CN112074541A - Pd-1和lag-3的高亲和力抗体以及由其制备的双特异性结合蛋白 - Google Patents

Pd-1和lag-3的高亲和力抗体以及由其制备的双特异性结合蛋白 Download PDF

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Abstract

本文公开了识别程序性死亡配体‑1(PD‑1)和淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG‑3)的高亲和力抗体。将来自人源化抗PD‑1和抗LAG‑3抗体的结合位点掺入Fabs‑in‑Tandem免疫球蛋白形式，而没有明显损失结合亲和力，所得的双特异性多价结合蛋白能够同时结合PD‑1和LAG‑3。此类双特异性FIT‑Ig结合蛋白对于治疗癌症是有用的。

Description

PD-1和LAG-3的高亲和力抗体以及由其制备的双特异性结合 蛋白
技术领域
本发明涉及识别程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的新抗体、识别淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG-3)的新抗体以及由那些抗体制备的双特异性PD-1/LAG-3结合蛋白，例如FIT-Ig结合蛋白。抗体和双特异性结合蛋白可用于治疗免疫疾病和血液癌症。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，CD279)是CD28受体家族的成员，该CD28受体家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。PD-1的表达经常出现在免疫细胞中，例如T细胞、B细胞、单核细胞和自然杀伤(NK)细胞。PD-1和类似的家族成员是I型跨膜糖蛋白，其包含负责配体结合的类似于Ig可变结构域的免疫球蛋白样结构域、和负责信号传导分子结合的胞质尾部。PD-1的胞质尾部包含两个基于酪氨酸的信号传导基序，一个是ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，一个是ITSM(基于免疫受体酪氨酸的开关基序)。Vivier等人，Immunol.Today，18:286-291(1997)和Chemnitz等人，J.Immunol.，173:945-954(2004)。
已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体：程序性死亡配体1(PD-L1、CD274、B7-H1)和PD-L2(CD273、B7-DC)，并且已经表明其诱导细胞内信号转导，抑制CD3和CD28介导的T细胞活化。Riley，Immunol.Rev.，229:114-125(2009)。这种T细胞活化的下调反过来导致T细胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ分泌以及其他生长因子和细胞因子的分泌减少。Freeman等人,J.Exp.Med.,192:1027-1034(2000)；Latchman等人,Nat.Immunol.,2:261-8(2001)；Carter等人,Eur.J.Immunol.,32:634-43(2002)；Ohigashi等人,Clin.Cancer Res.,11:2947-53(2005)。据信通过PD-1/PD-L1相互作用的信号传导通过负调节T细胞应答，在免疫系统内起着至关重要的、非冗余的功能。该调节参与胸腺中T细胞的发育、慢性炎性反应的调节以及外周耐受和免疫赦免的维持。在PD-1缺陷型小鼠中例证了这些功能的关键性质，这些PD-1缺乏型小鼠表现出自身免疫表型。C57BL/6小鼠中的PD-1缺乏导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎。在Balb/c小鼠中，由于存在心脏组织特异性自身反应抗体，PD-1缺乏导致严重的心肌病。
在T细胞刺激后，PD-1将酪氨酸磷酸酶SHP-2募集到其胞质尾部中的ITSM基序，导致参与CD3T细胞信号传导级联的效应分子(如CD3-δ、PKC-θ和ZAP70)的去磷酸化。PD-1下调T细胞应答的机制与CTLA-4相似，但不相同，因为这两个分子调节重叠组的信号传导蛋白。Parry等人,Mol.Cell Biol.,25:9543-9553(2005)。通常，PD-1介导的抑制信号在免疫耐受中起重要作用。Bour-Jordan等人,Immunol.Rev.,241:180-205(2011)。
发现PD-1表达在肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)中增加，并且已经报道了在各种不同组织的癌症中在肿瘤细胞中表达PD-1配体，所述不同组织包括肺、肝、胃、肾、乳腺、卵巢、胰腺、黑素细胞和食道。通常，在肿瘤细胞上PD-1配体的表达与多种肿瘤类型的癌症患者的预后不良相关。Okazaki and Honjo,Int.Immunol.,19:813-824(2007)。
PD-1/PD-L1相互作用的阻断可导致增强的肿瘤特异性T细胞免疫，因此有助于免疫系统清除肿瘤细胞。在侵袭性胰腺癌的鼠模型中，T.Nomi等人证明了PD-1/PD-L1阻断的治疗功效，表明施用抗PD-1或抗PD-L1抗体显著抑制了肿瘤的生长。Nomi等人,Clin.CancerRes.,13:2151-2157(2007)。抗体的阻断有效地促进了肿瘤反应性CD8+T细胞向肿瘤内的浸润，导致包括IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素的抗肿瘤效应物的上调。在另一项研究中，使用小鼠鳞状细胞癌模型，抗体阻断PD-1或PD-L1显著抑制了肿瘤的生长。Tsushima等人,OralOncol.,42:268-274(2006)。
最近，已经表明PD-1在来自HIV感染个体的T细胞上高表达，并且受体表达与受损的T细胞功能和疾病进展相关。Day等人,Nature,443:350-354(2006)；Trautmann等人,Nat.Med.,12:1198-1202(2006)。在两项研究中，在体外阻断配体PD-L1均显著增加了HIV特异性的IFN-γ产生细胞的扩增。
因此，通过拮抗剂分子对PD-1信号传导的治疗性调节可使免疫细胞从耐受中恢复，并使其重新活化以根除癌症和慢性病毒感染。
淋巴细胞活化基因3(LAG-3)
淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG-3、CD223)是一种负性共刺激受体，其调节T细胞的稳态、增殖和活化。Sierro等人,Expert Opin.Ther.Targets,15:91-101(2010)。免疫球蛋白超家族成员LAG-3是一种CD4样蛋白，其与CD4相似，与II类MHC分子结合，但亲和力是CD4的两倍，并且与CD4位于不同的位点。Huard等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,94:5744-9(1997)。LAG-3在活化的CD8+T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、B细胞、浆细胞样树突细胞和调节性T细胞(Treg)上表达。LAG-3作为T细胞应答的负调节物的作用是基于对LAG-3敲除小鼠的研究以及在体外模型和体内系统中使用抗LAG-3阻断抗体的研究。Sierro等人(2010),op.cit.；Hannier等人,J.Immunol.,161:4058-65(1998)；Macon-Lemaitre等人,Immunology,115:170-8(2005)；Workman等人,Eur.J.Immunol.,33:970-9(2003)。天然和诱导的Treg都表达增加的LAG-3，这是其最大抑制功能所必需的。Camisaschi等人,J.Immunol.,184:6545-6551(2010)；Huang,等人,Immunity,21:503-513(2004)。此外，LAG-3在CD4+效应T细胞上的异位表达降低了这些细胞的增殖能力，并赋予其对抗第三方T细胞的调节潜力。Huang，同上。最近的研究还表明，耗尽淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)特异性CD8+T细胞上高的LAG-3表达导致其无反应状态并限制CD8+T细胞的抗肿瘤应答。Blackburn等人,Nat.Immunol.,10:29-37(2009)and Grosso等人,J.Clin.Invest.,117:3383-3392(2007)。
LAG-3在抗肿瘤免疫应答中起着重要作用，并且对感染的免疫应答使其成为免疫疗法的感兴趣靶标。已经提出使用包括单克隆抗体的拮抗剂阻断LAG-3，以治疗某些癌症和慢性病毒感染。Turnis等人,Eur.J.Immunol.,45:1892-1905(2015)。
随着对PD-1和LAG-3介导的信号传导的重要性的更好地理解，持续需要发现可以有效改变T细胞功能或增加肿瘤细胞对免疫效应细胞的反应性的新型抑制性抗PD-1和抗LAG-3抗体。而且，可以组合PD-1和LAG-3抑制作用的双特异性分子的设计也将是癌症治疗的治疗方法中期望的改善。
发明内容
本发明提供了以高亲和力结合PD-1的新型抗体和以高亲和力结合LAG-3的新型抗体。本发明还提供了与PD-1和LAG-3二者反应的PD-1/LAG-3双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Igs)。本发明的抗体和双特异性结合蛋白可以阻断TIL上的LAG-3，以减少肿瘤浸润性Treg细胞群或使TIL恢复为细胞毒性表型。另外，本发明的抗体和双特异性结合蛋白可以用于抑制PD-1/PD-L1信号传导，以重新激活肿瘤浸润性细胞毒性T细胞。本文所述的双特异性多价结合蛋白将用作PD-1/LAG-3双特异性抑制剂提供协同的组合作用，以克服抗肿瘤免疫抑制，从而改善甚至对单独的抗PD-1或抗LAG-3疗法不响应或已停止响应的患者的结果。
本发明还提供了制备和使用本文所述的抗PD-1和抗LAG-3抗体和PD-1/LAG-3双特异性结合蛋白的方法，以及可用于检测样本中的PD-1和/或LAG-3的方法中、或用于治疗或预防与PD-1和/或LAG-3活性相关的个体的病症的方法中的各种组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，
其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接与VHB融合，或(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接与VLA融合；
其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHA-CH1；和
其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLB-CL；
其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区，A是PD-1或LAG-3的表位，B是PD-1或LAG-3的表位，前提是A和B不同。根据本发明，此类FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3两者结合。
在优选的实施方案中，此类FIT-Ig结合蛋白的Fab片段掺入了来自与抗原靶标PD-1或LAG-3之一结合的亲本抗体的VLA-CL和VHA-CH1结构域，并且掺入了来自与抗原靶标PD-1和LAG-3中的另一个结合的不同亲本抗体的VLB-CL和VHB-CH1结构域。因此，VH-CH1/VL-CL配对将产生识别PD-1和LAG-3的串联Fab部分。
根据本发明，PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白可有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fc，其中CL直接与VHLAG-3融合，其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHPD-1-CH1；其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLLAG-3-CL；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在替代实施方案中，PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白可有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fc，其中CL直接与VHPD-1融合，其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CH1；其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在替代实施方案中，PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白可有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fc，其中CH1直接与VHPD-1融合，其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VLLAG-3-CL；并且其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VHPD-1-CH1；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在替代实施方案中，PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白可有利地包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fc，其中CH1直接与VHLAG-3融合，其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL；并且其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CH1；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，并且Fc是免疫球蛋白Fc区。有利地，在第一多肽链中，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
在上述FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链的式中，Fc区可以是天然或变体Fc区。在特定实施方案中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的人Fc区。在特定的实施方案中，Fc是来自IgG1的人Fc，或修饰的人Fc，如下面的表6所示(SEQIDNO：28)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白保留了亲本抗体的一种或多种性质，利用所述亲本抗体的Fab片段的序列并将其掺入FIT-Ig结构中。在优选的实施方案中，FIT-Ig将保留与亲本抗体相当的对靶标抗原(即，LAG-3和PD-1)的结合亲和力，这意味着FIT-Ig结合蛋白对PD-1和LAG-3抗原靶标的结合亲和力与亲本抗体对其各自的靶标抗原的结合亲和力相比，相差不超过10倍，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:78的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:83的氨基酸20-240的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸23-236的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见表27)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:88的氨基酸23-684的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:91的氨基酸20-235的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:93的氨基酸23-236的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见表28)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:95的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:98的氨基酸20-242的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:100的氨基酸23-236的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见表29)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:102的氨基酸23-684的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:105的氨基酸20-235的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:107的氨基酸23-236的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见表30)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:140的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:144的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:146的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT107-1-6a-1；表41)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:147的氨基酸23-684的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:151的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:153的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-6b-1；表42)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:154的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:158的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:160的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-6a-2；表43)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:161的氨基酸23-684的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:165的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:167的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-2-6b-2；表44)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:168的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:172的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:174的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-6a-3；表45)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:175的氨基酸23-684的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:179的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:181的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-3-6b-1；表46)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:182的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:186的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:188的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-7a-1；表47)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:189的氨基酸23-687的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:193的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:195的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-7b-1；表48)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:196的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:200的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:202的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-7a-2；表49)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:203的氨基酸23-687的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:207的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:209的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-7b-2；表50)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:210的氨基酸23-679的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:214的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:216的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-7a-3；表51)。
在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:217的氨基酸23-687的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:221的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:223的氨基酸的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见FIT-107-1-7b-3；表52)。
本发明还提供了能够结合人PD-1的新型抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含一组六个CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其选自以下定义的CDR组：
Figure BDA0002758486640000101
Figure BDA0002758486640000111
Figure BDA0002758486640000121
本发明还提供了能够结合人LAG-3的新型抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含一组六个CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其选自以下定义的CDR组：
Figure BDA0002758486640000122
Figure BDA0002758486640000131
Figure BDA0002758486640000141
Figure BDA0002758486640000151
在一个实施方案中，根据本发明的结合蛋白是双特异性、多价免疫球蛋白结合蛋白，其包含两个或更多个抗原结合位点，其中至少一个抗原结合位点包含选自上述CDR组1、2、3和4中的CDR组，并且至少一个抗原结合位点包含上述CDR组5。
在一个实施方案中，根据本发明的抗PD-1抗体包含VH和VL结构域，其中两个可变结构域包含选自以下的氨基酸序列：
Figure BDA0002758486640000152
Figure BDA0002758486640000161
在另一个实施方案中，根据本发明的抗LAG-3抗体包含VH和VL结构域，其中两个可变结构域包含选自以下的氨基酸序列：
Figure BDA0002758486640000162
Figure BDA0002758486640000171
*其中SEQIDNO：226与SEQIDNO：135相同，除了在氨基酸56处用Ala(A)代替Gly(G)(G55A取代，Kabat编号)；SEQIDNO：227与SEQIDNO：136相同，除了在氨基酸56处用Ala(A)代替Gly(G)(G55A取代，Kabat编号)。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或抗LAG-3抗体可用于通过本领域内公认的技术来制备识别相同靶标抗原的衍生物结合蛋白。此类衍生物可以是，例如单链抗体(scFv)、Fab片段(Fab)、Fab'片段、F(ab')2、Fv和二硫键连接的Fv。
在本发明的另一方面，本文所述的抗体或双特异性结合蛋白能够调节PD-1、LAG-3或两者的生物功能。在另一方面，本文描述的抗PD-1抗体能够抑制PD-1/PD-L1信号传导。可在混合淋巴细胞反应测定法中测量信号抑制，例如在下文的实施例中进行。在另一方面，本文所述的抗LAG-3抗体能够抑制II类MHC/LAG-3相互作用。可以在PBMC SEB活化测定法中测量这种抑制，例如在下文的实施例中进行。在另一方面，本文所述的双特异性PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白能够抑制PD-1/PD-L1信号传导和MHCII类/LAG-3相互作用。
