BR112020022371A2

BR112020022371A2 - anticorpos de alta afinidade para pd-1 e lag-3 e proteínas de ligação biespecífica produzidas a partir dos mesmos

Info

Publication number: BR112020022371A2
Application number: BR112020022371-9A
Authority: BR
Inventors: Xuan Wu; Shiyong GONG; Chengbin Wu
Original assignee: Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd.
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2021-02-02
Also published as: MX2020011588A; TW202041537A; WO2019210848A1; TWI784190B; KR20210005894A; CA3097916A1; EP3788079A4; AU2019263850A1; EP3788079A1; JP7368453B2; JP2021522347A; CN112074541A; US20210188980A1

Abstract

  ANTICORPOS DE ALTA AFINIDADE PARA PD-1 E LAG-3 E PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO BIESPECÍFICA PRODUZIDAS A PARTIR DOS MESMOS. Trata-se de anticorpos de alta afinidade que reconhecem o Ligante de Morte Programada 1 (PD-1) e a proteína do Gene de Ativação de Linfócitos 3 (LAG-3). Sítios de ligação de anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 humanizados são incorporados em um formato de imunoglobulina Fabs-in-Tandem sem perda significativa de afinidade de ligação, e as proteínas de ligação multivalentes biespecíficas resultantes têm a capacidade de se ligar tanto a PD-1 como a LAG-3, simultaneamente. Essas proteínas biespecíficas de ligação a FIT-Ig são úteis para o tratamento contra câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS DE ALTA AFINIDADE PARA PD-1 E LAG-3 E PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO BIESPECÍFICA PRODUZIDAS A PARTIR DOS MESMOS” Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere a novos anticorpos que reconhecem a proteína de morte celular programada 1 (PD- 1), novos anticorpos que reconhecem a proteína do Gene de Ativação de Linfócitos 3 (LAG-3) e proteínas de ligação biespecíficas PD-1/LAG-3, como proteínas de ligação FIT-Ig produzidas com o uso desses anticorpos. Os anticorpos e proteínas de ligação biespecíficas são úteis para o tratamento de doenças imunológicas e cânceres hematológicos.

Fundamentos da Invenção Proteína de Morte Celular Programada 1 (PD-1)

[002] A Proteína de morte celular programada 1 (PD-1, CD279) é um membro da família de receptores CD28, que inclui CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 e BTLA. A expressão de PD-1 é frequentemente encontrada em células do sistema imunológico, como células T, células B, monócitos e células assassinas naturais (NK). PD-1 e membros da família similares são glicoproteínas transmembranares do tipo I contendo um domínio similar à imunoglobulina similar a um domínio variável de Ig que é responsável pela ligação do ligante e uma cauda citoplasmática que é responsável pela ligação de moléculas de sinalização. A cauda citoplasmática de PD-1 contém dois motivos de sinalização baseados em tirosina, um ITIM (motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptor) e um ITSM (motivo switch à base de imunorreceptor tirosina).

Vivier et al., Immunol. Today, 18:286 a 291 (1997) e Chemnitz et al., J. Immunol., 173:945 a 954 (2004).

[003] Dois ligantes de glicoproteína de superfície celular para PD-1 foram identificados, Ligante de Morte Programada 1 (PD-L1, CD274, B7-H1) e PD-L2 (CD273, B7-DC), e mostraram induzir a transdução de sinal intracelular que inibe a ativação de células T mediada por CD3 e CD28. Riley, Immunol. Rev., 229:114 a 125 (2009). Essa regulação negativa da ativação de células T, por sua vez, resulta na redução da proliferação de células T, secreção de IL-2, secreção de IFN-γ e secreção de outros fatores de crescimento e citocinas. Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1.027 a 1.034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-8 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-43 (2002); Ohigashi et al., Clin. Cancer Res., 11:2947-53 (2005). Acredita-se que a sinalização por meio da interação PD-1/PD-L1 sirva como funções críticas e não redundantes dentro do sistema imunológico, regulando negativamente as respostas das células T. Essa regulação está envolvida no desenvolvimento de células T no timo, na regulação de respostas inflamatórias crônicas e na manutenção da tolerância periférica e do privilégio imunológico. A natureza crítica dessas funções é exemplificada em camundongos deficientes em PD-1, que exibem um fenótipo autoimune. A deficiência de PD-1 em camundongos C57BL/6 resulta em glomerulonefrite tipo lúpus progressiva crônica e artrite. Em camundongos Balb/c, a deficiência de PD-1 leva a cardiomiopatia grave devido à presença de anticorpos autorreativos específicos do tecido cardíaco.

[004] Após a estimulação de células T, PD-1 recruta a tirosina fosfatase SHP-2 para o motivo ITSM dentro de sua cauda citoplasmática, levando à desfosforilação de moléculas efetoras, como CD3-ζ, PKC-θ e ZAP70 que estão envolvidas na cascata de sinalização de célula T CD3. O mecanismo pelo qual PD-1 modula negativamente as respostas das células T é similar, mas distinto daquele da CTLA-4, já que ambas as moléculas regulam um conjunto sobreposto de proteínas de sinalização. Parry et al., Mol. Cell Biol., 25:9.543 a 9.553 (2005). Em geral, o sinal inibitório mediado por PD-1 desempenha um papel importante na tolerância imunológica.

Bour-Jordan et al., Immunol. Rev., 241:180 a 205 (2011).

[005] A expressão aumentada de PD-1 é encontrada em linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), e a expressão de ligantes de PD-1 em células tumorais foi relatada em uma variedade de cânceres de diferentes tecidos, incluindo pulmão, fígado, estômago, rim, mama, ovário, pâncreas, melanócitos e esôfago. Em geral, a expressão do ligante PD- 1 em células tumorais foi correlacionada ao mau prognóstico de pacientes com câncer em vários tipos de tumor. Okazaki e Honjo, Int. Immunol., 19:813 a 824 (2007).

[006] O bloqueio da interação PD-1/PD-L1 pode levar ao aumento da imunidade de células T tumor-específicas e, portanto, ser útil na eliminação de células tumorais pelo sistema imunológico. Em um modelo murino de câncer pancreático agressivo, T. Nomi et al. demonstraram a eficácia terapêutica do bloqueio de PD-1/PD-L1, mostrando que a administração de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PD-L1 inibiu significativamente o crescimento do tumor. Nomi et al., Clin.

Cancer Res., 13:2.151 a 2.157 (2007). O bloqueio de anticorpos promoveu efetivamente a infiltração de células T CD8+ reativas ao tumor no tumor, resultando na regulação positiva de efetores antitumorais, incluindo IFN-γ, granzima B e perforina. Em outro estudo, usando um modelo de carcinoma de células escamosas em camundongos, o bloqueio de anticorpos de PD-1 ou PD-L1 inibiu significativamente o crescimento do tumor. Tsushima et al., Oral Oncol., 42:268 a 274 (2006).

[007] Recentemente, foi demonstrado que PD-1 é altamente expresso em células T de indivíduos infectados com HIV e que a expressão do receptor se correlaciona com a função das células T prejudicada e a progressão da doença.

Day et al., Nature, 443:350 a 354 (2006); Trautmann et al., Nat. Med., 12:1.198 a 1.202 (2006). Em ambos os estudos, o bloqueio do ligante PD-L1 aumentou significativamente a expansão de células produtoras de IFN-γ específicas para HIV in vitro.

[008] Consequentemente, a modulação terapêutica da sinalização de PD-1 por moléculas antagonistas pode reverter as células imunes da tolerância e reativar as mesmas para erradicar o câncer e infecções virais crônicas.

Gene de Ativação de Linfócitos 3 (LAG-3)

[009] A proteína do Gene de Ativação de Linfócitos 3 (LAG-3, CD223) é um receptor coestimulador negativo que modula a homeostase, proliferação e ativação de células T.

Sierro et al., Expert Opin. Ther. Targets, 15: 91 a 101 (2010). Um membro da superfamília de imunoglobulinas, LAG-3 é uma proteína semelhante a CD4 que, como CD4, se liga a moléculas MHC de classe II, mas com afinidade duas vezes maior e em um sítio distinto de CD4. Huard et al., Proc.

Natl Acad. Sci. USA, 94:5744-9 (1997). LAG-3 é expressa em células T CD8+ ativadas, células T γδ, células exterminadoras, células B, células dendríticas plasmocitoides e células T reguladoras (Tregs). O papel da LAG-3 como regulador negativo das respostas das células T é baseado em estudos com camundongos knockout para LAG-3 e no uso de anticorpos anti-LAG-3 bloqueadores em modelos de sistemas in vitro e in vivo. Sierro et al. (2010), op. cit.; Hannier et al., J. Immunol., 161:4058-65 (1998); Macon- Lemaitre et al., Immunology, 115:170-8 (2005); Workman et al., Eur. J. Immunol., 33:970-9 (2003). Tanto as Tregs naturais quanto induzidas expressam LAG-3 aumentada, que é necessária para sua função supressora máxima. Camisaschi et al., J. Immunol., 184:6.545 a 6.551 (2010); Huang, et al., Immunity, 21:503 a 513 (2004). Além disso, a expressão ectópica de LAG-3 em células T efetoras CD4+ reduz sua capacidade proliferativa e confere às mesmo potencial regulatório contra células T de terceiros. Huang, ibid.

Estudos recentes também mostraram que a alta expressão de LAG-3 em células T CD8+ específicas do vírus da coriomeningite linfocítica exaurida (LCMV) contribui para seu estado de não resposta e limita as respostas antitumorais de células T CD8+. Blackburn et al., Nat. Immunol., 10:29 a 37 (2009) e Grosso et al., J. Clin. Invest., 117:3.383 a

3.392 (2007).

[0010] O importante papel que a LAG-3 desempenha na resposta imune antitumoral e na resposta imune à infecção a torna um alvo de interesse para a imunoterapia. O bloqueio de LAG-3 com antagonistas, incluindo anticorpos monoclonais, foi proposto para o tratamento de certos cânceres e infecções virais crônicas. Turnis et al., Eur. J. Immunol., 45:1.892 a 1.905 (2015).

[0011] À medida que a importância da sinalização mediada por PD-1- e LAG-3 torna-se mais bem compreendida, existe uma necessidade contínua de descoberta de novos anticorpos inibitórios anti-PD-1 e anti-LAG-3 que podem alterar efetivamente a funcionalidade das células T ou aumentar a reatividade das células tumorais às células efetoras do sistema imunológico. Além disso, o projeto de moléculas biespecíficas que poderiam combinar os efeitos da inibição de PD-1 e LAG-3 também seria uma melhoria desejável nas abordagens terapêuticas para o tratamento contra câncer.

Sumário da Invenção

[0012] A presente invenção fornece novos anticorpos que se ligam a PD-1 com alta afinidade e novos anticorpos que se ligam a LAG-3 com alta afinidade. A invenção também fornece imunoglobulinas biespecíficas Fabs-in-Tandem (FIT-Igs) PD- 1/LAG-3 que são reativas com PD-1 e LAG-3. Os anticorpos e proteínas de ligação biespecíficas da presente invenção podem bloquear LAG-3 em TILs para reduzir a população de células Treg infiltradas por tumor ou para recuperar TILs a um fenótipo citotóxico. Além disso, os anticorpos e proteínas de ligação biespecíficas da invenção podem ser usados para inibir a sinalização de PD-1/PD-L1, a fim de reativar células T citotóxicas infiltradas por tumor. As proteínas de ligação multivalentes biespecíficas aqui descritas serão úteis como inibidores biespecíficos PD-1/LAG-3 para fornecer um efeito de combinação sinérgica para superar a supressão imunológica antitumoral e, assim, melhorar os resultados mesmo para pacientes que não respondem ou pararam de responder a terapias anti-PD-1 ou anti-LAG-3 sozinhas.

[0013] A invenção também fornece métodos de produção e uso de anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 e proteínas de ligação biespecíficas PD-1/LAG-3 aqui descritas, bem como várias composições que podem ser usadas em métodos de detecção de PD-1 e/ou LAG-3 em uma amostra ou em métodos de tratamento ou prevenção de um distúrbio em um indivíduo que está associado à atividade de PD-1 e/ou LAG-3.

[0014] Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma proteína de ligação a imunoglobulina biespecífica Fabs-in- Tandem (FIT-Ig) que compreende a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, (i) VL A-CL-VHB-CH1- Fc em que CL está diretamente fundido a VH B, ou (ii) VHB-CH1- VLA-CL-Fc em que CH1 está diretamente fundido a VL A; em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VH A-CH1; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VLB-CL; em que VL é um domínio variável de cadeia leve, CL é um domínio constante de cadeia leve, VH é um domínio variável de cadeia pesada, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, Fc é uma região Fc de imunoglobulina, A é um epítopo de PD-1 ou LAG-3 e B é um epítopo de PD-1 ou LAG-3, com a condição de que A e B sejam diferentes. De acordo com a presente invenção, tais proteínas de ligação a FIT-Ig ligam- se a PD-1 e LAG-3.

[0015] Em modalidades preferidas, os fragmentos Fab de tais proteínas de ligação FIT-Ig incorporam domínios VL A-CL e VHA-CH1 de um anticorpo parental que se liga a um dos alvos de antígeno PD-1 ou LAG-3, e incorporam domínios VL B-CL e VHB-CH1 de um anticorpo parental diferente que se liga ao outro dos alvos de antígeno PD-1 e LAG-3. Assim, o emparelhamento VH-CH1/VL-CL resultará em frações Fab em tandem que reconhecem PD-1 e LAG-3.

[0016] De acordo com a presente invenção, uma proteína de ligação a PD-1/LAG-3 FIT-Ig pode compreender vantajosamente a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLPD-1-CL-VHLAG-3- CH1-Fc em que CL é diretamente fundido a VH LAG-3, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHPD-1-CH1; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao carboxilo, VLLAG-3-CL; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VHPD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VLLAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina. Vantajosamente, na primeira cadeia polipeptídica, os domínios VL PD-1-CL são iguais à cadeia leve de um anticorpo parental anti-PD-1, os domínios VHPD-1-CH1 são os mesmos que a variável da cadeia pesada e os domínios constantes de cadeia pesada de um anticorpo parental anti- PD-1, os domínios VLLAG-3-CL são os mesmos que a cadeia leve de um anticorpo parental anti-LAG-3 e os domínios VHLAG-3-CH1 são os mesmos que os domínios constantes da cadeia variável pesada e da cadeia pesada de um anticorpo parental anti-LAG-

3.

[0017] Em modalidades alternativas, uma proteína de ligação a PD-1/LAG-3 FIT-Ig pode compreender vantajosamente a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fc em que CL é diretamente fundido a VH PD-1, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHLAG-3-CH1; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao carboxilo, VL PD-1-CL; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VHPD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VL LAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG- 3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

Vantajosamente, na primeira cadeia polipeptídica, os domínios VLLAG-3-CL são iguais à cadeia leve de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VHLAG-3-CH1 são os mesmos que a variável da cadeia pesada e os domínios constantes de cadeia pesada de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VLPD-1-CL são os mesmos que a cadeia leve de um anticorpo parental anti-PD-1 e os domínios VHPD-1-CH1 são os mesmos que os domínios constantes da cadeia variável pesada e da cadeia pesada de um anticorpo parental anti-PD-1.

[0018] Em modalidades alternativas, uma proteína de ligação a PD-1/LAG-3 FIT-Ig pode compreender vantajosamente a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fc em que CH1 é diretamente fundido a VL PD-1, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLLAG-3-CL; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao carboxilo, VH PD-1-CH1; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VHPD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VL LAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG- 3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

[0019] Em modalidades alternativas, uma proteína de ligação a PD-1/LAG-3 FIT-Ig pode compreender vantajosamente a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fc em que CH1 é diretamente fundido a VL LAG-3, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLPD-1-CL; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao carboxilo, VH LAG-3-CH1; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VHPD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VL LAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG- 3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

[0020] Nas fórmulas anteriores para a primeira cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação a FIT-Ig, uma região Fc pode ser uma região Fc nativa ou variante. Em modalidades particulares, a região Fc é uma região Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE ou IgD. Em modalidades particulares, o Fc é um Fc humano de IgG1, ou um Fc humano modificado, como estabelecido na Tabela 6, infra (SEQ ID NO:28).

[0021] Em uma modalidade da invenção, as proteínas de ligação a FIT-Ig da presente invenção retêm uma ou mais propriedades de anticorpos parentais a partir dos quais as sequências de seus fragmentos Fab são utilizadas e incorporadas na estrutura de FIT-Ig. Em modalidades preferenciais, o FIT-Ig irá reter afinidade de ligação para os antígenos alvo (ou seja, LAG-3 e PD-1) comparável ao dos anticorpos parentais, o que significa que a afinidade de ligação da proteína de ligação de FIT-Ig para os alvos de antígeno PD-1 e LAG-3 não variam em mais de 10 vezes em comparação com a afinidade de ligação dos anticorpos parentais para seus respectivos antígenos alvo, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biocamada.

[0022] Em uma modalidade, uma proteína de ligação a FIT- Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:78; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 20-240 de SEQ ID NO:83; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO:86. (Consulte a Tabela 27.)

[0023] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO:88; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 20-235 de SEQ ID NO:91; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO:93. (Consulte a Tabela 28.)

[0024] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:95; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 20-242 de SEQ ID NO:98; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO:100. (Consulte a Tabela 29.)

[0025] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO:102; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 20-235 de SEQ ID NO:105; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO:107. (Consulte a Tabela 30.)

[0026] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:140; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:144; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:146. (Consulte FIT107-1-6a-1; Tabela 41.)

[0027] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO:147; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:151; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:153. (Consulte FIT-107-1-6b-1; Tabela 42.)

[0028] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:154; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:158; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:160. (Consulte FIT-107-1-6a-2; Tabela 43.)

[0029] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO:161; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:165; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:167. (Consulte FIT-107-1-6b-2; Tabela 44.)

[0030] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:168; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:172; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:174. (Consulte FIT-107-1-6a-3; Tabela 45.)

[0031] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO:175; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:179; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:181. (Consulte FIT-107-1-6b-3; Tabela 46.)

[0032] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:182; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:186; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:188. (Consulte FIT-107-1-7a-1; Tabela 47.)

[0033] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-687 de SEQ ID NO:189; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:193; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:195. (Consulte FIT-107-1-7b-1; Tabela 48.)

[0034] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:196; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:200; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:202. (Consulte FIT-107-1-7a-2; Tabela 49.)

[0035] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-687 de SEQ ID NO:203; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:207; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:209. (Consulte FIT-107-1-7b-2; Tabela 50.)

[0036] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO:210; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:214; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:216. (Consulte FIT-107-1-7a-3; Tabela 51.)

[0037] Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-687 de SEQ ID NO:217; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:221; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:223. (Consulte FIT-107-1-7b-3; Tabela 52.)

[0038] A invenção também fornece novos anticorpos com capacidade de se ligar a PD-1 humano, em que o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo compreende um conjunto de seis CDRs, ou seja, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3, selecionados a partir do grupo de conjuntos de CDR definidos abaixo:

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 SYMMS NO:4 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 SMSGGGRDTYYPDSVKG NO:4 resíduos 99-106 de SEQ CDR-H3 RGTYAMDY ID NO:4 1 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 LASQTIGTWLT NO:5 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AATSLAD NO:5 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQLYSTPWT NO:5 resíduos 31-36 de SEQ ID CDR-H1 TGYYWN NO:6 resíduos 51-66 de SEQ ID CDR-H2 YMSYDGNNNYNPSLKN NO:6 resíduos 99-111 de SEQ CDR-H3 DRGTTILGGTMDY ID NO:6 2 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 KASQSVSNDVA NO:7 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 YAFYRYT NO:7 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQDYSSPWT NO:7 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 FYTMS NO:8 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 TISGGGRDTYYPDSVKG NO:8 resíduos 99-107 de SEQ CDR-H3 QGGNYLFAY 3 ID NO:8 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 KASQDVNTVVA NO:9 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 WASTRHT NO:9 CDR-L3 QQHYTTPYT resíduos 89-97 de SEQ ID

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no NO:9 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DYGMH NO:10 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 YISSGSYTIYYADTVKG NO:10 resíduos 99-110 de SEQ CDR-H3 RGGSSHVNVMDY ID NO:10 4 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 KASDHINNWLA NO:11 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 GATSLET NO:11 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQYWSPPYT NO:11 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DNNVE NO:12 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 DINPNNGDTLYSQYFKD NO:12 resíduos 99-106 de SEQ CDR-H3 GKSDQFDY ID NO:12 5 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 LASQTIGTWLA NO:13 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AATSLAD NO:13 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQLYSSPWT NO:13 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 SYAMS NO:14 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 TISGGGRDTYYPDSVKG NO:14 resíduos 99-107 de SEQ 6 CDR-H3 QGGTYLFAS ID NO:14 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 KASQDVNTAVA NO:15 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 WASTRHT NO:15

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQHYTTPYT NO:15 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DYEMH NO:16 resíduos 51-66 de SEQ ID CDR-H2 VIEPESGGTVYNQKFKG NO:16 resíduos 99-109 de SEQ CDR-H3 EGFNSDHYFDY ID NO:16 7 resíduos 24-39 de SEQ ID CDR-L1 RSSQNIVHSNGNTYLE NO:17 resíduos 55-61 de SEQ ID CDR-L2 KVFNRFS NO:17 resíduos 94-102 de SEQ CDR-L3 FQGSHVPYT ID NO:17 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 SHLMS NO:18 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 AISGGGADTYYPDSVKG NO:18 resíduos 99-105 de SEQ CDR-H3 QILAFDS ID NO:18 8 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 HASQNIYVWLN NO:19 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 KASNLHT NO:19 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQGQSYPWT NO:19 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 SHLMS NO:53 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 AISGGGADTYYPASVKG NO:53 9 resíduos 99-105 de SEQ CDR-H3 QILAFDA ID NO:53 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 HASQNIYVWLN NO:19 CDR-L2 KASNLHT resíduos 50-56 de SEQ ID

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no NO:19 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 QQGQSYPWT NO:19

A invenção também fornece novos anticorpos com capacidade de se ligar a LAG-3 humano, em que o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo compreende um conjunto de seis CDRs, ou seja, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3, selecionados a partir do grupo de conjuntos de CDR definidos abaixo:

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:60 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG NO:60 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:60 10 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:61 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDS NO:61 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:61 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:60 11 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG NO:60

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:60 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:62 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDS NO:62 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:62 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DYEMH NO:63 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 AIDPETGGTAYNQKFKG NO:63 resíduos 101-108 de SEQ CDR-H3 WGSTVFPY ID NO:63 12 resíduos 24-39 de SEQ ID CDR-L1 KSTKSLLNSDGFTYLD NO:64 resíduos 55-61 de SEQ ID CDR-L2 LVSNRFS NO:64 resíduos 94-102 de SEQ CDR-L3 FQSNYLPWT ID NO:64 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DYEMH NO:65 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 AIDPATGGTAYNQKFKG NO:65 resíduos 99-106 de SEQ CDR-H3 WGTTVFPY ID NO:65 13 resíduos 24-39 de SEQ ID CDR-L1 KSTKSLLNSDGFTYLD NO:66 resíduos 55-61 de SEQ ID CDR-L2 LVSNRFS NO:66 resíduos 94-102 de SEQ CDR-L3 FQSNYLPWT ID NO:66 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH 14 NO:67 CDR-H2 WIDPENGDTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no NO:67 resíduos 99-101 de SEQ CDR-H3 FDY ID NO:67 resíduos 24-39 de SEQ ID CDR-L1 KSSQSLLDSDGKTYLN NO:68 resíduos 55-61 de SEQ ID CDR-L2 LVSKLDS NO:68 resíduos 94-102 de SEQ CDR-L3 WQGSHFPQT ID NO:68 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYVH NO:69 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIDPENGDTEYASKFQG NO:69 resíduos 99-105 de SEQ CDR-H3 WDAEENY ID NO:69 15 resíduos 24-39 de SEQ ID CDR-L1 RSSKSLLHSNGNTYLY NO:70 resíduos 55-61 de SEQ ID CDR-L2 RMSNLAS NO:70 resíduos 94-102 de SEQ CDR-L3 MQHLEYPFT ID NO:70 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYIH NO:71 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIDPENGDTEYASKFQG NO:71 resíduos 100-105 de SEQ CDR-H3 DYRNWY ID NO:71 16 resíduos 24-39 de SEQ ID CDR-L1 KSSQSLLDSDGKTYLN NO:68 resíduos 55-61 de SEQ ID CDR-L2 LVSKLDS NO:68 resíduos 94-102 de SEQ CDR-L3 WQGSHFPQT ID NO:68 resíduos 26-35 de SEQ ID 17 CDR-H1 DFNIKDDYMH NO:114

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG NO:114 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:114 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:117 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDS NO:117 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:117 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:72 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG NO:72 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:72 18 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:77 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDS NO:77 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:77 resíduos 30-34 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:119 resíduos 48-64 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTVYASKFQG NO:119 resíduos 95-98 de SEQ ID CDR-H3 YGDY NO:119 19 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:120 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASALDS NO:120 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:120 20 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no NO:121 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG NO:121 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:121 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RAMQEISGYLS NO:122 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDS NO:122 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYAYYPLT NO:122 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:123 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG NO:123 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:123 21 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:124 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASHLDS NO:124 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:124 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:125 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGLTEYASKFQG NO:125 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:125 22 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:126 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 ATSTLDS NO:126 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:126

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:127 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGKTEYASKFQG NO:127 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:127 23 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:128 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AAMTLDS NO:128 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:128 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:129 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPENGNTHYASKFQG NO:129 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:129 24 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:130 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 EASTLDS NO:130 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:130 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:131 resíduos 50-66 de SEQ ID CDR-H2 WIVPRNGNTMYASKFQG NO:131 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY 25 ID NO:131 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:132 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDL NO:132 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID

Conj unto CDR de CDR Sequência de SEQ ID NO: CDR aminoácidos no NO:132 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:135 CDR-H2 WIVPENANTVYASKFQG SEQ ID NO:224 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:135 26 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:138 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASALDS NO:138 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:138 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:136 CDR-H2 WIVPRNANTVYASKFQG SEQ ID NO:225 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:136 27 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:139 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASALDL NO:139 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:139 resíduos 31-35 de SEQ ID CDR-H1 DDYMH NO:136 CDR-H2 WIVPRNANTVYASKFQG SEQ ID NO:225 resíduos 99-102 de SEQ CDR-H3 YGDY ID NO:136 28 resíduos 24-34 de SEQ ID CDR-L1 RASQEISGYLS NO:117 resíduos 50-56 de SEQ ID CDR-L2 AASTLDS NO:117 resíduos 89-97 de SEQ ID CDR-L3 LQYASYPLT NO:117

[0039] Em uma modalidade, uma proteína de ligação de acordo com a invenção é uma proteína de ligação a imunoglobulina multivalente biespecífica compreendendo dois ou mais locais de ligação ao antígeno, em que pelo menos um sítio de ligação ao antígeno compreende um conjunto de CDR selecionado dos Conjuntos de CDR 1, 2, 3 e 4 acima e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno compreende o Conjunto 5 de CDR acima.

[0040] Em uma modalidade, um anticorpo anti-PD-1 de acordo com a invenção compreende domínios VH e VL, em que os dois domínios variáveis compreendem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:36

SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:57.

[0041] Em uma modalidade adicional, um anticorpo anti- LAG-3 de acordo com a invenção compreende domínios VH e VL, em que os dois domínios variáveis compreendem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:62

SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:69 e SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:121 e SEQ ID NO:122 SEQ ID NO:123 e SEQ ID NO:124 SEQ ID NO:125 e SEQ ID NO:126 SEQ ID NO:127 e SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:129 e SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:132 SEQ ID NO:135 e SEQ ID NO:138 SEQ ID NO:136 e SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:136 e SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:226* e SEQ ID NO:138 SEQ ID NO:227* e SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:227* e SEQ ID NO:117 * em que SEQ ID NO: 226 é a mesma que SEQ ID NO: 135 exceto com um Ala (A) em vez de Gly (G) no aminoácido 56 (substituição de G55A por numeração de Kabat); e SEQ ID NO: 227 é a mesma que SEQ ID NO: 136 exceto com um Ala (A) em vez de Gly (G) no aminoácido 56 (substituição de G55A por numeração de Kabat).

[0042] Em outra modalidade, um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-LAG-3 pode ser usado para produzir proteínas de ligação derivadas que reconhecem o mesmo antígeno alvo por técnicas bem estabelecidas no campo. Tal derivado pode ser, por exemplo, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento Fab (Fab), um fragmento Fab’, um F(ab’)2, um Fv e um Fv ligado por dissulfeto.

[0043] Em outro aspecto da invenção, um anticorpo ou proteína de ligação biespecífica aqui descrita tem a capacidade de modular uma função biológica de PD-1, LAG-3 ou ambos. Em outro aspecto, um anticorpo anti-PD-1 aqui descrito tem a capacidade de inibir a sinalização de PD-1/PD-L1. Em outro aspecto, um anticorpo anti-PD-1 aqui descrito tem a capacidade de inibir a sinalização de PD-1/PD-L1, infra. Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG-3 aqui descrito tem a capacidade de inibir a interação MHC Classe II/LAG-3. Tal inibição pode ser medida em um ensaio de ativação PBMC SEB, como realizado nos exemplos de trabalho, infra. Em outro aspecto, a proteína de ligação a FIT-Ig biespecífica PD- 1/LAG-3 aqui descrita tem a capacidade de inibir a sinalização de PD-1/PD-L1 e a interação MHC Classe II/LAG-

3.

[0044] Em uma modalidade, um anticorpo anti-PD-1 aqui descrito ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de taxa de associação (k on) para PD-1 humana de pelo menos 1 × 104 M-1s-1, pelo menos 3 × 104 M-1s-1, pelo menos 5 × 104 M-1s-1, pelo menos 7 × 104 M-1s-1, pelo menos 9 × 104 M-1s-1, pelo menos 1 × 105 M-1s-1, pelo menos 1.1 × 105 M-1s- 1, pelo menos 1 × 105 M-1s-1, pelo menos 1.25 × 105 M-1s-1, pelo menos 1,4 × 105 M-1s-1, pelo menos 1,5 × 105 M-1s-1, pelo menos 3 × 105 M-1s-1 ou mais, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biocamada.

[0045] Em outra modalidade, um anticorpo anti-PD-1 aqui descrito ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de taxa de dissociação (koff) para PD-1 humana menor que 1 × 10-3s-1, menor que 5 × 10-4s-1, menor que 3 × 10- 4s-1, menor que 1 × 10-4s-1, menor que 8 × 10-5s-1, menor que 6 × 10-5s-1, menor que 4 × 10-5s-1, menor que 3 × 10-5s-1, ou menor que 1 × 10-5s-1, medida por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biocamada.

[0046] Em outra modalidade, um anticorpo anti-PD-1 aqui descrito ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de dissociação (K D) para PD-1 menor que 1 × 10- 8 M, menor que 5 × 10-9 M, menor que 3 × 10-9 M, menor que 1 × 10-9 M, menor que 8 × 10-10 M, menor que 6 × 10-10 M, menor que 4 × 10-10 M, menor que 2 × 10-10 M ou menor que 1 × 10-10 M.

[0047] Em uma modalidade, um anticorpo anti-LAG-3 aqui descrito ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de taxa de associação (k on) para LAG-3 humana de pelo menos 5 × 10 3 M-1s-1, pelo menos 7 × 103 M-1s-1, pelo menos 1 × 104 M-1s-1, pelo menos 3 × 104 M-1s-1, pelo menos 5 × 104 M-1s-1, pelo menos 7 × 104 M-1s-1, pelo menos 1 × 105 M-1s- 1, ou pelo menos 2 × 105 M-1s-1 ou mais, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biocamada.

[0048] Em outra modalidade, um anticorpo anti-LAG-3 aqui descrito ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de taxa de dissociação (k off) para LAG-3 humana menor que 1,5 × 10 -3s-1, menor que 1 × 10-3s-1, menor que 8 × 10-4s-1, menor que 6 × 10-4s-1, menor que 4 × 10-4s-1, menor que 2 × 10-4s-1, menor que 1 × 10-4s-1, menor que 9 × 10- 5s-1, menor que 8 × 10-5s-1, menor que 7 × 10-5s-1, menor que 5 × 10-5s-1, menor que 4 × 10-5s-1, menor que 2 × 10-5s-1, ou menor que 1 × 10-5s-1, medida por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biocamada.

