ES2335345T3

ES2335345T3 - Expresion de n-acetilglucosaminil transferasa iii en eucariotas inferiores.

Info

Publication number: ES2335345T3
Application number: ES04713412T
Authority: ES
Inventors: Piotr Bobrowicz; Stephen R. Hamilton; Tillman U Gerngross; Stefan Wildt; Byung-Kwon Choi; Juergen Hermann Nett; Robert C Davidson
Original assignee: Glycofi Inc
Current assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2010-03-25
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: CA2516520C; CA2753408A1; AU2004213868A1; WO2004074461A2; ES2336790T5; US20100016555A1; DE602004024289D1; ES2384929T3; JP2011019521A; CA2516550A1; AU2004213859B2; ES2335345T5; US7598055B2; JP2006518597A; CA2516520A1; US20100016561A1; JP4758335B2; WO2004074461A3; EP2080809A1; EP1597381B2

Abstract

Un procedimiento para fabricar una glucoproteína recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso de eucariota inferior modificada para producir una glucoproteína que tiene una estructura central de Man3GlcNAc2 o de Man5GlcNAc2, que comprende la etapa de introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, en el que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII Δ32 de ratón o GnTIII Δ86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae.

Description

Expresión de N-acetilglucosaminil transferasa III en eucariotas inferiores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones por los que se pueden modificar genéticamente células huésped de levadura o de hongo unicelular o multicelular filamentoso para producir proteínas glucosiladas (glucoproteínas) que tienen patrones de glucosilación similares a los de glucoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos, enseres humanos o animales.

Antecedentes de la invención Rutas de Glucosilación en Seres Humanos y Eucariotas Inferiores

Después de que el ADN se haya transcrito y traducido en una proteína, el procesamiento post-traduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glucosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glucosilación (glucosiltransferasas y glucosidasas) y tienen diferentes sustratos disponibles (nucleótido azúcar), de tal forma que los patrones de glucosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se está expresando la proteína particular. Las bacterias típicamente no glucosilan proteínas y, si lo hacen, solamente de un modo muy inespecífico (Moens y Vanderleyden (1997) Arch Microbiol. 168(3): 169-175). Los eucariotas inferiores tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente azúcares manosa y manosilfosfato. El glucano resultante se conoce como un glucano de tipo "alto contenido de manosa" o un manano. Las células vegetales y las células de insecto (tales como células Sf9) glucosilan proteínas de otro modo. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la cadena lateral del oligosacárido naciente se puede cortar para eliminar varios restos de manosa y prolongar con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en los N-glucanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, Bretthauer, y col. (1999) Biotechnology and Applied Biochemistry 30: 193-200; Martinet, y col. (1998) Biotechnology Letters 20: 1171-1177; Weikert, y col. (1999) Nature Biotechnology, 17: 1116-1121; M. Malissard, y col. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications 267: 169-173; Jarvis, y col., (1998) Current Opinion in Biotechnology 9: 528-533; y Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9: S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones secuenciales en el curso de las cuales se añaden y se eliminan restos de azúcar mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glucosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glucosilación resultantes de proteínas secretadas. Por tanto, el patrón de glucosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glucosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999). La estructura de un N-glucano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de la glucosilación humana se pueden dividir en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2} ligados a lípidos se ensamblan por un conjunto secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplásmico (RE) (Figura 13) y (ii) la transferencia de este oligosacárido del ancla lipídica dolicil pirofosfato a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define por un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (SEC ID Nº: 1 y 2) donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne (1990) Protein Eng. 3: 433-42). Tiene lugar un procesamiento adicional por glucosidasas y manosidasas en el RE antes de que la glucoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, donde se eliminan restos de manosa adicionales por alfa (\alpha)-1,2-manosidasas específicas de Golgi. El procesamiento continúa cuando la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medial, varias enzimas modificadoras, que incluyen N-acetilglucosaminil transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y eliminan restos de azúcar específicos. Finalmente, en el Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) produce una estructura de glucoproteína que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri- y tetra-antenarias, que contienen galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a las glucoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glucano humano típico se muestra en la Figura 1B. Véase también las Figuras 14 y 15 para etapas implicadas en el procesamiento de N-glucano de tipo mamífero.

En prácticamente todos los eucariotas, las glucoproteínas se obtienen de un precursor común de oligosacárido ligado a lípido Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2}-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y el procesamiento de oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos en todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido central por células fúngicas, por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido que abandona el RE y que entra en el Golgi, difiere significativamente del de seres humanos cuando se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares de manosa.

En levaduras, estas etapas se catalizan por manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Ochlp, Mntlp y Mnnlp, que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad de manosiltransferasa. Se ha demostrado que los mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad de manosiltransferasa (por ejemplo, mutantes ochl1 o mnn9) son no mortales y presentan un contenido reducido de manosa en el oligosacárido de glucoproteínas de levadura. Puede que también se tengan que eliminar otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasa, dependiendo del patrón de glucosilación endógeno particular del huésped.

\vskip1.000000\baselineskip

Precursores de Nucleótido Azúcar

Los N-glucanos de glucoproteínas animales incluyen típicamente galactosa, fucosa y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentras en glucoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, toda la variedad de precursores de nucleótido azúcar (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido central por glucosiltransferasas (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91(2): A406-A406; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715).

Las reacciones de transferencia de glucosilo producen típicamente un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras que los monofosfatos se pueden exportar directamente en intercambio por azúcares de nucleósido trifosfato por un mecanismo de cotransporte bidireccional, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir por fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir nucleósido monofosfato y fosfato inorgánico antes de ser exportados. Esta reacción es importante para la glucosilación eficaz; por ejemplo, se ha observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, esa GDPasa tiene una actividad reducida el 90% con respecto a UDP (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad de difosfatasa específica de UDP en el Golgi ya que no utilizan precursores de UDP-azúcar para síntesis de glucoproteína basada en Golgi. Se ha observado que Schizosaccharomyces pombe, una levadura de la que se ha observado que añade restos de galactosa a polisacáridos de pared celular (de UDP-galactosa) tiene actividad de UDPasa específica, indicando el requisito potencial de tal enzima (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Se sabe que el UDP es un inhibidor potente de glucosiltransferasas y la eliminación de este producto secundario de la glucosilación puede ser importante para evitar la inhibición por glucosil-transferasa en el lumen del Golgi (Khatara y col. (1974) Eur. J. Biochem. 44: 537-560). Véase Berninsone y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(24): 14564-14567; Beaudet y col. (1998) Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects 292: 397-413.

\vskip1.000000\baselineskip

Procesamiento Secuencial de N-glucanos por Actividades Enzimáticas Compartimentalizadas

Las transferasas de azúcar y glucosidasas (por ejemplo, manosidasas) revisten la superficie interna (luminal) del RE y del aparato de Golgi y proporcionan de este modo una superficie "catalítica" que permite el procesamiento secuencial de glucoproteínas cuando avanzan a través del RE y la red de Golgi. Los múltiples compartimentos del Golgi cis, medial y trans y la Red de Golgi trans (TGN) proporcionan las diferentes localizaciones en las que puede tener lugar la secuencia ordenada de reacciones de glucosilación. Cuando una glucoproteína avanza desde síntesis en el RE hasta maduración completa en el Golgi tardío o TGN, se expone secuencialmente a diferentes glucosidasas, manosidasas y glucosiltransferasas de tal forma que se puede sintetizar una estructura específica de hidrato de carbono. Se ha dedicado mucho trabajo para poner de manifiesto el mecanismo exacto por el que estas enzimas se retienen y anclan a su orgánulo respectivo. La imagen resultante es compleja, pero las pruebas sugieren que la región de tallo, la región transmembrana y cola citoplasmática, individualmente o de forma concertada, dirigen enzimas a la membrana de orgánulos individuales y de este modo localizan el dominio catalítico asociado en ese locus (véase, por ejemplo, Gleeson (1998) Histochem. Cell Biol. 109: 517-532).

En algunos casos, se ha observado que estas interacciones específicas funcionan entre especies. Por ejemplo, se demostró que el dominio transmembrana de \alpha2,6-ST de ratas, una enzima que se conoce que se localiza en el Golgi trans del animal, también localiza un gen indicador (invertasa) en el Golgi de levadura (Schwientek y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Sin embargo, el mismo dominio transmembrana como parte de una \alpha2,6-ST de longitud completa se retuvo en el RE y no se transportó adicionalmente al Golgi de levadura (Krezdorn y col. (1994) Eur. J. Biochem. 220(3): 809-17). Una GalT de longitud completa de seres humanos no se sintetizó de forma uniforme en levaduras, a pesar de niveles de transcripción demostrablemente elevados. Por el contrario, la región transmembrana de la misma GalT humana fusionada con un indicador de invertasa fue capaz de dirigir la localización al Golgi de levadura, aunque a niveles de producción bajos. Schwientek y colaboradores han mostrado que la fusión de 28 aminoácidos de una manosiltransferasa de levadura (MNT1), una región que contiene una cola citoplasmática, una región transmembrana y ocho aminoácidos de la región de tallo al dominio catalítico de GalT humana es suficiente para la localización en Golgi de una GalT activa. Parece que otras galactosiltransferasas dependen de interacciones con enzimas que residen en orgánulos particulares debido a que después de la retirada de su región transmembrana, todavía son capaces de localizarse de forma apropiada.

La localización inapropiada de una enzima de glucosilación puede evitar el funcionamiento apropiado de la enzima en la ruta. Por ejemplo, Aspergillus nidulans, que tiene numerosas \alpha-1,2-manosidasas (Eades y Hintz (2000) Gene 255(1): 25-34), no añade GlcNAc a Man_{5}GlcNAc_{2} cuando se transforma con el gen de GnTI de conejo, a pesar de un nivel globalmente alto de actividad de GnTI (Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). La GnTI, aunque se expresa activamente, se puede localizar incorrectamente, de tal forma que la enzima no está en contacto con sus dos sustratos: UDP-GlcNAc y un sustrato de Man_{5}GlcNAc_{2} productivo (no todas las estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} son productivas; véase a continuación). Alternativamente, el organismo huésped puede no proporcionar un nivel adecuado de UDP-GlcNAc en el Golgi o la enzima se puede localizar de forma apropiada pero, sin embargo, de forma inactiva en su nuevo entorno. Además, las estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} presentes en la célula huésped pueden diferir en estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} encontrado en mamíferos. Maras y colaboradores observaron que aproximadamente un tercio de los N-glucanos de celobiohidrolasa I (CBHI) obtenidos de T. reesei se pueden cortar hasta Man_{5}GlcNAc_{2} por 1,2 manosidasa de A. saitoi in vitro. Menos del 1% de esos N-glucanos, sin embargo, podrían servir como un sustrato productivo para GnTI. Maras y col. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707. La mera presencia de Man_{5}GlcNAc_{2}, por lo tanto, no garantiza que se pueda conseguir el procesamiento in vivo adicional de Man_{5}GlcNAc_{2}. Se requiere formación de una estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} productiva reactiva con GnTI. Aunque Man_{5}GlcNAc_{2} se podría producir en la célula (aproximadamente el 27% en mol), solamente una pequeña fracción se podría convertir en Man_{5}GlcNAc_{2} (menos de aproximadamente el 5%, véase Chiba y col., documento WO 01/14522). Shinkawa y col. (2003), J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473, usaron células Lec 10, una línea celular de CHO que sobre-expresa GnT III, para producir una IgG anti-CD20 con un perfil de oligosacárido del 74% de GlcNAc de bisección y el 100% de fucosa. En comparación con el mAb anti-CD20 producido comercialmente Rituxan que tiene el 0% de GlcNAc de bisección y el 94% de fucosa, la IgG producida por LEC 10 mostró una mejora de varias veces de la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Davies y col. (2001), Biotechnology and Bioengineering 74(4): 288-294, describen la clonación y co-expresión del gen que codifica la enzima de glucosilación de rata \beta1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) en una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) de producción recombinante que expresa un anticuerpo IgG1 quimérico de ratón/ser humano anti-CD20. El análisis de HPLC mostró que la enzima tenía añadidos restos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) de bisección en la mayoría (del 48% al 71%) de los oligosacáridos ligados a N aislados de preparaciones de anticuerpos purificados de las líneas celulares. El documento WO 02/079255 se refiere a anticuerpos recombinantes co-expresados con GnT III correspondientes a Davies y col. (2001), es decir, que describen que para la línea celular positiva a GnT III, se demostró que la mayoría de las glucoformas (48-71%) contenían un resto de GlcNAc bisecado, reflejando los efectos catalíticos in vivo de GnT III sobre las glucoformas de preparaciones de anticuerpos purificados.

Hasta la fecha, no existe un modo fiable de predecir si una glucosiltransferasa o manosidasa expresada de forma heteróloga particular en un eucariota inferior se (1) traducirá suficientemente, (2) será catalíticamente activa o (3) se localizará en el orgánulo apropiado dentro de la ruta secretora. Debido a que estos tres puntos son necesarios para afectar a los patrones de glucosilación en eucariotas inferiores, sería deseable un esquema sistemático para conseguir la función catalítica deseada y la retención apropiada de enzimas en ausencia de herramientas predictivas, que actualmente no están disponibles.

\vskip1.000000\baselineskip

Producción de Glucoproteínas Terapéuticas

Un número significativo de proteínas aisladas de seres humanos o animales se modifican después de la traducción, siendo la glucosilación una de las modificaciones más significativas. Un número estimado del 70% de todas las proteínas terapéuticas están glucosiladas y, por tanto, actualmente dependen de un sistema de producción (es decir, célula huésped) que sea capaz de glucosilar de un modo similar a seres humanos. Varios estudios han demostrado que la glucosilación desempeña un papel importante al determinar (1) la inmunogenicidad, (2) las propiedades farmacocinéticas, (3) el tránsito y (4) la eficacia de proteínas terapéuticas. Por tanto, no es sorprendente que se haya dirigido esfuerzos sustanciales por la industria farmacéutica a desarrollar procedimientos para obtener glucoproteínas que sean tan "humanoides" o "de tipo humano" como sea posible. Hasta la fecha, la mayoría de las glucoproteínas se preparan en un sistema huésped de mamífero. Esto puede implicar la modificación genética de tales células de mamífero para mejorar el grado de sialilación (es decir, adición terminal de ácido siálico) de proteínas expresadas por las células, que se sabe que mejora las propiedades farmacocinéticas de tales proteínas. Alternativamente, se puede mejorar el grado de sialilación por adición in vitro de tales azúcares usando glucosiltransferasas conocidas y sus nucleótido azúcares respectivos (por ejemplo, 2,3-sialiltransferasa y CMP-ácido siálico).

Aunque la mayoría de los eucariotas superiores realizan reacciones de glucosilación que son similares a las observadas en seres humanos, las proteínas humanas recombinantes expresadas en los sistemas huésped que se han mencionado anteriormente difieren invariablemente de su equivalente humano "natural" (Raju y col. (2000) Glycobiology 10(5): 477-486). Por tanto, se ha dirigido un trabajo de desarrollo extenso para encontrar modos para mejorar el "carácter humano" de proteínas preparadas en estos sistemas de expresión. Esto incluye la optimización de condiciones de fermentación y la modificación genética de huéspedes de expresión de proteína introduciendo genes que codifican enzimas implicadas en la formación de glucoformas de tipo humano. Goochee y col. (1999) Biotechnology 9(12): 1347-55; Andersen y Goochee (1994) Curr Opin Biotechnol. 5(5): 546-49; Werner y col. (1998)
Arzneizmittelforschung. 48(8): 870-80; Weikert y col. (1999) Nat Biotechnol. 17(11): 1116-21; Yang y Butler (2000) Biotech. Bioeng. 68: 370-80, Los problemas inherentes asociados con todos los sistemas de expresión de mamífero no se han resuelto.

\vskip1.000000\baselineskip

Producción de Glucoproteínas Usando Microorganismos Eucariotas

Aunque la estructura de oligosacárido central transferida a una proteína en el retículo endoplásmico básicamente es idéntica en mamíferos y eucariotas inferiores, se han observado diferencias sustanciales en las reacciones de procesamiento posteriores que tienen lugar en el aparato de Golgi de hongos y mamíferos. De hecho, incluso entre diferentes eucariotas inferiores existe una gran diversidad de estructuras de glucosilación. Esto ha evitado históricamente el uso de eucariotas inferiores como huéspedes para la producción de glucoproteínas humanas recombinantes a pesar de ventajas por lo demás destacadas con respecto a sistemas de expresión de mamíferos.

Las glucoproteínas terapéuticas producidas en un huésped microorganismo tal como levadura utilizando la ruta de glucosilación del huésped endógena difieren estructuralmente de las producidas en células de mamífero y muestran típicamente una eficacia terapéutica en gran medida reducida. Tales glucoproteínas típicamente son inmunogénicos en seres humanos y muestran una semivida (y, por tanto, bioactividad) reducida in vivo después de la administración (Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9: S29-S35). Los receptores específicos en seres humanos y animales (es decir, receptores de manosa en macrófagos) pueden reconocer restos de manosa terminales y promover el aclaramiento rápido de la glucoproteína extraña del torrente sanguíneo. Los efectos adversos adicionales pueden incluir cambios en el plegamiento, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tránsito, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad o alergenicidad de la
proteína.

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se han usado de forma exitosa para la producción de proteínas recombinantes, tanto intracelulares como secretadas (Cereghino y Cregg (2000) FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45-66; Harkki y col. (1989) BioTechnology 7(6): 596; Berka y col. (1992) Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203: 121-BIOT; Svetina y col. (2000) J. Biotechnol. 76(2-3): 245-251). Diversas levaduras, tales como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha, han desempeñado papeles particularmente importantes como sistemas de expresión eucariotas debido a que son capaces de crecer hasta altas densidades celulares y secretar grandes cantidades de proteína recombinante. Asimismo, los hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassa y otros se han usado para producir de forma eficaz glucoproteínas a escala industrial. Sin embargo, como se ha señalado anteriormente, las glucoproteínas expresadas en cualquiera de estos microorganismos eucariotas difieren sustancialmente en la estructura de N-glucano de las de animales. Esto ha evitado el uso de levaduras u hongos filamentosos como huéspedes para la producción de muchas glucoproteínas terapéuticas.

Aunque la glucosilación en levaduras y hongos es muy diferente que en seres humanos, se comparten algunos elementos comunes. La primera etapa, la transferencia de la estructura de oligosacárido central a la proteína naciente, está altamente conservada en todos los eucariotas incluyendo levaduras, hongos, plantas y seres humanos (compárese Figuras 1A y 1B). Sin embargo, el procesamiento posterior del oligosacárido central difiere significativamente en levaduras e implica la adición de varios azúcares de manosa. Esta etapa está catalizada por manosiltransferasas que residen en el Golgi (por ejemplo, OCH1, MNT1, MNN1, etc.), que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas humanoides y, por tanto, es deseable para reducir o eliminar la actividad de manosiltransferasa. Se ha demostrado que los mutantes de S. cerevisiae deficientes en actividad de manosiltransferasa (por ejemplo, mutantes ochl o mnn9) son no mortales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glucoproteínas de levadura. Puede que también se tengan que eliminar otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasas, dependiendo del patrón de glucosilación endógeno particular del huésped. Después de reducir reacciones de glucosilación endógenas indeseadas, se tiene que incluir la formación de N-glucanos complejos en el sistema huésped. Esto requiere la expresión estable de varias enzimas y transportadores de nucleótido-azúcar. Además, se tienen que localizar estas enzimas de tal forma que se garantice un procesamiento secuencial de la estructura de glucosilación que está
madurando.

Se han realizados varios esfuerzos para modificar las rutas de glucosilación de microorganismos eucariotas para proporcionar glucoproteínas más adecuadas para el uso como agentes terapéuticos de mamífero. Por ejemplo, se han clonado y expresado varias glucosiltransferasas por separado en S. cerevisiae (GAIT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos (Yoshida y col. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8, Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). Sin embargo, no se han obtenido N-glucanos que se parezcan a los preparados en células humanas.

Las levaduras producen una diversidad de manosiltransferasas (por ejemplo, 1,3-manosiltransferasas tales como MNN1 en S. cerevisiae; Graham y Emr (1991) J. Cell. Biol. 114(2): 207-218), 1,2-manosiltransferasas (por ejemplo, la familia de KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferasas (por ejemplo, OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores (por ejemplo, MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas en reacciones de glucosilación endógenas. Muchos de estos genes se han delecionado individualmente dando lugar a organismos viables que tienen perfiles de glucosilación alterados. Se muestran ejemplos en la
Tabla 1.

TABLA 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

La Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Nº 8-336387 describe la deleción de un homólogo de OCH1 en Pichia pastoris. En S. cerevisiae, OCH1 codifica 1,6-manosiltransferasa, que añade una manosa a la estructura de glucano Man_{8}GlcNAc_{2} para producir Man_{9}GlcNAc_{2}. La estructura Man_{9}GlcNAc_{2}, que contiene tres restos de 1,6 manosa, después es un sustrato para 1,2-, 1,6- y 1,3-manosiltransferasas adicionales in vivo, conduciendo a las glucoproteínas hipermanosiladas que son características de S. cerevisiae y que pueden tener típicamente 30-40 restos de manosa por N-glucano. Debido a que Ochlp inicia la transferencia de 1,6 manosa al núcleo Man_{8}GlcNAc_{2}, se denomina con frecuencia la "1,6 manosiltransferasa de inicio" para distinguir la misma de otras 1,6 manosiltransferasas que actúan posteriormente en el Golgi. En una cepa mutante de ochl mnnl mnn4 de S. cerevisiae, las proteínas glucosiladas con Man_{8}GlcNAc_{2} se acumulan y no tiene lugar la hipermanosilación. Sin embargo, Man_{8}GlcNAc_{2} no es un sustrato para glucosiltransferasas de mamífero, tales como UDP-GlcNAc transferasa I, y por consiguiente, el uso de esa cepa mutante, por sí misma, no es útil para producir proteínas de tipo mamífero, es decir, las que tienen patrones de glucosilación complejos o híbridos.

Se pueden cortar estructuras de Man_{8}GlcNAc_{2} hasta una isómero de Man_{5}GlcNAc_{2} en S. cerevisiae (aunque todavía se tiene que demostrar un corte de alta eficacia mayor del 50% in vivo) introduciendo una manosidasa fúngica de A. saitoi en el retículo endoplásmico (RE). Los defectos de esta estrategia son dos: (1) no está claro si las estructuras Man_{5}GlcNAc_{2} formadas se forman de hecho in vivo (en lugar de haberse secretado y modificado adicionalmente por manosidasas en el exterior de la célula); y (2) no está claro si cualquier estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} formada, si de hecho se ha formado in vivo, es la isoforma correcta para ser un sustrato productivo para modificación posterior de N-glucano por GlcNAc transferasa I (Maras y col. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707).

Con el objetivo de proporcionar una glucoproteína más de tipo humano obtenida de un huésped fúngico, la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 describe un procedimiento para producir una glucoproteína híbrida obtenida de Trichoderma reesei. Un N-glucano híbrido tiene solamente restos de manosa en el brazo Man\alpha1-6 de la estructura de manosa central y una o dos antenas complejas en el brazo Man\alpha1-3. Aunque esta estructura tiene utilidad, el procedimiento tiene la desventaja de que se tienen que realizar numerosas etapas enzimática in vitro, lo que es costoso y requiere tiempo. Las enzimas aisladas son caras de preparar y necesitan sustratos costosos (por ejemplo, UDP-GlcNAc). El procedimiento tampoco permite la producción de glucanos complejos en una proteína deseada.

Actividad de Manosidasa Intracelular Implicada en el Corte de N-glucano

Se requiere actividad de alfa-1,2-manosidasa para el corte de Man_{8}GlcNAc_{2} para formar Man_{5}GlcNAc_{2}, que es un intermedio principal para la formación de N-glucano complejo en mamíferos. El trabajo previo ha demostrado que se puede expresar \alpha-1,2-manosidasa murina, fúngica y humana truncada en la levadura metilótrofa P. pastoris y presenta actividad de corte de Man_{8}GlcNAc_{2} hasta Man_{5}GlcNAc_{2} (Lal y col. (1998) Glycobiology 8(10): 981-95; Tremblay y col. (1998) Glycobiology 8 (6): 585-95, Callewaert y col. (2001) FEBS Lett. 503(2-3): 173-8). Sin embargo, hasta la fecha no existen informes que demuestran el alto nivel de corte in vivo de Man_{8}GlcNAc_{2} hasta Man_{5}GlcNAc_{2} en una glucoproteína secretada de P. pastoris.

Además, la mera presencia de una \alpha-1,2-manosidasa en la célula no garantiza, por sí misma, el corte intracelular apropiado de Man_{8}GlcNAc_{2} hasta Man_{5}GlcNAc_{2}. (Véase, por ejemplo, Contreras y col. documento WO 02/00856 A2, en el que se localiza una manosidasa marcada con HDEL de T. reesei principalmente en el RE y se co-expresa con una proteína indicadora de hemaglutinina (HA) de gripe en la que prácticamente no se pudo detectar Man_{5}GlcNAc_{2}. Véase también Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (41): 26298-26304, en el que una fusión quimérica de \alpha-1,2-manosidasa/dominio transmembrana de Ochlp localizada en el RE, Golgi temprano y citosol de S. cerevisiae, no tenía actividad de corte de manosidasa). Por consiguiente, la mera localización de una manosidasa en el RE o Golgi es insuficiente para garantizar la actividad de la respectiva enzima en ese orgánulo dirigido. (Véase también Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, que muestra que una \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei, aunque se localice intracelularmente, aumentó más que disminuyó el alcance de manosilación). Hasta la fecha no existen informes que demuestren la localización intracelular de una \alpha-1,2-manosidasa heteróloga activa en hongos o levaduras usando una secuencia de localización transmembrana.

Aunque es útil modificar cepas que son capaces de producir Man_{5}GlcNAc_{2} como la estructura de N-glucano principal, cualquier intento de modificar adicionalmente estas estructuras de precursor de alto contenido de manosa para parecerse más estrechamente a glucanos humanos requiere etapas adicionales in vivo o in vitro. Se describen procedimientos para humanizar adicionalmente glucanos de fuentes fúngicas y de levadura in vitro en la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 (anteriormente). Si se tiene que humanizar Man_{5}GlcNAc_{2} adicionalmente in vivo, se tiene que garantizar que las estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} generadas, de hecho, se generen intracelularmente y no sean el producto de actividad de manosidasa en el medio. La formación de N-glucano complejo en levaduras u hongos requerirá que se generen altos niveles de Man_{5}GlcNAc_{2} dentro de la célula debido a que solamente los glucanos Man_{5}GlcNAc_{2} intracelulares se pueden procesar adicionalmente hasta N-glucanos híbridos y complejos in vivo. Además, se tiene que demostrar que la mayoría de las estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} generadas de hecho son un sustrato para GnTI y por tanto, permiten la formación de N-glucanos híbridos y complejos.

Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos para producir glucoproteínas caracterizadas por un alto contenido intracelular de Man_{5}GlcNAc_{2} que se pueda procesar adicionalmente a estructuras de glucoproteína de tipo humano en células huésped eucariotas no humanas y, particularmente, en levaduras y hongos filamentosos.

N-Acetilglucosaminiltransferasas

Las N-acetilglucosaminiltransferasas ("GnT") pertenecen a otra clase de enzimas de glucosilación que modifican oligosacáridos ligados a N en la ruta secretora. Tales glucosiltransferasas catalizan la transferencia de monosacárido de donadores de nucleótido azúcar específicos en una posición de hidroxilo particular de un monosacárido en una cadena de glucano creciente en uno de dos posibles enlaces anoméricos (a o \beta). Dennis y col. (1999) Bioessays 21 (5): 412-21. Las GnT específicas añaden N-acetilglucosamina ("GlcNAc") al brazo Man\alpha1,6 o al brazo Man\alpha1,3 de un sustrato de N-glucano (por ejemplo, Man_{5}GlcNAc_{2} ("núcleo de manosa-5") y Man_{3}GlcNAc_{2} (una "estructura central interna")). El producto de reacción (por ejemplo, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}) después se puede modificar hasta estructuras de oligosacáridos ligados a N bi-, tri- y tetra-antenarias. El documento WO 02/00879 describe un procedimiento para producir glucoproteínas que tienen estructuras de hidrato de carbono "de tipo humano" que comprenden la etapa de dirigir enzimas tales como GnT I-VI a sitios in vivo de glucosilación tales como el RE/red de Golgi. El documento WO 02/00879 describe adicionalmente ejemplos particulares de células huésped tales como Pichia pastoris que son deficientes en OCH1 y que expresan enzimas de glucosilación tales como GnT I, GnT II y manosidasas. Choi y col. (2003) PNAS 100 (9): 5022-27 describen el aislamiento de cepas modificadas genéticamente de Pichia pastoris que producen glucoproteínas que tienen N-glucanos que tienen un estructura de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} con un alto rendimiento.

La N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIII") es una enzima que cataliza la adición de una GlcNAc en la manosa central del núcleo de trimanosa (Man\alpha1,6 (Man\alpha1,3) Man\beta1,4 - GlcNAc\beta1,4 - GlcNA\beta1,4 - Asn) de un oligosacárido ligado a N. La adición por GnTIII de una GlcNAc de bisección a un sustrato aceptor (por ejemplo, núcleo de trimanosa) produce un denominado N-glucano bisecado. Por ejemplo, la adición por GnTIII de una GlcNAc de bisección a la estructura de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} puede producir un N-glucano bisecado, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}. De forma similar, la adición por GnTIII de una GlcNAc de bisección a una estructura de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} produce otro N-glucano bisecado, GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}. Esta última estructura se ha implicado en una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80. Se pueden formar otros N-glucanos bisecados por la acción de GnTIII. Por ejemplo, GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} se puede convertir en GlcNAc_{2}Man_{4}GlcNAc_{2} bisecado, Man_{5}GlcNAc_{2} se puede convertir en GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} bisecado y GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} se puede convertir en GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} bisecado. Véase, por ejemplo, Narasimhan (1982) J. Biol. Chem. 257: 10235-42. Hasta ahora, la actividad de GnTIII se ha demostrado solamente en células de mamífero.

La re-modificación de glucoformas de inmunoglobulinas expresadas por células de mamífero es una tarea tediosa y compleja. Especialmente en el caso de GnTIII, donde la sobre-expresión de esta enzima se ha implicado en la inhibición del crecimiento, se han tenido que emplear procedimientos que implican expresión génica regulada (inducible) para producir inmunoglobulinas con N-glucanos bisecados. Umana y col. (1999) Biotechnol Bioeng. 65(5): 542-9; Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80; Umana y col. documento WO 03/011878; Patente de Estados Unidos Nº 6.602.684. Tal efecto de inhibición del crecimiento complica la capacidad de co-expresar la proteína diana y GnTIII y puede impartir un límite superior a la sobre-expresión de GnTIII. Patente de Estados Unidos Nº 6.602.684. Puede ser necesaria la optimización cuidadosa de los niveles de expresión de GnTIII. Id. Por lo tanto, lo que se necesita es un sistema de producción de proteína que utilice la capacidad inherente de títulos de producto robustos tales como los producidos en células huésped eucariotas inferiores (por ejemplo, levaduras y hongos filamentosos), que sea capaz de producir N-glucanos bisecados en proteínas, especialmente proteínas terapéuticas, expresadas en estas células. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, el desarrollo de las células huésped eucariotas inferiores usadas en tal sistema de producción de producción de proteína requiere que las rutas de glucosilación endógenas de las células huésped se modifiquen adicionalmente.

\vskip1.000000\baselineskip

Sumario de la invención

Se han desarrollado células huésped y líneas celulares que tienen rutas de glucosilación modificadas genéticamente que permiten que realicen una secuencia de reacciones enzimáticas que imitan el procesamiento de glucoproteínas en mamíferos, especialmente en seres humanos. Las proteínas recombinantes expresadas en estos huéspedes modificados producen glucoproteínas más similares, si no sustancialmente idénticas, a sus equivalentes de mamífero, por ejemplo, humanos. Las células huésped de la invención, es decir, una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso desarrollado en cultivo, se modifican para producir una glucoproteína que tiene una estructura de Man_{3}GlcNAc_{2} o de Man_{5}GlcNAc_{2} en la que se introduce un ácido nucleico que codifica una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III en la célula huésped en la que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnT III\Delta32 de ratón o GnT III\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae, de tal forma que más del 10% en mol de una glucoproteína recombinante producida en la célula huésped comprende una estructura de N-glucano bisecado. Este resultado se consigue usando una combinación de modificación y/o selección de cepas que, por ejemplo, no expresan enzimas que crean las estructuras indeseables características de las glucoproteínas fúngicas y que expresan N-acetilglucosaminiltransferasa III y, por ejemplo, expresan enzimas heterólogas adicionales capaces de producir una glucoproteína "de tipo humano".

Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de producción para una glucoproteína recombinante que comprende un glucano bisecado usando células huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que tienen un patrón de glucosilación diferente de seres humanos y que se modifican para producir una glucoproteína que tiene una estructura de Man_{3}GlcNAc_{2} o de Man_{5}GlcNAc_{2} y que comprenden una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, de tal forma que las células huésped se parecen más estrechamente a estructuras de hidratos de carbono encontradas en proteínas de mamífero, por ejemplo, humanas. Este procedimiento permite obtener una célula huésped modificada que se puede usar para expresar y dirigir cualquier gen o genes deseables, por ejemplo, uno implicado en la glucosilación, por procedimientos que están bien establecidos en la bibliografía científica y se conocen generalmente por el especialista en el campo de la expresión de proteínas. Se crean o seleccionan células huésped con oligosacáridos modificados. Para la producción de proteínas terapéuticas, este procedimiento se puede adaptar para modificar líneas celulares en las que se puede obtener cualquier estructura de glucosilación deseada.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona procedimientos para preparar una glucoproteína de tipo humano en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso por introducción en la célula de una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III donde dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnT III\Delta32 de ratón o GnT III\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae. En una realización preferida, dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III se expresa en la célula y, en una realización aún más preferida, esta expresión da como resultado la producción de N-glucanos que comprenden estructuras bisecadas de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}. En otra realización preferida, dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III es sustancialmente intracelular. En otra realización preferida de la invención, la glucoproteína que incluye los N-glucanos con estructuras bisecadas se aísla de la célula huésped eucariota inferior. En una realización aún más preferida, la glucoproteína producida en la célula huésped es una proteína terapéutica.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped que incluye tanto dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III como una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa II. En una realización preferida, la célula huésped que incluye dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III produce N-glucanos o glucoproteínas que comprenden estructuras de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc que son capaces de reaccionar con esta actividad. La actividad produce un glucano bisecado. La célula huésped de la invención, por tanto, incluye un N-glucano con un glucano bisecado. En una realización preferida, el N-glucano incluye más del 10% en mol del glucano bisecado. En algunas realizaciones, la célula huésped incluye un N-glucano que comprende estructuras bisecadas de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}. En una realización preferida, la célula huésped incluye una estructura central de Man_{5}GlcNAc_{2} o una estructura central de Man_{3}GlcNAc_{2} que se modifica por una GlcNAc de bisección. En una realización aún más preferida, la célula produce más del 10% en mol de la estructura modificada.

En otra realización de la invención, la célula huésped contiene una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa I además de dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III. En una realización preferida, las actividades son sustancialmente intracelulares. En otra realización preferida, la célula produce N-glucanos que comprenden GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} que son capaces de reaccionar con dicha actividad de GnTIII. Dicha actividad de GnTIII de la célula produce un glucano bisecado.

En otra realización, la célula huésped de la invención contiene tanto dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III como una actividad de manosidasa II. En una realización preferida, la célula huésped contiene adicionalmente una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa I. En otra realización preferida, la célula huésped contiene además una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa II. En otra realización preferida, la célula huésped contiene además tanto una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa I como una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa
II.

