PT1597381E

PT1597381E - Produção de glicoproteínas modificadas com estruturas antenárias múltiplas

Info

Publication number: PT1597381E
Application number: PT04713388T
Authority: PT
Inventors: Stefan Wildt; Byung-Kwon Choi; Juergen Hermann Nett; Piotr Bobrowicz; Robert C Davidson; Tilman U Gerngross; Stephen R Hamilton
Original assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2010-02-23
Also published as: CA2516520C; CA2753408A1; AU2004213868A1; WO2004074461A2; ES2336790T5; US20100016555A1; DE602004024289D1; ES2384929T3; JP2011019521A; CA2516550A1; AU2004213859B2; ES2335345T5; US7598055B2; JP2006518597A; CA2516520A1; US20100016561A1; JP4758335B2; WO2004074461A3; EP2080809A1; EP1597381B2

Description

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DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DE GLICOPROTEÍNAS MODIFICADAS COM ESTRUTURAS ANTENÁRIAS MÚLTIPLAS"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a métodos e composições que possibilitam a modificação genética de células hospedeiras eucariotas não humanas, tal como células fúngicas unicelulares e multicelulares, para produzirem proteínas glicosiladas (glicoproteínas) com padrões de glicosilação semelhantes às das glicoproteínas produzidas por células animais, em especial células humanas, úteis como agentes terapêuticos para seres humanos ou animais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Vias de glicosilação em seres humanos e eucariotas inferiores

Depois de transcrito e traduzido o ADN para uma proteína, a continuação do processamento pós-traducional envolve a ligação de resíduos de açúcar, um processo conhecido como glicosilação. Diferentes organismos produzem enzimas de glicosilação diferentes (glicosiltransferases e glicosidases) e possuem substratos diferentes (açúcares-nucleótido) disponíveis, de forma que os padrões de glicosilação, bem como a composição dos oligossacáridos individuais, até da mesma proteína, serão diferentes conforme o sistema hospedeiro em que a proteína específica 2 está a ser expressa. Tipicamente, as bactérias não glicosilam proteínas e se o fazem será apenas de uma forma muito inespecífica (Moens and Vanderleyden (1997) Arch Microbiol. 168 (3):169-175). Os eucariotas inferiores, tal como fungos filamentosos e leveduras, adicionam principalmente os açúcares manose e manosilfosfato. 0 glicano resultante é conhecido como glicano com "alto teor de manose" ou um manano. As células vegetais e células de insectos (tais como as células Sf9) glicosilam proteínas ainda de outra forma. Em contraste, em eucariotas superiores, tais como seres humanos, a cadeia lateral de oligossacáridos nascente pode ser encurtada para remover vários resíduos de manose e alongada com resíduos de açúcar adicionais que não são tipicamente encontrados nos N-glicanos dos eucariotas inferiores. Vide, por exemplo, Bretthauer, et al. (1999) Biotechnology and Applied Biochemistry 30:193-200; Martinet, et al. (1998) Biotechnology Letters 20:1171-1177; Weikert, et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:1116-1121; M. Malissard, et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications 267:169-173; Jarvis, et al., (1998) Current Opinion in Biotechnology 9:528-533; and Takeuchi (1997) Trends in Glyco-science and Glycotechnology 9:S29-S35. A síntese de estruturas de oligossacáridos de tipo mamífero tem início com um conjunto de reacções sequenciais, ao longo das quais são adicionados e removidos resíduos de açúcar enquanto a proteína se move pela via secretória no organismo hospedeiro. As enzimas que residem ao longo da via de glicosilação do organismo ou célula hospedeiro determinam os padrões de glicosilação resultantes das proteínas secretadas. Assim, o padrão de glicosilação 3 resultante das proteínas expressas em células hospedeiras eucariotas inferiores difere substancialmente do padrão de glicosilação de proteínas expressas em eucariotas superiores, tais como seres humanos e outros mamíferos (Bretthauer, 1999) . A estrutura de um N-glicano fúngico típico é revelada na figura IA.

As fases iniciais da glicosilação humana podem ser divididas em pelo menos duas fases diferentes: (i) oligossacáridos Glc3Man9GlcNAc2 ligados a lípidos são construídos por meio de um conjunto sequencial de reacções na membrana do retículo endoplasmático (RE) (figura 13) e (ii) a transferência deste oligossacárido a partir do pirofosfato doliquil que funciona como uma âncora lipídica para a proteína sintetizada de novo. 0 sítio da transferência específica é definido por um resíduo asparagina (Asn) na sequência Asn-Xaa-Ser/Thr (SEQ ID N°s:l e 2) , em que Xaa pode ser qualquer aminoácido com excepçâo de prolina (Gavel and von Heijne (1990) Protein Eng. 3:433— 42). No RE ocorre a continuação do processamento por glucosidases e manosidases antes da glicoproteína nascente ser transferida para a face cis do aparelho de Golgi, onde resíduos adicionais de manose são removidos por alfa (a)-1,2-manosidases, específicas do Golgi. O processamento continua à medida que a proteína progride através do Golgi. No Golgi mediano, várias enzimas modificantes, incluindo N-acetilglucosaminil transferases (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV e GnTV), manosidase II e fucosiltransferases adicionam e removem resíduos de açúcar específicos. Finalmente, no Golgi trans, galactosiltranferases (GalT) e sialiltransferases (ST) produzem uma estrutura de glicoproteína que é libertada do Golgi. É esta estrutura, 4 caracterizada por estruturas bi, tri e tetra antenárias, contendo galactose, fucose, N-acetilglucosamina e um elevado nível de ácido siálico terminal que confere às glicoproteínas as suas características humanas. A estrutura de um N-glicano humano típico é revelada na figura 1B. Ver também as figuras 14 e 15, onde constam as fases envolvidas no processamento do W-glicano de tipo mamífero.

Em todos os eucariotas estudados até à data, as glicoproteínas são derivada de um precursor oligossacárido ligado a lípido comum, Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. No interior do retículo endoplasmático, a síntese e processamento de oligossacáridos ligados a dolicol-pirofosfato são idênticos entre todos os eucariotas conhecidos. No entanto, a continuação do processamento do oligossacárido "core" pelas células fúngicas, por exemplo levedura, difere significativamente da do ser humano à medida que se move pelas vias secretórias.

Na levedura, estas fases são catalizadas por manosiltransferases residentes no aparelho de Golgi, como Ochlp, Mntlp e Mnnlp, que adicionam sequencialmente açúcares manose ao oligossacárido "core". A estrutura resultante é indesejada para a produção de proteínas humanóides e é, assim, desejável reduzir ou eliminar a actividade de manosiltransferase. Os mutantes de S. cerevisiae, deficientes em actividade de manosiltransferase (por exemplo mutantes ochl ou mnn9) revelaram que não são letais e apresentam um teor de manose reduzido no oligossacárido das glicoproteínas de levedura. Outras enzimas envolvidas no processamento de oligossacáridos, tal como manosilfosfato transferases, podem também ter de ser 5 eliminadas dependendo das vias de glicosilação particulares do hospedeiro.

Precursores de nucleótido de açúcar

Os N-glicanos de glicoproteinas animais incluem tipicamente galactose, frutose e ácido siálico terminal. Estes açúcares não são encontrados em glicoproteinas produzidas em leveduras e fungos filamentosos. Em seres humanos, a totalidade da gama de precursores de açúcares nucleotídicos (por exemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuraminico, UDP-galactose, GDP-fucose, etc.) são sintetizados no citosol e transportados para o Golgi, onde são ligados ao oligossacárido "core" pelas glicosiltransferases. (Sommers e Hirschberg, 1981 J. Cell Biol. 91 (2): A406-A406; Sommers e Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez e Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138: 709-715).

em relação à UDP

As reacções de transferência do glicosilo rendem tipicamente um subproduto, que é um nucleosideo difosfato ou monofosfato. Enquanto os monofosfatos podem ser directamente exportados, em troca de açúcares nucçeosideos trifosfato por um mecanismo antiporte, os difosfonucleosideos (por exemplo GDP) têm de ser clivados por fosfatases (por exemplo GDPase) para se obter nucleosideos monofosfatos e fosfatos inorgânicos antes de serem exportados. Esta reacção é importante para uma glicosilação eficiente; por exemplo, observou-se que a GDPase de Saccharomyces cerevisiae {S.cerevisiae) é necessária para a manosilação. No entanto, essa GDPase têm uma actividade reduzida em 90 % 6 (Berninsone et aL, 1994 J. BioL Chem. 269(1):207-211). Tipicamente, as células de eucariotas inferiores não têm actividade de difosfatase especifica de UDP no Golgi, uma vez que não utilizam precursores de açúcar-UDP para a sintese de glicoproteinas no aparelho de Golgi. Constatou-se que a Schizosaccharomyces pombe, uma levedura que se verificou adicionar resíduos de galactose aos polissacarídeos da parede celular (da UDP-galactose), tem actividade de UDPase específica, indicando a necessidade potecial de uma enzima destas (Berninsone et al., 1994). A UDP é conhecida como um potente inibidor das glicosiltransferases e a remoção deste subproduto da glicosilação é importante para prevenir a inibição da glicosiltransferase no lúmen do Golgi (Khatara et al., 1974). (1974) Eur. J. Biochem. 44:537-560). See Berninsone et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (24):14564-14567,- Beaudet et al. (1998) Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects 292: 397-413.

Processamento sequencial de N-glicanos por actividades enzimáticas compartimentadas

As transferases de açúcares e glicosidases (por exemplo, manosidases) revestem a superfície interna (luminal) do RE e aparelho de Golgi e proporcionam, assim, uma superfície "catalítica" que permite o processamento sequencial de glicoproteinas, à medida que progridem através da rede do RE e Golgi. As múltiplas cisternas do Golgi cis, mediano e trans e a rede Golgi trans (trans Golgi Network - TGN) proporcionam as diferentes localizações onde pode ocorrer a sequência ordenada das reacções de glicosilação. À medida 7 que a glicoproteína progride desde a síntese no RE até à maturação plena no Golgi trans ou TGN, é exposta sequencialmente a diferentes glicosidases, manosidases e glicosiltransferases, de modo que pode ser sintetizada uma estrutura de hidrato de carbono específica. Tem sido dedicado muito trabalho para se tentar descobrir o mecanismo exacto de retenção e ancoragem destas enzimas no seu organelo respectivo. A figura que tem vindo a ser obtida é complexa, mas os resultados sugerem que a região tronco, região transmembranar e cauda citoplasmática dirigem, individualmente ou em conjunto, as enzimas para a membrana de organelos individuais e localizam assim o domínio catalítico associado para esse locus (vide, por exemplo, Gleeson (1998) Histochem. Cell Biol. 109:517-532).

Nalguns casos constatou-se que estas interacções específicas funcionam entre espécies. Por exemplo, revelou-se que o domínio transmembranar de a-2,6-ST de ratos, uma enzima conhecida por localizar no Golgi trans do animal, localiza também um gene repórter (invertase) no Golgi de levedura (Schwientek, et al., 1995 J. Biol. Chem. 270(10):5483-9). No entanto, precisamente o mesmo domínio transmembranar, como parte de a-2,6-ST completa, foi retido no RE e não continuou a ser transportado para o Golgi da levedura (Krezdom et aL, 1994). J. Biochem. 220(3):809-17). Uma GalT completa de seres humanos nem sequer foi sintetizada em levedura, apesar dos níveis de transcrição comprovadamente elevados. Em contraste, a região transmembranar da mesma GalT humana fundida com um repórter invertase foi capaz de orientar a localização para o Golgi de levedura, muito embora a níveis muito baixos. Schwientek e colaboradores revelaram que a fusão de 28 aminoácidos de uma manosiltransferase (Mntl) de levedura, uma região contendo uma cauda citoplasmática, uma região transmembranar e oito aminoácidos da região tronco para o domínio catalítico de GalT humana bastam para a localização Golgi de uma GalT activa. Outras galactosiltransferases dependem aparentemente de interacções com enzimas residentes em organelos específicos, porque após a remoção da respectiva região transmembranar ainda são capazes de se localizar adequadamente.

Uma localização incorrecta de uma enzima de glicosilação pode impedir um adequado funcionamento da enzima na via. Por exemplo, Aspergillus nidulans, que possui numerosas a- 1.2- manosidases (Eades e Hintz, 2000 Gene 255(1): 25-34), não adiciona GlcNAc a MansGlcNAc2 quando é transformado com o gene GnT I de coelho, apesar de um elevado nivel geral de actividade de GaT I (Kalsner et al., 1995) Glycoconj. J. 12(3):360-370). GnT I, embora expresso activamente, pode ser incorrectamente localizado, de modo que a enzima não fica em contacto com os seus dois substratos: UDP-GlcNAc e um substrato produtivo Man5GlcNAc2 (nem todas as estruturas MansGlcNAc2 são produtivas; vide abaixo). Em alternativa, o organismo hospedeiro pode não proporcionar um nível adequado de UDP-GlcNAc no Golgi ou a enzima pode estar convenientemente localizada mas ainda assim inactiva no seu novo ambiente. Além disso, as estruturas Man5GlcNAc2 presentes na célula hospedeira poderão divergir quanto à estrutura Man5GlcNAc2 observada em mamíferos. Maras e colaboradores descobriram que cerca de um terço dos N-glicanos de celobio-hidrolase I (CGHI), obtidos a partir de T.reesei podem ser encurtados até Man5GlcNAc2 por A.saitoi 1.2- manosidase in vitro. Menos de 1 % desses W-glicanos, 9 contudo, poderiam servir de substrato produtivo para GnTI. Maras et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249:701-707. Por conseguinte, a simples presença de Man5GlcNAc2 não garante que se consegue continuar o processamento in vivo de

Man5GlcNAc2. É necessária a formação de uma estrutura Man5GlcNAc2 reactiva a GnTI produtiva Embora se possa produzir Man5GlcNAc2 na célula (cerca de 27 % em mol), apenas uma pequena fracção poderia ser convertida em MansGlcNAc2 (menos de cerca de 5 %, vide Chiba et al. WO 01/14522) .

Actualmente, não existe uma forma fidedigna para prever se uma glicosiltransferase ou manosidase especifica expressa de forma heteróloga num eucariota inferior será (1) suficientemente traduzida, (2) cataliticamente activa ou (3) localizada no organelo adequado, na via secretória. Porque todos estes três aspectos são necessários para afectar os padrões de glicosilaçâo em eucariotas inferiores, seria desejável um esquema sistemático para atingir a função catalítica desejada e a adequada retenção das enzimas na ausência de ferramentas de previsão, que não existem actualmente.

Produção de glicoproteínas terapêuticas

Um número significativo de proteínas isoladas a partir de seres humanos ou animais são modificadas de modo pós-traducional, sendo a glicosilaçâo uma das modificações mais significativas. Estima-se que 70 % de todas as proteínas terapêuticas são glicosiladas e assim dependem actualmente de um sistema de produção (isto é, a célula hospedeira) capaz de glicosilar de um modo semelhante aos humanos. 10 Vários estudos revelaram que a glicosilação desempenha um importante papel na determinação de (1) imunogenicidade, (2) propriedades farmacocinéticas, (3) tráfico e (4) eficácia das proteínas terapêuticas. Deste modo, não é surpreendente que tenham sido dirigidos esforços substanciais por parte da indústria farmacêutica no desenvolvimento de processos para obter glicoproteínas que sejam tão "humanóides" ou "semelhantes às humanas" quanto possível. Até hoje, a maioria das glicoproteínas são preparadas num sistema hospedeiro de mamífero. Esta operação poderá envolver a modificação genética destas células de mamífero para intensificar o grau de sialilação (isto é, a adição terminal de ácido siálico) das proteínas expressas pelas células, que se sabe melhorar as propriedades farmacocinéticas destas proteínas. Em alternativa, pode melhorar-se o grau de sialilação pela adição in vitro destes açúcares, utilizando glicosiltransferases conhecidas e respectivos açúcares nucleotídicos (por exemplo 2,3-sialiltransferase e ácido Siálico-CMP).