在一个实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段对人PD-1具有至少1×104M-1s-1、至少3×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少7×104M-1s-1、至少9×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1、至少1.1×105M-1s-1、至少1×105M-1s-1、至少1.25×105M-1s-1、至少1.4×105M- 1s-1、至少1.5×105M-1s-1、至少3×105M-1s-1或更高的结合速率常数(kon)，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在另一个实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段对人PD-1具有小于1×10-3s-1、小于5×10-4s-1、小于3×10-4s-1、小于1×10-4s-1、小于8×10-5s-1、小于6×10- 5s-1、小于4×10-5s-1、小于3×10-5s-1或小于1×10-5s-1的解离速率常数(koff)，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在另一个实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段对PD-1具有小于1×10-8M、小于5×10-9M、小于3×10-9M、小于1×10-9M、小于8×10-10M、小于6×10-10M、小于4×10-10M、小于2×10-10M、或小于1×10-10M的解离常数(KD)。
在一个实施方案中，本文所述的抗LAG-3抗体或其抗原结合片段对人LAG-3具有至少5×103M-1s-1、至少7×103M-1s-1、至少1×104M-1s-1、至少3×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少7×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1、或至少2×105M-1s-1或更高的结合速率常数(kon)，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在另一个实施方案中，本文所述的抗LAG-3抗体或其抗原结合片段对人LAG-3具有小于1.5×10-3s-1、小于1×10-3s-1、小于8×10-4s-1、小于6×10-4s-1、小于4×10-4s-1、小于2×10-4s-1、小于1×10-4s-1、小于9×10-5s-1、小于8×10-5s-1、小于7×10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于4×10-5s-1、小于2×10-5s-1或小于1×10-5s-1的解离速率常数(koff)，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在另一个实施方案中，本文所述的抗LAG-3抗体或其抗原结合片段对LAG-3具有小于5×10-7M、小于2×10-7M、小于1×10-7M、小于8×10-8M、小于6×10-8M、小于4×10-8M、小于2×10-8M、小于1×10-8M、小于8×10-9M、小于6×10-9M、小于4×10-9M、小于2×10-9M或小于1×10-9M的解离常数(KD)。
在一个实施方案中，根据本发明的能够结合PD-1和LAG-3的双特异性FIT-Ig结合蛋白对人PD-1具有至少5×103M-1s-1、至少1×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1、至少3×105M-1s-1或至少5×105M-1s-1或更高的结合速率常数(kon)，并且相同的结合蛋白对人LAG-3具有至少5×103M-1s-1、至少1×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1、至少3×105M-1s-1、或至少5×105M-1s-1或更高的结合速率常数(kon)，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。在进一步的实施方案中，如本文所述的能够结合PD-1和LAG-3的双特异性FIT-Ig结合蛋白所具有的对人PD-1的结合速率常数(kon)与衍生所述FIT-Ig结合蛋白的抗PD-1特异性的亲本抗PD-1抗体对PD-1的kon相比降低不超过10倍，并且与衍生所述FIT-Ig结合蛋白的抗LAG-3特异性的亲本抗LAG-3抗体对LAG-3的kon相比降低不超过10倍。换句话说，FIT-Ig结合蛋白将保留对每种抗原(PD-1或LAG-3)的结合速率常数，所述结合速率常数与对相应的PD-1或LAG-3抗原具有反应性的亲本抗体所呈现的结合速率常数(kon)相比更高、相同或降低不超过一个数量级。如本文所公开的，与亲本抗体所呈现的对相应抗原的kon相比，抗原的PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白可以显示对一种或两种抗原的kon的改善，或者，对一种或两种抗原的kon可以基本上与亲本抗体分别呈现的相同，或者，如果与亲本抗体相比，FIT-Ig结合蛋白所显示的对一种或两种抗原的kon降低，则降低不超过10倍。优选地，与亲本抗体对特定抗原的kon相比，FIT-Ig对该特定抗原的Kon的降低小于50％，更优选小于25％。与亲本抗体的kons相比，双特异性FIT-Ig中如此高地保留了kon值，是本领域令人惊讶的成就。
在一个实施方案中，根据本发明的能够结合PD-1和LAG-3的双特异性FIT-Ig结合蛋白对人PD-1具有小于2×10-4s-1、小于1×10-4s-1、小于5×10-5s-1、小于3×10-5s-1、小于2×10-5s-1、小于1×10-5s-1或小于8×10-6s-1的解离速率常数(koff)，并且相同的结合蛋白对人LAG-3具有小于2×10-4s-1、小于1×10-4s-1、小于5×10-5s-1、小于3×10-5s-1、小于2×10- 5s-1、小于1×10-5s-1或小于8×10-6s-1的解离速率常数(koff)，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在另一个实施方案中，根据本发明的能够结合PD-1和LAG-3的双特异性FIT-Ig结合蛋白对PD-1具有小于2×10-8M、小于1×10-8M、小于5×10-9M、小于1×10-9M、小于6×10- 10M、小于5×10-10M、小于3×10-10M、小于2×10-10M、小于1×10-10M、小于8×10-11M、小于6×10-11M、小于4×10-11M或小于1×10-11M的解离常数(KD)，并且相同的结合蛋白对人LAG-3具有小于2×10-8M、小于1×10-8M、小于5×10-9M、小于1×10-9M、小于6×10-10M、小于5×10-10M、小于3×10-10M、小于2×10-10M、小于1×10-10M、小于8×10-11M、小于6×10-11M、小于4×10-11M或小于1×10-11M的解离常数(KD)。在进一步的实施方案中，如本文所述的能够结合PD-1和LAG-3的双特异性FIT-Ig结合蛋白所具有的对人PD-1的解离常数(kD)与衍生所述FIT-Ig结合蛋白的抗PD-1特异性的亲本抗PD-1抗体对PD-1的kD相比不同不超过10倍，并且与衍生所述FIT-Ig结合蛋白的抗LAG-3特异性的亲本抗LAG-3抗体对LAG-3的kD相比不同不超过10倍。换句话说，FIT-Ig结合蛋白将保留亲本抗体对每种抗原(PD-1或LAG-3)的结合亲和力，如解离常数(kD)在分别对PD-1或LAG-3抗原具有反应性的亲本抗体所呈现的KD的一个数量级内所示。如本文所公开的，与亲本抗体所呈现的对相应抗原的KD相比，PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白可以显示对一种或两种抗原的KD的改善(即，具有较低的KD值；更紧密地结合)，或者，对一种或两种抗原的KD可以基本上与亲本抗体分别呈现的相同，或者，与亲本抗体的KD相比，FIT-Ig结合蛋白所显示的对一种或两种抗原的KD显示降低(即，具有较高的KD值；较不紧密地结合)，但是如果FIT-Ig结合蛋白与亲本抗体的KD之间存在差异，那么该差异不超过10倍。优选地，与一种或两种亲本抗体所呈现的对相应抗原的KD相比，PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白对一种或两种抗原显示较低的KD(更紧密地结合)。保留亲本抗PD-1和抗LAG-3抗体的结合亲和力±10倍的KD变化是本领域令人惊讶的成就。
本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种本文所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种抗LAG-3抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本发明还提供了药物组合物，其包含本文所述的抗PD-1和抗LAG-3抗体或其抗原结合片段的组合，以及药学上可接受的载体。本发明还提供了与PD-1和LAG-3二者具有反应性的双特异性、多价免疫球蛋白结合蛋白，该结合蛋白掺入了来自本文所述的抗PD-1和抗LAG-3抗体的VH/VL结合位点。特别地，本发明提供了药物组合物，其包含至少一种能够结合PD-1和LAG-3的FIT-Ig结合蛋白以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可进一步包含至少一种另外的活性成分。在一个实施方案中，这种另外的成分包括，但不限于，治疗剂、成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、不同特异性的抗体或功能性片段、可检测标记或报道分子；特定细胞因子的激动剂或拮抗剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、皮质类固醇、同化类固醇(anabolicsteroid)、促红细胞生成素、免疫原、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂(例如苯丙胺、咖啡因等)、β激动剂、吸入的类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子。
在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种用于治疗病症的其他治疗剂，在所述病症中PD-1介导的和/或LAG-3介导的信号传导活性是有害的。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的分离核酸；编码本发明的抗LAG-3抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的分离核酸；和编码能够结合PD-1和LAG-3的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的分离核酸。可以将此类核酸插入载体中以进行各种遗传分析或表达、表征或改善本文所述的抗体或结合蛋白的一种或多种特性。载体可包含编码本文所述的抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的一个或多个核酸分子，其中所述一个或多个核酸分子可操作地连接至适当的转录和/或翻译序列，以允许抗体或结合蛋白在携带载体的特定宿主细胞中表达。用于克隆或表达编码本文所述的结合蛋白的氨基酸序列的核酸的载体的实例包括但不限于pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ及其衍生物。
本发明还提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文所述的抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的核酸。可用于本发明的宿主细胞可以是原核或真核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞是大肠杆菌。在本发明中用作宿主细胞的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。示例性的真菌细胞是酵母细胞，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。根据本发明用作宿主细胞的示例性动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、禽细胞和昆虫细胞。优选的哺乳动物细胞包括但不限于CHO细胞、HEK细胞和COS细胞。根据本发明用作宿主细胞的昆虫细胞是昆虫Sf9细胞。
另一方面，本发明提供了生产抗PD-1抗体或其功能片段的方法，该方法包括在足以使宿主细胞表达能够结合PD-1的抗体或片段的条件下，在培养基中培养包含编码该抗体或功能片段的表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明提供了生产抗LAG-3抗体或其功能片段的方法，该方法包括在足以使宿主细胞表达能够结合LAG-3的抗体或片段的条件下，在培养基中培养包含编码该抗体或功能片段的表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明提供了生产能够结合PD-1和LAG-3的双特异性、多价结合蛋白，具体是结合PD-1和LAG-3的FIT-Ig结合蛋白的方法，该方法包括在足以使宿主细胞表达能够结合PD-1和LAG-3的结合蛋白的条件下，在培养基中培养包含编码FIT-Ig结合蛋白的表达载体的宿主细胞。可以分离如此产生的蛋白并用于本文所述的各种组合物和方法中。
在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的抗PD-1抗体或其PD-1结合片段，其中所述抗体或结合片段能够在表达PD-1的细胞中结合PD-1并抑制PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2介导的信号传导。在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的抗LAG-3抗体或其LAG-3结合片段，其中所述抗体或结合片段能够在表达LAG-3的细胞中结合LAG-3并抑制II类MHC/LAG-3介导的信号传导。在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的能够结合LAG-3和PD-1的双特异性FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合LAG-3和PD-1，并能够在表达LAG-3的细胞中抑制II类MHC/LAG-3介导的信号传导，并能够在表达PD-1的细胞中抑制PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2信号传导。在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:102的氨基酸23-684的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:105的氨基酸20-235的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:107的氨基酸23-236的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见表30)。在另一个实施方案中，本发明的FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3结合，并且其由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:189的氨基酸23-687的序列、基本上由其组成或由其组成；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:192的氨基酸20-235的序列、基本上由其组成或由其组成；并且所述第三多肽链包含SEQ ID NO:194的氨基酸23-236的序列、基本上由其组成或由其组成。(参见表48)。
在另一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法，其中结合蛋白能够结合LAG-3和PD-1，并且其中所述自身免疫疾病或癌症通常是对免疫疗法有反应的自身免疫疾病或癌症。在另一个实施方案中，癌症是与免疫疗法无关的癌症。在另一个实施方案中，癌症是难治性或复发性恶性肿瘤。在另一个实施方案中，结合蛋白抑制肿瘤细胞的生长或存活。在另一个实施方案中，癌症选自黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。
本文所述的治疗方法可以进一步包括向有此需要的受试者施用免疫刺激性佐剂，例如包含全部或部分磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)。例如，在本发明的治疗方法中，可以将免疫刺激性佐剂掺入包含本发明的抗体或FIT-Ig结合蛋白的组合物中，并将该组合物施用于需要治疗的受试者。在另一个实施方案中，本发明的治疗方法可以包括向需要治疗的受试者施用本文所述的抗体或FIT-Ig结合蛋白的步骤；以及在向所述受试者施用本发明的抗体或FIT-Ig结合蛋白的步骤之前、同时或之后，向所述受试者施用免疫刺激性佐剂的单独步骤。
附图说明
图1A和1B是显示在混合淋巴细胞反应中IL-2产生水平的柱状图，其测试了与从公开的序列产生的两种重组抗PD-1抗体(纳武单抗(nivolumab)和哌姆单抗(pembrolizumab))和针对无关抗原的对照人和鼠抗体(“hIgG4”和“mIgG”)相比，本文公开的各种抗PD-1抗体的效果。图1A和1B显示了使用来自不同供体的有反应者淋巴细胞进行的单独的MLR测试。
图2A和2B是显示在混合淋巴细胞反应中γ干扰素(IFN-γ)产生水平的柱状图，其测试了与从公开的序列产生的两种重组抗PD-1抗体(纳武单抗(nivolumab)和哌姆单抗(pembrolizumab))和针对无关抗原的对照人和鼠抗体(“hIgG4”和“mIgG”)相比，本文公开的各种抗PD-1抗体的效果。图2A和2B显示了使用来自不同供体的有反应者淋巴细胞进行的单独的MLR测试。
图3是显示在混合淋巴细胞反应中IL-2产生水平的柱状图，其测试了与从公开的序列产生的重组治疗性抗PD-1抗体(纳武单抗(nivolumab))和针对无关抗原的对照人抗体(“HuF0323-1”)相比，本文公开的各种人源化抗PD-1抗体的效果。
图4是显示在混合淋巴细胞反应中IL-2产生水平的柱状图，其测试了亲本鼠mAb709、从公开的序列产生的重组治疗性抗PD-1抗体(纳武单抗(nivolumab))和针对无关抗原的对照人抗体(“HuF0323-1”)相比，本文公开的各种人源化抗PD-1抗体的效果。
图5是显示在混合淋巴细胞反应中IL-2产生水平的柱状图，其测试了与具有亲本鼠mAb713可变结构域的嵌合体(mAb713c)、从公开的序列产生的重组治疗性抗PD-1抗体(纳武单抗(nivolumab))和针对无关抗原的对照人抗体(“HuF0323-1”)相比，本文公开的各种人源化抗PD-1抗体的效果。图3、4和5显示了使用来自不同供体的有反应者淋巴细胞进行的单独的MLR测试。
图6是显示在SEB T细胞活化测定法中IL-2产生的柱状图，其比较了在本文所述的两种鼠抗LAG-3抗体的不同浓度下，对T细胞抑制作用的逆转。将本发明的抗LAG-3抗体(“3502-mAb746”和“3502-mAb747”)的功能与由公开序列产生的重组抗LAG-3mAb(“BMS-986016”)、由公开序列产生的重组鼠抗LAG-3抗体(“BAP050”)、以及针对无关抗原的对照人和鼠抗体(“hIgG4”和“mIgG”)进行比较。
图7是显示在SEB T细胞活化测定法中IL-2产生的柱状图，其比较了在本文所述的FIT-Ig双特异性结合蛋白FIT107-1-2a的不同浓度下，对T细胞抑制作用的逆转。将FIT107-1-2a的功能与已知序列的重组抗LAG-3mAb(BMS-986016)和已知序列的重组抗PD-1mAb(纳武单抗(nivolumab))的组合以及抗-PD-1抗体单独(“PD-1”，本文公开的mAb709)进行比较。
图8呈现的曲线显示了在混合淋巴细胞反应中相对γ干扰素(IFN-g)的产生水平，其测试了与已知序列的重组抗LAG-3mAb(BMS-986016)和已知序列的重组抗PD-1mAb(纳武单抗(nivolumab))的组合、和本文公开的人源化抗PD-1抗体HumAb709-8相比较，各种浓度的FIT107-1-2a双特异性FIT-Ig结合蛋白的效果。
图9是显示在SEB T细胞活化测定法中IL-2产生的柱状图，其比较了不同浓度的嵌合抗LAG-3抗体mAb747c和人源化抗LAG-3抗体HumAb747-60对T细胞抑制作用的逆转。参见实施例13。将本发明的人源化抗LAG-3抗体(HumAb747-60)的功能与使用本文所述的鼠可变结构域产生的嵌合抗LAG-3mAb和针对无关抗原的人抗体(“hIgG4”，对照)进行比较。
图10是显示在SEB T细胞活化测定法中IL-2产生的柱状图，其比较了不同浓度的嵌合抗LAG-3抗体mAb747c和人源化抗LAG-3抗体HumAb747-60的高亲和力变体(掺入了亲和力成熟实验后指示的突变)对T细胞抑制作用的逆转。参见实施例14。将本发明的抗LAG-3变体抗体(HumAb747V-66至HumAb747V-73)的功能与使用本文所述的鼠可变结构域产生的嵌合抗LAG-3mAb和针对无关抗原的人抗体(“hIgG4”，对照)进行比较。
图11是显示在SEB T细胞活化测定法中IL-2产生的柱状图，其比较了不同浓度的对LAG-3和PD-1靶标具有特异性的FIT-Ig结合蛋白对T细胞抑制作用的逆转。参见实施例16.2。将本发明的PD-1/LAG-3FIT-Ig双特异性抗体的功能与由公开序列制备的重组抗PD-1和抗LAG-3单克隆抗体的组合(“纳武单抗(nivolumab)”+BMS986016”)以及针对无关抗原的人抗体(“hIgG”，对照)进行比较。
图12是显示受体阻断测定法的结果的柱状图，其显示了根据本发明的抗LAG-3抗体(HumAb747V-67)和根据本发明的PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白(FIT107-1-7b-1)阻断人LAG-3与纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)之间的相互作用的能力。参见实施例16.5。
图13是评估与T细胞上表达的PD-1和LAG-3的细胞表面结合的一系列图。结果表明，双特异性FIT-Ig蛋白FIT107-1-7b-1识别T细胞上的PD-1和LAG-3表面蛋白。
发明详述
本发明涉及新型抗PD-1抗体、新型抗LAG-3抗体、其抗原结合部分以及与PD-1和LAG-3靶标二者结合的多价、双特异性结合蛋白，例如Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)。本发明的各个方面涉及抗PD-1和抗LAG-3抗体和抗体片段、与人PD-1和人LAG-3结合的FIT-Ig结合蛋白、其药物组合物、以及用于制备此类抗体、功能性抗体片段和结合蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体、功能性抗体片段和双特异性结合蛋白检测人PD-1、人LAG-3或两者的方法；在体外或体内抑制人PD-1和/或人LAG-3活性的方法；治疗疾病，尤其是癌症的方法，所述疾病，尤其是癌症由PD-1和/或LAG-3与其各自的配体(即PD-1和II类MHC)结合所介导。
除非本文另有定义，否则本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。这些术语的含义和范围应该是清楚的，但是，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则诸如“元件”或“组件”等术语涵盖包含一个单元的元件和组件、以及包含一个以上子单元的元件和组件。
通常，在本文中，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交相关使用的命名法和技术，是本领域公知和常用的那些。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法以及如本说明书中引用和讨论的各种一般性的和更具体的参考文献中所描述的方法来进行。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、按照本领域通常实施的方式或按照本文所述的方式来进行。在本文中，与分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学相关使用的术语以及实验室程序和技术，是本领域公知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
以下定义了一些术语，以便可以更容易地理解本发明。
术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用，并且也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然的或人工的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质氨基酸序列的多肽类似物。术语“多肽”包括其片段和变体(包括变体片段)，除非上下文另有说明。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少一个连续或非线性的多肽表位。可以使用本领域普通技术确认至少一个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个连续氨基酸，例如至少约10个连续氨基酸，至少约15个连续氨基酸，或至少约20个连续氨基酸。多肽的变体如本文所述。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是一种蛋白质或多肽，就其起源或衍生来源而言，其与天然状态下伴随其的天然相关组分分离，基本上不含来自同一物种的其他蛋白质，由来自不同物种的细胞表达，或在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽，将是与其天然相关组分“分离”的。还可以使用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离，使蛋白质基本上不含天然相关组分。
术语“回收”是指通过分离(例如使用本领域公知的蛋白质纯化技术)使得化学物质(如多肽)成为基本上不含天然相关组分的过程。
术语“生物活性”是指本文所述的抗PD-1或抗LAG-3抗体的所有固有生物特性。抗PD-1抗体的生物特性包括但不限于与PD-1蛋白的结合；抗LAG-3抗体的生物特性包括但不限于与II类MHC蛋白的结合。
术语“特异性的结合”或“特异性地结合”，当涉及抗体、结合蛋白、或肽与第二个化学物质的相互作用时，表示该相互作用依赖于第二个化学物质上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，但非通常的蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的，未标记的A)的分子的存在，将降低与抗体结合的标记的A的量。
术语“抗体”宽泛地指，由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子、或保留了Ig分子的必要表位结合特征的其任何功能性片段、突变体、变体或衍生物。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。以下讨论了非限制性的实施方案。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，间插更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，从氨基端排列至羧基端。VH结构域的第一、第二和第三个CDR通常记为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；同样，VL结构域的第一、第二和第三个CDR通常记为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域，例如在IgM和IgE抗体的Fc区的情况下。IgG、IgA和IgD抗体的Fc区包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。相反，IgM和IgE抗体的Fc区缺乏铰链区，但是包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。Fc部分中具有氨基酸残基替换以改变抗体效应子功能的变体Fc区是本领域已知的(参见，例如，Winter等，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。在一些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是理想的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，分别通过与FcγR和补体C1q的结合来介导ADCC和CDC。在另一个实施方案中，在抗体的恒定区例如抗体的Fc区中替换至少一个氨基酸残基，从而改变抗体的效应子功能。免疫球蛋白的两条相同重链的二聚化通过CH3结构域的二聚化来介导，并且通过将CH1恒定结构域连接至Fc恒定结构域(例如CH2和CH3)的铰链区中的二硫键来稳定。IgG的抗炎活性完全依赖于IgG Fc片段的N-连接聚糖的唾液酸化。已经确定了抗炎活性的精确聚糖要求，从而可以产生合适的IgG1 Fc片段，由此产生具有极大增强效力的完全重组的唾液酸化IgG1Fc(参见，Anthony等，Science，320：373-376(2008))。
