TWI772904B - Ｃｄ３９的高親和力抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明公開識別CD39的高親和力抗體。所述抗體能夠中和表達CD39的細胞上的CD39的ATP酶活性。這樣的抗體可用於治療由CD39活性介導的癌症和其他疾病。

Description

CD39的高親和力抗體及其用途
本發明涉及識別CD39的新抗體，CD39也稱為胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1)或NTPDase 1。CD39抗體可用於治療免疫性疾病和癌症。
癌細胞的一個標誌是，它們能夠藉由獲得性表達免疫應答的多種負調節因子，來逃避免疫介導的破壞作用。這種現在常常稱為“免疫檢查點”的負調節因子包括表面受體，如CTLA-4(CD152)和PD-L1(CD274)。靶向免疫反應的這些關鍵調節因子已經成為一種新的治療選擇，來防止腫瘤介導的免疫抑制以及建立長效的癌症特異性免疫應答。Bonnefoy等，OncoImmunology，4：5，e1003015(2015)。抗體介導的這些免疫調節途徑的阻斷已導致有希望的臨床結果。然而，由於在不到50%的患者中觀察到客觀反應並且這些反應是腫瘤依賴性的，因此鑒定可以在協同治療關聯方案中作為靶點的替代性非冗餘抑制/免疫抑制途徑，是十分有意義的。
在參與免疫應答調節的分子中，CD39(胞外核苷酸酶三磷酸二磷酸水解酶-1，NTPDase1)是一種有希望的癌症免疫療法的新靶標。CD39是一種 膜整合型蛋白，具有兩個跨膜結構域和一個大的胞外區(Maliszewski等，1994)，具有核苷三磷酸二磷酸水解酶活性(Wang和Guidotti，1996)。CD39在細胞表面上定位後具有催化活性，並且其糖基化對正確的蛋白質折疊、膜靶向和酶活性至關重要。(Smith等，Biochim.Biophys.Acta.，1386：65-78(1998))。
CD39在脾、胸腺、肺和胎盤中組成型地表達(Enjyoji等，Nat.Med.，5：1010-1017(1999)；Zimmermann H.，Trends Pharmacol.Sci.，20：231-236(1999))；Mizumoto等，Nat.Med.，8：358-365(2002)；Kapojos等，Eur.J.Pharmacol.，501：191-198(2004))，並且在這些器官中，它主要與內皮細胞和免疫細胞群有關，所述免疫細胞群如B細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、單核細胞、巨噬細胞、腎小球系膜細胞、嗜中性白細胞和調節性T細胞(Treg)。(Dwyer等，Purinergic Signal，3：171-180(2007))。CD39表達藉由轉錄因子Sp1(Eltzschig等(2009)同上)、Stat3和鋅指蛋白生長因子非依賴性-1轉錄因子(Chalmin等，Immunity，36：362-373(2012))，受幾種促炎性細胞因子、氧化應激和缺氧的調節(Deaglio S.和Robson S.C.，Adv.Pharmacol.，61：301-332(2011)；Eltzschig等，Blood，113：224-232(2009))。此外，CD39的表達在幾種實體腫瘤中增加，所述實體腫瘤例如結腸直腸癌、頭頸癌和胰腺癌，以及慢性淋巴細胞性白血病，表明這種酶也參與了惡性疾病的發生和進展(Bastid等，Oncogene，32(24)：1743-1751(2013))。已顯示可溶性催化活性形式的CD39在人和鼠血液中循環(Yegutkin等，FASEB.J.，26：3875-3883(2012))。
CD39與CD73一起藉由將胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)水解成一磷酸腺苷(AMP)(藉由CD39)以及將AMP水解成腺苷(藉由CD73)來調節嘌呤能信號的持續時間、規模和化學性質。CD39和CD73都在調節性T 細胞(Treg，以前稱為抑制性T細胞)上高度表達，調節性T細胞是一種有助於維持免疫系統的體內平衡的CD4+亞群。在CD39陽性Treg浸潤的癌症中，CD39發揮關鍵作用，因為它藉由啟動腺苷的產生增加了腫瘤血管生成並抑制免疫抗腫瘤反應。(Stagg等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，107(4)：1547-1552(2010))
骨髓來源的抑制細胞(MDSCs)也藉由CD39介導的機制促進腫瘤生長。例如，CD39表達在從癌症患者分離的MDSC上升高，並且與來自健康供體的MDSC相比，這些細胞顯示出對於抗腫瘤T細胞的抑制作用。
此外，來自CD39剔除小鼠的Treg被組成型地激活，過度增殖，並且喪失了它們的抑制功能。與野生型小鼠相比，剔除小鼠中的黑色素瘤生長以及肺轉移、結腸轉移和肉瘤也顯著減少，還觀察到了血管生成的嚴重缺陷。
CD39抑制是具有前景的克服天然抗腫瘤效應T細胞活性的Treg抑制的方法。施用CD39抑制劑，如抗CD39抗體和/或其抗原結合片段，可提供一種手段，恢復或支持在許多癌症中被抑制的抗腫瘤免疫應答。
鑒於藉由募集免疫效應細胞應答和抑制對效應細胞激活的抑制，在研發治療癌症的新方法方面中取得的進展，需要新的活性CD39抑制劑和方法。還不斷需要研發針對CD39的治療以及評估抗CD39抗體活性，所述治療可以單獨或結合其他免疫檢查點抑制劑。
本發明提供了以高親和力結合CD39的新抗體。本發明的抗CD39抗體可用於在體外或體內檢測人CD39、抑制CD39 NTPDase1活性，和/或中和人CD39介導的免疫抑制。
本發明還提供了製備和使用本文所述的抗CD39抗體和/或其抗原結合片段的方法、以及可用於檢測樣品中的CD39、或用於治療或預防個體中與CD39活性相關的疾病的方法中的各種組合物。
本發明還提供了能夠結合人CD39的新抗體，其中抗體的抗原結合結構域包含一組六個CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，選自以下定義的CDR組：
Figure 109133319-A0202-12-0004-1
Figure 109133319-A0202-12-0005-2
在一個實施方案中，根據本發明的抗CD39抗體包含VH和VL結構域，其中兩個可變結構域包含選自以下的胺基酸序列：
Figure 109133319-A0202-12-0006-3
在另一個實施方案中，如本文所述的抗CD39抗體可用於藉由本領域熟知的技術製備識別相同靶抗原的衍生結合蛋白。這種衍生物可以是例如單鏈抗體(scFv)，Fab片段(Fab)，Fab'片段，F(ab')2，Fv和二硫鍵連接的Fv。
本發明的另一個方面，本文所述的抗CD39抗體能夠調節CD39的生物學功能。在另一個方面，本文所述的抗CD39抗體能夠抑制CD39介導的ATP水解。在進一步的實施方案中，根據本發明的抗CD39抗體抑制至少80%的CD39介導的ATP水解，如在基於細胞的CD39 ATP酶抑制測定中測量的。
在一個實施方案中，藉由表面等離子體共振或生物膜干涉法測量本文所述的抗CD39抗體或其抗原結合片段與人CD39的結合速率常數(kon)為至少1×105M-1s-1，至少1.25×105M-1s-1，至少1.35×105M-1s-1，至少1.4×105M-1s-1，至少1.5×105M-1s-1，至少1.75×105M-1s-1，至少2×105M-1s-1，至少3×105M-1s-1，至少5×105M-1s-1，至少7×105M-1s-1，或至少1×106M-1s-1，
在另一個實施方案中，藉由表面等離子體共振或生物膜干涉法測量本文所述的抗CD39抗體或其抗原結合片段與人CD39的解離速率常數(koff)小於1×10-3s-1，小於8×10-4s-1，小於7×10-4s-1，小於6×10-4s-1，小於5×10-4s-1，小於4×10-4s-1，小於3×10-4s-1，小於1×10-4s-1，小於5×10-5s-1，或小於1×10-5s-1，
在另一個實施方案中，本文所述的抗CD39抗體或其抗原結合片段對CD39的解離常數(KD)小於5×10-8M，小於1×10-8M，小於5×10-9M，小於2×10-9M，小於1×10-9M，小於8×10-10M；小於6×10-10M；小於4×10-10M，小於3×10-10M，小於2×10-10M；小於1×10-10M，小於8×10-11M，小於6×10-11M，小於4×10-11M，小於2×10-11M，或小於1×10-11M。
本發明還提供了包含至少一種抗CD39抗體或其抗原結合片段和藥物學上可接受載體的醫藥組成物。本發明的醫藥組成物可進一步包含至少一種另外的活性成分。在一個實施方案中，這種另外的成分包括，但不限於，治療劑、成像劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、不同特異性的抗體或功能性片段、可檢測標記或報道分子；特定細胞因子的激動劑或拮抗劑、麻醉劑、非類固醇抗炎藥(NSAID)、鎖痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、皮質類固醇、同化類固醇(anabolic steroid)、促紅細胞生成素、免疫原、免疫抑制劑、生長激素、激 素替代藥物、放射性藥物、抗抑鬱藥、抗精神病藥、興奮劑、β激動劑、吸入的類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子。
在另一個實施方案中，醫藥組成物還包含至少一種另外的治療劑，該治療劑用於治療其中CD39介導的信號傳導活性是有害的疾病。
在再一個實施方案中，本發明提供了分離的核酸，其編碼本發明的抗CD39抗體或其抗原結合片段的一個或多個胺基酸序列。可將此類核酸插入載體中以進行各種遺傳分析或用於表達、表徵或改善本文所述的抗體或其抗原結合片段的一種或多種性質。載體可包含編碼本文所述抗體或抗原結合片段的一個或多個胺基酸序列的一個或多個核酸分子，其中該一個或多個核酸分子與合適的轉錄和/或翻譯序列可操作地連接以允許抗體或抗原結合片段在攜帶載體的特定宿主細胞中表達。用於選殖或表達編碼本文所述的抗體及其抗原結合片段的胺基酸序列的核酸的載體的實例包括，但不限於，pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
