BR112020023432A2

BR112020023432A2 - molécula de ligação a gp41, composição farmacêutica e método para tratar ou prevenir infecção por hiv-1 em um indivíduo que precisa do mesmo

Info

Publication number: BR112020023432A2
Application number: BR112020023432-0A
Authority: BR
Inventors: Chia-Ying Kao Lam; Gundo Diedrich; Jeffrey Lee Nordstrom; Liqin Liu; Leslie S. Johnson; Scott Koenig; Barton F. Haynes; Guido Ferrari
Original assignee: Macrogenics, Inc.; Duke University
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2021-02-23
Also published as: SG11202011355QA; IL278832A; EP3794027A4; CA3100398A1; EP3794027A1; MX2020012309A; JP2021524451A; CN112533945A; WO2019222104A1; AU2019269383A1; ZA202007056B; US20210246194A1

Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a gp41 de HIV-1 otimizadas que têm imunogenicidade reduzida. Mais especificamente, a invenção se refere a moléculas de ligação a gp41 otimizadas que compreendem um domínio de cadeia leve variável de ligação a gp41 (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada variável de ligação a gp41 (VH) que foi/foram otimizados para reduzir a imunogenicidade de tal domínio (ou domínios) mediante administração a um indivíduo destinatário. A invenção se refere particularmente a moléculas de ligação a gp41 que são moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas (que inclui diacorpos biespecíficos (que inclui diacorpos DART®), BiTE®s, anticorpos biespecíficos, moléculas de ligação trivalentes (que inclui moléculas TRIDENT?) etc.) que compreendem: (i) tal domínio variável de ligação a gp41 otimizado (ou domínios variáveis de ligação a gp41 otimizados) e (ii) um domínio com capacidade de se ligar a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora. A invenção também se refere a composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 e a métodos que envolvem o uso de qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 no tratamento de infecção por HIV-1.

Description

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR INFECÇÃO POR HIV-1 EM UM

INDIVÍDUO QUE PRECISA DO MESMO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade sobre o Pedido de Patente Número de Série U.S. 62/673.462 (depositado em 18 de maio de 2019; pendente), cujo pedido é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] Este pedido inclui uma ou mais Listagens de Sequência de acordo com 37 C.F.R. 1.821 et seq., que são reveladas em mídia legível por computador (nome do arquivo: 1301_0155PCT_ST25.txt, criado em 11 de maio de 2019 e com tamanho de 158.835 bytes), cujo arquivo é incorporado no presente documento em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a gp41 de HIV-1 otimizadas que têm imunogenicidade reduzida. Mais especificamente, a invenção se refere a moléculas de ligação a gp41 otimizadas que compreendem um domínio de cadeia leve variável de ligação a gp41 (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada variável de ligação a gp41 (VH) que foi/foram otimizadas para reduzir a imunogenicidade de tal domínio (ou domínios) mediante administração a um indivíduo destinatário. A invenção se refere particularmente a moléculas de ligação a gp41 que são moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas (que incluem diacorpos biespecíficos (que incluem diacorpos DART®), BiTE®s, anticorpos biespecíficos, moléculas de ligação trivalentes (que incluem moléculas TRIDENT™) etc.) que compreendem: (i) tal domínio variável de ligação a gp41 otimizado (ou domínios variáveis de ligação a gp41 otimizados) e (ii) um domínio com capacidade de se ligar a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora. A invenção também se refere a composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 e a métodos que envolvem o uso de qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 no tratamento de infecção por HIV-1.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A terapia antirretroviral altamente ativa (HAART) tem sido eficaz na redução da carga viral e na melhoria dos efeitos da infecção pelo HIV tipo 1 (HIV-1) em indivíduos infectados. No entanto, a HAART não pode erradicar a infecção pelo HIV-1 e não acelera a eliminação das células infectadas. Em indivíduos infectados, o HIV-1 persiste em um estado latente como provírus integrados nas células T CD4 + de memória em repouso que não são acessíveis a HAART. Dessa forma, apesar da administração de tal terapia, o vírus HIV-1 persiste no indivíduo dentro de um reservatório latente de células infectadas com HIV-1 que se esquivaram do tratamento. As células T CD8 + têm uma capacidade limitada de eliminar o HIV- 1 em tais células infectadas latentemente.

[005] Dessa forma, existe uma necessidade de agentes terapêuticos para o tratamento de indivíduos infectados com HIV-1, particularmente agentes que têm como alvo células infectadas com vírus e têm o potencial de reduzir o reservatório latente de células infectadas com HIV-1 e que são adequados para administração repetida.

[006] A glicoproteína do envelope (“Env”) do vírus HIV-1 é crucial para a infectividade viral (por meio de sua capacidade de se ligar ao receptor CD4) e para conduzir a fusão de membrana. O produto do gene Env do HIV-1 consiste em um complexo trimérico de duas subunidades, gp120 e gp41. A proteína Env é sintetizada como uma proteína precursora gp160 glicosilada, que é dobrada em trímeros e clivada proteoliticamente para produzir as proteínas gp120 e gp41 maduras. O Env clivado é montado, juntamente com outros componentes virais, para o desenvolvimento do vírion da superfície de célula e está presente na superfície de células infectadas (Miranda, L., et al., 2002 “Cell Surface Expression Of The HIV-1 Envelope Glycoproteins Is Directed From Intracellular CTLA-4-Containing Regulated Secretory Granules.” Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12): 8031-8036). Dessa forma, HIV Env e, particularmente, sua subunidade gp41, é um alvo viral altamente específico para a eliminação terapêutica dos reservatórios infectados com HIV persistentes por meio de morte celular mediada por anticorpos (Sloane, D., et al., 2015, “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual- Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells” PLOS Pathogens | DOI:10.1371/journal.ppat.1005233.

[007] No entanto, apesar de todos os avanços anteriores, ainda permanece a necessidade por moléculas de ligação a gp41 de HIV otimizadas com atividade anti-HIV aumentada e/ou imunogenicidade reduzida. A presente invenção aborda essa necessidade e a necessidade de agentes terapêuticos melhorados para o tratamento e prevenção de HIV-1.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a gp41 de HIV-1 otimizadas que têm imunogenicidade reduzida. Mais especificamente, a invenção se refere a moléculas de ligação a gp41 otimizadas que compreendem um domínio de cadeia leve variável de ligação a gp41 (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada variável de ligação a gp41 (VH) que foi/foram otimizadas para reduzir a imunogenicidade de tal domínio (ou domínios) mediante administração a um indivíduo destinatário. A invenção se refere particularmente a moléculas de ligação a gp41 que são moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas (que incluem diacorpos biespecíficos (que incluem diacorpos DART®), BiTE®s, anticorpos biespecíficos, moléculas de ligação trivalentes (que incluem moléculas TRIDENT™) etc.) que compreendem: (i) tal domínio variável de ligação a gp41 otimizado (ou domínios variáveis de ligação a gp41 otimizados) e (ii) um domínio com capacidade de se ligar a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora. A invenção também se refere a composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 e a métodos que envolvem o uso de qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 no tratamento de infecção por HIV-1.

[009] Em detalhes, a invenção fornece uma molécula de ligação a gp41 que compreende um domínio de cadeia leve variável (VL) e um domínio de cadeia pesada variável (VH), em que o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57 e/ou o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58.

[0010] A invenção se refere ainda à modalidade da molécula de ligação a gp41 indicada acima, em que a molécula de ligação a gp41 compreende:

[0011] (a) o domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57 e

[0012] (b) o domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58.

[0013] A invenção se refere ainda às modalidades da molécula de ligação a gp41 indicada acima, em que a molécula é um anticorpo ou compreende uma porção de ligação ao epítopo de gp41 da mesma.

[0014] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula é:

[0015] (a) um anticorpo biespecífico; ou

[0016] (b) um diacorpo, sendo que o diacorpo é um complexo ligado covalentemente que compreende duas, três, quatro ou cinco cadeias de polipeptídeos; ou

[0017] (c) uma molécula de ligação trivalente, sendo que a molécula de ligação trivalente é um complexo ligado covalentemente que compreende três, quatro, cinco ou mais de cinco cadeias de polipeptídeos.

[0018] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula é o diacorpo e compreende um Domínio de Ligação à Albumina (ABD).

[0019] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula compreende uma Região Fc. A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que a Região Fc é uma Região Fc variante que compreende:

[0020] (a) uma ou mais modificações de aminoácido que reduzem a afinidade da região Fc variante para um FcγR; e/ou

[0021] (b) uma ou mais modificações de aminoácido que melhoram a meia vida de soro da região Fc variante.

[0022] A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que as modificações que reduzem a afinidade da região Fc variante para um FcγR compreendem a substituição de L234A; L235A; ou L234A e L235A, em que a dita numeração é aquela do índice EU como em Kabat.

[0023] A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que as modificações que melhoram a meia vida de soro da região Fc variante compreendem a substituição de M252Y; M252Y e S254T; M252Y e T256E; M252Y, S254T e T256E; ou K288D e H435K, em que a dita numeração é aquela do índice EU como em Kabat.

[0024] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula é biespecífica e compreende um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41 e um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora.

[0025] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula é biespecífica e compreender dois sítios de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41 e dois sítios de ligação ao epítopo de com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora.

[0026] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula é triespecífica e compreende:

[0027] (a) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41;

[0028] (b) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma primeira molécula presente na superfície de uma célula efetora; e

[0029] (c) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma segunda molécula presente na superfície de uma célula efetora.

[0030] A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que a primeira molécula presente na superfície de uma célula efetora é CD3 e a segunda molécula presente na superfície de uma célula efetora é CD8.

[0031] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula é triespecífica e compreende:

[0032] (a) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um primeiro epítopo de gp41;

[0033] (b) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um segundo epítopo de gp41 ou um epítopo de uma proteína HIV-1 diferente; e

[0034] (c) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora;

[0035] em que o primeiro e o segundo epítopos de gp41 são diferentes.

[0036] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula tem capacidade de se ligar simultaneamente a gp41 e à molécula presente na superfície de uma célula efetora. A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que a molécula presente na superfície de uma célula efetora é CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, NKp46 ou NKG2D.

[0037] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a célula efetora é uma célula T citotóxica ou uma célula assassina natural (NK).

[0038] A invenção se refere ainda à modalidade das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima, em que a molécula media a ligação coordenada de uma célula que expressa gp41 e uma célula T citotóxica.

[0039] A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que a molécula compreende uma primeira cadeia de polipeptídeos, uma segunda cadeia de polipeptídeos e uma terceira cadeia de polipeptídeos, e em que:

[0040] I) (a) a primeira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:113;

[0041] (b) a segunda cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:114; e

[0042] (c) a terceira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:112;

[0043] ou

[0044] II) (a)a primeira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:115;

[0045] (b) a segunda cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:116; e

[0046] (c) a terceira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:112.

[0047] A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que a molécula compreende uma primeira cadeia de polipeptídeos, uma segunda cadeia de polipeptídeos, uma terceira cadeia de polipeptídeos e uma quarta cadeia de polipeptídeos e em que:

[0048] (a) a primeira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:113;

[0049] (b) a segunda cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:114;

[0050] (c) a terceira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:117; e

[0051] (d) a quarta cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:118.

[0052] A invenção se refere ainda à modalidade de tais moléculas de ligação a gp41, em que a molécula compreende uma primeira cadeia de polipeptídeos, uma segunda cadeia de polipeptídeos, uma terceira cadeia de polipeptídeos e uma quarta cadeia de polipeptídeos e em que:

[0053] I) (a) a primeira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:113;

[0054] (b) a segunda cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:114;

[0055] (c) a terceira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:119; e

[0056] (d) a quarta cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:120;

[0057] ou

[0058] II) (a)a primeira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:115;

[0059] (b) a segunda cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:116;

[0060] (c) a terceira cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:119; e

[0061] (d) a quarta cadeia de polipeptídeos compreende SEQ ID NO:120.

[0062] A invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz da molécula de ligação a gp41 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0063] A invenção se refere ainda a um método para tratar ou prevenir infecção por HIV-1 em um indivíduo que precisa do mesmo compreende a administração ao indivíduo de uma composição que compreende qualquer uma das moléculas de ligação a gp41 indicadas acima ou a composição farmacêutica indicada acima em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[0064] A invenção se refere ainda à modalidade de tal método para tratar ou prevenir infecção por HIV-1 que compreende ainda a administração de um agente de ativação de latência (como vorinostat, romidepsina, panobinostat, dissulfiram, JQ1, briostatina, PMA, ionomicina ou qualquer combinação dos mesmos). BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[0065] As Figuras 1A a 1B fornecem um esquema de um diacorpo representativo ligado covalentemente, que têm dois domínios de ligação ao epítopo compostos por duas cadeias de polipeptídeos, sendo que cada uma tem um domínio de promoção de heterodímero da espiral E ou espiral K são apresentados a seguir domínios de promoção de heterodímero de espiral E ou espiral K (os domínios de promoção de heterodímero alternativos são fornecidos abaixo). Um resíduo de cisteína pode estar presente em um ligante (Figura 1A) e/ou no domínio de promoção de heterodímero (Figura 1B). Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados com uso do mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento. A linha ondulada (WWW) nessa e em todas as Figuras que fornecem apresentações esquemáticas de domínios de moléculas de ligação representa um ou mais Domínios de Promoção de Heterodímero opcionais, que está/estão, de preferência, presentes.

[0066] A Figura 2 fornece um esquemático de uma molécula de diacorpo ligada covalentemente representativa que tem dois domínios de ligação de epítopo compostos por duas cadeias de polipeptídeos, cada uma com um domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formam todo ou parte de uma Região Fc. Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados com uso do mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.

[0067] As Figuras 3A-3C fornecem esquemas que mostra diacorpos tetravalentes representativos ligados covalentemente que têm quatro domínios de ligação ao epítopo compostos por dois pares de cadeias de polipeptídeos (isto é, quatro cadeias de polipeptídeos no total). Uma cadeia de polipeptídeos de cada par possui um domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formam todo ou parte de uma Região Fc. Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados com uso do mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento. Os dois pares de cadeias de polipeptídeos podem ser os mesmos. Em tais modalidades, em que os dois pares de cadeias de polipeptídeos são os mesmos e os domínios VL e VH reconhecem epítopos diferentes (como mostrado nas Figuras 3A a 3B), a molécula resultante possui quatro domínios de ligação ao epítopo e é biespecífica e bivalente em relação a cada epítopo ligado. Em tais modalidades, em que os domínios VL e VH reconhecem o mesmo epítopo (por exemplo, os mesmos CDRs de domínio VL e os mesmos CDRs de domínio VH são usados em ambas as cadeias), a molécula resultante possui quatro domínios de ligação a epítopo e é monoespecífica e tetravalente em relação a um único epítopo. Alternativamente, os dois pares de polipeptídeos podem ser diferentes. Em tais modalidades, em que os dois pares de cadeias de polipeptídeos são diferentes e os domínios VL e VH de cada par polipeptídico reconhecem epítopos diferentes (como mostrado pelos diferentes sombreamentos e padrões da Figura 3C), a molécula resultante possui quatro domínios de ligação ao epítopo e é específico e monovalente em relação a cada epítopo ligado. A Figura 3A mostra um diacorpo que contém Região Fc que contém um domínio de promoção de heterodímero de peptídeo que compreende um resíduo de cisteína. A Figura 3B mostra um diacorpo que contém Região Fc, que contém domínios de promoção de heterodímero de espiral E e espiral K que compreende um resíduo de cisteína e um ligante (com um resíduo de cisteína opcional). A Figura 3C, mostra um diacorpo que contém região Fc, que contém domínios de CH1 e CL de anticorpo. Conforme fornecido abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias de polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.

[0068] As Figuras 4A a 4B fornecem esquemas de uma molécula de diacorpo ligada covalentemente representativa que tem dois domínios de ligação a epítopos compostos por três cadeias de polipeptídeos. Duas das cadeias de polipeptídeos possuem um domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formam todo ou parte de uma Região Fc. As cadeias de polipeptídeos que compreendem o domínio VL e VH compreendem ainda um domínio de promoção de heterodímero. Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados com uso do mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.

[0069] A Figura 5 fornece esquemas de uma molécula de ligação ligada covalentemente representativa que tem quatro domínios de ligação ao epítopo compostos por cinco cadeias de polipeptídeos. Duas das cadeias de polipeptídeos possuem um domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formam uma Região Fc que compreende todo ou parte de uma Região Fc. As cadeias de polipeptídeos que compreendem os domínios VL e VH ligados ainda compreendem um domínio de promoção de heterodímero. Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados com uso do mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento. Conforme fornecido abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias de polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.

[0070] As Figuras 6A a 6F fornecem esquemas de moléculas de ligação trivalentes que contém a Região Fc representativas com três domínios de ligação ao epítopo. A Figura 6A ilustra esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo e um domínio de ligação do tipo Fab que têm diferentes orientações de domínio em que os domínios de ligação do tipo diacorpo são terminais N para uma região Fc. A Figura 6B ilustra esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo e um domínio de ligação do tipo Fab que têm diferentes orientações de domínio em que os domínios de ligação do tipo diacorpo são terminais C para uma região Fc. As moléculas nas Figuras 6A a 6B compreendem quatro cadeias. As Figuras 6C e 6D, respectivamente, ilustram esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo do terminal n a um domínio Fc e um domínio de ligação do tipo Fab no qual a cadeia leve e a cadeia pesada estão ligadas através de um polipeptídeo espaçador ou um domínio de ligação do tipo scFv. As moléculas de ligação trivalentes nas Figuras 6E e 6F, respectivamente, ilustram esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo do terminal C a um domínio Fc e um domínio de ligação do tipo Fab no qual a cadeia leve e a cadeia pesada estão ligadas através de um polipeptídeo espaçador ou um domínio de ligação do tipo scFv. As moléculas de ligação trivalentes nas Figuras 6C a 6F compreendem três cadeias. Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados com uso do mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.

[0071] As Figuras 7A a 7B mostram os alinhamentos das sequências de aminoácidos de 7B2, 7B2 de linha germinativa (7B2GL) e as linhas germinais humanas indicadas. As diferenças de 7B2 estão sombreadas, a estrutura (FW) e as regiões CDR são indicadas e a numeração de Kabat é fornecida. O domínio VL é apresentado na Figura 7A e o domínio VL é apresentado na Figura 7B.

[0072] As Figuras 8A a 8B mostram os sensogramas de HIV-1 JRFL gp140 recombinante (100, 50, 25 nM) que se ligam a 7B2 IgG imobilizado (Figura 8A) e 7B2GL IgG (Figura 8B) conforme medido pela célula Attana A200 QCM.

[0073] A Figura 9 mostra a capacidade de DART-A (que compreende os domínios 7B2GL VL e VH otimizados para minimizar a imunogenicidade) e DART-1 (que compreende os domínios 7B2 VL e VH parentais) para se ligar à superfície de células HEK 293/D371 que expressam gp140.

[0074] A Figura 10 mostra a capacidade de DART-A (que compreende os domínios 7BGL VL e VH otimizados para minimizar a imunogenicidade) e DART-1 (que compreende os domínios 7B2 VL e VH parentais) para ativar células T conforme medido em um ensaio repórter de células T Jurkat.

[0075] A Figura 11 mostra a capacidade do DART-A (que compreende os Domínios 7BGL VL e VH otimizados para minimizar a imunogenicidade) e o DART-1 (que compreende os Domínios 7B2 VL e VH dos pais) para mediar a morte redirecionada das células T de células alvo que expressam gp41 do HIV em um ensaio CTL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0076] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a gp41 de HIV-1 otimizadas que têm imunogenicidade reduzida. Mais especificamente, a invenção se refere a moléculas de ligação a gp41 otimizadas que compreendem um domínio de cadeia leve variável de ligação a gp41 (VL) e/ou um domínio de cadeia pesada variável de ligação a gp41 (VH) que foi/foram otimizados para reduzir a imunogenicidade de tal domínio (ou domínios) mediante administração a um indivíduo destinatário. A invenção se refere particularmente a moléculas de ligação a gp41 que são moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas (que inclui diacorpos biespecíficos (que inclui diacorpos DART®), BiTE®s, anticorpos biespecíficos, moléculas de ligação trivalentes (que inclui moléculas TRIDENT™) etc.) que compreendem: (i) tal domínio variável de ligação a gp41 otimizado (ou domínios variáveis de ligação a gp41 otimizados) e (ii) um domínio com capacidade de se ligar a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora. A invenção também se refere a composições farmacêuticas que compreendem qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 e a métodos que envolvem o uso de qualquer uma dentre tais moléculas de ligação a gp41 no tratamento de infecção por HIV-1.

ANTICORPOS E OUTRAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A. ANTICORPOS

[0077] As moléculas de ligação a gp41 da presente invenção podem ser anticorpos, ou podem ser deriváveis de anticorpos de ligação a gp41 (por exemplo, por fragmentação, clivagem etc. de polipeptídeos de anticorpo) ou obtidas a partir do uso da sequência de aminoácidos de um ou mais das cadeias de polipeptídeos de moléculas de anticorpo, ou expressas por polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos, ou obtidas a partir das sequências de nucleotídeos de tais polinucleotídeos.

[0078] Anticorpos são moléculas de imunoglobulina com capacidade de ligação específica a um domínio específico ou fração ou conformação (um "epítopo") de uma molécula, como carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo etc. Uma molécula que contém epítopo pode ter atividade imunogênica, como que provoca uma resposta de produção de anticorpos em um animal; essas moléculas são denominadas "antígenos". Conforme usado no presente documento, os termos "anticorpo" e

"anticorpos" se referem a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quiméricos, anticorpos policlonais, anticorpos camelizados, Fvs de cadeia única (scFv), cadeia única anticorpos, porções Fab, porções F (ab'), Fvs biespecíficos ligados a dissulfeto (sdFv), intracorpos e domínios de ligação a epítopo de qualquer um dos acima. Tais moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse, ou espécies (bovino, equino, felino, canino, roedor, primata (por exemplo, incluindo macaco, como um macaco cinomolgo, ser humano etc.).

[0079] O termo "anticorpo monoclonal" se refere a uma população de anticorpos homogêneos em que o anticorpo monoclonal é composto de aminoácidos (de ocorrência natural ou não natural) que estão envolvidos na ligação seletiva de um antígeno. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único epítopo (ou sítio antigênico). O termo "anticorpo monoclonal" abrange não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais completos, mas também porções dos mesmos (como Fab, Fab', F(ab')2 (Fv), cadeia única (scFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão que compreende uma porção de anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária e a capacidade de se ligar a um antígeno. Não se pretende que seja limitado no que diz respeito à fonte do anticorpo ou à maneira pela qual é produzido (por exemplo, por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante, animais transgênicos etc.). O termo inclui imunoglobulinas completas, bem como as porções etc. descritos acima sob a definição de "anticorpo".

[0080] Os métodos de produção de anticorpos monoclonais são conhecidos na técnica. Um método que pode ser empregado é o método de Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495 a 497 ou uma modificação do mesmo. Normalmente, os anticorpos monoclonais são desenvolvidos em camundongos, ratos ou coelhos. Os anticorpos são produzidos imunizando um animal com uma quantidade imunogênica de células, extratos celulares ou preparações proteicas que contêm o epítopo desejado. O imunogênio pode ser, mas sem limitação, células primárias, linhas celulares cultivadas, células cancerígenas, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos ou tecido. As células usadas para imunização podem ser cultivadas por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas) antes de serem usadas como imunógeno. As células podem ser usadas como imunógenos por si próprias ou em combinação com um adjuvante não desnaturante, como Ribi (consulte, por exemplo, Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119 a 125). Em geral, as células devem ser mantidas intactas e de preferência viáveis quando usadas como imunógenos. As células intactas podem permitir que os antígenos sejam mais bem detectados do que as células rompidas pelo animal imunizado. O uso de adjuvantes desnaturantes ou agressivos, por exemplo, adjuvante de Freund, pode romper as células e, portanto, é desencorajado. O imunógeno pode ser administrado várias vezes em intervalos periódicos, como, bi semanalmente ou semanalmente, ou pode ser administrado de maneira a manter a viabilidade no animal (por exemplo, em um tecido recombinante). Alternativamente, os anticorpos monoclonais existentes e quaisquer outros anticorpos equivalentes que sejam imunoespecíficos para um epítopo patogênico desejado podem ser sequenciados e produzidos de forma recombinante por qualquer meio conhecido na técnica. Em uma modalidade, esse anticorpo é sequenciado e a sequência de polinucleotídeos é então clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. A sequência de polinucleotídeos de tais anticorpos pode ser usada para manipulação genética para gerar as moléculas monoespecíficas ou multispecíficas (por exemplo, biespecíficas, triespecíficas e tetraespecíficas) da invenção, bem como uma afinidade otimizada, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e/ou um anticorpo caninizado, para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo, conforme detalhado abaixo.

[0081] Anticorpos e as moléculas de ligação da presente invenção ligam epítopos através de seus domínios de ligação de uma maneira "imunoespecífica". Conforme usado no presente documento, diz-se que uma molécula se liga a um epítopo de outra molécula de uma maneira imunoespecífica (ou "imunoespecificamente") se a mesma se liga ou se associa com mais frequência, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com esse epítopo em relação a epítopos alternativos. Por exemplo, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo viral é um anticorpo que se liga a esse epítopo viral com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga imunoespecificamente a outros epítopos virais ou epítopos não virais. Também é entendido lendo-se esta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou fração ou epítopo) que se liga imunoespecificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar específica ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, a "ligação imunoespecífica" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação "imunoespecífica". Os anticorpos naturais têm capacidade de se ligarem a apenas uma espécie de epítopo (isto é, os mesmos são “monoespecíficos”), embora possam se ligar imunoespecificamente a múltiplas cópias dessa espécie (isto é, exibindo “bivalência” ou “multivalência”). Diz-se que duas moléculas têm capacidade de se ligar a uma outra de uma maneira “fisioespecífica”, se tal ligação exibir a especificidade com que receptores liguem seus respectivos ligantes.

[0082] As últimas décadas viram um renascimento do interesse no potencial terapêutico dos anticorpos, e os anticorpos se tornaram uma das principais classes de medicamentos derivados da biotecnologia (Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663 a 666). Mais de 200 medicamentos à base de anticorpos foram aprovados para uso ou estão em desenvolvimento.

