TWI784190B - 針對lag-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性pd-1/lag-3結合蛋白 - Google Patents

針對lag-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性pd-1/lag-3結合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TWI784190B
TWI784190B TW108128587A TW108128587A TWI784190B TW I784190 B TWI784190 B TW I784190B TW 108128587 A TW108128587 A TW 108128587A TW 108128587 A TW108128587 A TW 108128587A TW I784190 B TWI784190 B TW I784190B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
lag
seq
cdr
antibody
domain
Prior art date
Application number
TW108128587A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202041537A (zh
Inventor
巫玄
宮世勇
辰冰 吳
Original Assignee
中國大陸商上海岸邁生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中國大陸商上海岸邁生物科技有限公司 filed Critical 中國大陸商上海岸邁生物科技有限公司
Publication of TW202041537A publication Critical patent/TW202041537A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI784190B publication Critical patent/TWI784190B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明揭示識別計劃性死亡配位體-1 (PD-1)及淋巴球活化基因3蛋白(LAG-3)之高親和力抗體。將來自人類化抗PD-1抗體及抗LAG-3抗體之結合位點併入串聯Fab免疫球蛋白格式中而不顯著損失結合親和力，且所得雙特異性多價結合蛋白能夠同時與PD-1及LAG-3兩者結合。此類雙特異性FIT-Ig結合蛋白適用於治療癌症。

Description

針對LAG-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性PD-1/LAG-3結合蛋白
本發明係關於識別淋巴球活化基因3蛋白(LAG-3)之新穎抗體及使用彼等抗體製備之雙特異性PD-1/LAG-3結合蛋白，諸如FIT-Ig結合蛋白。該等抗體及雙特異性結合蛋白適用於治療免疫疾病及血液癌症。
計劃性細胞死亡蛋白1(PD-1)
計劃性細胞死亡蛋白1(PD1，CD279)為CD28受體家族之成員，該家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1及BTLA。在免疫細胞，諸如T細胞、B細胞、單核球及自然殺手(NK)細胞中經常存在PD-1之表現。PD-1及類似家族成員為I型跨膜醣蛋白，其含有類似於負責配位體結合之Ig可變域及負責信號傳導分子之結合的胞質尾區的免疫球蛋白樣域。PD-1之胞質尾區含有兩個基於酪胺酸之信號傳導基元，ITIM(基於免疫受體酪胺酸之抑制基元)及ITSM(基於免疫受體酪胺酸之開關基元)。Vivier等人，Immunol.Today,18：286-291(1997)及Chemnitz等人，J.Immunol.,173：945-954(2004)。
已鑑別出PD-1之兩種細胞表面糖蛋白配位體計劃性死亡配位體1(PD-L1，CD274，B7-H1)及PD-L2(CD273，B7-DC)，且已顯示其誘導抑制CD3-及CD28-介導的T細胞活化的胞內信號轉導。Riley,Immunol.Rev.,229：114-125(2009)。T細胞活化之此下調轉而引起T細胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ分泌及其他生長因子與細胞介素之分泌降低。Freeman等人，J.Exp.Med.,192：1027-1034(2000)；Latchman等人，Nat.Immunol.,2：261-8(2001)；Carter等人，Eur.J.Immunol.,32：634-43(2002)；Ohigashi等人，Clin.Cancer Res.,11：2947-53(2005)。咸信經由PD-1/PD-L1相互作用的信號傳導會在免疫系統中藉由負性調節T細胞反應來提供重要的非冗餘功能。此調節與胸腺中之T細胞發育、慢性發炎反應之調節及周邊耐受性及免疫赦免兩者之維持有關。此等功能之關鍵性質在呈現自體免疫表型之PD-1缺乏小鼠中例示。C57BL/6小鼠中之PD-1缺乏引起慢性進展性狼瘡樣腎絲球腎炎及關節炎。在Balb/c小鼠中，PD-1缺乏由於存在心臟組織特異性自體反應性抗體而引起嚴重心肌病。
在T細胞刺激之後，PD-1將酪胺酸磷酸酶SHP-2募集至其胞質尾區內之ITSM基元，引起與CD3 T細胞信號傳導級聯有關之效應分子(諸如CD3-ζ、PKC-θ及ZAP70)之去磷酸化。由於PD-1及CTLA-4兩種分子調節重疊組之信號傳導蛋白質，PD-1下調T細胞反應之機制與CTLA-4的類似但又有所不同。Parry等人，Mol.Cell Biol.,25：9543-9553(2005)。一般而言，PD-1介導的抑制性信號在免疫耐受性中起重要作用。Bour-Jordan等人，Immunol.Rev.,241：180-205(2011)。
在腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)中發現增加的PD-1表現，且已在多種不同組織(包括肺、肝、胃、腎臟、乳房、卵巢、胰臟、黑素細胞 及食道)癌症中報導在腫瘤細胞中表現PD-1配位體。一般而言，腫瘤細胞上表現之PD-1配位體與在多個腫瘤類型中，癌症患者之不良預後有關。Okazaki and Honjo,Int.Immunol.,19：813-824(2007)。
阻斷PD-1/PD-L1相互作用可引起腫瘤特異性T細胞免疫性增強，且因此有助於藉由免疫系統清除腫瘤細胞。在侵襲性胰臟癌之鼠類模型中，T.Nomi等人表明PD-1/PD-L1阻斷之治療功效，顯示投與抗PD-1或抗PD-L1抗體顯著地抑制腫瘤生長。Nomi等人，Clin.Cancer Res.,13：2151-2157(2007)。抗體阻斷有效促進腫瘤反應性CD8+ T細胞浸潤至腫瘤中，引起包括IFN-γ、顆粒酶B及穿孔蛋白之抗腫瘤效應子上調。在另一研究中，使用小鼠鱗狀細胞癌模型，PD-1或PD-L1之抗體阻斷顯著地抑制腫瘤生長。Tsushima等人，Oral Oncol.,42：268-274(2006)。
近年來，已顯示，PD-1在來自HIV感染個體之T細胞上高度表現，且顯示，受體表現與減弱的T細胞功能及疾病進展相關。Day等人，Nature,443：350-354(2006)；Trautmann等人，Nat.Med.,12：1198-1202(2006)。在兩個研究中，配位體PD-L1之阻斷顯著增加活體外HIV特異性產生IFN-γ之細胞之擴增。
因此，拮抗劑分子對PD-1信號傳導之治療性調節可恢復免疫細胞之耐受性且使其再活化以根除癌症及慢性病毒感染。
淋巴球活化基因3(LAG-3)
淋巴球活化基因3蛋白(LAG-3，CD223)為一種調節T細胞穩態、增殖及活化之負性共刺激受體。Sierro等人，Expert Opin.Ther.Targets,15：91-101(2010)。免疫球蛋白超家族成員LAG-3為一種CD4樣蛋白，其類 似CD4，與MHC II類分子結合但具有高兩倍之親和力且在與CD4不同的位點。Huard等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,94：5744-9(1997)。LAG-3表現於活化CD8+ T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、B細胞、漿細胞樣樹突狀細胞及調節性T細胞(Treg)上。LAG-3作為T細胞反應之負調節劑之作用係基於利用LAG-3基因剔除小鼠及在模型中活體外及活體內系統使用阻斷性抗LAG-3抗體的研究。Sierro等人(2010),op.cit.；Hannier等人，J.Immunol.,161：4058-65(1998)；Macon-Lemaitre等人，Immunology,115：170-8(2005)；Workman等人，Eur.J.Immunol.,33：970-9(2003)。天然及誘導性Treg兩者均表現增加的LAG-3，此為該等Treg之最大抑制功能所需。Camisaschi等人，J.Immunol.,184：6545-6551(2010)；Huang，等人，Immunity,21：503-513(2004)。此外，CD4+效應T細胞上異位表現LAG-3降低其增殖能力且賦予其針對第三方T細胞之調節潛能。Huang,ibid。近期研究亦已顯示，在耗盡淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)-特異性CD8+ T細胞上之高LAG-3表現有助於其無反應性狀態且限制CD8+ T細胞抗腫瘤反應。Blackburn等人，Nat.Immunol.,10：29-37(2009)及Grosso等人，J.Clin.Invest.,117：3383-3392(2007)。
LAG-3在抗腫瘤免疫反應及針對感染之免疫反應中所起之重要作用使得其成為免疫療法之受關注目標。已提出將利用拮抗劑(包括單株抗體)阻斷LAG-3來治療某些癌症及慢性病毒感染。Turnis等人，Eur.J.Immunol.,45：1892-1905(2015)。
由於PD-1-及LAG-3-介導的信號傳導之重要性變得更好理解，持續不斷地需求發現可有效地改變T細胞功能性或增加腫瘤細胞針對免疫效應細胞之反應性之新穎抑制性抗PD-1及抗LAG-3抗體。此外，可 將PD-1及LAG-3抑制效果組合之雙特異性分子之設計亦將為對於癌症治療之治療方法的所需改良。
本發明提供以高親和力與LAG-3結合之新穎工程改造抗體。本發明亦提供可與PD-1及LAG-3兩者反應之PD-1/LAG-3雙特異性串聯Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)。本發明之抗體及雙特異性結合蛋白可阻斷TIL上之LAG-3降低腫瘤浸潤的Treg細胞群體或使TIL恢復細胞毒性表型。另外，本發明之雙特異性結合蛋白可用於抑制PD-1/PD-L1信號傳導，以便使腫瘤浸潤的細胞毒性T細胞再活化。本文所描述之雙特異性多價結合蛋白將適用作PD-1/LAG-3雙特異性抑制劑，以提供協同組合效果來克服抗腫瘤免疫抑制，且因此改良甚至對於單獨抗PD-1或抗LAG-3療法無反應或已終止反應之患者的結果。
本發明亦提供製備及使用本文所描述之抗LAG-3抗體及PD-1/LAG-3雙特異性結合蛋白之方法，以及可用於偵測樣本中之PD-1及/或LAG-3之方法中或可用於治療或預防個體之與LAG-3或PD-1及LAG-3活性相關之病症之方法中的各種組合物。
在又一實施例中，本發明提供一種雙特異性串聯Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)結合蛋白，其包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含：(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接與VHB融合；或(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接與VLA融合；其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHA-CH1；及其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLB-CL； 其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，Fc為免疫球蛋白Fc區，A為PD-1或LAG-3之抗原決定位且B為PD-1或LAG-3之抗原決定位，其限制條件為A與B不同。根據本發明，此類FIT-Ig結合蛋白與PD-1及LAG-3兩者結合。
在較佳實施例中，此類FIT-Ig結合蛋白之Fab片段併入來自與靶向PD-1或LAG-3之抗原中之一者結合之一種親本抗體的VLA-CL域及VHA-CH1域，且其併入來自與靶向PD-1及LAG-3之另一種抗原結合之不同親本抗體的VLB-CL域及VHB-CH1域。因此，VH-CH1/VL-CL配對將產生識別PD-1及LAG-3之串聯Fab部分。
根據本發明，PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白可宜包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fc，其中CL直接與VHLAG-3融合；其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHPD-1-CH1；且其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLLAG-3-CL；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。有利地，在第一多肽鏈中，VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，且VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
在替代實施例中，PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白可宜包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含 VLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fc，其中CL直接與VHPD-1融合；其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHLAG-3-CH1；且其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLPD-1-CL；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。有利地，在第一多肽鏈中，VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，且VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
在替代實施例中，PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白可宜包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fc，其中CH1直接與VLPD-1融合；其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLLAG-3-CL；且其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHPD-1-CH1；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。有利地，在第一多肽鏈中，VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，且VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
在替代實施例中，PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白可宜包含 第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fc，其中CH1直接與VLLAG-3融合；其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLPD-1-CL；且其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHLAG-3-CH1；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。有利地，在第一多肽鏈中，VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，且VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
在FIT-Ig結合蛋白之第一多肽鏈之前述式中，Fc區可為原生或變異Fc區。在特定實施例中，Fc區為來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之人類Fc區。在特定實施例中，Fc為來自IgG1之人類Fc或經修飾之人類Fc，諸如下文表6中所闡述的(SEQ ID NO：28)。
在本發明之一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白保留親本抗體之一或多個特性，自該等親本抗體中使用其Fab片段之序列且併入FIT-Ig結構中。在較佳實施例中，FIT-Ig將針對目標抗原(亦即LAG-3及PD-1)，保留與親本抗體之結合親和力相當的結合親和力，意謂FIT-Ig結合蛋白針對PD-1及LAG-3抗原目標之結合親和力與親本抗體針對其各別目標抗原之結合親和力相比相差不大於10倍，如藉由表面電漿子共振或生物層干涉法所量測。
在一個實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列23-679、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：146之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT107-1-6a-1；表41。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：147之胺基酸序列23-684、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-6b-1；表42。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：154之胺基酸序列23-679、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-6a-2；表43。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：161之胺基酸序列23-684、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1- 6b-2；表44。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：168之胺基酸序列23-679、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：174之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-6a-3；表45。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：175之胺基酸序列23-684、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：179之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-6b-3；表46。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列23-679、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-7a-1；表47。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列23-687、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-7b-1；表48。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列23-679、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-7a-2；表49。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列23-687、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-7b-2；表50。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列23-679、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-7a-3；表51。)
在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：217之胺基酸序列23-687、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：221 之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：223之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT-107-1-7b-3；表52。)
本發明亦提供能夠結合人類LAG-3之新穎抗體，其中抗體之抗原結合域包含一組六個CDR，亦即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該等CDR選自以下定義之CDR組的群組：
Figure 108128587-A0305-02-0014-1
Figure 108128587-A0305-02-0015-2
Figure 108128587-A0305-02-0016-3
在一個實施例中，根據本發明之結合蛋白為雙特異性多價免疫球蛋白結合蛋白，其包含兩個或更多個抗原結合位點，其中至少一個抗原結合位點包含選自以上CDR組10、11及12之抗LAG-3 CDR組，且至少一個抗原結合位點包含選自以下CDR組13及14之抗PD-1 CDR組：
Figure 108128587-A0305-02-0016-4
在又一實施例中，根據本發明之抗LAG-3抗體包含VH及VL域，其中該兩個可變域包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：
Figure 108128587-A0305-02-0016-564
Figure 108128587-A0305-02-0017-565
在另一實施例中，本文所描述之抗LAG-3抗體可用於藉由本領域中良好確立之技術製備識別相同目標抗原之衍生結合蛋白。此種衍生物可為例如單鏈抗體(scFv)、Fab片段(Fab)、Fab'片段、F(ab')2、Fv及二硫鍵聯Fv。
在本發明之另一態樣中，本文所描述之抗體或雙特異性結合蛋白能夠調節LAG-3或PD-1與LAG-3兩者之生物功能。在另一態樣中，如本文所描述之抗PD-1抗體特異性能夠抑制PD-1/PD-L1信號傳導。信號抑制可在混合淋巴球反應分析中量測，諸如在下文之工作實例中進行。在另一態樣中，如本文所描述之抗LAG-3抗體特異性能夠抑制MHC II類/LAG-3相互作用。此類抑制可在PBMC SEB活化分析分析中量測，諸如在下文之工作實例中進行。在另一態樣中，本文所描述之雙特異性PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白能夠抑制PD-1/PD-L1信號傳導及MHC II類/LAG-3相互作用兩者。
在一實施例中，本文所描述之抗LAG-3抗體或其抗原結合片段對於人類LAG-3具有以下之締合速率常數(kon)：至少5×103M-1s-1、至少7×103M-1s-1、至少1×104M-1s-1、至少3×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少7×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1或至少2×105M-1s-1或更高，如藉由表面電漿子共振或生物層干涉法所量測。
在另一實施例中，本文所描述之抗LAG-3抗體或其抗原結 合片段對於人類LAG-3具有以下之解離速率常數(koff)：低於1.5×10-3s-1、低於1×10-3s-1、低於8×10-4s-1、低於6×10-4s-1、低於4×10-4s-1、低於2×10-4s-1、低於1×10-4s-1、低於9×10-5s-1、低於8×10-5s-1、低於7×10-5s-1、低於5×10-5s-1、低於4×10-5s-1、低於2×10-5s-1或低於1×10-5s-1，如藉由表面電漿子共振或生物層干涉法所量測。
在另一實施例中，本文所描述之抗LAG-3抗體或其抗原結合片段對於LAG-3具有以下之解離常數(KD)：低於5×10-7M、低於2×10-7M、低於1×10-7M、低於8×10-8M、低於6×10-8M、低於4×10-8M、低於2×10-8M、低於1×10-8M、低於8×10-9M、低於6×10-9M、低於4×10-9M、低於2×10-9M或低於1×10-9M。
在一實施例中，根據本發明之能夠結合PD-1及LAG-3之雙特異性FIT-Ig結合蛋白對於人類PD-1具有以下之締合速率常數(kon)：至少5×103M-1s-1、至少1×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1、至少3×105M-1s-1或至少5×105M-1s-1或更高；且相同結合蛋白對於人類LAG-3具有以下之締合速率常數(kon)：至少5×103M-1s-1、至少1×104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少1×105M-1s-1、至少3×105M-1s-1或至少5×105M-1s-1或更高，如藉由表面電漿子共振或生物層干涉法所量測。在其他實施例中，如本文所描述之能夠結合PD-1及LAG-3之雙特異性FIT-Ig結合蛋白對於人類PD-1將具有以下之締合速率常數(kon)，該締合速率常數比親本抗PD-1抗體針對PD-1之kon低不大於10倍且比親本抗LAG-3抗體針對LAG-3之kon低不大於10倍，分別自該等親本抗體中衍生FIT-Ig結合蛋白之抗PD-1及抗LAG-3特異性。換言之，FIT-Ig結合蛋白將保留針對各抗原(PD-1或LAG-3)之締合速率常數，亦即比由可與各別PD-1或 LAG-3抗原反應之親本抗體呈現之締合速率常數(kon)高、相同或低不大於一個數量級。如本文所揭示，與由親本抗體呈現之針對各別抗原之kon相比，針對抗原之PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白可顯示針對一種或兩種抗原之kon改良，或針對一種或兩種抗原之kon可基本上分別與由親本抗體所呈現的相同，或若與親本抗體相比，顯示FIT-Ig結合蛋白針對一種或兩種抗原之kon降低，則降低不大於10倍降低。較佳地，與親本抗體針對特定抗原之kon相比，FIT-Ig中針對該抗原之kon的降低小於50%，更佳地小於25%降低。與親本抗體之kon相比，雙特異性FIT-Ig中之此類高保留的kon值為一個本領域中的出人意料的成就。
在一實施例中，根據本發明之能夠結合PD-1及LAG-3之雙特異性FIT-Ig結合蛋白對於人類PD-1具有以下之解離速率常數(koff)：低於2×10-4s-1、低於1×10-4s-1、低於5×10-5s-1、低於3×10-5s-1、低於2×10-5s-1、低於1×10-5s-1或低於8×10-6s-1；且相同結合蛋白對於人類LAG-3具有以下之解離速率常數(koff)：低於2×10-4s-1、低於1×10-4s-1、低於5×10-5s-1、低於3×10-5s-1、低於2×10-5s-1、低於1×10-5s-1或低於8×10-6s-1，如藉由表面電漿子共振或生物層干涉法所量測。