[0049] Em outra modalidade, um anticorpo anti-LAG-3 aqui descrito ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de dissociação (KD) para LAG-3 menor que 5 × 10-7 M, menor que 2 × 10-7 M, menor que 1 × 10-7 M, menor que 8 × 10-8 M, menor que 6 × 10 -8 M, menor que 4 × 10 -8 M; menor que 2 × 10-8 M; menor que 1 × 10-8 M; menor que 8 × 10- 9 M; menor que 6 × 10-9 M, menor que 4 × 10-9 M; menor que 2 × 10-9 M; ou menor que 1 × 10 -9 M.

[0050] Em uma modalidade, uma proteína de ligação de FIT-Ig biespecífica com a capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3 de acordo com esta invenção tem uma constante de taxa de associação (kon) para PD-1 humana de pelo menos 5 × 10 3 M- 1s-1, pelo menos 1 × 104 M-1s-1, pelo menos 5 × 104 M-1s-1, pelo menos 1 × 105 M-1s-1, pelo menos 3 × 105 M-1s-1, ou pelo menos 5 × 105 M-1s-1, ou mais, e a mesma proteína de ligação tem uma constante de taxa de associação (k on) para LAG-3 humana de pelo menos 5 × 103 M-1s-1, pelo menos 1 × 104 M-1s-1, pelo menos 5 × 104 M-1s-1, pelo menos 1 × 105 M-1s-1, pelo menos 3 × 10 5

M-1s-1 ou pelo menos 5 × 105 M-1s-1, ou mais, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biolamada.

Em outras modalidades, uma proteína de ligação a FIT-Ig biespecífica com a capacidade de se ligar a PD-1 e

LAG-3, conforme descrito neste documento, terá uma constante de taxa de associação (kon) para PD-1 humana que não é mais do que uma diminuição de 10 vezes a partir da k on para PD-1 do anticorpo anti-PD-1 parental e não é mais do que uma diminuição de 10 vezes da k on para LAG-3 do anticorpo anti-

LAG-3 parental a partir do qual o anti-PD-1 e as especificidades anti-LAG-3, respectivamente, da proteína de ligação a FIT-Ig foram derivadas.

Em outras palavras, a proteína de ligação a FIT-Ig irá reter uma constante de taxa de associação para cada antígeno (PD-1 ou LAG-3) que é maior que, a mesma ou não mais do que uma ordem de magnitude menor que a constante de taxa de associação (k on) exibida pelos anticorpos parentais reativos com os respectivos antígenos

PD-1 ou LAG-3. Conforme revelado neste documento, uma proteína de ligação PD-1/LAG-3 FIT-Ig para o antígeno pode mostrar melhora na kon para um ou ambos os antígenos em comparação com a kon para os respectivos antígenos exibidos pelos anticorpos parentais, ou a k on para um ou ambos os antígenos podem ser essencialmente os mesmos que os exibidos pelos anticorpos parentais, respectivamente, ou, se houver uma diminuição na kon para um ou ambos os antígenos mostrados pela proteína de ligação FIT-Ig em comparação com um anticorpo parental, então essa diminuição não é uma diminuição de mais de 10 vezes. De preferência, uma diminuição na kon para um determinado antígeno no FIT-Ig em comparação com o kon para esse antígeno de um anticorpo parental é menor do que 50%, mais preferencialmente menor do que 25%. Esses altos valores de k on retidos no FIT-Ig biespecífico em comparação com as k on dos anticorpos parentais é uma conquista surpreendente no campo.

[0051] Em uma modalidade, uma proteína de ligação de FIT-Ig biespecífica com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG- 3 de acordo com esta invenção tem uma constante de taxa de dissociação (koff) para PD-1 humana menor que 2 × 10 -4s-1, menor que 1 × 10-4s-1, menor que 5 × 10-5s-1, menor que 3 × 10- 5s-1, menor que 2 × 10-5s-1, menor que 1 × 10-5s-1, ou menor que 8 × 10-6s-1, e a mesma proteína de ligação tem uma constante de taxa de dissociação (k off) para LAG-3 humana menor que 2 × 10-4s-1, menor que 1 × 10-4s-1, menor que 5 × 10-5s-1, menor que 3 × 10-5s-1, menor que 2 × 10-5s-1, menor que 1 × 10-5s-1, ou menor que 8 × 10-6s-1, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície ou interferometria de biocamada.

[0052] Em outra modalidade, uma proteína de ligação de FIT-Ig biespecífica com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG- 3 de acordo com esta invenção tem uma constante de dissociação (KD) para PD-1 menor que 2 × 10-8 M, menor que 1

× 10-8 M, menor que 5 × 10-9 M, menor que 1 × 10-9 M, menor que 6 × 10-10 M, menor que 5 × 10-10 M, menor que 3 × 10-10 M,

menor que 2 × 10-10 M, menor que 1 × 10-10 M, menor que 8 × 10- 11 M, menor que 6 × 10-11 M, menor que 4 × 10-11 M, ou menor que 1 × 10-11 M, e a mesma proteína de ligação tem uma constante de dissociação (KD) para LAG-3 humana menor que 2

× 10-8 M, menor que 1 × 10 -8 M, menor que 5 × 10-9 M, menor que 1 × 10-9 M, menor que 6 × 10-10 M, menor que 5 × 10-10 M,

menor que 3 × 10-10 M, menor que 2 × 10-10 M, menor que 1 × 10-

10 M, menor que 8 × 10-11 M, menor que 6 × 10-11 M, menor que 4

× 10-11 M, ou menor que 1 × 10 -11 M.

Em outras modalidades,

uma proteína de ligação a FIT-Ig biespecífica com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3, conforme descrito neste documento, terá uma constante de dissociação (K D) para PD-1 humana que não é mais do que 10 vezes diferente da KD para

PD-1 do anticorpo anti-PD-1 parental e não é mais do que 10 vezes diferente do K D para LAG-3 do anticorpo anti-LAG-3 parental a partir do qual o anti-PD-1 e o anti-LAG As especificidades -3, respectivamente, da proteína de ligação a FIT-Ig foram derivadas.

Em outras palavras, a proteína de ligação FIT-Ig irá reter a afinidade de ligação dos anticorpos parentais para cada antígeno (PD-1 ou LAG-3),

conforme indicado por uma constante de dissociação (K D) que está dentro de uma ordem de magnitude da K D exibida pelos anticorpos parentais reativos com os antígenos PD-1 ou LAG-

3, respectivamente. Conforme revelado neste documento, uma proteína de ligação PD-1/LAG-3 FIT-Ig pode mostrar melhora em KD (isto é, tem um valor de K D mais baixo; liga-se mais firmemente) para um ou ambos os antígenos em comparação com o KD para os respectivos antígenos exibidos pelos anticorpos parentais, ou a KD para um ou ambos os antígenos pode ser essencialmente o mesmo que o exibido pelos anticorpos parentais, respectivamente, ou a K D para um ou ambos os antígenos mostrados pela proteína de ligação FIT-Ig pode mostrar uma diminuição (isto é, têm um valor de K D maior, liga-se com menos força) em comparação com a K D de um anticorpo parental, mas se houver uma diferença em K D entre a proteína de ligação de FIT-Ig e o anticorpo parental, então essa diferença não é mais do que 10 vezes . De preferência, uma proteína de ligação de PD-1/LAG-3 FIT-Ig mostra uma KD inferior (liga-se mais fortemente) para um ou ambos os antígenos em comparação com a KD para os respectivos antígenos exibidos por um ou ambos os anticorpos parentais.

A retenção da afinidade de ligação dos anticorpos parentais anti-PD-1 e anti-LAG-3 alteração de ± 10 vezes em K D é uma conquista surpreendente na área.

[0053] A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um anticorpo anti- PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito neste documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.

A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um anticorpo anti-

LAG-3 ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável.

A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem uma combinação de anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 como aqui descrito, ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno dos mesmos e um carreador farmaceuticamente aceitável.

A invenção também fornece proteínas de ligação de imunoglobulina multivalentes biespecíficas reativas com PD-

1 e LAG-3, cujas proteínas de ligação incorporam sítios de ligação VH/VL de anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 aqui descritos.

Em particular, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma proteína de ligação a FIT-Ig com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da invenção podem compreender ainda pelo menos um ingrediente ativo adicional.

Em uma modalidade, tal ingrediente adicional inclui, sem limitação, um agente terapêutico, um agente de imagem, um agente citotóxico, um inibidor de angiogênese, um inibidor de quinase, um bloqueador de molécula de coestimulação, um bloqueador de molécula de adesão, um anticorpo de especificidade diferente ou fragmento funcional do mesmo, um marcador detectável ou repórter; um agonista ou antagonista para citocina (ou citocinas) específica, um narcótico, um fármaco anti- inflamatório não esteroide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um agente antimicrobiano, um corticosteroide, um esteroide anabolizante, uma eritropoetina, um imunógeno, um agente imunossupressor, um hormônio de crescimento, um medicamento de reposição hormonal, um radiofármaco, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante (por exemplo, uma anfetamina, cafeína, etc.), um beta-agonista, um esteroide inalado, uma epinefrina ou análogo, uma citocina.

[0054] Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende ainda pelo menos um agente terapêutico adicional para o tratamento de um distúrbio no qual a atividade de sinalização mediada por PD-1 e/ou LAG-3 é prejudicial.

[0055] Em uma outra modalidade, a invenção fornece ácidos nucleicos isolados que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos de um anticorpo anti-PD-1 da invenção ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; ácidos nucleicos isolados que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos de um anticorpo anti-LAG-3 da invenção ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e ácidos nucleicos isolados que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos de uma proteína de ligação a imunoglobulina biespecífica Fabs-in-Tandem (FIT-Ig) com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3. Esses ácidos nucleicos podem ser inseridos em um vetor para realizar várias análises genéticas ou para expressar, caracterizar ou melhorar uma ou mais propriedades de um anticorpo ou proteína de ligação aqui descrita. Um vetor pode compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos de um anticorpo ou proteína de ligação aqui descrita em que uma ou mais moléculas de ácido nucleico estão operacionalmente ligadas a sequências de transcrição e/ou tradução adequadas que permitem a expressão do anticorpo ou proteína de ligação em uma célula hospedeira particular carregando o vetor. Exemplos de vetores para clonagem ou expressão de ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos de proteínas de ligação aqui descritas incluem, sem limitação, pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV e pBJ e derivados dos mesmos.

[0056] A invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma ou mais sequências de aminoácidos de um anticorpo ou proteína de ligação aqui descrita. As células hospedeiras úteis na invenção podem ser procarióticas ou eucarióticas. Uma célula hospedeira procariótica exemplificadora é Escherichia coli. As células eucarióticas úteis como células hospedeiras na invenção incluem células protistas, células animais, células vegetais e células fúngicas. Uma célula fúngica exemplificadora é uma célula de levedura, incluindo Saccharomyces cerevisiae. Uma célula animal exemplar útil como célula hospedeira de acordo com a invenção inclui, sem limitação, uma célula de mamífero, uma célula de ave e uma célula de inseto. As células de mamíferos preferidas incluem, sem limitação, células CHO, células HEK e células COS. Uma célula de inseto útil como célula hospedeira de acordo com a invenção é uma célula de inseto Sf9.

[0057] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de anticorpo anti-PD-1 ou um fragmento funcional do mesmo que compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que codifica o anticorpo ou fragmento funcional em meio de cultura sob condições suficientes para causar expressão pela célula hospedeira do anticorpo ou fragmento com capacidade de se ligar a PD-1. Em outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de anticorpo anti-LAG-3 ou um fragmento funcional do mesmo que compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que codifica o anticorpo ou fragmento funcional em meio de cultura sob condições suficientes para causar expressão pela célula hospedeira do anticorpo ou fragmento com capacidade de se ligar a LAG-3. Em outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de uma proteína de ligação multivalente biespecífica com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3, especificamente uma proteína de ligação a FIT-Ig que se liga a PD-1 e LAG-3 que compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que codifica a proteína de ligação a FIT-Ig em meio de cultura sob condições suficientes para causar a expressão pela célula hospedeira da proteína de ligação com capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3. As proteínas assim produzidas podem ser isoladas e usadas em várias composições e métodos aqui descritos.

[0058] Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade disso, em que o método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação a PD-1 do mesmo como aqui descrito, em que o anticorpo ou ligação fragmento tem a capacidade de se ligar a PD-1 e inibir a sinalização mediada por PD-1/PD-L1 ou PD-1/PD-L2 em uma célula que expressa PD-1. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade disso, em que o método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação de LAG-3 deste, conforme descrito neste documento, em que o anticorpo ou ligação fragmento tem a capacidade de se ligar a LAG-3 e inibir a sinalização mediada por MHC Classe II/LAG-3 em uma célula que expressa LAG-3. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade disso,

em que o método compreende administrar ao indivíduo uma proteína de ligação FIT-Ig biespecífica com capacidade de se ligar a LAG-3 e PD-1, conforme descrito neste documento, em que a ligação a proteína tem a capacidade de se ligar a LAG-

3 e PD-1 e de inibir a sinalização mediada por MHC Classe

II/LAG-3 em uma célula que expressa LAG-3 e de inibir PD-

1/PD-L1 ou PD-1/PD-L2 sinalização em uma célula que expressa

PD-1. Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende,

consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO:102; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 20-235 de SEQ ID NO:105;

e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos

23-236 de SEQ ID NO:107. (Consulte a Tabela 30.) Em uma modalidade adicional, uma proteína de ligação a FIT-Ig da presente invenção liga PD-1 e LAG-3 e é composta por uma primeira cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos

23-687 de SEQ ID NO:189; uma segunda cadeia polipeptídica que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 20-235 de SEQ ID NO:192; e uma terceira cadeia polipeptídica compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO:194. (Consulte a Tabela 48.)

[0059] Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma doença autoimune ou um câncer em um indivíduo em necessidade disso, em que a proteína de ligação tem a capacidade de se ligar a LAG-3 e PD-1, e em que a doença autoimune ou câncer é autoimune doença ou câncer geralmente responsivos à imunoterapia. Em outra modalidade, o câncer é um câncer que não foi associado à imunoterapia. Em outra modalidade, o câncer é um câncer que é refratário ou uma malignidade recorrente. Em outra modalidade, a proteína de ligação inibe o crescimento ou a sobrevivência das células tumorais. Em outra modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), adenocarcinoma pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de esôfago, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de tireoide, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma e outras neoplasias neoplásicas.

[0060] Os métodos de tratamento descritos neste documento podem compreender ainda a administração a um indivíduo em necessidade disso de um adjuvante imunoestimulador, como um oligodesoxinucleotídeo CpG (CpG ODN) que compreende um fosfodiéster total ou parcial ou estrutura de fosforotioato. Por exemplo, em um método de tratamento da invenção, um adjuvante imunoestimulador pode ser incorporado em uma composição que compreende um anticorpo ou proteína de ligação a FIT-Ig da invenção e a composição administrada a um indivíduo em necessidade de tratamento. Em outra modalidade, um método de tratamento da invenção pode compreender uma etapa de administração a um indivíduo em necessidade disso de tratamento de um anticorpo ou proteína de ligação de FIT-Ig aqui descrita e uma etapa separada de administração de um adjuvante imunoestimulador ao indivíduo antes, simultaneamente, ou após a etapa de administração ao indivíduo de um anticorpo ou proteína de ligação a FIT-Ig da invenção.

Breve descrição dos Desenhos

[0061] As Figuras 1A e 1B são gráficos de barras que mostram os níveis de produção de IL-2 em uma reação mista de linfócitos testando o efeito de vários anticorpos anti-PD-1 aqui revelados, em comparação com dois anticorpos anti-PD-1 recombinantes produzidos a partir de sequências publicadas (nivolumab e pembrolizumab) e controle de anticorpos humanos e murinos dirigidos contra antígenos irrelevantes (“hIgG4” e “mIgG”). As Figuras 1A e 1B mostram testes de MLR separados, usando linfócitos respondedores de diferentes doadores.

[0062] As Figuras 2A e 2B são gráficos de barras que mostram os níveis de produção de interferon gama (IFN-gama) em uma reação mista de linfócitos testando o efeito de vários anticorpos anti-PD-1 aqui revelados, em comparação com dois anticorpos anti-PD-1 recombinantes produzidos a partir de sequências publicadas (nivolumab e pembrolizumab) e controle de anticorpos humanos e murinos dirigidos contra antígenos irrelevantes (“hIgG4” e “mIgG”). As Figuras 2A e 2B mostram testes de MLR separados, usando linfócitos respondedores de diferentes doadores.

[0063] A Figura 3 mostra gráficos de barras dos níveis de produção de IL-2 em uma reação mista de linfócitos testando o efeito de vários anticorpos anti-PD-1 humanizados aqui revelados, em comparação com um anticorpo anti-PD-1 terapêutico recombinante produzido a partir de sequências publicadas (nivolumab), e um anticorpo humano de controle direcionado contra o antígeno irrelevante (“HuF0323-1”).

[0064] A Figura 4 mostra gráficos de barras dos níveis de produção de IL-2 em uma reação mista de linfócitos testando o efeito de vários anticorpos anti-PD-1 humanizados aqui revelados, em comparação com o murino parenteal mAb709,

um anticorpo anti-PD-1 terapêutico recombinante produzido a partir de sequências publicadas (nivolumab), e um anticorpo humano de controle direcionado contra o antígeno irrelevante (“HuF0323-1”).

[0065] A Figura 5 mostra gráficos de barras dos níveis de produção de IL-2 em uma reação mista de linfócitos testando o efeito de vários anticorpos anti-PD-1 humanizados aqui revelados, em comparação com uma quimera com os domínios variáveis de murino parenteal mAb713 (mAb713c), um anticorpo anti-PD-1 terapêutico recombinante produzido a partir de sequências publicadas (nivolumab), e um anticorpo humano de controle direcionado contra o antígeno irrelevante (“HuF0323-1”). As Figuras 3, 4 e 5 mostram testes de MLR separados, usando linfócitos respondedores de diferentes doadores.

[0066] A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra a produção de IL-2 em um ensaio de ativação de células T SEB comparando a reversão do efeito de supressão de células T em várias concentrações de dois anticorpos anti-LAG-3 murinos aqui descritos. A funcionalidade dos anticorpos anti-LAG-3 da invenção (“3502-mAb746” e 3502-mAb747”) é comparada com um mAb anti-LAG-3 recombinante produzido a partir de uma sequência publicada (“BMS-986016”), um anticorpo anti-LAG-3 murino recombinante produzido a partir de uma sequência publicada (“BAP050”) e anticorpos humanos e murinos de controle dirigidos contra antígenos irrelevantes (“hIgG4” e “mIgG”).

[0067] A Figura 7 é um gráfico de barras que mostra a produção de IL-2 em um ensaio de ativação de células T SEB comparando a reversão do efeito de supressão de células T em várias concentrações de várias proteínas de ligação biespecíficas FIT-Ig, FIT107-1-2a, aqui descritas. A funcionalidade de FIT107-1-2a é comparada contra uma combinação de um mAb anti-LAG-3 recombinante de sequência conhecida (BMS-986016) e um mAb anti-PD-1 recombinante de sequência conhecida (nivolumab), e contra um anticorpo anti- PD-1 sozinho (“PD-1”, mAb709 aqui revelado).

[0068] A Figura 8 apresenta curvas que mostram os níveis relativos de produção de interferon gama (IFN-g) em uma reação de linfócitos mistos testando o efeito da proteína de ligação FIT-Ig biespecífica FIT107-1-2a em várias concentrações, em comparação com uma combinação de um anti- LAG-3 mAb recombinante de sequência conhecida (BMS-986016) e um anti-PD-1 mAb recombinante de sequência conhecida (nivolumab) e contra o anticorpo anti-PD-1 humanizado HumAb709-8 revelado neste documento).

[0069] A Figura 9 é um gráfico de barras que mostra a produção de IL-2 em um ensaio de ativação de células T SEB comparando a reversão do efeito de supressão de células T em várias concentrações de um anticorpo quimérico anti-LAG-3 mAb747c e um anticorpo anti-LAG-3 humanizado HumAb747- 60 Consulte o Exemplo 13. A funcionalidade do anticorpo anti- LAG-3 humanizado da invenção (HumAb747-60) é comparada com um mAb anti-LAG-3 quimérico produzido com o uso de domínios variáveis murinos aqui descritos e um anticorpo humano dirigido contra um antígeno irrelevante (“hIgG4”, ao controle).

[0070] A Figura 10 é um gráfico de barras que mostra a produção de IL-2 em um ensaio de ativação de células T SEB comparando a reversão do efeito de supressão de células T em várias concentrações de um anticorpo quimérico anti-LAG-3 mAb747c e variantes de alta afinidade de anticorpo anti-LAG- 3 humanizado HumAb747-60 incorporando mutações indicadas após experiências de maturação por afinidade. Consulte o Exemplo 14. A funcionalidade de anticorpos variantes anti- LAG-3 da invenção (HumAb747V-66 a HumAb747V-73) é comparada com um mAb anti-LAG-3 quimérico produzido com o uso de domínios variáveis murinos aqui descritos e um anticorpo humano dirigido contra um antígeno irrelevante (“hIgG4”, ao controle).

[0071] A Figura 11 é um gráfico de barras que mostra a produção de IL-2 em um ensaio de ativação de células T SEB comparando a reversão do efeito de supressão de células T em várias concentrações de uma proteína de ligação de FIT-Ig específica para ambos os alvos LAG-3 e PD-1. Consulte o

Exemplo 16.2. A funcionalidade dos anticorpos biespecíficos PD-1/LAG-3 FIT-Ig da invenção é comparada com uma combinação de anticorpos monoclonais anti-PD-1 e anti-LAG-3 recombinantes preparados a partir de sequências publicadas (“nivolumab + BMS 986016”) e um anticorpo humano dirigido contra um antígeno irrelevante (“hIgG”, controle).

[0072] A Figura 12 é um gráfico de barras que mostra os resultados de um ensaio de bloqueio de receptor que mostra a capacidade de um anticorpo anti-LAG-3 de acordo com a invenção (HumAb747V-67) e uma proteína de ligação de FIT-Ig PD-1/LAG-3 de acordo com a invenção (FIT107-1-7b-1) para bloquear a interação entre LAG-3 humana e proteína similar a fibrinogênio 1 (FGL1). Consulte o Exemplo 16.5.

[0073] A Figura 13 é uma série de gráficos que avaliam a ligação da superfície celular a PD-1 e LAG-3 expressa em células T. Os resultados mostram que a proteína biespecífica FIT-Ig FIT107-1-7b-1 reconhece as proteínas de superfície PD-1 e LAG-3 nas células T.

Descrição Detalhada da Invenção

[0074] Esta invenção se refere a novos anticorpos anti- PD-1, novos anticorpos anti-LAG-3, porções de ligação ao antígeno dos mesmos e proteínas de ligação biespecíficas multivalentes, como imunoglobulinas Fabs-in-Tandem (FIT-Igs) que se ligam a PD -1 e LAG-3 alvos. Vários aspectos da invenção se referem a anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 e fragmentos de anticorpos, proteínas de ligação de FIT-Ig que se ligam a PD-1 humano e LAG-3 humano e composições farmacêuticas dos mesmos, bem como ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras para a produção de tais anticorpos, fragmentos de anticorpos funcionais e proteínas de ligação. Métodos de uso de anticorpos, fragmentos de anticorpos funcionais e proteínas de ligação biespecíficas da invenção para detectar PD-1 humana, LAG-3 humana ou ambas; para inibir a atividade de PD-1 humana e/ou LAG-3 humana, in vitro ou in vivo; e para tratar doenças, especialmente câncer, que são mediadas pela ligação de PD-1 e/ou LAG-3 aos seus respectivos ligantes, isto é, PD-1 e MHC de classe II, também estão incluídas na invenção.

[0075] A menos que definido de outro modo no presente documento, os termos científicos e técnicos usados em combinação com a presente invenção devem ter os significados que são comumente compreendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. O significado e escopo dos termos devem ser claros, no entanto, no caso de qualquer ambiguidade latente, as definições fornecidas no presente documento tem prioridade sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca. Adicionalmente, a menos que seja exigido de outro modo através do contexto, os termos no singular deverão incluir pluralidades e termos no plural deverão incluir o singular. Neste pedido, o uso de “ou” significa “e/ou”, a menos que indicado de outra forma. Além disso, o uso do termo “incluindo”, bem como outras formas, como “inclui” e “incluído”, não é limitante. Além disso, termos como “elemento” ou “componente” abrangem tanto elementos como componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, a menos que especificamente indicado de outra forma.

[0076] Geralmente, nomenclaturas usadas em combinação com, e técnicas de, cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, química e hibridização de genética e proteína e ácido nucleico descritos no presente documento são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou conforme descrito neste documento. As nomenclaturas usadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório de, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. As técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento de pacientes.

[0077] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, alguns termos são definidos abaixo.

[0078] O termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia polimérica de aminoácidos. Os termos “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável com o termo polipeptídeo e também se referem a uma cadeia polimérica de aminoácidos. O termo “polipeptídeo” abrange proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteínas e análogos de polipeptídeos de uma sequência de aminoácidos de proteína.

O termo “polipeptídeo” abrange fragmentos e variantes (incluindo fragmentos de variantes) dos mesmos, a menos que de outra forma contradito pelo contexto. Para um polipeptídeo antigênico, um fragmento de polipeptídeo contém opcionalmente pelo menos um epítopo contíguo ou não linear do polipeptídeo. Os limites precisos do pelo menos um fragmento de epítopo podem ser confirmados usando habilidades normais na técnica. O fragmento compreende pelo menos cerca de 5 aminoácidos contíguos, como pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos ou pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos. Uma variante de um polipeptídeo é conforme aqui descrito.

[0079] O termo “proteína isolada” ou “polipeptídeo isolado” é uma proteína ou polipeptídeo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, não está associado a componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo, está substancialmente livre de outras proteínas do mesmo espécie, é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou não ocorre na natureza. Assim, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula da qual se origina naturalmente será “isolado” de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína também pode ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados por isolamento, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica.

[0080] O termo “recuperação” se refere ao processo de tornar uma espécie química, tal como um polipeptídeo, substancialmente livre de componentes naturalmente associados por isolamento, por exemplo, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica.

[0081] O termo “atividade biológica” se refere a todas as propriedades biológicas inerentes dos anticorpos anti-PD- 1 ou anti-LAG-3 aqui descritos. Propriedades biológicas de anticorpos anti-PD-1 incluem, sem limitação, ligação à proteína PD-1; propriedades biológicas dos anticorpos anti-

LAG-3 incluem, sem limitação, ligação a proteínas MHC de Classe II.

[0082] O termo “ligação específica” ou “ligação específica” em referência à interação de um anticorpo, uma proteína de ligação ou um peptídeo com uma segunda espécie química, significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) na segunda espécie química. Por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura de proteína específica ao invés de proteínas em geral. Se um anticorpo é específico para o epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou livre, A não marcado), em uma reação contendo “A” marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

[0083] O termo “anticorpo” se refere amplamente a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) composta por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), ou qualquer fragmento funcional, mutante, variante ou derivação do mesmo, que retém o características essenciais de ligação ao epítopo de uma molécula de Ig. Esses formatos de anticorpos mutantes, variantes ou derivados são conhecidos na técnica. Modalidades não limitativas das quais são discutidas abaixo.

[0084] Em um anticorpo de comprimento total, cada cadeia pesada é composta por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios: CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser, adicionalmente, subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), interspersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, arranjados do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Primeiro, segundo e terceiro CDRs de um domínio VH são comumente enumerados como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3; da mesma forma, a primeira, a segunda e a terceira CDRs de um domínio VL são comumente enumeradas como CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.

[0085] O termo “região Fc” é usado para definir a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, que pode ser gerada pela digestão com papaína de um anticorpo intacto.

A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante.

A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, isto é, um domínio CH2 e um domínio CH3, e opcionalmente compreende um domínio CH4, por exemplo, como no caso das regiões Fc de anticorpos IgM e IgE.

A região Fc dos anticorpos IgG, IgA e

IgD compreende uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em contrapartida, a região Fc de anticorpos IgM e IgE carece de uma região de dobradiça, mas compreende um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4. As regiões Fc variantes com substituições de resíduos de aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetora do anticorpo são conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Winter et al.,

Patentes no US 5.648.260 e 5.624.821). A porção Fc de um anticorpo medeia várias funções efetoras importantes, por exemplo, indução de citocina, ADCC, fagocitose,

citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e meia-

vida/taxa de eliminação de anticorpos e complexos antígeno-

anticorpo.

Em alguns casos, essas funções efetoras são desejáveis para o anticorpo terapêutico, mas em outros casos podem ser desnecessárias ou mesmo deletérias, dependendo dos objetivos terapêuticos.

Certos isotipos IgG humanos,

particularmente IgG1 e IgG3, medeiam ADCC e CDC via ligação a Fc Rs e complemento C1q, respectivamente.

Em ainda outra modalidade, pelo menos, um resíduo de aminoácido é substituído na região constante do anticorpo, por exemplo,

a região Fc do anticorpo, de modo que as funções efetoras do anticorpo sejam alteradas. A dimerização de duas cadeias pesadas idênticas de uma imunoglobulina é mediada pela dimerização dos domínios CH3 e é estabilizada pelas ligações dissulfeto dentro da região de dobradiça que conecta os domínios constantes CH1 aos domínios constantes Fc (por exemplo, CH2 e CH3). A atividade antiinflamatória de IgG é completamente dependente da sialilação do glicano N-ligado do fragmento Fc de IgG. Os requisitos precisos de glicano para a atividade anti-inflamatória foram determinados, de modo que um fragmento Fc de IgG1 apropriado possa ser criado, gerando assim um Fc de IgG1 sialilado totalmente recombinante com potência muito aumentada (consulte Anthony et al., Science, 320: 373 a 376 (2008)).

[0086] Os termos “porção de ligação ao antígeno” e “fragmento de ligação ao antígeno” ou “fragmento funcional” de um anticorpo são usados indistintamente e se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno, ou seja, o mesmo antígeno (por exemplo, PD-1, LAG-3) como o anticorpo de comprimento total do qual a porção ou fragmento é derivado.

Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Tais modalidades de anticorpo também podem ser formatos biespecíficos, específicos duplos ou multiespecíficos; ligação específica a dois ou mais antígenos diferentes (por exemplo, PD-1 e um antígeno diferente, como LAG-3). Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature, 341: 544 a 546 (1989); Publicação no PCT WO 90/05144), que compreende um único domínio variável; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, com o uso de métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam produzidos como uma única cadeia de proteína na qual o VL e as regiões VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); consulte, por exemplo, Bird et al., Science, 242: 423 a 426 (1988); e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:

5.879 a 5.883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a ser abrangidos pelo termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo e termos equivalentes dados acima. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, como diacorpos, também estão incluídas. Diacorpos são anticorpos bivalentes biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, mas com o uso de um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (consulte, por exemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6.444 a 6.448 (1993). Tais porções de ligação de anticorpo são conhecidas na técnica (Kontermann e Dübel eds., Antibody Engineering (Springer- Verlag, Nova York, 2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5)). Além disso, os anticorpos de cadeia única também incluem “anticorpos lineares” que compreendem um par de segmentos Fv em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10):

1.057 a 1.062 (1995); e Patente n o US 5.641.870)).

[0087] Um domínio constante de imunoglobulina (C) se refere a um domínio constante de cadeia pesada (CH) ou leve (CL). As sequências de aminoácidos de domínio constante de cadeia pesada e leve de IgG murina e humana são conhecidas na técnica.

[0088] O termo “monoclonal anticorpo” ou “mAb” conforme comparado no presente documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para possíveis mutações naturalmente ocorrentes que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único determinante antigênico (epítopo). Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador “monoclonal” não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular.

[0089] O termo “anticorpo humano” inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo “anticorpo humano” não inclui anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas.

[0090] O termo “anticorpo humano recombinante” inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorpos expressos com o uso de um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios recombinantes (Hoogenboom, H.R., Trends Biotechnol., 15: 62 a 70 (1997); Azzazy e Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425 a 445 (2002); Gavilondo e Larrick, BioTechniques, 29: 128 a 145 (2000); Hoogenboom e Chames, Immunol. Today, 21: 371 a 378 (2000)), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (consulte, por exemplo, Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: 6.287 a 6.295 (1992); Kellermann e Green, Curr.

Opin. Biotechnol., 13: 593 a 597 (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: 364 a 370 (2000)); ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões constantes e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em certas modalidades, no entanto, taisa anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humano é usado, mutagênese somática in vivo) e, desse modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivados e relacionados às sequências de VH e VL de linha germinal humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo.

[0091] O termo “anticorpo quimérico” se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve de uma espécie e sequências de região constante de outra espécie, como anticorpos com regiões variáveis de cadeia pesada e leve de murino ligadas a regiões constantes humanas.