术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”或“功能性片段”可互换使用，并且是指抗体的一个或多个片段，所述片段保留特异性地结合抗原(即，与衍生所述部分或片段的全长抗体结合相同的抗原(例如，PD-1，LAG-3))的能力。已经表明，可以通过全长抗体的片段来执行抗体的抗原结合功能。这样的抗体实施方案还可以是双特异性的、双重特异的、或多特异性的格式；特异性地结合两个或更多个不同的抗原(例如PD-1和不同的抗原，例如LAG-3)。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等Nature 341:544-546(1989)，PCT公开WO 90/05144)，其包括单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH可以通过分开的基因编码，但也可以使用重组方法，通过人工接头将它们连接在一起，所述接头能使其作为单个蛋白质链产生，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等Science 242:423-426(1988)；和Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这样的单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”以及以上给出的等效术语内。该术语还包括其他形式的单链抗体，如双链抗体(diabody)。双链抗体可以是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短以致不允许同一链上的两个结构域之间配对，并由此迫使这些结构域分别与另一条链的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dübel编辑，Antibody Engineering(Springer-Verlag，NewYork，2001)，p.790(ISBN 3-540-41354-5))。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-VH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起，形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)；和美国专利No.5,641,870)。
免疫球蛋白恒定区(C)结构域是指重链(CH)或轻链(CL)恒定结构域。鼠和人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，构成群的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原决定簇(表位)。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。
术语“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，并且特别是在CDR3中。然而，如本文中使用的，术语“人抗体”，不包括其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经嫁接至人框架序列上的抗体。
术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、形成或分离的人抗体，如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom,H.R.，Trends Biotechnol.15:62-70(1997)；Azzazy和Highsmith，Clin.Biochem.35:425-445(2002)；Gavilondo和Larrick，BioTechniques 29:128-145(2002)；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21:371-378(2000))、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor等，Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992)；Kellermann等，Current Opinion in Biotechnology 13:593-597(2002)；Little等，Immunol.Today，21:364-370(2002))；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、形成或分离的抗体。这样的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，由此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下序列：尽管源自并且涉及人种系VH和VL序列，但可以非天然存在于体内人抗体种系库中。
术语“嵌合抗体”是指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，如具有连接人恒定区的小鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“CDR-移植的抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一个物种的CDR序列替换，如具有人重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个人CDR已经被鼠CDR序列替代。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改变为更像“人”的，即更类似于人类种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR-移植的抗体，其中将来自非人物种(例如小鼠)的CDR序列引入人VH和VL框架序列中。人源化抗体是免疫特异性地结合目标抗原的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其中所述抗体包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架区和恒定区但具有基本上是非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用，术语“基本上”就CDR而言是指与非人抗体CDR的氨基酸序列至少具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含至少一个并且通常是两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的，并且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的。在一个实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述免疫球蛋白恒定区通常是人免疫球蛋白的。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自一种以上类别或同种型的序列，并且可使用本领域公知的技术，选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架和CDR区不需要与亲本序列精确对应，例如，可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失来诱变供体抗体CDR或受体框架，使得该位点的CDR或框架残基与供体抗体或共有框架不对应。然而，在一个示例性实施方案中，此类突变不会是大量的。通常，人源化抗体残基的至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％将对应于亲本FR和CDR序列。在特定框架位置的回复突变以恢复为出现在供体抗体中该位置的相同氨基酸，通常可以用于保留特定的环结构或正确定向CDR序列以与靶抗原接触。
术语“CDR”指抗体可变域序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，其被称为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。如本文所用的术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单个可变区中出现的三个CDR的组。根据不同的系统，这些CDR的确切边界已被不同地定义。Kabat描述的系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。
本领域公认的术语“Kabat编号”是指，在抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中比其他氨基酸残基更可变(即，超变)的氨基酸残基的编号系统。参见，Kabat等，Ann.NY and Acad.Sci.，190：382-391(1971)；和Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH公开号91-3242(1991)。
在过去的二十年中，可变重链和轻链区氨基酸序列广泛的公共数据库的增长和分析，使得人们了解了可变区序列内框架区(FR)和CDR序列之间的典型边界，并使得本领域技术人员能够根据Kabat编号、Chothia编号或其他系统准确确定CDR。参见，例如，Martin,"Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,"Kontermann and Dübel,eds.,Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001),第31章,第432-433页。
术语“多价结合蛋白”表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选地被工程化为具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“双特异性结合蛋白”是指能够结合两个不同特异性靶标的结合蛋白。本发明的“Fabs-in-Tandem免疫球蛋白”(FIT-Ig)结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点，并且通常是四价结合蛋白。FIT-Ig可以是单特异性的，即，能够结合一种抗原，或者是多特异性的，即，能够结合两种或更多种抗原。根据本发明的优选的FIT-Ig结合PD-1和LAG-3两者，因此是双特异性的。包含两条长(重)V-C-V-C-Fc链多肽和四条短(轻)V-C链多肽的FIT-Ig结合蛋白形成具有四个Fab抗原结合位点的六聚体(VH-CH1与VL-CL配对，有时称为VH-CH1::VL-CL)。FIT-Ig的每一半均包含一个重链多肽和两个轻链多肽，并且三条链的VH-CH1和VL-CL元件的互补免疫球蛋白配对产生两个Fab结构的抗原结合位点，其串联排列。在本发明中，优选地包含Fab元件的免疫球蛋白结构域直接融合在重链多肽中，而不使用结构域间接头。即，长(重)多肽链的N末端V-C元件在其C末端直接融合至另一V-C元件的N末端，后者又与C末端Fc区连接。在双特异性FIT-Ig结合蛋白中，串联Fab元件将与不同的抗原反应。每个Fab抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，每个抗原结合位点总共有六个CDR。
在PCT公开WO2015/103072中提供了对FIT-Ig分子的设计、表达和表征的描述。这种FIT-Ig分子的优选示例包括一条重链和两条不同的轻链。重链包含结构式VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接与VHB融合，或重链包含结构式VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接与VLA融合，其中VLA是来自结合抗原A的亲本抗体的可变轻链结构域，VHB是来自结合抗原B的亲本抗体的可变重链结构域，CL是轻链恒定结构域，CH1是重链恒定结构域，而Fc是免疫球蛋白Fc区(例如，IgG1抗体重链的C末端铰链-CH2-CH3部分)。FIT-Ig的两条轻链多肽链分别具有式VHA-CH1和VLB-CL。在双特异性FIT-Ig的实施方案中，抗原A和抗原B是不同的抗原、或相同抗原的不同表位。在本发明中，A和B之一是PD-1，另一个是LAG-3。
术语“活性”包括诸如特异性结合靶抗原的能力、抗体对抗原的亲和力、中和靶抗原的生物活性的能力、抑制靶抗原与其天然受体相互作用的能力等性质。本发明优选的抗体和结合蛋白具有抑制PD-1与其配体PD-L1结合的能力、抑制LAG-3与其配体II类MHC结合的能力、或者在本文所述的双特异性结合蛋白的情况下，具有抑制二者的能力。
如本文中使用的，术语“kon”(也称为“Kon”，“kon”)意指结合蛋白(例如，抗体)与抗原结合形成如本领域已知的结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)的结合速率常数。“kon”也称为术语“缔合速率常数”或“ka”，如本文中可互换使用的。该值表示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体与抗原之间的复合物形成速率，如下式所示：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本文所用，术语“koff”(也称为“Koff”，“koff”)意指，如本领域已知的，结合蛋白(例如，抗体)从结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)解离的速率常数、或“解离速率常数”。该值表示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的速率，如下式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文中使用的，术语“KD”(也为“Kd”)旨在表示“平衡解离常数”，并且是指在平衡时滴定测量中获得的值，或者通过解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)而获得的值。结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡解离常数(KD)用于表示抗体与抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域公知的。可以使用基于荧光的技术，提供高灵敏度以及在平衡状态下生理缓冲液中检查样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器，例如
Figure BDA0002758486640000351
(生物分子相互作用分析)测定法(例如，可从BIAcore InternationalAB，GE Healthcare公司，Uppsala，Sweden获得的仪器)。使用例如
Figure BDA0002758486640000361
RED96系统(PallFortéBio LLC)的生物膜干涉(BLI)是另一种亲和力测定技术。另外，还可以使用获自Sapidyne Instruments(Boise，Idaho)的
Figure BDA0002758486640000362
(动力学排除测定)试验。
术语“分离的核酸”应指，这样的(例如，基因组的、cDNA或合成来源的，或其某些组合)多核苷酸，其中所述多核苷酸通过人为干预而与在自然界与其相关的全部或部分多核苷酸分开；可操作地连接天然与其不相连的多核苷酸；或是以在自然界中不存在的更大序列的一部分出现。
如本文中使用的，术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们起到等效的作用。
术语“可操作地连接”是指并置，其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，即所述方式将使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列、以及以反式或远距离起作用的方式控制目的基因的表达控制序列。如本文所用的术语“表达控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工而言是必不可少的组分，并且还可以包括其存在是有利的其他组分，例如前导或信号序列和融合伴侣序列。
如本文所定义的“转化”是指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。可以使用本领域公知的各种方法在天然或人工条件下进行转化。转化可依赖于任何已知的方法将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中。基于待转化的宿主细胞选择该方法，并且可以包括，但不限于，转染、病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这种“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分复制。也包括在有限时间内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含编码抗体的两个或更多个(例如，多个)核酸，例如，如美国专利号7,262,028中描述的宿主细胞。这些术语不仅旨在指特定的主题细胞，还指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌(Escherichia coli)；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书、或者按照本领域通常实施的方式或如本文所述的方式进行。前述技术和程序通常可以根据本领域公知的常规方法进行，这些方法也描述在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版。(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
如本文中使用的，术语“激动剂”是指这样的调节剂：与不存在激动剂时观察到的活性或功能的规模相比，该调节剂与感兴趣的分子接触后导致分子的某种活性或功能的规模增加。如本文中使用的，术语“拮抗剂”和“抑制剂”是指这样的调节剂：与不存在拮抗剂时观察到的活性或功能的规模相比，所述调节剂在与感兴趣的分子接触后导致分子的某种活性或功能的规模降低。特别感兴趣的拮抗剂包括阻断或降低人PD-1和人LAG-3的生物学或免疫学活性的那些拮抗剂。
如本文中使用的，术语“有效量”是指治疗量，所述量足以降低或改善病症的严重性和/或持续时间或其一种或多种症状；防止疾病的进展；导致疾病消退；预防与疾病相关的一种或多种症状的复发、发展或进展；检测疾病；或增强或改善另一种疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果。
抗PD-1和抗LAG-3抗体的产生
本发明的抗PD-1和抗LAG-3抗体可通过本领域已知的许多技术中的任何一种产生。例如，从宿主细胞表达，其中将编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优选在真核细胞中表达抗体，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为这样的真核细胞(并且特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。
用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980)，与DHFR选择标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、和SP2细胞。将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞后，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间来产生抗体，或者更优选地，抗体分泌到用于培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中收集抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应该理解，上述程序的变化都在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去编码轻链和重链之一或两者的DNA中的一些或全部，这些DNA对于结合目标抗原不是必需的。由这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一重链和轻链对目标抗原之外的抗原具有特异性，可以通过标准化学交联方法将本发明的抗体与第二抗体交联。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的一个示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经转染了载体的CHO细胞。培养选择的转染宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中收集完整的抗体。可以将标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转染体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。本发明还提供了通过在合适的培养基中培养本发明的转染的宿主细胞直至产生本发明的重组抗体来制备本发明的重组抗PD-1或抗LAG-3抗体的方法。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
结合PD-1和LAG-3的双特异性FIT-Ig的产生
使用免疫检查点抑制剂(例如，靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抗体)的临床研究已取得了有前景的结果，但是，已经观察到只有一部分患者最初对这些抑制剂有反应，并且越来越多的临床证据表明相当大比例的初始反应者最终复发，数月或数年后，成为致命的药物抗性疾病。Syn等人,The Lancet Oncology,18(12):e731–e741(2017)。LAG-3和PD-1都在耐受的肿瘤浸润性淋巴细胞(TILS)上共表达，导致在肿瘤中的免疫抑制；已经提出将LAG-3和PD-1双重阻断作为恢复CD8+T细胞中抗肿瘤功能的手段。Matsuzaki等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107(17):7875-7880(2010)。因此，设计可以同时阻断免疫抑制的T细胞上的两个靶标的LAG-3/PD-1双特异性结合蛋白，可以提供该治疗领域的进步。
本发明提供了与PD-1和LAG-3二者结合的Fabs-in-Tandem免疫球蛋白结合蛋白(FIT-Ig)。此类FIT-Ig分子的示例性实施例包括(1)重多肽链，其包含结构式(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接融合至VHB，或包含结构式(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接融合至VLA；(2)式VHA-CH1的轻多肽链；和(3)式VLB-CL的另一条轻多肽链，
其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区，A是PD-1或LAG-3的表位，B是PD-1或LAG-3的表位，前提是A和B不同。根据本发明，此类FIT-Ig结合蛋白与PD-1和LAG-3两者结合。
FIT-Ig可包含两条此类重链(1)、两条此类轻链(2)和两条此类轻链(3)，形成呈现四功能性Fab抗原结合位点的六链结合蛋白单体。此类FIT-Ig结合蛋白包含两个相同的亚基，其中每个亚基包含一条重链(1)、一条轻链(2)和一条轻链(3)，它们一起形成一对串联排列的Fab结合位点。两个此类亚基的Fc区的配对产生了本发明的六链双特异性FIT-Ig结合蛋白，其具有总共四个功能性Fab结合单元。
可以在重链上使用肽接头以分隔串联连接的Fab部分，但是对于根据本发明的双特异性FIT-Ig，优选省略此类接头序列。在具有串联结合位点的多价工程化的免疫球蛋白形式中，在本领域中通常理解相邻的结合位点将相互干扰，除非使用柔性接头在空间上分隔结合位点。然而，已经发现，对于本发明的PD-1/LAG-3FIT-Ig，根据以上给出的链式排列免疫球蛋白结构域，使得多肽链在转染的哺乳动物细胞中良好表达、适当组装、并作为结合靶抗原PD-1和LAG-3的双特异性、多价免疫球蛋白样结合蛋白被分泌。参见以下的实施例10。尽管在Fab结合位点之间不存在任何接头序列，但是本发明的PD-1/LAG-3FIT-Ig保留了对靶抗原的结合亲和力，呈现与亲本mAb可比的结合亲和力。此外，从结合蛋白中省略合成的接头序列可避免产生哺乳动物免疫系统可识别的抗原性位点，这样，消除接头会降低FIT-Ig可能的免疫原性，并使循环中的半衰期类似天然抗体，也就是说，FIT-Ig不会通过免疫调理作用以及肝脏中的捕获而迅速清除。
FIT-Ig中的每个可变结构域(VH或VL)可从一种或多种结合靶抗原之一(即PD-1或LAG-3)的“亲本”单克隆抗体获得。有利地，使用本文公开的抗PD-1和抗LAG-3单克隆抗体的可变结构域序列产生FIT-Ig结合蛋白。优选地，亲本抗体是人源化抗体。
本发明的一个方面涉及选择亲本抗体，所述亲本抗体具有至少一种或多种FIT-Ig分子中期望的性质。在一个实施方案中，抗体性质选自抗原特异性、对抗原的亲和力、效力、生物功能、表位识别、稳定性、溶解性、生产效率、缺乏免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、和直系同源抗原的结合。PD-1和LAG-3都是细胞表面蛋白，并且与它们各自的配体PD-L1(细胞表面受体)和II类MHC(抗原呈递细胞上的表面蛋白)相互作用，导致参与T细胞抑制和免疫应答的细胞内信号传导。因此，根据本发明的抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体和PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白抑制PD-1/PD-L1和/或II类MHC/LAG-3相互作用的能力，使其成为免疫细胞活化和免疫效应子细胞活性的有效调节物。
可以通过使用本领域可用于纯化抗体和结合蛋白的多种方法和材料中的一种或多种来纯化根据本发明的抗体、其功能片段和结合蛋白(用于预期用途)。此类方法和材料包括但不限于亲和色谱法(例如，使用与蛋白A、蛋白G、蛋白L或抗体的特定配体、其功能片段或结合蛋白缀合的树脂、颗粒或膜)、离子交换色谱法(例如，使用离子交换颗粒或膜)、疏水相互作用色谱法(“HIC”；例如，使用疏水性颗粒或膜)、超滤、纳米过滤、渗滤、尺寸排阻色谱法(“SEC”)、低pH处理(以灭活污染的病毒)及其组合，以获得预期用途可接受的纯度。用于灭活污染的病毒的低pH值处理的非限制性实例包括在18℃-25℃下，用0.5M磷酸将包含本发明的抗体、其功能片段或结合蛋白的溶液或悬浮液的pH值降低至pH3.5，持续60至70分钟。