1. ATRIBUTOS ESTRUTURAIS GERAIS DE ANTICORPOS

[0083] A unidade estrutural básica de imunoglobulinas que ocorrem naturalmente (por exemplo, IgG) é um composto de tetrâmero de duas “cadeias leves” menores e complexado com duas “cadeias pesadas” maiores e é geralmente expressado como uma glicoproteína de cerca de 150.000 Da. Cada cadeia é composta por uma porção amino-terminal ("terminal N") que compreende um "Domínio Variável" e uma porção de terminal carboxila ("terminal C") que compreende pelo menos um "Domínio Constante". Uma cadeia leve de IgG é composta por um único “Domínio variável da cadeia leve” (“VL”) e um único “Domínio constante da cadeia leve” (“CL”). Assim, a estrutura das cadeias leves de uma molécula de IgG é n-VL-CL-c(em que n e c representam, respectivamente, o terminal N e o terminal C do polipeptídeo). Uma cadeia pesada de IgG é composta por um único “domínio variável de cadeia pesada” ("VH"), três “domínios constantes de cadeia pesada” ("CH1", "CH2" e "CH3") e uma região "de articulação" ("H") localizada entre os domínios CH1 e CH2. Dessa forma, a estrutura de uma cadeia pesada de IgG é n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (em que n e c representam, respectivamente, o terminal N e o terminal C do polipeptídeo). A capacidade de um anticorpo intacto e não modificado (por exemplo, um anticorpo de IgG) para se ligar a um epítopo de um antígeno depende da presença e sequências dos domínios variáveis. A menos que especificamente indicado, a ordem dos domínios das moléculas de proteína no presente documento descritas está na direção "terminal N para terminal C". (A) DOMÍNIOS CONSTANTES (I) DOMÍNIO CONSTANTE DE CADEIA LEVE

[0084] Um domínio CL preferido é um domínio de IgG CL Kappa humano. A sequência de aminoácidos de um domínio CL Kappa humano exemplificativo é (SEQ ID NO:1):

[0085] Alternativamente, um exemplo de Domínio CL é um Domínio de IgG CL Lambda humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio Lambda CL humano exemplificativo é (SEQ ID NO:2): (II) DOMÍNIOS CH1 DE CADEIA PESADA

[0086] Os domínios CH1 das duas cadeias pesadas de um complexo de anticorpo com a região constante "CL" da cadeia leve do anticorpo e estão ligados aos domínios CH2 das cadeias pesadas através de um domínio de articulação interveniente.

[0087] Um exemplo de Domínio CH1 é um Domínio CH1 de IgG1 humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG1 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:3):

[0088] Um exemplo de Domínio CH1 é um Domínio CH1 de IgG2 humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG2 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:4):

[0089] Um exemplo de Domínio CH1 é um Domínio CH1 de IgG3 humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG3 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:5):

[0090] Um exemplo de Domínio CH1 é um Domínio CH1 de IgG4 humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG4 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:6):

(B) REGIÕES DE ARTICULAÇÃO DE CADEIA PESADA

[0091] Um exemplo de Domínio de Articulação é um Domínio de articulação de IgG1 humano. A sequência de aminoácidos de um domínio de articulação de IgG1 humano exemplificativo é (SEQ ID NO: 7):

[0092] Outro exemplo de domínio de articulação é um domínio de articulação de IgG2 humano. A sequência de aminoácidos de um domínio de articulação de IgG2 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:8):

[0093] Outro exemplo de domínio de articulação é um domínio de articulação de IgG3 humano. A sequência de aminoácidos de um domínio de articulação de IgG3 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:9):

[0094] Outro exemplo de domínio de articulação é um domínio de articulação de IgG4 humano. A sequência de aminoácidos de um domínio de articulação de IgG4 humano exemplar é (SEQ ID NO: 10): ESKYGPPCPSCP. Conforme descrito no presente documento, um Domínio de articulação de IgG4 pode compreender uma mutação de estabilização, como a substituição S228P. A sequência de aminoácidos de um domínio de articulação de IgG4 humano estabilizado com S228P exemplificativo é (SEQ ID NO:11): (C) DOMÍNIOS CH2 E CH3 DE CADEIA PESADA

[0095] Os domínios CH2 e CH3 das duas cadeias pesadas interagem para formar o "Domínio Fc" de anticorpos IgG que é reconhecido pelos Receptores Fc celulares, incluindo, mas sem limitação a Receptores Fc gama (FcγRs). Conforme usado no presente documento, o termo "Região Fc" é usado para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de IgG. Uma porção de uma Região Fc (que inclui uma porção que abrange uma Região Fc inteira) é mencionada no presente documento como um “domínio Fc”. Diz-se que uma região Fc é de um isotipo, classe ou subclasse de IgG particular se a sua sequência de aminoácidos for mais homóloga a esse isotipo em relação a outros isotipos de IgG. Além de seus usos conhecidos em diagnósticos, os anticorpos mostraram ser úteis como agentes terapêuticos.

[0096] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG1 humano exemplificativo é (SEQ ID NO:12):

[0097] conforme numerado pelo índice EU conforme estabelecido em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.

[0098] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG2 humana exemplificativo é (SEQ ID NO:13):

[0099] conforme numerado pelo índice EU conforme estabelecido em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00100] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG3 humana exemplificativo é (SEQ ID NO:14):

[00101] conforme numerado pelo índice EU conforme estabelecido em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00102] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG4 humana exemplificativo é (SEQ ID NO:15):

[00103] conforme numerado pelo índice EU conforme estabelecido em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00104] Ao longo da presente especificação, a numeração dos resíduos na região constante de uma cadeia pesada de IgG é a do índice EU como em Kabat et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat”), expressamente incorporado no presente documento por referência. O termo “índice EU como em Kabat” se refere à numeração dos domínios constantes do anticorpo IgG1 EU humano. Polimorfismos foram observados em uma série de posições diferentes dentro de regiões constantes de anticorpos (por exemplo, posições Fc, incluindo, mas sem limitação às posições 270, 272, 312, 315, 356 e 358, numeradas pelo índice EU conforme estabelecido em Kabat), e assim podem existir pequenas diferenças entre a sequência apresentada e as sequências na técnica anterior. As formas polimórficas de imunoglobulinas humanas foram bem caracterizadas. No presente, são conhecidos 18 Gm alótipos: G1m (1, 2, 3, 17) ou G1m (a, x, f, z), G2m (23) ou G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) ou G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1,

c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). É especificamente contemplado que os anticorpos da presente invenção podem incorporar qualquer alótipo, isoalótipo ou haplótipo de qualquer gene de imunoglobulina e não estão limitados ao alótipo, isoalótipo ou haplótipo das sequências fornecidas no presente documento. Além disso, em alguns sistemas de expressão, o resíduo de aminoácido terminal C (em negrito acima) do domínio CH3 pode ser removido pós-traducionalmente. Consequentemente, o resíduo terminal-C do domínio CH3 é um resíduo de aminoácido opcional nas moléculas de ligação a gp41 da invenção. Especificamente abrangidos pela presente invenção estão as moléculas de ligação a gp41 sem o resíduo terminal C do domínio CH3. Também especificamente englobados pela presente invenção estão essas construções que compreendem o resíduo de lisina terminal C do domínio CH3. (D) DOMÍNIOS VARIÁVEIS

[00105] Os domínios variáveisde uma molécula de IgG consistem em três regiões determinantes de complementaridade ("CDRs"), que contêm os resíduos de aminoácidos do anticorpo que estarão em contato com o epítopo, bem como segmentos não CDR intervenientes, chamados de "regiões de estrutura" ("FRs"), que, em geral, mantêm a estrutura e determinam o posicionamento dos circuitos CDR de modo a permitir tal contato (embora certos resíduos de estrutura também possam entrar em contato com o epítopo). Dessa forma, os domínios VL e VH têm a estrutura n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4-c. As sequências de aminoácidos dos CDRs determinam a possibilidade de um anticorpo ter capacidade de se ligar a um epítopo específico. A interação de uma cadeia leve de anticorpo com uma cadeia pesada de anticorpo e, em particular, a interação de seus domínios VL e VH, forma um domínio de ligação ao epítopo do anticorpo.

[00106] Os aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves maduras de imunoglobulinas também são designados pela posição de um aminoácido na cadeia. Kabat descreveu numerosas sequências de aminoácidos para anticorpos, identificou uma sequência de consenso de aminoácidos para cada subgrupo e atribuiu um número de resíduo a cada aminoácido, e os CDRs são identificados conforme definido por Kabat (será entendido que CDRH1 conforme definido por Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196: 901-917) começa cinco resíduos anteriormente). O esquema de numeração de Kabat é extensível a anticorpos não incluídos em seu compêndio, alinhando-se o anticorpo em questão com uma das sequências de consenso em Kabat por referência a aminoácidos conservados. Este método para atribuir números de resíduos se tornou padrão no campo e identifica prontamente aminoácidos em posições equivalentes em diferentes anticorpos, incluindo variantes quiméricas ou humanizadas. Por exemplo, um aminoácido na posição 50 de uma cadeia leve de anticorpo humano ocupa a posição equivalente a um aminoácido na posição 50 de uma cadeia leve de anticorpo de camundongo.

[00107] Os polipeptídeos que são (ou podem servir como) o primeiro, segundo e terceiro CDR da cadeia leve de um anticorpo são no presente documento respectivamente designados como: Domínio CDRL1, Domínio CDRL2 e Domínio CDRL3. De modo similar, polipeptídeos que são (ou podem servir como) o primeiro, segundo e terceiro CDR da cadeia pesada de um anticorpo são no presente documento respectivamente designados como: Domínio CDRH1, Domínio CDRH2 e Domínio CDRH3. Assim, os termos domínio CDRL1, domínio CDRL2, domínio CDRL3, domínio CDRH1, domínio CDRH2 e domínio CDRH3 são direcionados a polipeptídeos que, quando incorporados a uma proteína, fazem com que essa proteína tenha capacidade de se ligar a um epítopo específico, independentemente de tal proteína ser uma anticorpo com cadeias leves e pesadas ou é um diacorpo ou uma molécula de ligação de cadeia única (por exemplo, um scFv, um BiTe® etc.) ou é outro tipo de proteína.

[00108] O termo "Domínio de ligação de epítopo" (por exemplo, um domínio de ligação a gp41) denota uma porção de uma molécula de ligação (ou um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de tal porção) que contribui para a capacidade da molécula de ligação de se ligar imunoespecificamente a um epítopo (por exemplo, um epítopo de gp41). Um domínio de ligação ao epítopo pode conter domínio VL ou VH de um anticorpo ou qualquer 1, 2, 3, 4 ou 5 dentre os domínios CDR de um anticorpo ou pode conter todos os 6 domínios da CDR de um anticorpo e, embora com capacidade de se ligar imunoespecificamente a esse epítopo, pode exibir um imunoespecificidade, afinidade ou seletividade em relação a esse epítopo que difere daquele de tal anticorpo. Um domínio de ligação ao epítopo pode conter apenas parte de um CDR, a saber o subconjunto de resíduos de CDR exigidos para ligação, denominados SDRs (Kim, J.H. et al. (2012) “Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting,” Methods Mol. Biol. 907:237-245; Kim, K.S. et al. (2010)

“Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231- 237; Kashmiri, S.V. et al. (2005) “SDR Grafting – A New Approach To Antibody Humanization,” Methods 36(1):25 a 34; Gonzales, N.R. et al. (2004) “SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity,” Mol. Immunol. 41:863-872). Preferencialmente, no entanto, um Domínio de Ligação ao Epítopo conterá todos os 6 dos Domínios CDR de tal anticorpo. Um Domínio de Ligação ao Epítopo pode ser uma única cadeia de polipeptídeos (por exemplo, um scFv), ou pode compreender duas ou mais cadeias de polipeptídeos, que podem cada uma ter um terminal amino e um terminal carboxila (por exemplo, um diacorpo, uma porção Fab, uma porção Fab2 etc.), e que podem ser covalentemente ligados entre si por meio de uma ligação de dissulfeto.

2. HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPOS

[00109] A invenção também abrange particularmente moléculas de ligação que compreendem um domínio VL ou VH de um anticorpo e, de preferência, tanto um domínio VL quanto um domínio VH de um anticorpo. Preferencialmente, esse anticorpo é um anticorpo humanizado. Os anticorpos monoclonais são tipicamente preparados em espécies não humanas, como camundongo ou coelho. Os domínios variáveis e/ou constantes de tais anticorpos podem ser reconhecidos como imunógenos, provocando assim uma resposta imune contra os mesmos. Essas moléculas podem, no entanto, ser "humanizadas" pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos para tornar esses anticorpos mais semelhantes aos anticorpos produzidos por humanos, reduzindo ou eliminando assim sua imunogenicidade. O termo anticorpo “humanizado" se refere a uma molécula quimérica, geralmente preparada com uso de técnicas recombinantes, que tem um domínio de ligação ao epítopo de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e uma estrutura de imunoglobulina remanescente da molécula que tem por base a estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana.

A sequência de polinucleotídeos dos domínios variáveis de tais anticorpos pode ser usada para manipulação genética para gerar tais derivados e para melhorar a afinidade, ou outras características de tais anticorpos.

A aplicação dessa abordagem a vários anticorpos foi relatada por LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc.

Natl.

Acad.

Sci. (EUA) 86:4.220 a 4.224; Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1.534 a 1.536; Kettleborough, C.

A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124 a 134; Gorman, S.

D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc.

Natl.

Acad.

Sci. (EUA) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M.

S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc.

Natl.

Acad.

Sci. (EUA) 88:2869-2873; Carter,

P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 89:4.285 a 4.289; e Co, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas os seis CDRs dos anticorpos de camundongo). Em outras modalidades, os anticorpos humanizados têm um ou mais CDRs (um, dois, três, quatro, cinco e/ou seis) que diferem na sequência em relação ao anticorpo original.

[00110] O princípio geral na humanização de um anticorpo envolve a retenção da sequência básica do Domínio de Ligação ao Epítopo do anticorpo, enquanto troca o restante não humano do anticorpo por sequências de anticorpos humanos. Existem quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. Esses são: (1) determinar o nucleotídeo e a sequência de aminoácidos prevista dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida (2) projetar o anticorpo humanizado ou anticorpo caninizado, isto é, decidir qual região de estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização ou canonização (3) o metodologias/técnicas de humanização ou caninização reais e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Consulte, por exemplo, as Patentes números U.S. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; e

6.331.415.

[00111] Uma série de moléculas de anticorpo humanizado que compreende um Domínio de ligação ao epítopo derivado de uma imunoglobulina não humana foram descritas, incluindo anticorpos quiméricos com domínio variável de roedor ou roedor modificado e suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) associadas fundidas a domínios constantes humanos (consulte, por exemplo, Winter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc.

Natl.

Acad.

Sci. (EUA) 86:4.220 a 4.224 (1989), Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J.

Immunol. 138:4534- 4538, e Brown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertados em uma região estrutural de suporte humano (FR) antes da fusão com um Domínio Constante de anticorpo humano apropriado (consulte, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; e Jones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525). Outra referência descreve CDRs roedores sustentados por regiões de estrutura de roedor recombinantemente revestidas.

Consulte, por exemplo, Publicação de Patente Europeia número 519.596. Essas moléculas "humanizadas" são projetadas para minimizar a resposta imunológica indesejada para moléculas de anticorpos anti- humanos de roedores, o que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas dessas porções em receptores humanos.

Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser utilizados são revelados por Daugherty et al. (1991)

“Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR- Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2.471 a 2.476 e nas Patentes número U.S.

6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; e 5.866.692. A invenção abrange particularmente moléculas de ligação (que incluem anticorpos e diacorpos) que compreendem um domínio VL e/ou VH de um anticorpo humanizado.

[00112] Apesar de tais sucessos, a produção de diacorpos estáveis, heterodiméricos funcionais, não monoespecíficos otimizados para uso terapêutico pode ser ainda melhorada pela consideração cuidadosa e colocação dos domínios empregados nas cadeias de polipeptídeos. A presente invenção é, dessa forma, direcionada ao fornecimento de polipeptídeos específicos que são particularmente concebidos para formar, por meio de ligação covalente, diacorpos heterodiméricos estáveis e terapeuticamente úteis e diacorpos Fc heterodiméricos que têm capacidade de ligarem simultaneamente gp41 e uma molécula presente na superfície de uma célula efetora. B. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[00113] Conforme indicado acima, os anticorpos naturais têm capacidade de se ligarem a apenas uma espécie de epítopo (isto é, são monoespecíficos), embora possam se ligar a múltiplas cópias dessa espécie (isto é, exibindo bivalência ou multivalência). A capacidade de um anticorpo se ligar a um epítopo de um antígeno depende da presença e da sequência de aminoácidos dos domínios VL e VH do anticorpo. A interação da cadeia leve e da cadeia pesada de um anticorpo e, em particular, a interação de seus domínios VL e VH forma um dos dois domínios de ligação ao epítopo de um anticorpo natural, como uma IgG.

[00114] A funcionalidade dos anticorpos pode ser aumentada gerando-se moléculas com base em anticorpos multiespecíficos que podem ligar simultaneamente dois antígenos separados e distintos (ou diferentes epítopos do mesmo antígeno) e/ou gerando-se molécula com base em anticorpos com maior valência (isto é., mais de dois Domínios de ligação) para o mesmo epítopo e/ou antígeno.

[00115] Para fornecer moléculas com maior capacidade do que os anticorpos naturais, uma ampla variedade de formatos de anticorpos biespecíficos recombinantes foram desenvolvidos (consulte, por exemplo, Publicações PCT números WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565). A maioria de tais abordagens usa peptídeos ligantes para fundir um domínio de ligação adicional (por exemplo, um scFv, VL, VH etc.), ou dentro do núcleo de anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM), ou para fundir múltiplas porções de ligação de anticorpos entre si (por exemplo, duas porções Fab ou scFv). Formatos alternativos usam peptídeos ligantes para fundir uma proteína de ligação (por exemplo, um scFv, VL, VH etc.) a um domínio de dimerização como o domínio CH2-CH3 ou polipeptídeos alternativos (WO 2005/070966, WO 2006/107786A, WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Tipicamente, tais abordagens envolvem compromissos e acordos. Por exemplo, as Publicações PCT números WO 2013/174873, WO 2011/133886 e WO 2010/136172 revelam que o uso de ligantes pode causar problemas em configurações terapêuticas, e ensinam que um anticorpo triespecífico no qual os Domínios CL e CH1 são trocados de suas respectivas posições naturais e os Domínios VL e VH foram diversificados (WO 2008/027236; WO 2010/108127) para permitir que se liguem a mais de um antígeno.

Dessa forma, as moléculas reveladas nesses documentos trocam a especificidade de ligação pela capacidade de se ligar a espécies de antígenos adicionais.

Publicações PCT números WO 2013/163427 e WO 2013/119903 revelam a modificação do Domínio CH2 para conter um aduto de proteína de fusão que compreende um domínio de ligação.

O documento observa que o domínio CH2 provavelmente desempenha apenas um papel mínimo na função efetora de mediação.

Publicações PCT números WO 2010/028797, WO2010028796 e WO 2010/028795 revelam anticorpos recombinantes cujos Regiões Fc foram substituídos por Domínios VL e VH adicionais, de modo a formar moléculas de ligação trivalentes.

Publicações PCT números WO 2003/025018 e WO2003012069 revelam diacorpos recombinantes cujas cadeias individuais contêm domínios scFv.

Publicação PCT números WO 2013/006544 revela moléculas Fab multivalentes que são sintetizadas como uma única cadeia de polipeptídeos e depois submetidas a proteólise para produzir estruturas heterodiméricas.

Dessa forma, as moléculas reveladas nesses documentos trocam toda ou parte da capacidade de função efetora de mediação pela capacidade de se ligar a espécies de antígenos adicionais.

Publicação PCT números WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 e WO 1991/003493 revelam a adição de domínios de ligação adicionais ou grupos funcionais a um anticorpo ou uma porção de anticorpo (por exemplo, adicionar um diacorpo à cadeia leve do anticorpo, ou adicionar domínios VL e VH adicionais às cadeias leve e pesada do anticorpo, ou adicionar uma proteína de fusão heteróloga ou encadear múltiplos Domínios Fab uns aos outros). Dessa forma, as moléculas reveladas nesses documentos trocam a estrutura de anticorpo nativa pela capacidade de se ligar a espécies de antígenos adicionais. II. DIACORPOS BIESPECÍFICOS

[00116] Adicionalmente foi observado na técnica a capacidade de produzir diacorpos que diferem de anticorpos naturais em terem capacidade de se ligar a duas ou mais espécies de epítopos diferentes (isto é, exibindo biespecificidade ou multiespecificidade além de bivalência ou multivalência) (consulte, por exemplo, Holliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90 a 94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19.665 a 19.672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21 a 27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1.025 a 1.033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000)

“Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583- 588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4.941 a

4.944).

[00117] O projeto de um diacorpo tem por base na estrutura da porção do Domínio Variável de cadeia simples (scFv), na qual os Domínios Variáveis da Cadeia Leve e Pesada estão ligados entre si usando um curto peptídeo de ligação. Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423 a 426) descreve um exemplo de peptídeos de ligação que formam uma ponte de aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carboxila de um domínio variável e o terminal amino de outro domínio variável. Ligantes de outras sequências foram projetados e usados (Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen- Binding Proteins,” Science 242:423 a 426). Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados para funções adicionais, como fixação de fármacos ou fixação a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas de forma recombinante ou sintética. Para a produção sintética de scFv, um sintetizador automatizado pode ser usado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado que contém polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, seja eucariótica, como levedura, planta, inseto ou células de mamífero, ou procariótica, como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos por manipulações de rotina, como a ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnicas padrão de purificação de proteínas conhecidas na técnica.

[00118] O fornecimento de "diacorpos" não monoespecíficos fornece uma vantagem significativa sobre os anticorpos: a capacidade de coligar e colocalizar células que expressam diferentes epítopos. Os diacorpos biespecíficos têm, portanto, aplicações abrangentes, incluindo terapia e imunodiagnóstico. A biespecificidade permite grande flexibilidade no projeto e na engenharia do diacorpo em várias aplicações, proporcionando avidez aprimorada para antígenos multiméricos, a reticulação de antígenos diferentes e direcionamento direcionado a tipos de células específicos que dependem da presença de ambos os antígenos alvo. Devido à sua bivalência, baixas taxas de dissociação e rápida eliminação da circulação (para diacorpos de tamanho pequeno, em ou abaixo de ~50 kDa), as moléculas de diacorpo conhecidas na técnica também mostraram uso particular no campo de imagiologia de tumor (Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1.221 a 1.225).

[00119] A capacidade de produzir diacorpos biespecíficos levou ao seu uso (em "trans") para coligar duas células, por exemplo, coligando-se receptores que estão presentes na superfície de diferentes células (por exemplo, reticulação de células T citotóxicas com células-alvo, como células cancerosas ou células infectadas por patógenos, que expressam um antígeno de doença) (Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628 a 631, e Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299 a 305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,”

Acta Pharmacol.

Sin. 26:649-658; Sloan et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re- targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233)). Alternativamente (ou adicionalmente), diacorpos biespecíficos (ou multispecíficos) podem ser usados (em "cis") para coligar moléculas, como receptores etc., que estão presentes na superfície da mesma célula.

A coligação de diferentes células e/ou receptores é útil para modular funções efetoras e/ou sinalização de células imunes.

Moléculas multiespecíficas (por exemplo, diacorpos biespecíficos) que compreende Domínios de Ligação ao Epítopo podem ser direcionadas a um determinante de superfície de qualquer célula imune, como CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, NKG2D etc., que são expressos em linfócitos T, células assassinas naturais (NK), células que apresentam antígeno ou outras células mononucleares, ou a um determinante de superfície de uma célula B, como CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 e CD74 (Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4.542 a 4.551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B- Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N.

Engl.

J.

Med. 359(6):613 a 626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies,” Exp.

Hematol. 36(7):755 a 768). Em particular, os Domínios de Ligação a Epítopo dirigidos a um receptor de superfície celular que está presente em células efetoras imunes, são úteis na geração de moléculas de ligação multispecíficas com capacidade de mediar a morte celular redirecionada.

[00120] Em muitos estudos, ligação de diacorpo a determinantes de célula efetora, por exemplo, receptores Fcγ (FcγR), também foram constatados para ativar a célula efetora (Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299 a 305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2.909 a

2.916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, a ativação da célula efetora é desencadeada pela ligação de um anticorpo ligado ao antígeno a uma célula efetora por meio de uma interação Domínio Fc - FcγR; assim, a este respeito, as moléculas de diacorpo podem exibir funcionalidade semelhante a Ig independentemente de compreenderem um Domínio Fc (por exemplo, conforme testado em qualquer ensaio de função efetora conhecido na técnica ou exemplificado aqui (por exemplo, ensaio ADCC)). Através da ligação cruzada de células tumorais e efetoras, o diacorpo não apenas traz a célula efetora para a proximidade de uma célula tumoral, mas leva à morte eficaz do tumor (consulte por exemplo, Cao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171 a 197).

[00121] No entanto, as vantagens dos diacorpos biespecíficos acima descritos têm um custo saliente. A formação de tais diacorpos não monoespecíficos requer a montagem com sucesso de dois ou mais polipeptídeos distintos e diferentes (isto é, tal formação requer que os diacorpos sejam formados através da heterodimerização de diferentes espécies de cadeias de polipeptídeos). Esse fato contrasta com os diacorpos monoespecíficos, que são formados pela homodimerização de cadeias de polipeptídeos idênticas. Devido a pelo menos dois polipeptídeos diferentes (isto é, duas espécies de polipeptídeos) precisam ser fornecidos para formar um diacorpo não monoespecífico, e devido à homodimerização de tais polipeptídeos leva a moléculas inativas (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583 a 588), a produção de tais polipeptídeos precisa ser realizada de modo a prevenir a ligação covalente entre polipeptídeos da mesma espécie (isto é, de modo a evitar a homodimerização) (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583 a 588). A técnica, portanto, ensinou a associação não covalente de tais polipeptídeos (consulte, por exemplo, Olafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site- Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21 a 27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583 a 588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin- Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).

[00122] No entanto, a técnica reconheceu que diacorpos biespecíficos compostos de polipeptídeos não covalentemente associados são instáveis e prontamente se dissociam em monômeros de cadeia de polipeptídeos única não funcionais (consulte, por exemplo, Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19.665 a 19.672).