Enquanto a maioria dos eucariotas superiores executam reacções de glicosilação que são semelhantes às encontradas em seres humanos, as proteínas recombinantes humanas, expressas nos sistemas hospedeiros anteriormente mencionados, diferem invariavelmente dos seus equivalentes "naturais" humanos (Raju et al. (2000) Glycobiology 10(5): 477-486) . Tem, assim, sido dirigido um extensivo trabalho de desenvolvimento para a descoberta de formas de melhoramento do "carácter humano" das proteínas produzidas nestes sistemas de expressão. Isto inclui a optimização das condições de fermentação e a modificação genética de 11 hospedeiros de expressão de proteínas por meio da introdução de genes codificadores de enzimas envolvidas na formação de glicoformas semelhantes às humanas. Goochee et al. (1999) Biotechnology 9(12):1347-55; Andersen e Goochee (1994) Curr Opin Biotechnol. 5(5):546-49; Werner et al. (1998) Arzneimittelforschung. 48(8): 870-80; Weikert et al. (1999) Nat Biotechnol. 17(11):1116-21; Yang e Butler (2000) Biotech. Bioeng. 68:370-80. Os problemas inerentes, associados a todos os sistemas de expressão em mamíferos não foram ainda resolvidos.

Produção de Glicoproteína Utilizando Microrganismos Eucariotas

Embora a estrutura do oligossacárido "core" transferida para uma proteína no retículo endoplasmático seja basicamente idêntica em mamíferos e eucariotas inferiores, forma encontradas diferenças substanciais nas reacções de processamento posteriores, as quais ocorrem no aparelho de Golgi de fungos e mamíferos. Na realidade, mesmo entre eucariotas inferiores diferentes existe uma grande variedade de estruturas de glicosilação. Este facto tem impedido, historicamente, a utilização de eucariotas inferiores como hospedeiros para a produção de glicoproteínas humanas recombinantes, apesar de outras vantagens notáveis em relação aos sistemas de expressão em mamíferos.

As glicoproteínas terapêuticas produzidas num microorganismo hospedeiro, tal como a levedura, utilizando a via de glicosilação endógena do hospedeiro divergem estruturalmente das produzidas em células de mamífero e 12 revelam tipicamente uma eficácia terapêutica muito reduzida. Estas glicoproteinas são tipicamente imunogénicas em seres humanos e apresentam um reduzido tempo de semi-vida (e, logo, de bioactividade) in vivo após a administração (Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9:S29-S35). Receptores específicos em seres humanos e animais (isto é receptores de manose macrófagos) podem reconhecer resíduos terminais de manose e promover uma depuração rápida da glicoproteína exógena da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos adicionais podem incluir alterações no enrolamento das proteínas, na sua solubilidade, susceptibilidade a proteases, tráfico, transporte, compartimentação, secreção, reconhecimento por outras proteínas ou factores, antigenicidade ou alergenicidade.

Tanto leveduras como fungos filamentosos têm sido empregues com êxito na produção de proteínas recombinantes, seja intracelulares como secretadas (Cereghino and Cregg (2000) FEMS Microbiology Reviews 24(l):45-66; Harkki et al. (1989) BioTechnology 7 (6):596,- Berka et al. (1992) Abstr.Papers Amer. Chem. Soc. 203:121-BIOT; Svetina et al. (2000) J. Biotechnol. 76(2-3):245-251). Várias leveduras, tal como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica e Hansenula polymorpha desempenharam papéis particularmente importantes como sistemas de expressão eucariotas uma vez que são capazes de crescer até atingir elevadas densidades celulares e/ou secretar grandes quantidades de proteína recombinante. Do mesmo modo, fungos filamentosos, tais como Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassae outros, foram utilizados para produzir de forma eficiente glicoproteinas a uma escala industrial. No entanto, como 13 indicado anteriormente, as glicoproteinas expressas em qualquer destes microrganismos eucariotas diferem substancialmente quanto à estrutura de N-glicano daquelas que se encontram em animais. Este facto tem impedido a utilização de levedura ou fungos filamentosos como hospedeiros para a produção de muitas glicoproteinas terapêuticas.

Embora a glicosilação em levedura e fungos seja muito diferente da glicosilação em seres humanos, partilham alguns elementos comuns. A primeira etapa, a transferência da estrutura oligossacaridica "core" para a proteina nascente, está muito conservada em todos os eucariotas, incluindo levedura, fungos, plantas e seres humanos (compare as figuras IA e 1B). 0 processamento subsequente dos oligossacáridos "core" difere contudo significativamente na levedura e envolve a adição de vários açúcares manose. Esta etapa é catalisada por manosiltransferases existentes no aparelho de Golgi (por exemplo, 0CH1, MNT1, MNN1, etc.), que adicionam sequencialmente açúcares manose ao oligossacárido "core". A estrutura resultante é indesejada para a produção de proteínas humanóides e é, assim, desejável reduzir ou eliminar a actividade manosiltransferase. Os mutantes de S. cerevisiae, deficiente em actividade manosiltransferase (por exemplo mutantes ochl ou mnn9) revelaram que não são letais e apresentam um teor de manose reduzido no oligossacárido das glicoproteinas de levedura. Outras enzimas processadoras de oligossacáridos, tal como manosilfosfato transferase, podem também ter de ser eliminadas conforme o padrão de glicosilação endógeno particular do hospedeiro. Após a redução de reacções de 14 glicosilação endógenas indesejadas, a formação de N-glicanos complexos tem de ser alterada no sistema hospedeiro. Este facto exige a expressão estável de várias enzimas e transportadores açúcar-nucleotideo. De resto, um tem de localizar estas enzimas de modo a garantir um processamento sequencial da estrutura de glicosilação em maturação. Têm sido evidados vários esforços para modificar as vias de glicosilação de microrganismos eucariotas para proporcionar glicoproteinas mais adequadas ao uso como agentes terapêuticos para mamíferos. Por exemplo, têm sido clonadas em separado várias glicosiltransferases e expressas em S. cerevisiae (GAIT, GnT I), Aspergillus nidulans (GnT I) e outros fungos (Yoshida et al. (1999) Glycobiology 9(1):53-8, Kalsner et al. (1995) Glycoconj. J. 12(3):360-370). No entanto, não foram obtidos N-glicanos com características humanas.

As leveduras produzem uma variedade de manosiltransferases (por exemplo 1,3-manosiltransferases tal como MNN 1 em S. cerevisiae; Graham e Emr, 1991 J. Cell. Biol. 114(2):207-218) 1,2-manosiltransferases (por exemplo família KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferases (OCHl de cerevisiae), manosilfosfato transferases e respectivos reguladores (MNN4 e MNN6 e S. cerevisiae) e enzimas adicionais que estão envolvidas em reacções de glicosilação endógenas. Muitos destes genes foram eliminados individualmente, dando origem a organismos viáveis com perfis de glicosilação alterados. São apresentados exemplos no quadro 1.

Quadro 1. Exemplos de estirpes de levedura com manosilação alterada 15

Estirpe N-glicano (tipo selvagem) Mutação N-glicano (mutante) Referência S. pombe Man>9GlcNAC2 OCHl Man8GlcNAc2 Yoko-o et al. (2001) FEBS Lett. 489 (1) :75-80 S. cerevisi ae Man>9GlcNAC2 OCH1/MNN1 Man8GlcNAc2 Nakanishi-Shindo et al. (1993) J. Biol. Chem.268(35): 26338-26345 S. cerevisi ae Man>9GlcNAC2 0CH1/MNN1/MN N4 Man8GlcNAc2 Chiba et al. (1998) J.Biol. Chem. 273,26298- 26304 P. pastoris hiperglicosi lado OCHl (eliminação completa) Não hiperglicosil ado Welfide, Publicação de pedido de patente japonesa N° 8-336387 P. pastoris Man>8GlcNAc2 OCHl (disrupção) Man>8GlcNAc2 Contreras et al. WO 02/00856 A2 A publicação do pedido de patente japonês n° 8-336387 descreve a delecçãoo de um homólogo OCHl em Pichia pastoris. Em S.cerevisiae o gene 0CH1 codifica uma 1,6-manosiltransferase, que adiciona uma manose à estrutura glicano Man8GlcNAc2 para se obter Man9GlcNAc2. A estrutura Man9GlcNAc2, que contém três resíduos 1,6 manose é, então, um substrato para posteriores 1,2-manosiltransferase, 1,6-manosiltransferase e 1,3-manosiltransferase in vivo, conduzindo às glicoproteínas hipermanosiladas, que são características do S.cerevisiae e que podem ter tipicamente pelo menos de 30 a 40 resíduos manose por N-glicano. Porque o Ochlp inicia a transferência de 1,6 manose para o "core" Man8GlcNAc2, é frequentemente designado como a "1,6 16 manosiltransferase iniciadora" para distinguir de outras 1,6 manosiltransferases com acção posterior no Golgi. Na estirpe mutante ochl mnnl mnn4 de S.cerevisiae, as proteínas glicosiladas com Man8GlcNAc2 são acumuladas e a hipermanosilação não tem lugar. No entanto, Man8GlcNAc2 não é um substrato para as glicosiltransferases de mamífero, tal como UDP-GlcNAc transferase I humana e, assim, a utilização da estirpe mutante, por si só, não é útil para a produção de proteínas semelhantes à de mamífero, isto é, aquelas com padrões de glicosilação complexos ou híbridos.

Pode-se encurtar estruturas Man8GlcNAc2, tornando-as num isómero Man5GlcNAc2 em S.cerevisiae (embora falte ainda demonstrar um encurtamento de alta eficiência, maior que 50 % in vivo) por meio de modificação genética de uma manosidase fúngica de A.saitoi para o retículo endoplasmático (RE). As deficiências desta abordagem são duplas: (1) não é evidente se as estruturas Man5GlcNAc2 formadas são, de facto, formada in vivo (em vez de ter sido segregadas e modificadas por manosidase fora da célula) e (2) não é evidente se quaisquer estruturas Man5GlcNAc2 formadas, se foram de facto formadas in vivo, são a isoforma correcta que será um substrato produtivo para posterior modificação do N-glicano por GlcNAc transferase I (Maras et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249:701-707).

Com o objectivo de proporcionar uma glicoproteína mais semelhante à glicoproteína do ser humano derivada de um hospedeiro fúngico, a patente norte-americana n° 5,834,251 revela um método para a produção de uma glicoproteína híbrida, derivada de Trichoderma reesei. Um N-glicano híbrido só tem resíduos de manose no braço manal-6 do núcleo e uma ou duas antenas complexas no braço mana 1-3. 17

Embora esta estrutura tenha utilidade, o método tem a desvantagem da necessidade de execução de numerosas etapas enzimáticas in vitro, o que é dispendioso e moroso. As enzimas isoladas têm uma preparação dispendiosa e necessitam de substratos caros (por exemplo UDP-GlcNAc) Este método também não permite a produção de glicanos complexos da proteína desejada.

Actividade manosidase intracelular envolvida no encurtamento de N-glicano A actividade alfa-1,2-manosidase é necessária para o encurtamento de Man8GlcNAc2, para se obter Man5GlcNAc2, um intermediário importante para a formação de N-glicano complexo em mamíferos. Trabalhos anteriores revelam que a-1,2-manosidase truncada de murino, fúngica e humana pode ser expressa na levedura metilotrópica P.pastoris e exibem actividade de encurtamento Man8GlcNAc2 para Man5GlcNAc2 (Lai et al. (1998) Glycobiology 8 (10) : 981-95; Tremblay et al. (1998) Glycobiology 8 (6):585-95, Callewaert et al. (2001) FEBS Lett. 503(2-3):173-8). No entanto, até à data, não existem relatórios que revelem o elevado nível de encurtamento in vivo de Man8GlcNAc2 em Man5GlcNAc2 numa glicoproteína segregada a partir de P.pastoris.

Além disso, a simples presença de uma a-1,2-manosidase na célula não garante, em si, um encurtamento intracelular adequado de Man8GlcNAc2 em Man5GlcNAc2. (vide, por exemplo, Contreras et al. WO 02/00856 A2, onde uma manosidase com marcação HDEL de T.reesei está localizada primariamente no RE e é co-expressa com uma proteína relatora de influenza hemaglutinina (HA), na qual não foi possível detectar virtualmente Man5GlcNAc2 nenhum. Vide também Chiba et al. 18 (1998) J. Biol. Chem. 273 (41): 26298-26304, em que uma fusão do domínio transmembranar quimérico a-1,2-manosidase, localizada no RE, Golgi cis e citosol de S.cerevisiae não tinham actividade de encurtamento da manosidase) . Assim, a simples localização de uma manosidase no RE ou Golgi é insuficiente para garantir actividade da respectiva enzima nesse organelo alvo. (vide também Martinet et al. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, demonstrando que a-1,2-manosidase a partir de T.reesei, enquanto localiza intracelularmente, aumentou em vez de diminuir a extensão da manosilação). Actualmente, não há qualquer relatório que demonstre a localização intracelular de uma a-1,2-manosidase heteróloga activa, seja numa levedura ou num fungo utilizando uma sequência de localização transmembranar.

Enquanto é útil modificar geneticamente estirpes capazes de produzir Man5GlcNAc2 como a estrutura N-glicano principal, qualquer tentativa de modificar mais profundamente estas estruturas precursoras com elevado teor de manose, para se assemelharem mais aos glicanos humanos, exige fases adicionais in vivo ou in vitro adicionais. Os métodos para humanizar ainda mais glicanos a partir de fontes fúngicas e leveduras in vitro são descritos na patente norte-americana n° 5,834,251 (supra). Caso se pretenda humanizar mais profundamente Man5GlcNAc2 in vivo, é necessário garantir que as estruturas Man5GlcNAc2 geradas são, de facto, geradas intracelularmente e não o produto da actividade de manosidase no meio. A formação de N-glicano complexo em levedura ou fungos irá exigir a geração de elevados níveis de Man5GlcNAc2 dentro da célula, porque apenas os glicanos Man5GlcNAc2 intracelulares podem continuar a ser 19 transformados em híbridos e N-glicanos complexos ín vivo. Além disso, é necessário demonstrar que a maioria das estruturas Man5GlcNAc2 geradas são, de facto um substrato para GnTI, permitindo assim a formação de N-glicanos híbridos e complexos.

