JP2021522347A - Ｐｄ−１およびｌａｇ−３に対する高親和性抗体ならびにそれらから作製された二重特異性結合タンパク質 - Google Patents
Ｐｄ−１およびｌａｇ−３に対する高親和性抗体ならびにそれらから作製された二重特異性結合タンパク質 Download PDFInfo
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Abstract
プログラム細胞死リガンド-1（PD-1）とリンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）とを認識する高親和性抗体が開示される。ヒト化抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体に由来する結合部位が、結合親和性の顕著な損失なしにタンデム型Fab免疫グロブリンフォーマットに組み入れられ、結果として生じる二重特異性多価結合タンパク質はPD-1およびLAG-3の両方に同時に結合することが可能である。そのような二重特異性FIT-Ig結合タンパク質はがんの処置に有用である。
Description
発明の分野
本発明は、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）を認識する新規抗体、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）を認識する新規抗体、およびそれらの抗体を用いて作製された、FIT-Ig結合タンパク質などの二重特異性PD-1/LAG-3結合タンパク質に関する。これらの抗体および二重特異性結合タンパク質は、免疫疾患および血液がんの処置に有用である。
本発明は、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）を認識する新規抗体、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）を認識する新規抗体、およびそれらの抗体を用いて作製された、FIT-Ig結合タンパク質などの二重特異性PD-1/LAG-3結合タンパク質に関する。これらの抗体および二重特異性結合タンパク質は、免疫疾患および血液がんの処置に有用である。
発明の背景
プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）
プログラム細胞死タンパク質1（PD-1、CD279）は、CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、およびBTLAを含むCD28ファミリーの受容体のメンバーである。PD-1の発現は、T細胞、B細胞、単球、およびナチュラルキラー（NK）細胞などの免疫細胞にしばしば見られる。PD-1などのファミリーのメンバーは、リガンドの結合を担うIg可変ドメインに類似する免疫グロブリン様ドメインと、シグナル伝達分子の結合を担う細胞質尾部とを含有するI型膜貫通糖タンパク質である。PD-1の細胞質尾部は、2つのチロシンシグナル伝達モチーフ、ITIM（免疫受容体チロシン抑制性モチーフ）、およびITSM（免疫受容体チロシンスイッチモチーフ(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)）を含有する。Vivier et al., Immunol. Today, 18：286-291 (1997)およびChemnitz et al., J. Immunol., 173：945-954 (2004)。
プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）
プログラム細胞死タンパク質1（PD-1、CD279）は、CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、およびBTLAを含むCD28ファミリーの受容体のメンバーである。PD-1の発現は、T細胞、B細胞、単球、およびナチュラルキラー（NK）細胞などの免疫細胞にしばしば見られる。PD-1などのファミリーのメンバーは、リガンドの結合を担うIg可変ドメインに類似する免疫グロブリン様ドメインと、シグナル伝達分子の結合を担う細胞質尾部とを含有するI型膜貫通糖タンパク質である。PD-1の細胞質尾部は、2つのチロシンシグナル伝達モチーフ、ITIM（免疫受容体チロシン抑制性モチーフ）、およびITSM（免疫受容体チロシンスイッチモチーフ(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)）を含有する。Vivier et al., Immunol. Today, 18：286-291 (1997)およびChemnitz et al., J. Immunol., 173：945-954 (2004)。
PD-1に対する2つの細胞表面糖タンパク質リガンドは、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1、CD274、B7-H1）およびPD-L2（CD273、B7-DC）が同定されており、CD3およびCD28媒介T細胞活性化を阻害する細胞内シグナル伝達を誘導することが示されている。Riley, Immunol. Rev., 229：114-125 (2009)。このT細胞活性化のダウンレギュレーションの結果として、次に、T細胞増殖の低減、IL-2分泌、IFN-γ分泌、ならびに他の成長因子およびサイトカインの分泌が生じる。Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-8 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-43 (2002); Ohigashi et al., Clin. Cancer Res., 11:2947-53 (2005)。PD-1/PD-L1相互作用を介するシグナル伝達は、T細胞応答を負に調節することによって免疫系内に重要で非冗長な機能を果たすと考えられる。この調節は、胸腺におけるT細胞発生、慢性炎症応答の調節、ならびに末梢性トレランスおよび免疫特権の両方の維持に関与する。これらの機能の重要な性質は、自己免疫表現型を示すPD-1欠損マウスにおいて例証されている。C57BL/6マウスにおけるPD-1欠損の結果として、慢性進行性ループス様糸球体腎炎および関節炎が生じる。Balb/cマウスでは、PD-1欠損が心組織特異的自己反応性抗体の存在による重度の心筋症をもたらす。
T細胞の刺激後、PD-1は、その細胞質尾部内のITSMモチーフにチロシンホスファターゼSHP-2を動員し、CD3 T細胞シグナル伝達カスケードに関与するCD3-ζ、PKC-θ、およびZAP70などのエフェクター分子の脱リン酸化をもたらす。PD-1がT細胞応答をダウンモジュレーションするメカニズムは、CTLA-4と類似しているが、別個であり、それは、両方の分子がシグナル伝達タンパク質の重複するセットを調節するからである。Parry et al., Mol. Cell Biol., 25:9543-9553 (2005)。一般に、PD-1媒介阻害シグナルは、免疫トレランスに重要な役割を果たす。Bour-Jordan et al., Immunol. Rev., 241:180-205 (2011)。
増大したPD-1発現は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）に見い出され、腫瘍細胞におけるPD-1リガンドの発現が、肺、肝臓、胃、腎臓、乳房、卵巣、膵臓、メラニン細胞、および食道を含む種々の組織の多様ながんで報告されている。一般に、腫瘍細胞上のPD-1リガンドの発現は、多数の腫瘍型にわたるがん患者の予後不良と関連付けられている。Okazaki and Honjo, Int. Immunol., 19:813-824 (2007)。
PD-1/PD-L1相互作用の遮断は、腫瘍特異的T細胞免疫の強化をもたらし、したがって、免疫系による腫瘍細胞の排除に役立つこともできる。侵襲性膵臓がんのマウスモデルにおいて、T. Nomiらは、PD-1/PD-L1遮断の治療有効性を実証し、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体のいずれかの投与が、腫瘍の成長を有意に阻害したことを示した。Nomi et al., Clin. Cancer Res., 13:2151-2157 (2007)。抗体の遮断は、腫瘍内への腫瘍反応性CD8+ T細胞の浸潤を効果的に促進し、結果としてIFN-γ、グランザイムB、およびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターのアップレギュレーションを生じた。マウスにおける扁平上皮がんモデルを用いた別の研究では、PD-1またはPD-L1の抗体遮断が腫瘍の成長を有意に阻害した。Tsushima et al., Oral Oncol., 42：268-274 (2006)。
近年、PD-1がHIV感染個体のT細胞上に高度に発現されること、ならびに受容体の発現がT細胞機能の障害および疾患進行と相関することが示されている。Day et al., Nature, 443：350-354 (2006)； Trautmann et al., Nat. Med., 12：1198-1202 (2006)。両方の研究において、リガンドPD-L1の遮断は、インビトロでHIV特異的なIFN-γ産生細胞の増殖を有意に増大させた。
したがって、アンタゴニスト分子によるPD-1のシグナル伝達の治療的モジュレーションは、免疫細胞をトレランスから復帰させ、それらを再活性化して、がんおよび慢性ウイルス感染症を根絶する可能性がある。
リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）
リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3、CD223）は、T細胞の恒常性、増殖、および活性化をモジュレーションする負の補助刺激受容体である。Sierro et al., Expert Opin. Ther. Targets, 15: 91-101 (2010)。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるLAG-3は、CD4のようにMHCクラスII分子に結合するが2倍高い親和性でCD4と異なる部位に結合する、CD4様タンパク質である。Huard et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94:5744-9 (1997)。LAG-3は、活性化CD8+ T細胞、γδT細胞、ナチュラルキラー、B細胞、形質細胞様樹状細胞、および制御性T細胞（Treg）上に発現される。T細胞応答の負の調節因子としてのLAG-3の役割は、LAG-3ノックアウトマウスを用いる研究ならびにインビトロおよびインビボモデル系におけるブロッキング抗LAG-3抗体の使用に基づく。Sierro et al. (2010)、引用書中； Hannier et al., J. Immunol., 161：4058-65 (1998); Macon-Lemaitre et al., Immunology, 115：170-8 (2005); Workman et al., Eur. J. Immunol., 33:970-9 (2003)。天然Tregおよび誘導Tregの両方が、それらの最大抑制機能に必要な、増大したLAG-3を発現する。Camisaschi et al., J. Immunol., 184:6545-6551 (2010); Huang, et al., Immunity, 21:503-513 (2004)。さらに、CD4+エフェクターT細胞上のLAG-3の異所性発現は、それらの増殖能を低減し、それらにサードパーティーT細胞に対する制御能を付与する。Huang、同上。最近の研究によって、疲弊したリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）特異的CD8+ T細胞上の高いLAG-3発現が、それらの非応答状態の一因となり、CD8+ T細胞抗腫瘍応答を制限することも示されている。Blackburn et al., Nat. Immunol., 10:29-37 (2009)およびGrosso et al., J. Clin. Invest., 117:3383-3392 (2007)。
リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3、CD223）は、T細胞の恒常性、増殖、および活性化をモジュレーションする負の補助刺激受容体である。Sierro et al., Expert Opin. Ther. Targets, 15: 91-101 (2010)。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるLAG-3は、CD4のようにMHCクラスII分子に結合するが2倍高い親和性でCD4と異なる部位に結合する、CD4様タンパク質である。Huard et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94:5744-9 (1997)。LAG-3は、活性化CD8+ T細胞、γδT細胞、ナチュラルキラー、B細胞、形質細胞様樹状細胞、および制御性T細胞（Treg）上に発現される。T細胞応答の負の調節因子としてのLAG-3の役割は、LAG-3ノックアウトマウスを用いる研究ならびにインビトロおよびインビボモデル系におけるブロッキング抗LAG-3抗体の使用に基づく。Sierro et al. (2010)、引用書中； Hannier et al., J. Immunol., 161：4058-65 (1998); Macon-Lemaitre et al., Immunology, 115：170-8 (2005); Workman et al., Eur. J. Immunol., 33:970-9 (2003)。天然Tregおよび誘導Tregの両方が、それらの最大抑制機能に必要な、増大したLAG-3を発現する。Camisaschi et al., J. Immunol., 184:6545-6551 (2010); Huang, et al., Immunity, 21:503-513 (2004)。さらに、CD4+エフェクターT細胞上のLAG-3の異所性発現は、それらの増殖能を低減し、それらにサードパーティーT細胞に対する制御能を付与する。Huang、同上。最近の研究によって、疲弊したリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）特異的CD8+ T細胞上の高いLAG-3発現が、それらの非応答状態の一因となり、CD8+ T細胞抗腫瘍応答を制限することも示されている。Blackburn et al., Nat. Immunol., 10:29-37 (2009)およびGrosso et al., J. Clin. Invest., 117:3383-3392 (2007)。
LAG-3が抗腫瘍免疫応答および感染に対する免疫応答に果たす重要な役割によって、LAG-3は免疫療法にとって関心対象の標的になっている。ある特定のがんおよび慢性ウイルス感染症の処置のために、モノクローナル抗体を含むアンタゴニストを用いてLAG-3を遮断することが提唱されている。Turnis et al., Eur. J. Immunol., 45：1892-1905 (2015)。
PD-1およびLAG-3が媒介するシグナル伝達の重要性がより十分に理解されたので、T細胞の機能性を効果的に変えることができる、または免疫エフェクター細胞に対する腫瘍細胞の反応性を増大させることができる、新規阻害性抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体を発見する継続的な必要性がある。そのうえ、PD-1およびLAG-3の阻害の効果を組み合わせることもできる二重特異性分子の設計もまた、がんの処置に向けた治療アプローチに望ましい改善であると考えられる。
本発明は、PD-1に高い親和性で結合する新規抗体およびLAG-3に高い親和性で結合する新規抗体を提供する。本発明はまた、PD-1およびLAG-3の両方と反応するPD-1/LAG-3二重特異性タンデム型Fab（Fab-in-Tandem）免疫グロブリン（FIT-Ig）を提供する。本発明の抗体および二重特異性結合タンパク質は、TIL上のLAG-3を遮断して、腫瘍浸潤Treg細胞集団を減少させるか、またはTILを細胞傷害性表現型に回復させることができる。追加的に、腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞を再活性化するために、本発明の抗体および二重特異性結合タンパク質を、PD-1/PD-L1シグナル伝達を阻害するために使用することができる。本明細書に記載される二重特異性多価結合タンパク質は、組み合わせ相乗効果を提供して抗腫瘍免疫抑制を克服し、それにより、抗PD-1療法単独または抗LAG-3療法単独に対して応答しないかまたは応答を停止した患者にさえもアウトカムを改善するためのPD-1/LAG-3二重特異性阻害剤として有用であると考えられる。
本発明はまた、本明細書に記載される抗PD-1および抗LAG-3抗体ならびにPD-1/LAG-3二重特異性結合タンパク質を作製および使用する方法のみならず、試料中のPD-1および／もしくはLAG-3を検出する方法、またはPD-1および／もしくはLAG-3活性に関連する、個体における障害を予防もしくは治療する方法に使用され得る様々な組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含む、二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）結合タンパク質を提供し、
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に（i）CLがVHBに直接融合している、VLA-CL-VHB-CH1-Fc、または（ii）CH1がVLAに直接融合している、VHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み；
第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHA-CH1を含み；かつ
第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLB-CLを含み；
ここで、VLが軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHが重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、Fcが免疫グロブリンFc領域であり、AがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但し、AとBが異なる。本発明によると、そのようなFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3の両方に結合する。
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に（i）CLがVHBに直接融合している、VLA-CL-VHB-CH1-Fc、または（ii）CH1がVLAに直接融合している、VHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み；
第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHA-CH1を含み；かつ
第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLB-CLを含み；
ここで、VLが軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHが重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、Fcが免疫グロブリンFc領域であり、AがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但し、AとBが異なる。本発明によると、そのようなFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3の両方に結合する。
好ましい態様では、そのようなFIT-Ig結合タンパク質のFabフラグメントは、抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの一方に結合する親抗体由来のVLA-CLドメインおよびVHA-CH1ドメインを組み入れており、かつ抗原標的のPD-1およびLAG-3のうちの他方に結合する別の親抗体由来のVLB-CLドメインおよびVHB-CH1ドメインを組み入れている。したがって、VH-CH1/VL-CLの対形成の結果として、PD-1とLAG-3とを認識するタンデム型Fab部分を生じる。
本発明によると、PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、有利には第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含んでもよく、第1のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fcを含み、ここで、CLはVHLAG-3に直接融合しており；第2のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHPD-1-CH1を含み；かつ第3のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLLAG-3-CLを含み；ここで、VLPD-1は抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1は抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3は抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3は抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcは免疫グロブリンFc領域である。有利には、第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLPD-1-CLは、抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHPD-1-CH1は、抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLLAG-3-CLは、抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHLAG-3-CH1は、抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。
代替的な態様では、PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、有利には、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含んでもよく、第1のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fcを含み、ここで、CLはVHPD-1に直接融合しており；第2のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHLAG-3-CH1を含み；かつ第3のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLPD-1-CLを含み；ここで、VLPD-1は抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1は抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3は抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3は抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcは免疫グロブリンFc領域である。有利には、第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLLAG-3-CLは、抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHLAG-3-CH1は、抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLPD-1-CLは、抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHPD-1-CH1は、抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。
代替的な態様では、PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、有利には、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含んでもよく、第1のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fcを含み、ここで、CH1はVLPD-1に直接融合しており；第2のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLLAG-3-CLを含み；かつ第3のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHPD-1-CH1を含み；ここで、VLPD-1は、抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1は抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3は抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3は抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcは免疫グロブリンFc領域である。有利には、第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLLAG-3-CLは、抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHLAG-3-CH1は、抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLPD-1-CLは、抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHPD-1-CH1は、抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。
代替的な態様では、PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、有利には、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含んでもよく、第1のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fcを含み、ここで、CH1はVLLAG-3に直接融合しており；第2のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLPD-1-CLを含み；かつ第3のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHLAG-3-CH1を含み；ここで、VLPD-1は抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1は抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3は抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3は抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcは免疫グロブリンFc領域である。有利には、第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLLAG-3-CLは、抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHLAG-3-CH1は、抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLPD-1-CLは、抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHPD-1-CH1は、抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。
FIT-Ig結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖についての前記式において、Fc領域は、ネイティブなFc領域またはバリアントFc領域であり得る。特別な態様では、Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、またはIgD由来のヒトFc領域である。特別な態様では、Fcは、IgG1由来のヒトFc、または下記の表6に示されるような修飾ヒトFc（SEQ ID NO：28）である。
本発明の態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、親抗体の1つまたは複数の特性を保持し、親抗体のFabフラグメントの配列が用いられかつFIT-Ig構造に組み入れられている。好ましい態様では、FIT-Igは、標的抗原（すなわち、LAG-3およびPD-1）に対して親抗体に匹敵する結合親和性を保持する。これは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、PD-1およびLAG-3抗原標的に対するFIT-Ig結合タンパク質の結合親和性を、それぞれの標的抗原に対する親抗体の結合親和性と比較した違いが10倍を超えないことを意味する。
一態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：78のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：83のアミノ酸20〜240の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：86のアミノ酸23〜236の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（表27参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：88のアミノ酸23〜684の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：91のアミノ酸20〜235の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：93のアミノ酸23〜236の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（表28参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：95のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：98のアミノ酸20〜242の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：100のアミノ酸23〜236の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（表29参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：102のアミノ酸23〜684の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：105のアミノ酸20〜235の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：107のアミノ酸23〜236の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（表30参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：140のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：144のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：146のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT107-1-6a-1；表41参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：147のアミノ酸23〜684の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：151のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：153のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-6b-1；表42参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：154のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：158のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：160のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-6a-2；表43参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：161のアミノ酸23〜684の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：165のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：167のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-6b-2；表44参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：168のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：172のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：174のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-6a-3；表45参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：175のアミノ酸23〜684の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：179のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：181のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-6b-3；表46参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：182のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：186のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：188のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-7a-1；表47参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：189のアミノ酸23〜687の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：193のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：195のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-7b-1；表48参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：196のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：200のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：202のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-7a-2；表49参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：203のアミノ酸23〜687の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：207のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：209のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-7b-2；表50参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：210のアミノ酸23〜679の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：214のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：216のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-7a-3；表51参照。）
さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、かつSEQ ID NO：217のアミノ酸23〜687の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：221のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：223のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（FIT-107-1-7b-3；表52参照。）
本発明はまた、ヒトPD-1と結合することが可能な新規な抗体を提供し、抗体の抗原結合ドメインは、6つのCDRのセット、すなわち下記に定義されるCDRセットの群より選択されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
本発明はまた、ヒトLAG-3と結合することが可能な新規な抗体を提供し、抗体の抗原結合ドメインは、下記に定義されるCDRセットの群より選択される、6つのCDRのセット、すなわち、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
一態様では、本発明による結合タンパク質は、2つまたはそれよりも多い抗原結合部位を含む二重特異性多価免疫グロブリン結合タンパク質であり、少なくとも1つの抗原結合部位は、上記のCDRセット1、2、3、および4より選択されるCDRセットを含み、少なくとも1つの抗原結合部位は、上記のCDRセット5を含む。
一態様では、本発明による抗PD-1抗体は、VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明による抗LAG-3抗体は、VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
*SEQ ID NO：226は、アミノ酸56のGly（G）の代わりにAla（A）を有することを除きSEQ ID NO：135と同じであり（Kabat番号付けによるG55A置換）；かつSEQ ID NO：227は、アミノ酸56のGly（G）の代わりにAla（A）を有することを除きSEQ ID NO：136と同じである（Kabat番号付けによるG55A置換）。
別の態様では、抗PD-1抗体または抗LAG-3抗体は、当技術分野において十分に確立した技術によって同じ標的抗原を認識する誘導体結合タンパク質を作製するために使用されてもよい。そのような誘導体は、例えば、単鎖抗体（scFv）、Fabフラグメント（Fab）、Fab'フラグメント、F（ab'）2、Fv、およびジスルフィド結合型Fvであり得る。
本発明の別の局面では、本明細書に記載される抗体または二重特異性結合タンパク質は、PD-1、LAG-3、またはその両方の生物学的機能をモジュレートすることが可能である。別の局面では、本明細書に記載される抗PD-1抗体は、PD-1/PD-L1シグナル伝達を阻害することが可能である。シグナル阻害は、下記実施例において行われるような、混合リンパ球反応アッセイで測定することができる。別の局面では、本明細書に記載される抗LAG-3抗体は、MHCクラスII/LAG-3相互作用を阻害することが可能である。そのような阻害は、下記実施例において行われるような、PBMC SEB活性化アッセイで測定することができる。別の局面では、本明細書に記載される二重特異性PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、PD-1/PD-L1シグナル伝達およびMHCクラスII/LAG-3相互作用の両方を阻害することが可能である。
一態様では、本明細書に記載される抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、少なくとも1×104M-1s-1、少なくとも3×104M-1s-1、少なくとも5×104M-1s-1、少なくとも7×104M-1s-1、少なくとも9×104M-1s-1、少なくとも1×105M-1s-1、少なくとも1.1×105M-1s-1、少なくとも1×105M-1s-1、少なくとも1.25×105M-1s-1、少なくとも1.4×105M-1s-1、少なくとも1.5×105M-1s-1、少なくとも3×105M-1s-1、またはそれよりも大きい、ヒトPD-1に対するオンレート（on rate）定数（kon）を有する。
別の態様では、本明細書に記載される抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、1×10-3s-1未満、5×10-4s-1未満、3×10-4s-1未満、1×10-4s-1未満、8×10-5s-1未満、6×10-5s-1未満、4×10-5s-1未満、3×10-5s-1未満、または1×10-5s-1未満の、ヒトPD-1に対するオフレート（off rate）定数（koff）を有する。
別の態様では、本明細書に記載される抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10-8M未満、5×10-9M未満、3×10-9M未満、1×10-9M未満、8×10-10M未満、6×10-10M未満、4×10-10M未満、2×10-10M未満、または1×10-10M未満の、PD-1に対する解離定数（KD）を有する。
一態様では、本明細書に記載される抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、少なくとも5×103M-1s-1、少なくとも7×103M-1s-1、少なくとも1×104M-1s-1、少なくとも3×104M-1s-1、少なくとも5×104M-1s-1、少なくとも7×104M-1s-1、少なくとも1×105M-1s-1、もしくは少なくとも2×105M-1s-1またはそれよりも大きい、ヒトLAG-3に対するオンレート定数（kon）を有する。