[00123] Diante desse desafio, a técnica teve sucesso no desenvolvimento de diacorpos heterodiméricos não monoespecíficos estáveis, covalentemente ligados, denominados diacorpos DART®, consulte, por exemplo, Liu. L et al. (2017) “MGD011, A CD19 x CD3 Dual-Affinity Retargeting Bi-specific Molecule Incorporating Extended Circulating Half-life for the Treatment of B-Cell Malignancies,” Clin Cancer Res. 23(6):1.506 a 1.518; Tsai, P. et al. (2016) “CD19xCD3 DART Protein Mediates Human B-Cell Depletion In Vivo In Humanized BLT Mice,” Mol. Ther. Oncolytics 3:15024. doi:

10.1038/mto.2015.24; Chen, X. et al. (2016) “Mechanistic Projection of First-in-Human Dose for Bispecific Immunomodulatory P-Cadherin LP-DART: An Integrated PK/PD Modeling Approach,” Clin. Pharmacol. Ther. 100(3):232 a 241; Sloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T- Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To

Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv- Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436 a 449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1.933 a 1.943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B- Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4.542 a 4.551; Patentes números U.S. 9.932.400; 9.908.938; 9.889.197; 9.884.921; 9.822.181;

9.296.816; 9.284.375; 8.795.667; 8.187.593; 8.669.349;

8.784.808; 8.795.667; 8.802.091; 8.802.093; 8.946.387 e

8.968.730, e Publicações de Patentes números U.S. 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0034221; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; 2014/0099318; 2014/0255407; 2015/0175697; 2016/0017038; 2016/0159908; 2016/0159908; 2016/0194396; 2016/0194396; 2016/0200827; 2016/0200827; 2016/0222105; 2016/0222105; 2016/0333111; 2016/0355586; 2016/0355586; 2017/0157251; 2017/0157251; 2017/0198037; 2017/0198037; 2017/0198045; 2017/0204176; 2017/0204176; 2017/0247452; e 2018/0094072; Documentos de Patentes Européias números EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; e Publicações PCT números WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400;

WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; e WO 2015/026894). Esses diacorpos compreendem dois ou mais polipeptídeos covalentemente complexados e envolvem a manipulação de um ou mais resíduos de cisteína em cada uma das espécies polipeptídicas empregadas que permitem que ligações dissulfeto se formem e, assim, liguem covalentemente um ou mais pares de tais cadeias de polipeptídeos entre si. Por exemplo, a adição de um resíduo de cisteína ao terminal C de tais construtos mostrou permitir a ligação dissulfeto entre as cadeias de polipeptídeos envolvidas, estabilizando o diacorpo resultante sem interferir com as características de ligação do diacorpo.

[00124] O diacorpo DART® mais simples compreende duas cadeias de polipeptídeos, sendo que cada uma compreende três domínios (Figuras 1A-1B). A primeira cadeia de polipeptídeos compreende: (i) um domínio que compreende uma região de ligação de um domínio variável de cadeia leve de uma primeira imunoglobulina (VL1), (ii) um segundo domínio que compreende uma região de ligação de um domínio variável de cadeia pesada de uma segunda imunoglobulina (VH2), e (iii) um terceiro domínio que serve para promover a heterodimerização (um "domínio de promoção de heterodímero") com a segunda cadeia de polipeptídeos e para ligar covalentemente o primeiro polipeptídeo à segunda cadeia de polipeptídeos do diacorpo. A segunda cadeia de polipeptídeos contém um primeiro domínio complementar (um domínio VL2), um segundo domínio complementar (um domínio VH1) e um terceiro domínio que se torna complexa com o terceiro domínio da primeira cadeia de polipeptídeos para promover a heterodimerização (um "domínio de promoção de heterodímero ”) e ligação covalente com a primeira cadeia de polipeptídeos. Essas moléculas são estáveis, potentes e têm a capacidade de se ligar simultaneamente a dois ou mais antígenos. Em uma modalidade, o terceiro Domínio da primeira e segunda cadeias de polipeptídeos, cada um contém um resíduo de cisteína ("©"), que serve para ligar os polipeptídeos juntos por meio de uma ligação de dissulfeto.

[00125] O terceiro domínio de uma ou ambas as cadeias de polipeptídeos podem possuir adicionalmente a sequência de um domínio CH2-CH3, de modo que a complexação dos polipeptídeos diacorpo forme um domínio Fc que tem capacidade de se ligar ao receptor Fc de células (como linfócitos B , células dendríticas, células assassinas naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos). Muitas variações de tais moléculas foram descritas (consulte, por exemplo, Publicação de Patente números US 2013-0295121; 2010- 0174053; 2007-0004909; 2009-0060910; Publicação de Patente Europeia números EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; e Publicações PCT números WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) e são fornecidos no presente documento. Muitas variações de tais moléculas foram descritas (consulte, por exemplo, Publicação de Patente números US 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318; 2013/0295121; 2010/0174053; 2009/0060910; 2007-0004909; Publicação de Patente Europeia números EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; EP 1868650; e Publicações PCT números WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) e são fornecidos no presente documento.

[00126] Construções alternativas são conhecidas na técnica para aplicações em que uma molécula biespecífica ou tetravalente é desejável, mas um Fc não é necessário incluindo, mas sem limitação, moléculas Engager de células T biespecíficas, também chamadas de "anticorpos BiTE®" (consulte, por exemplo, PCT Publicação números: WO 1993/11161; e WO 2004/106381) e anticorpos tetravalentes em tandem, também chamados de "TandAbs®" (consulte, por exemplo, Publicação de Patente número: US 2011-0206672; Publicação de Patente Europeia número EP 2371866, e; Publicação PCT números WO 1999/057150, WO 2003/025018 e WO 2013/013700). BiTE®s são formados a partir de uma única cadeia de polipeptídeos que compreende scFvs ligados em tandem, enquanto os TandAb®s são formados pela homodimerização de duas cadeias de polipeptídeos idênticas, sendo que cada uma possui um domínio VH1, VL2, VH2 e VL2. III. MODALIDADES DA INVENÇÃO

[00127] A presente invenção é dirigida a "Moléculas de ligação ao epítopo" que compreendem "Domínios de ligação ao epítopo", como um domínio CDRL1, domínio CDRL2, domínio CDRL3, domínio CDRH1, domínio CDRH2 ou domínio CDRH3, ou qualquer combinação ou subcombinação dos mesmos, suficiente para formar um "sítio de ligação ao epítopo" que permite que a molécula se ligue a um epítopo. Por exemplo, uma "Molécula de ligação ao epítopo de gp41" compreende "Domínios de ligação ao epítopo", como um domínio CDRL1, domínio CDRL2, domínio CDRL3, domínio CDRH1, domínio CDRH2 ou domínio CDRH3, ou qualquer combinação ou subcombinação dos mesmos, suficiente para formar um "sítio de ligação ao epítopo de gp41" que permite que a molécula se ligue a um epítopo de gp41. Preferencialmente, no entanto, tais moléculas de ligação a gp41 possuirão um domínio CDRL1, domínio CDRL2, domínio CDRL3,

domínio CDRH1, domínio CDRH2 e um domínio CDRH3 de um "anticorpo anti-gp41" que se liga imunoespecificamente a um epítopo de gp41. Em algumas modalidades, tais moléculas podem compreender apenas o domínio de ligação a gp41-VL de tal anticorpo anti- gp41, ou apenas o domínio de ligação a gp41-VH de tal anticorpo anti-gp41, cujos domínios podem interagir com outros domínios de ligação para mediar a ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41, ou pode ser suficiente por si só para mediar tal ligação. Em algumas modalidades, tais moléculas podem compreender um domínio de ligação gp41-VL de um anticorpo anti- gp41 e um domínio de ligação gp41-VH de um anticorpo anti- gp41, que pode ser derivado do mesmo ou de diferentes anticorpos.

[00128] Uma modalidade da presente invenção se refere a moléculas de ligação a gp41 "multiespecíficas" que são biespecíficas e têm capacidade de se ligarem a um "primeiro epítopo" e um "segundo epítopo", tais epítopos que não são idênticos um ao outro. A denotação de um epítopo como sendo o “Primeiro Epítopo”, “Segundo Epítopo” etc. tem o propósito meramente de fornecer uma base antecedente para sua descrição e não significa uma distinção substantiva. Tais moléculas multiespecíficas compreendem domínios "VL1"/"VH1" que têm capacidade de se ligarem ao primeiro epítopo e domínios "VL2"/"VH2" que têm capacidade de se ligarem ao segundo epítopo. A notação "VL1" e "VH1" denotam, respectivamente, o domínio da cadeia leve variável e o domínio da cadeia pesada variável que se ligam ao primeiro epítopo de tais moléculas biespecíficas. De modo similar, a notação "VL2" e "VH2" denotam, respectivamente, o Domínio Variável da Cadeia Leve e o Domínio Variável da Cadeia Pesada que se ligam ao Segundo

Epítopo de tais moléculas biespecíficas.

É irrelevante se um determinado epítopo é designado como o primeiro epítopo, o segundo epítopo etc.; sendo que tal notação tem relevância apenas no que diz respeito à presença e orientação de domínios das cadeias de polipeptídeos das Moléculas de Ligação da presente invenção.

Em uma modalidade, um de tais epítopos é um epítopo de gp41 humano e o outro é um epítopo diferente de gp41, ou é um epítopo de uma molécula que não é gp41. Em modalidades particulares, um de tais epítopos é um epítopo de gp41 humano e o outro é um epítopo de uma molécula (por exemplo, CD2, CD3, CD8, CD16, receptor de células T (TCR), NKG2D etc.) presente na superfície de uma célula efetora, como um linfócito T, uma célula assassina natural (NK) ou outra célula mononuclear.

Em certas modalidades, uma molécula multiespecífica compreende mais de dois Domínios de Ligação de Epítopo.

Em certas modalidades, as moléculas multiespecíficas da invenção são triespecíficas e têm capacidade de se ligarem a um primeiro epítopo, um segundo epítopo e um "terceiro epítopo". Tais moléculas triespecíficas compreendem domínios VL1/VH1 que têm capacidade de se ligarem ao Primeiro Epítopo, domínios VL2/VH2 que têm capacidade de se ligarem ao Segundo Epítopo e domínios "VL3" e "VH3" que têm capacidade de se ligarem ao Terceiro Epítopo.

Em outras modalidades, as moléculas multiespecíficas da invenção são tetraespecíficas e têm capacidade de se ligarem a um primeiro epítopo, um segundo epítopo, um terceiro epítopo e um "quarto epítopo". Tais moléculas tetraespecíficas compreendem domínios VL1/VH1 que têm capacidade de se ligarem ao Primeiro Epítopo, domínios VL2/VH2 que têm capacidade de se ligarem ao Segundo Epítopo, domínios VL3/VH3 que têm capacidade de se ligarem ao Terceiro

Epítopo, e Domínios “VL4”/“VH4”que têm capacidade de se ligarem ao Quarto Epítopo. Tais moléculas multiespecíficas se ligarão a pelo menos um epítopo de gp41 e pelo menos um epítopo de uma molécula que não é gp41 e podem ainda ligar epítopos adicionais de gp41 e/ou epítopos adicionais de uma molécula que não é gp41. A presente invenção em particular abrange diacorpos biespecíficos, BiTE®s, anticorpos, TandAb®s e moléculas trivalentes produzidas usando qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A gp41 MULTISPECÍFICAS

[00129] Em uma modalidade, as moléculas de ligação a gp41 da presente invenção serão moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas, com capacidade de se ligarem a dois ou mais epítopos diferentes e compreenderão:

[00130] (1) um primeiro domínio de ligação de epítopo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de gp41 (isto é, um domínio de ligação a gp41, de preferência, que compreende um domínio VL de ligação a gp41 otimizado da invenção e/ou um domínio VH de ligação a gp41 otimizado da invenção); e

[00131] (2) um segundo Domínio de Ligação ao Epítopo que se liga imunoespecificamente a um segundo epítopo, em que tal segundo epítopo é (i) um epítopo diferente de gp41, ou (ii) um epítopo de uma molécula que não é gp41; e

[00132] (3) opcionalmente, um ou mais Domínios de Ligação de Epítopo adicionais que imunoespecificamente se ligam a um terceiro epítopo adicional, um terceiro epítopo adicional e um quarto epítopo adicional etc., em que tais Domínios de Ligação de Epítopo adicionais podem ser iguais ou diferentes do primeiro epítopo ou o segundo epítopo.

[00133] Tais moléculas de ligação a gp41 compreendem, de preferência, uma combinação de domínios de ligação a epítopo que reconhecem um conjunto de antígenos únicos para células alvo ou células efetoras imunes. Em particular, a presente invenção se refere a moléculas multiespecíficas de ligação a gp41 que têm capacidade de se ligarem a um epítopo de gp41 e a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora (isto é, molécula de célula efetora ("ECM")) , especialmente uma molécula presente na superfície de um linfócito T, uma célula assassina natural (NK) ou outra célula mononuclear. Por exemplo, tais moléculas de ligação a gp41 da presente invenção podem ser construídas para compreender um primeiro domínio de ligação de epítopo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de gp41 e um segundo domínio de ligação ao epítopo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de uma ECM, especialmente CD2, CD3, CD8, CD16, receptor de células T (TCR) ou NKG2D. Em outras modalidades da invenção, tais moléculas de ligação conterão adicionalmente Domínios de Ligação de Epítopo suficientes para permitir que tais moléculas se liguem a um epítopo adicional de uma ECM e/ou um epítopo adicional de uma molécula presente na superfície de uma célula infectada com HIV-1 (por exemplo, um segundo epítopo de gp41, ou outro epítopo de uma proteína de envelope de HIV-1). A presente invenção também é direcionada a composições farmacêuticas que compreende tal molécula (ou moléculas).

[00134] Em uma modalidade, tais moléculas de ligação a gp41 serão biespecíficas, mas monovalentes, de modo a possuir a capacidade de se ligar a apenas um único epítopo de gp41 e apenas a um único epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora (ECM). Alternativamente, tais moléculas podem ser multiespecíficas e multivalentes, isto é, com capacidade de se ligar a um, dois, três ou quatro epítopos totais, que podem ser distribuídos de qualquer maneira para ligar um, dois ou três epítopos de gp41 (os quais dois ou três os epítopos de gp41 podem ser iguais ou diferentes) e três, dois ou um epítopo (ou epítopos) de uma ou mais ECM; ou um ou dois epítopos de gp41 (em que dois epítopos de gp41 podem ser iguais ou diferentes) e dois ou um epítopo (ou epítopos) de uma ou mais ECM e, opcionalmente, um ou dois epítopos de um ou mais moléculas de HIV-1 diferentes, particularmente quando tais moléculas são expressas na superfície de uma célula infectada com HIV-1.

[00135] Dessa forma, em que tais moléculas têm capacidade de se ligarem imunoespecificamente a apenas uma única ECM, podem ter capacidade de se ligarem imunoespecificamente a:

[00136] (1) apenas um epítopo de gp41 e um, dois ou três epítopo (ou epítopos) da ECM (cujos dois epítopos podem ser iguais ou diferentes, e cujos três epítopos podem ser iguais, ou podem ser diferentes, ou podem ser dois epítopos iguais e um epítopo diferente), ou

[00137] (2) apenas dois epítopos de gp41 (cujos dois epítopos podem ser iguais ou diferentes) e um ou dois epítopo (ou epítopos) da ECM (cujos dois epítopos podem ser iguais ou diferentes); ou

[00138] (3) três epítopos de gp41 (em que três epítopos podem ser iguais, ou podem ser diferentes ou podem ser dois epítopos que são iguais e um epítopo que é diferente) e 1 epítopo da ECM, ou opcionalmente, podem ter capacidade de se ligarem a um ou dois epítopos de gp41 (cujos epítopos podem ser iguais ou diferentes) e dois ou um epítopos de uma molécula de HIV-1 diferente (cujos dois epítopos podem ser iguais ou diferentes).

[00139] De modo similar, em que tais moléculas têm capacidade de se ligarem imunoespecificamente a duas ECMs diferentes (por exemplo, uma Primeira ECM e uma Segunda ECM), podem ter capacidade de se ligarem imunoespecificamente a:

[00140] (1) apenas um epítopo de gp41 e um ou dois epítopo (ou epítopos) da Primeira ECM (cujos dois epítopos da Primeira ECM podem ser iguais ou diferentes) e dois ou um epítopo (ou epítopos) da Segunda ECM (quais duas da Segunda ECM podem ser iguais ou diferentes), ou

[00141] (2) apenas dois epítopos de gp41 (em que dois epítopos podem ser iguais ou diferentes) e um epítopo da Primeira ECM e um epítopo da Segunda ECM ou, opcionalmente, podem ter capacidade de se ligarem a um epítopo de gp41 e um epítopo de um molécula de HIV-1 diferente.

[00142] Exemplos não limitativos de tais moléculas multiespecíficas com capacidade de ligar dois epítopos são descritos abaixo e incluem:

[00143] (1) DART-A, que se liga a um epítopo de gp41 e um epítopo de ECM, CD3; e

[00144] (2) DART-B, que se liga a um epítopo de gp41 e um epítopo de ECM, CD16.

[00145] Exemplos não limitativos de tais moléculas multiespecíficas com capacidade de ligar três epítopos são descritos abaixo e incluem:

[00146] (1) TRIDENT-A, que se liga a um epítopo de gp41 e epítopos de duas ECMs diferentes (CD3 e CD8);

[00147] (2) TRIDENT-B, que se liga a um epítopo de gp41, um epítopo de uma ECM (CD3) e um epítopo de uma molécula de HIV-1 diferente (gp120);

[00148] (3) TRIDENT-C, que se liga a um epítopo de gp41, um epítopo de uma ECM (CD16) e um epítopo de uma molécula de HIV-1 diferente (gp120); e

[00149] (4) TRIDENT-D, que se liga a dois epítopos de gp41 e um epítopo de uma ECM (CD3).

[00150] A Tabela 1 ilustra ainda especificidades de ligação de combinação possível de moléculas exemplificativas da invenção. Tabela 1 Número de epítopos reconhecidos por moléculas de ligação a gp41 exemplificadores da invenção que possuem dois, três ou quatro domínios de ligação aos epítopos que têm capacidade de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo Número de Número Número de Número Número Número Epítopos total de Epítopo de de de de domínios (ou Epítopos Epítopos Epítopos Molécula de epítopos) de 1º ECM de 2º ECM de 3º ECM HIV-1 ligação gp41 diferente 2 1 1 0 0 0 3 1 1 1 0 0 3 1 1 0 0 1 3 1 2 0 0 0 3 2 1 0 0 0 4 1 1 1 0 1 4 1 1 1 1 0 4 1 2 0 0 1 4 1 2 1 0 0 4 2 1 1 0 0 4 2 1 0 0 1

[00151] Ao formar moléculas mais complexas, pode- se obter moléculas de ligação a gp41 que têm capacidade de se ligarem a uma ou mais ECMs e, opcionalmente, uma ou mais moléculas de HIV-1 diferentes que possuem mais de quatro domínios de ligação ao epítopo. Dessa forma, nenhuma limitação é colocada na natureza de epítopos ou epítopos adicionais que podem ser ligados pelas moléculas da presente invenção, exceto que tal capacidade de ligação adicional não impede a molécula ou Domínio de Ligação da mesma que tem capacidade de se ligar a um epítopo de gp41 de tal ligação e não impede a molécula ou Domínio de Ligação da mesma que tem capacidade de se ligar a um epítopo de uma ECM de tal ligação. Dessa forma, as moléculas de ligação a gp41 da presente invenção podem possuir domínios de ligação aos epítopos alternativos ou adicionais. Como um exemplo, a invenção contempla uma molécula de ligação a gp41 que compreende um primeiro domínio de ligação ao epítopo com capacidade de se ligar imunoespecificamente a um epítopo de gp41 e um segundo domínio de ligação ao epítopo que tem capacidade de se ligar imunoespecificamente a um epítopo de uma ECM e um terceiro domínio de ligação de epítopo com capacidade de se ligar imunoespecificamente a uma ECM diferente ou, opcionalmente, a uma molécula de HIV-1 diferente.

1. DIACORPOS DE LIGAÇÃO A GP41 MULTIESPECÍFICOS COM

FALTA DE DOMÍNIOS FC

[00152] Em uma modalidade, as moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas da presente invenção serão diacorpos biespecíficos e compreenderão domínios com capacidade de se ligar a um primeiro epítopo e um segundo epítopo, mas não terão um domínio Fc e, portanto, não terão capacidade de se ligar a moléculas FcγR por meio de um Interação Fc-FcγR. Tais moléculas são, no entanto, com capacidade de se ligarem a gp41 através dos SDRs ou CDRs de seus domínios de ligação a gp41. A ausência de domínios Fc serve, assim, para evitar que as moléculas se liguem a FcγRs, como o receptor inibitório CD32B.

[00153] A primeira cadeia de polipeptídeos de tal modalidade de diacorpos biespecíficos compreende, de preferência, na direção terminal N para terminal C: um terminal N, o domínio VL de um anticorpo monoclonal com capacidade de se ligar ao primeiro ou ao segundo epítopo (isto é, tanto VLgp41 quanto VLsegundo epítopo), um primeiro peptídeo espaçador interveniente (Ligante 1), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal com capacidade de se ligar ao epítopo do segundo epítopo (se essa primeira cadeia de polipeptídeos contiver VLgp41) ou um Domínio VH de um anticorpo monoclonal com capacidade de se ligar a gp41 (se tal primeira cadeia de polipeptídeos contiver VLsegundo epítopo), um segundo peptídeo espaçador intermediário (Ligante 2) que contém opcionalmente um resíduo de cisteína, um domínio de promoção de heterodímero e um terminal C (Figuras 1A a 1B).

[00154] A segunda cadeia de polipeptídeos dessa modalidade de diacorpos biespecíficos compreende, na direção do terminal N para o terminal C: um terminal N, o domínio VL de um anticorpo monoclonal com capacidade de se ligar ao primeiro ou segundo Epítopo (isto é, VLgp41 ou VLSegundo Epítopo, e sendo o domínio VL não selecionado para inclusão na primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo), um peptídeo espaçador intermediário (Ligante 1), um domínio VH de um anticorpo monoclonal com capacidade de se ligar ao Primeiro ou ao Segundo Epítopo (isto é, VHgp41 ou VHSegundo Epítopo, e sendo que o Domínio

VH não é selecionado para inclusão na primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo), um segundo peptídeo espaçador interveniente (Ligante 2) que contém opcionalmente um resíduo de cisteína, um domínio de promoção de heterodímero e um terminal C (Figuras 1A a 1B). Os Domínios VL e VH empregados específicos para um determinado epítopo são preferencialmente obtidos ou derivados do mesmo anticorpo monoclonal. No entanto, esses domínios podem ser derivados de diferentes anticorpos monoclonais desde que se associem para formar um Domínio de Ligação funcional com capacidade de se ligar imunoespecificamente a tal epítopo. Esses anticorpos diferentes são chamados de anticorpos "correspondentes” no presente documento.

[00155] O domínio VL da primeira cadeia de polipeptídeos de tais diacorpos interage com o domínio VH da segunda cadeia de polipeptídeos do diacorpo para formar um primeiro domínio de ligação ao epítopo funcional que é específico para um dos epítopos (por exemplo, o primeiro epítopo ou o segundo epítopo). Da mesma forma, o Domínio VL da segunda cadeia de polipeptídeos interage com o Domínio VH da primeira cadeia de polipeptídeos para formar um segundo Domínio de Ligação ao Epítopo funcional que é específico para o outro epítopo (isto é, o segundo epítopo ou o primeiro epítopo). Dessa forma, a seleção dos Domínios VL e VH da primeira e segunda cadeias de polipeptídeos é "coordenada", de modo que as duas cadeias de polipeptídeos do diacorpo coletivamente compreendam os Domínios VL e VH com capacidade de se ligar tanto ao primeiro epítopo quanto ao segundo epítopo (isto é, coletivamente compreendem VLprimeiro epítopo/VHprimeiro epítopo e VLsegundo epítopo/VHsegundo epítopo), como VLgp41/VHgp41 e VLsegundo epítopo/VHsegundo epítopo.

[00156] Com a máxima preferência, o comprimento do peptídeo espaçador interveniente (isto é, "Ligante 1", que separa tais domínios VL e VH) é selecionado para impedir substancialmente ou completamente que os domínios VL e VH da cadeia de polipeptídeos se liguem (por exemplo, que consiste em 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos de aminoácido ligante intervenientes). Assim, os domínios VL e VH da primeira cadeia de polipeptídeos são substancialmente ou completamente incapazes de se ligarem um ao outro. Da mesma forma, os domínios VL e VH da segunda cadeia de polipeptídeos são substancialmente ou completamente incapazes de se ligarem um ao outro. Um peptídeo espaçador intermediário preferido (Ligante 1) tem a sequência (SEQ ID NO: 16): GGGSGGGG.

[00157] O comprimento e a composição do segundo peptídeo espaçador interveniente ("Ligante 2") são selecionados com base na escolha de um ou mais domínios polipeptídicos que promovem tal dimerização (isto é, um "domínio de promoção de heterodímero"). Tipicamente, o segundo peptídeo espaçador interveniente (“Ligante 2”) estará entre 3 e 20 resíduos de aminoácidos em comprimento. Em particular, em que o domínio (ou domínios) de promoção de heterodímero empregue não compreende um resíduo de cisteína, um segundo peptídeo espaçador interveniente que contém cisteína (Ligante 2) é utilizado. Um segundo peptídeo espaçador interveniente que contém cisteína (Ligante 2) conterá 1, 2, 3 ou mais de 3 cisteínas. Um peptídeo espaçador que contém cisteína preferido (ligante 2) tem a sequência GGCGGG (SEQ ID NO:17). Alternativamente, o ligante 2 não compreende uma cisteína (por exemplo, GGG, GGGS (SEQ ID NO: 18), LGGGSG (SEQ ID NO: 19),

GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 20), ASTKG (SEQ ID NO: 21), LEPKSS (SEQ ID NO: 22), APSSS (SEQ ID NO: 23), etc.) e um Domínio de Promoção de Heterodímero que contém cisteína, conforme descrito abaixo. Opcionalmente, são usadosum Ligante 2 que contém cisteína e um Domínio de Promoção de Heterodímero que contém cisteína.