Assim, existe a falta de métodos para produzir glicoproteínas, caracterizadas por um elevado teor de Man5GlcNAc2 intracelular, que pode ser ainda processado em estruturas glicoproteína semelhantes às humanas em células hospedeiras eucariotas não-humanas e particularmente em leveduras e fungos filamentosos. N-Acetilglucosaminiltransferases

As N-Acetilglucosaminiltransferases ("GnTs") pertencem a otura classe de enzimas de glicosilaçâo que modificam oligossacáridos N-ligados na via secretória. Estas glicosiltransferases catalizam a transferência de monossacáridos a partir de dadores nucleótidos de açúcar específicos para a posição hidroxilo particular de um monossacárido numa cadeia glicano crescente em uma ou dias ligações anoméricas possíveis (seja α ou 13). Dennis et al. (1999) Bioessays 21(5):412-21. GnTs específicos adicionam N-acetilglucosamina ("GlcNAc") para o braço Manai,6 ou o braço Manai,3 de um substrato N-glicano (por exemplo Man5GlcNAc2 ("núcleo manose-5") e Man3GlcNAc2 (uma "estrutura "core" interna") . 0 produto da reacção (por exemplo GlcNAcMan5GlcNAc2 ou GlcNAc2Man3GlcNAc2) pode então ser modificado em estruturas oligossacárido N-ligadas biantenárias, triantenárias, tetraantenárias e pentaantenárias. 20 N-acetilglucosaminiltransferase em (GnTIII") é uma enzima que catalisa a adição de uma GlcNAc na manose média do núcleo trimanose (Manai,6 (Manai,3) Manpi,4 - GlcNAcpi,4 -GlcNAcpl,4 - Asn) de um oligossacárido N-ligado. A adição por GnTIII de um GlcNAc bissectante a um substrato aceitador (por exemplo um "core" de trimanose) produz o designado N-glicano bissectado. Por exemplo, a adição por GnTIII de um GlcNAc bissectante à estrutura GlcNAcMan3GlcNAc2 poderá produzir um N-glicano bissectado, GlcNAc2Man3GlcNAc2. De modo semelhante, a adição por GnTIII de um GlcNAc bissectante à estrutura GlcNAc2Man3GlcNAc2 produz outro N-glicano bissectado, GlcNAc3Man3GlcNAc2. Esta última estrutura tem sido implicada em importante citotoxicidade celular dependente de anticorpos (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC).

Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-80. Outros N-glicanos bissectados podem ser formados por meio da acçâo de GnTIII. Por exemplo, GlcNAcMan4GlcNAc2 pode ser convertido em GlcNAc2Man4GlcNAc2 bissectado, MansGlcNAc2 pode ser convertido em GlcNAcMan5GlcNAc2 bissectado e GlcNAcMan5GlcNAc2 pode ser convertido em GlcNAc2Man5GlcNAc2 bissectado. Vide, por exemplo, Narasimhan (1982) J. Biol. Chem. 257:10235-42. Até agora só foi demonstrada actividade GnTIII em células de mamífero. A re-modificação genética das glicoformas de imunoglobulinas expressas por células de mamífero é uma tarefa entediante e penosa. Especialmente no caso de GnTIII, em que a sobreexpressão desta enzima tem sido implicada na inibição do crescimento, tiveram de ser empregues métodos que envolvem expressão genética regulada (induzível) para produzir imunoglobulinas com N-glicanos bissectados. Umana et al. (1999) Biotechnol Bioeng. 21 65(5):542-9; Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-80; Umana et al. WO 03/011878; patente norte-americana n° 6 602 684. Este efeito de inibição do crescimento complica a capacidade de co-expressar a proteina alvo e GnTIII e pode impor um limite máximo à sobreexpressão de GnTIII. Patente norte-americana n° 6,602,684. Poderá ser necessária uma cuidadosa optimização dos niveis de expressão de GnTIII. Id. Como anteriormente descrito, no entanto, o desenvolvimento das células hospedeiras eucariotas inferiores, utilizadas num sistema de produção de proteínas deste género, implica que as vias de glicosilação endógenas das células hospedeiras sejam modificadas mais profundamente.

As enzimas GnTlV, GnTV e GnTlX expressas em células de mamífero são conhecidas por catalizarem a transferência de resíduos GlcNAc em conformação particular para substratos oligossacárido, produzindo estruturas glicano multiantenárias. UDP-N-acetilglucosamina:al,3-D-manótidopl,4-N-acetilglucosaminil-transferase (GnTIV; EC 2.4.1.145) cataliza a transferência de GlcNAc a partir de UDP-GlcNAc em resíduos na ligação pl, 4 ao al,3-D-manótido em GlcNAcpl-2Manal-6 (GlcNAcpl-2Manal-3)Manal-4GlcNAcpi-4GlcNAcpi-Asn (Gleeson e Schachter, J Biol Chem. 1983 Maio 25,-258 (10):6162-73,- Schachter et al., (1989) Methods Enzymol., 179, 351-397). UDP-N-acetilglucosamina:a-6-D-manótido βΐ,6-N-acetilglucosaminiltransferase (GnTVI; EC 4.1.155) cataliza a adição de uma N-acetilglucosamina ao núcleo al,6 manosilo numa ligação β1,6, formando N-glicanos triantenários e tetraantenários.

De modo semelhante, a expressão de GnTVI em células de aves cataliza a transferência de resíduos GlcNAc em substratos 22 oligossacárido. Especificamente UDP N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) :GlcNAcpl-6(GlcNAc β1 — 2)Manal-R[GlcNAc para Man] β,4-N-acetilglucosaminilbansferase VI(GnTVI) cataliza a formação de N-glicanos pentaantenários (Sakamoto et al., J. Biol. Chem. 2000 Nov 17; 275 (46) : 36029-34) . O GnTVI codificador do gene foi purificado e isolado recentemente. Taniguchi et al., JP2002209587A2. Só recentemente foram sintetizados em hospedeiros fúngicos os substratos necessários para produzir estruturas multiantenárias complexas (Hamilton et al., Science. 2003 Aug 29; 301 (5637): 1244-6). As células de mamifero produzem tipicamente uma série de glicanos cokmplexos, tal como glicoformas biantenárias, triantenárias, tetraantenárias e mesmo pentaantenárias através de reacção sequencial de GnTs específicos. No aparelho de Golgi destas células o processamento N-glicano das glicoproteínas produz predominantemente estruturas biantenárias, para além da formação de estruturas triantenárias e tetraantenárias. Actualmente, pressupõe-se que na formação de glicanos complexos, GnTs específicos catalizam ligações β-GlcNAc específicas (por exemplo β1,2;β1,4;β1,6), produzindo glicanos multiantenários em células de mamífero. No entanto, estas células são incapazes de produzir uma glicoforma homogénea sequer com alto rendimento. Só recentemente foram modificados geneticamente eucariotas inferiores para produzir glicanos complexos em formas homogéneas a níveis significativos (Hamilton et al., Science. 2003 Ago 29;301 (5637): 1244-6). A capacidade para produzir glicanos complexos multiantenários em eucariotas inferiores proporcionaria grandes quantidades de proteínas adequadamente enroladas e glicosiladas a uma escala 23 industrial, a baixos custos, com maior rapidez, maior segurança e qualidade. Por conseguinte, necessita-se de um sistema de produção de proteínas utilizando a capacida de inerente de titulos de produto robustos, tal como os produzidos em células hospedeiras eucariotas inferiores (por exemplo leveduras e fungos filamentosos), capaz de produzir glicanos N-ligados multiantenários (e opcionalmente bissectados) em proteínas, especialmente proteínas terapêuticas, expressas nestas células.

RESUMO DA INVENÇÃO

Foram desenvolvidas células hospedeiras e linhas de células com vias de glicosilação geneticamente modificadas, que lhes permitem executar uma sequência de reacções enzimáticas, as quais simulam o processamento de glicoproteínas em mamíferos, especialmente em seres humanos. As proteínas recombinantes expressas nestes hospedeiros modificados fornecem glicoproteínas mais semelhantes, quando não substancialmente idênticas, aos seus equivalentes mamíferos, por exemplo, humanos. As células hospedeiras da presente invenção, por exemplo células hospedeiras multicelulares fúngicas, desenvolvidas em cultura, são modificadas para produzir N-glicanos, tal como N-glicanos bissectados ou outras estruturas produzidas pelas vias de glicosilação humanas. Este resultado é atingido utilizando uma combinação de modificação genética e/ou selecção de estirpes que, por exemplo, não expressam enzimas que criam as estruturas indesejadas, características das glicoproteínas fúngicas e que, por exemplo, expressam enzimas heterólogas capazes de produzir uma glicoproteína "semelhante à do ser humano". 24 A presente invenção proporciona assim um método de produção de glicoproteínas, utilizando um hospedeiro eucariota inferior, tal como um fungo unicelular ou filamentoso com um padrão de glicosilação diferente do humano, para modificar a composição e estruturas de glicosilação das proteínas produzidas num organismo hospedeiro ("célula hospedeira"), de forma que se assemelham mais às estruturas hidrato de carbono encontradas me mamíferos, por exemplo seres humanos. 0 processo permite obter uma célula hospedeira geneticamente modificada, que pode ser utilizada para expressar e marcar qualquer/quaisquer gene(s) desejável/desejáveis, por exemplo um gene envolvido na glicosilação, por meio de métodos bem estabelecidos na literatura científica e conhecidos em geral dos peritos na área da expressão de proteínas. São criadas ou seleccionadas as células hospedeiras com oligossacáridos modificados. Para a produção de proteínas terapêuticas, este método pode ser adaptado de forma a modificar linhas de células, obtendo-se qualquer estrutura de glicosilação desejada.

Em conformidade, numa concretização, a presente invenção proporciona métodos de preparação de uma glicoproteína semelhante à humana nuam célula hospedeira da presente invenção, por meio da introdução na célula de uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III. Numa concretização preferida, a actividade N-acetilglucosaminiltransferase III é expressa na célula hospedeira da presente invenção e numa concretização ainda mais preferida, esta expressão resulta na produção de N-glicanos compreendendo estruturas bissectadas GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAC2 ou GlcNAc2Man5GlcNAc2. 25

Noutra concretização preferida, a actividade N-acetilglucosaminiltransferase III é substancialmente intracelular. Noutra concretização preferida da presente invenção, a glicoproteina que inclui os N-glicanos com estruturas bissectadas é isolada da célula hospedeira eucariota inferior. Numa concretização ainda mais preferida, a glicoproteina produzida na célula hospedeira é uma proteína terapêutica.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira eucariota inferior que inclui tanto uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III como uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase II. Numa concretização preferida, a célula hospedeira que inclui a actividade N-acetilglucosaminiltransferase III produz N-glicanos compreendendo estruturas GlcNAcMan3GlcNAc2, capazes de reagir com esta actividade. Numa concretização mais preferida, a actividade produz um glicano bissectado. A célula hospedeira eucariota inferior de algumas concretizações da presente invenção inclui assim um N-glicano com um glicano bissectado. Numa concretização preferida, o N-glicano inclui mais de 10 % em mole do glicano bissectado. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira inclui um N-glicano que compreende estruturas bissectadas GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 ou GlcNAc2Man5GlcNAc2. Numa concretização preferida, a célula hospedeira inclui uma estrutura "core" MansGlcNAc2 ou uma estrutura "core" Man3GlcNAc2 que é modificada por um GlcNAc bissectante. Numa concretização ainda mais preferida, a célula produz mais de 10 % em mole da estrutura modificada.

Noutra concretização da presente invenção, a célula hospedeira eucariota inferior contém uma actividade N- 26 acetilglucosaminiltransferase I para além da actividade N-acetilglucosaminiltransferase III. Numa forma de concretização preferida, as actividades são substancialmente intracelulares. Noutra concretização preferida, a célula produz N-glicanos compreendendo GlcNAcMan3GlcNAc2 que são capazes de reagir com a actividade GnTIII. Numa concretização ainda mais preferida, a actividade GnTIII da célula produz um glicano bissectado.

Noutra concretização, a célula hospedeira eucariota inferior da presente invenção contém tanto uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III como uma actividade III e actividade manosidase II. Numa concretização preferida, a célula hospedeira contém ainda uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase I. Noutra concretização preferida, a célula hospedeira contém ainda uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase II. Noutra concretização preferida, a célula hospedeira contém ainda uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase I e uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase II. A presente invenção proporciona também métodos de preparação de uma glicoproteina semelhante à humana numa célula hospedeira eucariota inferior por meio da introdução na célula de um ácido nucleico codificador do dominio catalítico da N-acetilglucosaminiltransferase IV exógeno GnT IVB (A 104-53) humano, fundido a nucleótidos 1-108 do gene MNN2 de S.cerevisiae, actuando como sinal de marcação celular normalmente não associado ao dominio catalítico. Numa concretização preferida, a actividade N-acetilglucosaminiltransferase VI de GnT IVB (A 104-53) é expressa na célula e, numa concretização ainda mais preferida, esta expressão resulta na produção de N-glicanos 27 compreendendo a estrutura GlcNAc3Man3GlcNAC2. Noutra concretização preferida, a actividade N-acetilglucosaminiltransferase VI de GnT IVB (A 104-53) é substancialmente intracelular. Noutra concretização preferida da presente invenção, a glicoproteína que inclui os N-glicanos com estruturas triantenárias é isolada da célula hospedeira eucariota inferior. Numa concretização mais preferida, o N-glicano inclui mais de 90 % em mole do glicano triantenular. Numa concretização ainda mais preferida, a glicoproteína produzida na célula hospedeira é uma proteína terapêutica.

Deste modo, noutro aspecto a presente invenção proporciona uma célula hospedeira eucariota inferior que inclui tanto uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase IV como uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase V. Numa concretização preferida, a célula hospedeira que inclui as actividades N-acetilglucosaminiltransferase IV e V produz N-glicanos compreendendo estruturas GlcNAc4Man3GlcNAc2. Numa concretização mais preferida, a actividade produz um glicano tetraantenular. A célula hospedeira eucariota inferior de algumas concretizações da presente invenção pode incluir assim um N-glicano com um glicano tetraantenular. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira inclui um N-glicano que compreende estruturas GlcNAc3Man3GlcNAc2, e GlcNAc4Man3GlcNAc2. Numa concretização preferida, a célula hospedeira inclui uma estrutura "core" GlcNAcMan5GlcNAc2 que é modificada pela GnT IV mencionada ou uma estrutura "core" GlcNAc2Man3GlcNAc2 que é modificada pela GnT IV e GnT V mencionada. Numa concretização preferida, o N-glicano inclui mais de 70 % em mole do tetraantenular bissectado. Numa concretização ainda mais 28 preferida, a célula produz mais de 75 % em mole de glicanos tetraantenários. É também descrita uma célula hospedeira eucariota inferior que inclui uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase VI. A célula hospedeira descrita, que expressa a actividade N-acetilglucosaminiltransferase VI produz N-glicanos compreendendo estruturas GlcNAc5Man3GlcNAc2 (por exemplo glicanos pentaantenários) . As célula hospedeira unicelular ou multicelular descrita inclui assim um N-glicano com um glicano pentaantenular. Nalgumas concretizações, a célula hospedeira inclui um N-glicano que compreende estruturas GlcNAc5Man3GlcNAc2. Tal como descrito, a célula hospedeira inclui uma estrutura "core" GlcNAc2Man3GlcNAc2 que é modificada por uma GnT VI. São também descritos métodos de preparação de glicoproteinas humanas num hospedeiro fúngico unicelular ou multicelular, por meio da introdução na célula de uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase IX. Como descrito, a actividade N-acetilglucosaminiltransferase IX é expressa na célula e esta expressão resulta na produção de N-glicanos compreendendo estruturas GicNAc3Man3GlcNAc2 e GlcNAc4Man3GlcNAc2. Como descrito, a actividade N-acetilglucosaminiltransferase IX é substancialmente intracelular. Noutra concretização preferida da presente invenção, a glicoproteina que inclui os N-glicanos com estruturas multiantenárias é isolada da célula hospedeira fúngica unicelular ou multuicelular. Numa concretização ainda mais preferida, a glicoproteina produzida na célula hospedeira é uma proteína terapêutica. Noutra concretização da presente invenção, a célula hospedeira unicelular ou multicelular contém ainda uma actividade N- 29 acetilglucosaminiltransferase I e uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase II. Numa forma de concretização preferida, as actividades são substancialmente intracelulares. Noutra concretização preferida, a célula produz N-glicanos compreendendo GlcNAc2Man3GlcNAc2 que são capazes de reagir com a actividade GnTIV, produzindo glicanos triantenários. Numa concretização ainda mais preferida, a actividade GnTIV da célula produz um glicano tetraantenular.

