ ID NO：79、129或130；(13)SEQ IDNO:106、107或136；(14)SEQ ID NO:146、147或148；(15)SEQ ID NO：154、155或156；(16)SEQID NO：4、12或164；(17)SEQ ID NO:170、171或172；(18)SEQ ID NO:154、155或178；(19)SEQID NO:184、185或186；(20)SEQ ID NO:79、80或189；(21)SEQ ID NO：154、155或193；(22)SEQ ID NO：199、200或201；(23)SEQ ID NO:207、208或209；(24)SEQ ID NO:215、34或216；(25)SEQ ID NO:4、5或6；(26)SEQ ID NO:23、176或25；(27)SEQ ID NO：33、34或35；(28)SEQID NO:4、12或6；(29)SEQ ID NO：23、24或25；或(30)SEQ ID NO：33、34或35；其中0至3个氨基酸修饰可存在于任何CDR/SEQ ID NO：中，并且其中所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3具有以下氨基酸序列：(1)分别为SEQ ID NO:33、34和35；(2)分别为SEQ ID NO:56、57和58；(3)分别为SEQ ID NO：64、65和66；(4)分别为SEQ ID NO:71、72和73；(5)分别为SEQ ID NO:79、80和81；(6)分别为SEQ IDNO:33、34和85；(7)分别为SEQ ID NO：91、65和92；(8)分别为SEQ ID NO:98、99和100；(9)分别为SEQ ID NO：106、107和108；(10)分别为SEQ ID NO:113、114和115；(11)分别为SEQ IDNO：121、122和123；(12)分别为SEQ ID NO：79、129和130；(13)分别为SEQ ID NO：106、107和136；(14)分别为SEQ ID NO：146、147和148；(15)分别为SEQ ID NO：154、155和156；(16)分别为SEQ ID NO：4、12和164；(17)分别为SEQ ID NO：170、171和172；(18)分别为SEQ ID NO：154、155和178；(19)分别为SEQ ID NO：184、185和186；(20)分别为SEQ ID NO：79、80和189；(21)分别为SEQ ID NO：154、155和193；(22)分别为SEQ ID NO：199、200和201；(23)分别为SEQ ID NO:207、208和209；(24)分别为SEQ ID NO:215、34和216；(25)分别为SEQ ID NO:4、5和6；(26)分别为SEQ ID NO:23、176和25；(27)分别为SEQ ID NO:33、34和35；(28)分别为SEQ ID NO：4、5和6；(29)分别为SEQ ID NO:4、12和6；(30)分别为SEQ ID NO:23、24和25；或(31)分别为SEQ ID NO:33、34和35；其中0至3个氨基酸修饰可存在于任何CDR/SEQ ID NO:中，并且其中所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中(1)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和47所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：33、34和35所示的氨基酸序列；(2)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：53、54和55所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:56、57和58所示的氨基酸序列；(3)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:61、62和63所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:64、65和66所示的氨基酸序列；(4)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:61、69和70所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQID NO:71、72和73所示的氨基酸序列；(5)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:76、77和78所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:79、80和81所示的氨基酸序列；(6)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和84所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和85所示的氨基酸序列；(7)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:88、89和90所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:91、65和92所示的氨基酸序列；(8)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：95、96和97所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:98、99和100所示的氨基酸序列；(9)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQID NO:103、104和105所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：106、107和108所示的氨基酸序列；(10)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：76、111和112所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：113、114和115所示的氨基酸序列；(11)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:118、119和120所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：121、122和123所示的氨基酸序列；(12)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:126、127和128所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：79、129和130所示的氨基酸序列；(13)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：133、134和135所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:106、107和136所示的氨基酸序列；(14)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：103、134和139所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:106、107和136所示的氨基酸序列；(15)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：143、144和145所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：146、147和148所示的氨基酸序列；(16)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ IDNO：151、152和153所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：154、155和156所示的氨基酸序列；(17)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：159、160和161所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、12和164所示的氨基酸序列；(18)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:167、168和169所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:170、171和172所示的氨基酸序列；(19)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:170、171和172所示的氨基酸序列；(20)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和177所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:154、155和178所示的氨基酸序列；(21)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:181、182和183所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:184、185和186所示的氨基酸序列；(22)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:76、77和78所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：79、80和189所示的氨基酸序列；(23)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQID NO：45、191和192所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:154、155和193所示的氨基酸序列；(24)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:196、197和198所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:199、200和201所示的氨基酸序列；(25)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：204、205和206所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：207、208和209所示的氨基酸序列；(26)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：212、213和214所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:215、34和216所示的氨基酸序列；(27)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列；(28)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:20、163和22所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ IDNO:23、176和25所示的氨基酸序列；(29)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、48和32所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：33、34和35所示的氨基酸序列；(30)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、11和3所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、12和6所示的氨基酸序列；(31)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、11和3所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：4、5和6所示的氨基酸序列；(32)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、17和3所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ IDNO:4、12和6所示的氨基酸序列；(33)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：20、21和22所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:23、24和25所示的氨基酸序列；(34)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、31和32所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和35所示的氨基酸序列；或(35)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO：30、40和32所示的氨基酸序列，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：33、34和35所示的氨基酸序列；其中0至3个氨基酸修饰可存在于任何CDR/SEQ ID NO：中，并且其中所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含：(1)至少一个具有如SEQ ID NO：45、46或47所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：33、34或35所示氨基酸序列的VL CDR；(2)至少一个具有如SEQ ID NO：53、54或55所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:56、57和58所示氨基酸序列的VL CDR；(3)至少一个具有如SEQ ID NO:61、62或63所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:64、65或66所示氨基酸序列的VL CDR；(4)至少一个具有如SEQ ID NO：61、69或70所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQID NO:71、72和73所示氨基酸序列的VL CDR；(5)至少一个具有如SEQ ID NO:76、77或78所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：79、80或81所示氨基酸序列的VLCDR；(6)至少一个具有如SEQ ID NO:45、46或84所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：33、34或85所示氨基酸序列的VL CDR；(7)至少一个具有如SEQ ID NO：88、89或90所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：91、65或92所示氨基酸序列的VL CDR；(8)至少一个具有如SEQ ID NO：95、96或97所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:98、99或100所示氨基酸序列的VL CDR；(9)至少一个具有如SEQ IDNO：103、104或105所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:106、107或108所示氨基酸序列的VL CDR；(10)至少一个具有如SEQ ID NO:76、111或112所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:113、114或115所示氨基酸序列的VL CDR；(11)至少一个具有如SEQ ID NO：118、119或120所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQID NO:121、122或123所示氨基酸序列的VL CDR；(12)至少一个具有如SEQ ID NO：126、127或128所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：79、129或130所示氨基酸序列的VL CDR；(13)至少一个具有如SEQ ID NO:133、134或135所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:106、107或136所示氨基酸序列的VL CDR；(14)至少一个具有如SEQ ID NO:103、134或139所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：106、107或136所示氨基酸序列的VL CDR；(15)至少一个具有如SEQ ID NO:143、144或145所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:146、147或148所示氨基酸序列的VLCDR；(16)至少一个具有如SEQ ID NO:151、152或153所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：154、155或156所示氨基酸序列的VL CDR；(17)至少一个具有如SEQ IDNO:159、160或161所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：4、12或164所示氨基酸序列的VL CDR；(18)至少一个具有如SEQ ID NO:167、168或169所示氨基酸序列的VHCDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:170、171或172所示氨基酸序列的VL CDR；(19)至少一个具有如SEQ ID NO:45、46或47所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:170、171或172所示氨基酸序列的VL CDR；(20)至少一个具有如SEQ ID NO：45、46或177所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:154、155或178所示氨基酸序列的VLCDR；(21)至少一个具有如SEQ ID NO:181、182或183所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：184、185或186所示氨基酸序列的VL CDR；(22)至少一个具有如SEQ IDNO：76、77或78所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：79、80或189所示氨基酸序列的VL CDR；(23)至少一个具有如SEQ ID NO：45、191或192所示氨基酸序列的VHCDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：154、155或193所示氨基酸序列的VL CDR；(24)至少一个具有如SEQ ID NO：196、197或198所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:199、200或201所示氨基酸序列的VL CDR；(25)至少一个具有如SEQ ID NO：204、205或206所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:207、208或209所示氨基酸序列的VLCDR；(26)至少一个具有如SEQ ID NO:212、213或214所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：215、34或216所示氨基酸序列的VL CDR；(27)至少一个具有如SEQ IDNO：1、2或3所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:4、5或6所示氨基酸序列的VL CDR；(28)至少一个具有如SEQ ID NO:20、163或22所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:23、176或25所示氨基酸序列的VL CDR；(29)至少一个具有如SEQID NO:30、48或32所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：33、34或35所示氨基酸序列的VL CDR；(30)至少一个具有如SEQ ID NO:1、11或3所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:4、12或6所示氨基酸序列的VL CDR；(31)至少一个具有如SEQID NO:1、11或3所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:4、5或6所示氨基酸序列的VL CDR；(32)至少一个具有如SEQ ID NO:1、17或3所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：4、12或6所示氨基酸序列的VL CDR；(33)至少一个具有如SEQ IDNO:20、21或22所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：23、24或25所示氨基酸序列的VL CDR；(34)至少一个具有如SEQ ID NO：30、31或32所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO：33、34或35所示氨基酸序列的VL CDR；或(35)至少一个具有如SEQ ID NO:30、40或32所示氨基酸序列的VH CDR，和至少一个具有如SEQ ID NO:33、34或35所示氨基酸序列的VL CDR；其中0至3个氨基酸修饰可存在于任何CDR/SEQ ID NO:中，并且其中所述抗体还包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO：7、13或18所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，该重链可变区包含如SEQ ID NO：7、13或18所示的氨基酸序列，其中具有多达10个修饰，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:8或14所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:8或14所示的氨基酸序列，其中具有多达10个修饰，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
在这些实施方案的每个实施方案中，抗体具有包含至少一个氨基酸取代的Fc区，与缺乏取代的亲本分子相比，该至少一个氨基酸取代导致增加的与FcγR2B的结合。在一些实施方案中，与缺乏取代的亲本分子相比，抗体对结合FcγR2B的选择性优于对结合FcγR2A的选择性。
在具体实施方案中，抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:7、13或18所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO：8或14所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO：8所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO:14所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO:8所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO:14所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：9、15或19所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：9、15或19所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含如SEQ ID NO：10、16或29所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含如SEQ ID NO：10、16或29所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，该重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，其中具有多达10个修饰，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，其中具有多达10个修饰，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO：26所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO：27所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO：27所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:36或41所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，该重链可变区包含如SEQ ID NO:36或41所示的氨基酸序列，其中具有多达10个修饰，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQ ID NO：37或43所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，该轻链可变区包含如SEQ ID NO：37或43所示的氨基酸序列，其中具有多达10个修饰，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:36或41所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:37或43所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO:37所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO:37所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，并且该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQID NO：43所示的氨基酸序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:38或42所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:38或42所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含如SEQ ID NO：39或44所示的氨基酸序列或与这些氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该轻链包含如SEQ ID NO:39或44所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且该轻链包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了一种分离抗体，该分离抗体特异性结合人BTLA，该分离抗体包含重链和轻链，其中该重链包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列，并且其中该轻链包含如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列或其中具有多达10个修饰(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)的序列。
在其他实施方案中，重链可变区多肽与公开于SEQ ID NO：18的序列具有至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在其他实施方案中，重链可变区多肽与公开于SEQ ID NO：26的序列具有至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在其他实施方案中，重链可变区多肽与公开于SEQ ID NO:36的序列具有至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在其他实施方案中，轻链可变区多肽与公开于SEQ ID NO：14的序列具有至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在其他实施方案中，轻链可变区多肽与公开于SEQ ID NO:27的序列具有至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在其他实施方案中，轻链可变区多肽与公开于SEQ ID NO:43的序列具有至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
根据本发明第一方面的另一变化形式，提供了具有一级VH结构域和/或一级VL结构域的分离抗体，该一级VH结构域和/或一级VL结构域具有如表1或表2所示的任何抗体克隆的至少一个CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些实施方案中，本文提供了选自如表1或表2所示的抗体克隆的分离抗体。
表1：示例性BTLA激动性抗体
Figure BDA0004113379020000501
Figure BDA0004113379020000511
表2：人源化和工程化抗体