En otra realización, la célula huésped de la invención es deficiente en una actividad de OCH1 manosiltransferasa. Tal célula puede, por ejemplo, ser deficiente en una actividad de Dol-P-Man:Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol manosiltransferasa. En otra realización más, la célula huésped de la invención puede comprender además una actividad de \alpha-1,2-manosidasa I. En otra realización, la célula huésped puede comprende además un transportador de UDP-GlcNAc.

La presente invención también proporciona glucoproteínas recombinantes que se preparan mediante los procedimientos de la invención. La glucoproteína recombinante de la invención incluye una GlcNAc de bisección en una estructura central de Man_{5}GlcNAc_{2}, Man_{4}GlcNAc_{2} o Man_{3}GlcNAc_{2} y se produce en una célula huésped como se define en este documento. En otra realización, la glucoproteína incluye una GlcNAc de bisección unida a una estructura central seleccionada entre el grupo constituido por: GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} se produce en una célula huésped eucariota inferior. En una realización preferida, más del 10% en mol de las estructuras centrales de la glucoproteína de la invención se modifican por la GlcNAc de bisección.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen las glucoproteínas recombinantes de tipo humano de la invención producidas en una célula huésped de la invención. En este documento se describen adicionalmente vectores que codifican proteínas que tienen actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III y que contienen secuencias de péptido de dirección unidas. Las proteínas codificadas por los vectores se localizan en una célula huésped eucariota inferior de tal forma que producen N-glucanos que tienen estructuras bisecadas. La invención también se define por las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un diagrama esquemático de una ruta de N-glucosilación fúngica típica.

La Figura 1B es un diagrama esquemático de una ruta de N-glucosilación humana típica.

La Figura 2 ilustra la construcción de una genoteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión. La Figura 2A ilustra la inserción de un fragmento peptídico de dirección en pCR2.1 -TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). La Figura 2B muestra la sub-biblioteca de péptido de dirección generada que tiene sitios de restricción NotI-AscI. La Figura 2C ilustra la inserción de una región de dominio catalítico en pJN347, un vector pUC19 modificado. La Figura 2D muestra la sub-biblioteca de dominio catalítico generada que tiene sitios de restricción NotI, AscI y PacI. La Figura 2E ilustra una construcción de fusión particular generada a partir de la sub-biblioteca de péptido de dirección y la sub-biblioteca de dominio catalítico.

La Figura 3 ilustra la secuencia de ácido nucleico de fase de lectura abierta de \alpha-1,2-manosidasa IA de M. musculus (SEC ID Nº: 48) y la secuencia polipeptídica codificada (SEC ID Nº: 49). Las secuencias de los cebadores de PCR usados para generar truncamientos N-terminales están subrayadas.

Las Figuras 4A-4F ilustran la modificación de vectores con múltiples marcadores auxótrofos e integración genética de proteínas diana en el locus OCH1 de P. pastoris.

Las Figuras 5A-5E muestran análisis de MALDI-TOF que demuestra producción del dominio de kringle 3 (K3) de glucoproteínas de plasminógeno humano que tienen Man_{5}GlcNAc_{2} como la estructura de N-glucano predominante en P. pastoris. La Figura 5A ilustra el glucano Man_{5}GlcNAc_{2} convencional [a] (Glyko, Novato, CA) y Man_{5}GlcNAc_{2} + Na^{+} [b]. La Figura 5B muestra glucanos liberados por PNGasa de tipo silvestre de K3. Los N-glucanos mostrados son los siguientes: Man_{9}GlcNAc_{2} [d]; Man_{10}GlcNAc_{2} [e]; Man_{11}GlcNAc_{2} [f]; Man_{12}GlcNAc_{2} [g]. La Figura 5C ilustra la deleción de och1 que da como resultado la producción de Man_{8}GlcNAc_{2} [c] como el N-glucano predominante. Las Figuras 5D y 5E muestran la producción de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] después del corte in vivo de Man_{8}GlcNAc_{2} con una \alpha-1,2-manosidasa quimérica. El N-glucano predominante se indica por un pico con una masa (m/z) de 1253 coherente con su identificación como Man_{5}GlcNAc_{2} [b].

Las Figuras 6A-6F muestran análisis de MALDI-TOF que demuestra producción de glucoproteínas IFN-\beta que tienen Man_{5}GlcNAc_{2} como la estructura de N-glucano predominante en P. pastoris. La Figura 6A muestra Man_{5}GlcNAc_{2} convencional [a] y Man_{5}GlcNAc_{2} + Na^{+} [b] como el patrón (Glyko, Novato, CA). La Figura 6B muestra glucanos liberados por PNGasa - de tipo silvestre de IFN-\beta. La Figura 6C ilustra el knock-out de och1 que produce Man_{8}GlcNAc_{2} [c]; Man_{9}GlcNAc_{2} [d]; Man_{10}GlcNAc_{2} [e]; Man_{11}GlcNAc_{2} [f]; Man_{12}GlcNAc_{2} [g]; y ninguna producción de Man_{5}GlcNAc_{2} [b]. La Figura 6D muestra una cantidad relativamente pequeña de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] entre otros N-glucanos intermedios Man_{8}GlcNAc_{2} [c] a Man_{12}GlcNAc_{2} [g]. La Figura 6E muestra una cantidad significativa de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] con respecto a los demás glucanos Man_{8}GlcNAc_{2} [c] y Man_{9}GlcNAc_{2} [d] producidos por pGC5 (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón). La Figura 6F muestra la producción predominante de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] en la glucoproteína secretada IFN-\beta por pFB8 (SEC12(m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón). El N-glucano se indica por un pico con una masa (m/z) de 1254 coherente con su identificación como Man_{5}GlcNAc_{2} [b].

La Figura 7 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para: (A) patrón de Man9GlcNAc_{2} marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de P. pastoris, \Deltaoch1 transformado con manosidasa de pFB8, que demuestra una ausencia de actividad de manosidasa extracelular en el sobrenadante; y (C) patrón de Man_{9}GlcNAc_{2} marcado con 2-AB después de la exposición a manosidasa de T. reesei (control positivo).

La Figura 8 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para: (A) patrón de Man_{9}GlcNAc_{2} marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de P. pastoris, \Deltaoch1 transformado con manosidasa de pGC5, que demuestra una ausencia de actividad de manosidasa extracelular en el sobrenadante; y (C) patrón de Man_{9}GlcNAc_{2} marcado con 2-AB después de exposición a manosidasa de T. reesei (control positivo).

La Figura 9 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para: (A) patrón de Man_{9}GlcNAc_{2} marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de P. pastoris, \Deltaoch1 transformado con manosidasa de pBC 18-5, que demuestra ausencia de actividad de manosidasa extracelular en el sobrenadante; y (C) sobrenadante de medio de P. pastoris, \Deltaoch1 transformado con pDD28-3, que demuestra actividad en el sobrenadante (control
positivo).

Las Figuras 10A-10B demuestran la actividad de un transportador de UDP-GlcNAc en la producción de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en P. pastoris. La Figura 10A ilustra una cepa de P. pastoris (YSH-3) con una GnTI humana pero sin el transportador de UDP-GlcNAc dando como resultado cierta producción de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b] pero una producción predominante de Man_{5}GlcNAc_{2} [a]. La Figura 10B ilustra la adición de transportador de UDP-GlcNAc de K. lactis en una cepa (PBP-3) con la GnTI humana, que dio como resultado la producción predominante de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b]. El único pico prominente de masa (m/z) en 1457 es coherente con su identificación como GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b] como se muestra en la Figura 10B.

La Figura 11 muestra un óptimo de pH de una enzima manosidasa heteróloga codificada por pBB27-2 (MNN10(s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta31 de C. elegans) expresada en P. pastoris.

Las Figuras 12A-12C muestran análisis de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de un extracto sin células de K. lactis. La Figura 12A muestra los N-glucanos liberados de células de tipo silvestre, que incluyen N-glucanos de tipo de alto contenido de manosa. La Figura 12B muestra los N-glucanos liberados de células a las que se ha delecionado och1 mnn1, poniendo de manifiesto un pico de masa (m/z) distinto en 1908 coherente con su identificación como Man_{9}GlcNAc_{2} [d]. La Figura 12C muestra los N-glucanos liberados de células a las que se ha delecionado och1 mnn1 después de una digestión in vitro con \alpha-1,2-manosidasa correspondientes a un pico coherente con Man_{5}GlcNAc_{2}.

La Figura 13 es una vista esquemática de la estructura del oligosacárido ligado a dolicil pirofosfato.

La Figura 14 es una vista esquemática de la generación de N-glucanos GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} de células huésped fúngicas que son deficientes en actividades de alg3, alg9 o alg12.

La Figura 15 es una vista esquemática de reacciones de procesamiento requeridas para producir estructuras de oligosacárido de tipo mamífero en una célula huésped fúngica con un genotipo de alg3, och1.

La Figura 16 muestra Comparaciones de Secuencia de Alg3 de S. cerevisiae (Blast) (SEC ID Nº: 9-20, respectivamente, en orden de aparición).

La Figura 17 muestra Secuencias de ALG3 (SEC ID Nº: 21) y Alg3p (SEC ID Nº: 22) de S. cerevisiae.

La Figura 18 muestra Secuencias de ALG3 (SEC ID Nº: 23) y Alg3p (SEC ID Nº: 24) de P. pastoris.

La Figura 19 muestra Comparaciones de Secuencia de ALG3 de P. pastoris (Blast) (SEC ID Nº: 23-31, respectivamente, en orden de aparición).

La Figura 20 muestra Secuencias de ALG3 (SEC ID Nº: 33) y Alg3p (SEC ID Nº: 34) de K. lactis.

La Figura 21 muestra Comparaciones de Secuencia de ALG3 de K. lactis (Blast) (SEC ID Nº: 35-40, respectivamente, en orden de aparición).

La Figura 22 muestra un modelo de una inmunoglobulina IgG. La cadena pesada y la cadena ligera se pueden subdividir, basándose en estructura secundaria y terciaria similar, en dominios. Las dos cadenas pesadas (dominios V_{H}, C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3) se unen mediante tres puentes disulfuro. Las cadenas ligeras (dominios V_{L} y C_{L}) se unen por otro puente disulfuro a la porción C_{H}1 de la cadena pesada y, junto con los fragmentos C_{H}1 y V_{H}, establecen la región Fab. Los antígenos se unen en la porción terminal de la región Fab. Las funciones de efector, tales como unión a Receptor Fc-gamma, se han localizado en el dominio C_{H}2, justo cadena abajo de la región bisagra y están influidas por la N-glucosilación de asparagina 297 en la cadena pesada.

La Figura 23 es una revisión esquemática de un vector de expresión de IgG1 modular.

La Figura 24 muestra Secuencias de Ácido Nucleico (SEC ID Nº: 45) y de Aminoácidos (SEC ID Nº: 46) de GnTIII de M. musculus.

La Figura 25 (parte superior) es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 producida en un YSH-1 de P. pastoris que presenta un pico predominante en 1461 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d]; la Figura 25 (parte inferior) muestra un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 producida en un YSH-1 de P. pastoris transformado con manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNN2(s) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1140 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] y otros picos que se corresponden a GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] en 1303 m/z y GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] en 1465 m/z. Esta cepa se denominó YSH-37.

La Figura 26 (parte superior) es el análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 producida en YSH-1 de P. pastoris como se muestra en la Figura 25 (parte superior); la Figura 26 (parte inferior) es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 expresada en células YSH-1 de P. pastoris transformadas con una construcción pVA53 (MNN2(s) de S. cerevisiae/mGnTIII). El pico en 1463 m/z se corresponde a la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] y el pico en 1666 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} [a].

La Figura 27 (parte superior) es el análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 producida en YSH-1 de P. pastoris como se muestra en la Figura 25 (parte superior); la Figura 27 (parte inferior) es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 expresada en células YSH-1 de P. pastoris transformadas con una construcción pVA55 (MNN2(s) de S. cerevisiae/mGnTIII). El pico en 1463 m/z se corresponde a la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] y el pico en 1667 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} [a].

Figura 28 (parte superior) es el análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 producida en YSH-1 de P. pastoris como se muestra en la Figura 25 (parte superior); la Figura 28 (parte inferior) es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislado de una glucoproteína kringle 3 expresada en células YSH-1 de P. pastoris transformadas con una construcción pVB51 (GNT1(s) de K. lactis/mGnTIII). El pico predominante en 1463 m/z se corresponde a la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] y se observa un segundo pico en 1726 m/z [e], que no se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}.

La Figura 29 es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 expresada en células YSH-44 de P. pastoris. El pico predominante en 1356 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [x].

La Figura 30 es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 expresada en células YSH-44 de P. pastoris transformadas con una construcción pVA53 (MNN2(s) de S. cerevisiae/mGnTIII). El pico en 1340 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [x] y el pico en 1542 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} [y].

\newpage

La Figura 31 es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 expresada en células PBP6-5 de P. pastoris. El pico predominante en 1340 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [x].

La Figura 32 es un análisis de EM de MALDI-TOF de N-glucanos aislados de una glucoproteína kringle 3 expresada en células PBP6-5 de P. pastoris transformadas con una construcción pVA53 (MNN2(s) de S. cerevisiae/mGnTIII). El pico en 1340 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} [x] y el pico en 1543 m/z se corresponde a la masa de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} [y].

La Figura 33 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento, que demuestra una ausencia de actividad de GnTIII extracelular (pVA53) en el sobrenadante. El N-glucano GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} purificado de K3 expresado en una cepa PBP-3 se añadió a: BMMY (A); UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C); y el sobrenadante de YSH-57 + UDP-GlcNAc 1 mM (D).

La Figura 34 muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento, que muestra una ausencia de actividad de GnTIII extracelular (pVA53) en el sobrenadante. El N-glucano GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} purificado de K3 expresado en una cepa YSH-44 se añadió a: BMMY (A); UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); y el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C).

La Figura 35 es un diagrama esquemático que compara las rutas de glucosilación normal en seres humanos y P. pastoris (Panel A) con una ruta de N-glucosilación humanizada modificada en eucariotas inferiores (Panel B). La ruta modificada representa la construcción de la cepa de P. pastoris PBP6-5, que, después de la modificación con GnTIII, se convierte en la cepa de P. pastoris PBP38.

La Figura 36 es un diagrama esquemático que muestra la glucoforma secretada de forma predominante producida por cada una de las cepas de P. pastoris designadas y la modificación génica usada para modificar cada una de las cepas.

La Figura 37 es una representación estructural de la transferencia de una GlcNAc al intermedio de oligosacárido, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, producido en glucoproteínas en una célula huésped eucariota inferior, cuando se cataliza por GnTIII.

La Figura 38 es una representación estructural de la transferencia de una GlcNAc al intermedio de oligosacárido, GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, producido en glucoproteínas en una célula huésped de eucariota inferior, cuando se cataliza por GnTII, y la transferencia posterior de una GlcNAc al producto de esa reacción, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}, cuando se cataliza por GnTIII.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina de otro modo en este documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención deben tener los significados que se comprenden de forma común por los especialistas habituales en la técnica. Además, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, los términos en singular deben incluir los plurales y los términos en plural deberán incluir el singular. Los procedimientos y las técnicas de la presente invención generalmente se realizan con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con y las técnicas de bioquímica, enzimología, biología molecular y celular, microbiología, genética y química de proteína y ácido nucleico e hibridación descritas en este documentos son las bien conocidas y usadas de forma común en la técnica.

Los procedimientos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique de otro modo. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing Associates (1992, y Suplementos hasta 2002); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). Las nomenclaturas usadas en relación con y los procedimientos de laboratorio y técnicas de biología molecular y celular, bioquímica de proteínas, enzimología y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son las que se conocen bien y se usan de forma común en la técnica.

Las siguientes expresiones, a menos que se indique de otro modo, se debe entender que tienen los siguientes significados:

Como se usa en este documento, la expresión "N-glucano" se refiere a un oligosacárido ligado a N, por ejemplo, uno que está unido por un enlace de asparagina-N-acetilglucosamina a un resto de asparagina de un polipéptido. Los N-glucanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man_{3}GlcNAc_{2} ("Man" se refiere a manosa; "Glc" se refiere a glucosa; y "NAc" se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). La expresión "núcleo de trimanosa" usada con respecto al N-glucano también se refiere a la estructura Man_{3}GlcNAc_{2} ("Man_{3}"). La expresión "núcleo de pentamanosa" o "núcleo de Manosa-5" o "Man_{5}" usada con respecto al N-glucano se refiere a la estructura Man_{5}GlcNAc_{2}. Los N-glucanos difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GlcNAc, fucosa y ácido siálico) que se unen a la estructura central de Man_{3}. Los N-glucano se clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por ejemplo, manosa superior, complejo o híbrido).

Un N-glucano de tipo "alto contenido en manosa" tiene cinco o más restos de manosa. Un N-glucano de tipo "complejo" típicamente tiene al menos una GlcNAc unida al brazo de 1,3 manosa y al menos una GlcNAc unida al brazo de 1,6 manosa del núcleo de trimanosa. Los N-glucanos complejos también pueden tener restos de galactosa ("Gal") que están modificados opcionalmente con ácido siálico o derivados ("NeuAc", donde "Neu" se refiere a ácido neuramínico y "Ac" se refiere a acetilo). Un N-glucano complejo tiene típicamente al menos una rama que termina en un oligosacárido tal como, por ejemplo: NeuNAc-; NeuAc\alpha2-6GalNAc\alpha1-; NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-3GalNAc\alpha1-; NeuAc\alpha2-3/6Gal\beta1-GlcNAc\beta1-; GlcNAc\alpha1-4Gal\beta1-(solamente mucinas); Fuc\alpha1-2Gal\beta1-(grupo sanguíneo H). Los ésteres de sulfato pueden tener lugar en restos de galactosa, GalNAc y GlcNAc y los ésteres de fosfato pueden tener lugar en restos de manosa. El NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo) puede estar O-acetilado o sustituido por NeuGI (ácido-N-glucolilneuramínico). Los N-glucanos complejos también pueden tener sustituciones intracadena que comprenden GlcNAc "de bisección" y fucosa central ("Fuc"). Un N-glucano "híbrido" tiene al menos una GlcNAc en el extremo del brazo de 1,3 manosa del núcleo de trimanosa y cero o más manosas en el brazo de 1,6 manosa del núcleo de trimanosa.

El término "predominante" o "predominantemente" usado con respecto a la producción de N-glucanos se refiere a una estructura que representa el pico principal detectado por análisis de espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).

Las abreviaturas usadas en este documento son de uso común en la técnica, véase, por ejemplo, las abreviaturas de azúcares, anteriormente. Otras abreviaturas comunes incluyen "PNGasa", que se refiere al péptido N-glucosidasa F (EC 3.2.2.18); "GlcNAc Tr" o "GnT", que se refiere a enzimas N-acetilglucosaminil Transferasa, "NANA" se refiere a ácido N-acetilneuramínico.

Como se usa en este documento, una "glucoproteína humanizada" o una "glucoproteína de tipo humano" se refiere alternativamente a una proteína que tiene unida a la misma N-glucanos que tienen menos de cuatro restos de manosa e intermedios de glucoproteína sintética (que también son útiles y que se pueden manipular adicionalmente in vitro o in vivo) que tienen al menos cinco restos de manosa. Preferiblemente, las glucoproteínas producidas de acuerdo con la invención contienen al menos el 30% en mol, preferiblemente al menos el 40% en mol y más preferiblemente el 50, 60, 70, 80, 90 o incluso el 100% en mol del intermedio Man_{5}GlcNAc_{2}, al menos de forma transitoria. Esto se puede conseguir, por ejemplo, modificando una célula huésped de la invención para expresar una enzima de glucosilación "mejor", es decir, más eficaz. Por ejemplo, se selecciona una manosidasa de tal forma que tendrá una actividad óptima en las condiciones presentes en el sitio en la célula huésped donde las proteínas se glucosilan y se introduce en la célula huésped preferiblemente dirigiendo la enzima a un orgánulo de la célula huésped en el que se desea la actividad.

El término "enzima", cuando se usa en este documento en relación con alterar la glucosilación de la célula huésped, se refiere a una molécula que tiene al menos una actividad enzimática e incluye enzimas de longitud completa, fragmentos catalíticamente activos, quimeras, complejos y similares. Un "fragmento catalíticamente activo" de una enzima se refiere a un polipéptido que tiene un nivel detectable de actividad funcional (enzimática). La actividad de la enzima es "sustancialmente intracelular" cuando se puede medir menos del 10% de la actividad de la enzima en el exterior de la célula en comparación con la que se puede medir en células lisadas.

Una célula huésped eucariota inferior, cuando se describe en este documento en relación con perfiles de glucosilación, se refiere a cualquier célula eucariota que produce de forma normal N-glucanos de alto contenido de manosa y, por tanto, quiere decir que incluye algunas células animales o vegetales y más típicamente células eucariotas inferiores, que incluyen células fúngicas y de algas uni- y multicelulares. Una célula huésped de la presente invención es una levadura o un hongo unicelular o multicelular filamentoso.

Como se usa en este documento, la expresión "ruta de secreción" se refiere a la línea de ensamblaje de diversas enzimas de glucosilación a la que un precursor de oligosacárido ligado a lípido y un sustrato de N-glucano se exponen secuencialmente, siguiendo el flujo molecular de una cadena polipeptídica naciente desde el citoplasma al retículo endoplásmico (RE) y los compartimentos del aparato de Golgi. Se dice que las enzimas se localizan a lo largo de esta ruta. Una enzima X que actúa sobre un glucano ligado a lípido o un N-glucano antes que la enzima Y se dice que está o que actúa "aguas arriba" de una enzima Y; de forma similar, la enzima Y está o actúa "aguas abajo" de la enzima X.

La expresión "péptido de dirección" como se usa en este documento se refiere a secuencias de nucleótidos o aminoácidos que codifican un péptido señal de dirección celular que media en la localización (o retención) de una secuencia asociada en localizaciones sub-celulares, por ejemplo, orgánulos.

La expresión "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. La expresión incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico o sintético) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm o ARN sintético), así como análogos de ADN o ARN que contienen análogos de nucleótidos no naturales, enlaces internucleosídicos no nativos o ambos. El ácido nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser de cadena única, de doble cadena, de triple cadena, formar cuádruplex, tener parcialmente doble cadena, estar ramificado, formar una horquilla, ser circular o estar en una conformación de candado. La expresión incluye formas de cadena única y doble de ADN. Una molécula de ácido nucleico de esta invención puede incluir cadenas tanto con sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de lo anterior. Se pueden modificar química o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como se entenderá de forma sencilla por los especialistas en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psolareno, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia indicada por formación de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces peptídicos sustituyen enlaces de fosfato en la cadena principal de la molécula.

A menos que se indique de otro modo, un "ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: X" se refiere a un ácido nucleico, al menos una porción del cual tiene (i) la secuencia de la SEC ID Nº: X, o (ii) una secuencia complementaria a la SEC ID Nº: X. La elección entre ambos se indica por el contexto. Por ejemplo, si el ácido nucleico se usa como una sonda, la elección entre ambos se indica por el requisito de que la sonda sea complementaria a la diana deseada.

Un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" o "sustancialmente puro" (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que está asociado de forma natural. La expresión incluye un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno de origen natural, (2) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (3) se une operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza o (4) no tiene lugar en la naturaleza. La expresión "aislado" o "sustancialmente puro" también se puede usar con referencia a aislados de ADN recombinante o clonado, análogos de polinucleótidos sintetizados químicamente o análogos de polinucleótidos que se sintetizan biológicamente por sistemas heterólogos.

Sin embargo, "aislado" no requiere necesariamente que el propio ácido nucleico o polinucleótido descrito de este modo se haya eliminado físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógeno en el genoma de un organismo se considera "aislada" en este documento si se pone una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia que no es adyacente de forma natural a esta secuencia de ácido nucleico endógeno) adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógeno, de tal forma que la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógeno está alterada. A modo de ejemplo, el promotor nativo de un gen en el genoma de una célula humana se puede sustituir (por ejemplo, por recombinación homóloga) por una secuencia de promotor no nativo, de tal forma que este gen tenga un patrón de expresión alterado. Este gen ahora se convertiría en "aislado" debido a que se ha separado de al menos algunas de las secuencias que de forma natural lo flanquean.

Un ácido nucleico también se considera "aislado" si contiene cualquier modificación que no tiene lugar de forma natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera "aislada" si contiene una inserción, deleción o una mutación puntual introducida de manera artificial, por ejemplo, por intervención humana. Un "ácido nucleico aislado" incluye también un ácido nucleico integrado en un cromosoma de célula huésped en un sitio heterólogo, una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un "ácido nucleico aislado" puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usa en este documento, la frase "variante degenerada" de una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que se pueden traducir, de acuerdo con el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" o "idéntico" en el contexto de secuencias de ácido nucleico se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferiblemente al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en el Paquete de Wisconsin Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183: 63-98). Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto como se proporcionan en GCG Versión 6.1.

La expresión "homología sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente el 60% de las bases de nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente el 70%, más habitualmente al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, como se mide por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se ha analizado anteriormente.

Alternativamente, existe homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo hibrida con otro ácido nucleico, con una cadena de otro ácido nucleico, o con la cadena complementaria del mismo, en condiciones de hibridación rigurosas. Las "condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado rigurosas" en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico dependen de varios parámetros físicos diferentes. La hibridación de ácido nucleico se verá afectada por condiciones tales como concentración salina, temperatura, disolventes, la composición de bases de las especies hibridantes, la longitud de las regiones complementarias y el número de desapareamientos de bases de nucleótidos entre los ácidos nucleicos hibridantes, como se entenderá fácilmente por los especialistas en la técnica. El especialista habitual en la técnica conoce cómo variar esos parámetros para conseguir una rigurosidad particular de hibridación.

En general, la "hibridación rigurosa" se realiza a aproximadamente 25ºC por debajo del punto de fusión (T_{m}) térmico para el híbrido de ADN específico en un conjunto particular de condiciones. El "lavado riguroso" se realiza a temperaturas aproximadamente 5ºC por debajo de la T_{m} para el híbrido de ADN específico en un conjunto particular de condiciones. La T_{m} es la temperatura a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Véase Sambrook y col., anteriormente, página 9.51. Para los propósitos de este documento, las "condiciones de alta rigurosidad" se definen para hibridación en fase de solución como hibridación acuosa (es decir, sin formamida) en SSC 6X (donde SSC 20X contiene NaCl 3,0 M y citrato sódico 0,3 M), SDS al 1% a 65ºC durante 8-12 horas, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65ºC durante 20 minutos. Se entenderá por el especialista que la hibridación a 65ºC tendrá lugar a diferentes velocidades dependiendo de varios factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que están hibridando.

El término "mutado" cuando se aplica a secuencias de ácido nucleico significa que los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico se pueden insertar, delecionar o cambiar en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia. Se puede realizar una única alteración en un locus (una mutación puntual) o se pueden insertar, delecionar o cambiar múltiples nucleótidos en un único locus. Además, se pueden realizar una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico se puede mutar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, técnicas de mutagénesis tales como "PCR con tendencia a error" (un procedimiento para realizar PCR en condiciones en las que la fidelidad de copia de la ADN polimerasa es baja, de tal forma que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Véase, por ejemplo, Leung y col. (1989) Technique 1: 11-15 y Caldwell y Joyce (1992) PCR Methods Applic. 2: 28-33); y "mutagénesis dirigida a oligonucleótidos" (un procedimiento que permite la generación de mutaciones específicas de sitio en cualquier segmento de ADN clonado de interés. Véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson y col. (1988) Science 241: 53-57).

El término "vector" como se usa en este documento tiene por objeto referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral (analizado con más detalle más adelante). Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se pueden replicar junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores preferidos son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Tales vectores se denominan en este documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión").

Las secuencias de control de la expresión "unidas operativamente" se refieren a una unión en la que la secuencia de control de la expresión es contigua al gen de interés para controlar el gen de interés, así como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

La expresión "secuencia de control de la expresión" como se usa en este documento se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para afectar a la expresión de secuencias codificantes a las que están unidas operativamente. Las secuencias de control de la expresión son secuencias que controlan la transcripción, acontecimientos post-transcripcionales y traducción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de inicio de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático, secuencias que mejoran la eficacia de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosoma); secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína; y, cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción de proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión a ribosoma y una secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" tiene por objeto incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.

La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en este documento, tiene por objeto referirse a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico tal como un vector recombinante. Se debe entender que tales términos tienen por objeto referirse no solamente a la célula sujeto particular sino también a la progenie de tal célula. Debido a que pueden tener lugar ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero se incluye todavía en el alcance de la expresión "célula huésped" como se usa en este documento. Una célula huésped recombinante puede ser una célula aislada o una línea celular desarrollada en cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismos vivo.

El término "péptido" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que tiene típicamente menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y más típicamente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. El término como se usa en este documento incluye análogos y miméticos que imitan la función estructural y, por tanto, biológica.

El término "polipéptido" como se usa en este documento incluye proteínas tanto de origen natural como las que no son de origen natural y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de las mismas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender varios dominios diferentes, cada uno de los cuales tiene una o más actividades distintas.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que, debido a su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) cuando existe en una pureza no encontrada en la naturaleza, donde la pureza se puede estimar con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, está libre de otras proteínas de la misma especie) (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no tiene lugar en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido encontrado en la naturaleza o incluye análogos o derivados de aminoácidos no encontrados en la naturaleza o enlaces diferentes de los enlaces peptídicos convencionales). Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de forma natural estará "aislado" de sus componentes asociados de forma natural. Un polipéptido o una proteína también se puede convertir en sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica. Como se define, por tanto, "aislado" no requiere necesariamente que la proteína, polipéptido, péptido u oligopéptido descrito de este modo se haya retirado físicamente de su entorno nativo.

La expresión "fragmento polipeptídico" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con un polipéptido de longitud completa. En una realización preferida, el fragmento polipeptídico es una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. Los fragmentos tienen típicamente al menos 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 12, 14, 16 ó 18 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 25, 30, 35, 40 ó 45 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 50 ó 60 aminoácidos de longitud y aún más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud.

Un "derivado modificado" se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en el polipéptido nativo. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glucosilación, ubiquitinación, marcado, por ejemplo, con radionúclidos, y diversas modificaciones enzimáticas, como se entenderá de forma sencilla por los especialistas en la técnica. Una diversidad de procedimientos para marcar polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles para tales fines se conocen bien en la técnica e incluyen isótopos radioactivos tales como ^{125}I, ^{32}P, ^{35}S y ^{3}H, ligandos que se une a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y antiligandos que pueden servir como miembros de pares de unión específicos para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el cebador, requisitos de estabilidad e instrumentación disponible. Los procedimientos para marcar polipéptidos se conocen bien en la técnica. Véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y Suplementos hasta 2002).

Un "mutante polipeptídico" o "muteína" se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción, duplicación, deleción, reordenamiento o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo silvestre. Una muteína puede tener una o más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que un único aminoácido en una posición se ha cambiado a otro aminoácido, una o más inserciones y/o deleciones, en las que uno o más aminoácidos se insertan o delecionan, respectivamente, en la secuencia de la proteína de origen natural y/o truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera o en ambos de los extremos amino o carboxi. Una muteína puede tener la misma actividad biológica, pero preferiblemente, tiene una diferente, en comparación con la proteína de origen natural.

Una muteína tiene una homología de secuencia global de al menos el 70% con su equivalente de tipo silvestre. Se prefieren incluso más las muteínas que tienen una homología de secuencia global del 80%, 85% o del 90% con la proteína de tipo silvestre. En una realización incluso más preferida, una muteína muestra una identidad de secuencia del 95%, aún más preferiblemente el 97%, aún más preferiblemente el 98% y aún más preferiblemente el 99% de identidad de secuencia global. La homología de secuencia se puede medir mediante cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, tal como Gap o Bestfit.

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteolisis (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran la afinidad de unión o la actividad enzimática y (5) otorgan o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos.

Como se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis (2ª Edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha-, \alpha-disustituidos, aminoácidos de N-alquilo u otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxi-glutamato, \varepsilon-N-N-N-trimetillisina, \varepsilon-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en este documento, la dirección de la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección de la derecha es la dirección carboxi-terminal de acuerdo con el uso convencional y la convención.

Una proteína tiene "homología" o es "homóloga" a una segunda proteína si la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Alternativamente, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos "similares". (Por tanto, la expresión "proteínas homólogas" se define para querer decir que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares). Una proteína homóloga preferida es una que muestra el 60% de homología de secuencia con la proteína de tipo silvestre, se prefiere más una homología de secuencia del 70%. Se prefieren aún más proteínas homologas que muestran una homología de secuencia del 80%, 85% o del 90% con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferida, una proteína homóloga muestra una identidad de secuencia del 95%, 97%, 98% o del 99%. Como se usa en este documento, la homología entre dos regiones de secuencia de aminoácidos (especialmente con respecto a similitudes estructurales predichas) se interpreta que implica similitud en función.

Cuando "homólogo" se usa con referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de restos que no son idénticos con frecuencia difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que un resto aminoacídico se sustituye por otro resto aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de homología se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste se conocen bien por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Pearson (1990) Methods Enzymol. 183: 63-98).

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

La homología de secuencia para polipéptidos, que también se denomina porcentaje de identidad de secuencia, se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el Programa de Software de Análisis de Secuencia del Genetics Computer Group (GCG), Universidad de Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El software de análisis de proteína hace coincidir secuencias similares usando la medida de homología asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que se pueden usar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1.

Un algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de molécula inhibidora con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST (Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish y States (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden y col. (1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang y Madden (1997) Genome Res. 7: 649-656), especialmente blastp o tblastn (Altschul y col., 1997). Los parámetros preferidos para BLASTp son: Valor de expectativa: 10 (defecto); Filtro: seg (defecto); Coste de abrir un hueco: 11 (defecto); Coste de extender un hueco: 1 (defecto); Alineamientos máx.: 100 (defecto); Tamaño de palabra: 11 (defecto); Nº de descripciones: 100 (defecto); Matriz de Penalización: BLOWSUM62.

La longitud de secuencias polipeptídicas comparadas para homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 restos aminoacídicos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, típicamente al menos aproximadamente 28 restos y preferiblemente más de aproximadamente 35 restos. Cuando se explora una base de datos que contiene secuencias de un gran número de diferentes organismos, es preferible comparar secuencias de aminoácidos. La búsqueda en bases de datos usando secuencias de aminoácidos se puede medir por algoritmos diferentes de blastp conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias polipeptídicas se pueden comparar usando FASTA, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (véase Pearson (1990) Methods Enzymol. 183: 63-98). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), como se proporciona en GCG Versión 6.1.

El término "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento acoplado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles debido a que se pueden construir para contener dos o más elementos funcionales deseados de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de uno polipéptido de interés, más preferiblemente al menos 20 ó 30 aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 40, 50 ó 60 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 75, 100 ó 125 aminoácidos. Las proteínas de fusión se pueden producir recombinantemente construyendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo en fase con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido diferente y después expresando la proteína de fusión. Alternativamente, una proteína de fusión se puede producir químicamente reticulando el polipéptido o un fragmento del mismo con otra proteína.