本发明的抗体和结合蛋白的用途
鉴于它们结合人PD-1和/或LAG-3的能力，本文所述的抗体，其功能性片段和本文所述的双特异性多价结合蛋白可用于检测PD-1或LAG-3，或二者，例如在含有表达那些靶抗原的一者或二者的细胞的生物样品中。本发明的抗体、功能性片段和结合蛋白可用于常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本发明提供了一种检测生物样品中PD-1或LAG-3的方法，包括使生物样品与本发明的抗体，其抗原结合部分或结合蛋白接触，并检测是否发生与靶抗原的结合，从而检测生物样本中是否存在靶标。可以用可检测物质直接或间接标记抗体，功能性片段，或结合蛋白以便于检测结合或未结合的抗体/片段/结合蛋白。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
本发明的抗体、其功能片段和结合蛋白优选地能够在体外和体内中和人PD-1和/或人LAG-3活性。因此，本发明的抗体、其功能片段和结合蛋白可用于抑制人PD-1和/或人LAG-3活性，例如，在包含PD-1表达和/或LAG-3表达细胞的细胞培养物中、在人受试者中、或在具有与本发明的抗体、其功能片段或结合蛋白发生交叉反应的PD-1或LAG-3的其他哺乳动物受试者中，抑制由PD-1/PD-L1(或PD-1/PD-L2)相互作用和/或II类MHC/LAG-3相互作用介导的细胞信号传导。在一个实施方案中，本发明提供了一种恢复活化的T细胞的活性(逆转抑制)的方法，该方法包括使表达人PD-1的细胞与本发明的抗PD-1抗体或PD-1结合蛋白接触，使得PD-1活性被抑制。在一个实施方案中，本发明提供了一种恢复活化的T细胞的活性(逆转抑制)的方法，该方法包括使表达人LAG-3的细胞与本发明的抗LAG-3抗体或LAG-3结合蛋白接触，使得LAG-3活性被抑制。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患有其中PD-1和/或LAG-3活性是有害的疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或结合蛋白，使得降低由受试者中的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2结合和/或II类MHC/LAG-3结合介导的活性。
如本文所用，术语“其中PD-1和/或LAG-3活性是有害的疾病”旨在包括这样的疾病和其他病症，其中在患有病症的受试者中PD-1与其配体(PD-L1、PD-L2)中的一个或两个的相互作用或LAG-3与其配体(II类MHC)的相互作用，是该病症病理生理学的原因或是导致该病症恶化的因素。因此，其中PD-1和/或LAG-3活性是有害的病症是预期抑制PD-1和/或LAG-3活性以减轻病症的症状和/或进展的病症。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的能够结合LAG-3、PD-1或LAG-3和PD-1二者的抗体、其功能片段或结合蛋白，其中自身免疫疾病或癌症是对免疫疗法有反应的疾病。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗与免疫疗法无关的自身免疫疾病或癌症。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗难治性癌症或复发性恶性肿瘤。在另一个实施方案中，本发明的LAG-3或PD-1抗体、其功能片段或LAG-3/PD-1双特异性结合蛋白用于抑制肿瘤细胞生长或存活的方法中。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：向所述受试者施用本文所述的针对PD-1或LAG-3的抗体、其功能片段或本文所述的LAG-3/PD-1双特异性结合蛋白，例如Fabs-in-tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白，其中所述癌症选自：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤、原发性骨癌(例如骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和软骨肉瘤)、转移性癌以及其他肿瘤性恶性肿瘤。
本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分或双特异性多价结合蛋白(即主要活性成分)和药物学上可接受载体的药物组合物。包含本发明的蛋白的药物组合物用于，但不限于，诊断、检测或监测病症，治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状，和/或研究。在一个具体实施方案中，组合物包含一种或多种本发明的抗体或结合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种本发明的抗体或结合蛋白和除本发明抗体或结合蛋白之外的一种或多种用于治疗其中PD-1和/或LAG-3活性是有害的病症的预防或治疗剂。在一个实施方案中，预防剂或治疗剂已知可用于或已经或正在用于预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状。根据这些实施方案，组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。赋形剂通常是任何化合物或化合物的组合，其为组合物提供除主要活性成分之外(即，除本发明的抗体、其功能部分或结合蛋白之外)的期望的特征。
本发明的抗体(包括其功能性片段)和/结合蛋白可以掺入适于施用于受试者的药物组合物中。通常，药物组合物包含本发明的抗体或结合蛋白和药物学上可接受的载体。如本文中使用的，“药物学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)或氯化钠。药物学上可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可以增强组合物中存在的抗体或结合蛋白的保质期或有效性。
配制本发明的药物组合物以与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括，但不限于，肠胃外给药，(例如静脉内、皮内、皮下、肌内)、口服、鼻内(例如，吸入)、透皮(例如，局部)、肿瘤内、经粘膜和直肠给药。在一个具体实施方案中，该组合物按照常规方法配制成适合于对人类进行静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内或局部给药的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因(塞罗卡因、lignocaine)，以缓解注射部位的疼痛。
本发明的方法可包括施用配制用于通过注射(例如，通过推注或连续输注)肠胃外给药的组合物。用于注射的制剂可以以单位剂型(例如，在安瓿或多剂量容器中)与添加的防腐剂一起提供。组合物可以采取如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，主要活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。
本发明的方法可另外包括施用配制成储库型制剂(depot preparation)的组合物。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌内注射给药。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
本发明的抗体、其功能性片段或结合蛋白还可以与一种或多种用于治疗各种疾病的其他治疗剂一起施用。本文所述的抗体、其功能性片段和结合蛋白可单独使用或与另外的药剂(例如，治疗剂)组合使用，所述另外的药剂由技术人员基于其预期目的而选择。例如，另外的药剂可以是本领域公认为可用于治疗由本发明的抗体或结合蛋白治疗的疾病或病症的治疗剂。另外的药剂也可以是赋予治疗组合物有益属性的药剂，例如影响组合物粘度的药剂。
现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这些实施例仅出于举例说明的目的而包括在内，并不意图限制本发明。
实施例
实施例1：抗人PD-1单克隆抗体的产生
抗人PD-1单克隆抗体的产生如下：
实施例1.1：用人PD-1抗原免疫
在第1天，将50μg重组的纯化人PD-1细胞外结构域(ECD)多肽与完全弗氏佐剂混合，腹膜内注射到5只6-8周的Balb/C和5只SJL小鼠中。在第16和26天，将25μg重组的纯化人PD-1ECD免疫原与不完全弗氏佐剂混合，腹膜内注射到相同的小鼠中。融合前3-4天，使用25μg免疫原进行最后的增强免疫。
实施例1.2：杂交瘤的产生
根据在Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975)中描述的确定方法，将从实施例1.1中描述的免疫小鼠获得的脾细胞与SP2/0-Ag-14细胞以5：1的比例融合，产生杂交瘤。将融合产物以每孔1×105个脾细胞的密度铺板在96孔板的选择培养基中，其中含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)。融合后七至十天，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。
实施例1.3：通过ELISA和FACS评估PD-1结合活性
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定PD-1特异性抗体的存在，如下：
首先，从Synbio Technologies(中国苏州)订购了抗人PD-1、抗食蟹猴PD-1和抗鼠PD-1的合成靶标。每个靶标由与人IgGFc区融合的人、食蟹猴或鼠PD-1蛋白的细胞外结构域(ECD)的多肽片段组成。将编码每种ECD-Fc融合蛋白的合成基因亚克隆到pCP表达载体(Chempartner，中国上海)中，将表达质粒瞬时转染到1-3升培养基中的HEK293E细胞中，并在CO2摇床中培养7天。下表1中列出了用于每种融合体的ECD序列。每种融合蛋白的PD-1ECD部分以下划线标出。
表1：PD-1ECD-Fc融合蛋白靶标的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000471
Figure BDA0002758486640000481
通过以4000×g离心30分钟，收获含有重组ECD/Fc融合体的HEK293E转染子的上清液，然后进行使用MabSelectSuReTM亲和树脂(GEHealthcare)的蛋白A纯化。将用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析融合产物，并储存在-80℃。
用50μl上述合成的人PD-1ECD/Fc融合蛋白靶标在4℃下过夜孵育ELISA板，所述靶标在PBS缓冲液(pH7.4)中以1μg/ml稀释。将板在洗涤缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)中洗涤四次，并在37℃下用每孔200μl的封闭缓冲液(含0.05％Tween20的PBS溶液，含1％BSA)封闭1小时。除去封闭缓冲液后，将杂交瘤上清液(或随后稀释的纯化的mAb)以每孔100μl添加至孔中，并在37℃下孵育1小时。将孔用洗涤缓冲液洗涤四次，并将用于小鼠抗人PD-1抗体表征的抗小鼠HRP(Sigma)以1：5000稀释，并以每孔100μl添加到孔中。将板在37℃下孵育1小时，并在洗涤缓冲液中洗涤四次。每孔中加入100μl四甲基联苯胺(TMB)发色溶液。显色后，用1N HCl终止反应，并在
Figure BDA0002758486640000482
读板仪(MolecularDevices；美国加利福尼亚州圣何塞)上测量450nm处的吸光度。
实施例1.4：PD-1表达细胞系的制备和FACS分析
通过用具有插入的编码人PD-1或食蟹猴PD-1的基因的pLvx慢病毒质粒载体(Clontech)转染CHO-K1细胞(获自ATCC)，产生过表达人PD-1或食蟹猴PD-1的稳定细胞系。通过有限稀释分离单个克隆。使用从已知抗体序列重组产生的抗PD-1抗体(Chempartner)，通过FACS分析筛选克隆的表达水平，选择具有最高PD-1表达的克隆，用于FACS结合测定法和功能测定法中，如下所述。
细胞表面靶标的结合测定法：通过FACS分析确定纯化的抗体结合细胞膜人PD-1或食蟹猴PD-1的能力。将稳定表达人PD-1(CHO-K1-hPD-1细胞)或食蟹猴PD-1(CHO-K1-cynoPD-1)的CHO-K1细胞重悬于含有2％FBS的PBS(FACS缓冲液)中，并以2×104细胞/孔接种于96孔圆底板(Corning；目录号：3799)。将产生抗PD-1抗体的杂交瘤的上清液添加至孔中，并用
Figure BDA0002758486640000483
驴抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗(Invitrogen；目录号：A-21202)检测，然后在流式细胞仪上读取测定板。使用CHO-K1/cynoPD-1细胞进一步表征产生表达抗人PD-1阳性信号传导靶标上清液的杂交瘤，以确定抗体与食蟹猴PD-1的交叉反应性。
实施例1.5：受体阻断测定法(RBA)
使用固定的人PD-1ECD/Fc作为靶标，以及使用PD-L1/Fc和PD-L2/Fc融合蛋白(以与上述实施例1.3中所述的PD-1ECD/Fc结合蛋白相同的方法制备)，测试了呈现PD-1特异性活性的上清液阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2结合的能力。为了确定含抗体的上清液的相对效力，评估了它们抑制人PD-1配体(PD-L1或PD-L2)与人PD-1蛋白结合的能力。用100μl50ng/mlhuPD-1/Fc(即，移植到人Fc区N末端的PD-1的细胞外结构域，作为同源二聚体回收)的PBS溶液包被ELISA板，并在4℃下过夜孵育。将板在洗涤缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)中洗涤四次，并在37℃下用每孔200μl的封闭缓冲液(含0.05％Tween20的PBS溶液，含1％BSA)封闭1小时。去除封闭缓冲液后，将杂交瘤上清液(50μl)加入孔中，并与含有50μl生物素化人PD-L1/Fc(终浓度1.0mg/ml)的封闭缓冲液或含有50μl生物素化人PD-L2/Fc(终浓度50μg/ml)的封闭缓冲液混合，然后在37℃下孵育1小时。通过添加链霉亲和素-HRP(Sigma,目录号S2468)(100μl/孔的链霉亲和素-HRP，以1：5000稀释)产生信号，并在37℃下孵育40分钟，并在洗涤缓冲液中洗涤四次。每孔加入100μlTMB溶液。显色后，用1NHCl终止反应，并测量450nm的吸光度。
实施例1.6：抗PD-1单克隆抗体的表达和纯化
在FreeStyleTM293表达培养基(Gibco/LifeTechnologies)中，在CO2摇床上于37℃下培养产生鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞5至7天。在纯化前通过在4000×g下离心30分钟收集条件培养基，去除所有细胞和细胞碎片，然后通过0.22μm膜过滤。根据制造商的指南施加鼠抗体并使其与MabSelectTMSuRe(GEHealthcare)蛋白A树脂柱结合，用PBS洗涤，用含20mM柠檬酸盐、150mMNaCl，pH3.5的缓冲液洗脱。立即用pH8.0的1MTris中和洗脱的物质，并用PBS透析。如通过SEC-HPLC所检测的，一步纯化的抗体通常具有90％以上的纯度。通过测量在280nm处的吸光度或通过NanoDropTM微量分光光度计(ThermoScientific)确定蛋白浓度。将纯化的抗体等分保存在-80℃的冰箱中。
实施例2：纯化的抗PD-1抗体的结合活性
实施例2.1：ELISA表征
以与以上实施例1.3中所述相同的方法进行结合ELISA。将每种纯化的抗体10倍系列稀释，一式两份。封闭96孔测定板的含有固定的PD-1ECD/Fc融合蛋白靶标的孔后，将稀释浓度的纯化抗体样品添加至测定板的孔中。使用HRP连接的抗小鼠IgG抗体(A0168，Sigma)和TMB试剂检测和产生ELISA信号，在
Figure BDA0002758486640000503
读板仪上在450nm的波长下读取。使用GraphPad软件拟合曲线，并计算EC50。类似地，也如实施例1.5中所述用滴定的纯化抗体进行受体阻断测定法(RBA)，并确定最高阻断百分比和IC50值。
实施例2.2：通过FACS表征
将上述CHO-K1/huPD-1或CHO-K1/cynoPD-1细胞以每孔2×104个细胞装入96孔测定圆底测定板(目录号3799；Corning)，并用纯化的抗PD-1抗体染色。用
Figure BDA0002758486640000501
驴抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗(目录号A21202；Invitrogen)检测PD-1抗体,并使用流式细胞仪监测细胞荧光。通过GraphPad软件处理数据，并计算EC50值。
这些结合表征测定法的结果显示在下表2中。
表2：纯化的抗PD-1抗体的结合活性
Figure BDA0002758486640000502
Figure BDA0002758486640000511
实施例2.3：通过表面等离子体共振(SPR)进行亲和力测量
使用BiacoreT200仪器(GEHealthcare)、使用标准步骤、通过表面等离子体共振测量纯化抗体的结合动力学。简而言之，将山羊抗小鼠IgGFc多克隆抗体(Genway)直接固定在生物传感器芯片上，并将抗体样品以5μl/min的流速注入反应基质中。以30μl/min的连续流速分别测定结合和解离速率常数，kon(M-1s-1)和koff(s-1)。通过测量五个不同浓度的人PD-1/Fc蛋白的动力学结合测量值来得出速率常数。然后使用公式KD＝koff/kon从动力学速率常数计算抗体与相关靶蛋白之间反应的平衡解离常数KD(M)。如下表3所示，测量了11种鼠抗PD-1抗体的亲和力。
表3：11种抗PD-1单克隆抗体的亲和力测量值
mAb标识 k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
mAb701 7.52×10<sup>4</sup> 5.12×10<sup>-4</sup> 6.81×10<sup>-9</sup>
mAb703 3.47×10<sup>5</sup> 8.50×10<sup>-4</sup> 2.45×10<sup>-9</sup>
mAb707 5.26×10<sup>4</sup> 3.10×10<sup>-4</sup> 5.89×10<sup>-9</sup>
mAb709 1.11×10<sup>5</sup> 1.04×10<sup>-4</sup> 9.39×10<sup>-9</sup>
mAb711 4.80×10<sup>4</sup> 2.52×10<sup>-4</sup> 5.24×10<sup>-9</sup>
mAb713 1.45×10<sup>5</sup> 2.85×10<sup>-4</sup> 1.96×10<sup>-9</sup>
mAb714 9.94×10<sup>4</sup> 2.10×10<sup>-4</sup> 2.11×10<sup>-9</sup>
mAb715 1.58×10<sup>5</sup> 2.37×10<sup>-4</sup> 1.50×10<sup>-9</sup>
mAb716 1.26×10<sup>5</sup> 1.40×10<sup>-4</sup> 1.11×10<sup>-9</sup>
mAb718 5.84×10<sup>4</sup> 2.83×10<sup>-4</sup> 4.84×10<sup>-9</sup>
mAb719 7.15×10<sup>4</sup> 2.15×10<sup>-4</sup> 3.00×10<sup>-9</sup>
实施例3：抗PD-1抗体的功能活性
使用来自一个供体的单核细胞衍生的树突细胞和来自另一个供体的同种异体CD4+T细胞进行混合淋巴细胞反应(MLR)测定法。从健康供体中采集全血样品，并使用Ficoll-Pague梯度离心从全血中分离PBMC。在第1天，从一位供体分离PBMC，并用无血清RPMI1640稀释为1×106细胞/ml。将稀释的PBMC以3ml/孔接种到6孔组织培养板中，并孵育3小时。除去上清液，并洗去未附着的细胞。使用在含10％FBS的RPMI1640中的250U/ml IL-4和500U/mlGM-CSF使附着的单核细胞极化为树突细胞。在第4天，用含有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基置换培养基。在第7天，收集未成熟的树突细胞，并用在含10％FBS的RPMI1640中的1μg/ml细菌脂多糖(LPS)(Sigma)处理另外的24小时，使成熟。在第8天，通过负选择从另一供体的PBMC中分离CD4+T细胞，并调节至终浓度为2×106细胞/ml。将成熟的树突细胞在37℃下用丝裂霉素C处理1.5小时，然后用PBS洗涤树突细胞并调节至终浓度为1×106细胞/ml。将CD4+T细胞(反应细胞)以100μl/孔添加到96孔板中，并用稀释浓度的测试抗体预处理30分钟。将成熟的树突细胞(刺激细胞)以100μl/孔添加到孔中。每个孔的最终体积为200μl。将混合的淋巴细胞在37℃下孵育。72小时后测量IL-2的产生(参见图1A和1B)；在120小时时测量IFN-γ(参见图2A和2B)。
实施例4：抗PD-1mAb的克隆和序列分析
使用TRIzol试剂(目录号15596；Invitrogen)从>5×106细胞分离各杂交瘤克隆的总RNA。通过SuperScriptTMIII第一链合成SuperMix(目录号18080；Invitrogen)合成cDNA，并用作小鼠Ig-引物组的PCR模板(目录号69831-3；Novagen)。通过在具有SYBRTM Safe DNA凝胶染料(Invitrogen)的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳来分析PCR产物。根据制造商的说明书，用Nucleo
Figure BDA0002758486640000521
和PCR Clean-up纯化大小正确的DNA片段(目录号740609；Macherey-NagelGmbH)，并分别亚克隆到pMD18-T载体(SinoBiologicalInc.)中。从每个转化中选择15个菌落，并通过DNA测序分析插入片段的序列。如果VH和VL至少有8个匹配共有序列，则确认序列。通过序列同源性比对分析了鼠抗PD-1mAb可变区的蛋白序列，并列于表4。基于Kabat编号鉴定互补决定区(CDR)，并在下表4中以下划线表示。
表4：8种抗PD-1鼠单克隆抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000531
Figure BDA0002758486640000541
实施例5：鼠抗PD-1抗体的人源化
基于人PD-1的结合活性、食蟹猴PD-1与人相似的交叉反应性、在RBA测定法中几乎100％的阻断活性、在MLR中的功能活性以及通过Biacore所测量的至少纳摩尔的亲和力，选择了四种抗PD-1抗体用于人源化：mAb709、mAb713、mAb703和mAb719。
实施例5.1：鼠抗体mAb709的人源化
使用mAb709可变区基因来创建人源化抗体。在此方法的第一步骤中，将mAb709的VH和VL氨基酸序列与可获得的人IgV基因序列的数据库进行比较，以找到总体上最匹配的人种系IgV基因序列。另外，将VH或VL的框架4区段与J区数据库进行比较，以分别找到与鼠VH和VL区具有最高同源性的人框架。对于轻链，最接近的人V基因匹配是O12基因；对于重链，最接近的人匹配是VH3-7基因。然后设计人源化的可变结构域序列，其中将mAb709轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到O12基因的框架序列上，其中CDR-L3之后是JK4框架4序列；并且将mAb709重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3移植到VH3-7的框架序列上，其中CDR-H3之后是JH1框架4序列。然后生成mAb709的3维Fv模型，以确定是否存在任何其中小鼠的氨基酸对于支持环结构或VH/VL界面是至关重要的框架位置。应该将人源化序列中相同位置的这些残基回复突变为小鼠残基，以保留亲和力/活性。在轻链的情况下，将第71位的Phe回复突变为Tyr(F71Y，Kabat编号)、第49位的Tyr回复突变为Ser(Y49S，Kabat编号)、第3位的Gln回复突变为Val(Q3V，Kabat编号)、第46位的Leu回复突变为Val(L46V，Kabat编号)、第63位的Ser回复突变为Thr(S63T，Kabat编号)、第43位的Ala回复突变为Ser(A43S，Kabat编号)、以及第44位的Pro回复突变为Leu(P44L，Kabat编号)鉴定为理想的回复突变。在重链的情况下，将第98位的Arg突变为Gly(R94G，Kabat编号)和第44位的Gly突变为Arg(G44R，Kabat编号)鉴定为理想的回复突变。构建了包含一个或多个这些回复突变的突变可变结构域。参见下表5。(回复突变的框架氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000552
表示；来自原始亲本抗体的鼠CDR用下划 线表示。)
表5：mAb709w/回复突变为鼠残基的人源化VH/VL的设计
Figure BDA0002758486640000551
Figure BDA0002758486640000561
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其分别克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中。(参见下表6。)
表6：用于抗体人源化的人恒定区序列
Figure BDA0002758486640000562
人源化的VH和人源化的VK链配对创建了15种人源化抗体，称为HumAb709-1至HumAb709-15(表7)。为了比较亲和力，还产生了作为阳性对照的嵌合抗体(mAb709c)，其具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列。表达并纯化所有重组mAb。
表7：抗PD-1人源化mAb709抗体的生产清单
抗体标识 重链中的VH区 轻链κ中的VL区
HumAb709-1 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1A
HumAb709-2 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1A
HumAb709-3 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1A
HumAb709-4 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1B
HumAb709-5 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1B
HumAb709-6 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1B
HumAb709-7 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1C
HumAb709-8 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1C
HumAb709-9 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1C
HumAb709-10 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1D