別の態様では、本明細書に記載される抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、1.5×10-3s-1未満、1×10-3s-1未満、8×10-4s-1未満、6×10-4s-1未満、4×10-4s-1未満、2×10-4s-1未満、1×10-4s-1未満、9×10-5s-1未満、8×10-5s-1未満、7×10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、4×10-5s-1未満、2×10-5s-1未満、または1×10-5s-1未満の、ヒトLAG-3に対するオフレート定数（koff）を有する。
別の態様では、本明細書に記載される抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントは、5×10-7M未満、2×10-7M未満、1×10-7M未満、8×10-8M未満、6×10-8M未満、4×10-8M未満；2×10-8M未満；1×10-8M未満；8×10-9M未満；6×10-9M未満、4×10-9M未満；2×10-9M未満；または1×10-9M未満の、LAG-3に対する解離定数（KD）を有する。
一態様では、本発明によるPD-1およびLAG-3と結合することが可能な二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、少なくとも5×103M-1s-1、少なくとも1×104M-1s-1、少なくとも5×104M-1s-1、少なくとも1×105M-1s-1、少なくとも3×105M-1s-1、もしくは少なくとも5×105M-1s-1、またはそれよりも大きい、ヒトPD-1に対するオンレート定数（kon）を有し、当該結合タンパク質は、少なくとも5×103M-1s-1、少なくとも1×104M-1s-1、少なくとも5×104M-1s-1、少なくとも1×105M-1s-1、少なくとも3×105M-1s-1、もしくは少なくとも5×105M-1s-1、またはそれよりも大きい、ヒトLAG-3に対するオンレート定数（kon）を有する。さらなる態様では、本明細書に記載される、PD-1およびLAG-3と結合することが可能な二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、親抗PD-1抗体のPD-1に対するオンレート定数（kon）からの10倍以下の減少でありかつkonおよび親抗LAG-3抗体のLAG-3に対するkonからの10倍以下の減少である、ヒトPD-1に対するkonを有すると考えられる。FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-1特異性および抗LAG-3特異性は、それぞれの親抗体に由来したものである。言い換えると、FIT-Ig結合タンパク質は、それぞれPD-1抗原またはLAG-3抗原と反応する親抗体によって示されるオンレート定数（kon）よりも高い、それと同じ、またはそれよりも1桁以下小さい、各抗原（PD-1またはLAG-3）に対するオンレート定数を保持すると考えられる。本明細書に開示される場合、抗原に対するPD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、一方もしくは両方の抗原に対するkonに、親抗体によって示されるそれぞれの抗原に対するkonと比較して改善を示し得る、または一方もしくは両方の抗原に対するkonは、親抗体によって示されるものとそれぞれ本質的に同じであり得る、またはFIT-Ig結合タンパク質によって示される一方もしくは両方の抗原に対するkonに、親抗体と比較して減少がある場合、その減少は10倍以下の減少である。好ましくは、FIT-Igにおける特定の抗原に対するkonにおける減少は、親抗体のその抗原に対するkonと比較して、50％未満、より好ましくは25％未満の減少である。親抗体のkonと比較して二重特異性FIT-Igにおいてそのように高く維持されたkon値は、当技術分野における驚くべき偉業である。
一態様では、本発明による、PD-1およびLAG-3と結合することが可能な二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定される場合、2×10-4s-1未満、1×10-4s-1未満、5×10-5s-1未満、3×10-5s-1未満、2×10-5s-1未満、1×10-5s-1未満、または8×10-6s-1未満の、ヒトPD-1に対するオフレート定数（koff）を有し、当該結合タンパク質は、2×10-4s-1未満、1×10-4s-1未満、5×10-5s-1未満、3×10-5s-1未満、2×10-5s-1未満、1×10-5s-1未満、または8×10-6s-1未満の、ヒトLAG-3に対するオフレート定数（koff）を有する。
別の態様では、本発明によるPD-1およびLAG-3と結合することが可能な二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、2×10-8M未満、1×10-8M未満、5×10-9M未満、1×10-9M未満、6×10-10M未満、5×10-10M未満、3×10-10M未満、2×10-10M未満、1×10-10M未満、8×10-11M未満、6×10-11M未満、4×10-11M未満、または1×10-11M未満の、PD-1に対する解離定数（KD）を有し、当該結合タンパク質は、2×10-8M未満、1×10-8M未満、5×10-9M未満、1×10-9M未満、6×10-10M未満、5×10-10M未満、3×10-10M未満、2×10-10M未満、1×10-10M未満、8×10-11M未満、6×10-11M未満、4×10-11M未満、または1×10-11M未満の、ヒトLAG-3についての解離定数（KD）を有する。さらなる態様では、本明細書に記載されるPD-1およびLAG-3と結合することが可能な二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、親抗PD-1抗体のPD-1に対する解離定数（KD）と10倍以下異なりかつ親抗LAG-3抗体のLAG-3に対するKDと10倍以下異なる、ヒトPD-1に対するKDを有すると考えられる。FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-1特異性および抗LAG-3特異性は、それぞれの親抗体に由来したものである。言い換えると、FIT-Ig結合タンパク質は、それぞれPD-1抗原またはLAG-3抗原と反応する親抗体によって示される解離定数（KD）から1桁以内であるKDによって示される、それぞれの抗原（PD-1またはLAG-3）に対する親抗体の結合親和性を保持すると考えられる。本明細書に開示される場合、PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、一方もしくは両方の抗原に対するKDに、親抗体によって示されるそれぞれの抗原に対するKDと比較して改善を示し得る（すなわち、より低いKD値を有する；より堅固に結合する）、または一方もしくは両方の抗原に対するKDは、親抗体によって示されるものと本質的に同じであり得る、またはFIT-Ig結合タンパク質によって示される一方もしくは両方の抗原に対するKDは、親抗体のKDと比較して減少を示し得る（すなわち、より大きいKD値を有する、あまり堅固に結合しない）が、FIT-Ig結合タンパク質と親抗体との間でKDに差がある場合、その差は10倍以下の差である。好ましくは、PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質は、一方または両方の親抗体によって示されるそれぞれの抗原に対するKDと比較して、一方または両方の抗原に対してより低いKDを示す（より堅固に結合する）。KDにおける親抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体の結合親和性±10倍の変化を維持することは、当技術分野における驚くべき偉業である。
本発明はまた、本明細書に記載される少なくとも1つの抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、少なくとも1つの抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、PD-1およびLAG-3の両方と反応する二重特異性多価免疫グロブリン結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、本明細書に記載される抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体に由来するVH/VL結合部位を組み入れている。特に、本発明は、PD-1およびLAG-3と結合することが可能な少なくとも1つのFIT-Ig結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、少なくとも1つの追加的な活性成分をさらに含んでもよい。一態様では、そのような追加的な成分には、治療用物質、イメージング剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤、補助刺激分子遮断薬、接着分子遮断薬、異なる特異性の抗体またはその機能的フラグメント、検出可能な標識またはレポーター；特定のサイトカインに対するアゴニストまたはアンタゴニスト、麻薬、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫原、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬、抗うつ薬、抗精神病薬、刺激薬（例えば、アンフェタミン、カフェイン等）、βアゴニスト、吸入ステロイド薬、エピネフリンまたは類似体、サイトカインが含まれるが、それに限定されるわけではない。
別の態様では、薬学的組成物は、PD-1媒介および／またはLAG-3媒介シグナル伝達活性が有害である障害を処置するための少なくとも1つの追加的な治療用物質をさらに含む。
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントの1つまたは複数のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；本発明の抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントの1つまたは複数のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；ならびにPD-1およびLAG-3の両方と結合することが可能な二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）結合タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。そのような核酸は、様々な遺伝学的解析を実行するため、または本明細書に記載される抗体もしくは結合タンパク質の1つもしくは複数の特性を示す、特徴決定する、もしくは改善するために、ベクター中に挿入されてもよい。ベクターは、1つまたは複数の核酸分子が、ベクターを保有する特定の宿主細胞における抗体または結合タンパク質の発現を可能にする適切な転写および／または翻訳配列に機能的に連結される、本明細書に記載される抗体または結合タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸配列をコードする1つまたは複数の核酸分子を含んでもよい。本明細書に記載される結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸をクローニングまたは発現させるためのベクターの例には、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、およびpBJ、ならびにその誘導体が含まれるが、それに限定されるわけではない。
本発明はまた、本明細書に記載される抗体または結合タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明に有用な宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。例示的な原核宿主細胞は大腸菌（Escherichia coli）である。本発明における宿主細胞として有用な真核細胞には、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞が含まれる。例示的な真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）を含む酵母細胞である。本発明による宿主細胞として有用な例示的な動物細胞には、哺乳動物細胞、トリ細胞、および昆虫細胞が含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましい哺乳動物細胞には、CHO細胞、HEK細胞、およびCOS細胞が含まれるが、それに限定されるわけではない。本発明による宿主細胞として有用な昆虫細胞は、昆虫Sf9細胞である。
別の局面では、本発明は、抗PD-1抗体またはその機能的フラグメントを産生する方法であって、PD-1と結合することが可能な抗体またはフラグメントの宿主細胞による発現を引き起こすために十分な条件で、抗体または機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培地中で培養する段階を含む、方法を提供する。別の局面では、本発明は、抗LAG-3抗体またはその機能的フラグメントを産生する方法であって、LAG-3と結合することが可能な抗体またはフラグメントの宿主細胞による発現を引き起こすために十分な条件で、抗体または機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培地中で培養する段階を含む、方法を提供する。別の局面では、本発明は、PD-1およびLAG-3と結合することが可能な二重特異性多価結合タンパク質、具体的にはPD-1およびLAG-3と結合するFIT-Ig結合タンパク質を産生する方法であって、PD-1およびLAG-3と結合することが可能な該結合タンパク質の宿主細胞による発現を引き起こすために十分な条件で、FIT-Ig結合タンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培地中で培養する段階を含む、方法を提供する。そのように産生されたタンパク質は、本明細書に記載される様々な組成物および方法で単離および使用することができる。
一態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載される抗PD-1抗体またはそのPD-1結合フラグメントを投与する段階を含む、方法を提供し、該抗体または結合フラグメントは、PD-1と結合し、かつ、PD-1を発現している細胞においてPD-1/PD-L1またはPD-1/PD-L2媒介シグナル伝達を阻害することが可能である。別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載される抗LAG-3抗体またはそのLAG-3結合フラグメントを投与する段階を含む、方法を提供し、該抗体または結合フラグメントは、LAG-3と結合し、かつLAG-3を発現している細胞においてMHCクラスII/LAG-3媒介シグナル伝達を阻害することが可能である。別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載されるLAG-3およびPD-1と結合することが可能な二重特異性FIT-Ig結合タンパク質を投与する段階を含む、方法を提供し、該結合タンパク質は、LAG-3およびPD-1と結合し、かつLAG-3を発現している細胞においてMHCクラスII/LAG-3媒介シグナル伝達を阻害すること、およびPD-1を発現している細胞においてPD-1/PD-L1またはPD-1/PD-L2シグナル伝達を阻害することが可能である。さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、SEQ ID NO：102のアミノ酸23〜684の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：105のアミノ酸20〜235の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：107のアミノ酸23〜236の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（表30参照。）さらなる態様では、本発明のFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3と結合し、SEQ ID NO：189のアミノ酸23〜687の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO：192のアミノ酸20〜235の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO：194のアミノ酸23〜236の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる第3のポリペプチド鎖から構成される。（表48参照。）
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを処置するための方法を提供し、結合タンパク質はLAG-3およびPD-1と結合することが可能であり、かつ自己免疫疾患またはがんは、典型的には、免疫療法に応答性の自己免疫疾患またはがんである。別の態様では、がんは、免疫療法と付けられたことがないがんである。別の態様では、がんは、不応性または再発性の悪性腫瘍であるがんである。別の態様では、結合タンパク質は、腫瘍細胞の成長または生存を阻害する。別の態様では、がんは、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば明細胞がん）、前立腺がん（例えばホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および他の新生物悪性腫瘍からなる群より選択される。
本明細書に記載される処置の方法は、それを必要とする対象に完全または部分的ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格を含むCpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）などの免疫刺激アジュバントを投与する段階をさらに含んでもよい。例えば、本発明の処置の方法において、免疫刺激アジュバントは、本発明の抗体またはFIT-Ig結合タンパク質を含む組成物、および処置を必要とする対象に投与された組成物中に組み入れられてもよい。別の態様では、本発明の処置の方法は、処置を必要とする対象に、本明細書に記載される抗体またはFIT-Ig結合タンパク質を投与する段階、および対象に本発明の抗体またはFIT-Ig結合タンパク質を投与する段階の前、それと同時、またはその後に、対象に免疫刺激アジュバントを投与する別の段階を含み得る。
発明の詳細な説明
本発明は、新規な抗PD-1抗体、新規な抗LAG-3抗体、その抗原結合部分、ならびにPD-1標的およびLAG-3標的の両方と結合するタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）などの多価二重特異性結合タンパク質に関する。本発明の様々な局面は、抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体および抗体フラグメント、ヒトPD-1およびヒトLAG-3に結合するFIT-Ig結合タンパク質、ならびにその薬学的組成物のみならず、そのような抗体を作製するための核酸、組み換え発現ベクターおよび宿主細胞、機能的抗体フラグメント、ならびに結合タンパク質に関する。ヒトPD-1、ヒトLAG-3、またはその両方を検出するため；ヒトPD-1および／またはヒトLAG-3活性をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害するため；ならびにPD-1および／またはLAG-3とそれらのそれぞれのリガンド、すなわち、PD-1およびMHCクラスIIへの結合によって媒介される疾患、特にがんを処置するために、本発明の抗体、機能的抗体フラグメント、および二重特異性結合タンパク質を使用する方法もまた、本発明によって包含される。
本発明は、新規な抗PD-1抗体、新規な抗LAG-3抗体、その抗原結合部分、ならびにPD-1標的およびLAG-3標的の両方と結合するタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）などの多価二重特異性結合タンパク質に関する。本発明の様々な局面は、抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体および抗体フラグメント、ヒトPD-1およびヒトLAG-3に結合するFIT-Ig結合タンパク質、ならびにその薬学的組成物のみならず、そのような抗体を作製するための核酸、組み換え発現ベクターおよび宿主細胞、機能的抗体フラグメント、ならびに結合タンパク質に関する。ヒトPD-1、ヒトLAG-3、またはその両方を検出するため；ヒトPD-1および／またはヒトLAG-3活性をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害するため；ならびにPD-1および／またはLAG-3とそれらのそれぞれのリガンド、すなわち、PD-1およびMHCクラスIIへの結合によって媒介される疾患、特にがんを処置するために、本発明の抗体、機能的抗体フラグメント、および二重特異性結合タンパク質を使用する方法もまた、本発明によって包含される。
本明細書において特に定義されないかぎり、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。これらの用語の意味および範囲は明確なはずであるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書において提供される定義が、いかなる辞書または外的定義よりも優先される。さらに、文脈により特に必要とされないかぎり、単数形の語は、複数を含むものとし、複数形の語は単数を含むものとする。本出願において、「または」の使用は、特に述べないかぎり、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる（including）」という用語ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」などのその他の形態の使用は、非限定的である。また、特に具体的に述べないかぎり、「要素」または「構成成分」などの用語は、1ユニットを含む要素および構成成分ならびに1つよりも多いサブユニットを含む要素および構成成分の両方を包含する。
全体として、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。本発明の方法および技術は全体として、特に示さないかぎり、当技術分野において周知の従来法に従い、本明細書を通じて引用され論じられる様々な一般的およびより具体的な参照に記載されるように行われる。酵素反応および精製技術は、製造者の規格に従い、当技術分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載されるように行われる。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学および医薬化学に関連して使用される命名法ならびにそれらの検査手法および技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。化学合成、化学分析、製剤、製剤化、および送達、ならびに患者の処置に関して標準的な技術が使用される。
本発明がより容易に理解され得るように、選択した用語を下記に定義する。
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と互換的に使用され、同様にアミノ酸のポリマー鎖を指す。「ポリペプチド」という用語は、ネイティブまたは人工のタンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質アミノ酸配列のポリペプチド類似体を包含する。「ポリペプチド」という用語は、特に文脈と矛盾しないかぎり、そのフラグメントおよびバリアント（バリアントのフラグメントを含む）を包含する。抗原性ポリペプチドについて、ポリペプチドのフラグメントは、任意で、ポリペプチドの少なくとも1つの連続的なまたは非線状のエピトープを含有する。少なくとも1つのエピトープフラグメントの正確な境界は、当技術分野における通常の技術を用いて確認することができる。フラグメントは、少なくとも約5個の連続したアミノ酸、例えば少なくとも約10個の連続したアミノ酸、少なくとも約15個の連続したアミノ酸、または少なくとも約20個の連続したアミノ酸を含む。ポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載される通りである。
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その誘導体起源または誘導体供給源のおかげでそのネイティブな状態でそれに付随する天然関連構成成分と関連していないか、同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まないか、異なる種由来の細胞によって発現されるか、または天然に存在しない、タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学合成されるか、またはそれが自然由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その自然に関連する構成成分から「単離されている」。タンパク質はまた、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、自然に関連する構成成分を実質的に含まないようにされていてもよい。
「回収すること」という用語は、例えば、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いる、単離によって、ポリペプチドなどの化学種が天然関連構成成分を実質的に含まないようにする工程を指す。
「生物学的活性」という用語は、本明細書に記載される抗PD-1抗体または抗LAG-3抗体のすべての固有の生物学的特性を指す。抗PD-1抗体の生物学的特性には、PD-1タンパク質への結合を含むが、それに限定されるわけではなく；抗LAG-3抗体の生物学的特性は、MHCクラスIIタンパク質への結合を含むが、それに限定されるわけではない。
抗体、結合タンパク質、またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関する「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、相互作用が第2の化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質一般よりもむしろ特異的タンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的な場合、標識された「A」および抗体を含有する反応物中にエピトープA（または遊離の標識されていないA）を含有する分子が存在することで、抗体結合型の標識されたAの量は低減すると考えられる。
「抗体」という用語は、4つのポリペプチド鎖、すなわち2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖から構成される任意の免疫グロブリン（Ig）分子、またはIg分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的フラグメント、変異体、バリアント、もしくは誘導を広く指す。そのような変異体、バリアント、または誘導体抗体フォーマットは、当技術分野において公知である。その非限定的な態様を下記に述べる。
完全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略記される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン：CH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VH領域およびVL領域は、より大きく保存されたフレームワーク領域（FR）と名付けられる領域が散在する、相補性決定領域（CDR）と名付けられる超可変領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端方向に以下の順序で配列された3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VHドメインの第1、第2、および第3のCDRは、一般にCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と列挙され；同様に、VLドメインの第1、第2、および第3のCDRは、一般にCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と列挙される。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）またはサブクラスであることができる。
「Fc領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。Fc領域は、天然配列Fc領域またはバリアントFc領域であり得る。免疫グロブリンのFc領域は、一般的に、2つの定常ドメイン、すなわち、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、例えば、IgM抗体およびIgE抗体のFc領域の場合のように、任意でCH4ドメインを含む。IgG抗体、IgA抗体、およびIgD抗体のFc領域は、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。対照的に、IgM抗体およびIgE抗体のFc領域は、ヒンジ領域を欠くが、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびCH4ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変えるためにFc部分にアミノ酸残基の置換を有するバリアントFc領域は、当技術分野において公知である（例えば、Winterら、米国特許第5,648,260号および同第5,624,821号を参照されたい）。抗体のFc部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ADCC、食作用、補体依存性細胞傷害作用（CDC）、ならびに抗体および抗原-抗体複合体の半減期/クリアランス速度を媒介する。これらのエフェクター機能は、治療用抗体にとって望ましい場合があるが、別の場合には、必要ではないか、または治療目的次第で有害でさえある場合もある。ある特定のヒトIgGアイソタイプ、特にIgG1およびIgG3は、それぞれFcγRおよび補体C1qに結合することを介してADCCおよびCDCを媒介する。なお別の態様では、少なくとも1つのアミノ酸残基が、抗体の定常領域、例えば抗体のFc領域において置換され、その結果、抗体のエフェクター機能が変えられる。免疫グロブリンの2つの同一の重鎖の二量体化は、CH3ドメインの二量体化によって媒介され、CH1定常ドメインをFc定常ドメイン（例えば、CH2およびCH3）に接続するヒンジ領域内のジスルフィド結合によって安定化される。IgGの抗炎症活性は、IgG FcフラグメントのN-結合型グリカンのシアリル化に完全に依存する。抗炎症活性にとっての正確なグリカン必要条件が決定されており、その結果、適切なIgG1 Fcフラグメントを生成し、それにより、大きく強化された力価を有する完全組み換えシアリル化IgG1 Fcを生成することができる（Anthony et al., Science、320：373-376 (2008)を参照されたい）。
抗体の「抗原結合部分」および「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」という用語は、互換的に使用され、抗原、すなわち、部分またはフラグメントが由来する完全長抗体と同じ抗原（例えば、PD-1、LAG-3）に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たすことができることが示されている。そのような抗体の態様はまた、2つまたはそれよりも多い異なる抗原（例えば、PD-1および異なる抗原、例えばLAG-3）に特異的に結合する、二重特異性、デュアル特異性、または多特異性のフォーマットであり得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合フラグメントの例には、（i）Fabフラグメント、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価フラグメント；（ii）F(ab')2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント；（iii）VHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；（iv）抗体の単腕のVLドメインおよびVHドメインからなるFvフラグメント、（v）単一の可変ドメインを含むdAbフラグメント（Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)；PCT公報番号WO90/05144）；ならびに（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインのVLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え方法を用いて合成リンカーによって接合されることができ、この合成リンカーは、VL領域およびVH領域が対形成して一価分子（単鎖Fv（scFv）として公知；例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988)；およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)を参照されたい）を形成する単一のタンパク質鎖として、該ドメインが作製されることを可能にする。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語および上述の同等の用語内に包含されることが意図される。他の形態の単鎖抗体、例えばダイアボディー（diabody）もまた包含される。ダイアボディーは、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用い、それによりドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対形成させ、2つの抗原結合部位を生成する、二価二重特異性抗体である（例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)を参照されたい。そのような抗体結合部分は、当技術分野において公知である（Kontermann and Duebel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5)）。加えて、単鎖抗体はまた、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成するタンデム型Fvセグメント対（VH-CH1-VH-CH1）を含む「線状抗体」を含む（Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)；および米国特許第5,641,870号））。
免疫グロブリン定常（C）ドメインは、重（CH）鎖または軽（CL）鎖定常ドメインを指す。マウスおよびヒトIgG重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。
「モノクローナル抗体」または「mAb」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち、少量存在し得る可能性がある天然変異を除き、集団を構成する個別の抗体は、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原決定基（エピトープ）に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各mAbは、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えばCDRおよび特定のCDR3中にヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボの体細胞変異によって導入される変異）を含んでもよい。しかし、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDRがヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まない。
「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、生成、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞内にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Hoogenboom, H.R., Trends Biotechnol., 15: 62-70 (1997); Azzazy and Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425-445 (2002); Gavilondo and Larrick, BioTechniques, 29: 128-145 (2000); Hoogenboom and Chames, Immunol. Today, 21: 371-378 (2000)）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入された動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: 6287-6295 (1992); Kellermann and Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: 593-597 (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)を参照されたい）；またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、生成、もしくは単離された抗体を含む。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある特定の態様では、そのような組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（またはヒトIg配列が遺伝子導入された動物を使用する場合は、インビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって、組み換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し、それに関係するものの、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しなくてもよい、配列である。
「キメラ抗体」という用語は、1つの種由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列ならびに別の種由来の定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結したマウス重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
「CDR移植抗体」という用語は、1つの種由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列を含むが、VHおよび／またはVLのCDR領域のうち1つまたは複数の配列が別の種のCDR配列で置換されている抗体、例えば、ヒトCDRのうち1つまたは複数がマウスCDR配列で置換されているヒト重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、VHおよび／またはVL配列の少なくとも一部分がより大きく「ヒト様」であるように、すなわち、ヒト生殖系列可変配列により大きく類似するように変えられた抗体を指す。ヒト化抗体の1種類は、非ヒト種（例えば、マウス）由来のCDR配列がヒトVHフレームワーク配列およびVLフレームワーク配列に導入されているCDR移植抗体である。ヒト化抗体は、関心対象の抗原に免疫特異的に結合しかつヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域および定常領域を含むが非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（CDR）を含む、抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体、もしくはフラグメントである。CDRに関連して本明細書に使用される「実質的に」という用語は、非ヒト抗体のCDRのアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を有するCDRを指す。ヒト化抗体は、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のCDR領域に対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメイン（Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）の実質的にすべてを含む。一態様では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有する。抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含んでもよい。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖だけを含有する。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖だけを含有する。特定の態様では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／またはヒト化重鎖だけを含有する。
ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む任意のクラスならびに非限定的にIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意のアイソタイプの免疫グロブリンより選択されてもよい。ヒト化抗体は、1つよりも多いクラスまたはアイソタイプからの配列を含む場合があり、所望のエフェクター機能を最適化するために当技術分野において周知の技術を用いて特定の定常ドメインが選択されてもよい。
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびCDR領域は、親配列と正確に対応する必要はなく、例えば、ドナー抗体CDRまたはアクセプターフレームワークは、少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失によって変異誘発されてもよく、その結果、その部位のCDR残基またはフレームワーク残基がドナー抗体ともコンセンサスフレームワークとも対応しない。しかし例示的な態様では、そのような変異は広範囲ではないと考えられる。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも95％は、親FR配列および親CDR配列の残基に対応すると考えられる。ドナー抗体における特定のフレームワーク位置に出現する同じアミノ酸を元に戻すためのその位置での逆変異が、特定のループ構造を保つために、または標的抗原との接触のためにCDR配列を正確に配向させるために用いられることが多い。