Noutra concretização, a célula hospedeira eucariota inferior da presente invenção contém tanto uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase IV como uma actividade manosidase II. Numa concretização preferida, a célula hospedeira contém ainda uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase I. Noutra concretização preferida, a célula hospedeira contém ainda uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase II. Noutra concretização preferida, a célula hospedeira contém ainda uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase V.

Em certas concretizações preferidas, a célula hospedeira da presente invenção é deficiente numa actividade manosiltransferase 0CH1. Uma célula destas pode, por exemplo, ser deficiente numa actividade manosiltransferase Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol. Ainda noutra concretização, a célula hospedeira da invenção pode ainda incluir uma actividade a-1,2-manosidase I. Ainda noutra concretização, a célula hospedeira pode ainda incluir um transportador nucleótido de açúcar. De preferência, a célula hospedeira inclui um transportador UDP-GlcNAc, em que a transferência de resíduos GlcNAc é facilitada por qualquer uma das 30 actividades de N-acetilglucosaminiltransferase anteriormente mencionadas. A presente invenção proporciona também glicoproteinas preparadas pelo processo da invenção. Numa concretização, a glicoproteina inclui um GlcNAc bissectante numa estrutura "core" Man5GlcNAc2 ou Man3GlcNAc2 e é produzida numa célula hospedeira eucariota inferior. Noutra concretização, a glicoproteina inclui um GlcNAc bissectante ligado a uma estrutura "core" Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GicNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2 ou uma estrutura "core" GlcNAc2Man3GlcNAc2 e é produzida numa célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular. Numa concretização preferida, mais de 10 % em mole das estruturas nucleares da glicoproteina da invenção são modificadas bissectando GlcNAc.

Ainda noutra concretização, a presente invenção proporciona uma glicoproteina que inclui uma estrutura triantenular, tal como GlcNAc3Man3GicNAc2 e é produzida numa célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular. Numa concretização preferida, mais de 90 % em mole das estruturas nucleares da glicoproteina da invenção são modificadas pelo GnTIV da invenção. Noutra concretização, a glicoproteina inclui uma estrutura tetraantenular, tal como GlcNAc4Man3GlcNAc2 e é produzida numa célula hospedeira eucariota inferior. Numa concretização mais preferida, mais de 75 % em mole das estruturas nucleares da glicoproteina da invenção são modificadas pelo GnTIV da invenção.

Noutro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que contêm as glicoproteinas semelhantes às do ser humano, produzidas numa célula hospedeira eucariota 31 inferior. São também descritos vectores codificadores de proteínas com uma ou mais do que uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III, IV, V, VI e IX e contendo sequências de peptídeo de marcação ligadas. Numa concretização preferida as proteínas codificadas pelos vectores estão localizadas numa célula hospedeira fúngica, de forma que produzem N-glicanos com estruturas bissectadae e/ou multiantenárias. A presente invenção é também definida pelas reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura IA é um diagrama esquemático de uma via de N- glicosilação humana típica. A figura 1B é um diagrama esquemático de uma via de N- glicosilação humana típica.

A figura 2 descreve a construção de uma biblioteca de ADN combinatória de construções de fusão. A figura 2A

esquematiza a inserção de um fragmento de peptídeo de marcação em pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A figura 2B mostra a sub-biblioteca do peptídeo de marcação gerada, com sítios de restrição Notl - Ascl. A figura 2C é um diagrama da inserção de uma região domínio catalítico em pJN347, um vector pUC19 modificado. A figura 2D mostra a sub-biblioteca do domínio catalítico gerado com os sítios de restrição Notl, Ascl and FacL. A figura 2E descreve uma construção de fusão particular, gerada a partir da sub-biblioteca do peptídeo de marcação e sub-biblioteca do domínio catalítico. 32 A figura 3 ilustra a sequência de ácidos nucleicos de grelha de leitura aberta a-1,2-manosidase IA de M.musculus (SEQ ID NO:48) e sequência de polipeptideo codificada (SEQ ID NO:49). As sequências dos iniciadores PCR utilizadas para gerar truncagens N-terminais são sublinhadas. A figura 4 ilustra a modificação genética de vectores com marcadores auxotrópicos múltiplos e integração genetica de proteínas alvo no locus 0CH1 de P.pastoris.

As figuras 5A-5E mostram a análise MALDI-TOF que demonstra a produção do domínio 3 kringle de glicoproteínas de plasminogénio humano (K3) com MansGlcNAc2 como estrutura N-glicano predominante em P.pastoris. A figura 5A descreve o glicano [a] MansGlcNAc2 padrão (Glyko, Novato, CA) e Man5GlcNAc2 + Na+ [b] . A figura 5B mostra glicanos libertados por PNGase a partir de K3 de tipo selvagem. Os N-glicanos apresentados são os seguintes: Man9GlcNAc2 [d]; Mani0GlcNAc2 [e] ; MannGlcNAc2 [f] ; Mani2GlcNAc2 [g] . A figura 5C descreve a eliminação 0CH1 resultando na produção de Man8GlcNAc2 [c] como N-glicano predominante. As figuras 5D e 5E revelam a produção de Man5GlcNAc2 [b] após encurtamento in vivo de Man8GlcNAc2 com uma a-1,2-manosidase quimérica. 0 N-glicano predominante está indicado por um pico com uma massa (m/z) de 1253 consistente com a sua identificação como Man5GlcNAc2 [b] .

As figuras 6A-6F mostram a análise MALDI-TOF que demonstra a produção de glicoproteínas IFN-β com MansGlcNAc2 como estrutura N-glicano predominante em P.pastoris. A figura 6A mostra o Man5GlcNAc2 padrão [a] e Man5GlcNAc2 + Na+ [b] como o padrão (Glyko, Novato, CA) . A figura 6B mostra glicanos libertados por PNGase a partir de IFN-β de tipo selvagem. A 33 figura 6C descreve o Man8GlcNAc2 produtor de knock-out 0CH1 [c] ; Man9GlcNAc2 [d]; Mani0GlcNAc2 [e] ; MannGlcNAc2 [ f ] ; Mani2GlcNAc2 [g] e sem produção de Man5GlcNAc2 [b] . A figura 6D mostra uma quantidade relativamente pequena de Man5GlcNAc2 [b] entre outros N-glicanos intermediários Man8GlcNAc2 [c] a Mani2GlcNAc2 [g] . A figura 6E revela uma quantidade significativa de Man5GlcNAc2 [b] relativamente aos outros glicanos Man8GlcNAc2 [c] e Man9GlcNAc2 [d], produzidos por pGC5 (Saccharomyces MNS/(m)/manosidase IB 499 de ratinho). A figura 6F mostra a produção predominante de Man5GlcNAc2 [b] na glicoproteina IFN-β segregada pro pFB8 (Saccharomyces SEC12/(m)/manosidase IB 4187 de ratinho) . 0 N-glicano está indicado por um pico com uma massa (m/z) de 1254 consistente com a sua identificação como Man5GlcNAc2 [b]. A figura 7 mostra um cromatograma liquido de elevado rendimento para: (A) Man9GlcNAc2 padrão rotulado com 2-AB (controlo negativo); (B) sobrenadante do meio P.pastoris,

Alochl transformado com pFB8 manosidase, que demonstra uma ausência de actividade manosidase extracelular no sobrenadante e (C) Man9GlcNAc2 padrão rotulado com 2-AB após exposição a manosidase de T.reesei (controlo positivo). A figura 8 mostra um cromatograma líquido de elevado rendimento para: (A) Man9GlcNAc2 padrão marcado com 2-AB (controlo negativo); (B) sobrenadante do meio P.pastoris,

Alochl transformado com pGC5 manosidase, que demonstra uma ausência de actividade manosidase extracelular no sobrenadante e (C) Man9GlcNAc2 padrão rotulado com 2-AB 34 após exposição a manosidase de T.reesei (controlo positivo). A figura 9 mostra um cromatograma liquido de elevado rendimento para: (A) Man9GlcNAc2 padrão rotulado com 2-AB (controlo negativo); (B) sobrenadante do meio P.pastoris,

Alochl transformado com pBC18-5 manosidase, que demonstra uma ausência de actividade manosidase extracelular no sobrenadante e (C) sobrenadante do meio P.pastoris, Alochl transformado com pDD28-3 que demonstra actividade no sobrenadante (controlo positivo).

Figuras 10A - 10B demonstram a actividade de um transportador UDP-GlcNAc na produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 em P.pastoris. A figura 10A descreve uma estirpe P.pastoris (YSH-3) com GnTI humano mas sem o transportador UDP-GlcNAc, resultando nalguma produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] mas numa produção predominante de Man5GlcNAc2 [a] . A figura 10B descreve a adição de transportador UDP-GlcNAc de K.lactis a uma estirpe (PBP-3) com o GnTI humano, que resultou na produção predominante de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] . 0 único pico proeminente da massa (m/z) a 1457 é consistente com a sua identificação como GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] , como se mostra na figura 10B. A figura 11 mostra um pH óptimo da enzima manosidase heteróloga codificada por pBB27-2 (manosidase de

Saccharomyces MNN10 (s)lC. elegans IB 431) expressa em P.pastoris.

As figuras 12A-12C mostram a análise MALDI-TOF de N-glicanos libertados de um extracto isento de células de K.lactis. A figura 12A mostra os N-glicanos libertados de células tipo selvagem, que incluem os N-glicanos de tipo de 35 alto teor de manose. A figura 12B mostra os N-glicanos libertados de células eliminadas och 1 mnn 1, revelando um pico distinto de massa (m/z) a 1908, consistente com a sua identificação como Man9GlcNAc2 [d] A figura 12C mostra os N-glicanos libertados de células eliminadas ochl mnnl após digestão com a-1,2-manosidase in vitro, correspondendo ao pico consistente com Man5GlcNAc2. A figura 13 é um esquema da estrutura do oligossacárido ligado a pirofosfato doliquil. A figura 14 é um esquema da geração de N-glicanos GlcNAc2Man3GlcNAc2 de células hospedeiras fúngicas que são deficientes nas actividades alg3, alg9 ou algl2. A figura 15 é um esquema das reacções de processamento necessárias para produzir estruturas oligossacárido de tipo mamífero numa célula hospedeira fúngica com um genotipo alg3, och.

Figura 16 mostra comparações da sequência S.cerevisiae (Blast) (SEQ ID Nos: 9 a 20, respectivamente, por ordem de aparecimento). A figura 17 mostra sequências S.cerevisiae ALG3 (SEQ ID NO:21) e Alg3p (SEQ ID NO:22) A figura 18 mostra sequências P. pastoris ALG3 (SEQ ID NO:23) e Alg3p (SEQ ID NO:24)

Figura 19 mostra comparações da sequência S.cerevisiae (Blast) (SEQ ID Nos: 9 a 31, respectivamente, por ordem de aparecimento). A figura 20 mostra sequências K. lactis ALG3 (SEQ ID NO:33) e Alg3p (SEQ ID NO:34) 36

Figura 21 mostra comparações da sequência K. lactis (Blast) (SEQ ID Nos: 35 a 40, respectivamente, por ordem de aparecimento). A figura 22 mostra um modelo de uma imunoglobulina IgG. Com base em estruturas secundárias e terciárias semelhantes, a cadeia pesada e a cadeia leve pode ser subdividida em domínios. As duas cadeias pesadas (domíniod VH, CHI, CH2 e CH3) são ligadas por três pontes dissulfureto. As cadeias leves (domínios VL e CL9 são ligadas por outra ponte dissulfureto à porção CHI da cadeia pesada e, em conjunto com os fragmentos CHI e VH constituem a região Fab. Os antigénios ligao à porção terminal da região Fab. Têm sido localizadas funções efector, tal como ligação receptor Fc-gama, no domínio CH2, logo a jusante da região charneira e são influenciadas pro N-glicosilação da asparagina 297 na cadeia pesada. A figura 23 é uma perspectiva esquemática de um vector de expressão IgGl modular. A figura 24 mostra sequências do ácido nucleico (SEQ ID NO:45) e aminoácido (SEQ ID NO:46) de GnTIII de M. musculus A figura 25 (topo) é uma análise de MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteína Kringle 3 produzida num YSH-1 de P.pastoris apresentando um pico predominante a 1461 m/z, correpondendo à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d]; A figura 25 (fundo) mostra uma análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolada de uma glicoproteína kringle 3, produzida em YSH-1 de P.pastoris, transformada com manosidase D.melanogaster IIA74/S.cerevisiae MNN(2), mostrando um pico predominante a 1140 m/z, correspondendo à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] e outros picos correspondendo a 37

GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] a 1303 m /z e GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] a 1465 m/z. Esta estirpe foi designada YSH-37. A figura 26 (topo) é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 produzida num YSH-1 de P.pastoris como se mostra na fig 25 (topo); A figura 26 (fundo) mostra uma análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolada de uma glicoproteina kringle 3, expressa em células de YSH-1 de P.pastoris, transformadas com uma construção pVA53 (S. cerevísíae MNN (2) /mGnTIII) . 0 pico a 1463 m/z corresponde à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] e o pico 1666 m/z corresponde à massa de GlcNAc2Man5GlcNAc2 [a] . A figura 27 (topo) é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 produzida num YSH-1 de P.pastoris como se mostra na fig 25 (topo); A figura 27 (fundo) mostra uma análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolada de uma glicoproteina kringle 3, expressa em células de YSH-1 de P.pastoris, transformadas com uma construção pVA55 (S. cerevísíae MNN (2)/mGnTIII) . O pico a 1463 m/z corresponde à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] e o pico 1667 m/z corresponde à massa de GlcNAc2Man5GlcNAc2 [a]. A figura 28 (topo) é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 produzida num YSH-1 de P.pastoris como se mostra na fig 25 (topo); A figura 28 (fundo) mostra uma análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolada de uma glicoproteina kringle 3, expressa em células de YSH-1 de P.pastoris, transformadas com uma construção pVA51 (K.lactis GNT1 (s)/mGnTIII) . O pico a 1463 m/z corresponde à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] e o pico 1726 m/z corresponde à massa de GlcNAc2Man5GlcNAc2 [a] . 38 A figura 29 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 expressa em células num YSH-44 de P.pastoris. 0 pico predominante a 1356 m/z corresponde à massa de GicNAc2Man3GlcNAc2 [x] . A figura 30 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 expressa em células num YSH-44 de P.pastoris transformadas com uma construção pVA53 (S.cerevisiae MNN(2)/mGnTIII) . O pico a 1340 m/z corresponde à massa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x] e o pico 1542 m/z corresponde à massa de GlcNAc3Man3GlcNAc2 [y] . A figura 31 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 expressa em células num PBP6-5 de P.pastoris. O pico predominante a 1340 m/z corresponde à massa de GicNAc2Man3GlcNAc2 [x] . A figura 32 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteina kringle 3 expressa em células num PBP6-5 de P.pastoris transformadas com uma construção pVA53 (S.cerevisiae MNN2(s)/mGnTIII). O pico a 1340 m/z corresponde à massa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x] e o pico 1.543 m/z corresponde à massa de GlcNAc3Man3GlcNAc2 [y] . A figura 33 mostra um cromatograma liquido de elevado rendimento que demonstra uma ausência de actividade GnTlll extracelular (pVA53) no sobrenadante. O N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 purificado a partir de K3 expresso na estirpe PBP-3 foi adicionado a: BMMY (A); 1 mM UDP-GlcNAc (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em BMMY (B); o sobrenadante de YSH-44 transformado com pVA53 [YSH-57] (C); e o sobrenadante de YSH-57 + 1 mM UDP-GlcNAc (D).