HumAb709-11 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1D
HumAb709-12 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1D
HumAb709-13 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1E
HumAb709-14 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1E
HumAb709-15 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1E
HumAb709c SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9
通过结合ELISA和基于细胞的RBA对所有15种人源化抗体和嵌合抗体(mAb709c)进行表征。对于基于细胞的RBA，将2×105个细胞/孔的CHO-K1-huPD1细胞添加到预先封闭的96孔圆底平板中，洗涤后，向每个孔中添加50μl稀释浓度为0.064nM至200nM的抗体。接下来，添加50μl的60μg/ml生物素化的PD-L1/Fc或生物素化的PD-L2/Fc蛋白。轻轻混合并在4℃下孵育后，洗涤细胞并通过AlexaFluorTM488链霉亲和素溶液(1:1000,ThermoFisherScientific；目录号S32354)染色。通过FACS读取信号，并通过GraphPad软件拟合曲线。计算的IC50值显示在下表8中。使用BiacoreT200仪器通过表面等离子体共振测量进一步分析具有阳性(低)IC50值(即，对于至少一种PD-1配体，低于约1.0nM)的抗体的结合亲和力。简而言之，将山羊抗人IgGFc多克隆抗体直接固定在生物传感器芯片上，然后将抗PD-1人源化抗体或嵌合抗体样品以5μl/min的流速注入反应基质中。通过以30μl/min的连续流速测量五个不同浓度的人PD-1-His蛋白的动力学结合，分别确定结合和解离速率常数kon(M-1s-1)和koff(s-1)。使用公式KD＝koff/kon从动力学速率常数计算抗体与相关靶蛋白之间反应的平衡解离常数KD(M)。表8中显示了5种mAb709人源化抗PD-1衍生物的亲和力。HumAb709-8具有最少的回复突变，同时最大程度地保持了亲本可变结构域对嵌合mAb709c的亲和力。
表8：人源化mAb709抗PD-1抗体的RBA值和结合亲和力
Figure BDA0002758486640000581
实施例5.2：鼠抗体mAb713的人源化
使用抗PD-1mAb713的可变区基因创建人源化抗体。将mAb713的VH和VK氨基酸序列与可获得的人IgV基因序列的数据库进行比较，以找到总体上最匹配的人种系IgV基因序列。另外，将VH或VL的框架4区段与J区数据库进行比较，以分别找到与鼠VH和VL区具有最高同源性的框架。对于轻链，最接近的人V基因匹配是O18基因；对于重链，最接近的人匹配是VH3-48基因。然后设计人源化的可变结构域序列，其中将mAb713轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到O18基因的框架序列上，其中CDR-L3之后是JK4框架4序列；并且将mAb713重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3移植到VH3-48的框架序列上，其中CDR-H3之后是JH6框架4序列。然后生成mAb709的3维Fv模型，以确定是否存在任何其中小鼠的氨基酸对于支持环结构或VH/VL界面是至关重要的框架位置。应该将人源化序列中相同位置的这些残基回复突变为小鼠残基，以保留亲和力/活性。在轻链的情况下，将第71位的Phe回复突变为Tyr(F71Y，Kabat编号)、第49位的Tyr回复突变为Ser(Y49S，Kabat编号)、以及第69位的Thr回复突变为Lys(T69K，Kabat编号)鉴定为理想的回复突变。在重链的情况下，将第98位的Arg突变为Lys(R94K，Kabat编号)、第29位的Phe回复突变为Ser(F29S，Kabat编号)、第49位的Ser回复突变为Ala(S49A，Kabat编号)鉴定为理想的回复突变。构建了包含一个或多个这些回复突变的突变可变结构域。参见下表9。(回复突变的框架氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000592
表示；来自原始亲本抗体的鼠CDR用下划线表示。)
表9：mAb713VH和VL的可变结构域序列变体
Figure BDA0002758486640000591
Figure BDA0002758486640000601
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其单独克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中(参见表6，同上)。人VH变体和人VK变体的配对产生了16种人源化抗体，称为HumAb713-1至HumAb713-16(表10)。为了比较亲和力，还产生了作为阳性对照的嵌合抗体(mAb713c)，其具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列。
表10：人源化mAb713抗PD-1抗体的生产清单
抗体标识 重链中的VH区 轻链κ中的VL区
HumAb713-1 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1
HumAb713-2 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1
HumAb713-3 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1
HumAb713-4 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1
HumAb713-5 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1A
HumAb713-6 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1A
HumAb713-7 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1A
HumAb713-8 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1A
HumAb713-9 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1B
HumAb713-10 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1B
HumAb713-11 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1B
HumAb713-12 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1B
HumAb713-13 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1C
HumAb713-14 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1C
HumAb713-15 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1C
HumAb713-16 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1C
mAb713c SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11
通过结合ELISA、基于细胞的RBA和Biacore亲和力测试对所有16种人源化抗体和嵌合抗体(mAb713c)进行表征。结果总结在表11中。
表11：人源化mAb713抗PD-1抗体的RBA值和结合亲和力
Figure BDA0002758486640000611
HumAb713-7具有最少的回复突变，同时保持了嵌合抗体mAb713c的亲本可变结构域的亲和力特征。如实施例3所述，在MLR测定法中验证了mAb713人源化抗体的功能活性。如图5所示，在MLR中，HumAb713-7显示与嵌合抗体mAb713c可比较的活性，这与其保留的结合特性一致。
实施例5.3：鼠抗体mAb703的人源化
按照与实施例5.1和5.2相同的步骤，选择鼠抗PD-1抗体mAb703并对其进行人源化。构建了人源化的可变结构域，其中一些含有一个或多个回复突变，氨基酸序列列于下表12。(回复突变的框架氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000612
表示；来自原始亲本抗体的鼠CDR用下划线表示。)
表12：mAb703VH和VL的可变结构域序列变体
Figure BDA0002758486640000621
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其单独克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中(参见表6，同上)。人VH变体和人VK变体的配对产生了25种人源化抗体，称为HumAb703-1至HumAb703-25(表13)。为了比较亲和力，还产生了作为阳性对照的嵌合抗体，其具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列。
表13：人源化mAb703抗PD-1抗体的生产清单
抗体标识 重链中的VH区 轻链κ中的VL区
HumAb703-1 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1
HumAb703-2 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1
HumAb703-3 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1
HumAb703-4 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1
HumAb703-5 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1
HumAb703-6 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1A
HumAb703-7 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1A
HumAb703-8 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1A
HumAb703-9 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1A
HumAb703-10 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1A
HumAb703-11 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1B
HumAb703-12 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1B
HumAb703-13 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1B
HumAb703-14 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1B
HumAb703-15 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1B
HumAb703-16 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1C
HumAb703-17 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1C
HumAb703-18 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1C
HumAb703-19 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1C
HumAb703-20 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1C
HumAb703-21 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1D
HumAb703-22 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1D
HumAb703-23 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1D
HumAb703-24 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1D
HumAb703-25 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1D
mAb703c SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7
通过结合ELISA和Biacore亲和力测试对所有25种人源化抗体和嵌合抗体(mAb703c)进行表征。表14中总结了阳性结合物的亲和力结果。
表14：所选人源化mAb703抗PD-1抗体的结合亲和力
人源化抗体ID k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
HumAb703-11 1.874×10<sup>5</sup> 1.757×10<sup>-3</sup> 9.374×10<sup>-9</sup>
HumAb703-12 1.770×10<sup>5</sup> 1.594×10<sup>-3</sup> 9.003×10<sup>-9</sup>
HumAb703-13 1.454×10<sup>5</sup> 1.537×10<sup>-3</sup> 1.057×10<sup>-8</sup>
HumAb703-18 6.572×10<sup>4</sup> 1.242×10<sup>-3</sup> 1.890×10<sup>-8</sup>
HumAb703-22 2.294×10<sup>5</sup> 1.593×10<sup>-3</sup> 6.942×10<sup>-9</sup>
mAb703c 3.594×10<sup>5</sup> 9.664×10<sup>-4</sup> 2.684×10<sup>-9</sup>
如图2A和图3所示，在如实施例3所述进行的MLR分析中验证了人源化mAb703抗体的功能活性。
实施例5.4：鼠抗体mAb719的人源化
按照与实施例5.1和5.2相同的步骤，选择鼠抗PD-1抗体mAb719并对其进行人源化。构建了人源化的可变结构域，其中一些含有一个或多个回复突变，氨基酸序列列于下表15。(回复突变的框架氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000642
表示；来自原始亲本抗体的鼠CDR用下划线表示。)另外，进行CDR-H2中的Asp→Ala取代，以及CDR-H3中的Ser→Ala取代，以避免常见的重组抗体Asp的可能的异构化。(参见表15中的mAb719 VH.1E和mAb719 VH.1F序列。)
表15：mAb719VH和VL的可变结构域序列变体
Figure BDA0002758486640000641
Figure BDA0002758486640000651
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其单独克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中(参见表6，同上)。人VH变体和人VK变体的配对产生了21种人源化抗体，称为HumAb719-1至HumAb719-21(表16)。为了比较亲和力，还产生了作为阳性对照的嵌合抗体，其具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列。表达并纯化所有重组mAb。
表16：人源化mAb719抗PD-1抗体的生产清单
抗体标识 重链中的VH区 轻链κ中的VL区
HumAb719-1 mAb719 VH.1 mAb719 VK.1
HumAb719-2 mAb719 VH.1A mAb719 VK.1
HumAb719-3 mAb719 VH.1B mAb719 VK.1
HumAb719-4 mAb719 VH.1C mAb719 VK.1
HumAb719-5 mAb719 VH.1D mAb719 VK.1
HumAb719-6 mAb719 VH.1E mAb719 VK.1
HumAb719-7 mAb719 VH.1F mAb719 VK.1
HumAb719-8 mAb719 VH.1 mAb719 VK.1A
HumAb719-9 mAb719 VH.1A mAb719 VK.1A
HumAb719-10 mAb719 VH.1B mAb719 VK.1A
HumAb719-11 mAb719 VH.1C mAb719 VK.1A
HumAb719-12 mAb719 VH.1D mAb719 VK.1A
HumAb719-13 mAb719 VH.1E mAb719 VK.1A
HumAb719-14 mAb719 VH.1F mAb719 VK.1A
HumAb719-15 mAb719 VH.1 mAb719 VK.1B
HumAb719-16 mAb719 VH.1A mAb719 VK.1B
HumAb719-17 mAb719 VH.1B mAb719 VK.1B
HumAb719-18 mAb719 VH.1C mAb719 VK.1B
HumAb719-19 mAb719 VH.1D mAb719 VK.1B
HumAb719-20 mAb719 VH.1E mAb719 VK.1B
HumAb719-21 mAb719 VH.1F mAb719 VK.1B
mAb719c SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19
通过结合ELISA和使用
Figure BDA0002758486640000661
RED96生物层干涉法系统(PallFortéBioLLC)的亲和力测定表征所有21种人源化抗体和嵌合抗体(mAb719c)，使用具有固定的人PD-1/Fc作为抗体靶标的生物传感器。通过测量五个不同浓度的抗体的动力学结合测量值来得出速率常数。因为是二价结合靶标，亲和力显示比之前的Biacore测试更高。表17中总结了阳性结合物的亲和力结果。
表17：所选人源化mAb719抗PD-1抗体的结合亲和力
Figure BDA0002758486640000662
如图2B和图3所示，在MLR测定法中验证了人源化mAb719抗体的功能活性。
实施例6：主导抗PD-1抗体的药代动力学特性。
在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中评估了HumAb709-8和HumAb713-7的药代动力学特性。以5mg/kg的单次静脉内剂量向雄性SD大鼠施用抗体。在28天的期间内，在不同时间点收集血清样品，其中在第0、5、15和30分钟；在第1、2、4、8和24小时；和在第2、4、7、10、14、21和28天通过尾静脉连续采血，并通过常规ELISA进行分析。简而言之，用125ng/孔的山羊抗人IgGFc抗体(Rockland,目录号：609-101-017)在4℃下过夜包被ELISA板，用1XPBS/1％BSA/0.05％Tween-20/0.05％ProClinTM300封闭。首先将所有血清样品在封闭缓冲液中稀释20倍。在5％合并的大鼠血清中进行另外的稀释，并在板上于37℃孵育60分钟。用过氧化物酶缀合的抗人IgG(Fab片段)(Sigma；目录号A0293)进行检测，借助于使用四参数逻辑拟合的标准曲线确定浓度。使用WinNonlin软件(PharsightCorporation，MountainView，CA)通过非房室模型(non-compartmentalmodel)确定药代动力学参数的值。如这些结果所示(表18)，HumAb09-8和HumAb13-7的性质稳定。
表18：HumAb709-8和HumAb713-7的药代动力学特性
Figure BDA0002758486640000671
实施例7：抗LAG-3单克隆抗体的产生
通过杂交瘤融合产生抗LAG-3单克隆抗体(mAb)。
实施例7.1：免疫、杂交瘤融合和克隆。
除了使用人LAG-3D1-D2/鼠Fc同源二聚体作为免疫原以外，以与上述针对抗PD-1抗体产生(实施例1)相同的方式进行Balb/C小鼠的免疫。以2-3周的间隔加强动物免疫2-4次。最后的加强免疫后三天，使用标准技术分离来自免疫小鼠的脾细胞，并与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合。
实施例7.2：抗LAG-3抗体的鉴定与表征
从Synbio Technologies(中国苏州)订购了抗人LAG-3和抗食蟹猴LAG-3的合成靶标。每个靶标由与人IgGFc区融合的人或食蟹猴LAG-3蛋白的细胞外结构域的多肽片段组成。将编码每种LAG-3ECD/Fc融合蛋白的合成基因亚克隆到pCP表达载体(Chempartner，中国上海)中，将表达质粒瞬时转染到1-3升培养基中的HEK293E细胞中，并在CO2摇床中培养7天。下表19中列出了用于每种融合体的ECD序列。每种融合蛋白的LAG-3ECD部分以下划线标出。
表19：LAG-3ECD/Fc融合蛋白靶标的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000681
首先通过ELISA筛选杂交瘤克隆的上清液。简而言之，将1μg/ml人LAG-3ECD/Fc的NaHCO3溶液以50μl/孔直接包被在96孔板的每个孔中，过夜。用1XPBST，每孔300μl洗涤板3次。用含有1％BSA的PBST以每孔250μl封闭、在室温下孵育1小时后，以每孔50μl添加杂交瘤上清液，并在37℃下孵育1小时。洗涤后，添加100μl/孔的HRP连接的山羊抗小鼠IgGFc二抗(目录号：A0168,Sigma)，并将板在室温下孵育1小时。用100μl/孔的TMB试剂(InnoReagents)持续15分钟检测并生成ELISA信号，然后用1NHCl终止反应。用读板仪(
Figure BDA0002758486640000691
M5e,MolecularDevices,美国)在450nm的波长下读板。使用与以上实施例1.4类似的方法，通过FACS分析进一步验证ELISA阳性抗体生产克隆，除了使用表达人LAG-3或食蟹猴LAG-3的稳定的HEK293F细胞系之外。选择产生LAG-3结合活性的杂交瘤，并在受体阻断测定法(RBA)中进一步表征。
实施例7.3：受体阻断测定法(RBA)
测试了显示LAG-3特异性活性的上清液阻断LAG-3受体与II类MHC结合的能力。Raji人B细胞淋巴母细胞表达高水平的II类MCH，将其用作上述LAG-3ECD/Fc蛋白的结合靶标。简而言之，收获Raji细胞并将其重悬于FACS缓冲液中，然后铺板在96孔板中(2×105细胞/孔)。将抗LAG-3杂交瘤上清液与可溶性LAG-3ECD/Fc混合，将混合物以终体积为100μl/孔添加到孔中。将混合物加入细胞后，将板在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤两次后，将细胞与抗人
Figure BDA0002758486640000692
二抗在4℃下孵育1小时，用PBS洗涤两次，然后在流式细胞仪上测量荧光。
实施例7.4：抗LAG-3单克隆抗体的表达和纯化
在FreeStyleTM293表达培养基(Gibco/LifeTechnologies)中，在CO2摇床上于37℃下培养产生鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞5至7天。在纯化前通过在4000×g下离心30分钟收集条件培养基，去除所有细胞和细胞碎片，然后通过0.22μm膜过滤。根据制造商的指南施加鼠抗体并使其与MabSelectTMSuRe(GEHealthcare)蛋白A树脂柱结合，用PBS洗涤，用含20mM柠檬酸盐、150mMNaCl，pH3.5的缓冲液洗脱。立即用pH8.0的1MTris中和洗脱的物质，并用PBS透析。如通过SEC-HPLC所检测的，一步纯化的抗体通常具有90％以上的纯度。通过测量在280nm处的吸光度或通过NanoDropTM微量分光光度计(ThermoScientific)确定蛋白浓度。将纯化的抗体等分保存在-80℃的冰箱中。
实施例7.5：纯化的抗LAG-3抗体的结合活性
ELISA表征
以与以上实施例7.2中所述相同的方法进行结合ELISA。将每种纯化的抗体系列稀释10倍。封闭96孔测定板的含有固定的LAG-3ECD/Fc融合蛋白靶标的孔后，将稀释浓度的纯化抗体样品添加至测定板的孔中。使用HRP连接的抗小鼠IgG抗体(A0168，Sigma)和TMB试剂检测和产生ELISA信号，在
Figure BDA0002758486640000701
读板仪上在450nm的波长下读取。使用GraphPad软件拟合曲线，并计算EC50。类似地，也如实施例7.3中所述用滴定的纯化抗体进行RBA，并确定最高抑制百分比和IC50值。
通过FACS表征
使用与以上实施例1.4类似的方法进行FACS分析，除了使用表达人LAG-3或食蟹猴LAG-3的稳定的HEK293F细胞系之外。将表达LAG-3的细胞以每孔2×104个细胞装入96孔测定圆底测定板(目录号3799；Corning)，并用纯化的抗LAG-3抗体染色。用
Figure BDA0002758486640000702
驴抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗(目录号A21202；Invitrogen)检测LAG-3抗体，并使用流式细胞仪监测细胞荧光。通过GraphPad软件处理数据，并计算EC50值。
这些结合表征测定法的结果显示在下表20中。
表20：纯化的鼠抗LAG-3抗体的结合活性
Figure BDA0002758486640000703
Figure BDA0002758486640000711
在该表中，“N/A”表示未测量到结合活性。
实施例7.6：通过RBA的表征和抗原依赖性活化测定法
还以与实施例7.3中所述相同的方式在RBA中测试了纯化的抗LAG-3抗体。还在抗原特异性T细胞活化测定法中测试了抗体，如下所示：由ChemPartner(上海，中国)定制产生了表达huLAG-3的鼠T杂交瘤细胞系。来自相同小鼠株的小鼠脾细胞用作效应细胞。表达huLAG-3受体蛋白的杂交瘤能够与II类MHC阳性小鼠脾细胞结合，并通过II类的募集具有抑制作用。该测定法测试了抗LAG-3抗体介导的抑制作用的逆转，如通过增加IL-2的产生所测量的。从6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠中收获小鼠脾细胞，根据制造商的说明书使用红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich；R7757)裂解红细胞。接下来，将50μlT杂交瘤-huLAG-3细胞(2×106细胞/ml)接种到96孔培养板的每个孔中，然后以50μl/孔加入溶液中的一系列抗LAG-3单克隆抗体，并在37℃孵育30分钟。将小鼠脾细胞(4×106细胞/ml)和抗原(20μg/ml)混合，并在37℃下孵育30分钟。将混合物(100μl/孔)添加到已经接种了T杂交瘤-huLAG-3细胞和抗LAG-3mAb的每个孔中。将抗体、T杂交瘤-huLAG-3细胞、小鼠脾细胞和抗原的混合物培养3天。72小时后，吸出100μl细胞培养上清液，并稀释至合适的浓度，以按照制造商的规程使用R&DSystemsELISA试剂盒进行小鼠IL-2定量ELISA。使用ELISA-Endpoint-TMB和HRP规程在SpectraMaxM5读板仪(MolecularDevices)上读取ELISA板。RBA和抗原依赖性活化测定法的结果如表21所示。