「CDR」という用語は、抗体可変ドメイン配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに3つのCDRがあり、それらはCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と呼ばれる。本明細書において使用される「CDRセット」という用語は、抗原と結合することが可能な単一の可変領域中に存在する3つのCDRの群を指す。これらのCDRの正確な境界は、異なるシステムに従って異なる定義をされている。Kabatによって記載されるシステム（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) and (1991)）は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、3つのCDRを定義する正確な残基の境界も提供する。
当技術分野において認められている「Kabatの番号付け」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりも可変性が大きい（すなわち超可変的な）アミノ酸残基に番号付けするシステムを指す。Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971)；およびKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)を参照されたい。
過去20年にわたる重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の豊富な公的データベースの拡張および解析は、可変領域配列内のフレームワーク領域（FR）とCDR配列との間の典型的な境界の理解をもたらし、当業者がKabat番号付け、Chothia番号付け、または他のシステムに従ってCDRを正確に決定できるようにした。例えば、Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Duebel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), chapter 31, pages 432-433を参照されたい。
「多価結合タンパク質」という用語は、2つまたはそれよりも多い抗原結合部位を含む結合タンパク質を意味する。多価結合タンパク質は、好ましくは、3つまたはそれよりも多い抗原結合部位を有するように操作されており、一般的に天然抗体ではない。「二重特異性結合タンパク質」という用語は、異なる特異性の2つの標的と結合することが可能な結合タンパク質を指す。本発明の「タンデム型Fab免疫グロブリン」（FIT-Ig）結合タンパク質は、2つまたはそれよりも多い抗原結合部位を含み、典型的には四価結合タンパク質である。FIT-Igは、単一特異性、すなわち、1つの抗原と結合することが可能であり得るか、または多特異性、すなわち2つまたはそれよりも多い抗原と結合することが可能であり得る。本発明による好ましいFIT-Igは、PD-1およびLAG-3の両方と結合し、したがって二重特異性である。2つの長（重）V-C-V-C-Fc鎖ポリペプチドおよび4つの短（軽）V-C鎖ポリペプチドを含むFIT-Ig結合タンパク質は、4つのFab抗原結合部位（VL-CLと対形成したVH-CH1、VH-CH1::VL-CLと表されるときもある）を示す六量体を形成する。FIT-Igの各半分は、1つの重鎖ポリペプチドおよび2つの軽鎖ポリペプチドを含み、これら3つの鎖のVH-CH1要素とVL-CL要素との相補性免疫グロブリン対形成の結果として、タンデムに配列した2つのFab構造抗原結合部位が生じる。本発明において、Fab要素を構成する免疫グロブリンドメインが、ドメイン間リンカーを使用せずに重鎖ポリペプチドの状態に直接融合されていること、すなわち、長（重）ポリペプチド鎖のN末端V-C要素は、そのC末端で別のV-C要素のN末端に直接融合され、それが次にC末端Fc領域に融合されることが好ましい。二重特異性FIT-Ig結合タンパク質において、タンデム型Fab要素は、異なる抗原と反応性であると考えられる。各Fab抗原結合部位は、抗原結合部位1つあたり合計6つのCDRを有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
FIT-Ig分子の設計、発現、および特徴決定の説明は、PCT公報WO2015/103072に提供される。そのようなFIT-Ig分子の好ましい例は、重鎖および2つの異なる軽鎖を含む。重鎖は、CLがVHBに直接融合している、構造式VLA-CL-VHB-CH1-Fc、または、CH1がVLAに直接融合している、VHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み、ここで、VLAは、抗原Aと結合する親抗体由来の可変軽鎖ドメインであり、VHBは、抗原Bと結合する親抗体由来の可変重鎖ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、かつFcは免疫グロブリンFc領域（例えば、IgG1抗体の重鎖のC末端ヒンジ-CH2-CH3部分）である。FIT-Igの2つの軽ポリペプチド鎖は、それぞれ式VHA-CH1およびVLB-CLを有する。二重特異性FIT-Igの態様において、抗原Aおよび抗原Bは、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープである。本発明において、AおよびBのうちの一方はPD-1であり、かつ他方はLAG-3である。
「活性」という用語は、標的抗原と特異性をもって結合する能力、抗原に対する抗体の親和性、標的抗原の生物学的活性を中和する能力、標的抗原とその天然受容体との相互作用を阻害する能力などの特性を含む。本発明の好ましい抗体および結合タンパク質は、PD-1がそのリガンドPD-L1に結合するのを阻害する能力、LAG-3がそのリガンドMHCクラスIIに結合するのを阻害する能力、または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質の場合はその両方を有する。
本明細書に使用される「kon」（「Kon」、「kon」ともいう）という用語は、当技術分野において公知のように、結合タンパク質（例えば、抗体）が抗原と会合して、会合複合体、例えば、抗体/抗原複合体を形成するオンレート定数を指すことが意図される。「kon」はまた、本明細書において互換的に使用されるように、「会合速度定数」、または「ka」という用語によっても知られている。この値は、抗体のその標的抗原への結合速度を示すか、または抗体と抗原との間の複合体形成速度は、下記の式によって示される。
抗体（「Ab」）+抗原（「Ag」）→Ab-Ag
抗体（「Ab」）+抗原（「Ag」）→Ab-Ag
本明細書に使用される「koff」（「Koff」、「koff」ともいう）という用語は、当技術分野において公知のように、会合複合体（例えば、抗体/抗原複合体）からの結合タンパク質（例えば、抗体）の解離についてのオフレート定数、または「解離速度定数」を指すことが意図される。この値は、抗体のその標的抗原からの解離速度または下記の式によって示されるようなAb-Ag複合体から遊離の抗体および抗原への経時的な分離を示す。
Ab+Ag←Ab-Ag
Ab+Ag←Ab-Ag
本明細書に使用される「KD」という用語（「Kd」ともいう）は、「平衡解離定数」を指すことが意図され、平衡での力価測定で得られた値、または解離速度定数（koff）を会合速度定数（kon）で割ることによって得られた値を指す。会合速度定数（kon）、解離速度定数（koff）、および平衡解離定数（KD）は、抗体の抗原への結合親和性を表すために使用される。会合速度定数および解離速度定数を決定するための方法は、当技術分野において周知である。蛍光に基づく技術を使用することは、高い感度および生理的緩衝液中で平衡状態の試料を調査する能力を与える。BIAcore（登録商標）（biomolecular interaction analysis）アッセイなどの他の実験アプローチおよび機器（例えば、BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Swedenから入手可能な機器）を使用することができる。例えば、Octet（登録商標）RED96システム（Pall ForteBio LLC）を使用するバイオレイヤー干渉法（BLI）は、別の親和性アッセイ技術である。追加的に、Sapidyne Instruments（Boise, Idaho）から入手可能なKinExA（登録商標）（Kinetic Exclusion Assay）アッセイも使用することができる。
「単離された核酸」という用語は、ヒトの介入によって、それが自然界で一緒に見出されるポリヌクレオチドのすべてもしくは一部分と会合しないか；それが自然界で連結されないポリヌクレオチドに機能的に連結されるか；または自然界でより大きな配列の部分として存在しない、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、cDNA、もしくは合成起源、またはその何かの組み合わせのもの）を意味するものとする。
本明細書に使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことが意図される。ベクターの1つの種類は、追加的なDNAセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、追加的なDNAセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされてもよい。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み入れることができ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。そのうえ、ある特定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を指示することが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えDNA技術に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドはもっともよく使用される形態のベクターであるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用される場合がある。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルスベクターなどのそのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）。
「機能的に連結される」という用語は、記載される構成成分が意図される方法で機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「機能的に連結される」制御配列は、制御配列と適合する条件でコード配列の発現が達成される方法でライゲーションされる。「機能的に連結される」配列は、関心対象の遺伝子と近接する発現制御配列と、トランスでまたは距離を空けて作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列との両方を含む。本明細書に使用される「発現制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを引き起こすために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；ならびに所望であれば、タンパク質の分泌を強化する配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり；原核生物では、そのような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み；真核生物では、そのような制御配列は、一般的に、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングに不可欠である構成成分を含むことが意図され、その存在が有利である追加的な構成成分、例えば、リーダー配列またはシグナル配列および融合パートナー配列も含むことができる。
本明細書に定義される「形質転換」は、外因性DNAが宿主細胞に進入する任意の工程を指す。形質転換は、当技術分野において周知の様々な方法を用いて自然条件または人工条件下で行われてもよい。形質転換は、原核または真核宿主細胞中に外来核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に頼ってもよい。この方法は、形質転換されようとする宿主細胞に基づき選択され、かつ、トランスフェクション、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、および微粒子銃を含んでもよいが、それらに限定されるわけではない。そのような「形質転換」細胞は、挿入されたDNAが自律複製プラスミドまたは宿主染色体の部分のいずれかとしての複製が可能である安定形質転換細胞を含む。それらはまた、挿入されたDNAまたはRNAを限られた期間、一過性に発現する細胞も含む。
「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、外因性DNAが導入された細胞を指すことが意図される。一態様では、例えば、米国特許第7,262,028号に記載される宿主細胞のように、宿主細胞は、抗体をコードする2つまたはそれよりも多い（例えば、複数の）核酸を含む。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図される。次の世代で、変異または環境の影響のいずれかが原因である特定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一でない場合があるが、それでも本明細書に使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。一態様では、宿主細胞は、任意の生物界（Kingdoms of life）より選択される原核および真核細胞を含む。別の態様では、真核細胞は、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞を含む。別の態様では、宿主細胞は、原核細胞株、大腸菌；哺乳動物細胞株、CHO、HEK293、COS、NS0、SP2およびPER.C6；昆虫細胞株Sf9；ならびに真菌細胞サッカロミセス・セレビシアを含むが、それに限定されるわけではない。
標準的な技術は、組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用されてもよい。酵素反応および精製技術は、製造業者の規格に従って、または当技術分野において通常成し遂げられるように、または本明細書に記載されるように、行われてもよい。前述の技術および手法は全体として、当技術分野において周知の従来方法に従って、ならびに本明細書にわたり引用および論考される様々な一般的な参照およびより具体的な参照に記載されるように、行われてもよい。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)を参照されたい。
本明細書に使用される「アゴニスト」という用語は、関心対象の分子と接触された場合に、アゴニストの非存在下で観察される活性または機能の強度と比較して、その分子のある特定の活性または機能の強度に増大を引き起こすモジュレーターを指す。本明細書に使用される「アンタゴニスト」および「阻害剤」という用語は、関心対象の分子と接触された場合に、アンタゴニストの非存在下で観察される活性または機能の強度と比較して、その分子のある特定の活性または機能の強度に減少を引き起こすモジュレーターを指す。関心対象の特定のアンタゴニストは、ヒトPD-1およびヒトLAG-3の生物学的活性または免疫学的活性を遮断または低減するものを含む。
本明細書に使用される「有効量」という用語は、障害またはその1つもしくは複数の症状の重症度および／または持続期間を低減または改善するため；障害の進行を予防するため；障害の軽減を引き起こすため；障害に関連する1つまたは複数の症状の再発、発生、または進行を予防するため；障害を検出するため；あるいは別の治療法（例えば、予防用物質または治療用物質）の予防効果または治療効果を強化または改善するために十分である治療法の量を指す。
抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体の産生
本発明の抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体は、当技術分野において公知のいくつかの技術のうちのいずれかによって産生されてもよい。例えば、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが標準的な技術によって宿主細胞中にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現である。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核宿主細胞または真核宿主細胞中に外因性DNAを導入するために一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本発明の抗体を原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれかにおいて発現させることが可能であるものの、真核細胞における抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞における発現がもっとも好ましい。それは、そのような真核細胞（特に哺乳動物細胞）が、原核細胞よりも正しくフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いからである。
本発明の抗PD-1抗体および抗LAG-3抗体は、当技術分野において公知のいくつかの技術のうちのいずれかによって産生されてもよい。例えば、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが標準的な技術によって宿主細胞中にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現である。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核宿主細胞または真核宿主細胞中に外因性DNAを導入するために一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本発明の抗体を原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれかにおいて発現させることが可能であるものの、真核細胞における抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞における発現がもっとも好ましい。それは、そのような真核細胞（特に哺乳動物細胞）が、原核細胞よりも正しくフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いからである。
本発明の組み換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)に記載されるようなDHFR選択マーカーと共に使用される、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)に記載されるdhfr-CHO細胞を含む）、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、およびSP2細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入される場合、抗体は、宿主細胞において抗体を発現させるために、またはより好ましくは、宿主細胞が成長される培地中に抗体を分泌させるために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。
宿主細胞を使用して、FabフラグメントまたはscFv分子などの機能的抗体フラグメントを産生することもできる。上記手法の変形は、本発明の範囲内であることが理解されるであろう。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするDNAを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組み換えDNA技術を使用して、関心対象の抗原に結合するために必要ではない軽鎖および重鎖のうちの一方または両方をコードするDNAの一部、またはすべてが除去される場合もある。そのような切断型DNA分子から発現される分子もまた、本発明の抗体に包含される。加えて、一方の重鎖および一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖が関心対象の抗原以外の抗原に特異的である二機能性抗体が、標準的な化学架橋法により本発明の抗体を第2の抗体に架橋することによって産生されてもよい。
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組み換え発現のための例示的なシステムでは、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってdhfr-CHO細胞中に導入される。組み換え発現ベクター内で、抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子は、それぞれCMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節エレメントと機能的に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組み換え発現ベクターはまた、メトトレキサート選択／増幅を用いてベクターをトランスフェクトされたCHO細胞の選択を可能にするDHFR遺伝子を有する。選択された、トランスフェクトされた宿主細胞が培養されて、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、インタクトな抗体が培地から回収される。標準的な分子生物学技術を用いて、組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、トランスフェクタントを選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。なおさらに、本発明は、本発明の組み換え抗体が産生されるまで、本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を適切な培地中で培養することによって本発明の組み換え抗PD-1抗体または抗LAG-3抗体を作製する方法を提供する。この方法はさらに、培地から組み換え抗体を単離する段階をさらに含むことができる。
PD-1およびLAG-3と結合する二重特異性FIT-Igの産生
PD-1、PD-L1、およびCTLA-4を標的化する抗体などの免疫チェックポイント阻害剤を使用する臨床試験は有望な結果をもたらしたが、患者の部分集団だけがこれらの阻害剤に初期応答することが観察されており、益々増える臨床的証拠によって、かなりの比率の初期応答者が、最終的に数ヶ月または数年後に致死性薬物抵抗性疾患を再発することが示されている。Syn et al., The Lancet Oncology, 18(12):e731-e741 (2017)。LAG-3およびPD-1の両方が寛容化腫瘍浸潤リンパ球（TILS）上に共発現されて、腫瘍における免疫抑制の一因となるので、CD8+ T細胞における抗腫瘍機能を回復させる手段としてLAG-3およびPD-1の二重遮断が提唱されている。Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(17): 7875-7880 (2010)。したがって、免疫抑制T細胞上の両方の標的を同時に遮断することができるLAG-3/PD-1二重特異性結合タンパク質の設計は、この治療領域に進歩をもたらす可能性がある。
PD-1、PD-L1、およびCTLA-4を標的化する抗体などの免疫チェックポイント阻害剤を使用する臨床試験は有望な結果をもたらしたが、患者の部分集団だけがこれらの阻害剤に初期応答することが観察されており、益々増える臨床的証拠によって、かなりの比率の初期応答者が、最終的に数ヶ月または数年後に致死性薬物抵抗性疾患を再発することが示されている。Syn et al., The Lancet Oncology, 18(12):e731-e741 (2017)。LAG-3およびPD-1の両方が寛容化腫瘍浸潤リンパ球（TILS）上に共発現されて、腫瘍における免疫抑制の一因となるので、CD8+ T細胞における抗腫瘍機能を回復させる手段としてLAG-3およびPD-1の二重遮断が提唱されている。Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(17): 7875-7880 (2010)。したがって、免疫抑制T細胞上の両方の標的を同時に遮断することができるLAG-3/PD-1二重特異性結合タンパク質の設計は、この治療領域に進歩をもたらす可能性がある。
本発明は、PD-1およびLAG-3の両方に結合するタンデム型Fab免疫グロブリン結合タンパク質（FIT-Ig）を提供する。そのようなFIT-Ig分子の例示的な態様は、（1）CLがVHBに直接融合している構造式（i）VLA-CL-VHB-CH1-Fc、またはCH1がVLAに直接融合している構造式（ii）VHB-CH1-VLA-CL-Fcのいずれかを含む、重ポリペプチド鎖；（2）式VHA-CH1の軽ポリペプチド鎖；および（3）式VLB-CLの別の軽ポリペプチド鎖を含み、
ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、Fcは免疫グロブリンFc領域であり、Aは、PD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBはPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但し、AとBが異なる。本発明により、そのようなFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3の両方に結合する。
ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖定常ドメインであり、Fcは免疫グロブリンFc領域であり、Aは、PD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBはPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但し、AとBが異なる。本発明により、そのようなFIT-Ig結合タンパク質は、PD-1およびLAG-3の両方に結合する。
FIT-Igは、2つのそのような重鎖（1）、2つのそのような軽鎖（2）、および2つのそのような軽鎖（3）を含み、4つの機能的Fab抗原結合部位を示している6本鎖結合タンパク質単量体を形成してもよい。そのようなFIT-Ig結合タンパク質は、各サブユニットが一緒になってタンデムに配列されたFab結合部位の対を形成する1つの重鎖（1）、1つの軽鎖（2）、および1つの軽鎖（3）を含む、2つの同一のサブユニットを含む。2つのそのようなサブユニットのFc領域の対形成は、合計で4つの機能的Fab結合ユニットを有する本発明の6本鎖二重特異性FIT-Ig結合タンパク質をもたらす。
重鎖上のペプチドリンカーを使用してタンデムに接続されたFab部分を分離することが可能であるが、しかし、本発明による二重特異性FIT-Igについては、そのようなリンカー配列を省略することが好ましい。それに対して、タンデム型結合部位を有する多価の操作された免疫グロブリンフォーマットでは、結合部位を空間的に分離するために可動性リンカーを使用する場合を除き、隣接結合部位が相互に妨害し合うと当技術分野において一般に理解されていた。しかし、本発明のPD-1/LAG-3 FIT-Igについて、上記の鎖の式に従う免疫グロブリンドメインの配置の結果として、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において十分に発現され、適切に組み立てられ、標的抗原PD-1およびLAG-3と結合する二重特異性多価免疫グロブリン様結合タンパク質として分泌される、ポリペプチド鎖が生じることが発見された。下記の実施例10を参照されたい。Fab結合部位同士の間にいかなるリンカー配列も存在しないにもかかわらず、本発明のPD-1/LAG-3 FIT-Igは、標的抗原に対する結合親和性を保持し、親mAbに匹敵する結合親和性を示す。そのうえ、結合タンパク質から合成リンカー配列を省略することで、哺乳動物免疫系によって認識可能な抗原部位が生成されるのを避けることができる。このようにして、リンカーの除去は、FIT-Igの免疫原性の可能性を減少させ、天然抗体のような循環中半減期をもたらす。すなわち、FIT-Igは、免疫オプソニン作用および肝臓での捕捉により急速には浄化されることがない。
FIT-Igにおける各可変ドメイン（VHまたはVL）は、標的抗原の1つ、すなわち、PD-1またはLAG-3と結合する1つまたは複数の「親」モノクローナル抗体から得られてもよい。FIT-Ig結合タンパク質は、有利には、本明細書に開示される抗PD-1モノクローナル抗体および抗LAG-3モノクローナル抗体の可変ドメイン配列を使用して産生される。好ましくは、親抗体はヒト化抗体である。
本発明の局面は、FIT-Ig分子に望まれる少なくとも1つまたは複数の特性を有する親抗体を選択することに関する。一態様では、抗体の特性は、抗原特異性、抗原との親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、可溶性、産生効率、免疫原性の欠如、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオルソロガス抗原結合からなる群より選択される。PD-1およびLAG-3は、両方とも細胞表面タンパク質であり、かつ、それらのそれぞれのリガンドPD-L1（細胞表面受容体）およびMHCクラスII（抗原提示細胞上の表面タンパク質）との相互作用は、T細胞抑制および免疫応答に関わる細胞内シグナル伝達をもたらす。したがって、本発明による抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体、およびPD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質がPD-1/PD-L1および／またはMHCクラスII/LAG-3相互作用を阻害する能力によって、それらは免疫細胞活性化および免疫エフェクター細胞活性の強力な調節因子となる。
本発明による抗体、その機能的フラグメント、および結合タンパク質は、抗体および結合タンパク質を精製するために当技術分野において使用可能な多様な方法および材料のうち1つまたは複数を使用することによって、（用途のために）精製されてもよい。そのような方法および材料には、用途に対して許容される純度を得るための、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインL、または抗体の特異的リガンド、その機能的フラグメント、または結合タンパク質にコンジュゲートした樹脂、粒子、またはメンブランを使用する）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、イオン交換粒子またはメンブランを使用する）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「HIC」；例えば、疎水性粒子またはメンブランを使用する）、限外濾過、ナノ濾過、ダイアフィルトレーション、サイズ排除クロマトグラフィー（「SEC」）、低pH処理（混入ウイルスを不活性化するため）、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それに限定されるわけではない。混入ウイルスを不活性化するための低pH処理の非限定的な例は、本発明の抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質を含む溶液または懸濁液のpHを、18℃〜25℃で60〜70分間、0.5Mリン酸を用いてpH3.5に低下させることを含む。
本発明の抗体および結合タンパク質の使用
本明細書に記載される抗体、その機能的フラグメント、および本明細書に記載される二重特異性多価結合タンパク質がヒトPD-1および／またはLAG-3に結合できることを考えると、それらは、例えば、それらの標的抗原のうちの一方または両方を発現する細胞を含有する生物学的試料中の、PD-1もしくはLAG-3、またはその両方を検出するために使用することができる。本発明の抗体、機能的フラグメント、および結合タンパク質は、従来のイムノアッセイ、例えば酵素結合性免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、または組織免疫組織化学に使用することができる。本発明は、生物学的試料中のPD-1またはLAG-3を検出するための方法であって、生物学的試料を本発明の抗体、その抗原結合部分、または結合タンパク質と接触させる段階、および標的抗原への結合が起こるかどうかを検出し、それにより、生物学的試料中の標的の存在または非存在を検出する段階を含む、方法を提供する。抗体、機能的フラグメント、または結合タンパク質は、結合型または非結合型抗体／フラグメント／結合タンパク質の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接または間接的に標識されてもよい。適切な検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；適切な放射性物質の例は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、または153Smを含む。
本明細書に記載される抗体、その機能的フラグメント、および本明細書に記載される二重特異性多価結合タンパク質がヒトPD-1および／またはLAG-3に結合できることを考えると、それらは、例えば、それらの標的抗原のうちの一方または両方を発現する細胞を含有する生物学的試料中の、PD-1もしくはLAG-3、またはその両方を検出するために使用することができる。本発明の抗体、機能的フラグメント、および結合タンパク質は、従来のイムノアッセイ、例えば酵素結合性免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、または組織免疫組織化学に使用することができる。本発明は、生物学的試料中のPD-1またはLAG-3を検出するための方法であって、生物学的試料を本発明の抗体、その抗原結合部分、または結合タンパク質と接触させる段階、および標的抗原への結合が起こるかどうかを検出し、それにより、生物学的試料中の標的の存在または非存在を検出する段階を含む、方法を提供する。抗体、機能的フラグメント、または結合タンパク質は、結合型または非結合型抗体／フラグメント／結合タンパク質の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接または間接的に標識されてもよい。適切な検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；適切な放射性物質の例は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、または153Smを含む。
本発明の抗体、その機能的フラグメント、および結合タンパク質は、好ましくは、ヒトPD-1および／またはヒトLAG-3活性をインビトロおよびインビボの両方で中和することが可能である。したがって、本発明の抗体、その機能的フラグメント、および結合タンパク質を使用して、本発明の抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質が交差反応するPD-1またはLAG-3を有するヒト対象、または他の哺乳動物対象においてヒトPD-1および／またはヒトLAG-3活性を阻害すること、例えば、PD-1発現および／またはLAG-3発現細胞を含有する細胞培養においてPD-1/PD-L1（もしくはPD-1/PD-L2）相互作用および／またはMHCクラスII/LAG-3相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達を阻害することができる。一態様では、本発明は、活性化T細胞の活性を回復させる（抑制を後退させる）ための方法であって、PD-1活性が阻害されるようにヒトPD-1発現細胞を本発明の抗PD-1抗体またはPD-1結合タンパク質と接触させる段階を含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、活性化T細胞の活性を回復させる（抑制を後退させる）ための方法であって、LAG-3活性が阻害されるようにヒトLAG-3発現細胞を本発明の抗LAG-3抗体またはLAG-3結合タンパク質と接触させる段階を含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、PD-1および／またはLAG-3活性が有害である疾患または障害を患う対象を処置するための方法であって、対象に、本発明の抗体または結合タンパク質を、対象におけるPD-1/PD-L1もしくはPD-1/PD-L2結合および／またはMHCクラスII/LAG-3結合によって媒介される活性が低減されるような有効量で投与する段階を含む、方法を提供する。
本明細書に使用される、「PD-1および／またはLAG-3活性が有害である障害」という用語は、障害を患う対象におけるPD-1とそのリガンド（PD-L1、PD-L2）の一方もしくは両方との相互作用またはLAG-3とそのリガンド（MHCクラスII）との相互作用が障害の病態生理の原因または障害の悪化に寄与する要因のいずれかである、疾患および他の障害を含むことが意図される。したがって、PD-1および／またはLAG-3活性が有害である障害は、PD-1および／またはLAG-3活性の阻害が障害の症状および／または進行を緩和することが予期される障害である。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを処置するための方法であって、対象に、LAG-3、PD-1、またはLAG-3とPD-1との両方と結合することが可能な本明細書に記載される抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質を投与する段階を含む、方法を提供し、かつ自己免疫疾患またはがんは、免疫療法に応答性の疾患である。別の態様では、本発明の方法は、免疫療法と関連付けられたことがない自己免疫疾患またはがんを処置するために使用される。別の態様では、本発明の方法は、不応性または再発性の悪性腫瘍であるがんを処置するために使用される。別の態様では、本発明のLAG-3もしくはPD-1抗体、その機能的フラグメント、またはLAG-3/PD-1二重特異性結合タンパク質は、腫瘍細胞の成長または生存を阻害する方法に使用される。
別の態様では、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載されるPD-1もしくはLAG-3に対する抗体、その機能的フラグメント、または本明細書に記載されるLAG-3/PD-1二重特異性結合タンパク質、例えば、タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）結合タンパク質などを投与する段階を含む、方法を提供し、かつがんは、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えばホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、および軟骨肉腫）、転移がん、および新生物悪性腫瘍からなる群のいずれかより選択される。
本発明はまた、本発明の抗体、もしくはその抗原結合部分、または二重特異性多価結合タンパク質（すなわち、主活性成分）と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明のタンパク質を含む薬学的組成物は、障害を診断、検出、またはモニタリングする際の；障害またはその1つもしくは複数の症状を処置、管理、または改善する際の；および／または研究における、使用のためであるが、それに限定されるわけではない。具体的な態様では、組成物は、本発明の1つまたは複数の抗体または結合タンパク質を含む。別の態様では、薬学的組成物は、PD-1および／またはLAG-3活性が有害である障害を処置するための、本発明の1つまたは複数の抗体または結合タンパク質と、本発明の抗体または結合タンパク質以外の1つまたは複数の予防用物質または治療用物質とを含む。一態様では、予防用物質または治療用物質は、障害またはその1つもしくは複数の症状の予防、治療、管理、または改善に有用であることが公知である、またはそれに使用されてきた、もしくは現在使用されている。これらの態様に従い、組成物は、担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤は、一般的に、主活性成分の特徴以外の所望の特徴を組成物に与える任意の化合物または化合物の組み合わせ（すなわち、本発明の抗体、その機能的部分、または結合タンパク質以外）である。
本発明の抗体（その機能的フラグメントを含む）および結合タンパク質は、対象への投与に適した薬学的組成物中に組み入れることができる。典型的には、薬学的組成物は、本発明の抗体または結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの1つまたは複数ばかりでなく、それらの組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容される担体はさらに、組成物中に存在する抗体または結合タンパク質の有効期限または有効性を高める、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤などの少量の補助物質を含んでもよい。
本発明の薬学的組成物は、それの意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（例えば、外用）、腫瘍内、経粘膜、および直腸投与が含まれるが、それに限定されるわけではない。具体的な態様では、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内、または外用投与に適合された薬学的組成物として日常的な手法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、注射部位の疼痛を和らげるために可溶化剤および局所麻酔薬、例えばリドカイン（キシロカイン、リグノカイン）を含んでもよい。
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与のために製剤化された組成物の投与を含んでもよい。注射用の製剤は、保存剤が添加された単位投薬形態で（例えば、アンプル中または多用量容器中に）提示されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を採ってもよく、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤（formulatory agent）を含有してもよい。あるいは、主活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、無菌発熱物質不含水）で構成するための粉末形態であってもよい。
本発明の方法は、追加的に、デポ剤として製剤化された組成物の投与を含むことができる。そのような長時間作用型製剤は、植え込み（例えば、皮下もしくは筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与されることができる。したがって、例えば組成物は、適切なポリマー物質または疎水性物質（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂と共に、またはやや溶けにくい誘導体として（例えば、やや溶けにくい塩として）製剤化されることができる。