本發明還提供了包含載體的宿主細胞，該載體包含編碼本文所述的抗體或其抗原結合片段的一個或多個胺基酸序列的核酸。可用於本發明中的宿主細胞可以是原核的或真核的。示例性的原核宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)。可用作本發明中的宿主細胞的真核細胞包括原生生物細胞、動物細胞、植物細胞和真菌細胞。示例性真菌細胞是酵母細胞，包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可用作根據本發明的宿主細胞的示例性動物細胞包括但不限於哺乳動物細胞、禽細胞和昆蟲細胞。較佳的哺乳動物細胞包括CHO細胞、HEK細胞和COS細胞。可用作根據本發明的宿主細胞的昆蟲細胞是昆蟲Sf9細胞。
另一個方面，本發明提供了產生抗CD39抗體或其功能性片段的方法，包括在足以引起宿主細胞表達能夠結合CD39的抗體或片段的條件下，在培養基中培養包含編碼抗體或功能性片段的表達載體的宿主細胞。
在一個實施方案中，本發明提供了治療有需要的受試者中的癌症的方法，該方法包括向受試者施用本文所述的抗CD39抗體或其CD39結合片段，其中該抗體或結合片段能夠結合CD39並抑制表達CD39的細胞表面的ATP酶活性。
在另一個實施方案中，癌症是與免疫療法不相關的癌症。在另一個實施方案中，癌症是難治性或復發性惡性腫瘤。在另一個實施方案中，抗CD39抗體或其抗原結合片段抑制腫瘤細胞的生長或存活。在另一個實施方案中，癌症選自黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑素瘤)、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、頭頸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌、唾液腺癌、胃癌、膠質瘤癌、甲狀腺癌、胸腺癌、上皮癌、胃癌和淋巴瘤。
圖1是在基於細胞的CD39 ATP酶抑制測定中比較鼠抗人CD39 mAb的性能的濃度圖。呈現了抗CD39單株抗體mAb628、mAb629、mAb634、mAb635、mAb636、mAb638和無關鼠IgG對照的圖。可以看出，mAb638在亞奈莫耳濃度下基本上完全抑制了基於細胞的CD39 ATP酶活性。
圖2顯示了在基於蛋白質的CD39 ATP酶抑制測定中兩種大鼠抗小鼠CD39(muCD39)抗體的性能的濃度圖。呈現了抗muCD39單株抗體mAb605 和mAb606以及無關大鼠IgG對照的圖。可以看出，所測試的抗muCD39抗體均在30-50nM的濃度下達到EC50。
圖3顯示了在基於細胞的CD39 ATP酶抑制測定中比較人源化抗人CD39 mAb的性能的濃度圖。呈現了人源化抗huCD39單株抗體HuEM0004-38-21、-22和-23，鼠抗huCD39 mAb638，無關人IgG對照和無關鼠IgG對照的圖。可以看出，人源化抗體表現相似，在接近1nM的濃度下基本上完全抑制了ATP酶活性。鼠mAb638也是有效的，但是結合mAb638 CDR組的人源化抗體(在CDR-H2中具有G55A突變，參見下文實施例2.3)表現更為優異。
圖4是一系列條形圖，顯示了在T細胞增殖試驗中增加抗CD39活性對ATP酶介導的T細胞抑制的影響。在100nM濃度下，小鼠抗huCD39抗體mAb638中和ATP酶活性，導致在ATP存在下恢復激活T細胞的增殖。
圖5、圖6和圖7各自呈現了一系列條形圖，顯示了在T細胞增殖抑制試驗中，隨著在激活的T細胞/ATP混合物中加入增加濃度的人源化抗huCD39抗體，對ATP酶中和作用的影響。條形顯示在不同濃度的HuEM0004-38-21(圖5)、HuEM0004-38-22(圖6)和HuEM0004-38-23(圖7)存在下的中和作用。這些數據說明，人源化抗體保留具有相同CDR組(除了消除CDR-H2中的NG位點的點突變G54A，參見實施例2.3)的鼠抗體的ATP酶中和特性。
發明詳述
本發明涉及新的抗CD39抗體及其抗原結合部分，所述抗體和抗原結合部分可以用於在體外或在體內檢測人CD39、抑制CD39 NTPDase1活性和/或中和人CD39介導的免疫抑制。
本發明還提供了製備和使用本文所述的抗CD39抗體和/或其抗原結合片段的方法，以及可用於檢測樣品中的CD39、或可用於治療或預防個體中與CD39活性相關的疾病的方法中的各種組合物。
本發明的多個方面涉及抗CD39抗體和抗體片段，及其醫藥組成物，以及用於製備此類抗體和功能性抗體片段的核酸、重組表達載體和宿主細胞。本發明還包括使用本發明的抗體和功能性抗體片段的方法，用於在體外或體內檢測人CD39、或抑制人CD39活性、或用於治療由CD39介導的ATP酶活性介導的疾病(尤其是癌症)。
除非本文另有定義，否則本發明使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。這些術語的含義和範圍應該是清楚的，但是，如果存在任何潛在的歧義，本文提供的定義優先於任何字典或外在定義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。在本申請中，除非另有說明，否則“或”的使用意味著“和/或”。此外，術語“包括(including)”以及諸如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特別說明，否則諸如“元件”或“組件”等術語涵蓋包含一個單元的元件和組件、以及包含一個以上子單元的元件和組件。
通常，在本文中，與細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質和核酸化學以及雜交相關使用的命名法和技術，是本領域公知和常用的那些。除非另有說明，否則本發明的方法和技術通常根據本領 域公知的常規方法以及如本說明書中引用和討論的各種一般性的和更具體的參考文獻中所描述的方法來進行。酶促反應和純化技術根據製造商的說明書、按照本領域通常實施的方式或按照本文所述的方式來進行。在本文中，與分析化學、合成有機化學以及藥物和藥物化學相關使用的術語以及實驗室程序和技術，是本領域公知和常用的那些。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及患者的治療。
以下定義了一些術語，以便可以更容易地理解本發明。
術語“人CD39”(本文縮寫為huCD39)旨在包括可藉由標準重組表達方法製備的重組人CD39。人CD39的多肽序列如下表所示(胞外結構域(ECD)下劃線)：
Figure 109133319-A0202-12-0013-4
術語“多肽”是指胺基酸的任何聚合鏈。術語“肽”和“蛋白質”可與術語多肽互換使用，並且也指胺基酸的聚合鏈。術語“多肽”包括天然的或人工的蛋白質、蛋白質片段和蛋白質胺基酸序列的多肽類似物。術語“多肽”包括其片段和變體(包括變體片段)，除非上下文另有說明。對於抗原多肽，多肽片段任選含有至少一個連續或非線性的多肽表位。可以使用本領域普通技術確認至少一個表位片段的精確邊界。該片段包含至少約5個連續胺基酸，例如至少約10個連 續胺基酸，至少約15個連續胺基酸，或至少約20個連續胺基酸。多肽的變體如本文所述。
術語“分離的蛋白質”或“分離的多肽”是一種蛋白質或多肽，就其起源或衍生來源而言，其與天然狀態下伴隨其的天然相關組分分離，基本上不含來自同一物種的其他蛋白質，由來自不同物種的細胞表達，或在自然界中不存在。因此，化學合成的或在不同於其天然來源細胞的細胞系統中合成的多肽，將是與其天然相關組分“分離”的。還可以使用本領域公知的蛋白質純化技術，藉由分離，使蛋白質基本上不含天然相關組分。
術語“回收”是指藉由分離(例如使用本領域公知的蛋白質純化技術)使得化學物質(如多肽)成為基本上不含天然相關組分的過程。
術語“生物活性”是指CD39蛋白的所有固有生物學特性。CD39的生物學特性包括，但不限於，核苷三磷酸二磷酸水解酶活性。CD39具有藉由將胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)水解成一磷酸腺苷(AMP)來調節嘌呤能信號的持續時間、大小和化學性質的能力。
術語“特異性的結合”或“特異性地結合”，當涉及抗體、其抗原結合部分、或肽與第二個化學物質的相互作用時，表示該相互作用依賴於第二個化學物質上的特定結構(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識別並結合特定的蛋白質結構，但非通常的蛋白質。如果抗體對於表位“A”是特異性的，在含有標記的“A”和抗體的反應中，含有表位A(或游離的，未標記的A)的分子的存在，將降低與抗體結合的標記的A的量。
術語“抗體”寬泛地指，由四條多肽鏈(兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)組成的任何免疫球蛋白(Ig)分子、或保留了Ig分子的必要表位結合特徵的其任何 功能性片段、突變體、變體或衍生物。這樣的突變體、變體或衍生抗體形式是本領域已知的。以下討論了非限制性的實施方案。
在全長抗體中，每條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可以進一步細分成超可變區，稱為互補決定區(CDR)，間插更保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，按照以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，從胺基端排列至羧基端。VH結構域的第一、第二和第三個CDR通常記為CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；同樣，VL結構域的第一、第二和第三個CDR通常記為CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，其可以藉由完整抗體的木瓜蛋白酶消化來產生。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白的Fc區通常包含兩個恆定結構域，CH2結構域和CH3結構域，並且任選地包含CH4結構域。Fc部分中具有胺基酸殘基替換以改變抗體效應子功能的變體Fc區是本領域已知的(參見，例如，Winter等，美國專利號5,648,260和5,624,821)。抗體的Fc部分介導幾種重要的效應子功能，例如細胞因子誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)以及抗體和抗原-抗體複合物的半衰期/清除速率。在一些情況下，這些效應子功能對於治療性抗體是理想的，但在其他情況下可能是不必要的或甚至是有害的，這取決於治療目的。某些人IgG同種型，特別是IgG1和IgG3，分別藉由與FcγR和補體C1q的結合來介導ADCC 和CDC。在另一個實施方案中，在抗體的恆定區例如抗體的Fc區中替換至少一個胺基酸殘基，從而改變抗體的效應子功能。免疫球蛋白的兩條相同重鏈的二聚化藉由CH3結構域的二聚化來介導，並且藉由將CH1恆定結構域連接至Fc恆定結構域(例如CH2和CH3)的鉸鏈區中的二硫鍵來穩定。IgG的抗炎活性完全依賴於IgG Fc片段的N-連接聚糖的唾液酸化。已經確定了抗炎活性的精確聚糖要求，從而可以產生合適的IgG1 Fc片段，由此產生具有極大增強效力的完全重組的唾液酸化IgG1 Fc(參見，Anthony等，Science，320：373-376(2008))。