在另一實施例中，根據本發明之能夠結合PD-1及LAG-3之雙特異性FIT-Ig結合蛋白對於PD-1具有以下之解離常數(KD)：低於2×10-8M、低於1×10-8M、低於5×10-9M、低於1×10-9M、低於6×10-10M、低於5×10-10M、低於3×10-10M、低於2×10-10M、低於1×10-10M、低於8×10-11M、低於6×10-11M、低於4×10-11M或低於1×10-11M；且相同結合蛋白針對人類LAG-3具有以下之解離常數(KD)：低於2×10-8M、低於1×10-8M、低於5×10-9M、低於1×10-9M、低於6×10-10 M、低於5×10-10M、低於3×10-10M、低於2×10-10M、低於1×10-10M、低於8×10-11M、低於6×10-11M、低於4×10-11M或低於1×10-11M。在其他實施例中，如本文所描述之能夠結合PD-1及LAG-3之雙特異性FIT-Ig結合蛋白對於人類PD-1將具有以下之解離常數(KD)，該解離常數與親本抗PD-1抗體針對PD-1之KD相差不大於10倍，且與親本抗LAG-3抗體針對LAG-3之KD相差不大於10倍，分別自該等親本抗體中衍生FIT-Ig結合蛋白之抗PD-1及抗LAG-3特異性。換言之，FIT-Ig結合蛋白將保留親本抗體針對各抗原(PD-1或LAG-3)之結合親和力，如由在可分別與PD-1或LAG-3抗原反應之親本抗體所呈現之KD之一個數量級內的解離常數(KD)指示。如本文所揭示，與由親本抗體呈現之針對一種或兩種抗原之KD相比，PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白可顯示針對各別抗原之KD的改良(亦即具有更低KD值；更緊密地結合)，或針對一種或兩種抗原之KD可分別與由親本抗體所呈現的基本上相同，或與親本抗體之KD相比，FIT-Ig結合蛋白顯示針對一種或兩種抗原之KD可顯示降低(亦即具有更高KD值，不那麼緊密地結合)，但若FIT-Ig結合蛋白與親本抗體之間的KD存在差異，則該差異不大於10倍。較佳地，與由一種或兩種親本抗體呈現之針對一種或兩種抗原之KD相比，PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白針對各別抗原顯示更低的KD(更緊密地結合)。保留KD之親本抗PD-1及抗LAG-3抗體之結合親和力±10倍變化為一個本領域中之出人意料的成就。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含至少一種抗LAG-3抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。本發明亦提供醫藥組合物，其包含如本文中所描述之抗PD-1抗體與抗LAG-3抗體或其抗原結合片段之組合，及醫藥學上可接受之載劑。本發明亦提供可與PD-1及LAG-3兩 者反應之雙特異性多價免疫球蛋白結合蛋白，該等結合蛋白併入來自本文所描述之抗PD-1抗體及抗LAG-3抗體之VH/VL結合位點。特定言之，本發明提供醫藥組合物，其包含能夠結合PD-1及LAG-3之至少一種FIT-Ig結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。本發明之醫藥組合物可進一步包含至少一種額外活性成分。在一實施例中，此種額外成分包括(但不限於)：治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、具有不同特異性之抗體或其功能片段、可偵測標記或報導子；針對特定細胞介素之促效劑或拮抗劑、麻醉藥、非類固醇抗炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、肌神經阻斷劑、抗微生物劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫原、免疫抑制劑、生長激素、激素置換藥物、放射性藥品、抗抑鬱劑、抗精神病藥、刺激劑(例如安非他明(amphetamine)、咖啡鹼等)、β促效劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞介素。
在另一實施例中，醫藥組合物進一步包含用於治療其中PD-1介導及/或LAG-3介導的信號傳導活性有害的病症的至少一種額外治療劑。
在又一實施例中，本發明提供經分離核酸，其編碼本發明之抗LAG-3抗體或其抗原結合片段之一或多個胺基酸序列；且本發明進一步提供經分離核酸，其編碼能夠結合PD-1及LAG-3兩者之雙特異性串聯Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)結合蛋白的一或多個胺基酸序列。可將此類核酸插入至載體中以用於進行各種遺傳分析或用於表現、表徵或改良本文所描述之抗體或結合蛋白之一或多個特性。載體可包含編碼本文所描述之抗體或結合蛋白之一或多個胺基酸序列之一或多個核酸分子，其中該一或多個 核酸分子與准許在攜帶載體(例如經載體轉染)之特定宿主細胞中表現抗體或結合蛋白的適當轉錄及/或轉譯序列可操作地連接。用於選殖或表現編碼本文所描述之結合蛋白之胺基酸序列之核酸之載體的實例包括(但不限於)pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV及pBJ及其衍生物。
本發明亦提供一種宿主細胞，其包含含有編碼本文所描述之抗體或結合蛋白之一或多個胺基酸序列之核酸的載體。適用於本發明之宿主細胞可為原核或真核的。例示性原核宿主細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)。適用作本發明中之宿主細胞之真核細胞包括原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞。例示性真菌細胞為酵母細胞，包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。適用作根據本發明之宿主細胞之例示性動物細胞包括(但不限於)哺乳動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞。較佳的哺乳動物細胞包括(但不限於)CHO細胞、HEK細胞及COS細胞。適用作根據本發明之宿主細胞之昆蟲細胞為昆蟲Sf9細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種製造抗LAG-3抗體或其功能片段之方法，該方法包含在培養基中，在足以使得宿主細胞表現能夠結合LAG-3之抗體或片段之條件下，培養包含編碼抗體或功能片段之表現載體的宿主細胞。在另一態樣中，本發明提供一種製造能夠結合PD-1及LAG-3之雙特異性多價結合蛋白，特定言之結合PD-1及LAG-3之FIT-Ig結合蛋白之方法，該方法包含在培養基中，在足以使得宿主細胞表現能夠結合PD-1及LAG-3之結合蛋白之條件下，培養包含編碼FIT-Ig結合蛋白之表現載體的宿主細胞。如此製造之蛋白質可經分離，且用於本文所描述之各種組合物及方法中。
在另一實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之癌 症之方法，該方法包含向個體投與如本文中所描述之抗LAG-3抗體或其LAG-3結合片段，其中該抗體結合片段能夠在表現LAG-3之細胞中結合LAG-3且抑制MHC II類/LAG-3介導的信號傳導。在另一實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之癌症之方法，該方法包含向個體投與能夠結合如本文中所描述之LAG-3及PD-1之雙特異性FIT-Ig結合蛋白，其中該結合蛋白能夠在表現LAG-3之細胞中結合LAG-3及PD-1且抑制MHC II類/LAG-3介導的信號傳導，且能夠在表現PD-1之細胞中抑制PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2信號傳導。在又一實施例中，本發明之FIT-Ig結合蛋白結合PD-1及LAG-3，且包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列23-687、基本上由其組成或由其組成；第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列20-235、基本上由其組成或由其組成；及第三多肽鏈，其包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列23-236、基本上由其組成或由其組成。(參見FIT107-1-7b-1；表48。)
在另一實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之自體免疫疾病或癌症之方法，其中該結合蛋白能夠結合LAG-3及PD-1，且其中該自體免疫疾病或癌症為通常對免疫療法有反應之自體免疫疾病或癌症。在另一實施例中，該癌症為與免疫療法不相關之癌症。在另一實施例中，該癌症為癌症，即難治性或復發性惡性疾病。在另一實施例中，結合蛋白抑制腫瘤細胞之生長或存活。在另一實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素抗性前列腺腺癌)、胰臟腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、白血病、淋巴瘤及其他贅生 性惡性疾病。
本文所描述之治療方法可進一步包含向有需要之個體投與免疫刺激佐劑，諸如包含完全或部分磷酸二酯或硫代磷酸酯主鏈之CpG寡脫氧核苷酸(CpG ODN)。舉例而言，在本發明之治療方法中，可將免疫刺激佐劑併入包含本發明之抗體或FIT-Ig結合蛋白的組合物及向需要治療之個體投與的組合物中。在另一實施例中，本發明之治療方法可包含：向需要治療之個體投與本文所描述之抗體或FIT-Ig結合蛋白的步驟，及在向個體投與本發明之抗體或FIT-Ig結合蛋白之步驟之前、同時或之後，向該個體投與免疫刺激佐劑的獨立步驟。
圖1A及圖1B為顯示在混合淋巴球反應中之IL-2產量水準之條形圖，該混合淋巴球反應測試與由公開序列產生之兩種重組抗PD-1抗體(納武單抗(nivolumab)及帕博利珠單抗(pembrolizumab))及針對無關抗原之人類及鼠類對照抗體(「hIgG4」及「mIgG」)相比，本文所揭示之各種抗PD-1抗體的效果。圖1A及圖1B顯示使用來自不同供體之應答淋巴球之獨立MLR測試。
圖2A及圖2B為顯示在混合淋巴球反應中之γ干擾素(IFN-γ)產量水準之條形圖，該混合淋巴球反應測試與由公開序列產生之兩種重組抗PD-1抗體(納武單抗及帕博利珠單抗)及針對無關抗原之人類及鼠類對照抗體(「hIgG4」及「mIgG」)相比，本文所揭示之各種抗PD-1抗體的效果。圖2A及圖2B顯示使用來自不同供體之應答淋巴球之獨立MLR測試。
圖3顯示在混合淋巴球反應中之IL-2產量水準之條形圖，該混合淋巴 球反應測試與由公開序列產生之重組治療性抗PD-1抗體(納武單抗)及針對無關抗原之對照人類抗體(「HuF0323-1」)相比，本文所揭示之各種人類化抗PD-1抗體的效果。
圖4顯示在混合淋巴球反應中之IL-2產量水準之條形圖，該混合淋巴球反應測試與親本鼠類mAb709、由公開序列產生之重組治療性抗PD-1抗體(納武單抗)及針對無關抗原之對照人類抗體(「HuF0323-1」)相比，本文所揭示之各種人類化抗PD-1抗體的效果。
圖5顯示在混合淋巴球反應中之IL-2產量水準之條形圖，該混合淋巴球反應測試與具有親本鼠類mAb713可變域之嵌合體(mAb713c)、由公開序列產生之重組治療性抗PD-1抗體(納武單抗)及針對無關抗原之對照人類抗體(「HuF0323-1」)相比，本文所揭示之各種人類化抗PD-1抗體的效果。圖3、圖4及圖5顯示使用來自不同供體之應答淋巴球之獨立MLR測試。
圖6為顯示在SEB T細胞活化分析中之IL-2產量之條形圖，該SEB T細胞活化分析比較在本文所描述之兩種鼠類抗LAG-3抗體之不同濃度下的T細胞抑制效果的反轉。將本發明之抗LAG-3抗體(「3502-mAb746」及「3502-mAb747」)之功能性與以下各者進行比較：由公開序列產生之重組抗LAG-3 mAb(「BMS-986016」)、由公開序列產生之重組鼠類抗LAG-3抗體(「BAP050」)及針對無關抗原之人類及鼠類對照抗體(「hIgG4」及「mIgG」)。
圖7為顯示在SEB T細胞活化分析中之IL-2產量之條形圖，該SEB T細胞活化分析比較在本文所描述之FIT-Ig雙特異性結合蛋白FIT107-1-2a之不同濃度下的T細胞抑制效果的反轉。將FIT107-1-2a之功能性與以下 進行比較：已知序列之重組抗LAG-3 mAb(BMS-986016)與已知序列之重組抗PD-1 mAb(納武單抗)之組合，及單獨的人類化抗PD-1抗體(本文所揭示之HumAb709-8)。
圖8呈現顯示在混合淋巴球反應中之相對γ干擾素(IFN-g)產量水準的曲線，該混合淋巴球反應測試與已知序列之重組抗LAG-3 mAb(BMS-986016)與已知序列之重組抗PD-1 mAb(納武單抗)之組合，及人類化抗PD-1抗體(本文所揭示之HumAb709-8)相比，在不同濃度下之FIT107-1-2a雙特異性FIT-Ig結合蛋白的效果。
圖9為顯示在SEB T細胞活化分析中之IL-2產量之條形圖，該SEB T細胞活化分析比較在嵌合抗LAG-3抗體mAb747c及人類化抗LAG-3抗體HumAb747-60之不同濃度下的T細胞抑制效果的反轉。參見實例13。將本發明之人類化抗LAG-3抗體(HumAb747-60)之功能性與以下各者進行比較：使用本文所描述之鼠類可變域產生之嵌合抗LAG-3 mAb，及針對無關抗原之人類抗體(「hIgG4」，對照)。
圖10為顯示在SEB T細胞活化分析中之IL-2產量之條形圖，該SEB T細胞活化分析比較在嵌合抗LAG-3抗體mAb747c及在親和力成熟實驗之後併入所指示突變之人類化抗LAG-3抗體HumAb747-60之高親和力變體之不同濃度下的T細胞抑制效果的反轉。參見實例14。將本發明之抗LAG-3變體抗體(HumAb747V-66至HumAb747V-73)之功能性與以下各者進行比較：使用本文所描述之鼠類可變域產生之嵌合抗LAG-3 mAb，及針對無關抗原之人類抗體(「hIgG4」，對照)。
圖11為顯示在SEB T細胞活化分析中之IL-2產量之條形圖，該SEB T細胞活化分析比較在對LAG-3及PD-1目標兩者具有特異性之FIT-Ig結合蛋 白之不同濃度下的T細胞抑制效果的反轉。參見實例16.2。將本發明之PD-1/LAG-3 FIT-Ig雙特異性抗體之功能性與以下各者進行比較：根據公開序列製備之重組抗PD-1單株抗體與抗LAG-3單株抗體之組合(「納武單抗+BMS 986016」)，及針對無關抗原之人類抗體(「hIgG」，對照)。
圖12為顯示受體阻斷分析之結果之條形圖，該受體阻斷分析顯示根據本發明之抗LAG-3抗體(HumAb747V-67)及根據本發明之PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白(FIT107-1-7b-1)能夠阻斷人類LAG-3與血纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)之間的相互作用。參見實例16.5。
圖13為評價與T細胞上表現之PD-1及LAG-3之細胞表面結合之一系列曲線。結果顯示，雙特異性FIT-Ig蛋白FIT107-1-7b-1識別T細胞上之PD-1及LAG-3表面蛋白質兩者。
本發明係關於新穎抗LAG-3抗體、其抗原結合部分及多價雙特異性結合蛋白，諸如均與PD-1及LAG-3目標結合之串聯Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)。本發明之各種態樣係關於抗LAG-3抗體及抗體片段、與人類PD-1及人類LAG-3結合之多價FIT-Ig結合蛋白及自其製得之醫藥組合物，以及用於製備此類抗體、功能抗體片段及多價結合蛋白之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之抗體、功能抗體片段及雙特異性結合蛋白來偵測人類PD-1、人類LAG-3或兩者的方法；活體外或活體內抑制人類LAG-3或人類PD-1及人類LAG-3活性的方法；及治療由PD-1及/或LAG-3與其各別配位體(亦即PD-L1及MHC II類)結合介導的疾病(尤其癌症)的方法。
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術 術語應具有由一般熟習此項技術者通常理解之含義。術語之含義及範疇應為清楚的，然而，在任何潛在不明確性之情況下，本文所提供之定義優先於任何字典或外部定義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外陳述，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具限制性。此外，除非另外特定陳述，否則諸如「元件」或「組件」之術語涵蓋包含一個單元之元件及組件以及包含多於一個次單元之元件及組件兩者。
一般而言，本文中所描述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白與核酸化學及雜交結合使用的命名法及其技術為此項技術中熟知且常用者。除非另外指示，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般及更特定文獻中所描述來進行。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文所描述執行。本文所描述之與分析化學、合成有機化學及藥物與醫藥化學結合使用的命名法及其實驗室程序及技術為在此項技術中熟知且常用者。標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者治療。
為了可更容易地理解本發明，下文定義所選術語。
術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦指胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋原生或人工蛋白質、蛋白質片段及蛋白質胺基酸序列之多肽類似物。除非上下文矛盾，否則術語「多肽」涵蓋片段及其變體(包括變體之片段)。對於抗原性多肽，多肽片段視情況含有至少一個連續或非線性之多 肽抗原決定位。至少一個抗原決定位片段之精確邊界可使用此項技術中之一般技術確認。片段包含至少約5個連續胺基酸，諸如至少約10個連續胺基酸，至少約15個連續胺基酸或至少約20個連續胺基酸。如本文描述多肽變體。
術語「經分離蛋白質」或「經分離多肽」為如下蛋白質或多肽：根據其來源或衍生源而不與其在天然狀態中所伴隨的天然結合組分結合；實質上不含來自同一物種之其他蛋白質；由來自不同物種之細胞表現；或在自然界中不存在。因此，化學合成或在不同於其天然來源的細胞之細胞系統中合成之多肽將與其天然結合組分「分離」。蛋白質亦可藉由使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術進行分離而使得實質上不含天然結合組分。
術語「回收」係指藉由例如使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術進行分離，使得諸如多肽之化學物種實質上不含天然結合組分之過程。
術語「生物活性」係指本文所描述之抗PD-1或抗LAG-3抗體之所有固有生物特性。抗PD-1抗體之生物特性包括(但不限於)與PD-1蛋白結合；抗LAG-3抗體之生物特性包括(但不限於)與MHC II類蛋白結合。
提及抗體、結合蛋白或肽與第二化學物種之相互作用，術語「特異性結合(specific binding/specifically binding)」意謂，該相互作用取決於第二化學物種上之特定結構(例如抗原決定子或抗原決定位)之存在。舉例而言，抗體識別且結合於特定蛋白質結構而非一般蛋白質。若抗體對抗原決定位「A」具有特異性，則在含有經標記「A」及該抗體之反 應中，含有抗原決定位A(或未經標記之游離A)之分子的存在將減少與該抗體結合之經標記A的量。
術語「抗體」廣義地係指包含四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)之任何免疫球蛋白(Ig)分子，或保留Ig分子之基本抗原決定位結合特徵的其任何功能片段、突變體、變體或衍生物。此類突變體、變體或衍生物抗體形式為此項技術中已知的。下文論述其非限制性實施例。
在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL包含按以下次序自胺基端至羧基端排列的三個CDR及四個FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH域之第一、第二及第三CDR通常列為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；同樣，VL域之第一、第二及第三CDR通常列為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。
術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，其可藉由番木瓜蛋白酶消化完整抗體產生。Fc區可為原生序列Fc區或變異Fc區。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定域，亦即CH2域及CH3域，且視情況包含CH4域，例如如在IgM及IgE抗體之Fc區的情況下。IgG、IgA及IgD抗體之Fc區包含鉸鏈區、CH2域及CH3域。相比之下，IgM及IgE抗體之Fc區缺少鉸鏈區但包含CH2域、CH3域及CH4域。在Fc部分中置換胺基 酸殘基以改變抗體效應功能之變體Fc區為此項技術中已知的(參見例如Winter等人，美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。抗體之Fc部分介導若干重要效應功能，例如細胞介素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體與抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。在一些情況下，此等效應功能係治療性抗體所需的，但在其他情況下，取決於治療目的，可能為不必要的或甚至有害的。某些人類IgG同型，尤其IgG1及IgG3，分別經由與FcγR及互補序列C1q結合來介導ADCC及CDC。在再一實施例中，抗體之恆定區(例如抗體之Fc區)中之至少一個胺基酸殘基發生置換，使得抗體之效應功能改變。免疫球蛋白之兩條一致重鏈之二聚化係由CH3域之二聚化介導的，且藉由將CH1恆定域與Fc恆定域(例如CH2及CH3)連接之鉸鏈區內的二硫鍵穩定。IgG之消炎活性完全取決於IgG Fc片段之N-連接聚糖之唾液酸化。已測定消炎活性之精確聚糖需求，使得可產生適當IgG1 Fc片段，從而產生效能極大增強的完全重組唾液酸化IgG1 Fc(參見Anthony等人，Science,320：373-376(2008))。
術語抗體之「抗原結合部分」及「抗原結合片段」或「功能片段」可互換地使用，且係指保留與抗原，亦即與衍生該部分或片段之全長抗體相同的抗原(例如PD-1、LAG-3)特異性結合之能力的抗體的一或多個片段。經顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。此類抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特異性形式；與兩種或更多種不同抗原(例如PD-1及不同抗原，諸如LAG-3)特異性結合。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內之結合片段之實例包括：(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成的一價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區處藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由 VH及CH1域組成；(iv)Fv片段，其由抗體單臂之VL及VH域組成；(v)dAb片段(Ward等人，Nature,341：544-546(1989)；PCT公開案第WO 90/05144號)，其包含單一可變域；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH經獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成性連接子接合，該合成性連接子能夠將其製造成VL與VH區配對以形成一價分子之單一蛋白鏈(被稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，Science,242：423-426(1988)；及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85：5879-5883(1988))。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」及上文給出的等效術語內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使用過短而不允許相同鏈上之兩個域之間進行配對的連接子，從而迫使該等域與另一條鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)。此類抗體結合部分為此項技術中已知的(Kontermann及Dübel編，Antibody Engineering(Springer-Verlag,New York,2001)，第790頁(ISBN 3-540-41354-5))。另外，單鏈抗體亦包括「線性抗體」，其包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)，該等區段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng.,8(10)：1057-1062(1995)；及美國專利第5,641,870號))。
免疫球蛋白恆定(C)域係指重鏈(CH)或輕鏈(CL)恆定域。鼠類及人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列為此項技術中已知的。
術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即構成該群體的個別抗體除了可能少量存在的可能天然 存在之突變之外均相同。單株抗體針對單一抗原決定子(抗原決定位)具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定位)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各mAb係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。
術語「人類抗體」包括具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括並非由例如CDR且尤其CDR3中之人類生殖系免疫球蛋白序列(例如藉由活體外無規或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)編碼之胺基酸殘基。然而，術語「人類抗體」不包括來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已經移植至人類構架序列上之抗體。
術語「重組人類抗體」包括所有藉由重組手段製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如使用經轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體、自重組組合人類抗體庫分離之抗體Hoogenboom,H.R.,Trends Biotechnol.,15：62-70(1997)；Azzazy及Highsmith,Clin.Biochem.,35：425-445(2002)；Gavilondo及Larrick,BioTechniques,29：128-145(2000)；Hoogenboom及Chames,Immunol.Today,21：371-378(2000))、自對於人類免疫球蛋白基因為轉殖基因之動物(例如，小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor等人，Nucl.Acids Res.,20：6287-6295(1992)；Kellermann及Green,Curr.Opin.Biotechnol.,13：593-597(2002)；Little等人，Immunol.Today,21：364-370(2000))；或藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之手段製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經受活體外突 變誘發(或當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相關，但不會活體內天然存在於人類抗體生殖系抗體庫內的序列。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有與人類恆定區連接之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一種物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有人類重鏈及輕鏈可變區但其中一或多個人類CDR已經鼠類CDR序列置換的抗體。
術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列但該VH及/或VL序列之至少一部分已變成更「像人類」，亦即，更類似於人類生殖系可變序列的抗體。人類化抗體之一種類型為CDR移植抗體，其中將來自非人類物種(例如小鼠)之CDR序列引入至人類VH及VL構架序列中。人類化抗體為與所關注抗原免疫特異性結合且包含具有實質上人類抗體之胺基酸序列之構架區及恆定區但具有實質上非人類抗體之胺基酸序列之互補決定區(CDR)的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段。如本文所用，術語「實質上」在CDR之情形下係指CDR具有與非人類抗體CDR之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。人類化抗體包含實質上全部至少一個可變域，且通常兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，其中全部或實質上全部CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即供體抗 體)之彼等，且全部或實質上全部構架區為人類免疫球蛋白共有序列之彼等。在一些實施例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分(Fc)，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變域兩者。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈及/或人類化重鏈之人類化可變域。