Figure BDA0004113379020000512
在本发明第一方面的每个方面中，抗体具有包含至少一个氨基酸取代的Fc区，与缺乏取代的亲本分子相比，该至少一个氨基酸取导致增加的与FcγR2B的结合，以及/或者与缺乏取代的亲本分子相比，该至少一个氨基酸取导致相对于结合FcγR2A，对结合FcγR2B的选择性增加。在一些实施方案中，与缺乏取代的亲本分子相比，抗体相对于结合FcγR1A，对结合FcγR2B具有增强的选择性。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面(其包括第一方面的任何变体)的每种抗体包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)和位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置238(EU索引)处的天冬氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置237(EU索引)处的天冬氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置236(EU索引)处的天冬氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置235(EU索引)处的丙氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置234(EU索引)处的丙氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置265(EU索引)处的丙氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置267(EU索引)处的谷氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置271(EU索引)处的甘氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置297(EU索引)处的丙氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置322(EU索引)处的丙氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含具有位置330(EU索引)处的精氨酸的Fc。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的每种抗体包含Fc，该Fc包含位置237(EU索引)处的天冬氨酸、位置238(EU索引)处的天冬氨酸、位置271(EU索引)处的甘氨酸和位置330(EU索引)处的精氨酸。
在具体实施方案中，根据本发明第一方面的抗体包含具有取代的Fc同种型，该取代选自由以下项组成的组：hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A和hIgG4L235A。
在具体实施方案中，重链或轻链还包含恒定区。如果分子是全长IgG型抗体分子，则重链可包含三个恒定结构域。在某些实施方案中，特异性结合人BTLA的分离抗体表现出至多约10×10-9M的结合人BTLA的KD。在某些实施方案中，特异性结合人BTLA的分离抗体表现出至多约4×10-9M的结合人BTLA的KD。在某些实施方案中，特异性结合人BTLA的分离抗体表现出至多约1×10-9M的结合人BTLA的KD。
在某些实施方案中，本发明的分离抗体(例如人源化)在37℃下结合人BTLA，其中KD为不超过约10nM(1×10-8M)；合适地不超过约1nM；更合适的是其中抗体在37℃下具有不超过约500pM(5×10-10M)、200pM、100pM、50pM、20pM、10pM、5pM或甚至2pM的KD值的实施方案。如该上下文所用的术语“约”是指+/-10％。
在某些实施方案中，本发明的分离抗体(例如人源化的)在37℃下以至少1.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人BTLA。在某些实施方案中，本发明的分离抗体(例如人源化的)在37℃下以至少2.0×105(1/Ms)、3.0×105(1/Ms)、4.0×105(1/Ms)、5.0×105(1/Ms)、6.0×105(1/Ms)或7.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人BTLA。
在某些实施方案中，本发明的分离抗体(例如人源化的)在37℃下以不超过或小于1.0×10-3(1/s)的解离速率结合人BTLA。在某些实施方案中，本发明的分离抗体(例如人源化的)在37℃下以不超过或小于3.0×10-4(1/s)的解离速率结合人BTLA。在某些实施方案中，本发明的分离抗体(例如人源化的)在37℃下以不超过或小于2.0×10-4(1/s)或1.0×10-4(1/s)的解离速率结合人BTLA。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，这些分离激动性抗体以小于10nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，并且其中所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的；不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如例如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于3.0×10-4(1/s)的解离速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以3.0×10-4(1/s)至1.0×10-3(1/s)的解离速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的(此处的编号，例如D52，是指SEQ ID NO:225中的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO：225的位置)。
表征本发明抗体性质的方法是本领域熟知的。在37℃下使用表面等离子体共振(SPR)确定结合特异性的合适方法描述于实施例2中。用于确定所测试的抗体/其片段是否抑制BTLA与疱疹病毒侵入介质(HVEM)的结合的合适方法描述于实施例4中；这也使用了表面等离子体共振(SPR)。用于确定所测试的抗体/其片段是否在体外抑制T细胞增殖的合适方法是诸如实施例9中描述的混合淋巴细胞反应测试。用于确定抗体/其片段与BTLA的结合位点的合适方法可利用突变受体的x射线晶体学或流式细胞术，诸如通过实施例5中描述的方法。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，这些分离激动性抗体以至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如例如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且其中所述抗体在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于3.0×10-4(1/s)的解离速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于10nM的KD结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO：225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，该分离激动性抗体以3.0×10-4(1/s)至1.0×10-3(1/s)的解离速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如例如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且其中所述抗体在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于10nM的KD结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO：225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ IDNO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，这些分离激动性抗体以小于1.0×10-3(1/s)的解离速率以及至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如各自在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测量的，其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如例如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且其中所述抗体在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于10nM的KD结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQID NO:225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，该分离激动性抗体以小于2nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，其中所述抗体抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于1.0×106(1/Ms)的缔合速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于1.0×10-3(1/s)的解离速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于10nM的KD结合食蟹猴B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO:225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合BTLA的残基H68(根据SEQID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，该分离激动性抗体以小于1×10-3(1/s)的缔合解离速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，其中所述抗体抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于10nM的KD结合食蟹猴B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于2nM的KD结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO:225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)的分离激动性抗体，其中所述抗体以至少5nM的KD与食蟹猴BTLA结合，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，并且其中所述抗体抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测定使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO：225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO：225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)的分离激动性抗体，其中所述抗体以至少50nM的KD与食蟹猴BTLA结合，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，并且其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO：225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，该分离激动性抗体以1400nM至3500nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，并且其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以至少2.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于10.0×10-1(1/s)的解离速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO:225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO：225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，该分离激动性抗体以1.7×105(1/Ms)至2.5×105(1/Ms)的缔合速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，并且其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于3.0×10-1(1/s)的解离速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以3.0×10-1(1/s)至5.0×10-1(1/s)的解离速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以至少150nM的KD结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以150nM至1500nM的KD结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体与阻断286抗体结合的表位结合。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO：225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO：225的位置)。
在本发明第一方面的具体实施方案中，本文提供了分离激动性抗体，该分离激动性抗体以40nM至1200nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的，并且其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例4中描述的方法所测定的；并且在体外抑制T细胞增殖，如例如通过混合淋巴细胞反应测试使用诸如实施例9中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以至少1.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以1.0×105(1/Ms)至10×105(1/Ms)的缔合速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以小于6.0×10-1(1/s)的解离速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，所述抗体以6.0×10-1(1/s)至10.0×10-2(1/s)的解离速率结合人BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如实施例2中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO：225的位置)，如通过突变受体的X射线晶体学或通过流式细胞术使用诸如实施例5中描述的方法所测定的。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合人BTLA的残基H68(根据SEQ ID NO:225的位置)。在一些实施方案中，抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64(根据SEQ ID NO:225的位置)。
在某些实施方案中，特异性结合人BTLA的本发明的分离抗体增强了BTLA活性和/或通过受体的信号传导。
如上所述，当关于本发明第一方面使用时，术语抗体涵盖完整抗体以及其抗原结合片段。
具体的Fc受体结合实施方案
在本发明的某些实施方案中，特别是当根据本发明第一方面时，重链包含Fc区，该Fc区包含取代，该取代赋予抗体分子增加的与FcγR2B的结合并因此增强该FcγR2B的信号传导。在某些实施方案中，与亲本多肽相比，此类分子具有减少的与一种或多种活化性Fcγ受体(诸如FcγR2A或FcγR1A)的结合。在某些实施方案中，与亲本多肽相比，此类分子具有增加的与FcγR2B/FcγR2A的结合率。在某些实施方案中，与亲本多肽相比，此类分子具有增加的与FcγR2B/FcγR1A的结合率。
如上所述，在本发明的具体实施方案中，特别是当根据本发明第一方面时，抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)和位置297处的丙氨酸(A)(所有编号均根据EU索引)。合适地，因此Fc区和抗体本身能够与Fcγ受体结合。
在具体实施方案中，相对于包含缺乏上述一个或多个Fc取代的Fc区的可比较对照抗体，Fc区以更高的亲和力与FcγR2B结合。在具体实施方案中，抗体以约5μM至0.1μM的解离常数(KD)与FcγR2B结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。合适地，抗体经由其Fc区与FcγR2B结合。
在具体实施方案中，抗体以至多5μM的KD与FcγR2B结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
在具体实施方案中，抗体相对于亲本分子以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131R同种异型)结合。亲本分子是缺乏Fc取代的等效抗体，该Fc取代赋予抗体分子增加的与FcγR2B的结合并因此增强该FcγR2B的信号传导。
在具体实施方案中，当抗体包含P238D取代时，抗体相对于可比较对照抗体以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131R同种异型)结合，该可比较对照抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
在具体实施方案中，抗体以至少20μM的KD与FcγR2A(131R同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
在具体实施方案中，抗体以约25μM至35μM的KD与FcγR2A(131R同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
在具体实施方案中，抗体相对于亲本分子以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131H同种异型)结合。
在具体实施方案中，当抗体包含P238D取代时，抗体相对于可比较对照抗体以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131H同种异型)结合，该可比较对照抗体包含Fc区，该Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
在具体实施方案中，抗体以至少50μM的KD与FcγR2A(131H同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
在具体实施方案中，抗体具有为3或更高(诸如至少5)的[抗体对FcγR2A(131R)的KD值/抗体对FcγR2B的KD值]。合适地，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
在具体实施方案中，抗体具有为10或更高(诸如至少15)的[抗体对FcγR2A(131H)的KD值]/[抗体对FcγR2B的KD值]。合适地，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
在具体实施方案中，抗体具有为3或更高(诸如至少5)的[抗体对FcγR2A(131R)的KD值/抗体对FcγR2B的KD值]和/或为10或更高(诸如至少15)的[抗体对FcγR2A(131H)的KD值]/[抗体对FcγR2B的KD值]。合适地，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
适当地，相对于可比较对照抗体/亲本抗体，本发明的抗体对人免疫细胞表面上表达的人BTLA表现出增强的激动作用，如通过选自以下的BTLA激动剂测定所测量的：诸如实施例24中描述的T细胞活化测定、诸如实施例25中描述的混合淋巴细胞反应，或者诸如实施例26中描述的B细胞活化测定。
因此，如果抗体包含P238D取代，则相对于包含Fc区(该Fc区包含位置238处的脯氨酸)的可比较对照抗体，抗体对人免疫细胞表面上表达的人BTLA表现出增强的激动作用，如通过选自以下的BTLA激动剂测定所测量的：诸如实施例24中描述的T细胞活化测定、诸如实施例25中描述的混合淋巴细胞反应，或者诸如实施例26中描述的B细胞活化测定。
在具体实施方案中，本发明的抗体选自由以下项组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。
在具体实施方案中，本发明的抗体是抗原结合片段抗体，该抗原结合片段抗体选自由以下项组成的组：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab′、(Fab′)2和双价抗体。
在具体实施方案中，形成抗原结合片段的重链和轻链分子通过柔性接头连接。存在许多常用的柔性接头，并且接头的选择可由本领域技术人员进行。
连接scFv VH和VL结构域的肽接头将一个可变区结构域的羧基末端连接到另一个可变结构域的氨基末端，而不显著损害VH-VL配对和抗原结合位点的保真性。肽接头的长度可从10至25个氨基酸变化，并且通常但不总是由亲水性氨基酸诸如甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成。接头可以是在天然多结构域蛋白中发现的接头(例如参见Argos P.J Mol Biol.，第211卷：第943-958页，1990年；以及Heringa G.Protein Eng.，第15卷：第871-879页，2002年，或由其修改。
常用的柔性接头具有主要由Gly和Ser残基的片段组成的序列(“GS”接头)。最广泛使用的柔性接头的示例具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的序列(SEQ ID NO：232)。通过调节拷贝数量“n”，可改变该GS接头的长度以实现功能结构域的适当分离，或保持必需的结构域间相互作用。通常，具有n＝3个肽的GS接头用作scFv肽接头(Leith等人，Int.J.Oncol.，第24卷：第765-771页，2004年；Holiger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.第90卷：第6444-6448页，1993年)。该15个氨基酸的接头序列[命名为(GGGGS)3接头]用于可从Amersham商购获得的重组噬菌体抗体系统(RPAS试剂盒)。若干其他接头也已用于产生scFV分子(例如KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：233)和EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：234)；Bird等人，Science，第242卷：第432-426页，1988年)。
表位结合
本发明人对BTLA上的表位进行了作图，其中本文公开的有效激动剂和抗体结合。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106、E92、Y39、K41、R42、Q43、E45、S47、D35、T78、K81、S121、L123、H68、N65、A64。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106、E92。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的至少两个残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106、E92。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的至少三个残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的至少五个残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的所有残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的至少两个残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的所有残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的残基：D35、T78、K81、S121和L123。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的至少两个残基：D35、T78、K81、S121和L123。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合人BTLA的残基H68。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合选自以下的人BTLA的残基：N65和A64。
在具体实施方案中，本发明的抗体结合人BTLA的N65和A64残基两者。
残基编号诸如K41是指位置41处的氨基酸(K；赖氨酸)；其中编号是指SEQ ID NO:225所公开的人BTLA多肽中的位置。
在具体实施方案中，本发明的抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。在具体实施方案中，抗体是哺乳动物或人抗体。
在具体实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。
在具体实施方案中，本发明的抗体是完全人抗体。
在具体实施方案中，本发明的抗体作为诱导通过BTLA受体的信号传导的激动剂起作用。
本发明的抗体(包括抗原结合片段)是特别有效的激动剂。
在具体实施方案中，本发明的抗体具有不超过1nM的EC50。
本发明的激动剂抗体(例如全长/完整抗体或其抗原结合片段)具有特别高的功效。
在具体实施方案中，本发明的抗体抑制T细胞的增殖至少20％，合适地至少30％，更合适地至少40％。
在具体实施方案中，本发明的抗体抑制T细胞IFN-γ的产生至少50％，合适地至少75％，更合适地至少95％，例如通过体外混合淋巴细胞反应中上清液的ELISA测量。
在具体实施方案中，本发明的抗体抑制T细胞IL-2的产生至少50％，合适地至少75％，更合适地至少95％，例如通过体外混合淋巴细胞反应中上清液的ELISA测量。
在具体实施方案中，本发明的抗体抑制T细胞IL-17的产生至少50％，合适地至少75％，更合适地至少95％，例如通过体外混合淋巴细胞反应中上清液的ELISA测量。
在具体实施方案中，使用诸如实施例12中所述的方法，本发明的抗体使鼠GVHD模型中的死亡率降低至少50％，合适地至少75％，更合适地至少95％。
在具体实施方案中，使用诸如实施例11中所述的方法，本发明的抗体使鼠T细胞结肠炎模型中的体重减轻降低至少50％，合适地至少75％，更合适地至少95％。
在具体实施方案中，使用诸如实施例11中所述的方法，本发明的抗体使鼠T细胞结肠炎模型中的结肠炎症降低至少50％，合适地至少75％，更合适地至少95％。
在某些方面，本发明还涉及包含本文所述的抗体中的任一者的VL结构域或VH结构域的分离的多肽。
如本文所述，在具体实施方案中，结合BTLA的抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，该Fc区在位置238处包含天冬氨酸(EU索引)。
核酸分子
本发明的抗体将由核酸编码。抗体(包括其抗原结合片段)可由单个核酸分子编码，或者它可由两个或更多个核酸分子编码。例如，由于抗原结合位点通常由重链可变多肽区和轻链可变多肽区集合在一起形成，因此这两个可变(重和轻)多肽区可由单独的核酸分子编码。另选地，例如在scFv的情况下，它们可由相同核酸分子编码。
根据本发明第二方面，提供了编码根据本发明第一方面的抗体的一种或多种核酸分子。
根据编码本发明抗体的多肽的一级氨基酸序列，本领域技术人员能够确定编码多肽的合适的核苷酸序列，并且如果需要，确定密码子优化的核苷酸序列(例如参见Mauro和Chappell.，Trends Mol Med.，第20卷第11期：第604-613页，2014年)。
如本文所用，当提及本发明的先前方面时，例如“根据本发明第一(或第二等)方面”时，应当理解为还涵盖所述方面的任何所述变化形式(例如第一(或第二等)方面的变化形式)。此外，适用于本发明的特定方面的任何实施方案也适用于该方面的任何变化形式，因此适用于本发明的第一方面的实施方案也适用于本发明的第一方面的变化形式。
根据本发明第二方面的变化形式，提供了包含编码本发明的重链可变区多肽或轻链可变区多肽的核苷酸序列的分离核酸。本发明的重链可变多肽或轻链可变多肽是指包括构成抗原结合位点的一部分的氨基酸的单个多肽链。当然，所述多肽还可包含其他结构域，诸如恒定结构域、铰链区和Fc区，诸如包含一个或多个Fc受体结合位点的结构域。
根据本发明第二方面的另一个变化形式，提供了包含编码能够形成本发明的抗体的多肽的一个或多个核苷酸序列的分离核酸。在具体实施方案中，所述多肽还可包含其他结构域，诸如恒定结构域、铰链区和Fc区，诸如包含一个或多个Fc受体结合位点的结构域。
核酸分子中的一种核酸分子可仅编码包含抗体或其片段的VL结构域的多肽序列。核酸分子中的一种核酸分子可仅编码包含抗体或其片段的VH结构域的多肽序列。然而，核酸分子也可编码含有能够形成本发明的抗体(诸如全长/完整抗体或其抗原结合片段)的多肽序列的VH和VL结构域两者。
编码本发明的抗体(诸如根据本发明第一方面)的核酸分子可以是载体(诸如质粒载体、粘粒载体或病毒载体、或人工染色体)或可以是其一部分，该载体可包含其他功能区(元件)，诸如一个或多个启动子、一个或多个起点或复制、一个或多个选择标记、以及通常在表达载体中发现的一个或多个其他元件。编码蛋白质(包括抗体)的核酸的克隆和表达是在本领域技术人员的技术范围内建立的。