術語抗體的“抗原結合部分”和“抗原結合片段”或“功能性片段”可互換使用，並且是指抗體的一個或多個片段，所述片段保留特異性地結合抗原(即，與衍生所述部分或片段的全長抗體結合相同的抗原(例如，CD39))的能力。已經表明，可以藉由全長抗體的片段來執行抗體的抗原結合功能。這樣的抗體實施方案還可以是雙特異性的、雙重特異的、或多特異性的格式；特異性地結合兩個或更多個不同的抗原。涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分”中的結合片段的實例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在鉸鏈區藉由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，由抗體的單臂的VL和VH結構域組成，(v)dAb片段(Ward等Nature 341：544-546(1989)，PCT公開WO 90/05144)，其包括單個可變結構域；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域，VL和VH可以藉由分開的基因編碼，但也可以使用重組方法，藉由人工接頭將它們連接在一起，所述接頭能使其作為單個蛋白質鏈產生，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等Science 242：423-426(1988)；和Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。 這樣的單鏈抗體也旨在包括在術語抗體的“抗原結合部分”以及以上給出的等效術語內。該術語還包括其他形式的單鏈抗體，如雙鏈抗體(diabody)。雙鏈抗體可以是二價的、雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但使用的接頭太短以致不允許同一鏈上的兩個結構域之間配對，並由此迫使這些結構域分別與另一條鏈的互補結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))。這樣的抗體結合部分是本領域已知的(Kontermann和Dübel編輯，Antibody Engineering(Springer-Verlag，New York，2001)，p.790(ISBN 3-540-41354-5))。此外，單鏈抗體還包括包含一對串聯Fv區段(VH-VH1-VH-CH1)的“線性抗體”，其與互補輕鏈多肽一起，形成一對抗原結合區(Zapata等，Protein Eng.,8(10)：1057-1062(1995)；和美國專利No.5,641,870)。
免疫球蛋白恆定區(C)結構域是指重鏈(CH)或輕鏈(CL)恆定結構域。鼠和人IgG重鏈和輕鏈恆定結構域胺基酸序列是本領域已知的。
術語“單株抗體”或“mAb”是指從基本上同質的抗體群獲得的抗體，即除了可能少量存在的可能天然發生的突變外，構成群的各個抗體是相同的。單株抗體是高度特異性的，針對單一抗原決定簇(表位)。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製劑相反，每種mAb針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單株”不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。
術語“人抗體”包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本發明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變)，例如，在CDR中，並且特別是在CDR3中。然而，如本文中使用的，術 語“人抗體”，不包括其中源自另一個哺乳動物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已經嫁接至人框架序列上的抗體。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方式製備、表達、形成或分離的人抗體，如使用轉染至宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體、從重組的組合人抗體文庫分離的抗體(Hoogenboom,H.R.，Trends Biotechnol.15：62-70(1997)；Azzazy和Highsmith，Clin.Biochem.35：425-445(2002)；Gavilondo和Larrick，BioTechniques 29：128-145(2002)；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21：371-378(2000))、從人免疫球蛋白基因的轉基因動物(例如，小鼠)分離的抗體(參見，例如，Taylor等，Nucl.Acids Res.20：6287-6295(1992)；Kellermarn等，Current Opinion in Biotechnology 13：593-597(2002)；Little等，Immunol.Today，21：364-370(2002))；或藉由涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式製備、表達、形成或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在某些實施方式，可以對這樣的重組人抗體進行體外誘變(或，當使用人Ig序列的轉基因動物時，體內體細胞誘變)，由此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是如下序列：儘管源自並且涉及人種系VH和VL序列，但可以非天然存在於體內人抗體種系庫中。
術語“嵌合抗體”是指包括來自一個物種的重鏈和輕鏈可變區序列和來自另一個物種的恆定區序列的抗體，如具有連接人恆定區的小鼠重鏈和輕鏈可變區的抗體。
術語“CDR-移植的抗體”是指包含來自一個物種的重鏈和輕鏈可變區序列的抗體，但其中VH和/或VL的一個或多個CDR區的序列被另一個物 種的CDR序列替換，如具有人重鏈和輕鏈可變區的抗體，其中一個或多個人CDR已經被鼠CDR序列替代。
術語“人源化抗體”是指包含來自非人物種(例如，小鼠)的重鏈和輕鏈可變區序列的抗體，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改變為更像“人”的，即更類似於人類種系可變序列。一種類型的人源化抗體是CDR-移植的抗體，其中將來自非人物種(例如小鼠)的CDR序列引入人VH和VL框架序列中。人源化抗體是免疫特異性地結合目標抗原的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，其中該抗體包含基本上具有人抗體的胺基酸序列的框架區和恆定區但具有基本上是非人抗體的胺基酸序列的互補決定區(CDR)。如本文所用，術語“基本上”就CDR而言是指與非人抗體CDR的胺基酸序列至少具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的CDR。人源化抗體包含至少一個並且通常是兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋白(即供體抗體)的，並且所有或基本上所有框架區是人免疫球蛋白共有序列的。在一個實施方案中，人源化抗體還包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，該免疫球蛋白恆定區通常是人免疫球蛋白的。在一些實施方案中，人源化抗體含有輕鏈以及至少重鏈的可變結構域。抗體還可包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區。在一些實施方案中，人源化抗體僅含有人源化輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗體僅含有人源化重鏈。在具體的實施方案中，人源化抗體僅含有輕鏈的人源化可變結構域和/或人源化重鏈。
人源化抗體可選自任何類別的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同種型，包括不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化 抗體可包含來自一種以上類別或同種型的序列，並且可使用本領域公知的技術，選擇特定的恆定結構域以優化所需的效應子功能。
人源化抗體的框架和CDR區不需要與親本序列精確對應，例如，可以藉由至少一個胺基酸殘基的置換、插入和/或缺失來誘變供體抗體CDR或受體框架，使得該位點的CDR或框架殘基與供體抗體或共有框架不對應。然而，在一個示例性實施方案中，此類突變不會是大量的。通常，人源化抗體殘基的至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%，最佳至少95%將對應於親本FR和CDR序列。在特定框架位置的回復突變以恢復為出現在供體抗體中該位置的相同胺基酸，通常可以用於保留特定的環結構或正確定向CDR序列以與靶抗原接觸。