[00158] Os domínios de promoção de heterodímero podem ser GVEPKSC (SEQ ID NO: 24) ou VEPKSC (SEQ ID NO: 25) ou AEPKSC (SEQ ID NO: 26) em uma cadeia de polipeptídeos e GFNRGEC (SEQ ID NO: 27) ou FNRGEC (SEQ ID NO: 28) na outra cadeia de polipeptídeos (US2007/0004909).

[00159] Em uma modalidade preferencial, os Domínios de Promoção de Heterodímero compreenderão domínios de espiral repetidos em tandem de carga oposta, por exemplo, um Domínio de Promoção de Heterodímero de "espiral E" (SEQ ID NO: 29: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK), cujos resíduos de glutamato formarão uma carga negativa em pH 7, ou um domínio de promoção de heterodímero de "espiral K" (SEQ ID NO: 30: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE), cujos resíduos de lisina formarão uma carga positiva em pH 7. A presença de tais domínios carregados promove a associação entre o primeiro e o segundo polipeptídeos e, assim, promove a formação de heterodímero. Podem ser utilizados domínios de promoção de heterodímero que compreendem modificações das sequências da espiral E e da espiral K acima descritas de modo a incluir um ou mais resíduos de cisteína. A presença de tais resíduos de cisteína permite que a espiral presente em uma cadeia de polipeptídeos se torne covalentemente ligada a uma espiral complementar presente em outra cadeia de polipeptídeos, ligando covalentemente, assim, as cadeias de polipeptídeos umas às outras e aumentando a estabilidade do diacorpo. Exemplos de tais domínios de promoção de heterodímero particularmente preferidos incluem uma espiral E modificada que tem a sequência de aminoácidos EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK- EVAALEK (SEQ ID NO: 31), e uma espiral K modificada que tem a sequência de aminoácidos KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 32).

[00160] Conforme revelado no documento número WO 2012/018687, para melhorar as propriedades farmacocinéticas in vivo de diacorpos, um diacorpo pode ser modificado para conter uma porção polipeptídica de uma proteína de ligação ao soro em um ou mais dos terminais do diacorpo. Com a máxima preferência, essa porção polipeptídica de uma proteína de ligação ao soro será instalada no terminal C de uma cadeia de polipeptídeos do diacorpo. A albumina é a proteína mais abundante no plasma e tem meia-vida de 19 dias em humanos. A albumina possui vários domínios de ligação de pequenas moléculas que permitem que se ligue de forma não covalente a outras proteínas e, assim, estenda suas meias-vidas séricas. O Domínio de ligação à albumina 3 (ABD3) da proteína G de Streptococcus cepa G148 consiste em 46 resíduos de aminoácidos que formam um feixe de três hélices estáveise tem ampla especificidade de ligação à albumina (Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin- Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8.114 a 8.120). Assim, uma porção polipeptídica particularmente preferida de uma proteína de ligação ao soro para melhorar as propriedades farmacocinéticas in vivo de um diacorpo é o Domínio de ligação à albumina (ABD) da proteína G estreptocócica e, mais preferencialmente, o Domínio 3 de ligação à albumina (ABD3) da

Proteína G de Streptococcus cepa G148 (SEQ ID NO: 33): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP.

[00161] Conforme revelado no documento número WO 2012/162068 (incorporado no presente por referência), as variantes "desimunizadas" de SEQ ID NO: 33 têm a capacidade de atenuar ou eliminar a ligação de MHC de classe II. Com base nos resultados de mutação combinatória, as seguintes combinações de substituições são consideradas substituições preferidas para formar tal ABD desimunizado: 66D/70S +71A; 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. ABDs variantes com as modificações L64A, I65A e D79A ou as modificações N66S, T70S e D79A. ABD variante desimunizado que tem a sequência de aminoácidos:

[00162] (SEQ ID NO:34),

[00163] ou a sequência de aminoácidos:

[00164] (SEQ ID NO:35),

[00165] ou a sequência de aminoácidos:

[00166] (SEQ ID NO:36),

[00167] são particularmente preferidos uma vez que tais ABD desimunizados exibem ligação substancialmente de tipo selvagem enquanto fornecem ligação atenuada de MHC classe II. Assim, a primeira cadeia de polipeptídeos de tal diacorpo que tem um ABD contém um terceiro ligante (Ligante 3) preferencialmente posicionado no terminal C para o Domínio da espiral E (ou espiral K) de tal cadeia de polipeptídeos de modo a intervir entre o Domínio da espiral E (ou espiral K) e o ABD (que é de preferência um ABD desimunizado). Uma sequência preferida para tal Ligante 3 é SEQ ID NO: 18: GGGS.

2. DIACORPOS DE LIGAÇÃO A GP41 MULTIESPECÍFICOS QUE

COMPREENDEM DOMÍNIOS FC

[00168] Uma modalidade da presente invenção se refere a diacorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecífico, triespecífico, tetraespecífico etc.) que compreendem um Domínio Fc e que têm capacidade de ligarem simultaneamente um epítopo de gp41 e um segundo epítopo (por exemplo, um epítopo de uma Proteína do envelope do HIV-1 diferente ou um epítopo expresso na superfície de uma célula efetora). O domínio Fc de tais moléculas pode ser de qualquer isótipo (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). As moléculas podem compreender ainda um domínio CH1 e/ou um domínio articulação. Quando presente, o Domínio CH1 e/ou Domínio de articulação pode ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) e é de preferência do mesmo isotipo que o Domínio Fc desejado.

[00169] A adição de um Domínio de IgG CH2-CH3 a uma ou ambas as cadeias de polipeptídeos de diacorpo, de modo que a complexação das cadeias de diacorpo resulte na formação de um Domínio Fc, aumenta a meia-vida biológica e/ou altera a valência do diacorpo. Esses diacorpos compreendem duas ou mais cadeias de polipeptídeos cujas sequências permitem que as cadeias de polipeptídeos se liguem covalentemente umas às outras para formar um diacorpo associado covalentemente que tem capacidade de se ligar simultaneamente a gp41 e ao segundo epítopo. A incorporação de um Domínio de IgG CH2-CH3 em ambos os polipeptídeos diacorpo permitirá a formação de um diacorpo que contém o Domínio Fc biespecífico de duas cadeias (Figura 2).

[00170] Alternativamente, a incorporação de Domínios de IgG CH2-CH3 em apenas um dos polipeptídeos diacorpo permitirá que um diacorpo biespecífico que contém Domínio Fc de quatro cadeias mais complexo se forme (Figuras 3A-3C). A Figura 3C mostra um diacorpo representativo de quatro cadeias que tem o Domínio Constante Leve (CL) e o Domínio Constante Pesado CH1, no entanto porções de tais domínios, bem como outros polipeptídeos podem ser alternativamente empregados (consulte, por exemplo, as Figuras 3A e 3B, Publicação de Patente números US 2013-0295121; 2010-0174053 e 2009-0060910; Publicação de Patente Europeia números EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 e Publicação PCT números WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538). Assim, por exemplo, em vez do Domínio CH1, pode-se empregar um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos GVEPKSC (SEQ ID NO: 24), VEPKSC (SEQ ID NO: 25) ou AEPKSC (SEQ ID NO: 26), derivado do domínio de articulação de uma IgG humana, e em vez do domínio CL, pode-se empregar os 6 aminoácidos terminais C da cadeia leve kappa humana, GFNRGEC (SEQ ID NO: 27) ou FNRGEC (SEQ ID NO: 28). Um peptídeo representativo que contém diacorpo de quatro cadeias é mostrado na Figura 3A. Alternativamente, ou além disso, pode-se empregar um peptídeo que compreende domínios de espiral E tandem de carga oposta, como os domínios helicoidais de "espiral E" (SEQ ID NO: 29: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ou SEQ ID NO:31: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK); e os domínios de “espiral K” (SEQ ID NO:30: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE ou SEQ ID NO:32: KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE). Um domínio de espiral representativo que contém diacorpo de quatro cadeias é mostrado na Figura 3B.

[00171] Moléculas de diacorpo que contém Domínio Fc da presente invenção podem incluir peptídeos espaçadores intermediários adicionais (Ligantes), geralmente tais Ligantes serão incorporados entre um domínio de promoção de heterodímero (por exemplo, uma espiral E ou espiral K) e um Domínio CH2-CH3 e/ou entre um domínio CH2-CH3 e um domínio variável (isto é, VH ou VL). Tipicamente, os ligantes adicionais compreenderão 3 a 20 resíduos de aminoácidos e podem conter opcionalmente a totalidade ou uma porção de um Domínio de articulação de IgG (de preferência uma porção que contém cisteína de um Domínio de articulação de IgG que contém 1, 2, 3 ou mais resíduos de cisteína). Os ligantes que podem ser empregados nas moléculas de diacorpo que contém Domínio Fc biespecífico da presente invenção incluem: GGGS (SEQ ID NO:18), LGGGSG (SEQ ID NO:19), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:20), ASTKG (SEQ ID NO:21), LEPKSS (SEQ ID NO:22), APSSS (SEQ ID NO:23), APSSSPME (SEQ ID NO:37), VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:38), LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:39), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40), o ligante scFv: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:41); o ligante “longo”: GGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:42), GGC, e GGG. O ligante LEPKSS (SEQ ID NO: 22) pode ser usado em vez de GGG ou GGC para facilidade de clonagem. Além disso, os peptídeos GGG ou LEPKSS (SEQ ID NO: 22) podem ser imediatamente seguidos por DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40) para formar os ligantes alternativos: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:43); e LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:44). Moléculas que contém Domínio Fc biespecífico da presente invenção podem incorporar um Domínio de Articulação de IgG além de ou no lugar de um ligante. Os domínios de articulação exemplificativos incluem: EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 7) de IgG1, ERKCCVECPPCP

(SEQ ID NO: 8) de IgG2,

ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPP PCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 9) de IgG3, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 10) de IgG4, e ESKYGPPCPPCP (ID SEQ NO: 11) uma variante de articulação de IgG4 que compreende uma substituição S228P de estabilização (mostrado sublinhado) (conforme numerado pelo índice de EU conforme estabelecido em Kabat) para reduzir a troca de fita.

[00172] Conforme fornecido na Figura 3A-3C, diacorpos que contêm Domínio Fc da invenção podem compreender quatro cadeias. A primeira e a terceira cadeias de polipeptídeos de tal diacorpo contêm três domínios: (i) um domínio que contém VL1, (ii) um domínio que contém VH2, (iii) um domínio promotor de heterodímero e (iv) um domínio que contém uma sequência CH2-CH3. A segunda e a quarta cadeias de polipeptídeos contêm: (i) um domínio que contém VL2, (ii) um domínio que contém VH1, e (iii) um domínio promotor de heterodímero, em que os domínios de promoção de heterodímero promovem a dimerização da primeira/terceira cadeias de polipeptídeos com o segundo/quarto polipeptídeo correntes. Os domínios VL e/ou VH das terceira e quarta cadeias de polipeptídeos e os domínios VL e/ou VH das primeiras e segundas cadeias de polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica ou tetraespecífica. A notação "VL3" e "VH3" denotam, respectivamente, o Domínio Variável da Cadeia Leve e o Domínio Variável da Cadeia Pesada que ligam um "Terceiro Epítopo" de tal diacorpo. Da mesma forma, a notação "VL4" e "VH4" denotam, respectivamente, o Domínio Variável da Cadeia Leve e o Domínio Variável da Cadeia Pesada que ligam um "Quarto

Epítopo" de tal diacorpo. A estrutura geral das cadeias de polipeptídeos de um diacorpos biespecíficos que contém o Domínio Fc de quatro cadeias representativos da invenção é fornecida na Tabela 2: Tabela 2 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 1a cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH Biespecífico 1a cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 1a cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH Tetraespecífico 3a cadeia NH2-VL3-VH4-HPD-CH2-CH3-COOH 4a cadeia NH2-VL4-VH3-HPD-COOH HPD = Domínio de Promoção de Heterodímero

[00173] Em uma modalidade específica, diacorpos da presente invenção são biespecíficos, tetravalentes (isto é, possuem quatro domínios de ligação ao epítopo), diacorpos que contém Fc que são compostos por quatro cadeias de polipeptídeos totais (Figuras 3A-3C). Os diacorpos biespecíficos, tetravalentes, que contém Fc da invenção compreendem dois primeiros domínios de ligação ao epítopo e dois segundos domínios de ligação ao epítopo.

[00174] Em uma outra modalidade, os diacorpos que contém Domínio Fc da presente invenção podem compreender três cadeias de polipeptídeos. O primeiro polipeptídeo de tal diacorpo contém três domínios: (i) um domínio que contém VL1, (ii) um domínio que contém VH2 e (iii) um domínio que contém uma sequência CH2-CH3. O segundo polipeptídeo de tal diacorpo contém: (i) um Domínio que contém VL2, (ii) um Domínio que contém VH1 e (iii) um Domínio que promove heterodimerização e ligação covalente com a primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo. O terceiro polipeptídeo de tal diacorpo compreende uma sequência CH2-CH3. Assim, a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeos de tal diacorpo se associam para formar um domínio de ligação ao epítopo VL1/VH1 que tem capacidade de se ligar ao primeiro ou ao segundo epítopo, bem como um domínio de ligação ao epítopo VL2/VH2 que tem capacidade de ligar o outro de tais epítopos. O primeiro e o segundo polipeptídeos estão ligados um ao outro através de uma ligação dissulfeto envolvendo resíduos de cisteína em seus respectivos Terceiros Domínios. Notavelmente, a primeira e a terceira cadeias de polipeptídeos complexam uma com a outra para formar um domínio Fc que é estabilizado por meio de uma ligação dissulfeto. Esses diacorpos biespecíficos têm potência aumentada. As Figuras 4A e 4B ilustram as estruturas de tais diacorpos. Esses diacorpos que contém Domínio Fc podem ter qualquer uma das duas orientações (Tabela 3): Tabela 3 3a cadeia NH2-CH2-CH3-COOH Primeira Orientação 1a cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 3a cadeia NH2-CH2-CH3-COOH Segunda Orientação 1a cadeia NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH HPD = Domínio de Promoção de Heterodímero

[00175] Em uma modalidade específica, diacorpos da presente invenção são biespecíficos, bivalentes (isto é, possuem dois domínios de ligação ao epítopo), diacorpos que contém Fc que são compostos por três cadeias de polipeptídeos totais (Figuras 4A a 4B). Os diacorpos bivalentes que contêm Fc bivalente da invenção compreendem um Domínio de ligação ao epítopo imunoespecífico para o primeiro ou segundo epítopo, bem como um domínio de ligação ao epítopo VL2/VH2 que tem capacidade de se ligar ao outro de tais epítopos.

[00176] Em uma outra modalidade, os diacorpos que contém Domínio Fc podem compreender um total de cinco cadeias de polipeptídeos. Em uma modalidade particular, duas das cinco cadeias de polipeptídeos têm a mesma sequência de aminoácidos. A primeira cadeia de polipeptídeos de tal diacorpo contém: (i) um domínio que contém VH1, (ii) um domínio que contém CH1 e (iii) um domínio que contém uma sequência CH2-CH3. A primeira cadeia de polipeptídeos pode ser a cadeia pesada de um anticorpo que contém uma região constante de VH1 e uma cadeia pesada. A segunda e a quinta cadeias de polipeptídeos de tal diacorpo contêm: (i) um Domínio que contém VL1 e (ii) um Domínio que contém CL. A segunda e/ou quinta cadeias de polipeptídeos de tal diacorpo podem ser Cadeias Leves de um anticorpo que contém um VL1 complementar ao VH1 da primeira/terceira cadeia de polipeptídeos. A primeira, segunda e/ou quinta cadeias de polipeptídeos podem ser isoladas de um anticorpo de ocorrência natural. Alternativamente, podem ser construídos de forma recombinante. A terceira cadeia de polipeptídeos de tal diacorpo contém: (i) um Domínio que contém VH1, (ii) um Domínio que contém CH1, (iii) um Domínio que contém uma sequência CH2-CH3, (iv) um Domínio que contém VL2, (v) um Domínio que contém VH3 e (vi) um domínio de promoção de heterodímero, em que os domínios de promoção de heterodímero promovem a dimerização da terceira cadeia com a quarta cadeia.

O quarto polipeptídeo de tais diacorpos contém: (i) um Domínio que contém VL3, (ii) um Domínio que contém VH2 e (iii) um Domínio que promove a heterodimerização e ligação covalente com a terceira cadeia de polipeptídeos do diacorpo.

[00177] Assim, a primeira e a segunda, e a terceira e quinta cadeias de polipeptídeos de tais diacorpos se associam para formar dois Domínios de Ligação ao Epítopo VL1/VH1 com capacidade de se ligar a um primeiro epítopo. A terceira e a quarta cadeias de polipeptídeos de tais diacorpos se associam para formar um domínio de ligação ao epítopo VL2/VH2 que tem capacidade de se ligar a um segundo epítopo, bem como um domínio de ligação ao epítopo VL3/VH3 que tem capacidade de se ligar a um terceiro epítopo. O primeiro e o terceiro polipeptídeos estão ligados um ao outro através de uma ligação dissulfeto que envolve resíduos de cisteína em suas respectivas regiões constantes. Notavelmente, a primeira e a terceira cadeias de polipeptídeos complexam uma com a outra para formar um domínio Fc. Esses diacorpos multiespecíficos têm potência aumentada. A Figura 5 ilustra a estrutura de tais diacorpos. Será entendido que os domínios VL1/VH1, VL2/VH2 e VL3/VH3 podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação que é monoespecífica, biespecífica ou triespecífica.

[00178] Os domínios VL e VH das cadeias de polipeptídeos são selecionados de modo a formar domínios de ligação ao epítopo VL/VH específicos para um epítopo desejado. Os domínios de ligação ao epítopo VL/VH formados pela associação das cadeias de polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica. Em particular, os domínios VL e VH podem ser selecionados de modo que um diacorpo multivalente possa compreender dois domínios de ligação para um primeiro epítopo e dois domínios de ligação para um segundo epítopo, ou três domínios de ligação para um primeiro epítopo e um domínio de ligação para um segundo epítopo, ou dois domínios de ligação para um primeiro epítopo, um domínio de ligação para um segundo epítopo e um domínio de ligação para um terceiro epítopo (como representado na Figura 5). A estrutura geral das cadeias de polipeptídeos de diacorpos que contém Domínio Fc de cinco cadeias representativos da invenção é fornecida na Tabela 4: Tabela 4 2a cadeia NH2-VL1-CL-COOH 1a cadeia NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH Biespecífico NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD- 3a cadeia (2x2) COOH 5a cadeia NH2-VL1-CL-COOH 4a cadeia NH2-VL2-VH2-HPD-COOH 2a cadeia NH2-VL1-CL-COOH 1a cadeia NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH Biespecífico NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD- 3a cadeia (3x1) COOH 5a cadeia NH2-VL1-CL-COOH 4a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 2a cadeia NH2-VL1-CL-COOH 1a cadeia NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH Triespecífico NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD- 3a cadeia (2x1x1) COOH 5a cadeia NH2-VL1-CL-COOH 4a cadeia NH2-VL3-VH2-HPD-COOH HPD = Domínio de Promoção de Heterodímero

[00179] Em uma modalidade específica, diacorpos da presente invenção são biespecíficos, tetravalentes (isto é, possuem quatro domínios de ligação ao epítopo), diacorpos que contém Fc que são compostos por cinco cadeias de polipeptídeos totais com dois domínios de ligação ao epítopo imunoespecíficos para o primeiro epítopo, e dois domínios de ligação a epítopo específicos para o segundo epítopo. Em outra modalidade, os diacorpos biespecíficos, tetravalentes, que contém Fc da invenção compreendem três domínios de ligação a epítopo imunoespecíficos para o primeiro epítopo e um domínio de ligação a epítopo específico para o segundo epítopo. Conforme fornecido acima, os domínios VL e VH podem ser selecionados para permitir a ligação triespecífica. Consequentemente, a invenção também abrange diacorpos triespecíficos, tetravalentes, que contém Fc. Os diacorpos trispecíficos, tetravalentes, que contém Fc da invenção compreendem dois Domínios de Ligação ao Epítopo imunoespecíficos para o primeiro epítopo, um Domínio de Ligação ao Epítopo imunoespecífico para o segundo epítopo e um Domínio de Ligação ao Epítopo imunoespecífico para o terceiro epítopo.

[00180] Na função imunológica tradicional, a interação de complexos anticorpo-antígeno com células do sistema imunológico resulta em uma ampla gama de respostas, que vão desde funções efetoras, como citotoxicidade dependente de anticorpos, desgranulação de mastócitos e fagocitose, até sinais imunomoduladores, como a regulação de linfócitos proliferação e secreção de anticorpos. Todas essas interações são iniciadas através da ligação do Domínio Fc de anticorpos ou complexos imunes a receptores especializados de superfície celular em células hematopoiéticas. Conforme discutido acima,

a diversidade de respostas celulares desencadeadas por anticorpos e complexos imunes resulta da heterogeneidade estrutural dos três receptores Fc: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), e FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) e FcγRIII (CD16) são receptores de ativação (isto é, intensificadores do sistema imunológico); FcγRIIB (CD32B) é um receptor de inibição (isto é, amortecimento do sistema imunológico). Além disso, a interação com o receptor Fc neonatal (FcRn) medeia a reciclagem de moléculas de IgG do endossomo para a superfície celular e a liberação no sangue. A sequência de aminoácidos de IgG1 de tipo selvagem exemplificativo (SEQ ID NO: 12), IgG2 (SEQ ID NO: 13), IgG3 (SEQ ID NO: 14) e IgG4 (SEQ ID NO: 15) são apresentadas acima.

[00181] A modificação do domínio Fc pode levar a um fenótipo alterado, por exemplo, meia-vida sérica alterada, estabilidade alterada, suscetibilidade alterada a enzimas celulares ou função efetora alterada. Pode, portanto, ser desejável modificar uma molécula de ligação que contém Domínio Fc da presente invenção em relação à função efetora, por exemplo, de modo a aumentar a eficácia de tal molécula no tratamento de câncer. A redução ou eliminação da função efetora mediada pelo Domínio Fc é desejável em certos casos, por exemplo, no caso de anticorpos cujo mecanismo de ação envolve o bloqueio ou antagonismo, mas não a morte das células portadoras de um antígeno alvo. A função efetora aumentada é geralmente desejável quando direcionada a células indesejáveis, como células tumorais e estranhas, em que os FcγRs são expressos em níveis baixos, por exemplo, células B específicas de tumor com níveis baixos de FcγRIIB (por exemplo, linfoma não Hodgkin, CLL e linfoma de Burkitt). As moléculas da invenção que possuem tal atividade de função efetora conferida ou alterada são úteis para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção em que uma eficácia aumentada da atividade de função efetora é desejada.

[00182] Consequentemente, em certas modalidades, o Domínio Fc das moléculas que contém o Domínio Fc de ligação a gp41 da presente invenção pode ser um Domínio Fc variante manipulado. Embora o Domínio Fc das moléculas que contém o Domínio Fc biespecífico da presente invenção possam possuir a capacidade de se ligar a um ou mais receptores Fc (por exemplo, FcγR (s)), mais preferencialmente, tal Domínio Fc variante tem FcγRIA de ligação alterada (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16A) ou FcγRIIIB (CD16B) (em relação à ligação exibida por um Domínio Fc de tipo selvagem), por exemplo, terá ligação aumentada a um receptor de ativação e/ou terá substancialmente reduzido ou nenhuma capacidade para ligar receptor inibidor (ou receptores inibidores). Assim, o Domínio Fc das moléculas que contém o Domínio Fc da presente invenção pode incluir algum ou todo o Domínio CH2 e/ou algum ou todo o Domínio CH3 de um Domínio Fc completo, ou pode compreender um CH2 variante e/ou uma sequência CH3 variante (que pode incluir, por exemplo, uma ou mais inserções e/ou uma ou mais deleções em relação aos domínios CH2 ou CH3 de um domínio Fc completo). Tais Domínios Fc podem compreender porções de polipeptídeo não Fc, ou podem compreender porções de Domínios Fc não naturalmente completos, ou podem compreender orientações de ocorrência não natural de Domínios CH2 e/ou CH3 (como, por exemplo, dois Domínios CH2 ou dois Domínios CH3, ou na direção do terminal N para o terminal C, um domínio CH3 ligado a um domínio CH2 etc.).

[00183] As modificações do domínio Fc identificadas como alterando a função efetora são conhecidas na técnica, incluindo modificações que aumentam os receptores ativadores de ligação (por exemplo, FcγRIIA (CD16A) e reduzem os receptores inibidores de ligação (por exemplo, FcγRIIB (CD32B) (consulte, por exemplo, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890). A Tabela 5 lista substituições exemplificativas simples, duplas, triplas, quádruplas e quíntuplas (numeração (de acordo com o índice EU) e as substituições são relativas à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 como apresentado acima) de modificação exemplificativa que aumenta os receptores de ativação de ligação e/ou reduzir os receptores inibitórios de ligação.

Tabela 5 Variações de domínios Fc de ativação preferidos † Variações de sítio único F243L R292G D270E R292P Y300L P396L Variações de sítio duplo F243L e R292P F243L e Y300L F243L e P396L R292P e Y300L D270E e P396L R292P e V305I P396L e Q419H P247L e N421K R292P e P396L Y300L e P396L R255L e P396L R292P e P305I K392T e P396L Variações de sítio triplo F243L, P247L e N421K P247L, D270E e N421K F243L, R292P e Y300L R255L, D270E e P396L F243L, R292P e V305I D270E, G316D e R416G F243L, R292P e P396L D270E, K392T e P396L F243L, Y300L e P396L D270E, P396L e Q419H V284M, R292L e K370N R292P, Y300L e P396L Variações de sítio quádruplo L234F, F243L, R292P e Y300L F243L, P247L, D270E e N421K L234F, F243L, R292P e Y300L F243L, R255L, D270E e P396L

Tabela 5 Variações de domínios Fc de ativação preferidos † L235I, F243L, R292P e Y300L F243L, D270E, G316D e R416G L235Q, F243L, R292P e Y300L F243L, D270E, K392T e P396L P247L, D270E, Y300L e N421K F243L, R292P, Y300L e P396L R255L, D270E, R292G e P396L F243L, R292P, V305I e P396L R255L, D270E, Y300L e P396L F243L, D270E, P396L e Q419H D270E, G316D, P396L e R416G Variações de sítio quíntuplo L235V, F243L, R292P, Y300L e F243L, R292P, V305I, Y300L e P396L P396L L235P, F243L, R292P, Y300L e P396L † A numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat

[00184] Variantes exemplificativas de Domínios Fc de IgG1 humana com CD32B de ligação reduzido e/ou CD16A de ligação aumentada contêm substituições de F243L, R292P, Y300L, V305I ou P396L, em que a numeração é aquela do índice EU como em Kabat. Essas substituições de aminoácidos podem estar presentes em um Domínio Fc de IgG1 humano em qualquer combinação. Em uma modalidade, o domínio Fc de IgG1 humano variante contém uma substituição F243L, R292P e Y300L. Em outra modalidade, o domínio Fc de IgG1 humano variante contém uma substituição de F243L, R292P, Y300L, V305I e P396L.