El término "región" como se usa en este documento se refiere a una porción físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región se define por una porción contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

El término "dominio" como se usa en este documento se refiere a una estructura de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden tener la misma extensión que regiones o porciones de los mismos; los dominios también pueden incluir regiones distintas, no contiguas, de una biomolécula. Los ejemplos de dominio de proteína incluyen, pero sin limitación, un dominio de Ig, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

Como se usa en este documento, el término "molécula" significa cualquier compuesto, incluyendo, pero sin limitación, una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc. y tal compuesto puede ser natural o sintético.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado como se entiende de forma común por el especialista habitual en la técnica a la que se refiere esta invención. Los procedimientos y materiales ilustrativos se describen más adelante, aunque también se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica de la presente invención y serán evidentes para los especialistas en la técnica. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Los materiales, procedimientos y ejemplos son solamente ilustrativos y no tienen por objeto ser limitantes.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un número entero indicado o grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

Procedimientos Para Producir Glucoproteínas de tipo Humano en Células Huésped Eucariotas Inferiores

La invención proporciona procedimientos para producir una glucoproteína recombinante que comprende un glucano bisecado y que tiene glucosilación de tipo humano en una célula huésped de levadura o unicelular o multicelular modificada para producir una glucoproteína que tiene una estructura central de Man_{3}GlcNAc_{2} o de Man_{5}GlcNAc_{2} y que comprende una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, donde dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnT III\Delta32 de ratón o GnT III\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae. Como se describe con más detalle más adelante, una célula huésped eucariota que no expresa de forma natural, o que está modificada para no expresar, una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras de alto contenido de manosa, se selecciona como una célula huésped de partida. Tal célula huésped seleccionada se modifica para expresar una o más enzimas u otros factores requeridos para producir glucoproteínas de tipo humano. Una cepa huésped deseada se puede modificar en una enzima o más de una enzima al mismo tiempo. Además, una molécula de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades se puede usar para modificar una cepa huésped de la invención. Preferiblemente, se crea una biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas potencialmente útiles (por ejemplo, enzimas quiméricas que comprenden un fragmento enzimático catalíticamente activo ligado en fase con una secuencia de dirección subcelular heteróloga) (por ejemplo, por ligación de sub-bibliotecas que comprenden fragmentos enzimáticos y secuencias de dirección subcelulares) y una cepa que tiene una o más enzimas con actividades óptimas o que produce las glucoproteínas más de "tipo humano" se puede seleccionar transformando células huésped diana con uno o más miembros de la biblioteca.

En particular, los procedimientos descritos en este documento permiten obtener, in vivo, estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} con alto rendimiento, al menos de forma transitoria, con el fin de modificar las mismas adicionalmente para producir N-glucanos complejos. Un esquema exitoso para obtener estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas con rendimientos apropiados en una célula huésped, tal como un organismo eucariota inferior, implica generalmente dos estrategias paralelas: (1) reducir estructuras de alto contenido de manosa preparadas por actividades de manosiltransferasa endógenas, si las hay y (2) eliminar 1,2-\alpha-manosa por manosidasas para producir altos niveles de estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas que se pueden hacer reaccionar adicionalmente dentro de la célula huésped para formar glucoformas complejas, de tipo humano.

Por consiguiente, una primera etapa implica la selección o creación de una célula huésped eucariota, por ejemplo, un eucariota inferior, capaz de producir una estructura precursora específica de Man_{5}GlcNAc_{2} que es capaz de aceptar GlcNAc in vivo por la acción de una GlcNAc transferasa I ("GnTI"). En una realización, el procedimiento implica preparar o usar una célula huésped eucariota no humana empobrecida en una actividad de 1,6 manosiltransferasa con respecto al N-glucano en una glucoproteína. Preferiblemente, la célula huésped está empobrecida en una actividad de 1,6 manosiltransferasa de inicio (véase más adelante). Tal célula huésped carecerá de una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras de alto contenido de manosa que son indeseables para producir glucoproteínas de tipo humano.

Después se introducen una o más actividades enzimáticas en tal célula huésped para producir N-glucanos dentro de la célula huésped caracterizada por que tener al menos el 30% en mol de las estructuras de hidrato de carbono Man_{5}GlcNAc_{2} ("Man_{5}"). Las estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} son necesarias para la formación de N-glucano complejo: se tiene que formar Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo con un alto rendimiento (por ejemplo, en más del 30%), al menos de forma transitoria, ya que las reacciones posteriores de glucosilación de tipo mamífero y humano requieren Man_{5}GlcNAc_{2} o un derivado del mismo.

Esta etapa también requiere la formación de una estructura isomérica particular de Man_{5}GlcNAc_{2} dentro de la célula con un alto rendimiento. Aunque las estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} son necesarias para la formación de N-glucano complejo, su presencia no es de ninguna manera suficiente. Esto es debido a que Man_{5}GlcNAc_{2} puede aparecer en diferentes formas isoméricas, que pueden servir o no como un sustrato para GlcNAc transferasa I. Ya que la mayoría de las reacciones de glucosilación no están completas, una proteína glucosilada particular contiene generalmente una variedad de diferentes estructuras de hidratos de carbono (es decir, glucoformas) sobre su superficie. Por tanto, la mera presencia de cantidades traza (es decir, menos del 5%) de una estructura particular, Man_{5}GlcNAc_{2} es de poca relevancia práctica para producir glucoproteínas de tipo mamífero o humanas. Es la formación de un intermedio de Man_{5}GlcNAc_{2} que acepta GlcNAc transferasa I (Figura 1B) con un alto rendimiento (es decir, por encima del 30%) lo que se requiere. La formación de este intermedio es necesaria para permitir la síntesis in vivo posterior de N-glucanos complejos en proteínas glucosiladas de interés (proteínas diana).

Por consiguiente, algo o todo del Man_{5}GlcNAc_{2} producido por la célula huésped seleccionada tiene que ser un sustrato productivo para actividades enzimáticas junto con una ruta de glucosilación de mamífero, por ejemplo, puede servir como un sustrato para una actividad de GlcNAc transferasa I in vivo, formando de este modo el intermedio de N-glucano de tipo humano GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en la célula huésped. Preferiblemente, al menos el 10%, más preferiblemente al menos el 30% y mucho más preferiblemente el 50% o más del intermedio de Man_{5}GlcNAc_{2} producido en una célula huésped es un sustrato productivo para GnTI in vivo. Se entiende, por ejemplo, que si GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} se produce en el 10% y Man_{5}GlcNAc_{2} se produce en el 25% en una proteína diana, la cantidad total del Man_{5}GlcNAc_{2} producido de forma transitoria es del 35% debido a que GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} es un producto de Man_{5}GlcNAc_{2}.

El especialista habitual en la técnica puede seleccionar células huésped de la naturaleza, por ejemplo, hongos existentes u otros eucariotas inferiores que producen niveles significativos de Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo. Sin embargo, hasta ahora, no se ha demostrado que ningún eucariota inferior proporcione tales estructuras in vivo en más del 1,8% de los N-glucanos totales (véase, por ejemplo, Maras y col. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707). Alternativamente, tales células huésped se pueden modificar genéticamente para producir la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo. Se pueden usar procedimientos tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 para identificar la ausencia o presencia de glucosiltransferasas particulares, manosidasas y transportadores de nucleótido azúcar en una célula huésped diana u organismo de interés.

Inactivación de Enzimas de Glucosilación de Células Huésped Indeseables

Los procedimientos de la invención se refieren a la modificación de células huésped de levadura o de hongo unicelular o multicelular filamentoso para producir glucoproteínas recombinantes que tienen una estructura de Man_{3}GlcNAc_{2} o de Man_{5}GlcNAc_{2} y que comprenden estructuras de N-glucano bisecado de tipo humano que se consiguen introduciendo en las células huésped una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, donde dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnT III\Delta32 de ratón o GnT III\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae. En una realización preferida, los procedimientos se refieren a preparar células huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular en las que los precursores de oligosacáridos están enriquecidos en Man_{5}GlcNAc_{2}. Preferiblemente, se usa una célula huésped de levadura o de hongo unicelular o multicelular filamentoso que no expresa una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras de alto contenido de manosa. Tal célula huésped se puede encontrar en la naturaleza o se puede crear, por ejemplo, partiendo de o produciéndose a partir de uno de muchos de tales mutantes ya descritos en levaduras. Por tanto, dependiendo de la célula huésped seleccionada, uno o varios genes que codifican enzimas que se conoce que son características de reacciones de glucosilación no humana se tendrán que delecionar. Tales genes y sus proteínas correspondientes se han caracterizado de forma considerable en varios eucariotas inferiores (por ejemplo, S. cerevisiae, T. reesei, A. nidulans, etc.), proporcionando de este modo una lista de glucosiltransferasas conocidas en eucariotas inferiores, sus actividades y su respectiva secuencia genética. Es probable que estos genes se seleccionen del grupo de manosiltransferasas, por ejemplo, 1,3 manosiltransferasas (por ejemplo, MNN1 en S. cerevisiae) (Graham, 1991), 1,2 manosiltransferasas (por ejemplo, la familia KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6 manosiltransferasas (OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores (MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas en reacciones de glucosilación aberrantes, es decir, no humanas. Muchos de estos genes, de hecho, se han delecionado individualmente dando lugar a fenotipos viables con perfiles de glucosilación alterados. Los ejemplos se muestran en la Tabla 1.

Las células huésped preferidas de la invención, como se describen en este documento para ilustrar las etapas de manipulación requeridas, son mutantes sin hipermanosilación (och1) de Pichia pastoris o K. lactis. Al igual que otros eucariotas inferiores, P. pastoris procesa estructuras de Man_{9}GlcNAc_{2} en el RE con una \alpha-1,2-manosidasa para producir Man_{8}GlcNAc_{2} (Figura 1A). Por la acción de varias manosiltransferasas, esta estructura se convierte después en estructuras hipermanosiladas (Man>_{9}GlcNAc_{2}), también conocidas como mananos (Figura 35A). Además, se ha observado que P. pastoris es capaz de añadir grupos fosfato no terminales, por la acción de manosilfosfato transferasas, a la estructura de hidrato de carbono. Esto difiere de las reacciones realizadas en células de mamífero, que implican la eliminación en lugar de la adición de azúcares de manosa (Figura 35A). Es de importancia particular eliminar la capacidad de la célula huésped eucariota, por ejemplo, hongo, de hipermanosilar una estructura de Man_{8}GlcNAc_{2} existente. Esto se puede conseguir seleccionando una célula huésped que no hipermanosile o modificando genéticamente tal célula.

Los genes que están implicados en el proceso de hipermanosilación se han identificado, por ejemplo, en Pichia pastoris y creando mutaciones en estos genes, se puede reducir la producción de glucoformas "indeseables". Tales genes se pueden identificar por homología con manosiltransferasas existentes o sus reguladores (por ejemplo, OCH1, MNN4, MNN6, MNN1) encontrados en otros eucariotas inferiores tales como C. albicans, Pichia angusta o S. cerevisiae o mutageneizando la cepa huésped y seleccionando un fenotipo de glucosilación con manosilación reducida. Basándose en homologías frente a manosiltransferasas y manosilfosfato transferasas conocidas, se pueden diseñar cebadores de PCR (cuyos ejemplos se muestran en la Tabla 2) o usar genes o fragmentos génicos que codifican tales enzimas como sondas para identificar homólogos en genotecas de ADN de la diana o un organismo relacionado. Alternativamente, se puede identificar un homólogo funcional que tiene actividad de manosiltransferasa por su capacidad de complementar fenotipos de glucosilación particulares en organismos relacionados.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Cebadores de PCR

2

Para obtener el gen o los genes que codifican la actividad de 1,6-manosiltransferasa en P. pastoris, por ejemplo, se realizarían las siguientes etapas: los mutantes de OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a temperatura y crecen lentamente a temperaturas elevadas. Por tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante de OCH1 de S. cerevisiae con una genoteca de ADN o ADNc de P. pastoris. Están disponibles mutantes de S. cerevisiae, por ejemplo, en la Universidad de Stanford y están disponibles en el mercado en ResGen, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Los mutantes que presentan un fenotipo de crecimiento normal a temperatura elevada, después de haberse transformado con una genoteca de ADN de P. pastoris, probablemente llevarán un homólogo de OCH1 de P. pastoris. Tal genoteca se puede crear digiriendo parcialmente ADN cromosómico de P. pastoris con una enzima de restricción adecuada y, después de inactivar la enzima de restricción, ligando el ADN digerido en un vector adecuado, que se ha digerido con un enzima de restricción compatible.

Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, pRS314, un plásmido de bajo número de copias (CEN6/ARS4) basado en pBluescript que contiene el marcador Trp1 (Sikorski y Hieter (1989) Genetics 122: 19-27) y pFL44S, un plásmido de alto número de copias (2 \mu) basado en un pUC19 modificado que contiene el marcador URA3 (Bonneaud y col. (1991) Yeast 7: 609-615). Tales vectores se usan de forma común por investigadores académicos y están disponibles vectores similares en varios proveedores diferentes (por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad, CA); Pharmacia (Piscataway, NJ); New England Biolabs (Beverly, MA)). Los ejemplos adicionales incluyen pYES/GS, plásmido de expresión de levadura basado en origen de replicación 2 \mu de Invitrogen o el vehículo de clonación Yep24 de New England Biolabs.

Después de la ligación del ADN cromosómico y el vector, se puede introducir por transformación la genoteca de ADN en una cepa de S. cerevisiae con una mutación específica y seleccionar la corrección del fenotipo correspondiente. Después de subclonar y secuenciar el fragmento de ADN que es capaz de restaurar el fenotipo de tipo silvestre, se puede usar este fragmento para eliminar la actividad del producto génico codificado por OCH1 en P. pastoris usando mutagénesis in vivo y/o técnicas de recombinación bien conocidas por los especialistas en la técnica.

Alternativamente, si toda la secuencia genómica de una célula huésped particular, por ejemplo, un hongo, de interés se conoce, se pueden identificar tales genes simplemente buscando en bases de datos de ADN disponibles públicamente, que están disponibles en varias fuentes, tales como NCBI, Swissprot. Por ejemplo, buscando una secuencia genómica dada o base de datos con secuencias de un gen de 1,6 manosiltransferasa conocido (por ejemplo, OCH1 de S. cerevisiae), se pueden identificar genes de alta homología en tal genoma de célula huésped que pueden (pero no necesariamente) codificar proteínas que tienen actividad de 1,6-manosiltransferasa. Sin embargo, únicamente la homología de secuencia de ácido nucleico no es suficiente para probar que se ha identificado y aislado un homólogo que codifica una enzima que tiene la misma actividad. Por ejemplo, hasta la fecha no existen datos para mostrar que una deleción de OCH1 en P. pastoris elimina la actividad de 1,6-manosiltransferasa de inicio crucial (Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177; Contreras y col. documento WO 02/00856 A2). Por tanto, ningún dato prueba que el homólogo del gen OCH1 de P. pastoris realmente codifica esa función. Esa demostración se proporciona por primera vez en este documento.

Se han identificado homólogos para varias manosiltransferasas de S. cerevisiae en P. pastoris usando estas estrategias. Los genes homólogos tienen con frecuencia funciones similares a genes implicados en la manosilación de proteínas en S. cerevisiae y, por tanto, su deleción se puede usar para manipular el patrón de glucosilación en P. pastoris o, por analogía, en cualquier otra célula huésped, por ejemplo, células de hongo, vegetales, de insecto o animales, con rutas de glucosilación similares.

La creación de knock-outs génicos, una vez que se ha determinado una secuencia de gen diana dada, es una técnica bien establecida en la técnica que se puede realizar por el especialista habitual en la técnica (véase, por ejemplo, Rothstein (1991) Methods in Enzymology 194: 281). La elección de un organismo huésped se puede ver influida por la disponibilidad de buenas técnicas de transformación y alteración génica.

Si se tienen que anular varias manosiltransferasas, el procedimiento desarrollado por Alani y Kleckner (1987) Genetics 116: 541-545, por ejemplo, permite el uso repetido de un marcador de selección, por ejemplo, el marcador URA3 en levadura, para eliminar secuencialmente toda actividad de manosiltransferasa endógena indeseable. Esta técnica se ha refinado por otros pero implica básicamente el uso de dos secuencias de ADN repetidas, que flanquean un marcador de selección contrario. Por ejemplo: URA3 se puede usar como un marcador para garantizar la sección de un transformante que tiene integrada una construcción. Flanqueando el marcador URA3 con repeticiones directas, se pueden seleccionar en primer lugar transformantes que tengan integrada la construcción y, por tanto, que tienen alterado el gen diana. Después del aislamiento de los transformantes, y su caracterización, se puede contraseleccionar en una segunda ronda los que sean resistentes a ácido 5-fluoroótico (5-FOA). Las colonias que son capaces de sobrevivir en placas que contienen 5-FOA han perdido de nuevo el marcador URA3 por un acontecimiento de entrecruzamiento que implica las repeticiones que se han mencionado anteriormente. Por tanto, esta estrategia permite el uso repetido del mismo marcador y facilita la alteración de múltiples genes sin requerir marcadores adicionales. También se pueden usar técnicas similares para la eliminación secuencial de genes adaptados para el uso en otras células huésped eucariotas con otros marcadores de selección y de contraselección.

La eliminación de manosiltransferasas específicas, tales como 1,6 manosiltransferasa (OCH1) o manosilfosfato transferasas (MNN6, o genes que complementan mutantes Ibd) o reguladores (MNN4) en P. pastoris permite crear cepas modificadas de este organismo que sintetiza principalmente Man_{8}GlcNAc_{2} y que se puede usar para modificar adicionalmente el patrón de glucosilación para parecerse a estructuras de glucoforma más complejas, por ejemplo, las producidas en células de mamífero, por ejemplo, humanas. Una realización preferida de este procedimiento utiliza secuencias de ADN que codifican actividades de glucosilación bioquímicas para eliminar funciones bioquímicas similares o idénticas en P. pastoris para modificar la estructura de glucosilación de glucoproteínas producidas en la cepa de P. pastoris alterada genéticamente.

Los procedimientos usados para modificar la ruta de glucosilación en levaduras como se ilustra en este documento se pueden usar en hongos filamentosos para producir un sustrato preferido para modificación posterior. Se pueden desarrollar estrategias para modificar rutas de glucosilación en A. niger y otros hongos filamentosos, por ejemplo, usando protocolos análogos a los descritos en este documento para modificar cepas para producir glucoproteínas de tipo humano en levadura. Las actividades génicas indeseadas implicadas en la actividad de 1,2 manosiltransferasa, por ejemplo, homólogos de KTR/KRE, se modifican o eliminan. Un hongo filamentoso, tal como Aspergillus, es un huésped preferido debido a que carece de la actividad de 1,6 manosiltransferasa y, como tal, no se esperaría una actividad génica de hipermanosilación, por ejemplo, OCH1, en este huésped. Por el contrario, otras actividades deseadas (por ejemplo, \alpha-1,2-manosidasa, transportador de UDP-GlcNAc, glucosiltransferasa (GnT), galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST)) implicadas en la glucosilación se introducen en el huésped usando los procedimientos de dirección de la invención.

Modificación o Selección de Huéspedes que Tienen Actividad de \alpha-1,6 Manosiltransferasa de Inicio Disminuida

En una realización preferida, el procedimiento de la invención implica preparar o usar una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que esté disminuida o empobrecida en la actividad de una \alpha-1,6-manosiltransferasa de inicio, es decir, una enzima específica de inicio que inicia la manosilación de cadena externa en el brazo \alpha-1,3 de la estructura central de Man_{3}GlcNAc_{2}. En S. cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen OCH1. La alteración del gen OCH1 en S. cerevisiae da como resultado un fenotipo en el que los azúcares ligados a N carecen completamente de la cadena externa de poli-manosa. Las estrategias anteriores para obtener glucosilación de tipo mamífero en cepas fúngicas han requerido la inactivación de OCH1 (véase, por ejemplo, Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273: 26298-304). La alteración de la actividad de \alpha-1,6-manosiltransferasa de inicio en una célula huésped de la invención puede ser opcional, sin embargo (dependiendo de la célula huésped seleccionada), ya que la enzima Och1p requiere un Man_{8}GlcNAc_{2} intacto para el inicio de cadena externa de manosa eficaz. Por tanto, las células huésped seleccionadas o producidas de acuerdo con esta invención que acumulan oligosacáridos que tienen siete o menos restos de manosa pueden producir N-glucanos hipoglucosilados que probablemente serán malos sustratos para Och1p (véase, por ejemplo, Nakayama y col. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).

El gen OCH1 se clonó de P. pastoris (Ejemplo 1) y K. lactis (Ejemplo 9), como se ha descrito. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen OCH1 de K. lactis se exponen en las SEC ID Nº: 7 y 8. Mediante el uso de cebadores específicos de genes, se preparó una construcción de cada clon para delecionar el gen OCH1 del genoma de P. pastoris y K. lactis (Ejemplos 1 y 9, respectivamente). De este modo se obtuvieron células huésped empobrecidas en actividad de \alpha-1,6-manosiltransferasa de inicio y modificadas para producir N-glucanos que tienen una estructura de hidrato de carbono Man_{5}GlcNAc_{2} (véase, por ejemplo, Figuras 5, 6 y 12; Ejemplos 4 y 9).

Por tanto, en este documento se describe además una molécula de ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o que está constituida por al menos cuarenta y cinco, preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 60 y mucho más preferiblemente 75 o más restos de nucleótidos del gen OCH1 de K. lactis (SEC ID Nº: 7) y homólogos, variantes y derivados de la misma. En este documento también se describen moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico que se han descrito anteriormente. De forma similar, se proporcionan polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento. También se describen vectores, que incluyen vectores de expresión, que comprenden las anteriores moléculas de ácido nucleico como se describe adicionalmente en este documento. De forma similar, se proporcionan células huésped transformadas con las moléculas de ácido nucleico o vectores descritos en este documento.

En este documento se describen adicionalmente procedimientos para preparar o usar una célula huésped eucariota no humana disminuida o empobrecida en una actividad del gen alg (es decir, actividades de alg incluyendo actividades enzimáticas equivalentes en células huésped no fúngicas) e introducir en la célula huésped al menos una actividad de glucosidasa. En una realización específica, la actividad de glucosidasa se introduce provocando la expresión de una o más actividades de manosidasa dentro de la célula huésped, por ejemplo, por activación de una actividad de manosidasa o por expresión de una molécula de ácido nucleico de una actividad de manosidasa en la célula huésped.

En otra realización, el procedimiento implica preparar o usar una célula huésped disminuida o empobrecida en la actividad de una o más enzimas que transfieren un resto de azúcar al brazo 1,6 de precursores de oligosacáridos ligados a lípidos (Figura 13). Una célula huésped de la invención se selecciona o se modifica introduciendo una mutación en uno o más de los genes que codifican una enzima que transfiere un resto de azúcar (por ejemplo, manosila) al brazo 1,6 de un precursor de oligosacárido ligado a lípido. El resto de azúcar es más preferiblemente manosa, es preferiblemente una glucosa, GlcNAc, galactosa, ácido siálico, fucosa o un resto de fosfato de GlcNAc. En una realización preferida, la actividad de una o más enzimas que manosilan el brazo 1,6 de precursores de oligosacáridos ligados a lípidos está disminuida o empobrecida. El procedimiento puede comprender además la etapa de introducir en la célula huésped al menos una actividad de glucosidasa (véase a continuación).

En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para producir una glucoproteína recombinante de tipo humano en un huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso, donde la glucoproteína comprende un N-glucano bisecado que tiene al menos dos GlcNAc unidas a una estructura central de trima-
nosa.

En cada anterior realización, el procedimiento se refiere a preparar una célula huésped de levadura u hongo filamento unicelular o multicelular en la que los precursores de oligosacárido unidos a lípido están enriquecidos en estructuras de Man_{x}GlcNAc_{2}, donde X es 3, 4 ó 5 (Figura 14). Estas estructuras se transfieren en el RE de la célula huésped a cadenas polipeptídicas nacientes por oligosacaril-transferasa y después se pueden procesar por tratamiento con glucosidasas (por ejemplo, \alpha-manosidasas) y glucosiltransferasas (por ejemplo, GnT1) para producir N-glucanos que tienen estructuras centrales de GlcNAcMan_{x}GlcNAc_{2}, donde X es 3, 4 ó 5 y es preferiblemente 3 (Figuras 14 y 15). Como se muestra en la Figura 14, los N-glucanos que tienen una estructura central de GlcNAcMan_{x}GlcNAc_{2} donde X es mayor de 3 se pueden convertir en GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, por ejemplo, por tratamiento con una actividad de \alpha-1,3 y/o \alpha-1,2-1,3 manosidasa, cuando sea aplicable.

El procesamiento adicional de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} por tratamiento con glucosiltransferasas (por ejemplo,
GnTII) produce estructuras centrales de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que después se pueden modificar, como se desee, por ejemplo, por tratamiento ex vivo o por expresión heteróloga en la célula huésped de un conjunto de enzimas de glucosilación, que incluyen glucosiltransferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase a continuación), para convertirse en N-glucanos de tipo humano. Las glucoproteínas de tipo humano recombinantes preferidas que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen las que comprenden N-glucanos bisecados que tienen siete o menos o tres o menos restos de manosa; comprenden uno o más azúcares seleccionados entre el grupo constituido por galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa; y comprenden al menos una rama de oligosacárido que comprende la estructura NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man.

En una realización, la célula huésped tiene actividad disminuida o empobrecida de Dol-P-Man:Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol Manosiltransferasa, que es una actividad implicada en la primera etapa de manosilación de Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol a Man_{6}GlcNAc_{2}-PP-Dol en el lado luminal del RE (por ejemplo, ALG3 Figura 13; Figura 14). En S. cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen ALG3. Como se ha descrito anteriormente, las células de S. cerevisiae que alojan una mutación de alg3-1 parcial acumulan Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol y las células que tienen una deleción en alg3 parecen transferir estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} a cadenas polipeptídicas nacientes dentro del RE. Por consiguiente, en esta realización, las células huésped acumularán N-glucanos enriquecidos en estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} que después se pueden convertir en GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} por tratamiento con glucosidasas (por ejemplo, con actividades de \alpha-1,2 manosidasa, \alpha-1,3 manosidasa o \alpha-1,2-1,3 manosidasa) y actividades de glucosiltransferasa (por ejemplo, GnTI, GnTII) (Figura 14; Figura 35B).

Como se describe en el Ejemplo 10, se diseñaron cebadores degenerados basándose en un alineamiento de secuencias de proteína Alg3 de S. cerevisiae, D. melanogaster y seres humanos (H. sapiens) (Figuras 16 y 17) y se usaron para amplificar un producto de ADN genómico de P. pastoris. El producto de PCR resultante se usó como una sonda para identificar y aislar un clon genómico de P. pastoris que comprende una fase de lectura abierta (ORF) que codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia global del 35% y una similitud de secuencia del 53% con el gen ALG3 de S. cerevisiae (Figuras 18 y 19). Este de gen de P. pastoris se denomina en este documento "PpALG3". El gen ALG3 se identificó de forma similar y se aisló de K. lactis (Ejemplo 10; Figuras 20 y 21).

Por lo tanto, en este documento se describe además una molécula de ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o que está constituida por al menos cuarenta y cinco, preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 60 y mucho más preferiblemente 75 o más restos de nucleótidos del gen ALG3 de P. pastoris (Figura 18) y el gen ALG3 de K. lactis (Figura 20) y homólogos, variantes y derivados de las mismas. También se describen en este documento moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico que se han descrito anteriormente. De forma similar, se proporcionan polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico que se describen adicionalmente en este documento (los productos génicos de ALG3 de P. pastoris y K. lactis se muestran en las Figuras 18 y 20). Además, también se proporcionan vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico también descrita en este documento, como se describe adicionalmente en este documento.

Usando cebadores específicos de genes, se preparó una construcción para delecionar el gen PpALG3 en el genoma de P. pastoris (Ejemplo 10). Esta cepa se usó para generar una célula huésped empobrecida en actividad de Dol-P-Man:Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol Manosiltransferasa y produce precursores de Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol ligados a lípidos que se transfieren a cadenas polipeptídicas nacientes para producir N-glucanos que tienen una estructura de hidrato de carbono Man_{5}GlcNAc_{2}

Como se describe en el Ejemplo 11, tal célula huésped se puede modificar por expresión de manosidasas apropiadas para producir N-glucanos que tienen la estructura de hidrato de carbono central Man_{3}GlcNAc_{2} deseada. La expresión de GnT en la célula huésped (por ejemplo, dirigiendo una molécula de ácido nucleico o una biblioteca de moléculas de ácido nucleico como se describe más adelante) permite que la célula huésped modificada produzca N-glucanos que tienen una o dos estructuras de GlcNAc unidas a cada brazo de la estructura central Man3 (es decir, GlcNAc_{1}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}; véase la Figura 15). Estas estructuras se pueden procesar adicionalmente usando los procedimientos de la invención para producir N-glucanos de tipo humano en proteínas que entran en la ruta de secreción de la célula huésped.

En una realización preferida, el procedimiento de la invención implica preparar o usar una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que esté tanto (a) disminuida o empobrecida en la actividad de un gen alg o en una o más actividades que manosilan N-glucanos en el brazo \alpha-1,6 de la estructura de hidrato de carbono central Man_{3}GlcNAc_{2} ("Man3"); como (b) disminuida o empobrecida en la actividad de una \alpha-1,6-manosiltransferasa de inicio, es decir, una enzima específica de inicio que inicia la manosilación de cadena externa (en el brazo \alpha-1,3 de la estructura central Man3). En S. cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen OCH1. La alteración del gen ochl en S. cerevisiae da como resultado un fenotipo en el que los azúcares ligados a N carecen completamente de la cadena externa de poli-manosa. Las estrategias previas para obtener glucosilación de tipo mamífero en cepas fúngicas han requerido la inactivación de OCH1 (véase, por ejemplo, Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273: 26298-304). La alteración de la actividad de \alpha-1,6-manosiltransferasa de inicio en una célula huésped de la invención es opcional, sin embargo (dependiendo de la célula huésped seleccionada), ya que la enzima Ochlp requiere Man_{8}GlcNAc intacto para el inicio de cadena externa de manosa eficaz. Por tanto, las células huésped seleccionadas o producidas de acuerdo con esta invención, que acumulan oligosacáridos ligados a lípido que tienen siete o menos restos de manosa, después de la transferencia producirán N-glucanos hipoglucosilados que probablemente serán malos sustratos para Ochlp (véase, por ejemplo, Nakayama y col. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).

Modificación o Selección de Huéspedes que Tienen Actividad de N Acetilglucosaminiltransferasa III

La invención proporciona un procedimiento para producir una glucoproteína de tipo humano recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso expresando una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, donde dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnT III\Delta32 de ratón o GnT III\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae. En una realización, una célula huésped (por ejemplo, P. pastoris) se modifica para producir más N-glucanos de tipo humano, por ejemplo, por activación de dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III o por expresión de una molécula de ácido nucleico de dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III. Usando técnicas bien conocidas en la técnica, se diseñan cebadores específicos de genes para complementar las regiones homólogas de un gen de GnTIII, preferiblemente un gen de GnTIII de mamífero (por ejemplo, GnTIII de ratón) (Figura 24), para los que ya están disponibles secuencias en la técnica (por ejemplo, Número de Acceso de Genbank L39373) y se amplifican por PCR.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una glucoproteína de tipo humano recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso (por ejemplo, P. pastoris), donde la glucoproteína comprende un N-glucano bisecado que muestra una GlcNAc de bisección en una estructura central de trimanosa o trimanosilo (Man_{3}GlcNAc_{2}). En esta realización, GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} (que se puede producir haciendo reaccionar un núcleo de trimanosa con la actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa I ("GnTT") pero que se produce típicamente cortando GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} por una actividad de \alpha-1,3/\alpha-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II (Hamilton y col. (2003) Science 301: 1244-46)) se hace reaccionar con dicha actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III para producir un GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado. Por consiguiente, la invención proporciona una actividad de GnTIII que transfiere \beta-1,4 GlcNAc a sustratos que son capaces de aceptar la GlcNAc de bisección en células huésped de levadura u hongos unicelulares o multicelulares filamentosos.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una glucoproteína de tipo humano recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso (por ejemplo, P. pastoris), donde la glucoproteína comprende un N-glucano bisecado que muestra una GlcNAc de bisección en una estructura central de trimanosa o trimanosilo (Man_{3}GlcNAc_{2}) que tiene al menos dos GlcNAc unidas al núcleo de trimanosa. En esta realización, Man_{3}GlcNAc_{2} se hace reaccionar con una actividad de GnTI y después con una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII") y dicha actividad de GnTIII (en cualquier orden) para producir un GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado (Figura 38). Se debe entender que la estructura central de trimanosilo bisecada de esta realización también puede contener un grupo manosilo adicional en lugar de un resto de GlcNAc. Por ejemplo, GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} se puede hacer reaccionar con dicha actividad de GnTIII para producir un GlcNAc_{2}Man_{4}GlcNAc_{2} bisecado.

La invención también proporciona un procedimiento para producir una glucoproteína recombinante más de tipo humano en una célula huésped de levadura u hongo filamento unicelular o multicelular (por ejemplo, P. pastoris), donde la glucoproteína producida comprende un N-glucano bisecado que tiene al menos dos GlcNAc unidas a una estructura central de pentamanosa (Man_{5}GlcNAc_{2}) y que muestra un N-glucano bisecado. Por consiguiente, en esta realización, una estructura central de pentamanosa (Man_{5}GlcNAc_{2}) se hace reaccionar con dicha actividad de GnTIII para producir una estructura de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{s}GlcNAc_{2} bisecada.

En una realización alternativa, una estructura central de pentamanosa producida por la mutación de genes och1 y alg3 se hace reaccionar con \alpha1,2-manosidasa, GnTI, GnTII y dichas actividades de GnTIII y UDP-GlcNAc para producir un glucano GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado (Figura 35B). En otra realización, una estructura de central de pentamanosa se hace reaccionar con GnTI y dicha actividad de GnTIII (en cualquier orden o en combinación) para producir una estructura de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} bisecada (Figura 37).

En una realización más preferida, al usar el procedimiento de genoteca de ADN combinatoria como se describe más adelante, una construcción pVA53 que comprende el líder MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso de GenBank NP_009571) fusionado con un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII\Delta32) se expresa en una cepa de P. pastoris YSH-1 (Ejemplo 13), produciendo de este modo N-glucanos que tienen una estructura de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} bisecada (Ejemplo 20). La Figura 26 (parte inferior) presenta el espectro de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa que se ha mencionado anteriormente, que se denomina PBP26 (Figura 36), que muestra un pico predominante en 1666 m/z [a], que se corresponde a GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} bisecado. (Para comparación, la Figura 26 (parte superior) presenta el espectro de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-1 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante en 1461 m/z [d] se corresponde al glucano no modificado: GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}). Por consiguiente, en una realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos de forma transitoria, N-glucanos bisecados que muestran al menos el 50% en mol de un GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} o al menos el 50% en mol de una estructura de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que tiene una GlcNAc de bisección. El porcentaje en mol de los glucanos es con referencia al porcentaje de glucanos neutros totales como se detecta por MALDI-TOF. Se entiende que si, por ejemplo, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que tiene una GlcNAc de bisección se produce en el 20% y GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} se produce en el 25% en una proteína diana, la cantidad total de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} producido de forma transitoria que tiene una GlcNAc de bisección es del 45%, debido a que GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} es un producto de un GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que tiene una GlcNAc de bisección que se hecho reaccionar adicionalmente con GnTII.

De forma similar, en otra realización, una construcción pVA55 que comprende el líder MNN2(1) de S. cerevisiae (Nº de Acceso de GenBank NP_009571) fusionado con un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII \Delta32) se expresa en una cepa de P. pastoris (YSH-1) produciendo de este modo N-glucanos GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} y una estructura GlcNAC_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} de N-glucano bisecado. Como se muestra en la Figura 27 (parte inferior), estas estructuras se corresponden a picos en 1463 m/z y 1667 m/z, respectivamente. (Para comparación, la Figura 27 (parte superior) presenta el espectro de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-1 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante se corresponde a GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} no modificada en 1461 m/z [d]. Por consiguiente, en otra realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos de forma transitoria, N-glucanos que muestran al menos el 20% en mol de un GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} o al menos el 20% en mol de una estructura de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que tiene una GlcNAc de bisección.

En una realización aún más preferida, una construcción pVA53 que comprende el líder MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso de GenBank NP_009571) fusionado con un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII \Delta32) se expresa en una cepa de P. pastoris YSH-44 (Ejemplo 15) produciendo de este modo N-glucanos que tienen una estructura de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado (Ejemplo 20). La Figura 30 presenta el espectro de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa que se ha mencionado anteriormente denominada YSH-57, que muestra un pico predominante en 1542 m/z [y], que se corresponde al glucano bisecado GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}. (Para comparación, la Figura 29 presenta el espectro de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-44 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante en 1356 m/z [x] en la Figura 29 se corresponde al glucano no modificado: GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}). Por consiguiente, en una realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glucanos que presentan al menos el 80% en mol de una estructura de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} que tiene una GlcNAc de bisección. El porcentaje en mol de los glucanos es con referencia al porcentaje de glucanos neutros totales como se detecta por MALDI-TOF.