術語“CDR”指抗體可變域序列內的互補決定區。在重鏈和輕鏈的每個可變區中存在三個CDR，其被稱為CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。如本文所用的術語“CDR組”是指在能夠結合抗原的單個可變區中出現的三個CDR的組。根據不同的系統，這些CDR的確切邊界已被不同地定義。Kabat描述的系統(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland(1987)和(1991))不僅提供了適用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，而且還提供了定義三個CDR的精確殘基邊界。
本領域公認的術語“Kabat編號”是指，在抗體或其抗原結合部分的重鏈和輕鏈可變區中比其他胺基酸殘基更可變(即，超變)的胺基酸殘基的編號系統。參見，Kabat等，Ann.NY and Acad.Sci.，190：382-391(1971)；和Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生和人類服務部，NIH公開號91-3242(1991)。
術語“多價結合蛋白”表示包含兩個或更多個抗原結合位點的結合蛋白。較佳將多價結合蛋白工程化為具有三個或更多個抗原結合位點，並且通常不是天然存在的抗體。
術語“活性”包括諸如特異性結合靶抗原的能力、抗體對抗原的親和力、中和靶抗原的生物活性的能力、抑制靶抗原與其天然受體相互作用的能力等性質。本發明的較佳抗體及其抗原結合部分具有抑制CD39的ATP酶活性的能力。
如本文中使用的，術語“kon”(也稱為“Kon”，“kon”)意指結合蛋白(例如，抗體)與抗原結合形成如本領域已知的結合複合物(例如，抗體/抗原複合物)的結合速率常數。“kon”也稱為術語“締合速率常數”或“ka”，如本文中可互換使用的。該值表示抗體與其靶抗原的結合速率或抗體與抗原之間的複合物形成速率，如下式所示：
抗體(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本文所用，術語“koff”(也稱為“Koff”，“koff”)意指，如本領域已知的，結合蛋白(例如，抗體)從結合複合物(例如，抗體/抗原複合物)解離的速率常數、或“解離速率常數”。該值表示抗體從其靶抗原的解離速率、或Ab-Ag複合物隨時間分離成游離抗體和抗原的速率，如下式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文中使用的，術語“KD”旨在表示“平衡解離常數”，並且是指在平衡時滴定測量中獲得的值，或者藉由解離速率常數(koff)除以結合速率常數(kon)而獲得的值。結合速率常數(kon)、解離速率常數(koff)和平衡解離常數(KD)用於表示抗體與抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法是本領域公 知的。可以使用基於螢光的技術，提供高靈敏度以及在平衡狀態下生理緩衝液中檢查樣品的能力。可以使用其他實驗方法和儀器，例如BIAcore®(生物分子相互作用分析)測定法(例如，可從BIAcore International AB，GE Healthcare公司，Uppsala，Sweden獲得的儀器)。使用例如Octet® RED96系統(PallFortéBio LLC)的生物膜干涉是另一種親和力測定技術。另外，還可以使用獲自Sapidyne Instruments(Boise，Idaho)的KinExA®(動力學排除測定)試驗。如果藉由表面等離子體共振或生物膜干涉測量的KD為亞奈莫耳(即，KD<10-9M)，則認為本發明的抗體及其抗原結合片段對靶抗原(例如，人CD39)具有“高親和力”。
術語“分離的核酸”應指，這樣的(例如，基因組的、cDNA或合成來源的，或其某些組合)多核苷酸，其中該多核苷酸藉由人為干預而與在自然界與其相關的全部或部分多核苷酸分開；可操作地連接天然與其不相連的多核苷酸；或是以在自然界中不存在的更大序列的一部分出現。
如本文中使用的，術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接另外的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞時整合至宿主細胞的基因組中，並且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與它們可操作連接的基因的表達。此類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。通常，在重組DNA技術中有用的表達載體常常是質粒的形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明旨在包括其他形 式的表達載體，如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，它們發揮等效的作用。
術語“可操作地連接”是指並置，其中該組分處於允許它們以其預期方式發揮作用的關係中。與編碼序列“可操作地連接”的控制序列以這樣的方式連接，即該方式將使得在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達。“可操作地連接的”序列包括與目的基因鄰接的表達控制序列、以及以反式或遠距離發揮作用的方式控制目的基因的表達控制序列。如本文所用的術語“表達控制序列”是指實現與它們連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。表達控制序列包括合適的轉錄起始序列、終止序列、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號，如剪接和多腺苷酸化信號；穩定胞質mRNA的序列；提高翻譯效率的序列(即Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及當需要時，增強蛋白質分泌的序列。這些控制序列的性質根據宿主生物而不同；在原核生物中，這種控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，通常，這種控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語“控制序列”旨在包括其存在對於表達和加工而言是必不可少的組分，並且還可以包括其存在是有利的其他組分，例如前導序列和融合伴侶序列。
如本文所定義的“轉化”是指外源DNA進入宿主細胞的任何過程。可以使用本領域公知的各種方法在天然或人工條件下進行轉化。轉化可依賴於任何已知的方法將外源核酸序列插入原核或真核宿主細胞中。基於待轉化的宿主細胞選擇該方法，並且可以包括，但不限於，病毒感染、電穿孔、脂質轉染和粒子轟擊。這種“轉化的”細胞包括穩定轉化的細胞，其中插入的DNA能夠作為 自主複製質粒或作為宿主染色體的一部分複製。也包括在有限時間內瞬時表達插入的DNA或RNA的細胞。
術語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)意指其中已引入外源DNA的細胞。在一個實施方案中，宿主細胞包含編碼抗體的兩個或更多個(例如，多個)核酸，例如，如美國專利號7,262,028中描述的宿主細胞。這些術語不僅旨在指特定的主題細胞，還指這種細胞的後代。因為某些修飾可能由於突變或環境影響而在後代中發生，所以這些後代實際上可能與親本細胞不同，但仍包括在本文所用的術語“宿主細胞”的範圍內。在一個實施方案中，宿主細胞包括選自任何生命界的原核和真核細胞。在另一個實施方案中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物和動物細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞包括但不限於原核細胞系大腸桿菌(Escherichia coli)；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆蟲細胞系Sf9；和真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養和轉化(例如，電穿孔、脂轉染)。酶促反應和純化技術可以根據製造商的說明書、或者按照本領域通常實施的方式或如本文所述的方式進行。前述技術和程序通常可以根據本領域公知的常規方法進行，這些方法也描述在本說明書通篇引用和討論的各種一般性和更具體的參考文獻中。參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版。(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
如本文中使用的，術語“激動劑”是指這樣的調節劑：與不存在激動劑時觀察到的活性或功能的規模相比，該調節劑與感興趣的分子接觸後導致分子的某種活性或功能的規模增加。如本文中使用的，術語“拮抗劑”和“抑制劑” 是指這樣的調節劑：與不存在拮抗劑時觀察到的活性或功能的規模相比，該調節劑在與感興趣的分子接觸後導致分子的某種活性或功能的規模降低。特別感興趣的拮抗劑包括阻斷或調節人CD39的生物學或免疫學活性的那些拮抗劑。
如本文中使用的，術語“有效量”是指治療量，所述量足以降低或改善病症的嚴重性和/或持續時間或其一種或多種症狀；防止疾病的進展；導致疾病消退；預防與疾病相關的一種或多種症狀的復發、發展或進展；檢測疾病；或增強或改善另一種療法(例如預防劑或治療劑)的預防或治療效果。
抗CD39抗體的產生
本發明的抗CD39抗體可藉由本領域已知的許多技術中的任何一種產生。例如，從宿主細胞表達，其中將編碼重鏈和輕鏈的表達載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。術語“轉染”的各種形式旨在涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞的多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染等。儘管可以在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但較佳在真核細胞中表達抗體，並且最佳在哺乳動物宿主細胞中，因為這樣的真核細胞(並且特別是哺乳動物細胞)更可能比原核細胞組裝和分泌正確折疊和免疫活性的抗體。