人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE；以及任何同型，其包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可包含來自多於一種類別或同型之序列，且可使用此項技術中熟知的技術選擇特定恆定域以使所需效應功能最佳化。
人類化抗體之構架區及CDR區不一定精確地對應於親本序列，例如供體抗體CDR或受體架構可藉由取代、插入及/或缺失至少一個胺基酸殘基突變誘發，使得在該位點處之CDR或構架殘基不對應於供體抗體或保守構架。然而，在一例示性實施例中，此類突變不多。通常，人類化抗體殘基之至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%且最佳至少95%，將對應於親本FR及CDR序列之彼等殘基。在特定構架位置處恢復供體抗體中該位置處存在之相同胺基酸的回復突變，通常用以保持特定環結構或用以正確地定向CDR序列以與目標抗原接觸。
術語「CDR」係指抗體可變域序列內之互補決定區。在重鏈及輕鏈之各可變區中存在三個CDR，稱為CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。如本文所用，術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中的一組三個CDR。此等CDR之精確 邊界已根據不同系統以不同方式加以定義。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland(1987)及(1991))描述之系統，不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確的殘基編號系統，且亦提供定義三個CDR之精確殘基邊界。
在此項技術中公認之術語「Kabat編號」係指對抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之較高變(亦即高變)之胺基酸殘基而非其他胺基酸殘基進行編號的系統。參見Kabat等人，Ann.NY Acad.Sci.,190：382-391(1971)；及Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號(1991)。
在過去二十年間關於可變重鏈及輕鏈區之胺基酸序列之廣泛公共資料庫的成長及分析使得吾人可理解可變區序列內之構架區(FR)與CDR序列之間的典型邊界，且使得熟習此項技術者能夠根據Kabat編號、Chothia編號或其他系統精確判定CDR。參見例如，在Kontermann及Dübel編，Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001)，第31章，第432-433頁中之Martin,「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」。
術語「多價結合蛋白」表示包含兩個或更多個抗原結合位點之結合蛋白。多價結合蛋白較佳經工程改造以具有三個或更多個抗原結合位點，且一般不為天然存在之抗體。術語「雙特異性結合蛋白」係指能夠結合具有不同特異性之兩個目標的結合蛋白。本發明之「串聯Fab免疫球蛋白」(FIT-Ig)結合蛋白包含兩個或更多個抗原結合位點，且通常為四 價結合蛋白。FIT-Ig可為單特異性的，亦即，能夠結合一個抗原；或多特異性的，亦即，能夠結合兩個或更多個抗原。根據本發明之較佳FIT-Ig結合PD-1及LAG-3兩者，且因此為雙特異性的。包含兩條長(重鏈)V-C-V-C-Fc鏈多肽及四條短(輕鏈)V-C鏈多肽之FIT-Ig結合蛋白形成呈現四個Fab抗原結合位點(VH-CH1與VL-CL配對，有時標記為VH-CH1：：VL-CL)的六聚體。FIT-Ig之每一半包含重鏈多肽及兩條輕鏈多肽，且三條鏈之VH-CH1與VL-CL元件之互補免疫球蛋白配對產生串聯排列的兩個Fab結構化抗原結合位點。在本發明中，較佳的是，在不使用域間連接子之情況下，將包含Fab元件之免疫球蛋白域直接融合在重鏈多肽中。即，將長(重鏈)多肽鏈之N端V-C元件直接融合在另一V-C元件(其轉而與C端Fc區連接)之N端的C端處。在雙特異性FIT-Ig結合蛋白中，串聯Fab元件將可與不同抗原反應。各Fab結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域，其中總共六個CDR/抗原結合位點。
在PCT公開案WO 2015/103072中提供FIT-Ig分子之設計、表現及特徵之描述。此類FIT-Ig分子之較佳實例包含重鏈及二條不同輕鏈。重鏈包含結構式VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接與VHB融合，或結構式VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接與VLA融合，其中VLA為來自結合抗原A之親本抗體的可變輕鏈域，VHB為來自結合抗原B之親本抗體的可變重鏈域，CL為輕鏈恆定域，CH1為重鏈恆定域且Fc為免疫球蛋白Fc區(例如IgG1抗體之重鏈之C端鉸鏈-CH2-CH3部分)。FIT-Ig之兩條輕鏈多肽鏈分別具有式VHA-CH1及VLB-CL。在雙特異性FIT-Ig實施例中，抗原A及抗原B為不同抗原或相同抗原之不同抗原決定位。在本發明中，A及B中之一者為PD-1，且另一者為LAG-3。
術語「活性」包括諸如以下之特性：特異性結合目標抗原之能力，抗體針對抗原之親和力，中和目標抗原之生物活性之能力，抑制目標抗原與其天然受體之相互作用之能力及其類似者。本發明之較佳抗體及結合蛋白具有抑制PD-1與其配位體PD-L1結合之能力、抑制LAG-3與其配位體MHC II類結合之能力或兩者(在本文所描述之雙特異性結合蛋白之情況下)。
如本文所用，術語「kon」(亦稱為「Kon」、「kon」)意欲指結合蛋白(例如抗體)與抗原締合以形成締合複合物，例如抗體/抗原複合物之締合速率常數，如此項技術中已知。如在本文中可互換使用，「kon」亦已知為術語「締合速率常數」或「ka」。此值指示抗體與其目標抗原之結合速率或在抗體與抗原之間形成複合物之速率，如由以下方程式所示：抗體(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab-Ag。
如本文所用，術語「koff」(亦稱為「Koff」、「koff」)意欲指結合蛋白(例如抗體)自締合複合物(例如，抗體/抗原複合物)解離之解離速率常數(off rate constant)或「解離速率常數(dissociation rate constant)」，如此項技術中已知。此值指示抗體自其目標抗原之解離速率或Ab-Ag複合物隨時間推移分離為游離抗體及抗原，如由以下方程式所示：Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文所用，術語「KD」(亦稱為「Kd」)意欲指「平衡解離常數」，且係指在滴定量測中在平衡狀態下獲得之值，或藉由將解離速率常數(koff)除以締合速率常數(kon)獲得之值。締合速率常數(kon)、解離速率常數(koff)及平衡解離常數(KD)用於表示抗體對於抗原之結合親和 力。測定締合速率常數及解離速率常數之方法為此項技術中所熟知。使用基於螢光之技術提供高靈敏度及檢查在平衡下生理緩衝液中之樣本的能力。可使用其他實驗方法及儀器，諸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)分析法(例如，獲自BIAcore International AB,GE Healthcare company,Uppsala,Sweden之儀器)。使用例如Octet® RED96系統(Pall FortéBio LLC)之生物層干涉法(BLI)為另一親和力分析技術。另外，亦可使用KinExA®(動力學排除分析)分析，其獲自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)。
術語「經分離核酸」應意謂藉由人工干預，不與在自然界中發現伴隨其之全部或一部分聚核苷酸結合；與在自然界中不與其連接之聚核苷酸可操作地連接；或在自然界中不作為較大序列之一部分存在的聚核苷酸(例如基因組、cDNA或合成來源，或其某一組合)。
如本文所用，術語「載體」意欲指能夠轉運已與其連接之另一核酸的核酸分子。一種載體類型為「質體」，其係指可將額外DNA區段接合至其中之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段接合至病毒基因組中。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且因此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作地連接之基因之表現。此類載體在本文中被稱作「重組表現載體」(或簡言之，「表現載體」)。一般而言，在重組DNA技術中有用之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，由於質體為載體之最常用形式，故「質體」及「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括提供 等效功能之此類其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如，複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「可操作地連接」係指所描述之組分處於准許其以其預期方式作用的關係中的併接。與編碼序列「可操作地連接」之控制序列以使得編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下實現的方式接合。「可操作地連接」之序列包括與所關注基因相鄰之表現控制序列及以反式起作用或在一定距離起作用以控制所關注基因之表現控制序列兩者。如本文所用，術語「表現控制序列」係指實現所接合之編碼序列之表現及加工所需之聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增大轉譯效率之序列(亦即，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時，增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括其存在對表現及加工而言至關重要之組分，且亦可包括其存在有利之額外組分，例如前導或信號序列及融合搭配物序列。
如本文所定義，「轉化」係指外源性DNA藉以進入宿主細胞之任何過程。轉化可在天然或人工條件下使用此項技術中熟知之各種方法來進行。轉化可依賴於將外來核酸序列插入原核或真核宿主細胞中之任何已知方法。方法係基於轉化之宿主細胞選擇，且可包括(但不限於)轉染、病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒子轟擊。此類「轉化」細胞包括所插入之DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體之一部分進行複 製的穩定轉化細胞。其亦包括在有限時間段內短暫表現所插入之DNA或RNA的細胞。
術語「重組宿主細胞」(或簡言之「宿主細胞」)意欲指已引入外源性DNA之細胞。在一實施例中，宿主細胞包含編碼抗體之兩個或更多個(例如多個)核酸，諸如美國專利第7,262,028號中所描述之宿主細胞。此類術語意欲不僅指特定個體細胞，且亦指此種細胞之後代。因為某些修飾可能由於突變或環境影響而出現在隨後世代中，所以此類後代實際上無法與親本細胞相同，但仍包括在如本文所用之術語「宿主細胞」的範疇內。在一實施例中，宿主細胞包括選自任一生命界之原核及真核細胞。在另一實施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一實施例中，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK293、COS、NS0、SP2及PER.C6；昆蟲細胞株Sf9；及真菌細胞釀酒酵母。
可使用重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉化的標準技術(例如電穿孔、脂質體轉染)。可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述進行酶促反應及純化技術。前述技術及程序一般可根據此項技術中熟知及如在本說明書通篇中所引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述之習知方法進行。參見例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。
如本文所用，術語「促效劑」係指當與所關注分子接觸時，導致分子之某一活性或功能之量值相比與不存在該促效劑之情況下所觀測到之活性或功能之量值相比有所增加的調節劑。如本文所用，術語 「拮抗劑」及「抑制劑」係指當與所關注分子接觸時，導致分子之某一活性或功能之量值與不存在該拮抗劑之情況下所觀測到之活性或功能之量值相比有所減小的調節劑。所關注之特定拮抗劑包括阻斷或降低人類PD-1及人類LAG-3之生物或免疫活性之彼等拮抗劑。
如本文所用，術語「有效量」係指足以降低或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；預防病症進展；導致病症消退；預防與病症相關之一或多種症狀復發、發展或進展；偵測病症；或增強或改良另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療效果的療法之量。
抗PD-1及抗LAG-3抗體之產生
根據本發明適用之抗PD-1及抗LAG-3抗體可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者產生。舉例而言，由宿主細胞表現，其中藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明抗體，但在真核細胞中表現抗體為較佳的，且在哺乳動物宿主細胞中表現為最佳的，因為此類真核細胞(且尤其哺乳動物細胞)與原核細胞相比更可能組裝且分泌經恰當摺疊且具免疫活性的抗體。
用於表現本發明之重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO細胞)(包括在Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216-4220(1980)中描述之dhfr- CHO細胞，其與例如在Kaufman及Sharp,J.Mol.Biol.,159：601-621 (1982)中描述之DHFR可選標記物一起使用)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入至哺乳動物宿主細胞中時，抗體藉由將該等宿主細胞培養足以允許在該等宿主細胞中表現該抗體或更佳地，將該抗體分泌至生長該等宿主細胞之培養基中的時間段來產生。抗體可使用標準蛋白質純化方法而自培養基回收。
宿主細胞亦可用於產生功能性抗體片段，諸如Fab片段或scFv分子。應理解，以上程序之變化在本發明之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼本發明之抗體之輕鏈及/或重鏈之功能片段的DNA轉染宿主細胞。亦可使用重組DNA技術來移除一些或所有編碼不必與所關注抗原結合的輕鏈及重鏈中之任一者或兩者的DNA。本發明之抗體亦涵蓋自此類截短之DNA分子表現之分子。另外，可藉由標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯而產生雙功能抗體，其中一條重鏈及一條輕鏈為本發明抗體且另一條重鏈及輕鏈對除所關注抗原以外之抗原具有特異性。
在用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合部分之例示性系統中，藉由磷酸鈣介導的轉染，將編碼抗體重鏈及抗體輕鏈兩者之重組表現載體引入至dhfr- CHO細胞中。在重組表現載體內，將抗體重鏈及輕鏈基因各自與CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件可操作地連接以驅動高水準基因轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增來選擇已經載體轉染之CHO細胞。培養所選擇經轉染宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鏈，且自培養基回收完整抗體。使用標準分子生物學技術來製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉染體，培養宿主細胞且自培養基回收抗體。又另外，本發明提供一種藉由在適合培養基中培養本發明之經轉染宿主細胞直至產生本發明之重組抗體，來製備本發明之重 組抗PD-1或抗LAG-3抗體的方法。該方法可進一步包含自培養基分離重組抗體。
結合PD-1及LAG-3之雙特異性FIT-Ig之產生
使用免疫檢查點抑制劑(諸如靶向PD-1、PD-L1及CTLA-4之抗體)之臨床研究已得到有前景的結果，然而已觀察到，僅一子組患者最初對此等抑制劑起反應，且增加的臨床跡象指示大量比例之初始反應者最終在數月或數年後復發致死性耐藥性疾病。Syn等人，The Lancet Oncology,18(12)：e731-e741(2017)。在耐受腫瘤浸潤淋巴球(TIL)上共表現LAG-3及PD-1兩者，從而促進腫瘤中之免疫抑制；及已提出雙重阻斷LAG-3及PD-1作為在CD8+ T細胞中恢復抗腫瘤功能的手段。Matsuzaki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107(17)：7875-7880(2010)。因此，可同時阻斷免疫抑制T細胞上之兩個目標之LAG-3/PD-1雙特異性結合蛋白的設計可在此治療領域中提供進展。
本發明提供與PD-1及LAG-3兩者結合之串聯Fab免疫球蛋白結合蛋白(FIT-Ig)。此類FIT-Ig分子之例示性實施例包含：(1)重鏈多肽鏈，其包含結構式(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接與VHB融合，或結構式(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接與VLA融合；(2)式VHA-CH1之輕鏈多肽鏈；及(3)式VLB-CL之另一輕鏈多肽鏈，其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，Fc為免疫球蛋白Fc區，A為PD-1或LAG-3之抗原決定位且B為PD-1或LAG-3之抗原決定位，其限制條件為A與B不同。根據本發明，此類FIT-Ig結合蛋白與PD-1及LAG-3兩者結合。
FIT-Ig可包含兩條此類重鏈(1)、兩條此類輕鏈(2)及兩條此類輕鏈(3)，形成呈現四個功能Fab抗原結合位點之六鏈結合蛋白單體。此種FIT-Ig結合蛋白包含兩個一致次單元，其中各次單元包含一條重鏈(1)、一條輕鏈(2)及一條輕鏈(3)，該等鏈一起形成串聯排列的一對Fab結合位點。兩個此類次單元之Fc區之配對產生具有總共四個功能Fab結合單元之本發明之六鏈雙特異性FIT-Ig結合蛋白。
可使用重鏈上之肽連接子來分離串聯連接的Fab部分，然而對於根據本發明之雙特異性FIT-Ig，省略此類連接序列為較佳的。而在具有串聯結合位點之多價工程改造免疫球蛋白形式中，在本領域中通常應理解，相鄰結合位點將彼此干擾，除非可撓性連接子用於空間上分開結合位點。然而，已發現，對於本發明之PD-1/LAG-3 FIT-Ig，根據上文給出之鏈式之免疫球蛋白域之排列產生在轉染哺乳動物細胞中良好表現適當組裝且作為結合目標抗原PD-1及LAG-3之雙特異性多價免疫球蛋白樣結合蛋白分泌的多肽鏈。參見實例10及15，見下文。儘管在Fab結合位點之間不存在任何連接子序列，但本發明之PD-1/LAG-3 FIT-Ig保留針對目標抗原之結合親和力，呈現與親本mAb相當的結合親和力。此外，自結合蛋白省略合成連接子序列可避免產生哺乳動物免疫系統可識別之抗原位點，且以此方式，消除連接子降低FIT-Ig之可能免疫原性且導致在循環中類似於天然抗體的半衰期，即FIT-Ig不經由免疫調理及在肝中之捕捉而被快速清除。
FIT-Ig中之各可變域(VH或VL)可獲自結合目標抗原中之一者(亦即PD-1或LAG-3)之一或多個「親本」單株抗體。宜使用如本文所揭示之抗PD-1及抗LAG-3單株抗體之可變域序列，來產生FIT-Ig結合蛋白。 較佳地，親本抗體為人類化抗體。
本發明之一態樣係關於選擇具有在FIT-Ig分子中所需之至少一或多個特性之親本抗體。在一實施例中，抗體特性係選自由以下組成之群：抗原特異性、對於抗原之親和力、效能、生物功能、抗原決定位識別、穩定性、溶解性、生產效率、免疫原性之缺乏、藥物動力學、生物可用性、組織交叉反應及直系同源抗原結合。PD-1及LAG-3均為細胞表面蛋白質，且與其各別配位體PD-L1(細胞表面受體)及MHC II類(抗原呈遞細胞上之表面蛋白質)之相互作用引起涉及T細胞抑制及免疫反應的胞內信號傳導。因此，根據本發明之抗LAG-3抗體及PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白抑制PD-1/PD-L1及/或MHC II類/LAG-3相互作用之能力使得其成為免疫細胞活化及免疫效應細胞活性之強效調節劑。
根據本發明之抗體、其功能片段及結合蛋白可藉由使用純化抗體及結合蛋白項技術中可用之各種方法及材料中之一或多者來進行純化(以用於預期用途)。此類方法及材料包括(但不限於)：親和層析(例如使用與蛋白A、蛋白G、蛋白質L或抗體、其功能片段或結合蛋白之特異性配位體共軛的樹脂、粒子或膜)、離子交換色譜(例如使用離子交換粒子或膜)、疏水相互作用層析(「HIC」；例如使用疏水性粒子或膜)、超過濾、奈米過濾、透濾、尺寸排阻層析(「SEC」)、低pH處理(以使雜質病毒失活)及其組合，以得到用於預期用途之可接受純度。低pH處理以使雜質病毒失活之非限制性實例，包含在18℃-25℃下，使用0.5M磷酸降低包含本發明之抗體、其功能片段或結合蛋白之溶液或懸浮液的pH至pH 3.5持續60至70分鐘。
本發明之抗體及結合蛋白之用途
鑒於其與人類LAG-3或與人類PD-1及LAG-3兩者結合之能力，本文所描述之抗體、其功能片段及本文所描述之雙特異性多價結合蛋白(諸如FIT-Ig)可用於偵測例如含有表現彼等目標抗原中之一或兩者之細胞的生物樣本中的PD-1或LAG-3或兩者。本發明之抗體、功能片段及結合蛋白可在習知免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學中使用。本發明提供一種用於偵測生物樣本中之LAG-3之方法，其包含使生物樣本與本發明之抗體、其抗原結合部分或結合蛋白接觸；及偵測是否與存在之目標抗原結合，從而偵測在該生物樣本中是否存在該目標。抗體、功能片段或結合蛋白可直接地或間接地用可偵測物質標記，以便於偵測結合或未結合的抗體/片段/結合蛋白。適合的可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。適合的酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶。適合的輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生素蛋白/生物素；適合的螢光材料之實例包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料之實例包括流明諾(luminol)；及適合的放射性材料之實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
本文所描述之抗體、其功能片段及結合蛋白較佳地能夠活體外及活體內中和人類PD-1及/或人類LAG-3活性兩者。因此，本文所描述之抗體、其功能片段及結合蛋白可用於抑制人類PD-1及/或人類LAG-3活性，例如在含有表現PD-1及/或表現LAG-3之細胞之細胞培養物中，在人類個體中，或在具有與本發明之抗體、其功能片段或結合蛋白交叉反應 之PD-1或LAG-3之其他哺乳動物個體中，抑制由PD-1/PD-L1(或PD-1/PD-L2)相互作用及/或MHC II類/LAG-3相互作用介導的細胞信號傳導。在一個實施例中，本發明提供一種用於恢復活化T細胞之活性(逆轉抑制)之方法，其包含使表現人類PD-1之細胞與本發明之抗PD-1抗體或PD-1結合蛋白接觸，使得PD-1活性受到抑制。在另一實施例中，本發明提供一種用於恢復活化T細胞之活性(逆轉抑制)之方法，其包含使表現人類LAG-3之細胞與本發明之抗LAG-3抗體或LAG-3結合蛋白接觸，使得LAG-3活性受到抑制。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療罹患其中PD-1及/或LAG-3活性有害的疾病或病症之個體的方法，此種方法包含向個體投與有效量之本發明之抗體或結合蛋白，使得個體中由PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2結合及/或MHC II類/LAG-3結合介導的活性降低。
如本文所用，術語「其中PD-1及/或LAG-3活性有害的病症」意欲包括罹患造成病症之病理生理學或為促進病症惡化之因子之病症之個體疾病及其他病症，其中PD-1與其配位體(PD-L1、PD-L2)中之一或兩者之相互作用或LAG-3與其配位體(MHC II類)之相互作用。因此，其中PD-1及/或LAG-3活性有害的病症為預期抑制PD-1及/或LAG-3活性減輕病症之症狀及/或進展的病症。
在另一實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之自體免疫疾病或癌症之方法，其包含向個體投與本文所描述之能夠結合LAG-3、PD-1或LAG-3與PD-1兩者之抗體、其功能片段或結合蛋白，且其中該自體免疫疾病或癌症為對免疫療法有反應之疾病。在另一實施例中，使用本發明之方法來治療與免疫療法不相關之自體免疫疾病或癌症。 在另一實施例中，使用本發明之方法來治療癌症，即難治性或復發性惡性疾病。在另一實施例中，在抑制腫瘤細胞之生長或存活之方法中使用本發明之LAG-3抗體、其功能片段或LAG-3/PD-1雙特異性結合蛋白。
在另一實施例中，本發明提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與本文所描述之抗LAG-3抗體、其功能片段或本文所描述之LAG-3/PD-1雙特異性結合蛋白，例如串聯Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)結合蛋白的步驟，其中癌症係選自由以下組成之群中的任一者：黑素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素抗性前列腺腺癌)、胰臟腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、白血病、淋巴瘤、原發性骨癌(例如骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、惡性纖維組織細胞瘤及軟骨肉瘤)、轉移癌及其他贅生性惡性疾病。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體或其抗原結合部分、或雙特異性多價結合蛋白(亦即主要活性成分)及醫藥學上可接受之載劑。包含本發明蛋白質之醫藥組合物用於(但不限於)診斷、偵測或監視病症；治療、處理或改善病症或其一或多種症狀；及/或研究。在一具體實施例中，組合物包含一或多種本發明之抗體或結合蛋白。在另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種本發明之抗體或結合蛋白及一或多種除本發明之抗體或結合蛋白以外之預防劑或治療劑，以用於治療其中PD-1及/或LAG-3活性有害的病症。在一實施例中，預防劑或治療劑已知適用於或已經用於或正用於預防、治療、管理或改善病症或其一或多種症狀。根據此等實施例，組合物可進一步包含載劑、稀釋劑或賦形劑。賦形劑一 般為除主要活性成分以外(亦即除本發明之抗體、其功能部分或結合蛋白以外)，為組合物提供所需特徵之任何化合物或化合物組合。
可將本發明之抗體(包括其功能片段)及結合蛋白併入適合於向個體投與之醫藥組合物中。通常，醫藥組合物包含本發明之抗體或結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似者。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似者，以及其組合。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇或山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑，或緩衝劑，其提高組合物中存在之抗體或結合蛋白之存放期或效果。
將本發明之醫藥組合物調配成與其預期投與途徑相容。投與途徑之實例包括(但不限於)非經腸(例如靜脈內、皮內、皮下、肌肉內)、經口、鼻內(例如吸入)、經皮(例如局部)、腫瘤內、經黏膜及直腸投與。在一具體實施例中，組合物係根據常規程序調配為適合於向人類靜脈內、皮下、肌肉內、經口、鼻內或局部投與之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投與之組合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及諸如利多卡因(lidocaine)(昔羅卡因(xylocaine)、利諾卡因(lignocaine))之局部麻醉劑以減輕注射位點之疼痛。