[0092] O termo “anticorpo enxertado com CDR” se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve de uma espécie, mas em que as sequências de uma ou mais das regiões CDR de VH e/ou VL são substituídas por sequências de CDR de outra espécie, como anticorpos com regiões variáveis da cadeia pesada e leve humana em que uma ou mais das CDRs humanas foram substituídas por sequências de CDR murinas.

[0093] O termo “anticorpo humanizado” se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve de uma espécie não humana (por exemplo,

um camundongo), mas em que pelo menos uma porção da sequência de VH e/ou VL foi alterada para ser mais “do tipo humano”, ou seja, mais semelhante às sequências variáveis da linha germinativa humana. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo enxertado com CDR, no qual sequências de CDR de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo) são introduzidas nas sequências estruturais de VH e VL humanas.

Um anticorpo humanizado é um anticorpo ou um variante, derivado, análogo ou fragmento do mesmo que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende regiões estruturais e regiões constantes tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano, mas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Conforme usado neste documento, o termo “substancialmente” no contexto de um CDR se refere a uma CDR que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de um não humano imunoglobulina (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém tanto a cadeia leve quanto pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada.

[0094] Um anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo, sem limitação, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções efetoras desejadas com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica.

[0095] A estrutura e as regiões CDR de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às sequências parentais, por exemplo, a CDR do anticorpo doador ou a estrutura aceitadora pode ser mutagenizada por substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido para que a CDR ou o resíduo da estrutura nesse sítio não corresponde ao anticorpo doador ou à estrutura de consenso. Em uma modalidade exemplificadora, tais mutações, no entanto, não serão extensas. Normalmente, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e com a máxima preferência pelo menos 95% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão àqueles das sequências parentais FR e CDR. A mutação reversa em uma posição de estrutura particular para restaurar o mesmo aminoácido que aparece nessa posição no anticorpo doador é frequentemente utilizada para preservar uma estrutura de alça particular ou para orientar corretamente as sequências de CDR para contato com o antígeno alvo.

[0096] O termo “CDR” se refere às regiões determinantes de complementaridade dentro de sequências de domínio variável de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3.

O termo “conjunto de CDRs”, como usado no presente documento, se refere a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável com capacidade de se ligar ao antígeno. Os limites exatos desses CDRs foram definidos de forma diferente de acordo com os diferentes sistemas. O sistema descrito por

Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) e (1991)) não fornece apenas um sistema de numeração de resíduo inequívoco aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites de resíduos precisos que definem as três CDRs.

[0097] O termo “numeração de Kabat”, que é reconhecido na técnica, se refere a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (ou seja, hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo. Consulte, Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382 a 391 (1971); e Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação no NIH 91-3242 (1991).

[0098] O crescimento e a análise de extensas bases de dados públicas de sequências de aminoácidos de regiões variáveis pesadas e leves ao longo dos últimos vinte anos levaram à compreensão dos limites típicos entre regiões estruturais (FRs) e sequências de CDR dentro de sequências de região variável e habilitaram pessoas habilitadas na técnica para determinar com precisão as CDRs de acordo com a numeração de Kabat, numeração de Chothia ou outros sistemas. Consulte, por exemplo, Martin, “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” In Kontermann e Dübel, eds., Antibody Engineering (Springer- Verlag, Berlim, 2001), capítulo 31, páginas 432 a 433.

[0099] O termo “proteína de ligação multivalente” denota uma proteína de ligação que compreende dois ou mais sítios de ligação ao antígeno. Uma proteína de ligação multivalente é preferencialmente projetada para ter três ou mais sítios de ligação ao antígeno e geralmente não é um anticorpo de ocorrência natural. O termo “proteína de ligação biespecífica” se refere a uma proteína de ligação com capacidade de ligar dois alvos de especificidade diferente.

As proteínas de ligação de “imunoglobulina Fabs-in-Tandem” (FIT-Ig) da invenção compreendem dois ou mais sítios de ligação ao antígeno e são tipicamente proteínas de ligação tetravalente. Um FIT-Ig pode ser monoespecífico, ou seja, com capacidade de se ligar a um antígeno, ou multiespecífico, ou seja, com capacidade de se ligar a dois ou mais antígenos.

Um FIT-Ig preferido de acordo com esta invenção liga PD-1 e LAG-3 e, portanto, é biespecífico. Uma proteína de ligação FIT-Ig que compreende dois polipeptídeos de cadeia VCVC-Fc longa (pesada) e quatro polipeptídeos de cadeia VC curta (leve) forma um hexâmero exibindo quatro sítios de ligação ao antígeno Fab (VH-CH1 emparelhado com VL-CL, às vezes notado VH-CH1::VL-CL). Cada metade de um FIT-Ig compreende um polipeptídeo de cadeia pesada e dois polipeptídeos de cadeia leve, e o emparelhamento de imunoglobulina complementar dos elementos VH-CH1 e VL-CL das três cadeias resulta em dois sítios de ligação ao antígeno estruturados em Fab, dispostos em tandem. Na presente invenção, é preferencial que os domínios de imunoglobulina que compreendem os elementos Fab sejam diretamente fundidos no polipeptídeo de cadeia pesada, sem o uso de ligantes entre domínios. Ou seja, o elemento V-C N-terminal das cadeias polipeptídicas longas (pesadas) é diretamente fundido em seu terminal C ao terminal N de outro elemento V-C, que por sua vez está ligado a uma região Fc C-terminal. Em proteínas de ligação biespecíficas de FIT-Ig, os elementos Fab em tandem serão reativos com diferentes antígenos. Cada sítio de ligação ao antígeno Fab compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve com um total de seis CDRs por sítio de ligação ao antígeno.

[00100] Uma descrição do projeto, expressão e caracterização de moléculas FIT-Ig é fornecida na Publicação PCT WO 2015/103072. Um exemplo preferencial de tais moléculas FIT-Ig compreende uma cadeia pesada e duas cadeias leves diferentes. A cadeia pesada compreende a fórmula estrutural VLA-CL-VHB-CH1-Fc em que CL é diretamente fundido a VH B ou VHB-CH1-VLA-CL-Fc onde CH1 é diretamente fundido a VL A, em que VLA é um domínio leve variável de um anticorpo parental que se liga ao antígeno A, VH B é um domínio pesado variável de um anticorpo parental que se liga ao antígeno B, CL é um domínio constante de cadeia leve, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada e Fc é uma região Fc de imunoglobulina (por exemplo, a porção dobradiça-CH2-CH3 C-terminal de uma cadeia pesada de um anticorpo IgG1). As duas cadeias polipeptídicas leves do FIT-Ig têm as fórmulas VHA-CH1 e VLB-CL, respectivamente. Em modalidades biespecíficas de FIT-Ig, o antígeno A e o antígeno B são antígenos diferentes ou epítopos diferentes do mesmo antígeno. Na presente invenção, um de A e B é PD-1 e o outro é LAG-3.

[00101] O termo “atividade” inclui propriedades como a capacidade de ligar um antígeno alvo com especificidade, a afinidade de um anticorpo por um antígeno, a capacidade de neutralizar a atividade biológica de um antígeno alvo, a capacidade de inibir a interação de um antígeno alvo com seu receptor (ou receptores) natural e similares. Anticorpos e proteínas de ligação preferenciais da presente invenção têm a capacidade de inibir a ligação de PD-1 ao seu ligante PD- L1, a capacidade de inibir a ligação de LAG-3 ao seu ligante MHC de Classe II, ou ambos no caso de proteínas de ligação biespecíficas aqui descritas.

[00102] O termo “kon” (também “Kon”, “kon”), como aqui usado, destina-se a referir-se à constante de taxa de associação de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) a um antígeno para formar um complexo de associação, por exemplo, complexo anticorpo/antígeno, como é conhecido na técnica. O “kon” também é conhecido pelos termos “constante de taxa de associação” ou “ka”, conforme usados de forma intercambiável neste documento. Esse valor indica a taxa de ligação de um anticorpo ao seu antígeno alvo ou a taxa de formação de complexo entre um anticorpo e o antígeno, conforme mostrado pela equação abaixo: Anticorpo (“Ab”) + Antígeno (“Ag”)→Ab-Ag.

[00103] O termo “koff” (também “Koff”, “koff”), como aqui usado, destina-se a referir-se à constante de taxa de dissociação, ou “constante de taxa de dissociação”, de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) de um complexo de associação (por exemplo, um complexo anticorpo/antígeno) como é conhecido na técnica. Esse valor indica a taxa de dissociação de um anticorpo de seu antígeno alvo ou separação do complexo Ab-Ag ao longo do tempo em anticorpo e antígeno livres, conforme mostrado pela equação abaixo: Ab + Ag Ab-Ag.

[00104] O termo “KD” (também “Kd”), como aqui usado, destina-se a referir-se à “constante de dissociação de equilíbrio” e se refere ao valor obtido em uma medição de titulação em equilíbrio, ou dividindo a constante de taxa de dissociação (koff) pela constante da taxa de associação (k on).

A constante de taxa de associação (k on), a constante de taxa de dissociação (koff) e a constante de dissociação de equilíbrio (KD) são usadas para representar a afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno. Os métodos para determinar as constantes de taxa de associação e dissociação são bem conhecidos na técnica. O uso de técnicas baseadas em fluorescência oferece alta sensibilidade e a capacidade de examinar amostras em buffers fisiológicos em equilíbrio.

Outras abordagens e instrumentos experimentais, como um ensaio BIAcore® (análise de interação biomolecular), podem ser usados (por exemplo, instrumento disponível na BIAcore International AB, uma empresa GE Healthcare, Uppsala, Suécia). A interferometria de biolamada (BLI) com o uso, por exemplo, do sistema Octet® RED96 (Pall FortéBio LLC), é outra técnica de ensaio de afinidade. Além disso, um ensaio KinExA® (Ensaio de Exclusão Cinética), disponível na Sapidyne Instruments (Boise, Idaho), também pode ser usado.

[00105] O termo “ácido nucleico isolado” deve significar um polinucleotídeo (por exemplo, de origem genômica, cDNA ou sintética, ou alguma combinação dos mesmos) que, por intervenção humana, não está associado a todos ou a uma parte dos polinucleotídeos com os quais é encontrado na natureza; está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[00106] O termo “vetor”, como aqui usado, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico com capacidade de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores têm a capacidade de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma do hospedeiro.

Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados.

Esses vetores são aqui referidos como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados indistintamente, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção se destina a incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.

[00107] O termo “operacionalmente ligado” se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida.

Uma sequência de controle “operacionalmente ligada” a uma sequência de codificação é ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação seja alcançada em condições compatíveis com a sequência de controle.

Sequências “operacionalmente ligadas” incluem sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e sequências de controle de expressão que atuam in trans ou à distância para controlar o gene de interesse. O termo “sequência de controle de expressão”, como aqui usado, se refere a sequências de polinucleotídeos que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento de sequências de codificação às quais estão ligadas. As sequências de controle de expressão incluem as sequências apropriadas de iniciação, terminação, promotor e intensificador da transcrição; sinais de processamento de RNA eficientes, como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência da tradução (isto é, sequência de consenso Kozak); sequências que aumentam a estabilidade da proteína; e quando desejado,

sequências que aumentam a secreção de proteínas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossômica e sequência de terminação da transcrição; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controle incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. O termo “sequências de controle” se destina a incluir componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder ou de sinal e sequências parceiras de fusão.

[00108] “Transformação”, conforme definido neste documento, se refere a qualquer processo pelo qual o DNA exógeno entra em uma célula hospedeira. A transformação pode ocorrer em condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na técnica. A transformação pode basear-se em qualquer método conhecido para a inserção de sequências de ácido nucleico estranhas em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. O método é selecionado com base na célula hospedeira sendo transformada e pode incluir, sem limitação, transfecção, infecção viral, eletroporação, lipofecção e bombardeio de partículas. Essas células “transformadas” incluem células transformadas de forma estável nas quais o DNA inserido tem a capacidade de se replicar como um plasmídeo de replicação autônoma ou como parte do cromossomo hospedeiro. As mesmas também incluem células que expressam transitoriamente o DNA ou RNA inserido por períodos limitados de tempo.

[00109] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), destina-se a referir-se a uma célula na qual o DNA exógeno foi introduzido. Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende dois ou mais (por exemplo, múltiplos) ácidos nucleicos que codificam anticorpos, como as células hospedeiras descritas na Patente no US 7.262.028, por exemplo. Esses termos pretendem referir- se não apenas à célula em questão em particular, mas também à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo “célula hospedeira”, conforme usado neste documento.

Em uma modalidade, as células hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas selecionadas de qualquer um dos reinos da vida. Em outra modalidade, as células eucarióticas incluem células protistas, fúngicas, vegetais e animais. Em outra modalidade, as células hospedeiras incluem, sem limitação, a linha de células procarióticas Escherichia coli; linhas de células de mamíferos CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 e PER.C6; a linha celular de inseto Sf9; e a célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

[00110] As técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou conforme descrito neste documento. As técnicas e procedimentos anteriores podem ser geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Consulte, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

[00111] O termo “agonista”, como aqui usado, se refere a um modulador que, quando em contato com uma molécula de interesse, causa um aumento na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula em comparação com a magnitude da atividade ou função observada na ausência do agonista. Os termos “antagonista” e “inibidor”, como aqui usado, se referem a um modulador que, quando em contato com uma molécula de interesse causa uma diminuição na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula em comparação com a magnitude da atividade ou função observada na ausência do antagonista. Antagonistas de interesse particulares incluem aqueles que bloqueiam ou reduzem a atividade biológica ou imunológica de PD-1 humana e LAG-3 humana.

[00112] Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou melhorar a gravidade e/ou duração de um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo; prevenir o avanço de um distúrbio; causar regressão de um distúrbio; prevenir a recorrência, desenvolvimento ou progressão de um ou mais sintomas associados a um distúrbio; detectar um distúrbio; ou aumentar ou melhorar o efeito (ou efeitos) profilático ou terapêutico de outra terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico).

Produção de Anticorpos Anti-PD-1 e Anti-LAG-3

[00113] Os anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 da presente invenção podem ser produzidos por meio de qualquer uma de uma série de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a expressão de células hospedeiras, em que o vetor (ou vetores) de expressão que codifica as cadeias pesadas e leves é transfectado em uma célula hospedeira por meio de técnicas padrão. As várias formas do termo “transfecção” destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo,

eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e similares. Embora seja possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferencial, e com a máxima preferência em células hospedeiras de mamífero, devido ao fato de que é mais provável que tais células eucarióticas (e em particular células de mamífero) do que as células procarióticas montem e secretem um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[00114] As células hospedeiras de mamíferos preferenciais para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem o ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr –, descritas em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.216 a 4.220 (1980), usadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601 a 621 (1982)), células de mieloma NS0, células COS e células SP2.

Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura com o uso de métodos padrão de purificação de proteínas.

[00115] As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, como fragmentos Fab ou moléculas scFv. Será entendido que as variações no procedimento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica fragmentos funcionais da cadeia leve e/ou da cadeia pesada de um anticorpo desta invenção. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para a ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da invenção. Além disso, os anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo da invenção e a outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno diferente dos antígenos de interesse por reticulação de um anticorpo da invenção a um segundo anticorpo por métodos de reticulação química padrão.

[00116] Em um sistema exemplificador para a expressão recombinante de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, da invenção, um vetor de expressão recombinante que codifica a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido em células CHO dhfr - por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes de cadeia pesada e leve do anticorpo estão cada um operativamente ligados a elementos reguladores do intensificador de CMV/promotor de AdMLP para conduzir altos níveis de transcrição dos genes.

O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor com o uso de seleção/amplificação com metotrexato. As células hospedeiras transfectadas selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesadas e leves do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transfectantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura. Além disso, a invenção fornece um método de produção de um anticorpo anti- PD-1 ou anti-LAG-3 recombinante da invenção por cultura de uma célula hospedeira transfectada da invenção em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante da invenção seja produzido. O método pode ainda compreender o isolamento do anticorpo recombinante do meio de cultura.

Produção de FIT-Igs Biespecíficos que se Ligam a PD-1 e LAG-3

[00117] Estudos clínicos que usam inibidores de ponto de verificação imunológico, como anticorpos direcionados a PD-1, PD-L1 e CTLA-4, levaram a resultados promissores, no entanto, foi observado que apenas um subconjunto de pacientes responde inicialmente a esses inibidores, e evidências clínicas crescentes indicam que uma proporção substancial dos respondentes iniciais finalmente recai, com doença letal resistente aos fármacos meses ou anos depois. Syn et al., The Lancet Oncology, 18(12):e731–e741 (2017). Ambos LAG-3 e PD-1 são co-expressos em linfócitos infiltrados por tumor tolerados (TILS), contribuindo para a supressão imunológica em tumores; e o bloqueio duplo de LAG-3 e PD-1 foi proposto como um meio para restaurar a função antitumoral em células T CD8 +. Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(17): 7.875 a 7.880 (2010). Por conseguinte, o projeto de proteínas de ligação biespecíficas LAG-3/PD-1 que podem bloquear ambos os alvos em células T imunossuprimidas simultaneamente, pode fornecer um avanço nessa área terapêutica.

[00118] Esta invenção fornece proteínas de ligação de imunoglobulina Fabs-in-Tandem (FIT-Igs) que se ligam a PD-1 e LAG-3. Uma modalidade exemplar de tais moléculas FIT-Ig compreende (1) uma cadeia polipeptídica pesada que compreende a fórmula estrutural (i) VL A-CL-VHB-CH1-Fc em que CL é diretamente fundido a VH B, ou a fórmula estrutural (ii)

VHB-CH1-VLA-CL-Fc em que CH1 está diretamente fundido com VLA; (2) uma cadeia polipeptídica leve de fórmula VH A-CH1; e (3) outra cadeia polipeptídica leve da fórmula VL B-CL,

[00119] em que VL é um domínio variável de cadeia leve, CL é um domínio constante de cadeia leve, VH é um domínio variável de cadeia pesada, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, Fc é uma região Fc de imunoglobulina, A é um epítopo de PD-1 ou LAG-3 e B é um epítopo de PD-1 ou LAG- 3, com a condição de que A e B sejam diferentes. De acordo com a presente invenção, tais proteínas de ligação a FIT-Ig ligam-se a PD-1 e LAG-3.

[00120] Um FIT-Ig pode compreender duas dessas cadeias pesadas (1), duas dessas cadeias leves (2) e duas dessas cadeias leves (3), formando um monômero de proteína de ligação de seis cadeias exibindo quatro sítios de ligação do antígeno Fab funcionais. Tal proteína de ligação a FIT- Ig compreende duas subunidades idênticas, em que cada subunidade compreende uma cadeia pesada (1), uma cadeia leve (2) e uma cadeia leve (3) que, juntas, formam um par de sítios de ligação Fab dispostos em tandem. O emparelhamento das regiões Fc de duas de tais subunidades produz uma proteína de ligação FIT-Ig de seis cadeias, biespecífica, da invenção com um total de quatro unidades funcionais de ligação de Fab.

[00121] É possível usar um ligante peptídico na cadeia pesada para separar as porções Fab conectadas em tandem, no entanto, para FIT-Igs biespecíficos de acordo com a invenção, a omissão de tais sequências ligantes é preferencial.

Considerando que em formatos de imunoglobulina manipulada multivalente que têm sítios de ligação em tandem, era comumente entendido no campo que os sítios de ligação adjacentes interfeririam uns com os outros, a menos que um ligante flexível fosse usado para separar os sítios de ligação espacialmente. Foi constatado para o PD-1/LAG-3 FIT- Igs da presente invenção, no entanto, que o arranjo dos domínios de imunoglobulina de acordo com as fórmulas de cadeia fornecidas acima resulta em cadeias polipeptídicas que são bem expressas em células de mamíferos transfectadas, se montam apropriadamente e são secretadas como proteínas de ligação similares a imunoglobulinas multivalentes biespecíficas que se ligam aos antígenos alvo PD-1 e LAG-3.

Consulte o Exemplo 10, infra. Apesar da ausência de quaisquer sequências de ligante entre os sítios de ligação de Fab, os PD-1/LAG-3 FIT-Igs da invenção retêm as afinidades de ligação para os antígenos alvo, exibindo afinidades de ligação comparáveis aos mAbs parentais. Além disso, a omissão de sequências de ligantes sintéticos das proteínas de ligação pode evitar a criação de sítios antigênicos reconhecíveis pelo sistema imunológico de mamíferos e, dessa forma, a eliminação de ligantes diminui a possível imunogenicidade de

FIT-Igs e leva a uma meia-vida em circulação que é como um anticorpo natural, ou seja, o FIT-Ig não é eliminado rapidamente por meio de opsonização imunológica e captura no fígado.

[00122] Cada domínio variável (VH ou VL) em um FIT- Ig pode ser obtido a partir de um ou mais anticorpos monoclonais “parentais” que se ligam a um dos antígenos alvo, isto é, PD-1 ou LAG-3. As proteínas de ligação a FIT-Ig são vantajosamente produzidas com o uso de sequências de domínio variável de anticorpos monoclonais anti-PD-1 e anti-LAG-3 como aqui revelado. De preferência, os anticorpos parentais são anticorpos humanizados.

[00123] Um aspecto da presente invenção se refere à seleção de anticorpos parentais com pelo menos uma ou mais propriedades desejadas na molécula FIT-Ig. Em uma modalidade, as propriedades do anticorpo são selecionadas do grupo que consiste em especificidade de antígeno, afinidade para antígeno, potência, função biológica, reconhecimento de epítopo, estabilidade, solubilidade, eficiência de produção, falta de imunogenicidade, farmacocinética, biodisponibilidade, reatividade cruzada de tecido e ligação de antígeno ortólogo. PD-1 e LAG-3 são proteínas de superfície celular, e a interação com seus respectivos ligantes PD-L1 (receptor de superfície celular) e MHC de classe II (proteínas de superfície em células apresentadoras de antígeno) levam à sinalização intracelular envolvida com supressão de células T e imunidade resposta. Por conseguinte, a capacidade de os anticorpos anti-PD-1, anticorpos anti- LAG-3 e proteínas de ligação a FIT-Ig PD-1/LAG-3 de acordo com a invenção inibir interação PD-1/PD-L1 e/ou Classe MHC II/LAG-3 os torna reguladores potentes da ativação de células imunes e da atividade de células efetoras imunes.

[00124] Os anticorpos, fragmentos funcionais dos mesmos e proteínas de ligação de acordo com a invenção podem ser purificados (para um uso pretendido) com o uso de um ou mais de uma variedade de métodos e materiais disponíveis na técnica para purificar anticorpos e proteínas de ligação.

Tais métodos e materiais incluem, sem limitação, cromatografia de afinidade (por exemplo, com o uso de resinas, partículas ou membranas conjugadas com Proteína A, Proteína G, Proteína L ou um ligante específico do anticorpo, fragmento funcional do mesmo ou proteína de ligação), cromatografia de troca iônica (por exemplo, com o uso de partículas ou membranas de troca iônica), cromatografia de interação hidrofóbica (“HIC”; por exemplo, com o uso de partículas ou membranas hidrofóbicas), ultrafiltração, nanofiltração, diafiltração, cromatografia de exclusão de tamanho (“SEC”), tratamento de baixo pH (para inativar vírus contaminantes), e combinações dos mesmos, para obter uma pureza aceitável para um uso pretendido. Um exemplo não limitativo de um tratamento de baixo pH para inativar vírus contaminantes compreende reduzir o pH de uma solução ou suspensão que compreende um anticorpo, fragmento funcional do mesmo ou proteína de ligação da invenção para pH 3,5 com ácido fosfórico 0,5 M, a 18 °C a 25 °C, por 60 a 70 minutos.

Usos de Anticorpos e Proteínas de Ligação da Invenção

[00125] Dada sua capacidade de se ligar a PD-1 e/ou LAG-3 humano, os anticorpos aqui descritos, fragmentos funcionais dos mesmos e proteínas de ligação multivalentes biespecíficas aqui descritas podem ser usados para detectar PD-1 ou LAG-3, ou ambos, por exemplo, em uma amostra biológica contendo células que expressam um ou ambos os antígenos alvo. Os anticorpos, fragmentos funcionais e proteínas de ligação da invenção podem ser usados em um imunoensaio convencional, como um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou imuno- histoquímica de tecidos. A invenção fornece um método para detectar PD-1 ou LAG-3 em uma amostra biológica, que compreende colocar uma amostra biológica em contato com um anticorpo, porção de ligação ao antígeno do mesmo ou proteína de ligação da invenção e detectar se a ligação a um antígeno alvo ocorre, detectando assim a presença ou ausência do alvo na amostra biológica. O anticorpo, fragmento funcional ou proteína de ligação pode ser marcado direta ou indiretamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo/fragmento/proteína de ligação ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, -galactosidase ou acetilcolinesterase. Exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho ou 153Sm.

[00126] Os anticorpos, fragmentos funcionais dos mesmos e proteínas de ligação da invenção têm, de preferência, a capacidade de neutralizar a atividade de PD- 1 humana e/ou LAG-3 humana tanto in vitro quanto in vivo.

Consequentemente, os anticorpos, fragmentos funcionais dos mesmos e proteínas de ligação da invenção podem ser usados para inibir a atividade de PD-1 humano e/ou LAG-3 humano, por exemplo, inibir a sinalização celular mediada por interação PD-1/PD-L1 (ou PD-1/PD-L2) e/ou interação MHC Classe II/LAG-3 em uma cultura de células contendo células que expressam PD-1 e/ou LAG-3, em indivíduos humanos, ou em outros indivíduos mamíferos com PD-1 ou LAG-3 com a qual um anticorpo, fragmento funcional do mesmo ou proteína de ligação da invenção reage de forma cruzada. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para restaurar a atividade de células T ativadas (revertendo a supressão) que compreende colocar células humanas que expressam PD-1 em contato com um anticorpo anti-PD-1 ou proteína de ligação a PD-1 da invenção de modo que a atividade de PD-1 seja inibida. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método para restaurar a atividade de células T ativadas (revertendo a supressão) que compreende colocar células humanas que expressam LAG-3 em contato com um anticorpo anti- LAG-3 ou proteína de ligação a LAG-3 da invenção de modo que a atividade de LAG-3 seja inibida.

[00127] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para tratar um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio em que a atividade de PD-1 e/ou LAG-3 é prejudicial, em que tal método compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo ou proteína de ligação da invenção em uma quantidade eficaz, de modo que a atividade mediada pela ligação de PD-1/PD-L1 ou PD-1/PD-L2 e/ou ligação de MHC Classe II/LAG-3 no indivíduo seja reduzida.

[00128] Como aqui usado, o termo “um distúrbio no qual a atividade de PD-1 e/ou LAG-3 é prejudicial” destina-se a incluir doenças e outros distúrbios em que a interação de

PD-1 com um ou ambos os seus ligantes (PD- L1, PD-L2) ou a interação de LAG-3 com seu ligante (MHC Classe II) em um indivíduo que sofre do distúrbio é responsável pela fisiopatologia do distúrbio ou é um fator que contribui para o agravamento do distúrbio. Consequentemente, um distúrbio em que a atividade de PD-1 e/ou LAG-3 é prejudicial é um distúrbio em que se espera que a inibição da atividade de PD-1 e/ou LAG-3 alivie os sintomas e/ou a progressão do distúrbio.

[00129] Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma doença autoimune ou um câncer em um indivíduo em necessidade disso, que compreende a administração ao indivíduo de um anticorpo, fragmento funcional do mesmo ou uma proteína de ligação aqui descrita que tem a capacidade de se ligar a LAG-3 , PD-1 ou ambos LAG-3 e PD-1, e em que a doença autoimune ou câncer é uma doença que responde à imunoterapia. Em outra modalidade, um método da invenção é usado para o tratamento de uma doença autoimune ou câncer que não foi associado a imunoterapia. Em outra modalidade, um método da invenção é usado para tratar um câncer que é uma doença maligna refratária ou recorrente.

Em outra modalidade, um anticorpo LAG-3 ou PD-1, fragmento funcional do mesmo ou uma proteína de ligação biespecífica LAG-3/PD-1 da invenção é usado em um método que inibe o crescimento ou sobrevivência de células tumorais.

[00130] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para o tratamento de câncer em um indivíduo que compreende a etapa de administração ao indivíduo de um anticorpo para PD-1 ou LAG-3 aqui descrito, um fragmento funcional do mesmo, ou uma proteína de ligação biespecífica LAG-3/PD-1 aqui descrita, por exemplo, como uma proteína de ligação de imunoglobulina Fabs-in-tandem (FIT-Ig), em que o câncer é selecionado de qualquer um de um grupo que consiste em: um melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), um renal câncer (por exemplo, carcinoma de células claras), um câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), um adenocarcinoma pancreático, um câncer de mama, um câncer de cólon, um câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), um câncer de esôfago, a carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, um câncer de fígado, um câncer de ovário, um câncer cervical, um câncer de tireoide, um glioblastoma, um glioma, uma leucemia, um linfoma, um câncer ósseo primário (por exemplo, osteossarcoma, sarcoma de Ewing, maligno histiocitoma fibroso e condrossarcoma), um câncer metastático e outras doenças neoplásicas.

[00131] A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreende um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma proteína de ligação multivalente biespecífica da invenção (isto é, o ingrediente ativo primário) e um carreador farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas que compreendem proteínas da invenção são para uso em, sem limitação, diagnóstico, detecção ou monitoramento de um distúrbio; tratar, administrar ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo; e/ou pesquisa. Em uma modalidade específica, uma composição compreende um ou mais anticorpos ou proteínas de ligação da invenção. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um ou mais anticorpos ou proteínas de ligação da invenção e um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos diferentes de anticorpos ou proteínas de ligação da invenção para o tratamento de um distúrbio em que PD-1 e/ou LAG-3 atividade é prejudicial. Em uma modalidade, os agentes profiláticos ou terapêuticos são conhecidos por serem úteis ou têm sido ou estão atualmente sendo usados na prevenção, tratamento, gerenciamento ou melhoria de um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo. De acordo com essas modalidades, a composição pode compreender ainda um carreador, diluente ou excipiente. Um excipiente é geralmente qualquer composto ou combinação de compostos que fornece uma característica desejada a uma composição diferente daquela do ingrediente ativo primário (isto é, diferente de um anticorpo, porção funcional do mesmo ou proteína de ligação da invenção).

[00132] Os anticorpos (incluindo fragmentos funcionais dos mesmos) e proteínas de ligação da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou proteína de ligação da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis.

Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois (como manitol ou sorbitol) ou cloreto de sódio na composição. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de substâncias auxiliares, como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentam o prazo de validade ou eficácia do anticorpo ou proteína de ligação presente na composição.

[00133] Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem, sem limitação, administração parenteral (por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular), oral, intranasal (por exemplo, inalação), transdérmica (por exemplo, tópica), intratumoral, transmucosa e administração retal. Em uma modalidade específica, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, intranasal ou tópica a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, como lidocaína (xilocaína, lidocaína), para aliviar a dor no local da injeção.

[00134] O método da invenção pode compreender a administração de uma composição formulada para administração parenteral por injeção (por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua). As formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. As composições podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em carreadores oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Alternativamente, o ingrediente ativo primário pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado (por exemplo, água estéril apirogênica) antes do uso.

[00135] Os métodos da invenção podem compreender adicionalmente a administração de composições formuladas como preparações de depósito. Essas formulações de ação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, as composições podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis (por exemplo, como um sal moderadamente solúvel).

[00136] Um anticorpo, fragmento funcional do mesmo ou proteína de ligação da invenção também pode ser administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis no tratamento de várias doenças. Anticorpos, fragmentos funcionais dos mesmos e proteínas de ligação aqui descritas podem ser usados sozinhos ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, em que o dito agente adicional é selecionado pelo especialista para o propósito pretendido. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na técnica como sendo útil para tratar a doença ou condição a ser tratada pelo anticorpo ou proteína de ligação da presente invenção. O agente adicional também pode ser um agente que confere um atributo benéfico à composição terapêutica, por exemplo, um agente que afeta a viscosidade da composição.

[00137] Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma será mais claramente entendida por referência aos exemplos a seguir, que são incluídos apenas para fins de ilustração e não se destinam a ser limitantes da invenção.

Exemplos Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais PD-1 Anti- humanos

[00138] Os anticorpos monoclonais anti-PD-1 humanos foram gerados da seguinte forma: Exemplo 1.1: Imunização com Antígeno PD-1 Humano

[00139] 50 µg de polipeptídeo de domínio extracelular (ECD) de PD-1 humano purificado recombinante misturado com adjuvante de Freund completo foram injetados intraperitonealmente em cinco camundongos Balb/C de 6-8 semanas de idade e cinco camundongos SJL no Dia 1. Nos dias 16 e 26, 25 µg de imunógeno de ECD PD-1 humano purificado recombinante misturado com adjuvante de Freund incompleto foram injetados intraperitonealmente nos mesmos camundongos.