用於表達本發明重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980)，與DHFR選擇標記一起使用，例如，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、HEK293細胞和SP2細胞。將編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞後，藉由將宿主細胞培養足以允許抗體在宿主細胞中表達 的一段時間來產生抗體，或者更佳地，抗體分泌到用於培養宿主細胞的培養基中。可以使用標準蛋白質純化方法從培養基中收集抗體。
宿主細胞也可用於產生功能性抗體片段，例如Fab片段或scFv分子。應該理解，上述程序的變化都在本發明的範圍內。例如，可能期望用編碼本發明抗體的輕鏈和/或重鏈的功能片段的DNA轉染宿主細胞。重組DNA技術也可用於除去編碼輕鏈和重鏈之一或兩者的DNA中的一些或全部，這些DNA對於結合目標抗原不是必需的。由這種截短的DNA分子表達的分子也包括在本發明的抗體中。此外，可以產生雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈是本發明的抗體，而另一重鏈和輕鏈對目標抗原之外的抗原具有特異性，可以藉由標準化學交聯方法將本發明的抗體與第二抗體交聯。
在用於重組表達本發明的抗體或其抗原結合部分的一個示例性系統中，藉由磷酸鈣介導的轉染，將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表達載體內，抗體重鏈和輕鏈基因各自與CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件可操作地連接，以驅動基因的高水平轉錄。重組表達載體還攜帶DHFR基因，其允許使用甲胺蝶呤選擇/擴增來選擇已經轉染了載體的CHO細胞。培養選擇的轉化體宿主細胞以允許抗體重鏈和輕鏈的表達，並從培養基中收集完整的抗體。可以將標準分子生物學技術用於製備重組表達載體、轉染宿主細胞、選擇轉化體、培養宿主細胞以及從培養基中回收抗體。本發明還提供了藉由在合適的培養基中培養本發明的轉染的宿主細胞直至產生本發明的重組抗體來製備本發明的重組抗CD39抗體的方法。該方法可以進一步包括從培養基中分離重組抗體。
本發明抗體的用途
鑒於它們結合CD39的能力，本文所述的抗體及其功能性片段可用於檢測CD39，例如在含有表達CD39的細胞的生物樣品中。本發明的抗體和功能性片段可用於常規免疫測定，例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。本發明提供了一種檢測生物樣品中CD39的方法，包括使生物與本發明的抗體或其抗原結合部分接觸，並檢測是否發生與靶抗原的結合，從而檢測生物樣本中是否存在靶標。可以用可檢測物質直接或間接標記抗體或功能性片段，以便於檢測結合或未結合的抗體/片段。合適的可檢測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的實例包括鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素；合適的螢光材料的實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料的實例包括魯米諾；合適的放射性物質的實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
本發明的抗體和抗體片段較佳能夠在體外和體內中和人CD39活性。因此，它們可用於在含有CD39表達細胞的細胞培養物中、在人受試者中，或在具有本發明抗體或抗體片段可以交叉反應的CD39的其他哺乳動物受試者中，抑制CD39酶活性(ATP酶活性)和/或抑制CD39介導的ATP和ADP水解。
在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有疾病或病症的受試者的方法，其中在該疾病或病症中CD39活性是有害的，該方法包括給受試者施用本發明的抗體或其抗原結合片段，使得減少受試者的細胞微環境中由CD39活性介導的活性。
如本文中使用的，術語“其中CD39活性是有害的疾病”旨在包括如下的疾病和其他病症，其中CD39的ATP酶活性或其後果在患有該疾病的受試者中負責病症的病理生理學、或是促進病症惡化的因素。因此，其中CD39活性是有害的病症是預期CD39活性的抑制能減輕病症的症狀和/或進展的病症。
如本文所公開的抗CD39抗體及其抗原結合片段可用於治療其中期望抑制ATP酶活性的疾病和病症。此類病症包括，例如，許多癌症，包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌和淋巴瘤。此類抗體和抗原結合片段也可用於治療感染性疾病，例如HIV、B肝、C肝和細菌感染。
本發明還提供了包含抗體或其抗原結合部分和藥物學上可接受載體的醫藥組成物。包含本發明的抗體和/或其抗原結合部分的醫藥組成物用於，但不限於，診斷、檢測或監測病症，治療、控制或改善病症或其一種或多種症狀，和/或研究。在一個具體實施方案中，組成物包含一種或多種本發明的抗體。在另一個實施方案中，醫藥組成物包含一種或多種本發明的抗體和除本發明抗體之外的一種或多種用於治療其中CD39活性是有害的病症的預防或治療劑。在一個實施方案中，預防劑或治療劑已知可用於或已經或正在用於預防、治療、控制或改善病症或其一種或多種症狀。根據這些實施方案，組成物可進一步包含載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的抗體和/或其抗原結合部分可以摻入適於施用於受試者的醫藥組成物中。通常，醫藥組成物包含本發明的抗體或其抗原結合部分和藥物學上可接受的載體。如本文中使用的，“藥物學上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、 甘油、乙醇等中的一種或多種，及其組合。在許多情況下，較佳在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇，山梨糖醇)或氯化鈉。藥物學上可接受的載體可以進一步包含少量輔助物質，如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其可以增強抗體的保質期或有效性。
配製本發明的醫藥組成物以與其預期的給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括，但不限於，腸胃外給藥，例如靜脈內、皮內、皮下、口服、鼻內(例如，吸入)、透皮(例如，局部)、腫瘤內、經黏膜和直腸給藥。在一個具體實施方案中，該組合物按照常規方法配製成適合於對人類進行靜脈內、皮下、肌內、口服、鼻內或局部給藥的醫藥組成物。通常，用於靜脈內施用的組合物是無菌等滲水性緩衝液中的溶液。必要時，該組合物還可包括增溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。
本發明的方法可包括施用配製用於藉由注射(例如，藉由推注或連續輸注)腸胃外給藥的組合物。用於注射的製劑可以以單位劑型(例如，在安瓿或多劑量容器中)與添加的防腐劑一起提供。組成物可以採取如油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液的形式，並且可以含有配製劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以是粉末形式，用於在使用前用合適的載體(例如無菌無熱原水)構建。
本發明的方法可另外包括施用配製成儲庫型製劑(depot preparation)的組合物。這種長效製劑可以藉由植入(例如，皮下或肌肉內)或藉由肌內注射給藥。因此，例如，組合物可以用合適的聚合或疏水材料(例如，作為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂配製，或配製成微溶衍生物(例如，作為微溶鹽)。
本發明的抗體或其功能性片段還可以與一種或多種用於治療各種疾病的其他治療劑一起施用。本文所述的抗體及其功能性片段可單獨使用或與另外的藥劑(例如，治療劑)組合使用，該另外的藥劑由技術人員基於其預期目的而選擇。例如，另外的藥劑可以是本領域公認為可用於治療由本發明的抗體或其功能性片段治療的疾病或病症的治療劑。另外的藥劑也可以是賦予治療組合物有益屬性的藥劑，例如影響組合物黏度的藥劑。
現在已經詳細描述了本發明，藉由參考以下實施例將更清楚地理解本發明，這些實施例僅出於舉例說明的目的而包括在內，並不意圖限制本發明。
[實施例]
實施例1：抗CD39單株抗體的產生
如下獲得了小鼠抗人CD39和大鼠抗小鼠CD39單株抗體：
實施例1.1(a)：用人CD39抗原免疫小鼠
與完全弗氏佐劑混合的50微克重組純化的人CD39蛋白(R & D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)、或無佐劑的5×106細胞的CHO-K1-人CD39穩定細胞系，在第1天腹膜內注射至兩組5隻6-8週齡的Balb/C和SJL小鼠中。在第14天和第35天，與不完全弗氏佐劑混合的25微克重組純化的人CD39蛋白、或無佐劑的5×106的CHO-K1-人CD39穩定細胞系，腹膜內注射至相同小鼠中。在融合前3-4天使用相同免疫原進行最終加強。
實施例1.1(b)：用小鼠CD39抗原免疫大鼠
在第1天，與完全弗氏佐劑混合的100微克重組純化的小鼠CD39蛋白(Chempartner Co.，Ltd.；Shanghai)，腹膜內注射至一隻6-8隻齡的Sprague Dawley 大鼠中。在第14天和第35天，與不完全弗氏佐劑混合的50微克重組純化的小鼠CD39蛋白，腹膜內注射至同一大鼠中。在融合前3-4天使用相同免疫原進行最終加強。
實施例1.2：融合瘤的產生
根據Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)中所述的已建立的方法，將實施例1.1(a)和(b)中描述的免疫小鼠和大鼠獲得的脾細胞，與SP2/O-Ag-14細胞以5：1的比例融合，以產生融合瘤。將融合產物在96孔板中以每孔1×105個脾細胞/孔的密度接種在含有次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)的選擇培養基中。融合後7至10天，觀察到肉眼可見的融合瘤集落。藉由ELISA或FACS測試來自含有融合瘤集落的每個孔的上清液中的CD39抗體的存在。