Como alternativa, en otra realización, una construcción pVA53 que comprende el líder MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso de GenBank NP_009571) fusionado con un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII \Delta32) se expresa en una cepa de P. pastoris (PBP6-5) (Ejemplo 11) produciendo de este modo N-glucanos que tienen un GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} y una estructura de GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado. Como se muestra en la Figura 32, estas estructuras se corresponden a picos en 1340 m/z y 1543 m/z, respectivamente. Por consiguiente, en otra realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glucanos que muestran al menos el 20% en mol de una estructura GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} que tienen una GlcNAc de bisección en una célula huésped mutante de alg3.

La invención proporciona procedimientos para producir una glucoproteína de tipo humano recombinante que comprende un glucano bisecado en una levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso, donde la glucoproteína comprende una estructura central de Man_{5}GlcNAc_{2} o una estructura central de Man_{3}GlcNAc_{2} y donde la estructura central está modificada adicionalmente por dos o más GlcNAc. En la invención, más del 80% de las estructuras centrales están modificadas de este modo. En una realización altamente preferida, una de los GlcNAc es una GlcNAc de bisección.

En otro aspecto de la invención, una genoteca de ácido nucleico combinatoria que codifica al menos un dominio catalítico de GnTIII se usa para expresar una actividad de GnTIII en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso (Ejemplo 18). Preferiblemente, una biblioteca descrita adicionalmente en este documento comprende una sub-biblioteca de secuencias líder fusionadas en fase con una única molécula de ácido nucleico o una sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de GnTIII, una o más de la cuales codifican una dominio catalítico que tiene actividad de GnTIII en la célula huésped. Alternativamente, una única molécula de ácido nucleico o una sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias líder se fusiona en fase con una sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de GnTIII, una o más de las cuales codifican un dominio catalítico que tiene actividad de GnTIII en la célula huésped. (Véase más adelante). La expresión de estas y otras de tales bibliotecas combinatorias se realiza en una célula huésped que expresa una glucoproteína diana cuyas estructuras de N-glucano se analizan para determinar si y cuánta GnTIII se expresa. Una amplia variedad de enzimas de GnTIII catalíticamente activa se puede producir en una célula huésped usando los procedimientos y las bibliotecas descritas en este documento. Es este aspecto de los procedimientos descritos en este documento lo que permite a un especialista crear y delimitar entre enzimas de GnTIII que tienen poca o ninguna actividad y las enzimas que se expresa de forma activa y que producen niveles predominantes de un intermedio de oligosacárido bisecado deseado tal como GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} en las células huésped.

Como se describe adicionalmente más adelante, la dirección apropiada de una enzima responsable de una etapa dada en la ruta de glucosilación a la localización subcelular apropiada y la suficiencia de la actividad de la enzima al pH particular de esa localización subcelular son factores importantes en la producción de glucoproteínas que tienen N-glucanos con las estructuras deseadas. El uso de bibliotecas combinatorias de proteínas de fusión para generar diversas poblaciones de quimeras enzimáticas y la exploración de estas bibliotecas en células transformadas proporciona un procedimiento potente para identificar cepas huésped con la actividad de interés en la localización apropiada. En realizaciones preferidas de la invención, la actividad de la enzima se localiza de tal forma que una glucoproteína que contiene N-glucano expresada en la célula es capaz de reaccionar con la actividad durante el proceso de secreción.

No todas las combinaciones de líder/dominios catalíticos producen, sin embargo, actividades enzimáticas deseadas. Se crea una amplia diversidad de combinaciones de líder/dominio catalítico, solamente unas pocos de las cuales pueden ser útiles para producir los intermedios deseados en este momento. Sin embargo, también se describen en este documento incluso las combinaciones que no muestran en este momento una actividad enzimática deseada en la célula huésped ilustrada. La Figura 28 (parte inferior) muestra una construcción pVB51 que comprende el líder GNT(s) de K. lactis (Nº de Acceso GenBank AF106080) fusionado con un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII \Delta32) expresado en una cepa de P. pastoris YSH-1, que no muestra de forma sencilla actividad de GnTIII. (Para comparación, la Figura 28 (parte superior) presenta el espectro de MALDI-TOF de N-glucanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-1 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante se corresponde a GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} no modificado en 1461 m/z). Se observa el pico predominante en la Figura 28 (parte inferior) en 1463 m/z, que se correlaciona con la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. También se observa un segundo pico en 1726 m/z, que no se correlaciona con la masa de GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}. Se considera que esta y otras de tales combinaciones pueden ser útiles, con o sin ligeras modificaciones usando técnicas bien conocidas en la técnica, cuando se expresan, por ejemplo, en otras células huésped incluyendo las que se han modificado para producir glucoformas de tipo humano.

El uso de bibliotecas combinatorias para generar diversas poblaciones de quimeras enzimáticas y la exploración de estas bibliotecas en células transformadas permite adicionalmente que se identifiquen cepas en las que la actividad de la enzima sea sustancialmente intracelular. El siguiente Ejemplo 6 proporciona un ejemplo de condiciones de ensayo útiles para medir la actividad extracelular de \alpha-1,2-manosidasa. Los Ejemplos 22 y 23 también proporcionan ejemplos de ensayos para actividad de glucosiltransferasa (GnTIII) en el medio. Véase también la Tabla 9, a continuación y Choi y col. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(9): 5022-27. Para los propósitos de la invención, una actividad enzimática es sustancialmente intracelular cuando menos del 10% de la actividad enzimática se puede medir en el medio extracelular.

Como se describe en los Ejemplos 11, 12, 13, 14, 15 y 19-21, una célula huésped se puede modificar por la expresión de glucosiltransferasas apropiadas (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa) para producir N-glucanos que tengan las estructuras de hidrato de carbono deseadas (por ejemplo, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}). La expresión de GnT en la célula huésped (por ejemplo, dirigiendo una molécula de ácido nucleico o una biblioteca de moléculas de ácido nucleico como se describe más adelante y en Choi y col. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(9): 5022-27 y el documento WO 02/00879) permite que la célula huésped modificada produzca N-glucanos que tengan la GlcNAc de bisección en la manosa central. Estas estructuras se pueden procesar adicionalmente usando los procedimientos de la invención para producir N-glucanos de tipo humano en proteínas que entran en la ruta de secreción de la célula huésped.

En una realización más preferida, la co-expresión de transportador o transportadores y transferasa o transferasas de UDP-azúcar apropiados protegerá los restos \alpha-1,6 y \alpha-1,3 terminales así como la manosa central con GlcNAc, dando como resultado el precursor del complejo de tipo mamífero (por ejemplo, GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}) y N-glucosilación híbrida. Estas cadenas de oligosacáridos ligados a N unidos a péptidos sirven entonces como un precursor para modificación adicional hasta una estructura de oligosacárido de tipo mamífero. La expresión posterior de galactosiltransferasas y la modificación genética de la capacidad de transferir ácido siálico a los extremos (véase la Figura 1B) producirá una estructura de N-glucano de tipo mamífero (por ejemplo, de tipo humano).

Células Huésped de la Invención

Una célula huésped de la invención es una célula de levadura o de hongo unicelular o multicelular filamentoso, por ejemplo, levadura, un hongo unicelular y multicelular o filamentoso. Sin embargo, una amplia diversidad de células huésped se consideran útiles en los procedimientos de la invención. Las células vegetales o las células de insecto, por ejemplo, se pueden modificar para expresar una glucoproteína de tipo humano de acuerdo con la invención. Asimismo, una diversidad de células huésped no humanas, de mamífero, se pueden alterar para expresar glucoproteínas más de tipo humano o alteradas de otro usando los procedimientos de la invención. Como entenderá un especialista en la técnica, se puede usar cualquier célula huésped eucariota, (incluyendo una célula humana) junto con una biblioteca descrita en este documento para expresar una o más proteínas quiméricas que se dirigen a una localización subcelular, por ejemplo, orgánulo, en la célula huésped donde la actividad de la proteína está modificada y, preferiblemente, está aumentada. Tal proteína es preferiblemente -pero no tiene porque ser necesariamente- una enzima implicada en la glucosilación de proteína, como se ilustra en este documento. Se considera que se puede dirigir cualquier secuencia codificante de proteína y seleccionar para actividad modificada en una célula huésped eucariota usando los procedimientos descritos en este documento.

Los eucariotas inferiores que son capaces producir glucoproteínas que tienen el N-glucano Man_{5}GlcNAc_{2} unido son particularmente útiles debido a que (a) carecen de un alto grado de manosilación (por ejemplo, más de 8 manosas por N-glucano o especialmente 30-40 manosas), muestran inmunogenicidad reducida en seres humanos; y (b) el N-glucano es un sustrato para reacciones de glucosilación adicionales para formar una glucoforma incluso más de tipo humano, por ejemplo, por la acción de GlcNAc transferasa I (Figura 1B; \beta1,2 GnTI) para formar GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Se obtiene un rendimiento de más del 30% en mol, más preferiblemente un rendimiento del 50, 60, 70, 80, 90 ó incluso del 100% en mol, de las glucoproteínas con N-glucanos que tienen una estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}. En una realización preferida, se demuestra que más del 50% de la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} es un sustrato para una actividad de GnTI y puede servir como tal sustrato in vivo.

Los eucariotas inferiores preferidos de la invención incluyen pero sin limitación: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp.., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

En cada anterior realización, el procedimiento se refiere a preparar una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso en la que los precursores de oligosacáridos están enriquecidos en Man_{5}GlcNAc_{2}. Estas estructuras son deseables debido a que se pueden procesar después por tratamiento in vitro, por ejemplo, usando el procedimiento de Maras y Contreras, Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251. Sin embargo, en una realización preferida, los precursores enriquecidos en Man_{5}GlcNAc_{2} se procesan por al menos una reacción de glucosilación adicional in vivo -con glucosidasas (por ejemplo, \alpha-manosidasas) y glucosiltransferasas (por ejemplo, GnTI)- para producir N-glucanos de tipo humano. Los precursores de oligosacáridos enriquecidos en Man_{5}GlcNAc_{2}, por ejemplo, se procesan preferiblemente a los que tienen estructuras centrales de GlcNAcMan_{x}GlcNAc_{2}, donde X es 3, 4 ó 5 y es preferiblemente 3. Los N-glucanos que tienen una estructura central de GlcNAcMan_{x}GlcNAc_{2} donde X es mayor de 3 se pueden convertir en GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, por ejemplo, por tratamiento con una actividad de \alpha-1,3 y/o \alpha-1,6 manosidasa, cuando sea aplicable. El procesamiento adicional de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} por tratamiento con glucosiltransferasas (por ejemplo, GnTII) produce estructurales centrales de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que después se pueden modificar, cuando se desee, por ejemplo, por tratamiento ex vivo o por expresión heteróloga en la célula huésped de enzimas de glucosilación adicionales, que incluyen glucosiltransferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante), para convertirse en N-glucanos de tipo humano.

Las glucoproteínas de tipo humano recombinantes preferidas que comprenden un glucano bisecado que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen las que comprenden N-glucanos que tienen siete o menos, o tres o menos, restos de manosa; y que comprenden uno o más azúcares seleccionados entre el grupo constituido por galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa.

Otra célula huésped no humana preferida de la invención es un hongo unicelular o filamentoso, que está disminuido o empobrecido en la actividad de una o más actividades del gen alg (incluyendo una actividad enzimática que es un homólogo o equivalente a una actividad de alg). Otra célula huésped preferida de la invención está disminuida o empobrecida en la actividad de una o más enzimas (diferentes de actividades de alg) que manosilan el brazo \alpha-1,6 de una estructura de oligosacárido ligado a lípido.

Aunque se prefieren células huésped de levadura o unicelulares o multicelulares, una amplia diversidad de células huésped que tienen las propiedades que se han mencionado anteriormente se consideran útiles en los procedimientos de la invención. Las células vegetales, por ejemplo, se pueden modificar para expresar una glucoproteína de tipo humano de acuerdo con la invención. Asimismo, una diversidad de células huésped de mamífero, no humanas, se pueden alterar para expresar glucoproteínas más de tipo humano usando los procedimientos de la invención. Se puede modificar una célula huésped apropiada o se puede usar uno de los muchos de tales mutantes que ya se han descrito en levaduras. Una célula huésped preferida de la invención, como se ilustra en este documento, es un mutante sin hipermanosilación (OCH1) en Pichia pastoris, que se ha modificado adicionalmente para delecionar el gen alg3.

La invención proporciona adicionalmente una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso capaz de producir glucoproteínas recombinantes que tienen N-glucanos bisecados, tales como GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} y preferiblemente GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecados. En la invención, la célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso comprende una actividad de GnTIII donde dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III de GnTIII\Delta32 de ratón o GnTIII\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae. En una realización más preferida, las células huésped comprenden además una o más actividades seleccionadas entre: GnTI, GnTII, GnTIV y GnTV. Las células huésped preferidas expresan GnTI, GnTII y dicha actividad de GnTIII. Otras células huésped preferidas expresan adicionalmente GnTIV y/o GnTV. Aún más preferiblemente, la una o más actividades de GnT de las células huésped son sustancialmente intracelu-
lares.

Por tanto, en realizaciones preferidas de la invención, las células huésped de la invención que comprenden la una o más actividades de GnT producen N-glucanos bisecados que comprenden estructuras, que incluyen, pero sin limitación, GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} o GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, que son capaces de reaccionar con dicha actividad de enzima GnTIII para producir N-glucanos bisecados de forma correspondiente. Las actividades de enzima convierten de este modo las glucoproteínas que contienen estos N-glucanos en formas con propiedades nuevas y más deseables. Debido a que se entiende actualmente que GnTIII inhibe la actividad de GnT adicional en células de mamífero, el especialista debe entender que la reacción de glucosilación secuencial puede tener o no importancia. Sin embargo, la presente invención considera la adición de GnTI y dicha actividad de GnTIII en cualquier orden o de manera conjunta. También se debe entender que otras actividades enzimáticas dentro de la célula, tales como, por ejemplo, una o más actividades de manosidasa deseadas (por ejemplo, una 1,2 manosidasa, Manosidasa I, Manosidasa II) pueden actuar de forma concertada con las actividades de GnT para generar otras glucoproteínas de tipo humano más de interés (véase la Figura 1B).

En una realización preferida, una manosidasa II o un fragmento catalíticamente activo de la misma se introduce en la célula huésped para cortar los brazos que contienen \alpha1,3 y \alpha1,6 manosa de una estructura central de pentamanosa bisecada tal como GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}. Los glucanos resultantes (por ejemplo, GlcNAc_{2}Man_{4}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecados) son sustratos preferidos para la modificación de N-glucano de tipo humano posterior.

En otra realización de la invención, las células huésped comprenden una estructura central de Man_{5}GlcNAc_{2} o una estructura central de Man_{3}GlcNAc_{2} modificada por dos o más GlcNAc. Se debe entender que cualquier estructura central puede incluir modificaciones adicionales además de la modificación por GlcNAc. Preferiblemente, el 10% o más de las estructuras centrales están modificadas por GlcNAc. Más preferiblemente, el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o incluso más de las estructuras centrales contienen la modificación de GlcNAc.

\vskip1.000000\baselineskip

Formación de N-glucanos complejos

La formación de la síntesis de N-glucano complejo es un procedimiento secuencial por el que se eliminan restos de azúcar específicos y se unen a la estructura de oligosacárido central. En eucariotas superiores, esto se consigue exponiendo el sustrato de forma secuencial a diversas enzimas de procesamiento. Estas enzimas realizan reacciones específicas dependiendo de su localización particular dentro de toda la cascada de procesamiento. Esta "línea de ensamblaje" consiste en RE, Golgi temprano, medial y tardío y la red de Golgi trans, todos con su entorno de procesamiento específico. Para re-crear el procesamiento de glucoproteínas humanas en el Golgi y RE de eucariotas inferiores, se tienen que expresar numerosas enzimas (por ejemplo, glucosiltransferasas, glucosidasas, fosfatasas y transportadores) y se tienen que dirigir específicamente a estos orgánulos y, preferiblemente, en una localización de tal forma que funcionen de forma más eficaz en relación a su entorno así como en relación a otras enzimas en la
ruta.

Debido a que un objetivo de los procedimientos descritos en este documento es conseguir una cepa de producción de proteína robusta que sea capaz de funcionar bien en un procedimiento de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma de la célula huésped implica una planificación cuidadosa. Como se ha descrito anteriormente, uno o más genes que codifican enzimas que se conoce que son características de reacciones de glucosilación no humanas preferiblemente se delecionan. La cepa celular modificada se transforma con una variedad de diferentes genes que codifican actividades deseadas y estos genes se transforman de un modo estable, garantizando de este modo que se mantenga la actividad deseada a lo largo del proceso de fermentación.

Cualquier combinación de las siguientes actividades enzimáticas se puede modificar de forma única o de forma múltiple en el huésped usando los procedimientos de la invención: sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos del RE y Golgi (por ejemplo, transportadores de cotransporte unidireccional y bidireccional para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacáridos activados tales como UDP-galactosa y CMP-ácido-N-acetilneuramínico. Preferiblemente, se introducen actividades enzimáticas en una o más moléculas de ácido nucleico (véase también más adelante). Las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir de forma única o de forma múltiple, por ejemplo, en el contexto de una biblioteca de ácido nucleico tal como una biblioteca combinatoria descrita en este documento. Sin embargo, se tiene que entender que se pueden introducir actividades enzimática únicas o múltiples en una célula huésped de cualquier modo, incluyendo, pero sin limitación, procedimientos de suministro de proteínas y/o mediante el uso de una o más moléculas de ácido nucleico sin usar necesariamente una biblioteca de ácido nucleico o biblioteca combinatoria descrita en este documento.

Expresión de Glucosiltransferasas para Producir N-glucanos Complejos

Con la información de secuencia de ADN, el especialista puede clonar moléculas de ADN que codifican actividades de GnT (por ejemplo, Ejemplo 3, 8, 11, 15 y 18). Usando técnicas convencionales bien conocidas por los especialista en la técnica, se pueden insertar moléculas de ácido nucleico que codifican GnTI, II, III, IV o V (o que codifican fragmentos catalíticamente activos de los mismos) en vectores de expresión apropiados bajo el control transcripcional de promotores y otras secuencias de control de la expresión capaces de dirigir la transcripción en una célula huésped seleccionada de la invención, por ejemplo, una célula huésped fúngica, tal como Pichia sp., Kluyveromyces sp. y Aspergillus sp., como se describe en este documento, de tal forma que una o más de estas enzimas de GnT de mamífero se pueden expresar de forma activa en una célula huésped de elección para la producción de una glucoproteína compleja de tipo humano (por ejemplo, Ejemplos 8, 20 y 21).

Varias glucosiltransferasas individuales se han clonado y expresado en S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos, sin embargo, sin demostrar el resultado deseado de "humanización" en el patrón de glucosilación de los organismos (Yoshida y col. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8; Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). Se especuló que la estructura de hidrato de carbono requerida para aceptar azúcares por la acción de tales glucosiltransferasas no estaba presente en cantidades suficientes, lo que contribuyó muy probablemente a la ausencia de la formación de N-glucano complejo.

Un procedimiento preferido de la invención proporciona la expresión funcional de una actividad de GnT, tal como GnTI, GnTII y GnTIII de esta invención en el aparato de Golgi temprano, medial o tardío, y garantiza un suministro suficiente de UDP-GlcNAc (por ejemplo, por expresión de un transportador de UDP-GlcNAc; véase los siguientes Ejemplos).

Procedimientos para Proporcionar Precursores de Nucleótido Azúcar al Aparato de Golgi

Para que una glucosiltransferasa funcione satisfactoriamente en el Golgi, la enzima requiere una concentración suficiente de un nucleótido azúcar apropiado, que es el donador de alta energía del resto de azúcar añadido a una glucoproteína naciente. En seres humanos, toda la variedad de precursores de nucleótido azúcar (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, etc.) se sintetiza generalmente en el citosol y se transporta al Golgi, donde se une al oligosacárido central por glucosiltransferasas.

Para repetir este procedimiento en células huésped no humanas, tales como eucariotas inferiores, se tienen que expresar transportadores específicos de nucleósido azúcar en el Golgi para garantizar niveles adecuados de precursores de nucleósido azúcar (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91(2): A406-A406; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715). Se pueden proporcionar nucleótido azúcar a los compartimentos apropiados, por ejemplo, expresando en el microorganismo huésped un gen exógeno que codifica un transportador de nucleótido azúcar. La elección de una enzima transportadora está influida por la naturaleza de la glucosiltransferasa exógena que se está usando. Por ejemplo, una GlcNAc transferasa puede requerir un transportador de UDP-GlcNAc, una fucosiltransferasa puede requerir un transportador de GDP-fucosa, una galactosiltransferasa puede requerir un transportador de UDP-galactosa y una sialiltransferasa puede requerir un transportador de CMP-ácido siálico.

La proteína transportadora añadida transporta un nucleótido azúcar desde el citosol al aparato de Golgi, donde el nucleótido azúcar se puede hacer reaccionar por la glucosiltransferasa, por ejemplo, para alargar un N-glucano. La reacción libera un nucleósido difosfato o monofosfato, por ejemplo, UDP, GDP o CMP. Los nucleósidos monofosfato se pueden exportar directamente desde el Golgi en intercambio por azúcares de nucleósido trifosfato por un mecanismo de cotransporte bidireccional. La acumulación de un nucleósido difosfato, sin embargo, inhibe la actividad adicional de una glucosiltransferasa. Ya que esta reacción parece ser importante para la glucosilación eficaz, frecuentemente es deseable proporcionar una copia expresada de un gen que codifica una nucleótido difosfatasa. La difosfatasa (específica para UDP o GDP cuando sea apropiado) hidroliza el difosfonucleósido para producir nucleósido monosfosfato y un fosfato inorgánico.

Las enzimas transportadoras adecuadas, que son típicamente de origen de mamífero, se describen más adelante. Tales enzimas se pueden introducir en una célula huésped seleccionada usando los procedimientos de la invención.

En otro ejemplo, la \alpha 2,3- o \alpha 2,6-sialiltransferasa protege restos de galactosa con ácido siálico en el Golgi trans y TGN de seres humanos conduciendo a una forma madura de la glucoproteína (Figura 1B). Para volver a introducir esta etapa de procesamiento en una levadura o un hongo modificado metabólicamente se requerirá (1) actividad de \alpha 2,3- o \alpha 2,6-sialiltransferasa y (2) un suministro suficiente de CMP-ácido-N-acetilneuramínico, en el Golgi tardío de levadura. Para obtener una actividad de \alpha 2,3-sialiltransferasa suficiente en el Golgi tardío, por ejemplo, el dominio catalítico de una sialiltransferasa conocida (por ejemplo, de seres humanos) se tiene que dirigir al Golgi tardío en hongos (véase anteriormente). Asimismo, se tienen que insertar transportadores para permitir el transporte de CMP-ácido-N-acetilneuramínico al Golgi tardío. Actualmente no existe indicación de que los hongos sinteticen o incluso que puedan transportar cantidades suficientes de CMP-ácido-N-acetilneuramínico al Golgi. Por consiguiente, para garantizar el suministro adecuado de sustrato para las glucosiltransferasas correspondientes, se tiene que insertar metabólicamente la producción de CMP-ácido siálico en el hongo.

UDP-N-acetilglucosamina

El ADNc de transportador de UDP-N-acetilglucosamina humano, que se reconoció por una búsqueda de homología en la base de datos de etiquetas de secuencia expresada (dbEST), se ha clonado (Ishida (1999) J. Biochem. 126(1): 68-77). El transportador de membrana de Golgi de mamífero para UDP-N-acetilglucosamina se clonó por corrección fenotípica con ADNc de células de riñón caninas (MDCK) de un mutante de Kluyveromyces lactis caracterizado recientemente deficiente en transporte de Golgi del nucleótido azúcar anterior (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892). Los resultados demuestran que el gen de transportador de UDP-GlcNAc de Golgi de mamífero tiene toda la información necesaria para que la proteína se exprese y se dirija funcionalmente al aparato de Golgi de levadura y que dos proteínas con secuencias de aminoácidos muy diferentes pueden transportar el mismo soluto dentro de la misma membrana de Golgi (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892).

Por consiguiente, se puede incorporar la expresión de un transportador de UDP-GlcNAc en una célula huésped mediante una construcción de ácido nucleico que puede contener, por ejemplo: (1) una región por la que la construcción transformada se mantiene en la célula (por ejemplo, origen de replicación o una región que media en la integración cromosómica), (2) un gen marcador que permite la selección de células que se han transformado, incluyendo marcadores de contraselección y reciclables tales como ura3 o T-urf13 (Soderholm y col. (2001) Biotechniques 31(2): 306-10) u otros marcadores de selección bien caracterizados (por ejemplo, his4, bla, Sh ble etc.), (3) un gen o fragmento del mismo que codifica un transportador de UDP-GlcNAc funcional (por ejemplo, de K. lactis, (Abeijon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 5963-5968) o de H. sapiens (Ishida y col. (1996) J. Biochem. (Tokio) 120(6): 1074-8) y (4) un promotor que activa la expresión de la biblioteca de construcción de fusión de dominio de localización/catalítico que se ha mencionado anteriormente.

GDP-Fucosa

El transportador de GDP-fucosa de membrana de Golgi en hígado de rata se ha identificado y purificado por Puglielli y Hirschberg (1999) J. Biol. Chem. 274(50): 35596-35600. El gen correspondiente no se ha identificado, sin embargo, se puede usar la secuenciación N-terminal para el diseño de sondas oligonucleotídicas específicas para el gen correspondiente. Estos oligonucleótidos se pueden usar como sondas para clonar el gen que codifica el transportador de GDP-fucosa.

UDP-Galactosa

Dos genes heterólogos, gmal2(+) que codifica alfa 1,2-galactosiltransferasa (alfa 1,2 GalT) de Schizosaccharomyces pombe y (hUGT2) que codifica el transportador de UDP-galactosa (UDP-Gal) humano, se han expresado funcionalmente en S. cerevisiae para examinar las condiciones intracelulares requeridas para galactosilación. La correlación entre la galactosilación de la proteína y la actividad de transporte de UDP-galactosa indicó que un suministró exógeno de transportador de UDP-Gal, en lugar de alfa 1,2 GalT, desempeñó un papel clave para la galactosilación eficaz en S. cerevisiae (Kainuma (1999) Glycobiology 9(2): 133-141). Asimismo, se clonó un transportador de UDP-galactosa de S. pombe (Segawa (1999) FEBS Letters 451(3): 295-298).

CMP-Ácido-N-acetilneuramínico (CMP-Ácido Siálico)

El transportador de CMP-ácido siálico humano (hCST) se ha clonado y expresado en células CHO Lec 8 (Aoki y col. (1999) J. Biochem. (Tokio) 126(5): 940-50; Eckhardt y col. (1997) Eur. J. Biochem. 248(1): 187-92). La expresión funcional del transportador de CMP-ácido siálico murino se consiguió en Saccharomyces cerevisiae (Berninsone y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 12616-9). El ácido siálico se ha encontrado algunos hongos, sin embargo, no está claro si el sistema huésped elegido será capaz de suministrar niveles suficientes de CMP-ácido siálico. El ácido siálico se puede suministrar en el medio o, alternativamente, también se pueden integrar rutas fúngicas implicadas en la síntesis de ácido siálico en el genoma huésped.

Expresión de Difosfatasas

Cuando se transfieren azúcares a una glucoproteína, se libera un nucleósido difosfato o monofosfato de los precursores de nucleótido azúcar. Aunque los monofosfatos se pueden exportar directamente en sustitución por azúcares de trifosfato de nucleósido por un mecanismo de cotransporte bidireccional, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir por fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir nucleósidos monofosfato y fosfato inorgánico antes de ser exportados. Esta reacción parece ser importante para la glucosilación eficaz, ya que se ha observado que la GDPasa de S. cerevisiae es necesaria para la manosilación. Sin embargo, la enzima tiene solamente el 10% de la actividad frente a UDP (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Los eucariotas inferiores con frecuencia no tienen actividad de difosfatasa específica de UDP en el Golgi ya que no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glucoproteína en el Golgi. Se observó que Schizosaccharomyces pombe, una levadura que añade restos de galactosa a polisacáridos de pared celular (de UDP-galactosa), tiene actividad UDPasa específica, sugiriendo adicionalmente el requisito de tal enzima (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Se conoce que el UDP es un inhibidor potente de glucosiltransferasas y la eliminación de este producto secundario de la glucosilación es importante para evitar la inhibición de glucosiltransferasa en el lumen del Golgi (Khatara y col. (1974) Eur. J. Biochem. 44: 537-560).

Procedimientos para Alterar N-Glucanos en un Huésped Expresando una Actividad Enzimática Dirigida de una Molécula de Ácido Nucleico

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una glucoproteína de tipo humano recombinante que comprende un glucano bisecado en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de introducir en la célula una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima o enzimas para la producción de la estructura de hidrato de carbono Man_{5}GlcNAc_{2} e introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III donde dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII\Delta32 de ratón o GnTIII\Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae. En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico que codifica una o más actividades de manosidasa implicadas en la producción de Man_{5}GlcNAc_{2} a partir de Man_{8}GlcNAc_{2} o Man_{9}GlcNAc_{2} se introduce en el huésped. Adicionalmente se proporcionan en este documento procedimientos para preparar glucoproteínas alteradas en una célula huésped que comprenden la etapa de introducir en la célula huésped una molécula de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades de glucosilación. Las actividades de enzima preferidas se seleccionan entre el grupo constituido por UDP-GlcNAc transferasa, UDP-galactosiltransferasa, GDP-fucosiltransferasa, CMP-sialiltransferasa, transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa, transportador de CMP-ácido siálico y nucleótido difosfatasas. En una realización particularmente preferida, el huésped se selecciona o se modifica para expresar dos o más actividades enzimáticas en las que el producto de una actividad aumenta los niveles de sustrato de otra actividad, por ejemplo, una glucosiltransferasa y un transportador de azúcar correspondiente, por ejemplo, actividades de GnTI y de transportador de UDP-GlcNAc. En otra realización preferida, el huésped se selecciona o se modifica para expresar una actividad para eliminar productos que pueden inhibir las reacciones de glucosilación posteriores, por ejemplo, una actividad difosfatasa específica de UDP o GDP.

Los procedimientos preferidos de la invención implican expresar una o más actividades enzimáticas de una molécula de ácido nucleico en una célula huésped y comprenden la etapa de dirigir al menos una actividad enzimática a una localización subcelular deseada (por ejemplo, un orgánulo) formando una proteína de fusión que comprende un dominio catalítico de la enzima y un péptido señal de dirección celular, por ejemplo, un péptido señal heterólogo que normalmente no está ligado a o asociado con el dominio catalítico. La proteína de fusión se codifica por al menos una construcción genética ("construcción de fusión") que comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular ligado en la misma fase de lectura de traducción ("en fase") con un fragmento de ácido nucleico que codifica una enzima (por ejemplo, enzima de glucosilación) o fragmento catalíticamente activo de la misma.

El componente de péptido señal de dirección de la construcción o proteína de fusión se obtiene preferiblemente de un miembro del grupo constituido por: proteínas unidas a membrana del RE o Golgi, señales de recuperación, proteínas de membrana de Tipo II, proteínas de membrana de Tipo I, transportadores de nucleótido azúcar transmembrana, manosidasas, sialiltransferasas, glucosidasas, manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas.

El componente de dominio catalítico de la construcción o proteína de fusión se obtiene preferiblemente de una glucosidasa, manosidasa o actividad de glucosiltransferasa obtenida de un miembro del grupo constituido por GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, Ga1T, Fucosiltransferasa y Sialiltransferasa. El dominio catalítico tiene preferiblemente un óptimo de pH dentro de 1,4 unidades de pH del óptimo de pH promedio de otras enzimas representativas en el orgánulo en el que se localiza la enzima o tiene una actividad óptima a un pH entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, el dominio catalítico codifica una manosidasa seleccionada entre el grupo constituido por manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón, manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans, manosidasa II, manosidasa lix y manosidasa III de H. sapiens.

\vskip1.000000\baselineskip

Selección de una Enzima de Glucosilación: Óptimos de pH y Localización Subcelular

En una realización de la invención, una glucoproteína de tipo humano recombinante que comprende un glucano bisecado se prepara de forma eficaz en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso introduciendo en un compartimento subcelular de la célula una enzima de glucosilación seleccionada para tener un óptimo de pH similar a los óptimos de pH de otras enzimas en el compartimento subcelular dirigido. Por ejemplo, la mayoría de la enzimas que son activas en el RE y aparato de Golgi de S. cerevisiae tienen de óptimos de pH que están entre aproximadamente 6,5 y 7,5 (véase la Tabla 3). Debido a que la glucosilación de proteínas es un proceso altamente evolucionado y eficaz, el pH interno del RE y Golgi probablemente también está en el intervalo de aproximadamente 6-8. Todas las estrategias previas para reducir la manosilación por la acción de manosidasas recombinantes en células fúngicas, sin embargo, han introducido enzimas que tienen un óptimo de pH de aproximadamente pH 5,0 (Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177 y Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273(41): 26298-26304). A pH 7,0, la actividad determinada in vitro de esas manosidasas se reduce a menos del 10%, que probablemente es una actividad insuficiente en su punto de uso, a saber, el RE y Golgi temprano, para la producción in vivo eficaz de Man_{5}GlcNAc_{2} en N-glucanos.

Por consiguiente, una realización preferida de esta invención dirige una enzima de glucosilación seleccionada (o dominio catalítico de la misma), por ejemplo, una \alpha-manosidasa, a una localización subcelular en la célula huésped (por ejemplo, un orgánulo) donde el óptimo de pH de la enzima o dominio está dentro de 1,4 unidades de pH del óptimo de pH promedio de otras enzimas marcadoras representativas localizadas en el mismo o en los mismos orgánulos. El óptimo de pH de la enzima a dirigir a un orgánulo específico se debe hacer coincidir con el óptimo de pH de otras enzimas encontradas en el mismo orgánulo para maximizar la actividad por unidad de enzima obtenida. La Tabla 3 resume la actividad de manosidasas de diversas fuentes y sus respectivos óptimos de pH. La Tabla 4 resume sus localizaciones subcelulares típicas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

En una realización preferida, una enzima o dominio catalítico particular se dirige a una localización subcelular en la célula huésped mediante una construcción de fusión quimérica que codifica una proteína que comprende un péptido señal de dirección celular no asociado normalmente con el dominio enzimático. Preferiblemente, una enzima o un dominio se dirige al RE, el Golgi temprano, medial o tardío o el aparato Golgi trans de la célula huésped.

En una realización más preferida, la enzima de glucosilación dirigida es una manosidasa, glucosiltransferasa o una glucosidasa. En una realización especialmente preferida, la actividad de manosidasa se dirige al RE o Golgi cis, donde tienen lugar las reacciones tempranas de glucosilación. Aunque este procedimiento es útil para producir una glucoproteína de tipo humano en una célula huésped no humana, se entenderá que el procedimiento también es útil de forma más general para modificar perfiles de hidratos de carbono de una glucoproteína en cualquier célula huésped eucariota, incluyendo células huésped humanas.

Las secuencias de dirección que median en la retención de proteínas en ciertos orgánulos de la ruta secretora de la célula huésped se conocen bien y se describen en la bibliografía científica y bases de datos públicas, como se analiza con más detalle más adelante con respecto a bibliotecas para la selección de secuencias de dirección y enzimas dirigidas. Tales secuencias de dirección subcelulares se pueden usar solas o en combinación para dirigir una enzima de glucosilación seleccionada (o dominio catalítico de la misma) a una localización subcelular particular en una célula huésped, es decir, especialmente a una en la que la enzima tendrá actividad mejorada u óptima basándose en óptimos de pH o la presencia de otros factores estimuladores.