Um reforço final com 25 µg do imunógeno foi dado 3-4 dias antes da fusão.

Exemplo 1.2: Geração de Hibridomas

[00140] Os esplenócitos obtidos dos camundongos imunizados descritos no Exemplo 1.1 foram fundidos com células SP2/0-Ag-14 a uma razão de 5:1 de acordo com o método estabelecido descrito em Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 a 497 (1975) para gerar hibridomas. Os produtos de fusão foram semeados em meios de seleção contendo hipoxantina- aminopterina-timidina (HAT) em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 105 células de baço por poço. Sete a dez dias após a fusão, foram observadas colônias de hibridoma macroscópico.

Exemplo 1.3: Avaliação da atividade de ligação PD-1 por ELISA e FACS

[00141] A presença de anticorpos específicos de PD-1 foi avaliada por Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA), como segue: Em primeiro lugar, os alvos sintéticos para PD-1 anti- humano, PD-1 anti-cinomólogocinomólogo e PD-1 anti-murino foram feitos sob encomenda pela Synbio Technologies (Suzhou, China). Cada alvo consistia em um segmento polipeptídico do domínio extracelular (ECD) da proteína humana, cinomólogo ou murina PD-1 fundida a uma região Fc de IgG humana. Os genes sintéticos que codificam cada proteína de fusão ECD-Fc foram subclonados em um vetor de expressão pCP (Chempartner, Shanghai, China) e os plasmídeos de expressão foram transitoriamente transfectados em células HEK 293E em 1-3 litros de meio e cultivados por sete dias em um agitador de CO2. As sequências de ECD usadas para cada fusão são apresentadas na Tabela 1, abaixo. A porção do ECD PD-1 de cada proteína de fusão está sublinhada.

Tabela 1: Sequências de Aminoácidos para Alvos de Proteína de Fusão PD-1 ECD-Fc Sequência de Aminoácidos SEQ ID Fonte de PD- 1234567890123456789012345678901234567 NO 1 890

LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSE SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVT QLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIK ESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQIEGRM

DPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM 1 humano ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK LESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASE SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVT RLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIK ESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQIEGRM

DPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM macaco 2 ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT cinomólogo

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK LEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSE DLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQII QLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIE ESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQIEGRM

DPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM 3 camundongo

ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

Sequência de Aminoácidos SEQ ID Fonte de PD- 1234567890123456789012345678901234567 NO 1 890

QKSLSLSPGK

[00142] Os sobrenadantes de transfectantes HEK 293E contendo fusões ECD/Fc recombinantes foram coletados por centrifugação a 4000 × g durante 30 minutos, seguido de purificação de proteína A usando resina de afinidade MabSelect SuRe™ (GE Healthcare). Os produtos de fusão foram dialisados contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 e armazenados em -80° C.

[00143] As placas de ELISA foram incubadas durante a noite a 4 °C com 50 µl dos alvos de proteína de fusão humana PD-1 ECD/Fc sintéticos descritos acima diluídos em tampão PBS, pH 7,4, a 1 µg/ml. As placas foram lavadas quatro vezes em tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20) e bloqueadas durante 1 hora a 37 °C com 200 µl por tampão de bloqueio de poço (BSA a 1% em PBS contendo Tween 20 a 0,05%).

Após a remoção do tampão de bloqueio, o sobrenadante do hibridoma (ou mAbs purificados posteriormente diluídos) foi adicionado aos poços a 100 µl por poço e incubados a 37 °C durante 1 hora. Os poços foram lavados quatro vezes com tampão de lavagem e HRP anti-camundongo (Sigma) para caracterização do anticorpo PD-1 anti-humano de camundongo foi diluído 1:5000 e adicionado aos poços a 100 µl por poço.

As placas foram incubadas durante 1 hora a 37 °C e lavadas quatro vezes em tampão de lavagem. 100 µl de solução cromogênica de tetrametilbenzidina (TMB) foram adicionados por poço. Após o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida com 1 HCl normal e a absorvância a 450 nm foi medida em um leitor de placas SpectraMax® M5e (Molecular Devices; San Jose, Califórnia, EUA).

Exemplo 1.4: Preparação de Linhas Celulares que Expressam PD-1 e Análise FACS

[00144] Linhas celulares estáveis com superexpressão de PD-1 humano ou PD-1 cinomólogo foram geradas por transfecção de células CHO-K1 (obtidas junto à ATCC) com vetores de plasmídeo lentiviral pLvx (Clontech) com genes inseridos que codificam PD-1 humano ou PD-1 cinomólogo. Os clones únicos foram isolados por diluição limitante. Os clones foram rastreados quanto ao nível de expressão por análise de FACS com o uso de anticorpos anti-PD-1 produzidos de forma recombinante a partir de sequências de anticorpos conhecidas (Chempartner), e os clones com maior expressão de PD-1 foram selecionados para uso em ensaios de ligação FACS e ensaios funcionais, conforme descrito abaixo.

[00145] Ensaio de Ligação para Alvos de Superfície Celular: A capacidade dos anticorpos purificados para se ligarem a PD-1 humana da membrana celular ou PD-1 de macaco cinomólogo foi determinada por análise FACS. Células CHO-K1 expressando estavelmente PD-1 humana (células CHO-K1-hPD-1) ou PD-1 cinomólogo (CHO-K1-cynoPD-1) foram ressuspensas em PBS contendo FBS a 2% (tampão FACS) e semeadas em 2 × 10 4 células/poço em placas de fundo redondo de 96 poços (Corning; Cat. No 3799). Os sobrenadantes de hibridomas que produzem anticorpos anti-PD-1 foram adicionados aos poços e detectados com Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado IgG anti-camundongo de Burro (H+L) AlexaFluor® 488 (Invitrogen; Cat. No A-21202), e a placa de ensaio foi então lida em um citômetro de fluxo. Hibridomas que produzem sinalização de sobrenadante positiva contra alvos que expressam PD-1 humana foram ainda caracterizados usando células CHO-K1/cynoPD-1 para determinar a reatividade cruzada dos anticorpos com PD-1 cinomólogo.

Exemplo 1.5: Ensaio de Bloqueio de Receptor (RBA)

[00146] Os sobrenadantes exibindo atividade específica de PD-1 foram testados quanto à capacidade de bloquear a ligação de PD-1 aos seus ligantes PD-L1 e PD-L2 usando PD-1 ECD/Fc humano imobilizado como alvo e PD-L1/Fc e PD-L2/Proteínas de fusão Fc, preparadas da mesma maneira que as proteínas de ligação a PD-1 ECD/Fc descritas no Exemplo 1.3 acima. Para determinar a potência relativa dos sobrenadantes contendo anticorpos, foi avaliada sua capacidade de inibir a ligação de um ligante PD-1 humano (PD-L1 ou PD-L2) à proteína PD-1 humana. As placas de ELISA foram revestidas com 100 µl de 50 ng/ml de huPD-1/Fc (isto é, o domínio extracelular de PD-1 enxertado no terminal N de uma região Fc humana, recuperado como um homodímero) em PBS e incubado durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas quatro vezes em tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,05%) e bloqueadas por 1 hora a 37 °C com 200 µl por poço de tampão de bloqueio (BSA a 1% em PBS contendo Tween 20 a 0,05%) . Após a remoção do tampão de bloqueio, o sobrenadante de hibridoma (50 µl) foi adicionado aos poços, misturado com 50 µl de PD-L1/Fc humano biotinilado (concentração final de 1,0 mg/ml) em tampão de bloqueio ou 50 µl de PD-L2/humano biotinilado Fc (concentração final de 50 µg/ml) em tampão de bloqueio, depois incubado a 37 °C durante 1 hora. O sinal foi desenvolvido adicionando estreptavidina-HRP (Sigma, Cat.

no S2468) (100 µl/poço de estreptavidina-HRP na diluição 1:5000) e incubação durante 40 minutos a 37 °C e lavados quatro vezes em tampão de lavagem. 100 µl de solução TMB foram adicionados por poço. Após o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida com 1 HCl normal e a absorvância a 450 nm foi medida.

Exemplo 1.6: Expressão e Purificação de Anticorpos Monoclonais anti-PD-1

[00147] Células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais murinos foram cultivadas em meio de expressão FreeStyle™ 293 (Gibco/Life Technologies) em um agitador de

CO2 a 37 °C por 5 a 7 dias. O meio condicionado foi coletado por centrifugação a 4000 × g por 30 minutos para remover todas as células e resíduos celulares, em seguida, filtrado através de uma membrana de 0,22 μm antes da purificação. Os anticorpos murinos foram aplicados e ligados a uma coluna de resina de proteína A MabSelect™ SuRe (GE Healthcare) de acordo com as diretrizes do fabricante, lavados com PBS, eluídos com tampão contendo citrato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 3,5. Os materiais eluídos foram neutralizados com Tris 1 M a pH 8,0 imediatamente e dialisados contra PBS. Os anticorpos purificados de uma etapa geralmente têm pureza acima de 90%, conforme detectado por SEC-HPLC. As concentrações de proteína foram determinadas medindo a absorbância a 280 nm ou por espectrofotômetro de microvolume NanoDrop™ (Thermo Scientific). Os anticorpos purificados foram armazenados em alíquotas em freezer a -80 °C.

Exemplo 2: Atividade de Ligação de Anticorpos anti-PD- 1 Purificados Exemplos 2.1: Caracterização por ELISA

[00148] Um ELISA de ligação foi realizado da mesma maneira que a descrita no Exemplo 1.3 acima. Cada anticorpo purificado foi diluído em série 10 vezes e duplicado. Após o bloqueio da placa de ensaio de 96 poços com poços contendo alvos de proteína de fusão PD-1 ECD/Fc imobilizados, as amostras de anticorpos purificados com concentrações diluídas foram adicionadas aos poços das placas de ensaio.

O anticorpo IgG anti-camundongo ligado a HRP (A0168, Sigma) e o reagente TMB foram usados para detectar e desenvolver o sinal ELISA, que foi lido em um leitor de placa SpectraMax® M5e no comprimento de onda de 450 nm. As curvas foram ajustadas com o uso do software GraphPad e o EC50 foi calculado. Da mesma forma, um ensaio de bloqueio do receptor (RBA) também foi realizado como descrito no Exemplo 1.5 com anticorpos purificados titulados e as percentagens de bloqueio superiores e os valores de IC50 foram determinados.

Exemplo 2.2: Caracterização por FACS

[00149] As células CHO-K1/huPD-1 ou CHO-K1/cynoPD-1, descritas acima, foram carregadas a 2 × 10 4 células por poço em placas de ensaio de fundo redondo de ensaio de 96 poços (Cat. no 3799; Corning) e manchadas com anticorpos anti-PD- 1 purificados. Os anticorpos PD-1 foram detectados com o anticorpo secundário de alta adsorção cruzada IgG anti- camundongo de burro AlexaFluor® (H+L) (Cat. no A21202; Invitrogen), e a fluorescência das células foi monitorada com o uso de um citômetro de fluxo. Os dados foram processados pelo software GraphPad e os valores de EC50 foram calculados.

[00150] Os resultados destes ensaios de caracterização de ligação são mostrados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Atividade de Ligação de Anticorpos anti-PD-1

Purificados Ensaio de Bloqueio de

ELISA FACS Receptor (RBA) Revesti CHO- CHO-K1/ Ligante 1 Ligante 2 r huPD- K1/ cynoPD- Identifi (huPD-L1) (huPD-L2) 1/Fc huPD-1 1 cador de mAb inibiç EC50 EC50 EC50 IC50 inibição IC50 ão TOP (nM) (nM) (nM) (nM) TOP (%) (nM) (%) mAb701 0,10 3,0 3,8 87,1 5,32 94,1 2,67 mAb703 0,05 0,5 0,7 96,0 3,00 95,7 2,02 13,9 mAb707 0,10 27,4 4,3 87,7 23,1 9,91 4 mAb709 0,01 0,2 0,2 91,6 0,80 93,7 0,52 11,5 mAb711 0,03 18,6 3,0 89,3 27,4 6,77 6 mAb713 0,08 1,1 0,9 94,4 2,95 93,5 2,52 mAb714 0,05 1,6 0,8 92,3 2,95 93,1 2,24 mAb715 0,04 1,1 0,9 86,9 2,91 88,0 2,17 mAb716 0,02 0,7 0,7 95,8 1,56 96,9 1,05 mAb718 0,02 3,2 4,2 96,6 4,19 96,6 1,91 mAb719 0,02 1,7 2,1 96,5 3,39 95,2 1,85 IgG1 humana 63,95 0,0 NA 9,9 NA (control e) Exemplo 2.3: Medição de Afinidade por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR)

[00151] A cinética de ligação de anticorpos purificados foi medida por ressonância plasmônica de superfície com o uso de um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) com o uso de procedimentos padrão.

Resumidamente, o anticorpo policlonal de cabra anti-IgG Fc de camundongo (Genway) foi diretamente imobilizado através de um chip biossensor e as amostras de anticorpos foram injetadas sobre as matrizes de reação a uma taxa de fluxo de 5 µl/min. As constantes de taxa de associação e dissociação, kon (M-1s-1) e koff (s-1), respectivamente, foram determinadas com uma taxa de fluxo contínuo de 30 µl/min. As constantes de taxa foram derivadas fazendo medições de ligação cinética em cinco concentrações diferentes de proteína humana PD- 1/Fc. A constante de dissociação de equilíbrio KD (M) da reação entre os anticorpos e as proteínas alvo relacionadas foi então calculada a partir das constantes de velocidade cinética com o uso da fórmula K D = koff/kon. As afinidades para onze anticorpos anti-PD-1 murinos foram medidas, conforme estabelecido na Tabela 3, abaixo.

Tabela 3: Medições de Afinidade para 11 Anticorpos Monoclonais Anti-PD-1 Identificador kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) de mAb mAb701 7,52 × 104 5,12 × 10-4 6,81 × 10-9 mAb703 3,47 × 105 8,50 × 10-4 2,45 × 10-9 mAb707 5,26 × 104 3,10 × 10-4 5,89 × 10-9 mAb709 1,11 × 105 1,04 × 10-4 9,39 × 10-9 mAb711 4,80 × 104 2,52 × 10-4 5,24 × 10-9 mAb713 1,45 × 105 2,85 × 10-4 1,96 × 10-9 mAb714 9,94 × 104 2,10 × 10-4 2,11 × 10-9 mAb715 1,58 × 105 2,37 × 10-4 1,50 × 10-9 mAb716 1,26 × 105 1,40 × 10-4 1,11 × 10-9 mAb718 5,84 × 104 2,83 × 10-4 4,84 × 10-9 mAb719 7,15 × 104 2,15 × 10-4 3,00 × 10-9 Exemplo 3: Atividade Funcional de Anticorpos Anti-PD-1

[00152] Um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) foi realizado com o uso de células dendríticas derivadas de monócitos de um doador e células T CD4+ alogênicas de outro doador. Amostras de sangue total foram coletadas de doadores saudáveis e PBMC foram isoladas de sangue total usando centrifugação em gradiente de Ficoll-Pague. No dia 1, PBMC de um doador foram isolados e diluídos com RPMI 1640 sem soro a 1 × 106 células/ml. As PBMC diluídas foram semeadas em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços a 3 ml/poço e incubadas por 3 horas. O sobrenadante foi removido e as células não ligadas foram lavadas. Os monócitos anexados foram polarizados em células dendríticas com 250 U/ml de IL- 4 e 500 U/ml de GM-CSF em RPMI 1640 com FBS a 10%. O meio foi substituído por meio fresco contendo IL-4 e GM-CSF no dia 4. No dia 7, as células dendríticas imaturas foram coletadas e tratadas com 1 µg/ml de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) (Sigma) em RPMI 1640 com FBS a 10% por mais 24 horas para maturação. No Dia 8, as células T CD4+ foram isoladas de PBMC de outro doador por seleção negativa e ajustadas à concentração final de 2 x 10 6 células/ml. Células dendríticas maduras foram tratadas com mitomicina C a 37 °C por 1,5 hora, então as células dendríticas foram lavadas com

PBS e ajustadas para uma concentração final de 1 × 10 6 células/ml. As células T CD4+ (células respondedoras) foram adicionadas a placas de 96 poços a 100 µl/poço e pré-tratadas com o anticorpo de teste na concentração diluída durante 30 minutos. Células dendríticas maduras (células estimuladoras) foram adicionadas aos poços a 100 µl/poço. O volume final de cada poço é de 200 μl. Os linfócitos misturados foram incubados a 37 °C. A produção de IL-2 foi medida após 72 horas (consulte as Figuras 1A e 1B); IFN-γ foi medido em 120 horas (consulte as Figuras 2A e 2B).

Exemplo 4: C1oning e Análise de Sequência de mAbs Anti- PD-1

[00153] O RNA total de cada clone de hibridoma foi isolado de > 5 × 106 células com o reagente TRIzol (Cat. n o 15596; Invitrogen). O cDNA foi sintetizado por SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix (Cat. no 18080; Invitrogen) e aplicado como um modelo de PCR do conjunto de iniciadores de Ig de camundongo (Cat. n o 69831-3; Novagen).

Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 1,2% com coloração em gel SYBR™ Safe DNA (Invitrogen). Fragmentos de DNA com tamanho correto foram purificados com NucleoSpin® Gel e PCR Clean-up (Cat. no 740609; Macherey-Nagel GmbH) de acordo com as instruções do fabricante e subclonados para o vetor pMD18-T (Sino Biological Inc.) individualmente. Quinze colônias de cada transformação foram selecionadas e sequências de fragmentos de inserção foram analisadas por sequenciamento de DNA. As sequências foram confirmadas se pelo menos 8 corresponderem às sequências de consenso para VH e VL. As sequências de proteínas de regiões variáveis de mAbs anti-PD-1 murinas foram analisadas por alinhamento de homologia de sequência e listadas na Tabela 4. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas com base na numeração de Kabat e aparecem sublinhadas na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4: Sequências de Aminoácidos de 8 Anticorpos Monoclonais Anti-PD-1 Murinos sequências de aminoácidos anticor domín SEQ ID 12345678901234567890123456789012345 po io NO 67890

EVLLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYMMS

WIRQTPERRLEWVASMSGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH 4

SRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARRGTYAMD

YWGQGTSVTVSS mAb701

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLTW

YQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTK VL 5

FSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPWTFGGGTKLE IK DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITTGYYW

NWIRQFPGNKLEWMGYMSYDGNNNYNPSLKNRISI VH 6

TRDTSKNQFLLRLNSVTTEDTATYFCARDRGTTIL

GGTMDYWGQGTSVTVS mAb703

SIVMTQTPKFLFVSAGDRVTIACKASQSVSNDVAW

YQQKPGQSPKLLIYYAFYRYTGVPDRFTGSGYGTD VL 7

FTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPWTFGGGTKLE IK EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQTPEKRLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH 8 mAb709 SRDNAKNTLYLHMSSLRSEDTALYYCAGQGGNYLF

AYWGQGTLVTVSA VL 9 DIVMTQSHKFMSTSVGDSVTITCKASQDVNTVVAW sequências de aminoácidos anticor domín SEQ ID 12345678901234567890123456789012345 po io NO 67890

YQQKPGQSLKVLISWASTRHTGVPARFTGSGSGTD YTLTISSVQAEDLALYYCQQHYTTPYTFGGGTQLE IK EVKLVESGGGLVKPGGSLELSCAASGFTSSDYGMH

WVRQAPEKGLEWVAYISSGSYTIYYADTVKGRFTI VH 10

SRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAKRGGSSHV

NVMDYWGQGTSVTVSS mAb713

DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAW

YQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKD VL 11

YTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSPPYTFGGGTKLE IK EVHLQQSGPELVKPGASVKIFCKASGYTFTDNNVE

WVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTLYSQYFKDKATL VH 12

TVDKSSTTAYMELRSLTSEDTGLYYCARGKSDQFD

YWGQGTTLTVSS mAb714

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAW

YQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTK VL 13

FSFKISSLQGEDFVSYYCQQLYSSPWTFGGGTKLE IK EVMLVESGGGLLKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMS

WVRQTPEKRLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH 14

SRDNAKNTLYLQMTSLRSEDTAFYYCAGQGGTYLF

ASWGQGTLVTVSA mAb715

DIVMTQSHKFMSTSVGDSVTITCKASQDVNTAVAW

YQQKPGQPPKVLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTD VL 15

YTLTISSVQAEDLALYYCQQHYTTPYTFGGGTKLE IK QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMH

WAKQTPVHGLEWIGVIEPESGGTVYNQKFKGKAKL VH 16

TADKSSRTAYMELRSLTSEDSAVYYCTREGFNSDH

YFDYWGQGTTLTVSS mAb718

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGN

TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVFNRFSGVPDRFSGS VL 17

GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGG GTKLEIK EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCTASGFSFSSHLMS

WVRQTPEKRLEWVAAISGGGADTYYPDSVKGRFTI VH 18

SRDNAKNTLYLQMRSLRSEDTALYYCTRQILAFDS mAb719 WGQGTTLTVSS

DIQMNQSPSSLSVSLGDTITITCHASQNIYVWLNW VL 19

YQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGGGSGTG sequências de aminoácidos anticor domín SEQ ID 12345678901234567890123456789012345 po io NO 67890

FTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPWTFGGGTKLE

IK Exemplo 5: Humanização de Anticorpos Anti-PD-1 Murinos

[00154] Com base na atividade de ligação a PD-1 humana, reatividade cruzada de cinomólogo PD-1 similar à humana, quase 100% de atividade de bloqueio no ensaio de RBA, atividade funcional em MLR e afinidade de pelo menos nanomole medida por Biacore, quatro anticorpos anti-PD-1, mAb709, mAb713, mAb703 e mAb719, foram selecionados para humanização.

Exemplo 5.1: Humanização do Anticorpo Murino mAb709

[00155] Os genes da região variável mAb709 foram empregados para criar um anticorpo humanizado. Na primeira etapa desse processo, as sequências de aminoácidos de VH e VL de mAb709 foram comparadas com a base de dados disponível de sequências do gene V de Ig humana, a fim de encontrar as sequências do gene V de Ig da linha germinativa humana mais adequadas. Além disso, o segmento da estrutura 4 de VH ou VL foi comparado com o banco de dados da região J para encontrar a estrutura humana com a maior homologia com as regiões VH e VL murinas, respectivamente. Para a cadeia leve, a correspondência mais próxima do gene V humano foi o gene O12; e para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene VH3-7. As sequências de domínio variável humanizadas foram então projetadas onde a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve de mAb709 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene O12 com sequência de estrutura 4 de JK4 após CDR-L3; e o CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada de mAb709 foram enxertados em sequências de estrutura de VH3-7 com sequência de estrutura 4 de JH1 após CDR-H3. Um modelo Fv tridimensional de mAb709 foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições de estrutura em que os aminoácidos de camundongo eram críticos para suportar as estruturas de loop ou a interface VH/VL.

Esses resíduos em sequências humanizadas devem sofrer mutação reversa para resíduos de camundongos na mesma posição para reter a afinidade/atividade. No caso da cadeia leve, uma mutação posterior de Phe para Tyr na posição 71 (F71Y, numeração de Kabat), uma mutação posterior de Tyr para Ser na posição 49 (Y49S, numeração de Kabat), uma mutação posterior de Gln para Val na posição 3 (Q3V, numeração de Kabat), uma mutação de retorno de Leu para Val na posição 46 (L46V, numeração de Kabat), um Ser para Thr na posição 63 (S63T, numeração de Kabat), uma mutação de retorno de Ala para Ser na posição 43 (A43S, numeração de Kabat), e uma mutação reversa de Pro para Leu na posição 44 (P44L, numeração de Kabat) foram identificadas como mutações reversas desejáveis. No caso da cadeia pesada, uma mutação de Arg para Gly na posição 98 (R94G, por numeração de Kabat) e uma mutação de Gly para Arg na posição 44 (G44R, por numeração de Kabat), foram identificadas como mutações reversas desejáveis. Domínios variáveis mutados contendo uma ou mais dessas mutações reversas foram construídos. Consulte a Tabela 5 abaixo. (Os resíduos de aminoácidos da estrutura com mutação reversa são indicados com sublinhado duplo; CDRs murinos do anticorpo parental original estão sublinhados.) Tabela 5: Projeto VH/VL de humanização para mAb709 com mutações reversas para resíduos de murino mAb709 VH ou Sequência de Aminoácidos VL Humanizado SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 Identificado NO 567890 r

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTM

SWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRF mAb709 VH.1 20

TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGGN YLFAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTM

SWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRF mAb709 VH.1A 21

TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGN YLFAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTM

SWVRQAPGKRLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRF mAb709 VH.1B 22

TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGN YLFAYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVA

WYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSG mAb709 VK.1A 23

TDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGT KVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVA

WYQQKPGKAPKLLISWASTRHTGVPSRFSGSGSG mAb709 VK.1B 24

TDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGT

KVEIK mAb709 VK.1C 25 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVA mAb709 VH ou Sequência de Aminoácidos VL Humanizado SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 Identificado NO 567890 r

WYQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSG TDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGT KVEIK DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVA

WYQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFTGSGSG mAb709 VK.1D 26

TDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGT KVEIK DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVA

WYQQKPGKSLKVLISWASTRHTGVPSRFTGSGSG mAb709 VK.1E 27

TDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGT KVEIK

[00156] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, respectivamente clonados em vetores contendo os domínios constantes de IgG1 e kappa humano. (Consulte a Tabela 6 abaixo.) Tabela 6: Sequência de Região Constante Humana Usada na Humanização de Anticorpos Sequências de aminoácidos Região SEQ ID 123456789012345678901234567890123456 Constante NO 7890

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP

SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT mutante Ig CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC gama 1 VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN 28 humana STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE constante KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK kappa RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE constante 29 AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL humana TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[00157] O emparelhamento das cadeias VH humanizadas e VK humanizadas criou 15 anticorpos humanizados, denominados HumAb709-1 a HumAb709-15 (Tabela 7). Um anticorpo quimérico com VH/VL de camundongo parental e sequências da região constante humana (mAb709c) também foi produzido como um controle positivo, para comparação de afinidade. Todos os mAbs recombinantes foram expressos e purificados.

Tabela 7: Lista de Produção de Anticorpos Anti-PD-1 Humanizados mAb709 Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb709-1 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1A HumAb709-2 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1A HumAb709-3 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1A HumAb709-4 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1B HumAb709-5 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1B HumAb709-6 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1B HumAb709-7 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1C HumAb709-8 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1C HumAb709-9 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1C HumAb709-10 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1D HumAb709-11 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1D HumAb709-12 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1D HumAb709-13 mAb709 VH.1 mAb709 VK.1E HumAb709-14 mAb709 VH.1A mAb709 VK.1E HumAb709-15 mAb709 VH.1B mAb709 VK.1E HumAb709c SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9

[00158] Todos os 15 anticorpos humanizados e o anticorpo quimérico (mAb709c) foram caracterizados por ELISA de ligação e RBA baseado em células.

Para RBA baseado em células, 2 × 105 células/poço de células CHO-K1-huPD1 foram adicionados a uma placa de fundo redondo de 96 poços pré-

bloqueados e, após a lavagem, 50 µl de anticorpos com concentração diluída variando de 0,064 nM a 200 nM foram adicionados a cada poço.

Em seguida, foram adicionados 50 µl de 60 µg/ml de proteína PD-L1/Fc biotinilada ou proteína PD-

L2/Fc biotinilada.

Após mistura suave e incubação a 4 °C, as células foram lavadas e coradas com solução de estreptavidina

Alexa Fluor™ 488 (1:1000, ThermoFisher Scientific; Cat. n o

S32354). Os sinais foram lidos por FACS e as curvas foram ajustadas pelo software GraphPad.

Os valores de IC50 calculados são mostrados na Tabela 8 abaixo.

Os anticorpos com valores de IC50 positivos (baixos) (isto é, abaixo de cerca de 1,0 nM para pelo menos um ligante PD-1) foram ainda analisados quanto à afinidade de ligação por medições de ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento

Biacore T200. Resumidamente, o anticorpo policlonal de cabra anti-IgG Fc humana foi imobilizado diretamente através de um chip biossensor, e o anticorpo humanizado anti-PD-1 ou amostras de anticorpos quiméricos foram injetados sobre as matrizes de reação a uma taxa de fluxo de 5 µl/min.

As constantes de taxa de associação e dissociação, k on (M-1s-1)

e koff (s-1), respectivamente, foram determinadas fazendo medições de ligação cinética em cinco concentrações diferentes de proteína humana PD-1-His em uma taxa de fluxo contínuo de 30 µl/min. A constante de dissociação de equilíbrio KD (M) da reação entre os anticorpos e as proteínas alvo relacionadas foi calculada a partir das constantes de velocidade cinética com o uso da fórmula K D = koff/kon. As afinidades para cinco dos derivados anti-PD-1 humanizados mAb709 são mostradas na Tabela 8. HumAb709-8 tinha mutação (ou mutações) reversa mínima, embora mantendo ao máximo a afinidade dos domínios variáveis parentais no mAb709c quimérico.

Tabela 8: Valores de RBA e Afinidades de Ligação para Anticorpos Anti-PD-1 mAb709 Humanizados PD-L1 PD-L2 ID de

RBA RBA Anticorpo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) IC50 IC50 Humanizado (nM) (nM) 2,145 × 1,10 × HumAb709-1 1,02 1,64 1,95 × 105 10-3 10-8 6,84 × HumAb709-2 0,47 0,99 8,03 × 104 5,5 × 10-5 10-10 HumAb709-3 1,25 1,64 HumAb709-4 0,78 1,68 HumAb709-5 0,67 0,97 HumAb709-6 1,23 1,26 3,36 × 10- 2,36 × HumAb709-7 0,40 0,84 1,41 × 105 4 10-9 4,69 × 10- 3,68 × HumAb709-8 0,44 1,00 1,27 × 105 5 10-10 HumAb709-9 1,04 1,76 HumAb709- 2,97 × 10- 2,04 × 0,29 0,80 1,46 × 105 10 4 10-9

PD-L1 PD-L2 ID de

RBA RBA Anticorpo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) IC50 IC50 Humanizado (nM) (nM) HumAb709- 0,55 0,92 11 HumAb709- 0,45 1,35 12 HumAb709- 0,50 0,78 13 HumAb709- 0,51 0,92 14 HumAb709- 0,90 1,21 15 6,88 × 10- 5,67 × mAb709c 0,62 0,56 1,21 × 105 5 10-10 Exemplo 5.2: Humanização do Anticorpo Murino mAb713

[00159] Os genes da região variável para anti-PD-1 mAb713 foram empregados para criar um anticorpo humanizado.

As sequências de aminoácidos de VH e VK de mAb713 foram comparadas com a base de dados disponível de sequências do gene V de Ig humana a fim de encontrar as sequências do gene V de Ig da linha germinativa humana mais adequadas. Além disso, o segmento da estrutura 4 de VH ou VL foi comparado com o banco de dados da região J para encontrar a estrutura com a maior homologia com as regiões VH e VL murinas, respectivamente. Para a cadeia leve, a correspondência mais próxima do gene V humano foi o gene O18; e para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene VH3-48. As sequências de domínio variável humanizadas foram então projetadas onde a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve de mAb713 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene O18 com sequência de estrutura 4 de JK4 após CDR-L3; e o CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada de mAb713 foram enxertados em sequências de estrutura de VH3-48 com sequência de estrutura 4 de JH6 após CDR-H3. Um modelo Fv tridimensional de mAb709 foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições de estrutura em que os aminoácidos de camundongo eram críticos para suportar as estruturas de loop ou a interface VH/VL. Esses resíduos em sequências humanizadas devem sofrer mutação reversa para resíduos de camundongos na mesma posição para reter a afinidade/atividade. No caso da cadeia leve, uma mutação posterior de Phe para Tyr na posição 71 (F71Y, numeração de Kabat), uma mutação posterior de Tyr para Ser na posição 49 (Y49S, numeração de Kabat) e uma mutação posterior de Thr para Lys na posição 69 (T69K, numeração de Kabat) foram identificados como mutações reversas desejáveis. No caso da cadeia pesada, uma mutação Arg para Lys na posição 98 (R94K, por numeração de Kabat), uma mutação reversa de Phe para Ser na posição 29 (F29S, numeração Kabat) e uma mutação reversa de Ser para Ala na posição 49 (S49A, por numeração de Kabat), foram identificados como mutações reversas desejáveis.