CD39酶聯免疫吸附測定(ELISA)
為了確定抗CD39 mAb是否與人CD39結合，將ELISA板在4℃下與PBS，pH7.4緩衝液中1μg/ml稀釋的人CD39蛋白或小鼠CD39蛋白一起孵育過夜。將板在洗滌緩衝液(含有0.05%吐溫20的PBS)中洗滌四次，並在37℃下用200μl/孔封閉緩衝液(含有0.05%吐溫20的PBS中的1%BSA)封閉1小時。除去阻斷緩衝液後，將融合瘤上清液或稀釋的純化Ab以每孔100μl加入孔中，並在37℃下孵育1小時。用洗滌緩衝液洗滌孔4次，並將HRP偶聯的抗小鼠IgG抗體(用於小鼠抗人CD39 Ab表徵)或HRP偶聯的抗大鼠IgG抗體(用於大鼠抗小鼠CD39 Ab表徵)(Sigma)以1：5000稀釋並以每孔100μl添加到孔中。將板在37℃下孵育1小時並在洗滌緩衝液中洗滌4次。每孔加入100μl四甲基聯苯胺(TMB)顯色液。顯色後，用1N HCl終止反應，並在450nM下測量吸光度。藉由GraphPad軟體處理數據。
細胞膜CD39結合測定
藉由FACS分析測定了純化的抗體結合位於細胞膜表面的人CD39、食蟹猴CD39或小鼠CD39蛋白的能力。產生穩定轉染以過表達人CD39、食蟹猴CD39或小鼠CD39的CHO-K1細胞(CHO-K1-huCD39細胞、CHO-K1-cyCD39細胞和CHOK1-muCD39細胞)用於該測定。簡而言之，將SK-MEL-28黑色素瘤細胞(ATCC)或過表達CD39的穩定CHO細胞系重懸於含有2%FBS(FACS緩衝液)的PBS中，並以1-5×105個細胞/孔接種到U形底板中。將在FACS緩衝液中稀釋的抗CD39 mAb或同種型對照抗體加入孔中，並在4℃下孵育1小時。用FACS緩衝液洗滌後，加入1：1000稀釋的螢光標記的二抗(Life Technologies/ThermoFisher Scientific)並在4℃下孵育30分鐘。藉由用FACS緩衝液洗滌三次除去未結合的二抗，並隨後在FACS儀器上檢測樣品。藉由GraphPad軟體處理數據。
實施例1.3：抗人CD39抗體的鑒定和表徵
將能夠產生特異性地結合人CD39抗體的融合瘤細胞擴增，並藉由有限稀釋進行亞選殖。
將單株融合瘤細胞在含有2.5%低IgG胎牛血清的融合瘤無血清培養基中擴增。平均每種融合瘤收穫培養上清液(來自純株群體)200mL，將其濃縮，並藉由蛋白A親和層析方法純化。使用上述ELISA和FACS(細胞膜CD39結合)測試了純化的mAb結合CD39的能力。使用以下描述的基於蛋白質和基於細胞的ATP酶活性測定試驗，測定了mAb抑制CD39酶活性的能力。
基於蛋白質的CD39 ATP酶活性的抑制
藉由基於蛋白質的分析，測定了純化的抗小鼠或抗人CD39抗體抑制CD39 ATP酶活性的能力。將抗小鼠或抗人CD39抗體在測定緩衝液(10mM葡萄糖， 20mM Hepes，5mM KCl，120mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.5)中連續稀釋，並以50μl/孔加入測定板(Perkin Elmer，目錄# 6005181)。將重組CD39蛋白稀釋至0.12μg/ml，以25μl/孔加入測定板中。將測定板在4℃下孵育30分鐘，然後將40μM ATP受質以25μl/孔加入板，在37℃下孵育30分鐘。藉由CellTiter-Glo®發光細胞活力測定(Promega，目錄#G7573)測試剩餘的ATP。使用GraphPad軟體處理數據。
細胞表面人CD39 ATP酶活性的抑制
藉由基於細胞的分析，測定了純化的抗人CD39抗體抑制人CD39 ATP酶活性的能力。內源性表達CD39的SK-MEL-28人黑素瘤細胞株最初從ATCC獲得，在含10%FBS的EMEM培養基，37℃，5% CO2培養箱中培養。收穫細胞並以2×105個細胞/ml，50μl/孔接種到96孔平板的孔中。將抗人CD39抗體在測定緩衝液(10mM葡萄糖，20mM Hepes，5mM KCl，120mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.5)中連續稀釋，並以50μl/孔添加至已加入SK-MEL-28細胞的96孔平板中。將細胞和抗體混合物在37℃下孵育過夜。用測定緩衝液洗滌細胞三次後，加入100μM ATP並在37℃下孵育25分鐘。將上清液轉移到新的96孔板中，並根據孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑盒(R & D Systems；目錄No.DY996)的方法測量了上清液中的磷酸鹽濃度。
抗人CD39抗體對CHO-K1-人CD39和CHO-K1-食蟹猴CD39穩定細胞系的特異性結合活性顯示於表1中。抗小鼠CD39抗體對小鼠CD39蛋白和CHO-K1-小鼠CD39穩定細胞系的結合活性顯示於表2中。使用Graphpad軟體處理數據。
Figure 109133319-A0202-12-0034-5
Figure 109133319-A0202-12-0035-6
Figure 109133319-A0202-12-0036-7
抗人CD39抗體對CD39介導的ATP酶活性的抑制如圖1所示。抗小鼠CD39抗體對CD39介導的ATP酶活性的抑制如圖2所示。
實施例1.4：鼠抗huCD39抗體可變區的測序
為了擴增重鏈和輕鏈可變區，用TRIzol® RNA分離試劑(目錄No.15596，Invitrogen)從>5×106個細胞中分離每個融合瘤株的總RNA。藉由SuperScriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix(目錄No.18080，Invitrogen)合成cDNA，並用作Mouse Ig-Primer Set(目錄No.69831-3，Novagen)的PCR模板。使用SYBRTM Safe DNA凝膠染色(Invitrogen)，藉由1.2%瓊脂糖凝膠上的電泳分析了PCR擴增產物。根據製造商的說明，用NucleoSpin® Gel和PCR Clean-up(# 740609，Macherey-Nagel GmbH)純化具有正確大小的DNA片段，並單獨亞選殖至pMD18-T選殖載體(Sino Biological Inc.)中。從每次轉化選擇15個純株，並藉由DNA測序分析了插入片段的序列。對於VH和VL如果至少8個匹配共有序列，則確認序列。基於ATP酶抑制活性選擇四種mAb，並藉由序列同源性比對分析了四種mAb可變區的蛋白質序列並列於表3中。基於Kabat編號系統鑒定可變結構域中的互補決定區(CDR)，並在以下的表3中用下劃線顯示。
Figure 109133319-A0202-12-0038-8
Figure 109133319-A0202-12-0039-9
實施例2：鼠抗CD39抗體的人源化
基於特異性和細胞表面人CD39結合活性、食蟹猴CD39交叉反應性和ATP酶抑制活性，選擇了鼠抗人CD39 mAb638進行人源化。
實施例2.1：mAb638的人源化設計
使用mAb638可變區序列來設計人源化抗體。第一步將mAb638的VH和VK序列與可用的人IgV基因序列數據庫進行比對，以便找到總體最佳匹配的人種系IgV基因序列。另外，將VH或VL的框架4序列和J區數據庫進行比對，以找到分別與鼠VH和VL區具有最高同源性的人框架4基因。對於輕鏈，最接近的人V基因匹配是L6基因，而對於重鏈，最接近的人V-基因匹配是VH1-2 基因。然後設計人源化可變結構域序列，其中將mAb638輕鏈可變結構域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到L6基因的框架序列上，其中CDR-L3後為JK2框架4序列；將mAb638重鏈可變結構域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列移植到VH1-2的框架序列上，其中CDR-H3後為JH6框架4序列。然後建立mAb638的三維Fv模型，以確定是否存在一些關鍵的胺基酸位點，對於支持CDR環結構或VH/VL互作界面而言很重要。人源化序列中的此類胺基酸殘基應在相同位置回復突變為小鼠殘基以保留親和力/活性。在輕鏈中，鑒定了位置2的Ile回復突變成Asn(Kabat編號，I2N)，位置35的Tyr回復突變成Phe(Kabat編號，Y36F)，位置42的Ala回復突變成Ser(Kabat編號，A43S)，位置45的Leu回復突變成Val(Kabat編號，L46V)，位置57的Ile回復突變成Val(Kabat編號，I58V)，以及位置70的Phe回復突變成Tyr(Kabat編號，F71Y)。在重鏈中，位置48的Met回復突變成Ile(Kabat編號，M48I)，位置67的Arg回復突變成Lys(Kabat編號，R66K)，位置70的Met回復突變成Leu(Kabat編號，M69L)，位置72的Arg回復突變成Ala(Kabat編號，R71A)和位置74的Thr回復突變至Lys(Kabat編號，T73K)被鑒定為期望的回復突變。構建了含有這些回復突變中的一個或多個的突變可變結構域。參見以下表4。(回復突變的框架胺基酸殘基用
Figure 109133319-A0202-12-0040-79
表示；來自原始親本抗體的鼠CDR用下劃線表示。)
Figure 109133319-A0202-12-0041-10
Figure 109133319-A0202-12-0042-11
合成產生人源化VH和VK基因，然後分別選殖至含有人IgG1和人κ恆定結構域的載體中。使用的恆定區序列列於以下的表5中。
Figure 109133319-A0202-12-0043-12
表4中人VH和人VK結構域的配對產生了20種人源化抗體，命名為HuEM0004-38-1至HuEM0004-38-20(表6)。還生產了具有親本小鼠VH/VL和人恆定序列的嵌合抗體作為陽性對照，用於親和力比較。在mAb638的重鏈CDR2(CDR-H2)中存在可能的水解降解位點AsnGly，因此將親本重鏈在VH位置55或56處分別突變進行了替換，用Gln替換了Asn(N→Q)或用Ala替換了Gly(G→A)(Kabat編號，N54Q，G55A置換)。參見SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：27。突變的VH與mAb638 VK(SEQ ID NO：8)的配對產生了稱為EM0004-38c1和EM0004-38c2的抗體。表達並純化所有重組mAb。