[00185] Em certas modalidades, é preferido que os Domínios Fc das moléculas de ligação que contém Domínio Fc da presente invenção exibam FcγRIA (CD64) de ligação diminuída (ou substancialmente nenhuma), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16A ) ou FcγRIIIB (CD16B) (em relação à ligação exibida pelo Domínio Fc de IgG1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12)). Em uma modalidade específica, as moléculas de ligação que contém domínio Fc da presente invenção compreendem um domínio Fc de IgG que exibe função efetora de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo reduzida (ADCC).

Em uma modalidade preferida, os domínios CH2-CH3 de tais moléculas de ligação incluem qualquer 1, 2, 3 ou 4 das substituições: L234A, L235A, D265A, N297Q e N297G, em que a numeração é aquela do índice EU como em Kabat. Em outra modalidade, os domínios CH2-CH3 contêm uma substituição N297Q, uma substituição N297G, substituições L234A e L235A ou uma substituição D265A, uma vez que essas mutações abolem a ligação FcR. Alternativamente, um domínio CH2-CH3 de um domínio Fc de ocorrência natural que exibe inerentemente FcγRIIIA (CD16A) de ligação diminuída (ou substancialmente nenhuma) e/ou função efetora reduzida (em relação à função de ligação e efetora exibida pelo domínio Fc de IgG1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12)) é utilizado. Em uma modalidade específica, as moléculas de ligação que contêm o domínio Fc da presente invenção compreendem um domínio Fc de IgG2 (SEQ ID NO: 13), um domínio Fc de IgG3 (SEQ ID NO: 14) ou um domínio Fc de IgG4 (SEQ ID NO: 15). Quando um Domínio Fc de IgG4 é utilizado, a presente invenção também abrange a introdução de uma mutação de estabilização, tal como a substituição da região de articulação S228P descrita acima (consulte, por exemplo, SEQ ID NO: 11). Visto que as substituições N297G, N297Q, L234A, L235A e D265A abolem a função efetora, em circunstâncias em que a função efetora é desejada, essas substituições preferencialmente não seriam empregadas.

[00186] Uma sequência de IgG1 preferida para os domínios CH2 e CH3 das moléculas que contêm o domínio Fc da presente invenção com função efetora reduzida ou abolida compreenderá as substituições L234A/L235A (SEQ ID NO: 45):

[00187] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00188] A meia-vida sérica das proteínas que compreendem os domínios Fc pode ser aumentada aumentando-se a afinidade de ligação do domínio Fc para FcRn. O termo "meia- vida", tal como usado no presente documento, significa uma propriedade farmacocinética de uma molécula que é uma medida do tempo médio de sobrevivência das moléculas após sua administração. A meia-vida pode ser expressa como o tempo necessário para eliminar cinquenta por cento (50%) de uma quantidade conhecida da molécula do corpo de um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou outro mamífero) ou um compartimento específico do mesmo, por exemplo, conforme medido no soro, isto é, meia-vida circulante ou em outros tecidos. Em geral, um aumento na meia-vida resulta em um aumento no tempo médio de residência (MRT) em circulação para a molécula administrada.

[00189] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação que contém um domínio Fc da presente invenção compreendem um domínio Fc variante que compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a um domínio Fc de tipo selvagem, de modo que a molécula tenha uma meia-vida aumentada (em relação a tal molécula se compreende um Domínio Fc de tipo selvagem). Em algumas modalidades, as moléculas de ligação que contêm o domínio Fc da presente invenção compreendem um domínio Fc de IgG variante que compreende uma substituição de aminoácidos que prolonga a meia-vida em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 e 436, em que a numeração é a do índice EU como em Kabat. Numerosas mutações com capacidade de aumentar a meia-vida de uma molécula que contém o domínio Fc são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, M252Y, S254T, T256E e suas combinações. Por exemplo, consulte as mutações descritas nas Patentes números US 6.277.375,

7.083.784; 7.217.797, 8.088.376; Publicações números US 2002/0147311; 2007/0148164; e Publicações PCT números WO 98/23289; WO 2009/058492; e WO 2010/033279, que são incorporados no presente documento por referência em sua totalidade.

[00190] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação que contêm o domínio Fc da presente invenção exibindo meia-vida aumentada possuem um domínio Fc variante que compreende substituições em dois ou mais dos resíduos do domínio Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 e 436. Em particular, duas ou mais substituições selecionadas a partir de: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K, e Y436I, em que a numeração é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade específica, tais moléculas podem possuir um Domínio Fc de IgG variante que compreende a substituição:

[00191] (a) M252Y, S254T e T256E;

[00192] (B) M252Y e S254T;

[00193] (C) M252Y e T256E;

[00194] (D) T250Q e M428L;

[00195] (E) T307Q e N434A;

[00196] (F) A378V e N434A;

[00197] (G) N434A e Y436I;

[00198] (H) V308P e N434A; ou

[00199] (I) K288D e H435K.

[00200] Em uma modalidade preferida, uma molécula que contém Domínio Fc de ligação a gp41 da presente invenção possui uma Região IgG Fc variante que compreende qualquer 1, 2 ou 3 dentre as substituições: M252Y, S254T e T256E. A invenção abrange ainda moléculas de ligação a gp41 que possuem Regiões Fc variantes que compreendem:

[00201] (A) uma ou mais mutações que alteram a função efetora e/ou FcγR; e

[00202] (B) uma ou mais mutações que estendem a meia-vida sérica.

[00203] Uma sequência de IgG1 para os domínios CH2 e CH3 das moléculas que contêm o domínio Fc da presente invenção que fornece uma meia-vida aumentada (e que tem um aumento de 10 vezes na ligação a ambos os macacos cinomolgos e FcRn humano) (Dall'Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn),” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524) compreenderá as substituições M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO:46):

[00204] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00205] Uma sequência IgG1 alternativa para os domínios CH2 e CH3 das moléculas que contêm o domínio Fc da presente invenção combinando a função efetora reduzida ou abolida fornecida pelas substituições L234A/L235A e a meia- vida sérica aumentada fornecida pelas substituições M252Y/S254T/T256E é fornecido pela SEQ ID NO:47:

[00206] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00207] Para certos anticorpos, diacorpos e moléculas de ligação trivalentes que se deseja ter cadeias de polipeptídeos que contêm Domínio Fc de sequências de aminoácidos diferentes (por exemplo, cujas cadeias de polipeptídeos que contêm Domínio Fc são desejadas que não sejam idênticas), é desejável reduzir ou evitar que a homodimerização ocorra entre os domínios CH2-CH3 de cadeias idênticas (por exemplo, duas primeiras cadeias de polipeptídeos ou entre os domínios CH2-CH3 das duas terceiras cadeias de polipeptídeos). Os domínios CH2 e/ou CH3 de tais cadeias de polipeptídeos não precisam ser idênticos em sequência e, com vantagem, são modificados para promover a complexação de heterodímero entre as duas cadeias de polipeptídeos. Por exemplo, uma substituição de aminoácido (de preferência uma substituição com um aminoácido que compreende um grupo lateral volumoso formando um "botão", por exemplo, triptofano) pode ser introduzida no domínio CH2 ou CH3 de modo que a interferência estérica evite a interação com um domínio mutado de forma semelhante e obrigará o domínio mutado a emparelhar com um domínio no qual uma mutação complementar ou acomodativa foi projetada, isto é, “o orifício” (por exemplo, uma substituição por glicina). Esses conjuntos de mutações podem ser projetados em qualquer par de polipeptídeos que compreende domínios CH2-CH3 que formam um domínio Fc para promover a heterodimerização. Os métodos de engenharia de proteínas para favorecer a heterodimerização em relação à homodimerização são bem conhecidos na técnica, em particular no que diz respeito à engenharia de moléculas do tipo imunoglobulina, e são abrangidos no presente documento (consulte por exemplo, Ridgway et al. (1996) “‘Knobs-Into- Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26 a 35, e Xie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95 a 101; cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[00208] Um botão preferido é criado modificando-se um Domínio Fc de IgG para conter a modificação T366W. Um orifício preferido é criado modificando-se um Domínio Fc de IgG para conter a modificação T366S, L368A e Y407V. Para auxiliar na purificação de um homodímero de cadeia de polipeptídeos de portadora de orifício da molécula que contém o Domínio Fc heterodimérico biespecífico final, o domínio de ligação da Proteína A dos Domínios CH2 e CH3 de portadoras de orifício de uma cadeia de polipeptídeos é preferencialmente mutada por substituição de aminoácido na posição 435 (H435R). Assim, o homodímero de cadeia de polipeptídeos de mancal de orifício não se ligará à proteína A, enquanto o heterodímero biespecífico manterá sua capacidade de se ligar à proteína A por meio do domínio de ligação da proteína A. Em uma modalidade alternativa, a cadeia de polipeptídeos com orifício pode incorporar substituições de aminoácidos nas posições 434 e 435 (N434A/N435K).

[00209] Uma sequência de aminoácidos IgG1 preferida para os domínios CH2 e CH3 de uma cadeia de polipeptídeos que contém Domínio Fc de uma molécula que contém um Domínio Fc da presente invenção terá a sequência de "Portadora de Protuberância" (SEQ ID NO: 48):

[00210] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00211] Uma sequência de aminoácidos IgG1 alternativa para os Domínios CH2 e CH3 de uma cadeia de polipeptídeos contendo Domínio Fc de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção que tem uma substituição M252Y/S254T/T256E e uma sequência de "Portadora de Protuberância" é SEQ ID NO: 49:

[00212] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00213] Uma sequência de aminoácidos de IgG1 preferida para os domínios CH2 e CH3 da outra cadeia de polipeptídeos que contém um domínio Fc de uma molécula que contém um domínio Fc da presente invenção que tem duas cadeias de polipeptídeos (ou a terceira cadeia de polipeptídeos de uma molécula que contém um domínio Fc que tem três, quatro ou cinco cadeias de polipeptídeos) terão a sequência "portadora de orifícios" (SEQ ID NO: 50):

[00214] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00215] Uma sequência de aminoácidos IgG1 alternativa para os Domínios CH2 e CH3 da outra cadeia de polipeptídeos que contém Domínio Fc de uma molécula que contém um Domínio Fc da presente invenção com uma substituição M252Y/S254T/T256E e uma sequência de "Portadora de Orifício" é SEQ ID NO: 51:

[00216] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00217] Uma sequência de aminoácidos IgG4 para os domínios CH2 e CH3 da uma cadeia de polipeptídeos que contém domínio Fc de uma molécula que contém o domínio Fc da presente invenção aumentou a meia-vida sérica (em relação aos domínios IgG1 CH2 e CH3) devido à sua posse de Y252/T254/E256 (SEQ ID NO: 52):

[00218] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00219] Uma variante de "Portadora de Protuberância" de tal sequência de aminoácidos IgG4 CH2-CH3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53:

[00220] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00221] Uma variante de "Portadora de Orifício" de tal sequência de aminoácidos IgG4 CH2-CH3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54:

[00222] em que X é lisina (K) ou está ausente.

[00223] Como será observado, os domínios CH2-CH3 da SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 incluem uma substituição na posição 234 com alanina e 235 com alanina e, assim, forma um domínio Fc exibe (ou substancialmente nenhum) FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16A) ou FcγRIIIB (CD16B) (em relação à ligação exibida pelo Domínio Fc de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12)). A invenção também abrange tais domínios CH2- CH3, que compreendem os resíduos de alanina de tipo selvagem, substituições alternativas e/ou adicionais que modificam a função efetora e/ou atividade de ligação FγR do domínio Fc. A invenção também abrange tais domínios CH2-CH3, que compreendem ainda uma ou mais substituições de aminoácidos extensíveis de meia-vida. Em particular, a invenção engloba tais domínios

CH2-CH3 de Portadora de Orifício e Portadora de Protuberância que compreendem ainda o M252Y/S254T/T256E.

[00224] É preferido que a primeira cadeia de polipeptídeos tenha uma sequência CH2-CH3 de "Portadora de Protuberância", tal como a da SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 49. No entanto, como será reconhecido, um domínio CH2-CH3 de "Portadora de Orifício" (por exemplo, SEQ ID NO: 50 ou SEQ ID NO: 51) poderia ser empregado na primeira cadeia de polipeptídeos, caso em que, um domínio de "Portadora de Protuberância ”Domínio CH2-CH3 (por exemplo, SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 49) seria empregado na segunda cadeia de polipeptídeos de uma molécula que contém o Domínio Fc da presente invenção que tem duas cadeias de polipeptídeos (ou na terceira cadeia de polipeptídeos de uma molécula que tem um Domínio Fc com três, quatro ou cinco cadeias de polipeptídeos).

[00225] Em outras modalidades, a invenção abrange Moléculas de Ligação que contêm Domínio Fc que compreende Domínios CH2 e/ou CH3 que foram projetados para favorecer a heterodimerização em vez da homodimerização usando mutações conhecidas na técnica, tais como aquelas reveladas na Publicação PCT números WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867; WO 2014/081955; WO 2016/086189, todos os quais são incorporados no presente documento por referência em sua totalidade.

3. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO TRIVALENTES QUE CONTÉM

DOMÍNIOS FC

[00226] Uma outra modalidade da presente invenção se refere a moléculas de ligação trivalentes que compreendem um domínio Fc e têm capacidade de ligar simultaneamente um primeiro epítopo, um segundo epítopo e um terceiro epítopo, em que pelo menos um de tais epítopos não é idêntico a outro.

Essas moléculas de ligação trivalentes compreendem três domínios de ligação de epítopo, dois dos quais são domínios de ligação do tipo diacorpo, que fornecem domínio de ligação A e domínio de ligação B, e um dos quais é um domínio de ligação do tipo Fab ou um domínio de ligação do tipo scFv, que fornece domínio C de ligação (consulte, por exemplo, as Figuras 6A-6F, Publicações PCT números WO 2015/184207 e WO 2015/184203). Tais moléculas de ligação trivalentes compreendem, portanto, domínios "VL1"/"VH1" que têm capacidade de se ligarem ao primeiro epítopo e domínios "VL2"/"VH2" que têm capacidade de se ligarem ao segundo epítopo e domínios "VL3" e "VH3" que têm capacidade de se ligarem ao terceiro epítopo de tal molécula de ligação trivalente.

Um "Domínio de ligação do tipo diacorpo" é o tipo de domínio de ligação ao epítopo presente em um diacorpo, conforme descrito acima, em que uma única cadeia de polipeptídeos compreende tanto um domínio VL quanto um domínio VH, mas tais domínios não interagem para formar um sítio de ligação ao epítopo.

Cada um dentre um “domínio de ligação do tipo Fab” e um “domínio de ligação do tipo scFv” é do domínio de ligação ao epítopo do tipo presente em um anticorpo, conforme descrito acima, em que uma única cadeia de polipeptídeos compreende (1) tanto um domínio VL quanto um domínio VH, e uma segunda cadeia de polipeptídeos compreende o domínio VH ou o domínio VL correspondente de modo a formar um sítio de ligação ao epítopo, ou (2) tanto um domínio VL quanto um domínio VH, em que tais domínios interagem para formar um sítio de ligação ao epítopo.

Os domínios de ligação do tipo Fab também diferem dos domínios de ligação do tipo diacorpo em que as duas cadeias de polipeptídeos que formam um domínio de ligação do tipo Fab compreendem apenas um único domínio de ligação do epítopo, enquanto as duas cadeias de polipeptídeos que formam um domínio de ligação do tipo diacorpo compreendem pelo menos dois domínios de ligação ao epítopo. Da mesma forma, os domínios de ligação do tipo scFv também diferem dos domínios de ligação do tipo diacorpo porque compreendem apenas um único domínio de ligação ao epítopo. Assim, como usado no presente documento, os domínios de ligação do tipo Fab e scFv são distintos dos domínios de ligação do tipo diacorpo.

[00227] Normalmente, as moléculas de ligação trivalentes gp41 da presente invenção compreenderão quatro cadeias de polipeptídeos diferentes (consulte as Figuras 6A- 6B), no entanto, as moléculas podem compreender um número menor ou maior de cadeias de polipeptídeos, por exemplo, fundindo- se tais cadeias de polipeptídeos umas às outras (por exemplo, através de uma ligação peptídica) ou dividindo-se tais cadeias de polipeptídeos para formar cadeias de polipeptídeos adicionais, ou associando-se menos cadeias de polipeptídeos ou adicionais por meio de ligações dissulfeto. As Figuras 6C-6F ilustram esse aspecto da presente invenção, representando-se esquematicamente essas moléculas com três cadeias de polipeptídeos. Conforme fornecido nas Figuras 6A-6F, as moléculas de ligação trivalentes da presente invenção podem ter orientações alternativas em que os domínios de ligação do tipo diacorpo são terminal N (Figuras 6A, 6C e 6D) ou terminal C (Figuras 6B, 6E e 6F) para um domínio Fc. Os domínios CH2 e CH3 úteis para a geração de moléculas de ligação trivalentes são fornecidos acima e incluem domínios de Portadora de Protuberância e Portadora de Orifício.

[00228] Em certas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeos de tais moléculas de ligação a gp41 trivalentes da presente invenção contém: (i) um domínio que contém VL1, (ii) um domínio que contém VH2, (iii) um domínio promotor de heterodímero e (iv) um domínio que contém uma sequência CH2-CH3. Os domínios VL1 e VL2 estão localizados no terminal N ou terminal C do domínio que contém CH2-CH3, conforme apresentado na Tabela 5 (consulte também, Figuras 6A e 6B). A segunda cadeia de polipeptídeos de tais modalidades contém: (i) um domínio que contém VL2, (ii) um domínio que contém VH1, e (iii) um domínio de promoção de heterodímero. A terceira cadeia de polipeptídeos de tais modalidades contém: (i) um domínio que contém VH3, (ii) um domínio que contém CH1 e (iii) um domínio que contém uma sequência CH2-CH3. A terceira cadeia de polipeptídeos pode ser a cadeia pesada de um anticorpo que contém um VH3 e uma região constante da cadeia pesada, ou um polipeptídeo que contém tais domínios. O quarto polipeptídeo de tais modalidades contém: (i) um Domínio que contém VL3 e (ii) um Domínio que contém CL. As quartas cadeias de polipeptídeos podem ser uma cadeia leve de um anticorpo que contém um VL3 complementar ao VH3 da terceira cadeia de polipeptídeos, ou um polipeptídeo que contém esses domínios. A terceira ou quarta cadeias de polipeptídeos podem ser isoladas de anticorpos de ocorrência natural. Alternativamente, podem ser construídos de forma recombinante, sintética ou por outros meios.

[00229] O Domínio Variável da Cadeia Leve das primeiras e segundas cadeias de polipeptídeos são separados dos Domínios Variáveis da Cadeia Pesada de tais cadeias de polipeptídeos por um peptídeo espaçador interveniente com um comprimento que é muito curto para permitir seus domínios VL1/VH2 (ou seus VL2/VH1) para se associarem para formar um domínio de ligação ao epítopo com capacidade de se ligar ao primeiro ou ao segundo epítopo. Um peptídeo espaçador intermediário preferido (Ligante 1) para esse propósito tem a sequência (SEQ ID NO: 16): GGGSGGGG. Outros domínios das moléculas de ligação trivalentes podem ser separados por um ou mais peptídeos espaçadores intervenientes (ligantes), opcionalmente que compreende um resíduo de cisteína. Em particular, conforme fornecido acima, tais ligantes serão tipicamente incorporados entre Domínios Variáveis (isto é, VH ou VL) e Domínios de Promoção de Heterodímero de peptídeo (por exemplo, uma espiral E ou espiral K) e entre tais Domínios de Promoção de Heterodímero de peptídeo (por exemplo, uma espiral E ou espiral K) e domínios CH2-CH3. Ligantes exemplificativos úteis para a geração de moléculas de ligação trivalentes são fornecidos acima e também são fornecidos nos Pedidos Internacionais de Patente PCT números: WO 2015/184207; e WO 2015/184203. Assim, a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeos de tais moléculas de ligação trivalentes se associam para formar um domínio de ligação VL1/VH1 com capacidade de se ligar a um primeiro epítopo, bem como um domínio de ligação VL2/VH2 que tem capacidade de se ligar a um segundo epítopo. A terceira e quarta cadeias de polipeptídeos de tais moléculas de ligação trivalentes associam-se para formar um domínio de ligação VL3/VH3 que tem capacidade de se ligar a um terceiro epítopo.

[00230] Conforme descrito acima, as moléculas de ligação a gp41 trivalentes da presente invenção podem compreender três polipeptídeos. As moléculas de ligação trivalente que compreende três cadeias de polipeptídeos podem ser obtidas ligando-se os domínios do quarto terminal N de polipeptídeo ao domínio que contém VH3 do terceiro polipeptídeo (por exemplo, usando um peptídeo espaçador interveniente (ligante 4)). Alternativamente, é utilizada uma terceira cadeia de polipeptídeos de uma molécula de ligação trivalente da invenção que contém os seguintes domínios: (i) um Domínio que contém VL3, (ii) um Domínio que contém VH3 e (iii) um Domínio que contém uma sequência CH2-CH3, em que VL3 e VH3 são espaçados um do outro por um peptídeo espaçador interveniente que é suficientemente longo (pelo menos 9 ou mais resíduos de aminoácidos) de modo a permitir a associação desses domínios para formar um Domínio de Ligação ao Epítopo. Um peptídeo espaçador intermediário preferido para essa finalidade tem a sequência: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:41).

[00231] Será entendido que os domínios VL1/VH1, VL2/VH2 e VL3/VH3 de tais moléculas de ligação trivalentes podem ser diferentes de modo a permitir a ligação que é monoespecífica, biespecífica ou triespecífica. Em particular, os domínios VL e VH podem ser selecionados para que uma molécula de ligação trivalente compreenda dois domínios de ligação para um primeiro epítopo e domínios de ligação para um segundo epítopo, ou um domínio de ligação para um primeiro epítopo e dois domínios de ligação para um segundo epítopo, ou um domínio de ligação para um primeiro epítopo, um domínio de ligação para um segundo epítopo e um domínio de ligação para um terceiro epítopo.

[00232] A estrutura geral das cadeias de polipeptídeos de moléculas de ligação trivalentes representativas da invenção é fornecida nas Figuras 6A a 6H e na Tabela 6: Tabela 6 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Quatro cadeias 1a cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH 1a orientação 3a cadeia NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH 2a cadeia NH2-VL3-CL-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Quatro cadeias 1a cadeia NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH 2a orientação 3a cadeia NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH 2a cadeia NH2-VL3-CL-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Três cadeias 1a cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH 1a orientação 3a cadeia NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH 2a cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Três cadeias 1a cadeia NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH 2a orientação 3a cadeia NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH HPD = Domínio de Promoção de Heterodímero

[00233] Como fornecido acima, essas moléculas de ligação trivalentes podem compreender três, quatro, cinco ou mais cadeias de polipeptídeos. IV. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A GP41 EXEMPLIFICATIVAS DA

PRESENTE INVENÇÃO

[00234] A presente invenção é direcionada a moléculas de ligação a gp41 (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb®, um trident™ etc.) com capacidade de se ligar a um epítopo da proteína de envelope gp41 HIV-1 (Env) em virtude da sua posse de um domínio de ligação a gp41 otimizado com a especificidade de ligação do anticorpo 7B2.

A. A GLICOPROTEÍNA DE ENVELOPE (ENV) DE HIV

[00235] A glicoproteína de envelope (Env) de HIV é expressa na superfície das células infectadas produtivamente. O HIV tipo 1 (HIV-1) entra no hospedeiro através da mucosa em todas as transmissões em um processo conhecido como transcitose (Shen, R. et al. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell- Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3.648 a 3.655). Foi relatado que a transcitose de HIV-1 através do epitélio intestinal e genital envolve componentes virais, incluindo a proteína gp41 env (Bomsel, M. et al. (1998) “Intracellular Neutralization Of HIV Transcytosis Across Tight Epithelial Barriers By Anti-HIV Envelope Protein dIgA Or IgM,” Immunity 9:277 a 287; Alfsen, A. et al. (2002) “HIV-1 Gp41 Envelope Residues 650-685 Exposed On Native Virus Act As A Lectin To Bind Epithelial Cell Galactosyl Ceramide,” J. Biol. Chem. 277:25.649 a 25.659; Alfsen, A. et al. (2001) “Secretory IgA Specific For A Conserved Epitope On gp41 Envelope Glycoprotein Inhibits Epithelial Transcytosis Of HIV-1,” J. Immunol. 166:6.257 a 6.265; Tudor, D. et al. (2009) “HIV-1 gp41-Specific Monoclonal Mucosal IgAs Derived from Highly Exposed But IgG- Seronegative Individuals Block HIV-1 Epithelial Transcytosis And Neutralize CD4+ Cell Infection: An IgA Gene And Functional Analysis,” Mucosal Immunol. 2: 412 a 426), gp120 e gp160, e receptor de célula epitelial do hospedeiro e moléculas de fixação, incluindo a galactosilceramida de glicoesfingolipídeo, o correceptor CCR5 e os receptores de fixação de proteoglicanos de sulfato de heparina, sindecano e agrina (Shen, R. et al. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa and Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3.648 a

3.655.