Domínios variáveis mutados contendo uma ou mais dessas mutações reversas foram construídos. Consulte a Tabela 9 abaixo. (Os resíduos de aminoácidos da estrutura com mutação reversa são indicados com sublinhado duplo; CDRs murinos do anticorpo parental original estão sublinhados.) Tabela 9: Variantes de Sequência de Domínio Variável para mAb713 VH e VL Sequência de Aminoácidos Variantes de SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 mAb713 VH/VL NO 567890

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGM

HWVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRF mAb713 VH.1 30

TISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRGGS SHVNVMDYWGQGTTVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGM

HWVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRF mAb713 VH.1A 31

TISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGS SHVNVMDYWGQGTTVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGM

HWVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRF mAb713 VH.1B 32

HWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYYADTVKGRF mAb713 VH.1C 33

TISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGS SHVNVMDYWGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLA

WYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSG mAb713 VK.1 34

TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGT KVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLA

WYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSG mAb713 VK.1A 35

TDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGT KVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLA

WYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSG mAb713 VK.1B 36

TDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGT KVEIK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLA mAb713 VK.1C 37 WYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSG

KDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGT

Sequência de Aminoácidos Variantes de SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 mAb713 VH/VL NO 567890

KVEIK

[00160] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, clonados individualmente em vetores contendo o IgG1 humano e os domínios constantes kappa humanos (consulte a Tabela 6, supra). O emparelhamento das variantes de VH humano e as variantes de VK humano criou 16 anticorpos humanizados, denominados HumAb713-1 a HumAb713- 16 (Tabela 10). Um anticorpo quimérico (mAb713c) com VH/VL de camundongo parental e sequências constantes humanas também foi produzido como um controle positivo, para comparação de afinidade.

Tabela 10: Lista de Produção para Anticorpos Anti-PD-1 mAb713 Humanizados Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb713-1 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1 HumAb713-2 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1 HumAb713-3 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1 HumAb713-4 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1 HumAb713-5 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1A HumAb713-6 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1A HumAb713-7 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1A HumAb713-8 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1A HumAb713-9 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1B HumAb713-10 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1B

Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb713-11 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1B HumAb713-12 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1B HumAb713-13 mAb713 VH.1 mAb713 VK.1C HumAb713-14 mAb713 VH.1A mAb713 VK.1C HumAb713-15 mAb713 VH.1B mAb713 VK.1C HumAb713-16 mAb713 VH.1C mAb713 VK.1C mAb713c SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11

[00161] Todos os 16 anticorpos humanizados e o anticorpo quimérico (mAb713c) foram caracterizados por ELISA de ligação, RBA à base de células e teste de afinidade Biacore. Os resultados estão resumidos na Tabela 11.

Tabela 11: Valores de RBA e Afinidades de Ligação para Anticorpos Anti-PD-1 mAb713 Humanizados PD-L1 PD-L2 ID de

RBA RBA Anticorpo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) IC50 IC50 Humanizado (nM) (nM) 9,010 × 1,003 × 1,113 × HumAb713-1 0,50 1,20 104 10-3 10-8 HumAb713-2 1,71 3,13 8,447 × 2,082 × 2,465 × HumAb713-3 0,77 1,24 104 10-4 10-9 HumAb713-4 1,06 2,24 HumAb713-5 0,91 2,95 HumAb713-6 1,04 1,46 1,237 × 3,500 × 2,829 × HumAb713-7 0,76 1,40 105 10-4 10-9 HumAb713-8 1,05 1,91 HumAb713-9 1,20 2,00 HumAb713- 0,80 1,23

PD-L1 PD-L2 ID de

RBA RBA Anticorpo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) IC50 IC50 Humanizado (nM) (nM) 10 HumAb713- 1,591 × 3,776 × 2,373 × 0,51 0,97 11 105 10-4 10-9 HumAb713- 0,94 1,59 12 HumAb713- 0,70 2,13 13 HumAb713- 0,91 1,45 14 HumAb713- 0,88 1,65 15 HumAb713- 0,65 1,63 16 2,182 × 2,839 × 1,301 × mAb713c 0,91 2,20 105 10-4 10-9

[00162] HumAb713-7 tinha mutação (ou mutações) reversa mínima enquanto mantinha as características de afinidade dos domínios variáveis parentais do anticorpo quimérico, mAb713c. A atividade funcional dos anticorpos humanizados mAb713 foram validados em um ensaio MLR como descrito no Exemplo 3. Como visto na Figura 5, HumAb713-7 exibiu atividade comparável com o anticorpo quimérico mAb713c em MLR, em linha com suas propriedades de ligação retidas.

Exemplo 5.3: Humanização do Anticorpo Murino mAb703

[00163] Seguindo o mesmo procedimento que no Exemplo

5.1 e 5.2, o anticorpo murino anti-PD-1 mAb703 foi selecionado e humanizado. Domínios variáveis humanizados, alguns contendo uma ou mais mutações reversas, foram construídos e as sequências de aminoácidos são apresentadas na Tabela 12 abaixo. (Os resíduos de aminoácidos da estrutura com mutação reversa são indicados com sublinhado duplo; CDRs murinos do anticorpo parental original estão sublinhados.) Tabela 12: Variantes de Sequência de Domínio Variável para mAb703 VH e VL Sequência de Aminoácidos Variantes de SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 mAb703 VH/VL NO 567890

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISTGYY

WNWIRQPPGKGLEWIGYMSYDGNNNYNPSLKNRV mAb703 VH.1A 38

TISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGT TILGGTMDYWGQGTTVTVSS EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISTGYY

WNWIRQPPGKGLEWIGYMSYDGNNNYNPSLKNRI mAb703 VH.1B 39

WNWIRQPPGKGLEWMGYMSYDGNNNYNPSLKNRI mAb703 VH.1C 40

TISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGT TILGGTMDYWGQGTTVTVSS EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITTGYY

WNWIRQPPGKGLEWMGYMSYDGNNNYNPSLKNRI mAb703 VH.1D 41

WNWIRQPPGKKLEWMGYMSYDGNNNYNPSLKNRI mAb703 VH.1E 42

TISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARDRGT TILGGTMDYWGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA

WYQQKPGKAPKLLIYYAFYRYTGVPSRFSGSGSG mAb703 VK.1 43

TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGGGT KVEIK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA mAb703 VK.1A 44

WYQQKPGKAPKLLIYYAFYRYTGVPSRFSGSGYG

Sequência de Aminoácidos Variantes de SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 mAb703 VH/VL NO 567890

TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGGGT KVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA

WYQQKPGKAPKLLIYYAFYRYTGVPDRFSGSGYG mAb703 VK.1B 45

TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGGGT KVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA

WYQQKPGKSPKLLIYYAFYRYTGVPDRFSGSGYG mAb703 VK.1C 46

TDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPWTFGGGT KVEIK SIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA

WYQQKPGKSPKLLIYYAFYRYTGVPDRFTGSGYG mAb703 VK.1D 47

TDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPWTFGGGT KVEIK

[00164] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, clonados individualmente em vetores contendo o IgG1 humano e os domínios constantes kappa humanos (consulte a Tabela 6, supra). O emparelhamento das variantes de VH humano e as variantes de VK humano criou 25 anticorpos humanizados, denominados HumAb703-1 a HumAb703- 25 (Tabela 13). Um anticorpo quimérico com VH/VL de camundongo parental e sequências constantes humanas também foi produzido como um controle positivo, para comparação de afinidade.

Tabela 13: Lista de Produção para Anticorpos Anti-PD-1 mAb703 Humanizados

Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb703-1 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1 HumAb703-2 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1 HumAb703-3 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1 HumAb703-4 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1 HumAb703-5 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1 HumAb703-6 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1A HumAb703-7 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1A HumAb703-8 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1A HumAb703-9 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1A HumAb703-10 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1A HumAb703-11 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1B HumAb703-12 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1B HumAb703-13 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1B HumAb703-14 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1B HumAb703-15 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1B HumAb703-16 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1C HumAb703-17 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1C HumAb703-18 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1C HumAb703-19 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1C HumAb703-20 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1C HumAb703-21 mAb703 VH.1A mAb703 VK.1D HumAb703-22 mAb703 VH.1B mAb703 VK.1D HumAb703-23 mAb703 VH.1C mAb703 VK.1D HumAb703-24 mAb703 VH.1D mAb703 VK.1D HumAb703-25 mAb703 VH.1E mAb703 VK.1D mAb703c SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7

[00165] Todos os 25 anticorpos humanizados e o anticorpo quimérico (mAb703c) foram caracterizados por ELISA de ligação e teste de afinidade Biacore. Os resultados de afinidade para os ligantes positivos estão resumidos na

Tabela 14.

Tabela 14: Afinidades de Ligação para Anticorpos Anti- PD-1 mAb703 Humanizados Selecionados ID de Anticorpo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) Humanizado HumAb703-11 1,874 × 105 1,757 × 10-3 9,374 × 10-9 HumAb703-12 1,770 × 105 1,594 × 10-3 9,003 × 10-9 HumAb703-13 1,454 × 105 1,537 × 10-3 1,057 × 10-8 HumAb703-18 6,572 × 104 1,242 × 10-3 1,890 × 10-8 HumAb703-22 2,294 × 105 1,593 × 10-3 6,942 × 10-9 mAb703c 3,594 × 105 9,664 × 10-4 2,684 × 10-9

[00166] A atividade funcional de anticorpos mAb703 humanizados foi validada em ensaios de MLR conduzidos como descrito no Exemplo 3, como mostrado nas Figuras 2A e 3.

Exemplo 5.4: Humanização do Anticorpo Murino mAb719

[00167] Seguindo o mesmo procedimento que no Exemplo

5.1 e 5.2, o anticorpo murino anti-PD-1 mAb719 foi selecionado e humanizado. Domínios variáveis humanizados, alguns contendo uma ou mais mutações reversas, foram construídos e as sequências de aminoácidos são apresentadas na Tabela 15 abaixo. (Os resíduos de aminoácidos da estrutura com mutação reversa são indicados com sublinhado duplo; CDRs murinos do anticorpo parental original estão sublinhados.) Além disso, uma substituição Asp→Ala em CDR-H2 e uma substituição Ser→Ala em CDR-H3 foram realizadas para evitar possível isomerização de anticorpos recombinantes Asp frequentemente vistos. (Consulte, sequências mAb719 VH.1E e mAb719 VH.1F na Tabela 15.) Tabela 15: Variantes de Sequência de Domínio Variável para mAb719 VH e VL Sequência de Aminoácidos Variantes de SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 mAb719 VH/VL NO 567890

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHLM

SWVRQAPGKGLEWVSAISGGGADTYYPDSVKGRF mAb719 VH.1 48

TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQILA FDS-WGQGTTVTVSS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHLM

SWVRQAPGKGLEWVSAISGGGADTYYPDSVKGRF mAb719 VH.1A 49

TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQILA FDS-WGQGTTVTVSS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSHLM

SWVRQAPGKGLEWVSAISGGGADTYYPDSVKGRF mAb719 VH.1B 50

SWVRQAPGKGLEWVAAISGGGADTYYPDSVKGRF mAb719 VH.1C 51

SWVRQAPGKRLEWVAAISGGGADTYYPDSVKGRF mAb719 VH.1D 52

SWVRQAPGKGLEWVAAISGGGADTYYPASVKGRF mAb719 VH.1E 53

TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQILA FDA-WGQGTTVTVSS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSHLM

SWVRQAPGKRLEWVAAISGGGADTYYPASVKGRF mAb719 VH.1F 54

TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQILA FDA-WGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLN

WYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSG mAb719 VK.1 55

TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPWTFGGGT

KVEIK mAb719 VK.1A 56 DIQMNQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLN

Sequência de Aminoácidos Variantes de SEQ ID 1234567890123456789012345678901234 mAb719 VH/VL NO 567890

WYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPWTFGGGT KVEIK DIQMNQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLN

WYQQKPGKIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSG mAb719 VK.1B 57

TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPWTFGGGT KVEIK

[00168] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, clonados individualmente em vetores contendo o IgG1 humano e os domínios constantes kappa humanos (consulte a Tabela 6, supra). O emparelhamento das variantes de VH humano e as variantes de VK humano criou 21 anticorpos humanizados, denominados HumAb719-1 a HumAb719- 21 (Tabela 16). Um anticorpo quimérico com VH/VL de camundongo parental e sequências constantes humanas também foi produzido como um controle positivo, para comparação de afinidade. Todos os mAbs recombinantes foram expressos e purificados.

Tabela 16: Lista de Produção para Anticorpos Anti-PD-1 mAb719 Humanizados Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb719-1 mAb719 VH.1 mAb719 VK.1 HumAb719-2 mAb719 VH.1A mAb719 VK.1 HumAb719-3 mAb719 VH.1B mAb719 VK.1 HumAb719-4 mAb719 VH.1C mAb719 VK.1 HumAb719-5 mAb719 VH.1D mAb719 VK.1

Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb719-6 mAb719 VH.1E mAb719 VK.1 HumAb719-7 mAb719 VH.1F mAb719 VK.1 HumAb719-8 mAb719 VH.1 mAb719 VK.1A HumAb719-9 mAb719 VH.1A mAb719 VK.1A HumAb719-10 mAb719 VH.1B mAb719 VK.1A HumAb719-11 mAb719 VH.1C mAb719 VK.1A HumAb719-12 mAb719 VH.1D mAb719 VK.1A HumAb719-13 mAb719 VH.1E mAb719 VK.1A HumAb719-14 mAb719 VH.1F mAb719 VK.1A HumAb719-15 mAb719 VH.1 mAb719 VK.1B HumAb719-16 mAb719 VH.1A mAb719 VK.1B HumAb719-17 mAb719 VH.1B mAb719 VK.1B HumAb719-18 mAb719 VH.1C mAb719 VK.1B HumAb719-19 mAb719 VH.1D mAb719 VK.1B HumAb719-20 mAb719 VH.1E mAb719 VK.1B HumAb719-21 mAb719 VH.1F mAb719 VK.1B mAb719c SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19

[00169] Todos os 21 anticorpos humanizados e o anticorpo quimérico (mAb719c) foram caracterizados por ELISA de ligação e determinação de afinidade com o uso do sistema de interferometria de bicamada Octet® RED96 (Pall FortéBio LLC), usando um biossensor com PD-1/Fc humano imobilizado como o alvo do anticorpo. As constantes de taxa foram derivadas fazendo medições de ligação cinética em cinco concentrações diferentes de anticorpo. As afinidades mostraram-se mais elevadas do que os testes Biacore anteriores devido ao alvo de ligação bivalente. Os resultados de afinidade para os ligantes positivos estão resumidos na Tabela 17.

Tabela 17: Afinidades de Ligação para Anticorpos Anti- PD-1 mAb719 Humanizados Selecionados ID de Anticorpo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) Humanizado HumAb719-8 1,066 × 105 4,905 × 10-5 4,602 × 10-10 HumAb719-11 5,944 × 104 2,270 × 10-4 3,819 × 10-9 HumAb719-12 6,882 × 104 5,805 × 10-5 8,435 × 10-10 HumAb719-21 1,042 × 105 6,256 × 10-5 6,005 × 10-10 mAb719c 9,735 × 104 <1,00 × 10-5 <1,027 × 10-10

[00170] A atividade funcional dos anticorpos mAb719 humanizados foi validada em ensaios de MLR, como mostrado nas Figuras 2B e 3.

Exemplo 6: Propriedades farmacocinéticas de anticorpos anti-PD-1 Lead.

[00171] As propriedades farmacocinéticas de HumAb709- 8 e HumAb713-7 foram avaliadas em camundongos Sprague-Dawley (SD) machos. Os anticorpos foram administrados a camundongos SD machos em uma única dose intravenosa de 5 mg/kg. Amostras de soro foram coletadas em diferentes pontos de tempo ao longo de um período de 28 dias com amostragem em 0, 5, 15 e 30 minutos; 1, 2, 4, 8 e 24 horas; e sangramento em série de 2, 4, 7, 10, 14, 21 e 28 dias através da veia da cauda, e analisado por ELISAs gerais. Resumidamente, as placas de ELISA foram revestidas com 125 ng/poço de anticorpo Fc de

IgG anti-humano de cabra (Rockland, Cat n o: 609-101-017) a 4 °C durante a noite, bloqueado com 1X PBS/1% BSA/0,05% Tween- 20/0,05% ProClin™ 300. Todas as amostras de soro foram diluídas 20 vezes em tampão de bloqueio primeiro. Diluição adicional foi realizada em soro de camundongo a 5% reunido e incubado na placa por 60 minutos a 37 °C. A detecção foi realizada com IgG anti-humana (fragmento Fab) conjugado com peroxidase (Sigma; Cat. no A0293) e as concentrações foram determinadas com a ajuda de curvas padrão usando o ajuste logístico de quatro parâmetros. Os valores para os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por modelo não compartimental com o uso de software WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, Calif. EUA). Conforme demonstrado por esses resultados (Tabela 18), as propriedades de HumAb09-8 e HumAb13-7 são estáveis.

Tabela 18: Propriedades farmacocinéticas de HumAb709-8 e HumAb713-7 parâmetros CL Vss Beta t1/2 AUC MRT

PK Anticorpo ml/dia/kg ml/kg dia dia*μg/ml dia HumAb709-8 8,6 129,6 10,9 594,2 15,4 HumAb713-7 6,4 114,4 12,7 789,3 18,1 Exemplo 7: Geração de Anticorpos Monoclonais anti-LAG- 3

[00172] Os anticorpos monoclonais anti-LAG-3 (mAbs) foram gerados por fusão de hibridoma.

Exemplo 7.1: Imunização, fusão de hibridoma e clonagem.

[00173] A imunização de camundongos Balb/C foi realizada da mesma maneira descrita acima para a geração de anticorpo anti-PD-1 (Exemplo 1), exceto usando homodímero LAG-3 D1-D2/Fc murino humano como o imunógeno. Os animais imunizados receberam reforços 2-4 vezes em intervalos de 2- 3 semanas. Três dias após o reforço final, os esplenócitos de camundongos imunizados foram isolados e fundidos com a linha celular de mieloma murino, SP2/0, usando técnicas padrão.

Exemplo 7.2: Identificação e Caracterização de Anticorpos Anti-LAG-3

[00174] Os alvos sintéticos para LAG-3 anti-humano e LAG-3 anti-cinomólogo foram realizados por encomenda pela Synbio Technologies (Suzhou, China). Cada alvo consistia em um segmento polipeptídico do domínio extracelular da proteína LAG-3 humana ou cinomólogo fundida a uma região Fc de IgG humana. Os genes sintéticos que codificam cada proteína de fusão LAG-3 ECD/Fc foram subclonados em um vetor de expressão pCP (Chempartner, Shanghai, China) e os plasmídeos de expressão foram transitoriamente transfectados em células HEK 293E em 1-3 litros de meio e cultivados por sete dias em um agitador de CO 2. As sequências de ECD usadas para cada fusão são apresentadas na Tabela 19, abaixo. A porção do ECD LAG-3 de cada proteína de fusão está sublinhada.

Tabela 19: Sequências de Aminoácidos para Alvos de Proteína de Fusão LAG-3 ECD/Fc sequências de aminoácidos SEQ ID Fonte de 1234567890123456789012345678901234567 NO LAG-3 890

LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRA GVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRP RRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFS LWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQAS MTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRG QGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILT YRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLP CRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTL

RLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTP 58 humano

KSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRS FSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTE LSSPGAQRSGRAPGALPAGHLIEGRMDPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK PQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRA GVTWQHQPDSGPPAXAPGHPPVPGHRPAAPYSWGPRP RRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFS LWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQAS MTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRG QGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILT

YRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELP macaco CRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTL 59 cinomólogo RLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTP

KSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRS FSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTE LSSPGAQRSGRAPGALRAGHLIEGRMDPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP sequências de aminoácidos SEQ ID Fonte de 1234567890123456789012345678901234567 NO LAG-3 890

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[00175] Os sobrenadantes dos clones de hibridoma foram rastreados principalmente por ELISA. Resumidamente, 50 µl/poço de 1 µg/ml LAG-3 ECD/Fc humano em NaHCO 3 foram diretamente revestidos em cada poço da placa de 96 poços durante a noite. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST 1X, 300 µl por poço. Após bloqueio com BSA a 1% em PBST a 250 µl por poço e incubação à temperatura ambiente durante 1 hora, os sobrenadantes de hibridoma foram adicionados a 50 µl por poço e incubados a 37 °C durante 1 hora. Após a lavagem, um anticorpo secundário Fc de cabra anti-Fc de camundongo ligado a HRP (Cat. n o A0168, Sigma) foi adicionado a 100 µl/poço e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. O reagente TMB (InnoReagents) foi usado para detectar e desenvolver o sinal ELISA a 100 µl/poço por 15 minutos, a reação foi interrompida com HCl 1 normal.

As placas foram lidas em um leitor de placas (SpectraMax® M5e, Molecular Devices, EUA) no comprimento de onda de 450 nm. Os clones produtores de anticorpos positivos para ELISA foram ainda verificados por análise FACS com o uso de métodos similares ao Exemplo 1.4, acima, exceto que linhas de células HEK 293F estáveis expressando LAG-3 humana ou LAG-3 de cinomolgo foram usadas. Hibridomas que produzem atividade de ligação de LAG-3 foram selecionados e caracterizados adicionalmente em um ensaio de bloqueio de receptor (RBA).

Exemplo 7,3: Ensaio de Bloqueio de Receptor (RBA)

[00176] Os sobrenadantes exibindo atividade específica de LAG-3 foram testados quanto à capacidade de bloquear a ligação do receptor LAG-3 ao MHC de Classe II.

Linfoblastos Raji de células B humanas expressam altos níveis de MCH Classe II e foram usados como alvos de ligação para as proteínas LAG-3 ECD/Fc descritas acima. Resumidamente, as células Raji foram coletadas e ressuspensas em tampão FACS e plaqueadas em placas de 96 poços (2 × 10 5 células/poço).

Os sobrenadantes do hibridoma anti-LAG-3 foram misturados com LAG-3 ECD/Fc solúvel e a mistura foi adicionada aos poços a um volume final de 100 µl/poço. Depois de adicionar a mistura às células, as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após lavagem duas vezes com PBS, as células foram incubadas com anticorpo secundário IgG Alexa Fluor® 488 anti-humano a 4 °C por 1 hora, lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, a fluorescência foi medida em um citômetro de fluxo.

Exemplo 7.4: Expressão e Purificação de Anticorpos Monoclonais anti-LAG-3

[00177] Células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais murinos foram cultivadas em meio de expressão

FreeStyle™ 293 (Gibco/Life Technologies) em um agitador de CO2 a 37 °C por 5 a 7 dias. O meio condicionado foi coletado por centrifugação a 4000 × g por 30 minutos para remover todas as células e resíduos celulares, em seguida, filtrado através de uma membrana de 0,22 μm antes da purificação. Os anticorpos murinos foram aplicados e ligados a uma coluna de resina de proteína A MabSelect™ SuRe (GE Healthcare) de acordo com as diretrizes do fabricante, lavados com PBS, eluídos com tampão contendo citrato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 3,5. Os materiais eluídos foram neutralizados com Tris 1 M a pH 8,0 imediatamente e dialisados contra PBS. Os anticorpos purificados de uma etapa geralmente têm pureza acima de 90%, conforme detectado por SEC-HPLC. As concentrações de proteína foram determinadas medindo a absorbância a 280 nm ou por espectrofotômetro de microvolume NanoDrop™ (Thermo Scientific). Os anticorpos purificados foram armazenados em alíquotas em freezer a -80 °C.

Exemplo 7.5: Atividade de Ligação de Anticorpos anti- LAG-3 Purificados Caracterização por ELISA

[00178] Um ELISA de ligação foi realizado da mesma maneira que a descrita no Exemplo 7.2 acima. Cada anticorpo purificado foi diluído em série 10 vezes. Após o bloqueio de uma placa de ensaio de 96 poços com poços contendo alvos de proteína de fusão LAG-3 ECD/Fc imobilizados, as amostras de anticorpos purificados com concentrações diluídas foram adicionadas aos poços da placa de ensaio. O anticorpo IgG anti-camundongo ligado a HRP (A0168, Sigma) e o reagente TMB foram usados para detectar e desenvolver o sinal ELISA, que foi lido em um leitor de placa SpectraMax® M5e no comprimento de onda de 450 nm. As curvas foram ajustadas com o uso do software GraphPad e valores EC50 foram calculados. Da mesma forma, um RBA também foi realizado conforme descrito no Exemplo 7.3 com anticorpos titulados e purificados, e as porcentagens de inibição máxima e os valores de IC50 foram determinados.

Caracterização por FACS

[00179] A análise FACS foi realizada com o uso de métodos similares ao Exemplo 1.4, acima, exceto que foram utilizadas linhas de células HEK 293F estáveis que expressam LAG-3 humana ou LAG-3 de cinomolgo. As células que expressam LAG-3 foram carregadas a 2 × 10 4 células por poço em placas de ensaio de fundo redondo de ensaio de 96 poços (Cat. n o 3799; Corning) e manchadas com anticorpos anti-LAG-3 purificados. Os anticorpos LAG-3 foram detectados com o anticorpo secundário de alta adsorção cruzada IgG anti- camundongo de burro AlexaFluor® (H+L) (Cat. no A21202; Invitrogen), e a fluorescência das células foi monitorada com o uso de um citômetro de fluxo. Os dados foram processados pelo software GraphPad e os valores de EC50 foram calculados.

[00180] Os resultados destes ensaios de caracterização de ligação são mostrados na Tabela 20 abaixo.

Tabela 20: Atividade de Ligação de Anticorpos anti-LAG- 3 Murinos Purificados Ligação a LAG-3 Ligação a LAG-3 Humano Cinomólogo Identificado

ELISA FACS ELISA FACS r de mAb EC50 EC50 Max- EC50 EC50 Max- (nM) (nM) MFI (nM) (nM) MFI mAb742 0,22 2,8 102,9 0,32 56,4 48,5 mAb743 0,26 30,4 115,7 0,26 111,5 36,9 mAb744 0,19 9,5 135,0 0,21 67,0 37,8 mAb745 0,27 32,2 54,8 0,30 224,3 26,0 mAb746 0,31 1,3 120,8 0,21 4,1 66,2 mAb747 0,25 1,1 104,4 0,34 3,1 65,2 mAb748 0,24 13,4 73,1 0,25 79,6 31,9 mAb749 0,55 3,3 123,6 0,33 14,3 67,4 mAb750 0,25 24,1 88,7 0,32 113,6 36,7 mAb751 0,22 26,2 88,9 0,27 79,3 33,1 mAb757 0,23 25,3 91,8 0,30 77,2 35,1 mAb758 0,87 9,8 64,8 3,18 15,0 17,3 mAb759 0,43 3,0 60,2 0,53 6,3 18,6 mAb760 + N/A 12,3 N/A N/A 4,9 mAb761 0.1.18 17,8 105,2 1,24 34,6 39,5 IgG1 Humana(contr 0,13 0,9 190,6 78,23 63,7 28,1 ole)

[00181] Nesta tabela, “N/A” denota nenhuma atividade de ligação medida.

Exemplo 7.6: Caracterização por RBA e Ensaio de Ativação

Dependente de Antígeno

[00182] Os anticorpos anti-LAG-3 purificados também foram testados em um RBA da mesma maneira descrita no Exemplo

7.3. Os anticorpos também foram testados em um ensaio de ativação de células T específico para o antígeno, como segue: Uma linha de células de hibridoma T murino que expressa huLAG-3 foi gerada sob encomenda por ChemPartner (Shanghai, CN). Esplenócitos de camundongo da mesma linhagem de camundongos foram usados como células efetoras. O hibridoma que expressa a proteína do receptor huLAG-3 tem a capacidade de se ligar a esplenócitos de camundongo positivos para MHC de Classe II, com efeito inibitório via engajamento de Classe II. O ensaio testa a reversão do efeito inibitório mediada por anticorpos anti-LAG-3, conforme medido pelo aumento da produção de IL-2. Os esplenócitos de camundongos foram coletados de camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8 semanas de idade, os glóbulos vermelhos foram lisados com o uso de tampão de lise de glóbulos vermelhos (Sigma-Aldrich; R7757) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 50 µl de células T hibridoma-huLAG-3 (2 × 106 células / ml) foram semeadas em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços e, em seguida, uma série de anticorpos monoclonais anti-LAG-3 em solução a 50 µl/poço foram incubados a 37C por 30 min.

Esplenócitos de camundongo (4 × 10 6 células/ml) e o antígeno (20 µg/ml) foram misturados e incubados a 37℃ por 30 min. A mistura (100 µl/poço) foi adicionada a cada poço que já foi semeado com células T hibridoma-huLAG-3 e mAbs anti-LAG-3.

A mistura de anticorpos, células T hibridoma-huLAG-3, esplenócitos de camundongo e o antígeno foi cultivada por 3 dias. Após 72 horas, 100 µl de sobrenadante de cultura de células foram aspirados e diluídos em concentrações apropriadas para a realização de um ELISA quantitativo de IL-2 de camundongo com o uso de um kit R&D Systems ELISA de acordo com o protocolo do fabricante. A placa de ELISA foi lida em um leitor de placa SpectraMax M5 (Molecular Devices) com o uso do protocolo ELISA-Endpoint-TMB & HRP. Os resultados do ensaio de ativação dependente de antígeno e RBA são mostrados na Tabela 21.

Tabela 21: Caracterização de Anticorpos Anti-LAG-3 Murinos Ativação dependente de

FACS RBA Antígeno Raji 1 µg/ml HuLAG-3 IL-2 de camundongo ECD/Fc Identifica Inib. Máx. IL-2 Máx. IC50 (nM) EC50 (nM) dor de mAb (%) (pg/ml) mAb742 3,84 96,5 ++ 732,8 mAb743 11,66 96,6 ++ 583,2 mAb744 10,77 96,5 ++ 612,3 mAb745 12,38 95,0 + 357,1 mAb746 2,92 96,2 1,28 653,5 mAb747 2,84 96,3 1,27 729,2 mAb748 4,80 96,1 ++ 539,2 mAb749 4,73 93,9 +++ 513,0 mAb750 7,15 96,6 +++ 552,5 mAb751 6,59 96,0 ++ 447,0 mAb757 7,80 96,8 ++ 570,9 mAb758 + 7,9 - 182,9 mAb759 86,46 34,2 mAb760 + 3,4 mAb761 17,98 96,0 IgG1 Humana 2,30 94,7 0,71 785,7 (controle) Exemplo 7.7: Determinação da Afinidade de Ligação por Biacore

[00183] Para anticorpos com alta afinidade de ligação em ensaios ELISA e FACS, bem como atividade funcional potente, as afinidades de ligação foram determinadas com base na medição de constantes cinéticas de ligação em reações de ligação em tempo real com o uso de ressonância de plasmão de superfície Biacore. Resumidamente, o ensaio de ligação do anticorpo ao antígeno foi realizado com o uso de um sistema Biacore T200 através de uma abordagem de captura de anticorpo. O anticorpo Fc IgG anti-camundongo foi imobilizado em um chip sensor CM5 de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo monoclonal de murino anti-LAG-3 de teste foi injetado e capturado pelo Fc de IgG anti- camundongo imobilizado. Em seguida, as concentrações em série do antígeno LAG-3 foram injetadas individualmente e o perfil de ligação foi registrado para cada concentração de analito de antígeno. A temperatura do ensaio foi de 25 ℃, e a associação e os tempos de dissociação foram 180 e 1200 segundos, respectivamente. Os dados Biacore foram ajustados com o uso do software de avaliação Biacore T200 1.0 de acordo com um modelo de ligação 1:1 para calcular as constantes de taxa de associação (kon) e dissociação (koff) e a partir desses cálculos a constante de dissociação de equilíbrio (K D) foi determinada. As afinidades (K D) para quatro anticorpos anti- LAG-3 selecionados são mostradas na Tabela 22, abaixo.

Tabela 22: Afinidade de Ligação para Anticorpos Anti- LAG-3 Selecionados Identificador de Afinidade para Antígeno LAG-3 (KD) Anticorpo mAb746 3,774 × 10-8 M mAb747 5,201 × 10-8 M mAb749 1,893 × 10-7 M mAb750 7,506 × 10-8 M Exemplo 7.8: Comparação da Função do Anticorpo Anti- LAG-3 no Ensaio de PBMC

[00184] Para verificar ainda mais a função dos anticorpos anti-LAG-3 em PBMC humanos, foi conduzido um ensaio de estimulação de toxina bacteriana com o uso de superantígeno enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB).