Figure 109133319-A0202-12-0044-13
實施例2.2：抗CD39抗體的特異性和ATP酶抑制活性
如實施例1.2中所述，藉由ELISA測試了人源化抗體HuEM0004-38-6至HuEM0004-38-20和嵌合抗體EM0004-38c、EM0004-38c1和EM0004-38c2的CD39特異性結合，以及如實施例1.3中所述，測試了基於蛋白質的ATP酶活性的抑制。結果概括於表7中。
Figure 109133319-A0202-12-0046-14
實施例2.3：另外修飾的人源化抗CD39抗體的細胞表面CD39結合活性和ATP酶抑制活性
具有G55A突變的EM0004-38c2顯示出比具有N54Q突變的EM0004-38c1具有好一點的結合活性。與其他人源化抗體相比，HuEM0004-38-17、-18和-19顯示出良好的結合活性和ATP酶抑制活性。因此，在HuEM0004-38-17、-18和-19中的CDR-H2中引入G55A突變以產生HuEM0004-38-21(SEQ ID NO：32(VH)和SEQ ID NO：17(VK))，HuEM0004-38-22(SEQ ID NO：33(VH)和SEQ ID NO：17(VK))以及HuEM0004-38-23(SEQ ID NO：34(VH)和SEQ ID NO：17(VK)))。藉由FACS結合測定和基於細胞的ATP酶活性抑制，表徵了三種人源化抗CD39抗體。結果列於表8和圖3中。
Figure 109133319-A0202-12-0047-15
HuEM0004-38-21具有最小回復突變，同時最好地維持了具有親本VH和VL結構域的嵌合mAb的親和力和效力。
實施例3：抗人CD39抗體的功能表征
實施例3.1：人CD4+ T細胞增殖抑制測定
為了檢查本發明的抗CD39抗體的功能活性，將選擇的抗體用人T細胞增殖抑制試驗進行檢測。根據製造商的說明，用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)細胞滲透性螢光細胞染色染料(Sigma，目錄No.87444-5MG-F)標記從新鮮PBMC分離的人CD4 +細胞，並與CD2/CD3/CD28 T細胞激活磁珠(Miltenyi Biotec，目錄No.130-091-441)混合。將CD4+ T細胞以1×106個細胞/ml，100μl/孔，接種到測定板上，並與50μl/孔的連續稀釋的抗人CD39抗體在5% CO2培養箱中在37℃下孵育30分鐘。將2mM的ATP溶液以50μl/孔加入測定板中，並將測定板在5% CO2培養箱中在37℃下培養3天，此時再次添加補充的抗人CD39抗體(50μl/孔)。在第5天，收集上清液用於細胞因子分析，並用PBS中的2%FBS洗滌細胞兩次。在FACS儀(BD Biosciences FACSCanto II)上測量了CSFE信號。
圖4顯示了抗人CD39 mAb638在人CD4+ T細胞增殖抑制測定試驗中的作用。激活的T細胞的ATP酶活性被抗CD39抗體mAb638以濃度依賴性方式抑制。圖5、6和7顯示了人源化抗人CD39抗體HuEM0004-38-21、HuEM0004-38-22和HuEM0004-38-23在人CD4+ T細胞增殖抑制測定試驗中的作用。結果顯示所有測試的人源化抗體維持了親本抗體mAb638的ATP酶抑制活性。
實施例3.2：藉由表面等離子體共振(SPR)的親和力測量
使用Biacore T200儀器(GE Healthcare)藉由基於表面等離子體共振的測量來確定了純化抗體的結合動力學。簡而言之，將山羊抗小鼠IgG Fc多株抗體(Genway)直接固定在生物傳感器芯片上，並以5μl/min的流速將抗體樣品注射到反應基質上。藉由在五種不同濃度的重組人或小鼠CD39靶蛋白(huCD39-ECD-His或muCD39-ECD-His)下進行抗CD39抗體捕獲的動力學結合測量，分別確定 結合和解離速率常數kon(M-1s-1)和koff(s-1)。然後使用公式：KD=koff/kon，從動力學速率常數計算抗體和相關靶蛋白之間反應的平衡解離常數KD(M)。小鼠抗人CD39抗體mAb635和mAb638的結合親和力顯示在表9中；大鼠抗小鼠CD39抗體mAb605的結合親和力顯示在表10中。
Figure 109133319-A0202-12-0049-16
HuCD39-ECD-His是C末端六組胺酸標記的人CD39胞外結構域(ECD)蛋白。ECD序列是SEQ ID NO：35的38-478胺基酸。
Figure 109133319-A0202-12-0049-17
MuCD39-ECD-His是C末端六組胺酸標記的鼠CD39胞外結構域(ECD)。鼠ECD胺基酸序列如下所示：
Figure 109133319-A0202-12-0049-18
Figure 109133319-A0202-12-0050-19
Figure 109133319-A0202-12-0050-20
(SEQ ID NO：36)
上述數據表明，測試的抗人CD39和抗小鼠CD39抗體顯示出對靶抗原的高親和力。
實施例3.3：藉由Octet® RED測定的人源化抗HuCD39抗體的親和力
使用Octet®RED96生物膜干涉測量系統(Pall FortéBio LLC)來表徵抗CD39抗體的親和力和結合動力學。藉由抗小鼠IgG Fc捕獲(AMC)生物傳感器或抗人IgG Fc捕獲(AHC)生物傳感器，以100nM的濃度，捕獲純化的抗CD39抗體30秒。然後將生物傳感器浸入運行緩衝液(1X pH7.2 PBS，0.05%Tween 20，0.1% BSA)中60秒以檢查基線。藉由將傳感器浸入純化的重組人CD39蛋白(從200nM起，3倍連續稀釋)中120秒來測量結合。解離後，將傳感器浸入運行緩衝液中600秒。使用Fortébio數據分析軟體(Pall FortéBio LLC)將結合和解離曲線擬合至1：1 Langmuir結合模型。親和力測定顯示於以下的表11中。結果顯示出人源化抗體保留了親本鼠抗體呈現的對CD39抗原靶標的結合親和力。
Figure 109133319-A0202-12-0051-21
本申請通篇引用的所有出版物(包括參考文獻、專利、專利申請和網站)的內容均藉由引用明確地併入本文中用於任何目的，其中引用的參考文獻也是如此。除非另有說明，本發明實施方案的實施將採用本領域公知的免疫學、分子生物學和細胞生物學的常規技術。在不脫離本發明的精神或基本特徵的情況下，可以以其他特定形式實施所述實施方案。因此，前述實施方案在所有方面都應被視為舉例說明性的而非限制性的。本發明按照所附申請專利範圍所述來確定，並且因此在申請專利範圍等同的含義和範圍內的所有變化都包含在本文中。
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<120> CD39的高親和力抗體及其用途
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<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
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<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化重鏈可變區VH.1A
<400> 9
Figure 109133319-A0202-12-0055-31
Figure 109133319-A0202-12-0056-32
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化重鏈可變區VH.1B
<400> 10
Figure 109133319-A0202-12-0056-33
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化重鏈可變區VH.1C
<400> 11
Figure 109133319-A0202-12-0057-34
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化重鏈可變區VH.1D
<400> 12
Figure 109133319-A0202-12-0057-35
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化重鏈可變區VH.1E
<400> 13
Figure 109133319-A0202-12-0058-36
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化輕鏈可變區VK.1A
<400> 14
Figure 109133319-A0202-12-0058-37
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化輕鏈可變區VK.1B
<400> 15
Figure 109133319-A0202-12-0059-38
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化輕鏈可變區VK.1C
<400> 16
Figure 109133319-A0202-12-0059-39
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化輕鏈可變區VK.1D
<400> 17
Figure 109133319-A0202-12-0060-40
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Figure 109133319-A0202-12-0060-41
Figure 109133319-A0202-12-0061-42
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Figure 109133319-A0202-12-0061-43
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組5的CDR-H1
<400> 20
Figure 109133319-A0202-12-0061-44
Figure 109133319-A0202-12-0062-45
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組5的CDR-H2