Cuando se intenta cortar estructuras de alto contenido de manosa para producir Man_{5}GlcNAc_{2} en el RE o el aparato de Golgi de una célula huésped tal como S. cerevisiae, por ejemplo, se puede elegir cualquier enzima o combinación de enzimas que (1) tenga un óptimo de pH suficientemente próximo (es decir, entre pH 5,2 y pH 7,8), y (2) sabe que genera, sola o de forma concertada, la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} isomérica específica requerida para aceptar la adición posterior de GlcNAc por GnTI. Cualquier enzima o combinación de enzimas que se demuestra que genera una estructura que se puede convertir en GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} por GnTI in vitro constituiría una elección apropiada. Este conocimiento se puede obtener de la bibliografía científica o experimentalmente. Por ejemplo, se puede determinar si una manosidasa potencial puede convertir Man_{8}GlcNAc_{2}-2AB (2-aminobenzamida) en Man_{5}GlcNAc_{2}-AB y después verificar que la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}-2AB obtenida puede servir como un sustrato para GnTI y UDP-GlcNAc para dar GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} in vitro. La manosidasa IA de una fuente humana o murina, por ejemplo, sería una elección apropiada (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4). Los ejemplos descritos en este documento utilizan oligomanosa ligada a N marcada con 2-aminobenzamida seguido de análisis de HPLC para realizar esta determinación.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

5

6

Por consiguiente, una enzima de glucosilación tal como una enzima de \alpha-1,2-manosidasa usada de acuerdo con la invención tiene una actividad óptima a un pH entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, la enzima tiene una actividad óptima a un pH entre 5,5 y 7,5. La enzima manosidasa de C. elegans, por ejemplo, trabaja bien en los procedimientos de la invención y tiene un óptimo de pH aparente de aproximadamente 5,5). Las manosidasas preferidas incluyen las enumeradas en la Tabla 3 que tienen óptimos de pH apropiados, por ejemplo, Aspergillus nidulans, Homo sapiens IA (Golgi), Homo sapiens IB (Golgi), células de insecto de Lepidopteran (IPLB-SF21AE), Homo sapiens, ratón IB (Golgi), Xanthomonas manihotis, Drosophila melanogaster y C. elegans.

Un experimento que ilustra el óptimo de pH para una enzima \alpha-1,2-manosidasa se describe en el Ejemplo 7. Una proteína de fusión quimérica BB27-2 (MNN10 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta31 de C. elegans), que sale al medio, se sometió a diversos intervalos de pH para determinar la actividad óptima de la enzima. Los resultados del experimento muestran que la \alpha-1,2-manosidasa tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,5 para su función (Figura 11).

En una realización preferida, un único gen de manosidasa clonado se expresa en el organismo huésped. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable expresar varios genes de manosidasa diferentes o varias copias de un gen particular para conseguir una producción adecuada de Man_{5}GlcNAc_{2}. En los casos en los que se usan múltiples genes, las manosidasas codificadas tendrán preferiblemente todas óptimos de pH dentro del intervalo preferido de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 8,0, o especialmente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,5. Las actividades de manosidasa preferidas incluyen \alpha-1,2-manosidasas obtenidas de ratón, ser humano, Lepidoptera, Aspergillus nidulans o Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum, X. laevis o A. nidulans.

\vskip1.000000\baselineskip

Alteración In Vivo de Glucosilación de Célula Huésped Usando una Genoteca de ADN Combinatoria

Ciertos procedimientos de la invención se realizan preferiblemente (pero no necesariamente) usando una o más bibliotecas de ácido nucleico. Una característica ilustrativa de una biblioteca de ácido nucleico combinatoria descrita en este documento es que comprende secuencias que codifican péptidos señal de dirección celular y secuencias que codifican proteínas a dirigir (por ejemplo, enzimas o dominios catalíticos de las mismas, incluyendo, pero sin limitación, las que median en la glucosilación).

Una biblioteca de ácido nucleico combinatoria comprende: (a) al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes péptidos señal de dirección celular; y (b) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido a dirigir. Alternativamente, una biblioteca de ácido nucleico combinatoria comprende: (a) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular; y (b) al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido a dirigir a una célula huésped. Como se describe más adelante con más detalle, una secuencia de ácido nucleico obtenida de (a) y una secuencia de ácido nucleico obtenida de (b) se ligan para producir una o más construcciones de fusión que codifican un péptido señal de dirección celular ligado funcionalmente a un dominio polipeptídico de interés. Un ejemplo de un enlace funcional es cuando el péptido señal de dirección celular se liga al dominio polipeptídico de interés en el mismo macro de lectura de traducción ("en macro").

En una realización preferida, una genoteca de ADN combinatoria expresa una o más proteínas de fusión que comprenden péptidos señal de dirección celular ligados en macro con dominios enzimáticos catalíticos. La proteína de fusión codificada comprende preferiblemente un dominio catalítico de una enzima implicada en modificación de tipo mamífero o humano de N-glucanos. En una realización más preferida, el dominio catalítico se obtiene de una enzima seleccionada entre el grupo constituido por manosidasas, glucosiltransferasas y otras glucosidasas que se liga en macro con uno o más péptidos señal de dirección. El dominio enzimático puede ser exógeno y/o endógeno a la célula huésped. Un péptido señal particularmente preferido es uno que normalmente está asociado con una proteína que experimenta transporte del RE al Golgi.

La genoteca de ADN combinatoria descrita en este documento se puede usar para producir y localizar enzimas in vivo implicadas en modificación de N-glucano de tipo mamífero o humano. Las construcciones de fusión de la genoteca de ADN combinatoria se modifican de tal forma que las enzimas codificadas se localizan en el RE, Golgi o la red de Golgi trans de la célula huésped donde están implicadas en producir N-glucanos particulares en una glucoproteína de interés. La localización de enzimas que modifican N-glucanos de la presente invención se consigue mediante un mecanismo de anclaje o mediante interacción proteína-proteína donde el péptido de localización construido a partir de la genoteca de ADN combinatoria se localiza en un orgánulo deseado de la ruta secretora tal como el RE, Golgi o la red de Golgi trans.

Un ejemplo de un N-glucano útil, que se produce de forma eficaz y en cantidades suficientes para modificación adicional con reacciones de glucosilación (compleja) de tipo humano es Man_{5}GlcNAc_{2}, Una cantidad suficiente de Man_{5}GlcNAc_{2} se necesita en una glucoproteína de interés para procesamiento de tipo humano adicional in vivo (por ejemplo, más del 30% en mol). El intermedio de Man_{5}GlcNAc_{2} se puede usar como un sustrato para modificación de N-glucano adicional para producir GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} (Figura 1B; véase anteriormente). Por consiguiente, la genoteca de ADN combinatoria de la presente invención se puede usar para producir enzimas que producen posteriormente GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} u otros N-glucanos complejos deseados, en una cantidad útil.

Un aspecto adicional de las construcciones de fusión producidas usando la genoteca de ADN combinatoria de la presente invención es que permiten una actividad de corte de N-glucano intracelular suficiente y con frecuencia prácticamente completa en la célula huésped modificada. Las construcciones de fusión preferidas producidas por la genoteca de ADN combinatoria de la invención codifican una enzima de glucosilación, por ejemplo, una manosidasa, que se localiza de forma eficaz en un compartimento de la célula huésped intracelular y muestra de este modo muy poca y preferiblemente ninguna actividad extracelular. Se demuestra que las construcciones de fusión preferidas de la presente invención que codifican una enzima manosidasa se localizan donde los N-glucanos se modifican, a saber, el RE y Golgi. Las enzimas de fusión de la presente invención se dirigen a tales orgánulos particulares en la ruta secretora donde se localizan y actúan en N-glucanos tales como Man_{8}GlcNAc_{2} para producir Man_{5}GlcNAc_{2} en una glucoproteína de interés.

Las construcciones de fusión de GnTIII generadas a partir de una genoteca de ADN combinatoria para producir glucanos bisecados se ensayaron para determinar cualquier actividad extracelular. Un ejemplo de una construcción de fusión de GnTIII que muestra alteración in vivo de glucosilación de célula huésped se denomina pVA53. Después de transformar YSH-1 de P. pastoris con la construcción de fusión pVA53, el sobrenadante se ensayó para detectar cualquier actividad de GnTIII ex vivo. La Figura 33 no muestra ningún cambio aparente en el sustrato convencional GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en condiciones que pondrían de manifiesto actividad de GnTIII extracelular en el medio (Ejemplo 22). De forma similar, la Figura 34 no muestra actividad de GnTIII extracelular detectable en el medio en YSH-57 de P. pastoris que reacciona con el sustrato GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} (Ejemplo 23).

Las enzimas producidas por la genoteca de ADN combinatoria descrita en este documento pueden modificar N-glucanos en una glucoproteína de interés como se muestra para proteínas K3 o IFN-\beta expresadas en P. pastoris, como se muestra en las Figuras 5, 6 y 25-34 (véase también Ejemplos 2, 4 y 18-23). Sin embargo, se entiende que otros tipos de glucoproteínas, sin limitación, incluyendo eritropoyetina, citocinas tales como interferón-\alpha, interferón-\beta, interferón-\gamma, interferón-\omega y granulocito-CSF, factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana, cadena \alpha de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa e inhibidor de tripsina de urea, proteína de unión de IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor liberador de hormona del crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitor mieloide 1, osteoprotegerina, \alpha-1 antitripsina, ADNasa II, \alpha-feto proteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, también conocido como proteína de unión a TNF 1), TACI-Ig (interaccionador de ligando de ciclofilina y modulador de calcio y activador transmembrana), FSH (hormona estimuladora de folículos), GM-CSF, GLP-1 (proteína similar a glucagón 1) con y sin agonista de receptor FC de IL-1, sTNFr (enbrel, también conocido como fusión de receptor Fc TNF soluble) ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Antígeno 4 asociado a Linfocitos T Citotóxicos - Ig) se pueden glucosilar de este modo.

Construcción de una Genoteca de ADN combinatoria de Construcciones de Fusión

Una genoteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión presenta uno o más péptidos señal de dirección celular ("péptidos de dirección") obtenidos generalmente de dominios N-terminales de proteínas nativas (por ejemplo, realizando deleciones C-terminales). Sin embargo, algunos péptidos de dirección se obtienen del extremo C de proteínas nativas (por ejemplo, SEC12). Las proteínas unidas a membrana del RE o del Golgi se usan preferiblemente como una fuente para secuencias de péptidos de dirección. Estas proteínas tienen secuencias que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd) y una región de tallo (sr) que varían en longitud. Estas regiones se pueden reconocer por alineamientos de secuencia de proteína y comparaciones con homólogos conocidos y/u otras proteínas localizadas (por ejemplo, comparando gráficos de hidrofobicidad).

Los péptidos de dirección se indican en este documento como cortos (s) medios (m) y largos (1) con respecto a las partes de una membrana de tipo II. La secuencia de péptido de dirección indicado como corto (s) se corresponde al dominio transmembrana (tmd) de la proteína unida a membrana. La secuencia de péptido de dirección indicado como largo (l) se corresponde a la longitud del dominio transmembrana (tmd) y la región de tallo (sr). La secuencia de péptido de dirección indicado como media (m) se corresponde al dominio transmembrana (tmd) y aproximadamente la mitad de la longitud de la región de tallo (sr). Las regiones de dominio catalítico se indican en este documento por el número de deleción de nucleótidos con respecto a su enzima de glucosilación de tipo silvestre.

Sub-bibliotecas

En algunos casos, una biblioteca de ácido nucleico combinatoria descrita en este documento se puede ensamblar directamente a partir de genes existentes o de tipo silvestre. Preferiblemente, la genoteca de ADN se ensambla a partir de la fusión de dos o más sub-bibliotecas. Por la ligación en fase de las sub-bibliotecas, es posible crear un gran número de construcciones genéticas novedosas que codifican dominios de proteína dirigida útiles tales como los que tienen actividades de glucosilación.

Sub-bibliotecas de Dominio Catalítico que Codifican Actividades de Glucosilación

Una sub-biblioteca útil incluye secuencias de ADN que codifican enzimas tales como glucosidasas (por ejemplo, manosidasas), glucosiltransferasas (por ejemplo, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas), GlcNAc transferasas y sialiltransferasas. Los dominios catalíticos se pueden seleccionar del huésped a modificar, así como de otros organismos relacionados o no relacionados. Las enzimas de mamífero, vegetales, de insecto, de reptiles, de algas o fúngicas son todas útiles y se deben elegir para representar un amplio espectro de propiedades bioquímicas con respecto a temperatura y óptimos de pH. En una realización preferida, los genes se truncan para dar fragmentos, algunos de los cuales codifican los dominios catalíticos de las enzimas. Al eliminar secuencias de dirección endógenas, las enzimas después se pueden redirigir y expresar en otros loci celulares.

La elección de tales dominios catalíticos se puede guiar por el conocimiento del entorno particular en el que el dominio catalítico posteriormente será activo. Por ejemplo, si una enzima de glucosilación particular tiene que ser activa en el Golgi tardío, y todas las enzimas conocidas del organismo huésped en el Golgi tardío tienen un cierto óptimo de pH, o se conoce que el Golgi tardío tiene un pH particular, entonces se elige un dominio catalítico que muestre una actividad adecuada y preferiblemente máxima a ese pH, como se ha analizado anteriormente.

Sub-bibliotecas de Secuencia de Péptido de Dirección

Otra sub-biblioteca útil incluye secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos señal de dirección que dan como resultado la localización de una proteína en una localización particular dentro del RE, Golgi y red de Golgi trans. Estos péptidos de dirección se pueden seleccionar entre el organismo huésped a modificar así como otros organismos relacionados o no relacionados. Generalmente, tales secuencias se incluyen en tres categorías: (1) Secuencias N-terminales que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd) y parte o todo de una región de tallo (sr), que de forma conjunta o individualmente ancla proteínas a la membrana interna (luminal) del Golgi; (2) señales de recuperación que se encuentran generalmente en el extremo C tales como el tetrapéptido HDEL (SEC ID Nº: 41) o KDEL (SEC ID Nº: 42); y (3) regiones transmembrana de diversas proteínas, por ejemplo, transportadores de nucleótido azúcar, que se sabe que se localizan en el Golgi.

En el primer caso, cuando el péptido de dirección consiste en diversos elementos (ct, tmd y sr), la biblioteca se diseña de tal forma que la ct, el tmd y diversas partes de la región de tallo están representados. Por consiguiente, una realización preferida de la sub-biblioteca de secuencias de péptido de dirección incluye secuencias de ct, tmd y/o sr de proteínas unidas a membrana del RE o Golgi. En algunos casos, puede ser deseable proporcionar a la sub-biblioteca longitudes variables de secuencia de sr. Esto se puede conseguir mediante PCR usando cebadores que se unen al extremo 5' del ADN que codifica la región citosólica y empleando una serie de cebadores opuestos que se unen a diversas partes de la región de tallo.

Otras fuentes útiles más de secuencias de péptido de dirección incluyen péptidos señal de recuperación, por ejemplo, los tetrapéptidos HDEL o KDEL, que se encuentran típicamente en el extremo C de proteínas que se transportan de forma retrógrada al RE o Golgi. Otras fuentes más de secuencias de péptido de dirección incluyen (a) proteínas de membrana de tipo II, (b) las enzimas enumeradas en la Tabla 3, (c) transportadores de nucleótido azúcar transmembrana que se localizan en el Golgi y (d) secuencias a las que se hace referencia en la Tabla 5.

TABLA 5

7

8

En cualquier caso, se prefiere en gran medida que se seleccionen secuencias de péptido de dirección que sean apropiadas para la actividad o las actividades enzimáticas particulares para funcionar de forma óptima dentro de la secuencia de reacciones de glucosilación deseadas. Por ejemplo, al desarrollar un microorganismo modificado capaz de sialilación terminal de N-glucanos nacientes, un proceso que tiene lugar en el Golgi tardío en seres humanos, es deseable utilizar una sub-biblioteca de secuencias de péptido de dirección obtenida de proteínas de Golgi tardías. De forma similar, el corte de Man_{8}GlcNAc_{2} por una \alpha-1,2-manosidasa para dar Man_{5}GlcNAc_{2} es una etapa temprana en la formación de N-glucano complejo en seres humanos (Figura 1B). Por lo tanto, es deseable que está reacción ocurra en RE o Golgi temprano de un microorganismo huésped modificado. Se usa una sub-biblioteca que codifica señales de retención en RE y Golgi temprano.

Después se construye una serie de construcciones de proteínas de fusión (es decir, una genoteca de ADN combinatoria) uniendo funcionalmente una o una serie de secuencias de péptido de dirección a una o una serie de secuencias que codifican dominios catalíticos. En una realización preferida, esto se consigue por la ligación en fase de una sub-biblioteca que comprende ADN que codifica secuencias de péptido de dirección (anteriormente) con una sub-biblioteca que comprende ADN que codifica enzimas de glucosilación o fragmentos catalíticamente activos de las mismas (véase más adelante).

La biblioteca resultante comprende genes sintéticos que codifican proteínas de fusión que contienen secuencia de péptido de dirección. En algunos casos es deseable proporcionar una secuencia de péptido de dirección en el extremo N de una proteína de fusión o, en otros casos, en el extremo C. En algunos casos, las secuencias de péptido de dirección se pueden insertar en la fase de lectura abierta de una enzima, suponiendo que la estructura de la proteína de dominios plegados individuales no esté alterada. Cada tipo de proteína de fusión se construye (de un modo dirigido por pasos o semialeatorio) y las construcciones óptimas se pueden seleccionar después de la transformación de células huésped y caracterización de patrones de glucosilación en células transformadas usando procedimientos de la invención.

Alteración de Glucosilación de Célula Huésped Usando Construcciones de Fusión de Bibliotecas Combinatorias

La construcción de una genoteca de ADN combinatoria preferida se ilustra esquemáticamente en la Figura 2 y se describe en el Ejemplo 4. La construcción de fusión se puede unir operativamente a una multitud de vectores, tales como vectores de expresión bien conocidos en la técnica. Una amplia diversidad de tales construcciones de fusión se ensambló usando actividades representativas como se muestra en la Tabla 6. Las combinaciones de péptido de dirección/dominios catalíticos se pueden ensamblar para el uso en dirigir actividades de manosidasa, glucosiltransferasa y glucosidasa en el RE, Golgi y la red de Golgi trans de acuerdo con la invención. Sorprendentemente, el mismo dominio catalítico puede no tener ningún efecto hasta un efecto muy profundo sobre patrones de N-glucosilación, dependiendo del tipo del péptido de dirección usado (véase, por ejemplo, Tabla 7, Ejemplo 4).

Construcciones de Fusión de Manosidasa

Un ejemplo representativo de una construcción de fusión de manosidasa obtenida de una genoteca de ADN combinatoria de la invención es pFB8, que es un péptido de dirección SEC 12(m) de Saccharomyces truncado (988-1296 nucleótidos de SEC12 de SwissProt P11655) ligado en fase con una deleción de 187 aminoácidos N-terminales de una \alpha-manosidasa IA de ratón (Genbank AN 6678787). Por tanto, la nomenclatura usada en este documento se refiere al péptido de dirección/región de dominio catalítico de una enzima de glucosilación como SEC 12(m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón. La proteína de fusión codificada se localiza en el RE mediante la secuencia de péptido de dirección SEC12 mientras que conserva su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es capaz de producir N-glucanos in vivo que tienen una estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} (Ejemplo 4; Figuras 6F y 7B).

La construcción de fusión pGC5, MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón, es otro ejemplo de una construcción de fusión que tiene actividad de corte de manosidasa intracelular (Ejemplo 4; Figuras 5D y 8B). La construcción de fusión pDC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans) es otro ejemplo de una construcción de fusión eficaz capaz de producir N-glucanos que tienen una estructura de Nlan_{5}GlcNAc_{2} in vivo. Al crear una genoteca de ADN combinatoria de estas y otras de tales construcciones de fusión de manosidasa de acuerdo con la invención, un especialista puede distinguir y seleccionar las construcciones que tengan actividad de corte intracelular óptima de las que tienen relativamente poca o ninguna actividad. Los procedimientos que usan bibliotecas de ADN combinatoria de la invención son ventajosos debido a que solamente unas pocas construcciones de fusión de manosidasa seleccionadas pueden producir un N-glucano particularmente deseado in vivo.

Además, la actividad de corte de manosidasa puede ser específica de una proteína particular de interés. Por tanto, se tiene que entender adicionalmente que no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de manosidasa pueden funcionar de forma igualmente buena para producir la glucosilación apropiada en una glucoproteína de interés. Por consiguiente, una proteína de interés se puede introducir en una célula huésped transfectada con una genoteca de ADN combinatoria para identificar una o más construcciones de fusión que expresan una actividad de manosidasa óptima para la proteína de interés. Un especialista en la técnica será capaz de producir y seleccionar una construcción o construcciones de fusión óptimas usando la estrategia de genoteca de ADN combinatoria descrita en este documento.

Además, es evidente que otras de tales construcciones de fusión que muestran dominios catalíticos de manosidasa activos localizados (o más generalmente, dominios de una enzima) se pueden preparar usando técnicas tales como las ilustradas en el Ejemplo 4 y descritas en este documento. Será un asunto de experimentación rutinaria para un especialista en la técnica preparar y usar la genoteca de ADN combinatoria de la presente invención para optimizar, por ejemplo, la producción de Man_{5}GlcNAc_{2} a partir de una biblioteca de construcciones de fusión en un vector de expresión particular introducido en una célula huésped particular.

Construcciones de Fusión de Glucosiltransferasa

De forma similar, se preparó una genoteca de ADN combinatoria de glucosiltransferasa usando los procedimientos de la invención. Una genoteca de ADN combinatoria de secuencias obtenidas de actividades de glucosiltransferasa I (GnTI) se ensambló con péptidos de dirección y se exploró para producción eficaz en una célula huésped eucariota inferior de una estructura de N-glucano GlcNAcMan_{s}GlcNAc_{2} en una glucoproteína marcadora. Se identificó una construcción de fusión que se demostró que produce GcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} (pPB104), MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humana (Ejemplo 8). Se ensambló una amplia diversidad de tales construcciones de fusión de GnTI (Ejemplo 8, Tabla 10). Otras combinaciones de péptido de dirección/dominios catalíticos de GnTI se pueden ensamblar de forma sencilla preparando una genoteca de ADN combinatoria. También es evidente para el especialista en la técnica que se pueden preparar otras de tales construcciones de fusión que muestran actividad de glucosiltransferasa como se demuestra en el Ejemplo 8. Será un asunto de experimentación rutinaria para el especialista en la técnica usar el procedimiento de genoteca de ADN combinatoria descrito en este documento para optimizar la producción de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} usando una construcción de fusión seleccionada en un vector de expresión y una línea de célula huésped particular.

Como se ha indicado anteriormente para construcciones de fusión de manosidasa, no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de GnTI funcionarán igualmente bien para producir la glucosilación apropiada en una glucoproteína de interés como se describe en este documento. Sin embargo, un especialista en la técnica será capaz de producir y seleccionar una construcción o construcciones de fusión óptimas usando una estrategia de genoteca de ADN como se describe en este documento. El Ejemplo 8 ilustra una realización preferida de una genoteca de ADN combinatoria que comprende construcciones de fusión de péptidos de dirección y dominio catalítico de GnTI implicadas en producir glucoproteínas con una estructura predominantemente de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}.

Uso de Múltiples Construcciones de Fusión para Alterar la Glucosilación de la Célula Huésped

En otro ejemplo del uso de los procedimientos y las bibliotecas de la invención para alterar la glucosilación de células huésped, una cepa de P. pastoris con una deleción de OCH1 que expresa una proteína indicadora (K3) se transformó con múltiples construcciones de fusión aisladas de bibliotecas combinatorias de la invención para convertir N-glucanos de alto contenido de manosa en N-glucanos de tipo humano (Ejemplo 8). En primer lugar, la construcción de fusión de manosidasa pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) se introdujo por transformación en una cepa de P. pastoris que carecía de actividad de 1,6 manosiltransferasas de inicio (es decir, deleción de och1, Ejemplo 1). En segundo lugar, se construyó pPB103 que comprende un gen MNN2-2 de K. lactis (Genbank AN AF106080) que codifica una transportador de UDP-GlcNAc para aumentar la producción adicional de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, La adición del transportador de UDP-GlcNAc aumentó la producción de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} significativamente en la cepa de P. pastoris como se ilustra en la Figura 10B. En tercer lugar, se introdujo pPB104 que comprende MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humano en la cepa. Esta cepa de P. pastoris se denomina "PBP-3". (Véase la Figura 36).

Se entiende por el especialista en la técnica que las células huésped tales como las cepas de levadura que se han descrito anteriormente se pueden transformar de forma secuencial y/o co-transformar con uno o más vectores de expresión. También se debe entender que el orden de la transformación no es particularmente pertinente para producir la glucoproteína de interés. El especialista reconoce que las modificaciones rutinarias de los procedimientos descritos en este documento pueden proporcionar resultados mejorados en la producción de la glucoproteína de interés.

La importancia de usar una secuencia de péptido de dirección particular con una secuencia de dominio catalítico particular se entiende fácilmente a partir de los experimentos descritos en este documento. La genoteca de ADN combinatoria proporciona una herramienta para construir fusiones de enzima que están implicadas en modificar N-glucanos en una glucoproteína de interés, que es especialmente útil para producir glucoproteínas de tipo humano. (Sin embargo, cualquier fusión de enzima se puede seleccionar usando bibliotecas y procedimientos de la invención). Los transformantes deseados que expresan \alpha-1,2-manosidasa activa dirigida de forma apropiada producen K3 con N-glucanos de la estructura Man_{5}GlcNAc_{2} como se muestra en las Figuras 5D y 5E. Esto otorga una masa molecular reducida al glucano escindido en comparación con la K3 de la cepa con deleción de OCH1 parental, como se detectó por espectrometría de masas MALDI-TOF en la Figura 5C.

De forma similar, se usó la misma estrategia para producir otra glucoproteína secretada: IFN-\beta que comprende predominantemente Man_{5}GlcNAc_{2}, El Man_{5}GlcNAc_{2} se retiró por digestión con PNGasa (Papac y col. (1998) Glycobiology 8: 445-454) y se sometió a MALDI-TOF como se muestra en las Figuras 6A-6F. Un único pico prominente en 1254 (m/z) confirma la producción de Man_{5}GlcNAc_{2} en IFN-\beta en las Figuras 6E (pGC5) (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) y 6F (pFB8) (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón). Además, en la cepa de P. pastoris PBP-3 que comprende pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón), pPB104 (MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humano) y pPB103 (gen MNN2-2 de K. lactis), el N-glucano híbrido. Se detectó GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b] por MALDI-TOF (Figura 10).

Después de identificar transformantes con un alto grado de corte de manosa, se realizaron experimentos adicionales para confirmar que la actividad de manosidasa (corte) tuvo lugar in vivo y no era predominantemente el resultado de actividad extracelular en el medio de cultivo (Ejemplo 6; Figuras 7-9).

Aunque la presente invención se ilustra usando un organismo huésped P. pastoris, se entiende por los especialistas en la técnica que se pueden alterar otras células huésped eucariotas, incluyendo otras especies de huéspedes de levadura y fúngicos, como se describe en este documento, para producir glucoproteínas de tipo humano. Las técnicas descritas en este documento para la identificación y alteración de genes de glucosilación de célula huésped indeseables, por ejemplo, OCH1, se entiende que se puede aplicar a estos y/u otros genes homólogos o relacionados funcionalmente en otras células huésped eucariotas tales como otras cepas de levadura y fúngicas. Como se describe en el Ejemplo 9, los genes och1 mnn1 se delecionaron de K. lactis para modificar una célula huésped que conduce a N-glucanos que se convierten completamente en Man_{5}GlcNAc_{2} por 1,2-manosidasa (Figura 12C).

El gen MNN1 se clonó de K. lactis como se describe en el Ejemplo 9. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos deducida del gen MNN1 de K. lactis se muestran en las SEC ID Nº: 43 y 44, respectivamente. Mediante el uso de cebadores específicos de genes, se preparó una construcción para delecionar el gen de MNN1 del genoma de K. lactis (Ejemplo 9). Las células huésped empobrecidas en actividades de och1 y mnn1 producen N-glucanos que tienen una estructura de hidrato de carbono Man_{9}GldNAc_{2} (véase, por ejemplo, la Figura 12B). Tales células huésped se pueden modificar usando adicionalmente, por ejemplo, procedimientos y bibliotecas de la invención para producir glucoproteínas de tipo mamífero o humanas.

Por tanto, en otra realización, en este documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o que está constituida por al menos cuarenta y cinco, preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 60 y mucho más preferiblemente 75 o más restos de nucleótidos del gen MNN1 de K. lactis (SEC ID Nº: 43) y homólogos, variantes y derivados de la misma. También se describen en este documento moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico que se han descrito anteriormente. De forma similar, se proporcionan polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento. Además, también se describen en este documento vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico descrita en este documento, como se describe adicionalmente en este documento. De forma similar, se proporcionan células huésped transformadas con las moléculas de ácido nucleico o vectores descritos en este documento.

Otro aspecto descrito en este documento, por tanto, se refiere a una cepa huésped eucariota no humana que expresa glucoproteínas que comprenden N-glucanos modificados que se parecen a los preparados por células humanas. El realizar los procedimientos de la invención en especies diferentes de células de levadura y fúngicas, por tanto, se considera y se describe adicionalmente en este documento. Se considera que se puede usar una biblioteca de ácido nucleico combinatoria descrita en este documento para seleccionar construcciones que modifican la ruta de glucosilación en cualquier sistema de célula huésped eucariota. Por ejemplo, las bibliotecas combinatorias descritas en este documento también se pueden usar en plantas, algas e insectos y en otras células huésped eucariotas, incluyendo células de mamífero y humanas, para localizar proteínas, incluyendo enzimas de glucosilación o dominios catalíticos de las mismas, en una localización deseada a lo largo de una ruta secretora de célula huésped. Preferiblemente, las enzimas de glucosilación o dominios catalíticos y similares se dirigen a una localización subcelular a lo largo de la ruta secretora de célula huésped donde son capaces de funcionar y, preferiblemente, donde se diseñan o seleccionan para funcionar de forma más eficaz.

Las células vegetales y de insecto también se pueden modificar para alterar la glucosilación de proteínas expresadas usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de la invención. Además, la glucosilación en células de mamífero, incluyendo células humanas, también se puede modificar usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de la invención. Puede ser posible, por ejemplo, optimizar una actividad enzimática particular o modificar de otro modo las proporciones relativas de diversos N-glucanos preparados en una célula huésped de mamífero usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de la invención.

Los ejemplos de modificaciones de glucosilación que se pueden realizar usando un procedimiento de acuerdo con esta realización de la invención son: (1) modificar una célula huésped eucariota para cortar restos de manosa de Man_{8}GlcNAc_{2} para producir un N-glucano Man_{5}GlcNAc_{2}; (2) modificar una célula huésped eucariota para añadir un resto de N-acetilglucosamina (GlcNAc) a Man_{5}GlcNAc_{2} por acción de GlcNAc transferasa I; (3) modificar una célula huésped eucariota para expresar funcionalmente una enzima tal como una N-acetilglucosaminil Transferasa (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI), manosidasa II, fucosiltransferasa (FT), galactosil tranferasa (GalT) o una sialiltransferasa (ST).

Al repetir el procedimiento, se pueden incorporar rutas de glucosilación cada vez más complejas en un huésped diana, tal como un microorganismo eucariota inferior. En una realización preferida, el organismo huésped se transforma dos o más veces con bibliotecas de ADN que incluyen secuencias que codifican actividades de glucosilación. La selección de fenotipos deseados se puede realizar después de cada ronda de transformación o, alternativamente, después de que hayan tenido lugar varias transformaciones. Las rutas de glucosilación complejas se pueden modificar de forma rápida de este modo.

Reacciones de Glucosilación Secuencial

En una realización preferida, tales bibliotecas de péptido de dirección/dominio catalítico están diseñadas para incorporar información existente sobre la naturaleza secuencial de las reacciones de glucosilación en eucariotas superiores. Las reacciones que se sabe que tienen lugar de forma temprana en el curso del procesamiento de glucoproteína requieren la dirección de enzimas que catalizan tales reacciones a una parte temprana del Golgi o el RE. Por ejemplo, el corte de Man_{8}GlcNAc_{2} a Man_{5}GlcNAc_{2} por manosidasas es una etapa temprana en la formación de N-glucano complejo (Figuras 1B y 35A). Debido a que el procesamiento de proteína se inicia en el RE y después avanza a lo largo del Golgi temprano, medial y tardío, es deseable que esta reacción tenga lugar en el RE o Golgi temprano. Cuando se diseña una biblioteca para la localización de manosidasa I, por ejemplo, se intenta, por tanto, hacer coincidir las señales de dirección de RE y Golgi temprano con el dominio catalítico de manosidasa I.

Generación de Diversidad de Secuencia Adicional

El procedimiento de esta realización es más eficaz cuando un ácido nucleico, por ejemplo, una biblioteca de ADN, introducida por transformación en el huésped contiene una gran diversidad de secuencias, aumentando de este modo la probabilidad de que al menos un transformante mostrará el fenotipo deseado. Las mutaciones de un solo aminoácido, por ejemplo, pueden alterar espectacularmente la actividad de enzimas de procesamiento de glucoproteínas (Romero y col. (2000) J. Biol. Chem. 275(15): 11071-4). Por consiguiente, antes de la transformación, una genoteca de ADN o un sub-biblioteca constituyente se puede someter a una o más técnicas para generar diversidad de secuencia adicional. Por ejemplo, una o más rondas de transposición de genes, PCR con tendencia a error, mutagénesis in vitro u otros procedimientos para generar diversidad de secuencia se pueden realizar para obtener una mayor diversidad de secuencias dentro de la combinación de construcciones de fusión.

Secuencias de Control de la Expresión

Además de las secuencias de fase de lectura abierta que se han descrito anteriormente, generalmente es preferible proporcionar a cada construcción de biblioteca secuencias de control de la expresión, tales como promotores, terminadores de la transcripción, potenciadores, sitios de unión a ribosoma y otras secuencias funcionales como puede ser necesario para garantizar la transcripción y traducción eficaz de las proteínas de fusión después de la introducción por transformación de construcciones de fusión en el organismo huésped.

Los componentes de vector adecuados, por ejemplo, marcadores de selección, secuencias de control de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciadores, terminadores y similares) y, opcionalmente, secuencias requeridas para la replicación autónoma en una célula huésped, se seleccionan como una función de qué célula huésped particular se elige. Los criterios de selección para componentes de vector adecuados para el uso en una célula huésped de mamífero o eucariota inferior particular son rutinarios. Las células huésped eucariotas inferiores preferidas de la invención incluyen Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium Gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa. Cuando el huésped es Pichia pastoris, los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores AOX1, AOX2, GAPDH
y P40.

Marcadores de Selección

También es preferible proporcionar a cada construcción al menos un marcador de selección, tal como un gen para otorgar resistencia a fármacos o para complementar una lesión metabólica del huésped. La presencia del marcador es útil en la selección posterior de transformantes; por ejemplo, en levadura se pueden usar los genes URA3, HIS4, SUC2, G418, BLA o SH BLE. Se conoce una multitud de marcadores de selección y están disponibles para el uso en células huésped de levadura, hongos, plantas, insectos, de mamífero y otras eucariotas.