根据本发明第三方面，提供了一种载体，该载体包含本发明第二方面的核酸。在具体实施方案中，载体是质粒载体、粘粒载体、病毒载体或人工染色体。
本发明的核酸，包括包含编码能够形成本发明的抗体的多肽的核苷酸序列的载体核酸，可以是纯化/分离的形式。
编码本发明的抗体的分离/纯化的核酸将不含或基本上不含与它们天然相关的物质，诸如在它们的天然环境中发现的其他蛋白质或核酸，或者当通过在体外或体内实施重组DNA技术进行这种制备时在制备它们的环境中发现的其他蛋白质或核酸。
在具体实施方案中，本发明的核酸的纯度大于80％，诸如大于90％、大于95％、大于97％和大于99％。
因此，根据本发明第三方面的另一个变化形式，提供了包含编码本发明的重链可变多肽或轻链可变多肽的核酸或核苷酸序列的载体。在具体实施方案中，载体包含编码重链和轻链可变区的核酸。在具体实施方案中，所述多肽还可包含其他结构域，诸如恒定结构域、铰链区和Fc区，诸如包含一个或多个Fc受体结合位点的结构域。
可将本发明的核酸和/或载体引入宿主细胞。该引入可采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔法、脂质体介导的转染和使用反转录病毒或其他病毒(例如痘苗病毒，或对于昆虫细胞而言，杆状病毒)的转导。在宿主细胞，特别是真核细胞中引入核酸可使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以游离形式保持或者可掺入宿主细胞或人工染色体中。掺入可通过在单个或多个基因座随机或靶向整合一个或多个拷贝来进行。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
在一个实施方案中，将本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组(例如，染色体)中。根据标准技术，可通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
宿主细胞
本发明的另一个方面提供了含有本文公开的核酸的宿主细胞。这样的宿主细胞可以是体外的并且可以是培养中的。
宿主细胞可来自任何物种，诸如细菌或酵母，但合适地，宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如人细胞或啮齿动物细胞，例如HEK293T细胞或CHO-K1细胞。
因此，根据本发明第四方面，提供了包含根据本发明第二方面的核酸序列或根据本发明第三方面的载体的宿主细胞。
可处理宿主细胞以便致使或允许从核酸表达本发明的蛋白质，例如通过在表达编码核酸的条件下培养宿主细胞。所表达产物的纯化可通过本领域技术人员已知的方法实现。
因此，本发明的核酸，包括包含编码能够形成本发明的抗体的多肽的核苷酸序列的载体核酸，可存在于分离的宿主细胞中。宿主细胞通常是宿主细胞的克隆群体的一部分。如本文所用，提及宿主细胞还涵盖所述细胞的克隆群体。克隆群体是从单个亲本宿主细胞生长的群体。宿主细胞可来自任何合适的生物体。合适的宿主细胞包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。
宿主细胞可用于辅助扩增载体核酸(诸如用质粒)，或其可用作生物工厂以表达形成本发明的BTLA抗体的本发明的多肽。用于扩增载体核酸的合适的宿主可以是细菌或真菌细胞，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。用于表达本发明的蛋白质(即构成本发明的人BTLA结合抗体的多肽)的合适的宿主将是哺乳动物细胞，诸如HEK293T或CHO-K1细胞。在具体实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如HEK293T或CHO-K1细胞。
多种宿主表达载体系统可用于表达如本文所述的BTLA结合分子(参见例如美国专利号5,807,715)。例如，哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体诸如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件相结合是CEA蛋白质的有效表达系统(Foecking等人，Gene，第45卷：第101页，1986年；和Cockett等人，Bio/Technology，第8卷：第2期，1990年)。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保本公开的蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、HEK、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。
抗体生产
根据本发明第五方面，提供了产生根据本发明第一方面的抗体的方法，该方法包括在产生所述抗体的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞的步骤，以及任选地分离和/或纯化所述抗体。
根据本发明第五方面的变化形式，提供了产生结合人BTLA的抗体的方法，该方法包括在产生所述抗体的条件下培养包含编码形成结合人BTLA的抗体的多肽的核酸的宿主细胞的步骤，任选地进一步包括分离/纯化所述抗体。
通过分离/纯化，我们意指本发明的抗体或组成这些分子的多肽将不含或基本上不含与它们天然相关的物质，诸如在它们的天然环境中发现的其他蛋白质或核酸，或者当通过在体外或体内实施重组DNA技术进行这种制备时在制备它们的环境中发现的其他蛋白质或核酸。
根据本发明第五方面的变化形式，提供了用于制备特异性结合人BTLA的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含一种或多种核酸分子的宿主细胞，该一种或多种核酸分子编码包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域的氨基酸序列的一种或多种多肽，该一种或多种核酸分子在表达时能够组合以产生人BTLA结合分子；
b)培养表达所编码的氨基酸序列的宿主细胞；以及c)分离抗体分子。
该一种或多种核酸分子是编码能够形成特异性结合人BTLA的本发明抗体的一种或多种多肽的上述那些核酸分子。
在具体实施方案中，该抗体包含：i)包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；并且
ii)包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRL1具有如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在具体实施方案中，该抗体包含：i)包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；并且
ii)包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRL1具有如SEQ IDNO：23所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在具体实施方案中，该抗体包含：i)包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；并且
ii)包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRL1具有如SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。
在具体实施方案中，该抗体包含：
i)重链可变区，该重链可变区包含公开于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和
ii)轻链可变区，该轻链可变区包含公开于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在具体实施方案中，该抗体包含：
i)重链可变区，该重链可变区包含公开于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和
ii)轻链可变区，该轻链可变区包含公开于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在具体实施方案中，该抗体包含：
i)重链可变区，该重链可变区包含公开于SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和
ii)轻链可变区，该轻链可变区包含公开于SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
产生本发明的抗体和纯化所述分子的条件是本领域熟知的。对此的一种方式是制备能够表达本发明的抗体或其片段的细胞的克隆群体，并且将它们在适合的生长培养基中培养一段时间并在有利于允许细胞群的扩增/生长和感兴趣的蛋白质的表达的温度下培养。如果感兴趣的蛋白质(例如，本发明的抗体)在宿主细胞内表达，则可将细胞裂解(例如，使用温和清洁剂或超声处理)以将细胞的内容物(以及因此感兴趣的蛋白质)释放到周围培养基(其可以是培养基或细胞已在其中重建的另一种培养基)中，然后对该培养基进行纯化过程。如果目的蛋白质(例如，本发明的抗体)被分泌到生长培养基中，则对该培养基进行纯化过程。抗体纯化通常涉及使用公认的方法从例如杂交瘤细胞系的培养基或培养上清液中分离抗体，这些方法通常包括层析(例如，使用亲和层析、阴离子和/或阳离子交换层析、大小排阻层析或其他分离技术)，以将感兴趣的蛋白质与不需要的宿主来源的蛋白质和其他细胞污染物(例如，核酸、碳水化合物等)分离。所纯化的蛋白质也可进行病毒灭活步骤。最后，所纯化的感兴趣的蛋白质可例如被冻干或配制以准备储存、运输和随后使用。优选地，感兴趣的蛋白(例如，本发明的完整抗体或其抗原结合片段)将基本上不含在表达或细胞裂解后最初存在于培养基中的污染蛋白质。
在某些实施方案中，本发明的抗体的纯度将是至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的蛋白质(例如，本发明的完整抗体或其抗原结合片段)可被配制成合适的组合物。
组合物
虽然BTLA结合分子(本发明的抗体)可单独施用，但在某些实施方案中，施用的是其中BTLA结合分子与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的药物组合物。赋形剂可以是合适的药物载体溶质。此类载体是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、脂质体、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以合适的剂量施用给受试者。给药方案将由主治医师和临床因素决定。
根据本发明第六方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本发明第一方面的抗体或由本发明第五方面产生的抗体。在具体实施方案中，该组合物包含磷酸盐缓冲盐水。
“药物组合物”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式存在并且不含有对将施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。药物组合物将包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文中的术语赋形剂是指任何添加剂，诸如填充剂、增溶剂、载体、溶媒、添加剂等。
药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，包括例如水、离子交换剂、蛋白质、缓冲物质和盐。还可存在防腐剂和其他添加剂。赋形剂可以是溶剂或分散介质。用于本文公开的治疗方法的合适制剂描述于以下中：Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Osol,A.编辑，1980年。
“药学上可接受的”赋形剂是可合理地施用给受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些赋形剂。通过将组合物与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑，(1980)，以冻干制剂或水溶液的形式来制备本发明的药物组合物用于储存。可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵)；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN(TM)、PLURONICS(TM)或聚乙二醇(PEG)。冻干的HER2抗体制剂描述于WO 97/04801中。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可通过经无菌过滤膜过滤而容易地实现。
BTLA结合部分分子例如抗体或其抗原结合片段的施用途径可以是例如口服、肠胃外、通过吸入或局部施用。如本文所用，术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。
用于肠胃外施用的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液和悬浮液。非水溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯诸如油酸乙酯。含水载体包括水、水溶液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格或固定油。静脉内溶媒包括流体和营养补充物、电解质补充物(诸如基于林格氏葡萄糖的那些)等。防腐剂和其他添加剂也可存在，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，在人来源的某些实施方案中，组合物可包含蛋白质载体，如例如血清白蛋白或免疫球蛋白。对于静脉注射，或在患病部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，该水溶液无热原，并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员能够使用例如等渗溶媒诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。根据需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。如上所述，这些在本文中都是指赋形剂。
用于注射的组合物可用本领域已知的医疗装置给药。例如，用皮下注射针。也可使用无针注射装置，诸如在美国专利号6620135和5312335中公开的那些。
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可包含固体载体诸如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。如果需要，可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
根据分子的物理化学性质和递送途径，可将本发明的抗体配制成液体、半固体或固体形式。制剂可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括宽范围的抗体浓度和pH。固体制剂可通过例如冻干、喷雾干燥或通过超临界流体技术干燥来生产。
药物组合物可作为单剂量、多剂量或在确定的时间段内以输注形式施用。还可调整给药方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗或预防应答)。具体地，肠胃外制剂可以是单次推注剂量、输注或负载推注剂量，然后是一个或多个维持剂量。这些组合物可按特定的固定或可变的间隔施用，例如每天一次，或基于“按需”施用。
剂量
将是治疗有效的BTLA结合分子或含有该分子的药物制剂的量可通过标准临床技术确定，诸如通过剂量范围临床试验。此外，可任选地采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或障碍的严重性，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可根据来源于体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线推算。本领域技术人员可确定待施用的组合物的剂量，而无需结合标准剂量应答研究的不适当实验。在进行这些确定时待考虑的相关情况包括待治疗的一种或多种病症、待施用的组合物的选择、个体患者的年龄、体重和应答以及患者症状的严重性。例如，实际患者体重可用于计算待施用的以毫升(mL)计的制剂剂量。可能没有对“理想”重量的向下调整。在这种情况下，可通过下式计算合适的剂量：
剂量(mL)＝[患者体重(kg)×剂量水平(mg/kg)/药物浓度(mg/mL)]
如本文所讨论，用于治疗BTLA相关疾病或障碍的药物组合物的治疗有效剂量将根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者的体重或患者的性别、患者的年龄、患者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗有效剂量可能已经从临床试验确定，并且是主治医师可使用治疗指南确定的剂量。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定以优化安全性和功效。
在各种实施方案中，BTLA结合分子以约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg或约20mg/kg的浓度施用。
本发明的药物组合物可单独施用或与其他治疗组合施用，根据待治疗的病症同时或相继施用。这种组合可能与其他免疫抑制剂一起施用，诸如选自下列的一种：皮质类固醇、环孢霉素、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、他克莫司和芬戈莫德或其他生物制剂诸如英夫利昔单抗、阿达木单抗、优特克单抗、托珠单抗和利妥昔单抗。
根据本发明第七方面，提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将根据本发明第一方面的抗体或根据本发明第五方面产生的抗体配制成包含至少一种附加组分的组合物。在具体实施方案中，该至少一种附加组分是药学上可接受的赋形剂。
试剂盒
此外，产品(例如，BTLA结合分子或其药物组合物)可以试剂盒的形式包装和销售。此类制品可具有标签或包装说明书，指示关于产品和产品用于治疗患有或易患疾病或障碍的受试者的适当用途的说明。
因此，根据本发明第八方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明第一方面的抗体或根据本发明第六方面的药物组合物。合适地，此类试剂盒包括包含使用说明的包装说明书。
治疗/医学用途
本发明的抗体或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物可用于治疗，通常作为药物。
在某些实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物可用于治疗或预防对其有需要的受试者的任何疾病或病症。
BTLA涉及下调免疫应答，并且存在许多疾病或病症可通过抑制宿主T细胞和/或B细胞来治疗(例如参见Crawford和Wherry编辑：Therapeutic potential of targetingBTLA，J Leukocyte Biol.，第86卷：第5-8页，2009年)。可受益于用抗BTLA激动剂治疗的疾病或病症在本文中称为“BTLA相关疾病”。BTLA相关疾病包括炎性或自身免疫疾病，以及过度免疫细胞增殖的障碍。
可用本发明的BTLA结合分子治疗的特定BTLA相关疾病包括：艾迪生病、过敏反应、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、哮喘(包括变应性哮喘)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫多内分泌腺病综合征、白塞病、大疱性类天疱疮、脑性疟疾、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、乳糜泻、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬变)、幼年性关节炎、川崎病、白血病、淋巴瘤、淋巴增生性障碍、多发性硬化、重症肌无力、骨髓瘤、视神经脊髓炎、天疱疮、多肌炎、原发性胆道胆管炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿关节炎、结节病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、移植排斥、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-小柳原田病。
在具体实施方案中，待治疗的病症选自由以下项组成的组：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、移植物抗宿主病、移植排斥、多发性硬化、血管炎、干燥综合症、白塞病、葡萄膜炎、1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、原发性硬化性胆管炎、重症肌无力症。
在具体实施方案中，过度免疫细胞增殖的障碍选自淋巴瘤、白血病、系统性肥大细胞增生症、骨髓瘤或淋巴增生性障碍。
根据本发明第九方面，提供了用于治疗的根据本发明第一方面的抗体或根据本发明第六方面的药物组合物。
在具体实施方案中，该治疗是治疗或预防BTLA相关疾病。
在具体实施方案中，BTLA相关疾病是由受试者中BTLA的降低表达和/或活性引起的疾病。具体地，可用本发明的BTLA激动剂抗体治疗以T或B细胞的存在或活性为特征的任何疾病或病症。
在一个实施方案中，BTLA相关疾病是炎性疾病(诸如类风湿性关节炎)、自身免疫疾病或障碍(诸如移植物抗宿主病)或增殖性疾病或障碍(诸如癌症)。
在具体实施方案中，该治疗是治疗或预防炎性或自身免疫疾病，以及过度免疫细胞增殖的障碍。
根据本发明第九方面的变化形式，提供了治疗对其有需要的患者的方法，该方法包括向患者施用根据本发明第一方面的抗体(或BTLA结合分子)或根据本发明第六方面的药物组合物。在具体实施方案中，需要治疗或待治疗的患者患有(或正患有)BTLA相关疾病。在具体实施方案中，需要治疗或待治疗的患者患有(或正患有)炎性疾病、自身免疫疾病或过度免疫细胞增殖的障碍。
在具体实施方案中，将根据本发明第一方面的抗体或根据本发明第六方面的药物组合物以药学上可接受的量施用给对其有需要的患者。
在本发明该第九方面的变化形式中，提供了根据本发明第一方面的抗体(或BTLA结合分子)或根据本发明第六方面的药物组合物在治疗对其有需要的患者的方法中的用途。在具体实施方案中，该方法用于治疗或预防BTLA相关疾病。在具体实施方案中，该方法用于治疗或预防炎性或自身免疫疾病，以及过度免疫细胞增殖的障碍。
在该方面的进一步变化形式中，提供了根据本发明第一方面的抗体或根据的本发明第六方面的药物组合物在制备用于治疗对其有需要的患者的药物中的用途。
在一个实施方案中，该治疗用于治疗BTLA相关疾病。合适地，BTLA相关疾病是炎性疾病(诸如哮喘)、自身免疫疾病或障碍(诸如类风湿关节炎)或免疫增生性疾病或障碍(诸如淋巴瘤)。
在具体实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于抑制T细胞和/或B细胞。
在具体实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗或预防对其有需要的受试者的疾病或病症，该疾病或病症选自由以下项组成的组：艾迪生病、过敏反应、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、哮喘(包括变应性哮喘)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫多内分泌腺病综合征、白塞病、大疱性类天疱疮、脑性疟疾、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、乳糜泻、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎、移植物抗宿主病(GVHD)、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬变)、幼年性关节炎、川崎病、白血病、淋巴瘤、淋巴增生性障碍、多发性硬化(MS)、重症肌无力、骨髓瘤、视神经脊髓炎、天疱疮、多肌炎、原发性胆道胆管炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿关节炎、结节病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、移植排斥、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-小柳原田病。
在具体实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗或预防对其有需要的受试者的疾病或病症，该疾病或病症选自由以下项组成的组：克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、移植物抗宿主病、移植排斥、多发性硬化、血管炎、干燥综合症、白塞病、葡萄膜炎、1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、原发性硬化性胆管炎、重症肌无力症。在一个实施方案中，免疫增生性疾病是癌症。合适地，癌症是白血病或淋巴瘤。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于预防或治疗移植排斥。
在另一个实施方案中，本发明涉及移植物抗宿主病的预防或治疗。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗类风湿性关节炎。
在其他实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗糖尿病，诸如1型糖尿病。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗牛皮癣。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗多发性硬化。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物用于治疗结肠炎。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以改善患者的症状或实现期望的生物学结果，例如，癌症、肿瘤细胞死亡增加、肿瘤大小减小、无进展生存率或总体生存率增加的药物的剂量或量。如本文其他地方所公开的，有效量将通常通过广泛的人临床研究来评估。
在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和“含有”以及它们的变化形式意指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、部件、整体或步骤。在本说明书的整个说明书和权利要求书中，除非上下文另外要求，否则单数涵盖复数。具体地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另外要求，否则说明书应理解为考虑复数以及单数。
结合本发明的具体方面、实施方案或示例描述的特征、整体、特性、化合物、化学部分或组应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或示例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以任何组合进行组合，除了其中此类特征和/或步骤中的至少一些特征和/或步骤相互排斥的组合之外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或者扩展到如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。
读者的注意力指向与本申请相关的本说明书同时提交或在本说明书之前提交的并且对本说明书的公众检查开放的所有论文和文献，并且所有此类论文和文献的内容通过引用方式并入本文。
现在将参考以下非限制性示例和附图进一步描述本发明。
附图说明
图1
抗体与可溶和细胞表达形式的人和食蟹猴BTLA的结合。(a)相对于固定的抗BTLA抗体，以增加的浓度注射的可溶性单体人BTLA细胞外结构域的表面等离子体共振(SPR)结合曲线；图显示了参考和空白扣除之后的SPR信号。(b)如使用BiaEvaluation软件通过曲线拟合计算的与人或食蟹猴BTLA结合的缔合速率和解离速率。(c)与同种型对照抗体相比，抗体2.8.6与表达人BTLA或食蟹猴BTLA的Jurkat细胞系的结合(数据点表示在各抗体浓度下三份孔的平均值+/-SD)。(d)如使用GraphPad Prism软件通过非线性曲线拟合计算的抗体结合转染细胞系的EC50
图2
(a)通过SPR评估抗BTLA抗体对配体结合的阻断。将人BTLA胞外域固定在传感器芯片上。注射人HVEM以确认结合，然后使其完全解离。然后注射饱和浓度的抗BTLA抗体，随后立即第二次注射HVEM。(b)在注射抗体之后HVEM的平衡结合表示为注射抗体前HVEM结合的百分比。用克隆11.5.1饱和BTLA，但不用克隆2.8.6饱和，阻断了随后的配体结合。
图3
抗BTLA抗体的表位作图。(a)用也表达GFP的双顺反子载体中的BTLA构建体转染的HEK293T细胞用缀合了抗BTLA抗体的Pacific Blue染色。克隆11.5.1结合用野生型受体转染的细胞(左)，但不结合用具有Y39R突变的BTLA转染的细胞(右)。(b)与每个BTLA突变体构建体的结合表示为克隆2.8.6和11.5.1与野生型BTLA结合的百分比。(c)将选择性消除克隆11.5.1的结合的突变Y39R和K41E映射到人BTLA的晶体结构上(黑色残基)。对于配体HVEM的结合关键的残基以灰色突出显示。
图4
(a)与克隆2.8.6的Fab'片段复合的人BTLA胞外结构域的晶体结构。包埋在界面处的BTLA上的残基以黑色突出显示。(b)显示了抗体2.8.6的表位(黑色残基)与HVEM结合位点(灰色残基)的关系。
图5
(a)在人源化BTLA小鼠中产生嵌合BTLA基因的策略。将从外显子2起始到外显子3结束的人基因组DNA片段插入小鼠基因座，取代从外显子2起始到外显子4末端的小鼠序列。小鼠外显子2起始和小鼠外显子4结束的外显子-内含子连接处的序列保持完整，以确保正确的剪接。
图6
(a)评估体内抗BTLA抗体的T细胞转移测定方案。将人源化和野生型OVA特异性CD4T细胞的混合物注射到受体小鼠中。第二天用在明矾中的卵清蛋白对小鼠进行免疫以活化转移的细胞，并且24小时后给予抗人BTLA抗体或同种型对照。在初始细胞转移之后八天，通过流式细胞术评估脾中转移群体中人源化细胞与野生型细胞的比例。(b)相对于野生型，克隆11.5.1和较小程度的2.8.6两者均降低了人源化细胞的扩增。图显示了来自两次(对于11.5.1)或三次(对于2.8.6)重复实验的合并数据。每个数据点代表单个受体小鼠。