表21：鼠抗LAG-3抗体的表征
Figure BDA0002758486640000721
实施例7.7：通过Biacore进行结合亲和力测定
对于在ELISA和FACS测定法中具有高结合亲和力以及有效功能活性的抗体，使用Biacore表面等离子体共振、基于在实时结合反应中测量的结合动力学常数来确定结合亲和力。简而言之，使用BiacoreT200系统通过抗体捕获方法进行抗体与抗原的结合测定法。根据制造商的说明书，将抗小鼠IgGFc抗体固定在CM5传感器芯片上。注射测试的抗LAG-3鼠单克隆抗体，并通过固定的抗小鼠IgGFc捕获。然后分别注入系列浓度的LAG-3抗原，并记录每种浓度的抗原分析物的结合曲线。测定温度为25℃，结合和解离时间分别为180秒和1200秒。使用BiacoreT200评估软件1.0、根据1：1结合模型拟合Biacore数据，以计算结合(kon)和解离(koff)速率常数，并从这些计算中确定平衡解离常数(KD)。四种所选抗LAG-3抗体的亲和力(KD)显示在下表22中。
表22：所选抗LAG-3抗体的结合亲和力
Figure BDA0002758486640000731
实施例7.8：PBMC测定法中抗LAG-3抗体功能的比较
为了进一步验证抗LAG-3抗体在人PBMC中的功能，使用超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)进行了细菌毒素刺激测定法。SEB是一种已知的超抗原，可通过刺激人T细胞来活化免疫系统，从而引起几种细胞因子的过度产生。从健康人供体的血液样品中分离PBMC。将PBMC以2×105细胞/孔接种到96孔测定板中，然后将各种抗LAG-3测试抗体加入板中，并与PBMC在37℃下孵育30分钟。加入SEB溶液，至终浓度为10ng/ml。然后将板孵育96小时。孵育结束后，收集100μl细胞培养上清液，并使用ELISAIL-2检测试剂盒(R&DSystems；目录号：DY202)测量IL-2产生。结果如图6所示。
实施例8：鼠抗LAG-3抗体可变区的测序
为了扩增重链和轻链可变区，使用RNA分离试剂(Invitrogen；目录号：15596)从>5×106细胞中分离所选择的杂交瘤克隆的总RNA。通过SuperScriptTMIII第一链合成SuperMix(Invitrogen；目录号：18080)合成cDNA，并用作小鼠Ig-引物组的PCR模板(Novagen；目录号69831-3)。通过在具有SYBRTMSafe DNA凝胶染料(Invitrogen)的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳来分析PCR产物。根据制造商的说明书，用
Figure BDA0002758486640000733
和PCRClean-up(Macherey-NagelGmbH；目录号740609)纯化大小正确的DNA片段，并分别亚克隆到pMD18-T克隆载体中。从每个转化中选择15个菌落，并通过DNA测序分析插入片段的序列。如果发现VH和VL至少有8个匹配共有序列，则确认序列。表23列出了通过序列同源性比对分析的7种鼠mAb的可变区序列。基于Kabat编号识别互补决定区(CDR)。
表23：7种鼠抗LAG-3抗体的VH/VL氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000741
Figure BDA0002758486640000751
实施例9：鼠抗LAG-3抗体mAb747的人源化
根据抗原结合活性、食蟹猴LAG-3蛋白的交叉反应性、功能活性和亲和力，选择mAb747进行人源化。
实施例9.1：mAb747的人源化
使用抗LAG-3mAb747可变区基因来创建人源化抗体。在此方法的第一步骤中，将mAb747的VH和VK的氨基酸序列(SEQIDNO:60和SEQIDNO:62)与可获得的人IgV基因序列的数据库进行比较，以找到总体上最匹配的人种系IgV基因序列。另外，将VH或VL的框架4序列与J区数据库进行比较，以分别找到与鼠VH和VL区具有最高同源性的人框架。对于轻链，最接近的人V基因匹配是A1基因；对于重链，最接近的人匹配是VH1-f基因。然后设计人源化的可变结构域序列，其中将mAb747轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到A1基因的框架序列上，其中CDR-L3之后是JK4框架4序列；并且将mAb747重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3移植到VH1-f的框架序列上，其中CDR-H3之后是JH1框架4序列。然后生成mAb747的3维Fv模型，以确定是否存在任何其中小鼠的氨基酸对于支持环结构或VH/VL界面是至关重要的框架位置。应该将人源化序列中相同位置的这些残基回复突变为小鼠残基，以保留亲和力/活性。表明了mAb747VH和VL的几个期望的回复突变，并构建了三种替代的VH和VL设计，如下表24所示。(回复突变的框架氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000762
表示；来自原始亲本抗体的鼠CDR用下划线表示。)
表24：mAb747的人源化VH/VL设计–回复突变为鼠残基
Figure BDA0002758486640000761
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其分别克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中。人VH和人VK的配对产生了9种人源化的抗LAG-3抗体，称为HumAb747-34至-42(表25)。为了比较亲和力，还产生了作为阳性对照的嵌合抗体(mAb747c)，其具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列。
表25：人源化mAb747抗LAG-3抗体的生产清单
抗体标识 重链中的VH区 轻链κ中的VL区
HumAb747-34 mAb747 VH.1G mAb747 VK.1E
HumAb747-35 mAb747 VH.1G mAb747 VK.2A
HumAb747-36 mAb747 VH.1G mAb747 VK.2B
HumAb747-37 mAb747 VH.2A mAb747 VK.1E
HumAb747-38 mAb747 VH.2A mAb747 VK.2A
HumAb747-39 mAb747 VH.2A mAb747 VK.2B
HumAb747-40 mAb747 VH.2B mAb747 VK.1E
HumAb747-41 mAb747 VH.2B mAb747 VK.2A
HumAb747-42 mAb747 VH.2B mAb747 VK.2B
根据解离速率常数(koff)对所有9种人源化抗体(表25)和具有亲本鼠VH和VL结构域的嵌合抗体(mAb747c)进行排序。简而言之，通过
Figure BDA0002758486640000771
RED96生物层干涉法(PallFortéBioLLC)对抗体的亲和力和结合动力学进行了表征。通过抗HIgGFc捕获(AHC)生物传感器(Pall)捕获100nM浓度的抗体30秒。然后将传感器浸入运行缓冲液(1XpH7.2PBS，0.05％Tween20，0.1％BSA)中60秒，以检查基线。通过将传感器浸入单一浓度的重组人LAG-3-his蛋白(Novoprotein)中来测量结合。解离后，将传感器浸入运行缓冲液中1200秒。使用FortéBio数据分析软件(Pall)将结合和解离曲线拟合到1：1Langmuir结合模型。结果如表26所示。
表26：人源化抗LAG-3抗体的解离速率排序
抗体 解离速率(k<sub>off</sub>)(1/s)
mAb747c 3.77×10<sup>-4</sup>
HumAb747-42 8.30×10<sup>-4</sup>
HumAb747-39 1.14×10<sup>-3</sup>
HumAb747-42的解离速率常数仅是具有亲本可变结构域的嵌合对照的2.2倍。
实施例10：PD-1/LAG-3Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)的产生
构建了识别人PD-1和人LAG-3的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白结合蛋白。
对于下表中描述的每个FIT-Ig构建体，显示了三组分多肽链中每一个的表达载体中所使用的信号序列。在生产下述的FIT-Ig蛋白中使用MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQIDNO:79)或MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQIDNO:84)，尽管许多可选择的信号肽是本领域技术人员已知的，并且也可能被使用了。应当理解，在表达宿主细胞分泌多肽的过程中，此类信号序列被切割，因此这些信号序列不是最终的FIT-Ig结合蛋白的一部分。
实施例10.1：FIT107-1-2a
利用来自亲本抗体mAb709(鼠抗PD-1，参见上文表4)和mAb746(鼠抗LAG-3，参见上文表23)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-2a。FIT-IgFIT107-1-2a是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：mAb709的VL-CL，其直接融合至mAb746的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：mAb709的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域结构式：mAb746的轻链(VL-CL)。
三个表达的FIT107-1-2a多肽链的氨基酸序列显示在下表27中。
表27：FIT107-1-2a组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000781
Figure BDA0002758486640000791
Figure BDA0002758486640000801
实施例10.2：FIT107-1-2b
构建了另一种识别人PD-1和人LAG-3的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白。将该PD-1/LAG-3FIT-Ig命名为FIT107-1-2b。FIT107-1-2b结合蛋白的构建利用了来自亲本鼠抗体mAb709和mAb746的免疫球蛋白结构域的编码序列，但在该FIT-Ig构建体中，LAG-3结合结构域位于N末端(外部)位置，PD-1结合结构域位于内部位置，C-末端与LAG-3结合区的VL-CL结构域融合。FIT-IgFIT107-1-2b是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：mAb746的VL-CL，其直接融合至mAb746的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：mAb746的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：mAb709的轻链(VL-CL)。
下表28中显示了三个表达的FIT107-1-2b多肽链的氨基酸序列：
表28：FIT107-1-2b组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000811
Figure BDA0002758486640000821
Figure BDA0002758486640000831
实施例10.3：FIT107-1-5a
利用来自亲本人源化抗体HumAb709-8(抗PD-1,SEQIDNO:21和SEQIDNO:25)和HumAb747-42(SEQIDNO:73和SEQIDNO:77)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，称为FIT107-1-5a。FIT-IgFIT107-1-5a是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb709-8的VL-CL，其直接融合至HumAb747-42的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：HumAb709-8的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747-42的轻链(VL-CL)。
下表29中显示了三个表达的FIT107-1-5a多肽链的氨基酸序列：
表29：FIT107-1-5a组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000841
Figure BDA0002758486640000851
Figure BDA0002758486640000861
实施例10.4：FIT107-1-5b
构建了另一种识别人PD-1和人LAG-3的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白。将该PD-1/LAG-3FIT-Ig命名为FIT107-1-5b。FIT107-1-5b结合蛋白的构建利用了来自亲本人源化抗体HumAb709-8和HumAb747-42的免疫球蛋白结构域的编码序列，但在该FIT-Ig构建体中，LAG-3结合结构域位于N末端(外部)位置，PD-1结合结构域位于内部位置，C-末端与N末端LAG-3结合区的VL-CL结构域融合。FIT-Ig FIT107-1-5b是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747-42的VL-CL，其直接融合至HumAb709-8的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：mAb747-42的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb709-8的轻链(VL-CL)。
下表30中显示了三个表达的FIT107-1-5b多肽链的氨基酸序列：
表30：FIT107-1-5b组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000871
Figure BDA0002758486640000881
Figure BDA0002758486640000891
实施例10.5：FIT-Ig的表达和纯化
四个PD-1/LAG-3FIT-Ig构建体FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a和FIT107-1-5b是一类双特异性多价结合蛋白，称为Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(或FIT-Ig)，在WO2015/103072和WO2017/136820中一般性描述了。通过在用全部三个链的表达载体转染的哺乳动物宿主细胞中共表达三个组分多肽链来产生结合蛋白。结合蛋白的设计要求长多肽链(链#1)与短多肽链(链#2和链#3)配对以形成功能性串联Fab部分，并且长链还被设计为通过Fc区(铰链-CH2-CH3)二聚化，从而形成呈现四个完整Fab结合位点的六链结合蛋白。在结合蛋白FIT107-1-2a和FIT107-1-5a中，N末端或“外部”Fab结合位点结合PD-1，而相邻的“内部”Fab结合位点结合LAG-3。FIT107-1-2a和FIT107-1-5a的外部Fab片段(抗PD-1)仅通过长链(链#1)、通过直接的VL-CLmAb709或VL-CLHumAb709-8融合与内部Fab片段(抗LAG-3)连接，视情况而定，在其C末端分别与VH-CH1mAb746或VH-CH1HumAb747-42的N末端连接，而无需使用连接免疫球蛋白结构域的接头。类似地，FIT107-1-2b和FIT107-1-5b的外部Fab片段(抗LAG-3)仅通过长链(链#1)、通过直接的VL-CLmAb746或VL-CLmAb747-42融合与内部Fab片段(抗PD-1)连接，视情况而定，在其C末端分别与VH-CH1mAb709或VH-CH1mAb709-8的N末端连接，而无需使用连接免疫球蛋白结构域的接头。
使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂，在人胚胎肾293E细胞中瞬时共表达编码每个FIT-Ig(FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a和FIT107-1-5b)的多肽链#1、#2和#3的表达载体。简而言之，将FreeStyleTM293表达培养基中的DNA与PEI混合，其中DNA与PEI的终浓度比为1：2，在室温下孵育15-20分钟，然后以60μgDNA/120ml培养液添加到HEK293E细胞中(1.0–1.2×106/ml,细胞活力>95％)。在摇床中培养6-24小时后，将蛋白胨添加至转染的细胞中，终浓度为5％，在37℃下、在8％CO2下，以125rpm/min振动。在第6-7天，通过离心和过滤收集上清液，并根据制造商的说明书使用蛋白A色谱法(Pierce，Rockford，IL)纯化FIT-Ig蛋白。
对于FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a和FIT107-1-5b的表达，转染用于表达链#1、#2和#3的编码DNA，链#1:链#2:链#3的摩尔比为1:3:3。这样设计的目的是相对于长链(链#1)，成比例地表达更多的短链#2和#3，这反过来将降低长链(链#1)上未与相应的轻链配对、从而将导致无法形成功能性Fab片段的VL-CL和VH-CH1片段的出现。FIT-Ig蛋白表达产物通过蛋白A色谱法纯化。通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析纯化的FIT-Ig的组成和纯度。将PBS中包含的纯化的FIT-Ig施加到TSKgel SuperSW3000，300×4.6mm色谱柱(TOSOH)上。HPLC仪器，U3000型(DIONEX)用于SEC，在280nm和214nm处使用UV检测。参见下表31。
表31：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白的表达和SEC分析
Figure BDA0002758486640000901
FIT107-1-2b、-5a和-5b的较低的单体级分含量表示某些可能的聚集。
实施例11：FIT-Ig对靶抗原的结合亲和力
通过BiacoreSPR测量确定FIT-Ig与PD-1和LAG-3靶标结合的动力学。FIT107-1-2a和FIT107-1-2b对靶抗原PDL-1和LAG-3的结合亲和力显示在下表32中。
表32：FIT107-1-2a和FIT107-1-2b的结合亲和力
Figure BDA0002758486640000911
实施例12：FIT-Ig特异性和功能测定
在PBMC活化测定法中测试了FIT107-1-2a结合蛋白的抗PD1和抗LAG-3双特异性和生物学活性，使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为超抗原(参见实施例7.8)。简而言之，从健康的供体中分离PBMC，然后以2×105细胞/孔、50μl/孔接种到96孔板中。将测试结合蛋白(即，FIT107-1-2a、市售可获得的抗PD-1和抗LAG-3单克隆抗体的组合或单克隆抗PD-1抗体)加入板中，并与PBMC一起在37℃下孵育30分钟。加入SEB溶液至终浓度为10ng/ml。孵育板96小时，然后收集100μl细胞培养上清液，并使用ELISA IL-2检测试剂盒(R&DSystems；目录号：DY202)测量IL-2产生。结果如图7所示。与单独的抗PD-1抗体或抗LAG-3和抗PD-1抗体的混合物相比，FIL107-1-2a双特异性FIT-Ig蛋白能够增强T细胞活化，如IL-2产生所示。
另外，以与实施例3中所述类似的方法进行了混合淋巴细胞反应(MLR)测定法，以进一步验证FIT107-1-2a的抗PD-1和抗LAG-3功能。混合淋巴细胞反应是离体细胞免疫反应，其发生在两种同种异体淋巴细胞群混合在一起时。同种异体淋巴细胞响应于两个细胞群之间的主要组织相容性抗原(I类和II类MHC)的差异，经历了母细胞转化、DNA合成和细胞增殖，这两个细胞群被称为反应细胞和刺激细胞。在用于测试FIT107-1-2a的MLR中，在第1天，从健康供体中纯化PBMC，并分离CD14+单核细胞。将单核细胞接种到6孔板中，并用含有35ng/ml IL-4(R&DSystems)和50ng/ml GM-CSF(R&DSystems)的添加了10％FBS的RPMI1640培养基处理单核细胞。第4天后更换培养基。在第7天，收集分化为未成熟树突细胞的单核细胞，并在含有20ng/ml TNF-α(R&DSystems)、50μg/ml PolyI:C(Sigma)、35ng/ml IL-4和50ng/ml GM-CSF的成熟培养基中进一步处理两天。对于MLR共培养测定法，使用X-VIVOTM15无血清培养基，以避免血清干扰抗体功效。在96孔U型底板上以1×105细胞/孔接种同种异体CD4+T细胞(反应细胞)，并用测试的结合蛋白(即FIT107-1-2a、商售可获得的抗PD-1和抗LAG-3单克隆抗体的组合、或单克隆抗PD-1抗体)预处理30分钟。然后将成熟的树突细胞(刺激细胞)以1×104细胞/孔接种到孔中，并与反应细胞共培养5天，此时收集100μl上清液并通过ELISA测量IFN-γ的产生。结果如图8所示。FIT-Ig双特异性结合蛋白的EC50值为0.5084nM，与之相比，抗PD-1和抗LAG-3抗体的组合或单独的抗PD-1抗体的EC50值为16.84nM。因此，在MLR中，FIT-Ig结合蛋白增强了IFN-γ(γ干扰素)的产生，比单一抗体或抗体组合的浓度低30倍。
实施例13：mAb747的新批次人源化
使用抗LAG-3mAb747可变区基因来进一步创建抗LAG-3人源化mAb。在此方法的第一步骤中，将mAb747的VH和VK的氨基酸序列(SEQIDNO:60和SEQIDNO:62)与可获得的人IgV基因序列的数据库进行比较，以找到最匹配的人种系IgV基因序列。另外，将VH或VL的框架4(FW4)序列与J区数据库进行比较，以分别找到与鼠VH和VL区具有最高同源性的人框架。对于轻链，最佳人V基因匹配是A30基因；对于重链，最佳人匹配是VH1-69-2基因。然后设计人源化的可变结构域序列，其中将mAb747轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到A30基因的框架序列上，其中CDR-L3之后是JK4框架4序列；并且将mAb747重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列移植到VH1-69-2的框架序列上，其中CDR-H3之后是JH6框架4序列。然后生成mAb747的3维Fv模型，以确定是否存在任何其中小鼠的氨基酸对于支持环结构或VH/VL界面是至关重要的框架位置。应该将人源化序列中相同位置的这些残基回复突变为小鼠残基，以保留亲和力/活性。表明了mAb747VH和VL的几个期望的回复突变，并构建了三种替代的VH和VL设计，如下表33所示。(回复突变的框架氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000932
CDR用下划线标出，其 根据Kabat编号系统，但VH CDR1用ABM编号系统定义)。
表33：mAb747的人源化VH/VL设计–回复突变为鼠残基
Figure BDA0002758486640000931
Figure BDA0002758486640000941
人源化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其分别克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中。人VH和人VK的配对产生了9种人源化的抗LAG-3抗体，称为HumAb747-43至HumAb747-60(表34)。为了比较亲和力，还将具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列的嵌合抗体(mAb747c)用作阳性对照。
表34：人源化mAb747抗LAG-3抗体的生产清单
Figure BDA0002758486640000942
Figure BDA0002758486640000951
根据解离速率常数(koff)对所有18种人源化抗体(表34)和具有亲本鼠VH和VL结构域的嵌合抗体(mAb747c)进行排序。简而言之，通过
Figure BDA0002758486640000952
RED96生物层干涉法(PallFortéBioLLC)对抗体的亲和力和结合动力学进行表征。通过抗hIgGFc捕获(AHC)生物传感器(Pall)捕获100nM浓度的抗体30秒。然后将传感器浸入运行缓冲液(1X pH7.2 PBS，0.05％Tween 20，0.1％BSA)中60秒，以检查基线。通过将传感器浸入单一浓度的重组人LAG-3-his蛋白(Novoprotein)中来测量结合。解离后，将传感器浸入运行缓冲液中1200秒。使用FortéBio数据分析软件(Pall)将结合和解离曲线拟合到1:1Langmuir结合模型。结果如表35所示。在每个测试组中，可以将抗体的解离速率与mAb747c的解离速率进行比较。计算抗体的解离速率与其组中mAb747c的解离速率的比率，并比较其全部。比率越低，抗体的亲和力越高。
表35：人源化抗LAG-3抗体的解离速率排序
Figure BDA0002758486640000953
Figure BDA0002758486640000961
HumAb747-60的解离速率常数仅是具有亲本可变结构域的嵌合对照的1.5倍。
为了进一步验证抗LAG-3抗体在人PBMC中的功能，以与以上实施例7.8所述的方法，使用超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)进行了细菌毒素刺激测定法。使用PerkinElmer IL-2检测试剂盒(PerkinElmer；目录号：TRF1221M)测量IL-2的产生。HumAb747-60能够通过阻断LAG-3信号通路来增强SEB刺激的PBMC的IL-2分泌。结果如图9所示。因此证明HumAb747-60具有功能，选择其用于进一步的工程化。
实施例14：HumAb747-60的亲和力成熟
实施例14.1：亲和力成熟文库的构建和筛选
尽管HumAb747-60的解离速率常数仅为嵌合对照mAb747c的1.5倍，但PBMC-SEB测定结果表明HumAb747-60具有稍弱的功能活性。为了进一步改善亲和力，通过基于HumAb747-39的亲和力成熟来优化CDR残基(在ABM编号系统中)(参见表24、25)。设计并构建了两个噬菌体文库。一个设计为突变CDR-L1、CDR-L3和CDR-H3(ABM编号)，其中的每一个CDR均具有一个随机突变的残基。另一个设计为突变CDR-L2、CDR-H1和CDR-H2(ABM编号)，其中的每一个CDR均具有一个随机突变的残基。
使用JournalofImmunologicalMethods,201:35–55(1997)中报道的方法构建噬菌体展示文库。简而言之，用引入突变的简并引物扩增VH-CH1和VL-CL，然后依次克隆到噬菌粒载体的两个多克隆位点(MCS)中。然后将噬菌粒载体电转化至TG1(目录号60502-1,Lucigen),分别产生约1.2×108个克隆的文库，显示出高的序列多样性。用M13K07辅助噬菌体(目录号：N0315S)以约1:20的比率(细胞比噬菌体)救援文库。用重组人LAG-3蛋白进行噬菌体展示文库选择，然后进行洗涤步骤。还在噬菌粒载体中构建了HumAb747-39的Fab片段，作为阳性对照。所选噬菌体用于感染宿主细胞。通过ELISA筛选来自单个克隆的Fab上清液的结合能力。简而言之，通过在30℃下与1mM IPTG过夜培养来制备单个克隆的Fab上清液。将含有2μg/ml人LAG-3蛋白的100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)直接包被在96孔板的每个孔中。使用HRP连接的抗c-myc抗体(目录号：Ab1261,Abcam)和TMB试剂检测和产生ELISA信号，通过读板仪(