本發明之方法可包含藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)投與經調配用於非經腸投與之組合物。注射用調配物可以添加有防腐劑之單位劑型(例如，於安瓿或多劑量容器中)呈現。組合物可採用諸如於 油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。可替代地，主要活性成分可呈在使用之前用適合的媒劑(例如，無菌無熱原質水)復原之粉末形式。
本發明之方法可另外包含投與調配為儲槽式製劑之組合物。此類長效調配物可藉由(例如，皮下或肌肉內)植入或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，組合物可用適合的聚合或疏水性材料(例如呈於可接受之油中的乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物(例如微溶性鹽)。
本發明之抗體、其功能片段或結合蛋白亦可與適用於治療多種疾病之一或多種額外治療劑一起投與。本文所描述之抗體、其功能片段及結合蛋白可單獨使用或與額外藥劑(例如治療劑)組合使用，該額外藥劑由熟習此項技術者出於其預期目的進行選擇。舉例而言，該額外藥劑可為此項技術中公認適用於治療藉由本發明之抗體或結合蛋白所治療之疾病或病狀之治療劑。額外藥劑亦可為賦予治療組合物有益屬性之藥劑，例如影響組合物黏度之藥劑。
現已詳細描述了本發明，參考以下實例將更清楚地理解本發明，該等實例僅出於說明之目的包括在內且不意欲限制本發明。
實例 實例1：抗人類PD-1單株抗體之產生
如下產生抗人類PD-1單株抗體：
實例1.1：用人類PD-1抗原進行免疫接種
在第1天，將50μg與弗氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant)混合之重組純化人類PD-1胞外域(ECD)多肽，腹膜內注射至五隻6-8週齡Balb/C小鼠及五隻SJL小鼠中。在第16及26天，將25μg與不完全弗氏佐劑混合之重組純化人類PD-1 ECD免疫原，腹膜內注射至相同小鼠中。在融合3-4天之前，給予具有25μg免疫原之最終加強注射。
實例1.2：融合瘤之產生
根據Kohler及Milstein,Nature,256：495-497(1975)中所描述之確立方法，將自實例1.1中描述之免疫小鼠獲得之脾細胞與SP2/0-Ag-14細胞，以5：1之比率融合，產生融合瘤。將融合產物，以1×105個脾細胞/孔之密度，塗鋪在96孔盤之含有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)之選擇培養基中。在融合七至十天後，觀測到肉眼可見的融合瘤群落。
實例1.3：藉由ELISA及FACS進行PD-1結合活性之評定
藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)，如下分析PD-1特異性抗體之存在：首先，藉由Synbio技術(Suzhou,China)，定製抗人類PD-1、抗食蟹獼猴PD-1及抗鼠類PD-1之合成目標。各目標由與人類IgG Fc區融合之人類、食蟹獼猴或鼠類PD-1蛋白之胞外域(ECD)之多肽區段組成。將編碼各ECD-Fc融合蛋白之合成基因次選殖至pCP表現載體(Chempartner,Shanghai,China)中，且將表現質體短暫轉染至1-3公升培養基中之HEK 293E細胞中且在CO2振盪器中培養七天。用於各融合之 ECD序列闡述於下表1中。各融合蛋白之PD-1 ECD部分為加底線的。
Figure 108128587-A0305-02-0053-8
藉由在4000×g下離心30分鐘來收穫含有重組ECD/Fc融合物之HEK 293E轉染體之上清液，隨後使用MabSelect SuReTM親和力樹脂(GE Healthcare)進行蛋白A純化。將融合產物相對於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH 7.4進行透析，且儲存在-80℃下。
在4℃下，將ELISA盤與50μl以1μg/ml稀釋於PBS緩衝液pH 7.4中之上文所描述之合成人類PD-1 ECD/Fc融合蛋白目標一起培育隔夜。在洗滌緩衝液(含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌盤四次，且在37℃ 下用200μl/孔阻斷緩衝液(含1% BSA之含有0.05% Tween 20的PBS)阻斷1小時。在移除阻斷緩衝液之後，以100μl/孔，向各孔添加融合瘤上清液(或稍後稀釋的純化mAb)，且在37℃下培育1小時。孔用洗滌緩衝液洗滌四次，且以1：5000稀釋小鼠抗人類PD-1抗體特徵之抗小鼠HRP(Sigma)，並以100μl/孔向各孔中添加。在37℃下培育培養盤1小時，且在洗滌緩衝液中洗滌四次。每孔添加100μl四甲基聯苯胺(TMB)發色溶液。在顯色之後，用1N HCl終止反應，且在SpectraMax® M5e讀板儀(Molecular Devices；San Jose，California，US)上量測在450nm下之吸光度。
實例1.4：表現PD-1之細胞株之製備及FACS分析
藉由用具有編碼人類PD-1或食蟹獼猴PD-1之插入基因之pLvx慢病毒質體載體(Clontech)轉染CHO-K1細胞(獲自ATCC)，來產生過度表現人類PD-1或食蟹獼猴PD-1的穩定細胞株。藉由限制稀釋法分離單一純系。對於表現量，藉由FACS分析，使用以重組方式自已知抗體序列(Chempartner)產生之抗PD-1抗體篩選純系，且選擇具有最高PD-1表現之純系用於FACS結合分析及功能分析，如下文所描述。
針對細胞表面目標之結合分析：藉由FACS分析來測定純化抗體與細胞膜人類PD-1或食蟹獼猴PD-1結合的能力。將穩定地表現人類PD-1(CHO-K1-hPD-1細胞)或食蟹獼猴PD-1(CHO-K1-cynoPD-1)之CHO-K1細胞再懸浮於含有2% FBS之PBS(FACS緩衝液)中，且以2×104個細胞/孔接種至96孔圓底培養盤(Corning；目錄號3799)中。向各孔添加產生抗PD-1抗體之融合瘤之上清液，且用AlexaFluor® 488驢抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附二級抗體(Invitrogen；目錄號A-21202)偵測，且隨後 在流式細胞儀上讀取分析培養盤。使用CHO-K1/cynoPD-1細胞測定抗體與食蟹獼猴PD-1之交叉反應性來對表現人類PD-1之目標陽性信號傳導之產融合瘤上清液進行進一步表徵。
實例1.5：受體阻斷分析(RBA)
使用固定的人類PD-1 ECD/Fc作為目標，及以與以上實例1.3中描述之PD-1 ECD/Fc結合蛋白相同的方式製備之PD-L1/Fc與PD-L2/Fc融合蛋白，測試展示PD-1特異活性之上清液之阻斷PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2結合的能力。為了測定含抗體上清液之相對效能，評價其抑制人類PD-1配位體(PD-L1或PD-L2)與人類PD-1蛋白結合之能力。ELISA盤用100μl含50ng/ml之huPD-1/Fc(亦即移植至人類Fc區之N端上之PD-1之胞外域，作為均二聚體回收)之PBS塗覆，且在4℃下培育隔夜。在洗滌緩衝液(含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌盤四次，且在37℃下用200μl/孔阻斷緩衝液(含1% BSA之含有0.05% Tween 20的PBS)阻斷1小時。在移除阻斷緩衝液之後，向各孔添加與含50μl生物素標記的人類PD-L1/Fc(1.0mg/ml最終濃度)之阻斷緩衝液或含50μl生物素標記的人類PD-L2/Fc(最終濃度50μg/ml)之阻斷緩衝液混合的融合瘤上清液(50μl)，隨後在37℃下培育1小時。藉由添加抗生蛋白鏈菌素-HRP(Sigma，目錄號S2468)(100微升/孔之抗生蛋白鏈菌素-HRP，以1：5000稀釋)及在37℃下培育40分鐘來發展信號，且在洗滌緩衝液中洗滌四次。向每孔添加100μl TMB溶液。在顯色之後，用1N HCl終止反應，且量測在450nm下之吸光度。
實例1.6：抗PD-1單株抗體之表現及純化
在FreeStyleTM 293表現培養基(Gibco/Life Technologies)中，於CO2振盪器中，在37℃下培養產生鼠類單株抗體之融合瘤細胞5至7天。經由在4000×g下離心30分鐘移除所有細胞及細胞碎片來收集條件培養基，隨後在純化之前經由0.22μm膜過濾。根據製造商之指南，施加鼠類抗體且與MabSelectTM SuRe(GE Healthcare)蛋白A樹脂管柱結合，用PBS洗滌，用含有20mM檸檬酸鹽、150mM NaCl pH 3.5之緩衝液溶離。溶離材料緊接著用1M Tris pH 8.0中和，且相對於PBS進行透析。一步純化抗體通常具有高於90%純度，如由SEC-HPLC所偵測。藉由量測在280nm下之吸光度，或藉由NanoDropTM microvolume分光光度計(Thermo Scientific)，來測定蛋白質濃度。以等分試樣形式將純化抗體儲存於-80℃冰箱中。
實例2：純化抗PD-1抗體之結合活性 實例2.1：藉由ELISA進行表徵
以與以上實例1.3中所描述相同的方式進行結合ELISA。各純化抗體進行10倍連續稀釋且重複。在阻斷具有含固定的PD-1 ECD/Fc融合蛋白目標之孔之96孔分析培養盤之後，向分析培養盤之各孔添加具有稀釋濃度之純化抗體樣本。連接HRP之抗小鼠IgG抗體(A0168，Sigma)及TMB試劑用於偵測及發展ELISA信號，該等信號在SpectraMax® M5e讀板儀上在450nm波長下讀取。使用GraphPad軟體擬合曲線，且計算EC50。類似地，亦如實例1.5中所描述進行受體阻斷分析(RBA)，其中測定滴定純化抗體及最高阻斷百分比及IC50值。
實例2.2：藉由FACS進行表徵
以2×104個細胞/孔，將上文所描述之CHO-K1/huPD-1或CHO-K1/cynoPD-1細胞饋入至96孔分析圓底分析培養盤(目錄號3799；Corning)中，且用純化抗PD-1抗體染色。用AlexaFluor®驢抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二級抗體(目錄號A21202；Invitrogen)偵測PD-1抗體，且使用流式細胞儀監測細胞螢光。由GraphPad軟體處理資料，且計算EC50值。
此等結合特徵分析之結果顯示於下表2中。
Figure 108128587-A0305-02-0057-9
實例2.3：藉由表面電漿子共振(SPR)進行親和力量測
藉由表面電漿子共振，使用Biacore T200儀(GE Healthcare)，使用 標準程序，來量測純化抗體之結合動力學。簡言之，將山羊抗小鼠IgG Fc多株抗體(Genway)直接固定在生物感測器晶片中，且以5μl/min之流速，將抗體樣本注射在反應基質上。用30μl/min之連續流速，分別測定締合速率常數及解離速率常數kon(M-1s-1)及koff(s-1)。藉由在人類PD-1/Fc蛋白之五個不同濃度下進行動力學結合量測，推導出速率常數。隨後使用式KD=koff/kon，根據動力學速率常數計算抗體與相關目標蛋白質之間的反應的平衡解離常數KD(M)。量測十一種鼠類抗PD-1抗體之親和力，如下表3中所闡述。
Figure 108128587-A0305-02-0058-10
實例3：抗PD-1抗體之功能活動
使用來自一個供體之單核球源性樹突狀細胞及來自另一供體之同種異體CD4+ T細胞，進行混合淋巴球反應(MLR)分析。自健康供體採集全血樣本，且使用Ficoll-Pague梯度離心自全血分離出PBMC。在第1天，分離來自一個供體之PBMC，且用無血清RPMI 1640，以1×106個細胞/毫升進行稀釋。以3毫升/孔，將稀釋的PBMC接種至6孔組織培養盤中，且培育3小時。移除上清液，且洗掉未附著細胞。用含250U/ml IL-4及500U/ml GM-CSF之含有10% FBS的RPMI 1640，使附著單核球極化成樹突 狀細胞。在第4天，培養基用含有IL-4及GM-CSF之新鮮培養基置換。在第7天，採集不成熟樹突狀細胞，且用含1μg/ml細菌脂多醣(LPS)(Sigma)之具有10% FBS的RPMI 1640處理額外24小時以使其成熟。在第8天，藉由負選擇，自來自另一供體之PBMC分離CD4+ T細胞，且調節至2×106個細胞/毫升的最終濃度。在37℃下，成熟樹突狀細胞用絲裂黴素C處理1.5小時，隨後樹突狀細胞用PBS洗滌且調節至1×106個細胞/毫升的最終濃度。以100微升/孔將CD4+ T細胞(應答細胞)添加至96孔盤中，且用在稀釋濃度下之測試抗體預處理30分鐘。以100微升/孔，將成熟樹突狀細胞(刺激細胞)添加至各孔中。各孔之最終體積為200μl。在37℃下培育混合淋巴球。在72小時之後量測IL-2產量(參見圖1A及圖1B)；在120小時量測IFN-γ(參見圖2A及圖2B)。
實例4：抗PD-1 mAb之選殖及序列分析
用TRIzol試劑(目錄號15596；Invitrogen)，自>5×106個細胞分離各融合瘤純系之總RNA。藉由SuperScriptTM III第一股合成超混合液(目錄號18080；Invitrogen)合成cDNA，且用作小鼠Ig-引子組(目錄號69831-3；Novagen)之PCR模板。藉由用SYBRTM安全DNA凝膠染色(Invitrogen)之1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產物。根據製造商之說明書，具有正確大小之DNA片段用NucleoSpin®凝膠及PCR Clean-up(目錄號740609；Macherey-Nagel GmbH)純化，且獨立地將其次選殖至pMD18-T載體(Sino Biological Inc.)中。選擇來自各轉化之十五個群落，且藉由DNA定序分析插入片段之序列。若對於VH及VL，存在至少8個匹配共有序列，則確認序列。藉由序列同源性比對分析鼠類抗PD-1 mAb可變區之 蛋白質序列，且列於表4中。基於Kabat編號鑑別互補決定區(CDR)，且在下表4中以加底線形式呈現。
Figure 108128587-A0305-02-0060-11
Figure 108128587-A0305-02-0061-12
實例5：鼠類抗PD-1抗體之人類化
基於人類PD-1結合活性，食蟹獼猴PD-1交叉反應類似於人類，RBA分析中之幾乎100%阻斷活性、MLR中之功能活性及如藉由Biacore所量測之至少奈莫耳級親和力，選擇四種抗PD-1抗體mAb709、mAb713、mAb703及mAb719以用於人類化。
實例5.1：鼠類抗體mAb709之人類化
mAb709可變區基因用於產生人類化抗體。在此過程之第一步驟中，將mAb709之VH及VL之胺基酸序列與人類Ig V-基因序列之可用資料庫進行比較，以尋找總體最佳匹配的人類生殖系Ig V-基因序列。另外，將VH或VL之構架4區段與J-區資料庫進行比較，以尋找分別與鼠類VH及VL區具有最高同源性之人類構架。對於輕鏈，最接近的人類V-基因匹配為O12基因；且對於重鏈，最接近的人類匹配為VH3-7基因。隨後，設計人類化可變域序列，其中將mAb709輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3移植至O12基因之構架序列上，其中JK4構架4序列在CDR-L3之後；且將mAb709重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3移植至VH3-7之構架序列上，其中JH1構架4序列在CDR-H3之後。隨後產生mAb709之3維Fv模型，以判定是否存在其中小鼠胺基酸對於支持環結構或VH/VL界面而言關鍵的任何構架位置。人類化序列中之此等殘基應在相同位置處回復突變成小鼠殘基以保留親和力/活性。在輕鏈之情況下，在位置71處Phe回復突變成Tyr(F71Y，Kabat編號)、在位置49處Tyr回復突變成Ser(Y49S， Kabat編號)、在位置3處Gln回復突變成Val(Q3V，Kabat編號)、在位置46處Leu回復突變成Val(L46V，Kabat編號)、在位置63處Ser回復突變成Thr(S63T，Kabat編號)、在位置43處Ala回復突變成Ser(A43S，Kabat編號)及在位置44處Pro回復突變成Leu(P44L，Kabat編號)，鑑別為所需回復突變。在重鏈之情況下，在位置98處Arg突變成Gly(R94G，Kabat編號)及在位置44處Gly突變成Arg(G44R，Kabat編號)，鑑別為所需回復突變。構築含有此等回復突變中之一或多者之經突變可變域。參見下表5。(回復突變的構架胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0062-116
線指示；來自初始親本抗體之鼠類CDR為加底線的。)
Figure 108128587-A0305-02-0062-13
以合成方式產生人類化VH及VK基因，且隨後分別選殖至 含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中。(參見下表6。)
Figure 108128587-A0305-02-0063-14
人類化VH及人類化VK鏈之配對產生15種人類化抗體，稱為HumAb709-1至HumAb709-15(表7)。亦產生具有親本小鼠VH/VL及人類恆定區序列之嵌合抗體(mAb709c)作為親和力比較之陽性對照。表現所有重組mAb且進行純化。
Figure 108128587-A0305-02-0063-15
藉由結合ELISA及基於細胞之RBA對所有15種人類化抗體及嵌合抗體(mAb709c)進行表徵。對於基於細胞之RBA，向預阻斷的96孔 圓底培養盤中添加2×105個細胞/孔之CHO-K1-huPD1細胞，且在洗滌之後，向各孔中添加具有在0.064nM至200nM範圍內之稀釋濃度的50μl抗體。接下來，添加50μl 60μg/ml生物素標記的PD-L1/Fc或生物素標記的PD-L2/Fc蛋白。在平緩混合且在4℃下培育之後，洗滌細胞且用Alexa FluorTM 488抗生蛋白鏈菌素溶液(1：1000，ThermoFisher Scientific；目錄號S32354)進行染色。藉由FACS讀出信號，且藉由GraphPad軟體擬合曲線。計算之IC50值顯示於下表8中。藉由表面電漿子共振量測，使用Biacore T200儀，進一步分析具有正(低)IC50值(亦即針對至少一種PD-1配位體低於約1.0nM)之抗體的結合親和力。簡言之，將山羊抗人類IgG Fc多株抗體直接固定在生物感測器晶片中，且以5μl/min之流速，將抗PD-1人類化抗體或嵌合抗體樣本注射在反應基質上。藉由在30μl/min之連續流速下，在人類PD-1-His蛋白之五個不同濃度下進行動力學結合量測，來分別測定締合速率常數及解離速率常數kon(M-1s-1)及koff(s-1)。使用式KD=koff/kon，根據動力學速率常數計算抗體與相關目標蛋白質之間的反應的平衡解離常數KD(M)。mAb709人類化抗PD-1衍生物中之五者之親和力顯示於表8中。HumAb709-8具有極少回復突變，同時最大程度維持嵌合mAb709c上之親本可變域之親和力。
Figure 108128587-A0305-02-0064-16
Figure 108128587-A0305-02-0065-17
實例5.2：鼠類抗體mAb713之人類化
抗PD-1 mAb713之可變區基因用於產生人類化抗體。將mAb713之VH及VK之胺基酸序列與人類Ig V-基因序列之可用資料庫進行比較，以尋找總體最佳匹配的人類生殖系Ig V-基因序列。另外，將VH或VL之構架4區段與J-區資料庫進行比較，以尋找分別與鼠類VH及VL區具有最高同源性之構架。對於輕鏈，最接近的人類V-基因匹配為O18基因；且對於重鏈，最接近的人類匹配為VH3-48基因。隨後，設計人類化可變域序列，其中將mAb713輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3移植至O18基因之構架序列上，其中JK4構架4序列在CDR-L3之後；且將mAb713重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3移植至VH3-48之構架序列上，其中JH6構架4序列在CDR-H3之後。隨後產生mAb709之3維Fv模型，以判定是否存在其中小鼠胺基酸對於支持環結構或VH/VL界面而言關鍵的任何構架位置。人類化序列中之此等殘基應在相同位置處回復突變成小鼠殘基以保留親和力/活性。在輕鏈之情況下，在位置71處Phe回復突變成Tyr(F71Y，Kabat編號)、在位置49處Tyr回復突變成Ser(Y49S，Kabat編號)及在位置69處Thr回復突變成Lys(T69K，Kabat編號)，鑑別為所需回復突變。在重鏈之情況下，在位置98處Arg突變成Lys(R94K，Kabat編號)、在位置29處Phe回復突變成Ser(F29S，Kabat編號)及在位置49處Ser回復突變成Ala(S49A，Kabat編號)，鑑別為所需回復突變。構築含有此等回復突變中之 一或多者之經突變可變域。參見下表9。(回復突變的構架胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0066-128
Figure 108128587-A0305-02-0066-129
線指示；來自初始親本抗體之鼠類CDR為加底線的。)
Figure 108128587-A0305-02-0066-18
以合成方式產生人類化VH及VK基因，且隨後獨立地選殖至含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中(參見表6，見上文)。人類VH變體與人類VK變體之配對產生16種人類化抗體，稱為HumAb713-1至HumAb713-16(表10)。亦產生具有親本小鼠VH/VL及人類恆定序列之嵌合抗體(mAb713c)作為親和力比較之陽性對照。
Figure 108128587-A0305-02-0066-19
Figure 108128587-A0305-02-0067-20
藉由結合ELISA、基於細胞之RBA及Biacore親和力測試，對所有16種人類化抗體及嵌合抗體(mAb713c)進行表徵。結果概述於表11中。
Figure 108128587-A0305-02-0067-21
HumAb713-7具有極少的回復突變，維持嵌合抗體mAb713c之親本可變域之親和力特徵。在如實例3中所描述之MLR分析中驗證mAb713人類化抗體之功能活性。如圖5中所見，在MLR中， HumAb713-7呈現與嵌合抗體mAb713c相當的活性，與其保留的結合特性一致。
實例5.3：鼠類抗體mAb703之人類化
按照與實例5.1及5.2中之程序相同的程序，選擇鼠類抗PD-1抗體mAb703且進行人類化。構築人類化可變域(一些含有一或多個回復突變)，且胺基酸序列闡述於下表12中。(回復突變的構架胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0068-130
Figure 108128587-A0305-02-0068-131
線指示；來自初始親本抗體之鼠類CDR為加底線的。)
Figure 108128587-A0305-02-0068-22
Figure 108128587-A0305-02-0069-23
以合成方式產生人類化VH及VK基因，且隨後獨立地選殖至含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中(參見表6，見上文)。人類VH變體與人類VK變體之配對產生25種人類化抗體，稱為HumAb703-1至HumAb703-25(表13)。亦產生具有親本小鼠VH/VL及人類恆定序列之嵌合抗體作為親和力比較之陽性對照。
Figure 108128587-A0305-02-0069-24
藉由結合ELISA及Biacore親和力測試，對所有25種人類化抗體及嵌合抗體(mAb703c)進行表徵。陽性結合劑之親和力結果概述於表14中。
Figure 108128587-A0305-02-0070-25
在如實例3中所描述進行之MLR分析中驗證人類化mAb703抗體之功能活性，如圖2A及圖3中所示。
實例5.4：鼠類抗體mAb719之人類化
按照與實例5.1及5.2中之程序相同的程序，選擇鼠類抗PD-1抗體mAb719且進行人類化。構築人類化可變域(一些含有一或多個回復突變)，且胺基酸序列闡述於下表15中。(回復突變的構架胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0070-132
Figure 108128587-A0305-02-0070-133
線指示；來自初始親本抗體之鼠類CDR為加底線的。)另外，製備CDR-H2中之Asp→Ala取代及CDR-H3中之Ser→Ala取代，以避免重組抗體常見之可能的Asp異構化。(參見表15中之mAb719 VH.1E及mAb719 VH.1F序列。)
Figure 108128587-A0305-02-0070-26
Figure 108128587-A0305-02-0071-27
以合成方式產生人類化VH及VK基因，且隨後獨立地選殖至含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中(參見表6，見上文)。人類VH變體與人類VK變體之配對產生21種人類化抗體，稱為HumAb719-1至HumAb719-21(表16)。亦產生具有親本小鼠VH/VL及人類恆定序列之嵌合抗體作為親和力比較之陽性對照。表現所有重組mAb且進行純化。
Figure 108128587-A0305-02-0071-28
藉由結合ELISA及親和力測定，使用Octet® RED96生物層干涉法系統(Pall FortéBio LLC)，使用具有固定的人類PD-1/Fc作為抗體目標之生物感測器，對所有21種人類化抗體及嵌合抗體(mAb719c)進行表徵。藉由在抗體之五個不同濃度下進行動力學結合量測，推導出速率常數。由於二價結合目標，親和力顯示高於先前Biacore測試。陽性結合劑之親和力結果概述於表17中。
Figure 108128587-A0305-02-0072-29
在MLR分析中驗證人類化mAb719抗體之功能活性，如圖2B及圖3中所示。
實例6：前導抗PD-1抗體之藥物動力學特性
在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中評定HumAb709-8及HumAb713-7之藥物動力學特性。以5mg/kg之單一靜脈內劑量，向雄性SD大鼠投與抗體。經28天時段，在不同時間點採集血清樣本，其中在0、5、15及30分鐘；1、2、4、8及24小時；及2、4、7、10、14、21及28天，經由尾部靜脈連續出血進行取樣，且藉由一般ELISA進行分析。簡言之，在4℃下，ELISA盤用125奈克/孔之山羊抗人類IgG Fc抗體(Rockland，目錄號：609-101-017)塗覆隔夜，用1X PBS/1% BSA/0.05% Tween-20/0.05% ProClinTM 300阻斷。所有血清樣本首先在阻斷緩衝液中稀釋20倍。在5%合併大鼠血清中進行額外稀釋，且在37℃下在培養盤上 培育60分鐘。用共軛的抗人類IgG(Fab片段)過氧化酶(Sigma；目錄號A0293)進行偵測，且藉助於標準曲線，使用四參數對數擬合，測定濃度。藉由非分室模型，使用WinNonlin軟體(Pharsight Corporation，Mountain View，Calif.)，來測定藥物動力學參數之值。如此等結果(表18)所表明，HumAb09-8及HumAb13-7之特性為穩定的。
Figure 108128587-A0305-02-0073-30
實例7：抗LAG-3單株抗體之產生
藉由融合瘤融合產生抗LAG-3單株抗體(mAb)。
實例7.1：免疫接種、融合瘤融合及選殖。
以與上文關於抗PD-1抗體產生(實例1)所描述相同的方式進行Balb/C小鼠之免疫接種，不同之處在於使用人類LAG-3 D1-D2/鼠類Fc均二聚體作為免疫原。以2-3週間隔，對免疫動物進行增強免疫接種2-4次。在最終增強免疫接種三天之後，分離來自免疫小鼠之脾細胞，且使用標準技術，將其與鼠類骨髓瘤細胞株SP2/0融合。
實例7.2：抗LAG-3抗體之鑑別及特徵
藉由Synbio技術(Suzhou,China)，定製抗人類LAG-3及抗食蟹獼猴LAG-3之合成目標。各目標由與人類IgG Fc區融合之人類或食蟹獼猴LAG-3蛋白之胞外域之多肽區段組成。將編碼各LAG-3 ECD/Fc融合蛋白 之合成基因次選殖至pCP表現載體(Chempartner,Shanghai,China)中，且將表現質體短暫轉染至1-3公升培養基中之HEK 293E細胞中且在CO2振盪器中培養七天。用於各融合之ECD序列闡述於下表19中。各融合蛋白之LAG-3 ECD部分為加底線的。
Figure 108128587-A0305-02-0074-32
藉由ELISA對融合瘤純系之上清液進行初步篩選。簡言 之，將50微升/孔之含1μg/ml人類LAG-3 ECD/Fc之NaHCO3直接塗覆在96孔盤之各孔中隔夜。培養盤用1X PBST，300微升/孔洗滌3次。在用含1% BSA之PBST以250微升/孔阻斷且在室溫下培育1小時之後，以50微升/孔添加融合瘤上清液，且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，以100微升/孔添加連接HRP的山羊抗小鼠IgG Fc二級抗體(目錄號A0168，Sigma)，且在室溫下培育培養盤1小時。以100微升/孔，TMB試劑(InnoReagents)用於偵測及發展ELISA信號15分鐘，且反應用1N HCl終止。培養盤用讀板儀(SpectraMax® M5e，Molecular Devices，USA)在450nm波長下讀取。藉由FACS分析，使用類似於上文實例1.4之方法，進一步驗證ELISA陽性抗體產生者純系，不同之處在於使用表現人類LAG-3或食蟹獼猴LAG-3之穩定HEK 293F細胞株。選擇產生LAG-3結合活性之融合瘤，且在受體阻斷分析(RBA)中對其進一步表徵。
實例7.3：受體阻斷分析(RBA)