A figura 34 mostra um cromatograma liquido de elevado rendimento que demonstra uma ausência de actividade GnTIII 39 extracelular (pVA53) no sobrenadante. 0 N-glicano GlcNAc2Man3GlcNAc2 purificado a partir de K3 expresso na estirpe YSH-44 foi adicionado a: BMMY (A); 1 mM UDP-GlcNAc (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em BMMY (B) ; e o sobrenadante de YSH-44 transformado com pVA53 [YSH-57] (C). A figura 35 é um diagrama esquemático de comparação das vias de glicosilação normais em seres humanos e P.pastoris (painel A) com uma via de glicosilação humanizada, geneticamente modificada em eucariotas inferiores (painel B) . A via geneticamente modificada representa a construção da estirpe P.pastoris PBP6-5, que se torna na estirpe P.pastoris PBP38 depois da modificação com GnTIII. A figura 36 é um diagrama esquemático que mostra a glicoforma predominantemente segregada, produzida por cada uma das estirpes de P.pastoris designadas e a modificação genética utilizada para modificar geneticamente cada uma das estirpes. A figura 37 é uma representação estrutural da transferência de um GlcNAc para o intermediário oligossacárido GlcNAcMan5GlcNAc2 produzido em glicoproteinas, numa célula hospedeira eucariota inferior, tal como catalizado por GnTIII. A figura 38 é uma representação estrutural da transferência de um GlcNAc para o intermediário oligossacárido GlcNAcMan3GlcNAc2 produzido em glicoproteinas, numa célula hospedeira eucariota inferior, tal como catalizado por GnTII e a subsequente transferência de GlcNAc para o produto dessa reacção GlcNA02Man3GlcNAC2, tal como catalizado por GnTIII. 40 A figura 39 é um diagrama esquemático que mostra a transferência de resíduos GlcNAc para intermediários oligossacárido catalizados por GnTIV, GnTV, GnTVI e GnTIX em P.pastoris. A figura 40 mostra três mapas de plasmídeo representativos

Figura 40A: pPB144 contendo um fragmento de gene codificador de GnTIV de ratinho; figura 40B: pPB140 contendo um fragmento de gene codificador de GnTIV humano e figura 40C: pPB176 contendo um fragmento de gene codificador de GnTIX de ratinho, utilizado para a tansformação num P.pastoris hospedeiro.

Figura 41 mostra o gene codificador da glicoproteína manosil (alfa-1,3-) beta-l,4-N-acetilglucosaminiltransferase, isoenzima A (MGAT4A) de Homo sapiens número de acesso NM_012214.

Figura 42 mostra o gene codificador da glicoproteína manosil (alfa-1,3-) beta-l,4-N-acetilglucosaminiltransferase, isoenzima A (MGAT4A) de Homo sapiens número de acesso NM_014275. A figura 43 mostra o gene codificador de N-acetilglucosaminiltransferase V (Mgat5) de Mus musculus número de acesso AF474154. A figura 44 mostra o gene codificador de N-acetilglucosaminiltransferase VI Gallus gallus número de acesso AB040608. A figura 45 mostra o gene codificador de N-acetilglucosaminiltransferase IX Homo sapiens número de acesso AB109185.1. 41 A figura 46 mostra o fragmento de ADN optimizado codão que codifica parte da N-acetilglucosaminiltransferase IX sem o domínio TM (443). A figura 47 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteína kringle 3 expressa em PBP43 de P.pastoris. A estirpe de levedura P.pastoris YSH-44 foi transformada com pBP144, contendo a construção de fusão S.cerevisiae MNN2 (s)/GnTIV humano. 0 pico a 1543 m/z corresponde à massa de GicNAc3Man3GlcNAc2 [y] . A figura 48 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteína kringle 3 expressa em PBP32 de P.pastoris. A estirpe de levedura P.pastoris YSH-44 foi transformada com pBP140, contendo a fusão S.cerevisiae MNN2 (s)/GnTV ratinho. 0 pico a 1.559 m/z corresponde à massa de GicNAc3Man3GlcNAc2 [y]. A figura 49 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteína kringle 3 expressa em PBP46 de P.pastoris. A estirpe de levedura P.pastoris YSH-44 foi transformada com pPB140 e pPB144. 0 pico a 1543 m/z corresponde à massa de GlcNAc3Man5GlcNAc2 [y] e o pico 1747 m/z corresponde à massa de GlcNAc4Man3GlcNAc2 [z] . A figura 50 é a análise MALDI-TOF-MS de N-glicanos isolados de uma glicoproteína kringle 3 expressa em PBP94 de P.pastoris. A estirpe de levedura P.pastoris YSH-44 foi transformada com pBP128, contendo a construção de fusão S.cerevisiae MNN2 (s)/GnTIVA de ratinho e pBP140, contendo a construção de fusão S.cerevisiae MNN2 (s)/GnTV de ratinho. O pico predominante a 1743 m/z corresponde à massa de GicNAc4Man3GlcNAc2 [z]. 42

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Excepto quando definido em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados no contexto da presente invenção terão os mesmos significados normalmente assumidos por alguém com formaçã ordinária na técnica. Além disso, excepto quando exigido o contrário pelo contexto, termos singulares incluirão o plural e os termos no plural incluirão o singular. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente executados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas neste contexto e as técnicas de bioquímica, enzimologia, biologia molecular e celular, microbiologia, genética e quimica das proteínas e dos ácidos nucleicos e hibridação descritas correspondem às que são bem conhecidas e vulgarmente utilizadas na técnica.

Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente executados de acordo com os métodos convencionais, bem conhecidos na técnica e descritos em várias referências gerais e mais específicas, que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, excepto em caso de indicação em contrário. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lane,

Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme 43

Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). As nomenclaturas utilizadas neste contexto e as técnicas de biologia molecular e celular, bioquimica das proteínas, enzimologia e química medicinal e farmacêutica descritas correspondem às que são bem conhecidas e vulgarmente utilizadas na técnica.

Pressupõe-se que os termos seguintes, excepto em caso de indicação em contrário, têm os seguintes significados:

Tal como presentemente utilizado, o termo "N-glicano" refere-se a um oligossacárido N-ligado, por exemplo um que é ligado por uma ligação asparagina-N-acetilglucosamina a um resíduo asparagina de um polipeptídeo. Os N-glicanos possuem um núcleo pentasacárido de Man3GlcNAc2 ("Man" refere-se a manose; "Glc" refere-se a glucose e "NAc" refere-se a N-acetil; GlcNAc refere-se a N-acetilglucosamina). 0 termo "núcleo trimanose" utilizado relativamente ao N-glicano, refere-se também à estrutura Man3GlcNAc2 ("Man3") 0 termo "núcleo pentamanose" ou "núcleo manose-5" ou "Man5" utilizado relativamente ao N-glicano, refere-se à estrutura Man5GlcNAc2. Os N-glicanos diferem quanto ao número de ramificações (antenas), compreendendo açúcares periféricos (por exemplo GlcNAc, fucose e ácido siálico) que estão ligados à estrutura "core" Man3. Os N-glicanos são classificados de acordo com os respectivos constituintes ramificados (por exemplo, alto teor de manose, complexo ou híbrido). 44

Um N-glicano de "alto teor de manose" possui cinco ou mais resíduos manose. Um N-glicano de tipo "complexo" possui tipicamente pelo menos um GlcNAc ligado à ramificação 1,3 manose e pelo menos um GlcNAc ligado à ramificação 1,6 manose do núcleo trimanose. N-glicanos complexos podem também possuir resíduos galactose ("Gal"), que são opcionalmente modificados com ácido siálico ou derivados ("NeuAc", em que "Neu" se refere a ácido neuramínico e "Ac" se refere a acetilo). Um N-glicano complexo possui tipicamente pelo menos uma ramificação que termina num oligossacárido, tal como, por exemplo: NeuNAc-; NeuAca2-6GaINAcal-; NeuAca2-3Gall31-3GaINAcal-; NeuAca2-3/6Gall31-4GlcNAcpl-; GlcNAcc(l -4Galpl-(apenas mucinas); Fucal-2Galf)-1-(grupo sanguíneo H). Podem ocorrer ésteres sulfato em resíduos galactose GalNAc, e GlcNAc e ésteres fosfato podem ocorrer em resíduos manose. NeuAc (Neu: ácido neuramínimo; Ac:acetil) pode ser O-acetilado ou substituído por NeuGI (ácido N-glicolilneuramínico). N-glicanos complexos podem também ter substituições intracadeia, compreendendo GlcNAc "bissectante" e fucose "core" ("Fuc") . Um N-glicano "híbrido" tem pelo menos um GlcNAc no terminal da ramificação 1,3 manose do núcleo trimanose e zero ou mais manoses na ramificação 1,6 do núcleo trimanose. 0 termo "predominante" ou "predominantemente" utilizado relativamente à produção de N-glicanos refere-se à estrutura que representa o principal pico detectado por análise dessorção ionização laser assistida por matriz-espectrometria de massa por tempo de vôo (MALDI-TOF).

As abreviaturas utilizadas são correntes na técnica, vide, por exemplo abreviaturas de açúcares acima. Outras abreviaturas comuns incluem "PNase", que se refere ao 45 peptídeo N-glucosidase F (EC 3.2.2.18); "GlcNAc Tr" ou "GnT" que se refere a enzimas N-acetilglucosaminiltransferase; "NANA" refere-se a ácido N-acetilneuramínico.

Tal como presentemente utilizado, uma "glicoproteína humanizada" ou uma "glicoproteína semelhante à humana" refere-se, alternativamente, a uma proteína com N-glicanos ligados com menos do que quatro resíduos manose e os intermediários glicoproteína sintéticos (que são também úteis e podem ser ainda mais manipulados in vitro) com pelo menos cinco resíduos manose. De preferência, as glicoproteínas produzidas de acordo com a presente invenção contêm pelo menos 30 % em mole, de preferência pelo menos 40 % em mole e mais preferencialmente 50, 60, 70, 80, 90 ou mesmo 100 % em mole de intermediário Man5GlcNAc2, pelo menos transitoriamente. Este objectivo pode ser atingido, por exemplo por meio de modificação genética de uma célula hospedeirs da presente invenção para expressar uma enzima de glicosilação "melhor" isto é mais eficiente. Por exemplo, é seleccionada uma manosidase de forma que tenha uma actividade óptima nas condições presentes no sítio na célula hospedeira, onde as proteínas são glicosiladas e é introduzida na célula hospedeira de preferência por meio de marcação da enzima a um organelo da célula hospedeira onde se deseja a actividade. O termo "enzima", quando utilizado associado à alteração da glicosilação da célula hospedeira, refere-se a uma molécula com pelo menos uma actividade enzimática e inclui enzimas completas, fragmentos cataliticamente activos, complexos quiméricos e semelhantes. Um "fragmento cataliticamente activo" de uma enzima refere-se a um polipeptídeo com um 46 nível detectável de actividade funcional (enzimática). A actividade enzimática é "substancialmente intracelular" quando se pode medir menos de 10 % da actividade enzimática fora da célula em comparação com o que é medido das células lisadas.

Uma célula hospedeira eucariota inferior, quando utilizada associada a perfis de glicosilação, refere-se a qualquer célula eucariota que normalmente produza N-glicanos contendo alto teor de manose, pretendendo-se assim incluir algumas células animais ou vegetais e, mais tipicamente, células células eucariotas inferiores, incluindo células fúngicas e álgicas unicelulares e multicelulares.

Tal como presentemente utilizado, o termo "via de secreção" refere-se à linha de montagem de várias enzimas de glicosilação a que são expostos um precursor oligossacárido ligado a lípido e um substrato N-glicano, seguindo o fluxo molecular de uma cadeia de polipeptídeos nascente a partir do citoplasma até ao retículo endoplasmático (RE) e as cisternas do aparelho de Golgi. Diz-se que as enzimas estão localizadas ao longo desta via. Uma enzima X, que actua num glicano ligado a lípido ou um N-glicano antes da enzima Y é apontada como sendo ou actuando "a montante" da enzima Y, do mesmo modo, a enzima Y é ou actua "a jusante" da enzima X. O termo "peptídeo de marcação", tal como presentemente utilizado, refere-se a sequências de nucleótidos ou de aminoácidos codificadoras de um peptídeo de sinal de marcação celular, que medeia a localização (ou retenção) de uma sequência associada a localizações sub-celulares, por exemplo os organelos. 47 0 termo "polinucleótido" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos com pelo menos 10 bases de comprimento. O termo inclui moléculas de ADN (por exemplo, cADN ou ADN genómico ou sintético) e moléculas de ARN (por exemplo, mARN ou ARN sintético), bem como análogos de ADN ou ARN contendo análogos nucleótidos não naturais, ligações internucleósidos não-nativos ou ambos. O ácido nucleico pode encontrar-se em qualquer conformação topológica. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser de cadeia simples, cadeia dupla ou cadeia tripla, quadruplexes, parcialmente de cadeia dupla, ramificados, em forma de gancho, circular ou conformação padlocked. O termo inclui formas de ADN de cadeia simples ou dupla. Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode incluir cadeias, tanto sense como antisense, de ARN, cADN, ADN genómico e formas sintéticas e polímeros mistos dos anteriores. Podem ser química ou bioquimicamente modificado ou pode conter bases nucleótido não-naturais ou derivatizadas, como poderá constatar prontamente um perito na especialidade. Estas modificações incluem, por exemplo, marcações, metilação, substituição de um ou mais do que um nucleótido natural por um análogo, modificações internucleótido, tal como ligações sem carga (por exemplo fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) ligações com carga (pex, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) fracções pendentes (por exemplo, polipeptídeos), intercaladores (por exemplo acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquiladores e ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.). São também incluídas moléculas sintéticas que simulam polinucleótidos quanto à sua capacidade de se ligar 48 a uma sequência designada através de ligação de hidrogénio e outras interacções químicas. Estas moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas em que ligações peptídeo substituem ligações fosfato na cadeia principal da molécula. Excepto no caso de indicação em contrário, um "ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:X" refere-se a um ácido nucleico, pelo menos uma porção do qual possui (i) a sequência de SEQ ID NO:X oui (ii) uma sequência complementar de SEQ ID NO:X. A escolha entre as das é ditada pelo contexto. Por exemplo, se o ácido nucleico é utilizado como sonda, a escolha entre os dois é ditada pela necessidade de a sonda ser complementar ao alvo desejado.