Transformación

Después, la biblioteca de ácido nucleico se introduce por transformación en el organismo huésped. En levaduras, se puede usar cualquier procedimiento conveniente de transferencia de ADN, tal como electroporación, el procedimiento de cloruro de litio o el procedimiento de esferoplastos. En hongos filamentosos y células vegetales, los procedimientos convencionales incluyen bombardeo con partículas, electroporación y transformación mediada por agrobacterium. Para producir una cepa estable adecuada para cultivo de alta densidad (por ejemplo, fermentación en levadura), es deseable integrar las construcciones de genoteca de ADN en el cromosoma del huésped. En una realización preferida, la integración tiene lugar por recombinación homóloga, usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se proporcionan elementos de genoteca de ADN con secuencias flanqueantes homólogas a secuencias del organismo huésped. De este modo, la integración tiene lugar en un sitio definido en el genoma del huésped, sin alteración de genes deseables o esenciales.

En una realización especialmente preferida, el ADN de genoteca se integra en el sitio de un gen indeseado en un cromosoma del huésped, realizando la alteración o deleción del gen. Por ejemplo, la integración en los sitios de los genes OCH1, MNN1 o MNN4 permite la expresión de un ADN de biblioteca deseado mientras que se evita la expresión de enzimas implicadas en la hipermanosilación de levadura de glucoproteínas. En otras realizaciones, se puede introducir el ADN de la biblioteca en el huésped por una molécula de ácido nucleico, plásmido, vector (por ejemplo, vector viral o retroviral), cromosoma, y se puede introducir como una molécula de ácido nucleico autónoma o por integración homóloga o aleatoria en el genoma del huésped. En cualquier caso, generalmente es deseable incluir dentro de cada construcción de ADN de biblioteca al menos un gen marcador de selección para permitir la selección sencilla de organismos huésped que se han transformado de forma estable. Son especialmente adecuados los genes marcadores reciclables tales como ura3, que se pueden seleccionar en positivo o negativo.

Procedimientos de Exploración y Selección

Después de la transformación de la cepa huésped con la genoteca de ADN, se seleccionan los transformantes que presentan un fenotipo de glucosilación deseado. La selección se puede realizar en una única etapa o por una serie de etapas de enriquecimiento y/o empobrecimiento fenotípico usando cualquiera de una diversidad de ensayos o procedimientos de detección. La caracterización fenotípica se puede realizar manualmente o usando un equipamiento de exploración de alto rendimiento automatizado. De forma común, un microorganismo huésped presenta N-glucanos de proteína sobre la superficie celular, donde se localizan diversas glucoproteínas.

Se pueden explorar las células que tienen la mayor concentración de GlcNAc terminal sobre la superficie celular, por ejemplo, o las células que secretan la proteína con el mayor contenido de GlcNAc terminal. Tal exploración se puede basar en un procedimiento visual, como un procedimiento de tinción, la capacidad de unirse a anticuerpos de unión de GlcNAc terminal específicos o lectinas conjugadas con un marcador (tales lectinas están disponibles en E. Y. Laboratories Inc., San Mateo, CA), la capacidad reducida de lectinas específicas de unirse a restos de manosa terminales, la capacidad de incorporar un azúcar marcado radiactivamente in vitro, unión alterada a colorantes o superficies cargadas o se puede conseguir usando un dispositivo de Separación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) junto con una lectina o anticuerpo marcado con fluoróforo (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892).

Por consiguiente, las células intactas se pueden explorar para un fenotipo de glucosilación deseado exponiendo las células a una lectina o un anticuerpo que se une específicamente al N-glucano deseado. Está disponible en el mercado una amplia diversidad de lectinas específicas de oligosacáridos (por ejemplo, en EY Laboratories, San Mateo, CA). Alternativamente, están disponibles en el mercado anticuerpos para N-glucanos humanos o animales específicos o se pueden producir usando técnicas convencionales. Una lectina o anticuerpo apropiado se puede conjugar a una molécula indicadora, tal como un cromóforo, fluoróforo, radioisótopo o una enzima que tiene un sustrato cromogénico (Guillen y col., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892).

Después, la exploración se puede realizar usando procedimientos analíticos tales como espectrofotometría, fluorimetría, separación de células activadas por fluorescencia o recuento por escintilación. En otros casos, puede ser necesario analizar glucoproteínas aisladas o N-glucanos de células transformadas. El aislamiento de proteína se puede realizar por técnicas conocidas en la técnica. En una realización preferida, una proteína indicadora se secreta al medio y se purifica por cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de Ni o afinidad de glutatión S-transferasa). En los casos en los que se prefiere un N-glucano aislado, se puede usar una enzima tal como endo-\beta-N-acetilglucosaminidasa (Genzyme Co., Boston, MA, New England Biolabs, Beverly, MA) para escindir los N-glucanos de glucoproteínas. Después, se pueden analizar proteínas aisladas o N-glucanos por cromatografía líquida (por ejemplo, HPLC), espectrometría de masas u otros medios adecuados. La Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 describe varios procedimientos por los que se pueden identificar células con estructuras de hidratos de carbono extracelulares deseadas. En una realización preferida, se usa espectrometría de masas MALDI-TOF para analizar los N-glucanos escindidos.

Antes de la selección de un transformante deseado, puede ser deseable agotar la población transformada de células que tengan fenotipos indeseados. Por ejemplo, cuando se usa el procedimiento para incorporar una actividad de manosidasa funcional en células, los transformantes deseados tendrán niveles menores de manosa en la glucoproteína celular. La exposición de la población transformada a un radioisótopo letal de manosa en el medio agota la población de transformantes que tienen el fenotipo indeseado, es decir, niveles altos de manosa incorporada (Huffaker y Robbins (1983) Proc Natl Acad Sci USA. 80 (24): 7466-70). Alternativamente, se puede usar una lectina o un anticuerpo citotóxico, dirigido contra un N-glucano indeseable, para agotar una población transformada de fenotipos indeseados (por ejemplo, Stanley y Siminovitch (1977) Somatic Cell Genet 3(4): 391-405). La Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 describe varios procedimientos por los que se pueden identificar células con una estructura de hidrato de carbono extracelular deseada. La realización de forma repetida de esta estrategia permite la incorporación secuencial de glucanos más y más complejos en eucariotas inferiores.

Para detectar células huésped que tengan sobre su superficie un alto grado del intermedio de N-glucano de tipo humano GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, por ejemplo, se pueden seleccionar transformantes que permiten la transferencia más eficaz de GlcNAc por GlcNAc Transferasa de UDP-GlcNAc en un ensayo celular in vitro. Esta exploración se puede realizar cultivando células que alojan la biblioteca introducida por transformación bajo presión selectiva sobre una placa de agar y transfiriendo colonias individuales a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Después de cultivar las células, las células se centrifugan, las células se resuspenden en tampón y después de la adición de UDP-GlcNAc y GnTII, la liberación de UDP se determina por HPLC o un ensayo ligado a enzimas para UDP. Alternativamente, se puede usar UDP-GlcNAc y GnTII marcado radiactivamente, lavar las células y después buscar la liberación de GlcNAc radiactiva por N-acetilglucosaminidasa. Todo esto se puede realizar manualmente o de manera automatizada mediante el uso de equipamiento de exploración de alto rendimiento. Los transformantes que liberan más UDP, en el primer ensayo, o más GlcNAc marcada radiactivamente en el segundo ensayo, se espera que tengan un mayor grado de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} sobre su superficie y, por tanto, constituyen el fenotipo deseado. Se pueden adaptar ensayos similares para buscar los N-glucanos en proteínas secretadas del mismo modo.

Alternativamente, se puede usar cualquier otra exploración adecuada tal como un ensayo de unión de lectina que sea capaz de poner de manifiesto patrones de glucosilación alterados sobre la superficie de células transformadas. En este caso, la unión reducida de lectinas específicas para manosas terminales puede ser una herramienta de selección adecuada. La lectina de Galantus nivalis se une específicamente a \alpha-1,3 manosa terminal, que se espera que se reduzca si está presente suficiente actividad de manosidasa II en el Golgi. También se puede enriquecer en transformantes deseados realizando una etapa de separación cromatográfica que permita la retirada de células que contienen un alto contenido de manosa terminal. Esta etapa de separación se realizaría con una columna de lectina que se une específicamente a células con un alto contenido de manosa terminal (por ejemplo, lectina de Galantus nivalis unida a agarosa, Sigma, St. Louis, MO) con respecto a las que tienen un bajo contenido de manosa
terminal.

Además, se pueden crear directamente tales construcciones de proteína de fusión, ya que información adicional son respecto a la localización de enzimas modificadoras de hidratos de carbono activas en diferentes huéspedes eucariotas inferiores que está disponible en la bibliografía científica. Por ejemplo, se conoce que \beta1,4-GalTr humana se puede fusionar al dominio de membrana de MNT, una manosiltransferasa de S. cerevisiae y se localiza en el aparato de Golgi mientras que conserva su actividad catalítica (Schwientek y col. (1995) J. Biol. Chem. 270 (10): 5483-9). Si S. cerevisiae o un organismo relacionado es el huésped a modificar, se pueden incorporar directamente tales hallazgos en la estrategia global para obtener N-glucanos complejos de tal huésped. Varios de tales fragmentos génicos en P. pastoris se han identificado que están relacionados con glucosiltransferasas en S. cerevisiae y, por tanto, se podrían usar con ese propósito.

\vskip1.000000\baselineskip

Sitios de Integración

Como un objetivo final de este esfuerzo de modificación genética es una cepa de producción de proteína robusta que sea capaz de funcionar bien en un procedimiento de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma del huésped (por ejemplo, fúngico) implica preferiblemente una planificación cuidadosa. La cepa modificada probablemente se tiene que transformar con una variedad de diferentes genes y estos genes se tendrán que transformar de un modo estable para garantizar que la actividad deseada se mantenga a lo largo del procedimiento de fermentación. Como se describe en este documento, cualquier combinación de diversas actividades enzimáticas deseadas se puede introducir por ingeniería en el huésped de expresión de proteína fúngica, por ejemplo, sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos del RE y Golgi (por ejemplo, transportadores de cotransporte unidireccional y bidireccional para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacáridos activados tales como UDP-galactosa, CMP-ácido-N-acetilneuramínico. Los ejemplos de procedimientos preferidos para modificar la glucosilación en una célula huésped eucariota inferior, tal como Pichia pastoris, se muestran en la Tabla 6.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6

9

11

12

Como una estrategia para modificar la formación de N-glucanos complejos en una célula huésped tal como un eucariota inferior implica tanto la eliminación como la adición de actividades de glucosiltransferasa particulares, un esquema comprensible intentará coordinar ambos requisitos. Los genes que codifican enzimas que son indeseables sirven como sitios de integración potenciales para genes que son deseables. Por ejemplo, la actividad de 1,6 manosiltransferasa es un distintivo de glucosilación en muchos eucariotas inferiores conocidos. El gen que codifica alfa-1,6-manosiltransferasa (OCH1) se ha clonado de S. cerevisiae y mutaciones en el gen dan lugar a un fenotipo viable con manosilación reducida. El locus génico que codifica la actividad de alfa-1,6-manosiltransferasa, por lo tanto, es una diana principal para la integración de genes que codifican actividad de glucosiltransferasa. De un modo similar, se puede elegir una diversidad de otros sitios de integración cromosómicos que, basándose en un acontecimiento de alteración de gen en ese locus, se espera que: (1) mejoren la capacidad de las células de glucosilar de un modo más de tipo humano, (2) mejoren la capacidad de las células de secretar proteínas, (3) reduzcan la proteólisis de proteínas extrañas y (4) mejoren otras características del procedimiento que faciliten la purificación o el propio procedimiento de fermentación.

Glucoproteínas Diana

Los procedimientos descritos en este documento son útiles para producir glucoproteínas, especialmente glucoproteínas usadas terapéuticamente en seres humanos. Las glucoproteínas que tienen glucoformas específicas pueden ser especialmente útiles, por ejemplo, en la dirección de proteínas terapéuticas. Por ejemplo, se ha demostrado que manosa-6-fosfato dirige las proteínas al lisosoma, lo que puede ser esencial para la función apropiada de varias enzimas relacionadas con trastornos de almacenamiento lisosómico tales como enfermedad de Gaucher, de Hunter, de Hurler, de Scheie, de Fabry y de Tay-Sachs, por mencionar solamente unas pocas. Asimismo, la adición de uno o más restos de ácido siálico a una cadena lateral de glucano puede aumentar la vida de una glucoproteína terapéutica in vivo después de la administración. Por consiguiente, las células huésped (por ejemplo, de eucariota inferior o mamífero) se pueden modificar genéticamente para aumentar el alcance de ácido siálico terminal en glucoproteínas expresadas en las células. Alternativamente, se puede conjugar ácido siálico a la proteína de interés in vitro antes de la administración usando una transferasa de ácido siálico y un sustrato apropiado. Se pueden emplear cambios en la composición del medio de cultivo además de la expresión de actividades enzimáticas implicadas en glucosilación de tipo humano para producir glucoproteínas que se parecen más estrechamente a formas humanas (Weikert y col. (1999) Nature Biotechnology 17, 1116-1121; Werner y col. (1998) Arzneimittelforschung 48(8): 870-880; Andersen y Goochee (1994) Cur. Opin. Biotechnol. 5: 546-549; Yang y Butler (2000) Biotechnol. Bioengin. 68(4): 370-380). Se ha demostrado que las modificaciones de glucano específicas de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, la adición de una GlcNAc de bisección) mejoran la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80), lo que puede ser deseable para la producción de anticuerpos u otras proteínas terapéuticas.

Las proteínas terapéuticas se administran típicamente por inyección, por vía oral, por vía pulmonar u otros medios. Los ejemplos de glucoproteínas diana adecuadas que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación: eritropoyetina, citocinas tales como interferón-\alpha, interferón-\beta y interferón-\gamma, interferón-\omega y granulocito-CSF, factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína humana C, cadena \alpha de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de tripsina de urea, proteína de unión de IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitor mieloide-1, osteoprotegerina, \alpha-1-antitripsina, ADNasa II y \alpha-feto proteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, también conocido como proteína de unión a TNF 1), TACI-Ig (interaccionador de ligando de ciclofilina y modulador de calcio y activador transmembrana), FSH (hormona estimuladora de folículos), GM-CSF, GLP-1 (proteína similar a glucagón 1) con y sin agonista de receptor FC de IL-1, sTNFr, (enbrel, también conocido como fusión de Fc de receptor de TNF soluble), ATIII, rhThrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Antígeno 4 asociado a Linfocitos T Citotóxicos-Ig).

Expresión de GnT- para Reforzar la Funcionalidad de Anticuerpos

La adición de restos de N-acetilglucosamina a la estructura de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} por N-acetilglucosaminiltransferasas II y III produce un denominado N-glucano GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado (Figura 15). Esta estructura se ha implicado en una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80). La re-modificación de glucoformas de inmunoglobulinas expresadas por células de mamífero es una tarea tediosa y compleja. Especialmente en el caso de GnTIII, donde la sobre-expresión de esta enzima se ha implicado en la inhibición del crecimiento, se han tenido que emplear procedimientos que implican expresión génica regulada (inducible) para producir inmunoglobulinas con N-glucanos bisecados (Umana y col. (1999) Biotechnol Bioeng. 65(5): 542-9; Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80); Umana y col., documento WO 03/011878; Patente de Estados Unidos Nº.6.602.684.

Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona sistemas y procedimientos para producir N-glucanos de tipo humano que tienen N-acetilglucosamina (GlcNAc) de bisección en una estructura central de trimanosa o pentamanosa. Por tanto, las inmunoglobulinas que tienen N-glucanos bisecados se pueden producir de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. Los sistemas y procedimientos descritos en este documento no padecerán problemas previos, por ejemplo, citotoxicidad asociada con sobre-expresión de GnTIII o ADCC, ya que las células huésped de la invención se modifican y seleccionan para ser células viables y preferiblemente robustas que producen N-glucanos que tienen glucoformas de tipo humano sustancialmente modificadas tales como GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}. Por tanto, la adición de una N-acetilglucosamina de bisección en una célula huésped de la invención tendrá un efecto insignificativo sobre el fenotipo de crecimiento o la viabilidad de estas células huésped.

Además, el trabajo de otros ha mostrado que no existe una correlación lineal entre los niveles de expresión de GnTIII y el grado de ADCC. Umana y col. (1999) Nature Biotechnol. 17: 176-80. Por tanto, parece que es un desafío encontrar el nivel de expresión óptimo en células de mamífero y mantener el mismo a lo largo de un procedimiento de fermentación aprobado por la FDA. Sin embargo, en las células de la invención, tales como células fúngicas, el hallar un promotor de una fuerza apropiada para establecer un nivel de expresión de GnTIII robusto, fiable y óptimo, es una tarea comparativamente sencilla para el especialista en la técnica.

Una célula huésped de levadura o unicelular o multicelular capaz de producir glucoproteínas con N-glucanos de bisección se modifica de acuerdo con la invención introduciendo en la célula huésped la actividad de GnTIII de la invención (Ejemplo 12). La célula huésped se transforma con un ácido nucleico que codifica los dominios de GnTIII de la invención (véase, por ejemplo, la Figura 24) que tienen actividad enzimática, fusionado opcionalmente con un péptido de dirección señal de célula heterólogo (por ejemplo, usando las bibliotecas y procedimientos asociados de la invención). Las células huésped modificadas para expresar la actividad de GnTIII de la invención producirán mayores títulos de anticuerpos de lo que son capaces las células de mamífero. También producirán anticuerpos con una mayor potencia con respecto a ADCC.

Se ha demostrado que los anticuerpos producidos por líneas de células de mamífero transfectadas con GnTIII son tan eficaces como los anticuerpos producidos por líneas celulares no transfectadas, pero a una concentración 10-20 veces menor (Davies y col. (2001) Biotechnol. Bioeng. 74(4): 288-94). Un aumento de productividad del vehículo de producción de la invención con respecto a sistemas de mamífero en un factor de veinte, y un aumento de diez veces de la potencia dará como resultado una mejora de productividad neta de doscientos. Por tanto, se pueden producir altos títulos de un anticuerpo que tiene una alta potencia (por ejemplo, hasta varios órdenes de magnitud más potente de lo que se puede producir actualmente) de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. El sistema y procedimiento es seguro y proporciona anticuerpos de alta potencia con un bajo coste en periodos de tiempo cortos. Las células huésped modificadas para expresar la actividad de GnTIII de acuerdo con la invención producen inmunoglobulinas que tienen N-glucanos bisecados a velocidades de al menos 50 mg/litro/día hasta al menos 500 mg/litro/día. Además, cada molécula de inmunoglobulina (Ig) (que comprende GlcNAc de bisección) es más potente que la misma molécula de Ig producida sin GlcNAc de bisección.

Lo siguiente son ejemplos que ilustran diversos aspectos de la invención. Estos ejemplos no se deben considerar como limitantes: los ejemplos se incluyen solamente con fines de ilustración.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Clonación y Alteración del gen OCH1 en P. pastoris Generación de un mutante de OCH1 en P. pastoris

Una ORF de 1215 pb del gen OCH1 de P. pastoris que codifica una supuesta \alpha-1,6 manosiltransferasa se amplificó a partir de ADN genómico de P. pastoris (cepa X-33, Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los oligonucleótidos 5'-ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT-3' (SEC ID Nº: 3) y 5'-TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC-3' (SEC ID Nº: 4) que se diseñaron basándose en la secuencia de OCH1 de P. pastoris (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Nº 8-336387). Posteriormente, se amplificaron 2685 pb cadena arriba y 1175 pb cadena abajo de la ORF del gen OCH1 de una genoteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm, T. y col. (1999) Yeast 15(7): 563-72) usando los oligonucleótidos internos 5'-ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT-3' (SEC ID Nº: 47) en el gen OCH1 y 5'-GTAATAC
GACTCACTATAGGGC-3' T7 (SEC ID Nº: 48) y oligonucleótidos 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' T3 (SEC ID Nº: 4), en la cadena principal del plásmido lambda ZAP II que lleva la biblioteca (Stratagene, La Jolla, CA). El fragmento resultante de 5075 pb se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se denominó PBK9.

Después de ensamblar una construcción knockout génica que sustituyó la fase de lectura de OCH1 con un gen de resistencia HIS4, P. pastoris se transformó y las colonias se exploraron para sensibilidad a temperatura a 37ºC. Las mutantes de OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a temperatura y crecen lentamente a temperaturas elevadas. Por tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante de OCH1 de S. cerevisiae con una genoteca de ADN o ADNc de P. pastoris. Aproximadamente 20 cepas sensibles a temperatura se sometieron adicionalmente a una exploración por PCR de colonias para identificar colonias con un gen de och1 delecionado. Se obtuvieron varias deleciones de och1.

El pBK9.1 linealizado, que tiene una secuencia de 2,1 kb cadena arriba y una secuencia de 1,5 kb cadena abajo del casete del gen OCH1 que lleva el gen HIS4 de Pichia, se introdujo por transformación en BK1 de P. pastoris [GS115 (his4 Invitrogen Corp., San Diego, CA) que lleva el gen de IFN-\beta humano en el locus de AOX1] para anular el gen OCH1 de tipo silvestre. La exploración inicial de transformantes se realizó usando medio de retirada de histidina seguido de siembra por duplicado para seleccionar las colonias sensibles a temperatura. Veinte de doscientas de las colonias positivas a histidina mostraron un fenotipo sensible a temperatura a 37ºC. Para excluir la integración aleatoria de pBK9.1 en el genoma de Pichia, los 20 aislados sensibles a temperatura se sometieron a PCR de colonias usando cebadores específicos para la secuencia cadena arriba del sitio de integración y para la ORF de HIS4. Dos de las veinte colonias eran defectuosas en och1 y se analizaron adicionalmente usando una transferencia de Southern y una transferencia de Western indicando la alteración de och1 funcional por la construcción knock-out de och1. El ADN genómico se digirió usando dos enzimas de restricción separadas BglII y ClaI para confirmar el knock-out de och1 y para confirmar la integración en la fase de lectura abierta. La transferencia de Western mostró mutantes de och1 que carecían de una banda separada producida en el tipo silvestre de GS115 en 46,2 kDa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Modificación de P. pastoris con \alpha-1,2-Manosidasa para Producir Precursores de IFN-\beta que Contienen Man_{5}GlcNAc_{2}

Se requiere una \alpha-1,2-manosidasa para el corte de Man_{8}GlcNAc_{2} para producir Man_{5}GlcNAc_{2}, un intermedio esencial para la formación de N-glucano complejo. Aunque la producción de un precursor de Man_{5}GlcNAc_{2} es esencial, no es necesariamente suficiente para la producción de glucanos híbridos y complejos debido a que el isómero específico de Man_{5}GlcNAc_{2} puede o no ser un sustrato para GnTI. Un mutante de och1 de P. pastoris se modifica para expresar interferón \beta humano secretado bajo el control de un promotor aox. Se construyó una genoteca de ADN por la ligación en fase del dominio catalítico de manosidasa IB humana (una \alpha-1,2-manosidasa) con una sub-biblioteca que incluye secuencias que codifican péptidos de localización de Golgi temprano y RE. La genoteca de ADN después se introduce por transformación en el organismo huésped, dando como resultado una población genéticamente mixta en la que los transformantes individuales expresan cada uno interferón-\beta así como un gen de manosidasa sintético de la biblioteca. Las colonias de transformantes individuales se cultivan y la producción de interferón se induce por adición de metanol. En estas condiciones, más del 90% de la proteína secretada es interferón-\beta glucosilado.

Los sobrenadantes se purifican para retirar sales y contaminantes de bajo peso molecular por cromatografía en fase inversa de sílice C_{18}. Los transformantes deseados que expresan \alpha-1,2-manosidasa activa apropiadamente dirigida producen interferón-\beta, que incluye N-glucanos de la estructura Man_{5}GlcNAc_{2}, que tiene una masa molecular reducida en comparación con el interferón-\beta de la cepa parental. El interferón-\beta purificado se analiza por espectrometría de masas MALDI-TOF y se identifican las colonias que expresan la forma deseada de interferón-\beta.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Generación de una Cepa Mutante de och1 que Expresa una \alpha-1,2-Manosidasa, GnTI y GnTII para la Producción de una Glucoproteína de Tipo Humano

La fase de lectura abierta de 1215 pb del gen de OCH1 de P. pastoris así como 2685 pb cadena arriba y 1175 pb cadena abajo se amplificó por PCR (véase también el documento WO 02/00879), se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se denominó PBk9. Para crear una cepa knock-out de och1 que contiene múltiples marcadores auxótrofos, 100 \mug de pJN329, un plásmido que contiene un alelo mutante de och1::URA3 flanqueado con sitios de restricción SfiI se digirió con SfiI y se usó para transformar la cepa de P. pastoris JC308 (Cereghino y Col. (2001) Gene 263: 159-169) por electroporación. Después de la incubación de medio definido que carece de uracilo durante 10 días a temperatura ambiente, se seleccionaron 1000 colonias y se volvieron a sembrar en estrías. Se sometieron clones URA^{+} que eran incapaces de desarrollarse a 37ºC, pero que se desarrollaban a temperatura ambiente, a PCR de colonias para ensayar la integración correcta del alelo mutante och1::URA3. Un clon que mostró el patrón de PCR esperado se denominó YJN153. El dominio de Kringle 3 de plasminógeno humano (K3) se usó como una proteína modelo. Un plásmido marcado con Neo^{R} que contenía el gen de K3 se introdujo por transformación en la cepa YJN153 y una cepa resultante, que expresaba K3, se denominó BK64-1.

El plásmido pPB103, que contenía el gen de MNN2-2 de Kluyveromyces lactis que codifica un transportador de UDP-N-acetilglucosamina de Golgi, se construyó clonando un fragmento romo de BglII-HindIII del vector pDL02 (Abeijon y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 5963-5968) en pBLADE-SX digerido con BglII y BamHI y con extremos romos que contenía el gen ADE1 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169). Este plásmido se linealizó con EcoNI y se introdujo por transformación en la cepa BK64-1 por electroporación y una cepa que se había confirmado que contenía el MNN2-2 por análisis de PCR se denominó PBP1.

Se generó una biblioteca de construcciones de manosidasa, que comprenden fusiones en fase de los dominios líder de varias proteínas de membrana de tipo I o tipo II de S. cerevisiae y P. pastoris fusionados con los dominios catalíticos de varios genes de \alpha-1,2-manosidasa de fuentes humanas, de ratón, de mosca, de gusano y de levadura (véase, por ejemplo, el documento WO02/00879, incorporado en este documento como referencia). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de HIS4 de P. pastoris y se exploró linealizando con SalI, introduciendo por transformación por electroporación en la cepa PBP1 y analizando los glucanos liberados de la proteína indicadora K3. Una construcción activa elegida era una quimera de los nucleótidos 988-1296 (Extremo C) del gen SEC12 de levadura fusionado con una deleción N-terminal del gen de \alpha-1,2-manosidasa IA de ratón (Figura 3), que carecía de los 187 nucleótidos. Una cepa de P. pastoris que expresa esta construcción se denominó PBP2.

Se generó una biblioteca de construcciones de GnTI, que comprendía fusiones en fase de la misma biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTI de fuentes humanas, de gusano, de rana y de mosca (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de ARG4 de P. pastoris y se exploró linealizando con AatII, introduciendo por transformación por electroporación en la cepa PBP2 y analizando los glucanos liberados de K3. Un construcción activa elegida era una quimera de los primeros 120 pb del gen de MNN9 de S. cerevisiae fusionado con una deleción del gen de GnTI humana, que carecía de los primeros 154 pb. Una cepa de P. pastoris que expresa esta construcción se denominó PBP-3. (Véase también la Figura 36).

Se generó una biblioteca de construcciones de GnTII, que comprendía fusiones en fase de la biblioteca líder con los dominios catalíticos de los genes de GnTII de fuentes humanas y de rata (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de P. pastoris que contenía el gen de NST^{R} que otorga resistencia al fármaco nourseotricina. Los plásmidos de biblioteca se linealizaron con EcoRI, se introdujeron por transformación en la cepa RDP27 por electroporación y las cepas resultantes se exploraron por análisis de los glucanos liberados de K3 purificada.

\vskip1.000000\baselineskip

Materiales para las Siguientes Reacciones

El MOPS, cacodilato sódico, cloruro de manganeso, UDP-galactosa y CMP-ácido-N-acetilneuramínico eran de Sigma. El ácido trifluoroacético (TFA) era de Sigma/Aldrich, Saint Louis, MO. La \alpha-2,6-sialiltransferasa de rata recombinante de Spodoptera frugiperda y \beta1,4-galactosiltransferasa de leche bovina eran de Calbiochem (San Diego, CA). La N-glucosidasa F de proteína, manosidasas y oligosacáridos eran de Glyko (San Rafael, CA). La resina de DEAE de ToyoPearl era de TosoHaas. La resina quelante de metales "HisBind" era de Novagen (Madison, WI). Las placas de aclaramiento de lisado de 96 pocillos eran de Promega (Madison, WI). Las placas de 96 pocillos de unión de proteína eran de Millipore (Bedford, MA). Las sales y los agentes de tamponamiento eran de Sigma (St. Louis, MO). Las matrices de MALDI eran de Aldrich (Milwaukee, WI).

\vskip1.000000\baselineskip

Purificación de Proteína

Se purificó Kringle 3 usando un formato de 96 pocillos en un robot de manejo de muestras Beckman Biomek 2000 (Beckman/Coulter Ranch Cucamonga, CA). Se purificó Kringle 3 de medio de expresión usando un marcador hexa-histidina C-terminal. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind. En resumen, un volumen asentado de 150 \mul (\mul) de resina se vierte en los pocillos de una placa de unión de lisado de 96 pocillos, se lava con 3 volúmenes de agua y se carga con 5 volúmenes de NiSO_{4} 50 mM y se lava con 3 volúmenes de tampón de unión (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM pH 7,9). El medio de expresión de proteína se diluye 3:2, medio/PBS (PO4 60 mM, KCl 16 mM, NaCl 822 mM, pH 7,4) y se carga en las columnas. Después del drenado, las columnas se lavan con 10 volúmenes de tampón de unión y 6 volúmenes de tampón de lavado (imidazol 30 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9) y la proteína se eluye con 6 volúmenes de tampón de elución (imidazol 1M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). Las glucoproteínas eluídas se evaporan hasta sequedad por liofilización.

\vskip1.000000\baselineskip

Liberación de Glucanos Ligados a N

Los glucanos se liberan y separan de las glucoproteínas por una modificación de un procedimiento descrito previamente (Papac, y col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Los pocillos de una placa de 96 pocillos MultiScreen IP (membrana Immobilon-P) (Millipore) se humectan con 100 \mul de metanol, se lavan con 3X150 \mul de agua y 50 \mul de tampón RCM (urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6), drenando con vacío ligero después de cada adición. Las muestras de proteína secadas se disuelven en 30 \mul de tampón RCM y se transfieren a los pocillos que contienen 10 \mul de tampón RCM. Los pocillos se drenan y lavan dos veces con tampón RCM. Las proteínas se reducen por adición de 60 \mul de DTT 0,1 M en tampón RCM durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavan tres veces con 300 \mul de agua y se carboximetilan por adición de 60 \mul de ácido iodoacético 0,1 M durante 30 min en oscuridad a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan de nuevo tres veces con agua y las membranas se bloquean por la adición de 100 \mul de PVP 360 al 1% en agua durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se drenan y lavan tres veces con 300 \mul de agua y se desglucosilan por la adición de 30 \mul de NH_{4}HCO_{3} 10 mM pH 8,3 que contiene una milliunidad de N-glucanasa (Glyko). Después de 16 horas a 37ºC, la solución que contiene los glucanos se eliminó por centrifugación y se evaporó hasta sequedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Espectrometría de Masas de Desorción e Ionización por Láser Asistida por Matriz-Tiempo de Vuelo

Los pesos moleculares de los glucanos se determinaron usando un espectrómetro de masas de MALDI-TOF Voyager DE PRO lineal (Applied Biosciences) usando extracción retrasada. Los glucanos secados de cada pocillo se disolvieron en 15 \mul de agua y 0,5 \mul se aplicaron de forma puntual sobre placas de muestra de acero inoxidable y se mezclaron con 0,5 \mul de matriz S-DHB (9 mg/ml de ácido dihidroxibenzoico, 1 mg/ml de ácido 5-metoxisalicílico en 1:1 agua/acetonitrilo TFA a 0,1%) y se dejaron secar.

Se generaron iones por irradiación con un láser de nitrógeno pulsado (337 nm) con un tiempo de pulso de 4 ns. El instrumento se accionó en el modo de extracción retrasada con un retraso de 125 ns y con una tensión de aceleración de 20 kV. La tensión de rejilla era 93,00%, la tensión de cable de guía era del 0,10%, la presión interna era menor de 5 X 10-7 torr y el umbral de masa baja era 875 Da. Se generaron espectros a partir de la suma de 100-200 pulsos de láser y se adquirieron con un digitalizador de 2 GHz. Se usó el oligosacárido Man_{5}GlcNAc_{2} como un patrón de peso molecular externo. Todos los espectros se generaron con el instrumento en el modo de ión positivo. La precisión de masa estimada de los espectros era del 0,5%.

\newpage

Ejemplo 4

Modificación de P. pastoris para Producir Man_{5}GlcNAc_{2} como la Estructura de N-Glucano Predominante usando una Genoteca de ADN combinatoria

Un mutante de och1 de P. pastoris (véase los Ejemplos 1 y 3) se modificó para expresar y secretar proteínas tales como el dominio de kringle 3 del plasminógeno humano (K3) bajo el control del promotor AOXI inducible. El dominio de Kringle 3 de plasminógeno humano (K3) se usó como una proteína modelo. Un fragmento de ADN que codifica el K3 se amplificó usando polimerasa Pfu turbo (Strategene, La Jolla, CA) y se clonó en los sitios EcoRI y XbaI de pPICZ\alphaA (Invitrogen, Carlsbad, CA), dando como resultando un marcador 6-His C-terminal. Para mejorar la eficacia de glucosilación ligada a N de K3 (Hayes y col. 1975 J. Arch. Biochem. Biophys. 171, 651-655), Pro_{46} se sustituyó con Ser_{46} usando mutagénesis dirigida. El plásmido resultante se denominó pBK64. La secuencia correcta de la construcción de PCR se confirmó por secuenciación de ADN.

Se construyó una genoteca de ADN combinatoria por la ligación en fase de dominios catalíticos de \alpha-1,2-manosidasa IB murina (Genbank AN 6678787) y IA (Genbank AN 6754619) con una sub-biblioteca que incluye secuencias que codifican péptidos de localización de vesícula Cop II, RE y Golgi temprano de acuerdo con la Tabla 6. La genoteca de ADN combinada se usó para generar construcciones de fusión individuales, que después se introdujeron por transformación en el organismo huésped que expresa K3, dando como resultado una población genéticamente mixta en la que los transformantes individuales expresan cada uno K3 así como un gen de fusión de señal de localización/manosidasa de la biblioteca. Los transformantes individuales se cultivaron y la producción de K3 se indujo por transferencia a un medio que contenía metanol. En estas condiciones, después de 24 horas de inducción, más del 90% de la proteína en el medio era K3. La proteína indicadora K3 se purificó del sobrenadante para eliminar sales y contaminantes de bajo peso molecular por cromatografía de afinidad de Ni. Después de la purificación por afinidad, la proteína se sometió a precipitación salina por cromatografía de exclusión por tamaño en una resina Sephadex G10 (Sigma, St. Louis, MO) y se sometió directamente a análisis de MALDI-TOF descrito más adelante o los N-glucanos se eliminaron por digestión con PNGasa como se describe más adelante (liberación de N-glucanos) y se sometieron a análisis de MALDI-TOF Miele y col. (1997) Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 151-157.

Siguiendo esta estrategia, se obtuvo un conjunto diverso de transformantes; algunos no mostraron modificación de los N-glucanos en comparación con la cepa knock-out de och1, y otros mostraron un alto grado de corte de manosa (Figuras 5D y 5E). Los transformantes deseados que expresan \alpha-1,2-manosidasa activa dirigida apropiadamente produjeron K3 con N-glucanos de la estructura Man_{5}GlcNAc_{2}. Esto otorga una masa molecular reducida a la glucoproteína en comparación con la K3 de la cepa de deleción de och1 parental, una diferencia que se detectó de forma sencilla por espectrometría de masas MALDI-TOF (Figura 5). La Tabla 7 indica los niveles de producción relativos de Man_{5}GlcNAc_{2}.