SEB é um superantígeno conhecido por ativar o sistema imunológico por estimulação de células T humanas, que por sua vez causa uma superprodução de várias citocinas. PBMC foram isolados de uma amostra de sangue de um doador humano saudável. PBMC foram semeadas em uma placa de ensaio de 96 poços com 2 × 105 células/poço, em seguida, vários anticorpos de teste anti-LAG-3 foram adicionados às placas e incubados com PBMC a 37 °C por 30 min. Uma solução SEB foi adicionada, a uma concentração final de 10 ng/ml. As placas foram então incubadas durante 96 horas. No final dessa incubação, 100 µl de sobrenadante de cultura de células foram coletados e a produção de IL-2 foi medida usando um kit de detecção ELISA IL-2 (R&D Systems; Cat. no DY202). Os resultados são mostrados na Figura 6.

Exemplo 8: Sequenciamento de Regiões Variáveis de Anticorpo Anti-LAG-3 Murino

[00185] Para amplificar as regiões variáveis da cadeia pesada e leve, o RNA total de clones de hibridoma selecionados foi isolado de > 5 × 10 6 células com o reagente de isolamento de RNA TRIzol® (Invitrogen; Cat. n o 15596). O cDNA foi sintetizado por SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen; Cat. n o 18080) e aplicado como um modelo de PCR do conjunto de iniciadores de Ig de camundongo (Novagen; Cat. n o 69831-3). Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 1,2% com coloração em gel SYBR™ Safe DNA (Invitrogen).

Fragmentos de DNA de tamanho correto foram purificados com

NucleoSpin® Gel e PCR Clean-up (Macherey-Nagel GmbH; Cat. no 740609) de acordo com as instruções do fabricante e subclonado em vetores de clonagem pMD18-T individualmente.

Quinze colônias de cada transformação foram selecionadas e sequências de fragmentos de inserção foram analisadas por sequenciamento de DNA. As sequências eram confirmadas se pelo menos 8 correspondências para sequências de consenso para VH e VL fossem encontradas. As sequências da região variável de sete mAbs murinos analisadas por alinhamento de homologia de sequência estão listadas na Tabela 23. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas com base na numeração de Kabat.

Tabela 23: Sequências de Aminoácidos VH/VL de 7 Anticorpos Anti-LAG-3 Murinos SEQ sequências de aminoácidos α-LAG-3 Domínio ID 12345678901234567890123456789012345 mAb ID NO 67890

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASDFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATI VH 60

TADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTVYGDYWGQ

GTTLTVSS mAb746

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLNCRASQEISGYLSW

LQQKSDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSD VL 61

YSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPLTFGAGTKLE LK EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASDFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATI VH 60

TADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTVYGDYWGQ

GTTLTVSS mAb747

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLNCRASQEISGYLSW

LQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSD VL 62

YSLTISSLESEDFAAYYCLQYASYPLTFGAGTKLE LK

SEQ sequências de aminoácidos α-LAG-3 Domínio ID 12345678901234567890123456789012345 mAb ID NO 67890

QGQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFNDYEMH

WVKQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGKAIL VH 63

TADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCIRWGSTVFP

YWGQGTLVTVS mAb742

DGVLTQTPLSLPVNIGDQASISCKSTKSLLNSDGF

TYLDWYLQKPGQSPQLLIYLVSNRFSGVPDRFSGS VL 64

GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQSNYLPWTFGG GTKLEIK QVQLQQSGAELVRPGTSVTLSCKASGYTFTDYEMH

WMKQTPVHGLEWIGAIDPATGGTAYNQKFKGKAIL VH 65

TADKSSSTAYMDFRSLTSEDSAVYYCIRWGTTVFP

YWGQGTLVTVS mAb744

DVVLTQTPLSLPVNIGDQASISCKSTKSLLNSDGF

TYLDWYLQKPGQSPQLLIYLVSNRFSGVPDRFSGS VL 66

GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQSNYLPWTFGG GTKLEIK EVQMQQSGAELVRPGASVKLSCTVSGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATI VH 67

TADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCTYFDYWGQG

TTLTVSS mAb748

DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGK

TYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGS VL 68

GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPQTFGG GTKLEIK EVQLQQSGAELVRPGASVKVSCTASDFNIKDDYVH

WVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATI VH 69

TADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCSTWDAEENY

WGQGTTLSVSS mAb749

DIVLTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGN

TYLYWFLQRPGQSPQVLIYRMSNLASGVPVRFSGS VL 70

GSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGS GTKLEIK EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTPSGLNIKDDYIH

WVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATI VH 71

TADTSSNTAYLQLSSLTSEDSAVYYCCTADYRNWY

WGQGTTLTVSS mAb750

DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGK

TYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGS VL 68

GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPQTFGG GTKLEIK

Exemplo 9: Humanização de anticorpo anti-LAG-3 murino mAb747

[00186] Com base na atividade de ligação ao antígeno, reatividade cruzada da proteína Cinomólogo LAG-3, atividade funcional e afinidade, mAb747 foi selecionado para humanização.

Exemplo 9.1: Humanização de mAb747

[00187] Os genes da região variável anti-LAG-3 mAb747 foram empregados para criar um mAb humanizado. Na primeira etapa desse processo, as sequências de aminoácidos de VH e VK de mAb747 (SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:62) foram comparadas com a base de dados disponível de sequências do gene V de Ig humana, a fim de encontrar as sequências do gene V de Ig da linha germinativa humana mais adequadas. Além disso, a sequência da estrutura 4 de VH ou VL foi comparada com o banco de dados da região J para encontrar a estrutura humana com a maior homologia com as regiões VH e VL murinas, respectivamente. Para a cadeia leve, a correspondência mais próxima do gene V humano foi o gene A1, e para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene VH1-f. As sequências de domínio variável humanizadas foram então projetadas onde a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve de mAb747 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene A1 com sequência de estrutura 4 de JK4 após CDR-L3; e as sequências CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada de mAb747 foram enxertadas em sequências de estrutura de VH1 com sequência de estrutura 4 de JH1 após CDR-H3. Um modelo Fv tridimensional de mAb747 foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições de estrutura em que os aminoácidos de camundongo eram críticos para suportar as estruturas de loop ou a interface VH/VL. Tais resíduos em sequências humanizadas devem sofrer mutação reversa para resíduos de camundongos na mesma posição para reter a afinidade/atividade. Várias mutações reversas desejáveis foram indicadas para mAb747 VH e VL, e três projetos alternativos de VH e VL foram construídos, como mostrado na Tabela 24, abaixo. (Os resíduos de aminoácidos da estrutura com mutação reversa são indicados com sublinhado duplo; CDRs murinos do anticorpo parental original estão sublinhados.) Tabela 24: Projeto VH/VL de humanização para mAb747 - Mutações reversas para resíduos de murino Identificador sequências de aminoácidos de VH/VL SEQ ID NO 123456789012345678901234567890123 Humanizado 4567890

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDFNIKDDY

MHWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQG mAb747 VH.2A 72

RVTITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVY GDY----WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDFNIKDDY

MHWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQG mAb747 VH.2B 73

KATITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVY GDY----WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASDFNIKDDY

MHWVQQAPGKGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQG mAb747 VH.1G 74

RVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCTVY GDY----WGQGTTVTVSS

Identificador sequências de aminoácidos de VH/VL SEQ ID NO 123456789012345678901234567890123 Humanizado 4567890

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYL

SWLQQKPGKTIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSR mAb747 VK.1E 75

SGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFG GGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYL

SWLQQKPEKTIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSR mAb747 VK.2A 76

SGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFG GGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYL

SWLQQKPEGTIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSR mAb747 VK.2B 77

SGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFG GGTKVEIK

[00188] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, clonados em vetores contendo os domínios constantes de IgG1 e kappa humano, respectivamente. O emparelhamento do VH humano e do VK humano criou 9 anticorpos anti-LAG-3 humanizados, denominados HumAb747-34 a -42 (Tabela 25). Um anticorpo quimérico com VH/VL de camundongo parental e sequências constantes humanas também foi produzido (mAb747c) como um controle positivo, para comparação de afinidade.

Tabela 25: Lista de Produção para Anticorpos Anti-LAG- 3 mAb747 Humanizados Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb747-34 mAb747 VH.1G mAb747 VK.1E HumAb747-35 mAb747 VH.1G mAb747 VK.2A HumAb747-36 mAb747 VH.1G mAb747 VK.2B HumAb747-37 mAb747 VH.2A mAb747 VK.1E

Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb747-38 mAb747 VH.2A mAb747 VK.2A HumAb747-39 mAb747 VH.2A mAb747 VK.2B HumAb747-40 mAb747 VH.2B mAb747 VK.1E HumAb747-41 mAb747 VH.2B mAb747 VK.2A HumAb747-42 mAb747 VH.2B mAb747 VK.2B

[00189] Todos os 9 anticorpos humanizados (Tabela 25) e um anticorpo quimérico que tem os domínios VH e VL murinos parentais (mAb747c) foram classificados pela constante de taxa de dissociação (k off). Resumidamente, os anticorpos foram caracterizados quanto às afinidades e cinética de ligação por interferometria de biocamada Octet® RED96 (Pall FortéBio LLC). Os anticorpos foram capturados por Biossensores Anti-HIgG Fc Capture (AHC) (Pall) a uma concentração de 100 nM durante 30 segundos. Os sensores foram então mergulhados no tampão de corrida (1X pH 7,2 PBS, Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,1%) durante 60 segundos para verificar a linha de base. A ligação foi medida mergulhando os sensores em uma única concentração de proteína LAG-3-his humana recombinante (Novoprotein). A dissociação foi seguida pela imersão dos sensores no tempão de execução por 1200 segundos.

As curvas de associação e dissociação foram ajustadas a um modelo de ligação Langmuir 1:1 usando o software FortéBio Data Analysis (Pall). Os resultados são mostrados na Tabela

26.

Tabela 26: Classificação de taxa de dissociação de anticorpos anti-LAG-3 humanizados Taxa de Anticorpo dissociação (koff) (1/s) mAb747c 3,77 × 10-4 HumAb747-42 8,30 × 10-4 HumAb747-39 1,14 × 10-3

[00190] HumAb747-42 mostrou uma constante de taxa de desvio apenas 2,2 vezes maior do que a do controle quimérico tendo os domínios variáveis parentais.

Exemplo 10: Produção de imunoglobulinas PD-1/LAG-3 Fabs-in-Tandem (FIT-Igs)

[00191] As proteínas de ligação de imunoglobulina Fabs-in-Tandem biespecíficas que reconhecem PD-1 humana e LAG-3 humana foram construídas.

[00192] Para cada um dos construtos FIT-Ig descritos nas tabelas a seguir, é mostrada a sequência de sinal usada no vetor de expressão para cada uma das três cadeias polipeptídicas componentes. Tanto MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC (SEQ ID NO: 79) ou MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO: 84) foi usado na produção das proteínas FIT-Ig descritas abaixo, embora muitos peptídeos de sinal alternativos sejam conhecidos pelos versados na técnica e possam ser usados também. Será entendido que tais sequências de sinal são clivadas durante a secreção dos polipeptídeos pela célula hospedeira que expressa e, portanto, as sequências de sinal não fazem parte das proteínas de ligação FIT-Ig finais.

Exemplo 10.1: FIT107-1-2a

[00193] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-2a foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais mAb709 (anti-PD-1 murino, consulte a Tabela 4 supra) e mAb746 (anti-LAG-3 murino, consulte a Tabela 23 supra). FIT-Ig FIT107-1-2a é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica no 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de mAb709 fundido diretamente a VH-CH1 de mAb746 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de mAb709; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de mAb746.

[00194] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-2a expressas são mostradas na Tabela 27 abaixo.

Tabela 27: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-2a

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSHKFMST SVGDSVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGQSLKVLI SWASTRHTGVPARFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDL ALYYCQQHYTTPYTFGGGTQLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLQQSGA

ELVRPGASVKLSCTASDFNIKDDYMHWVKQRPEQG FIT107-1-2a LDWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATITADTSSNTA Cadeia YLQLSSLTSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTLTVSSA 78 Polipeptídica STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP de FIT-Ig no 1 VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV

PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSHKFMSTSVGDSVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGQSLKVLISWASTRHTGVPARFTGSGSGTD VL-CL de mAb

YTLTISSVQAEDLALYYCQQHYTTPYTFGGGTQLE mAb709 murino 80 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASDFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTVYGDYWGQ mAb746 murino 81 GTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN CH2-CH3 82 KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK de IgG1

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVKLVESGGGLVKPGG

SLKLSCAASGFTFSFYTMSWVRQTPEKRLEWVATI FIT107-1-2a SGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLHMSSL Cadeia RSEDTALYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLVTVSAAST 83 Polipeptídica KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT de FIT-Ig no 2 VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS

SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQTPEKRLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNTLYLHMSSLRSEDTALYYCAGQGGNYLF mAb709 murino 85 AYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA

SLGERVSLNCRASQEISGYLSWLQQKSDGTIKRLI FIT107-1-2a

YAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDF Cadeia 86 ADYYCLQYASYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLNCRASQEISGYLSW

LQQKSDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSD VL-CL de

YSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPLTFGAGTKLE murino mAb746 87 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 10.2: FIT107-1-2b

[00195] Outra imunoglobulina Fabs-in-Tandem biespecífica que reconhece PD-1 humana e LAG-3 humana foi construída. Esse PD-1/LAG-3 FIT-Ig foi designado FIT107-1- 2b. A construção da proteína de ligação FIT107-1-2b utilizou sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos murinos parentais mAb709 e mAb746, mas neste construto de FIT-Ig, o domínio de ligação LAG-3 estava na posição N-terminal (externa), e o domínio de ligação a PD-1 estava na posição interna, C-terminal fundido aos domínios VL-CL da região de ligação LAG-3. FIT-Ig FIT107-1-2b é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de mAb746 fundido diretamente a VH-CH1 de mAb709 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de mAb746; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de mAb709.

[00196] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-2b expressas são mostradas na Tabela 28 abaixo.

Tabela 28: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-2b

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SLGERVSLNCRASQEISGYLSWLQQKSDGTIKRLI YAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDF ADYYCLQYASYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVKLVESGG

GLVKPGGSLKLSCAASGFTFSFYTMSWVRQTPEKR FIT107-1-2b LEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTL Cadeia YLHMSSLRSEDTALYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLV 88 Polipeptídica TVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD de FIT-Ig no 1 YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS

SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLNCRASQEISGYLSW

LQQKSDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSD VL-CL de

YSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPLTFGAGTKLE murino mAb746 89 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQTPEKRLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNTLYLHMSSLRSEDTALYYCAGQGGNYLF mAb709 murino 90 AYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLQQSGAELVRPGA

SVKLSCTASDFNIKDDYMHWVKQRPEQGLDWIGWI FIT107-1-2b

VPENGNTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSL Cadeia 91 TSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTLTVSSASTKGPSV Polipeptídica

FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS de FIT-Ig no 2

GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT

QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASDFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTVYGDYWGQ mAb746 murino 92 GTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSHKFMST

SVGDSVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGQSLKVLI FIT107-1-2b

SWASTRHTGVPARFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDL Cadeia 93 ALYYCQQHYTTPYTFGGGTQLEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSHKFMSTSVGDSVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGQSLKVLISWASTRHTGVPARFTGSGSGTD VL-CL de

YTLTISSVQAEDLALYYCQQHYTTPYTFGGGTQLE mAb709 murino 94 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 10.3: FIT107-1-5a

[00197] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-5a foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos humanizados parentais HumAb709-8 (anti-PD-1, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25) e HumAb747-42 (SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 77). FIT-Ig FIT107-1-5a é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb709-8 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747- 42 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb709-8; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747-42.

[00198] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-5a expressas são mostradas na Tabela 29 abaixo: Tabela 29: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-5a Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI

SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF FIT107-1-5a

ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Cadeia 95 PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA Polipeptídica

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK de FIT-Ig no 1

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVQSGA EVKKPGASVKVSCKASDFNIKDDYMHWVRQAPGQG LEWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATITADTSINTA

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

YMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HumAb709-8 96 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDFNIKDDYMH

WVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747-42 97 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGG

SLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKGLEWVATI FIT107-1-5a

SGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL Cadeia 98 RAEDTAVYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLVTVSSAST Polipeptídica

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT de FIT-Ig no 2

VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 99 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

SVGDRVTINCRASQEISGYLSWLQQKPEGTIKRLI FIT107-1-5a

YAASTLDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Cadeia 100 ATYYCLQYASYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLSW

LQQKPEGTIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGTKVE HumAb747-42 101 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 10,4: FIT107-1-5b

[00199] Outra imunoglobulina Fabs-in-Tandem biespecífica que reconhece PD-1 humana e LAG-3 humana foi construída. Esse PD-1/LAG-3 FIT-Ig foi designado FIT107-1- 5b. A construção da proteína de ligação FIT107-1-5b utilizou sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos humanizados parentais HumAb709-8 e HumAb747- 42, mas neste construto de FIT-Ig, o domínio de ligação LAG-

3 estava na posição N-terminal (externa), e o domínio de ligação a PD-1 estava na posição interna, C-terminal fundido aos domínios VL-CL da região de ligação LAG-3 N-terminal.

FIT-Ig FIT107-1-5b é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica no 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747-42 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb709-8 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de mAb747-42; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb709-8.

[00200] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-5b expressas são mostradas na Tabela 30 abaixo.

Tabela 30: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-5b Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SVGDRVTINCRASQEISGYLSWLQQKPEGTIKRLI

YAASTLDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF FIT107-1-5b

ATYYCLQYASYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Cadeia 102 PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA Polipeptídica

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK de FIT-Ig no 1

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKG LEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSL

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

YLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLSW

LQQKPEGTIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGTKVE HumAb747-42 103 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 104 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGA

SVKVSCKASDFNIKDDYMHWVRQAPGQGLEWIGWI FIT107-1-5b

VPENGNTEYASKFQGKATITADTSINTAYMELSRL Cadeia 105 RSDDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSV Polipeptídica

FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS de FIT-Ig no 2

GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

Sequência de aminoácidos

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDFNIKDDYMH

WVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747-42 106 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI FIT107-1-5b

SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF Cadeia 107 ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HuMAb709-8 108 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 10,5: Expressão e Purificação de FIT-Igs

[00201] Os quatro construtos FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-2a, FIT107-1-2b, FIT107-1-5a e FIT107-1-5b são um tipo de proteína de ligação multivalente biespecífica conhecida como Imunoglobulina Fabs-in-Tandem (ou FIT-Ig) descrita geralmente nos documentos WO 2015/103072 e WO 2017/136820. As proteínas de ligação foram produzidas pela co-expressão de três cadeias polipeptídicas componentes em uma célula hospedeira de mamífero transfectada com vetores de expressão para todas as três cadeias.

O projeto da proteína de ligação exige que a cadeia polipeptídica longa

(Cadeia no 1) emparelhe com ambas as cadeias polipeptídicas curtas (Cadeias no 2 e 3) para formar frações Fab em tandem funcionais, e também a cadeia longa é projetada para dimerizar via a região Fc (dobradiça-CH2-CH3), de modo que uma proteína de ligação de seis cadeias exibindo quatro locais de ligação de Fab intactos seja formada.

Nas proteínas de ligação FIT107-1-2a e FIT107-1-5a, os sítios de ligação de Fab “externo” ou N-terminal ligam PD-1 e os sítios de ligação de Fab “interno” adjacentes ligam LAG-3. O fragmento

Fab externo (anti-PD-1) de FIT107-1-2a e FIT107-1-5a é unido ao fragmento Fab interno (anti-LAG-3) apenas através da cadeia longa (Cadeia n o 1) por fusão direta de VL-CLmAb709 ou

VL-CLHumAb709-8 conforme o caso pode estar em seu C-terminal para o N-terminal de VH-CH1mAb746 ou VH-CH1HumAb747-42,

respectivamente, sem o uso de ligantes conectando os domínios de imunoglobulina.

De modo similar, o fragmento Fab externo

(anti-LAG-3) de FIT107-1-2b e FIT107-1-5b é unido ao fragmento Fab interno (anti-PD-1) apenas através da cadeia longa (Cadeia no 1) por fusão direta de VL-CLmAb746 ou VL-

CLmAb747-42 conforme o caso pode estar em seu C-terminal para o N-terminal de VH-CH1mAb709 ou VH-CH1mAb709-8, respectivamente,

sem o uso de ligantes conectando os domínios de imunoglobulina.

[00202] Os vetores de expressão que codificam para as cadeias polipeptídicas no 1, 2 e 3 de cada FIT-Ig (FIT107-1- 2a, FIT107-1-2b, FIT107-1-5a e FIT107-1-5b) foram coexpressos transitoriamente com o uso de polietilenoimina (PEI) como um agente de transfecção em células 293E de rim embrionário humano. Resumidamente, o DNA no meio de expressão FreeStyle™ 293 foi misturado com o PEI com a concentração final de DNA para a razão PEI de 1:2, incubado por 15 a 20 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, adicionado às células HEK293E (1,0 a 1,2 × 106/ml, viabilidade celular > 95%) em 60 µg de DNA/120ml de cultura. Após 6 a 24 horas de cultura em agitador, foi adicionada peptona às células transfectadas a uma concentração final de 5%, com agitação a 125 rpm/min., a 37 ℃，CO2 a 8%. No 6º - 7º dia, o sobrenadante foi coletado por centrifugação e filtração e a proteína FIT-Ig foi purificada com o uso de cromatografia de Proteína A (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante.

[00203] Para a expressão FIT107-1-2a, FIT107-1-2b, FIT107-1-5a e FIT107-1-5b, o DNA que codifica para a expressão das Cadeias no 1, 2 e 3 foi transfectado usando uma razão molar para Cadeia n o 1: Cadeia no 2: Cadeia no 3 de 1:3:3. Isso foi projetado para fazer com que proporcionalmente mais das cadeias curtas n o 2 e 3 sejam expressas em relação à cadeia longa (Cadeia no 1), o que por sua vez diminuiria a ocorrência de segmentos VL-CL e VH-CH1 na cadeia longa (Cadeia n o 1) que não foram emparelhados com as cadeias leves correspondentes e, portanto, não formariam um fragmento Fab funcional. Os produtos de expressão da proteína FIT-Ig foram purificados por cromatografia em Proteína A. A composição e a pureza do FIT-Igs purificado foram analisadas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). FIT-Ig purificado, em PBS, foi aplicado em uma coluna TSKgel SuperSW3000, 300 × 4,6 mm (TOSOH). Um instrumento HPLC, Modelo U3000 (DIONEX) foi usado para SEC com o uso de detecção de UV a 280 nm e 214 nm. Consulte a Tabela 31 abaixo.

Tabela 31: Expressão e análise de SEC de proteínas de ligação PD-1/LAG-3 FIT-Ig razão molar de Nível de % de Fração proteína DNA: Cadeia no 1 expressão Monomérica de Pico FIT-Ig : no 2 : n o 3 (mg/l) por SEC FIT107-1-2a 1:3:3 5,40 >90% FIT107-1-2b 1:3:3 5,04 >80% FIT107-1-5a 1:3:3 7,95 >80% FIT107-1-5b 1:3:3 8,52 >80%

[00204] O conteúdo da fração monomérica inferior para FIT107-1-2b, -5a e -5b indica alguma agregação possível.

Exemplo 11: Afinidades de Ligação de FIT-Igs para Antígenos Alvo

[00205] A cinética de ligação de FIT-Ig aos alvos PD- 1 e LAG-3 foi determinada por medições Biacore SPR. As afinidades de ligação de FIT107-1-2a e FIT107-1-2b para ambos os antígenos alvo PDL-1 e LAG-3 são mostradas na Tabela 32 abaixo.

Tabela 32: Afinidades de Ligação para FIT107-1-2a e FIT107-1-2b Alvo Especifi imobilizado k koff Analieo cidade de on KD (M) no chip de (1/Ms) (1/s) analito sensor externo: FIT107-1- PD-1 6,97 × 1,17 × 1,68 × 2a interno: 104 10-5 10-10 LAG-3 externo: FIT107-1- LAG-3 1,68 × 8,76 × 5,23 × HuPD-1 ECD/Fc 2b interno: 105 10-5 10-10 e PD-1 HuLAG-3 ECD/Fc 2,88 × 9,72 × 3,37 × mAb709c PD-1 105 10-6 10-11 9,51 × 1,54 × 1,62 × mAb746c LAG-3 103 10-4 10-8 mAb709c + PD-1 e 2,82 × 2,08 × 7,35 × mAb746c LAG-3 105 10-5 10-11 2,52 × 8,82 × 3,50 × HuPD-1 ECD/Fc mAb709c PD-1 105 10-6 10-11 HuLAG-3 5,58 × 1,81 × 3,25 × mAb746c LAG-3 ECD/Fc 103 10-4 10-8 Exemplo 12: Especificidade de FIT-Ig e Determinações de Função

[00206] A biespecificidade anti-PD1 e anti-LAG-3 e a atividade biológica da proteína de ligação FIT107-1-2a foram testadas em um ensaio de ativação de PBMC com o uso de enterotoxina B estafilocócica (SEB) como um superantígeno (consulte o Exemplo 7.8). Resumidamente, PBMC foram isoladas de um doador saudável, em seguida, semeadas em uma placa de 96 poços com 50 µl/poço a 2 × 10 5 células/poço. Proteínas de ligação de teste (isto é, FIT107-1-2a, uma combinação de anticorpos monoclonais anti-PD-1 e anti-LAG-3 comercialmente disponíveis ou um anticorpo monoclonal anti-PD-1) foram adicionadas às placas e incubadas com PBMC a 37 °C durante 30 min. A solução SEB foi adicionada a uma concentração final de 10 ng/ml. As placas foram incubadas por 96 horas, em seguida, 100 µl de sobrenadante de cultura de células foram coletados e a produção de IL-2 foi medida com o uso de um kit de detecção de IL-2 ELISA (R&D Systems; Cat. n o DY202).

Os resultados são mostrados na Figura 7. A proteína FIT-Ig biespecífica FIT107-1-2a teve a capacidade de aumentar a ativação de células T, conforme indicado pela produção de IL-2, em comparação com um anticorpo anti-PD-1 sozinho ou uma mistura de anticorpos anti-LAG-3 e anti-PD-1.

[00207] Além disso, um ensaio de reação de linfócitos mistos (MLR) foi realizado de um modo similar àquele descrito no Exemplo 3, para verificar ainda mais a função anti-PD-1 e anti-LAG-3 para FIT107-1-2a. A reação mista de linfócitos é uma resposta imune celular ex vivo que ocorre entre duas populações de linfócitos halogênicos quando misturados. Os linfócitos halogênicos sofrem transformação de blastos, síntese de DNA e proliferação celular em resposta às principais diferenças de antígeno de histocompatibilidade (MHC Classe I e II) entre as duas populações de células, que foram designadas como células respondedoras e estimuladoras.

No MLR para o teste de FIT107-1-2a, no dia 1, PBMC foram purificadas de doadores saudáveis e monócitos CD14+ foram isolados. Os monócitos foram semeados em placas de 6 poços e tratados com 35 ng/ml de IL-4 (R&D Systems) e 50 ng/ml de GM-CSF (R&D Systems) em meio RPMI 1640 mais FBS a 10%. O meio foi trocado após o dia 4. No dia 7, monócitos diferenciados em células dendríticas imaturas foram coletados e posteriormente processados por dois dias em meio de maturação com 20 ng/ml de TNF-α (R&D Systems), 50 μg/ml de Poly I:C (Sigma), 35 ng/ml de IL-4 e 50 ng/ml de GM-CSF.

Para os ensaios de co-cultura de MLR, meio sem soro X-VIVO™ 15 foi usado para evitar a interferência do soro na eficácia do anticorpo. Placas de fundo em U de 96 poços foram semeadas com células T CD4+ alogênicas (células respondentes) a 1 × 105 células/poço e pré-tratadas com proteína de ligação de teste (ou seja, FIT107-1-2a, uma combinação de anticorpos monoclonais anti-PD-1 e anti-LAG-3 comercialmente disponíveis, ou um anticorpo monoclonal anti-PD-1) por 30 min. Em seguida, células dendríticas maduras (células estimuladoras) foram semeadas nos poços em 1 × 10 4 células/poço e co-cultivadas com as células respondentes por cinco dias, momento em que 100 μl de sobrenadante foram coletados e a produção de IFN-γ foi medida por ELISA. Os resultados são mostrados na Figura 8. A proteína de ligação biespecífica FIT-Ig mostrou um EC50 de 0,5084 nM, em comparação com os valores de EC50 de 16,84 nM para uma combinação de anticorpos anti-PD-1 e anti-LAG-3 ou um anticorpo anti-PD-1 sozinho. Assim, a proteína de ligação a FIT-Ig aumentou a produção de IFN-γ (interferon gama) no MLR a uma concentração mais de 30 vezes menor do que o anticorpo único ou combinação de anticorpos.

Exemplo 13: Humanização de Novo Lote de mAb747

[00208] Os genes da região variável anti-LAG-3 mAb747 foram empregados para criar um outro mAb humanizado anti- LAG-3. Na primeira etapa desse processo, as sequências de aminoácidos de VH e VK de mAb747 (SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:62) foram comparadas com a base de dados disponível de sequências do gene V de Ig humana, a fim de encontrar as sequências do gene V de Ig da linha germinativa humana mais adequadas. Além disso, a sequência da estrutura 4 (FW4) de VH ou VL foi comparada com o banco de dados da região J para encontrar a estrutura humana com a maior homologia com as regiões VH e VL murinas, respectivamente. Para a cadeia leve, a melhor correspondência do gene V humano foi o gene A30; e para a cadeia pesada, a melhor correspondência humana foi o gene VH1-69-2. As sequências de domínio variável humanizadas foram então projetadas onde a CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve de mAb747 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene A30 com sequência de estrutura 4 de JK4 após CDR-L3; e as sequências CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada de mAb747 foram enxertadas em sequências de estrutura de VH1-69-2 com sequência de estrutura 4 de JH6 após CDR-H3. Um modelo Fv tridimensional de mAb747 foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições de estrutura em que os aminoácidos de camundongo eram críticos para suportar as estruturas de loop ou a interface VH/VL.

Tais resíduos em sequências humanizadas devem sofrer mutação reversa para resíduos de camundongos na mesma posição para reter a afinidade/atividade. Várias mutações reversas desejáveis foram indicadas para mAb747 VH e VL, e três projetos alternativos de VH e VL foram construídos, como mostrado na Tabela 33, abaixo. (Resíduos de aminoácidos de estrutura com mutação reversa são indicados com sublinhado duplo; CDRs estão sublinhados de acordo com o sistema de numeração de Kabat, exceto VH CDR1 definido com o sistema de numeração ABM.) Tabela 33: Projeto VH/VL de humanização para mAb747 - Mutações reversas para resíduos de murino

Identificador Sequência de Aminoácidos de VH/VL SEQ ID NO 1234567890123456789012345678901234 Humanizado 567890

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSDFNIKDDYM

HWVQQAPGKGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRV huEpi001-VHv1 109

TITADTSTDTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCKASDFNIKDDYM

HWVQQAPGKGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRV huEpi001-VHv2 110

TITADTSTDTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASDFNIKDDYM

HWVQQAPGKGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRV huEpi001-VHv3 111

HWVKQAPGKGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRA huEpi001-VHv4 112

TITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASDFNIKDDYM

HWVKQRPEQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRA huEpi001-VHv5 113

HWVKQRPEQGLDWIGWIVPENGNTEYASKFQGKA huEpi001-VHv6 114

TITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLS

WLQQKPGKAIKSLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSG huEpi001 VLv1 115

TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGQGT KLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLS

WLQQKPGKAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSG huEpi001 VLv2 116

TDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGQGT KLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLS

WLQQKPGGAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSG huEpi001 VLv3 117

SDYTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGT KLELK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLS

WLQQKPGGAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSG huEpi001 VLv4 118

SDYTLTISSLEPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGT KLELK

[00209] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, clonados em vetores contendo os domínios constantes de IgG1 e kappa humano, respectivamente. O emparelhamento do VH humano e do VK humano criou 9 anticorpos anti-LAG-3 humanizados, denominados HumAb747-43 a HumAb747-60 (Tabela 34). O anticorpo quimérico com VH/VL de camundongo parental e sequências constantes humanas descritas acima também foi usado (mAb747c) como um controle positivo, para comparação de afinidade.