图7
抗BTLA克隆2.8.6在体外混合淋巴细胞反应中对CD4T细胞增殖的作用。将来自人源化C57BL/6小鼠的T细胞用CellTraceViolet染色，并在抗BTLA抗体或同种型对照的存在下将其加入到丝裂霉素C处理的Balb/c刺激细胞中。在96小时之后，评估人源化CD4细胞的增殖，并归一化为在抗体的不存在下的增殖。克隆2.8.6以0.029nM的IC50抑制人源化细胞的增殖，并具有42％增殖抑制的最大作用。数据点表示在每个抗体浓度下三份孔的平均值+/-SD，并且代表5次独立实验。
图8
(a)克隆2.8.6在T细胞结肠炎模型中的作用。给RAG敲除受体小鼠注射来自人源化BTLA小鼠的CD45RBhiCD25-CD4+T细胞，并在第7、21和35天用200μg 2.8.6或同种型对照抗体处理。同种型对照处理的小鼠从3周开始体重逐渐减轻，而2.8.6处理的小鼠则幸免。。(b)在细胞转移之后8周，处理结肠以提取固有层淋巴细胞，并计算每个结肠提取的炎性细胞的总数。同种型对照处理的小鼠比2.8.6处理的小鼠具有显著更多的浸润性免疫细胞。(c)计算结肠重量与长度比作为炎症和增厚的标记。2.8.6处理防止了在同种型对照治疗的小鼠中观察到的重量与长度比的增加。
图9
(a)BTLA抗体在GVHD的亲本至F1模型中的作用。将来自人源化BTLA小鼠的C57BL/6脾细胞和骨髓细胞注射到CB6F1受体小鼠中，然后用抗BTLA抗体或同种型对照处理。未处理的小鼠发展为临床GVHD，伴有进展性体重减轻、皮炎和腹泻，并且当它们达到预先指定的人道终点时处死。2.8.6和11.5.1抗体处理的小鼠相对而言是多余的，生存率与用同源细胞重建的对照小鼠相当。(b)在细胞转移之后5周处死小鼠并计算结肠重量与长度比作为肠道炎症的标记。2.8.6和11.5.1处理抑制了未处理小鼠中观察到的结肠增厚。
图10
(a)D265A突变克隆11.5.1在T细胞转移测定中的体内作用。这种不结合Fc受体的突变抗体不再抑制人源化BTLA细胞的增殖，而是由于受体阻断而导致增殖增强。(b)D265A突变的11.5.1抗体在混合淋巴细胞反应中不再抑制T细胞增殖。
图11
抗BTLA抗体不固定补体。在20μg/mL BTLA抗体、同种型对照或阳性对照(耗尽型CD20抗体)的存在下，将来自人源化BTLA小鼠的脾细胞与10％兔子补体在37℃下温育1小时。抗CD20抗体耗尽了大部分B细胞，证实了兔子补体的活性，但BTLA抗体不耗尽B细胞或T细胞，即使这两个群体均对BTLA染色呈阳性。
图12
抗BTLA抗体不引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在20μg/mL BTLA抗体、同种型对照或阳性对照(耗尽型CD20抗体)的存在下，将来自人源化BTLA小鼠的脾细胞在37℃下温育24小时。抗CD20抗体通过由混合物中的效应细胞诱导ADCC而耗尽了大部分B细胞，但BTLA抗体不耗尽B细胞或T细胞，即使这两个群体均对BTLA染色呈阳性。
图13
抗BTLA抗体不会在体内耗尽B细胞或T细胞。给人源化BTLA小鼠注射200μg的2.8.6抗体。在24小时之后，收集脾和骨髓，并通过流式细胞术评估细胞群。2.8.6没有耗尽脾中的B细胞或T细胞或影响骨髓中不同B细胞前体群体的频率(n＝3只小鼠/组)。
图14
与来自注射同种型对照抗体的小鼠的细胞上的BTLA表达相比，用抗体2.8.6或11.5.1体内温育6天后来自人源化小鼠的B细胞或CD4+T细胞上的BTLA表达水平(n＝5只小鼠/组)。
图15
报告基因测定中BTLA抗体的激动剂作用依赖于Fc受体结合，并且具有更大FcγR2B结合的同种型是更有效的激动剂。用人BTLA转染在NFkB应答转录元件控制下表达GFP的Jurkat T细胞系，并通过与在其表面上表达抗CD3scFv构建体的BW5147细胞系共培养来刺激。在培养24小时之后，通过流式细胞术测量GFP几何平均值来检测NFkB信号传导。在BW5147细胞系也被转染以表达hFcγR2B的条件下(a)或在不存在Fc受体的条件下(b)评估向培养物中添加不同同种型的BTLA激动剂抗体的抑制作用。数据点是在每个抗体浓度下三份孔的平均值+/-SD，并且代表3次独立实验。
图16
与BTLA的配体HVEM的Fc融合蛋白或现有技术的BTLA激动剂22B3相比，在P238D同种型上表达的人源化抗BTLA激动剂抗体2.8.6、6.2_varC和3E8在报告基因测定中具有更大的功效和效力。用人BTLA转染在NFkB应答转录元件控制下表达GFP的Jurkat T细胞系，并通过与在其表面上表达抗CD3scFv构建体和hFcγR2B的BW5147细胞系共培养来刺激。在培养24小时之后，通过流式细胞术测量GFP几何平均值来检测NFkB信号传导。评估添加到共培养物中的BTLA激动剂抗体的抑制作用。数据点是在每个抗体浓度下三份孔的平均值+/-SD，并且代表3次独立实验。
图17
人源化抗BTLA 2.8.6在混合的白细胞反应中抑制CD4T细胞增殖。在BTLA激动剂抗体或hIgG1P238D同种型对照的存在下，将来自血液中心供体的纯化的原代人T细胞用细胞增殖示踪染料染色，并与来自不同供体的同种异体单核细胞衍生的树突细胞以4∶1的比例共培养5天。通过流式细胞术鉴定细胞群，并通过示踪染料的稀释评估增殖。将在BTLA抗体的存在下的CD4增殖归一化为在等浓度同种型对照的存在下的增殖。将来自6个独立实验的数据与不同供体对进行核对。2.8.6作为P238D同种型显著抑制CD4T细胞增殖，但在其他同种型形式中不抑制。现有技术的分子22B3对CD4增殖没有显著影响。
图18
在P238D同种型上表达的人源化抗BTLA激动剂抗体2.8.6、6.2_varC和3E8抑制响应于TLR9激动剂ODN2006的原代B细胞活化。从健康供体PBMC分离原代人B细胞，并在不同剂量的P238D同种型对照抗体或选定的BTLA激动剂抗体的存在或不存在下用0.01μM ODN2006刺激。在5天之后，通过ELISA评估上清液中的IL-10浓度。柱表示在每个抗体浓度下三份孔的平均值+/-SD，并且代表3次独立实验。
图19
在异种移植物对宿主疾病模型中，在P238D同种型上表达的人源化抗BTLA激动剂抗体2.8.6、6.2_varC和3E8显著减少了体重减轻。在第0天用1千万人PBMC对经照射的NSG小鼠进行IV重建，然后在第1天用10mg/kg BTLA抗体或P238D同种型对照进行IP处理。对小鼠进行定期称重，并将重量相对于起始重量作图(n＝9只小鼠/组，数据点表示平均值+/-SD)。
实施例
在随后的实施例中，显示抗体诸如11.5.1和2.8.6以高亲和力结合人BTLA。使用表达人受体的转基因小鼠显示，在与BTLA结合后，这些抗体在体外和体内抑制T细胞应答，并且能够改善炎性肠病和移植物抗宿主病的鼠模型中的疾病。虽然这些激动剂作用依赖于Fc受体结合，但抗体不会经由细胞毒性引起表达BTLA的细胞的消耗，并且不会诱导受体下调。在重链中引入P238D修饰极大地增强了FcγR2B的激动剂信号传导并且增加了FcγR2B相对于FcγR2A的信号传导比例。预期此类双重BTLA和FcγR2B激动剂抗体具有治疗效用，特别是在自身免疫和炎性疾病背景中。
实施例1：抗BTLA抗体的产生和测序
由BioGenes GmbH经由用人BTLA(BTLAK31-R151)的胞外区免疫小鼠产生识别人免疫细胞受体BTLA的抗体。将来自免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，并结合稀释克隆，通过上清液的ELISA选择与人BTLA反应的所得杂交瘤。使用Rapid MouseIsotyping试剂盒(RayBiotech)从杂交瘤上清液中将抗体同种型化。发现克隆2.8.6和11.5.1产生的抗体都是IgG1k。
为了对免疫球蛋白可变结构域进行测序，使用TRIzol试剂(ThermoFisher)按照制造商的说明从杂交瘤中提取RNA。使用对重链的第一恒定结构域或轻链的恒定结构域特异的引物，和Super Script II逆转录酶(Invitrogen)按照制造商的说明，将RNA逆转录以产生cDNA。
然后如先前所述(Tiller等人，J Immunol Methods，第350卷：第183-193页，2009年)使用靶向免疫球蛋白基因座的保守区的引物进行PCR，病对PCR产物进行测序。在一些情况下，来自融合骨髓瘤细胞系的大量非功能性κ轻链cDNA使功能性轻链的鉴定复杂化，并且为了解决这一问题，采用先前描述的技术，添加对非功能性链CDR3特异的过量引物以强制截短异常链产物(Yuan等人，J Immunol Methods，第294卷：第39553-39561页，2005年)。
使用NCBI IgBlast工具评估可变结构域序列以确定CDR的位置。
实施例2：与可溶性人和食蟹猴BTLA的结合
使用Biacore T200(GE Healthcare)通过表面等离子体共振测定本发明的BTLA激动剂抗体(2.8.6和11.5.1)与人或食蟹猴BTLA的结合亲和力和动力学。使用小鼠抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)用多克隆抗小鼠IgG包被Series S CM5传感器芯片(GEHealthcare)。然后将抗BTLA抗体捕获到生物传感器表面上，将阴性对照抗体(克隆Mopc21；Biolegend)捕获到参考通道中。然后在37℃下，在单循环动力学分析中，将各种浓度的单体可溶性人BTLA胞外结构域(BTLAK31-R151)(来自SEQ ID NO：225)或可溶性食蟹猴BTLA细胞外结构域(BTLAK31-R151)(来自SEQ ID NO：226)注射到缓冲液10mM Hepes、150mM NaCl、0.005％v/v表面活性剂P20、pH7.4(HBS-P)中的固定化抗体上(图1a)。在参考和空白扣除之后，使用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)拟合缔合速率和解离速率，并计算解离常数(图1b)。克隆2.8.6以0.65nM的KD结合人BTLA，并且以7.89nM的KD结合食蟹猴BTLA。克隆11.5.1以0.75nM的KD结合人BTLA，并且以0.99nM的KD结合食蟹猴BTLA。在仅针对人BTLA的单独实验中，克隆2.8.6以0.37nM的KD结合人BTLA，并且克隆11.5.1以0.53nM的KD结合人BTLA。
实施例3：与细胞上的BTLA的结合
通过流式细胞术评估本发明的BTLA激动剂抗体(2.8.6和11.5.1)与细胞表面上表达的人或食蟹猴BTLA结合的能力。慢病毒转染系统用于在Jurkat T细胞系中表达全长人或食蟹猴BTLA。将1×105个细胞/孔接种在96孔U型底板中。BTLA抗体与mIgG1同种型对照(克隆MOPC-21，Biolegend目录号400165)的结合在通过在FACS缓冲液(PBS，2％ FCS，0.05％叠氮化钠)中以1∶3连续稀释的十二个浓度下进行评估，从浓度90μg/mL开始。通过添加Fc嵌段(Biolegend目录号101319)防止非特异性抗体结合。将抗体与细胞在冰上温育30分钟，然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，然后用AF647缀合的抗mIgG1二抗(Biolegend目录号406618)染色。将二抗在冰上温育30分钟，然后洗涤细胞并再悬浮于FACS缓冲液中以在流式细胞仪上进行分析。绘制每种浓度的二抗的几何平均荧光强度，并使用GraphPad Prism软件通过非线性曲线拟合计算受体结合的EC50。克隆11.5.1与EC50为0.016nM的表达人BTLA的细胞和EC50为0.0057nM的表达食蟹猴BTLA的细胞结合。克隆2.8.6与EC50为0.085nM的表达人BTLA的细胞和EC50为0.16nM的表达食蟹猴BTLA的细胞结合(图1c至图1d)。
实施例4：与天然配体HVEM竞争与BTLA的结合
使用Biacore T200(GE Healthcare)通过表面等离子体共振评估本发明的BTLA激动剂抗体(2.8.6和11.5.1)阻断天然配体与BTLA结合的能力。使用胺偶联将人BTLA胞外结构域(BTLA31K-151R)共价偶联至CM5传感器芯片。然后在37℃下将与小鼠IgG1Fc融合的人HVEM胞外结构域注射到HBS-P缓冲液中的固定化hBTLA上，并使其完全解离。然后注射饱和量的抗BTLA抗体(2.8.6或11.5.1)，随后立即以与初始注射相同的浓度第二次注射人HVEM-mFc(图2A)。用抗体饱和BTLA之后的平衡HVEM结合(以共振单位计)表示为抗体注射之前的结合百分比(图2B)。如果用抗体饱和后的HVEM结合＞抗体注射前结合的90％，则认为该抗体是非阻断的。
实施例5：抗体11.5.1在人BTLA上的结合表位
抗体11.5.1在人BTLA上的功能性表位通过流式细胞术评估与一组在细胞表面表达的受体的单残基突变体的结合来测定。将编码BTLA的人胞外区与鼠CD28的跨膜区和胞内区的构建体克隆到也编码GFP的双顺反子哺乳动物表达载体pGFP2-n2(BioSignal PackardLtd)中。使用“剧烈”诱变方法制备改变一个氨基酸的突变体构建体(Davis等人，Proc NatlAcad Sci USA，第95卷：第5490-5494页，1998年)。使用Genejuice转染剂(Novagen；6μL/孔)将质粒(2μg/孔)转染到6孔板中的HEK293T细胞中。每个实验包括模拟和无转染对照。在48小时收获细胞，并且在PBS、0.05％叠氮、2％ FCS(FACS缓冲液)中用10μg/mL的荧光染料缀合的抗BTLA抗体与活/死标记一起在4℃下染色1h。洗涤细胞，沉淀并再悬浮于200μL FACS缓冲液中，然后在BD FACSCanto流式细胞仪上进行分析。门控GFP阳性(转染的)活细胞并分析抗BTLA抗体的结合(克隆11.5.1的结合分析的示例显示在图3a中)。对于每个突变体，与转染细胞结合的抗BTLA抗体的几何平均值表示为与野生型受体结合的百分比(图3b)。评估一组抗BTLA抗体，并且从分析中排除消除所有抗体的结合的任何突变，假设此类突变导致蛋白折叠或表达的剧烈变化，而不是指示抗体表位。突变Y39R和K41E完全消除了抗体11.5.1的结合，而不影响2.8.6的结合。这些突变被映射到图3c中的人BTLA晶体结构上(Compaan等人，J Biol Chem.，第280卷：第39553-39561页，2005年)(黑色残基)，表明了11.5.1的结合表位。HVEM结合所需的残基(Gln37、Arg42、Pro59、His127；来自专利公布号WO2017004213)也被映射到灰色结构上，表明了11.5.1与非常接近HVEM结合位点的表位结合。
实施例6：与人BTLA复合的2.8.6的Fab'片段的晶体结构
抗体2.8.6在人BTLA上的结构表位通过解析与人BTLA胞外结构域复合的抗体Fab的晶体结构来测定。将抗体2.8.6的重链和轻链可变结构域克隆到pOPINVH和pOPINVL表达载体(Addgene)中，这些表达载体分别编码小鼠IgG1重链的第一恒定结构域(具有6xHistidine标签)和小鼠Igκ链的恒定结构域。将这些载体瞬时共转染到HEK293T细胞中以产生抗BTLA2.8.6的Fab'片段，该片段通过Ni-NTA纯化来纯化。将人BTLA Ig-V组结构域(BTLAS33-D135)克隆到pGMT7载体中，并在BL21(DE3)pLysS大肠杆菌细胞(Novagen)中表达以产生包涵体。通过超声处理从细胞沉淀中分离包涵体，并用含有0.5％ Triton X-100的洗涤溶液重复洗涤。将纯化的BTLA包涵体溶解在含有6M盐酸胍的变性剂溶液中。将溶解的蛋白质溶液在重折叠缓冲液[0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.6M L-精氨酸、2mM乙二胺四乙酸、3.73mM胱胺和6.73mM半胱胺]中缓慢稀释至1μM至2μM的最终蛋白质浓度，然后在4℃下搅拌48h。然后用VIVA FLOW50系统(Sartorius)浓缩重折叠的BTLA混合物。通过凝胶过滤在Superdex 75柱(GE Healthcare)上纯化BTLA。
将所纯化的BTLA和Fab'混合并通过尺寸排阻色谱法纯化为复合物。在293°K下，通过悬滴蒸汽扩散法在0.2M醋酸钙、0.1M咪唑pH 8.0、10％(w/v)PEG 8000中获得适于数据收集的晶体。在Photon Factory收集最终数据集，并使用BTLA(PDB ID；2AW2链A)和抗PD1-Fab(PDB ID:5GGS链C、D)的结构作为搜索探针，通过分子置换确定结构。
BTLA上与抗体2.8.6的界面处的残基是A50、G51、D52、P53、E83、D84、R85、Q86、E103、P104、V105、L106、P107、N108、D135。
实施例7：人源化BTLA小鼠的开发
为了提供评价小鼠模型中的抗人BTLA抗体的平台，开发了表达具有人胞外区和鼠跨膜区和信号传导区的嵌合形式的BTLA的C57Bl/6小鼠的敲入菌株。将从外显子2起始到外显子3结束的人基因组DNA片段插入小鼠基因座，取代从外显子2起始到外显子4末端的小鼠序列。小鼠外显子2起始和小鼠外显子4结束的外显子-内含子连接处的序列保持完整，以确保正确的剪接(图5)。
实施例8：体内抗原特异性T细胞增殖的抑制
使用敏感性T细胞转移测定评估本发明的BTLA激动剂抗体(2.8.6和11.5.1)体内抑制抗原特异性T细胞增殖的能力(图6a)。在该测定中，将5×105个T细胞转移到非转基因C57BL/6受体中，这些T细胞包含对来自表达纯合人BTLA(hBTLA)的小鼠和来自表达野生型鼠BTLA受体(The Jackson Laboratory)的OT-II小鼠的卵白蛋白(OVA)特异的纯化的OTII(TCR转基因)CD4+T细胞的混合物。使用CD45.2(相对于CD45.1)同种异型标记将转移的细胞与宿主细胞区分开。野生型供体细胞还在人泛素C启动子的控制下表达绿色荧光蛋白质，以允许通过流式细胞术将它们与人源化供体细胞区分开。在T细胞转移之后的第二天，用与100μL Imject Alum(ThermoFisher)混合的100μL PBS中的100μg卵白蛋白(Sigma-Aldrich)对受体小鼠进行免疫，以诱导T细胞的扩增。在第二天，腹膜内给予小鼠200μg抗体。在最初转移T细胞后八天，通过流式细胞术测定脾中表达人源化BTLA的T细胞和野生型OVA特异性T细胞的比例。以这种方式，有可能追踪结合抗人BTLA抗体的人源化细胞相对于不结合抗人BTLA抗体的野生型对照的扩增或收缩。相对于野生型对照，抗体2.8.6和11.5.1两者均导致人源化BTLA细胞的扩增减少，这表明它们通过抑制性BTLA受体诱导信号传导，这导致T细胞增殖减少(图6b)。
实施例9：在混合的淋巴细胞反应中T细胞增殖的抑制
使用混合的淋巴细胞反应(MLR)评估本发明的BTLA激动剂抗体(2.8.6和11.5.1)体外抑制来自人源化小鼠的原代T细胞增殖的能力。将来自Balb/c小鼠的脾细胞用丝裂霉素C在37℃下处理30mib，然后洗涤并用作刺激细胞。通过使用磁活化细胞分选(Mojosort小鼠CD3T细胞分离试剂盒，Biolegend目录号480023)的负选择从人源化BTLA小鼠的脾纯化T细胞，并用CellTrace Violet Cell Proliferation试剂盒(ThermoFisher)染色以用作应答细胞。将4×105个刺激细胞/孔和2×105个应答细胞/孔在96孔U型底板中与各种浓度的抗BTLA或同种型对照抗体(克隆MOPC-21，Biolegend目录号400165)混合。从浓度1μg/mL开始，共10个浓度，对连续1∶3稀释的抗体进行评估。多克隆抗mHVEM抗体(R&D systems目录号AF2516)还以101μg/mL加入到所有孔中，以阻断通过BTLA途径的任何基线信号传导，并加强激动剂抗体的作用。在96小时之后，通过流式细胞术评估应答细胞中CellTrace Violet的稀释作为增殖的标记。将在抗BTLA抗体或同种型对照的存在下的增殖与在抗体的不存在下的增殖进行比较。门控CD4+和CD8+群体并分别分析。抗体2.8.6和11.5.1两者均降低了表达人BTLA的T细胞的增殖，表明它们通过人BTLA受体诱导抑制信号传导。克隆2.8.6以0.029nM的IC50抑制CD4T细胞，并具有42％增殖抑制的最大作用(图7)。克隆11.5.1以0.016nM的IC50抑制CD4T细胞，并具有33％增殖抑制的最大作用。
实施例10：人BTLA或食蟹猴BTLA转染的Jurkat T细胞系中NFkB信号传导的抑制
使用BTLA转染的报告基因T细胞系评估本发明的BTLA激动剂抗体(2.8.6和11.5.1)抑制NFkB信号传导的能力。用包括最小CMV启动子(mCMV)-GFP盒上游的NF-κB应答转录元件(Source BioSciences目录号TR850A-1)的表达盒稳定转染的Jurkat T细胞系用作NFkB信号转导的报告基因细胞系。慢病毒转染系统用于在该报告基因细胞系中表达全长人或食蟹猴BTLA。将这些细胞与由在其表面表达抗CD3scFv构建体的bw5147细胞组成的刺激细胞系混合，如描述于Leitner等人J Immunol Methods，2010年10月31日，第362卷第1-2期：第131-141页。刺激细胞系也用鼠FcγR2B转染以提供用于递呈激动剂BTLA抗体的Fc受体。在各种浓度的BTLA抗体或同种型对照(克隆MOPC-21，Biolegend目录号400165)的存在下，将5×104个报告基因细胞/孔与5×104个刺激细胞/孔在96孔U型底板中混合。在37℃下温育24小时之后，将细胞沉淀并用活力染料(Zombie Aqua，Biolegend目录号423101)和小鼠CD45抗体(Pe-Cy7缀合的克隆104，Biolegend目录号109830)染色用于流式细胞术，以将刺激(鼠)细胞与应答(人)细胞分开。评估每种抗体浓度的GFP表达的几何平均值，并归一化为在抗体的不存在下的GFP表达。克隆2.8.6抑制IC50为0.06nM的人BTLA转染细胞和IC50为0.22nM的食蟹猴BTLA转染细胞。克隆11.5.1抑制IC50为0.033nM的人BTLA转染细胞和IC50为0.14nM的食蟹猴BTLA转染细胞。
实施例11：通过抗体2.8.6治疗T细胞驱动的结肠炎小鼠模型
使用人源化小鼠评估BTLA激动剂抗体2.8.6改善T细胞驱动的结肠炎模型的能力。这种T细胞转移模型先前已被描述为炎性肠病的鼠模型(Ostanin等人，Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol.，第296卷：G135-46，2009年)。将从人源化BTLA小鼠的脾和淋巴结分选的CD45RBhiCD25-CD4+T细胞以剂量5×105个细胞/小鼠腹膜内注射到Rag1KO受体(Rag1tm1Mom；Jackson Laboratory)中。转移的T细胞引起在约3周后发展的炎性结肠炎，并导致腹泻和体重减轻。没有接受转移的T细胞的Rag1KO cagemates作为非患病对照。在T细胞转移之后的第7、21和35天，给受体小鼠腹膜内注射200μg的2.8.6或同种型对照抗体。将所有小鼠定期称重，并在8周时将结肠称重并测量，并且通过组织学以及通过细胞计数和提取的粘膜固有层白细胞的流式细胞术评估炎性浸润。抗体2.8.6防止体重减轻(图8a)并显著减少结肠的炎性浸润(图8b)。患病小鼠的结肠炎症导致结肠重量：长度比增加，这在2.8.6处理的小鼠中未观察到(图8c)。
实施例12：移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型的处理
在GVHD的非致死亲本进入F1模型中评估抗BTLA激动剂抗体的作用。从人源化BTLA供体小鼠(C57BL/6背景；H2B)收获骨髓细胞(BMC)和脾细胞。将2×107个BMC和107个脾细胞静脉内注射到已经用9Gy全身辐照致死辐照的CB6F1(H2B/d)受体中。用同系BMC和脾细胞重建的辐照CB6F1小鼠作为非患病对照。在免疫细胞转移的当天，给小鼠腹膜内注射200μg抗BTLA抗体或同种型对照。对小鼠进行定期称重，并通过计算体重的相对损失和临床观察来监测GVHD。在免疫细胞转移之后5周或当它们达到人道终点(其包括在第一个14天相对于起始重量＞20％的重量损失，或在任何其他时间＞15％的重量损失)时处死小鼠。在死亡时，称重并测量结肠，并且计算结肠重量:长度比作为结肠炎症的标记，这是GVHD的突出临床特征。抗体2.8.6和11.5.1两者均显著减少了体重减轻，导致生存率增加(图9a)并预防了结肠炎症(图9b)。
实施例13：抗体11.5.1的激动剂活性依赖于Fc受体结合。
抗体11.5.1被重组表达为含有D265A突变的mIgG1k，该突变先前已被描述为显著降低Fc受体结合(Clynes等人，Nat Med.，第6卷：第443-446页，2000年)。在实施例8中描述的T细胞转移测定中评估该突变抗体。亲本11.5.1抗体抑制人源化T细胞的增殖，因为其净效应是BTLA受体的激动作用。然而，FcR-无效D265A突变导致人源化T细胞的增殖增强，表明FcR-无效突变去除了抗体的激动作用，仅留下受体阻断的作用(图10a)。
D265A突变的11.5.1抗体也在实施例9中描述的体外MLR测定中评估。同样，亲本11.5.1抗体抑制人源化T细胞的增殖，因为其净效应是BTLA受体的激动作用。FcR-无效D265A突变去除了抗体的激动作用，因此该抗体在该测定中没有显示出作用(图10b)。在该测定中，FcR无效11.5.1抗体不增强人源化细胞的增殖，因为HVEM被阻断(通过添加多克隆抗HVEM抗体)，因此没有基线信号通过被BTLA阻断抗体阻断的途径。
实施例14：抗体2.8.6和11.5.1在体外不固定补体
将来自人源化小鼠的脾细胞与10％幼兔补体(BioRad)和20μg/mL的抗BTLA抗体(或同种型对照或耗尽型抗CD20抗体的阳性对照；克隆SA271G2，来自Biolegend)在37℃下温育15分钟。虽然抗CD20抗体耗尽了大部分B220+B细胞，但抗BTLA抗体不耗尽B220+或CD4+细胞(图11)，即使这两个群体均对BTLA染色呈阳性。
实施例15：抗体2.8.6和11.5.1不在体外诱导ADCC
将来自人源化小鼠的完整脾细胞(包括髓样效应细胞)与20μg/mL的抗BTLA抗体(或同种型对照或耗尽型抗CD20抗体SA271G2)在37℃下温育24小时。虽然抗CD20抗体耗尽了大部分B220+细胞，但抗BTLA抗体不耗尽B220+或CD4+细胞(图12)，即使这两个群体均对BTLA染色呈阳性。
实施例16：抗体2.8.6和11.5.1不耗尽体内表达BTLA的细胞
给人源化BTLA小鼠腹膜内注射200μg抗BTLA抗体或同种型对照。在24小时收获脾，并通过流式细胞术鉴定不同细胞群的频率。抗BTLA抗体对脾中B细胞或T细胞的频率或绝对数量或对骨髓中B细胞前体的数量没有作用(图13)。
实施例17：抗体2.8.6和11.5.1在体内稳定BTLA在免疫细胞上的表达
给人源化小鼠腹膜内注射10mg/kg抗体2.8.6或11.5.1。在注射之后六天，人道处死小鼠，并收获脾并加工成单细胞悬浮液以通过流式细胞术进行评估。细胞用抗体混合物染色以鉴定免疫细胞亚群，并用荧光缀合的抗BTLA抗体染色，该抗BTLA抗体与已注射的抗体具有非竞争性表位。将用抗BTLA抗体体内温育后BTLA染色的几何平均值归一化为用同种型对照温育后BTLA染色的几何平均值(使用相同的染色抗体)。与注射了同种型对照的小鼠相比，注射了克隆2.8.6或11.5.1的小鼠的B细胞和CD4T细胞上的BTLA表达显著更高(图14)。这表明克隆2.8.6和11.5.1在体内稳定BTLA在细胞表面上的表达，而不是诱导受体下调，如在现有技术中其他BTLA抗体所观察到的那样(M.-L.del Rio等人，/Immunobiology，第215卷：第570–578页，2010年)。为了免疫抑制的目的，与下调抗体相比，稳定受体表达的激动剂抗体表现出能够延长通过该途径的高水平抑制信号传导的益处。
实施例18：在动物模型中的耐受性和副作用
在用抗体2.8.6或11.5.1的任何动物研究中没有注意到耐受性问题或副作用。
实施例19：示例性BTLA抗体的表征
在该实施例中描述了除2.8.6和11.5.1外本文提供的示例性mIgG1BTLA抗体的表征。评价表1和表2中列出的各种克隆对BTLA的结合亲和力和淋巴细胞的抑制效率(表3)。
表1：示例性BTLA激动性抗体
Figure BDA0004113379020000931
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Figure BDA0004113379020000941
表2：人源化和工程化抗体
Figure BDA0004113379020000942
对于每种抗体，结合人BTLA的缔合速率(“结合速率”(on rate))和解离速率(“解离速率”(off rate))以及结合人或食蟹猴BTLA的KD根据实施例2中描述的方法测量，拟合以单一浓度注射BTLA胞外结构域的曲线。还在10μg/mL的单一浓度下评价了单个抗体对T细胞的抑制效率。根据实施例9中描述的方法对每个单个抗体进行MLR测定(如表4所示的两次生物重复)；根据下述方法进行抗CD3测定(两次生物重复，表4)；并且根据实施例10中描述的方法测定每种抗体对人BTLA转染的Jurkat T细胞系中NFkB信号传导的抑制(表4)。在各示例性抗体的各种体外刺激测定中，相对于同种型对照，T细胞的平均抑制计算为所有测定结果的百分比抑制的平均值(表3和表4)。
表3：示例性抗体的结合亲和力和抑制作用的表征
Figure BDA0004113379020000951
Figure BDA0004113379020000961
表4：示例性抗体的抑制作用测定结果
Figure BDA0004113379020000962
如下评估BTLA激动剂抗体抑制抗CD3和抗CD28诱导的T细胞活化的能力。将来自人源化BTLA小鼠的脾细胞加工成单细胞悬浮液并用ACK缓冲液处理以裂解红细胞。细胞用CFSE(Biolegend目录号423801)染色以能够跟踪细胞增殖。将2×105个细胞/孔接种于96孔U型底板中，其中可溶性抗CD3抗体(克隆145.2C11；Biolegend目录号100339)和抗CD28(克隆37.51；Biolegend目录号102115)各自浓度为50ng/mL，并且可溶性抗BTLA抗体或同种型对照浓度为10μg/mL。在72小时之后，通过流式细胞术分析细胞，以通过对表面表达的活化标记进行染色来评估增殖(“抗CD3/CD28(CD4T细胞增殖)”)和T细胞活化(“抗CD3/CD28(CD69+CD4T细胞)”)。对于每个BTLA抗体，计算与同种型对照抗体相比的抑制百分比。