本発明の抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質はまた、様々な疾患の処置に有用な1つまたは複数の追加的な治療用物質と共に投与することができる。本明細書に記載される抗体、その機能的フラグメント、および結合タンパク質は、単独で、または追加的な剤、例えば、治療用物質と組み合わせて使用することができ、追加的な剤は、その意図される目的のために技術者によって選択される。例えば、追加的な剤は、本発明の抗体または結合タンパク質によって処置される疾患または状態を処置するために有用であると当技術分野において承認されている治療用物質であることができる。追加的な剤はまた、治療用組成物に有益な性状を付与する剤、例えば、組成物の粘性に影響する剤であることができる。
これまで本発明を詳細に説明してきたが、以下の実施例の参照により同じことがより明白に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のためだけに含まれ、本発明を限定していることは意図されない。
実施例1：抗ヒトPD-1モノクローナル抗体の生成
以下のように抗ヒトPD-1モノクローナル抗体を生成した。
以下のように抗ヒトPD-1モノクローナル抗体を生成した。
実施例1.1：ヒトPD-1抗原による免疫処置
フロイント完全アジュバントと混合した50μgの組み換え精製ヒトPD-1細胞外ドメイン（ECD）ポリペプチドを1日目に5匹の6〜8週齢Balb/Cマウスおよび5匹のSJLマウスに腹腔内注射した。16日目および26日目に、フロイント不完全アジュバントと混合した25μgの組み換え精製ヒトPD-1 ECD免疫原を同じマウスに腹腔内注射した。25μgの免疫原の最終追加免疫を融合の3〜4日前に与えた。
フロイント完全アジュバントと混合した50μgの組み換え精製ヒトPD-1細胞外ドメイン（ECD）ポリペプチドを1日目に5匹の6〜8週齢Balb/Cマウスおよび5匹のSJLマウスに腹腔内注射した。16日目および26日目に、フロイント不完全アジュバントと混合した25μgの組み換え精製ヒトPD-1 ECD免疫原を同じマウスに腹腔内注射した。25μgの免疫原の最終追加免疫を融合の3〜4日前に与えた。
実施例1.2：ハイブリドーマの生成
Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)に記載される、確立された方法に従って、実施例1.1に記載された免疫処置後マウスから得られた脾細胞をSP2/0-Ag-14細胞と5：1の比で融合させて、ハイブリドーマを生成した。96ウェルプレート中のヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）を含有する選択培地中に融合産物を1×105個の脾細胞／ウェルの密度で蒔いた。融合の7〜10日後に、肉眼的なハイブリドーマコロニーが観察された。
Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)に記載される、確立された方法に従って、実施例1.1に記載された免疫処置後マウスから得られた脾細胞をSP2/0-Ag-14細胞と5：1の比で融合させて、ハイブリドーマを生成した。96ウェルプレート中のヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）を含有する選択培地中に融合産物を1×105個の脾細胞／ウェルの密度で蒔いた。融合の7〜10日後に、肉眼的なハイブリドーマコロニーが観察された。
実施例1.3：ELISAおよびFACSによるPD-1結合活性の評価
PD-1特異的抗体の存在を以下のような酵素結合性免疫吸着アッセイ（ELISA）によってアッセイした。
PD-1特異的抗体の存在を以下のような酵素結合性免疫吸着アッセイ（ELISA）によってアッセイした。
最初に、Synbio Technologies（Suzhou, China）による注文に合わせて抗ヒトPD-1、抗カニクイザルPD-1および抗マウスPD-1に対する合成標的を作製した。各標的は、ヒト、カニクイザル、またはマウスPD-1タンパク質の細胞外ドメイン（ECD）のポリペプチドセグメントがヒトIgG Fc領域と融合したものからなった。各ECD-Fc融合タンパク質をコードする合成遺伝子をpCP発現ベクター（Chempartner, Shanghai, China）中にサブクローニングし、発現プラスミドを1〜3リットルの培地中のHEK 293E細胞内に一過性にトランスフェクトし、CO2振盪機で7日間培養した。各融合のために使用したECD配列を下記の表1に示す。各融合タンパク質のPD-1 ECD部分に下線を付ける。
（表１）PD-1 ECD-Fc融合タンパク質標的についてのアミノ酸配列
組み換えECD/Fc融合物を含有するHEK 293Eトランスフェクタントの上清を、4000×gで30分間遠心分離することによって回収し、続いてMabSelect SuRe（商標）アフィニティー樹脂（GE Healthcare）を使用するプロテインA精製を行った。融合産物をpH7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）に対して透析し、-80℃で保存した。
PBS緩衝液（pH7.4）中に1μg/mlとなるように希釈した上記の合成ヒトPD-1 ECD/Fc融合タンパク質標的50μlを有するELISAプレートを4℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液（0.05％ Tween 20を含有するPBS）中でプレートを4回洗浄し、200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（0.05％ Tween 20を含有するPBS中に1％のBSA）を用いて37℃で1時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去後、ウェルにハイブリドーマ上清（またはその後に希釈した精製mAb）を100μl/ウェルで添加し、37℃で1時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄し、マウス抗ヒトPD-1抗体の特徴決定のための抗マウスHRP（Sigma）を1：5000希釈し、ウェルに100μl/ウェルで添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、洗浄緩衝液中で4回洗浄した。テトラメチルベンジジン（TMB）発色溶液をウェル1つあたり100μl添加した。発色後、1規定のHClで反応を止め、SpectraMax（登録商標）M5eプレートリーダー（Molecular Devices； San Jose, California, US）で450nmの吸光度を測定した。
実施例1.4：PD-1発現細胞株の調製およびFACS分析
ヒトPD-1またはカニクイザルPD-1のいずれかをコードする挿入遺伝子を有するpLvxレンチウイルスプラスミドベクター（Clontech）をCHO-K1細胞（ATCCから入手）にトランスフェトすることによって、ヒトPD-1またはカニクイザルPD-1を過剰発現している安定細胞株を生成した。限界希釈によって単一のクローンを単離した。公知の抗体配列から組み換え産生された抗PD-1抗体（Chempartner）を使用するFACS分析によって、クローンを発現レベルについてスクリーニングし、PD-1の最高の発現を有するクローンを、下記のようなFACS結合アッセイおよび機能アッセイでの使用のために選択した。
ヒトPD-1またはカニクイザルPD-1のいずれかをコードする挿入遺伝子を有するpLvxレンチウイルスプラスミドベクター（Clontech）をCHO-K1細胞（ATCCから入手）にトランスフェトすることによって、ヒトPD-1またはカニクイザルPD-1を過剰発現している安定細胞株を生成した。限界希釈によって単一のクローンを単離した。公知の抗体配列から組み換え産生された抗PD-1抗体（Chempartner）を使用するFACS分析によって、クローンを発現レベルについてスクリーニングし、PD-1の最高の発現を有するクローンを、下記のようなFACS結合アッセイおよび機能アッセイでの使用のために選択した。
細胞表面標的についての結合アッセイ：精製抗体が細胞膜ヒトPD-1またはカニクイザルPD-1に結合する能力をFACS分析によって測定した。2％ FBSを含有しているPBS（FACS緩衝液）中に、ヒトPD-1を安定的に発現しているCHO-K1細胞（CHO-K1-hPD-1細胞）またはカニクイザルPD-1を安定的に発現しているCHO-K1細胞（CHO-K1-cynoPD-1）を再懸濁し、96ウェル丸底プレート（Corning； Cat. No. 3799）中に細胞2×104個の細胞／ウェルとなるように播種した。抗PD-1抗体を産生しているハイブリドーマの上清をウェルに添加し、AlexaFluor（登録商標）488ロバ抗マウスIgG（H+L）高交差吸着二次抗体（Invitrogen； Cat. No. A-21202）を用いて検出し、次いでアッセイプレートをフローサイトメーターで読み取った。CHO-K1/cynoPD-1細胞を使用して、ヒトPD-1発現標的に対してシグナル陽性の上清を産生しているハイブリドーマをさらに特徴決定して、抗体とカニクイザルPD-1との交差反応性を判定した。
実施例1.5：受容体ブロッキングアッセイ（RBA）
PD-1特異的活性を示している上清を、そのリガンドPD-L1およびPD-L2へのPD-1の結合を遮断する能力について、標的としての固定化ヒトPD-1 ECD/Fc、ならびに上記の実施例1.3に記載されるPD-1 ECD/Fc結合タンパク質と同様に調製したPD-L1/FcおよびPD-L2/Fc融合タンパク質を使用して試験した。抗体を含有する上清の相対力価を測定するために、それらがヒトPD-1タンパク質へのヒトPD-1リガンド（PD-L1またはPD-L2）の結合を阻害する能力を評価した。ELISAプレートにPBS中の50ng/ml huPD-1/Fc（すなわち、ホモ二量体として回収されたヒトFc領域のN末端に移植したPD-1の細胞外ドメイン）100μlをコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（Tween 20を0.05％含有するPBS）中で4回洗浄し、200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（Tween 20を0.05％含有するPBS中に1％のBSA）を用いて37℃で1時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去した後、ハイブリドーマ上清（50μl）をウェルに添加し、ブロッキング緩衝液中のビオチン化ヒトPD-L1/Fc（終濃度1.0mg/ml）50μlまたはブロッキング緩衝液中のビオチン化ヒトPD-L2/Fc（終濃度50μg/ml）50μlのいずれかと混合し、次いで、37℃で1時間インキュベートした。ストレプトアビジン-HRP（Sigma, Cat. No. S2468）（1：5000希釈のストレプトアビジン-HRPを100μl/ウェル）を添加し、37℃で40分間インキュベートすることによってシグナルを発生させ、洗浄緩衝液中で4回洗浄した。TMB溶液100μl/ウェルを添加した。発色後、1規定のHClで反応を止め、450nmの吸光度を測定した。
PD-1特異的活性を示している上清を、そのリガンドPD-L1およびPD-L2へのPD-1の結合を遮断する能力について、標的としての固定化ヒトPD-1 ECD/Fc、ならびに上記の実施例1.3に記載されるPD-1 ECD/Fc結合タンパク質と同様に調製したPD-L1/FcおよびPD-L2/Fc融合タンパク質を使用して試験した。抗体を含有する上清の相対力価を測定するために、それらがヒトPD-1タンパク質へのヒトPD-1リガンド（PD-L1またはPD-L2）の結合を阻害する能力を評価した。ELISAプレートにPBS中の50ng/ml huPD-1/Fc（すなわち、ホモ二量体として回収されたヒトFc領域のN末端に移植したPD-1の細胞外ドメイン）100μlをコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（Tween 20を0.05％含有するPBS）中で4回洗浄し、200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（Tween 20を0.05％含有するPBS中に1％のBSA）を用いて37℃で1時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去した後、ハイブリドーマ上清（50μl）をウェルに添加し、ブロッキング緩衝液中のビオチン化ヒトPD-L1/Fc（終濃度1.0mg/ml）50μlまたはブロッキング緩衝液中のビオチン化ヒトPD-L2/Fc（終濃度50μg/ml）50μlのいずれかと混合し、次いで、37℃で1時間インキュベートした。ストレプトアビジン-HRP（Sigma, Cat. No. S2468）（1：5000希釈のストレプトアビジン-HRPを100μl/ウェル）を添加し、37℃で40分間インキュベートすることによってシグナルを発生させ、洗浄緩衝液中で4回洗浄した。TMB溶液100μl/ウェルを添加した。発色後、1規定のHClで反応を止め、450nmの吸光度を測定した。
実施例1.6：抗PD-1モノクローナル抗体の発現および精製
マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞をFreeStyle（商標）293発現培地（Gibco/Life Technologies）に入れてCO2振盪機中、37℃で5〜7日間培養した。4000×gで30分間遠心分離することによって馴化培地を収集して、すべての細胞および細胞片を除去し、次いで0.22μmメンブランに通して濾過した後、精製した。製造業者のガイドラインに従ってMabSelect（商標）SuRe（GE Healthcare）プロテインA樹脂カラムにマウス抗体を適用し、結合させ、PBSで洗浄し、20mMクエン酸塩、150mM NaCl（pH3.5）を含有する緩衝液で溶出させた。溶出した物質を1M Tris（pH8.0）で直ちに中和し、PBSに対して透析した。SEC-HPLCによって検出したとき、一段階精製抗体は、通常90％を超える純度を有する。280nmの吸光度を測定することによって、またはNanoDrop（商標）微量分光光度計（Thermo Scientific）によって、タンパク質濃度を測定した。精製抗体を-80℃の冷凍庫に入れて一定分量で保存した。
マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞をFreeStyle（商標）293発現培地（Gibco/Life Technologies）に入れてCO2振盪機中、37℃で5〜7日間培養した。4000×gで30分間遠心分離することによって馴化培地を収集して、すべての細胞および細胞片を除去し、次いで0.22μmメンブランに通して濾過した後、精製した。製造業者のガイドラインに従ってMabSelect（商標）SuRe（GE Healthcare）プロテインA樹脂カラムにマウス抗体を適用し、結合させ、PBSで洗浄し、20mMクエン酸塩、150mM NaCl（pH3.5）を含有する緩衝液で溶出させた。溶出した物質を1M Tris（pH8.0）で直ちに中和し、PBSに対して透析した。SEC-HPLCによって検出したとき、一段階精製抗体は、通常90％を超える純度を有する。280nmの吸光度を測定することによって、またはNanoDrop（商標）微量分光光度計（Thermo Scientific）によって、タンパク質濃度を測定した。精製抗体を-80℃の冷凍庫に入れて一定分量で保存した。
実施例2：精製した抗PD-1抗体の結合活性
実施例2.1：ELISAによる特徴決定
上記の実施例1.3に記載されるものと同じ方法で結合ELISAを行った。各精製抗体を10倍段階希釈し、二つ組にした。固定化PD-1 ECD/Fc融合タンパク質標的を含有するウェルで96ウェルアッセイプレートをブロッキング後、希釈された濃度を有する精製抗体試料をアッセイプレートのウェルに添加した。HRP結合抗マウスIgG抗体（A0168, Sigma）およびTMB試薬を使用して、ELISAシグナルを検出および発生させ、それらをSpectraMax（登録商標）M5eプレートリーダーにより波長450nmで読み取った。GraphPadソフトウェアを用いて曲線をフィットさせ、EC50を計算した。同様に、抗体価測定された精製抗体を用いて実施例1.5に記載されるように受容体ブロッキングアッセイ（RBA）も行い、最高のブロッキング率およびIC50値を決定した。
実施例2.1：ELISAによる特徴決定
上記の実施例1.3に記載されるものと同じ方法で結合ELISAを行った。各精製抗体を10倍段階希釈し、二つ組にした。固定化PD-1 ECD/Fc融合タンパク質標的を含有するウェルで96ウェルアッセイプレートをブロッキング後、希釈された濃度を有する精製抗体試料をアッセイプレートのウェルに添加した。HRP結合抗マウスIgG抗体（A0168, Sigma）およびTMB試薬を使用して、ELISAシグナルを検出および発生させ、それらをSpectraMax（登録商標）M5eプレートリーダーにより波長450nmで読み取った。GraphPadソフトウェアを用いて曲線をフィットさせ、EC50を計算した。同様に、抗体価測定された精製抗体を用いて実施例1.5に記載されるように受容体ブロッキングアッセイ（RBA）も行い、最高のブロッキング率およびIC50値を決定した。
実施例2.2：FACSによる特徴決定
上記のCHO-K1/huPD-1細胞またはCHO-K1/cynoPD-1細胞を、96ウェルアッセイ丸底アッセイプレート（Cat. No. 3799； Corning）中に2×104個の細胞／ウェルでチャージし、精製した抗PD-1抗体で染色した。PD-1抗体を、AlexaFluor（登録商標）ロバ抗マウスIgG（H+L）高交差吸着二次抗体（Cat. No. A21202； Invitrogen）を用いて検出し、フローサイトメーターを使用して細胞蛍光をモニタリングした。GraphPadソフトウェアによりデータを処理し、EC50値を計算した。
上記のCHO-K1/huPD-1細胞またはCHO-K1/cynoPD-1細胞を、96ウェルアッセイ丸底アッセイプレート（Cat. No. 3799； Corning）中に2×104個の細胞／ウェルでチャージし、精製した抗PD-1抗体で染色した。PD-1抗体を、AlexaFluor（登録商標）ロバ抗マウスIgG（H+L）高交差吸着二次抗体（Cat. No. A21202； Invitrogen）を用いて検出し、フローサイトメーターを使用して細胞蛍光をモニタリングした。GraphPadソフトウェアによりデータを処理し、EC50値を計算した。
これらの結合特徴決定アッセイの結果を下記の表2に示す。
（表２）精製した抗PD-1抗体の結合活性
実施例2.3：表面プラズモン共鳴（SPR）による親和性測定
Biacore T200機器（GE Healthcare）を使用し、標準的な手法を用いる表面プラズモン共鳴によって精製抗体の結合動態を測定した。簡潔には、バイオセンサーチップの全域にヤギ抗マウスIgG Fcポリクローナル抗体（Genway）を直接固定化し、抗体試料を流速5μl/minで反応マトリックス上に注入した。連続流速30μl/minで会合速度定数および解離速度定数、それぞれkon（M-1s-1）およびkoff（s-1）を決定した。ヒトPD-1/Fcタンパク質の異なる5つの濃度で動態結合測定を行うことによって速度定数を得た。次いで、式KD=koff/konを用いて動態速度定数から抗体と関連標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数KD（M）を計算した。下記の表3に示すように、11種類のマウス抗PD-1抗体についての親和性を測定した。
Biacore T200機器（GE Healthcare）を使用し、標準的な手法を用いる表面プラズモン共鳴によって精製抗体の結合動態を測定した。簡潔には、バイオセンサーチップの全域にヤギ抗マウスIgG Fcポリクローナル抗体（Genway）を直接固定化し、抗体試料を流速5μl/minで反応マトリックス上に注入した。連続流速30μl/minで会合速度定数および解離速度定数、それぞれkon（M-1s-1）およびkoff（s-1）を決定した。ヒトPD-1/Fcタンパク質の異なる5つの濃度で動態結合測定を行うことによって速度定数を得た。次いで、式KD=koff/konを用いて動態速度定数から抗体と関連標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数KD（M）を計算した。下記の表3に示すように、11種類のマウス抗PD-1抗体についての親和性を測定した。
（表３）11種類の抗PD-1モノクローナル抗体についての親和性の測定
実施例3：抗PD-1抗体の機能的活性
1人のドナー由来の単球由来樹状細胞および別のドナー由来の同種CD4+ T細胞を使用して混合リンパ球反応（MLR）アッセイを行った。健康なドナーから全血試料を収集し、Ficoll-Pague勾配遠心分離を用いて全血からPBMCを単離した。1日目に、1人のドナー由来のPBMCを単離し、無血清RPMI 1640で1×106個/mlに希釈した。希釈されたPBMCを6ウェル組織培養プレート中に3ml/ウェルで播種し、3時間インキュベートした。上清を除去し、接着していない細胞を洗い流した。接着した単球を、10％ FBSを有するRPMI 1640中に250U/mlのIL-4および500U/mlのGM-CSFで樹状細胞に極性化させた。4日目にIL-4およびGM-CSFを含有する新鮮培地に培地を交換した。7日目に、未熟樹状細胞を収集し、10％ FBSを有するRPMI 1640中に1μg/mlの細菌リポ多糖（LPS）（Sigma）で追加的に24時間、成熟のために処理した。8日目に、別のドナー由来のPBMCから負の選択によりCD4+ T細胞を単離し、2×106個の細胞/mlの終濃度に調整した。成熟樹状細胞をマイトマイシンCにより37℃で1.5時間処理し、次いで、樹状細胞をPBSで洗浄し、1×106個の細胞/mlの終濃度に調整した。CD4+ T細胞（レスポンダー細胞）を100μl/ウェルで96ウェルプレート中に添加し、希釈された濃度の試験抗体で30分間前処理した。成熟樹状細胞（スティミュレーター細胞）を100μl/ウェルでウェルに添加した。各ウェルの最終体積は200μlである。混合されたリンパ球を37℃でインキュベートした。72時間後にIL-2の産生を測定した（図1Aおよび1B参照）；IFN-γを120時間目に測定した（図2Aおよび2B参照）。
1人のドナー由来の単球由来樹状細胞および別のドナー由来の同種CD4+ T細胞を使用して混合リンパ球反応（MLR）アッセイを行った。健康なドナーから全血試料を収集し、Ficoll-Pague勾配遠心分離を用いて全血からPBMCを単離した。1日目に、1人のドナー由来のPBMCを単離し、無血清RPMI 1640で1×106個/mlに希釈した。希釈されたPBMCを6ウェル組織培養プレート中に3ml/ウェルで播種し、3時間インキュベートした。上清を除去し、接着していない細胞を洗い流した。接着した単球を、10％ FBSを有するRPMI 1640中に250U/mlのIL-4および500U/mlのGM-CSFで樹状細胞に極性化させた。4日目にIL-4およびGM-CSFを含有する新鮮培地に培地を交換した。7日目に、未熟樹状細胞を収集し、10％ FBSを有するRPMI 1640中に1μg/mlの細菌リポ多糖（LPS）（Sigma）で追加的に24時間、成熟のために処理した。8日目に、別のドナー由来のPBMCから負の選択によりCD4+ T細胞を単離し、2×106個の細胞/mlの終濃度に調整した。成熟樹状細胞をマイトマイシンCにより37℃で1.5時間処理し、次いで、樹状細胞をPBSで洗浄し、1×106個の細胞/mlの終濃度に調整した。CD4+ T細胞（レスポンダー細胞）を100μl/ウェルで96ウェルプレート中に添加し、希釈された濃度の試験抗体で30分間前処理した。成熟樹状細胞（スティミュレーター細胞）を100μl/ウェルでウェルに添加した。各ウェルの最終体積は200μlである。混合されたリンパ球を37℃でインキュベートした。72時間後にIL-2の産生を測定した（図1Aおよび1B参照）；IFN-γを120時間目に測定した（図2Aおよび2B参照）。
実施例4：抗PD-1 mAbのクローニングおよび配列分析
TRIzol試薬（Cat. No. 15596； Invitrogen）を用いて＞5×106個の細胞から各ハイブリドーマクローンの総RNAを単離した。SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix（Cat. No. 18080； Invitrogen）によってcDNAを合成し、マウスIg-プライマーセットのPCR鋳型（Cat. No. 69831-3； Novagen）として適用した。SYBR（商標）Safe DNAゲル染料（Invitrogen）を有する1.2％アガロースゲル上の電気泳動によってPCR産物を分析した。製造業者の説明書に従ってNucleoSpin（登録商標）ゲルおよびPCR Clean-up（Cat. No. 740609; Macherey-Nagel GmbH）を用いて正しいサイズのDNAフラグメントを精製し、個別にpMD18-Tベクター（Sino Biological Inc.）にサブクローニングした。各形質転換からの15個のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をDNA配列決定により分析した。配列の少なくとも8つがVHおよびVLについてのコンセンサス配列とマッチするかどうかを確認した。配列相同性アライメントによってマウス抗PD-1 mAb可変領域のタンパク質配列を分析し、表4に記載する。Kabat番号付けに基づき相補性決定領域（CDR）を同定し、下記の表4に下線を付けて示す。
TRIzol試薬（Cat. No. 15596； Invitrogen）を用いて＞5×106個の細胞から各ハイブリドーマクローンの総RNAを単離した。SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix（Cat. No. 18080； Invitrogen）によってcDNAを合成し、マウスIg-プライマーセットのPCR鋳型（Cat. No. 69831-3； Novagen）として適用した。SYBR（商標）Safe DNAゲル染料（Invitrogen）を有する1.2％アガロースゲル上の電気泳動によってPCR産物を分析した。製造業者の説明書に従ってNucleoSpin（登録商標）ゲルおよびPCR Clean-up（Cat. No. 740609; Macherey-Nagel GmbH）を用いて正しいサイズのDNAフラグメントを精製し、個別にpMD18-Tベクター（Sino Biological Inc.）にサブクローニングした。各形質転換からの15個のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をDNA配列決定により分析した。配列の少なくとも8つがVHおよびVLについてのコンセンサス配列とマッチするかどうかを確認した。配列相同性アライメントによってマウス抗PD-1 mAb可変領域のタンパク質配列を分析し、表4に記載する。Kabat番号付けに基づき相補性決定領域（CDR）を同定し、下記の表4に下線を付けて示す。
（表４）8種類の抗PD-1マウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列
実施例5：マウス抗PD-1抗体のヒト化
ヒトPD-1の結合活性、カニクイザルPD-1のヒトとの交差反応類似性、RBAアッセイにおけるほぼ100％のブロッキング活性、MLRにおける機能的活性およびBiacoreによって測定される少なくともナノモルの親和性に基づき、4種類の抗PD-1抗体、mAb709、mAb713、mAb703、およびmAb719をヒト化のために選択した。
ヒトPD-1の結合活性、カニクイザルPD-1のヒトとの交差反応類似性、RBAアッセイにおけるほぼ100％のブロッキング活性、MLRにおける機能的活性およびBiacoreによって測定される少なくともナノモルの親和性に基づき、4種類の抗PD-1抗体、mAb709、mAb713、mAb703、およびmAb719をヒト化のために選択した。
実施例5.1：マウス抗体mAb709のヒト化
mAb709可変領域遺伝子を用いてヒト化抗体を生成した。この工程の第1の段階で、全体的にもっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見つけるために、mAb709のVHおよびVLのアミノ酸配列をヒトIg V遺伝子配列の使用可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4セグメントをJ領域データベースと比較して、マウスVHおよびVL領域とそれぞれ最高の相同性を有するヒトフレームワークを見出した。軽鎖について、もっとも近いヒトV遺伝子のマッチはO12遺伝子であり；重鎖について、もっとも近いヒトマッチはVH3-7遺伝子であった。次いで、mAb709軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がO12遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb709重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3がVH3-7のフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH1フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb709の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入すべきである。軽鎖の場合、位置71でのPheからTyrへの逆変異（F71Y、Kabat番号付け）、位置49でのTyrからSerへの逆変異（Y49S、Kabat番号付け）、位置3でのGlnからValへの逆変異（Q3V、Kabat番号付け）、位置46でのLeuからValへの逆変異（L46V、Kabat番号付け）、位置63でのSerからThr（S63T、Kabat番号付け）、位置43でのAlaからSerへの逆変異（A43S、Kabat番号付け）、および位置44でのProからLeuへの逆変異（P44L、Kabat番号付け）を望ましい逆変異として同定した。重鎖の場合、位置98でのArgからGlyへの変異（R94G、Kabat番号付けによる）、および位置44でのGlyからArgへの変異（G44R、Kabat番号付けによる）を、望ましい逆変異として同定した。これらの逆変異のうち1つまたは複数を含有する変異型可変ドメインを構築した。下記の表5を参照されたい。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
を付けて表示し；元の親抗体由来のマウスCDRに下線を付ける。）
mAb709可変領域遺伝子を用いてヒト化抗体を生成した。この工程の第1の段階で、全体的にもっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見つけるために、mAb709のVHおよびVLのアミノ酸配列をヒトIg V遺伝子配列の使用可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4セグメントをJ領域データベースと比較して、マウスVHおよびVL領域とそれぞれ最高の相同性を有するヒトフレームワークを見出した。軽鎖について、もっとも近いヒトV遺伝子のマッチはO12遺伝子であり；重鎖について、もっとも近いヒトマッチはVH3-7遺伝子であった。次いで、mAb709軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がO12遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb709重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3がVH3-7のフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH1フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb709の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入すべきである。軽鎖の場合、位置71でのPheからTyrへの逆変異（F71Y、Kabat番号付け）、位置49でのTyrからSerへの逆変異（Y49S、Kabat番号付け）、位置3でのGlnからValへの逆変異（Q3V、Kabat番号付け）、位置46でのLeuからValへの逆変異（L46V、Kabat番号付け）、位置63でのSerからThr（S63T、Kabat番号付け）、位置43でのAlaからSerへの逆変異（A43S、Kabat番号付け）、および位置44でのProからLeuへの逆変異（P44L、Kabat番号付け）を望ましい逆変異として同定した。重鎖の場合、位置98でのArgからGlyへの変異（R94G、Kabat番号付けによる）、および位置44でのGlyからArgへの変異（G44R、Kabat番号付けによる）を、望ましい逆変異として同定した。これらの逆変異のうち1つまたは複数を含有する変異型可変ドメインを構築した。下記の表5を参照されたい。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
（表５）マウス残基への逆変異を有するmAb709についてのヒト化VH/VLの設計
ヒト化VHおよびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中にそれぞれクローニングした。（下記の表6参照。）
（表６）抗体ヒト化に使用されるヒト定常領域配列
ヒト化VH鎖とヒト化VK鎖との対形成により、HumAb709-1〜HumAb709-15という名の15種類のヒト化抗体を生成した（表7）。親マウスVH/VLおよびヒト定常領域配列を有するキメラ抗体（mAb709c）もまた、親和性比較のための陽性対照として産生した。すべての組み換えmAbを発現させ、精製した。
（表７）抗PD-1ヒト化mAb709抗体の産物リスト
15種類のヒト化抗体すべて、およびキメラ抗体（mAb709c）は、結合ELISAおよび細胞に基づくRBAによって特徴決定された。細胞に基づくRBAについて、2×105個の細胞／ウェルのCHO-K1-huPD1細胞をブロッキング前の96ウェル丸底プレートに添加し、洗浄後、0.064nM〜200nMの範囲の希釈濃度を有する50μlの抗体を各ウェルに添加した。次に、50μlの60μg/mlビオチン化PD-L1/Fcまたはビオチン化PD-L2/Fcタンパク質を添加した。やさしく混合し、4℃でインキュベートした後、細胞を洗浄し、Alexa Fluor（商標）488ストレプトアビジン溶液（1：1000, ThermoFisher Scientific; Cat. No. S32354）によって染色した。FACSによってシグナルを読み取り、GraphPadソフトウェアによって曲線をフィットさせた。計算したIC50値を下記の表8に示す。Biacore T200機器を使用する表面プラズモン共鳴測定によって、正の（低い）IC50値（すなわち、少なくとも1つのPD-1リガンドに対して約1.0nM未満）を有する抗体を結合親和性についてさらに分析した。簡潔には、バイオセンサーチップの全域にヤギ抗マウスIgG Fcポリクローナル抗体を直接固定化し、抗PD-1ヒト化抗体試料またはキメラ抗体試料を流速5μl/minで反応マトリックス上に注入した。連続流速30μl/minでヒトPD-1-Hisタンパク質の異なる5つの濃度で動態結合測定を行うことによって会合速度定数および解離速度定数、それぞれkon（M-1s-1）およびkoff（s-1）を決定した。式KD=koff/konを用いて動態速度定数から抗体と関連標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数KD（M）を計算した。mAb709ヒト化抗PD-1誘導体のうちの5つについての親和性を表8に示す。HumAb709-8は、最小の逆変異を有した一方で、キメラmAb709c上の親可変ドメインの親和性を最大限に維持していた。
（表８）ヒト化mAb709抗PD-1抗体についてのRBA値および結合親和性
実施例5.2：マウス抗体mAb713のヒト化
抗PD-1 mAb713についての可変領域遺伝子を用いて、ヒト化抗体を生成した。全体的にもっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見つけるために、mAb713のVHおよびVKのアミノ酸配列をヒトIg V遺伝子配列の使用可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4セグメントをJ領域データベースと比較して、マウスVHおよびVL領域とそれぞれ最高の相同性を有するフレームワークを見い出した。軽鎖について、ヒトV遺伝子ともっともよくマッチしたのはO18遺伝子であり；重鎖について、ヒトともっともよくマッチしたのはVH3-48遺伝子であった。次いで、mAb713軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がO18遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb713重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3がVH3-48のフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH6フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb709の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入されるべきである。軽鎖の場合、位置71でのPheからTyrへの逆変異（F71Y、Kabat番号付け）、位置49でのTyrからSerへの逆変異（Y49S、Kabat番号付け）、および位置69でのThrからLysへの逆変異（T69K、Kabat番号付け）を望ましい逆変異として同定した。重鎖の場合、位置98でのArgからLysへの変異（R94K、Kabat番号付けによる）、位置29でのPheからSerへの逆変異（F29S、Kabat番号付け）、および位置49でのSerからAlaへの逆変異（S49A、Kabat番号付け）を、望ましい逆変異として同定した。これらの逆変異のうち1つまたは複数を含有する変異型可変ドメインを構築した。下記の表9を参照されたい。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
を付けて表示し；元の親抗体由来のマウスCDRに下線を付ける。）
抗PD-1 mAb713についての可変領域遺伝子を用いて、ヒト化抗体を生成した。全体的にもっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見つけるために、mAb713のVHおよびVKのアミノ酸配列をヒトIg V遺伝子配列の使用可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4セグメントをJ領域データベースと比較して、マウスVHおよびVL領域とそれぞれ最高の相同性を有するフレームワークを見い出した。軽鎖について、ヒトV遺伝子ともっともよくマッチしたのはO18遺伝子であり；重鎖について、ヒトともっともよくマッチしたのはVH3-48遺伝子であった。次いで、mAb713軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がO18遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb713重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3がVH3-48のフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH6フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb709の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入されるべきである。軽鎖の場合、位置71でのPheからTyrへの逆変異（F71Y、Kabat番号付け）、位置49でのTyrからSerへの逆変異（Y49S、Kabat番号付け）、および位置69でのThrからLysへの逆変異（T69K、Kabat番号付け）を望ましい逆変異として同定した。重鎖の場合、位置98でのArgからLysへの変異（R94K、Kabat番号付けによる）、位置29でのPheからSerへの逆変異（F29S、Kabat番号付け）、および位置49でのSerからAlaへの逆変異（S49A、Kabat番号付け）を、望ましい逆変異として同定した。これらの逆変異のうち1つまたは複数を含有する変異型可変ドメインを構築した。下記の表9を参照されたい。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
（表９）mAb713 VHおよびVLについての可変ドメイン配列バリアント
ヒト化VHおよびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中に個別にクローニングした（前記の表6参照）。ヒトVHバリアントとヒトVKバリアントとの対形成により、HumAb713-1〜HumAb713-16という名の16種類のヒト化抗体を生成した（表10）。親マウスVH/VLおよびヒト定常配列を有するキメラ抗体（mAb713c）も親和性比較のための陽性対照として産生した。
（表１０）ヒト化mAb713抗PD-1抗体の産物リスト
16種類のヒト化抗体すべて、およびキメラ抗体（mAb713c）は結合ELISA、細胞に基づくRBA、およびBiacore親和性試験によって特徴決定された。結果を表11にまとめる。
（表１１）ヒト化mAb713 抗PD-1抗体についてのRBA値および結合親和性
HumAb713-7は、最小の逆変異を有し、一方キメラ抗体mAb713cの親可変ドメインの親和性特徴を維持していた。実施例3に記載されるMLRアッセイでmAb713ヒト化抗体の機能的活性を検証した。図5から分かるように、HumAb713-7は、それが結合特性を保持したことと一致して、MLRにおいてキメラ抗体mAb713cに匹敵する活性を示した。
実施例5.3：マウス抗体mAb703のヒト化
実施例5.1および5.2と同じ手法に従って、マウス抗PD-1抗体mAb703を選択し、ヒト化した。いくつかが1つまたは複数の逆変異を含有するヒト化可変ドメインを構築し、そのアミノ酸配列を下記の表12に示す。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
を付けて表示し；元の親抗体由来のマウスCDRに下線を付ける。）
実施例5.1および5.2と同じ手法に従って、マウス抗PD-1抗体mAb703を選択し、ヒト化した。いくつかが1つまたは複数の逆変異を含有するヒト化可変ドメインを構築し、そのアミノ酸配列を下記の表12に示す。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
（表１２）mAb703 VHおよびVLについての可変ドメイン配列バリアント
ヒト化VHおよびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中に個別にクローニングした（前記の表6参照）。ヒトVHバリアントとヒトVKバリアントとの対形成により、HumAb703-1〜HumAb703-25という名の25種類のヒト化抗体を生成した（表13）。親マウスVH/VLおよびヒト定常配列を有するキメラ抗体も親和性比較のための陽性対照として産生した。
（表１３）ヒト化mAb703抗PD-1抗体の産物リスト
25種類のヒト化抗体すべて、およびキメラ抗体（mAb703c）は結合ELISAおよびBiacore親和性試験によって特徴決定された。陽性結合物質についての親和性の結果を表14にまとめる。
（表１４）選択されたヒト化mAb703抗PD-1抗体についての結合親和性
図2Aおよび3に示すように、ヒト化mAb703抗体の機能的活性を実施例3に記載されるように行ったMLRアッセイで検証した。
実施例5.4：マウス抗体mAb719のヒト化