Tabela 34: Lista de Produção para Anticorpos Anti-LAG- 3 mAb747 Humanizados Identificador Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia κ de Anticorpo Pesada Leve HumAb747-43 huEpi001-VHv1 huEpi001 VLv1 HumAb747-44 huEpi001-VHv2 huEpi001 VLv1 HumAb747-45 huEpi001-VHv3 huEpi001 VLv1 HumAb747-46 huEpi001-VHv4 huEpi001 VLv1 HumAb747-47 huEpi001-VHv1 huEpi001 VLv2 HumAb747-48 huEpi001-VHv2 huEpi001 VLv2 HumAb747-49 huEpi001-VHv3 huEpi001 VLv2 HumAb747-50 huEpi001-VHv4 huEpi001 VLv2 HumAb747-51 huEpi001-VHv1 huEpi001 VLv3 HumAb747-52 huEpi001-VHv2 huEpi001 VLv3 HumAb747-53 huEpi001-VHv3 huEpi001 VLv3 HumAb747-54 huEpi001-VHv4 huEpi001 VLv3 HumAb747-55 huEpi001-VHv1 huEpi001 VLv4 HumAb747-56 huEpi001-VHv2 huEpi001 VLv4 HumAb747-57 huEpi001-VHv3 huEpi001 VLv4 HumAb747-58 huEpi001-VHv4 huEpi001 VLv4

Identificador Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia κ de Anticorpo Pesada Leve HumAb747-59 huEpi001-VHv5 huEpi001 VLv3 HumAb747-60 huEpi001-VHv6 huEpi001 VLv3

[00210] Todos os 18 anticorpos humanizados (Tabela 34) e um anticorpo quimérico que tem os domínios VH e VL murinos parentais (mAb747c) foram classificados pela constante de taxa de dissociação (k off). Resumidamente, os anticorpos foram caracterizados quanto às afinidades e cinética de ligação por interferometria de biocamada Octet® RED96 (Pall FortéBio LLC). Os anticorpos foram capturados por Biossensores Anti-hIgG Fc Capture (AHC) (Pall) a uma concentração de 100 nM durante 30 segundos. Os sensores foram então mergulhados no tampão de corrida (1X pH 7,2 PBS, Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,1%) durante 60 segundos para verificar a linha de base. A ligação foi medida mergulhando os sensores em uma única concentração de proteína LAG-3-his humana recombinante (Novoprotein). A dissociação foi seguida pela imersão dos sensores no tempão de execução por 1200 segundos.

35. Em cada grupo de teste, as taxas de desativação de anticorpos puderam ser comparadas com as do mAb747c. As taxas de dissociação foram calculadas pela taxa de dissociação do anticorpo em relação ao mAb747c de seu grupo e foram comparadas em conjunto. Quanto menor a proporção, maior a afinidade do anticorpo.

Tabela 35: Classificação de Taxa de Dissociação de Anticorpos Anti-LAG-3 Humanizados Taxa de Razão de taxa de Grupo de dissociação dissociação para Anticorpo teste (koff) aquele de (1/s) mAb747c HumAb747-43 9,25 × 10-3 682% HumAb747-44 1,10 × 10-2 809% HumAb747-45 1,08 × 10-2 797% 1 HumAb747-46 1,09 × 10-2 801% HumAb747-47 1,44 × 10-2 1062% HumAb747-48 8,03 × 10-3 592% mAb747c 1,36 × 10-3 100% HumAb747-49 7,73 × 10-3 575% HumAb747-50 7,19 × 10-3 534% HumAb747-51 1,19 × 10-2 888% 2 HumAb747-52 4,36 × 10-3 324% HumAb747-53 4,30 × 10-3 319% HumAb747-54 4,23 × 10-3 314% mAb747c 1,35 × 10-3 100% HumAb747-55 1,19 × 10-2 972% HumAb747-56 4,31 × 10-3 352% 3 HumAb747-57 4,11 × 10-3 335% HumAb747-58 4,05 × 10-3 331% mAb747c 1,23 × 10-3 100% HumAb747-59 1,20 × 10-3 226% 4 HumAb747-60 8,10 × 10-4 153% mAb747c 5,30 × 10-4 100%

[00211] HumAb747-60 mostrou uma constante de taxa de desvio apenas 1,5 vezes maior do que a do controle quimérico tendo os domínios variáveis parentais.

[00212] Para verificar ainda mais a função dos anticorpos anti-LAG-3 em PBMC humana, foi realizado um ensaio de estimulação de toxina bacteriana com o uso de superantígeno enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB), da maneira descrita no Exemplo 7.8 supra. A produção de IL- 2 foi medida usando um kit de detecção PerkinElmer IL-2 (PerkinElmer; Cat. no TRF1221M). HumAb747-60 teve a capacidade de aumentar a secreção de IL-2 de PBMC estimuladas por SEB bloqueando a via do sinal LAG-3. Os resultados são mostrados na Figura 9. HumAb747-60 foi, portanto, comprovado funcional e foi selecionado para manipulação adicional.

Exemplo 14: Maturação de Afinidade de HumAb747-60 Exemplo 14.1: Construção e Triagem da Biblioteca de Maturação de Afinidade

[00213] Embora HumAb747-60 tenha mostrado uma constante de taxa de dissociação apenas 1,5 vez maior do que aquela do controle quimérico mAb747c, os resultados do ensaio PBMC-SEB indicaram que HumAb747-60 tem uma atividade funcional ligeiramente mais fraca. Para melhorar ainda mais a afinidade, os resíduos de CDR (no sistema de numeração ABM) foram otimizados por maturação de afinidade com base no HumAb747-39 (consulte as Tabelas 24, 25). Duas bibliotecas de fago foram projetadas e construídas. Uma foi projetada para mutar CDR-L1, CDR-L3 e CDR-H3 (numeração ABM), em que cada um dos quais tinha um resíduo mutado aleatoriamente. A outra foi projetada para mutar CDR-L2, CDR-H1 e CDR-H2 (numeração ABM), em que cada um dos quais tinha um resíduo mutado aleatoriamente.

[00214] As bibliotecas de exibição de fago foram construídas usando o método relatado em Journal of Immunological Methods, 201:35–55 (1997). Resumidamente, VH- CH1 e VL-CL foram amplificados com primers degenerados que introduzem mutações e, em seguida, clonados em dois sítios de clonagem múltipla (MCS) de um vetor fagemídeo sequencialmente. Os vetores fagemídeos foram então eletrotransformados em TG1 (Cat. no 60502-1, Lucigen), resultando em bibliotecas de aproximadamente 1,2 × 10 8 clones, respectivamente, mostrando alta diversidade de sequência. As bibliotecas foram resgatadas com fago auxiliar M13K07 (Cat. no N0315S) em aproximadamente uma razão de 1:20 (célula e fago). As seleções da biblioteca de exibição de fagos foram realizadas com a proteína LAG-3 humana recombinante, seguida por etapas de lavagem. Um fragmento Fab de HumAb747-39 também foi construído em um vetor fagemídeo como um controle positivo. Os fagos selecionados foram usados para infecção de células hospedeiras. A capacidade de ligação dos sobrenadantes Fab de clones únicos foi rastreada por ELISA. Resumidamente, os sobrenadantes Fab de clones únicos foram preparados por cultura durante a noite a 30 °C com IPTG 1 mM. 2 µg/ml de proteína LAG-3 humana em 100 µl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram revestidos diretamente em cada poço de placas de 96 poços.

O anticorpo anti-c-myc ligado a HRP (Cat. n o Ab1261, Abcam) e o reagente TMB foram usados para detectar e desenvolver o sinal ELISA, que foi lido por um leitor de placas (leitor de placas de absorvância SpectraMax® Plus 384, Molecular Devices) no comprimento de onda de 450 nm.

[00215] Os clones positivos no ELISA de triagem foram selecionados para sequenciamento. Considerando a redundância de sequência e a força do sinal no ELISA de triagem, os 7 clones a seguir foram selecionados para avaliação posterior.

As sequências VH / VL são mostradas na Tabela 36. (Resíduos de aminoácidos mutados identificados por maturação de afinidade são indicados com sublinhado duplo; CDRs estão sublinhados de acordo com o sistema de numeração de Kabat.) Tabela 36: Sequências de Aminoácidos VH/VL de 7 Anticorpos com Mutações Maturadas por Afinidade Clones maturado sequências de proteínas

SEQ ID s por Domínio 1234567890123456789012345678901234

NO afinidad 567890 e

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDDYM B2-53 VH 119 HWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTVYASKFQGRV

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDY

Clones maturado sequências de proteínas

SEQ ID s por Domínio 1234567890123456789012345678901234

NO afinidad 567890 e

WGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYAASALDSGVPSRFSGSRSG VL 120

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGT KVEIK EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDFNIKDDYM

HWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRV VH 121

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDV

WGQGTTVTVSS B3-21

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRAMQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSG VL 122

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYAYYPLTFGGGT KVEIK EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDDYM

HWVCQAPGQGLEWIGWIVPENGNTEYASKFQGRV VH 123

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDY

WGQGTTVTVSS B3-43

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYAASHLDSGVPSRFSGSRSG VL 124

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGT KVEIK EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDDYM

HWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGLTEYASKFQGRV VH 125

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDY

WGQGTTVTVSS B3-46

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYATSTLDSGVPSRFSGSRSG VL 126

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGT KVEIK EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASDFSIKDDYM

HWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGKTEYASKFQGRV VH 127

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDY

WGQGTTVTVSS B3-48

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYAAMTLDSGVPSRFSGSRSG VL 128

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGT KVEIK

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDDYM B3-69 VH 129

HWVRQAPGQGLEWIGWIVPENGNTHYASKFQGRV

Clones maturado sequências de proteínas

SEQ ID s por Domínio 1234567890123456789012345678901234

NO afinidad 567890 e

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYEASTLDSGVPSRFSGSRSG VL 130

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGT KVEIK EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDDYM

HWVRQAPGQGLEWIGWIVPRNGNTMYASKFQGRV VH 131

TITADTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVYGDY

WGQGTTVTVSS D1-70

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQEISGYLS

WLQQKPEGTIKRLIYAASTLDLGVPSRFSGSRSG VL 132

SDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASYPLTFGGGT

KVEIK Exemplo 14,2: Conversão de IgG e Caracterização de Clones Positivos

[00216] Os sete clones Fab foram convertidos em proteínas IgG completas. Resumidamente, os genes VH e VL foram produzidos sinteticamente e depois clonados em vetores contendo sequências de codificação para os domínios constantes de IgG1 e kappa humano, respectivamente. Os plasmídeos da cadeia pesada e da cadeia leve cognata foram co-transfectados em células HEK 293E, individualmente. Após aproximadamente seis dias de cultura de células pós- transfecção, os sobrenadantes foram coletados e submetidos a cromatografia de afinidade em Proteína A. A afinidade de anticorpos purificados foi classificada por interferometria de biolamada Octet® RED96 (consulte o Exemplo 9.1, supra).

Os resultados são mostrados na Tabela 37.

Tabela 37: Classificação de Taxa de Dissociação de Anticorpos Anti-LAG-3 após Maturação por Afinidade Anticorpo de Taxa de Razão de taxa de Grupo de comprimento dissociação dissociação para teste total (koff) (1/s) aquele de mAb747c B3-21-IgG 1,98 × 10-3 132% B3-43-IgG 5,88 × 10-3 392% B3-46-IgG 2,48 × 10-3 165% 1 B3-48-IgG 2,85 × 10-3 190% B3-69-IgG 3,59 × 10-3 239% B2-53-IgG 1,80 × 10-3 120% mAb747c 1,50 × 10-3 100% D1-70-IgG 2,60 × 10-3 160% HumAb747-42 4,28 × 10-3 263% 2 HumAb747-39 3,91 × 10-3 240% mAb747c 1,63 × 10-3 100%

[00217] D1-70-IgG e B2-53-IgG mostraram uma constante de taxa de desvio com aumento mínimo em comparação com HumAb747-39, refletindo o maior aumento de afinidade após mutações. Portanto, as mutações em D1-70-IgG e B2-53-IgG foram introduzidas na sequência de HumAb747-60 que era a melhor candidata após a humanização.

Exemplo 14.3: Geração e Caracterização de Anticorpos Manipulados Adicionais

[00218] As mutações em D1-70 identificadas pelo processo de maturação de afinidade foram D26G, E53R e E58M no domínio VH, e S56L no domínio VL (posição do resíduo determinada pelo sistema de numeração de Kabat). As mutações em B2-53 identificadas pelo processo de maturação de afinidade foram D26G e E58V no domínio VH, e T53A no domínio VL (posição do resíduo determinada pela numeração de Kabat).

Essas mutações foram incorporadas nas sequências VH/VL de HumAb747-60, separadamente ou em combinação.

[00219] Houve um padrão NG no CDR-H2 do HumAb747-60, que pode ter resultado em heterogeneidade durante a fabricação devido às reações de desaminação, portanto, uma mutação de NG para NA também foi avaliada. A mutação G55A no domínio VH foi calculada para não perturbar a atividade de HumAb747-60 enquanto quebra o padrão NG. As sequências de aminoácidos para as variantes de anticorpos, incluindo as mutações discutidas acima, são mostradas na Tabela 38. (CDRs estão sublinhados de acordo com a numeração de Kabat.) Tabela 38: Projeto de VH/VL Manipulado para HumAb747- 60 Identificador sequências de aminoácidos

SEQ ID de VH/VL 1234567890123456789012345678901234

NO Manipulado 567890

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASDFNIKDDYM huEpi001- HWVKQRPEQGLDWIGWIVPENANTEYASKFQGKA 133 VHv6(G55A) TITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY

WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYM

HWVKQRPEQGLDWIGWIVPRNGNTMYASKFQGKA huEpi001-VHv6.1 134

TITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS

Identificador sequências de aminoácidos

SEQ ID de VH/VL 1234567890123456789012345678901234

NO Manipulado 567890

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYM

HWVKQRPEQGLDWIGWIVPENGNTVYASKFQGKA huEpi001-VHv6.2 135

TITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDY WGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYM

HWVKQRPEQGLDWIGWIVPRNGNTVYASKFQGKA huEpi001-VHv6.3 136

WLQQKPGGAIKRLIYAASTLDLGVPSRFSGSRSG huEpi001-VLv3.4 137

SDYTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGT KLELK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLS

WLQQKPGGAIKRLIYAASALDSGVPSRFSGSRSG huEpi001-VLv3.5 138

SDYTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGT KLELK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLS huEpi001-VLv3.6 WLQQKPGGAIKRLIYAASALDLGVPSRFSGSRSG 139

SDYTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGT KLELK

[00220] Os genes VH e VK manipulados foram produzidos sinteticamente e, em seguida, clonados em vetores contendo os domínios constantes de IgG1 e kappa humano, respectivamente. O emparelhamento do VH humano e do VK humano criou 13 anticorpos anti-LAG-3 manipulados, denominados HumAb747V-43 a HumAb747V-73 (Tabela 39). O anticorpo quimérico com VH/VL de camundongo parental e sequências constantes humanas (mAb747c) foi usado como um controle positivo para comparação de afinidade.

Tabela 39: Lista de Produção de Anticorpos Anti-LAG-3 Manipulados

Identificador de Região VH na Cadeia Região VL na Cadeia Anticorpo Pesada κ Leve HumAb747V-61 huEpi001-VHv6(G55A) huEpi001 VLv3 HumAb747V-62 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3.4 HumAb747V-63 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3.5 HumAb747V-64 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3.6 HumAb747V-65 huEpi001-VHv6.1 huEpi001 VLv3 HumAb747V-66 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3.4 HumAb747V-67 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3.5 HumAb747V-68 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3.6 HumAb747V-69 huEpi001-VHv6.2 huEpi001 VLv3 HumAb747V-70 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3.4 HumAb747V-71 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3.5 HumAb747V-72 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3.6 HumAb747V-73 huEpi001-VHv6.3 huEpi001 VLv3

[00221] Todos os 13 anticorpos humanizados (Tabela 39) e anticorpo anti-LAG-3 quimérico mAb747c com os domínios VH e VL murinos parentais foram classificados pela constante de taxa de dissociação (koff) da mesma maneira descrita no Exemplo 9.1 supra. Os resultados são mostrados na Tabela 40.

Em cada grupo de teste, as taxas de desativação de anticorpos puderam ser comparadas com as do mAb747c. As taxas de dissociação foram calculadas pela taxa de dissociação do anticorpo em relação ao mAb747c de seu grupo e foram comparadas em conjunto. Quanto menor a proporção, maior a afinidade do anticorpo.

Tabela 40: Classificação de Taxa de Dissociação de Anticorpos Anti-LAG-3 com Manipulação Adicional

Anticorpo de Taxa de Razão de taxa de Grupo de comprimento dissociação dissociação para teste total (koff) (1/s) aquela de mAb747c HumAb747V-61 6,86 × 10-4 112% HumAb747V-62 4,80 × 10-4 78% HumAb747V-63 5,22 × 10-4 85% 1 HumAb747V-64 4,50 × 10-4 73% HumAb747V-65 2,92 × 10-4 47% HumAb747V-66 5,84 × 10-4 95% mAb747c 6,15 × 10-4 100% HumAb747V-67 3,19 × 10-4 47% HumAb747V-68 2,95 × 10-4 44% HumAb747V-69 3,57 × 10-4 53% 2 HumAb747V-70 2,73 × 10-4 40% HumAb747V-71 2,92 × 10-4 43% HumAb747V-72 2,47 × 10-4 37% mAb747c 6,76 × 10-4 100% HumAb747V-73 3,21 × 10-4 51% 3 mAb747c 6,31 × 10-4 100%

[00222] Com base no HumAb747-60, a maioria dos anticorpos com mutações de CDR adotadas após a maturação de afinidade mostraram taxa de dissociação melhorada em comparação com a taxa de dissociação de mAb747c, prevendo afinidade aprimorada. HumAb747V-61 tinha uma taxa de dissociação similar a mAb747c, o que indicava que a substituição de aminoácido VH G55A não perturbou a afinidade.

Os anticorpos que tinham taxas de dissociação inferiores a 60% do mAb747c em seu grupo de teste foram avaliados posteriormente em um ensaio funcional baseado em células.

[00223] A atividade anti-LAG-3 foi testada em um ensaio de ativação de PBMC com o uso de enterotoxina B estafilocócica (SEB) como superantígeno. Resumidamente, PBMC foram semeadas em uma placa de 96 poços com 2 × 10 5 células/poço. As proteínas de teste (anticorpos monoclonais anti-LAG-3) foram adicionadas às placas e incubadas com PBMC a 37 °C durante 30 min. A solução SEB foi adicionada a uma concentração final de 10 ng/ml. As placas foram incubadas por 96 horas, em seguida, 100 µl de sobrenadante de cultura de células foram coletados e a produção de IL-2 foi medida com o uso de um kit de detecção PerkinElmer IL-2 (PerkinElmer; Cat. no TRF1221M). Os resultados são mostrados na Figura 10. Os resultados mostram que as variantes de anticorpos projetados podem aumentar a produção de IL-2 a partir de PBMC estimuladas por SEB, bloqueando a sinalização mediada por LAG-3.

[00224] Com base nos resultados do ensaio PBMC-SEB, HumAb747V-67, HumAb747V-72 e HumAb747V-73 demonstraram atividade de bloqueio de LAG-3 superior; portanto, esses três anticorpos foram usados para gerar proteínas de ligação a FIT-Ig direcionadas a LAG-3 e também a PD-1.

Exemplo 15: Geração de PD-1/LAG-3 FIT-Igs com o Uso de Novas Sequências de Anticorpos Anti-LAG-3

[00225] Os anticorpos anti-LAG-3 HumAb747V-67, HumAb747V-72 e HumAb747V-73 gerados conforme descrito acima,

e dois anticorpos anti-PD-1, HumAb709-8 (consulte as Tabelas 5 e 7, supra) e HumAb713-7 (consulte as Tabelas 9 e 10, supra), foram usados para gerar proteínas de ligação a FIT- Ig, seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 10, supra.

A mutação G55A foi incluída no desenho da sequência de todos os domínios VH das porções Fab anti-LAG-3.

Exemplo 15.1: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-6a-1

[00226] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-6a-1 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais mAb709-8 (anti-PD-1 humanizado, consulte as Tabelas 5 e 6, supra) e HumAb747V-67 (anti-LAG-3 humanizado, consulte as Tabelas 38 e 39, supra). FIT-Ig FIT107-1-6a-1 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb709-8 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747V-67 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb709-8; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747V-676.

[00227] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-6a-1 expressas são mostradas na Tabela 41 abaixo: Tabela 41: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-6a-1 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVQSGA

EVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQG FIT107-1-6a-1

LDWIGWIVPENANTVYASKFQGKATITADTSTNTA Cadeia

YLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA Polipeptídica 140

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP de FIT-Ig no 1

VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HumAb709-8 141 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-67 142 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK

VEPKSC dobradiça-CH2- 82 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 CH3 TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK de IgG1 humana PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN

KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKGLEWVATI

SGGGRDTYY FIT107-1-6a-1

PDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY Cadeia 143 CAGQGGNYLFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA Polipeptídica

PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT de FIT-Ig no 2

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 144 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI FIT107-1-6a-1

YAASALDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Cadeia 145 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW VL-CL de LQQKPGGAIKRLIYAASALDSGVPSRFSGSRSGSD HumAb747V-67 YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE 146 (VL LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY sublinhado) PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

RGEC Exemplo 15,2: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-6b-1

[00228] Outra imunoglobulina Fabs-in-Tandem biespecífica que reconhece PD-1 humana e LAG-3 humana foi construída. Esse PD-1/LAG-3 FIT-Ig foi designado FIT107-1- 6b-1. A construção da proteína de ligação FIT107-1-6b-1 utilizou sequências de codificação para domínios de imunoglobulina de anticorpos parentais HumAb747V-67 (anti- LAG-3) e HumAb709-8 (anti-PD-1). Esse construto FIT-Ig exibiu um domínio de ligação LAG-3 na posição N-terminal (externa) e um domínio de ligação PD-1 na posição interna fundido C-terminal aos domínios VL-CL da região de ligação LAG-3. FIT-Ig FIT107-1-6b-1 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747V-67 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb709-8 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb747V-67; e

[00229] A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb709-8.

[00230] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-6b-1 expressas são mostradas na Tabela 42 abaixo.

Tabela 42: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-6b-1 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI YAASALDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGG

GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKG FIT107-1-6b-1 LEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSL Cadeia YLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLV 147 Polipeptídica TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD de FIT-Ig no 1 YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS

HEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASALDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-67 148 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC VH-CH1 de mAb EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS HumAb709-8 149 WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI (VH SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 sublinhado) AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

TVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLDWIGWI FIT107-1-6b-1 VPENANTVY Cadeia ASKFQGKATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYY 150 Polipeptídica CTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS de FIT-Ig no 2 TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-67 151 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI FIT107-1-6b-1

SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF Cadeia 152 ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais VL-CL de DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW 153 HumAb709-8 YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 (VL YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE sublinhado) IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,3: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-6a-2

[00231] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-6a-2 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb709-8 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-72 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-6a-2 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb709-8 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747V-72 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb709-8; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747V-72.

[00232] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-6a-2 expressas são mostradas na Tabela 43 abaixo:

Tabela 43: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-6a-2 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

EVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQG FIT107-1-6a-2 LDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATITADTSTNTA Cadeia YLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA 154 Polipeptídica STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP de FIT-Ig no 1 VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HumAb709-8 155 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-72 156 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK

VEPKSC dobradiça- DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR CH2-CH3 82 TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK de IgG1 PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 humana KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKGLEWVATI

SGGGRDTYY FIT107-1-6a-2

PDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY Cadeia 157 CAGQGGNYLFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA Polipeptídica

PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT de FIT-Ig no 2

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 158 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI FIT107-1-6a-2

YAASALDLGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Cadeia 159 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASALDLGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-72 160 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC

Exemplo 15,4: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-6b-2

[00233] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-6b-2 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb709-8 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-72 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-6b-2 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747V-72 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb709-8 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb747V-72; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb709-8.

[00234] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-6b-2 expressas são mostradas na Tabela 44 abaixo.

Tabela 44: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-6b-2 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 FIT107-1-6b-2 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA Cadeia 161 SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI Polipeptídica YAASALDLGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 de FIT-Ig no 1 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKG LEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASALDLGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-72 162 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de mAb

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 163 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VL

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK FIT107-1-6b-2 164 MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGA

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 Cadeia TVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLDWIGWI Polipeptídica VPRNANTVY de FIT-Ig no 2 ASKFQGKATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYY

CTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-72 165 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI FIT107-1-6b-2

SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF Cadeia 166 ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HumAb709-8 167 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15.5: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-6a-3

[00235] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-6a-3 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb709-8 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-73 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-6a-3 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb709-8 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747V-73 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb709-8; e

[00236] A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747V-73.

[00237] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-6a-3 expressas são mostradas na Tabela 45 abaixo: Tabela 45: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-6a-3 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI FIT107-1-6a-3 SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF Cadeia ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica 168 PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 1 LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVQSGA EVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQG LDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATITADTSTNTA

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

YLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HumAb709-8

IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL 169

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-73 170 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

SLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKGLEWVATI FIT107-1-6a-3

SGGGRDTYY Cadeia 171 PDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY Polipeptídica

CAGQGGNYLFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA de FIT-Ig no 2

PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 172 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI FIT107-1-6a-3

YAASTLDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Cadeia 173 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-73 174 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,6: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-6b-3

[00238] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-6b-3 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb709-8 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-73 (anti-LAG-

3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-6b-3 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747V-73 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb709-8 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb747V-73; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb709-8.

[00239] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-6b-3 expressas são mostradas na Tabela 46 abaixo.

Tabela 46: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-6b-3 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI YAASTLDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA FIT107-1-6b-3 LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK Cadeia HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGG Polipeptídica 175 GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMSWVRQAPGKG de FIT-Ig no 1 LEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSL

YLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-73 176 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYTMS

WVRQAPGKGLEWVATISGGGRDTYYPDSVKGRFTI VH-CH1 de mAb

SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQGGNYLF HumAb709-8 177 AYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (VH

AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL sublinhado)

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGA TVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLDWIGWI

VPRNANTVY FIT107-1-6b-3

ASKFQGKATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYY Cadeia 178 CTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS Polipeptídica

TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT de FIT-Ig no 2

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais VH-CH1 de 179 EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 HumAb747V-73 WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI (VH TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ sublinhado) GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIVMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASQDVNTVVAWYQQKPGKAPKVLI FIT107-1-6b-3

SWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF Cadeia 180 ATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNTVVAW

YQQKPGKAPKVLISWASTRHTGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPYTFGGGTKVE HumAb709-8 181 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,7: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-7a-1

[00240] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-7a-1 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb713-7 (anti-PD-1 humanizado; consulte as Tabelas 9 e 10, supra) e HumAb747V-67 (anti-LAG-3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-7a-1 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes:

A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb713-7 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747V-67 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb713-7; e A cadeia polipeptídica no 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747V-67.

[00241] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-7a-1 expressas são mostradas na Tabela 47 abaixo: Tabela 47: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-7a-1 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLI YGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDI ATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVQSGA FIT107-1-7a-1 EVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQG Cadeia LDWIGWIVPENANTVYASKFQGKATITADTSTNTA Polipeptídica 182 YLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA de FIT-Ig no 1 STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAW

YQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVE HumAb713-7 183 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-67 184 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTSSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI

SSGSYTIYY FIT107-1-7a-1

ADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYY Cadeia 185 CAKRGGSSHVNVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVF Polipeptídica

PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG de FIT-Ig no 2

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMH VH-CH1 de

WVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTI HumAb713-7 186 SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHV (VH

NVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS sublinhado)

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI FIT107-1-7a-1

YAASALDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF FIT-Ig 187 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídeo

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA Chain #3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASALDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-67 188 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,8: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-7b-1

[00242] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-7b-1 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb713-7 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-67 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-7b-1 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747V-67 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb713-7 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma

IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb747V-67; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb713-7.

As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-7b-1 expressas são mostradas na Tabela 48 abaixo.

Tabela 48: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-7b-1 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

GLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMHWVRQAPGKG FIT107-1-7b-1

LEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSL FIT-Ig

YLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHVNVMDYWGQG Polipeptídeo 189

TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL Chain #1

VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais VL-CL de mAb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW HumAb747V-67 190 LQQKPGGAIKRLIYAASALDSGVPSRFSGSRSGSD

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 (VL YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE sublinhado) LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMH

WVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTI VH-CH1 de mAb

SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHV HumAb713-7 191 NVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (VH

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP sublinhado)

AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

VPENANTVY FIT107-1-7b-1

ASKFQGKATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYY Cadeia 192 CTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS Polipeptídica

TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT de FIT-Ig no 2

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPENANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-67 193 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK

VEPKSC FIT107-1-7b-1 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA 194 Cadeia SVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLI

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 Polipeptídica YGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDI de FIT-Ig no 3 ATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAW

YQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de

YTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVE HumAb713-7 195 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,9: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-7a-2

[00243] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-7a-2 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb713-7 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-72 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-7a-2 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb713-7 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747V-72 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante (consulte a Tabela 6, supra); A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb713-7; e

A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747V-72.

[00244] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-7a-2 expressas são mostradas na Tabela 49 abaixo: Tabela 49: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-7a-2 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLI YGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDI ATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVQSGA

EVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQG FIT107-1-7a-2

LDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATITADTSTNTA Cadeia

YLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA Polipeptídica 196 STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP de FIT-Ig no 1

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAW

YQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVE HumAb713-7 197 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC VH-CH1 de mAb 198 EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 HumAb747V-72 WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI (VH TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ sublinhado) GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

SLRLSCAASGFTSSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI FIT107-1-7a-2 SSGSYTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL Cadeia RDEDTAVYYCAKRGGSSHVNVMDYWGQGTTVTVSS 199 Polipeptídica ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE de FIT-Ig no 2 PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT

VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMH

WVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHV HumAb713-7 200 NVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (VH

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP sublinhado)

SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI FIT107-1-7a-2

YAASALDLGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Cadeia 201 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASALDLGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-72 202 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,10: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-7b-2

[00245] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-7b-2 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb713-7 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-72 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-7b-2 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747V-72 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb713-7 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb747V-72; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb713-7.

[00246] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-7b-2 expressas são mostradas na Tabela 50 abaixo.

Tabela 50: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-7b-2 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI YAASALDLGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGG

GLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMHWVRQAPGKG FIT107-1-7b-2

LEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSL Cadeia

YLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHVNVMDYWGQG Polipeptídica 203

TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL de FIT-Ig no 1

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASALDLGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-72 204 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMH

WVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTI VH-CH1 de mAb

SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHV HumAb713-7 205 NVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (VH

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP sublinhado)

AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP

SNTKVDKKVEPKSC dobradiça- 82 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890 CH2-CH3 TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK de IgG1 PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN humana KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGA TVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLDWIGWI

VPRNANTVY FIT107-1-7b-2

ASKFQGKATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYY Cadeia 206 CTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS Polipeptídica

TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT de FIT-Ig no 2

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-72 207 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLI FIT107-1-7b-2

YGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDI Cadeia 208 ATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAW VL-CL de YQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTD HumAb713-7 YTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVE 209 (VL IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY sublinhado) PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

RGEC Exemplo 15,11: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-7a-3

[00247] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-7a-3 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb713-7 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-73 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-7a-3 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb713-7 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb747V-73 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb713-7; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb747V-73.

[00248] As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-7a-3 expressas são mostradas na Tabela 51 abaixo: Tabela 51: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-7a-3

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

EVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQG FIT107-1-7a-3

LDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATITADTSTNTA Cadeia

YLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQGTTVTVSSA Polipeptídica 210

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP de FIT-Ig no 1

NHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAW

YQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de mAb

YTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVE HumAb713-7 211 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de mAb

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-73 212 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTSSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI

SSGSYTIYY FIT107-1-7a-3

ADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYY Cadeia 213 CAKRGGSSHVNVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVF Polipeptídica

PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG de FIT-Ig no 2

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMH

WVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTI VH-CH1 de

SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHV HumAb713-7 214 NVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (VH

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP sublinhado)

SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI FIT107-1-7a-3

YAASTLDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Cadeia 215 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-73 216 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 15,12: Produção de proteína de ligação FIT-Ig PD-1/LAG-3 FIT107-1-7b-3

[00249] Um PD-1/LAG-3 FIT-Ig designado FIT107-1-7b-3 foi construído com a utilização de sequências de codificação para domínios de imunoglobulina dos anticorpos parentais HumAb713-7 (anti-PD-1 humanizado) e HumAb747V-73 (anti-LAG- 3 humanizado). FIT-Ig FIT107-1-7b-3 é um hexâmero composto por três cadeias polipeptídicas componentes: A cadeia polipeptídica n o 1 tem a fórmula de domínio: VL-CL de HumAb747V-73 fundido diretamente a VH-CH1 de HumAb713-7 fundido diretamente a dobradiça-CH2-CH3 de uma IgG1 constante humana mutante; A cadeia polipeptídica n o 2 tem a fórmula de domínio: VH-CH1 de HumAb747V-73; e A cadeia polipeptídica n o 3 tem a fórmula do domínio: cadeia leve (VL-CL) de HumAb713-7.