[00236] Dessa forma, gp41 pode ser usado como um alvo para imunoconjugados citotóxicos (ICs), em que porções químicas de morte celular, incluindo toxinas, fármacos ou radionuclídeos, são quimicamente ou geneticamente ligados a moléculas de ligação a gp41 (consulte, por exemplo, Pincus, S.H. et al. (2017) “Design and In Vivo Characterization of Immunoconjugates Targeting HIV gp160,” J. Virol. 91(3). pii: e01360-16. doi: 10.1128/JVI.01360-16). B. ANTICORPO 7B2

[00237] O anticorpo 7B2 (números de acesso ao Genbank JX188438 e JX188439) é um anticorpo IgG1 humano env anti-HIV que se liga a gp41 do HIV em 598-604 na região imunodominante da hélice-laço-hélice da molécula (Sadraeian, M. et al. (2017) “Selective Cytotoxicity Of A Novel Immunotoxin Based On Pulchellin A Chain For Cells Expressing HIV Envelope,” Sci. Rep. 7(1):7579 doi: 10.1038/s41598-017-08037-3). O anticorpo foi isolado de um indivíduo infectado cronicamente com HIV-1 com uso de transformação de células B do vírus Epstein-Barr (EB) e produção de hetero-hibridoma (Pincus, S.H. et al. (2003) “In Vivo Efficacy Of Anti-Glycoprotein 41, But Not Anti-Glycoprotein 120, Immunotoxins In A Mouse Model Of HIV Infection,” J. Immunol. 170(4):2.236 a 2.241). Foi constatado que o anticorpo 7B2 tem capacidade de reconhecer partículas de vírus e células infectadas (Santra, S. et al. (2015) “Human Non-neutralizing HIV-1 Envelope Monoclonal Antibodies Limit the Number of Founder Viruses during SHIV Mucosal Infection in Rhesus Macaques,” PLoS Pathog. 11(8):e1005042. doi: 10.1371/journal.ppat.1005042; Tay, M.Z.

et al. (2016) “Antibody-Mediated Internalization of Infectious HIV-1 Virions Differs among Antibody Isotypes and Subclasses,” PLoS Pathog. 12(8):e1005817. doi:

10.1371:journal.ppat.1005817).

[00238] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo 7B2 (SEQ ID NO:55) é mostrada abaixo e na Figura 7A (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):

[00239] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo 7B2 (SEQ ID NO:56) é mostrada abaixo e na Figura 7B (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados): C. 7B2GL OTIMIZADO

[00240] A sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo 7B2GL otimizado (SEQ ID NO:57) é mostrada abaixo e na Figura 7A (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):

[00241] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo 7B2GL otimizado (SEQ ID NO:58) é mostrada abaixo e na Figura 7B (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados): V. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A CÉLULA

EFETORA

[00242] Conforme fornecido no presente documento, a presente invenção se refere a moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas que têm capacidade de se ligarem a um epítopo de gp41 e a um epítopo de uma molécula de superfície de célula efetora ("ECM"). Como usado no presente documento, o termo "célula efetora" denota uma célula que medeia direta ou indiretamente a morte de células alvo (por exemplo, células estranhas, células infectadas ou células cancerosas). Exemplos de células efetoras incluem células T auxiliares, células T citotóxicas, células assassinas naturais (NK), células plasmáticas (células B secretoras de anticorpos), macrófagos e granulócitos. As moléculas de superfície celular efetoras preferidas ("ECMs") incluem CD2, CD3, CD8, CD16, TCR e o receptor NKG2D. Consequentemente, as moléculas com capacidade de se ligar imunoespecificamente a um epítopo de tais moléculas, ou a outras moléculas da superfície celular efetoras, podem ser utilizadas de acordo com os princípios da presente invenção. Anticorpos exemplificativos, cujos domínios VH e/ou VL, e/ou 1, 2, ou todos os 3 dos CDRLs da região VL e/ou 1, 2 ou todos os 3 dos CDRHs do domínio VH, podem ser usados para construir moléculas com capacidade de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo são fornecidos abaixo. A. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A CD2

[00243] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo de CD2 presente na superfície de tal célula efetora. CD2 é uma molécula de adesão celular encontrada na superfície das células T e células assassinas naturais (NK). CD2 aumenta a citotoxicidade das células NK, possivelmente como um promotor de formação de nanotubos de células NK (Mace, E.M. et al.

(2014) “Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245 a 255; Comerci, C.J. et al. (2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation,” PLoS One 7(10):e47664:1- 12). As moléculas que se ligam especificamente ao CD2 incluem o anticorpo anti-CD2 “CD2 mAb Lo-CD2a”.

[00244] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD2 mAb Lo-CD2a (Número de Acesso ATCC: HB-11423); SEQ ID NO: 59) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):

[00245] A sequência de aminoácidos do domínio VL de CD2 mAb Lo-CD2a (Número de acesso ATCC: 11.423; SEQ ID NO:60) é mostrado abaixo (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados): B. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A CD3

[00246] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo de CD3. CD3 é um correceptor de células T composto por quatro cadeias distintas (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; páginas 1 a 14). Nos mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3γ, uma cadeia CD3δ e duas cadeias CD3ε. Essas cadeias se associam a uma molécula conhecida como receptor de células T (TCR) para gerar um sinal de ativação nos linfócitos T. Na ausência de CD3, os TCRs não se agrupam adequadamente e são degradados (Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170 a 177). O CD3 é encontrado ligado às membranas de todas as células T maduras e praticamente em nenhum outro tipo de célula (consulte, Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, páginas 214 a 216; Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913 a 923; Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. Fevereiro de 2006; 24 (2):133-139). As moléculas que se ligam especificamente ao CD3 incluem os anticorpos anti-CD3 “CD3 mAb 1” e “OKT3”. O anticorpo anti-CD3 CD3 mAb 1 tem capacidade de se ligar a primatas não humanos (por exemplo, macaco cinomolgo).

[00247] A sequência de aminoácidos do domínio VH de CD3 mAb 1 humanizado (SEQ ID NO:61) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00248] A sequência de aminoácidos do domínio VL de CD3 mAb 1 humanizado (SEQ ID NO:62) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00249] Uma variante humanizada "CD3 mAb 1 (D65G)" pode ser incorporada. CD3 mAb 1 (D65G) compreende o domínio VL de CD3 mAb 1 (SEQ ID NO:62) e um domínio VH CD3 mAb 1 com uma substituição D65G (Kabat posição 65, correspondente ao resíduo 68 de SEQ ID NO:63).

[00250] A sequência de aminoácidos do VH de CD3 mAb 1 (D65G) (SEQ ID NO:63) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados, a posição substituída (D65G) é mostrada em sublinhado duplo):

[00251] Alternativamente, uma variante de afinidade humanizada do mAb 1 CD3 pode ser incorporada. As variantes incluem uma variante de baixa afinidade designada “CD3 mAb 1 devagar” e uma variante com uma taxa de desativação mais rápida designada “CD3 mAb 1 rápido”. O domínio VL do mAb1 CD (SEQ ID NO:62) é comum ao mAb 1 CD3 baixo e ao mAb1 CD3 rápido e é fornecido acima. As sequências de aminoácidos dos Domínios VH de cada um dentre CD3 mAb 1 devagar e CD3 mAb1 rápido são fornecidas abaixo.

[00252] A sequência de aminoácidos do Domínio de Cadeia Pesada Variável do mAb 1 Baixo CD3 anti-humano (SEQ ID NO:64) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH estão sublinhados):

[00253] A sequência de aminoácidos do Domínio Variável da Cadeia Pesada do mAb 1 Rápido CD3 anti-humano (SEQ ID NO:65) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):

[00254] Outro anticorpo anti-CD3, que pode ser utilizado é o anticorpo Muromonab-CD3 "OKT3" (Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16 a 26); Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615 a 620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121 a 124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670 a 678).

[00255] A sequência de aminoácidos do domínio VH de OKT3 (SEQ ID NO:66) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00256] A sequência de aminoácidos do domínio VL de OKT3 (SEQ ID NO:67) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00257] Os anticorpos anti-CD3 adicionais que podem ser utilizados incluem, mas sem limitação a aqueles descritos nas Publicações PCT números WO 2008/119566; e WO 2005/118635. C. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A CD8

[00258] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo de CD8 presente na superfície de tal célula efetora. CD8 é um correceptor de células T composto por duas cadeias distintas (Leahy, DJ, (1995) “A Structural View of CD4 and CD8,”, FASEB J., 9:17 a 25) que é expresso em células T citotóxicas. Foi constatado que a ativação das células T CD8+ é mediada por interações coestimuladoras entre um antígeno: complexo principal de moléculas de histocompatibilidade classe I (MHC I) que está disposto em matriz na superfície de uma célula alvo e um complexo de CD8 e receptor de célula T, disposto em matriz na superfície da célula T CD8+ (Gao, G., e Jakobsen, B., (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor". Immunol Today 21: 630 a 636). Ao contrário das moléculas de MHC II, que são expressas apenas por certas células do sistema imunológico, as moléculas de MHC I são muito amplamente expressas. Assim, as células T citotóxicas com capacidade de se ligar a uma grande variedade de tipos de células. As células T citotóxicas ativadas mediam a morte celular através da liberação de citotoxinas perforina, granzimas e granulisina. Os anticorpos que se ligam especificamente ao CD8 incluem os anticorpos anti-CD8 “OKT8” e “TRX2”.

[00259] A sequência de aminoácidos do domínio VH de OKT8 (SEQ ID NO:68) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00260] A sequência de aminoácidos do domínio VL de OKT8 (SEQ ID NO:69) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00261] A sequência de aminoácidos do domínio VH de TRX2 (SEQ ID NO:70) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00262] A sequência de aminoácidos do domínio VL de TRX2 (SEQ ID NO:71) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados): D. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A CD16

[00263] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo de CD16. O CD16 é expresso por neutrófilos, eosinófilos, células assassinas naturais (NK) e macrófagos de tecido que se ligam a IgG humana agregada, mas não monomérica (Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 86(3):1.013 a 1.017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133 a 141; Miller, J.S. (2013)

“Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247 a 253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti- Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13 a 19; Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507 a 511). As moléculas que se ligam especificamente ao CD16 incluem os anticorpos anti-CD16 “3G8” e “A9”. Os anticorpos 3G8 humanizados (“h3G8”) são descritos na Publicação PCT número WO 03/101485.

[00264] A sequência de aminoácidos do domínio VH de murino 3G8 (SEQ ID NO:72) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00265] A sequência de aminoácidos do domínio VL de murino 3G8 (SEQ ID NO:73) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00266] A sequência de aminoácidos do domínio VH de h3G8 (SEQ ID NO:74) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00267] A sequência de aminoácidos do domínio VL de murino h3G8 (SEQ ID NO:75) é mostrada abaixo (os resíduos

CDRL são mostrados sublinhados):

[00268] A sequência de aminoácidos do domínio VH de A9 (SEQ ID NO:76) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00269] A sequência de aminoácidos do domínio VL de A9 (SEQ ID NO:77) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00270] A Patente número US 9.035.026 descreve um anticorpo anti-CD16 que tem capacidade de se ligar a CD16A, mas não a CD16B. Tal anticorpo é particularmente útil como um componente de uma molécula de ligação bi ou multiespecífica que é direcionada contra células associadas à doença, uma vez que recrutaria principalmente células NK, e não seria ligado por CD16B solúvel circulante ou desviado da ligação de células NK por ligação a neutrófilos ou eosinófilos ativados.

[00271] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo anti-CD16A da Patente número US 9.035.026 (SEQ ID NO:78) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):

[00272] As sequências de aminoácidos de sete domínios VL adequados para tal anticorpo anti-CD16A da Patente número US 9.035.026 são mostradas abaixo como SEQ ID Nos:79 a 85:

[00273] Em uma outra modalidade, os domínios de ligação a CD16 do anticorpo anti-CD16 humanizado, hCD16-M1 ou anticorpo anti-CD16 humanizado, hCD16-M2, podem ser empregados em conjunto com os domínios de ligação a gp41 para produzir moléculas de ligação multiespecíficas que têm capacidade de ligação a CD16 e gp41. A sequência de aminoácidos do domínio VH de hCD16-M1 (SEQ ID NO:127) é mostrada abaixo (os resíduos

CDRH são mostrados sublinhados):

[00274] A sequência de aminoácidos do domínio VL de hCD16-M1 (SEQ ID NO:128) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00275] O anticorpo hCD16-M2 é um derivado humanizado do anticorpo monoclonal CD16-M2 anti-humano murino. A humanização resultou em dois Domínios VH adequados (hCD16- M2 VH1 e hCD16-M2 VH2), qualquer um dos quais pode ser empregado com o Domínio VL humanizado obtido (hCD16-M2 VL1).

[00276] A sequência de aminoácidos do domínio VH de hCD16-M2 VH1 (SEQ ID NO:129) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00277] A sequência de aminoácidos do domínio VH de hCD16-M2 VH2 (SEQ ID NO:130) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00278] Como será reconhecido, a sequência de aminoácidos de hCD16-M2 VH1 (SEQ ID NO:129) difere daquela de hCD16-M2 VH2 (SEQ ID NO:130) por possuir uma substituição T98R no resíduo que precede imediatamente CDRH3 (mostrado caixa acima).

[00279] A sequência de aminoácidos do domínio VL de hCD16-M2 VL1 (SEQ ID NO:131) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00280] Os anticorpos anti-CD16 adicionais que podem ser utilizados incluem, mas sem limitação, anticorpos disponíveis comercialmente DJ130c (Tamm, A. et al. (1996) “The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc Gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding,” J. Immunol. 157(4):1.576 a 1.581), eBioCB16 (ThermoFisher) ou 1D3 (Abcam), ou aqueles descritos nas Publicações PCT números WO 03/101485; e WO 2006/125668. E. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A TCR

[00281] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo do receptor de células T (TCR). O Receptor de células T é expresso de forma nativa por células T CD4+ ou CD8+ e permite que essas células reconheçam peptídeos antigênicos que são ligados e apresentados por proteínas MHC de classe I ou classe II de células apresentadoras de antígenos. O reconhecimento de um complexo pMHC (peptídeo-MHC) por um TCR inicia a propagação de uma resposta imune celular que leva à produção de citocinas e à lise da célula apresentadora de antígenos (consulte, por exemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide–MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Parte 2):183 a 196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against

Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1.093 a 1.099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804 a 812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534 a 550). CD3 é o receptor que se liga ao TCR (Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170 a 177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex,” Immunol. Rev. 232(1):7 a 21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648 a 657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 9 de junho de 2009) “Bispecific T-célula Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4.941 a

4.944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation,” Annu. Rev. Immunol. 27:591 a 619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307 a 309).

[00282] As moléculas que se ligam especificamente ao receptor de células T incluem o anticorpo anti-TCR “BMA 031” (EP 0403156; Kurrle, R. et al. (1989) “BMA 031 – A TCR- Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1.017 a 1.019; Nashan, B. et al. (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4.270 a 4.272; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928 a 935; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression

And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4.366 a

4.373).

[00283] A sequência de aminoácidos de um domínio VH de BMA 031 (SEQ ID NO:86) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00284] A sequência de aminoácidos do domínio VL de BMA 031 (SEQ ID NO:87) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados): F. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A NKG2D

[00285] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo do receptor NKG2D. O receptor NKG2D é expresso em todas as células assassinas naturais humanas (e de outros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727 a 729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19 a 29) bem como em todas as células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255 a 260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19 a 29). As moléculas que se ligam especificamente ao receptor NKG2D incluem os anticorpos anti-NKG2D "KYK-1.0" e "KYK-2.0" (Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1.143 a 1.156).

[00286] A sequência de aminoácidos do domínio VH de KYK-1.0 (SEQ ID NO:88) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00287] A sequência de aminoácidos do domínio VL de KYK-1.0 (SEQ ID NO:89) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00288] A sequência de aminoácidos de um domínio VH de KYK-2.0 (SEQ ID NO:90) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00289] A sequência de aminoácidos de um domínio VL de KYK-2.0 (SEQ ID NO:91) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados): G. CAPACIDADES EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO A NKP46

[00290] Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo de NKp46 (CD335). NKp46 é um importante receptor de ativação de células NK que está envolvido na eliminação de células-alvo (Sivori S, et al. (1997). "p46, a Novel Natural Killer Cell–specific Surface Molecule That Mediates Cell Activation," J. Exp. Med. 186 (7): 1.129 a 36). NKp46 é expresso exclusivamente em todos os subconjuntos de células NK (Narni-Mancinelli E, et al. (2011). “Fate mapping analysis of lymphoid cells expressing the NKp46 cell surface receptor,” Proc Natl Acad Sci U S A 108:18.324 a 9). As moléculas que se ligam especificamente ao NKp46 incluem os anticorpos anti-NKp46 “BAB281” e “NKp46- 3” (WO 2015/197593).

[00291] A sequência de aminoácidos do domínio VH de BAB281 (SEQ ID NO:92) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00292] A sequência de aminoácidos do domínio VL de BAB281 (SEQ ID NO:93) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00293] A sequência de aminoácidos do domínio VH de NKp46-3 (SEQ ID NO:94) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00294] A sequência de aminoácidos do domínio VL de NKp46-3 (SEQ ID NO:95) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00295] Anticorpos adicionais que se ligam a NKp46 são descritos em WO 2015/197593 e WO 2017/016805. Outros anticorpos exemplificativos que se ligam à superfície celular de uma célula assassina natural incluem anticorpos: A1, AC2, EPR3678 (2), EPR20461, EPR20627 e IMG17B5F11 (que ligam CD39); TB01, HNK-1 / Leu-7 e NK1 (que ligam CD57); FN50 (que se liga a CD69); 5B5, B-L2, TS82b e C33 (que se ligam a CD82); 3B3, B199.2 e EP7169 (que ligam CD161); 17D9 (que liga CLEC1B); 2F9 (que liga KIR2DL1); EPR8825 (que liga KIR2DL2); mAb 33 (que se liga a KIR2DL4); 11E3, 17B4, EPR4392 (2), EPR20261 e EPR 20627 (que se ligam ao Gene de Ativação de Linfócitos 3); A10, C7, CX5, 1D11 e MM0489-10R27 (que se ligam a NKG2D); BMK13 (que liga PRG2); EPR9916 (que liga SLAMF6); etc. Os anticorpos com capacidade de se ligarem a cada uma dessas moléculas de superfície das células NK estão comercialmente disponíveis na Abcam plc e outras fontes, e podem ser facilmente adaptados aos fins da presente invenção. VI. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ALTERNATIVAS A HIV-1

EXEMPLIFICATIVAS

[00296] O trímero da glicoproteína do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) maduro (Env) é composto por três cópias de um heterodímero gp120/gp41 ligado não covalentemente que surge da clivagem da proteína precursora gp160 viral. Em uma modalidade, as moléculas da invenção têm capacidade de se ligarem a um epítopo da proteína Env do HIV- 1 gp120, gp160 e/ou gp41 que é distinto do epítopo de 7B2.

[00297] O anticorpo monoclonal A32 reconhece um epítopo conformacional na região C1 do HIV-1 Env gp120 (Wyatt et al. (1995) “Involvement Of The V1/V2 Variable Loop Structure In The Exposure Of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Epitopes Induced By Receptor Binding,” J. Virol. 69:5.723 a

5.733) e medeia a atividade ADCC potente e pode bloquear uma proporção significativa da atividade Ab mediadora de ADCC detectável em indivíduos infectados com HIV-1 (Ferrari, G. et al. (2011) “An HIV-1 gp120 Envelope Human Monoclonal Antibody That Recognizes a C1 Conformational Epitope Mediates Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Activity and Defines a Common ADCC Epitope in Human HIV-1 Serum,” J. Virol. 85(14):7.029 a 7.036).

[00298] Vários domínios VH do anticorpo A32 foram relatados na técnica que possuem pequenas alterações nas regiões estruturais 1 e/ou 4 relatadas (consulte, por exemplo, número de acesso à base de dados de proteína PDB: 4YBL_H, US 2015/0239961 e WO 2006/044410). Qualquer um destes Domínios VH do Anticorpo A32 variantes podem ser utilizado de acordo com a presente invenção. A sequência de aminoácidos de um Domínio VH ilustrativa de A32 (SEQ ID NO: 96) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00299] A sequência de aminoácidos do domínio VL de A32 (SEQ ID NO:97) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00300] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de A32 (SEQ ID NO:97) pode ser empregada com o Domínio VH ilustrativo de A32 (SEQ ID NO:96) ou com qualquer um dos Domínios VH do Anticorpo A32 variante (consulte, por exemplo, Número de Acesso ao Banco de Dados de Proteína PDB: 4YBL_H, US 2015/0239961 e WO 2006/044410) para formar um sítio de ligação ao epítopo anti-HIV-1 Env gp120.

[00301] O anticorpo monoclonal 10-1074 tem como alvo a base do laço V3 do HIV-1 Env gp120 (consulte, por exemplo, o documento número WO 2014/063059) e está entre os anticorpos neutralizantes anti-HIV-1 mais potentes isolados e mostrou alguma atividade in vivo em um ensaio clínico em estágio inicial (Caskey, M., et al., (2017) “Antibody 10-1074 Suppresses Viremia In HIV-1-infected individuals.” Nat Med. 23:185 a 191).

[00302] A sequência de aminoácidos do domínio VH de 10-1074 (SEQ ID NO:98) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00303] A sequência de aminoácidos do domínio VL de 10-1074 (SEQ ID NO:99) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00304] O anticorpo monoclonal 3BNC117 tem como alvo o sítio de ligação a CD4 de gp120 e é um anticorpo anti- HIV-1 amplamente neutralizante (consulte, por exemplo, o documento número WO 2013/016468) que mostrou alguma atividade in vivo em um ensaio clínico de estágio inicial (Caskey, M., et al. (2015) “Viraemia Suppressed In HIV-1-Infected Humans By Broadly Neutralizing Antibody 3BNC117,” Nature 522:487 a 491).

[00305] A sequência de aminoácidos do domínio VH de 3BNC117 (SEQ ID NO:100) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00306] A sequência de aminoácidos do domínio VL de 3BNC117 (SEQ ID NO:101) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00307] Os anticorpos monoclonais PGT121 e PGT145 são amplamente neutralizantes de anticorpos HIV-1 que são amplamente dependentes do glicano gp120 para reconhecimento de Env (Mouquet H, et al., (2012) “Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.” Proc Natl Acad Sci U S A 109: E3268–3277; Yasmeen, A., et al. (2014) “Differential Binding Of Neutralizing And Non- Neutralizing Antibodies To Native-Like Soluble HIV-1 Env Trimers, Uncleaved Env Proteins, And Monomeric Subunits.” Retrovirology 11:41; WO 2012/030904).

[00308] A sequência de aminoácidos do domínio VH de PGT121 (SEQ ID NO:102) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00309] A sequência de aminoácidos do domínio VL de PGT121 (SEQ ID NO:103) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00310] A sequência de aminoácidos do domínio VH de PGT145 (SEQ ID NO:104) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00311] A sequência de aminoácidos do domínio VL de PGT145 (SEQ ID NO:105) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00312] O anticorpo monoclonal VRC01 é um anticorpo anti-HIV-1 amplamente neutralizante dirigido contra o sítio de ligação a CD4 da gp120 (Wu, X. et al. (2010) “Rational Design Of Envelope Identifies Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibodies To HIV-1,” Science 329:856 a 861 e Zhou, T. et al. (2010) “Structural Basis For Broad And Potent Neutralization Of HIV-1 By Antibody VRC01,” Science 329:811 a 817; WO 2013/163427).

[00313] A sequência de aminoácidos do domínio VH de VRC01 (SEQ ID NO:106) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00314] A sequência de aminoácidos do domínio VL de VRC01 (SEQ ID NO:107) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00315] O anticorpo monoclonal 10E8 é um anticorpo específico da região externa proximal da membrana gp41 do HIV- 1 amplamente neutralizante (MPER) (Huang, J., et al. 2012. “Broad And Potent Neutralization Of HIV-1 By A gp41-Specific Human Antibody.” Nature. 491:406 a 12).

[00316] A sequência de aminoácidos do domínio VH de 10E8 (SEQ ID NO:108) é mostrada abaixo (os resíduos CDRH são mostrados sublinhados):

[00317] A sequência de aminoácidos do domínio VL de 10E8 (SEQ ID NO:109) é mostrada abaixo (os resíduos CDRL são mostrados sublinhados):

[00318] A presente invenção inclui e engloba especificamente moléculas de ligação multiespecíficas de gp41 que compreendem o domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todos os 3 CDRLs da região VL e/ou 1, 2 ou todos os 3 CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-HIV-1 fornecidos acima. VII. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A GP41 MULTISPECÍFICAS

EXEMPLIFICATIVAS

[00319] É fornecida no presente documento uma série de moléculas de ligação a gp41 exemplificativas que incorporam um primeiro domínio de ligação de epítopo que é imunoespecífico para um epítopo de gp41 (isto é, um domínio de ligação a gp41) e um segundo domínio de ligação ao epítopo que é imunoespecífico para um epítopo de um ECM. Opcionalmente, tais moléculas incorporam um terceiro domínio de ligação de epítopo (ou um terceiro domínio de ligação de epítopo e um quarto domínio de ligação de epítopo) que é imunoespecífico para um epítopo diferente de gp41 e/ou um epítopo de uma molécula de HIV-1 diferente e/ou um epítopo diferente do ECM e/ou um epítopo de um ECM diferente. Particularmente preferidas são as moléculas que compreendem os domínios de ligação a gp41 otimizados de 7B2GL. As estruturas e sequências de tais moléculas de ligação a gp41 ilustrativas estão resumidas na Tabela 7 e são descritas em detalhes abaixo. Como será reconhecido, moléculas análogas podem da mesma forma ser construídas (empregando-se os domínios VL e VH dos anticorpos desejados em vez dos domínios VL e VH usados nas moléculas de ligação a gp41 ilustrativas.