測試展示LAG-3特異活性之上清液之阻斷LAG-3受體與MHC II類結合的能力。Raji人類B細胞淋巴母細胞表現高水準之MCH II類，且用作上文所描述之LAG-3 ECD/Fc蛋白的結合目標。簡言之，收穫Raji細胞且將其再懸浮於FACS緩衝液中並塗鋪在96孔盤(2×105個細胞/孔)中。將抗LAG-3融合瘤上清液與可溶性LAG-3 ECD/Fc混合，且以100微升/孔之最終體積向各孔添加該混合物。在向細胞添加混合物之後，在室溫下培育培養盤30分鐘。在用PBS洗滌兩次之後，將細胞與抗人類IgG Alexa Fluor® 488二級抗體一起在4℃下培育1小時，用PBS洗滌兩次，隨後在流式細胞儀上量測螢光。
實例7.4：抗LAG-3單株抗體之表現及純化
在FreeStyleTM 293表現培養基(Gibco/Life Technologies)中，於CO2振盪器中，在37℃下培養產生鼠類單株抗體之融合瘤細胞5至7天。經由在4000×g下離心30分鐘移除所有細胞及細胞碎片來收集條件培養基，隨後在純化之前經由0.22μm膜過濾。根據製造商之指南，施加鼠類抗體且與MabSelectTM SuRe(GE Healthcare)蛋白A樹脂管柱結合，用PBS洗滌，用含有20mM檸檬酸鹽、150mM NaCl pH 3.5之緩衝液溶離。溶離材料緊接著用1M Tris pH 8.0中和，且相對於PBS進行透析。一步純化抗體通常具有高於90%純度，如由SEC-HPLC所偵測。藉由量測在280nm下之吸光度，或藉由NanoDropTM microvolume分光光度計(Thermo Scientific)，來測定蛋白質濃度。以等分試樣形式將純化抗體儲存於-80℃冰箱中。
實例7.5：純化抗LAG-3抗體之結合活性 藉由ELISA進行表徵
以與以上實例7.2中所描述相同的方式進行結合ELISA。將各純化抗體進行10倍連續稀釋。在阻斷具有含固定的LAG-3 ECD/Fc融合蛋白目標之孔之96孔分析培養盤之後，向分析培養盤之各孔添加具有稀釋濃度之純化抗體樣本。連接HRP之抗小鼠IgG抗體(A0168，Sigma)及TMB試劑用於偵測及發展ELISA信號，該等信號在SpectraMax® M5e讀板儀上在450nm波長下讀取。使用GraphPad軟體擬合曲線，且計算EC50值。類似地， 亦如實例7.3中所描述進行RBA，其中測定滴定純化抗體及最大抑制百分比及IC50值。
藉由FACS進行表徵
使用類似於上文實例1.4之方法進行FACS分析，不同之處在於使用表現人類LAG-3或食蟹獼猴LAG-3之穩定HEK 293F細胞株。以2×104個細胞/孔，將LAG-3表現細胞饋入至96孔分析圓底分析培養盤(目錄號3799；Corning)中，且用純化抗LAG-3抗體進行染色。用AlexaFluor®驢抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二級抗體(目錄號A21202；Invitrogen)偵測LAG-3抗體，且使用流式細胞儀監測細胞螢光。由GraphPad軟體處理資料，且計算EC50值。
此等結合特徵分析之結果顯示於下表20中。
Figure 108128587-A0305-02-0077-33
在此表中，「N/A」表示未量測到結合活性。
實例7.6：藉由RBA及抗原依賴性活化分析進行表徵
亦在RBA中以與實例7.3中所描述相同的方式測試純化抗LAG-3抗體。亦在抗原特異性T細胞活化分析中如下測試抗體：藉由ChemPartner(Shanghai，CN)定製產生表現huLAG-3之鼠類T融合瘤細胞株。來自相同小鼠細胞株之小鼠脾細胞用作效應細胞。表現huLAG-3受體蛋白之融合瘤能夠與MHC II類陽性小鼠脾細胞結合，經由II類之接合具有抑制作用。該分析測試抗LAG-3抗體介導之抑制作用之反轉，如藉由IL-2之產量增加所量測。自6-8週齡雌性C57BL/6小鼠收穫小鼠脾細胞，且根據製造商之說明書，使用紅血球裂解緩衝液(Sigma-Aldrich；R7757)裂解紅血球。接下來，將50μl T融合瘤-huLAG-3細胞(2×106個細胞/毫升)接種在96孔培養盤之各孔中，且隨後以50微升/孔添加一系列含抗LAG-3單株抗體之溶液且在37℃下培育30min。將小鼠脾細胞(4×106個細胞/毫升)與抗原(20μg/ml)混合，且在37℃下培育30min。將混合物(100微升/孔)添加至已經接種有T融合瘤-huLAG-3細胞及抗LAG-3 mAb之各孔中。培養抗體、T融合瘤-huLAG-3細胞、小鼠脾細胞及抗原之混合物3天。在72小時之後，抽取100μl細胞培養物上清液且稀釋成適當濃度，以用於根據製造商之方案，使用R&D Systems ELISA套組執行小鼠IL-2定量ELISA。使用ELISA-Endpoint-TMB & HRP方案，在SpectraMax M5讀板儀(Molecular Devices)上讀取ELISA培養盤。RBA及抗原依賴性活化分析結果顯示於表21中。
Figure 108128587-A0305-02-0079-34
實例7.7：藉由Biacore進行結合親和力測定
對於在ELISA及FACS分析中具有高結合親和力以及強效功能活性之抗體，基於使用Biacore表面電漿子共振進行之實時結合反應之結合動力學常數量測來判定結合親和力。簡言之，使用Biacore T200系統，利用抗體捕捉方法，進行抗體對於抗原之結合分析。根據製造商之說明書，將抗小鼠IgG Fc抗體固定在CM5感測器晶片上。注射測試抗LAG-3鼠類單株抗體，且由固定的抗小鼠IgG Fc捕捉。隨後，獨立地注射連續濃度之LAG-3抗原，且記錄各抗原分析物濃度之結合概況。分析溫度為25℃，且締合時間及解離時間分別為180秒及1200秒。使用Biacore T200評價軟體1.0，根據1：1結合模型，擬合Biacore資料，以計算締合(kon)速率常數及解離(koff)速率常數，且根據此等計算，判定平衡解離常數(KD)。四種所選擇抗LAG-3抗體之親和力(KD)顯示於下表22中。
Figure 108128587-A0305-02-0080-35
實例7.8：在PBMC分析中，抗LAG-3抗體功能之比較
為了進一步驗證人類PBMC中之抗LAG-3抗體功能，使用超級抗原金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)腸毒素B(SEB)進行細菌毒素刺激分析。SEB為用於藉由刺激人類T細胞而活化免疫系統(此轉而引起過度產生若干細胞介素)之已知超級抗原。自來自健康人類供體之血液樣本分離PBMC。以2×105個細胞/孔，將PBMC接種至96孔分析培養盤中，隨後將各種抗LAG-3測試抗體添加至培養盤中且在37℃下與PBMC一起培育30min。添加SEB溶液至10ng/ml之最終濃度。隨後培育培養盤96小時。在此培育結束時，採集100μl細胞培養物上清液，且使用ELISA IL-2偵測套組(R&D Systems；目錄號DY202)來量測IL-2產量。結果顯示於圖6中。
實例8：鼠類抗LAG-3抗體可變區之定序
為了擴增重鏈及輕鏈可變區，用TRIzol® RNA分離試劑(Invitrogen；目錄號15596)，自>5×106個細胞分離所選擇融合瘤純系之總RNA。藉由SuperScriptTM III第一股合成超混合液(Invitrogen；目錄號18080)合成cDNA，且用作小鼠Ig-引子組(Novagen；目錄號69831-3)之PCR模板。藉由用SYBRTM安全DNA凝膠染色(Invitrogen)之1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產物。根據製造商之說明書，用NucleoSpin®凝膠及 PCR Clean-up(Macherey-Nagel GmbH；目錄號740609)純化正確大小之DNA片段，且獨立地將其次選殖至pMD18-T選殖載體中。選擇來自各轉化之十五個群落，且藉由DNA定序分析插入片段之序列。若對於VH及VL，存在至少8個匹配共有序列，則確認序列。藉由序列同源性比對分析之七種鼠類mAb之可變區序列列於表23中。基於Kabat編號，鑑別互補決定區(CDR)。
Figure 108128587-A0305-02-0081-37
Figure 108128587-A0305-02-0082-38
實例9：鼠類抗LAG-3抗體mAb747之人類化
基於抗原結合活性、食蟹獼猴LAG-3蛋白交叉反應、功能活性及親和力，選擇mAb747用於人類化。
實例9.1：mAb747之人類化
抗LAG-3 mAb747可變區基因用於產生人類化mAb。在此過程之第一步驟中，將mAb747之VH及VK之胺基酸序列(SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62)與人類Ig V-基因序列之可用資料庫進行比較，以尋找總體最佳匹配的人類生殖系Ig V-基因序列。另外，將VH或VL之構架4序列與J-區資料庫進行比較，以尋找與鼠類VH及VL區分別具有最高同源性之人類構架。對於輕鏈，最接近的人類V-基因匹配為A1基因；且對於重鏈，最接近的人類匹配為VH1-f基因。隨後，設計人類化可變域序列，其中將mAb747輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3移植至A1基因之構架序列上，其中JK4構架4序列在CDR-L3之後；且將mAb747重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列移植至VH1-f之構架序列上，其中JH1構架4序列在CDR-H3之後。隨後產生mAb747之3維Fv模型，以測定是否存在其中小鼠胺基酸對於支持環結構或VH/VL界面而言關鍵的任何構架位置。人類化序列中之此類殘基應在相同位置處回復突變成小鼠殘基以保留親和力/活性。指示針對mAb747 VH及VL之若干所需回復突變，且構築三種替代性VH及VL設計，如下表24中所示。(回復突變的構架胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0082-134
Figure 108128587-A0305-02-0083-135
線指示；來自初始親本抗體之鼠類CDR為加底線的。)
Figure 108128587-A0305-02-0083-39
以合成方式產生人類化VH及VK基因，且隨後分別選殖至含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中。人類VH與人類VK之配對產生9種人類化抗LAG-3抗體，稱為HumAb747-34至-42(表25)。亦產生具有親本小鼠VH/VL及人類恆定序列之嵌合抗體(mAb747c)作為親和力比較之陽性對照。
Figure 108128587-A0305-02-0083-40
根據解離速率常數(koff)，對所有9種人類化抗體(表25)及具有親本鼠類VH與VL域之嵌合抗體(mAb747c)進行排名。簡言之，藉由 Octet® RED96生物層干涉法(Pall FortéBio LLC)，對抗體進行親和力及結合動力學表徵。在100nM濃度下，抗體經抗HIgG Fc捕捉(AHC)生物感測器(Pall)捕捉30秒。隨後，將感測器浸漬至操作緩衝液(1X pH7.2 PBS，0.05% Tween 20，0.1% BSA)中60秒，以檢查基線。藉由將感測器浸漬至單一濃度之重組人類LAG-3-his蛋白(Novoprotein)中，來量測結合。在將感測器浸漬至操作緩衝液中1200秒之後，解離。使用FortéBio資料分析軟體(Pall)，將締合曲線及解離曲線擬合於1：1朗繆爾結合模型。結果顯示於表26中。
Figure 108128587-A0305-02-0084-41
HumAb747-42顯示其解離速率常數僅比具有親本可變域之嵌合對照的高2.2倍。
實例10：PD-1/LAG-3串聯Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)之產生
構築識別人類PD-1及人類LAG-3兩者之雙特異性串聯Fab免疫球蛋白結合蛋白。
對於以下表中所描述之各FIT-Ig構築體，顯示在三組分多肽鏈中之每一者之表現載體中使用的信號序列。在以下所描述之FIT-Ig蛋白之產生中使用MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO：79)或MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：84)，但許多替代性信號肽將為熟習此項技術者已知的且亦可進行使用。應理解，此類信號序列將在表現宿主細胞分泌多肽期間裂解，且因此信號序列不為最終FIT-Ig結合蛋白 之一部分。
實例10.1：FIT107-1-2a
使用來自親本抗體mAb709(鼠類抗PD-1，參見表4，見上文)及mAb746(鼠類抗LAG-3，參見表23，見上文)之免疫球蛋白域之編碼序列，構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-2a。FIT-Ig FIT107-1-2a為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：mAb709之VL-CL直接與mAb746之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：mAb709之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：mAb746之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-2a多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表27中。
Figure 108128587-A0305-02-0085-43
Figure 108128587-A0305-02-0086-44
實例10.2：FIT107-1-2b
構築識別人類PD-1及人類LAG-3兩者之另一雙特異性串聯Fab免疫 球蛋白結合蛋白。此PD-1/LAG-3 FIT-Ig稱為FIT107-1-2b。FIT107-1-2b結合蛋白之構築使用來自親本鼠類抗體mAb709及mAb746之免疫球蛋白域之編碼序列，但在此FIT-Ig構築體中，LAG-3結合域係在N端(外部)位置，且PD-1結合域係在內部位置LAG-3結合區之VL-CL域的融合C端。FIT-Ig FIT107-1-2b為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：mAb746之VL-CL直接與mAb709之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：mAb746之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：mAb709之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-2b多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表28中：
Figure 108128587-A0305-02-0087-45
Figure 108128587-A0305-02-0088-46
實例10.3：FIT107-1-5a
使用來自親本人類化抗體HumAb709-8(抗PD-1，SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：25)及HumAb747-42(SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：77)之免疫球蛋白域之編碼序列，構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-5a。 FIT-Ig FIT107-1-5a為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb709-8之VL-CL直接與HumAb747-42之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb709-8之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747-42之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-5a多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表29中：
Figure 108128587-A0305-02-0089-47
Figure 108128587-A0305-02-0090-48
實例10.4：FIT107-1-5b
構築識別人類PD-1及人類LAG-3兩者之另一雙特異性串聯Fab免疫球蛋白結合蛋白。此PD-1/LAG-3 FIT-Ig稱為FIT107-1-5b。FIT107-1-5b結合蛋白之構築使用來自親本人類化抗體HumAb709-8及HumAb747-42之免疫球蛋白域之編碼序列，但在此FIT-Ig構築體中，LAG-3結合域係在N端(外部)位置，且PD-1結合域係在內部位置，N端LAG-3結合區之VL-CL域的融合C端。FIT-Ig FIT107-1-5b為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747-42之VL-CL直接與HumAb709-8之 VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：mAb747-42之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb709-8之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-5b多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表30中：
Figure 108128587-A0305-02-0091-49
Figure 108128587-A0305-02-0092-50
實例10.5：FIT-Ig之表現及純化
四種PD-1/LAG-3 FIT-Ig構築體FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a及FIT107-1-5b為一種類型之雙特異性多價結合蛋白，被稱為一般在WO 2015/103072及WO 2017/136820中描述的串聯Fab免疫球蛋白(或FIT-Ig)。藉由在經所有三條鏈之表現載體轉染之哺乳動物宿主細胞中共表現三組分多肽鏈，產生結合蛋白。結合蛋白之設計需要長多肽鏈(鏈1號)，以與短多肽鏈(鏈2號及3號)兩者配對，形成功能串聯Fab部分，且亦設計長鏈以經由Fc區(鉸鏈-CH2-CH3)進行二聚合，使得形成呈現四個完整Fab結合位點的六鏈結合蛋白。在結合蛋白FIT107-1-2a及FIT107-1-5a中，N端或「外部」Fab結合位點結合PD-1，且相鄰「內部」Fab結合位 點結合LAG-3。藉由視具體情況而定可分別將VL-CLmAb709或VL-CLHumAb709-8直接融合在其VH-CH1mAb746或VH-CH1HumAb747-42之N端的C端，FIT107-1-2a及FIT107-1-5a之外部Fab片段(抗PD-1)，僅經由長鏈(鏈1號)，與內部Fab片段(抗LAG-3)接合，而不使用連接免疫球蛋白域的連接子。類似地，藉由視具體情況而定可分別將VL-CLmAb746或VL-CLmAb747-42直接融合在其VH-CH1mAb709或VH-CH1mAb709-8之N端的C端，FIT107-1-2b及FIT107-1-5b之外部Fab片段(抗LAG-3)，僅經由長鏈(鏈1號)，與內部Fab片段(抗PD-1)接合，而不使用連接免疫球蛋白域的連接子。
使用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉染劑，在人胎腎293E細胞中短暫共表現編碼各FIT-Ig(FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a及FIT107-1-5b)之多肽鏈1號、2號及3號的表現載體。簡言之，將FreeStyleTM 293表現培養基中之DNA與PEI混合，其中DNA與PEI之最終濃度比率為1：2，在室溫下培育15-20分鐘，且隨後以60μg DNA/120ml培養物，將其添加至HEK293E細胞(1.0-1.2×106個/毫升，細胞生存力>95%)。在振盪器中培養6-24小時之後，在以125rpm/min振盪之情況下，在37℃、8% CO2下，以5%之最終濃度，向經轉染細胞中添加蛋白腖。在第6-第7天，藉由離心及過濾收穫上清液，且根據製造商之說明書，使用蛋白A層析(Pierce，Rockford，IL)來純化FIT-Ig蛋白。
對於表現FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a及FIT107-1-5b，使用1：3：3之鏈1號：鏈2號：鏈3號莫耳比，轉染編碼鏈1號、2號及3號之表現的DNA。此係設計用於使得待表現之短鏈2號及3號相對於長鏈(鏈1號)更呈比例，此轉而將降低長鏈(鏈1號)上不與對應輕鏈配對， 且因此將不能形成功能Fab片段的VL-CL及VH-CH1區段的存在。藉由蛋白A層析，來純化FIT-Ig蛋白表現產物。藉由尺寸排阻層析(SEC)，來分析純化FIT-Ig之組成及純度。將含純化FIT-Ig之PBS施加在TSKgel SuperSW3000,300×4.6mm管柱(TOSOH)上。使用在280nm及214nm下之UV偵測，HPLC儀器Model U3000(DIONEX)用於進行SEC。參見下表31。
Figure 108128587-A0305-02-0094-51
FIT107-1-2b、-5a及-5b之較低單體部分含量指示一些可能聚集。
實例11：FIT-Ig針對目標抗原之結合親和力
藉由Biacore SPR量測，來測定FIT-Ig與PD-1及LAG-3目標結合之動力學。FIT107-1-2a及FIT107-1-2b針對目標抗原PDL-1及LAG-3兩者之結合親和力顯示於下表32中。
Figure 108128587-A0305-02-0094-52
Figure 108128587-A0305-02-0095-53
實例12：FIT-Ig特異性及功能測定
在PBMC活化分析中，使用葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素B(SEB)作為超級抗原(參見實例7.8)，測試FIT107-1-2a結合蛋白之抗PD1與抗LAG-3雙特異性及生物活性。簡言之，自健康供體分離PBMC，隨後以50微升/孔，2×105個細胞/孔，將其接種至96孔盤中。將測試結合蛋白(亦即FIT107-1-2a，市售抗PD-1及抗LAG-3單株抗體之組合，或單株抗PD-1抗體)添加至培養盤中，且在37℃下，與PBMC一起培育30min。添加SEB溶液至10ng/ml之最終濃度。培育培養盤96小時，隨後採集100μl細胞培養物上清液，且使用ELISA IL-2偵測套組(R&D Systems；目錄號DY202)來量測IL-2產量。結果顯示於圖7中。與抗PD-1抗體單獨或抗LAG-3與抗PD-1抗體之混合物相比，FIT107-1-2a雙特異性FIT-Ig蛋白能夠增強T細胞活化，如由IL-2產量所指出。
另外，以與實例3中所描述的相似之方式進行混合淋巴球反應(MLR)分析，以進一步驗證FIT107-1-2a之抗PD-1及抗LAG-3功能。混合淋巴球反應為當混合在一起時發生在兩個同種異體淋巴球群體之間的離體細胞免疫反應。回應於兩個細胞群體(其被稱為應答細胞及刺激細胞)之間的主要組織相容抗原(MHC I類及II類)差異，同種異體淋巴球經歷母細胞轉化、DNA合成及細胞增殖。在用於測試FIT107-1-2a之MLR中，在第1天，自健康供體純化PBMC，且分離CD14+單核球。將單核球接種至6孔盤中，且在RPMI 1640培養基加10% FBS中，用35ng/ml IL-4(R&D Systems)及50ng/ml GM-CSF(R&D Systems)處理。在4天之後，更換培養基。在第7天，採集分化為不成熟樹突狀細胞之單核球，且在成熟化培 養基中用20ng/ml TNF-α(R&D Systems)、50μg/ml聚I：C(Sigma)、35ng/ml IL-4及50ng/ml GM-CSF另外處理兩天。對於MLR共培養分析，不含血清之X-VIVOTM 15培養基用於避免抗體效力中之血清干擾。對96孔U形底培養盤以1×105個細胞/孔接種同種異體CD4+ T細胞(應答細胞)，且用測試結合蛋白(亦即FIT107-1-2a，市售抗PD-1與抗LAG-3單株抗體之組合，或單株抗PD-1抗體)預處理30min。隨後，以1×104個細胞/孔，將成熟樹突狀細胞(刺激細胞)接種至各孔中，且與應答細胞一起共培養五天，此時採集100μl上清液且藉由ELISA來量測IFN-γ產量。結果顯示於圖8中。與抗PD-1與抗LAG-3抗體之組合或抗PD-1抗體單獨之16.84nM的EC50值相比，FIT-Ig雙特異性結合蛋白顯示0.5084nM的EC50。因此，在MLR中，在比單一抗體或抗體組合低30倍之濃度下，FIT-Ig結合蛋白增強IFN-γ(γ干擾素)產量。
實例13：mAb747之新批次人類化
抗LAG-3 mAb747可變區基因用於產生其他抗LAG-3人類化mAb。在此過程之第一步驟中，將mAb747之VH及VK之胺基酸序列(SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62)與人類Ig V-基因序列之可用資料庫進行比較，以尋找最佳匹配的人類生殖系Ig V-基因序列。另外，將VH或VL之構架4(FW4)序列與J-區資料庫進行比較，以尋找與鼠類VH及VL區分別具有最高同源性之人類構架。對於輕鏈，最佳的人類V-基因匹配為A30基因；且對於重鏈，最佳的人類匹配為VH1-69-2基因。隨後，設計人類化可變域序列，其中將mAb747輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3移植至A30基因之構架序列上，其中JK4構架4序列在CDR-L3之後；且將mAb747重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列移植至VH1-69-2之構架序列上，其 中JH6構架4序列在CDR-H3之後。隨後產生mAb747之3維Fv模型，以測定是否存在其中小鼠胺基酸對於支持環結構或VH/VL界面而言關鍵的任何構架位置。人類化序列中之此類殘基應在相同位置處回復突變成小鼠殘基以保留親和力/活性。指示針對mAb747 VH及VL之若干所需回復突變，且構築三種替代性VH及VL設計，如下表33中所示。(回復突變的構架胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0097-136
指示；CDR根據Kabat編號系統加底線，不同之處在於VH CDR1用ABM編號系統進行定義。)
Figure 108128587-A0305-02-0097-54
以合成方式產生人類化VH及VK基因，且隨後分別選殖至 含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中。人類VH與人類VK之配對產生9種人類化抗LAG-3抗體，稱為HumAb747-43至HumAb747-60(表34)。亦使用具有上文所描述之親本小鼠VH/VL及人類恆定序列之嵌合抗體(mAb747c)作為親和力比較之陽性對照。
Figure 108128587-A0305-02-0098-55
根據解離速率常數(koff)，對所有18種人類化抗體(表34)及具有親本鼠類VH與VL域之嵌合抗體(mAb747c)進行排名。簡言之，藉由Octet® RED96生物層干涉法(Pall FortéBio LLC)，對抗體進行親和力及結合動力學表徵。在100nM濃度下，抗體經抗HIgG Fc捕捉(AHC)生物感測器(Pall)捕捉30秒。隨後，將感測器浸漬至操作緩衝液(1X pH7.2 PBS，0.05% Tween 20，0.1% BSA)中60秒，以檢查基線。藉由將感測器浸漬至單一濃度之重組人類LAG-3-his蛋白(Novoprotein)中，來量測結合。在將感測器浸漬至操作緩衝液中1200秒之後，解離。使用FortéBio資料分析軟體(Pall)，將締合曲線及解離曲線擬合於1：1朗繆爾結合模型。結 果顯示於表35中。在各測試組中，抗體之解離率能夠與mAb747c進行比較。藉由抗體之解離速率與其組之mAb747c之解離速率之比，計算解離速率比率，且全部一起進行比較。比率愈低，抗體之親和力愈高。
Figure 108128587-A0305-02-0099-56
HumAb747-60顯示其解離速率常數僅比具有親本可變域之嵌合對照高的1.5倍。
為了進一步驗證人類PBMC中之抗LAG-3抗體功能，以上文實例7.8中描述之方式，使用超級抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)進行細菌毒素刺激分析。使用PerkinElmer IL-2偵測套組(PerkinElmer；目錄號TRF1221M)，來量測IL-2產量。藉由阻斷LAG-3信號路徑，HumAb747-60能夠增強SEB刺激的PBMC之IL-2分泌。結果顯示於圖9中。因此，證實HumAb747-60起作用，且選擇其用於進一步工程改造。
實例14：HumAb747-60之親和力成熟 實例14.1：親和力成熟文庫構築及篩選
儘管HumAb747-60顯示其解離速率常數僅比嵌合對照mAb747c之解離速率常數高1.5倍，但PBMC-SEB分析結果指示，HumAb747-60具有略微較弱的功能活性。為了進一步提高親和力，藉由基於HumAb747-39(參見表24、25)之親和力成熟，對CDR殘基(ABM編號系統)進行最佳化。設計且構築兩個噬菌體庫。一個設計成突變CDR-L1、CDR-L3及CDR-H3(ABM編號)，其中之每一者具有一個隨機突變殘基。另一個設計成突變CDR-L2、CDR-H1及CDR-H2(ABM編號)，其中之每一者具有一個隨機突變殘基。