As sequências de aminoácidos para as três cadeias polipeptídicas FIT107-1-7b-3 expressas são mostradas na Tabela 52 abaixo.

Tabela 52: Sequências de Aminoácidos de Cadeias de Componentes FIT107-1-7b-3 Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA FIT107-1-7b-3 SVGDRVTITCRASQEISGYLSWLQQKPGGAIKRLI Cadeia YAASTLDSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDF Polipeptídica 217 ADYYCLQYASYPLTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIF de FIT-Ig no 1 PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGG

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

GLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMHWVRQAPGKG LEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHVNVMDYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISGYLSW

LQQKPGGAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGSRSGSD VL-CL de mAb

YTLTISSLQPEDFADYYCLQYASYPLTFGQGTKLE HumAb747V-73 218 LKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSDYGMH

WVRQAPGKGLEWVSYISSGSYTIYYADTVKGRFTI VH-CH1 de mAb

SRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKRGGSSHV HumAb713-7 219 NVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (VH

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP sublinhado)

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK dobradiça-

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP humana

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVQSGAEVKKPGA FIT107-1-7b-3

TVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLDWIGWI Cadeia 220 VPRNANTVY Polipeptídica

ASKFQGKATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYY de FIT-Ig no 2

CTVYGDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS

Sequência de aminoácidos

SEQ ID Polipeptídeo 12345678901234567890123456789012345 NO: 67890

TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKKVEPKSC sequência de 84 MEFGLSWLFLVAILKGVQC sinais

EVQLVQSGAEVKKPGATVKLSCTASGFNIKDDYMH

WVKQRPEQGLDWIGWIVPRNANTVYASKFQGKATI VH-CH1 de

TADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCTVYGDYWGQ HumAb747V-73 221 GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (VH

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL sublinhado)

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSLSA

SVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLI FIT107-1-7b-3

YGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDI Cadeia 222 ATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF Polipeptídica

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA de FIT-Ig no 3

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC sequência de 79 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC sinais

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAW

YQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTD VL-CL de

YTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSPPYTFGGGTKVE HumAb713-7 223 IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY (VL

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL sublinhado)

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN

RGEC Exemplo 16: Caracterização de Novas Proteínas FIT-Ig Exemplo 16.1: Expressão e Análise SEC

[00250] As 12 proteínas de ligação a FIT-Ig descritas acima (Tabelas 41 a 52) foram expressas da mesma maneira como descrito no Exemplo 10.5, supra, e purificadas por cromatografia em Proteína A. A composição e a pureza do FIT- Igs purificado foram analisadas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). FIT-Ig purificado, em PBS, foi aplicado em uma coluna TSKgel SuperSW3000, 300 × 4,6 mm (TOSOH). Um instrumento de HPLC DIONEX™ UltiMate 3000 (Thermo Scientific) foi usado para SEC com o uso de detecção de UV em 280 nm e 214 nm. Consulte a Tabela 53 abaixo.

Tabela 53: Expressão e Análise de SEC de Proteínas de Ligação PD-1/LAG-3 FIT-Ig razão molar de Nível de % de Fração proteína DNA: Cadeia no expressão Monomérica de FIT-Ig 1 : no 2 : no 3 (mg/l) Pico por SEC FIT107-1- 1:2:1,5 6,21 78,9% 6a-1 FIT107-1- 1:2:1,5 8,58 55,4% 6b-1 FIT107-1- 1:2:1,5 6,11 90,9% 6a-2 FIT107-1- 1:2:1,5 15,86 43,2% 6b-2 FIT107-1- 1:2:1,5 11,37 43,0% 6a-3 FIT107-1- 1:2:1,5 17,22 44,0% 6b-3 FIT107-1- 1:2:1,5 14,47 80,0% 7a-1 FIT107-1- 1:2:1,5 17,96 94,8% 7b-1 FIT107-1- 1:2:1,5 19,25 88,3% 7a-2 FIT107-1- 1:2:1,5 22,12 98,5% 7b-2 FIT107-1- 1:2:1,5 14,31 80,9% 7a-3

FIT107-1- 1:2:1,5 29,20 98,7% 7b-3

[00251] As proteínas FIT-Ig que tinham teores de fração monomérica mais baixos (<80%) foram excluídas na caracterização posterior.

Exemplo 16.2: Ensaios Funcionais

[00252] A atividade FIT-Ig de PD-1/LAG-3 foi testada em um ensaio de ativação de PBMC com o uso de enterotoxina B estafilocócica (SEB) como um superantígeno, conforme descrito no Exemplo 12. Os resultados são mostrados na Figura

11. Os resultados mostraram que todas as variantes de FIT- Ig testadas podem aumentar a secreção de IL-2 de PBMC estimuladas por SEB. O aumento foi de alguma forma revertido nas doses mais altas de FIT107-1-7b-2 e FIT107-1-7b-3, portanto, essas duas proteínas FIT-Ig não foram priorizadas como moléculas principais.

Exemplo 16.3: Atividade de Ligação

[00253] A cinética de ligação de FIT-Ig aos alvos PD- 1 e LAG-3 foi determinada por interferometria de biocamada com o uso do sistema Octet® RED96 (Pall FortéBio LLC). As afinidades de ligação para ambos os antígenos alvo PD-1 e LAG-3 são mostradas na Tabela 54 abaixo. Todas as proteínas FIT-Ig retiveram afinidade para huPD-1 e huLAG-3. Todas as proteínas FIT-Ig testadas contra antígenos de cinomólogo também mostraram reatividade cruzada com antígenos de cinomólogo.

Tabela 54: Afinidades de Ligação para Proteínas de Ligação PD-1/LAG-3 FIT-Ig FIT-Ig capturado no Analieo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) chip de sensor 8,96 × 9,35 × 1,04 × PD-1-His humano 104 10-4 10-8 2,15 × 7,75 × 3,61 × PD-1-His cyno FIT107-1-7b- 105 10-4 10-9 1 LAG-3-His 2,00 × 2,43 × 1,22 × humano 105 10-4 10-9 5,19 × 6,36 × 1,23 × LAG-3-his cyno 105 10-5 10-10 1,16 × 1,03 × 8,86 × PD-1-His humano 105 10-3 10-9 2,48 × 9,19 × 3,71 × PD-1-His cyno FIT107-1-7b- 105 10-4 10-9 3 LAG-3-His 1,44 × 3,28 × 2,28 × humano 105 10-4 10-9 2,81 × 4,70 × 1,67 × LAG-3-His cyno 105 10-5 10-10 1,87 × 2,39 × 1,28 × PD-1-His humano 105 10-4 10-9 3,06 × 1,07 × 3,49 × PD-1-His cyno FIT107-1-6a- 105 10-3 10-9 2 LAG-3-His 1,15 × 1,17 × 1,02 × humano 105 10-4 10-9

1.,1 × 8,17 × 4,28 × LAG-3-His cyno 105 10-5 10-10 1,77 × 5,38 × 3,04 × PD-1-His humano FIT107-1-7a- 105 10-4 10-9 1 LAG-3-His 1,69 × 1,24 × 7,32 × humano 105 10-4 10-10 FIT107-1-7a- 1,66 × 5,26 × 3,17 × PD-1-His humano 2 105 10-4 10-9

FIT-Ig capturado no Analieo kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M) chip de sensor LAG-3-His 1,05 × 1,28 × 1,22 × humano 105 10-4 10-9 2,08 × 6,28 × 3,01 × PD-1-His humano FIT107-1-7a- 105 10-4 10-9 3 LAG-3-His 9,10 × 1,34 × 1,47 × humano 104 10-4 10-9 1,05 × 8,27 × 7,90 × PD-1-His humano FIT107-1-7b- 105 10-4 10-9 2 LAG-3-His 1,74 × 2,46 × 1,41 × humano 105 10-4 10-9 Exemplo 16.4: Dados farmacocinéticos de Rato

[00254] Com base na pureza após a purificação em uma etapa, a titulação de expressão em transfecção transitória, a afinidade de ligação retida, bem como a atividade funcional no ensaio PBMC-SEB, FIT107-1-7b-1 foi selecionada como molécula principal. As propriedades farmacocinéticas de FIT107-1-7b-1 foram avaliadas em camundongos Sprague-Dawley (SD) machos. A proteína FIT-Ig foi administrada a ratos SD machos em uma única dose intravenosa de 5 mg/kg. Amostras de soro foram coletadas em diferentes pontos de tempo ao longo de um período de 28 dias com amostragem em 0, 5, 15 e 30 minutos; 1, 2, 4, 8 e 24 horas; e sangramento em série de 2, 4, 7, 10, 14, 21 e 28 dias através da veia da cauda, e analisado por ELISAs gerais. Resumidamente, as placas de ELISA foram revestidas com 125 ng/poço de anticorpo Fc de

IgG anti-humano de cabra (Rockland, Cat n o: 609-101-017) a 4 °C durante a noite, bloqueado com 1X PBS/1% BSA/0,05% Tween- 20/0,05% ProClin™ 300. Todas as amostras de soro foram diluídas 20 vezes em tampão de bloqueio primeiro. Uma diluição adicional foi feita em soro de rato reunido a 5% e incubado na placa por 60 minutos a 37 °C. A detecção foi realizada com um anticorpo de cabra conjugado com IgG- peroxidase anti-humano específico de Fab (Sigma-Aldrich; Cat. no A0293) e as concentrações foram determinadas com a ajuda de curvas padrão usando o ajuste logístico de quatro parâmetros. Os valores para os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por modelo não compartimental com o uso de software WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, Calif. EUA). Conforme demonstrado por esses resultados mostrados na Tabela 55, as propriedades de FIT107-1-7b-1 são estáveis in vivo.

Tabela 55: Propriedades Farmacocinéticas de FIT107-1- 7b-1 parâmetros CL Vss Beta t1/2 AUC MRT

PK Anticorpo ml/dia/kg ml/kg dia dia*μg/ml dia FIT107-1- 9,17 114 8,82 436 12,4 7b-1 Exemplo 16.5: Ensaio de bloqueio de receptor FGL1 (RBA)

[00255] Foi relatado recentemente que a proteína 1 similar ao fibrinogênio (FGL1) é um ligante funcional LAG-3 principal independente do MHC Classe II (Wang J. et al., Cell, 176 (1): 334-47 (2019)). O bloqueio da interação FGL1/LAG-3 por anticorpos estimula a imunidade tumoral. Para avaliar a atividade de bloqueio do anticorpo anti-LAG-3 ou FIT-Ig, FGL1 (Wuhan USCN, Cat. n o RPD022Hu01) foi diluído para 5 µg/ml com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco e 100 µl foram adicionados a uma placa de 96 poços e incubados a 4 °C de um dia para o outro. A placa foi lavada três vezes com 300 µl/poço de PBS+TWEEN 20 (PBST). HumAb747V- 67, FIT107-1-7b-1, hIgG (concentração de trabalho: 100 nM, 10 nM, 1 nM e 0,1 nM) e 1 µg/ml de LAG-3 biotinilado (AcroBiosystem, Cat. n o H82E5) foram adicionados e incubados à temperatura ambiente durante 2 horas. A placa foi lavada três vezes com 300 µl/poço de PBST, depois lida com o uso de um leitor de microplacas VARIOSKAN™ LUX (Thermo Scientific) com o uso do protocolo ELISA-Endpoint-TMB/HRP. Os resultados são mostrados na Figura 12. Os resultados mostraram que ambos FIT107-1-7b-1 FIT-Ig e seu anticorpo anti-LAG-3 parental HumAb747V-67 podem bloquear a ligação de LAG-3 humana à proteína FGL1.

Exemplo 16.6: Atividade de ligação a células primárias da proteína FIT107-1-7b-1.

[00256] Os ensaios anteriores demonstraram que as proteínas PD-1/LAG-3 FIT-Ig podem se ligar a proteínas do antígeno recombinante. Para avaliar ainda mais a capacidade de ligação à superfície celular de FIT107-1-7b-1, os anticorpos parentais HumAb713-7, HumAb747V-67 e o FIT-Ig FIT107-1-7b-1 biespecífico foram biotinilados com reagente de biotina (Sigma, Cat . no S3259). Para PBMC sem estimulação, PBMCs foram ressuspensas a 5 × 10 6 células/ml.

Para o teste de anticorpo PD-1 (HumAb713-7) ou anticorpo LAG-3 (HumAb747V-67), foram adicionados 100 µg/ml de anticorpo e a mistura de reação deixada incubar a 37 °C por 40 minutos separadamente, seguido por duas lavagens com Tampão FACS. Em seguida, 100 µl, 5 × 10 5 PBMC/poço (grupo não tratado, grupo tratado com anticorpo anti-PD-1 e grupo tratado com anticorpo anti-LAG-3) foram semeados em poços de placa de 96 poços. HumAb713-7, HumAb747V-67 e FIT107-1-7b-1 biotinilados foram adicionados e incubados a 37 °C por 40 minutos (concentração de trabalho final começando em 100 nM com diluição em série de 3 vezes) seguido por lavagem com tampão FACS duas vezes. FITC-estreptavidina e anticorpo BV421-anti-CD3 humano foram adicionados e a placa de ensaio incubada a 4 °C por 30 minutos, seguido por lavagem com tampão FACS duas vezes. A placa foi analisada com um citômetro de fluxo Beckman Coulter CytoFlex. Grupos de estimulação de PBMC foram estimulados com anticorpo anti-CD3 mais anticorpo anti-CD28 por 72 horas, para induzir a expressão de PD-1 e LAG-3 em células T. A ligação de HumAb713-7, HumAb747V-67 e FIT107-1-7b-1 foi testada em PBMC estimulados com a mesma estratégia de agrupamento (não tratado, anticorpo anti-PD-1 tratado e grupo tratado com anticorpo anti-LAG-3) como nos experimentos de PBMC não estimulada. A ligação dos anticorpos de teste foi investigada no subconjunto de células T CD3 por FACS. Os resultados são mostrados na Figura 13. Os resultados mostraram que FIT107- 7b-1 exibiu um padrão de ligação único que indica a ligação aos alvos PD-1 e LAG-3 em células T.

[00257] O conteúdo de todas as referências (incluindo referências de literatura, patentes, pedidos de patentes e sites) que são citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados a título de referência em sua totalidade. A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular e biologia celular, que são bem conhecidas na técnica.

[00258] A invenção pode ser realizada em outras formas específicas sem se afastar das características essenciais da invenção descritas acima. As modalidades anteriores devem, portanto, ser consideradas ilustrativas em vez de limitantes da invenção aqui descrita. O âmbito da invenção é indicado pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que tem a capacidade de se ligar ao PD-1 humano, em que a porção de ligação ao antígeno do anticorpo compreende um conjunto de seis CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, selecionados do grupo de conjuntos de CDR da seguinte forma: Conjunto CDR CDR SEQ ID NO: de CDR no Sequência de aminoácidos CDR-H1 SYMMS resíduos 31-35 de SEQ ID NO:4 CDR-H2 SMSGGGRDTYYPDSVKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:4 CDR-H3 RGTYAMDY resíduos 99-106 de SEQ ID NO:4 1 CDR-L1 LASQTIGTWLT resíduos 24-34 de SEQ ID NO:5 CDR-L2 AATSLAD resíduos 50-56 de SEQ ID NO:5 CDR-L3 QQLYSTPWT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:5 CDR-H1 TGYYWN resíduos 31-36 de SEQ ID NO:6 CDR-H2 YMSYDGNNNYNPSLKN resíduos 51-66 de SEQ ID NO:6 CDR-H3 DRGTTILGGTMDY resíduos 99-111 de SEQ ID NO:6 2 CDR-L1 KASQSVSNDVA resíduos 24-34 de SEQ ID NO:7 CDR-L2 YAFYRYT resíduos 50-56 de SEQ ID NO:7 CDR-L3 QQDYSSPWT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:7 CDR-H1 FYTMS resíduos 31-35 de SEQ ID NO:8 CDR-H2 TISGGGRDTYYPDSVKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:8 CDR-H3 QGGNYLFAY resíduos 99-107 de SEQ ID NO:8 3 CDR-L1 KASQDVNTVVA resíduos 24-34 de SEQ ID NO:9 CDR-L2 WASTRHT resíduos 50-56 de SEQ ID NO:9 CDR-L3 QQHYTTPYT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:9 CDR-H1 DYGMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:10 CDR-H2 YISSGSYTIYYADTVKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:10 CDR-H3 RGGSSHVNVMDY resíduos 99-110 de SEQ ID NO:10 4 CDR-L1 KASDHINNWLA resíduos 24-34 de SEQ ID NO:11 CDR-L2 GATSLET resíduos 50-56 de SEQ ID NO:11 CDR-L3 QQYWSPPYT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:11 CDR-H1 DNNVE resíduos 31-35 de SEQ ID NO:12 CDR-H2 DINPNNGDTLYSQYFKD resíduos 50-66 de SEQ ID NO:12 5 CDR-H3 GKSDQFDY resíduos 99-106 de SEQ ID NO:12 CDR-L1 LASQTIGTWLA resíduos 24-34 de SEQ ID NO:13 CDR-L2 AATSLAD resíduos 50-56 de SEQ ID NO:13

CDR-L3 QQLYSSPWT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:13 CDR-H1 SYAMS resíduos 31-35 de SEQ ID NO:14 CDR-H2 TISGGGRDTYYPDSVKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:14 CDR-H3 QGGTYLFAS resíduos 99-107 de SEQ ID NO:14 6 CDR-L1 KASQDVNTAVA resíduos 24-34 de SEQ ID NO:15 CDR-L2 WASTRHT resíduos 50-56 de SEQ ID NO:15 CDR-L3 QQHYTTPYT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:15 CDR-H1 DYEMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:16 CDR-H2 VIEPESGGTVYNQKFKG resíduos 51-66 de SEQ ID NO:16 CDR-H3 EGFNSDHYFDY resíduos 99-109 de SEQ ID NO:16 7 CDR-L1 RSSQNIVHSNGNTYLE resíduos 24-39 de SEQ ID NO:17 CDR-L2 KVFNRFS resíduos 55-61 de SEQ ID NO:17 CDR-L3 FQGSHVPYT resíduos 94-102 de SEQ ID NO:17 CDR-H1 SHLMS resíduos 31-35 de SEQ ID NO:18 CDR-H2 AISGGGADTYYPDSVKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:18 CDR-H3 QILAFDS resíduos 99-105 de SEQ ID NO:18 8 CDR-L1 HASQNIYVWLN resíduos 24-34 de SEQ ID NO:19 CDR-L2 KASNLHT resíduos 50-56 de SEQ ID NO:19 CDR-L3 QQGQSYPWT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:19 CDR-H1 SHLMS resíduos 31-35 de SEQ ID NO:53 CDR-H2 AISGGGADTYYPASVKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:53 CDR-H3 QILAFDA resíduos 99-105 de SEQ ID NO:53 9 CDR-L1 HASQNIYVWLN resíduos 24-34 de SEQ ID NO:19 CDR-L2 KASNLHT resíduos 50-56 de SEQ ID NO:19 CDR-L3 QQGQSYPWT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:19

2. Anticorpo anti-PD-1 caracterizado pelo fato de que compreende domínios VH e VL, em que os dois domínios variáveis compreendem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:25

SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:20 e SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:57.

3. Anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que tem a capacidade de se ligar ao LAG-3 humano, em que a porção de ligação ao antígeno do anticorpo compreende um conjunto de seis CDRs,

CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3,

selecionados do grupo de conjuntos de CDR da seguinte forma:

Conjunto CDR CDR SEQ ID NO: de CDR no Sequência de aminoácidos CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:60 CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:60 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:60 10 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:61 CDR-L2 AASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:61 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:61 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:60 CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:60 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:60 11 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:62 CDR-L2 AASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:62 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:62 CDR-H1 DYEMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:63 CDR-H2 AIDPETGGTAYNQKFKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:63 CDR-H3 WGSTVFPY resíduos 101-108 de SEQ ID NO:63 12 CDR-L1 KSTKSLLNSDGFTYLD resíduos 24-39 de SEQ ID NO:64 CDR-L2 LVSNRFS resíduos 55-61 de SEQ ID NO:64 CDR-L3 FQSNYLPWT resíduos 94-102 de SEQ ID NO:64 CDR-H1 DYEMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:65 CDR-H2 AIDPATGGTAYNQKFKG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:65 CDR-H3 WGTTVFPY resíduos 99-106 de SEQ ID NO:65 13 CDR-L1 KSTKSLLNSDGFTYLD resíduos 24-39 de SEQ ID NO:66 CDR-L2 LVSNRFS resíduos 55-61 de SEQ ID NO:66 CDR-L3 FQSNYLPWT resíduos 94-102 de SEQ ID NO:66 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:67 CDR-H2 WIDPENGDTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:67 CDR-H3 FDY resíduos 99-101 de SEQ ID NO:67 14 CDR-L1 KSSQSLLDSDGKTYLN resíduos 24-39 de SEQ ID NO:68 CDR-L2 LVSKLDS resíduos 55-61 de SEQ ID NO:68 CDR-L3 WQGSHFPQT resíduos 94-102 de SEQ ID NO:68 CDR-H1 DDYVH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:69 15 CDR-H2 WIDPENGDTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:69 CDR-H3 WDAEENY resíduos 99-105 de SEQ ID NO:69

CDR-L1 RSSKSLLHSNGNTYLY resíduos 24-39 de SEQ ID NO:70 CDR-L2 RMSNLAS resíduos 55-61 de SEQ ID NO:70 CDR-L3 MQHLEYPFT resíduos 94-102 de SEQ ID NO:70 CDR-H1 DDYIH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:71 CDR-H2 WIDPENGDTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:71 CDR-H3 DYRNWY resíduos 100-105 de SEQ ID NO:71 16 CDR-L1 KSSQSLLDSDGKTYLN resíduos 24-39 de SEQ ID NO:68 CDR-L2 LVSKLDS resíduos 55-61 de SEQ ID NO:68 CDR-L3 WQGSHFPQT resíduos 94-102 de SEQ ID NO:68 CDR-H1 DFNIKDDYMH resíduos 26-35 de SEQ ID NO:114 CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:114 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:114 17 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:117 CDR-L2 AASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:117 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:117 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:72 CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:72 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:72 18 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:77 CDR-L2 AASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:77 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:77 CDR-H1 DDYMH resíduos 30-34 de SEQ ID NO:119 CDR-H2 WIVPENGNTVYASKFQG resíduos 48-64 de SEQ ID NO:119 CDR-H3 YGDY resíduos 95-98 de SEQ ID NO:119 19 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:120 CDR-L2 AASALDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:120 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:120 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:121 CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:121 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:121 20 CDR-L1 RAMQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:122 CDR-L2 AASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:122 CDR-L3 LQYAYYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:122 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:123 CDR-H2 WIVPENGNTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:123 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:123 21 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:124 CDR-L2 AASHLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:124 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:124 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:125 CDR-H2 WIVPENGLTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:125 22 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:125 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:126

CDR-L2 ATSTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:126 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:126 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:127 CDR-H2 WIVPENGKTEYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:127 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:127 23 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:128 CDR-L2 AAMTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:128 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:128 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:129 CDR-H2 WIVPENGNTHYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:129 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:129 24 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:130 CDR-L2 EASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:130 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:130 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:131 CDR-H2 WIVPRNGNTMYASKFQG resíduos 50-66 de SEQ ID NO:131 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:131 25 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:132 CDR-L2 AASTLDL resíduos 50-56 de SEQ ID NO:132 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:132 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:135 CDR-H2 WIVPENANTVYASKFQG SEQ ID NO:224 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:135 26 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:138 CDR-L2 AASALDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:138 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:138 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:136 CDR-H2 WIVPRNANTVYASKFQG SEQ ID NO:225 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:136 27 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:139 CDR-L2 AASALDL resíduos 50-56 de SEQ ID NO:139 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:139 CDR-H1 DDYMH resíduos 31-35 de SEQ ID NO:136 CDR-H2 WIVPRNANTVYASKFQG SEQ ID NO:225 CDR-H3 YGDY resíduos 99-102 de SEQ ID NO:136 28 CDR-L1 RASQEISGYLS resíduos 24-34 de SEQ ID NO:117 CDR-L2 AASTLDS resíduos 50-56 de SEQ ID NO:117 CDR-L3 LQYASYPLT resíduos 89-97 de SEQ ID NO:117

4. Anticorpo anti-LAG-3 caracterizado pelo fato de que compreende domínios VH e VL, em que os dois domínios variáveis compreendem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:69 e SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:121 e SEQ ID NO:122 SEQ ID NO:123 e SEQ ID NO:124 SEQ ID NO:125 e SEQ ID NO:126 SEQ ID NO:127 e SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:129 e SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:132 SEQ ID NO:135 e SEQ ID NO:138 SEQ ID NO:136 e SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:136 e SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:226 e SEQ ID NO:138 SEQ ID NO:227 e SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:227 e SEQ ID NO:117.

5. Proteína de ligação multivalente biespecífica caracterizada pelo fato de que compreende a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, (i) VL A-CL-VHB-CH1-Fc, em que CL está diretamente fundido a VH B, ou (ii) VHB-CH1- VLA-CL-Fc, em que CH1 está diretamente fundido a VL A; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VH A-CH1; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VL B-CL; em que VL é um domínio variável de cadeia leve, CL é um domínio constante de cadeia leve, VH é um domínio variável de cadeia pesada, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, Fc é uma região Fc de imunoglobulina, A é um epítopo de PD-1 ou LAG -3 e B é um epítopo de PD-1 ou LAG-3, com a condição de que A e B sejam diferentes, em que a dita proteína de ligação tem a capacidade de se ligar a PD-1 e LAG-3.

6. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os domínios VLA-CL e VHA-CH1 são de um anticorpo parental que se liga a um dos alvos de antígeno PD-1 ou LAG-3, e os domínios VLB-CL e VHB-CH1 são de uma ligação do anticorpo parental diferente ao outro dos alvos de antígeno PD-1 ou LAG-3.

7. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fc, em que CL é diretamente fundido a VH LAG-3, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VH PD-1-CH1; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VL LAG-3-CL; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VHPD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VLLAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

8. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que, na primeira cadeia polipeptídica, os domínios VL PD-1-CL são iguais à cadeia leve de um anticorpo parental anti-PD-1, os domínios VHPD-1-CH1 são os mesmos que a variável da cadeia pesada e os domínios constantes de cadeia pesada de um anticorpo parental anti-PD-1, os domínios VLLAG-3-CL são os mesmos que a cadeia leve de um anticorpo parental anti-LAG-3 e os domínios VHLAG- 3-CH1 são os mesmos que os domínios constantes da cadeia variável pesada e da cadeia pesada de um anticorpo parental anti-LAG-3.

9. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fc, em que CL é diretamente fundido a VH PD-1, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VH LAG-3-CH1; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VLPD-1-CL; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VH PD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VL LAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

10. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que, na primeira cadeia polipeptídica, os domínios VL LAG-3-CL são iguais à cadeia leve de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VHLAG-3-CH1 são os mesmos que a variável da cadeia pesada e os domínios constantes de cadeia pesada de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VLPD-1-CL são os mesmos que a cadeia leve de um anticorpo parental anti-PD-1 e os domínios VHPD-1-CH1 são os mesmos que os domínios constantes da cadeia variável pesada e da cadeia pesada de um anticorpo parental anti-PD-1.

11. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fc, em que CH1 é diretamente fundido a VL PD-1, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende,

do terminal amino ao terminal carboxila, VL LAG-3-CL; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHPD-1-CH1; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VH PD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VL LAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

12. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que, na primeira cadeia polipeptídica, os domínios VL LAG-3-CL são iguais à cadeia leve de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VHLAG-3-CH1 são os mesmos que a variável da cadeia pesada e os domínios constantes de cadeia pesada de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VLPD-1-CL são os mesmos que a cadeia leve de um anticorpo parental anti-PD-1 e os domínios VHPD-1-CH1 são os mesmos que os domínios constantes da cadeia variável pesada e da cadeia pesada de um anticorpo parental anti-PD-1.

13. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a primeira, a segunda e a terceira cadeias polipeptídicas, em que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fc, em que CH1 é diretamente fundido a VL LAG-3, em que a dita segunda cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino ao terminal carboxila, VL PD-1-CL; e em que a dita terceira cadeia polipeptídica compreende, do terminal amino à carboxila, VHLAG-3-CH1; em que VLPD-1 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-PD-1, CL é um domínio constante de cadeia leve, VH PD-1 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1, CH1 é um domínio constante de cadeia pesada, VL LAG-3 é um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo anti-LAG-3, VHLAG-3 é um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- LAG-3 e Fc é uma região Fc de imunoglobulina.

14. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que, na primeira cadeia polipeptídica, os domínios VL LAG-3-CL são iguais à cadeia leve de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VHLAG-3-CH1 são os mesmos que a variável da cadeia pesada e os domínios constantes de cadeia pesada de um anticorpo parental anti-LAG-3, os domínios VLPD-1-CL são os mesmos que a cadeia leve de um anticorpo parental anti-PD-1 e os domínios VHPD-1-CH1 são os mesmos que os domínios constantes da cadeia variável pesada e da cadeia pesada de um anticorpo parental anti-PD-1.

15. Anticorpo ou proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região Fc que compreende SEQ ID NO: 28.

16. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 78, a dita segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 20-240 de SEQ ID NO: 83, e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO: 86.

17. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO: 88, a dita segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 20-235 de SEQ ID NO: 91, e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO: 93.

18. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 95, a dita segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 20-242 de SEQ ID NO: 98, e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO: 100.

19. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO: 102, a dita segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 20-235 de SEQ ID NO: 105, e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-236 de SEQ ID NO: 107.

20. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 140; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146.

21. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO: 147; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 153.

22. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 154; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.

23. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO: 161; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167.

24. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 168; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174.

25. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-684 de SEQ ID NO: 175; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181.

26. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 182; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.

27. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-687 de SEQ ID NO: 189; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 195.

28. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 196; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 202.

29. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-687 de SEQ ID NO: 203; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209.

30. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-679 de SEQ ID NO: 210; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 216.

31. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23-687 de SEQ ID NO: 217; a dita segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 221; e a dita terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 223.

32. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

33. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo anti-LAG-3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 3, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

34. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação de anticorpo anti-PD-1 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, e anticorpo anti-LAG-3, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 3, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

35. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma proteína de ligação biespecífica, conforme definido na reivindicação 5, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

36. Uso de uma proteína de ligação biespecífica, conforme definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para tratar uma doença ou distúrbio em que a atividade mediada por PD-1 e/ou atividade mediada por LAG-3 é prejudicial.

37. Uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a dita doença é câncer.

38. Uso, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o câncer é: um melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), um câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), um câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), um adenocarcinoma pancreático, um câncer de mama, um câncer de cólon, um câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), um câncer de esôfago, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, um câncer de fígado, um câncer de ovário, um câncer cervical, um câncer de tireoide, um glioblastoma, um glioma, uma leucemia, um linfoma ou um câncer ósseo primário (por exemplo, osteossarcoma, sarcoma de Ewing, histiocitoma fibroso maligno ou condrossarcoma).

39. Método para preparar um medicamento para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em que a atividade mediada por PD-1 e/ou atividade mediada por LAG-3 é prejudicial caracterizado pelo fato de que compreende a formulação de pelo menos uma proteína de ligação biespecífica, conforme definido na reivindicação 5, com um carreador farmaceuticamente aceitável.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a dita doença é câncer.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o câncer é: um melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), um câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), um câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), um adenocarcinoma pancreático, um câncer de mama, um câncer de cólon, um câncer de pulmão (por exemplo, um câncer de pulmão de células não pequenas), um câncer de esôfago, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, um câncer de fígado, um câncer de ovário, um câncer cervical, um câncer de tireoide, um glioblastoma, um glioma, uma leucemia, um linfoma ou um câncer ósseo primário (por exemplo, osteossarcoma, sarcoma de Ewing, histiocitoma fibroso maligno ou condrossarcoma).

42. Método de tratamento de um distúrbio em que a atividade mediada por PD-1 e/ou LAG-3 é prejudicial caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 35, ou uma combinação dos mesmos.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a dita doença é câncer.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o câncer é: um melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), um câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), um câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), um adenocarcinoma pancreático, um câncer de mama, um câncer de cólon, um câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), um câncer de esôfago, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, um câncer de fígado, um câncer de ovário, um câncer cervical, um câncer de tireoide, um glioblastoma, um glioma, uma leucemia, um linfoma ou um câncer ósseo primário (por exemplo, osteossarcoma, sarcoma de Ewing, histiocitoma fibroso maligno ou condrossarcoma).

45. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um ser humano.