TABLA 7 Una genoteca de ADN combinatoria representativa de secuencias de localización/dominios catalíticos que muestra niveles relativos de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}

14

TABLA 8 Otra genoteca de ADN combinatoria de secuencias de localización/dominios catalíticos que muestra niveles relativos de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Se seleccionaron péptidos de dirección de MNS I (SwissProt P32906) en S. cerevisiae (largo, medio y corto) (véase anteriormente Bibliotecas de Ácido Nucleico; Genoteca de ADN Combinatoria de Construcciones de fusión) y SEC12 (SwissProt P11655) en S. cerevisiae (988-1140 nucleótidos: corto) y (988-1296: medio). Aunque la mayoría de las secuencias de péptido de dirección eran deleciones N-terminales, algunas secuencias de péptido de dirección, tales como SEC12, eran deleciones C-terminales. Los dominios catalíticos usados en este experimento se seleccionaron de manosidasa 1A de ratón con una deleción N-terminal de 187 aminoácidos; y manosidasa 1B de ratón con una deleción de 58, 99 y 170 aminoácidos. El número de (+), como se usa en este documento, indica los niveles relativos de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}. La notación (-) indica ninguna producción aparente de Man_{5}GlcNAc_{2}. La notación (+) indica menos del 10% de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}. La notación (+ +) aproximadamente el 10-20% de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}. La notación con (+++) indica aproximadamente el 20-40% de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}. La notación con (++++) indica aproximadamente el 50% de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}. La notación con (+++++) indica más del 50% de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}.

La Tabla 9 muestra la cantidad relativa de Man_{5}GlcNAc_{2} en K3 secretada. Se generaron seiscientas ocho (608) cepas diferentes de P. pastoris, \Deltaoch1 transformando las mismas con una única construcción de una biblioteca genética combinatoria que se generó fusionando diecinueve (19) dominios catalíticos de \alpha-1,2-manosidasa con treinta y dos (32) líderes fúngicos de RE y Golgi cis.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9

16

La Tabla 7 muestra dos construcciones pFB8 y pGC5, entre otras, que presentan Man_{5}GlcNAc_{2}. La Tabla 8 muestra una construcción más preferida, pBC18-5, una secuencia de péptido de dirección de VAN1(s) de S. cerevisiae (de SwissProt 23642) ligada en fase con una deleción N-terminal de 80 aminoácidos de manosidasa IB de C. elegans (Genbank AN CAA98114) (Van1 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans). Esta construcción de fusión también produce una estructura predominante de Man_{5}GlcNAc_{2}, como se muestra en la Figura 5E. Se demostró que esta construcción produce más del 50% de Man_{5}GlcNAc_{2} (+++++).

Generación de una biblioteca de localización/manosidasa combinatoria

La generación de una genoteca de ADN combinatoria de dominios catalíticos de \alpha-1,2-manosidasa fusionados con péptidos de dirección requirió la amplificación de dominios de manosidasa con longitudes variables de deleciones N-terminales de varios organismos. Para conseguir este objetivo, las fases de lectura abierta (ORF) de longitud completa de \alpha-1,2-manosidasas se amplificaron por PCR de ADNc o ADN genómico obtenido de las siguientes fuentes: Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Aspergillus nidulans y Penicillium citrinum. En cada caso, el ADN se incubó en presencia de cebadores oligonucleotídicos específicos para la secuencia deseada de manosidasa además de reactivos requeridos para realizar la reacción de PCR. Por ejemplo, para amplificar la ORF de la \alpha-1,2-manosidasa IA de M. musculus, los cebadores 5'-ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTT
CAGTAGC (SEC ID Nº: 52) y el cebador 3'-TCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEC ID Nº: 53) se incubaron en presencia de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) y se amplificaron en las condiciones recomendadas por Stratagene usando los parámetros de ciclado: 94ºC durante 1 min (1 ciclo); 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 3 min (30 ciclos). Después de la amplificación, la secuencia de ADN que codifica la ORF se incubó a 72ºC durante 5 min con 1 U de ADN polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) antes de la ligación en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se introdujo por transformación en E. coli TOP10 químicamente competente, como se recomienda por Invitrogen. El producto de PCR clonado se confirmó por secuenciación ABI usando cebadores específicos para la ORF de manosidasa.

Para generar los truncamientos N-terminales deseados de cada manosidasa, toda la ORF de cada manosidasa se usó como el molde en una ronda posterior de reacciones de PCR en la que la posición de hibridación del cebador 5' era específica para el extremo 5' del truncamiento deseado y el cebador 3' permaneció específico para el extremo 3' original de la ORF. Para facilitar la subclonación del fragmento de manosidasa truncado en el vector de expresión de levadura, se introdujeron sitios de restricción AscI y PacI de pJN347 (Figura 2C) en cada producto de truncamiento, respectivamente en los extremos 5' y 3'. El número y la posición de los truncamientos N-terminales generados para cada ORF de manosidasa dependía de la posición de la región transmembrana (TM) en relación al dominio catalítico (CD). Por ejemplo, si la región del tallo localizada entre la TM y CD era menor de 150 pb, entonces solamente se generó un truncamiento para esa proteína. Sin embargo, si la región del tallo era mayor de 150 pb, entonces se generaron uno o dos truncamientos dependiendo de la longitud de la región de tallo.

Un ejemplo de cómo se generaron truncamientos para la manosidasa IA de M. musculus (Genbank AN 6678787) se describe en este documento, usándose una estrategia similar para las demás manosidasas. La Figura 3 ilustra la ORF de la \alpha-1,2-manosidasa IA de M. musculus con los dominios predichos transmembrana y catalíticos resaltados en negrita. Basándose en esta estructura, se diseñaron tres cebadores 5' (posiciones de hibridación subrayadas en la Figura 3) para generar las deleciones N-terminales \Delta65, \Delta105 y \Delta187. Usando la deleción \Delta65 N-terminal como un ejemplo, el cebador 5' usado fue 5'-GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC-3' (SEC ID Nº: 54) (con el sitio de restricción AscI resaltado en negrita) junto con el cebador 3' 5'-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEC ID Nº: 55) (con el sitio de restricción de PacI resaltado en negrita). Estos dos cebadores se usaron para amplificar un fragmento de 1561 pb en las condiciones resumidas anteriormente para amplificar la ORF de manosidasa 1A de M. musculus de longitud completa. Además, al igual que el producto obtenido para la ORF de longitud completa, el producto truncado también se incubó con ADN polimerasa de Taq, se ligó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), se introdujo por transformación en TOP 10 y se secuenció por ABI. Después de haber amplificado y confirmado la secuencia del fragmento de manosidasa truncado, el plásmido resultante, pCR2.1-\Delta65mMannlA, se digirió con AscI y PacI en tampón Nº 4 de New England Biolabs (Beverly, MA) durante 16 h a 37ºC. En paralelo, el pJN347 (Figura 2C) se digirió con las mismas enzimas y se incubó como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión, tanto la cadena principal de pJN347 (Figura 2C) como el dominio catalítico truncado se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit de Ligación Quick (New England Biolabs, Beverly, MA), como se recomienda por los fabricantes, y se introdujo por transformación en células DH5\alpha químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usó PCR de colonias para confirmar la generación de la construcción de manosidasa IA \Delta65 de ratón pJN347.

Al haber generado una biblioteca de dominios catalíticos de \alpha-1,2-manosidasa truncados en el vector de expresión de levadura pJN347 (Figura 2C), la etapa remanente para generar la biblioteca de péptido de dirección/dominio catalítico era clonar en fase las secuencias de péptido de dirección (Figura 2). Tanto las construcciones de manosidasa de pJN347 (Figura 2D) como las construcciones de péptido de dirección de pCR2.1-TOPO (Figura 2B) como tales se incubaron durante una noche a 37ºC en tampón Nº 4 de New England Biolabs en presencia de las enzimas de restricción NotI y AscI. Después de la digestión, tanto la cadena principal de manosidasa de pJN347 como las regiones de péptido de dirección se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit de Ligación Quick (New England Biolabs, Beverly, MA), como se recomienda por los fabricantes, y se introdujeron por transformación en células DH5\alpha químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Posteriormente, las construcciones de péptido de dirección/manosidasa de pJN347 se secuenciaron por ABI para confirmar que las fusiones generadas estaban en fase. El tamaño estimado de la biblioteca final de péptido de dirección/alfa-1,2-manosidasa contiene más de 1300 construcciones generadas por la estrategia que se ha descrito anteriormente. La Figura 2 ilustra la construcción de la genoteca de ADN combinatoria.

\vskip1.000000\baselineskip

Modificación de una cepa knock-out de OCH1 de P. pastoris con múltiples marcadores auxótrofos

La primera etapa en la construcción de plásmido implicó crear un conjunto de plásmidos universales que contienen regiones de ADN del gen KEX1 de P. pastoris (Boehm y col. Yeast 1999 May; 15(7): 563-72) como separadores para las regiones 5' y 3' de los genes a anular. Los plásmidos también contenían el Ura-blaster de S. cerevisiae (Alani y col. (1987) Genetics 116: 541-545) como un separador para los marcadores auxótrofos y un casete de expresión con un sitio de clonación múltiple para la inserción de un gen extraño. Un fragmento de 0,9 kb de la región KEXI-5' de P. pastoris se amplificó por PCR usando los cebadores GGCGAGCT
CGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCA GA (SEC ID Nº: 56) y GCCCACGTCGACG
GATCCGTTTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEC ID Nº: 57) y ADN genómico de P. pastoris como un molde y se clonó en los sitios SacI, SalI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA). El plásmido resultante se cortó con BamHI y SalI y un fragmento de 0,8 kb de la región KEX1-3' que se había amplificado usando los cebadores CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEC ID Nº: 58) y GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGG ATGACTCTTTTC (SEC ID Nº: 59) se clonó en los sitios abiertos creando pJN262. Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento de 3,8 kb de BamHI, BglII de pNKY51 (Alani y col. (1987) Genetics 116: 541-545) se insertó en las dos posibles orientaciones dando como resultado los plásmidos pJN263 (Figura 4A) y pJN284 (Figura 4B).

Se creó un casete de expresión con NotI y PacI como sitios de clonación. El promotor de GAPDH de P. pastoris se amplificó usando los cebadores CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT (SEC ID Nº: 60) y GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGAC AA (SEC ID Nº: 61) y el plásmido pGAPZ-A (Invitrogen) como molde y se clonó en los sitios BamHI, SphI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) (Figura 4B). El plásmido resultante se cortó con SpeI y SphI y la región de terminador de la transcripción ("TT") CYC1 que se había amplificado usando los cebadores CCTTGCTAGCTTAAT
TAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEC ID Nº: 62) y GGACATGCATGCGGATCCCT
TAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCC C (SEC ID Nº: 63) y el plásmido pPICZ-A (Invitrogen) como un molde se clonó en los sitios abiertos creando pJN261 (Figura 4B).

Se creó un plásmido knockout para el gen OCH1 de P. pastoris digiriendo pJN263 son SalI y SpeI y un fragmento de ADN de 2,9 kb de la región OCH1-5', que se había amplificado usando los cebadores GAACCACGTCGAC
GGCCATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATT CAAACACAAGGCATTGC (SEC ID Nº: 64) y CTCCAATAC
TAGTCGAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEC ID Nº: 65) y ADN genómico de P. pastoris como un molde se clonó en los sitios abiertos (Figura 4C). El plásmido resultante se cortó con EcoRI y Pmel y un fragmento de ADN de 1,0 kb de la región 3' de OCH que se había generado usando los cebadores TGGAAG
GTTTAAACAAAGCTAGAGTAAAATAGATATAGCGAG ATTAGAGAATG (SEC ID Nº: 66) y AAGAATTC
GGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATGTAGTTCCCGTT TTCATC (SEC ID Nº: 67) se insertó para generar pJN298 (Figura 4C). Para permitir la posibilidad de usar simultáneamente el plásmido para introducir un nuevo gen, el casete de expresión de BamHI de pJN261 (Figura 4B) se clonó en el único sitio BamHI de pJN298 (Figura 4C) para crear pJN299 (Figura 4E).

El casete de P. pastoris Ura3-blaster se construyó usando una estrategia similar a la descrita en Lu y col. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 141-146. Un fragmento de 2,0 kb de PstI, SpeI de URA3 de P. pastoris se insertó en los sitios PstI, XbaI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear pJN306 (Figura 4D). Después, un fragmento de ADN de 0,7 kb de SacI, PvuII de la fase de lectura abierta de lacZ se clonó en los sitios SacI, SmaI para producir pJN308 (Figura 4D). Después de la digestión de pJN308 (Figura 4D) con PstI y tratamiento con ADN polimerasa de T4, el fragmento SacI-PvuII de lacZ en el que se habían formado extremos romos con ADN polimerasa de T4 se insertó generando pJN315 (Figura 4D). El casete lacZ/URA3 se liberó por digestión con SacI y SphI, se crearon extremos romos con ADN polimerasa de T4 y se clonó en la cadena principal de pJN299 que se había digerido con PmeI y AflII y se crearon extremos romos con ADN polimerasa de T4. El plásmido resultante se denominó pJN329 (Figura 4E).

Un plásmido de expresión marcado con HIS4 se creó cortando pJN261 (Figura 4F) con EcoICRI (Figura 4F). Un fragmento de 2,7 kb del gen HIS4 de Pichia pastoris que se había amplificado usando los cebadores GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA AAAATACGG (SEC ID Nº: 68) y GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTA AAATCTCTAA (SEC ID Nº: 69) cortado con NgoMIV y SwaI y en los que después se habían formado extremos romos usando ADN polimerasa de T4, se ligó entonces en el sitio abierto. Este plásmido se denominó pJN337 (Figura 4F). Para construir un plásmido con un sitio de clonación múltiple adecuado para la construcción de biblioteca de fusión, pJN337 se cortó con NotI y PacI y los dos oligonucleótidos GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEC ID Nº: 70) y TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC (SEC ID Nº: 71) que se habían hibridado in vitro se ligaron en los sitios abiertos, creando pJN347 (Figura 4F).

Para crear una cepa knockout de och1 que contiene múltiples marcadores auxótrofos, 100 \mug de pJN329 se digirieron con SfiI y se usaron para transformar la cepa de P. pastoris JC308 (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169) por electroporación. Después de la transformación, las placas de retirada de URA se incubaron a temperatura ambiente durante 10 días. Mil (1000) colonias se seleccionaron y volvieron a sembrar en estrías. Los 1000 clones después se sembraron en estrías en 2 conjuntos de placas de retirada de URA. Un conjunto se incubó a temperatura ambiente, mientras que el segundo conjunto se incubó a 37ºC. Los clones que no eran capaces de desarrollarse a 37ºC, pero que se desarrollaron a temperatura ambiente, se sometieron a PCR de colonias para ensayar el knockout correcto de OCH1. Un clon que mostró la señal de PCR esperada (aproximadamente 4,5 kb) se denominó YJN153.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Caracterización de la Genoteca de ADN combinatoria

Los transformantes positivos explorados por PCR de colonias que confirman la integración de la construcción de manosidasa en el genoma de P. pastoris se cultivaron posteriormente a temperatura ambiente en medio complejo de metanol tamponado con BMGY 50 mol constituido por extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, tampón fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34%, 4 X 10^{-5}% de biotina y glicerol al 1% como un medio de cultivo) hasta DO_{600} nm 2-6, punto en el cual se lavaron con medio BMMY 10 mol (medio complejo de metanol tamponado constituido por extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, tampón fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34%, 4 X 10^{-5}% de biotina y metanol al 1,5% como un medio de cultivo) antes de la inducción de la proteína indicadora durante 24 horas a temperatura ambiente en 5 ml de BMMY. En consecuencia, la proteína indicadora se aisló y analizó como se describe en el Ejemplo 3 para caracterizar su estructura de glucano. Usando los péptidos de dirección en la Tabla 6, los dominios catalíticos de manosidasa localizados en el RE o el Golgi mostraron un nivel significativo de corte de un glucano que contiene predominantemente Man_{8}GlcNAc_{2} hasta un glucano que contiene predominantemente Man_{5}GlcNAc_{2}. Esto es evidente cuando la estructura de glucano de la glucoproteína indicadora se compara entre la del knockout de och1 de P. pastoris en las Figuras 5C y 6C y la misma cepa transformada con construcciones de manosidasa de M. musculus como se muestra en las Figuras 5D, 5E, 6D-6F. Las Figuras 5 y 6 muestran la expresión de construcciones generadas a partir de la genoteca de ADN combinatoria que muestran actividad de manosidasa significativa en P. pastoris. La expresión de pGC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) (Figuras 5D y 6E) produjo una proteína que tiene aproximadamente el 30% de todos los glucanos cortados hasta Man_{5}GlcNAc_{2}, mientras que la expresión de pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) (Figura 6F) produjo aproximadamente el 50% de Man_{5}GlcNAc_{2} y la expresión de pBC18-5 (VAN1 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans) (Figura 5E) produjo el 70% de Man_{5}GlcNAc_{2}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Corte in vivo por \alpha-1,2-manosidasa

Para garantizar que las cepas modificadas novedosas del Ejemplo 4 de hecho producían la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} deseada in vivo, los sobrenadantes celulares se ensayaron para actividad de manosidasa (véase las Figuras 7-9). Para cada construcción/cepa huésped descrita más adelante, se realizó HPLC a 30ºC con una columna de 4,0 mm x 250 mm de Altech (Avondale, PA, EE.UU.) de resina Econosil-NH_{2} (5 \mum) a un caudal de 1,0 ml/min durante 40 min. En las Figuras 7 y 8, la degradación del Man_{9}GlcNAc_{2} convencional [b] se demostró que tenía lugar dando como resultado un pico que se correlaciona con Man_{8}GlcNAc_{2}. En la Figura 7, el Man_{9}GlcNAc_{2} [b] convencional eluyó a 24,61 min y Man_{5}GlcNAc_{2} [a] eluyó a 18,59 min. En la Figura 8, Man_{9}GlcNAc_{2} eluyó a 21,37 min y Man_{5}GLcNAc_{2} a 15,67 min. En la Figura 9, el Man_{8}GLcNAc_{2} convencional [b] se demostró que eluía a 20,88 min.

Las células de P. pastoris que comprenden el plásmido pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) se cultivaron a 30ºC en BMGY hasta una DO_{600} de aproximadamente 10. Las células se recuperaron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente claro. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una única etapa de purificación usando cromatografía de CM-sepharose y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 al 95% pura que eluía entre NaCl 300-500 mM. El análisis de N-glucano de los glucanos obtenidos de K3 se muestra en la Figura 6F. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente para la presencia de actividad de manosidasa secretada. Un patrón disponible en el mercado de oligomanosa 9 de tipo ligado a N marcada con 2-aminobenzamida (Man9-2-AB) (Glyko, Novato, CA) se añadió a: BMMY (Figura 7A), el sobrenadante de la anterior alícuota (Figura 7B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei (obtenido de Contreras y col., documento WO 02/00856 A2) (Figura 7C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el alcance del corte de manosidasa.

Las células de P. pastoris que comprendían el plásmido pGC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) se cultivaron y ensayaron de forma similar. Las células se cultivaron a temperatura ambiente en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMYY para inducir la producción de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente claro. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una única etapa de purificación usando cromatografía de CM-sepharose y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 al 95% pura que eluía entre NaCl 300-500 mM. El análisis de N-glucano de los glucanos obtenidos de K3 se muestra en la Figura 5D. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente para la presencia de actividad de manosidasa secretada como se muestra en la Figura 8B. Un patrón disponible en el mercado de Man9-2-AB (Glyko, Novato, CA) se añadió a: BMMY (Figura 8A), el sobrenadante de la anterior alícuota (Figura 8B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei (obtenido de Contreras y col., documento WO 02/00856 A2) (Figura 8C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el alcance del corte de manosidasa.

Man9-2-AB se usó como sustrato y es evidente que después de 24 horas de incubación, la actividad de manosidasa prácticamente estaba ausente en el sobrenadante del producto de digestión de la cepa pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) (Figura 7B) y el producto de digestión de pGC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa 1B \Delta99 de ratón) (Figura 8B) mientras que el control positivo (\alpha-1,2-manosidasa purificada de T. reesei obtenida de Contreras) conduce a la conversión completa de Man_{9}GlcNAc_{2} a Man_{5}GlcNAc_{2} en las mismas condiciones, como se muestra en las Figuras 7C y 8C. Estos son datos concluyentes que muestran el corte de manosidasa in vivo en la cepa pGC5 de P. pastoris; y la cepa pFB8, que es claramente diferente de lo que se había descrito hasta la fecha (Contreras y col., documento WO 02/00856 A2).

La Figura 9 confirma adicionalmente la localización y la actividad de la enzima manosidasa. Se cultivó P. pastoris que comprende pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans) a temperatura ambiente en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recuperaron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente claro. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una única etapa de purificación usando cromatografía de CM-sepharose y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 al 95% pura que eluía entre NaCl 300-500 mM. El análisis de N-glucano de los glucanos obtenidos de K3 se muestra en la Figura 5E. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente para la presencia de actividad de manosidasa secretada como se muestra en la Figura 9B. Un patrón disponible en el mercado de ManB-2-AB (Glyko, Novato, CA) se añadió a: BMMY (Figura 9A), sobrenadante de la anterior alícuota de pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans (Figura 9B) y BMMY que contenía medio de una construcción de fusión diferente pDD28-3 (MNN10(m) de Saccharomyces (de SwissProt 50108)/manosidasa IB \Delta99 de H. sapiens) (Figura 9C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el alcance del corte de manosidasa. La Figura 9B demuestra la actividad de manosidasa intracelular en comparación con una construcción de fusión pDD28-3 (MNN10(m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de H. sapiens) que muestra un resultado negativo (Figura 9C).

Ejemplo 7

Ensayo de Óptimo de pH de \alpha-1,2-manosidasa modificada

Se cultivaron células de P. pastoris que comprendían el plásmido pBB27-2 (MNN10(s) de Saccharomyces (de SwissProt 50108)/manosidasa IB \Delta31 de C. elegans) a temperatura ambiente en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 17. Aproximadamente 80 \mul de estas células se inocularon en 600 \mul de BMGY y se cultivaron durante una noche. Posteriormente, las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente claro (pH 6,43). El sobrenadante se retiró para ensayos de óptimo de pH de manosidasa. Se añadió Man_{8}GlcNAc_{2} marcado con fluorescencia (0,5 \mug) a 20 \mul de sobrenadante ajustado a diversos pH (Figura 11) y se incubó durante 8 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, la muestra se analizó por HPLC usando una columna de sílice unida a amino, de perlas de 5 micrómetros, Econosil NH2 4,6 X 250 mm (Altech, Avondale, PA). El caudal fue 1,0 ml/min durante 40 min y la columna se mantuvo a 30ºC. Después de eluir de forma isocrática (68% A:32% B) durante 3 min, se empleó un gradiente de disolvente lineal (68% A:32% B a 40% A:60% B) a lo largo de 27 min para eluir los glucanos (18). Disolvente A (acetonitrilo) y el disolvente B (formato de amonio, 50 mM, pH 4,5). La columna se equilibró con disolvente (68% A:32% B) durante 20 min entre ciclos.

Ejemplo 8

Modificación de P. pastoris para Producir N-glucanos con la Estructura GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}

Se requiere actividad de GlcNAc Transferasa I para la maduración de N-glucanos complejos e híbridos (Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251). Man_{5}GlcNAc_{2} se puede cortar solamente por manosidasa II, una etapa necesaria en la formación de glucoformas humanas, después de la adición de N-acetilglucosamina al resto de \alpha-1,3-manosa terminal del tallo de trimanosa por GlcNAc Transferasa I (Schachter, 1991 Glycobiology 1(5): 453-461). Por consiguiente, se preparó una genoteca de ADN combinatoria que incluía fragmentos de ADN que codificaban dominios catalíticos dirigidos de forma adecuada de genes de GlcNAc Transferasa I de C. elegans y Homo sapiens; y secuencias de localización de GLS, MNS, SEC, MNN9, VAN1, ANP1, HOC1, MNN10, MNN11, MNT1, KTR1, KTR2, MNN2, MNN5, YUR1, MNN1 y MNN6 de supuestas \alpha-1,2-manosiltransferasas de S. cerevisiae y P. pastoris basándose en la homología de S. cerevisiae: D2, D9 y J3, que son homólogos de KTR. La Tabla 10 incluye, pero no limita, secuencias de péptido de dirección tales como SEC y OCH1, de GnTI de P. pastoris y K. lactis (Véase la Tabla 6 y la Tabla 10).

TABLA 10 Una biblioteca combinatoria representativa de secuencias de péptido de dirección/dominio catalítico para UDP-N-Acetilglucosaminil Transferasa I (GnTI)

17

Las secuencias de péptido de dirección se seleccionaron de OCH1 en P. pastoris (largo, medio y corto) (véase Ejemplo 4) y MNN9 (SwissProt P39107) en S. cerevisiae (corto y medio). Se seleccionaron dominios catalíticos de GnTI humana con una deleción N-terminal de 38 y 86 aminoácidos, GnTI de C. elegans (gly-12) con una deleción de 35 y 63 aminoácidos así como GnTI de C. elegans (gly-14) con una deleción N-terminal de 88 aminoácidos y GnTI de X. laevis con una deleción N-terminal de 33 y 103 aminoácidos, respectivamente.

Una porción del gen que codifica N-acetilglucosaminil Transferasa I humana (MGATI, Nº de Acceso NM002406), que carece de los primeros 154 pb, se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos 5'-TGGCAGGCGCGCCT
CAGTCAGCGCTCTCG-3' (SEC ID Nº: 72) y 5'-AGGTTAATTA AGTGCTAATTCCAGCTAGG-3' (SEC ID Nº: 73) y el vector pHG4.5 (ATCC# 79003) como molde. El producto de PCR resultante se clonó en pCR2.1-TOPO y se confirmó la secuencia correcta. Después de la digestión con AscI y PacI, la GnTI truncada se insertó en el plásmido pJN346 para crear pNA. Después de la digestión de pJN271 con NotI y Asc, el inserto de 120 pb se ligó en pNa para generar una fusión en fase del dominio transmembrana de MNN9 con la GnTI, creando pNA1 5.

El organismo huésped es una cepa de P. pastoris que es deficiente en hipermanosilación (por ejemplo, un mutante de och1), proporciona el sustrato UDP-GlcNAc en el Golgi y/o RE (es decir, contiene un transportador funcional de UDP-GlcNAc) y proporciona N-glucanos de la estructura Man_{5}GlcNAC_{2} en el Golgi y/o RE (por ejemplo, pFB8 de P. pastoris (SEC12(m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) de antes). En primer lugar, pFB8 de P. pastoris se transformó con pPB103 que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN AF106080) (que codifica el transportador de UDP-GlcNAc) clonado en el sitio BamHI y BglII del plásmido pBLADE-SX (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169). Después, la genoteca de ADN combinatoria que se ha mencionado anteriormente que codifica una combinación de genes de GnTI/localización exógenos o endógenos se transformó y las colonias se seleccionaron y analizaron para la presencia de la construcción de GnTI por PCR de colonias. La eficacia de transformación e integración estaba generalmente por encima del 80% y la exploración de PCR se puede omitir una vez que se han establecido parámetros de transformación robustos.

\vskip1.000000\baselineskip

Purificación de Proteína

Se purificó K3 del medio por cromatografía de afinidad de Ni utilizando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind. Se puede realizar otro procedimiento de exploración usando un anticuerpo de unión de GlcNAc terminal específico o una lectina tal como la lectinas GSII de Griffonia simplificolia, que se une a la GlcNAc (EY Laboratories, San Mateo, CA). Estas exploraciones se pueden automatizar usando lectinas o anticuerpos que se han modificado con marcadores fluorescentes tales como FITC o analizar por MALDI-TOF.

La K3 secretada se puede purificar por cromatografía de afinidad de Ni, cuantificar y cantidades iguales de proteína se pueden unir a una placa de 96 pocillos de alta unión a proteína. Después del bloqueo con BSA, las placas se pueden sondar con una lectina GSII-FACS y explorar para una respuesta fluorescente máxima. Un procedimiento preferido para detectar las anteriores proteínas glucosiladas implica la exploración por espectrometría de masas MALDI-TOF después de la purificación por afinidad de K3 secretada del sobrenadante de transformantes cultivados en 96 pocillos. Las colonias transformadas se seleccionaron y desarrollaron hasta una DO600 de 10 en una placa de 2 ml, 96 pocillos en BMGY a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron en BMMY y se resuspendieron en 250 \mul de BMMY. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación, el sobrenadante se recuperó y K3 se purificó del sobrenadante por cromatografía de afinidad de Ni. Los N-glucanos se liberaron y analizaron por espectrometría de masas de extracción retrasada MALDI-TOF como se describe en este documento.

En resumen, los procedimientos de la invención produjeron cepas de P. pastoris que producen GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} con alto rendimiento, como se muestra en la Figura 10B. Al menos el 60% de los N-glucanos son GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Hasta la fecha, no existen informes que describen la formación de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en glucoproteínas solubles secretadas en ninguna levadura. Los resultados presentados en este documento muestran que la adición del transportador de UDP-GlcNAc junto con la actividad de GnTI produce una estructura predominante de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, que se confirma por el pico en 1457 (m/z) (Figura 10B).

\vskip1.000000\baselineskip

Construcción de la cepa PBP-3

La cepa de P. pastoris que expresa K3, (\Deltaochl, arg-, ade-, his-) se transformó sucesivamente con los siguientes vectores. En primer lugar, pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta1887 de ratón) se introdujo por transformación en la cepa de P. pastoris por electroporación. En segundo lugar, pPB103 que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN AF106080) (que codifica el transportador de UDP-GlcNAc) clonado en el plásmido pBLADE-SX (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169) digerido con las enzimas BanaHI y BglII se introdujo por transformación en la cepa de P. pastoris. En tercer lugar, pPB104 que contenía el gen que codifica MNN9(s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humana clonado como fragmento de NotI-PacI en pJN336 se introdujo por transformación en la cepa de P. pastoris.

\newpage

Ejemplo 9

Modificación de Células de K. lactis para Producir N-glucanos con la Estructura Man_{5}GlcNAc_{2} Identificación y Alteración del gen OCH1 de K. lactis

El gen OCH1 de la levadura de gemación S. cerevisiae codifica una 1,6-manosiltransferasa que es responsable de la primera adición de manosa localizada en Golgi a la estructura de N-glucano Man_{8}GlcNAc_{2} en proteínas secretadas (Nakanishi-Shindo y col. (1993) J. Biol. Chem.; 268(35): 26338-45). Esta transferencia de manosa se reconoce generalmente como la etapa inicial clave en la polimanosilación específica de hongos de estructuras de N-glucano (Nakanishi-Shindo y col. (1993) J. Biol. Chem. 268 (35): 26338-26345; Nakayama y col. (1992) EMBO J. 11 (7):2511-19; Morin-Ganet y col. (2000) Traffic 1 (1): 56-68). La deleción de este gen en S. cerevisiae da como resultado una estructura de N-glucano significativamente más corta que no incluye esta polimanosilación típica o un defecto de crecimiento a temperaturas elevadas (Nakayama y col. (1992) EMBO J. 11 (7): 2511-19).

La secuencia de Och1p de S. cerevisiae se alineó con homólogos conocidos de Candida albicans (Nº de acceso de Genbank AAL49987) y P. pastoris junto con las proteínas Hoc1 de S. cerevisiae (Neiman y col (1997) Genetics 145(3): 637-45) y K. lactis (base de datos PENDANT EST) que son manosiltransferasas relacionadas pero distintas. Las regiones de alta homología que eran comunes entre homólogos de Och1p pero distintos de los homólogos de Hoc1p se usaron para diseñar pares de cebadores degenerados que se dirigieron contra ADN genómico de la cepa de K. lactis MG1/2 (Bianchi y col (1987) Current Genetics 12: 185-192). La amplificación por PCR con cebadores RCD33 (CCAGAAGAATTCAATTYTGYCARTGG) (SEC ID Nº: 74) y RCD34 (CAGTGAAAATACCTGGNCCNGTCCA) (SEC ID Nº: 75) dio como resultado un producto de 302 pb que se clonó y secuenció y se demostró que la traducción predicha tenía un alto grado de homología con la proteínas de Och1 (>55% con Och1p de S. cerivisiae).

El producto de PCR de 302 pb se usó para sondar una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa de K. lactis (MG1/2) con alta rigurosidad (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se observó hibridación en un patrón coherente con un único gen que indica que este segmento de 302 pb se corresponde a una porción del genoma de K. lactis y que K. lactis (KIOCH1) contiene una única copia del gen. Para clonar todo el gen KIOCH1, la transferencia de Southern se usó para mapear el locus genómico. Por consiguiente, un fragmento de 5,2 kb de BamHI/PstI se clonó digiriendo ADN genómico y ligando esos fragmentos en el intervalo de 5,2 kb en pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear una biblioteca subgenómica de K. lactis. Esta biblioteca subgenómica se introdujo por transformación en E. coli y se ensayaron varios cientos de clones por PCR de colonias usando RCD 33/34. El clon de 5,2 kb que contenía el gen predicho de KIOCH1 se secuenció y una fase de lectura abierta de 1362 pb que codificaba una proteína predicha, es decir, idéntica en el 46,5% con el gen OCH1 de S. cerevisiae. La secuencia de 5,2 kb se usó para preparar cebadores para la construcción de un alelo de deleción och1::KAN^{R} usando un procedimiento de solapamiento de PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt8): 2607-15). Este alelo de deleción se introdujo por transformación en dos cepas de K. lactis y se seleccionaron las colonias resistentes a G418. Estas colonias se exploraron tanto por PCR como por sensibilidad a temperatura para obtener una cepa a la que se había delecionado la ORF de OCH1. Los resultados del experimento muestran cepas que ponen de manifiesto un patrón de PCR mutante, que se caracterizaron por análisis de desarrollo a diversas temperaturas y análisis de hidratos de carbono de N-glucano de proteínas secretadas y de pared celular después de la digestión con PNGasa. La mutación de och1 otorgó una sensibilidad a temperatura que permitió que las cepas se desarrollaran a 30ºC pero no a 35ºC. La Figura 12A muestra un análisis de MALDI-TOF de una cepa de K. lactis de tipo silvestre que produce N-glucanos de Man_{8}GlcNAc_{2} [c] y más.

Identificación, Clonación y Alteración del gen MNN1 de K. lactis

El MNN1 de S. cerevisiae es el gen estructural de la \alpha-1,3-manosiltransferasa de Golgi. El producto de MNN1 es una proteína de membrana de tipo II de 762 aminoácidos (Yip y col. (1994) Proc Natl Acad Sci USA. 91 (7): 2723-7). Tanto los oligosacáridos ligados a N como los ligados a O aislados de mutantes de mnn1 carecen de enlaces \alpha-1,3-manosa (Raschke y col. (1973) J Biol Chem. 248(13):4660-66).

La secuencia de Mnn1p de S. cerevisiae se usó para buscar las secuencias genómicas traducidas de K. lactis (PEDANT). Se identificó una secuencia de ADN de 405 pb que codifica un supuesto fragmento de proteína de similitud significativa con Mnn1p. Un segmento interno de esta secuencia se amplificó posteriormente por PCR con los cebadores KMN1 (TGCCATCTTT-TAGGTCCAGGCCCGTTC) (SEC ID Nº: 76) y KMN2 (GATCCCACGACG
CATCGTATTTCTTTC), (SEC ID Nº: 77) y se usó para sondar una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa de K. lactis (MG1/2). Basándose en los datos de hibridación de Southern se clonó un fragmento de 4,2 kb de BamHI-PstI generando una biblioteca seleccionada por tamaño como se describe en este documento. Un único clon que contenía el gen MNN1 de K. lactis se identificó por PCR de colonias completas usando los cebadores KMN1 y KMN2 y se secuenció. Dentro de este clon se identificó una ORF de 2241 pb que codificaba una proteína predicha que era idéntica en el 34% con el gen MNN1 de S. cerevisiae. Los cebadores se diseñaron para la construcción de un alelo de deleción de mnn1::NAT^{R} usando el procedimiento de solapamiento de PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15).