Figure BDA0002758486640000971
384吸光度读板仪，Molecular Devices)在450nm波长处读取ELISA信号。
挑选筛选ELISA中的阳性克隆进行测序。考虑到筛选ELISA中的序列冗余和信号强度，选择以下7个克隆用于进一步的评估。VH/VL序列显示在下表36中：(通过亲和力成熟鉴定的突变氨基酸残基用
Figure BDA0002758486640000972
表示；根据Kabat编号系统的CDR用下划线表示。)
表36：具有亲和力成熟突变的7种抗体的VH/VL氨基酸序列
Figure BDA0002758486640000981
Figure BDA0002758486640000991
实施例14.2：IgG转化和阳性克隆的表征
将七个Fab克隆转化为完整的IgG蛋白。简而言之，合成产生VH和VL基因，然后将其分别克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的编码序列的载体中。将重链和同源轻链质粒单独共转染到HEK293E细胞中。转染后细胞培养大约六天后，收获上清液，并进行蛋白A亲和色谱法。通过
Figure BDA0002758486640000993
生物层干涉法对纯化的抗体亲和力进行排序(参见上文实施例9.1)。结果如表37所示。
表37：亲和力成熟后抗LAG-3抗体的解离速率排序
Figure BDA0002758486640000992
与HumAb747-39相比，D1-70-IgG和B2-53-IgG显示解离速率常数具有小幅增加，反映出突变后最大的亲和力增加。因此，将D1-70-IgG和B2-53-IgG中的突变引入人源化后最佳候选HumAb747-60的序列中。
实施例14.3：进一步工程化的抗体的产生和表征
通过亲和力成熟方法鉴定的D1-70中的突变为VH结构域中的D26G、E53R和E58M，以及VL结构域中的S56L(残基位置由Kabat编号系统确定)。通过亲和力成熟方法鉴定的B2-53中的突变为VH结构域中的D26G和E58V，以及VL结构域中的T53A(残基位置由Kabat编号系统确定)。将这些突变单独或组合地掺入HumAb747-60的VH/VL序列中。
HumAb747-60的CDR-H2中存在NG模式，由于脱氨基反应，其可能在生产过程中导致异质性，因此也评估了从NG到NA的突变。计算出VH结构域中的G55A突变不会破坏HumAb747-60的活性，而破坏了NG模式。表38中显示了包含以上讨论的突变的抗体变体的氨基酸序列。(根据Kabat编号的CDR以下划线表示。)
表38：HumAb747-60的工程化的VH/VL设计
Figure BDA0002758486640001001
Figure BDA0002758486640001011
工程化的VH和VK基因是合成产生的，然后将其分别克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的载体中。人VH和人VK的配对产生了13种工程化的抗LAG-3抗体，称为HumAb747V-61至HumAb747V-73(表39)。为了比较亲和力，将具有亲本小鼠VH/VL和人恒定区序列的嵌合抗体(mAb747c)用作阳性对照。
表39：工程化的抗LAG-3抗体的生产清单
抗体标识 重链中的VH区 轻链κ中的VL区
HumAb747V-61 huEpi001-VHv6(G55A) huEpi001 VLv3
HumAb747V-62 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3.4
HumAb747V-63 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3.5
HumAb747V-64 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3.6
HumAb747V-65 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3
HumAb747V-66 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3.4
HumAb747V-67 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3.5
HumAb747V-68 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3.6
HumAb747V-69 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3
HumAb747V-70 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3.4
HumAb747V-71 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3.5
HumAb747V-72 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3.6
HumAb747V-73 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3
以如以上实施例9.1所述相同的方法，根据解离速率常数(koff)将所有13种人源化抗体(表39)和具有亲本鼠VH和VL结构域的嵌合抗LAG-3抗体mAb747c排序。结果如表40所示。在每个测试组中，可以将抗体的解离速率与mAb747c的解离速率进行比较。计算抗体的解离速率与其组中mAb747c的解离速率的比率，并比较其全部。比率越低，抗体的亲和力越高。
表40：进一步工程化的抗LAG-3抗体的解离速率排序
Figure BDA0002758486640001021
基于HumAb747-60，亲和力成熟后的具有CDR突变的大多数抗体与mAb747c相比，表现出改善的解离速率，预示着改善的亲和力。HumAb747V-61与mAb747c具有相似的解离速率，这表明VHG55A氨基酸取代不会干扰亲和力。在基于细胞的功能测定法中进一步评估了其测试组中解离速率比率低于mAb747c的60％的抗体。
使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为超抗原，在PBMC活化测定法中测试了抗LAG-3活性。简而言之，将PBMC以2×105细胞/孔接种到96孔板中。将测试蛋白(即，抗LAG-3单克隆抗体)加入板中，并与PBMC一起在37℃下孵育30分钟。加入SEB溶液至终浓度为10ng/ml。孵育板96小时，然后收集100μl细胞培养上清液，并使用PerkinElmerIL-2检测试剂盒(PerkinElmer；目录号：TRF1221M)测量IL-2产生。结果如图10所示。结果表明，工程化的抗体变体可以通过阻断LAG-3介导的信号传导来增强SEB刺激的PBMC的IL-2产生。
根据PBMC-SEB测定结果，HumAb747V-67、HumAb747V-72和HumAb747V-73表现出优异的LAG-3阻断活性；因此，这三种抗体用于产生靶向LAG-3以及PD-1的FIT-Ig结合蛋白。
实施例15：使用新的抗LAG-3抗体序列生成PD-1/LAG-3FIT-Ig
如上所述产生的抗LAG-3抗体HumAb747V-67、HumAb747V-72和HumAb747V-73，和两种抗PD-1抗体，HumAb709-8(参照表5和表7，同上)和HumAb713-7(参见表9和表10，同上)，被用于根据上文实施例10中所述的步骤产生FIT-Ig结合蛋白。G55A突变包含在抗LAG-3Fab部分的所有VH结构域的序列设计中。
实施例15.1：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-6a-1的产生
利用来自亲本抗体mAb709-8(人源化抗PD-1，参见上文表5和表6)和HumAb747V-67(人源化抗LAG-3，参见上文表38和表39)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-6a-1。FIT-IgFIT107-1-6a-1是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb709-8的VL-CL，其直接融合至HumAb747-67的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：HumAb709-8的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747V-676的轻链(VL-CL)。
下表41中显示了三个表达的FIT107-1-6a-1多肽链的氨基酸序列：
表41：FIT107-1-6a-1组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001031
Figure BDA0002758486640001041
Figure BDA0002758486640001051
实施例15.2：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-6b-1的产生
构建了另一种识别人PD-1和人LAG-3的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白。该PD-1/LAG-3FIT-Ig命名为FIT107-1-6b-1。利用来自亲本抗体HumAb747V-67(抗LAG-3)和HumAb709-8(抗PD-1)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了FIT107-1-6b-1结合蛋白。该FIT-Ig构建体在N末端(外部)位置呈现LAG-3结合结构域，在内部位置呈现PD-1结合结构域，所述PD-1结合结构域的C末端与LAG-3结合区的VL-CL结构域融合。FIT-IgFIT107-1-6b-1是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747V-67的VL-CL，其直接融合至HumAb709-8的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：HumAb747V-67的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb709-8的轻链(VL-CL)。
以下表42中显示了三个表达的FIT107-1-6b-1多肽链的氨基酸序列：
表42：FIT107-1-6b-1组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001061
Figure BDA0002758486640001071
实施例15.3：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-6a-2的产生
利用来自亲本抗体HumAb709-8(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-72(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-6a-2。FIT-IgFIT107-1-6a-2是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb709-8的VL-CL，其直接融合至HumAb747-72的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：HumAb709-8的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747V-72的轻链(VL-CL)。
下表43中显示了三个表达的FIT107-1-6a-2多肽链的氨基酸序列：
表43：FIT107-1-6a-2组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001081
Figure BDA0002758486640001091
实施例15.4：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-6b-2的产生
利用来自亲本抗体HumAb709-8(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-72(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-6b-2。FIT-IgFIT107-1-6b-2是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747V-72的VL-CL，其直接融合至HumAb709-8的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb747V-72的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb709-8的轻链(VL-CL)。
以下表44中显示了三个表达的FIT107-1-6b-2多肽链的氨基酸序列：
表44：FIT107-1-6b-2组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001101
Figure BDA0002758486640001111
Figure BDA0002758486640001121
实施例15.5：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-6a-3的产生
利用来自亲本抗体HumAb709-8(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-73(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-6a-3。FIT-IgFIT107-1-6a-3是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb709-8的VL-CL，其直接融合至HumAb709-73的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb709-8的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747V-73的轻链(VL-CL)。
下表45中显示了三个表达的FIT107-1-6a-3多肽链的氨基酸序列：
表45：FIT107-1-6a-3组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001122
Figure BDA0002758486640001131
Figure BDA0002758486640001141
实施例15.6：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-6b-3的产生
利用来自亲本抗体HumAb709-8(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-73(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-6b-3。FIT-IgFIT107-1-6b-3是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747V-73的VL-CL，其直接融合至HumAb709-8的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb747V-73的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb709-8的轻链(VL-CL)。
以下表46中显示了三个表达的FIT107-1-6b-3多肽链的氨基酸序列：
表46：FIT107-1-6b-3组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001142
Figure BDA0002758486640001151
Figure BDA0002758486640001161
实施例15.7：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-7a-1的产生
利用来自亲本抗体HumAb713-7(人源化的抗PD-1；参见以上表9和表10)和HumAb747V-67(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-7a-1。FIT-IgFIT107-1-7a-1是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb713-7的VL-CL，其直接融合至HumAb747V-67的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb713-7的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747V-67的轻链(VL-CL)。
下表47中显示了三个表达的FIT107-1-7a-1多肽链的氨基酸序列：
表47：FIT107-1-7a-1组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001162
Figure BDA0002758486640001171
Figure BDA0002758486640001181
实施例15.8：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-7b-1的产生
利用来自亲本抗体HumAb713-7(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-67(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-7b-1。FIT-IgFIT107-1-7b-1是六聚体，由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747V-67的VL-CL，其直接融合至HumAb713-7的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb747V-67的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb713-7的轻链(VL-CL)。
以下表48中显示了三个表达的FIT107-1-7b-1多肽链的氨基酸序列：
表48：FIT107-1-7b-1组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001191
Figure BDA0002758486640001201
实施例15.9：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-7a-2的产生
利用来自亲本抗体HumAb713-7(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-72(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-7a-2。FIT-IgFIT107-1-7a-2是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb713-7的VL-CL，其直接融合至HumAb747-72的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3(参见上文表6)；
多肽链#2具有结构域式：HumAb713-7的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747V-72的轻链(VL-CL)。
下表49中显示了三个表达的FIT107-1-7a-2多肽链的氨基酸序列：
表49：FIT107-1-7a-2组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001211
Figure BDA0002758486640001221
实施例15.10：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-7b-2的产生
利用来自亲本抗体HumAb713-7(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-72(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-7b-2。FIT-IgFIT107-1-7b-2是六聚体，由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747V-72的VL-CL，其直接融合至HumAb713-7的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb747V-72的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb713-7的轻链(VL-CL)。
以下表50中显示了三个表达的FIT107-1-7b-2多肽链的氨基酸序列：
表50：FIT107-1-7b-2组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001231
Figure BDA0002758486640001241
Figure BDA0002758486640001251
实施例15.11：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-7a-3的产生
利用来自亲本抗体HumAb713-7(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-73(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-7a-3。FIT-IgFIT107-1-7a-3是六聚体，其由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb713-7的VL-CL，其直接融合至HumAb747V-73的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb713-7的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb747V-73的轻链(VL-CL)。
下表51中显示了三个表达的FIT107-1-7a-3多肽链的氨基酸序列：
表51：FIT107-1-7a-3组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001252
Figure BDA0002758486640001261
Figure BDA0002758486640001271
实施例15.12：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白FIT107-1-7b-3的产生
利用来自亲本抗体HumAb713-7(人源化的抗PD-1)和HumAb747V-73(人源化的抗LAG-3)的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了PD-1/LAG-3FIT-Ig，命名为FIT107-1-7b-3。FIT-IgFIT107-1-7b-3是六聚体，由三组分多肽链组成：
多肽链#1具有结构域式：HumAb747V-73的VL-CL，其直接融合至HumAb713-7的VH-CH1，其直接融合至突变的人恒定IgG1的铰链-CH2-CH3；
多肽链#2具有结构域式：HumAb747V-73的VH-CH1；和
多肽链#3具有结构域式：HumAb713-7的轻链(VL-CL)。
以下表52中显示了三个表达的FIT107-1-7b-3多肽链的氨基酸序列：
表52：FIT107-1-7b-3组分链的氨基酸序列
Figure BDA0002758486640001272
Figure BDA0002758486640001281
Figure BDA0002758486640001291
实施例16：新的FIT-Ig蛋白的表征
实施例16.1：表达和SEC分析
以与上文实施例10.5中所述相同的方法表达上述12种FIT-Ig结合蛋白(表41-52)，并通过蛋白A色谱法纯化。通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析纯化的FIT-Ig的组成和纯度。将包含纯化的FIT-Ig的PBS施加到TSKgel SuperSW3000，300×4.6mm柱(TOSOH)上。使用DIONEXTMUltiMate3000HPLC仪器(ThermoScientific)进行SEC，在280nm和214nm处使用UV检测。参见下表53。
表53：PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白的表达和SEC分析
Figure BDA0002758486640001292
Figure BDA0002758486640001301
在进一步的表征中排除了具有较低单体级分含量(<80％)的FIT-Ig蛋白。
实施例16.2：功能测定法
如实施例12中所述，使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为超抗原，在PBMC活化测定法中测试了PD-1/LAG-3FIT-Ig活性。结果如图11所示。结果表明，所有测试的FIT-Ig变体均可增强SEB刺激的PBMC分泌IL-2。在最高剂量的FIT107-1-7b-2和FIT107-1-7b-3中，增强作用被原因不明地逆转，因此，这两个FIT-Ig蛋白没有优先作为主导分子。
实施例16.3：结合活性
通过使用
Figure BDA0002758486640001303
系统(PallFortéBioLLC)的生物层干涉法测定FIT-Ig与PD-1和LAG-3靶标结合的动力学。对靶抗原PDL-1和LAG-3的结合亲和力显示在下表54中。所有FIT-Ig蛋白均保留了对huPD-1和huLAG-3的亲和力。针对食蟹猴抗原测试的所有FIT-Ig蛋白也显示出与食蟹猴抗原的交叉反应性。
表54：对PD-1/LAG-3FIT-Ig结合蛋白的结合亲和力
Figure BDA0002758486640001302
Figure BDA0002758486640001311
实施例16.4：大鼠药代动力学数据
根据一步骤纯化后的纯度、瞬时转染中的表达滴度、保留的结合亲和力以及PBMC-SEB测定法中的功能活性，选择FIT107-1-7b-1作为主导分子。在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中评估了FIT107-1-7b-1的药代动力学特性。以5mg/kg的单次静脉内剂量向雄性SD大鼠施用FIT-Ig蛋白。在28天的期间内，在不同时间点收集血清样品，其中在第0、5、15和30分钟；在第1、2、4、8和24小时；和在第2、4、7、10、14、21和28天通过尾静脉连续采血取样，并通过常规ELISA进行分析。简而言之，用125ng/孔的山羊抗人IgGFc抗体(Rockland,目录号：609-101-017)在4℃下过夜包被ELISA板，用1XPBS/1％BSA/0.05％Tween-20/0.05％ProClinTM300封闭。首先将所有血清样品在封闭缓冲液中稀释20倍。在5％合并的大鼠血清中进行另外的稀释，并在板上于37℃孵育60分钟。用缀合过氧化物酶的山羊Fab特异的抗人IgG抗体(Sigma-Aldrich；目录号A0293)进行检测，借助于使用四参数逻辑拟合的标准曲线确定浓度。使用WinNonlin软件(PharsightCorporation,MountainView,Calif.)通过非房室模型确定药代动力学参数的值。如表55所示的这些结果所证明的，FIT107-1-7b-1在体内的性质是稳定。