Tabela 7 Cadeia Domínio VL Domínio VH Nome do SEQ SEQ de SEQ SEQ Outro diacorp ID Anticor Antico ID polipep ID ID domínio o NO po rpo NO tídeos NO NO DART-1 1 110 7B2 55 63 Espiral E Cys 31

Tabela 7 Cadeia Domínio VL Domínio VH Nome do SEQ SEQ de SEQ SEQ Outro diacorp ID Anticor Antico ID polipep ID ID domínio o NO po rpo NO tídeos NO NO Portadora CD3 de mAb 1 48 Protuberâ (G65D) ncia Fc CD3 mAb Espiral K 2 111 62 7B2 56 32 1 Cys Portadora Cadeia de polipeptídeos de 3 112 50 de diacorpo comum Orifício Fc Espiral E Cys 31 CD3 Portadora 1 113 7B2GL 57 mAb 1 63 de (G65D) 48 Protuberâ ncia Fc DART-A CD3 mAb Espiral K 2 114 62 7B2GL 58 32 1 Cys Portadora Cadeia de polipeptídeos de 3 112 50 de diacorpo comum Orifício Fc Espiral E Cys 31 Portadora 1 115 7B2GL 57 h3G8 74 de 48 Protuberâ ncia Fc DART-B Espiral K 2 116 h3G8 75 7B2GL 58 32 Cys Portadora Cadeia de polipeptídeos de 3 112 50 de diacorpo comum Orifício Fc 1 113 7B2GL 57 63 Espiral E Cys 31

Tabela 7 Cadeia Domínio VL Domínio VH Nome do SEQ SEQ de SEQ SEQ Outro diacorp ID Anticor Antico ID polipep ID ID domínio o NO po rpo NO tídeos NO NO Portadora CD3 de mAb 1 48 Protuberâ (G65D) ncia Fc CD3 mAb Espiral K 2 114 62 7B2GL 58 32 1 Cys TRIDENT IgG CH1 3 -A Articulaç 7 ão de IgG 3 117 TRX2 70 Portadora de 50 Orifício Fc 4 118 TRX2 71 CL Kappa 1 Espiral E Cys 31 CD3 Portadora 1 113 7B2GL 57 mAb 1 63 de (G65D) 48 Protuberâ ncia Fc CD3 mAb Espiral K 2 114 62 7B2GL 58 32 1 Cys

TRIDENT IgG CH1 3 -B Articulaç 7 ão de IgG 3 119 A32 96 Portadora de 50 Orifício Fc 4 120 A32 97 CL Kappa 1 1 115 7B2GL 57 h3G8 74 Espiral E Cys 31

Tabela 7 Cadeia Domínio VL Domínio VH Nome do SEQ SEQ de SEQ SEQ Outro diacorp ID Anticor Antico ID polipep ID ID domínio o NO po rpo NO tídeos NO NO Portadora de 48 Protuberâ ncia Fc

2 116 h3G8 75 7B2GL 58 Espiral K 32 Cys TRIDENT IgG CH1 3 -C Articulaç 7 ão de IgG 3 119 A32 96 Portadora de 50 Orifício Fc 4 120 A32 97 CL Kappa 1 Espiral E Cys 31 Domínio CD3 Fc de 1 113 7B2GL 57 mAb 1 63 Portadora (G65D) 48 de Protuberâ ncia CD3 mAb Espiral K 2 114 62 7B2GL 58 32 TRIDENT 1 Cys -D IgG CH1 3 Articulaç 7 ão de IgG 3 121 7B2GL 58 Portadora de 50 Orifício Fc 4 122 7B2GL 57 CL Kappa 1

A. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD3, DART-1

[00320] A molécula de ligação a gp41 x CD3 designada "DART-1" é uma primeira molécula de ligação a gp41 biespecífica ilustrativa. DART-1 é um diacorpo biespecífico que contém Domínio Fc, com capacidade de se ligar a gp41 e ao antígeno CD3. DART-1 é composto por três cadeias de polipeptídeos e possui um domínio de ligação que compreende os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti-humano 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de gp41) e um domínio de ligação que compreende o VL e VH Domínios do mAb 1 CD3 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno CD3). As três cadeias de polipeptídeos se associam para formar um diacorpo covalentemente ligado com capacidade de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de gp41 e ao epítopo do Antígeno CD3 (consulte, por exemplo, Figura 4A).

[00321] A primeira cadeia de polipeptídeos de DART-1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110:

[00322] Os resíduos 1-113 da primeira cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:110) de DART-1 correspondem ao Domínio VL do 7B2 (SEQ ID NO:55). Os resíduos 114 a 121 (sublinhado duplo) da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem ao Ligante 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Os resíduos 122-246 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem ao Domínio VH do mAb 1 CD3 (D65G) (SEQ ID NO:63). Os resíduos 247-251 correspondem a um ligante (SEQ ID NO:21, sublinhado). Os resíduos 252-279 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a uma espiral E que contém cisteína (SEQ ID NO:31). Os resíduos 280-292 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a um ligante (SEQ ID NO:40). Os resíduos 293-509 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a uma “Portadora de Protuberância” (SEQ ID NO:48), em que o resíduo final é lisina.

[00323] A segunda cadeia de polipeptídeos de DART- 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111:

[00324] Os resíduos 1-110 da segunda cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:111) do DART-1 correspondem ao Domínio VL do mAb 1 CD3 (SEQ ID NO:62). Os resíduos 111-118 (sublinhado duplo) da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem ao Ligante 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Os resíduos 119-244 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem ao Domínio VH de 7B2 (SEQ ID NO:56). Os resíduos 245-249 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem a um ligante (SEQ ID NO:21, sublinhado). Os resíduos 250-277 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem a uma espiral K que contém cisteína (SEQ ID NO:32).

[00325] A terceira cadeia de polipeptídeos de DART-1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112:

[00326] Os resíduos 1-10 da terceira cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:112) do DART-1 correspondem a um ligante (SEQ ID NO:40). Os resíduos 11-227 da terceira cadeia de polipeptídeos correspondem a um Domínio IgG1 CH2-CH3 "Portadora de Orifício" (SEQ ID NO:50), que contém a substituição H435R (mostrada sublinhada) e em que o resíduo final é lisina. Conforme afirmado acima, a substituição H435R elimina a capacidade da molécula de se ligar para se ligar à Proteína A.

[00327] Conforme será reconhecido, a terceira cadeia de polipeptídeos de DART-1 não contém quaisquer sítios de ligação ao epítopo e pode, portanto, ser empregada em várias moléculas de ligação a gp41 têm a estrutura geral fornecida nas Figuras 4A a 4B. Consequentemente, a terceira cadeia de polipeptídeos do DART-1 é mencionada no presente documento a "cadeia de polipeptídeos de diacorpo comum". B. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD3, DART-A

[00328] Uma segunda molécula de ligação a gp41 x CD3 ilustrativa, designada "DART-A", é semelhante ao DART-1 descrito acima, mas contém os domínios VL e VH do anticorpo 7B2GL gp41 anti-humano em vez do Domínios 7B2 VL e VH parentais.

[00329] A primeira cadeia de polipeptídeos de DART-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:113:

[00330] Os resíduos 1-113 da primeira cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:113) de DART-A correspondem ao Domínio VL de 7B2GL (SEQ ID NO:57). Os resíduos 114 a 121 (sublinhado duplo) da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem ao Ligante 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Os resíduos 122-246 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem ao Domínio VH do mAb 1 CD3 (D65G) (SEQ ID NO:63). Os resíduos 247-251 correspondem a um ligante (SEQ ID NO:21, sublinhado). Os resíduos 252-279 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a uma espiral E que contém cisteína (SEQ ID NO:31). Os resíduos 280-292 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a um ligante (SEQ ID NO:40). Os resíduos 293-509 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a uma “Portadora de Protuberância” (SEQ ID NO:48), em que o resíduo final é lisina.

[00331] A segunda cadeia de polipeptídeos de DART- A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:114:

[00332] Os resíduos 1-110 da segunda cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:114) do DART-A correspondem ao Domínio VL do mAb 1 CD3 (SEQ ID NO:62). Os resíduos 111-118 (sublinhado duplo) da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem ao Ligante 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Os resíduos 119-244 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem ao Domínio VH de 7B2GL (SEQ ID NO:58). Os resíduos 245-249 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem a um ligante (SEQ ID NO:21, sublinhado). Os resíduos 250-277 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem a uma espiral K que contém cisteína (SEQ ID NO:32).

[00333] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia de polipeptídeos de DART-A é a mesma da terceira cadeia de polipeptídeos do DART-1 (isto é, SEQ ID NO:112). C. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD16, DART-B

[00334] A molécula de ligação a gp41 x CD16 designada "DART-B" é uma terceira molécula de ligação a gp41 biespecífica ilustrativa. O DART-B é semelhante ao DART-A descrito acima, mas compreende um domínio de ligação a CD16 em vez do domínio de ligação a CD3 do DART-A. Assim, o DART-B é composto por três cadeias de polipeptídeos e possui um domínio de ligação que compreende os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti-humano 7B2GL (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de gp41), e um domínio de ligação que compreende o Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano 3G8 (e, portanto, é imunoespecífico para um epítopo de CD16).

[00335] A primeira cadeia de polipeptídeos de DART-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:115:

[00336] Os resíduos 1-113 da primeira cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:115) de DART-B correspondem ao Domínio VL de 7B2GL (SEQ ID NO:57). Os resíduos 114 a 121 (sublinhado duplo) da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem ao Ligante 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Os resíduos 122-239 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem ao Domínio VH de h3G8 (SEQ ID NO:74). Os resíduos 240-244 correspondem a um ligante (SEQ ID NO:21, sublinhado). Os resíduos 245-272 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a uma espiral E que contém cisteína (SEQ ID NO:31). Os resíduos 273-285 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a um ligante (SEQ ID NO:40). Os resíduos 286-502 da primeira cadeia de polipeptídeos correspondem a uma “Portadora de Protuberância” (SEQ ID NO:48), em que o resíduo final é lisina.

[00337] A segunda cadeia de polipeptídeos de DART- B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:116:

[00338] Os resíduos 1-111 da segunda cadeia de polipeptídeos (SEQ ID NO:116) de DART-B correspondem ao Domínio VL de h3G8 (SEQ ID NO:75). Os resíduos 112-119 (sublinhado duplo) da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem ao Ligante 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Os resíduos 120-245 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem ao Domínio VH de 7B2GL (SEQ ID NO:58). Os resíduos 246-250 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem a um ligante (SEQ ID NO:21, sublinhado). Os resíduos 251-278 da segunda cadeia de polipeptídeos correspondem a uma espiral K que contém cisteína (SEQ ID NO:32).

[00339] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia de polipeptídeos de DART-A é a mesma da terceira cadeia de polipeptídeos do DART-A (isto é, SEQ ID NO:112). D. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD3 X CD8, TRIDENT-

A

[00340] A molécula de ligação a gp41 x CD3 x CD8 designada “TRIDENT-A” é uma primeira molécula de ligação a gp41 trivalente ilustrativa. TRIDENT-A é composto por quatro cadeias de polipeptídeos e tem um domínio de ligação que compreende os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti-humano 7B2GL (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de gp41), um domínio de ligação que compreende Domínios VL e VH do mAb 1 CD3 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno CD3) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de TRX8 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno CD8). As quatro cadeias de polipeptídeos se associam para formar uma molécula trivalente ligada covalentemente com capacidade de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de gp41, ao epítopo do antígeno CD3 e ao epítopo de CD8 (consulte, por exemplo, Figura 6A).

[00341] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-A é a mesma da primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-A descrito acima (SEQ ID NO:113). De modo similar, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-A é a mesma da segunda cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-A descrito acima (SEQ ID NO:114).

[00342] A terceira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:117:

[00343] Os resíduos 1-121 da terceira cadeia de polipeptídeos TRIDENT-A correspondem ao Domínio VH do anticorpo anti-CD8 TRX2 (SEQ ID NO: 70). Os resíduos 121-219 correspondem a um Domínio IgG1 CH1 (SEQ ID NO:3). Os resíduos 220-234 correspondem a um domínio de articulação de IgG1 (SEQ ID NO: 7). Os resíduos 235-451 correspondem ao Domínio CH2-CH3 "Portadora de Orifício" de IgG1 (SEQ ID NO: 50).

[00344] A quarta cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:118:

[00345] Os resíduos 1-106 da quarta cadeia de polipeptídeos TRIDENT-A correspondem ao Domínio VL do anticorpo anti-CD8 TRX2 (SEQ ID NO: 71). Os resíduos 107-213 correspondem a um domínio CL Kappa (SEQ ID NO: 1). E. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD3 X GP120, TRIDENT-

B

[00346] Uma segunda molécula de ligação a gp41 x CD3 x gp120 trivalente ilustrativa, designada "TRIDENT-B", é semelhante ao TRIDENT-A descrito acima, mas contém os domínios VL e VH do anticorpo gp120 anti-humano A32 em vez do Domínios VL TRX8 e VH de TRIDENT-A. Assim, TRIDENT-B é composto por quatro cadeias de polipeptídeos e possui um domínio de ligação que compreende os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti- humano 7B2GL (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de gp41), um domínio de ligação que compreende os Domínios VL e VH de mAb 1 CD3 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno CD3) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de A32 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno gp120).

[00347] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-B é a mesma da primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-A descrito acima (SEQ ID NO:113). De modo similar, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-B é a mesma da segunda cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-A descrito acima (SEQ ID NO:114).

[00348] A terceira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:119:

[00349] Os resíduos 1-123 da terceira cadeia de polipeptídeos TRIDENT-B correspondem ao Domínio VH do anticorpo anti-gp120 A32 (SEQ ID NO: 96). Os resíduos 124-221 correspondem a um Domínio IgG1 CH1 (SEQ ID NO:3). Os resíduos 222-236 correspondem a um domínio de articulação de IgG1 (SEQ ID NO: 7). Os resíduos 237-453 correspondem ao Domínio CH2-CH3 "Portadora de Orifício" de IgG1 (SEQ ID NO: 50).

[00350] A quarta cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:120:

[00351] Os resíduos 1-110 da quarta cadeia de polipeptídeos TRIDENT-B correspondem ao Domínio VL do anticorpo anti-gp120 A32 (SEQ ID NO: 97). Os resíduos 111-217 correspondem a um domínio CL Kappa (SEQ ID NO: 1). F. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD16 X GP120, TRIDENT-C

[00352] Uma terceira molécula de ligação a gp41 x CD16 x gp120 trivalente ilustrativa designada "TRIDENT-C" é semelhante ao TRIDENT-B descrito acima, mas contém os domínios

VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano h3G8 em vez do mAb 1 CD3 (D65G) Domínios VL e VH de TRIDENT-B. Assim, TRIDENT-C é composto por quatro cadeias polipeptídicas e possui um domínio de ligação que compreende os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti-humano 7B2GL (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de gp41), um domínio de ligação que compreende o Domínios VL e VH de h3G8 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de A32 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno gp120).

[00353] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-C é a mesma da primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-B descrito acima (SEQ ID NO:115). De modo similar, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-C é a mesma da segunda cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-B descrito acima (SEQ ID NO:116).

[00354] A sequência de aminoácidos do terceiro e quarto polipeptídeos de TRIDENT-C são iguais às da terceira e quarta cadeias de polipeptídeos do TRIDENT-B descrito acima (SEQ ID NO:119 e SEQ ID NO:120). G. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41 X CD3 X GP41, TRIDENT-

D

[00355] Uma terceira molécula de ligação a gp41 x CD3 x gp41 trivalente ilustrativa, designada "TRIDENT-D", é semelhante ao TRIDENT-A descrito acima, mas contém os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti-humano 7B2GL em vez do TRX2 Domínios anti-CD8 VL e VH de TRIDENT-A. Assim, TRIDENT-D é composto por quatro cadeias de polipeptídeos e possui dois domínios de ligação que compreendem os domínios VL e VH do anticorpo gp41 anti-humano 7B2GL (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de gp41), um domínio de ligação que compreende os Domínios VL e VH de hCD3 mAb 1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno CD3).

[00356] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-D é a mesma da primeira cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-A descrito acima (SEQ ID NO:113). De modo similar, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-D é a mesma da segunda cadeia de polipeptídeos do diacorpo DART-A descrito acima (SEQ ID NO:114).

[00357] A terceira cadeia de polipeptídeos de TRIDENT-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:121:

[00358] Os resíduos 1-126 da terceira cadeia de polipeptídeos TRIDENT-D correspondem ao Domínio VH do anticorpo anti-gp41 7B2GL otimizado (SEQ ID NO:58). Os resíduos 127-224 correspondem a um Domínio IgG1 CH1 (SEQ ID NO:3). Os resíduos 225-239 correspondem a um domínio de articulação de IgG1 (SEQ ID NO: 7). Os resíduos 240-456 correspondem ao Domínio CH2-CH3 "Portadora de Orifício" de IgG1 (SEQ ID NO: 50).

[00359] A quarta cadeia de polipeptídeos de

TRIDENT-D tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:122:

[00360] Os resíduos 1-113 da quarta cadeia de polipeptídeos TRIDENT-B correspondem ao Domínio VL do anticorpo anti-gp41 7B2GL (SEQ ID NO: 57). Os resíduos 114-220 correspondem a um domínio CL Kappa (SEQ ID NO: 1). H. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A GP41 MULTISPECÍFICAS

ALTERNATIVAS

[00361] Conforme será reconhecido em vista da presente revelação, moléculas multiespecíficas adicionais de ligação a gp41 que tem a estrutura geral de qualquer uma das moléculas exemplificativas acima que compreendem os domínios VL e VH de 7B2GL e que compreendem um local de ligação para um ECM alternativo e/ou HIV-1 antígeno pode ser construído empregando-se os domínios VL e VH de anticorpos ECM e/ou HIV- 1 alternativos em vez dos domínios VL e VH presentes nas moléculas descritas acima. Os domínios VL e VH de numerosos sítios de ligação a ECM e HIV-1 alternativos são fornecidos no presente documento, os domínios VL e VH adicionais são conhecidos na técnica. De modo similar, conforme fornecido no presente documento, as moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas alternativas podem da mesma forma ser construídas incorporando ligantes alternativos e/ou domínios de promoção de heterodímero, particularmente aqueles fornecidos no presente documento. VIII. MÉTODOS DE PRODUÇÃO

[00362] As moléculas da presente invenção são, com a maior preferência, produzidas através da expressão recombinante de moléculas de ácido nucleico que codificam tais polipeptídeos, como é bem conhecido na técnica.

[00363] Os polipeptídeos da invenção podem ser convenientemente preparados com uso de síntese de peptídeos em fase sólida (Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341 a 347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 82(15):5.131 a 5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3 a 10).

[00364] Os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante e expressos com uso de qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante isolando-se primeiro os anticorpos feitos de animais hospedeiros, obtendo-se a sequência de seu DNA e usando-se a sequência de tal DNA para expressar o anticorpo de forma recombinante em células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a sequência do anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou no leite de animais transgênicos. Métodos adequados para expressar anticorpos de forma recombinante em plantas ou leite foram revelados (consulte, por exemplo, Peeters et al. (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,” Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol 13:65 a 93; e Pollock et al. (1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,” J. Immunol. Methods 231:147-157).

Os métodos adequados para a preparação de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia única etc., são conhecidos na técnica e foram descritos acima. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante por tecnologia de exibição de fago (consulte, por exemplo, Patentes números US 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743;

6.265.150; e Winter, G. et al. (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology,” Annu. Rev. Immunol. 12,433 a 455).

[00365] Os vetores que contêm polinucleotídeos de interesse (por exemplo, polinucleotídeos que codificam as cadeias de polipeptídeos das moléculas de ligação da presente invenção) podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um dentre uma série de meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção que emprega cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, cálcio fosfato, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bombardeio de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, em que o vetor é um agente infeccioso, como o vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira.

[00366] Qualquer célula hospedeira com capacidade de superexpressar DNAs heterólogos pode ser usada com o propósito de expressar um polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamíferos adequados incluem, mas não estão limitados a células COS, HeLa e CHO.

[00367] A invenção inclui polipeptídeos que compreende uma sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação desta invenção. Os polipeptídeos dessa invenção podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) como descrito acima ou por síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos com até cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente.

[00368] A invenção inclui variantes das moléculas de ligação reveladas, incluindo polipeptídeos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente as propriedades de tais moléculas, bem como variantes que aumentaram ou diminuíram a atividade. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica e não precisa ser descrita em detalhes no presente documento. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram deletéria ou significativamente a atividade funcional deletéria ou o uso de análogos químicos. Os resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos conservativamente uns pelos outros incluem, mas não estão limitados a: glicina/alanina; serina/treonina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; lisina/arginina; e fenilalanina/tirosina. Esses polipeptídeos também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-tradução, como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação e fosforilação. Preferencialmente, as substituições de aminoácidos seriam conservativas, isto é, o aminoácido substituído possuiria propriedades químicas de carga, tamanho etc. semelhantes às do aminoácido original. Tais substituições conservativas são conhecidas na técnica e exemplos foram fornecidos acima. As modificações de aminoácidos podem variar de alterar ou modificar um ou mais aminoácidos até o redesenho completo de uma região, como o domínio variável. As mudanças no domínio variável podem alterar a afinidade de ligação e/ou especificidade. Outros métodos de modificação incluem o uso de técnicas de acoplamento conhecidas na técnica, incluindo, mas sem limitação, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. As modificações podem ser utilizadas, por exemplo, para a fixação de marcadores para imunoensaio, tal como a fixação de porções radioativas para radioimunoensaio. Os polipeptídeos modificados são feitos com uso de procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser rastreados com uso de uso ensaios padrão conhecidos na técnica.

[00369] Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leve e pesada. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão contém uma região constante de imunoglobulina heteróloga. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão contém um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo produzido a partir de um hibridoma depositado publicamente. Para os fins desta invenção, uma proteína de fusão de anticorpo contém domínios polipeptídicos que permitem que a proteína se ligue imunoespecificamente tanto a gp41 quanto a um ECM (por exemplo, CD3, CD16 etc.), e que contém outra sequência de aminoácidos à qual não está anexada em a molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região (por exemplo, um domínio de ligação de albumina desimunizado, uma sequência de reconhecimento de Proteína A, um marcador de peptídeo etc.).

[00370] A presente invenção abrange particularmente tais moléculas de ligação (por exemplo, anticorpos, diacorpos, moléculas de ligação trivalentes etc.) conjugadas a uma porção de diagnóstico ou terapêutica. Para fins de diagnóstico, as moléculas de ligação da invenção podem ser acopladas a uma substância detectável. Essas moléculas de ligação são úteis para monitorar e/ou prognosticar o desenvolvimento ou progressão de uma doença como parte de um procedimento de teste clínico, como a determinação da eficácia de uma terapia particular. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano, beta-galactosidase etc.), grupos protéticos (por exemplo, avidina/biotina), materiais fluorescentes (por exemplo, umbeliferona, fluoresceína ou ficoeritrina), materiais luminescentes (por exemplo, luminol), materiais bioluminescentes (por exemplo, luciferase ou aequorina), materiais radioativos (por exemplo, carbono-14, manganês-54, estrôncio-85 ou zinco-65), metais emissores de pósitrons e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente à molécula de ligação ou indiretamente, através de um intermediário (por exemplo, um ligante) com uso de técnicas conhecidas na técnica.

[00371] Para fins terapêuticos, as moléculas de ligação da invenção podem ser conjugadas a uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, (por exemplo, um agente citostático ou citocida), um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, emissores alfa. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial às células, como, por exemplo, exotoxina de Pseudomonas, toxina da difteria, uma toxina botulínica A a F, abrina de ricina, saporina e fragmentos citotóxicos de tais agentes. Um agente terapêutico inclui qualquer agente com um efeito terapêutico para tratar profilaticamente ou terapeuticamente um distúrbio. Tais agentes terapêuticos podem ser agentes terapêuticos químicos, agentes terapêuticos de proteínas ou polipeptídeos e incluem agentes terapêuticos que possuem uma atividade biológica desejada e/ou modificam uma determinada resposta biológica. Exemplos de agentes terapêuticos incluem agentes alquilantes, inibidores de angiogênese, agentes antimitóticos, agentes de terapia hormonal e anticorpos úteis para o tratamento de distúrbios proliferativos celulares. A porção química terapêutica pode ser acoplada ou conjugada diretamente à molécula de ligação ou indiretamente, através de um intermediário (por exemplo, um ligante) com uso de técnicas conhecidas na técnica. IX. USOS DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DA PRESENTE

INVENÇÃO

[00372] Conforme discutido acima, as moléculas com capacidade de se ligar a gp41 e a um ECM têm capacidade de mediar a morte celular redirecionada de uma célula alvo (isto é, uma célula infectada por patógeno) que expressa tal gp41 em sua superfície celular. Essas moléculas podem ser usadas para fins terapêuticos, por exemplo, em indivíduos com uma infecção, particularmente uma infecção latente por HIV-1. Dessa forma, as moléculas de ligação da presente invenção têm a capacidade de tratar uma doença ou condição associada ou caracterizada pela expressão de gp41, particularmente infecção latente por

HIV-1. Dessa forma, sem limitação, as moléculas de ligação da presente invenção podem ser empregues no tratamento de uma infecção por HIV-1, particularmente uma infecção latente por HIV-1.

[00373] Em particular, a presente invenção abrange tais métodos em que a molécula com capacidade de se ligar a gp41 compreende um "Domínio de ligação ao epítopo" de um anticorpo que tem capacidade de se ligar a gp41 e também compreende um domínio de ligação ao epítopo com capacidade de se ligar a um ECM (em particular CD3 e/ou CD16) na superfície de uma célula imune efetora de modo a mediar a morte redirecionada da célula alvo que expressa gp41 (por exemplo, por mediação da morte celular redirecionada (por exemplo, citotoxicidade redirecionada de células T)).

[00374] Em certos aspectos, a invenção fornece o uso das moléculas de ligação a gp41 da invenção, particularmente moléculas de ligação a gp41 multiespecíficas, como, mas sem limitação a moléculas biespecíficas e triespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos biespecíficos, moléculas de ligação trivalentes etc.), em métodos de tratamento e prevenção da infecção por HIV-1 em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula de ligação a gp41 da invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, a molécula de ligação a gp41 se liga a diferentes epítopos de HIV-1, de preferência diferentes epítopos presentes no envelope de HIV-1.

[00375] As várias moléculas de ligação a gp41 descritas no presente documento têm utilidade, por exemplo, em configurações incluindo, mas sem limitação ao seguinte:

[00376] i) no contexto da exposição conhecida antecipada à infecção por HIV-1, uma molécula de ligação a gp41 da presente invenção pode ser administrada profilaticamente (por exemplo, IV, topicamente ou intranasalmente) como um microbicida,

[00377] ii) no cenário de exposição conhecida ou suspeita, como ocorre no cenário de vítimas de estupro, ou profissionais do sexo, ou em qualquer transmissão homossexual ou heterossexual sem proteção de preservativo, uma molécula de ligação a gp41 da presente invenção pode ser administrada como profilaxia pós-exposição, por exemplo, IV ou topicamente e

[00378] iii) no cenário de infecção aguda por HIV- 1 (AHI), uma molécula de ligação a gp41 da presente invenção pode ser administrada como um tratamento para AHI para controlar a carga viral inicial, ou para a eliminação de células T CD4 infectadas por vírus.