此外，对于每种BTLA抗体，根据如实施例4中描述的方法评估它们的配体阻断能力，例如，与HVEM竞争与BTLA的结合，并且对于超过90％的HVEM-BTLA结合抑制，结果呈现为“是”，并且对于小于10％的HVEM-BTLA结合抑制，结果呈现为“否”。每个BTLA抗体的功能性表位也根据实施例5中描述的方法测定。表3中的“表位”列汇总了每个单个BTLA抗体结合的表位组。抗体2.8.6、6.2、831、16H2、7A1、16F10、6G8、3E8、4E8、15C6、12F11、10B1、15B6、4D3、16E1、4D5和3A9均与第一表位(在表中称为“表位1”)结合，第一表位包含选自以下列表的至少一个关键残基：D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO：225的位置)。与表位1结合的抗体不与配体HVEM竞争与BTLA的结合。抗体11.5.1、14D4、1H6、8C4、27G9、26F3均与不同的第二表位(“表位2”)结合，第二表位包含选自以下列表的至少一个关键残基：Y39、K41、R42、Q43、E45和S47。与表位2结合的抗体确实与配体HVEM竞争与BTLA的结合。抗体26B1与第三表位(“表位3”)结合，第三表位包含选自以下列表的至少一个关键残基：D35、T78、K81、S121和L123。与表位3结合的抗体确实与配体HVEM竞争与BTLA的结合。抗体24H7、4B1、8B4、4H4均与不同的第四表位(“表位4”)结合，第四表位包含关键残基H68。与表位4结合的抗体不与配体HVEM竞争与BTLA的结合。抗体21C7与不同的第五表位(“表位5”)结合，第五表位包含选自以下列表的至少一个关键残基：N65和A64。与表位5结合的抗体不与配体HVEM竞争与BTLA的结合。
实施例20：BTLA抗体6.2、2.8.2和3E8的人源化和CDR工程化
抗体2.8.6通过CDR移植到同源人种系框架区(参见SEQ ID NO:26、27)上而人源化。IGHV2-5*08用于重链，并且IGKV3-11*01用于轻链。在人源化之后，通过SPR评估与BTLA的结合。与单体BTLA结合的人源化2.8.6具有0.73nM的KD。
6.2和3E8的可变结构域通过与同源人种系框架区(Seq ID No.7、8和36、37)进行种系化而人源化。对于3E8，选择的受体框架对于重链是VH1-1-08和JH6，并且对于轻链是VK3-L6和JK2。对于6.2，选择的受体框架对于重链是VH3-3-21和JH6，并且对于轻链是VK2-A19和JK4。
有时可能取代抗体的CDR或可变结构域框架区中的某些残基以去除不期望的特征而不显著影响靶结合。人源化抗体6.2的CDRH2用单独的N56Q(SEQ ID NO:17)或N56Q和D54E取代(SEQ ID NO：11)修饰以分别去除脱酰胺可能性和异构化可能性。人源化6.2的CDRL2用D61E取代修饰以降低预测的免疫原性，如通过Lonza’s Epibase分析所测定的(Seq ID NO:12)。在CDR之外，将S77T取代引入人源化6.2的重可变框架区以降低预测的免疫原性，并将Q51K取代引入轻可变框架区以降低免疫原性。产生了含有这些取代的不同组合的人源化6.2的三个工程化变体(工程化人源化6.2“变体A”、“变体B”和“变体C”)。表2描述了这些变体中的每一者的组成CDR和可变结构域。在PCT/GB2019/053569中没有公开含有仅具有N56Q而不具有D54E取代的CDRH2的抗体6.2的工程化变体(例如，工程化人源化6.2变体C)。
类似地，人源化抗体3E8的CDRH2用N57Q取代进行修饰以去除脱酰胺可能性，以及用K63S取代进行修饰以降低预测的免疫原性(Seq ID No.40)。在CDR之外，将G42D和A61S取代引入3E8的轻链可变框架中，以降低预测的免疫原性。此外，将P15L和P81A取代引入轻链可变框架以将这些位置恢复至鼠序列，而不是引入可能对局部构象具有影响的脯氨酸。包含所有四个这些取代的工程化3E8轻链可变结构域的序列在Seq ID No.43中给出。表2描述了人源化3E8的工程化变体的组成CDR和可变结构域。
实施例21：人源化抗BTLA抗体与可溶性人和食蟹猴BTLA的结合
使用Biacore 8K(GE Healthcare)通过表面等离子体共振测定人源化BTLA激动剂抗体与人或食蟹猴BTLA的结合亲和力和动力学。使用人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare目录号29234600)用多克隆抗人IgG包被Series S CM5传感器芯片(GE Healthcare)。然后将抗BTLA抗体捕获到生物传感器表面并将阴性对照抗体(人IgG1k同种型对照；SinoBiological目录号HG1K)捕获到参考通道。然后在37℃下，在单循环动力学分析中，将各种浓度的单体可溶性人BTLA胞外结构域(BTLAK31-R151，内部重组产生)或可溶性食蟹猴BTLA胞外结构域(BTLAK31-R151，内部重组产生)注射到缓冲液HBS-EP(GE Healthcare，目录号BR100669)，pH 7.4(HBS-P)中的固定化抗体上。对于人BTLA，使用673nM至164pM浓度的连续四倍稀释液。对于食蟹猴BTLA，使用1351nM至330pM浓度的连续四倍稀释液。在参考和空白扣除之后，使用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)拟合缔合速率和解离速率，并计算解离常数(表5)。人源化2.8.6以2.33nM的KD结合人BTLA，并且以147nM的KD结合食蟹猴BTLA。人源化3E8变体B(3E8_var_B)以141nM的KD结合人BTLA，并且以1520nM的KD结合食蟹猴BTLA。在其CDRH2中含有D54E和N56Q取代两者以分别去除异构化和脱酰胺可能性的人源化6.2变体A以10.9nM的KD与人BTLA结合并以695nM的KD与食蟹猴BTLA结合。这种结合表示亲本克隆6.2抗体的亲和力显著降低，该抗体以1.7nM的KD与人BTLA结合，并且以9.71nM的KD与食蟹猴BTLA结合(表5)。在CDRH2中仅含有N56Q取代但不含有D54E取代的6.2的人源化变体(称为人源化6.2变体C(或6.2_var_C))以1.25nM的KD结合人BTLA并且以15.4nM的KD结合食蟹猴BTLA，因此保持与亲本克隆更接近的亲和力。
Figure BDA0004113379020000991
表5：抗体与可溶性人或食蟹猴BTLA结合的结合动力学和亲和力，如在37℃下通过 表面等离子体共振所测定的。
实施例22：人源化抗BTLA抗体与细胞上的BTLA的结合
通过流式细胞术评估本发明的BTLA激动剂抗体与细胞表面上表达的人或食蟹猴BTLA结合的能力。慢病毒转染系统用于在Jurkat T细胞系中表达全长人或食蟹猴BTLA。将1×105个细胞/孔接种在96孔U型底板中。BTLA抗体与hIgG1k P238D同种型对照(克隆MOPC-21，通过绝对抗体重组产生；重链SEQ ID NO：230，轻链SEQ ID NO：231)的结合在通过在FACS缓冲液(PBS，2％ FCS，0.05％叠氮化钠)中以1:3连续稀释的十二个浓度下进行评估，从浓度30μg/mL开始。通过添加Fc嵌段(Biolegend目录号101319)防止非特异性抗体结合。将抗体与细胞在冰上温育60分钟，然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，然后用AF647缀合的抗hIgG二抗(克隆HP6017；BioLegend目录号409320)染色。将二抗在冰上温育30分钟，然后洗涤细胞并再悬浮于FACS缓冲液中以在流式细胞仪上进行分析。绘制每种浓度的二抗的几何平均荧光强度，并使用GraphPad Prism软件通过非线性曲线拟合计算受体结合的EC50。人源化2.8.6与EC50为0.066nM的表达人BTLA的细胞(图15a)和EC50为0.854nM的表达食蟹猴BTLA的细胞结合(图15b)。人源化6.2_var_C与EC50为0.062nM的表达人BTLA的细胞和EC50为0.148nM的表达食蟹猴BTLA的细胞结合。人源化3E8_var_B与EC50为0.177nM的表达人BTLA的细胞和EC50为15.6nM的表达食蟹猴BTLA的细胞结合。
实施例23：Fc变体抗体对人Fc受体的结合亲和力
在实施例13中，令人惊奇地证明BTLA抗体的激动剂功能可能依赖于抗体的Fc部分的Fc受体接合。在人体中存在一种抑制性Fcγ受体(FcγR2B)，而其他Fcγ受体(FcγR1A、FcγR2A、FcγR3A和FcγR3B)都在传递免疫活化信号。为了使BTLA激动剂抗体有效抑制免疫应答而不引发炎性FcR信号传导，我们提出可能需要选择性Fc与FcγR2B结合。此外，与FcγR2B选择性结合将促进通过BTLA表达细胞上的BTLA和通过FcγR2B表达细胞上的FcγR2B的双向抑制性信号传导，这将增强抗体的免疫抑制作用。这将是旨在用于治疗免疫过度活化疾病的治疗性抗体中所期望的。相反，对FcγR2B的极高亲和力可能会由于受体在肝窦上皮细胞中的代谢周转而对抗体半衰期产生不利影响(Ganesan等人，The Journal ofImmunology，第189卷第10期：第4981-4988页，2012年)，如FcγR2B增强的IgG1抗体XmAb7195所示，该抗体以7.74nM的KD与FcγR2B结合(Chu等人，Journal of Allergy andClinical Immunology，第129卷第4期：第1102-1115页，2012年；https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0091674911018343(2020年5月13日)，并且据Xencor报道，与野生型IgG1的平均半衰期为约21天相比(Morell，Terry和Waldmann.，Journal of Clinical Investigation，第49卷第4期：第673-680页，1970年；http://www.jci.org/articles/view/106279(2020年5月16日))，在1a期试验中，该抗体的平均体内半衰期为3.9天(美国胸腔学会(ATS)，2016年加利福尼亚州旧金山国际会议-A6476：展板编号407)。因此，虽然对FcγR2B的选择性以及与支持激动剂的充分结合对于BTLA激动剂抗体来说可能是期望的，但FcγR2B的过高亲和力在治疗中可能是不期望的，因为由此缩短的半衰期将可能需要更频繁的给药。
重组产生一系列Fc突变的抗体变体(含有人源化2.8.6的可变结构域)，并且通过表面等离子体共振评估它们与不同人Fcγ受体的结合(在37℃下，在缓冲液HBS-EP+中，pH7.4)。Fc变体在hIgG1或hIgG4主链上重组产生，具有已知影响FcR结合或基于它们在Fc-FcR结合界面中的位置可能影响FcR结合的取代(hIgG1G236D、hIgG1G237D、hIgG1P238D、hIgG1D265A、hIgG1S267E、hIgG1P271G、hIgG1A330R、hIgG1K322A、hIgG1N297A、hIgG4P238D、hIgG4G237D、hIgG4P271G、hIgG4S330R、hIgG4F234A、hIgG4L235A)。这些突变被评估为单一取代或组合。也评估了Armour等人描述的包含从hIgG2转换的序列片段的变体(MolecularImmunology，第40期第9卷：第585–93页，2003年)(称为δb、δc、δab和δac)。还评估了mIgG1和mIgG1D265A与人FcR的结合。
对于低亲和力FcγR(FcγR2A、FcγR2B、FcγR3A和FcγR3B)，使用重组表达的FcR(仅胞外结构域)作为分析物通过表面等离子体共振评估相互作用。简言之，使用GEHealthcare Amine偶联试剂盒将重组人BTLA胞外结构域(BTLAK31-R151)共价固定到CM5系列S传感器芯片的所有通道的两个流动细胞上。然后在每个通道的流动池2中捕获待评估的2.8.6Fc变体(约500至1000个应答单位)。然后通过在多个循环中注射不同浓度的FcR并测量平衡结合来进行稳态亲和力分析。使用双参考(减去参考Fc1中的信号并且还减去来自空白零浓度注射的信号)。根据Langmuir曲线计算KD(绘制平衡结合对分析物浓度的曲线以确定半数最大结合所需的浓度)。
对于高亲和力FcR相互作用(FcγR1A，以及也在pH6.0评估的FcRn)，以抗体作为分析物在动力学分析中评估结合。简言之，根据所提供的方案，将生物素酰化的FcR(SinoBiological，对于FcγR1A的目录号10256-H08S-B或对于FcRn的目录号CT009-H08H-B)捕获在链霉亲和素芯片(系列S传感器芯片SA-BR-1005-31)上的流动池2中。参考流动池1在所有通道中是空的。然后以单一浓度注射纯化的抗体，并且通过在BiaEvaluation软件上进行曲线拟合来计算缔合/解离速率。pH6.0下的FcRn相互作用不引起炎性信号转导，但是维持体内抗体半衰期所必需的，因此这种相互作用是治疗性抗体所期望的。IgG Fc具有两个FcRn结合位点，因此用高密度固定的FcRn进行的这种评估提供了相互作用的亲合力估计而不是真正的KD。
评估的Fc变体中的每一者与人Fc受体中的每一者结合的KD值提供在表6中。P238D突变的存在显著增强了对FcγR2B的选择性(通过略微增加对FcγR2B的亲和力，同时急剧降低对其他FcγR的亲和力)。先前描述的包括P238D(P238D G237D P271G A330R)的突变组合，称为V9(Mimoto等人，Protein Engineering，Design and Selection，第26卷第10期：第589-598页，2013年)，显著增加了对FcγR2B的结合亲和性，但也保留了对FcγR2A的131R多态性变体的显著结合。当将P238D单一或组合取代引入hIgG4主链中时，观察到增加FcγR2B选择性的相同作用。
Figure BDA0004113379020001021
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Figure BDA0004113379020001031
表6：在37℃下，通过SPR评估的Fc变体与人FcR结合的亲和力(KD)。n/a＝未评估， NB＝未检测到结合。
实施例24：在NFkB报告基因测定中人源化BTLA激动剂对T细胞活化的抑制依赖于 Fc受体结合。
BTLA是在T细胞上表达的抑制性受体，因此可预期针对BTLA的激动剂抗体通过诱导通过受体的抑制性信号转导来抑制T细胞活化。使用BTLA转染的报告基因T细胞系评估选择的人源化BTLA激动剂抗体抑制T细胞活化的能力。用包括最小CMV启动子(mCMV)-GFP盒上游的NF-κB应答转录元件(Source BioSciences目录号TR850A-1)的表达盒稳定转染的Jurkat T细胞系用作NFkB信号转导的报告基因细胞系。慢病毒转染系统用于在该报告基因细胞系中表达全长人BTLA。将这些细胞与由在其表面表达抗CD3scFv构建体的bw5147细胞组成的刺激细胞系混合，如描述于Leitner等人(J Immunol Methods，第362卷第1-2期：第131-141页，2010年)。刺激细胞系也用人FcγR2B转染以提供用于递呈激动剂BTLA抗体的Fc受体。在各种浓度的BTLA抗体或hIgG1k同种型对照抗体(Sino Biologicals目录号HG1K)的存在下，将5×104个报告基因细胞/孔与5×104个刺激细胞/孔在96孔U型底板中混合。在37℃下温育24小时之后，将细胞沉淀并用活力染料(Zombie Aqua，Biolegend目录号423101)和小鼠CD45抗体(Pe-Cy7缀合的克隆104，Biolegend目录号109830)染色用于流式细胞术，以将刺激(鼠)细胞与应答(人)细胞分开。评估每种抗体浓度的GFP表达的几何平均值，并归一化为在抗体的不存在下的GFP表达。
在hIgG4同种型以及hIgG1P238D同种型和hIgG1V9(P238D G237D P271G A330R)同种型上测试人源化2.8.6。2.8.6hIgG1P238D导致比2.8.6hIgG4更有效地抑制NFkB信号传导，并且2.8.6hIgG1V9仍导致更有效地抑制(图15a)。因此，在FcγR2B是唯一存在的Fc受体的条件下，增加对FcγR2B的亲和力赋予BTLA激动剂抗体的优异的激动活性。当在其中刺激细胞不表达FcγR2B的测定的改进版本中测试相同抗体时，没有观察到任何抗体的抑制作用，证实了BTLA的抗体激动作用依赖于抗体的FcR接合(图15b)。在报告基因测定中，当人FcγR2B在刺激细胞上表达时，2.8.6、6.2和3E8的小鼠IgG1亲本抗体也能够抑制T细胞活化，这与实施例23中观察到的mIgG1和hFcγR2B之间的交叉反应性拟合。
人源化2.8.6、6.2_var_C和3E8_var_B均在hIgG1P238D同种型上产生，并在上述T细胞报告基因测定中进行比较。还将它们与如WO2018/213113中描述的现有技术BTLA激动剂22B3(在hIgG4PAA同种型上表达)和与mIgG1Fc区融合的天然BTLA配体HVEM的融合蛋白(hHVEM-mFc，内部重组产生；包含信号肽和C-末端His-标签的hHVEM-mFc融合蛋白具有公开于SEQ ID NO:229的序列)进行了比较。所有三种人源化P238D变体抗体证明与22B3或hHVEM-mFc相比对NFkB信号的显著更大抑制(图16a)。3E8_var_B抑制NFkB信号达54％，其中IC50为65pM。6.2_var_C抑制NFkB信号达47％，其中IC50为28pM。2.8.6抑制达42％，其中IC50为59pM。22B3抑制NFkB信号达18％，其中IC50为3.8nM。hHVEM-mFc抑制NFkB信号达27％，其中IC50为9.6nM。因此，在FcγR2B是唯一存在Fc受体的情况下，人源化2.8.6hIgG1P238D、6.2_var_C hIgG1P238和3E8hIgG1P238D均是比现有技术抗体22B3hIgG4PAA显著更有效和强效的BTLA激动剂，并且比作为Fc融合蛋白质的内源性配体HVEM递送更强的信号。
实施例25：在混合淋巴细胞反应中人源化BTLA激动剂对原代人T细胞增殖的抑制
在混合淋巴细胞反应(MLR)的背景下评估选择的BTLA激动剂抗体抑制人T细胞增殖的能力。简言之，使用人Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec目录号130-096-535)从健康供体外周血单核细胞(PBMC)中分离人原代T细胞，并用细胞增殖示踪染料Tag-itViolet(Biolegend目录号425101)染色。通过培养使用CD14+分离试剂盒(Miltenyi Biotec目录号130-050-201)从PBMC分离的CD14+单核细胞来产生同种异体单核细胞衍生的树突细胞(DC)。用人重组IL-4(Peprotech目录号200-04)和GM-CSF(Biolegend目录号572904)处理CD14+单核细胞7天。然后通过添加人重组TNF-α(Biolegend目录号717904)另外2天来诱导DC成熟。成熟树突细胞表达活化和抑制FcγR两者(Guilliams等人，Nature ReviewsImmunology，第14卷第2期：第94-108页，2014年，http://www.nature.com/articles/nri3582(2020年5月18日))。
然后通过在平底96孔板中以4∶1(T∶DC)的比例共培养1×105个总T细胞与同种异体成熟DC来进行MLR。将T细胞和DC在无抗体或在不同剂量的BTLA激动剂抗体(2.8.6hIgG1P238D、2.8.6hIgG1V9、2.8.6IgG4)、hIgG1k同种型对照抗体(SinoBiologicals目录号HG1K)或现有技术BTLA激动剂22B3hIgG4PAA的存在下温育5天。在5天之后，通过流式细胞术评价T细胞增殖。收获T细胞，并用抗CD3抗体(PerCP/Cy5.5缀合的克隆OKT3，Biolegend目录号317336)、抗CD4抗体(BB515缀合的克隆RPA-T4，BD Horizon目录号564419)、抗CD8抗体(BV510缀合的克隆SK1，BD Horizon目录号563919)连同活力染料(Zombie NIR，Biolegend目录号423105)染色，并在BD FACSCelesta仪器上采集。将在抗体的存在下的CD4增殖(测量为CTV低细胞的百分比)归一化为在抗体的不存在下的平均增殖。图17显示了从6个单独的MLR与不同PBMC供体组合的数据。hIgG1P238D同种型上的抗体2.8.6显著抑制了CD4T细胞增殖，其中在10μg/mL下具有51％的平均抑制作用。hIgG1V9同种型或hIgG4同种型上的抗体2.8.6没有抑制作用。因此，出乎意料地，在存在多种Fc受体的条件下，与FcγR2B选择性结合的hIgG1P238D同种型赋予BTLA激动剂比测试的其他同种型更优异的激动活性。hIgG1V9同种型结合FcγR2B的亲和力比P238D同种型高约30倍，在这种情况下的无效性可能是由于通过FcγR2A(131R)的活化信号传导，其也保留了显著结合。另选地，hIgG1V9同种型的无效性可能是由于抗体、BTLA和FcγR2B之间在相同细胞表面上(例如在表达两种受体的树突细胞上)的顺式相互作用的稳定形成，其可能不诱导信号转导但将阻断抗体、BTLA和FcγR2B之间在不同细胞上的生产性反式相互作用的形成。P238D同种型对FcγR2B的较低亲和力可能意味着如果形成这些顺式相互作用，则它们寿命较短并且不完全阻断反式相互作用。
22B3hIgG4PAA在混合淋巴细胞反应中也没有抑制作用，并且事实上趋向于增加CD4T细胞的增殖，这可通过抗体通过干扰其与配体HVEM的相互作用而阻断通过BTLA的天然抑制信号传导来解释。抗体6.2、3E8和286与BTLA上不与HVEM结合界面重叠的表位结合，因此这些抗体不阻断BTLA-HVEM相互作用(实施例19)。
实施例26：BTLA激动剂对原代人B细胞活化的抑制
评价BTLA激动剂抗体抑制原代人B细胞活化的能力。B细胞表达高水平的BTLA和FcγR2B。
使用人B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec目录号130-050-301)从健康供体外周血单核细胞中分离人原代B细胞，并用细胞增殖示踪染料Tag-it VioletTM(Biolegend目录号425101)染色。
然后在不同剂量的同种型对照抗体或选定的BTLA激动剂抗体的存在或不存在下，用0.01μM的TLR9激动剂ODN2006(InvivoGen目录号tlrl-2006-1)刺激96孔平底板的1×105个B细胞/孔。测试BTLA激动剂2.8.6、6.2_var_C和3E8_var_B(所有hIgG1P238D同种型)并与现有技术的BTLA激动剂22B3hIgG4PAA比较。使用重组HVEM融合蛋白(hHHEM-mFc，内部生产)作为阳性对照。在37℃下温育5天之后，收获B细胞并用抗CD20抗体(PE-CF594缀合的克隆2H7，BD Horizon目录号562295)与活力染料(Zombie NIR，Biolegend目录号423105)，以通过流式细胞术评价它们的增殖。此外，收集培养上清液以通过ELISA评估IL-6(rndsystems目录号DY206)和IL-10(rndsystems目录号DY217B)的产生。
按照基本上如上所述的程序，BTLA激动剂抗体能够与hHVEM-mFc阳性对照一样有效地抑制B细胞增殖。此外，与22B3相比，所有三种抗体变体都表现出对B细胞增殖的更加显著抑制。此外，P238D BTLA激动剂削弱活化的B细胞产生IL-10(图18)和IL-6。与增殖数据一致，与22B3抗体相比，P238D BTLA抗体抑制IL-10和IL-6产生的能力更大。
实施例27：移植物抗宿主病(GVHD)的异种模型的处理
在体内确定了人PBMC驱动的移植物抗宿主病(GvHD)的预防。
简言之，雌性NSG小鼠(JAX Labs，品种号05557)，大约8-10周龄(每个治疗组n＝10只小鼠)接受2.4Gy全身辐射。从leukopak(经由Tissue Solutions订购的HemaCare产品)分离人外周血单核细胞(PBMC)，并以50×106个细胞/mL的PBS重悬。在辐照之后1天通过尾部注射给小鼠静脉内(IV)注射200μL细胞悬浮液(10×106个PBMC)。第二天，通过腹膜内注射10mg/kg测试抗体处理小鼠。对小鼠进行定期称重，当其体重减轻15％时或28天之后处以安乐死。在研究终止时，使用hCD45、hCD4、hCD8、hCD20、hCD25和FOXP3的标记通过流式细胞术定量人PBMC向肺、肝和脾中的浸润。
按照如上所述的程序，与hIgG1P238D同种型对照相比，人源化2.8.6hIgG1P238D、6.2_var_C hIgG1P238D和3E8_var_B hIgG1P238D都显著降低了体重减轻(图19)，并导致肺、肝和脾中浸润人免疫细胞的显著降低。使用所有三种BTLA激动剂也观察到调节性T细胞的频率增加的趋势。
实施例28：P238D突变的hIgG1抗体在食蟹猴中的体内半衰期和人半衰期的预测
评价了食蟹猴中6.2_var_C对hIgG1P238D同种型的体内半衰期。给2只雌性食蟹猴静脉注射3mg/kg抗体，并且给2只雌性食蟹猴注射10mg/kg抗体。在注射抗体之前以及在注射抗体之后1小时、6小时、24小时、48小时、72小时、168小时、240小时、336小时、432小时和504小时对食蟹猴取血。通过靶捕获ELISA评估在这些时间点的每一者的血清中6.2_var_C的浓度。将96孔微板(Thermoscientific目录号439454)在4℃下用100μL人BTLA胞外结构域以1μg/mL PBS中包被过夜。然后用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS(ThermoScientific目录号28320))洗涤该板3次，并用300μL SuperBlock缓冲液(Thermoscientific目录号37515)在室温下封闭孔1小时，然后再用洗涤缓冲液洗涤3次。然后加入在ELISA缓冲液(PBS，1％牛血清白蛋白，0.05％吐温20)中稀释的100μL血清样品，并在室温下温育1小时。在ELISA缓冲液中已知浓度的6.2_var_C的11点标准曲线一式两份地进行，并且仅含有ELISA缓冲液的一式两份孔用作空白。温育后，用洗涤缓冲液洗涤孔3次，然后加入在ELISA缓冲液中以1∶20,000稀释的HRP缀合的抗人检测抗体(Abcam目录号ab98624)，并在室温下温育1小时。孔再次用洗涤缓冲液洗涤3次，然后每孔加入100μL的Ultra TMB-ELISA底物溶液(ThermoScientific目录号34028)。用铝箔覆盖培养90秒以确保板不在直射光下，然后每孔加入50μL停止液(ThermoScientific目录号SS04)。然后在Thermo MultiSkan FC上读取450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism软件来自标准曲线内插的浓度。
使用每个时间点的血清抗体浓度，用2-腔室模型拟合每个猴的药代动力学(Dirks等人，Clin.Pharmacokinet，第49卷第10期：第633-659页，2010年)。食蟹猴的平均终末半衰期计算为5.4天(130小时)。模型参数(分布体积V1和V2、清除率Cl和室间交换系数Q)随后使用等位标度法按人体比例缩放。用异速缩放法，从另一个物种parameter1的体重BW1中估计出一个物种parameter2的体重BW2，公式如下：
Figure BDA0004113379020001091
其中β是给定参数的缩放系数。该方法已被充分记录，并已被证明可从临床前物种(Dong等人，Clin Pharmacokinet，第50卷第2期：第131-142页，2011年)和(Wang等人Biopharmaceutics&drug disposition，第31卷：第253-263页，2010年)中提供了足够的人预测。
对于人，假设体重为70kg。对于食蟹猴，使用3kg的参考体重。使用大分子的理论缩放指数：对于V1和V2，β＝1，对于Cl，β＝0.75(如以下中所述：Kleiber等人，Hilgardia，第6卷第11期：第315-333页，1932年)并且对于Q，β＝2/3。对于隔室间交换系数Q的缩放，假设化合物的交换速率取决于血管内皮的表面积。该假设是基于隔室间交换的具体实施，其被写为：
Q·(cp-ct)＝P·S·(cp-ct)
其中cp-ct是跨血管边界的浓度差，P是以m/s为单位的血管渗透系数，并且S是以m2为单位的交换所涉及的脉管系统的表面积。假设血管通透性P是分子的性质，并且其与物种无关。物种之间的唯一差异是血管表面，其以2/3的系数与体重成比例。利用这些参数，假设的缩放值Q是2/3。
然后使用2-腔室模型从缩放的参数计算预测的人终末半衰期。人的平均预测半衰期计算为12.5天(300小时)。
本发明的某些实施方案。
1.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含与缺乏取代的亲本分子相比导致与FcγR2B的结合增加的所述取代。
2.根据实施方案1所述的抗体，其中与缺乏所述取代的亲本分子相比，所述抗体对结合FcγR2B的选择性优于对结合FcγR2A的选择性。
3.根据实施方案1或2所述的抗体，其中所述抗体具有：
(i)与亲本多肽相比，增强的FcγR2B结合活性并且保持或降低对FcγR2A(R型)和/或FcγR2A(H型)的结合活性；并且/或者
(ii)[多肽变体对FcγR2A(R型)的KD值]/[多肽变体对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10或更大；并且/或者
(iii)[多肽变体对FcγR2A(H型)的KD值]/[多肽变体对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10或更大；并且/或者
(iv)与亲本多肽相比，增强的FcγR2B结合活性并且保持或降低的对FcγR1A的结合活性；并且/或者
(v)[多肽变体对FcγR1A的KD值]/[多肽变体对FcγR2B的KD值]的值为2或更大，诸如3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合选
自以下的人BTLA的残基：
(i)D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92(根据SEQ ID NO:225的位置)；或者
(ii)Y39、K41、R42、Q43、E45和S47；或者
(iii)D35、T78、K81、S121和L123；或者
(iv)H68；或者
(v)N65和A64；
其中每个位置与公开于SEQ ID NO:225的氨基酸序列相关。
5.一种抗体，所述抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)或位置297处的丙氨酸(A)(编号均根据EU索引)。
6.根据实施方案5所述的抗体，其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
7.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体是激动性抗体。
8.根据实施方案6所述的抗体，其中所述抗体相对于可比较对照抗体以更高的亲和力与FcγR2B结合，所述可比较对照抗体包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
9.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以约5μM至0.1μM的亲和力与FcγR2B结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
10.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以至多5μM的亲和力与FcγR2B结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