実施例5.1および5.2と同じ手法に従って、マウス抗PD-1抗体mAb719を選択し、ヒト化した。いくつかが1つまたは複数の逆変異を含有するヒト化可変ドメインを構築し、そのアミノ酸配列を下記の表15に示す。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
を付けて表示し；元の親抗体由来のマウスCDRに下線を付ける。）加えて、CDR-H2にAsp→Ala置換およびCDR-H3にSer→Ala置換を行って、組み換え抗体にしばしば見られるAspが異性化する可能性を回避した。（表15におけるmAb719 VH.1EおよびmAb719 VH.1F配列を参照されたい。）
実施例5.1および5.2と同じ手法に従って、マウス抗PD-1抗体mAb719を選択し、ヒト化した。いくつかが1つまたは複数の逆変異を含有するヒト化可変ドメインを構築し、そのアミノ酸配列を下記の表15に示す。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
（表１５）mAb719 VHおよびVLについての可変ドメイン配列バリアント
ヒト化VH遺伝子およびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中に個別にクローニングした（前記の表6参照）。ヒトVHバリアントとヒトVKバリアントとの対形成によって、HumAb719-1〜HumAb719-21という名の21種類のヒト化抗体を生成した（表16）。親マウスVH/VLおよびヒト定常配列を有するキメラ抗体も親和性比較のための陽性対照として産生した。すべての組み換えmAbを発現させ、精製した。
（表１６）ヒト化mAb719抗PD-1抗体についての産物リスト
21種類のヒト化抗体すべて、およびキメラ抗体（mAb719c）は、結合ELISAおよび抗体標的として固定化ヒトPD-1/Fcを有するバイオセンサーを使用するOctet（登録商標）RED96バイオレイヤー干渉システム（Pall ForteBio LLC）を使用する親和性測定によって特徴決定された。抗体の5つの異なる濃度で速度論的結合測定を行うことによって速度定数を得た。二価結合性の標的が原因で、これらの親和性は、以前のBiacore試験よりも高く示された。陽性結合物質についての親和性の結果を表17にまとめる。
（表１７）選択されたヒト化mAb719抗PD-1抗体についての結合親和性
図2Bおよび3に示すように、ヒト化mAb719抗体の機能的活性をMLRアッセイで検証した。
実施例6：リード抗PD-1抗体の薬物動態特性
HumAb709-8およびHumAb713-7の薬物動態特性を雄性Sprague-Dawley（SD）ラットにおいて評価した。雄性SDラットに5mg/kgの静脈内単回用量で抗体を投与した。28日間にわたり異なる時点で、0、5、15、および30分；1、2、4、8、および24時間；ならびに2、4、7、10、14、21、および28日に尾静脈を介して経時的に採血して血清試料を収集し、一般的なELISAによって分析した。簡潔には、ELISAプレートに125ng/ウェルのヤギ抗ヒトIgG Fc抗体（Rockland, Cat#： 609-101-017）を4℃で一晩コーティングし、1×PBS/1％ BSA/0.05％ Tween-20/0.05％ ProClin（商標）300でブロッキングした。最初にすべての血清試料をブロッキング緩衝液中に20倍希釈した。5％プールラット血清中に追加的な希釈を行い、プレート上、37℃で60分間インキュベートした。抗ヒトIgG（Fabフラグメント）ペルオキシダーゼコンジュゲート型（Sigma; Cat. No. A0293）を用いて検出を実行し、4パラメーターロジスティックフィットを用いて標準曲線の助けを借りて濃度を測定した。WinNonlinソフトウェア（Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.）を使用して非コンパートメントモデルによって薬物動態パラメーターについての値を決定した。これらの結果によって実証されるように（表18）、HumAb09-8およびHumAb13-7の特性は安定している。
HumAb709-8およびHumAb713-7の薬物動態特性を雄性Sprague-Dawley（SD）ラットにおいて評価した。雄性SDラットに5mg/kgの静脈内単回用量で抗体を投与した。28日間にわたり異なる時点で、0、5、15、および30分；1、2、4、8、および24時間；ならびに2、4、7、10、14、21、および28日に尾静脈を介して経時的に採血して血清試料を収集し、一般的なELISAによって分析した。簡潔には、ELISAプレートに125ng/ウェルのヤギ抗ヒトIgG Fc抗体（Rockland, Cat#： 609-101-017）を4℃で一晩コーティングし、1×PBS/1％ BSA/0.05％ Tween-20/0.05％ ProClin（商標）300でブロッキングした。最初にすべての血清試料をブロッキング緩衝液中に20倍希釈した。5％プールラット血清中に追加的な希釈を行い、プレート上、37℃で60分間インキュベートした。抗ヒトIgG（Fabフラグメント）ペルオキシダーゼコンジュゲート型（Sigma; Cat. No. A0293）を用いて検出を実行し、4パラメーターロジスティックフィットを用いて標準曲線の助けを借りて濃度を測定した。WinNonlinソフトウェア（Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.）を使用して非コンパートメントモデルによって薬物動態パラメーターについての値を決定した。これらの結果によって実証されるように（表18）、HumAb09-8およびHumAb13-7の特性は安定している。
（表１８）HumAb709-8およびHumAb713-7の薬物動態特性
実施例7：抗LAG-3モノクローナル抗体の生成
抗LAG-3モノクローナル抗体（mAb）をハイブリドーマ融合によって生成した。
抗LAG-3モノクローナル抗体（mAb）をハイブリドーマ融合によって生成した。
実施例7.1：免疫処置、ハイブリドーマ融合、およびクローニング
ヒトLAG-3 D1-D2/マウスFcホモ二量体を免疫原として使用することを除き、抗PD-1抗体生成について上に記載した方法（実施例1）と同じようにBalb/Cマウスの免疫処置を行った。免疫処置された動物を2〜3週間間隔で2〜4回追加免疫した。最終の追加免疫の3日後に、免疫処置されたマウス由来の脾細胞を単離し、標準的な技術を用いてマウス骨髄腫細胞株、SP2/0と融合させた。
ヒトLAG-3 D1-D2/マウスFcホモ二量体を免疫原として使用することを除き、抗PD-1抗体生成について上に記載した方法（実施例1）と同じようにBalb/Cマウスの免疫処置を行った。免疫処置された動物を2〜3週間間隔で2〜4回追加免疫した。最終の追加免疫の3日後に、免疫処置されたマウス由来の脾細胞を単離し、標準的な技術を用いてマウス骨髄腫細胞株、SP2/0と融合させた。
実施例7.2：抗LAG-3抗体の同定および特徴決定
Synbio Technologies（Suzhou, China）による注文に合わせて抗ヒトLAG-3および抗カニクイザルLAG-3についての合成標的を作製した。各標的は、ヒトまたはカニクイザルLAG-3タンパク質の細胞外ドメインのポリペプチドセグメントがヒトIgG Fc領域と融合したものからなった。各LAG-3 ECD/Fc融合タンパク質をコードする合成遺伝子をpCP発現ベクター（Chempartner, Shanghai, CN）中にサブクローニングし、発現プラスミドを1〜3リットルの培地中のHEK 293E細胞内に一過性にトランスフェクトし、CO2振盪機で7日間培養した。各融合のために使用したECD配列を下記の表19に示す。各融合タンパク質のLAG-3 ECD部分に下線を付ける。
Synbio Technologies（Suzhou, China）による注文に合わせて抗ヒトLAG-3および抗カニクイザルLAG-3についての合成標的を作製した。各標的は、ヒトまたはカニクイザルLAG-3タンパク質の細胞外ドメインのポリペプチドセグメントがヒトIgG Fc領域と融合したものからなった。各LAG-3 ECD/Fc融合タンパク質をコードする合成遺伝子をpCP発現ベクター（Chempartner, Shanghai, CN）中にサブクローニングし、発現プラスミドを1〜3リットルの培地中のHEK 293E細胞内に一過性にトランスフェクトし、CO2振盪機で7日間培養した。各融合のために使用したECD配列を下記の表19に示す。各融合タンパク質のLAG-3 ECD部分に下線を付ける。
（表１９）LAG-3 ECD/Fc融合タンパク質標的についてのアミノ酸配列
ハイブリドーマクローンの上清をまずELISAによってスクリーニングした。簡潔には、NaHCO3中に1μg/mlのヒトLAG-3 ECD/Fcを50μl/ウェルで96ウェルプレートの各ウェルに一晩直接コーティングした。プレートを300μl/ウェルの1×PBSTで3回洗浄した。250μl/ウェルのPBST中1％のBSAでブロッキングし、室温で1時間インキュベーション後、ハイブリドーマ上清を50μl/ウェルで添加し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、HRP結合型ヤギ抗マウスIgG Fc二次抗体（Cat. No. A0168、Sigma）を100μl/ウェルで添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。100μl/ウェルでTMB試薬（InnoReagents）を使用して、ELISAシグナルを15分間検出および発生させ、1規定のHClで反応を止めた。プレートリーダー（SpectraMax（登録商標）M5e, Molecular Devices, USA）を用いて波長450nmでプレートを読み取った。ヒトLAG-3またはカニクイザルLAG-3のいずれかを発現している安定なHEK 293F細胞株を使用したことを除き、ELISA陽性抗体産生クローンを上記の実施例1.4と類似の方法を用いるFACS分析によってさらに検証した。LAG-3結合活性を産生しているハイブリドーマを選択し、受容体ブロッキングアッセイ（RBA）でさらに特徴決定した。
実施例7.3：受容体ブロッキングアッセイ（RBA）
MHCクラスIIへのLAG-3受容体の結合を遮断する能力について、LAG-3特異的活性を示す上清を試験した。RajiヒトB細胞リンパ芽球は、高レベルのMCHクラスIIを発現し、これを上記のLAG-3 ECD/Fcタンパク質についての結合標的として使用した。簡潔には、Raji細胞を回収し、FACS緩衝液中に再懸濁し、96ウェルプレート中に蒔いた（2×105個の細胞／ウェル）。抗LAG-3ハイブリドーマ上清を可溶性LAG-3 ECD/Fcと混合し、混合物を終体積100μl/ウェルでウェルに添加した。混合物を細胞に添加した後、プレートを室温で30分間インキュベートした。PBSで2回洗浄後、細胞を抗ヒトIgG Alexa Fluor（登録商標）488二次抗体と共に4℃で1時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、次いで蛍光をフローサイトメーターで測定した。
MHCクラスIIへのLAG-3受容体の結合を遮断する能力について、LAG-3特異的活性を示す上清を試験した。RajiヒトB細胞リンパ芽球は、高レベルのMCHクラスIIを発現し、これを上記のLAG-3 ECD/Fcタンパク質についての結合標的として使用した。簡潔には、Raji細胞を回収し、FACS緩衝液中に再懸濁し、96ウェルプレート中に蒔いた（2×105個の細胞／ウェル）。抗LAG-3ハイブリドーマ上清を可溶性LAG-3 ECD/Fcと混合し、混合物を終体積100μl/ウェルでウェルに添加した。混合物を細胞に添加した後、プレートを室温で30分間インキュベートした。PBSで2回洗浄後、細胞を抗ヒトIgG Alexa Fluor（登録商標）488二次抗体と共に4℃で1時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、次いで蛍光をフローサイトメーターで測定した。
実施例7.4：抗LAG-3モノクローナル抗体の発現および精製
マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞をFreeStyle（商標）293発現培地（Gibco/Life Technologies）に入れてCO2振盪機中、37℃で5〜7日間培養した。4000×gで30分間遠心分離することによって馴化培地を収集して、すべての細胞および細胞片を除去し、次いで0.22μmメンブランに通して濾過した後、精製した。製造業者のガイドラインに従ってMabSelect（商標）SuRe（GE Healthcare）プロテインA樹脂カラムにマウス抗体を適用し、結合させ、PBSで洗浄し、20mMクエン酸塩、150mM NaCl（pH3.5）を含有する緩衝液で溶出させた。溶出した物質を1M Tris（pH8.0）で直ちに中和し、PBSに対して透析した。SEC-HPLCにより検出したとき、一段階精製抗体は、通常90％を超える純度を有する。280nmの吸光度を測定することによって、またはNanoDrop（商標）微量分光光度計（Thermo Scientific）によって、タンパク質濃度を測定した。精製抗体を-80℃の冷凍庫に入れて一定分量で保存した。
マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞をFreeStyle（商標）293発現培地（Gibco/Life Technologies）に入れてCO2振盪機中、37℃で5〜7日間培養した。4000×gで30分間遠心分離することによって馴化培地を収集して、すべての細胞および細胞片を除去し、次いで0.22μmメンブランに通して濾過した後、精製した。製造業者のガイドラインに従ってMabSelect（商標）SuRe（GE Healthcare）プロテインA樹脂カラムにマウス抗体を適用し、結合させ、PBSで洗浄し、20mMクエン酸塩、150mM NaCl（pH3.5）を含有する緩衝液で溶出させた。溶出した物質を1M Tris（pH8.0）で直ちに中和し、PBSに対して透析した。SEC-HPLCにより検出したとき、一段階精製抗体は、通常90％を超える純度を有する。280nmの吸光度を測定することによって、またはNanoDrop（商標）微量分光光度計（Thermo Scientific）によって、タンパク質濃度を測定した。精製抗体を-80℃の冷凍庫に入れて一定分量で保存した。
実施例7.5：精製した抗LAG-3抗体の結合活性
ELISAによる特徴決定
上記の実施例7.2に記載されるものと同じ方法で結合ELISAを行った。各精製抗体を10倍段階希釈した。固定化LAG-3 ECD/Fc融合タンパク質標的を含有するウェルで96ウェルアッセイプレートをブロッキング後、希釈された濃度を有する精製抗体試料をアッセイプレートのウェルに添加した。HRP結合抗マウスIgG抗体（A0168, Sigma）およびTMB試薬を使用して、ELISAシグナルを検出および発生させ、それらをSpectraMax（登録商標）M5eプレートリーダーにより波長450nmで読み取った。GraphPadソフトウェアを用いて曲線をフィットさせ、EC50値を計算した。同様に、実施例7.3に記載されるように抗体価測定された精製抗体を用いてRBAも行い、最大の阻害率およびIC50値を決定した。
ELISAによる特徴決定
上記の実施例7.2に記載されるものと同じ方法で結合ELISAを行った。各精製抗体を10倍段階希釈した。固定化LAG-3 ECD/Fc融合タンパク質標的を含有するウェルで96ウェルアッセイプレートをブロッキング後、希釈された濃度を有する精製抗体試料をアッセイプレートのウェルに添加した。HRP結合抗マウスIgG抗体（A0168, Sigma）およびTMB試薬を使用して、ELISAシグナルを検出および発生させ、それらをSpectraMax（登録商標）M5eプレートリーダーにより波長450nmで読み取った。GraphPadソフトウェアを用いて曲線をフィットさせ、EC50値を計算した。同様に、実施例7.3に記載されるように抗体価測定された精製抗体を用いてRBAも行い、最大の阻害率およびIC50値を決定した。
FACSによる特徴決定
ヒトLAG-3またはカニクイザルLAG-3のいずれかを発現している安定HEK 293F細胞株を使用したことを除き、上記実施例1.4と類似の方法を用いたFACS分析を行った。LAG-3発現細胞を2×104個の細胞／ウェルで96ウェルアッセイ丸底アッセイプレート（Cat. No. 3799; Corning）中にチャージし、精製した抗LAG-3抗体で染色した。LAG-3抗体をAlexaFluor（登録商標）ロバ抗マウスIgG（H+L）高交差吸着二次抗体（Cat. No. A21202; Invitrogen）を用いて検出し、フローサイトメーターを用いて細胞蛍光をモニタリングした。GraphPadソフトウェアによってデータを処理し、EC50値を計算した。
ヒトLAG-3またはカニクイザルLAG-3のいずれかを発現している安定HEK 293F細胞株を使用したことを除き、上記実施例1.4と類似の方法を用いたFACS分析を行った。LAG-3発現細胞を2×104個の細胞／ウェルで96ウェルアッセイ丸底アッセイプレート（Cat. No. 3799; Corning）中にチャージし、精製した抗LAG-3抗体で染色した。LAG-3抗体をAlexaFluor（登録商標）ロバ抗マウスIgG（H+L）高交差吸着二次抗体（Cat. No. A21202; Invitrogen）を用いて検出し、フローサイトメーターを用いて細胞蛍光をモニタリングした。GraphPadソフトウェアによってデータを処理し、EC50値を計算した。
これらの結合特徴決定アッセイの結果を下記の表20に示す。
（表２０）精製マウス抗LAG-3抗体の結合活性
この表では「N/A」は測定された結合活性なしを意味する。
実施例7.6：RBAおよび抗原依存性活性化アッセイによる特徴決定
実施例7.3に記載されたものと同じように、精製した抗LAG-3抗体もRBAで試験した。抗体を以下のような抗原特異的T細胞活性化アッセイでも試験した：ChemPartner（Shanghai, CN）による注文に合わせてhuLAG-3発現マウスTハイブリドーマ細胞株を生成した。同じ系統のマウス由来のマウス脾細胞をエフェクター細胞として使用した。huLAG-3受容体タンパク質を発現しているハイブリドーマは、MHCクラスII陽性マウス脾細胞に結合することが可能であり、クラスIIの会合による阻害効果を有する。このアッセイは、IL-2の産生増大により測定される阻害効果の抗LAG-3抗体媒介性後退について試験するものである。マウス脾細胞を6〜8週齢雌C57BL/6マウスから回収し、赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich; R7757）を使用して製造業者の説明書に従って赤血球を溶解させた。次に、Tハイブリドーマ-huLAG-3細胞（2×106個/ml）50μlを96ウェル培養プレートの各ウェル中に播種し、次いで溶液中の一連の抗LAG-3モノクローナル抗体を50μl/ウェルで添加し、37℃で30分間インキュベートした。マウス脾細胞（4×106個/ml）および抗原（20μg/ml）を混合し、37℃で30分間インキュベートした。Tハイブリドーマ-huLAG-3細胞および抗LAG-3 mAbがすでに播種された各ウェルの中に混合物（100μl/ウェル）を添加した。抗体、Tハイブリドーマ-huLAG-3細胞、マウス脾細胞、および抗原の混合物を3日間培養した。72時間後に、細胞培養上清100μlを吸引し、R&D Systems ELISAキットを製造業者のプロトコールに従って使用してマウスIL-2定量ELISAを行うために適した濃度に希釈した。ELISA-Endpoint-TMB & HRPプロトコールを使用して、ELISAプレートをSpectraMax M5プレートリーダー（Molecular Devices）で読み取った。RBAおよび抗原依存性活性化アッセイの結果を表21に示す。
実施例7.3に記載されたものと同じように、精製した抗LAG-3抗体もRBAで試験した。抗体を以下のような抗原特異的T細胞活性化アッセイでも試験した：ChemPartner（Shanghai, CN）による注文に合わせてhuLAG-3発現マウスTハイブリドーマ細胞株を生成した。同じ系統のマウス由来のマウス脾細胞をエフェクター細胞として使用した。huLAG-3受容体タンパク質を発現しているハイブリドーマは、MHCクラスII陽性マウス脾細胞に結合することが可能であり、クラスIIの会合による阻害効果を有する。このアッセイは、IL-2の産生増大により測定される阻害効果の抗LAG-3抗体媒介性後退について試験するものである。マウス脾細胞を6〜8週齢雌C57BL/6マウスから回収し、赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich; R7757）を使用して製造業者の説明書に従って赤血球を溶解させた。次に、Tハイブリドーマ-huLAG-3細胞（2×106個/ml）50μlを96ウェル培養プレートの各ウェル中に播種し、次いで溶液中の一連の抗LAG-3モノクローナル抗体を50μl/ウェルで添加し、37℃で30分間インキュベートした。マウス脾細胞（4×106個/ml）および抗原（20μg/ml）を混合し、37℃で30分間インキュベートした。Tハイブリドーマ-huLAG-3細胞および抗LAG-3 mAbがすでに播種された各ウェルの中に混合物（100μl/ウェル）を添加した。抗体、Tハイブリドーマ-huLAG-3細胞、マウス脾細胞、および抗原の混合物を3日間培養した。72時間後に、細胞培養上清100μlを吸引し、R&D Systems ELISAキットを製造業者のプロトコールに従って使用してマウスIL-2定量ELISAを行うために適した濃度に希釈した。ELISA-Endpoint-TMB & HRPプロトコールを使用して、ELISAプレートをSpectraMax M5プレートリーダー（Molecular Devices）で読み取った。RBAおよび抗原依存性活性化アッセイの結果を表21に示す。
（表２１）マウス抗LAG-3抗体の特徴決定
実施例7.7：Biacoreによる結合親和性測定
ELISAアッセイおよびFACSアッセイで高結合親和性ならびに強力な機能的活性を有する抗体について、Biacore表面プラズモン共鳴を用いるリアルタイム結合反応における結合動力学定数の測定に基づき、結合親和性を決定した。簡潔には、抗体捕捉アプローチによりBiacore T200システムを用いて抗原への抗体の結合アッセイを行った。製造業者の説明書に従って抗マウスIgG Fc抗体をCM5センサーチップ上に固定化した。試験抗LAG-3マウスモノクローナル抗体を注入し、固定化抗マウスIgG Fcによって捕捉した。次いで、系列濃度のLAG-3抗原を個別に注入し、抗原分析物の各濃度について結合プロファイルを記録した。アッセイ温度は25℃であり、会合時間および解離時間は、それぞれ180秒および1200秒であった。Biacore T200評価ソフトウェア1.0を使用して1：1結合モデルに従ってBiacoreデータをフィットさせて、会合速度定数（kon）および解離速度定数（koff）を計算し、これらの計算から平衡解離定数（KD）を決定した。4つの選択された抗LAG-3抗体についての親和性（KD）を下記の表22に示す。
ELISAアッセイおよびFACSアッセイで高結合親和性ならびに強力な機能的活性を有する抗体について、Biacore表面プラズモン共鳴を用いるリアルタイム結合反応における結合動力学定数の測定に基づき、結合親和性を決定した。簡潔には、抗体捕捉アプローチによりBiacore T200システムを用いて抗原への抗体の結合アッセイを行った。製造業者の説明書に従って抗マウスIgG Fc抗体をCM5センサーチップ上に固定化した。試験抗LAG-3マウスモノクローナル抗体を注入し、固定化抗マウスIgG Fcによって捕捉した。次いで、系列濃度のLAG-3抗原を個別に注入し、抗原分析物の各濃度について結合プロファイルを記録した。アッセイ温度は25℃であり、会合時間および解離時間は、それぞれ180秒および1200秒であった。Biacore T200評価ソフトウェア1.0を使用して1：1結合モデルに従ってBiacoreデータをフィットさせて、会合速度定数（kon）および解離速度定数（koff）を計算し、これらの計算から平衡解離定数（KD）を決定した。4つの選択された抗LAG-3抗体についての親和性（KD）を下記の表22に示す。
（表２２）選択された抗LAG-3抗体についての結合親和性
実施例7.8：PBMCアッセイにおける抗LAG-3抗体の機能の比較
ヒトPBMCにおける抗LAG-3抗体の機能をさらに検証するために、スーパー抗原黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシンB（SEB）を使用する細菌毒素刺激アッセイを行った。SEBは、ヒトT細胞の刺激により免疫系を活性化し、次にいくつかのサイトカインの過剰産生を引き起こすことで知られるスーパー抗原である。健康なヒトドナー由来の血液試料からPBMCを単離した。96ウェルアッセイプレート中にPBMCを2×105個の細胞／ウェルで播種し、次いで様々な抗LAG-3試験抗体をプレート中に添加し、PBMCと共に37℃で30分間インキュベートした。SEB溶液を終濃度10ng/mlまで添加した。次いでプレートを96時間インキュベートした。このインキュベーションの終わりに、細胞培養上清100μlを収集し、ELISA IL-2検出キット（R&D Systems; Cat. No. DY202）を使用してIL-2の産生を測定した。結果を図6に示す。
ヒトPBMCにおける抗LAG-3抗体の機能をさらに検証するために、スーパー抗原黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシンB（SEB）を使用する細菌毒素刺激アッセイを行った。SEBは、ヒトT細胞の刺激により免疫系を活性化し、次にいくつかのサイトカインの過剰産生を引き起こすことで知られるスーパー抗原である。健康なヒトドナー由来の血液試料からPBMCを単離した。96ウェルアッセイプレート中にPBMCを2×105個の細胞／ウェルで播種し、次いで様々な抗LAG-3試験抗体をプレート中に添加し、PBMCと共に37℃で30分間インキュベートした。SEB溶液を終濃度10ng/mlまで添加した。次いでプレートを96時間インキュベートした。このインキュベーションの終わりに、細胞培養上清100μlを収集し、ELISA IL-2検出キット（R&D Systems; Cat. No. DY202）を使用してIL-2の産生を測定した。結果を図6に示す。
実施例8：マウス抗LAG-3抗体可変領域の配列決定
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅するために、TRIzol（登録商標）RNA単離試薬（Invitrogen; Cat. No. 15596）を用いて、＞5×106個の細胞から選択されたハイブリドーマクローンの総RNAを単離した。SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen； Cat. No. 18080）によってcDNAを合成し、マウスIg-Primer Set（Novagen; Cat. No. 69831-3）のPCR鋳型として適用した。SYBR（商標）Safe DNAゲル染色液（Invitrogen）を用いて1.2％アガロースゲル上の電気泳動によってPCR産物を分析した。NucleoSpin（登録商標）ゲルおよびPCR Clean-up（Macherey-Nagel GmbH; Cat. No. 740609）を製造業者の説明書に従って用いて正しいサイズのDNAフラグメントを精製し、pMD18-Tクローニングベクター中に個別にサブクローニングした。各形質転換から15個のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をDNA配列決定により分析した。VHおよびVLに関するコンセンサス配列について少なくとも8つのマッチが見い出された場合、配列を確定した。配列相同性アライメントにより解析された7つのマウスmAbの可変領域配列を表23に記載する。Kabat番号付けに基づき相補性決定領域（CDR）を同定した。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅するために、TRIzol（登録商標）RNA単離試薬（Invitrogen; Cat. No. 15596）を用いて、＞5×106個の細胞から選択されたハイブリドーマクローンの総RNAを単離した。SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen； Cat. No. 18080）によってcDNAを合成し、マウスIg-Primer Set（Novagen; Cat. No. 69831-3）のPCR鋳型として適用した。SYBR（商標）Safe DNAゲル染色液（Invitrogen）を用いて1.2％アガロースゲル上の電気泳動によってPCR産物を分析した。NucleoSpin（登録商標）ゲルおよびPCR Clean-up（Macherey-Nagel GmbH; Cat. No. 740609）を製造業者の説明書に従って用いて正しいサイズのDNAフラグメントを精製し、pMD18-Tクローニングベクター中に個別にサブクローニングした。各形質転換から15個のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をDNA配列決定により分析した。VHおよびVLに関するコンセンサス配列について少なくとも8つのマッチが見い出された場合、配列を確定した。配列相同性アライメントにより解析された7つのマウスmAbの可変領域配列を表23に記載する。Kabat番号付けに基づき相補性決定領域（CDR）を同定した。
（表２３）7つのマウス抗LAG-3抗体のVH/VLアミノ酸配列
実施例9：マウス抗LAG-3抗体mAb747のヒト化
抗原結合活性、カニクイザルLAG-3タンパク質の交差反応性、機能的活性、および親和性に基づき、mAb747をヒト化のために選択した。
抗原結合活性、カニクイザルLAG-3タンパク質の交差反応性、機能的活性、および親和性に基づき、mAb747をヒト化のために選択した。
実施例9.1：mAb747のヒト化
抗LAG-3 mAb747可変領域遺伝子を用いて、ヒト化mAbを生成した。この工程の第1段階では、全体的にもっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見い出すために、mAb747のVHおよびVKのアミノ酸配列（SEQ ID NO：60およびSEQ ID NO：62）をヒトIg V遺伝子配列の入手可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4配列をJ領域データベースと比較して、それぞれマウスVHおよびVL領域と最高の相同性を有するヒトフレームワークを見い出した。軽鎖について、最も近いヒトV遺伝子マッチはA1遺伝子であり、重鎖について、最も近いヒトマッチはVH1-f遺伝子であった。次いで、mAb747軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がA1遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb747重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3配列がVH1-fのフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH1フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb747の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるそのような残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入されるべきである。mAb747 VHおよびVLについていくつかの望ましい逆変異が示され、表24に示すように3つの代替的なVHおよびVLの設計を構築した。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
を付けて表示し；元の親抗体由来のマウスCDRに下線を付ける。）
抗LAG-3 mAb747可変領域遺伝子を用いて、ヒト化mAbを生成した。この工程の第1段階では、全体的にもっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見い出すために、mAb747のVHおよびVKのアミノ酸配列（SEQ ID NO：60およびSEQ ID NO：62）をヒトIg V遺伝子配列の入手可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4配列をJ領域データベースと比較して、それぞれマウスVHおよびVL領域と最高の相同性を有するヒトフレームワークを見い出した。軽鎖について、最も近いヒトV遺伝子マッチはA1遺伝子であり、重鎖について、最も近いヒトマッチはVH1-f遺伝子であった。次いで、mAb747軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がA1遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb747重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3配列がVH1-fのフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH1フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb747の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるそのような残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入されるべきである。mAb747 VHおよびVLについていくつかの望ましい逆変異が示され、表24に示すように3つの代替的なVHおよびVLの設計を構築した。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
（表２４）mAb747についてのヒト化VH/VLの設計 - マウス残基への逆変異
ヒト化VH遺伝子およびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中にそれぞれクローニングした。ヒトVHとヒトVKとの対形成により、HumAb747-34〜HumAb747-42という名の9種類のヒト化抗LAG-3抗体が生成された（表25）。親マウスVH/VLおよびヒト定常配列を有するキメラ抗体（mAb747c）も親和性比較のための陽性対照として産生した。
（表２５）ヒト化mAb747抗LAG-3抗体の産物リスト
9種類のヒト化抗体すべて（表25）、ならびに親マウスVHおよびVLドメインを有するキメラ抗体（mAb747c）を解離速度定数（koff）により順位を付けた。簡潔には、Octet（登録商標）RED96バイオレイヤー干渉法（Pall ForteBio LLC）によって抗体を親和性および結合動態について特徴決定した。抗HIgG Fc Capture（AHC）Biosensors（Pall）によって抗体を濃度100nMで30秒間捕捉した。次いで、センサーをランニングバッファー（1×pH7.2 PBS、0.05％ Tween 20、0.1％ BSA）中に60秒間浸してベースラインをチェックした。単一濃度の組み換えヒトLAG-3-hisタンパク質（Novoprotein）中にセンサーを浸すことによって結合を測定した。解離に続いて、ランニングバッファー中にセンサーを1200秒間浸した。ForteBio Data Analysisソフトウェア（Pall）を使用して会合曲線および解離曲線は1：1ラングミュア結合モデルにフィットした。結果を表26に示す。
（表２６）ヒト化抗LAG-3抗体のオフレートの順位付け
HumAb747-42は、親可変ドメインを有するキメラ対照よりも2.2倍だけ大きいオフレート定数を示した。
実施例10：PD-1/LAG-3タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の産生
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリン結合タンパク質を構築した。
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリン結合タンパク質を構築した。
以下の表に記載されるFIT-Ig構築物のそれぞれについて、3つの構成成分ポリペプチド鎖のそれぞれについての発現ベクターに使用されるシグナル配列を示す。
のいずれかを下記のFIT-Igタンパク質の産生に使用したが、多数の代替的なシグナルペプチドが当業者に公知であり、同様に使用され得る。そのようなシグナル配列は、宿主細胞を発現させることによりポリペプチドの分泌の間に切断され、したがって、シグナル配列は、最終FIT-Ig結合タンパク質の部分ではないことが理解されよう。
実施例10.1：FIT107-1-2a
親抗体mAb709（マウス抗PD-1、前記の表4参照）およびmAb746（マウス抗LAG-3、前記の表23参照）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いてFIT107-1-2aと呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-2aは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したmAb746のVH-CH1に直接融合したmAb709のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：mAb709のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：mAb746の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-2aポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表27に示す。
親抗体mAb709（マウス抗PD-1、前記の表4参照）およびmAb746（マウス抗LAG-3、前記の表23参照）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いてFIT107-1-2aと呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-2aは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したmAb746のVH-CH1に直接融合したmAb709のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：mAb709のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：mAb746の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-2aポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表27に示す。
（表２７）FIT107-1-2a構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例10.2：FIT107-1-2b
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する別の二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリンを構築した。このPD-1/LAG-3 FIT-IgをFIT107-1-2bと呼んだ。FIT107-1-2b結合タンパク質の構築は、親マウス抗体mAb709およびmAb746由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いたが、このFIT-Ig構築物では、LAG-3結合ドメインがN末端（外側）位置にあり、PD-1結合ドメインは、C末端がLAG-3結合領域のVL-CLドメインに融合した内側位置にあった。FIT-Ig FIT107-1-2bは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常部IgG1のヒンジ-CH2-CH3と直接融合したmAb709のVH-CH1と直接融合したmAb746のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：mAb746のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：mAb709の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-2bポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表28に示す。
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する別の二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリンを構築した。このPD-1/LAG-3 FIT-IgをFIT107-1-2bと呼んだ。FIT107-1-2b結合タンパク質の構築は、親マウス抗体mAb709およびmAb746由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いたが、このFIT-Ig構築物では、LAG-3結合ドメインがN末端（外側）位置にあり、PD-1結合ドメインは、C末端がLAG-3結合領域のVL-CLドメインに融合した内側位置にあった。FIT-Ig FIT107-1-2bは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常部IgG1のヒンジ-CH2-CH3と直接融合したmAb709のVH-CH1と直接融合したmAb746のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：mAb746のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：mAb709の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-2bポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表28に示す。
（表２８）FIT107-1-2b構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例10.3：FIT107-1-5a
親ヒト化抗体HumAb709-8（抗PD-1、SEQ ID NO：21およびSEQ ID NO：25）ならびにHumAb747-42（SEQ ID NO：73およびSEQ ID NO：77）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-5aと呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-5aは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747-42のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747-42の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-5aポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表29に示す。
親ヒト化抗体HumAb709-8（抗PD-1、SEQ ID NO：21およびSEQ ID NO：25）ならびにHumAb747-42（SEQ ID NO：73およびSEQ ID NO：77）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-5aと呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-5aは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747-42のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747-42の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-5aポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表29に示す。