使用報導於Journal of Immunological Methods,201：35-55(1997)中之方法，構築噬菌體呈現文庫。簡言之，用引入突變之簡併引子擴增VH-CH1及VL-CL，且隨後依序將其選殖至噬菌質體載體之兩個多選殖位點(MCS)中。隨後，將噬菌質體載體電轉化至TG1(目錄號60502-1，Lucigen)中，分別產生顯示高序列多樣性之大致1.2×108個純系的文庫。用M13K07輔助噬菌體(目錄號N0315S)，以大致1：20比率(細胞：噬菌體)，修復文庫。用重組人類LAG-3蛋白進行噬菌體呈現文庫選擇，隨後進行洗滌步驟。亦在噬菌質體載體中構築HumAb747-39之Fab片段作為陽性對照。使用所選擇噬菌體來感染宿主細胞。藉由ELISA篩選來自單一純系之Fab上清液之結合能力。簡言之，藉由在30℃下與1mM IPTG一起培養隔夜，來製備單一純系之Fab上清液。將含2μg/ml人類LAG-3蛋白之100 μL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)直接塗覆在96孔盤之各孔中。連接HRP的抗c-myc抗體(目錄號Ab1261，Abcam)及TMB試劑用於偵測及發展ELISA信號，該等信號藉由讀板儀(SpectraMax® Plus 384吸光度讀板儀，Molecular Devices)在450nm波長下讀出。
挑取篩選ELISA中之陽性純系用於定序。考慮到篩選ELISA中之序列冗餘及信號強度，選擇以下7個純系用於進一步評價。VH/VL序列顯示於表36中。(藉由親和力成熟鑑別之經突變胺基酸殘基由
Figure 108128587-A0305-02-0101-127
指示；CDR根據Kabat編號系統加底線。)
Figure 108128587-A0305-02-0101-57
Figure 108128587-A0305-02-0102-58
實例14.2：陽性純系之IgG轉化及特徵
將七個Fab純系轉化成全IgG蛋白。簡言之，以合成方式產生VH及VL基因，且隨後分別選殖至含有人類IgG1及人類κ恆定域之編碼序列之載體中。獨立地將重鏈及同源輕鏈質體共轉染至HEK 293E細胞中。在轉染細胞培養物大致六天之後，收穫上清液且經受蛋白A親和層析。藉由Octet® RED96生物層干涉法(參見實例9.1，見上文)，對純化抗體之親和力進行排名。結果顯示於表37中。
Figure 108128587-A0305-02-0102-59
相較於HumAb747-39，D1-70-IgG及B2-53-IgG顯示解離速率常數具有極少增加，反映大部分親和力在突變之後增加。因此，將D1-70-IgG及B2-53-IgG中之突變引入至HumAb747-60(其為在人類化之 後的最佳候選者)之序列中。
實例14.3：其他工程改造抗體之產生及特徵
藉由親和力成熟過程鑑別之D1-70中之突變為VH域中之D26G、E53R及E58M，以及VL域中之S56L(殘基位置如藉由Kabat編號系統所測定)。藉由親和力成熟過程鑑別之B2-53中之突變為VH域中之D26G及E58V，以及VL域中之T53A(殘基位置如藉由Kabat編號所測定)。將此等突變單獨地或組合地併入HumAb747-60之VH/VL序列中。
在HumAb747-60之CDR-H2中存在NG圖案，其可由於去胺基作用反應而在製造期間產生異源性，因此亦評價NG突變成NA之突變。經計算VH域中之G55A突變不干擾HumAb747-60之活性同時破壞NG圖案。包括上文所論述之突變之抗體變體之胺基酸序列顯示於表38中。(CDR根據Kabat編號加底線。)
Figure 108128587-A0305-02-0103-60
以合成方式產生工程改造VH及VK基因，且隨後分別選殖至含有人類IgG1及人類κ恆定域之載體中。人類VH與人類VK之配對產生13種工程改造抗LAG-3抗體，稱為HumAb747V-61至HumAb747V-73(表39)。亦使用具有親本小鼠VH/VL及人類恆定序列之嵌合抗體(mAb747c)作為親和力比較之陽性對照。
Figure 108128587-A0305-02-0104-61
根據解離速率常數(koff)，以與上文實例9.1中所描述的相同方式，對所有13種人類化抗體(表39)及具有親本鼠類VH及VL域之嵌合抗LAG-3抗體mAb747c進行排名。結果顯示於表40中。在各測試組中，抗體之解離率能夠與mAb747c進行比較。藉由抗體之解離速率與其組之mAb747c之解離速率之比，計算解離速率比率，且全部一起進行比較。比率愈低，抗體之親和力愈高。
Figure 108128587-A0305-02-0104-62
Figure 108128587-A0305-02-0105-63
基於HumAb747-60，與mAb747c之解離速率相比，具有在親和力成熟之後採用之CDR突變之大部分抗體顯示解離速率提高，從而預測親和力提高。HumAb747V-61具有與mAb747c類似的解離速率，此指示，VH G55A胺基酸取代並不干擾親和力。在基於細胞之功能分析中，進一步評價解離速率比率低於其測試組中之mAb747c之解離速率比的60%的抗體。
在PBMC活化分析中，使用葡萄球菌腸毒素B(SEB)作為超級抗原，測試抗LAG-3活性。簡言之，以2×105個細胞/孔，將PBMC接種至96孔盤中。將測試蛋白質(抗LAG-3單株抗體)添加至培養盤中，且在37℃下與PBMC一起培育30min。添加SEB溶液至10ng/ml之最終濃度。培育培養盤96小時，隨後採集100μl細胞培養物上清液，且使用PerkinElmer IL-2偵測套組(PerkinElmer；目錄號TRF1221M)來量測IL-2產量。結果顯示於圖10中。結果顯示，工程改造抗體變體可藉由阻斷LAG-3介導的信號傳導，而增強來自SEB刺激的PBMC的IL-2產量。
基於PBMC-SEB分析結果，HumAb747V-67、HumAb747V-72及HumAb747V-73表明優良的LAG-3阻斷活性；因此，使用此等三種抗體來產生靶向LAG-3以及PD-1的FIT-Ig結合蛋白。
實例15：使用新穎抗LAG-3抗體序列，產生PD-1/LAG-3 FIT-Ig
按照上文實例10中描述之程序，如上文所描述產生之抗LAG-3抗體HumAb747V-67、HumAb747V-72及HumAb747V-73，以及兩種抗PD-1抗體HumAb709-8(參見表5及7，見上文)及HumAb713-7(參見表9及10，見上文)，用於產生FIT-Ig結合蛋白。抗LAG-3 Fab部分之所有VH域之序列設計包括G55A突變。
實例15.1：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-6a-1之產生
使用來自親本抗體mAb709-8(人類化抗PD-1，參見表5及6，見上文)及HumAb747V-67(人類化抗LAG-3，參見表38及39，見上文)之免疫球蛋白域之編碼序列，構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-6a-1。FIT-Ig FIT107-1-6a-1為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb709-8之VL-CL直接與HumAb747V-67之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb709-8之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747V-676之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-6a-1多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表41中。
Figure 108128587-A0305-02-0106-64
Figure 108128587-A0305-02-0107-65
Figure 108128587-A0305-02-0108-67
實例15.2：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-6b-1之產生
構築識別人類PD-1及人類LAG-3兩者之另一雙特異性串聯Fab免疫球蛋白結合蛋白。此PD-1/LAG-3 FIT-Ig稱為FIT107-1-6b-1。FIT107-1-6b-1結合蛋白之構築使用來自親本抗體HumAb747V-67(抗LAG-3)及HumAb709-8(抗PD-1)之免疫球蛋白域的編碼序列。此FIT-Ig構築體呈現在N端(外部)位置的LAG-3結合域及在LAG-3結合區之VL-CL域之融合C端之內部位置的PD-1結合域。FIT-Ig FIT107-1-6b-1為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747V-67之VL-CL直接與HumAb709-8之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb747V-67之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb709-8之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-6b-1多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表42中：
Figure 108128587-A0305-02-0108-68
Figure 108128587-A0305-02-0109-69
Figure 108128587-A0305-02-0110-70
實例15.3：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-6a-2之產生
使用來自親本抗體HumAb709-8(人類化抗PD-1)及HumAb747V-72(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-6a-2。FIT-Ig FIT107-1-6a-2為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb709-8之VL-CL直接與HumAb747V-72之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb709-8之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747V-72之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-6a-2多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表43中。
Figure 108128587-A0305-02-0110-71
Figure 108128587-A0305-02-0111-72
實例15.4：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-6b-2之產生
使用來自親本抗體HumAb709-8(人類化抗PD-1)及HumAb747V-72(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-6b-2。FIT-Ig FIT107-1-6b-2為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747V-72之VL-CL直接與HumAb709-8之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb747V-72之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb709-8之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-6b-2多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表44中。
Figure 108128587-A0305-02-0112-73
Figure 108128587-A0305-02-0113-74
實例15.5：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-6a-3之產生
使用來自親本抗體HumAb709-8(人類化抗PD-1)及HumAb747V-73(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-6a-3。FIT-Ig FIT107-1-6a-3為包含三組分多肽鏈之六 聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb709-8之VL-CL直接與HumAb747V-73之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb709-8之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747V-73之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-6a-3多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表45中。
Figure 108128587-A0305-02-0114-75
Figure 108128587-A0305-02-0115-76
實例15.6：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-6b-3之產生
使用來自親本抗體HumAb709-8(人類化抗PD-1)及HumAb747V-73(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-6b-3。FIT-Ig FIT107-1-6b-3為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747V-73之VL-CL直接與HumAb709-8之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3 融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb747V-73之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb709-8之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-6b-3多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表46中。
Figure 108128587-A0305-02-0116-77
Figure 108128587-A0305-02-0117-78
實例15.7：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-7a-1之產生
使用來自親本抗體HumAb713-7(人類化抗PD-1；參見表9及10，見上文)及HumAb747V-67(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-7a-1。FIT-Ig FIT107-1-7a-1為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb713-7之VL-CL直接與HumAb747V-67之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb713-7之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747V-67之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-7a-1多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表47中。
Figure 108128587-A0305-02-0118-79
Figure 108128587-A0305-02-0119-80
實例15.8：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-7b-1之產生
使用來自親本抗體HumAb713-7(人類化抗PD-1)及HumAb747V-67(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-7b-1。FIT-Ig FIT107-1-7b-1為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747V-67之VL-CL直接與HumAb713-7之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb747V-67之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb713-7之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-7b-1多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表48中。
Figure 108128587-A0305-02-0120-81
Figure 108128587-A0305-02-0121-82
實例15.9：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-7a-2之產生
使用來自親本抗體HumAb713-7(人類化抗PD-1)及HumAb747V-72(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-7a-2。FIT-Ig FIT107-1-7a-2為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb713-7之VL-CL直接與HumAb747V-72之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1(參見表6，見上文)之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb713-7之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747V-72之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-7a-2多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表49中。
Figure 108128587-A0305-02-0121-83
Figure 108128587-A0305-02-0122-84
Figure 108128587-A0305-02-0123-85
實例15.10：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-7b-2之產生
使用來自親本抗體HumAb713-7(人類化抗PD-1)及HumAb747V-72(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-7b-2。FIT-Ig FIT107-1-7b-2為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747V-72之VL-CL直接與HumAb713-7之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb747V-72之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb713-7之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-7b-2多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表50中。
Figure 108128587-A0305-02-0123-86
Figure 108128587-A0305-02-0124-87
實例15.11：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-7a-3之產生
使用來自親本抗體HumAb713-7(人類化抗PD-1)及HumAb747V-73(人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-7a-3。FIT-Ig FIT107-1-7a-3為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb713-7之VL-CL直接與HumAb747V-73之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb713-7之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb747V-73之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-7a-3多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表51中。
Figure 108128587-A0305-02-0125-88
Figure 108128587-A0305-02-0126-89
實例15.12：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合蛋白FIT107-1-7b-3之產生
使用來自親本抗體HumAb713-7(人類化抗PD-1)及HumAb747V-73 (人類化抗LAG-3)之免疫球蛋白域之編碼序列，來構築PD-1/LAG-3 FIT-Ig，稱為FIT107-1-7b-3。FIT-Ig FIT107-1-7b-3為包含三組分多肽鏈之六聚體：多肽鏈1號具有域式：HumAb747V-73之VL-CL直接與HumAb713-7之VH-CH1融合，該VH-CH1直接與突變人類恆定IgG1之鉸鏈-CH2-CH3融合；多肽鏈2號具有域式：HumAb747V-73之VH-CH1；及多肽鏈3號具有域式：HumAb713-7之輕鏈(VL-CL)。
三條所表現FIT107-1-7b-3多肽鏈之胺基酸序列顯示於下表52中。
Figure 108128587-A0305-02-0127-90
Figure 108128587-A0305-02-0128-91
實例16：新穎FIT-Ig蛋白之特徵 實例16.1：表現及SEC分析
以與上文實例10.5中所描述相同的方式，來表現上文所描述的12種FIT-Ig結合蛋白(表41-52)，且藉由蛋白A層析來純化。藉由尺寸排阻層析(SEC)，來分析純化FIT-Ig之組成及純度。將含純化FIT-Ig之PBS施加在 TSKgel SuperSW3000,300×4.6mm管柱(TOSOH)上。DIONEXTM UltiMate 3000 HPLC儀(Thermo Scientific)用於使用在280nm及214nm下進行UV偵測來進行SEC。參見下表53。
Figure 108128587-A0305-02-0129-93
具有較低單體部分含量(<80%)之FIT-Ig蛋白排除在進一步表徵外。
實例16.2：功能分析
如實例12中所描述，在PBMC活化分析中，使用葡萄球菌腸毒素B(SEB)作為超級抗原，測試PD-1/LAG-3 FIT-Ig活性。結果顯示在圖11中。結果顯示，所有所測試FIT-Ig變體均可增強SEB刺激的PBMC進行IL-2分泌。在某種程度上，在FIT107-1-7b-2及FIT107-1-7b-3之最高劑量中，該增強反轉，因此此等兩種FIT-Ig蛋白不優先作為前導分子。
實例16.3：結合活性
藉由生物層干涉法，使用Octet® RED96系統(Pall FortéBio LLC)，來測定FIT-Ig與PD-1及LAG-3目標結合之動力學。針對目標抗原PD-1及 LAG-3兩者之結合親和力顯示於下表54中。所有FIT-Ig蛋白均保留針對huPD-1及huLAG-3兩者之親和力。針對食蟹獼猴抗原測試之所有FIT-Ig蛋白亦顯示與食蟹獼猴抗原之交叉反應性。
Figure 108128587-A0305-02-0130-94
實例16.4：大鼠藥物動力學資料
基於在一步純化後之純度、瞬時轉染中之表現效價、所保留之結合親和力以及在PBMC-SEB分析中之功能活性，選擇FIT107-1-7b-1作為前導分子。在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中評定FIT107-1-7b-1之藥物 動力學特性。以5mg/kg之單一靜脈內劑量，向雄性SD大鼠投與FIT-Ig蛋白。經28天時段，在不同時間點採集血清樣本，其中在0、5、15及30分鐘；1、2、4、8及24小時；及2、4、7、10、14、21及28天，經由尾部靜脈連續出血進行取樣，且藉由一般ELISA進行分析。簡言之，在4℃下，ELISA盤用125奈克/孔之山羊抗人類IgG Fc抗體(Rockland，目錄號：609-101-017)塗覆隔夜，用1X PBS/1% BSA/0.05% Tween-20/0.05% ProClinTM 300阻斷。所有血清樣本首先在阻斷緩衝液中稀釋20倍。在5%合併大鼠血清中進行額外稀釋，且在37℃下在培養盤上培育60分鐘。用山羊Fab特異性抗人類IgG-過氧化酶共軛抗體(Sigma-Aldrich；目錄號A0293)進行偵測，且藉助於標準曲線，使用四參數對數擬合來測定濃度。藉由非分室模型，使用WinNonlin軟體(Pharsight Corporation，Mountain View，Calif.)，來測定藥物動力學參數之值。如藉由表55中顯示之此等結果所表明，FIT107-1-7b-1之特性在活體內為穩定的。
Figure 108128587-A0305-02-0131-95
實例16.5：FGL1受體阻斷分析(RBA)
近年來報導，血纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)為獨立於MHC II類之主要LAG-3功能配位體(Wang J.等人，Cell,176(1)：334-47(2019))。藉由抗體阻斷FGL1/LAG-3相互作用刺激腫瘤免疫性。為了評價抗LAG-3抗體或FIT-Ig之阻斷活性，用杜爾貝科氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水將FGL1(Wuhan USCN，目錄號RPD022Hu01)稀釋至5μg/ml，且將100μl添加至 96孔盤中並在4℃下培育隔夜。培養盤用300微升/孔PBS+TWEEN 20(PBST)洗滌三次。添加HumAb747V-67、FIT107-1-7b-1、hIgG(工作濃度：100nM，10nM，1nM及0.1nM)及1μg/ml生物素標記的LAG-3(AcroBiosystem，目錄號H82E5)，且在室溫下培育2小時。培養盤用300微升/孔PBST洗滌三次，隨後使用VARIOSKANTM LUX微量盤讀取器(Thermo Scientific)使用ELISA-Endpoint-TMB/HRP方案讀取。結果顯示於圖12中。結果顯示，FIT107-1-7b-1 FIT-Ig及其親本抗LAG-3抗體HumAb747V-67兩者均可阻斷人類LAG-3與FGL1蛋白結合。
實例16.6：FIT107-1-7b-1蛋白之初代細胞結合活性。
前述分析表明，PD-1/LAG-3 FIT-Ig蛋白可結合重組抗原蛋白質。為了進一步評價FIT107-1-7b-1之細胞表面結合能力，親本抗體HumAb713-7、HumAb747V-67及雙特異性FIT-Ig FIT107-1-7b-1用生物素試劑(Sigma，目錄號S3259)進行生物素標記。對於未刺激之PBMC，以5×106個細胞/毫升將PBMC再懸浮。對於PD-1抗體(HumAb713-7)或LAG-3抗體(HumAb747V-67)測試，添加100μg/ml抗體，且在37℃下單獨地培育反應混合物40分鐘，隨後用FACS緩衝液洗滌兩次。隨後，將100μl 5×105個PBMC/孔(未處理組，抗PD-1抗體處理組及抗LAG-3抗體處理組)接種至96孔盤之孔中。添加生物素標記的HumAb713-7、HumAb747V-67及FIT107-1-7b-1，且在37℃下培育40分鐘(最終工作濃度以100nM為起始，3倍連續稀釋)，隨後用FACS緩衝液洗滌兩次。添加FITC-抗生蛋白鏈菌素及BV421-抗人類CD3抗體，且在4℃下培育分析培養盤30分鐘，隨後用FACS緩衝液洗滌兩次。用Beckman Coulter CytoFlex流式細胞儀分析培 養盤。PBMC刺激組用抗-CD3加抗CD28抗體刺激72小時，以誘導T細胞上之PD-1及LAG-3表現。用與未刺激PBMC實驗相同的分組策略(未處理組、抗PD-1抗體處理組及抗LAG-3抗體處理組)，測試刺激PBMC上的HumAb713-7、HumAb747V-67及FIT107-1-7b-1結合。藉由FACS，研究CD3-T細胞上之測試抗體之結合。結果顯示於圖13中。結果顯示，FIT107-7b-1呈現指示與T細胞上之PD-1及LAG-3目標兩者結合之獨特結合模式。
本申請案通篇中所引用之所有引用參考文獻(包括文獻參照案、專利、專利申請案及網站)之內容在此明確地以全文引用的方式併入本文中。除非另外指示，否則本發明之實踐將使用此項技術中熟知的免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術。
本發明可在不脫離上文所描述之本發明之基本特徵之情況下以其他特定形式來實施。因此，前述實施例應視為說明性而非限制本文所描述之本發明。本發明之範疇藉由所附申請專利範圍指定。
<110> 中國大陸商上海岸邁生物科技有限公司(Shanghai EpimAb Biotherapeutics Co.,Ltd.)