11.根据实施方案6至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体相对于可比较对照抗体以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131R同种异型)结合，所述可比较对照抗体包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
12.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以至少20μM的KD与FcγR2A(131R同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
13.根据实施方案6至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体相对于可比较对照抗体以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131H同种异型)结合，所述可比较对照抗体包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸。
14.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以至少50μM的KD与FcγR2A(131H同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
15.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人免疫细胞表面上表达的人BTLA表现出增强的激动作用，如通过选自以下的BTLA激动剂测定所测量的：诸如实施例24中描述的T细胞活化测定、诸如实施例25中描述的混合淋巴细胞反应，或者诸如实施例26中描述的B细胞活化测定。
16.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合人BTLA，其中所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链包含Fc区和重链可变区，所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3；其中(1)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者(2)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者(3)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且其中Fc区在位置238处包含天冬氨酸(EU索引)。
17.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中(1)所述重链包含重链可变区和Fc区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；或者(2)所述重链包含重链可变区和Fc区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；或者(3)所述重链包含重链可变区和Fc区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。
18.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合人BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中(1)所述重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且所述轻链包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；(2)所述重链包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且所述轻链包含如SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；或者(3)所述重链包含如SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且所述轻链包含如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；并且其中对于(1)、(2)和(3)中的每一者，所述重链包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
19.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
20.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体选自由以下项组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。
21.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体是单克隆的。
22.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体激动在免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA，其中所述免疫细胞任选地是T细胞。
23.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体与免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA的结合相对于未被所述抗体结合的可比较免疫细胞降低了所述细胞的增殖，并且其中所述细胞任选地是T细胞。
24.根据实施方案23所述的抗体，其中细胞增殖的所述降低为至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。
25.根据实施方案23所述的抗体，其中细胞增殖的所述降低为约10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、10％至15％、20％至50％、20％至40％或20％至30％。
26.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与Fc受体结合的结构域。
27.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述Fc受体在免疫细胞的所述表面上表达。
28.根据实施方案27所述的抗体，其中所述免疫细胞是抗原递呈细胞。
29.根据实施方案28所述的抗体，其中所述抗原递呈细胞是树突细胞、巨噬细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞。
30.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体与在T细胞的所述表面上表达的人BTLA结合。
31.根据实施方案26至30中任一项所述的抗体，其中所述Fc受体是FcγR2B。
32.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体与免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA的结合相对于未被所述抗体结合的可比较免疫细胞降低了所述免疫细胞的NFκB信号传导，并且其中所述免疫细胞任选地是T细胞。
33.根据实施方案32所述的抗体，其中所述免疫细胞的NFκB信号传导的所述降低通过实施例10中描述的测定来测量。
33.根据实施方案32或33所述的抗体，其中所述免疫细胞的NFκB信号转导的所述降低为至少约10％、15％、20％、25％、30％或40％。
34.根据实施方案32或33所述的抗体，其中所述免疫细胞的NFκB信号转导的所述降低为约10％至40％、10％至30％、10％至20％、20％至40％或20％至30％。
35.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体与在免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA的结合降低了所述人BTLA的细胞质结构域的去磷酸化。
36.根据实施方案35所述的抗体，其中所述去磷酸化由所述免疫细胞的所述表面上表达的CD45介导。
37.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于10nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如各自在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的，并且其中所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的；不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
38.根据实施方案37所述的抗体，其中所述抗体以在37℃下至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)。
39.根据实施方案37或38所述的抗体，其中所述抗体以在37℃下小于3.0×10-4(1/s)的解离速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)。
40.根据实施方案37至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体以3.0×10-4(1/s)至1.0×10-3(1/s)的解离速率结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)。
41.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的，其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且其中所述抗体在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
42.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于10nM的KD结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
43.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
44.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以3.0×10-4(1/Ms)至1.0×10-3(1/Ms)的解离速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且其中所述抗体在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
45.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于1.0×10-3(1/Ms)的解离速率和至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如各自在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且其中所述抗体在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
46.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于2nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的，其中所述抗体抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
47.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，其中所述抗体以至少5nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的；并且其中所述抗体抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
48.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，其中所述抗体以至少50nM的KD结合食蟹猴BTLA，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的；并且其中所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
49.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体在人体内具有至少7天的体内半衰期。
50.一种核酸，所述核酸包含编码能够形成根据实施方案1至49中任一项所述的抗体的多肽的一个或多个核苷酸序列。
51.一种表达载体，所述表达载体包含根据实施方案50所述的核酸分子。
52.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案50或51所述的核酸序列。
53.一种产生结合BTLA的抗体(或BTLA结合分子)的方法，所述方法包括在产生所述抗体的条件下培养根据实施方案52所述的宿主细胞的步骤，任选地进一步包括分离和/或纯化所述抗体。
54.一种用于制备特异性结合BTLA的人抗体(或BTLA结合分子)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含一种或多种核酸分子的宿主细胞，所述一种或多种核酸分子编码重链和轻链的氨基酸序列，所述一种或多种核酸分子在表达时能够组合以产生根据实施方案1至49中任一项所述的抗体；
(ii)培养表达所编码的氨基酸序列的所述宿主细胞；以及
(iii)分离所述抗体。
55.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据实施方案1至49中任一项所述的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
56.根据实施方案1至49中任一项所述的抗体或根据实施方案55所述的药物组合物，其用于治疗。
57.根据实施方案1至49中任一项所述的抗体或根据实施方案55所述的药物组合物，其用于治疗或预防炎性或自身免疫疾病，以及过度免疫细胞增殖的障碍。
58.根据实施方案56所述使用的抗体，其中所述炎性或自身免疫疾病选自艾迪生病、过敏反应、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、哮喘(包括变应性哮喘)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫多内分泌腺病综合征、白塞病、大疱性类天疱疮、脑性疟疾、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、乳糜泻、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬变)、幼年性关节炎、川崎病、白血病、淋巴瘤、淋巴增生性障碍、多发性硬化、重症肌无力、骨髓瘤、视神经脊髓炎、天疱疮、多肌炎、原发性胆道胆管炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿关节炎、结节病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、移植排斥、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-小柳原田病。
59.根据实施方案57所述使用的抗体，其中所述过度免疫细胞增殖的障碍选自淋巴瘤、白血病、系统性肥大细胞增生症、骨髓瘤或淋巴增生性障碍。
60.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，所述分离抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中(i)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；并且其中所述重链包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
61.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，并且其中所述重链包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
62.根据实施方案61所述的分离抗体，其中所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。
63.根据实施方案60至62中任一项所述的分离抗体，其中所述重链包含如SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
64.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合人BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列；并且其中所述重链包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
65.根据实施方案64所述的分离抗体，其中所述重链包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
66.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合人BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，CDRH2具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，并且CDRH3具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ IDNO:35所示的氨基酸序列；并且其中所述重链包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
67.根据实施方案66所述的分离抗体，其中所述重链包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
68.根据实施方案60至67或82至84中任一项所述的抗体，所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
69.根据实施方案60至68或82至84中任一项所述的抗体，所述抗体选自由以下项组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。
70.根据实施方案60至69或82至84中任一项所述的抗体，所述抗体是抗原结合片段部分，所述抗原结合片段部分选自由以下项组成的组：scFv、sc(Fv)2、dsFv、Fab、Fab'、(Fab')2和双抗体。
71.根据实施方案60至70或82至84中任一项所述的抗体，所述抗体是单克隆的。
72.根据实施方案60至71或82至84中任一项所述的抗体，其中所述抗体激动在免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA，其中所述免疫细胞任选地是T细胞。
73.根据实施方案60至72或82至84中任一项所述的抗体，其中所述抗体与免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA的结合相对于未被所述抗体结合的可比较免疫细胞降低了所述细胞的增殖，并且其中所述细胞任选地是T细胞。
74.一种分离核酸，所述分离核酸包含编码能够形成根据实施方案60至73或82至84中任一项所述的抗体的多肽的一个或多个核苷酸序列。
75.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案74所述的核酸序列。
76.一种产生结合BTLA的抗体的方法，所述方法包括在产生所述抗体的条件下培养根据实施方案75所述的宿主细胞的步骤，任选地进一步包括分离和/或纯化所述抗体。
77.一种用于制备特异性结合BTLA的人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供包含一种或多种核酸分子的宿主细胞，所述一种或多种核酸分子编码重链和轻链的氨基酸序列，所述一种或多种核酸分子在表达时能够组合以产生根据实施方案60至73或82至84中任一项所述的抗体；
ii)培养表达所编码的氨基酸序列的所述宿主细胞；以及
iii)分离所述抗体。
78.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据实施方案60至73或82至84中任一项所述的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
79.根据实施方案60至73或82至84中任一项所述的抗体或根据实施方案78所述的药物组合物，其用于治疗。
80.根据实施方案60至73或82至84中任一项所述的抗体或根据实施方案78所述的药物组合物，其用于治疗或预防炎性或自身免疫疾病，以及过度免疫细胞增殖的障碍。
81.根据权利要求80所述使用的抗体，其中所述炎性或自身免疫疾病选自艾迪生病、过敏反应、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、哮喘(包括变应性哮喘)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫多内分泌腺病综合征、白塞病、大疱性类天疱疮、脑性疟疾、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、乳糜泻、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬变)、幼年性关节炎、川崎病、白血病、淋巴瘤、淋巴增生性障碍、多发性硬化、重症肌无力、骨髓瘤、视神经脊髓炎、天疱疮、多肌炎、原发性胆道胆管炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿关节炎、结节病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、移植排斥、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-小柳原田病。
82.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中(1)所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。
83.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中(1)所述重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且轻链包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。
84.一种分离的人抗体，所述分离的人抗体特异性结合B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，所述分离的人抗体包含重链和轻链，其中
(a)所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQID NO:12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；并且/或者
(b)所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；并且/或者
(c)所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；
任选地其中所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
序列：
表7：示例性CDR序列
Figure BDA0004113379020001231
/>
Figure BDA0004113379020001241
表8：示例性VH和VL序列
Figure BDA0004113379020001242
/>
Figure BDA0004113379020001251
/>
Figure BDA0004113379020001261
/>
Figure BDA0004113379020001271
/>
Figure BDA0004113379020001281
/>
Figure BDA0004113379020001291
表9：示例性重链和轻链序列
Figure BDA0004113379020001292
/>
Figure BDA0004113379020001301
/>
Figure BDA0004113379020001311
SEQ ID NO：225人(智人)BTLA多肽。位置1-30是信号序列，位置31-151是胞外区，位置152-178是跨膜区，并且位置179至末端是胞内区。
Figure BDA0004113379020001312
SEQ ID NO：226食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))BTLA多肽。
Figure BDA0004113379020001313
SEQ ID NO:227具有238D的hIgG1恒定区
Figure BDA0004113379020001321
SEQ ID NO:228 hkappa恒定区
Figure BDA0004113379020001322
SEQ ID NO：229hHVEM-mFc融合蛋白(包括信号肽和C末端His标签)
Figure BDA0004113379020001323
SEQ ID NO:230 Mopc21 hIgG1 P238D同种型对照重链
Figure BDA0004113379020001324
Figure BDA0004113379020001331
SEQ ID NO:231 Mopc21 hIgG1 P238D同种型对照轻链
Figure BDA0004113379020001332
SEQ ID NO:232
Figure BDA0004113379020001333
SEQ ID NO:233
Figure BDA0004113379020001334
SEQ ID NO:234
Figure BDA0004113379020001335
SEQ ID NO:235—含有P238D以及S228P取代的参考IgG4恒定序列。
Figure BDA0004113379020001336
/>
序列表
<110> 牛津大学创新有限公司（Oxford University Innovation Limited）
米罗生物有限公司（MIROBIO LIMITED）
<120> BTLA抗体
<130> P300188WO
<150> GB2008860.5
<151> 2020-06-11
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<170> PatentIn版本3.5
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<213> 人工序列
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Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<213> 人工序列
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Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
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Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用N56Q和D54E取代修饰的人源化抗体6.2的CDRH2
<400> 11
Ser Ile Arg Ser Glu Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
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<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用D61E取代修饰的人源化6.2的CDRL2
<400> 12
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Glu Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Glu Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 17
Ser Ile Arg Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 20
Thr Tyr Gly Val His
1 5
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 21
Val Met Trp Pro Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 22
Gly Asp Tyr Glu Tyr Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 23
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 24
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 25
His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 26
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Pro Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
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Arg Gly Asp Tyr Glu Tyr Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 28