（表２９）FIT107-1-5a構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例10.4：FIT107-1-5b
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する別の二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリンを構築した。このPD-1/LAG-3 FIT-IgをFIT107-1-5bと呼んだ。FIT107-1-5b結合タンパク質の構築は、親ヒト化抗体HumAb709-8およびHumAb747-42由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いたが、このFIT-Ig構築物において、LAG-3結合ドメインがN末端（外部）位置にあり、PD-1結合ドメインは、C末端がN末端LAG-3結合領域のVL-CLドメインに融合した内部位置にあった。FIT-Ig FIT107-1-5bは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747-42のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：mAb747-42のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-5bポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表30に示す。
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する別の二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリンを構築した。このPD-1/LAG-3 FIT-IgをFIT107-1-5bと呼んだ。FIT107-1-5b結合タンパク質の構築は、親ヒト化抗体HumAb709-8およびHumAb747-42由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いたが、このFIT-Ig構築物において、LAG-3結合ドメインがN末端（外部）位置にあり、PD-1結合ドメインは、C末端がN末端LAG-3結合領域のVL-CLドメインに融合した内部位置にあった。FIT-Ig FIT107-1-5bは、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747-42のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：mAb747-42のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-5bポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表30に示す。
（表３０）FIT107-1-5b構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例10.5：FIT-Igの発現および精製
4つのPD-1/LAG-3 FIT-Ig構築物FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a、およびFIT107-1-5bは、一般的にWO2015/103072およびWO2017/136820に記載されるタンデム型Fab免疫グロブリン（またはFIT-Ig）として公知の種類の二重特異性多価結合タンパク質である。全部で3つの鎖についての発現ベクターをトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞における3つの構成成分ポリペプチド鎖の同時発現によって結合タンパク質を産生した。結合タンパク質の設計は、長ポリペプチド鎖（鎖#1）に両方の短ポリペプチド鎖（鎖#2および#3）と対形成して機能的タンデム型Fab部分を形成するように求めており、長鎖はまた、Fc領域（ヒンジ-CH2-CH3）を介して二量体化し、その結果、4つのインタクトなFab結合部位を示す6本鎖結合タンパク質が形成されるように設計されている。結合タンパク質FIT107-1-2aおよびFIT107-1-5aにおいて、N末端または「外側」Fab結合部位はPD-1と結合し、隣接する「内部」Fab結合部位はLAG-3と結合する。FIT107-1-2aおよびFIT107-1-5aの外側Fabフラグメント（抗PD-1）は、免疫グロブリンドメインを接続するリンカーを使用せずに、VL-CLmAb709またはVL-CLHumAb709-8が場合によってはそのC末端でそれぞれVH-CH1mAb746またはVH-CH1HumAb747-42のN末端に直接融合することにより、長鎖（鎖#1）だけを通じて内部Fabフラグメント（抗LAG-3）に接合される。同様に、FIT107-1-2bおよびFIT107-1-5bの外部Fabフラグメント（抗LAG-3）は、免疫グロブリンドメインを接続するリンカーを使用せずに、VL-CLmAb746またはVL-CLmAb747-42が場合によってはそのC末端でそれぞれVH-CH1mAb709またはVH-CH1mAb709-8のN末端に直接融合することにより、長鎖（鎖#1）だけを通じて内部Fabフラグメント（抗PD-1）に接合される。
4つのPD-1/LAG-3 FIT-Ig構築物FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a、およびFIT107-1-5bは、一般的にWO2015/103072およびWO2017/136820に記載されるタンデム型Fab免疫グロブリン（またはFIT-Ig）として公知の種類の二重特異性多価結合タンパク質である。全部で3つの鎖についての発現ベクターをトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞における3つの構成成分ポリペプチド鎖の同時発現によって結合タンパク質を産生した。結合タンパク質の設計は、長ポリペプチド鎖（鎖#1）に両方の短ポリペプチド鎖（鎖#2および#3）と対形成して機能的タンデム型Fab部分を形成するように求めており、長鎖はまた、Fc領域（ヒンジ-CH2-CH3）を介して二量体化し、その結果、4つのインタクトなFab結合部位を示す6本鎖結合タンパク質が形成されるように設計されている。結合タンパク質FIT107-1-2aおよびFIT107-1-5aにおいて、N末端または「外側」Fab結合部位はPD-1と結合し、隣接する「内部」Fab結合部位はLAG-3と結合する。FIT107-1-2aおよびFIT107-1-5aの外側Fabフラグメント（抗PD-1）は、免疫グロブリンドメインを接続するリンカーを使用せずに、VL-CLmAb709またはVL-CLHumAb709-8が場合によってはそのC末端でそれぞれVH-CH1mAb746またはVH-CH1HumAb747-42のN末端に直接融合することにより、長鎖（鎖#1）だけを通じて内部Fabフラグメント（抗LAG-3）に接合される。同様に、FIT107-1-2bおよびFIT107-1-5bの外部Fabフラグメント（抗LAG-3）は、免疫グロブリンドメインを接続するリンカーを使用せずに、VL-CLmAb746またはVL-CLmAb747-42が場合によってはそのC末端でそれぞれVH-CH1mAb709またはVH-CH1mAb709-8のN末端に直接融合することにより、長鎖（鎖#1）だけを通じて内部Fabフラグメント（抗PD-1）に接合される。
各FIT-Ig（FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a、およびFIT107-1-5b）のポリペプチド鎖#1、#2、および#3をコードする発現ベクターを、トランスフェクション剤としてポリエチレンイミン（PEI）を使用してヒト胚性腎臓293E細胞に一過性に共発現させた。簡潔には、FreeStyle（商標）293発現培地中のDNAをPEIと、DNAとPEIが1：2の比の終濃度で混合し、室温で15〜20分間インキュベートし、次いで培養HEK293E細胞（1.0〜1.2×106個/ml、細胞生存率＞95％）に、60μg DNA/120ml培養液となるように添加した。振盪機内で6〜24時間培養後、トランスフェクトされた細胞に、37℃、8％ CO2にて125rpm/minで振盪しながらペプトンを終濃度5％まで添加した。6〜7日目に、遠心分離および濾過により上清を回収し、プロテインAクロマトグラフィー（Pierce, Rockford、IL）を製造業者の説明書に従って使用してFIT-Igタンパク質を精製した。
FIT107-1-2a、FIT107-1-2b、FIT107-1-5a、およびFIT107-1-5bの発現のために、鎖#1、#2、および#3の発現をコードするDNAを鎖#1：鎖#2：鎖#3について1：3：3のモル比を用いてトランスフェクトした。これは、長鎖（鎖#1）と比較して短鎖#2および#3を比例的に大きく発現させ、その結果として、対応する軽鎖と対形成しないことから機能的Fabフラグメントを形成できないVL-CLセグメントおよびVH-CH1セグメントが長鎖（鎖#1）上に出現することを減少させるように、設計された。FIT-Igタンパク質の発現産物をプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。精製FIT-Igの組成および純度をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分析した。PBS中の精製FIT-IgをTSKgel SuperSW3000、300×4.6mmカラム（TOSOH）に適用した。280nmおよび214nmでのUV検出を用いるSECのために、HPLC機器モデルU3000（DIONEX）を使用した。下記の表31を参照されたい。
（表３１）PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質の発現およびSEC分析
FIT107-1-2b、-5a、および-5bについてのより低い単量体画分の含量は、いくぶん凝集している可能性を示す。
実施例11：標的抗原に対するFIT-Igの結合親和性
FIT-IgがPD-1およびLAG-3標的に結合する動態を、Biacore SPR測定によって決定した。標的抗原PDL-1およびLAG-3の両方に対するFIT107-1-2aおよびFIT107-1-2bの結合親和性を下記の表32に示す。
FIT-IgがPD-1およびLAG-3標的に結合する動態を、Biacore SPR測定によって決定した。標的抗原PDL-1およびLAG-3の両方に対するFIT107-1-2aおよびFIT107-1-2bの結合親和性を下記の表32に示す。
（表３２）FIT107-1-2aおよびFIT107-1-2bについての結合親和性
実施例12：FIT-Igの特異性および機能の判定
FIT107-1-2a結合タンパク質の抗PD1および抗LAG-3二重特異性ならびに生物学的活性を、スーパー抗原としてブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を使用するPBMC活性化アッセイで試験した（実施例7.8参照）。簡潔には、健康なドナーからPBMCを単離し、次いで、2×105個の細胞／ウェルとなるように50μl/ウェルで96ウェルプレート中に播種した。試験結合タンパク質（すなわち、FIT107-1-2a、市販の抗PD-1および抗LAG-3モノクローナル抗体の組み合わせ、またはモノクローナル抗PD-1抗体）をプレート内に添加し、PBMCと共に37℃で30分間インキュベートした。SEB溶液を終濃度10ng/mlとなるように添加した。プレートを96時間インキュベートし、次いで細胞培養上清100μlを収集し、ELISA IL-2検出キット（R&D Systems; Cat. No. DY202）を使用してIL-2の産生を測定した。結果を図7に示す。FIT107-1-2a二重特異性FIT-Igタンパク質は、抗PD-1抗体単独または抗LAG-3抗体と抗PD-1抗体との混合物と比較して、IL-2産生によって示されるT細胞活性化を強化することが可能であった。
FIT107-1-2a結合タンパク質の抗PD1および抗LAG-3二重特異性ならびに生物学的活性を、スーパー抗原としてブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を使用するPBMC活性化アッセイで試験した（実施例7.8参照）。簡潔には、健康なドナーからPBMCを単離し、次いで、2×105個の細胞／ウェルとなるように50μl/ウェルで96ウェルプレート中に播種した。試験結合タンパク質（すなわち、FIT107-1-2a、市販の抗PD-1および抗LAG-3モノクローナル抗体の組み合わせ、またはモノクローナル抗PD-1抗体）をプレート内に添加し、PBMCと共に37℃で30分間インキュベートした。SEB溶液を終濃度10ng/mlとなるように添加した。プレートを96時間インキュベートし、次いで細胞培養上清100μlを収集し、ELISA IL-2検出キット（R&D Systems; Cat. No. DY202）を使用してIL-2の産生を測定した。結果を図7に示す。FIT107-1-2a二重特異性FIT-Igタンパク質は、抗PD-1抗体単独または抗LAG-3抗体と抗PD-1抗体との混合物と比較して、IL-2産生によって示されるT細胞活性化を強化することが可能であった。
加えて、実施例3に記載したものと類似のやり方で混合リンパ球反応（MLR）アッセイを行って、FIT107-1-2aについての抗PD-1機能および抗LAG-3機能をさらに検証した。混合リンパ球反応は、一緒に混合された場合に2つの同種リンパ球集団の間で起こるエクスビボ細胞免疫応答である。同種リンパ球は、レスポンダー細胞およびスティミュレーター細胞と呼ばれる2つの細胞集団の間の主要組織適合抗原（MHCクラスIおよびII）の違いに応答して芽球の幼若化、DNA合成および細胞増殖を受ける。FIT107-1-2aを試験するための1日目のMLRにおいて、健康なドナーからPBMCを精製し、CD14+単球を単離した。6ウェルプレート内に単球を播種し、RPMI 1640培地+10％ FBS中に35ng/mlのIL-4（R&D Systems）および50ng/ml GM-CSF（R&D Systems）で処理した。4日目の後で培地を交換した。7日目に、未熟樹状細胞に分化した単球を収集し、20ng/ml TNF-α（R&D Systems）、50μg/ml ポリI：C（Sigma）、35ng/ml IL-4および50ng/ml GM-CSFを有する成熟培地中で2日間さらに処理した。MLR共培養アッセイのために、X-VIVO（商標）15無血清培地を使用して抗体力価における血清の干渉を回避した。96ウェルU底プレートに1×105個の細胞／ウェルの同種CD4+ T細胞（レスポンダー細胞）を播種し、試験結合タンパク質（すなわち、FIT107-1-2a、市販の抗PD-1モノクローナル抗体と抗LAG-3モノクローナル抗体との組み合わせ、またはモノクローナル抗PD-1抗体）で30分間前処理した。次いで、成熟樹状細胞（スティミュレーター細胞）を1×104個の細胞／ウェルでウェル内に播種し、レスポンダー細胞と共に5日間共培養し、その時点で上清100μlを収集し、ELISAによってIFN-γの産生を測定した。結果を図8に示す。抗PD-1抗体と抗LAG-3抗体との組み合わせまたは抗PD-1抗体単独について16.84nMというEC50値と比較して、FIT-Ig二重特異性結合タンパク質は、0.5084nMというEC50を示した。したがって、FIT-Ig結合タンパク質は、単一の抗体または抗体の組み合わせよりも30倍超低い濃度でMLRにおけるIFN-γ（γインターフェロン）の産生を強化した。
実施例13：mAb747の新規バッチヒト化
抗LAG-3 mAb747可変領域遺伝子を用いて、さらなる抗LAG-3ヒト化mAbを生成した。この工程の第1の段階では、もっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見い出すために、mAb747のVHおよびVKのアミノ酸配列（SEQ ID NO：60およびSEQ ID NO：62）をヒトIg V遺伝子配列の入手可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4（FW4）配列をJ領域データベースと比較して、それぞれマウスVHおよびVL領域と最高の相同性を有するヒトフレームワークを見出した。軽鎖について、最良のヒトV遺伝子マッチはA30遺伝子であり、重鎖について、最良のヒトマッチはVH1-69-2遺伝子であった。次いで、mAb747軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がA30遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb747重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3配列がVH1-69-2のフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH6フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb747の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるそのような残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入されるべきである。mAb747 VHおよびVLについていくつかの望ましい逆変異が示されたので、表33に示すように3つの代替的なVHおよびVLの設計を構築した。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
を付けて表示し；CDRに、ABM番号付けシステムで規定されたVH CDR1を除きKabat番号付けシステムに従って下線を付ける。）
抗LAG-3 mAb747可変領域遺伝子を用いて、さらなる抗LAG-3ヒト化mAbを生成した。この工程の第1の段階では、もっともよくマッチするヒト生殖系列Ig V遺伝子配列を見い出すために、mAb747のVHおよびVKのアミノ酸配列（SEQ ID NO：60およびSEQ ID NO：62）をヒトIg V遺伝子配列の入手可能なデータベースと比較した。追加的に、VHまたはVLのフレームワーク4（FW4）配列をJ領域データベースと比較して、それぞれマウスVHおよびVL領域と最高の相同性を有するヒトフレームワークを見出した。軽鎖について、最良のヒトV遺伝子マッチはA30遺伝子であり、重鎖について、最良のヒトマッチはVH1-69-2遺伝子であった。次いで、mAb747軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3がA30遺伝子のフレームワーク配列上に移植され、CDR-L3の後にJK4フレームワーク4配列を有し；mAb747重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3配列がVH1-69-2のフレームワーク配列上に移植され、CDR-H3の後にJH6フレームワーク4配列を有するヒト化可変ドメイン配列を設計した。次いで、mAb747の3次元Fvモデルを生成して、マウスアミノ酸がループ構造またはVH/VL界面を支持するために重要であったフレームワーク位置があったかどうかを判定した。ヒト化配列におけるそのような残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に逆変異導入されるべきである。mAb747 VHおよびVLについていくつかの望ましい逆変異が示されたので、表33に示すように3つの代替的なVHおよびVLの設計を構築した。（逆変異型フレームワークアミノ酸残基に
（表３３）mAb747のためのヒト化VH/VLの設計 - マウス残基への逆変異
ヒト化VH遺伝子およびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、それぞれヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中にクローニングした。ヒトVHとヒトVKとの対形成により、HumAb747-34〜HumAb747-60という名の9種類のヒト化抗LAG-3抗体を生成した（表34）。上記の親マウスVH/VLおよびヒト定常配列を有するキメラ抗体も親和性比較のための陽性対照として使用した（mAb747c）。
（表３４）ヒト化mAb747抗LAG-3抗体の産物リスト
18種類のヒト化抗体すべて（表34）、ならびに親マウスVHドメインおよびVLドメインを有するキメラ抗体（mAb747c）を解離速度定数（koff）により順位付けした。簡潔には、Octet（登録商標）RED96バイオレイヤー干渉法（Pall ForteBio LLC）により親和性および結合動態について特徴決定した。濃度100nMの抗hIgG Fc Capture（AHC）バイオセンサー（Pall）によって抗体を30秒間捕捉した。次いで、ランニングバッファー（1×pH7.2 PBS、0.05％ Tween 20、0.1％ BSA）中にセンサーを60秒間浸してベースラインをチェックした。単一濃度の組み換えヒトLAG-3-hisタンパク質（Novoprotein）中にセンサーを浸すことによって結合を測定した。解離に続いて、ランニングバッファー中にセンサーを1200秒間浸した。ForteBio Data Analysisソフトウェア（Pall）を使用して会合曲線および解離曲線を1：1ラングミュア結合モデルにあてはめた。結果を表35に示す。各試験群において、抗体のオフレートをmAb747cのオフレートと比較することが可能であった。その群のmAb747cのオフレートに対する抗体のオフレートによりオフレート比を計算し、一斉に比較した。比が低いほど、抗体の親和性は高かった。
（表３５）ヒト化抗LAG-3抗体のオフレートの順位付け
HumAb747-60は、親可変ドメインを有するキメラ対照のオフレート定数よりも1.5倍だけ大きいオフレート定数を示した。
ヒトPBMCにおける抗LAG-3抗体の機能をさらに検証するために、前記の実施例7.8に記載されるようにスーパー抗原黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を使用する細菌毒素刺激アッセイを行った。PerkinElmer IL-2検出キット（PerkinElmer; Cat. No. TRF1221M）を使用してIL-2の産生を測定した。HumAb747-60は、LAG-3シグナル経路を遮断することによってSEBで刺激されたPBMCのIL-2分泌を強化することが可能であった。結果を図9に示す。したがって、HumAb747-60は機能的であることが証明され、これをさらなる操作のために選択した。
実施例14：HumAb747-60の親和性成熟
実施例14.1：親和性成熟ライブラリーの構築およびスクリーニング
HumAb747-60は、キメラ対照mAb747cのオフレート定数よりも1.5倍だけ大きいオフレート定数を示したが、PBMC-SEBアッセイの結果は、HumAb747-60がわずかに弱い機能的活性を有することを示した。親和性をさらに改善するために、CDR残基（ABM番号付けシステムによる）を、HumAb747-39に基づく親和性成熟によって最適化した（表24、25参照）。2つのファージライブラリーを設計および構築した。一方は、CDR-L1、CDR-L3およびCDR-H3（ABM番号付け）を変異させるために設計され、そのそれぞれは、1つのランダム変異された残基を有した。他方は、CDR-L2、CDR-H1およびCDR-H2（ABM番号付け）を変異させるために設計され、そのそれぞれは、1つのランダム変異された残基を有した。
実施例14.1：親和性成熟ライブラリーの構築およびスクリーニング
HumAb747-60は、キメラ対照mAb747cのオフレート定数よりも1.5倍だけ大きいオフレート定数を示したが、PBMC-SEBアッセイの結果は、HumAb747-60がわずかに弱い機能的活性を有することを示した。親和性をさらに改善するために、CDR残基（ABM番号付けシステムによる）を、HumAb747-39に基づく親和性成熟によって最適化した（表24、25参照）。2つのファージライブラリーを設計および構築した。一方は、CDR-L1、CDR-L3およびCDR-H3（ABM番号付け）を変異させるために設計され、そのそれぞれは、1つのランダム変異された残基を有した。他方は、CDR-L2、CDR-H1およびCDR-H2（ABM番号付け）を変異させるために設計され、そのそれぞれは、1つのランダム変異された残基を有した。
Journal of Immunological Methods, 201:35-55 (1997)に報告された方法を用いてファージディスプレイライブラリーを構築した。簡潔には、変異を導入する縮重プライマーを用いてVH-CH1およびVL-CLを増幅し、次いで、ファージミドベクターの2つのマルチクローニング部位（MCS）に順次クローニングした。次いで、ファージミドベクターをTG1（Cat.No. 60502-1, Lucigen）中に電気的形質転換し、結果として、高い配列多様性を示すそれぞれ約1.2×108クローンのライブラリーがもたらされた。ライブラリーを、約1：20の比（細胞対ファージ）のM13K07ヘルパーファージ（Cat. No. N0315S）でレスキューした。組み換えヒトLAG-3タンパク質を用いてファージディスプレイライブラリーの選択を行い、続いて洗浄段階を行った。HumAb747-39のFabフラグメントもまた陽性対照としてファージミドベクター中に構築した。選択されたファージを宿主細胞の感染のために使用した。単一のクローン由来のFab上清の結合能をELISAによってスクリーニングした。簡潔には、1mM IPTGと共に30℃で一晩培養することによって単一のクローンのFab上清を調製した。リン酸緩衝食塩水（PBS）100μl中2μg/mlのヒトLAG-3タンパク質を96ウェルプレートの各ウェル内に直接コーティングした。HRP結合型抗c-myc抗体（Cat. No. Ab1261, Abcam）およびTMB試薬を使用して、ELISAシグナルを検出および発生し、それをプレートリーダー（SpectraMax（登録商標）Plus 384吸光度プレートリーダー, Molecular Devices）により波長450nmで読み取った。
スクリーニングELISAにおける陽性クローンを配列決定のために選定した。配列の重複性およびスクリーニングELISAにおけるシグナル強度を考慮して、以下の7つのクローンをさらなる評価のために選択した。VH/VL配列を表36に示す。（親和性成熟によって同定された変異型アミノ酸残基に
を付けて表示し；Kabat番号付けシステムによるCDRに下線を付ける。）
（表３６）親和性成熟変異を有する7種類の抗体のVH/VLアミノ酸配列
実施例14.2：陽性クローンのIgG変換および特徴決定
7つのFabクローンを完全IgGタンパク質に変換した。簡潔には、VH遺伝子およびVL遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインについてのコード配列を含有するベクター中にそれぞれクローニングした。重鎖および同族軽鎖プラスミドをHEK 293E細胞内に個別に共トランスフェクトした。トランスフェクション後の細胞培養の約6日後に、上清を回収し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーに供した。精製抗体の親和性をOctet（登録商標）RED96バイオレイヤー干渉法によって順位付けした（前記の実施例9.1参照）。結果を表37に示す。
7つのFabクローンを完全IgGタンパク質に変換した。簡潔には、VH遺伝子およびVL遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインについてのコード配列を含有するベクター中にそれぞれクローニングした。重鎖および同族軽鎖プラスミドをHEK 293E細胞内に個別に共トランスフェクトした。トランスフェクション後の細胞培養の約6日後に、上清を回収し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーに供した。精製抗体の親和性をOctet（登録商標）RED96バイオレイヤー干渉法によって順位付けした（前記の実施例9.1参照）。結果を表37に示す。
（表３７）親和性成熟後の抗LAG-3抗体のオフレートの順位付け
D1-70-IgGおよびB2-53-IgGは、変異後の親和性増大が最大であることを反映して、HumAb747-39と比較してオフレート定数に最小限の増加を示した。したがって、ヒト化後の最良の候補であったHumAb747-60の配列にD1-70-IgGおよびB2-53-IgGにおける変異を導入した。
実施例14.3：さらなる操作された抗体の生成および特徴決定
親和性成熟工程によって同定されたD1-70における変異は、VHドメイン中のD26G、E53RおよびE58M、ならびにVLドメイン中のS56Lであった（Kabat番号付けシステムによって決定された残基位置）。親和性成熟工程によって同定されたB2-53における変異は、VHドメイン中のD26GおよびE58V、ならびにVLドメイン中のT53Aであった（Kabat番号付けによって決定された残基位置）。HumAb747-60のVH/VL配列中にこれらの変異を別々に、または組み合わせて組み入れた。
親和性成熟工程によって同定されたD1-70における変異は、VHドメイン中のD26G、E53RおよびE58M、ならびにVLドメイン中のS56Lであった（Kabat番号付けシステムによって決定された残基位置）。親和性成熟工程によって同定されたB2-53における変異は、VHドメイン中のD26GおよびE58V、ならびにVLドメイン中のT53Aであった（Kabat番号付けによって決定された残基位置）。HumAb747-60のVH/VL配列中にこれらの変異を別々に、または組み合わせて組み入れた。
HumAb747-60のCDR-H2にNGパターンがあったが、このパターンの結果として、製造途中に脱アミノ反応による不均一性がもたらされる場合があった。したがって、NGからNAへの変異も評価した。VHドメインにおけるG55A変異は、NGパターンを破壊するが、HumAb747-60の活性を妨害しないと計算された。上記の変異を含む抗体バリアントについてのアミノ酸配列を表38に示す。（Kabat番号付けに従ってCDRに下線を付ける。）
（表３８）HumAb747-60についての操作されたVH/VLの設計
操作されたVH遺伝子およびVK遺伝子を合成的に産生し、次いで、ヒトIgG1およびヒトκ定常ドメインを含有するベクター中にそれぞれクローニングした。ヒトVHおよびヒトVKの対形成により、HumAb747V-61〜HumAb747V-73という名の13種類の操作された抗LAG-3抗体を生成した（表39）。親マウスVH/VLおよびヒト定常配列（mAb747c）を有するキメラ抗体を親和性比較のための陽性対照として使用した。
（表３９）操作された抗LAG-3抗体の産物リスト
13種類のヒト化抗体すべて（表39）、ならびに親マウスVHドメインおよび親マウスVLドメインを有するキメラ抗LAG-3抗体mAb747cを、前記の実施例9.1に記載されたものと同じように解離速度定数（koff）によって順位付けした。結果を表40に示す。各試験群において、抗体のオフレートをmAb747cのオフレートと比較することが可能であった。その群のmAb747cのオフレートに対する抗体のオフレートによってオフレート比を計算し、一斉に比較した。比が低いほど、抗体の親和性は高かった。
（表４０）さらに操作された抗LAG-3抗体のオフレートの順位付け
HumAb747-60に基づき、親和性成熟の後に取り入れたCDR変異を有する大部分の抗体は、mAb747cのオフレートと比較して改善されたオフレートを示し、これは親和性が改善されたことを予測した。HumAb747V-61は、mAb747cと類似のオフレートを有したが、それは、VH G55Aアミノ酸置換が親和性を妨害しなかったことを示した。それらの試験群においてmAb747cのオフレート比の60％未満のオフレート比を有した抗体を細胞に基づく機能アッセイでさらに評価した。
スーパー抗原としてブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を使用するPBMC活性化アッセイにおいて抗LAG-3活性を試験した。簡潔には、PBMCを2×105個の細胞／ウェルで96ウェルプレート中に播種した。試験タンパク質（抗LAG-3モノクローナル抗体）をプレートに添加し、PBMCと共に37℃で30分間インキュベートした。SEB溶液を終濃度10ng/mlになるように添加した。プレートを96時間インキュベートし、次いで細胞培養上清100μlを収集し、PerkinElmer IL-2検出キット（PerkinElmer; Cat. No. TRF1221M）を使用してIL-2産生を測定した。結果を図10に示す。結果は、操作された抗体バリアントがLAG-3媒介シグナル伝達を遮断することによってSEBに刺激されるPBMCからのIL-2産生を強化できることを示している。
PBMC-SEBアッセイの結果に基づき、HumAb747V-67、HumAb747V-72、およびHumAb747V-73は優れたLAG-3遮断活性を実証した。したがって、LAG-3およびまたPD-1を標的化するFIT-Ig結合タンパク質を生成するためにこれら3つの抗体を使用した。
実施例15：新規抗LAG-3抗体配列を使用するPD-1/LAG-3 FIT-Igの生成
上記のように生成された抗LAG-3抗体、HumAb747V-67、HumAb747V-72、およびHumAb747V-73、ならびに2つの抗PD-1抗体、HumAb709-8（前記の表5および7参照）およびHumAb713-7（前記の表9および10参照）を使用して、前記の実施例10に記載される手法に従って、FIT-Ig結合タンパク質を生成した。抗LAG-3 Fab部分のすべてのVHドメインの配列設計にG55A変異を含めた。
上記のように生成された抗LAG-3抗体、HumAb747V-67、HumAb747V-72、およびHumAb747V-73、ならびに2つの抗PD-1抗体、HumAb709-8（前記の表5および7参照）およびHumAb713-7（前記の表9および10参照）を使用して、前記の実施例10に記載される手法に従って、FIT-Ig結合タンパク質を生成した。抗LAG-3 Fab部分のすべてのVHドメインの配列設計にG55A変異を含めた。
実施例15.1：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-6a-1の産生
親抗体mAb709-8（ヒト化抗PD-1、前記の表5および6参照）およびHumAb747V-67（ヒト化抗LAG-3、前記の表38および39参照）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6a-1と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6a-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-67のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-676の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6a-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表41に示す。
親抗体mAb709-8（ヒト化抗PD-1、前記の表5および6参照）およびHumAb747V-67（ヒト化抗LAG-3、前記の表38および39参照）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6a-1と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6a-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-67のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-676の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6a-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表41に示す。
（表４１）FIT107-1-6a-1構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.2：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-6b-1の産生
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する別の二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリンを構築した。このPD-1/LAG-3 FIT-IgをFIT107-1-6b-1と呼んだ。FIT107-1-6b-1結合タンパク質の構築は、親抗体HumAb747V-67（抗LAG-3）およびHumAb709-8（抗PD-1）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いた。このFIT-Ig構築物は、N末端（外側）位置におけるLAG-3結合ドメインおよびLAG-3結合領域のVL-CLドメインのC末端が融合した内部位置におけるPD-1結合ドメインを示した。FIT-Ig FIT107-1-6b-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-67のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-67のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6b-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表42に示す。
ヒトPD-1とヒトLAG-3の両方を認識する別の二重特異性タンデム型Fab免疫グロブリンを構築した。このPD-1/LAG-3 FIT-IgをFIT107-1-6b-1と呼んだ。FIT107-1-6b-1結合タンパク質の構築は、親抗体HumAb747V-67（抗LAG-3）およびHumAb709-8（抗PD-1）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いた。このFIT-Ig構築物は、N末端（外側）位置におけるLAG-3結合ドメインおよびLAG-3結合領域のVL-CLドメインのC末端が融合した内部位置におけるPD-1結合ドメインを示した。FIT-Ig FIT107-1-6b-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-67のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-67のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6b-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表42に示す。
（表４２）FIT107-1-6b-1構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.3：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-6a-2の産生
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6a-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6a-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-72のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-72の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6a-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表43に示す。
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6a-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6a-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-72のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-72の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6a-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表43に示す。
（表４３）FIT107-1-6a-2構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.4：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-6b-2の産生
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6b-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6b-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-72のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-72のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6b-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表44に示す。
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6b-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6b-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-72のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-72のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6b-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表44に示す。
（表４４）FIT107-1-6b-2構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.5：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-6a-3の産生
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6a-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6a-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-73のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-73の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6a-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表45に示す。