<120> 針對LAG-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性PD-1/LAG-3結合蛋白
<140> 108128587
<141> 2019-08-12
<150> PCT/CN2019/085164
<151> 2019-04-30
<160> 227
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類PD-1/Fc融合蛋白
<400> 1
Figure 108128587-A0305-02-0134-96
Figure 108128587-A0305-02-0135-97
Figure 108128587-A0305-02-0136-98
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴PD-1/Fc融合蛋白
<400> 2
Figure 108128587-A0305-02-0136-99
Figure 108128587-A0305-02-0137-100
Figure 108128587-A0305-02-0138-101
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠PD-1/Fc融合蛋白
<400> 3
Figure 108128587-A0305-02-0138-102
Figure 108128587-A0305-02-0139-103
Figure 108128587-A0305-02-0140-104
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb701
<400> 4
Figure 108128587-A0305-02-0140-105
Figure 108128587-A0305-02-0141-106
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb701
<400> 5
Figure 108128587-A0305-02-0141-107
Figure 108128587-A0305-02-0142-108
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb703
<400> 6
Figure 108128587-A0305-02-0142-109
Figure 108128587-A0305-02-0143-110
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb703
<400> 7
Figure 108128587-A0305-02-0143-111
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb709
<400> 8
Figure 108128587-A0305-02-0144-112
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb709
<400> 9
Figure 108128587-A0305-02-0144-113
Figure 108128587-A0305-02-0145-114
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb713
<400> 10
Figure 108128587-A0305-02-0145-115
Figure 108128587-A0305-02-0146-116
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb713
<400> 11
Figure 108128587-A0305-02-0146-117
Figure 108128587-A0305-02-0147-118
<210> 12
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb714
<400> 12
Figure 108128587-A0305-02-0147-119
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb714
<400> 13
Figure 108128587-A0305-02-0148-120
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb715
<400> 14
Figure 108128587-A0305-02-0148-121
Figure 108128587-A0305-02-0149-122
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL mAb715
<400> 15
Figure 108128587-A0305-02-0149-123
Figure 108128587-A0305-02-0150-124
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb718
<400> 16
Figure 108128587-A0305-02-0150-125
Figure 108128587-A0305-02-0151-126
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb718
<400> 17
Figure 108128587-A0305-02-0151-127
<210> 18
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb719
<400> 18
Figure 108128587-A0305-02-0152-128
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb719
<400> 19
Figure 108128587-A0305-02-0152-129
Figure 108128587-A0305-02-0153-130
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb709 VH.1
<400> 20
Figure 108128587-A0305-02-0153-131
Figure 108128587-A0305-02-0154-132
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb709 VH.1A
<400> 21
Figure 108128587-A0305-02-0154-133
Figure 108128587-A0305-02-0155-134
<210> 22
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb709 VH.1B
<400> 22
Figure 108128587-A0305-02-0155-135
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb709 VK.1A
<400> 23
Figure 108128587-A0305-02-0156-136
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb709 VK.1B
<400> 24
Figure 108128587-A0305-02-0156-137
Figure 108128587-A0305-02-0157-138
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb709 VK.1C
<400> 25
Figure 108128587-A0305-02-0157-139
Figure 108128587-A0305-02-0158-140
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb709 VK.1D
<400> 26
Figure 108128587-A0305-02-0158-141
Figure 108128587-A0305-02-0159-142
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb709 VK.1E
<400> 27
Figure 108128587-A0305-02-0159-143
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Figure 108128587-A0305-02-0159-144
Figure 108128587-A0305-02-0160-145
Figure 108128587-A0305-02-0161-146
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Figure 108128587-A0305-02-0161-147
Figure 108128587-A0305-02-0162-148
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb713 VH.1
<400> 30
Figure 108128587-A0305-02-0162-149
Figure 108128587-A0305-02-0163-150
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb713 VH.1A
<400> 31
Figure 108128587-A0305-02-0163-151
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb713 VH.1B
<400> 32
Figure 108128587-A0305-02-0164-152
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb713 VH.1C
<400> 33
Figure 108128587-A0305-02-0165-153
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb713 VK.1
<400> 34
Figure 108128587-A0305-02-0165-155
Figure 108128587-A0305-02-0166-156
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb713 VK.1A
<400> 35
Figure 108128587-A0305-02-0166-157
Figure 108128587-A0305-02-0167-158
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb713 VK.1B
<400> 36
Figure 108128587-A0305-02-0167-159
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb713 VK.1C
<400> 37
Figure 108128587-A0305-02-0168-160
<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb703 VH.1A
<400> 38
Figure 108128587-A0305-02-0168-161
Figure 108128587-A0305-02-0169-162
<210> 39
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb703 VH.1B
<400> 39
Figure 108128587-A0305-02-0169-163
Figure 108128587-A0305-02-0170-164
<210> 40
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb703 VH.1C
<400> 40
Figure 108128587-A0305-02-0170-165
Figure 108128587-A0305-02-0171-166
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb703 VH.1D
<400> 41
Figure 108128587-A0305-02-0171-167
Figure 108128587-A0305-02-0172-168
<210> 42
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb703 VH.1E
<400> 42
Figure 108128587-A0305-02-0172-169
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb703 VK.1
<400> 43
Figure 108128587-A0305-02-0173-170
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb703 VK.1A
<400> 44
Figure 108128587-A0305-02-0173-171
Figure 108128587-A0305-02-0174-172
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb703 VK.1B
<400> 45
Figure 108128587-A0305-02-0174-173
Figure 108128587-A0305-02-0175-174
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb703 VK.1C
<400> 46
Figure 108128587-A0305-02-0175-175
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb703 VK.1D
<400> 47
Figure 108128587-A0305-02-0176-176
<210> 48
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1
<400> 48
Figure 108128587-A0305-02-0176-177
Figure 108128587-A0305-02-0177-178
<210> 49
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1A
<400> 49
Figure 108128587-A0305-02-0177-179
Figure 108128587-A0305-02-0178-180
<210> 50
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1B
<400> 50
Figure 108128587-A0305-02-0178-181
Figure 108128587-A0305-02-0179-182
<210> 51
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1C
<400> 51
Figure 108128587-A0305-02-0179-183
Figure 108128587-A0305-02-0180-184
<210> 52
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1D
<400> 52
Figure 108128587-A0305-02-0180-185
<210> 53
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1E
<400> 53
Figure 108128587-A0305-02-0181-186
<210> 54
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb719 VH.1F
<400> 54
Figure 108128587-A0305-02-0181-187
Figure 108128587-A0305-02-0182-190
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb719 VK.1
<400> 55
Figure 108128587-A0305-02-0182-191
Figure 108128587-A0305-02-0183-192
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb719 VK.1A
<400> 56
Figure 108128587-A0305-02-0183-193
Figure 108128587-A0305-02-0184-194
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb719 VK.1B
<400> 57
Figure 108128587-A0305-02-0184-195
<210> 58
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類LAG-3/Fc融合蛋白
<400> 58
Figure 108128587-A0305-02-0185-196
Figure 108128587-A0305-02-0186-197
Figure 108128587-A0305-02-0187-198
Figure 108128587-A0305-02-0188-199
<210> 59
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴LAG-3/Fc融合蛋白
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 59
Figure 108128587-A0305-02-0188-200
Figure 108128587-A0305-02-0189-201
Figure 108128587-A0305-02-0190-202
Figure 108128587-A0305-02-0191-203
Figure 108128587-A0305-02-0192-204
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb746及VH mAb747
<400> 60
Figure 108128587-A0305-02-0192-205
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb746
<400> 61
Figure 108128587-A0305-02-0193-206
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb747
<400> 62
Figure 108128587-A0305-02-0193-207
Figure 108128587-A0305-02-0194-208
<210> 63
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb742
<400> 63
Figure 108128587-A0305-02-0194-209
Figure 108128587-A0305-02-0195-210
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb742
<400> 64
Figure 108128587-A0305-02-0195-211
Figure 108128587-A0305-02-0196-212
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb744
<400> 65
Figure 108128587-A0305-02-0196-213
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb744
<400> 66
Figure 108128587-A0305-02-0197-214
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb748
<400> 67
Figure 108128587-A0305-02-0197-215
Figure 108128587-A0305-02-0198-216
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb748及VL mAb750
<400> 68
Figure 108128587-A0305-02-0198-217
Figure 108128587-A0305-02-0199-218
<210> 69
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb749
<400> 69
Figure 108128587-A0305-02-0199-219
Figure 108128587-A0305-02-0200-220
<210> 70
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VL mAb749
<400> 70
Figure 108128587-A0305-02-0200-221
<210> 71
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> VH mAb750
<400> 71
Figure 108128587-A0305-02-0201-222
<210> 72
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb747 VH.2A
<400> 72
Figure 108128587-A0305-02-0201-223
Figure 108128587-A0305-02-0202-224
<210> 73
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb747 VH.2B
<400> 73
Figure 108128587-A0305-02-0202-225
Figure 108128587-A0305-02-0203-226
<210> 74
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb747 VH.1G
<400> 74
Figure 108128587-A0305-02-0203-227
Figure 108128587-A0305-02-0204-228
<210> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb747 VK.1E
<400> 75
Figure 108128587-A0305-02-0204-229
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK mAb747 VK.2A
<400> 76
Figure 108128587-A0305-02-0205-230
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Vk mAb747 VK.2B
<400> 77
Figure 108128587-A0305-02-0205-231
Figure 108128587-A0305-02-0206-232
<210> 78
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-2a FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 78
Figure 108128587-A0305-02-0206-233
Figure 108128587-A0305-02-0207-234
Figure 108128587-A0305-02-0208-235
Figure 108128587-A0305-02-0209-236
Figure 108128587-A0305-02-0210-237
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 79
Figure 108128587-A0305-02-0210-238
<210> 80
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb709之VL-CL
<400> 80
Figure 108128587-A0305-02-0210-239
Figure 108128587-A0305-02-0211-240
<210> 81
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb746之VH-CH1
<400> 81
Figure 108128587-A0305-02-0211-241
Figure 108128587-A0305-02-0212-242
Figure 108128587-A0305-02-0213-243
<210> 82
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1之鉸鏈-CH2-CH3
<400> 82
Figure 108128587-A0305-02-0213-244
Figure 108128587-A0305-02-0214-245
<210> 83
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-2a FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 83
Figure 108128587-A0305-02-0214-246
Figure 108128587-A0305-02-0215-247
<210> 84
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 84
Figure 108128587-A0305-02-0216-248
<210> 85
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類mAb709之VH-CH1
<400> 85
Figure 108128587-A0305-02-0216-249
Figure 108128587-A0305-02-0217-250
<210> 86
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-2a FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 86
Figure 108128587-A0305-02-0217-251
Figure 108128587-A0305-02-0218-252
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類mAb746之VL-CL
<400> 87
Figure 108128587-A0305-02-0219-253
Figure 108128587-A0305-02-0220-254
<210> 88
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-2b FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 88
Figure 108128587-A0305-02-0220-255
Figure 108128587-A0305-02-0221-256
Figure 108128587-A0305-02-0222-257
Figure 108128587-A0305-02-0223-258
<210> 89
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb746之VL-CL
<400> 89
Figure 108128587-A0305-02-0224-259
Figure 108128587-A0305-02-0225-260
<210> 90
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb709之VH-CH1
<400> 90
Figure 108128587-A0305-02-0225-261
Figure 108128587-A0305-02-0226-262
<210> 91
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-2b FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 91
Figure 108128587-A0305-02-0226-263
Figure 108128587-A0305-02-0227-264
<210> 92
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb746之VH-CH1
<400> 92
Figure 108128587-A0305-02-0228-265
Figure 108128587-A0305-02-0229-266
<210> 93
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-2b FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 93
Figure 108128587-A0305-02-0229-267
Figure 108128587-A0305-02-0230-268
<210> 94
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb709之VL-CL
<400> 94
Figure 108128587-A0305-02-0230-269
Figure 108128587-A0305-02-0231-270
<210> 95
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-5a FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 95
Figure 108128587-A0305-02-0232-271
Figure 108128587-A0305-02-0233-272
Figure 108128587-A0305-02-0234-273
Figure 108128587-A0305-02-0235-274
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 96
Figure 108128587-A0305-02-0235-275
Figure 108128587-A0305-02-0236-276
<210> 97
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb HumAb747-42之VH-CH1
<400> 97
Figure 108128587-A0305-02-0237-277
Figure 108128587-A0305-02-0238-278
<210> 98
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-5a FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 98
Figure 108128587-A0305-02-0238-279
Figure 108128587-A0305-02-0239-280
<210> 99
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 99
Figure 108128587-A0305-02-0239-281
Figure 108128587-A0305-02-0240-282
<210> 100
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-5a FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 100
Figure 108128587-A0305-02-0241-283
Figure 108128587-A0305-02-0242-284
<210> 101
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747-42之VL-CL
<400> 101
Figure 108128587-A0305-02-0242-285
Figure 108128587-A0305-02-0243-286
<210> 102
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-5b FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 102
Figure 108128587-A0305-02-0243-287
Figure 108128587-A0305-02-0244-288
Figure 108128587-A0305-02-0245-289
Figure 108128587-A0305-02-0246-290
Figure 108128587-A0305-02-0247-291
<210> 103
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747-42之VL-CL
<400> 103
Figure 108128587-A0305-02-0247-292
Figure 108128587-A0305-02-0248-293
<210> 104
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 104
Figure 108128587-A0305-02-0248-294
Figure 108128587-A0305-02-0249-295
<210> 105
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-5b FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 105
Figure 108128587-A0305-02-0250-296
Figure 108128587-A0305-02-0251-297
<210> 106
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747-42之VH-CH1
<400> 106
Figure 108128587-A0305-02-0251-298
Figure 108128587-A0305-02-0252-299
<210> 107
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-5b FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 107
Figure 108128587-A0305-02-0252-300
Figure 108128587-A0305-02-0253-301
Figure 108128587-A0305-02-0254-302
<210> 108
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb HuMAb709-8之VL-CL
<400> 108
Figure 108128587-A0305-02-0254-303
Figure 108128587-A0305-02-0255-304
<210> 109
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv1之VH
<400> 109
Figure 108128587-A0305-02-0255-305
Figure 108128587-A0305-02-0256-306
<210> 110
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv2之VH
<400> 110
Figure 108128587-A0305-02-0256-307
Figure 108128587-A0305-02-0257-308
<210> 111
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv3之VH
<400> 111
Figure 108128587-A0305-02-0257-309
<210> 112
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv4之VH
<400> 112
Figure 108128587-A0305-02-0258-310
<210> 113
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv5之VH
<400> 113
Figure 108128587-A0305-02-0259-311
<210> 114
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv6之VH
<400> 114
Figure 108128587-A0305-02-0259-312
Figure 108128587-A0305-02-0260-313
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001 VLv1之VL
<400> 115
Figure 108128587-A0305-02-0260-314
Figure 108128587-A0305-02-0261-315
<210> 116
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001 VLv2之VL
<400> 116
Figure 108128587-A0305-02-0261-316
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001 VLv3之VL
<400> 117
Figure 108128587-A0305-02-0262-317
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001 VLv4之VL
<400> 118
Figure 108128587-A0305-02-0262-318
Figure 108128587-A0305-02-0263-319
<210> 119
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B2-53之VH
<400> 119
Figure 108128587-A0305-02-0263-320
Figure 108128587-A0305-02-0264-321
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B2-53之VL
<400> 120
Figure 108128587-A0305-02-0264-322
Figure 108128587-A0305-02-0265-323
<210> 121
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-21之VH
<400> 121
Figure 108128587-A0305-02-0265-324
<210> 122
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-21之VL
<400> 122
Figure 108128587-A0305-02-0266-325
<210> 123
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-43之VH
<400> 123
Figure 108128587-A0305-02-0266-326
Figure 108128587-A0305-02-0267-327
<210> 124
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-43之VL
<400> 124
Figure 108128587-A0305-02-0267-328
Figure 108128587-A0305-02-0268-329
<210> 125
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-46之VH
<400> 125
Figure 108128587-A0305-02-0268-330
Figure 108128587-A0305-02-0269-331
<210> 126
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-46之VL
<400> 126
Figure 108128587-A0305-02-0269-332
<210> 127
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-48之VH
<400> 127
Figure 108128587-A0305-02-0270-333
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-48之VL
<400> 128
Figure 108128587-A0305-02-0270-334
Figure 108128587-A0305-02-0271-335
<210> 129
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-69之VH
<400> 129
Figure 108128587-A0305-02-0271-336
Figure 108128587-A0305-02-0272-337
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體B3-69之VL
<400> 130
Figure 108128587-A0305-02-0272-338
Figure 108128587-A0305-02-0273-339
<210> 131
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體D1-70之VH
<400> 131
Figure 108128587-A0305-02-0273-340
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於抗體D1-70之VL
<400> 132
Figure 108128587-A0305-02-0274-341
<210> 133
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv6(G55A)之VH
<400> 133
Figure 108128587-A0305-02-0274-342
Figure 108128587-A0305-02-0275-343
<210> 134
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv6.1之VH
<400> 134
Figure 108128587-A0305-02-0275-344
Figure 108128587-A0305-02-0276-345
<210> 135
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv6.2之VH
<400> 135
Figure 108128587-A0305-02-0276-346
Figure 108128587-A0305-02-0277-347
<210> 136
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VHv6.3之VH
<400> 136
Figure 108128587-A0305-02-0277-348
Figure 108128587-A0305-02-0278-349
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VLv3.4之VL
<400> 137
Figure 108128587-A0305-02-0278-350
<210> 138
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VLv3.5之VL
<400> 138
Figure 108128587-A0305-02-0279-351
<210> 139
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於huEpi001-VLv3.6之VL
<400> 139
Figure 108128587-A0305-02-0279-352
Figure 108128587-A0305-02-0280-353
<210> 140
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-1 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 140
Figure 108128587-A0305-02-0280-354
Figure 108128587-A0305-02-0281-355
Figure 108128587-A0305-02-0282-356
Figure 108128587-A0305-02-0283-357
<210> 141
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 141
Figure 108128587-A0305-02-0284-358
Figure 108128587-A0305-02-0285-359
<210> 142
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VH-CH1
<400> 142
Figure 108128587-A0305-02-0285-360
Figure 108128587-A0305-02-0286-361
<210> 143
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-1 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 143
Figure 108128587-A0305-02-0286-362
Figure 108128587-A0305-02-0287-363
Figure 108128587-A0305-02-0288-364
<210> 144
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 144
Figure 108128587-A0305-02-0288-365
Figure 108128587-A0305-02-0289-366
<210> 145
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-1 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 145
Figure 108128587-A0305-02-0289-367
Figure 108128587-A0305-02-0290-368
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VL-CL
<400> 146
Figure 108128587-A0305-02-0290-369
Figure 108128587-A0305-02-0291-370
Figure 108128587-A0305-02-0292-371
<210> 147
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-1 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 147
Figure 108128587-A0305-02-0292-372
Figure 108128587-A0305-02-0293-373
Figure 108128587-A0305-02-0294-374
Figure 108128587-A0305-02-0295-375
<210> 148
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VL-CL
<400> 148
Figure 108128587-A0305-02-0295-376
Figure 108128587-A0305-02-0296-377
Figure 108128587-A0305-02-0297-378
<210> 149
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 149
Figure 108128587-A0305-02-0297-379
Figure 108128587-A0305-02-0298-380
<210> 150
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-1 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 150
Figure 108128587-A0305-02-0298-381
Figure 108128587-A0305-02-0299-382
<210> 151
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VH-CH1
<400> 151
Figure 108128587-A0305-02-0299-383
Figure 108128587-A0305-02-0300-384
Figure 108128587-A0305-02-0301-385
<210> 152
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-1 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 152
Figure 108128587-A0305-02-0301-386
Figure 108128587-A0305-02-0302-387
<210> 153
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 153
Figure 108128587-A0305-02-0302-388
Figure 108128587-A0305-02-0303-389
<210> 154
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-2 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 154
Figure 108128587-A0305-02-0304-390
Figure 108128587-A0305-02-0305-391
Figure 108128587-A0305-02-0306-392
Figure 108128587-A0305-02-0307-394
<210> 155
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 155
Figure 108128587-A0305-02-0307-395
Figure 108128587-A0305-02-0308-396
<210> 156
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VH-CH1
<400> 156
Figure 108128587-A0305-02-0308-397
Figure 108128587-A0305-02-0309-398
Figure 108128587-A0305-02-0310-399
<210> 157
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-2 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 157
Figure 108128587-A0305-02-0310-400
Figure 108128587-A0305-02-0311-401
<210> 158
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 158
Figure 108128587-A0305-02-0311-402
Figure 108128587-A0305-02-0312-403
<210> 159
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-2 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 159
Figure 108128587-A0305-02-0313-404
Figure 108128587-A0305-02-0314-405
<210> 160
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VL-CL
<400> 160
Figure 108128587-A0305-02-0314-406
Figure 108128587-A0305-02-0315-407
<210> 161
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-2 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 161
Figure 108128587-A0305-02-0315-408
Figure 108128587-A0305-02-0316-409
Figure 108128587-A0305-02-0317-410
Figure 108128587-A0305-02-0318-411
Figure 108128587-A0305-02-0319-412
<210> 162
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VL-CL
<400> 162
Figure 108128587-A0305-02-0319-413
Figure 108128587-A0305-02-0320-414
<210> 163
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 163
Figure 108128587-A0305-02-0320-415
Figure 108128587-A0305-02-0321-416
<210> 164
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-2 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 164
Figure 108128587-A0305-02-0322-417
Figure 108128587-A0305-02-0323-418
<210> 165
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VH-CH1
<400> 165
Figure 108128587-A0305-02-0323-419
Figure 108128587-A0305-02-0324-420
<210> 166
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-2 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 166
Figure 108128587-A0305-02-0324-421
Figure 108128587-A0305-02-0325-422
<210> 167
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 167
Figure 108128587-A0305-02-0326-423
Figure 108128587-A0305-02-0327-424
<210> 168
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-3 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 168
Figure 108128587-A0305-02-0327-425
Figure 108128587-A0305-02-0328-426
Figure 108128587-A0305-02-0329-427
Figure 108128587-A0305-02-0330-428
<210> 169
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 169
Figure 108128587-A0305-02-0331-429
Figure 108128587-A0305-02-0332-430
<210> 170
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VH-CH1
<400> 170
Figure 108128587-A0305-02-0332-431
Figure 108128587-A0305-02-0333-432
<210> 171
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-3 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 171
Figure 108128587-A0305-02-0333-433
Figure 108128587-A0305-02-0334-434
<210> 172
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 172
Figure 108128587-A0305-02-0335-435
Figure 108128587-A0305-02-0336-436
<210> 173
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6a-3 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 173
Figure 108128587-A0305-02-0336-437
Figure 108128587-A0305-02-0337-438
<210> 174
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VL-CL
<400> 174
Figure 108128587-A0305-02-0337-439
Figure 108128587-A0305-02-0338-440
<210> 175
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-3 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 175
Figure 108128587-A0305-02-0339-441
Figure 108128587-A0305-02-0340-442
Figure 108128587-A0305-02-0341-443
Figure 108128587-A0305-02-0342-444
<210> 176
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VL-CL
<400> 176
Figure 108128587-A0305-02-0342-445
Figure 108128587-A0305-02-0343-446
<210> 177
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VH-CH1
<400> 177
Figure 108128587-A0305-02-0344-447
Figure 108128587-A0305-02-0345-448
<210> 178
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-3 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 178
Figure 108128587-A0305-02-0345-449
Figure 108128587-A0305-02-0346-450
<210> 179
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VH-CH1
<400> 179
Figure 108128587-A0305-02-0346-451
Figure 108128587-A0305-02-0347-452
<210> 180
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-6b-3 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 180
Figure 108128587-A0305-02-0348-453
Figure 108128587-A0305-02-0349-454
<210> 181
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb709-8之VL-CL
<400> 181
Figure 108128587-A0305-02-0349-455
Figure 108128587-A0305-02-0350-456
<210> 182
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-1 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 182
Figure 108128587-A0305-02-0350-457
Figure 108128587-A0305-02-0351-458
Figure 108128587-A0305-02-0352-459
Figure 108128587-A0305-02-0353-460
Figure 108128587-A0305-02-0354-461
<210> 183
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb HumAb713-7之VL-CL
<400> 183
Figure 108128587-A0305-02-0354-462
Figure 108128587-A0305-02-0355-463
<210> 184
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VH-CH1
<400> 184
Figure 108128587-A0305-02-0355-464
Figure 108128587-A0305-02-0356-465
<210> 185
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-1 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 185