[00379] De acordo com a invenção, as moléculas de ligação a gp41 da presente invenção podem ser administradas antes do contato do sujeito ou do sistema/células imune do sujeito com HIV-1 ou dentro de cerca de 48 horas após tal contato. A administração dentro desse período de tempo pode maximizar a inibição da infecção de células vulneráveis do sujeito com HIV.

[00380] Além disso, várias formas das moléculas de ligação a gp41 da presente invenção podem ser administradas a indivíduos infectados cronicamente ou agudamente por HIV-1 e usadas para matar células infectadas por vírus remanescentes em virtude da ligação da molécula de ligação a gp41 à superfície do vírus infectado células e ter capacidade de mediar a morte celular redirecionada de tais células infectadas.

[00381] Em certas modalidades, as moléculas de ligação a gp41 da invenção podem ser administradas em combinação com agentes ativadores de latência, de modo a ativar um reservatório latente de células infectadas por HIV que podem estar presentes em um sujeito. A expectativa é que, ao ativar o DNA pró-viral latente do HIV-1 em células em repouso, as células anteriormente inativas comecem a produzir novos vírus e serão reconhecidas e eliminadas por um sistema imunológico que foi aumentado pelas moléculas de ligação a gp41 da invenção. Exemplos não limitativos de agentes ativadores de latência são inibidores de HDAC, por exemplo, vorinostat, romidepsina, panobinostat, dissulfiram, JQ1, briostatina, PMA, ionomicina ou qualquer combinação dos mesmos. Consulte Bullen et al. Nature Medicine 20, 425 a 429 (2014).

[00382] Em certas modalidades, as moléculas de ligação a gp41 da invenção podem ser administradas em combinação com agentes anti-retrovirais.

[00383] Em uma modalidade específica, a molécula com capacidade de se ligar a gp41 e a ECM é um anticorpo biespecífico, um BiTe® ou um TandAb®.

[00384] Em uma modalidade específica, a molécula com capacidade de se ligar a gp41 e a ECM é um diacorpo biespecífico.

[00385] Em uma modalidade específica, a molécula com capacidade de se ligar a gp41 e a ECM é uma molécula de ligação trivalente.

[00386] Conforme usado no presente documento, os termos: “fornecimento de uma terapia" e "tratamento" se referem a qualquer administração de uma composição que está associada a qualquer indício de resultado benéfico ou desejado, incluindo, sem limitação, qualquer resultado clínico, como diminuição dos sintomas resultantes da doença, atenuando um sintoma de infecção (por exemplo, carga viral, febre, dor, sepse etc.) uma diminuição de um sintoma resultante da doença, um aumento da qualidade de vida do indivíduo receptor, uma diminuição da dose de outros medicamentos fornecidos para tratar a doença de um indivíduo, um aumento do efeito de outro medicamento, como através de direcionamento e/ou internalização, um retardo da progressão da doença e/ou um prolongamento da sobrevivência do indivíduo receptor.

[00387] Os indivíduos para tratamento incluem animais, com máxima preferência, espécies de mamíferos, como não primatas (por exemplo, bovinos, equinos, felinos, caninos, roedores etc.) ou um primata (por exemplo, macacos como um macaco cinomolgo, humano etc.). Em uma modalidade preferida, o indivíduo é um humano.

[00388] Distúrbios exemplificativos que podem ser tratados por várias modalidades da presente invenção incluem, mas sem limitação, infecção por HIV-1 (especialmente uma infecção latente por HIV-1 associada à expressão de gp41 ligada por uma molécula com capacidade de mediar a morte celular redirecionada). Em várias modalidades, a invenção abrange métodos e composições para tratamento, prevenção ou gerenciamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz das moléculas de ligação da presente invenção. Tais moléculas são particularmente úteis para reduzir a carga de HIV-1 ou eliminar células infectadas por

HIV. Embora não pretendam estar ligados a um mecanismo de ação específico, tais moléculas podem mediar a função efetora contra células alvo, promover a ativação do sistema imunológico contra células alvo, reticular antígenos de superfície celular e/ou receptores em células alvo e aumentar a apoptose ou sinalização reguladora de crescimento negativa, ou uma combinação das mesmas, resultando em eliminação e/ou redução no número de células alvo. X. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00389] A presente invenção abrange composições que compreende uma molécula de ligação a gp41 da invenção. As composições da invenção incluem composições de fármacos a granel úteis na fabricação de composições farmacêuticas (por exemplo, composições impuras ou não estéreis) e composições farmacêuticas (isto é, composições que são adequadas para administração a um indivíduo) que podem ser usadas no preparação de formas de dosagem unitária. Tais composições compreendem uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma molécula com capacidade de se ligar a gp41 e também com capacidade de se ligar a uma ECM (isto é, uma molécula de ligação a gp41 x ECM) de modo a ser ter capacidade de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo (por exemplo, uma célula infectada com HIV etc.), ou uma combinação de tais agentes e um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, as composições da invenção compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz das moléculas de ligação da presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto preferido, tais composições são substancialmente purificadas (isto é, substancialmente livres de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados).

[00390] Várias formulações de tais composições podem ser usadas para administração. Além do agente farmacologicamente ativo (ou agentes farmacologicamente ativos), as composições da presente invenção podem conter transportadores farmaceuticamente aceitáveisadequados que compreendem excipientes e auxiliares que são bem conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz ou que facilitar o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente para distribuição no sítio de ação. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência, ou atuar como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas sem limitação agentes estabilizadores, agentes umectantes e emulsificantes, sais para variar osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões e intensificadores de penetração na pele.

[00391] Em uma modalidade específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos Estados Unidos ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em humanos. O termo "transportador" se refere a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente ou veículo com o qual a terapêutica é administrada. Geralmente, os ingredientes das composições da invenção são fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão que contém água ou soro fisiológico estéril de grau farmacêutico. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou soro fisiológico pode ser fornecido para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00392] A invenção também fornece um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios com uma molécula de ligação a gp41 da presente invenção, sozinha ou com tal veículo farmaceuticamente aceitável. Adicionalmente, um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de uma doença também podem ser incluídos no pacote ou kit farmacêutico. A invenção também fornece um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associado a tal recipiente (ou recipientes) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.

[00393] A presente invenção fornece kits que podem ser usados nos métodos acima. Um kit pode compreender qualquer uma dentre as moléculas de ligação da presente invenção. O kit pode compreender ainda um ou mais outros agentes profiláticos e/ou terapêuticos úteis para o tratamento do câncer, em um ou mais recipientes. XI. MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[00394] As composições da presente invenção podem ser fornecidas para o tratamento, profilaxia e melhoria de um ou mais sintomas associados a uma doença, distúrbio ou infecção pela administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação a gp41 da presente invenção. Em um aspecto preferido, tais composições são substancialmente purificadas (isto é, substancialmente livres de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados). Em uma modalidade específica, o indivíduo é um animal, de preferência um mamífero, como não primata (por exemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor etc.) ou um primata (por exemplo, macaco, tal como, um macaco Cinomolgo, humano etc.). Em uma modalidade preferida, o indivíduo é um humano.

[00395] Métodos de administração de uma molécula de ligação a gp41 ou composição que compreende tal molécula de ligação a gp41 da invenção incluem, mas sem limitação, administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural e mucosa (por exemplo, vias intranasal e oral). Em uma modalidade específica, as moléculas de ligação da presente invenção são administradas por via intramuscular, intravenosa ou subcutânea. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal etc.) e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[00396] A invenção também fornece que as preparações da molécula de ligação a gp41 da presente invenção são embaladas em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade da molécula. Em uma modalidade, tal molécula de ligação a gp41 é fornecida como um pó liofilizado esterilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado e pode ser reconstituída, por exemplo, com água ou soro fisiológico para a concentração apropriada para administração a um indivíduo. Preferencialmente, a molécula de ligação a gp41 da presente invenção é fornecida como um pó liofilizado estéril seco em um recipiente hermeticamente fechado.

[00397] As preparações liofilizadas da Molécula de ligação a gp41 da presente invenção devem ser armazenadas entre 2 °C e 8 °C em seu recipiente original e as moléculas devem ser administradas em 12 horas, de preferência em 6 horas, em 5 horas, em 3 horas ou em 1 hora após ser reconstituído. Em uma modalidade alternativa, tais moléculas são fornecidas na forma líquida em um recipiente hermeticamente fechado indicando a quantidade e a concentração da molécula, proteína de fusão ou molécula conjugada. Preferencialmente, tais moléculas de ligação, quando fornecidas na forma líquida, são fornecidas em um recipiente hermeticamente fechado.

[00398] A quantidade de tais preparações da invenção que serão eficazes no tratamento, prevenção ou melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada indivíduo receptor. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.

[00399] Tal como no presente documento utilizado, uma "quantidade eficaz" de uma composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar os resultados benéficos ou desejados, incluindo, sem limitação, resultados clínicos, tais como diminuição dos sintomas resultantes da doença, atenuação de um sintoma de infecção (por exemplo, carga viral, febre, dor, sepse etc.) aumentando assim a qualidade de vida de quem sofre da doença, diminuindo a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, aumentando o efeito de outro medicamento, como via direcionamento e/ou internalização, retardando a progressão da doença e/ou prolongando a sobrevida dos indivíduos. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado sozinho, o termo se refere a esse ingrediente sozinho. Quando aplicado a uma combinação, o termo se refere a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrado em combinação, em série ou simultaneamente.

[00400] Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente: para matar e/ou reduzir a proliferação de células infectadas por HIV-1, para reduzir a proliferação de (ou o efeito de) um vírus HIV-1 e para reduzir e/ou retardar o desenvolvimento da doença mediada pelo HIV, de forma direta ou indireta. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um medicamento, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro medicamento, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes quimioterapêuticos e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado. Embora as necessidades individuais variem, a determinação de intervalos ideais de quantidades eficazes de cada componente está dentro da habilidade da técnica.

[00401] Para as moléculas de ligação abrangidas pela invenção, a dosagem administrada a um indivíduo receptor é preferencialmente determinada com base no peso corporal (kg) do indivíduo receptor. Para as moléculas de ligação abrangidas pela invenção, a dosagem administrada a um indivíduo receptor é tipicamente de cerca de 0,01 μg/kg a cerca de 300 mg/kg ou mais do peso corporal do indivíduo.

[00402] A dosagem e a frequência de administração de uma molécula de ligação da presente invenção podem ser reduzidas ou alteradas aumentando a absorção e penetração da molécula no tecido por modificações como, por exemplo, lipidação.

[00403] A dosagem de uma molécula de ligação da invenção administrada a um indivíduo receptor pode ser calculada para uso como uma terapia de agente único. Alternativamente, a molécula pode ser usada em combinação com outras composições terapêuticas e a dosagem administrada a um indivíduo receptor é menor do que quando as ditas moléculas são usadas como uma terapia de agente único.

[00404] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas localmente na área que necessita de tratamento; isto pode ser conseguido por, por exemplo, e não por meio de limitação, infusão local, por injeção ou por meio de um implante, sendo que o dito implante é de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tal como membranas SIALASTIC® ou fibras. Preferencialmente, ao administrar uma molécula da invenção, deve-se ter cuidado ao usar materiais para os quais a molécula não absorve.

[00405] As composições da invenção podem ser administradas em uma vesícula, em particular um lipossoma (consulte,Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, páginas 353 a 365 (1989); Lopez- Berestein, ibid., páginas 317 a 327).

[00406] O tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de uma molécula de ligação da presente invenção pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos. Em um exemplo preferido, um indivíduo é tratado com uma composição farmacêutica da invenção por entre cerca de 1 a 10 semanas, de preferência entre 2 a 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 a 7 semanas, e ainda mais preferencialmente por cerca de 4, 5, ou 6 semanas. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas uma vez por dia com tal administração ocorrendo uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano etc. Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas duas por dia com tal administração ocorrendo uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano etc. Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas três vezes por dia com tal administração ocorrendo uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano etc. Será também apreciado que a dosagem eficaz das moléculas usadas para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um tratamento particular.

EXEMPLOS

[00407] Tendo agora descrito genericamente a invenção, a mesma será mais facilmente compreendida por referência aos seguintes exemplos, os quais são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a ser limitantes da presente invenção, a menos que especificado. EXEMPLO 1

OTIMIZAÇÃO

[00408] O anticorpo anti-HIV-1 Env (proteína gp41) designado “7B2 IgG” (Número de Acesso ao GenBank AFQ31503; Buchacher, A. et al. (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein- Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359 a 369; Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV- 1 Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3.648 a 3.655) foi constatado para compreender numerosos resíduos de aminoácidos em suas regiões de estrutura que são raros no repertório da linha germinativa de IgG humana. A presença de tais resíduos não germinativos raros pode ser imunogênica e resultar na geração de anticorpos antifármacos após administração repetida a indivíduos receptores. Para reduzir ou mesmo eliminar o potencial imunogênico desses domínios, a região variável 7B2 foi otimizada pela introdução de mutações em suas regiões estruturais para substituir esses resíduos de aminoácidos raros por resíduos de aminoácidos da linha germinativa.

[00409] Conforme mostrado nas Figuras 7A a 7B, nove (9) mutações foram introduzidas nas regiões de estrutura VL (Figura 7A) e dezessete (17) substituições de aminoácidos foram introduzidas nas regiões de estrutura VH (Figura 7B) para gerar Domínios VL e VH totalmente germinados designados “7B2GL VL” e “7B2GL VH,” respectivamente. Os Domínios VL/VH resultantes são coletivamente chamados de "7B2GL".

[00410] As sequências de aminoácidos dos Domínios VL do anticorpo 7B2 e do anticorpo 7B2GL foram apresentadas acima (SEQ ID NO:55 e SEQ ID NO:57, respectivamente). As sequências de aminoácidos do Domínio VL do doador de estrutura 1-3 (IGKV4-1) e a sequência de aminoácidos da região de estrutura 4 do doador de estrutura 4 (IGKJ1-01) são: IGKV4-1 (SEQ ID NO:123): e IGKJ1-01 (SEQ ID NO:124):

[00411] As sequências de aminoácidos dos Domínios VH do anticorpo 7B2 e do anticorpo 7B2GL foram apresentadas acima (SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:58, respectivamente). As sequências de aminoácidos do Domínio VH do doador de estrutura

1-3 (IGVH3-11) e a sequência de aminoácidos da região de estrutura 4 do doador de estrutura 4 (IGHJ4-01) são: IGVH3-11 (SEQ ID NO:125): e IGHJ4-01 (SEQ ID NO:126):

[00412] A ligação de uma IgG que compreende as regiões variáveis totalmente germinadas (designadas “7B2GL IgG”) foi examinada por Attana Cell A200 QCM. Resumidamente, a proteína recombinante de HIV-1 JRFL gp140 (proteína Env de HIV-1 menos os resíduos de aminoácidos transmembrana e terminal C, mas que retém o epítopo de gp41 reconhecido por 7B2) em 25, 50 e 100 nM foi passado por 7B2 IgG (Figura 8A) ou 7B2GL IgG (Figura 8B) capturado independentemente em um chip sensor Attana revestido com uma superfície Fc de IgG anti-humana. Para análise dos parâmetros cinéticos (ka, kd, KD), a ligação 1:1 foi escolhida como modelo de ajuste por ser o modelo menos manipulado matematicamente. No entanto, como o JRFL gp140 é uma mistura de monômero (20 a 30%), dímeros (40%) e trímeros (30%), esse modelo não descreve totalmente as interações. Por conseguinte, os parâmetros cinéticos (ka, kd, KD que usa ajuste de ligação 1:1) fornecidos na Tabela 8 são úteis principalmente com o propósito de comparar diretamente a atividade de ligação Ag dos construtos 7B2 e 7B2GL um ao outro. Embora várias mudanças estejam localizadas em zonas Vernier (por exemplo, posições de domínio VH Kabat: 30, 48, 49 e 79, e posições de domínio VL Kabat 48) que são conhecidos por serem importantes para a ligação ao antígeno (Foote e Winter (1992) “Antibody Framework Residues Affecting The Conformation Of The

Hypervariable Loops,” J. Mol. Biol. 224: 487 a 499), e não são normalmente alterados (consulte, por exemplo, Chromikova et al. (2015) “Introduction Of Germline Residues Improves The Stability Of Anti-HIV mAb 2G12-IgM,” Biochim. Biophys. Acta 1854:1.536 a 1.544), esses estudos mostram que todas as 26 mutações da linha germinativa foram bem toleradas e que o anticorpo totalmente germinado exibiu uma cinética de ligação ao epítopo que era quase idêntica à do anticorpo de tipo selvagem, 7B2. Tabela 8 Anticorpo ka kd KD (nM) 7B2 7,0E4 ± 3,0E2 2,02E-4 ± 4,0E-7 2,9 ± 0,01 7B2GL 6,9E4 ± 6,0E2 2,02E-4 ± 6,0E-7 2,9 ± 0,03 EXEMPLO 2 MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE HIV X CD3

[00413] Foram geradas duas moléculas de ligação de HIV x CD3 com capacidade de se ligar à proteína gp41 Env de HIV e ao alvo de células efetoras imunes exemplificativas, CD3. Em particular, dois diacorpos biespecíficos (designados "DART-1" e "DART-A") que compreendem domínios variáveis 7B2 ou 7B2GL e têm três cadeias polipeptídicas foram gerados, sendo que cada um compreende domínios variáveis CD3 mAb 1 (D65G). DART-1 e DART-A são diacorpos biespecíficos que contêm Domínio Fc que tem a estrutura geral mostrada na Figura 4A que têm capacidade de se ligar a HIV e CD3. Os domínios e as sequências de aminoácidos dessas moléculas exemplares são descritos em detalhes acima.

[00414] A atividade biológica de DART-1 e DART-A foi examinada em vários ensaios. A capacidade de DART-1 e DART-

A para se ligarem a gp41 expressa na superfície de células HEK/D371 foi avaliada por citometria de fluxo. Resumidamente, células HEK 293/D371 que expressam gp140 (expressão induzida por doxiciclina de HIV-1 CM244 (subtipo AE) envelope gp140, obtido do Dr. John Kappes (Universidade do Alabama em Birmingham), após 24 horas de pré-incubação com 1 µg/ml doxiciclina) foram incubados com diluições em série (10 µg/ml - 0,0024 µg/ml) de DART-1, DART-A ou o controle negativo RSV x CD3. Após a lavagem, as células foram incubadas com anticorpo secundário Alexa IgG1 Fc 488 anti-humano e analisadas por citometria de fluxo (por exemplo, com uso de um Guava EasyCyte 8HT (Millipore) e MFI plotado por GraphPad Prism 7). Conforme mostrado na Figura 9, DART-1 e DART-A se ligam a células HEK 293/D371 que expressam gp140 de uma maneira dependente da dose semelhante.

[00415] A capacidade do DART-1 e do DART-A para ativar as células T foi avaliada com uso de um ensaio repórter de células T Jurkat (Promega). Resumidamente, as células repórter Jurkat IL2 Luc2P foram cocultivadas com células HEK293/D371 expressando gp140 (20:1) na presença de diluições em série (10 µg/ml - 0,0024 µg/ml) de DART-1, DART-A ou o controle negativo RSV x CD3 e luminescência foram medidos usando o Sistema de Ensaio de Luciferase ONE-GLO™ (Promega). Conforme mostrado na Figura 10, DART-1 e DART-A exibem atividade de ativação de células T comparável.

[00416] A capacidade de DART-1 e DART-A para mediar a morte de células alvo redirecionadas de células T foi avaliada com uso de um ensaio de CTL. Resumidamente, as células Pan T são isoladas de PBMCs humanos saudáveis (por exemplo, com uso do kit Dynabeads® Untouched ™ Human T Cells

(Invitrogen)). gp140 que expressa HEK293/D371 (1-4 x105 células/ml) são tratados com diluições em série de DART-1, DART-A ou o controle negativo RSV x CD3, juntamente com células T humanas em um efetor: alvo (E:T) razão = 10:1, ou de outra forma em razões E:T variáveis, conforme indicado, e incubado a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas. A citotoxicidade é medida pela liberação de lactato desidrogenase (LDH) (por exemplo, com uso de Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativa CytoTox 96®, Promega). Conforme mostrado na Figura 11, DART-1 e DART-A exibem atividade de morte de células alvo redirecionada de células T comparáveis.

[00417] Os resultados desses estudos demonstram que as numerosas substituições introduzidas nos domínios VL e VH de 7B2 para gerar os domínios 7B2GL totalmente germinados otimizados não afetam a ligação a gp140 ou a atividade biológica nos ensaios descritos acima.

[00418] Todas as publicações e patentes mencionadas neste relatório descritivo são no presente documento incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência em sua totalidade. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será entendido que a mesma tem capacidade de modificações adicionais e este pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios do invenção e incluindo tais desvios da presente divulgação como abrangido da prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence e como podem ser aplicados às características essenciais no presente documento estabelecidas anteriormente.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A GP41, caracterizada por compreender um domínio de cadeia leve variável (VL) e um domínio de cadeia pesada variável (VH), em que o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57 e/ou o dito domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58.

2. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a dita molécula de ligação a gp41 é caracterizada por compreender: (a) o dito domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57 e (b) o dito domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58.

3. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, sendo que a dita molécula é caracterizada por ser um anticorpo ou compreender uma porção de ligação ao epítopo de gp41 da mesma.

4. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo que a dita molécula é caracterizada por ser: (a) um anticorpo biespecífico; ou (b) um diacorpo, sendo que o dito diacorpo é um complexo ligado covalentemente que compreende duas, três, quatro ou cinco cadeias de polipeptídeo; ou (c) uma molécula de ligação trivalente, sendo que a dita molécula de ligação trivalente é um complexo ligado covalentemente que compreende três, quatro, cinco ou mais de cinco cadeias de polipeptídeo.

5. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 4,

sendo que a dita molécula é caracterizada por ser o dito diacorpo e compreender um domínio de ligação a albumina (ABD).

6. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo que a dita molécula é caracterizada por compreender uma região Fc.

7. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela dita região Fc ser uma região Fc variante que compreende: (a) uma ou mais modificações de aminoácido que reduzem a afinidade da região Fc variante para um FcγR; e/ou (b) uma ou mais modificações de aminoácido que melhora a meia vida de soro da região Fc variante.

8. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelas ditas modificações que reduzem a afinidade da região Fc variante para um FcγR compreenderem a substituição de L234A; L235A; ou L234A e L235A, em que a dita numeração é aquela do índice EU como em Kabat.

9. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelas ditas modificações que melhoram a meia vida de soro da região Fc variante compreenderem a substituição de M252Y; M252Y e S254T; M252Y e T256E; M252Y, S254T e T256E; ou K288D e H435K, em que a dita numeração é aquela do índice EU como em Kabat.

10. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por ser biespecífica e compreender um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41 e um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora.

11. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por ser biespecífica e compreender dois sítios de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41 e dois sítios de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora.

12. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por ser triespecífica e compreender: (a) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de gp41; (b) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma primeira molécula presente na superfície de uma célula efetora; e (c) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma segunda molécula presente na superfície de uma célula efetora.

13. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por ser triespecífica e compreender: (a) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um primeiro epítopo de gp41; (b) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um segundo epítopo de gp41 ou um epítopo de uma proteína HIV-1 diferente; e (c) um sítio de ligação ao epítopo com capacidade de ligação imunoespecífica a um epítopo de uma molécula presente na superfície de uma célula efetora; em que os ditos primeiro e segundo epítopos de gp41 são diferentes.

14. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, sendo que a dita molécula é caracterizada por ter capacidade de se ligar simultaneamente a gp41 e à dita molécula presente na superfície de uma célula efetora.

15. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pela molécula presente na superfície de uma célula efetora ser CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, NKp46 ou NKG2D.

16. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizada pela dita célula efetora ser uma célula T citotóxica ou uma célula exterminadora natural (NK).

17. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela dita molécula presente na superfície de uma célula efetora ser CD3.

18. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela dita primeira molécula presente na superfície de uma célula efetora ser CD3 e pela dita segunda molécula presente na superfície de uma célula efetora ser CD8.

19. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, sendo que a dita molécula é caracterizada por mediar a ligação coordenada de uma célula que expressa gp41 e uma célula T citotóxica.

20. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por compreender uma primeira cadeia de polipeptídeo, uma segunda cadeia de polipeptídeo e uma terceira cadeia de polipeptídeo, e em que:

I) (a) a dita primeira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:113; (b) a dita segunda cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:114; e (c) a dita terceira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:112; ou II) (a) a dita primeira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:115; (b) a dita segunda cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:116; e (c) a dita terceira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:112.

21. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por compreender uma primeira cadeia de polipeptídeo, uma segunda cadeia de polipeptídeo, uma terceira cadeia de polipeptídeo e uma quarta cadeia de polipeptídeo, e em que: (a) a dita primeira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:113; (b) a dita segunda cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:114; (c) a dita terceira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:117; e (d) a dita quarta cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:118.

22. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 9, sendo que a dita molécula é caracterizada por compreender uma primeira cadeia de polipeptídeo, uma segunda cadeia de polipeptídeo, uma terceira cadeia de polipeptídeo e uma quarta cadeia de polipeptídeo, e em que: I) (a) a dita primeira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:113; (b) a dita segunda cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:114; (c) a dita terceira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:119; e (d) a dita quarta cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:120; ou II) (a) a dita primeira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:115; (b) a dita segunda cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:116; (c) a dita terceira cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:119; e (d) a dita quarta cadeia de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:120.

23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz da molécula de Ligação a gp41, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

24. MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR INFECÇÃO POR HIV-1 EM UM INDIVÍDUO QUE PRECISA DO MESMO, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma composição que compreende qualquer uma das moléculas de ligação a gp41, de acordo com a reivindicação 1 a 22, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, sendo que o dito método é caracterizado por compreender ainda a administração de um agente de ativação de latência.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo dito agente de ativação de latência ser vorinostat, romidepsina, panobinostat, dissulfiram, JQ1, briostatina, PMA, ionomicina ou qualquer combinação dos mesmos.