Um ácido nucleico ou polinucleótido "isolado" ou "substancialmente puro" (por exemplo, um ARN, ADN ou um polímero misto) é um que é substancialmente separado de outros componentes celulares que acompanham naturalmente o polinucleótido nativo na sua célula hospedeira natural, por exemplo ribosomas, polimerases e sequências genómicas às quais está naturalmente associado. 0 termo abrange um ácido nucleico ou polinucleótido que (1) foi removido do seu ambiente natural, (2) não está associado à totalidade ou uma porção de um polinucleótido no qual o "polinucleótido isolado" é encontrado na natureza (3) está ligado operacionalmente a um polinucleótido ao qual não está ligado na natureza ou (4) não ocorre na natureza. 0 termo "isolado" ou "substancialmente puro" pode também ser utilizado relativamente a isolados de ADN, recombinantes ou clonados, análogos de polinucleótidos sintetizados quimicamente ou análogos de polinucleótidos que são biologicamente sintetizados por sistemas heterólogos. 49

No entanto, "isolado" não implica necessariamente que o ácido nucleico ou polinucleótido descrito tenha sido ele próprio removido fisicamente do seu ambiente nativo. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico endógena no genoma de um organismo é considerada "isolada" se a sequência heteróloga (isto é uma sequência que não é naturalmente adjacente à esta sequência de ácido nucleico endógena) é colocada adjacente à sequência de ácido nucleico endógena, de forma que é alterada a expressão desta sequência de ácido nucleico endógena. A título de exemplo, uma sequência promotora não-nativa pode ser substituída (por exemplo, por recombinação homóloga) para o promotor nativo de um gene no genoma de uma célula humana, de forma que este gene possui um padrão de expressão alterado. Este gene tornar-se-ia agora "isolado" porque é separado de pelo menos algumas das sequências que o flanqueiam naturalmente,

Um ácido nucleico é também considerado "isolado" se contiver quaisquer modificações que não ocorrem naturalmente ao ácido nucleico correspondente num genoma. Por exemplo, uma sequência codificadora endógena é considerada "isolada" se contiver uma inserção, eliminação ou um ponto de mutação introduzido artificialmente, por exemplo, por meio de intervenção humana. Um "ácido nucleico isolado" inclui também um ácido nucleico integrado num cromossoma de uma célula hospedeira num sítio heterólogo, uma contrução de ácido nucleico presente como epissoma. Além disso, um "ácido nucleico isolado" pode ser substancialmente isento de outro material celular ou substancialmente isento de meio de cultura quando produzido por técnicas de recombinação ou substancialmente isento de 50 precursores químicos o outros químicos quando sintetizado quimicamente.

Tal como presentemente utilizado, a frase "variante degenerada" de uma sequência de ácido nucleico de referência engloba sequências de ácidos nucleicos que podem ser translacionados, de acordo com o código genético padrão, para proporcionar uma sequência de aminoácidos idêntica à translacionada da sequência de ácido nucleico de referência. O termo "identidade da sequência em percentagem" ou "idêntico", no contecto das sequências de ácido nucleico, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para máxima correspondência. O comprimento da comparação da identidade da sequência pode prolongar-se por um espaço de pelo menos cerca de nove nucleótidos, normalmente pelo menos cerca de 20 nucleótidos, mais habitualmente pelo menos cerca de 24 nucleótidos, tipicamente cerca de 28 nucleótidos, mais tipicamente pelo menos 32 nucleótidos e preferencialmente pelo menos 36 ou mais nucleótidos. Existem alguns algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade da sequência de nucleótidos. Por exemplo, sequências polinucleótidos podem ser comparadas utilizando FASTA, Gap ou Bestfit, qeu são programas em Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA fornece alinhamentos e percentagem da identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências query e search (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98). 51

Por exemplo, a percentagem de identidade da sequência entre sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada utilizando FASTA com os respectivos parâmetros por defeito (um tamanho de palavra de 6 e o factor NOPAM para a matriz de pontuação) ou utilizando Gap, com os seus parâmetros por defeito como fornecido na versão GCG 6.1. 0 termo "homologia substancial" ou "semelhança substancial", quando referindo um ácido nucleico ou respectivo fragmento, indica que, quando optimamente alinhado com inserções ou eliminações nucleótido apropriadas, com outro ácido nucleico (ou respecitva cadeia complementar) existe uma identidade da sequência nucleótido de pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente 60% das bases nucleótido, normalmente pelo menos cerca de 70%, mais habitualmente pelo menos cerca de 80%, de preferência pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleótido, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido da identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como anteriormente discutido.

Em alternativa, existe uma homologia ou semelhança substancial quando um ácido nucleico ou respectivo fragmento híbrida para outro ácido nucleico, para uma cadeia de outro ácido nucleico ou para a respectiva cadeia complementar, sob exigentes condições de hibridação. "Condições de hibridação restringentes" e "condições de lavagem restringentes", no contexto das experiências de hibridação de ácidos nucleicos dependem de vários parâmetros físicos diferentes. A hibridação de ácidos nucleicos será afectada por condições tais como concentração de sal, temperatura, solventes, composição 52 básica da espécie em hibridação, comprimento das regiões complementares e número de desemparelhamentos de base nucleótido entre os ácidos nucleicos hibridizantes, como se aperceberá rapidamente o perito na especialidade. Alguém com formação ordinária na técnica sabe como fazer variar estes parâmetros, para atingir uma restringência de hibridação particular.

Em geral, "hibridação restringente" é efectuada a cerca de 25 °C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para o híbrido de ADN específico num conjunto particular de condições. Em geral, "lavagem restringente" é efectuada a cerca de 5 °C abaixo do Tm para o híbrido de ADN específico num conjunto particular de condições. Tm é temperatura à qual 50% da sequência alvo híbrida até atingir uma sonda perfeitamente emparelhada. Vide Sambrook et al., supra, página 9.51.

Para os fins do presente documento, "condições de restringência elevada" são definidas para a hibridação em fase de solução como hibridação aquosa (isto é isenta de formamida) em 6X SSC (em que 20X SSC contém 3,0 M de NaCl e 0,3 M de citrato de sódio), 1% SDS a 65 °C durante 8 a 12 horas, seguido de duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65 °C durante 20 minutos. Um perito na especialidade poderá observar que a hibridação a 65 °C vai ocorrer a velocidades diferentes conforme um número de factores, incluindo o comprimento e percentagem de identidade das sequências em hibridação. O termo "mutado", quando aplicado a sequências de ácido nucleico, significa que os nucleótidos numa sequência de ácido nucleico específica podem ser inseridos, eliminados ou alterados em comparação com uma sequência de ácido 53 nucleico de referência. Uma única alteração pode ser feita num locus (uma mutação pontual) ou podem ser inseridos, eliminados ou alterados múltiplos nucleótidos num único locus. Além disso, uma ou mais do que uma alteração pode ser feita em qualquer número de loci na sequência de ácido nucleico. Uma sequência de ácido nucleico pode ser mutada por meio de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem se limitar a técnicas de mutagénese, tal como "error-prone PCR" (um processo de execução de PCR em condições de baixa fidelidade de cópia da polimerase de ADN, de modo que se obtém uma elevada taxa de mutaçõesp ontuais ao longo de todo o comprimento do produto PCR. Vide, por exemplo, Leung et al. (1989) Technique 1:11-15 and Caldwell and Joyce (1992) PCR Methods Applic. 2:28-33); e "mutagénese dirigida por um oligonucleótido" (processo que permite a geração de mutações específicas do sítio em qualquer segmento de ADN clonado de interesse. Vide por exemplo, Reidhaar-Olson et al. (1988) Science 241:53-57). 0 termo "vector" tal como presentemente utilizado, pretende designar uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de ADN de cadeia dupla, circular, na qual se podem ligar segmentos de ADN adicionais. Outros vectores incluem cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) e cromossomas artificiais de levedura (YAC). Outro tipo de vector é um vector virai, em que podem ser ligados segmentos adicionais de ADN ao genoma virai (discutido mais pormenorizadamente mais abaixo). Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira, na qual são introduzidos (por exemplo vectores com uma origem 54 de replicação que funciona na célula hospedeira). Outros vectores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira com a introdução na célula hospedeira, e são assiim replciados em conjunto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vectores preferidos são capazes de orientar a expressão dos genes aos quais estão ligados operacionalmente. Estes vectores são designados como "vectores de expressão recombinantes" (ou apenas "vectores de expressão").

Sequências de controlo da expressão "ligados operacionalmente" designa uma ligação em que a sequência de controlo da expressão é contígua ao gene de interesse para controlar o gene de interesse, bem como as sequências de controlo da expressão que actuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.

0 termo "sequência de controlo da expressão", tal como presentemente utilizado, designa sequências de polinucleótidos que são necessárias para afectar a expressão das sequências de codificação às quais estão ligados operacionalmente. As sequências de controlo da expressão são sequências que controlam a transcrição, eventos pós-transcicionais e translação de sequências de ácidos nucleicos. As sequências de controlo da expressão incluem sequências iniciadoras, terminais, promotoras e intensificadoras, os sinais de processamento do ARN eficientes, tal como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mARN citoplasmático; sequências que intensificam a eficiência da translação (por exemplo, sítios de ligação do ribossoma); sequências que intensifica a estabilidade da proteína e, quando desejado, sequências que intensificam a secreção da proteína. A 55 natureza destas sequências de controlo difere conforme o organismo hospedeiro. No caso dos procariotas, estas sequências de controlo incluem geralmente promotor, sitio de ligação ribossomal e a sequência de terminação da transcrição. 0 termo "sequências de controlo® pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências parceiro de fusão. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou apenas "célula hospedeira"), tal como presentemente utilizada, pretende designar uma célula na qual foi introduzido um ácido nucleico, tal como um vector recombinante. Subentende-se que estes termos não pretendem designar apenas a célula em questão particular, mas toda a descendência dessa célula. Porque podem ocorrer certas modificações nas sucessivas gerações, devido a uma mutação ou influências ambientais, esta descendência poderá, na realidade, não ser idêntica à célula progenitora, mas ainda assim ser incluída no âmbito do termo "célula hospedeira", tal como presentemente utilizado. Uma célula hospedeira pode ser uma célula isolada ou linha de células desenvolvida em cultura ou pode ser uma célula que vive em tecido ou organismo vivo. 0 termo "peptídeo", tal como presentemente utilizado, refere-se a um polipeptídeo curto, por exemplo um que tipicamente é inferior a cerca de 50 aminoácidos e mais tipicamente é inferior a cerca de 30 aminoácidos. O termo, tal como presentemente utilizado engloba análogos e miméticos que simulam a função estrutural e, portanto, biológica. 56 0 termo "polipeptídeo" tal como presentemente utilizado, engloba proteínas tanto naturais como não naturais e respectivos fragmentos, mutantes, derivados e análogos. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico. Além disso, um polipeptídeo pode incluir um conjunto de diferentes domínios, cada um dos quais possui uma ou mais do que uma actividades distintas. 0 termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isolado" é uma proteína ou polipeptídeo, devido à sua origem ou fonte de derivação (1) não está associado a componentes naturalmente associados que o acompanham no seu estado nativo (2) quando existe num grau de pureza que não se encontra na natureza, podendo a pureza ser avaliada relativamente à presença de outro material celular (por exemplo, é isento de outras proteínas da mesma espécie) (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza (por exemplo, é um fragmento de um polipeptídeo encontrado na natureza ou inclui análogos ou derivados de aminoácido não encontrados na natureza ou ligações diferentes das ligações peptídeo padrão). Deste modo, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado num sistema celular diferente da célula da qual é naturalmente originária será "isolado" dos seus componentes naturalmente associados. Um polipeptídeo ou proteína pode também ser tornado substancialmente isento de componentes naturalmente associados por meio de isolamento, utilizando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica. Tal como definido, "isolado" não implica necessariamente que a proteína, polipeptídeo, peptídeo ou oligopeptídeo descrito tenha sido ele próprio removido fisicamente do seu ambiente nativo. 57 0 termo "fragmento polipeptídeo", tal como presentemente utilizado, refere-se a um polipeptídeo que possui uma eliminação no terminal amino e/ou no terminal carboxilo, em comparação com um polipeptídeo completo. Nuam concretização preferida, o fragmento de polipeptídeo é uma sequência contígua, em que a sequência de aminoácidos do fragmento é idêntica às posições correspondentes na sequência natural. OS fragmentos têm tipicamente pelo menos 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, de preferência pelo menos 12, 14, 16 ou 18 aminoácidos, masi preferencialmente pelo menos 20 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 25, 30, 35, 40 ou 45 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 50 ou 60 aminoácidos e ainda mais preferencialmente pelo menos 70 aminoácidos.

Um "derivado modificado" designa polipeptídeos ou respectivos fragmentos que são substancialmente homólogos em sequência estrutural principal, mas que incluem, por exemplo, modificações in vivo ou in vitro químicas e bioquímicas ou que incorporam aminoácidos que não são encontrados no polipeptídeo nativo. Estas modificações incluem, por exemplo, acetilação, carboxilação, fosforilação, glicosilação, ubiquitinação, marcação, por exemplo com radionuclídeos e várias modificações enzimáticas, tal como será evidente para um perito na especialidade. Uma variedade de métodos para marcação de polipeptídeos e de substituintes ou marcações úteis para estes fins são bem conhecidos na técnica e incluem isótopos radioactivos, tal como 1251, 32P, 35S e 3H, ligandos que se ligam a antiligandos marcados (por exemplo anticorpos), fluoroforos, agentes quimioluminescentes, enzimas e antiligandos que podem servir como membros pares de ligação 58 específicos para um ligando marcado. A escolha da marcação depende da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com o iniciador, requisitos de estabilidade e instrumentação disponível. Os métodos de marcação de polipeptídeos são bem conhecidos na técnica. Vide Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 e suplementos de 2002).

Um "mutante de polipeptídeo" ou "muteína" designa um polipeptídeo cuja sequência contém uma inserção, duplicação, eliminação, rearranjo ou substituição de um ou mais do que um aminoácido em comparação com a sequência de aminoácidos de uma proteína nativa ou de tipo selvagem. Uma muteína pode ter uma ou mais do que uma substituição pontual de aminoácidos, em que um único aminoácido numa posição foi alterada para outro aminoácido, uma ou mais do que uma inserção e/ou eliminação, em que um ou mais do que um aminoácido é inserido ou eliminado, respectivamente, na sequência da proteína natural e/ou truncagens da sequência de aminoácidos em qualquer um ou em ambos os terminais amino ou carboxilo. Uma muteína pode ter a mesma actividade biológica, mas de preferência possui uma actividade biológica diferente em comparação com a proteína natural.