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6a-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6a-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-73のVH-CH1に直接融合したHumAb709-8のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb709-8のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-73の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6a-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表45に示す。
（表４５）FIT107-1-6a-3構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.6：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-6b-3の産生
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6b-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6b-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-73のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-73のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6b-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表46に示す。
親抗体HumAb709-8（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-6b-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-6b-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb709-8のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-73のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-73のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb709-8の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-6b-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表46に示す。
（表４６）FIT107-1-6b-3構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.7：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-7a-1の産生
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1；前記の表9および10参照）およびHumAb747V-67（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7a-1と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7a-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-67のVH-CH1に直接融合したHumAb713-7のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb713-7のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-67の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7a-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表47に示す。
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1；前記の表9および10参照）およびHumAb747V-67（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7a-1と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7a-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-67のVH-CH1に直接融合したHumAb713-7のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb713-7のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-67の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7a-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表47に示す。
（表４７）FIT107-1-7a-1構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.8：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-7b-1の産生
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-67（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7b-1と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7b-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb713-7のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-67のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-67のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb713-7の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7b-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表48に示す。
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-67（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7b-1と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7b-1は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb713-7のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-67のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-67のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb713-7の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7b-1ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表48に示す。
（表４８）FIT107-1-7b-1構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.9：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-7a-2の産生
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7a-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7a-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-72のVH-CH1に直接融合したHumAb713-7のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb713-7のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-72の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7a-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表49に示す。
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7a-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7a-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-72のVH-CH1に直接融合したHumAb713-7のVL-CL（前記の表6参照）を有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb713-7のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-72の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7a-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表49に示す。
（表４９）FIT107-1-7a-2構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.10：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-7b-2の産生
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7b-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7b-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb713-7のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-72のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-72のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb713-7の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7b-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表50に示す。
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-72（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7b-2と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7b-2は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb713-7のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-72のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-72のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb713-7の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7b-2ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表50に示す。
（表５０）FIT107-1-7b-2構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.11：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-7a-3の産生
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7a-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7a-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-73のVH-CH1に直接融合したHumAb713-7のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb713-7のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-73の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7a-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表51に示す。
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7a-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7a-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb747V-73のVH-CH1に直接融合したHumAb713-7のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb713-7のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb747V-73の軽鎖（VL-CL）を有する。
3つの発現されるFIT107-1-7a-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表51に示す。
（表５１）FIT107-1-7a-3構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例15.12：PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質FIT107-1-7b-3の産生
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7b-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7b-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb713-7のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-73のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-73のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb713-7の軽鎖（VL-CL）を有する
3つの発現されるFIT107-1-7b-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表52に示す。
親抗体HumAb713-7（ヒト化抗PD-1）およびHumAb747V-73（ヒト化抗LAG-3）由来の免疫グロブリンドメインについてのコード配列を用いて、FIT107-1-7b-3と呼ばれるPD-1/LAG-3 FIT-Igを構築した。FIT-Ig FIT107-1-7b-3は、以下の3つの構成成分ポリペプチド鎖から構成される六量体である：
ポリペプチド鎖#1は次のドメイン式：変異型ヒト定常IgG1のヒンジ-CH2-CH3に直接融合したHumAb713-7のVH-CH1に直接融合したHumAb747V-73のVL-CLを有し；
ポリペプチド鎖#2は次のドメイン式：HumAb747V-73のVH-CH1を有し；かつ
ポリペプチド鎖#3は次のドメイン式：HumAb713-7の軽鎖（VL-CL）を有する
3つの発現されるFIT107-1-7b-3ポリペプチド鎖についてのアミノ酸配列を下記の表52に示す。
（表５２）FIT107-1-7b-3構成成分鎖のアミノ酸配列
実施例16：新規FIT-Igタンパク質の特徴決定
実施例16.1：発現およびSEC分析
上記の12種類のFIT-Ig結合タンパク質（表41〜52）を前記の実施例10.5に記載したものと同じように発現させ、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。精製FIT-Igの組成および純度をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分析した。PBS中の精製FIT-IgをTSKgel SuperSW3000、300×4.6mmカラム（TOSOH）に適用した。280nmおよび214nmでのUV検出を用いるSECのためにDIONEX（商標）UltiMate 3000 HPLC機器（Thermo Scientific）を使用した。下記の表53を参照されたい。
実施例16.1：発現およびSEC分析
上記の12種類のFIT-Ig結合タンパク質（表41〜52）を前記の実施例10.5に記載したものと同じように発現させ、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。精製FIT-Igの組成および純度をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分析した。PBS中の精製FIT-IgをTSKgel SuperSW3000、300×4.6mmカラム（TOSOH）に適用した。280nmおよび214nmでのUV検出を用いるSECのためにDIONEX（商標）UltiMate 3000 HPLC機器（Thermo Scientific）を使用した。下記の表53を参照されたい。
（表５３）PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質の発現およびSEC分析
より低い単量体画分含量（<80％）を有したFIT-Igタンパク質を、さらなる特徴決定から除外した。
実施例16.2：機能的アッセイ
実施例12に記載されたスーパー抗原としてブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を使用するPBMC活性化アッセイでPD-1/LAG-3 FIT-Ig活性を試験した。結果を図11に示す。結果により、試験されたFIT-Igバリアントがすべて、SEBで刺激されたPBMCからのIL-2分泌を強化できることが示された。最高用量のFIT107-1-7b-2およびFIT107-1-7b-3で強化がどういうわけか後退したことから、これらの2つのFIT-Igタンパク質はリード分子として優先しなかった。
実施例12に記載されたスーパー抗原としてブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を使用するPBMC活性化アッセイでPD-1/LAG-3 FIT-Ig活性を試験した。結果を図11に示す。結果により、試験されたFIT-Igバリアントがすべて、SEBで刺激されたPBMCからのIL-2分泌を強化できることが示された。最高用量のFIT107-1-7b-2およびFIT107-1-7b-3で強化がどういうわけか後退したことから、これらの2つのFIT-Igタンパク質はリード分子として優先しなかった。
実施例16.3：結合活性
Octet（登録商標）RED96システム（Pall ForteBio LLC）を使用するバイオレイヤー干渉法によって、FIT-IgがPD-1およびLAG-3標的に結合する動態を決定した。標的抗原PD-1およびLAG-3の両方に対する結合親和性を下記の表54に示す。すべてのFIT-Igタンパク質は、huPD-1およびhuLAG-3の両方に対して親和性を保持した。カニクイザル抗原に対して試験したすべてのFIT-Igタンパク質は、カニクイザル抗原との交差反応性も示した。
Octet（登録商標）RED96システム（Pall ForteBio LLC）を使用するバイオレイヤー干渉法によって、FIT-IgがPD-1およびLAG-3標的に結合する動態を決定した。標的抗原PD-1およびLAG-3の両方に対する結合親和性を下記の表54に示す。すべてのFIT-Igタンパク質は、huPD-1およびhuLAG-3の両方に対して親和性を保持した。カニクイザル抗原に対して試験したすべてのFIT-Igタンパク質は、カニクイザル抗原との交差反応性も示した。
（表５４）PD-1/LAG-3 FIT-Ig結合タンパク質についての結合親和性
実施例16.4：ラット薬物動態データ
一段階精製後の純度に基づき、一過性トランスフェクションにおける発現力価、保持された結合親和性のみならず、PBMC-SEBアッセイにおける機能的活性に基づき、FIT107-1-7b-1をリード分子として選択した。FIT107-1-7b-1の薬物動態特性を雄性Sprague-Dawley（SD）ラットにおいて評価した。雄性SDラットに5mg/kgの静脈内単回用量のFIT-Igタンパク質を投与した。28日間にわたり異なる時点で、0、5、15、および30分；1、2、4、8、および24時間；ならびに2、4、7、10、14、21、および28日に尾静脈を介して経時的に採血して血清試料を収集し、一般的なELISAによって分析した。簡潔には、ELISAプレートに125ng/ウェルのヤギ抗ヒトIgG Fc抗体（Rockland, Cat#： 609-101-017）を4℃で一晩コーティングし、1×PBS/1％ BSA/0.05％ Tween-20/0.05％ ProClin（商標）300でブロッキングした。最初にすべての血清試料をブロッキング緩衝液中に20倍希釈した。5％ラットプール血清中に追加的な希釈を行い、プレート上、37℃で60分間インキュベートした。ヤギFab特異的抗ヒトIgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート型抗体（Sigma-Aldrich; Cat. No. A0293）を用いて検出を実行し、4パラメーターロジスティックフィットを用いて標準曲線の助けを借りて濃度を測定した。WinNonlinソフトウェア（Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.）を使用する非コンパートメントモデルによって薬物動態パラメーターについての値を決定した。表55に示されたこれらの結果によって実証されるように、FIT107-1-7b-1の特性はインビボで安定している。
一段階精製後の純度に基づき、一過性トランスフェクションにおける発現力価、保持された結合親和性のみならず、PBMC-SEBアッセイにおける機能的活性に基づき、FIT107-1-7b-1をリード分子として選択した。FIT107-1-7b-1の薬物動態特性を雄性Sprague-Dawley（SD）ラットにおいて評価した。雄性SDラットに5mg/kgの静脈内単回用量のFIT-Igタンパク質を投与した。28日間にわたり異なる時点で、0、5、15、および30分；1、2、4、8、および24時間；ならびに2、4、7、10、14、21、および28日に尾静脈を介して経時的に採血して血清試料を収集し、一般的なELISAによって分析した。簡潔には、ELISAプレートに125ng/ウェルのヤギ抗ヒトIgG Fc抗体（Rockland, Cat#： 609-101-017）を4℃で一晩コーティングし、1×PBS/1％ BSA/0.05％ Tween-20/0.05％ ProClin（商標）300でブロッキングした。最初にすべての血清試料をブロッキング緩衝液中に20倍希釈した。5％ラットプール血清中に追加的な希釈を行い、プレート上、37℃で60分間インキュベートした。ヤギFab特異的抗ヒトIgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート型抗体（Sigma-Aldrich; Cat. No. A0293）を用いて検出を実行し、4パラメーターロジスティックフィットを用いて標準曲線の助けを借りて濃度を測定した。WinNonlinソフトウェア（Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.）を使用する非コンパートメントモデルによって薬物動態パラメーターについての値を決定した。表55に示されたこれらの結果によって実証されるように、FIT107-1-7b-1の特性はインビボで安定している。
（表５５）FIT107-1-7b-1の薬物動態特性
実施例16.5：FGL1受容体ブロッキングアッセイ（RBA）
フィブリノーゲン様タンパク質1（FGL1）は、MHCクラスIIに依存しない主なLAG-3機能的リガンドであることが、最近報告された（Wang J. et al., Cell, 176(1):334-47 (2019)）。抗体によるFGL1/LAG-3相互作用の遮断は、腫瘍免疫を刺激する。抗LAG-3抗体またはFIT-Igのブロッキング活性を評価するために、FGL1（Wuhan USCN, Cat. No. RPD022Hu01）をDulbeccoリン酸緩衝食塩水で5μg/mlに希釈し、100μlを96ウェルプレート中に添加し、4℃一晩インキュベートした。プレートを300μl/ウェルのPBS+TWEEN 20（PBST）で3回洗浄した。HumAb747V-67、FIT107-1-7b-1、hIgG（作業濃度：100nM、10nM、1nM、および0.1nM）、および1μg/mlビオチン化LAG-3（AcroBiosystem, Cat. No. H82E5）を添加し、室温で2時間インキュベートした。プレートを300μl/ウェルのPBSTで3回洗浄し、次いで、VARIOSKAN（商標）LUXマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific）を使用し、ELISA-Endpoint-TMB/HRPプロトコールを用いて読み取った。結果を図12に示す。結果によって、FIT107-1-7b-1 FIT-Igおよびその親抗LAG-3抗体HumAb747V-67の両方がヒトLAG-3のFGL1タンパク質への結合を遮断できることが示された。
フィブリノーゲン様タンパク質1（FGL1）は、MHCクラスIIに依存しない主なLAG-3機能的リガンドであることが、最近報告された（Wang J. et al., Cell, 176(1):334-47 (2019)）。抗体によるFGL1/LAG-3相互作用の遮断は、腫瘍免疫を刺激する。抗LAG-3抗体またはFIT-Igのブロッキング活性を評価するために、FGL1（Wuhan USCN, Cat. No. RPD022Hu01）をDulbeccoリン酸緩衝食塩水で5μg/mlに希釈し、100μlを96ウェルプレート中に添加し、4℃一晩インキュベートした。プレートを300μl/ウェルのPBS+TWEEN 20（PBST）で3回洗浄した。HumAb747V-67、FIT107-1-7b-1、hIgG（作業濃度：100nM、10nM、1nM、および0.1nM）、および1μg/mlビオチン化LAG-3（AcroBiosystem, Cat. No. H82E5）を添加し、室温で2時間インキュベートした。プレートを300μl/ウェルのPBSTで3回洗浄し、次いで、VARIOSKAN（商標）LUXマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific）を使用し、ELISA-Endpoint-TMB/HRPプロトコールを用いて読み取った。結果を図12に示す。結果によって、FIT107-1-7b-1 FIT-Igおよびその親抗LAG-3抗体HumAb747V-67の両方がヒトLAG-3のFGL1タンパク質への結合を遮断できることが示された。
実施例16.6：FIT107-1-7b-1タンパク質の初代細胞結合活性
前述のアッセイによって、PD-1/LAG-3 FIT-Igタンパク質が組み換え抗原タンパク質と結合できることが実証された。FIT107-1-7b-1の細胞表面結合能をさらに評価するために、親抗体HumAb713-7、HumAb747V-67、および二重特異性FIT-Ig FIT107-1-7b-1をビオチン試薬（Sigma, Cat. No. S3259）でビオチン化した。刺激を行わないPBMCについて、PBMCを5×106個/mlで再懸濁した。PD-1抗体（HumAb713-7）またはLAG-3抗体（HumAb747V-67）の試験のために、100μg/mlの抗体を添加し、反応混合物を別々に37℃で40分間インキュベートさせ、続いてFACS緩衝液で2回洗浄した。次いで、100μlの5×105個の細胞／ウェルのPBMC（未処理群、抗PD-1抗体処理群および抗LAG-3抗体処理群）を96ウェルプレートのウェル中に播種した。ビオチン化HumAb713-7、HumAb747V-67およびFIT107-1-7b-1を添加し、37℃で40分間インキュベートし（最終作業濃度は100nMから始まる3倍系列希釈）、続いてFACS緩衝液で2回洗浄した。FITC-ストレプトアビジンおよびBV421-抗ヒト-CD3抗体を添加し、アッセイプレートを4℃で30分間インキュベートし、続いて、FACS緩衝液で2回洗浄した。Beckman Coulter CytoFlexフローサイトメーターでプレートを分析した。PBMC刺激群を抗CD3+抗CD28抗体で72時間刺激して、T細胞上のPD-1およびLAG-3の発現を誘導した。未刺激PBMC実験と同じ群分け戦略（未処理、抗PD-1抗体処理および抗LAG-3抗体処理群）で、刺激PBMCに対するHumAb713-7、HumAb747V-67およびFIT107-1-7b-1の結合を試験した。FACSによるCD3-T細胞サブセットに対する試験抗体の結合を検討した。結果を図13に示す。結果によって、FIT107-7b-1がT細胞上のPD-1標的およびLAG-3標的の両方への結合を示す独特の結合パターンを表したことが示された。
前述のアッセイによって、PD-1/LAG-3 FIT-Igタンパク質が組み換え抗原タンパク質と結合できることが実証された。FIT107-1-7b-1の細胞表面結合能をさらに評価するために、親抗体HumAb713-7、HumAb747V-67、および二重特異性FIT-Ig FIT107-1-7b-1をビオチン試薬（Sigma, Cat. No. S3259）でビオチン化した。刺激を行わないPBMCについて、PBMCを5×106個/mlで再懸濁した。PD-1抗体（HumAb713-7）またはLAG-3抗体（HumAb747V-67）の試験のために、100μg/mlの抗体を添加し、反応混合物を別々に37℃で40分間インキュベートさせ、続いてFACS緩衝液で2回洗浄した。次いで、100μlの5×105個の細胞／ウェルのPBMC（未処理群、抗PD-1抗体処理群および抗LAG-3抗体処理群）を96ウェルプレートのウェル中に播種した。ビオチン化HumAb713-7、HumAb747V-67およびFIT107-1-7b-1を添加し、37℃で40分間インキュベートし（最終作業濃度は100nMから始まる3倍系列希釈）、続いてFACS緩衝液で2回洗浄した。FITC-ストレプトアビジンおよびBV421-抗ヒト-CD3抗体を添加し、アッセイプレートを4℃で30分間インキュベートし、続いて、FACS緩衝液で2回洗浄した。Beckman Coulter CytoFlexフローサイトメーターでプレートを分析した。PBMC刺激群を抗CD3+抗CD28抗体で72時間刺激して、T細胞上のPD-1およびLAG-3の発現を誘導した。未刺激PBMC実験と同じ群分け戦略（未処理、抗PD-1抗体処理および抗LAG-3抗体処理群）で、刺激PBMCに対するHumAb713-7、HumAb747V-67およびFIT107-1-7b-1の結合を試験した。FACSによるCD3-T細胞サブセットに対する試験抗体の結合を検討した。結果を図13に示す。結果によって、FIT107-7b-1がT細胞上のPD-1標的およびLAG-3標的の両方への結合を示す独特の結合パターンを表したことが示された。
本出願にわたり引用されるすべての参照（参考文献、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、それらの全体で参照により本明細書に明白に組み入れられる。本発明の実施は、特に示さないかぎり、当技術分野において周知の免疫学、分子生物学、および細胞生物学の従来技術を用いる。
本発明は、上記の本発明の本質的な特徴から逸脱せずに他の具体的な形態で具体化されてもよい。したがって、前述の態様は、本明細書に記載される本発明を限定するものよりも、むしろ例示するものと見なされるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示される。
本発明はまた、ヒトPD-1と結合することが可能な新規な抗体を提供し、抗体の抗原結合ドメインは、6つのCDRのセット、すなわち下記に定義されるCDRセットの群より選択されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
本発明はまた、ヒトLAG-3と結合することが可能な新規な抗体を提供し、抗体の抗原結合ドメインは、下記に定義されるCDRセットの群より選択される、6つのCDRのセット、すなわち、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
本明細書に記載される処置の方法は、それを必要とする対象に完全または部分的ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格を含むCpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）などの免疫刺激アジュバントを投与する段階をさらに含んでもよい。例えば、本発明の処置の方法において、免疫刺激アジュバントは、本発明の抗体またはFIT-Ig結合タンパク質を含む組成物、および処置を必要とする対象に投与された組成物中に組み入れられてもよい。別の態様では、本発明の処置の方法は、処置を必要とする対象に、本明細書に記載される抗体またはFIT-Ig結合タンパク質を投与する段階、および対象に本発明の抗体またはFIT-Ig結合タンパク質を投与する段階の前、それと同時、またはその後に、対象に免疫刺激アジュバントを投与する別の段階を含み得る。
[本発明1001]
ヒトPD-1と結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体の抗原結合部分が、以下のCDRセットの群より選択される6つのCDRであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のセットを含む、該抗体またはその抗原結合部分：
。
[本発明1002]
VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗PD-1抗体：
。
[本発明1003]
ヒトLAG-3と結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体の抗原結合部分が、以下のCDRセットの群より選択される6つのCDRであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のセットを含む、該抗体またはその抗原結合部分：
。
[本発明1004]
VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗LAG-3抗体：
。
[本発明1005]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含む二重特異性多価結合タンパク質であって、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に（i）CLがVH B に直接融合している、VL A -CL-VH B -CH1-Fc、または（ii）CH1がVL A に直接融合している、VH B -CH1-VL A -CL-Fcを含み；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH A -CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL B -CLを含み；
ここで、VLが軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHが重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、Fcが免疫グロブリンFc領域であり、AがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但しAとBが異なり、該結合タンパク質がPD-1およびLAG-3の両方に結合することが可能である、
該二重特異性多価結合タンパク質。
[本発明1006]
VL A -CLドメインおよびVH A -CH1ドメインが、抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの一方に結合する親抗体に由来し、かつVL B -CLドメインおよびVH B -CH1ドメインが、該抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの他方に結合する別の親抗体に由来する、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1007]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL PD-1 -CL-VH LAG-3 -CH1-Fcを含み、ここでCLがVH LAG-3 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH PD-1 -CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL LAG-3 -CLを含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1008]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1007の結合タンパク質。
[本発明1009]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL LAG-3 -CL-VH PD-1 -CH1-Fcを含み、ここで、CLがVH PD-1 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH LAG-3 -CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL PD-1 -CLを含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1010]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1009の結合タンパク質。
[本発明1011]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH LAG-3 -CH1-VL PD-1 -CL-Fcを含み、ここで、CH1がVL PD-1 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL LAG-3 -CLを含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH PD-1 -CH1を含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1012]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1011の結合タンパク質。
[本発明1013]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH PD-1 -CH1-VL LAG-3 -CL-Fcを含み、ここで、CH1がVL LAG-3 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL PD-1 -CLを含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH LAG-3 -CH1を含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1014]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1013の結合タンパク質。
[本発明1015]
SEQ ID NO：28を含むFc領域をさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの抗体または結合タンパク質。