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Pro Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 29
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 30
Ser Tyr Ala Ile Arg
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 31
Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 32
Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 33
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 34
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
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Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
1 5
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Arg Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 37
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Pro Leu
35 40 45
Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Arg Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 39
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Pro Leu
35 40 45
Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro
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Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR
<400> 40
Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Arg Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Arg Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 43
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 43
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Arg Pro Leu
35 40 45
Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
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Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
<400> 44
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Arg Pro Leu
35 40 45
Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
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<211> 5
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<213> 人工序列
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<400> 49
000
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<400> 50
000
<210> 51
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<220>
<223> VH
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 52
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<220>
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<220>
<223> VH
<400> 59
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Trp Arg Gln Leu Arg Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 61
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 62
Met Ile His Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 63
Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 64
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ile His
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 65
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
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<220>
<223> CDRL3
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His Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 67
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Arg Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys
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Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
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<223> VL
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20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
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<213> 人工序列
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<223> VL
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<400> 120
Gly Gly Tyr Asp Ser Asp Trp Gly Phe Ala Tyr
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 121
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Phe
1 5 10 15
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 122
Arg Met Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 123
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 123
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
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<223> VH
<400> 124
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<223> VL
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Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Asn Thr Phe Leu Phe Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln His
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100 105 110
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Gly
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<223> VL
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<223> VH
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<223> VL
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
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<220>
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<223> VL
<400> 174
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<223> VH
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<223> CDRL3
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<220>
<223> VH
<400> 179
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 180
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 181
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1 5
<210> 182
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 182
Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 183
Ser Asn Trp Asn Phe Asp Tyr
1 5
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 184
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 185
Trp Ala Ser Thr Arg Arg Thr
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
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1 5
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 187
Gln Asp Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Asn Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 188
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Arg Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 190
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1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 192
Arg Ile Ser Ser Gly Ser Gly Val Asp Tyr
1 5 10
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<213> 人工序列
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<400> 193
Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 194
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ile Ser Ser Gly Ser Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 195
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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<213> 人工序列
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<223> CDRH3
<400> 198
Gly Thr Pro Val Val Ala Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr
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<213> 人工序列
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<223> CDRL1
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Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
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<213> 人工序列
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<400> 200
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1 5
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<400> 201
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 202
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp His Trp Ile Arg His Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr His Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Thr Pro Val Val Ala Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 203
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Ser Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Ala Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 204
Ser Ala Tyr Trp Asn
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 205
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
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<213> 人工序列
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Ser His Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 15
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<213> 人工序列
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Arg Ala Ser Glu Thr Ile Asp Ser Tyr Gly Asp Ser Leu Met His
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 208
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 209
Gln Gln Thr Asp Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 210
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 210
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asn Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser His Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 211
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 211
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Thr Ile Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asp
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 212
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 212
Ser Gly Tyr Ser Trp His
1 5
<210> 213
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 213
Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 214
Gly Pro His Arg Tyr Asp Gly Val Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 215
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His
1 5 10
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 216
Gln Gln Gly Thr Asn Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 217
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 217
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro His Arg Tyr Asp Gly Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 218
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 218
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Asn Ile Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 219
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 219
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 220
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 220
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ile Ser Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 221
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 221
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Pro Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ala Pro Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Asp Tyr Glu Tyr Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 222
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 222
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 223
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 223
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Arg Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 224
<400> 224
000
<210> 225
<211> 289
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 225
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
20 25 30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
35 40 45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
50 55 60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
85 90 95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
130 135 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg Leu Leu Pro
145 150 155 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
165 170 175
Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala
180 185 190
Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr
195 200 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225 230 235 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val
245 250 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala
260 265 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
275 280 285
Ser
<210> 226
<211> 289
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴（Macaca fascicularis）
<400> 226
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Ser Gly Arg Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Val Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
20 25 30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Tyr His Ser Ile
35 40 45
Phe Ala Gly Asp Pro Phe Lys Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
50 55 60
His Arg Pro Gln Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Leu Glu Gly Arg His Thr Ser Trp Lys Gln Glu Lys Asn Leu Ser
85 90 95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Ser Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Leu Ser Ala Ile Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
130 135 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro
145 150 155 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
165 170 175
Phe Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Thr
180 185 190
Gly Arg Glu Ile Thr Leu Val Asp Val Pro Phe Lys Ser Glu Gln Thr
195 200 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Asp Asn Glu Pro Asp Phe Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225 230 235 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Ile
245 250 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Ile Ile Gly Leu Asn Ser Arg Gln Ala
260 265 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
275 280 285
Ser
<210> 227
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有238D的hIgG1恒定区
<400> 227
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 228
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hkappa恒定区
<400> 228
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 229
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hHVEM-mFc融合蛋白（包括信号肽和C末端His标签）
<400> 229
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
115 120 125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser
130 135 140
Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr
145 150 155 160
Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu
165 170 175
Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala
180 185 190
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Pro Ser Ile Ser Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
210 215 220
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
225 230 235 240
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
245 250 255
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
260 265 270