Uma muteína possui pelo menos 70% de homologia da sequência global com o seu equivalente de tipo selvagem. São ainda mais preferidas as muteinas com 80 %, 85% ou 90% de homologia da sequência global com a proteína de tipo selvagem. Numa concretização ainda mais preferidam uma muteína exibe uma identidade de sequência de 95%, ainda mais preferencialmente 97%, ainda mais preferencialmente 98% e ainda mais preferencialmente 99% de identidade da sequência global. A homologia da sequência pode ser medida 59 por qualquer alqorítmo de análise de sequência comum, tal como Gap ou Bestfit.

As substituições de aminoácidos preferidas são as que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos de proteínas, (4) alteram a afinidade de ligação ou a actividade enzimática e (5) conferem ou modificam outras propriedades fisico-químicas ou funcionais destes análogos.

Tal como presentemente utilizado, so vinte aminoácidos convencionais e respectivas abreviaturas respeitam o uso convencional. Vide Immunology - A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)),

Os estereoisómeros (por exemplo, agentes D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não-naturais, tal como aminoácidos ### -dissubstituídos, aminoácidos N-alilo e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para polipeptídeos da presente invenção Exemplos de aminoácidos não-convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamate, ###-W,N,N-trimetilisina, ### -N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina e outros aminoácidos e ácidos imino semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na noteção de polipeptídeos utilizada, o sentido para a esquerda é o sentido terminal amino e o sentido para a direita é o sentido terminal carboxilo, de acordo com o uso padrão e convenções. 60

Uma proteína possui "homologia" ou é "homóloga" em relação a uma segunda proteína se a sequência de áciso nucleicos que codifica possui uma sequência semelhante à sequência do ácido nucleico que codifica a segunda proteína. Em alternativa, uma proteína posui homologia em relação a uma segunda proteína se as duas proteínas possuem sequências de aminoácidos "semelhantes". (assim, o termo "proteínas homólogas" é definido para significar que duas proteínas possuem sequências de aminoácidos semelhantes) . Numa concretização preferida, uma proteína homologa é aquela que exibe uma homologia de 60% da sequência com a proteína de tipo selvagem, é mais preferida uma homologia de 70% da sequência. São ainda mais preferidas as proteínas homólogas com homologia de 80 %, 85% ou 90% da sequência com a proteína de tipo selvagem. Numa concretização ainda mais preferida, a proteína homóloga exibe 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade da sequência. Tal como presentemente utilizado, a homologia entre duas regiões de sequência de aminoácido (especialmente no que respeita semelhanças estruturais previstas) é interpretada como implicando semelhança em função.

Quando se utiliza "homólogo" relativamente a proteínas ou peptídeos, admite-se que posições residuais que não são idênticas, diferem frequentemente por substituições de aminoácidos conservadoras. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em que um resíduo aminoácido é substituído por outro resíduo aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de ácido aminado conservador não irá alterar substancialmente as propriedades funcionais de uma 61 proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservadoras, a percentagem de identidade da sequência ou grau de homologia pode ser ajustada no sentido ascendente para corrigir a natureza conservadora da substituição. Os meios de realização deste ajuste são bem conhecidas dos peritos na especialidade (vide, por exemplo, Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98).

Os seis grupos seguintes contêm cada um aminoácidoss que são substituições conservadoras uns dos outros: 1) Serina (S) , Treonina (T); 2) Aspartic Acid (D), Glutamic Acid (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) lsoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V), and 6) Fenilalanina (F), Tirosina (I), Triptofano (W). A homologia da sequência para polipeptídeos, que é também designada como percentagem de identidade da sequência, é tipicamente medida utilizando software de análise de sequência, vide por exemplo, o Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. O software de análise de proteínas emparelha sequências semelhantes utilizando medida de homologia atribuída a várias substituições e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoacidos. Por exemplo, GCG contém programas, tal como "Gap" e "Bestfit" que podem ser utilizados com parâmetros por defeito para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos próximos, tal como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de 62 organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma respectiva muteína. Vide, por exemplo, GCG, Versão 6.1.

Um algoritmo preferido para a comparação de uma sequência molecular inibidora com uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é programa de computador BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish and States (1993) Nature

Genet. 3:266-272; Madden et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids

Res.25:3389-3402; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656), especialmente blastp or tblastn (Altschul et al, 1997). Os parâmetros preferidos para BLASTp são: Valor expectativa: 10 (defeito); Filtro: seg (defeito); custo de abertura de intervalo: 11 (defeito); custo de ampliação de intervalo: 1 (defeito); alinhamentos max.: 100 (defeito); tamanho de palavra: 11 (defeito); N°. de descrições: 100 (defeito); Matriz penalizaçâo: BLOWSUM62. O comprimento das sequências de polipeptídeo comparadas para homologia terá, geralmente, pelo menos 16 resíduos de aminoácidos, normalmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais normalmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos e preferencialmente mais de cerca de 35 resíduos. No caso de uma pesquisa de uma base de dados contendo sequências de um grande número de organismos diferentes, é preferível comparar sequências de aminoácidos. A pesquisa da base de dados utilizando sequências de aminoácidos pode ser medida por algoritmos diferentes do blastp conhecido na técnica. Por exemplo, sequências de polipeptídeo podem ser comparadas utilizando FASTA, um programa em GCG, Versão 6.1. FASTA fornece alinhamentos e percentagem da identidade 63 de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências query e search (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98). Por exemplo, percentagem de identidade da sequência entre as sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando FASTA com os respectivos parâmetros por defeito (uma dimensão de palavra de 2 e a matriz de pontuação Palm250) como os proporcionados na GCG, Versão 6.1. O termo "proteina de fusão" designa um polipeptideo compreendendo um polipeptideo ou fragmento acoplado às sequências de aminoácido heterólogas. As proteínas de fusão são úteis porque podem ser construídas de forma a conterem dois ou mais elementos funcionais desejados a partir de duas ou mais proteínas diferentes. Uma proteína de fusão compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos de um polipeptideo de interesse, mais preferencialmente pelo menos 20 ou 30 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 40, 50 ou 60 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 75, 100 ou 125 aminoácidos. As proteínas de fusão podem ser produzidas de modo recombinante, construindo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptideo ou respectivo fragmento enquadrado com uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína diferente ou peptídeo e depois expressandi a proteína de fusão. Em alternativa, uma proteína de fusão pode ser produzida quimicamente, interligando o polipeptideo ou respectivo fragmento com outra proteína. O termo "região" tal como presentemente utilizado, designa uma porção fisicamente contígua da estrutura principal de uma biomolécula. No caso das proteínas, é definida uma região com uma porção contígua da sequência de aminoácido 64 dessa proteína. 0 termo "domínio" tal como presentemente utilizado, designa uma estrutura de uma biomolécula que contribui para uma função conhecida ou suspeitada da biomolécuma. Os domínos podem ser co-extensivos a regiões ou respectivas porções; os domínios podem também incluir regiões distintas, não contíguas de uma biomolécula. Exemplos de domínios de proteína incluem, sem se limitarem a, um domínio lc, um domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático.

Tal como presentemente utilizado, o termo "molécula" significa qualquer composto, incluindo mas sem se limitar a um peptídeo de molécula pequena, proteína, açúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc e este composto pode ser natural ou sintético.

Excepto quando definido em contrário, todos os temros técnicos e científicos utilizados têm um significado igual ao pressuposto por alguém com formação ordinária na técnica da presente invenção. Seguidamente serão descritos métodos e materiais de exemplo, embora, na prática da presente invenção, possam também ser utilizados os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos e serão evidentes aos peritos na especialidade.

Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá. Os materiais, métodos e exemplo são apenas ilustrativos e não se pretende que constituam limitações.

Ao longo da presente especificação e reivindicações, pressupões-se que a palavra "compreender" ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo" implique a inclusão de um número inteiro mencionado ou grupo de números inteiros, 65 mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. Método de produção de glicoproteinas semelhantes às humanas em células hospedeiras eucariotas inferiores A presente invenção proporciona métodos de produção de uma glicoproteína com glicosilação semelhante à humana numa célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular. Como descrito mais pormenorizadamente em seguida, uma célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular, que não expressa naturalmente ou que foi modificada geneticamente para não expressar uma ou mais do que uma enzima envolvida na produção de estruturas de alto teor de manose é seleccionada como célula hospedeira de partida. Esta célula hospedeira seleccionada é modificada geneticamente para expressar uma ou mais do que uma enzima ou outros factores necessários para produzir glicoproteinas semelhantes às humanas. Uma estirpe hospedeira desejada pode ser geneticamente modificada em uma enzima ou mais do que uma enzima de cada vez. Para além disso, pode ser utilizada uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma ou mais do que uma enzima ou actividades para modificar geneticamente uma estirpe hospedeira da presente invenção. De preferência, uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico codificadoras de enzimas potencialmente úteis (por exemplo enzimas quiméricas, compreendendo um fragmento de enzima cataliticamente activa ligada in-frame a uma sequência de marcação subcelular heteróloga) é criada (por exemplo, por meio de ligação de sub-bibliotecas compreendendo fragmentos enzimáticos e sequências de marcação subcelular) e uma estirpe com uma ou mais do que uma enzima com actividades óptimas ou produtoras de glicoproteinas "semelhantes às 66 humanas" podem ser seleccionadas por meio da transformação de células hospedeiras com um ou mais do que um membro da biblioteca.

Em particular, os métodos presentemente descritos permitem obter, in vivo estruturas Man5GlcNAc2 com elevado rendimento, pelo menos transitoriamente, com inestirpe de a modificar ainda mais para obter N-glicanos complexos. Um esquema de sucesso para obter estruturas Man5GlcNAc2 adequadas com rendimento apropriado numa célula hospedeira, tal como um organismo eucariota inferior, envolve geralmente duas abordagens paralelas: (1) redução de estruturas de alto teor de manose, feitas por actividades de manosiltransgerase endógenas, se houver, e (2) remoção de oí-1,2-manosidase por manosidases para render altos níveis de estruturas Man5GlcNAc2 adequadas que podem reagir ainda dentro da célula hospedeira para formar glicoformas complexas, semelhantes às humanas.

Assim, uma primeira etapa envolve a selecção ou criação de uma célula hospedeira eucariota, por exemplo um eucariota inferior capaz de produzir uma estrutura precursora específica de Man5GlcNAc2, que é capaz de aceitar GlcNAc in vivo por meio da acção de transferase I GlcNAc ("GnTI") . Numa concretização, o método envolve a preparação ou utilização de uma célula hospedeira eucariota não-humana, esgotada numa actividade 1,6-manosiltransferase no que respeita ao N-glicano numa glicoproteína. De preferência, a célula hospedeira é esgotada numa actividade 1,6-manosiltransferase inicidora (vide abaixo). Esta célula hospedeira não terá uma ou mais do que uma enzima envolvida na produção de estruturas de alto teor de manose, que são 67 indesejáveis para a produção de glicoproteinas semelhantes às humanas.

Uma ou mais do que uma actividades enzimáticas são então introduzidas numa célula hospedeira destas, para produzir N-glicanos dentro da célula hospedeira, caracterizados por ter pelo menos 30 % mol, das estruturas hidratos de carbono Man5GlcNAc2 ("Man5") . As estruturas Man5GlcNAc2 são necessárias para a formação de N-glicanos complexos: Man5GlcNAc2 deve ser formado in vivo com um elevado rendimento (por exemplo, com excedente de mais de 30 %), pelo menos transitoriamente, uma vez que todas as reacções de glicosilação, semelhantes às do mamífero e do ser humano, subsequentes exigem Man5GlcNAc2 ou seus derivados.

Esta etapa exige a formação de uma estrutura isomérica específica de Man5GlcNAc2 dentro da célula com um elevado rendimento. Embora as estruturas Man5GlcNAc2 sejam necessárias para a formação de N-glicanos complexos a sua presença não é, de modo algum, suficiente. Este facto deve-se à possibilidade de Man5GlcNAc2 ocorrer em diferentes formas isoméricas, que podem ou não servir como substrato para GlcNAc transferase I. A maioria das reacções de glicosilação não estão completas e, assim, uma proteína glicosilada mais específica contém geralmente uma gama de estruturas hidrato de carbono diferentes (isto é glicoformas) à sua superfície. Assim, a mera presença de quantidades vestigiais (inferiores a 5 %) de uma estrutura particular, como Man5GlcNAc2, reveste-se de pouca relevância prática para a produção de glicoproteinas semelhantes às de mamífero ou de ser humano. Exige-se sim a formação de um intermediário Man5GlcNAc2 aceitador de transferase I GlcNAc (figura 1B) com elevado rendimento 68 (acima de 30 %). A formação deste intermediário é necessária para permitir depois a síntese in vivo de N-glicanos complexos em proteínas glicosiladas de interesse (proteínas alvo). Assim, algum ou todo o Man5GlcNAc2 produzido pela célula hospedeira seleccionada tem de ser um substrato produtivo para as actividades enzimátivas ao longo da via e glicosilação do mamífero, por exemplo, pode servir de substrato para uma actividade transferase I GlcNAc in vivo, formando assim o intermediário GlcNAcMan5GlcNAc2 N-glicano semelhante ao humano na célula hospedeira. Numa concretização preferida, pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 30% e mais preferencialmente 50% ou mais do intermediário MansGlcNAc2 produzido na célula hospedeira da presente invenção é um substrato produtivo para GnTI in vivo. Pressupõe-se que, por exemplo GlcNAcMan5GlcNAc2 é produzido a 10% e Man5GlcNAc2 é produzido a 25% numa proteína alvo, que a quantidade total de Man5GlcNAc2 produzido transitoriamente é 35% porque GlcNAcMan5GlcNAc2 é um produto de Man5GlcNAc2.

Alguém com formação ordinária na técnica pode seleccionar células hospedeiras da natureza, por exemplo fungos ou outros eucariotas inferiores que produzam níveis dignificativos de Man5GlcNAc2 in vivo. No entanto, até agora, nenhum eucariota inferior demonstrou proporcionar estas estruturas in vivo com um excesso de 1,8 % do total de N-glicanos (Maras et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707) . Em alternativa, estas células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas para produzirem a estrutura Man5GlcNAc2 in vivo. Podem ser empregues métodos tais como os descritos na patente norte-americana 5,595,900 para identificar a ausência ou presença de glicosiltransferases, 69 manosidases e transportadores de açúcar nucleótido específicos num organismo alvo de interesse.

Inactivação de enzimas de glicosilação de células hospedeiras indesejadas

Os métodos da presente invenção são dirigidos para a preparação de células hospedeiras que produzem glicoproteínas com estruturas alteradas e de preferência semelhantes às humanas N-glicano. Numa concretização preferida, os métodos são orientados para a preparação de células hospedeiras em que os precursores oligossacáridos são enriquecidos em Man5GlcNAc2. De preferência são utilizadas células hospedeiras eucariotas que não exprimem uma ou mais enzimas envolvidas na produção de estruturas com elevado teor de manose. Uma célula hospedeira destas pode ser encontrada na natureza ou pode ser modificada geneticamente, por exemplo a partir de ou derivada de um de vários mutantes já descritos me leveduras. Assim, conforme a célula hospedeira seleccionada, terão de ser eliminados um ou vários genes que codificam enzimas conhecidas como sendo características de reacções de glicosilação não-humanas. Estes genes e respectivas proteínas correspondentes têm sido amplamente caracterizadas numa série de eucariotas inferiores (por exemplo S. cerevisiae, T. reesei, A. nidulans, etc.), fornecendo assim uma lista de glicosiltransferases em eucariotas inferiores, respectivas actividades e sequência genética respectiva. Estes genes são provavelmente seleccionados do grupo das manosiltransferases por exemplo 1,3-manosiltransferases (por exemplo MNN 1 em S. cerevisiae) (Graham e Emr, 1991 J. Cell. Biol. 1991(1,2):207-218), 1,2-manosiltransferases (por exemplo família KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6- 70 manosiltransferases (OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferases e respectivos reguladores (MNN4 e MNN6 e S. cerevisiae) e enzimas adicionais que estão envolvidas em reacções de glicosilaçâo aberrantes, isto é não humanas. Muitos destes genes foram eliminados individualmente, dando origem a fenotipos viáveis com perfis de glicosilaçâo alterados. São apresentados exemplos no quadro 1.