[本発明1016]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：78のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：83のアミノ酸20〜240のアミノ酸配列を含み、かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：86のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1017]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：88のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：91のアミノ酸20〜235のアミノ酸配列を含み、かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：93のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1018]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：95のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：98のアミノ酸20〜242のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：100のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1019]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：102のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：105のアミノ酸20〜235のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：107のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1020]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：140のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：144のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：146のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1021]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：147のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：151のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：153のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1022]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：154のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：158のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：160のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1023]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：161のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：165のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：167のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1024]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：168のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：172のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：174のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1025]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：175のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：179のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：181のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1026]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：182のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：186のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：188のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1027]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：189のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：193のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：195のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1028]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：196のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：200のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：202のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1029]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：203のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：207のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：209のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1030]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：210のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：214のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：216のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1031]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：217のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：221のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：223のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1032]
少なくとも1つの本発明1001の抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1033]
少なくとも1つの本発明1003の抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1034]
本発明1001の抗PD-1抗体またはその抗原結合部分および本発明1003の抗LAG-3抗体またはその抗原結合部分の組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1035]
少なくとも1つの本発明1005の二重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1036]
PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である疾患または障害を処置するための、本発明1005の二重特異性結合タンパク質の使用。
[本発明1037]
前記疾患ががんである、本発明1036の使用。
[本発明1038]
前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、本発明1037の使用。
[本発明1039]
PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である疾患または障害を処置する際に使用するための医薬を作製するための方法であって、少なくとも1つの本発明1005の二重特異性結合タンパク質を薬学的に許容される担体と共に製剤化する段階を含む、該方法。
[本発明1040]
前記疾患ががんである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1032〜1035のいずれかの薬学的組成物またはその組み合わせの有効量を投与する段階を含む、該方法。
[本発明1043]
前記疾患ががんである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記対象がヒトである、本発明1042の方法。
[本発明1001]
ヒトPD-1と結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体の抗原結合部分が、以下のCDRセットの群より選択される6つのCDRであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のセットを含む、該抗体またはその抗原結合部分：
[本発明1002]
VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗PD-1抗体：
[本発明1003]
ヒトLAG-3と結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体の抗原結合部分が、以下のCDRセットの群より選択される6つのCDRであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のセットを含む、該抗体またはその抗原結合部分：
[本発明1004]
VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗LAG-3抗体：
[本発明1005]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含む二重特異性多価結合タンパク質であって、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に（i）CLがVH B に直接融合している、VL A -CL-VH B -CH1-Fc、または（ii）CH1がVL A に直接融合している、VH B -CH1-VL A -CL-Fcを含み；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH A -CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL B -CLを含み；
ここで、VLが軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHが重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、Fcが免疫グロブリンFc領域であり、AがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但しAとBが異なり、該結合タンパク質がPD-1およびLAG-3の両方に結合することが可能である、
該二重特異性多価結合タンパク質。
[本発明1006]
VL A -CLドメインおよびVH A -CH1ドメインが、抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの一方に結合する親抗体に由来し、かつVL B -CLドメインおよびVH B -CH1ドメインが、該抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの他方に結合する別の親抗体に由来する、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1007]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL PD-1 -CL-VH LAG-3 -CH1-Fcを含み、ここでCLがVH LAG-3 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH PD-1 -CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL LAG-3 -CLを含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1008]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1007の結合タンパク質。
[本発明1009]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL LAG-3 -CL-VH PD-1 -CH1-Fcを含み、ここで、CLがVH PD-1 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH LAG-3 -CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL PD-1 -CLを含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1010]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1009の結合タンパク質。
[本発明1011]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH LAG-3 -CH1-VL PD-1 -CL-Fcを含み、ここで、CH1がVL PD-1 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL LAG-3 -CLを含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH PD-1 -CH1を含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1012]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1011の結合タンパク質。
[本発明1013]
第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH PD-1 -CH1-VL LAG-3 -CL-Fcを含み、ここで、CH1がVL LAG-3 に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVL PD-1 -CLを含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVH LAG-3 -CH1を含み；
ここで、VL PD-1 が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VH PD-1 が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VL LAG-3 が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VH LAG-3 が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
本発明1006の結合タンパク質。
[本発明1014]
前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVL LAG-3 -CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVH LAG-3 -CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVL PD-1 -CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVH PD-1 -CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、本発明1013の結合タンパク質。
[本発明1015]
SEQ ID NO：28を含むFc領域をさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの抗体または結合タンパク質。
[本発明1016]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：78のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：83のアミノ酸20〜240のアミノ酸配列を含み、かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：86のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1017]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：88のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：91のアミノ酸20〜235のアミノ酸配列を含み、かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：93のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1018]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：95のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：98のアミノ酸20〜242のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：100のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1019]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：102のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：105のアミノ酸20〜235のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：107のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1020]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：140のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：144のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：146のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1021]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：147のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：151のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：153のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1022]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：154のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：158のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：160のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1023]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：161のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：165のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：167のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1024]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：168のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：172のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：174のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1025]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：175のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：179のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：181のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1026]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：182のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：186のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：188のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1027]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：189のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：193のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：195のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1028]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：196のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：200のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：202のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1029]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：203のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：207のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：209のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1030]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：210のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：214のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：216のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1031]
前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：217のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：221のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：223のアミノ酸配列を含む、本発明1005の結合タンパク質。
[本発明1032]
少なくとも1つの本発明1001の抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1033]
少なくとも1つの本発明1003の抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1034]
本発明1001の抗PD-1抗体またはその抗原結合部分および本発明1003の抗LAG-3抗体またはその抗原結合部分の組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1035]
少なくとも1つの本発明1005の二重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1036]
PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である疾患または障害を処置するための、本発明1005の二重特異性結合タンパク質の使用。
[本発明1037]
前記疾患ががんである、本発明1036の使用。
[本発明1038]
前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、本発明1037の使用。
[本発明1039]
PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である疾患または障害を処置する際に使用するための医薬を作製するための方法であって、少なくとも1つの本発明1005の二重特異性結合タンパク質を薬学的に許容される担体と共に製剤化する段階を含む、該方法。
[本発明1040]
前記疾患ががんである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1032〜1035のいずれかの薬学的組成物またはその組み合わせの有効量を投与する段階を含む、該方法。
[本発明1043]
前記疾患ががんである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記対象がヒトである、本発明1042の方法。
Claims (45)
- ヒトPD-1と結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体の抗原結合部分が、以下のCDRセットの群より選択される6つのCDRであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のセットを含む、該抗体またはその抗原結合部分：
。 - VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗PD-1抗体：
。 - ヒトLAG-3と結合することが可能な抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体の抗原結合部分が、以下のCDRセットの群より選択される6つのCDRであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のセットを含む、該抗体またはその抗原結合部分：
。 - VHドメインとVLドメインとを含み、これらの2つの可変ドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗LAG-3抗体：
。 - 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含む二重特異性多価結合タンパク質であって、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に（i）CLがVHBに直接融合している、VLA-CL-VHB-CH1-Fc、または（ii）CH1がVLAに直接融合している、VHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHA-CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLB-CLを含み；
ここで、VLが軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHが重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、Fcが免疫グロブリンFc領域であり、AがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、かつBがPD-1またはLAG-3のエピトープであり、但しAとBが異なり、該結合タンパク質がPD-1およびLAG-3の両方に結合することが可能である、
該二重特異性多価結合タンパク質。 - VLA-CLドメインおよびVHA-CH1ドメインが、抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの一方に結合する親抗体に由来し、かつVLB-CLドメインおよびVHB-CH1ドメインが、該抗原標的のPD-1またはLAG-3のうちの他方に結合する別の親抗体に由来する、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLPD-1-CL-VHLAG-3-CH1-Fcを含み、ここでCLがVHLAG-3に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHPD-1-CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLLAG-3-CLを含み；
ここで、VLPD-1が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
請求項6に記載の結合タンパク質。 - 前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLPD-1-CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHPD-1-CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLLAG-3-CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHLAG-3-CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、請求項7に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLLAG-3-CL-VHPD-1-CH1-Fcを含み、ここで、CLがVHPD-1に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHLAG-3-CH1を含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLPD-1-CLを含み；
ここで、VLPD-1が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
請求項6に記載の結合タンパク質。 - 前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLLAG-3-CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHLAG-3-CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLPD-1-CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHPD-1-CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、請求項9に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHLAG-3-CH1-VLPD-1-CL-Fcを含み、ここで、CH1がVLPD-1に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLLAG-3-CLを含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHPD-1-CH1を含み；
ここで、VLPD-1が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
請求項6に記載の結合タンパク質。 - 前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLLAG-3-CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHLAG-3-CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLPD-1-CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHPD-1-CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、請求項11に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖と第3のポリペプチド鎖とを含み、
該第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHPD-1-CH1-VLLAG-3-CL-Fcを含み、ここで、CH1がVLLAG-3に直接融合しており；
該第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVLPD-1-CLを含み；かつ
該第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にVHLAG-3-CH1を含み；
ここで、VLPD-1が抗PD-1抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが軽鎖定常ドメインであり、VHPD-1が抗PD-1抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1が重鎖定常ドメインであり、VLLAG-3が抗LAG-3抗体の軽鎖可変ドメインであり、VHLAG-3が抗LAG-3抗体の重鎖可変ドメインであり、かつFcが免疫グロブリンFc領域である、
請求項6に記載の結合タンパク質。 - 前記第1のポリペプチド鎖において、ドメインVLLAG-3-CLが抗LAG-3親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインVHLAG-3-CH1が抗LAG-3親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインVLPD-1-CLが抗PD-1親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインVHPD-1-CH1が抗PD-1親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである、請求項13に記載の結合タンパク質。
- SEQ ID NO：28を含むFc領域をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体または結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：78のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：83のアミノ酸20〜240のアミノ酸配列を含み、かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：86のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：88のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：91のアミノ酸20〜235のアミノ酸配列を含み、かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：93のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：95のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：98のアミノ酸20〜242のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：100のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：102のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：105のアミノ酸20〜235のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：107のアミノ酸23〜236のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：140のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：144のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：146のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：147のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：151のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：153のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：154のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：158のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：160のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：161のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：165のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：167のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：168のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：172のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：174のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：175のアミノ酸23〜684のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：179のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：181のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：182のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：186のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：188のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：189のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：193のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：195のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：196のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：200のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：202のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：203のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：207のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：209のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：210のアミノ酸23〜679のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：214のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：216のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：217のアミノ酸23〜687のアミノ酸配列を含み；前記第2のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：221のアミノ酸配列を含み；かつ前記第3のポリペプチド鎖が、SEQ ID NO：223のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 少なくとも1つの請求項1に記載の抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 少なくとも1つの請求項3に記載の抗LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 請求項1に記載の抗PD-1抗体またはその抗原結合部分および請求項3に記載の抗LAG-3抗体またはその抗原結合部分の組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 少なくとも1つの請求項5に記載の二重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である疾患または障害を処置するための、請求項5に記載の二重特異性結合タンパク質の使用。
- 前記疾患ががんである、請求項36に記載の使用。
- 前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、請求項37に記載の使用。
- PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である疾患または障害を処置する際に使用するための医薬を作製するための方法であって、少なくとも1つの請求項5に記載の二重特異性結合タンパク質を薬学的に許容される担体と共に製剤化する段階を含む、該方法。
- 前記疾患ががんである、請求項39に記載の方法。
- 前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、請求項40に記載の方法。
- PD-1媒介活性および／またはLAG-3媒介活性が有害である障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項32〜35のいずれか一項に記載の薬学的組成物またはその組み合わせの有効量を投与する段階を含む、該方法。
- 前記疾患ががんである、請求項42に記載の方法。
- 前記がんが、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、膵腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、または原発性骨がん（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、もしくは軟骨肉腫）である、請求項43に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項42に記載の方法。
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