Este alelo de alteración se introdujo por transformación en una cepa de K. lactis por electroporación y se seleccionaron transformantes resistentes a nourseotricina y se amplificaron por PCR para inserción homóloga del alelo de alteración. Las cepas que ponen de manifiesto un patrón de PCR mutante se pueden someter a análisis de hidratos de carbono de N-glucano de un gen indicador conocido.

La Figura 12B ilustra los N-glucanos de la cepa de deleción de ochl1 mm1 de K. lactis observada después de la digestión con PNGasa por MALDI-TOF como se describe en este documento. El pico predominante en 1908 (m/z) indicó que [d] es coherente con la masa de Man_{9}GlcNAc_{2}.

Se describen procedimientos y reactivos adicionales que se pueden usar en los procedimientos para modificar la glucosilación en la bibliografía, tal como la Patente de Estados Unidos Nº 5.955,422, Patente de Estados Unidos Nº 4.775.622, Patente de Estados Unidos Nº 6.017.743, Patente de Estados Unidos Nº 4.925.796, Patente de Estados Unidos Nº 5.766.910, Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251, Patente de Estados Unidos Nº 5.910.570, Patente de Estados Unidos Nº 5.849.904, Patente de Estados Unidos Nº 5.955.347, Patente de Estados Unidos Nº 5.962.294, Patente de Estados Unidos Nº 5.135.854, Patente de Estados Unidos Nº 4.935.349, Patente de Estados Unidos Nº 5.707.828 y Patente de Estados Unidos Nº 5.047.335. Se pueden obtener sistemas de expresión en levadura apropiados de fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD. Los vectores están disponibles en el mercado en una diversidad de fuentes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Identificación, clonación y deleción del gen ALG3 en P. pastoris y K. lactis

Se generaron cebadores degenerados basándose en un alineamiento de secuencias de proteínas Alg3 de S. cerevisiae, H. sapiens y D. melanogaster y se usaron para amplificar un producto de 83 pb del ADN genómico de P. pastoris: 5'-GGTGTTTTGTTTTCTAGATCTTTGCAYTAYCARTT-3' (SEC ID Nº: 78) y 5'-AGAATTTGGTGGG
TAAGAATTCCARCACCAYTCRTG-3' (SEC ID Nº: 79). El producto de PCR resultante se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el análisis de secuencia puso de manifiesto homología con homólogos conocidos de ALG3/RHK1/NOT56 (Genbank NC_001134.2, AF309689, NC_003424.1). Posteriormente, 1929 pb cadena arriba y 2738 pb cadena abajo del producto de PCR inicial se amplificaron de una genoteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm (1999) Yeast 15 (7): 563-72) usando los oligonucleótidos internos 5'-CCTAAGCTGG
TATGCGTTCTCTTTGCCATATC-3' (SEC ID Nº: 80) y 5'-GCGG CATAAACAATAATAGATG CTATAAAG-3' (SEC ID Nº: 81) junto con T3 (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') (SEC ID Nº: 49) y T7 (5'-GTAATACGACT
CACTATAGGGC-3') (SEC ID Nº: 48) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) en la cadena principal del plásmido lambda ZAP II que lleva la biblioteca (Stratagene, La Jolla, CA). Los fragmentos resultantes se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron. A partir de esta secuencia se identificó una ORF de 1395 pb que codifica una proteína con una identidad del 35% y una similitud del 53% con el gen ALG3 de S. cerevisiae (usando programas BLAST). El gen se denominó PpALG3.

La secuencia de PpALG3 se usó para crear un conjunto de cebadores para generar una construcción de deleción del gen PpALG3 por solapamiento de PCR (Davidson y col (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15). Los siguientes cebadores se usaron para amplificar regiones de 1 kb 5' y 3' de la ORF de PpALG3 y el gen KAN^{R}, respectivamente:

1000

Posteriormente, los cebadores RCD 142 y RCD 147 se usaron para solapar los tres productos de PCR resultantes en un único alelo de deleción de 3,6 kb alg3::KAN^{R}.

Identificación, clonación y deleción del gen ALG3 en K. lactis

Las secuencias de ALG3p de S. cerevisiae, Drosophila melanogaster, Homo sapiens etc., se alinearon con secuencias de K. lactis (base de datos PENDANT EST). Las regiones de alta homología que eran homólogos en común pero distintos en la secuencia exacta de los homólogos se usaron para crear pares de cebadores degenerados que se dirigieron contra ADN genómico de la cepa de K. lactis MG1/2 (Bianchi y col., 1987). En el caso de ALG3, la amplificación por PCR con los cebadores KAL-1 (5'-ATCCTTTACCGATGCTGTAT-3') (SEC ID Nº: 88) y KAL-2 (5'-ATAACAG
TATGTGTTACACGCGTGTAG-3') (SEC ID Nº: 89) dio como resultado un producto que se clonó y secuenció y se demostró que la traducción predicha tenía un alto grado de homología con proteínas de Alg3p (>50% con Alg3p de S. cerevisiae).

El producto de PCR se usó para sondar una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa de K. lactis (MG1/2) con alta rigurosidad (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se observó hibridación en un patrón coherente con un único gen. Esta transferencia de Southern se usó para mapear los loci genómicos. Los fragmentos genómicos se clonaron digiriendo ADN genómico y ligando esos fragmentos en el intervalo de tamaño apropiado en pUC19 para crear una biblioteca subgenómica de K. lactis. Esta biblioteca subgenómica se introdujo por transformación en E. coli y se ensayaron varios cientos de clones por PCR de colonias, usando los cebadores KAL-1 y KAL-2. Los clones que contenían los genes predichos KIALG3 y KIALG61 se secuenciaron y se identificaron las fases de lectura abiertas.

Los cebadores para la construcción de un alelo de deleción alg3::NAT^{R}, usando un procedimiento de solapamiento de PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt8): 2607-15), se diseñaron y el alelo de deleción resultante se introdujo por transformación en dos cepas de K. lactis y se seleccionaron las colonias resistentes a NAT. Estas colonias se exploraron por PCR y se obtuvieron transformantes en los que la ORF de ALG3 se sustituyó con el alelo mutante och1::NAT^{R}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Generación de una cepa mutante de alg3 och1 que expresa una \alpha-1,2-manosidasa, GnT1 y GnTII para la producción de una glucoproteína de tipo humano

Se generó una construcción de deleción de alg3::KAN^{R} de P. pastoris como se ha descrito en el Ejemplo 10. Aproximadamente 5 \mug del producto de PCR resultante se introdujeron por transformación en la cepa PBP-3 (véase el Ejemplo 3) y se seleccionaron colonias en medio YPD que contenía 200 \mug/ml de G418. Se confirmó que una cepa de 20 exploradas por PCR contenía la integración correcta del alelo mutante de alg3::KAN^{R} y que carecía del alelo de tipo silvestre. Esta cepa se denominó RDP27 (Figura 36).

Después se generó una biblioteca de construcciones de GnTII, que comprendía fusiones en fase de la biblioteca líder con los dominios catalíticos de los genes de GnTII de fuentes humanas y de rata (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de P. pastoris que contenía el gen de NSP^{R} que otorga resistencia al fármaco nourseotricina. Los plásmidos de biblioteca se linealizaron con EcoRI, se introdujeron por transformación en la cepa RDP27 por electroporación y las cepas resultantes se exploraron por análisis de los glucanos liberados de K3 purificada. Una cepa de P. pastoris que expresa la GnTII de rata fusionada en fase con la construcción MNN9 (s) de S. cerevisiae se denominó PBP6-5 (Figura 36).

Generación de construcciones de expresión de GnTII

La construcción de un vector de expresión de GnTI (pNA15) que contenía un gen de GnTI humana fusionado con la parte N-terminal del gen MNN9 de S. cerevisiae se describe en Choi y col. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(9): 5022-27). De un modo similar se clonó el gen de GnTII de rata. El gen de GnTII de rata (número de acceso de GenBank U21662) se amplificó por PCR usando la polimerasa Takara EX Taq^{TM} (Panvera) de genoteca de ADNc de hígado de rata (Clontech) con los cebadores RAT1 (5'-TTCCTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3') (SEC ID Nº: 90) y RAT2 (5'-TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3') (SEC ID Nº: 91). El producto de PCR después se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Usando este vector como un molde, el fragmento AscI-PacI de GnTII, que codifica los aminoácidos 88-443, se amplificó con polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) y los
cebadores,

1010

respectivamente, los sitios de restricción de AscI y PacI introducidos están subrayados). Después de la confirmación por secuenciación, el dominio catalítico de GnTII de rata se clonó cadena abajo del promotor PMA1 como un fragmento de AscI-PacI en pBP124. En la etapa final, el fragmento génico que codifica la señal de localización de Mnn2 de S. cerevisiae se clonó de pJN281 como fragmento de NotI-AscI para generar una fusión en fase con el dominio catalítico de GnTII, para generar el plásmido pTC53.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Clonación y Expresión De GnTIII Para Producir GlcNAc de Bisección que Refuerzan la Funcionalidad de Anticuerpo

La adición de una N-acetilglucosamina a la estructura de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} por N-acetilglucosaminiltransferasas III produce un denominado N-glucano bisecado (véase la Figura 15). Esta estructura se ha implicado en una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80).

Una célula huésped tal como una cepa de levadura capaz de producir glucoproteínas con N-glucanos bisecados se modifica de acuerdo con la invención introduciendo en la célula huésped una actividad de GnTIII. Preferiblemente, la célula huésped se transforma con un ácido nucleico que codifica GnTIII (por ejemplo, una de mamífero tal como la GnTIII murina mostrada en la Figura 24) o un dominio del mismo que tiene actividad enzimática, fusionado opcionalmente con un péptido de dirección señal celular heterólogo (por ejemplo, usando las bibliotecas y procedimientos asociados de la invención).

Las IgG están constituidas por dos cadenas pesadas (V_{H}, C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3 en la Figura 22), interconectadas en la región bisagra mediante tres puentes disulfuro, y dos cadenas ligeras (V_{L}, C_{L} en la Figura 22). Las cadenas ligeras (dominios V_{L} y C_{L}) están unidas por otro puente disulfuro con la porción C_{H}1 de la cadena pesada y junto con el fragmento C_{H}1 y V_{H} establecen la denominada región Fab. Los antígenos se unen a la porción terminal de la región Fab. La región Fc de IgG está constituida por la región C_{H}3, la C_{H}2 y la bisagra y es responsable de ejercer las denominadas funciones efectoras (véase más adelante).

La función principal de anticuerpos es la unión a un antígeno. Sin embargo, a menos que la unión a antígeno inactive directamente el antígeno (tal como en el caso de toxinas bacterianas), la mera unión es insignificativa a menos que se desencadenan las denominadas funciones efectoras. Los anticuerpos de la subclase IgG ejercen dos funciones efectoras principales: la activación del sistema de complemento y la inducción de fagocitosis. El sistema de complemento está constituido por un grupo complejo de proteínas séricas implicadas en el control de acontecimientos inflamatorios, en la activación de fagocitos y en la destrucción lítica de membranas celulares. La activación del complemento comienza con la unión del complejo C1 a la porción Fc de dos IgG en estrecha proximidad. El C1 está constituido por una molécula, C1q y dos moléculas C1e y C1s. La fagocitosis se inicia mediante una interacción entre el fragmento Fc de IgG y los receptores Fc-gamma (Fc\gammaRI, II y III en la Figura 22). Los receptores Fc se expresan principalmente sobre la superficie de células efectoras del sistema inmune, en particular, macrófagos, monocitos, células mieloides y células dendríticas.

La porción C_{H}2 aloja un sitio de N-glucosilación conservado en asparagina 297 (Asn297). Los N-glucanos de Asn297 son altamente heterogéneos y se conoce que afectan a la unión de receptor Fc y la activación del complemento. Solamente una minoría (es decir, aproximadamente el 15-20%) de las IgG llevan un N-glucano disialilado y el 3-10% tienen uno monosialilado (revisado en Jefferis (2001) Biopharm. 14:19-26). De forma interesante, la estructura mínima de N-glucano que se muestra que es necesaria para anticuerpos completamente funcionales capaces de activación de complemento y unión de receptor Fc es un pentasacárido con restos de N-acetilglucosamina terminales (GlcNAc_{2}Man_{3}) (revisado en Jefferis, R., Glycosylation of human IgG Antibodies. BioPharm, 2001). Los anticuerpos con menos de un N-glucano GlcNAc_{2}Man_{3} o sin N-glucosilación en Asn297 todavía pueden ser capaces de unirse a un antígeno pero, muy probablemente, no activarán los acontecimientos cruciales aguas abajo tales como fagocitos y activación de complemento. Además, los anticuerpos con N-glucanos de tipo fúngico unidos a Asn297, con toda probabilidad, provocarán una respuesta inmune en un organismo mamífero que convertirá ese anticuerpo en inútil como una glucoproteína terapéutica.

\vskip1.000000\baselineskip

Clonación Y Expresión De GnTIII

El fragmento de ADN que codifica parte de la proteína GnTIII de ratón que carece del dominio TM se amplifica por PCR a partir de ADN genómico murino (u otro mamífero) usando los cebadores

1020

Esos cebadores incluyen sitios de restricción AscI y PacI que se pueden usar para clonar en el vector adecuado para la fusión con la biblioteca líder.

Las secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº: 45) y de aminoácidos (SEC ID Nº: 46) de GnTIII murina se muestran en la Figura 24.

Clonación de Secuencias que Codifican Inmunoglobulina

Se han publicado protocolos para la clonación de las regiones variables de anticuerpos, incluyendo secuencias de cebador, previamente. Las fuentes de anticuerpos y genes codificantes pueden ser, entre otras, células B humanas inmunizadas in vitro (véase, por ejemplo, Borreback y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3995-3999), linfocitos de sangre periférica o células B humanas únicas (véase, por ejemplo, Lagerkvist y col. (1995) Biotechniques 18: 862-869; y Temess y col. (1997) Hum. Immunol. 56: 17-27) y ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana, que permiten la creación de líneas celulares de hibridoma.

Usando técnicas de ADN recombinante convencionales, se pueden clonar secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpo. Las fuentes de información genética que codifican inmunoglobulinas de interés son típicamente preparaciones de ARN total de células de interés, tales como linfocitos sanguíneos o líneas celulares de hibridoma. Por ejemplo, empleando un protocolo basado en PCR con cebadores específicos, se pueden clonar regiones variables mediante transcripción inversa iniciada a partir de un cebador específico de secuencia que hibrida con el sitio del dominio C_{H}1 de IgG y un segundo cebador que codifica los aminoácidos 111-118 de la región constante kappa murina. Después, los ADNc que codifican V_{H} y V_{K} se pueden amplificar como se ha publicado previamente (véase, por ejemplo, Graziano y col. (1995) J Immunol. 155(10): 4996-5002; Welschof y col. (1995) J. Immunol. Methods 179: 203-214; y Orlandi y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833). También se han publicado procedimientos de clonación para inmunoglobulinas completas (cadenas pesada y ligera) (véase, por ejemplo, Buckel y col. (1987) Gene 51: 13-19; Recinos y col. (1994) Gene 149: 385-386; Recinos y col. (1995) Gene 158: 311-12). Se han descrito protocolos adicionales para la clonación y generación de fragmentos de anticuerpo y construcciones de expresión de anticuerpo en Antibody Engineering, Kontermann y Dübel (2001), Eds., Springer Verlag: Berlin Heidelberg New York.

Se han descrito plásmidos de expresión fúngicos que codifican la cadena pesada y ligera de inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Abdel-Salam y col. (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 157-164; y Ogunjimi y col. (1999) Biotechnology Letters 21: 561-567). Por tanto, se pueden generar plásmidos de expresión que alojan las regiones constantes de inmunoglobulinas. Para facilitar la clonación de regiones variables en estos vectores de expresión, se pueden poner sitios de restricción adecuados en estrecha proximidad con los extremos de las regiones variables. Las regiones constantes se pueden construir de tal manera que las regiones variables se puedan fusionar de forma sencilla en fase con las mismas por un simple experimento de digestión por restricción/ligación. La Figura 23 muestra una revisión esquemática de tal construcción de expresión, diseñada de un modo muy modular, que permite el intercambio sencillo de promotores, terminadores de la transcripción, dominios de dirección de integración e incluso marcadores de selección.

Como se muestra en la Figura 23, los dominios V_{L} así como V_{H} de elección se pueden clonar de forma sencilla en fase con las regiones C_{L} y C_{H}, respectivamente. La integración inicial se dirige al locus de AOX de P. pastoris (o un locus homólogo en otra célula fúngica) y el promotor AOX inducible por metanol dirigirá la expresión. Alternativamente se puede usar cualquier otro casete de promotor constitutivo o inducible deseado. Por tanto, si se desea, las regiones AOX 5' y AOX 3' así como los fragmentos de terminador de la transcripción (TT) se pueden sustituir de forma sencilla con diferentes dominios de TT, promotor y de dirección de integración para optimizar la expresión. Inicialmente, la señal de secreción de factor alfa con el sitio de proteasa KEX convencional se emplea para facilitar la secreción de cadenas pesadas y ligeras. Las propiedades del vector de expresión se pueden refinar adicionalmente usando técnicas convencionales.

Un vector de expresión de Ig tal como el que se ha descrito anteriormente se introduce en una célula huésped de la invención que expresa GnTIII, preferiblemente en el aparato de Golgi de la célula huésped. Las moléculas de Ig expresadas en tal célula huésped comprenden N-glucanos que tienen GlcNAc de bisección.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Generación de la Cepa de Levadura YSH-1 (\Deltaoch1, \alpha1,2-manosidasa, GnTI)

La cepa de P. pastoris que se ha descrito anteriormente BK64 (Choi y col. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(9): 5022-7), un triple auxótrofo (ADE, ARG, HIS) que posee el knock-out de OCH1 y que expresa el domino kringle 3 (K3) de plasminógeno humano se usó como la cepa huésped. BK64 se transformó con el plásmido pPB103 linealizado con la enzima de restricción EcoNI para introducir el transportador de UDP-N-acetilglucosamina de K. lactis en la célula huésped, creando de este modo la cepa PBP-1. El Mnsl de ratón se introdujo en esta cepa por transformación con el plásmido pFB8 linealizado con la enzima de restricción EcoNI, generando la cepa PBP-2. El análisis de glucano de K3 de proteínas aisladas de la cepa PBP-2 demostró que la glucoforma principal presente era Man_{5}GlcNAc_{2}.

Posteriormente se transformó PBP-2 con el plásmido de GnTI humana pNA15 linealizado con la enzima de restricción AatlI, generando la cepa PBP-3. El análisis de las glucoformas de K3 producidas en la cepa PBP-3 demostró que el glucano híbrido GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} era la estructura predominante. Para recuperar el marcador URA3 de PBP-3, esta cepa se cultivó en YPD antes de la selección en medio mínimo que contenía 5-Fluroorótico (5-FOA, BioVectra) y uracilo (Boeke y col. (1984) Mol. Gen. Genet. 197: 345-346). La cepa Ura-menos recuperada que producía las glucoformas GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} se denominó YSH-1 (Figura 36). El perfil de N-glucano de la cepa YSH-1 se muestra en la Figura 25 (parte superior) y presenta un pico predominante en 1465 m/z que se corresponde a la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d].

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Generación de la Cepa de Levadura YSH-37 (P. pastoris que expresa manosidasa II)

YSH-1 (Ejemplo 13) se transformó con el plásmido de manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNN2(s) de S. cerevisiae (pKD53) linealizado con la enzima de restricción ApaI, generando la cepa YSH-37 (Figura 36). El análisis de las estructuras de glucano K3 producidas en la cepa YSH-37 (Figura 25 (parte inferior)) demostró que la glucoforma predominante en 1140 m/z se corresponde a la masa de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] y otras glucoformas GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] en 1303 m/z y GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] en 1465 m/z.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15

Generación de la Cepa de Levadura YSH-44

La cepa YSH-37 (Ejemplo 14) se transformó con un plásmido que codifica un líder de GnTII de rata/MNN2 (s), pTC53, linealizado con la enzima de restricción EcoRI. La cepa resultante, YSH-44 (Figura 36), produjo un N-glucano de K3 que tiene una única glucoforma en 1356 m/z, que se corresponde a la masa de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [x], por espectrometría de masas MALDI-TOF en modo positivo (Figura 29).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16

Construcción del Plásmido pJN 348

El plásmido pBLURA-SX (de Jim Cregg) se digirió con BamHI y BglII para liberar el casete de expresión AOX. El fragmento de BamHI que contiene el casete de expresión de GAPDH/CYC1 de pJN261 (Figura 4B) (Ejemplo 4) después se ligó en la cadena principal de pBLURA-SX para crear pJN338. El plásmido pJN338 se cortó con NotI y PacI y los dos oligonucleótidos

1030

que se habían hibridado in vitro se ligaron en los sitios abiertos, para crear pJN348.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17

Construcción de un Plásmido de Integración pRCD259

El PpURA3 que contiene el vector de expresión de GAPDH pJN348 se linealizó con XhoI y se crearon extremos romos con ADN polimerasa de T4 y se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP). El marcador de resistencia HYG se digirió de pAG32 con BglII y SacI y se formaron extremos romos, después se ligó en pJN348 para crear pRCD259 que se pude usar como un vector de expresión de HYG que se integra en el locus de PpURA3.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18

Generación de Construcciones de Fusión de GnTIII

Se prepararon construcciones de fusión entre GnTIII de mamífero y secuencias de dirección de levadura usando el gen Mgat3 de ratón (número de acceso de GenBank L39373, Bhaumik y col., 1995). Tres fragmentos de ADN correspondientes a deleciones N-terminales \Delta32, \Delta86 y \Delta212 del gen de GnTIII de ratón se amplificaron por PCR usando polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) con los cebadores directos

1040

Después, los productos de PCR se clonaron en el vector pJN 348 como fragmentos de AscI-PacI y se secuenciaron. Los vectores resultantes pVA (GnTIII \Delta32), pVB (GnTIII \Delta86) y pVC (GnTIII \Delta212) se digirieron con enzimas NotI-AscI y se usaron para la ligación con la biblioteca líder de levadura (líderes 20-67). Estos péptidos de dirección se fusionan con los dominios catalíticos seleccionados de la GnTIII de ratón con deleciones N-terminales de 32, 86, 212 aminoácidos. Por ejemplo, el péptido de dirección de MNN2 de S. cerevisiae (largo, medio y corto) y GNT1 de K. lactis (corto y medio) (véase el Ejemplo 11) se muestran en la Tabla 11

TABLA 11 Una biblioteca combinatoria representativa de secuencias de péptido de dirección/dominios catalíticos que muestran actividad de UDP-N-Acetilglucosamidiltransferasa III (GnTIII) YSH-1 de P. pastoris

19

Ejemplo 19

Modificación de P. pastoris para producir GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} bisecado

La cepa de P. pastoris que produce GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} (PBP-3) (véase el Ejemplo 8) se contraseleccionó en 5-FOA, seleccionando de este modo para pérdida del marcador Ursa3+ y un fenotipo ura3-. Esa cepa, denominada YSH-1 (Figura 36) se transformó con la biblioteca de dominios catalíticos de N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) (vectores pVA, pVB y pVC) y líderes. Los transformantes se cultivaron a 30ºC en BMGY hasta una DO_{600} de aproximadamente 10, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. La K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni utilizando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glucanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). Los N-glucanos se analizaron con una EM de MALDI-TOF (Ejemplo 3). Las actividades de GnTIII se muestran en la Tabla 11. El número de (+), como se usa en este documento, indica los niveles relativos de producción de N-glucano bisecado del % de glucanos neutros. Las secuencias de péptido de dirección se seleccionaron entre el grupo constituido por: GLS1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, OCH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP1 de Saccharomyces, HOC1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de Saccharomyces. Los transformantes de pVA53 que muestran la GlcNAc de bisección (por ejemplo, GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}) se denominaron PBP26 (Figura 36).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 20

Modificación de YSH-44 de P. pastoris para producir GlcNAc_{3}Ma_{3}GlcNAc_{2} bisecado

Para la expresión de GnTIII en la cepa YSH-44 (Figura 36), se transfirieron construcciones de GnTIII de los vectores pVA53, pVB53, pVA54 y pVB54 como fragmentos de NotI-PacI en pRCD259 para generar vectores pPB135, pPB137, pPB136 y pPB138. Los vectores contienen un marcador de resistencia a HYG y un gen de URA3 de P. pastoris como una secuencia de dirección para la integración genómica. Los plásmidos se linealizan con SalI, se introducen por transformación en la cepa YSH-44 por electroporación, se seleccionan en medio que contiene higromicina y las cepas resultantes se exploran por análisis de los glucanos liberados de K3 purificada. Los transformantes se cultivaron a 24ºC en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Se purificó K3 del medio por cromatografía de afinidad de Ni utilizando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000 (Ejemplo 3). La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glucanos se liberaron por digestión con PNGasa. Los N-glucanos se analizaron con una EM de MALDI-TOF (Ejemplo 3). Los transformantes de pPB135 que muestran la GlcNAc de bisección (por ejemplo, GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}) se denominaron YSH-57 (Figura 36). La Tabla 11 ilustra la actividad de la GnTIII de ratón.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 21

Modificación de PBP6-5 de P. pastoris para producir GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2} bisecado

El PBP6-5 de P. pastoris (Ejemplo 11) se transformó con el plásmido pPB135 (Tabla 11) que codifica un dominio catalítico de GnTIII de ratón (\Delta32) ligado en fase con un péptido de dirección procedente de MNN2 de S. cerevisiae. Los transformantes se cultivaron a 30ºC en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Se purificó K3 del medio por cromatografía de afinidad de Ni utilizando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glucanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). Los N-glucanos se analizaron con una EM de MALDI-TOF (Ejemplo 3). Los transformantes que muestran la GlcNAc de bisección (por ejemplo, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}) se denominaron PBP-38 (Figura 36). La Tabla 11 ilustra la actividad de la GnTIII de ratón.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 22

Ensayo de actividad de GnTIII in vitro usando el sustrato GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en la cepa de P. pastoris modificada YSH-57

Para ensayar cualquier actividad de GnTIII ex vivo potencial en la cepa de P. pastoris, los sobrenadantes de cultivo celular de YSH-57 se ensayaron para actividad de GnTIII. Las células de P. pastoris YSH-57 se cultivaron a 24ºC en BMGY (B) hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente claro. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de GnTIII y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Se purificó K3 del medio por cromatografía de afinidad de Ni utilizando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glucanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente para presencia de actividad de GnTIII secretada. Se añadió GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} purificado de K3 expresada en la cepa PBP-3 a: BMMY (A) UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C); el sobrenadante de YSH-57 + UDP-GlcNAc 1 mM (D). Después de la incubación durante 8 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el alcance de la actividad de GnTIII.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 23

Ensayo de actividad de GnTIII in vitro usando el sustrato GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} en la cepa de P. pastoris modificada YSH-57

Para ensayar cualquier actividad de GnTIII ex vivo potencial en la cepa de P. pastoris YSH-57 se ensayaron sobrenadantes de cultivo celular para actividad de GnTIII. Las células de P. pastoris YSH-57 se cultivaron a 24ºC en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOXI. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente claro. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de GnTIII y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Se purificó K3 del medio por cromatografía de afinidad de Ni utilizando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glucanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente para la presencia de actividad de GnTIII secretada. Se añadió GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2} purificado de K3 expresada en la cepa YSH-44 a: BMMY (A) UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C). Después de incubación durante 8 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el alcance de actividad de GnTIII.

<110> BOBROWICZ, PIOTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> EXPRESIÓN DE N-ACETILGLUCOSAMINILTRANSFERASA III EN EUCARIOTAS INFERIORES

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> L2575 EPS3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US04/005128

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 20-02-2004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 10/680.963

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 07-10-2003

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 10/371.877

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 20-02-2003

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/892.591

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 27-06-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/214.358

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-06-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/215.638

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 30-06-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/279.997

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 30-03-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US02/41510

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 24-12-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/344.169

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 27-12-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentInVer. 3.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido excepto Pro

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Xaa Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido excepto Pro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Xaa Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggcgaagg cagatggcag t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagtccttc caacttcctt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> g, a, t o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> g, a, t o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> g, a, t o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taytggmgng tngarcynga yathaa

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<200>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> g, a, t o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> g, a, t o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcrtcncccc anckytcrta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgcctgc agatttaaat gaattcggcg cgccttaat

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaggcgcgc cgaattcatt taaatctgca gggc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (304)..(318)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (416)..(436)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 389

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (279)..(293)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

<211 > 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila virilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila virilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1395

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pichia pastoris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 464

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pichia pastoris

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

45

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pichia pastoris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (209)..(223)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (235)..(246)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

48

49

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pichia pastoris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (183)..(197)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (209)..(220)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

53

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

55

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pichia pastoris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (176)..(190)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (202)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizosaccharomyces pombe

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

59

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pichia pastoris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (176)..(190)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (202)..(213)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 428

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Kluyveromyces lactis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Kluyveromyces lactis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Kluyveromyces lactis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Kluyveromyces lactis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1968

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1965)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

74

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 655

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

76

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctggcgcg ccttcccgag agaactggcc tccctc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaggcgcg ccacagagga actgcaccgg gtg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 536

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgccatct gccttcgcca t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaatacgac tcactatagg gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattaaccct cactaaaggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgaggcgc gccatcaacg ccatcaacat caaccac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattaattaa ccctagccct ccgctgtatc caacttg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcccgtgg ggggcctgtt gccgctcttc agtagc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatttctct ttgccatcaa tttccttctt ctgttcacgg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgcgccga ctcctccaag ctgctcagcg gggtcctgtt ccac

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttaattaa tcatttctct ttgccatcaa tttccttctt ctgttcacgg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgagctcg gcctacccgg ccaaggctga gatcatttgt ccagcttcag a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccacgtcg acggatccgt ttaaacatcg attggagagg ctgacaccgc tacta

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccac tagtatttaa atcatatgtg cgagtgtaca actcttccca catgg

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacgcgtcg acggcctacc cggccgtacg aggaatttct cggatgactc ttttc

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccct cgagagatct tttttgtaga aatgtcttgg tgcct

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttgctagc ttaattaacc gcggcacgtc cgacggcggc ccacgggtcc ca

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccaatact agtcgaagat tatcttctac ggtgcctgga ctc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggaaggttt aaacaaagct agagtaaaat agatatagcg agattagaga atg

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaattcgg ctggaaggcc ttgtaccttg atgtagttcc cgttttcatc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccaagccg gccttaaggg atctcctgat gactgactca ctgataataa aaatacgg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcgcgtat ttaaatacta gtggatctat cgaatctaaa tgtaagttaa aatctctaa

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgcctgc agatttaaat gaattcggcg cgccttaat

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaggcgcgc cgaatlcatt taaatctgca gggc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcaggcgc gcctcagtca gcgctctcg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggttaatta agtgctaatt ccagctagg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagaagaat tcaattytgy cartgg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtgaaaat acctggnccn gtcca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgccatcttt taggtccagg cccgttc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcccacga cgcatcgtat ttctttc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgttttgt tttctagatc tttgcaytay cartt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaatttggt gggtaagaat tccarcacca ytcrtg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctaagctgg tatgcgttct ctttgccata tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggcataaa caataataga tgctataaag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacatcatc cgtgctacat atag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgaggcaag ctaaacagat ctcgaagtat cgagggttat ccag

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatccagtg tcgaaaacga gccaatggtt catgtctata aatc

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctcagcg ccaacaagcg atgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggataacc ctcgatactt cgagatctgt ttagcttgcc tcgt

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatttataga catgaaccat tggctcgttt tcgacactgg atgg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcctttacc gatgctgtat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataacagtat gtgttacacg cgtgtag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcctcactg cagtcttcta taact

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggagaccat gaggttccgc atctac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggcgcgcc tccctagtgt accagttgaa ctttg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattaattaa ctcactgcag tcttctataa ct

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctggcgcg ccttcccgag agaactggcc tccctc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattaattaa ccctagccct ccgctgtatc caacttg

\hfill

37

Claims

1. Un procedimiento para fabricar una glucoproteína recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso de eucariota inferior modificada para producir una glucoproteína que tiene una estructura central de Man_{3}GlcNAc_{2} o de Man_{5}GlcNAc_{2}, que comprende la etapa de introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, en el que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII \Delta32 de ratón o GnTIII \Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las glucoproteínas recombinantes producidas por el procedimiento comprenden más del 10% en mol de estructuras de N-glucano bisecadas seleccionadas entre el grupo constituido por GlcNAC_{3}Man_{3}GlcNAC_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III es sustancialmente intracelular.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de aislar la glucoproteína de la célula huésped.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymor-pha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica y Pichia sp.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la célula huésped es Pichia pastoris.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la glucoproteína es una proteína terapéutica.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo constituido por eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena \alpha de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de tripsina de urea, proteína de unión de IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona de crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitor mieloide 1, osteoprotegerina, \alpha-1-antitripsina, \alpha-fetoproteína, ADNasa II, AAt, rhTBP-1, TACI-Ig, FSH, GM-CSF, GLP-1 con y sin agonista de receptor FC de IL-1, sTNFr ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig.

10. Una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, en la que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII \Delta32 de ratón o GnTIII \Delta86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae.

11. La célula huésped de la reivindicación 10, que comprende además una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa I y/o de N-acetilglucosaminiltransferasa II.

12. La célula huésped de la reivindicación 10 u 11, en la que la célula es capaz de producir N-glucanos en glucoproteínas que comprenden estructuras de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} o GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que son capaces de reaccionar con una actividad de GnTIII.

13. La célula huésped de la reivindicación 10, en la que la célula huésped produce glucoproteínas que comprenden estructuras de N-glucano bisecados en una estructura central de Man_{5}GlcNAc_{2} o Man_{3}GlcNAc_{2}.

14. La célula huésped de la reivindicación 10 u 11, en la que la célula huésped produce glucoproteínas que comprenden estructuras de N-glucano bisecado seleccionadas entre el grupo constituido por GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}.

15. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende además una actividad de \alpha-1,2-manosidasa I y/o una actividad de manosidasa II.

16. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que es deficiente en una actividad de OCH1 manosiltransferasa y/o actividad de Dol-P-Man:Man_{5}GlcNAc_{2}-PP-Dol manosiltransferasa.

17. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que comprende además una actividad de transportador de UDP-GlcNAc.

18. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en la que las actividades son sustancialmente intracelulares.

19. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

20. La célula huésped de la reivindicación 19, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolic y Pichia sp.

21. La célula huésped de la reivindicación 20, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

22. Una composición de glucoproteína, en la que las glucoproteínas en dicha composición carecen de fucosa y más del 10% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una GlcNAc de bisección en una estructura central de Man_{5}GlcNAc_{2}, Man_{4}GlcNAc_{2} o Man_{3}GlcNAc_{2}.

23. La composición de glucoproteína de la reivindicación 22, en la que más del 10% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una GlcNAc de bisección unida a una estructura central seleccionada entre el grupo constituido por: GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}.

24. La composición de glucoproteína de la reivindicación 22, en la que más del 80% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una GlcNAc de bisección unida a una estructura central seleccionada entre el grupo constituido por: Man_{5}GlcNAc_{2}, Man_{4}GlcNAc_{2}, Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}, GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}.

25. La composición de glucoproteína de la reivindicación 22, en la que las glucoproteínas se preparan por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y en la que más del 10% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una estructura de bisección seleccionada entre el grupo constituido por GlcNAc_{3}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}, GlcNAc_{2}Man_{4}GlcNAc_{2} y GlcNAc_{2}Man_{5}GlcNAc_{2}.

26. Una composición farmacéutica que comprende la glucoproteína de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25.