Figure 108128587-A0305-02-0357-466
Figure 108128587-A0305-02-0358-467
<210> 186
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VH-CH1
<400> 186
Figure 108128587-A0305-02-0358-468
Figure 108128587-A0305-02-0359-469
<210> 187
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-1 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 187
Figure 108128587-A0305-02-0359-470
Figure 108128587-A0305-02-0360-471
Figure 108128587-A0305-02-0361-472
<210> 188
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VL-CL
<400> 188
Figure 108128587-A0305-02-0361-473
Figure 108128587-A0305-02-0362-474
<210> 189
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-1 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 189
Figure 108128587-A0305-02-0362-475
Figure 108128587-A0305-02-0363-476
Figure 108128587-A0305-02-0364-477
Figure 108128587-A0305-02-0365-478
Figure 108128587-A0305-02-0366-479
<210> 190
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VL-CL
<400> 190
Figure 108128587-A0305-02-0366-480
Figure 108128587-A0305-02-0367-481
<210> 191
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VH-CH1
<400> 191
Figure 108128587-A0305-02-0367-482
Figure 108128587-A0305-02-0368-483
<210> 192
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-1 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 192
Figure 108128587-A0305-02-0368-484
Figure 108128587-A0305-02-0369-485
Figure 108128587-A0305-02-0370-486
<210> 193
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-67之VH-CH1
<400> 193
Figure 108128587-A0305-02-0370-487
Figure 108128587-A0305-02-0371-488
<210> 194
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-1 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 194
Figure 108128587-A0305-02-0371-489
Figure 108128587-A0305-02-0372-490
<210> 195
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VL-CL
<400> 195
Figure 108128587-A0305-02-0373-491
Figure 108128587-A0305-02-0374-492
<210> 196
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-2 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 196
Figure 108128587-A0305-02-0374-493
Figure 108128587-A0305-02-0375-494
Figure 108128587-A0305-02-0376-495
Figure 108128587-A0305-02-0377-496
<210> 197
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VL-CL
<400> 197
Figure 108128587-A0305-02-0378-497
Figure 108128587-A0305-02-0379-498
<210> 198
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VH-CH1
<400> 198
Figure 108128587-A0305-02-0379-499
Figure 108128587-A0305-02-0380-500
<210> 199
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-2 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 199
Figure 108128587-A0305-02-0380-501
Figure 108128587-A0305-02-0381-502
<210> 200
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VH-CH1
<400> 200
Figure 108128587-A0305-02-0382-503
Figure 108128587-A0305-02-0383-504
<210> 201
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-2 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 201
Figure 108128587-A0305-02-0383-505
Figure 108128587-A0305-02-0384-506
<210> 202
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VL-CL
<400> 202
Figure 108128587-A0305-02-0384-507
Figure 108128587-A0305-02-0385-508
<210> 203
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-2 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 203
Figure 108128587-A0305-02-0386-509
Figure 108128587-A0305-02-0387-510
Figure 108128587-A0305-02-0388-511
Figure 108128587-A0305-02-0389-512
<210> 204
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb HumAb747V-72之VL-CL
<400> 204
Figure 108128587-A0305-02-0389-513
Figure 108128587-A0305-02-0390-514
<210> 205
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VH-CH1
<400> 205
Figure 108128587-A0305-02-0391-515
Figure 108128587-A0305-02-0392-516
<210> 206
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-2 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 206
Figure 108128587-A0305-02-0392-517
Figure 108128587-A0305-02-0393-518
<210> 207
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-72之VH-CH1
<400> 207
Figure 108128587-A0305-02-0393-519
Figure 108128587-A0305-02-0394-520
<210> 208
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-2 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 208
Figure 108128587-A0305-02-0395-521
Figure 108128587-A0305-02-0396-522
<210> 209
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VL-CL
<400> 209
Figure 108128587-A0305-02-0396-523
Figure 108128587-A0305-02-0397-524
<210> 210
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-3 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 210
Figure 108128587-A0305-02-0397-525
Figure 108128587-A0305-02-0398-526
Figure 108128587-A0305-02-0399-527
Figure 108128587-A0305-02-0400-528
Figure 108128587-A0305-02-0401-529
<210> 211
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VL-CL
<400> 211
Figure 108128587-A0305-02-0401-530
Figure 108128587-A0305-02-0402-531
<210> 212
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VH-CH1
<400> 212
Figure 108128587-A0305-02-0402-532
Figure 108128587-A0305-02-0403-533
<210> 213
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-3 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 213
Figure 108128587-A0305-02-0404-534
Figure 108128587-A0305-02-0405-535
<210> 214
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VH-CH1
<400> 214
Figure 108128587-A0305-02-0405-536
Figure 108128587-A0305-02-0406-537
<210> 215
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7a-3 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 215
Figure 108128587-A0305-02-0407-538
Figure 108128587-A0305-02-0408-539
<210> 216
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VL-CL
<400> 216
Figure 108128587-A0305-02-0408-540
Figure 108128587-A0305-02-0409-541
<210> 217
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-3 FIT-Ig多肽鏈1號
<400> 217
Figure 108128587-A0305-02-0409-542
Figure 108128587-A0305-02-0410-543
Figure 108128587-A0305-02-0411-544
Figure 108128587-A0305-02-0412-545
Figure 108128587-A0305-02-0413-546
<210> 218
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VL-CL
<400> 218
Figure 108128587-A0305-02-0413-547
Figure 108128587-A0305-02-0414-548
<210> 219
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VH-CH1
<400> 219
Figure 108128587-A0305-02-0414-549
Figure 108128587-A0305-02-0415-550
<210> 220
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-3 FIT-Ig多肽鏈2號
<400> 220
Figure 108128587-A0305-02-0416-551
Figure 108128587-A0305-02-0417-552
<210> 221
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb747V-73之VH-CH1
<400> 221
Figure 108128587-A0305-02-0417-553
Figure 108128587-A0305-02-0418-554
<210> 222
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT107-1-7b-3 FIT-Ig多肽鏈3號
<400> 222
Figure 108128587-A0305-02-0418-555
Figure 108128587-A0305-02-0419-556
<210> 223
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HumAb713-7之VL-CL
<400> 223
Figure 108128587-A0305-02-0420-557
Figure 108128587-A0305-02-0421-558
<210> 224
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3抗體HumAb747V-67之CDR-H2，具有G55A取代(Kabat編號)
<400> 224
Figure 108128587-A0305-02-0421-560
<210> 225
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3抗體HumAb747V-72或HumAb747V-73之CDR-H2，具有G55A取代(Kabat編號)
<400> 225
Figure 108128587-A0305-02-0421-559
<210> 226
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有G55A取代之VH(Kabat編號)
<400> 226
Figure 108128587-A0305-02-0422-561
<210> 227
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有G55A取代之VH(Kabat編號)
<400> 227
Figure 108128587-A0305-02-0422-562
Figure 108128587-A0305-02-0423-563

Claims (33)

  1. 一種結合蛋白，其包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含：(i)VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接與VHB融合；或(ii)VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接與VLA融合；該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHA-CH1；及該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLB-CL；其中VL為輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VH為重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，Fc為免疫球蛋白Fc區，A為PD-1或LAG-3之抗原決定位且B為PD-1或LAG-3之抗原決定位，其限制條件為A與B不同，該結合蛋白為雙特異性及多價，能夠與PD-1及LAG-3兩者結合：其中當A為LAG-3之抗原決定位且B為PD-1之抗原決定位時，VHA和VLA分別表示VHLAG-3及VLLAG-3且VHB和VLB分別表示VHPD-1及VLPD-1，或當B為LAG-3之抗原決定位且A為PD-1之抗原決定位時，VLB和VHB分別表示VLLAG-3及VHLAG-3且VLA和VHA分別表示VLPD-1及VHPD-1，且其中該VHLAG-3和VLLAG-3分別包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，以及CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且該等CDR選自以下CDR組之群組：a)包含DDYMH(SEQ ID NO：135之殘基31-35)之CDR-H1、包含WIVPENANTVYASKFQG(SEQ ID NO：224)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：135之殘基99-102)之CDR-H3、包含 RASQEISGYLS(SEQ ID NO：138之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASALDS(SEQ ID NO：138之殘基50-56)之CDR-L2及包LQYASYPLT(SEQ ID NO：138之殘基89-97)之CDR-L3；b)包含DDYMH(SEQ ID NO：136之殘基31-35)之CDR-H1、包含WIVPRNANTVYASKFQG(SEQ ID NO：225)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：136之殘基99-102)之CDR-H3、包含RASQEISGYLS(SEQ ID NO：139之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASALDL(SEQ ID NO：139之殘基50-56)之CDR-L2及包含LQYASYPLT(SEQ ID NO：139之殘基89-97)之CDR-L3；及c)包含DDYMH(SEQ ID NO：136之殘基31-35)之CDR-H1、包含WIVPRNANTVYASKFQG(SEQ ID NO：225)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：136之殘基99-102)之CDR-H3、包含RASQEISGYLS(SEQ ID NO：117之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASTLDS(SEQ ID NO：117之殘基50-56)之CDR-L2及包含LQYASYPLT(SEQ ID NO：117之殘基89-97)之CDR-L3；且其中該VHPD-1和VLPD-1分別包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，以及CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且該等CDR分別為：包含DYGMH(SEQ ID NO：10之殘基31-35)之CDR-H1、包含YISSGSYTIYYADTVKG(SEQ ID NO：10之殘基50-66)之CDR-H2、包含RGGSSHVNVMDY(SEQ ID NO：10之殘基99-110)之CDR-H3、包含KASDHINNWLA(SEQ ID NO：11之殘基24-34)之CDR-L1、包含GATSLET(SEQ ID NO：11之殘基50-56)之CDR-L2及包含QQYWSPPYT(SEQ ID NO：11之殘基89-97)之CDR-L3。
  2. 如請求項1之結合蛋白，其中該VLA-CL域及VHA-CH1域與和抗原靶標PD-1及LAG-3中一者結合的親本抗體相同，且該VLB-CL域及VHB-CH1域與和抗原靶標PD-1及LAG-3中另一者結合的不同親本抗體相同。
  3. 如請求項2之結合蛋白，其包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fc，其中CL直接與VHLAG-3融合，其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHPD-1-CH1；及其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLLAG-3-CL；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。
  4. 如請求項3之結合蛋白，其中在該第一多肽鏈中，該等VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，該等VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，該等VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，且該等VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
  5. 如請求項2之結合蛋白，其包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fc，其中CL直 接與VHPD-1融合，其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHLAG-3-CH1；及其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLPD-1-CL；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。
  6. 如請求項5之結合蛋白，其中在該第一多肽鏈中，該等VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，該等VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，該等VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，且該等VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
  7. 如請求項2之結合蛋白，其包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fc，其中CH1直接與VLPD-1融合，其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLLAG-3-CL；及其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHPD-1-CH1；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。
  8. 如請求項7之結合蛋白，其中在該第一多肽鏈中，該等VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，該等VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，該等VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，且該等VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
  9. 如請求項2之結合蛋白，其包含第一、第二及第三多肽鏈，其中該第一多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fc，其中CH1直接與VLLAG-3融合，其中該第二多肽鏈自胺基端至羧基端包含VLPD-1-CL；及其中該第三多肽鏈自胺基端至羧基端包含VHLAG-3-CH1；其中VLPD-1為抗PD-1抗體之輕鏈可變域，CL為輕鏈恆定域，VHPD-1為抗PD-1抗體之重鏈可變域，CH1為重鏈恆定域，VLLAG-3為抗LAG-3抗體之輕鏈可變域，VHLAG-3為抗LAG-3抗體之重鏈可變域且Fc為免疫球蛋白Fc區。
  10. 如請求項9之結合蛋白，其中在該第一多肽鏈中，該等VLLAG-3-CL域與抗LAG-3親本抗體之輕鏈相同，該等VHLAG-3-CH1域與抗LAG-3親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同，該等VLPD-1-CL域與抗PD-1親本抗體之輕鏈相同，且該等VHPD-1-CH1域與抗PD-1親本抗體之重鏈可變域及重鏈恆定域相同。
  11. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：189之胺基酸23-687的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：193的胺基酸序列；及該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：195的胺基酸序列。
  12. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：196之胺基酸23-679的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：200的胺基酸序列；及該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列。
  13. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：203之胺基酸23-687的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列；及該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列。
  14. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：210之胺基酸23-679的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列；及該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：216的胺基酸序列。
  15. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：217之胺基酸23-687的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：221的胺基酸序列；及該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：223的胺基酸序列。
  16. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：154之胺基酸23-687的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：158的胺基酸序列；及該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：160的胺基酸序列。
  17. 一種抗LAG3抗體或其抗原結合部分，其能夠結合人類LAG-3，其中該抗體之該抗原結合部分包含一組六個CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該等CDR選自以下CDR組的群組：a)包含DFNIKDDYMH(SEQ ID NO：114之殘基26-35)之CDR-H1、包含WIVPENGNTEYASKFQG(SEQ ID NO：114之殘基50-66)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：114之殘基99-102)之CDR-H3、包含RASQEISGYLS(SEQ ID NO：117之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASTLDS(SEQ ID NO：117之殘基50-56)之CDR-L2及包含LQYASYPLT(SEQ ID NO：117之殘基89-97)之CDR-L3；b)包含DDYMH(SEQ ID NO：135之殘基31-35)之CDR-H1、包含WIVPENANTVYASKFQG(SEQ ID NO：224)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：135之殘基99-102)之CDR-H3、包含RASQEISGYLS(SEQ ID NO：138之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASALDS(SEQ ID NO：138之殘基50-56)之CDR-L2及包LQYASYPLT(SEQ ID NO：138之殘基89-97)之CDR-L3；c)包含DDYMH(SEQ ID NO：136之殘基31-35)之CDR-H1、包含WIVPRNANTVYASKFQG(SEQ ID NO：225)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：136之殘基99-102)之CDR-H3、包含RASQEISGYLS(SEQ ID NO：139之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASALDL(SEQ ID NO：139之殘基50-56)之CDR-L2及包含LQYASYPLT(SEQ ID NO：139之殘基89-97)之CDR-L3；及 d)包含DDYMH(SEQ ID NO：136之殘基31-35)之CDR-H1、包含WIVPRNANTVYASKFQG(SEQ ID NO：225)之CDR-H2、包含YGDY(SEQ ID NO：136之殘基99-102)之CDR-H3、包含RASQEISGYLS(SEQ ID NO：117之殘基24-34)之CDR-L1、包含AASTLDS(SEQ ID NO：117之殘基50-56)之CDR-L2及包含LQYASYPLT(SEQ ID NO：117之殘基89-97)之CDR-L3。
  18. 一種抗LAG-3抗體或其抗原結合部分，其包含VH域及VL域，其中：-該VH域包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列；-該VH域包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列；-該VH域包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列；-該VH域包含SEQ ID NO：226之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列；-該VH域包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列；或-該VH域包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至16中任一項之結合蛋白，其進一步包含含有SEQ ID NO：28之胺基酸序列之Fc區。
  20. 如請求項17或18之抗LAG-3抗體或其抗原結合部分，其進一步包含含有SEQ ID NO：28之胺基酸序列之Fc區。
  21. 一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項1至10中任一項之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  22. 一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項11至16中任一項之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  23. 一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項17之抗LAG-3抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。
  24. 一種如請求項1之結合蛋白之用途，其用於製造用以治療其中PD-1介導的活性及/或LAG-3介導的活性有害的疾病或病症的藥物。
  25. 如請求項24之用途，其中該疾病為癌症。
  26. 如請求項25之用途，其中該癌症為：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰臟腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、白血病、淋巴瘤或原發性骨癌。
  27. 如請求項25之用途，其中該癌症為非小細胞肺癌。
  28. 如請求項25之用途，其中該癌症為骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、惡性纖維組織細胞瘤或軟骨肉瘤。
  29. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之至少一種結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑，其用於治療其中PD-1介導的活性及/或LAG-3介導的活性有害的病症。
  30. 如請求項29之醫藥組合物，其中該病症為癌症。
  31. 如請求項30之醫藥組合物，其中該癌症為：黑素瘤、腎癌、前列腺癌、胰臟腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、白血病、淋巴瘤或原發性骨癌。
  32. 如請求項30之醫藥組合物，其中該癌症為非小細胞肺癌。
  33. 如請求項30之醫藥組合物，其中該癌症為骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤或軟骨肉瘤。
TW108128587A 2018-05-03 2019-08-12 針對lag-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性pd-1/lag-3結合蛋白 TWI784190B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018085468 2018-05-03
WOPCT/CN2019/085164 2019-04-30
PCT/CN2019/085164 WO2019210848A1 (en) 2018-05-03 2019-04-30 High affinity antibodies to pd-1 and lag-3 and bispecific binding proteins made therefrom

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202041537A TW202041537A (zh) 2020-11-16
TWI784190B true TWI784190B (zh) 2022-11-21

Family

ID=68386276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108128587A TWI784190B (zh) 2018-05-03 2019-08-12 針對lag-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性pd-1/lag-3結合蛋白

Country Status (11)

Country Link
US (1) US12060425B2 (zh)
EP (1) EP3788079A4 (zh)
JP (1) JP7368453B2 (zh)
KR (1) KR20210005894A (zh)
CN (1) CN112074541A (zh)
AU (1) AU2019263850A1 (zh)
BR (1) BR112020022371A2 (zh)
CA (1) CA3097916A1 (zh)
MX (1) MX2020011588A (zh)
TW (1) TWI784190B (zh)
WO (1) WO2019210848A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459182B (zh) * 2013-12-30 2021-09-03 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
WO2021104371A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. Antibodies to cd3 and bcma, and bispecific binding proteins made therefrom
CN114907478A (zh) * 2021-02-08 2022-08-16 迈威(上海)生物科技股份有限公司 结合lag-3的抗体及其用途
WO2022188801A1 (zh) * 2021-03-10 2022-09-15 北京拓界生物医药科技有限公司 Pd-1结合蛋白及其医药用途
BR112023019703A2 (pt) * 2021-03-31 2023-10-31 Incyte Corp Frações de ligação multiespecíficas compreendendo novos domínios de ligação à pd-1
CN114989297B (zh) * 2022-06-14 2022-10-25 北京科跃中楷生物技术有限公司 包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒
US20240101718A1 (en) * 2022-09-28 2024-03-28 Incyte Corporation Anti-pd-1/lag-3 bispecific antibodies and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201613962A (en) * 2013-12-30 2016-04-16 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
TW201702265A (zh) * 2015-06-08 2017-01-16 宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
US20170247456A1 (en) * 2014-01-24 2017-08-31 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
TW201803906A (zh) * 2016-06-20 2018-02-01 Ｆ星德爾塔有限公司 結合物件(二)

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK172110B1 (da) 1988-04-15 1997-10-27 Gen Hospital Corp Fremgangsmåde til isolation af mutanter af DNA-sekvenser og anvendelsen heraf til identifikation af celleoverfladeproteiner
US5006309A (en) 1988-04-22 1991-04-09 Abbott Laboratories Immunoassay device with liquid transfer between wells by washing
US5089424A (en) 1988-06-14 1992-02-18 Abbott Laboratories Method and apparatus for heterogeneous chemiluminescence assay
US5063081A (en) 1988-11-14 1991-11-05 I-Stat Corporation Method of manufacturing a plurality of uniform microfabricated sensing devices having an immobilized ligand receptor
CA2069530A1 (en) 1991-06-03 1992-12-04 Cass J. Grandone Reagent pack for immunoassays
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
IL119586A (en) 1996-11-07 2001-09-13 Univ Ramot Discontinuous library of a single biological unit and a method for its preparation
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
KR20020093029A (ko) 2000-04-11 2002-12-12 제넨테크, 인크. 다가 항체 및 그의 용도
EP1297172B1 (en) 2000-06-28 2005-11-09 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
CA2433353C (en) 2000-12-28 2017-03-21 Altus Biologics, Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
WO2003016466A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company ANTI-Aβ ANTIBODIES
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US7419821B2 (en) 2002-03-05 2008-09-02 I-Stat Corporation Apparatus and methods for analyte measurement and immunoassay
US20040018577A1 (en) 2002-07-29 2004-01-29 Emerson Campbell John Lewis Multiple hybrid immunoassay
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
SI1648509T1 (sl) 2003-07-15 2012-12-31 Amgen Inc. Humana protitelesa, ki nevtralizirajo anti-ngf, kot selektivni inhibitorji poti nfg
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
JP2007528723A (ja) 2003-08-22 2007-10-18 メディミューン，インコーポレーテッド 抗体のヒト化
US7682833B2 (en) 2003-09-10 2010-03-23 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with improved sample closure
US7723099B2 (en) 2003-09-10 2010-05-25 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with immuno-reference electrode
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
US20050250185A1 (en) 2003-12-12 2005-11-10 Murphy Andrew J OGH fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
DK1730191T3 (da) 2004-03-30 2011-10-17 Glaxo Group Ltd Immunglobulin som binder HOSM
WO2005117973A2 (en) 2004-05-05 2005-12-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
FR2873699B1 (fr) 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
WO2006093794A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
SI1907424T1 (sl) 2005-07-01 2015-12-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana monoklonska protitelesa proti programiranem smrtnem ligandu 1 (PD-L1)
JP2009508470A (ja) 2005-07-21 2009-03-05 アボット・ラボラトリーズ Ｓｏｒｆ構築物並びにポリタンパク質、プロタンパク質及びタンパク質分解による方法を含む複数の遺伝子発現
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
CN101326195B9 (zh) 2005-12-13 2022-11-11 伊莱利利公司 抗il-17抗体
EP2626371A1 (en) 2007-07-31 2013-08-14 MedImmune, LLC Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
ES2618292T3 (es) 2008-01-31 2017-06-21 Inserm - Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Anticuerpos contra CD39 humano y uso de los mismos para inhibir la actividad de las células T reguladoras
CL2009000542A1 (es) 2008-03-06 2010-11-05 Genentech Inc Uso de un antagonista de c-met y egfr de formula general i para preparar un medicamento para tratar el cancer.
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
MX2010013239A (es) 2008-06-03 2011-02-24 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
JP2011526591A (ja) 2008-06-30 2011-10-13 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 抗ヒトインターロイキン−２０抗体
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2478373B1 (en) 2009-09-14 2019-01-09 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Methods for characterizing antibody binding affinity and epitope diversity in food allergy
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CN103154035B (zh) 2010-05-27 2017-05-10 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
CN103068847B (zh) 2010-08-24 2019-05-07 罗切格利卡特公司 可活化的双特异性抗体
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
JP6009455B2 (ja) 2010-12-21 2016-10-19 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｉｌ−１アルファおよびベータ二重特異的二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
DK2654789T3 (en) 2010-12-22 2018-09-03 Orega Biotech ANTIBODIES AGAINST HUMAN CD39 AND USE THEREOF
JP2014515598A (ja) 2011-03-10 2014-07-03 エイチシーオー アンティボディ， インク． 二重特異性三鎖抗体様分子
CA2831957A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Amgen Inc. Novel egfr binding proteins
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
BR112014003598B1 (pt) 2011-08-23 2022-05-31 Roche Glycart Ag Molécula de ligação de antígeno biespecífica, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação de antígeno biespecífica
PE20141521A1 (es) 2011-08-23 2014-10-25 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
PT2802607T (pt) 2012-01-13 2018-01-03 Univ Wuerzburg J Maximilians Complementação funcional bipartida induzida por duplo antigénio
BR112014024903A2 (pt) 2012-04-05 2017-07-11 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos contra tweak humanao e il17 humana e seus usos
MX363188B (es) 2012-11-30 2019-03-13 Hoffmann La Roche Identificación de pacientes con necesidad de coterapia del inhibidor de pd-l1.
MX2015012059A (es) 2013-03-15 2016-01-12 Merck Patent Gmbh Anticuerpos biespecificos tetravalentes.
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
BR112015025549A2 (pt) 2013-04-07 2017-10-10 Bioex Therapeutics Inc anticorpo contra o receptor do fator de crescimento epidérmico
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
KR102089591B1 (ko) 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
US20160367662A1 (en) 2013-12-12 2016-12-22 Novartis Ag Combinations of trametinib, panitumumab and dabrafenib for the treatment of cancer
EP3126398B1 (en) 2014-03-03 2020-07-15 Academia Sinica Bi-specific antibodies and uses thereof
WO2015138920A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
KR102246800B1 (ko) 2014-05-13 2021-04-30 바이오아트라, 인코퍼레이티드 조건부 활성 생체 단백질
CN106714839A (zh) 2014-05-15 2017-05-24 百时美施贵宝公司 使用抗pd‑1抗体和另一种抗癌剂的组合治疗肺癌
US10092645B2 (en) 2014-06-17 2018-10-09 Medimmune Limited Methods of treatment with antagonists against PD-1 and PD-L1 in combination with radiation therapy
MX2017001556A (es) 2014-08-04 2017-05-15 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t.
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
TN2017000113A1 (en) 2014-10-31 2018-07-04 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
EP3215538A4 (en) 2014-11-07 2018-07-04 Igenica Biotherapeutics, Inc. Anti-cd39 antibodies and uses thereof
ES2808853T3 (es) 2014-11-20 2021-03-02 Hoffmann La Roche Cadenas ligeras comunes y procedimientos de uso
GB201500319D0 (en) * 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
MX2018001227A (es) 2015-07-30 2018-03-26 Macrogenics Inc Moleculas de union a pd-1 y metodos de uso de las mismas.
WO2017024515A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Wuxi Biologics (Cayman) Inc. Novel anti-pd-1 antibodies
EA201891165A1 (ru) 2015-11-18 2018-11-30 Мерк Шарп И Доум Корп. Молекулы, связывающие pd1 и/или lag3
WO2017089334A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Innate Pharma Cd39 vascular isoform targeting agents
WO2017132827A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
NZ743881A (en) 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
TWI755395B (zh) * 2016-05-13 2022-02-21 美商再生元醫藥公司 抗-pd-1抗體與輻射治療癌症之組合
CN114456269A (zh) * 2016-09-21 2022-05-10 基石药业（苏州）有限公司 一种新的pd-1单克隆抗体
KR20230136711A (ko) 2016-10-13 2023-09-26 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사 항-lag-3 항체 및 조성물
WO2018129522A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Torch Therapeutics Conditionally effective bispecific therapeutics
EP3661966A4 (en) 2017-07-31 2021-07-21 Tizona Therapeutics ANTI-CD39 ANTIBODIES, COMPOSITIONS INCLUDING ANTI-CD39 ANTIBODIES AND METHODS OF USE OF ANTI-CD39 ANTIBODIES
BR112020006809A2 (pt) 2017-10-06 2020-10-06 Innate Pharma anticorpos, agente, uso, composto, composição farmacêutica, kits e composição ou uso
CA3075371A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Innate Pharma Potentiating the effect of atp release
MX2022001682A (es) 2019-08-08 2022-05-13 Regeneron Pharma Nuevos formatos de moleculas de union a antigenos.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201613962A (en) * 2013-12-30 2016-04-16 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
US20170247456A1 (en) * 2014-01-24 2017-08-31 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
TW201702265A (zh) * 2015-06-08 2017-01-16 宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TW201803906A (zh) * 2016-06-20 2018-02-01 Ｆ星德爾塔有限公司 結合物件(二)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210005894A (ko) 2021-01-15
JP2021522347A (ja) 2021-08-30
WO2019210848A1 (en) 2019-11-07
EP3788079A4 (en) 2022-12-21
CN112074541A (zh) 2020-12-11
AU2019263850A1 (en) 2020-11-19
EP3788079A1 (en) 2021-03-10
JP7368453B2 (ja) 2023-10-24
US12060425B2 (en) 2024-08-13
CA3097916A1 (en) 2019-11-07
US20210188980A1 (en) 2021-06-24
MX2020011588A (es) 2020-12-07
TW202041537A (zh) 2020-11-16
BR112020022371A2 (pt) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210403560A1 (en) Antibodies to human programmed death receptor pd-1
TWI784190B (zh) 針對lag-3之工程化抗體及自其製備之雙特異性pd-1/lag-3結合蛋白
US20230382994A1 (en) Monoclonal antibodies to cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla-4)
US20220389111A1 (en) High affinity antibodies to cd39 and uses thereof
TW202227491A (zh) 抗ｒｏｒ１抗體及相關雙特異性結合蛋白
TW202132347A (zh) 針對cd3和bcma的抗體和自其製備的雙特異性結合蛋白
AU2014201367B2 (en) Antibodies to human programmed death receptor pd-1
US20240269276A1 (en) Specific binding protein targeting pd-l1 and cd73
RU2782381C2 (ru) Высокоаффинные анти-pd-1 и анти-lag-3 антитела и полученные из них биспецифические связывающие белки
WO2022258015A1 (en) Antibodies and bispecific binding proteins that bind ox40 and/or pd-l1
CN117255804A (zh) 针对人4-1bb的抗体及其变体