表55：FIT107-1-7b-1的药代动力学特性
PK参数 CL Vss Beta t<sub>1/2</sub> AUC MRT
抗体 mL/天/kg mL/kg 天 day*μg/mL 天
FIT107-1-7b-1 9.17 114 8.82 436 12.4
实施例16.5：FGL1受体阻断测定法(RBA)
最近报道了纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)是不依赖于II类MHC的主要LAG-3功能性配体(WangJ.等人,Cell,176(1):334-47(2019))。通过抗体阻断FGL1/LAG-3的相互作用，可刺激肿瘤免疫。为了评估抗LAG-3抗体或FIT-Ig的阻断活性，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水将FGL1(WuhanUSCN,目录号：RPD022Hu01)稀释至5μg/ml，然后将100μl加入到96孔板中，并在4℃下过夜孵育。用300μl/孔的PBS+TWEEN20(PBST)将板洗涤3次。加入HumAb747V-67、FIT107-1-7b-1、hIgG(工作浓度：100nM、10nM、1nM和0.1nM)和1μg/ml生物素化的LAG-3(AcroBiosystem,目录号：H82E5)，并在室温下孵育2小时。用300μl/孔PBST洗涤板3次，然后使用ELISA-Endpoint-TMB/HRP规程、使用VARIOSKANTMLUX微读板仪(ThermoScientific)进行读取。结果如图12所示。结果表明FIT107-1-7b-1FIT-Ig及其亲本抗LAG-3抗体HumAb747V-67均阻断人LAG-3与FGL1蛋白的结合。
实施例16.6：FIT107-1-7b-1蛋白的原代细胞结合活性。
前述测定法证明PD-1/LAG-3FIT-Ig蛋白可以结合重组抗原蛋白。为了进一步评估FIT107-1-7b-1的细胞表面结合能力，用生物素试剂(Sigma,目录号：S3259)将亲本抗体HumAb713-7、HumAb747V-67和双特异性FIT-Ig FIT107-1-7b-1生物素化。对于无刺激的PBMC，将PBMC以5×106细胞/ml重新悬浮。对于PD-1抗体(HumAb713-7)或LAG-3抗体(HumAb747V-67)测试，添加100μg/ml抗体，并将反应混合物分别在37℃下孵育40分钟，然后用FACS缓冲液进行两次洗涤。然后将100μl、5×105PBMC/孔(未处理组、抗PD-1抗体处理组和抗LAG-3抗体处理组)接种到96孔板的孔中。加入生物素化的HumAb713-7、HumAb747V-67和FIT107-1-7b-1，并在37℃下孵育40分钟(最终工作浓度从100nM开始进行3倍系列稀释)，随后用FACS缓冲液洗涤两次。加入FITC-链霉亲和素和BV421-抗人CD3抗体，并将测定板在4℃下孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。用BeckmanCoulterCytoFlex流式细胞仪分析该板。用抗CD3加抗CD28抗体刺激PBMC刺激组72小时，以诱导T细胞上PD-1和LAG-3的表达。使用与未刺激PBMC实验相同的分组策略(未处理组、抗PD-1抗体处理组和抗LAG-3抗体处理组)，在刺激的PBMC上测试HumAb713-7、HumAb747V-67和FIT107-1-7b-1的结合。通过FACS研究了测试抗体对CD3-T细胞亚组的结合。结果如图13所示。结果显示FIT107-7b-1表现出独特的结合模式，表明与T细胞上的PD-1和LAG-3靶标二者结合。
在本申请全文中引用的所有参考(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容在此明确地全文引入作为参考。除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域熟知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
在不脱离上述本发明的基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。因此，前述实施方式应被认为是说明性的，而不是限制本文所述的发明。本发明的范围由所附权利要求书表明。

Claims (45)

1.一种能够结合人PD-1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的抗原结合部分包含一组六个CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其选自以下的CDR组：
Figure FDA0002758486630000011
Figure FDA0002758486630000021
2.一种抗PD-1抗体，其包含VH和VL结构域，其中两个可变结构域包含选自以下的氨基酸序列：
Figure FDA0002758486630000022
Figure FDA0002758486630000031
3.一种能够结合人LAG-3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的抗原结合部分包含一组六个CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其选自以下的CDR组：
Figure FDA0002758486630000041
Figure FDA0002758486630000051
Figure FDA0002758486630000061
4.一种抗PD-1抗体，其包含VH和VL结构域，其中两个可变结构域包含选自以下的氨基酸序列：
Figure FDA0002758486630000062
Figure FDA0002758486630000071
5.包含第一、第二和第三多肽链的双特异性多价结合蛋白，其中
所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接与VHB融合，或(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接与VLA融合；
所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHA-CH1；和
所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLB-CL；
其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区，A是PD-1或LAG-3的表位，B是PD-1或LAG-3的表位，前提是A和B不同，所述结合蛋白能够结合PD-1和LAG-3。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述VLA-CL和VHA-CH1结构域来自与抗原靶标PD-1或LAG-3之一结合的亲本抗体，并且所述VLB-CL和VHB-CH1结构域来自与抗原靶标PD-1或LAG-3的另一个结合的不同亲本抗体。
7.根据权利要求6所述的结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fc，其中CL直接融合至VHLAG-3，
其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHPD-1-CH1；和
其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLLAG-3-CL；
其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区。
8.根据权利要求7所述的结合蛋白，其中在第一多肽链中，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
9.根据权利要求6所述的结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fc，其中CL直接融合至VHPD-1，
其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CH1；和
其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区。
10.根据权利要求9所述的结合蛋白，其中在第一多肽链中，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
11.根据权利要求6所述的结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fc，其中CH1直接融合至VLPD-1，
其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CL；和
其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区。
12.根据权利要求11所述的结合蛋白，其中在第一多肽链中，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
13.根据权利要求6所述的结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，其中所述第一多肽链从氨基到羧基末端包含VHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fc，其中CH1直接融合至VLLAG-3，
其中所述第二多肽链从氨基到羧基末端包含VLPD-1-CL；和
其中所述第三多肽链从氨基到羧基末端包含VHLAG-3-CH1；其中VLPD-1是抗PD-1抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHPD-1是抗PD-1抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLLAG-3是抗LAG-3抗体的轻链可变结构域，VHLAG-3是抗LAG-3抗体的重链可变结构域，Fc是免疫球蛋白Fc区。
14.根据权利要求13所述的结合蛋白，其中在第一多肽链中，结构域VLLAG-3-CL与抗LAG-3亲本抗体的轻链相同，结构域VHLAG-3-CH1与抗LAG-3亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLPD-1-CL与抗PD-1亲本抗体的轻链相同，并且结构域VHPD-1-CH1与抗PD-1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或结合蛋白，其进一步包含Fc区，所述Fc区包含SEQIDNO：28。
16.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：78的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：83的氨基酸20-240的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：86的氨基酸23-236的氨基酸序列。
17.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：88的氨基酸23-684的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：91的氨基酸20-235的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：93的氨基酸23-236的氨基酸序列。
18.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：95的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：98的氨基酸20-242的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：100的氨基酸23-236的氨基酸序列。
19.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：102的氨基酸23-684的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：105的氨基酸20-235的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：107的氨基酸23-236的氨基酸序列。
20.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：140的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：144的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：146的氨基酸序列。
21.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：147的氨基酸23-684的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：151的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：153的氨基酸序列。
22.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：154的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：158的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：160的氨基酸序列。
23.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：161的氨基酸23-684的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：165的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：167的氨基酸序列。
24.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：168的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：172的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：174的氨基酸序列。
25.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：175的氨基酸23-684的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：179的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：181的氨基酸序列。
26.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：182的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：186的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：188的氨基酸序列。
27.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：189的氨基酸23-687的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：193的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：195的氨基酸序列。
28.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：196的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：200的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：202的氨基酸序列。
29.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：203的氨基酸23-687的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：207的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：209的氨基酸序列。
30.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：210的氨基酸23-679的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：214的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：216的氨基酸序列。
31.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO：217的氨基酸23-687的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQIDNO：221的氨基酸序列，并且所述第三多肽链包含SEQIDNO：223的氨基酸序列。
32.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
33.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求3所述的抗LAG-3抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
34.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗PD-1抗体或其抗原结合部分和根据权利要求3所述的抗LAG-3抗体或其抗原结合部分的组合,以及药学上可接受的载体。
35.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求5所述的双特异性结合蛋白和药学上可接受的载体。
36.根据权利要求5所述的双特异性结合蛋白在治疗疾病或病症中的用途,在所述疾病或病症中PD-1介导的活性和/或LAG-3介导的活性是有害的。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述疾病是癌症。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述癌症是黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或软骨肉瘤)。
39.一种制备用于治疗其中PD-1介导的活性和/或LAG-3介导的活性是有害的疾病或病症的药物的方法，所述方法包括配制至少一种根据权利要求5所述的双特异性结合蛋白与药学上可接受的载体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述疾病是癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和软骨肉瘤)。
42.一种治疗其中PD-1介导的和/或LAG-3介导的活性是有害的病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求32-35中任一项所述的药物组合物，或其组合。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病是癌症。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤或原发性骨癌(例如骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或软骨肉瘤)。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者是人。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022166987A1 (zh) * 2021-02-08 2022-08-11 迈威(上海)生物科技股份有限公司 结合lag-3的抗体及其用途
WO2022188801A1 (zh) * 2021-03-10 2022-09-15 北京拓界生物医药科技有限公司 Pd-1结合蛋白及其医药用途

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6706578B2 (ja) * 2013-12-30 2020-06-10 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド タンデム型Ｆａｂ免疫グロブリン及びその使用
AU2020390288A1 (en) * 2019-11-26 2022-05-26 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. Antibodies to CD3 and BCMA, and bispecific binding proteins made therefrom
EP4313311A1 (en) * 2021-03-31 2024-02-07 Merus N.V. Multispecific binding moieties comprising novel pd-1 binding domains
CN114989297B (zh) * 2022-06-14 2022-10-25 北京科跃中楷生物技术有限公司 包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒
WO2024072893A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Incyte Corporation Anti-pd-1/lag-3 bispecific antibodies and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016028672A1 (en) * 2014-08-19 2016-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-lag3 antibodies and antigen-binding fragments
WO2017019846A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Macrogenics, Inc. Pd-1-binding molecules and methods use thereof
CN106459182A (zh) * 2013-12-30 2017-02-22 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
US20170137517A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-18 Edward Bowman PD1 and/or LAG3 BINDERS
CN107614013A (zh) * 2015-06-08 2018-01-19 宏观基因有限公司 结合lag‑3的分子和其使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200094A1 (ar) * 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
BR112016018408A2 (pt) * 2014-03-14 2017-12-26 Immutep Sas moléculas de anticorpo à lag-3 e usos das mesmas
GB201500319D0 (en) * 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
WO2017024515A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Wuxi Biologics (Cayman) Inc. Novel anti-pd-1 antibodies
WO2017132827A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
TWI822521B (zh) * 2016-05-13 2023-11-11 美商再生元醫藥公司 藉由投予pd-1抑制劑治療皮膚癌之方法
KR20190019144A (ko) * 2016-06-20 2019-02-26 에프-스타 델타 리미티드 Pd-l1 및 lag-3에 결합하는 결합 분자
CN114456269A (zh) * 2016-09-21 2022-05-10 基石药业（苏州）有限公司 一种新的pd-1单克隆抗体
AU2017342071A1 (en) * 2016-10-13 2019-04-18 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd Anti-LAG-3 antibodies and compositions

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459182A (zh) * 2013-12-30 2017-02-22 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
WO2016028672A1 (en) * 2014-08-19 2016-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-lag3 antibodies and antigen-binding fragments
CN107614013A (zh) * 2015-06-08 2018-01-19 宏观基因有限公司 结合lag‑3的分子和其使用方法
WO2017019846A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Macrogenics, Inc. Pd-1-binding molecules and methods use thereof
US20170137517A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-18 Edward Bowman PD1 and/or LAG3 BINDERS

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SERGEY M. DEYEV 等: ""Multivalency: the hallmark of antibodies used for optimization of tumor targeting by design "", BIOESSAYS, vol. 30, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 904 - 918 *
张敏 等: ""靶向抗肿瘤单克隆抗体药物应用的现状和展望"", 中国肿瘤生物治疗杂志, vol. 24, no. 9, 30 September 2017 (2017-09-30), pages 929 - 937 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022166987A1 (zh) * 2021-02-08 2022-08-11 迈威(上海)生物科技股份有限公司 结合lag-3的抗体及其用途
WO2022188801A1 (zh) * 2021-03-10 2022-09-15 北京拓界生物医药科技有限公司 Pd-1结合蛋白及其医药用途

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