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
275 280 285
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
290 295 300
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
305 310 315 320
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
325 330 335
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
340 345 350
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
355 360 365
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
370 375 380
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
385 390 395 400
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
405 410 415
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys His His His His
420 425 430
His His
<210> 230
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mopc21 hIgG1 P238D同种型对照重链
<400> 230
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Leu His Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Asn Tyr Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 231
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mopc21 hIgG1 P238D同种型对照轻链
<400> 231
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 232
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 232
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 233
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 233
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 234
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 234
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 235
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有P238D以及S228P取代的参考IgG4恒定序列。
<400> 235
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325

Claims (31)

1.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含与缺乏取代的亲本分子相比导致与FcγR2B的结合增加的所述取代。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含以下氨基酸中的一者或多者：位置234处的丙氨酸(A)、位置235处的丙氨酸(A)、位置236处的天冬氨酸(D)、位置237处的天冬氨酸(D)、位置238处的天冬氨酸(D)、位置265处的丙氨酸(A)、位置267处的谷氨酸(E)、位置271处的甘氨酸(G)、位置330处的精氨酸(R)、位置332处的丙氨酸(A)或位置297处的丙氨酸(A)(编号根据EU索引)。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中(i)所述Fc区相对于可比较对照抗体以更高的亲和力与FcγR2B结合，所述可比较对照抗体包含Fc区，所述Fc区具有位置238(EU索引)处的脯氨酸；或者(ii)所述抗体以约5μM至0.1μM的亲和力与FcγR2B结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的；或者(iii)所述Fc区相对于可比较对照抗体以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131R同种异型)结合，所述可比较对照抗体包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸；或者(iv)所述抗体以至少20μM的KD与FcγR2A(131R同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的；或者(v)所述抗体相对于可比较对照抗体以较低或相等的亲和力与FcγR2A(131H同种异型)结合，所述可比较对照抗体包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的脯氨酸；或者(vi)所述抗体以至少50μM的KD与FcγR2A(131H同种异型)结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的；或者(vii)其中所述抗体表现出至少10天的体内半衰期。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人BTLA的表位结合，所述表位选自由以下项组成的组：
(i)D52、P53、E55、E57、E83、Q86、E103、L106和E92；或者
(ii)Y39、K41、R42、Q43、E45和S47；或者
(iii)D35、T78、K81、S121和L123；或者
(iv)H68；或者
(v)N65和A64；
其中每个位置与公开于SEQ ID NO:225的氨基酸序列相关。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体对人免疫细胞的表面上表达的人BTLA表现出增强的激动作用，诸如通过选自T细胞活化测定或B细胞活化测定的BTLA激动剂测定所测量的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR)：CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中
(i)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、17和3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、12和6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(ii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:20、21和22所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:23、24和25所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(iii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、31和32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(iv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和47所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(v)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:53、54和55所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:56、57和58所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(vi)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:61、62和63所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:64、65和66所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(vii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:61、69和70所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:71、72和73所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(viii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:76、77和78所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:79、80和81所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(ix)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和84所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和85所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(x)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:88、89和90所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:91、65和92所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xi)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:95、96和97所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:98、99和100所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:103、104和105所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:106、107和108所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xiii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:76、111和112所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:113、114和115所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xiv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:118、119和120所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:121、122和123所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:126、127和128所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:79、129和130所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xvi)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:133、134和135所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:106、107和136所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xvii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:103、134和139所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:106、107和136所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xviii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:143、144和145所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:146、147和148所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xix)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:151、152和153所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:154、155和156所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xx)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:159、160和161所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、12和164所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xx1)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:167、168和169所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:170、171和172所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和47所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:170、171和172所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxiii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、46和177所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:154、155和178所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxiv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:181、182和183所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:184、185和186所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:76、77和78所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:79、80和189所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxvi)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:45、191和192所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:154、155和193所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxvii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:196、197和198所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:199、200和201所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxviii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:204、205和206所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:207、208和209所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxix)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:212、213和214所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:215、34和216所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxx)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxi)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:20、163和22所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:23、176和25所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、48和32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxiii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、11和3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、12和6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxiv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、11和3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxv)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、17和3所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:4、12和6所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxvi)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:20、21和22所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:23、24和25所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxvii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、31和32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；或者
(xxxviii)CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:30、40和32所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有如SEQ ID NO:33、34和35所示的氨基酸序列，具有0至3个氨基酸修饰；
任选地其中所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
8.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中(1)所述重链包含重链可变区和Fc区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；或者(2)所述重链包含重链可变区和Fc区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；或者(3)所述重链包含重链可变区和Fc区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸，并且所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。
9.一种分离抗体，所述分离抗体特异性结合BTLA，所述分离抗体包含重链和轻链，其中(1)所述重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且轻链包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；(2)所述重链包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且轻链包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；或者(3)所述重链包含如SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，并且轻链包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体选自由以下项组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是单克隆的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体激动在免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA，任选地其中所述免疫细胞是T细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体与免疫细胞的所述表面上表达的人BTLA的结合相对于未被所述抗体结合的可比较免疫细胞降低了所述细胞的增殖，任选地其中所述细胞是T细胞，任选地其中细胞增殖的所述降低为至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中(i)所述抗体以小于10nM的KD特异性结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)；并且/或者(ii)其中所述抗体以小于20nM的KD结合食蟹猴BTLA；并且/或者(iii)所述抗体不抑制BTLA与疱疹病毒进入介质(HVEM)的结合；并且/或者(iv)所述抗体在体外抑制T细胞的增殖，如通过混合淋巴细胞反应测定所测定的。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中所述抗体在37℃下以至少5.0×105(1/Ms)的缔合速率并且/或者在37℃下以小于3.0×10-4(1/s)的解离速率并且/或者小于10nM的KD结合人B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，如在37℃下通过表面等离子体共振(SPR)所测定的。
17.一种分离的人抗体，所述分离的人抗体特异性结合B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，所述分离的人抗体包含重链和轻链，其中
(a)所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含三个CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含三个CDR：CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，并且CDRL3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；并且/或者
(b)所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；并且/或者
(c)所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的序列；
其中所述重链包含Fc区，所述Fc区包含位置238(EU索引)处的天冬氨酸；
任选地其中所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
18.一种核酸，所述核酸包含编码能够形成根据权利要求1至17中任一项所述的抗体的多肽的一个或多个核苷酸序列。
19.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求18所述的核酸分子。
20.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求18或19所述的核酸序列。
21.一种产生结合BTLA的抗体的方法，所述方法包括在产生所述抗体的条件下培养根据权利要求20所述的宿主细胞的步骤，任选地进一步包括分离和/或纯化所述抗体。
22.一种用于制备特异性结合BTLA的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含一种或多种核酸分子的宿主细胞，所述一种或多种核酸分子编码重链和轻链的氨基酸序列，所述一种或多种核酸分子在表达时能够组合以产生根据权利要求1至17中任一项所述的抗体分子；
(ii)培养表达所编码的氨基酸序列的所述宿主细胞；以及
(iii)分离所述抗体。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
24.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或根据权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或根据权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗或预防炎性或自身免疫疾病，以及过度免疫细胞增殖的障碍。
26.根据权利要求25所述使用的抗体，其中所述炎性或自身免疫疾病选自艾迪生病、过敏反应、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、哮喘(包括变应性哮喘)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫多内分泌腺病综合征、白塞病、大疱性类天疱疮、脑性疟疾、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、乳糜泻、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬变)、幼年性关节炎、川崎病、白血病、淋巴瘤、淋巴增生性障碍、多发性硬化、重症肌无力、骨髓瘤、视神经脊髓炎、天疱疮、多肌炎、原发性胆道胆管炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿关节炎、结节病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、移植排斥、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-小柳原田病。
27.根据权利要求25所述使用的抗体，其中所述过度免疫细胞增殖的障碍选自淋巴瘤、白血病、系统性肥大细胞增生症、骨髓瘤或淋巴增生性障碍。
28.一种治疗患者的BTLA相关疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或根据权利要求23所述的药物组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述BTLA相关疾病是炎性或自身免疫疾病，或者免疫增生性疾病或障碍。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述炎性或自身免疫疾病选自艾迪生病、过敏反应、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、哮喘(包括变应性哮喘)、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫多内分泌腺病综合征、白塞病、大疱性类天疱疮、脑性疟疾、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、乳糜泻、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、1型糖尿病、嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬变)、幼年性关节炎、川崎病、白血病、淋巴瘤、淋巴增生性障碍、多发性硬化、重症肌无力、骨髓瘤、视神经脊髓炎、天疱疮、多肌炎、原发性胆道胆管炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿关节炎、结节病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、移植排斥、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和Vogt-小柳原田病。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述免疫增生性疾病或障碍选自淋巴瘤、白血病、系统性肥大细胞增生症、骨髓瘤或淋巴增生性障碍。
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