<400> 21
Figure 109133319-A0202-12-0062-46
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組5的CDR-H3
<400> 22
Figure 109133319-A0202-12-0062-47
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組5的CDR-L1
<400> 23
Figure 109133319-A0202-12-0062-48
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組5的CDR-L2
<400> 24
Figure 109133319-A0202-12-0062-49
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組5的CDR-L3
<400> 25
Figure 109133319-A0202-12-0063-50
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組6的CDR-H1
<400> 26
Figure 109133319-A0202-12-0063-51
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組6的CDR-H2
<400> 27
Figure 109133319-A0202-12-0063-52
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組6的CDR-H3
<400> 28
Figure 109133319-A0202-12-0063-53
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組6的CDR-L1
<400> 29
Figure 109133319-A0202-12-0063-54
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組6的CDR-L2
<400> 30
Figure 109133319-A0202-12-0064-55
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD39 CDR組6的CDR-L3
<400> 31
Figure 109133319-A0202-12-0064-56
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈可變區VH.1B具有G55A替代在CDR-H2中
<400> 32
Figure 109133319-A0202-12-0064-57
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈可變區VH.1C具有G55A替代在CDR-H2中
<400> 33
Figure 109133319-A0202-12-0065-58
<210> 34
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈可變區VH.1D具有G55A替代在CDR-H2中
<400> 34
Figure 109133319-A0202-12-0065-59
<210> 35
<211> 510
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Figure 109133319-A0202-12-0066-60
Figure 109133319-A0202-12-0067-61
<210> 36
<211> 440
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 36
Figure 109133319-A0202-12-0067-62
Figure 109133319-A0202-12-0068-63

Claims (12)

  1. 一種能夠結合人CD39的抗體或其抗原結合片段，其中抗體的抗原結合片段包含一組六個CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，選自如下的CDR組：a)包含SFWMH(SEQ ID NO：7的殘基31-35)之CDR-H1，包含NINPRNGATKYNEKFRS(SEQ ID NO：7的殘基50-66)之CDR-H2，包含EDYDEIYYAMDS(SEQ ID NO：7的殘基99-110)之CDR-H3，包含SASSSVIYMY(SEQ ID NO：8的殘基24-33)之CDR-L1，包含DTSNLASSEQ ID NO：8的殘基49-55之CDR-L2，和包含QQWSTYPLT(SEQ ID NO：8的殘基88-96)之CDR-L3；b)包含SFWMH(SEQ ID NO：20)之CDR-H1，包含NINPRQGATKYNEKFRS(SEQ ID NO：21)之CDR-H2，包含EDYDEIYYAMDS(SEQ ID NO：22)之CDR-H3，包含SASSSVIYMY(SEQ ID NO：23)之CDR-L1，包含DTSNLAS(SEQ ID NO：24)之CDR-L2，和包含QQWSTYPLT(SEQ ID NO：25)之CDR-L3；以及c)包含SFWMH(SEQ ID NO：26)之CDR-H1，包含NINPRNAATKYNEKFRS(SEQ ID NO：27)之CDR-H2，包含EDYDEIYYAMDS(SEQ ID NO：28)之CDR-H3，包含SASSSVIYMY(SEQ ID NO：29)之CDR-L1，包含DTSNLAS(SEQ ID NO：30)之CDR-L2，和包含QQWSTYPLT(SEQ ID NO：31)之CDR-L3。
  2. 一種包含VH和VL結構域的抗CD39的抗體或其抗原結合片段，其中兩個可變結構域包含選自以下的胺基酸序列： SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15；SEQID NO：12和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：17； SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：17；或SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：17。
  3. 如請求項1的抗體或其抗原結合片段，進一步包含Fc區，該Fc區包含SEQ ID NO：18的殘基104-330的胺基酸序列。
  4. 一種編碼結合人CD39的單株抗體的核酸分子，其中編碼重鏈的核苷酸序列和編碼輕鏈的核苷酸序列分別包含編碼選自如下的重鏈和輕鏈CDR組的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3的核苷酸：a)包含SFWMH(SEQ ID NO：7的殘基31-35)之CDR-H1，包含NINPRNGATKYNEKFRS(SEQ ID NO：7的殘基50-66)之CDR-H2，包含EDYDEIYYAMDS(SEQ ID NO：7的殘基99-110)之CDR-H3，包含SASSSVIYMY(SEQ ID NO：8的殘基24-33)之CDR-L1，包含DTSNLAS SEQ ID NO：8的殘基49-55之CDR-L2，和包含QQWSTYPLT(SEQ ID NO：8的殘基88-96)之CDR-L3；b)包含SFWMH(SEQ ID NO：20)之CDR-H1，包含NINPRQGATKYNEKFRS(SEQ ID NO：21)之CDR-H2，包含EDYDEIYYAMDS(SEQ ID NO：22)之CDR-H3，包含SASSSVIYMY(SEQ ID NO：23)之CDR-L1，包含DTSNLAS(SEQ ID NO：24)之CDR-L2，和包含QQWSTYPLT(SEQ ID NO：25)之CDR-L3；以及c)包含SFWMH(SEQ ID NO：26)之CDR-H1，包含NINPRNAATKYNEKFRS(SEQ ID NO：27)之CDR-H2，包含EDYDEIYYAMDS(SEQ ID NO：28)之CDR-H3，包含SASSSVIYMY(SEQ ID NO：29)之CDR-L1， 包含DTSNLAS(SEQ ID NO：30)之CDR-L2，和包含QQWSTYPLT(SEQ ID NO：31)之CDR-L3。
  5. 一種表達載體，其包含編碼如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段的核酸分子。
  6. 一種宿主細胞，其包含如請求項5所述的表達載體。
  7. 一種用於產生如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段的方法，其中該方法包括以下步驟：(a)在表達結合人CD39的單株抗體的表達條件下培養如請求項6的宿主細胞；(b)分離和純化步驟(a)中獲得的結合人CD39的單株抗體。
  8. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至3中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和藥物學上可接受的載體。
  9. 一種如請求項8所述的醫藥組成物在製備用於治療其中CD39介導的活性是有害的疾病或病症的藥物的用途。
  10. 一種如請求項1至3中任一項的抗體或其抗原結合片段在製備用於治療其中CD39介導的活性是有害的疾病或病症的藥物中的用途。
  11. 如請求項9或10所述的用途，其中該疾病是選自黑色素瘤、腎癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、頭頸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、胃癌、膠質瘤癌、甲狀腺癌、胸腺癌、上皮癌、胃癌和淋巴瘤的癌症。
  12. 如請求項11所述的用途，其中所述疾病或病症是選自轉移性惡性黑素瘤、非小細胞的癌症。
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