As células hospedeiras eucariotas inferior preferidas da presente invenção, como descrito para exemplificar as etapas de manipulação necessárias, são mutantes hipermanosilação-menos 9ochl) de Pichia pastoris ou K.lactis. Á semelhança de outros eucariotas inferiores, o P.pastoris processa estruturas Man9GlcNAc2 no RE com um a-1,2-manosidase para se obter Man8GlcNAc2 (figura IA) . Por meio da acção de várias manosiltransferases, esta estrutura é depois convertida em estruturas hipermanosiladas (Man9GlcNAc2) , também conhecida como mananos (figura 35A) . Além disso, constatou-se que P. pastoris é capaz de acrescentar grupos fosfato não-terminais por meio da acção das manosilfosfato transferases para a estrutura de hidrato de carbono. Este aspecto difere das reacções encontradas em células de mamifero, as quais envolvem a remoção de açúcares manose em vez da sua adição (figura 35A). Reveste-se de particular importância a eliminação da capacidade da célula hospedeira eucariota, por exemplo fungo para hipermanosilar a estrutura Man8GlcNAc2 existente. Este facto pode ser alcançado por meio da selecção de uma célula hospedeira que não procede à hipermanosilação ou manipulando geneticamente uma célula dessas.

Os genes que estão envolvidos processo de hipermanosilação foram identificados por exemplo no Pichia pastoris e, por 71 meio da criação de mutações nestes genes, é possível reduzir a produção de glicoformas "indesejadas". Estes genes podem ser identificados por homologia com manosiltransferases existentes ou os seus reguladores (por exemplo, 0CH1, MNN4, MNN6, MNN1), encontradas noutros eucariotas inferiores, tais como C. albicans, Píchía augusta ou S.cerevisiae ou por meio de mutagenização da estirpe hospedeira e selecção de um fenotipo com manosilação reduzida. Com base nas homologias entre as manosiltransferases e manosilfosfato transferases conhecidas, é possível conceber iniciadores PCR (cujos exemplos se encontram no quadro 2) ou utilizar genes ou fragmentos de gene codificadores das enzimas como sondas para identificar homólogos em bibliotecas de ADN do organismo alvo ou relacionado. Em alternativa, é possível identidicar um homólogo funcional com actividade manosiltransferase pela sua capacidade em complementar fenotipos de glicosilação particulares em organismos relacionados.

Iniciador PCR A Iniciador PCR B Gene(s) alvo em P.pastoris Homólogos ATGGCGAAGGCA GATGGCAGT (SEQ ID NO:3) TTAGTCCTTCCAA CTTCCTTC (SEQ ID NO:4) 1,6- nanosiltransfera se 0CH1 S. cerevisiae, Pichia albicans TAYTGGMGNGTN GARCYNGAYATH AA (SEQ ID NO: 5) GCRTCNCCCCANC KYTCRTA (SEQ ID NO:6) 1,2- nanosiltransfera se Família KTR/KRE, S. cerevisiae 72

Legenda: M = A ou C, R = A ou G, W = A ou T, S = C ou G, Y=C ou T,K=G ou T,V=A ou C ou G, H=A ou C OU T,D=A OU G OU T, B=C ou G ou T,N=G ou A ou T ou C.

Para obter o gene ou genes codificadores da actividade 1,6-manosiltransferase em P.pastoris, por exemplo, é possível executar as seguintes etapas. Mutantes 0CH1 de S. cerevisiae são termicamente sensíveis e crescem lentamente a temperaturas elevadas. Deste modo é possível identificar homólogos funcionais de 0CH1 em P.pastoris complementando um mutante 0CH1 de S. cerevisiae com uma biblioteca de ADN ou cADN de P.pastoris. Mutantes de S. cerevisiae são disponibilizados por exemplo junto da Stanford University e estão coemrcialmente disponíveis junto da ResGen, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Os mutantes que apresentam um fenotipo de crescimento normal a temperatura elevada, após terem sido transformados com uma biblioteca de ADN de P.pastoris possuem muito provavelmente um homólogo 0CH1 de P.pastoris. Uma biblioteca destas pode ser criada por meio de digestão parcial do ADN cromossómico de P.pastoris com uma enzima de restrição adequada e, após inactivação da enzima de restrição, ligação do ADN digerido a um vector adequado, o qual foi previamente digerido com uma enzima de restrição compatível.

Os vectores adequados incluem, por exemplo, pRS314, um plasmídeo com baixo número de cópias (CEN6/ARS4) baseado em pBluescript contendo o marcador Trpl (Sikorski and Hieter (1989) Genetics 122:19-27) e pFL44S, um plasmíodeo com elevado número de cópias (211μ) plasmid baseado em pUC19 modificado, contendo o marcador URA3 (Bonneaud, N., et al., 1991, Yeast 7, 609-615). Estes vectores são vulgarmente 73 utilizados pelos investigadores académicos ou estão disponíveis vectores semelhantes junto de vários diferentes vendedores, tal como Invitrogen (Carlsbad, CA) , Pharmacia (Piscataway, NJ), New England Biolabs (Beverly, MA) . Constituem exemplos pYES&GS, 2μ origem do plasmídeo de expressão de levedura baseada na replicação da Invitrogen ou veículo de clonagem Yep24 do New England Biolabs. Após ligação do ADN cromossómico e do vector, é possível transformar a biblioteca de ADN em estirpe de S. cerevisiae com uma mutação específica e seleccionar a correcção do fenotipo correspondente. Após subclonagem e sequenciação do fragmento de ADN capaz de restaurar o fenotipo de tipo selvagem, é possível utilizar este fragmento para eliminar a actividade do produto genético codificado por 0CH1 em P.pastoris, utilizando mutagénese in vivo e/ou técnicas de recombinação bem conhecidas dos peritos na especialidade.

Em alternativa, se a totalidade da sequência genómica de uma célula hospedeira específica, por exemplo fungo, de interesse é conhecida, é possível identificar estes genes apenas por meio de pesquisa das bases de dados de ADN disponíveis ao público, as quais são disponibilizadas por várias fontes, tal como NCBI, Swissprot. Por exemplo, ao pesquisar uma dada sequência genómica ou base de dados com um gene de 1,6 manosiltransferase conhecido (0CH1) de S. cerevisiae é possível identificar genes com grande homologia num genoma em que um elevado grau de de certeza codifica um gene com actividade 1,6 manosiltransferase. Apenas a homologia da sequência de ácidos nucleicos não basta para provar que se identificou e isolou um homólogo codificador de uma enzima com a mesma actividade. Até à data, por exemplo, não existem dados para mostrar que uma 74 eliminação 0CH1 em P.pastoris elimina a actividade 1,6-manosiltransferase iniciadora crucial (Martinet et al. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177; Contreras et al. WO 02/00856 A2) . Assim, dados alguns provam que o homólogo do gene OCH1 de P.pastoris codifica realmente essa função. A demonstração é apresentada no presente documento pela primeira vez.

Os homólogos de várias manosiltransferases de S.cerevisiae têm sido identificados em P.pastoris utilizando estas abordagens. Genes homólogos têm funções semelhantes aos genes envolvidos na manosilação de proteínas em S. cerevisiae e pode-se utilizar deste modo a sua eliminação para manipular o padrão de glicosilação em P.pastoris ou, por analogia, qualquer outra célula hospedeira, por exemplo, fungos, células vegetais de insectos ou animais com vias de glicosilação semelhantes. A criação de knock-outs de genes assim que é determinada uma dada sequência genética, é uma técnica bem estabelecida e pode ser realizada por quem possuir uma formação ordinária na técnica (vide, por exemplo, R-Rothsteins, (1991) Methods in Enzymology, 194:281). A escolha de um organismo hospedeiro pode ser influenciada pela disponibilidade de boas técnicas de transformação e interrupção de genes.

Se várias manosiltransferases têm de ser sujeitas a knock out, o método desenvolvido por Alani e Kleckner (1987) Genetics 116:541-545, por exemplo permite a utilização repetida de marcadores seleccionáveis, por exemplo o marcador URA3 em levedura, para eliminar sequencialmente toda a actividade manosiltransferase endógena indesejada. 75

Esta técnica tem sido aperfeiçoada por outros, mas basicamente envolve a utilização de duas sequências de ADN repetidas, a flanquear um marcador contrasseleccionável. Por exemplo: URA3 pode ser utilizado como marcador para garantir a selecção de transformantes com uma construção genética integrada. Ao flanquear o marcador URA3 com repetições directas é possível seleccionar primeiro os transformantes com a construção integrada e, portanto, com o gene alvo interrompido. Após o isolamento dos transformantes e respectiva caracterização, é possível contrasseleccionar uma segunda volta para aqueles que são resistentes a ácido 5-fluo-orótico (5-FOA). As colónias que são capazes de sobrevier em placas contendo 5-FOA perderam novamente o marcador URA3 através de um evento cross-over, envolvendo as repetições mencionadas anteriormente. Esta abordagem permite assim a repetida utilização do mesmo marcador e facilita a interrupção de múltiplos genes sem necessitar de marcadores adicionais. Podem também ser utilizadas técnicas semelhantes de eliminação sequencial dos genes adaptadas à utilização em outras células hospedeiras eucariotas com outros marcadores selecionáveis e contra-seleccionáveis. A eliminação de manosiltransferases específicas, tal como 1,6 manosiltransferase (0CH1), manosilfosfato transferases (MNN4, MNN6 ou genes complementares de lbd mutante) ou reguladores em P.pastoris permite a criação de estirpes geneticamente manipuladas deste organismo, as quais sintetizam em primeiro lugar Man8GlcNAc2 e podem assim ser utilizadas para modificar ainda mais o padrão de glicosilação para se assemelhar mais às estruturas glicoforma humanas mais complexas, por exemplo aquelas 76 produzidas em mamíferos, por exemplo células humanas. Uma concretização preferida deste método utiliza sequências de ADN codificadoras de actividades de glicosilação bioquímicas para eliminar funções bioquímicas semelhantes ou idênticas em P.pastoris, de modo a modificar a estrutura de glicosilação de glicoproteínas da estirpe P.pastoris geneticamente alterada.

Os métodos utilizados para modificar geneticamente a via de glicosilação em levedura, como exemplificado, pode ser utilizada em fungos filamentosos para produzir um substrato preferido, para subsequente modificação. As estratégias de modificação das vias de glicosilação em A.niger e outros fungos filamentosos, por exemplo, pode ser desenvolvida utilizando protocolos análogos aos descritos para estirpes geneticamente modificadas para produzirem glicoproteínas semelhantes às humanas em levedura. As actividades genéticas indesejadas envolvidas na actividade 1,2-manosiltransferase, por exemplo homólogos KTR/KRE, são modificadas ou eliminadas. Um fungo filamentoso, tal como Aspergíllus, é um hospedeiro preferido porque não tem a actividade 1,6-manosiltransferase e, assim, não seria previsível uma actividade genética hipermanosilante, por exemplo 0CH1 neste hospedeiro. Em contraste, outras actividades desejadas (por exemplo a-1,2-manosidase, transportador UDP-GlcNAc, glicosiltransferase (GnT), galactosiltransferase (Gaff) e sialiltransferase (ST) ) envolvidas na glicosilação são introduzidas no hospedeiro utilizando métodos de marcação da invenção.

Modificação genética ou selecção de hospedeiros com actividade a-1,6-manosiltransferase iniciadora diminuída 77

Numa concretização preferida, o método da presente invenção envolve a preparação ou utilização de uma célula hospedeira que tem a actividade de uma a-1,6-manosiltransferase iniciadora diminuída ou esgotada, isto é uma enzima especifica de iniciação que inicia a manosilação da cadeia exterior na ramificação a-1,3 da estrutura "core" Man3GlcNAc2. Em S.cerevisiae, esta enzima é codificada pelo gene 0CH1. A ruptura do gene OCHl em S.cerevisiae resulta num fenotipo em que falta completamente aos açúcares N-ligados a cadeia exterior polimanose. Abordagens anteriores para a obtenção de glicosilação de tipo mamífero em estirpes fúngicas implicaram a inactivação de OCHl (vide, por exemplo, Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:26298-304). A interrupção da actividade a-1,6-manosiltransferase iniciadora numa célula hospedeira da presente invenção pode ser opcional, no entanto (conforme a célula hospedeira seleccionada) como a enzima Ochlp exige uma Man8GlcNAc2 para uma iniciação eficiente da cadeia exterior manose. Assim, as células hospedeiras seleccionadas ou produzidas de acordo com a presente invenção, que acumulam oligossacáridos com sete ou menos resíduos manose, podem produzir N-glicanos hipoglicosilados que muito provavelmente serão substratos fracos para Ochlp (vide, por exemplo Nakayama et al. (1997) FEBS Lett. 412(3):547-50). 0 gene OCHl foi clonado a partir de P.pastoris (exemplo 1) e K.lactis (exemplo 9) como descrito. As sequências de ácido nucleico e de aminoácido do gene OCHl de K.lactis são apresentadas na SEQ ID NO:7 e 8. Utilizando iniciadores específicos dos genes foi feita uma construção a partir de cada clone para eliminar o gene OCHl do genoma de P.pastoris e K.lactis (exemplos 1 e 9, respectivamente). 78

Obtiveram-se assim as células hospedeiras esgotadas em actividade a-1, 6-manosiltransferase iniciadora e manipuladas geneticamente para produzirem N-glicanos com estrutura hidrato de carbono Man5GlcNAc2 (vide, por exemplo, figuras 5, 6 e 12; exemplos 4 e 9).

Assim, são descritos no presente documento uma molécula de ácido nucleico isolada, com uma sequência de ácido nucleico compreendendo ou consistindo em pelo menos quarenta e cinco, de preferência pelo menos 50, mais preferencialmente pelo menos 60 e o mais preferido 75 ou mais resíduos nucleótido do gene OCH1 de K.lactis (SEQ ID NO: 7) e respectivos homólogos, variantes e derivados. São também descritas moléculas de ácido nucleico que hibridam em condições rigorosas nas moléculas de ácido nucleico descritas. De modo semelhante, os polipeptídeos isolados (incluindo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados e análogos) codificados pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção são presentemente descritos. São também descritos os vectores, incluindo vectores de expressão, que compreendem as moléculas de ácido nucleico da presente invenção anteriores, tal como descrito mais adiante. De modo semelhante, as células hospedeiras transformadas com as moléculas de ácido nucleico ou vectores da presente invenção são presentemente descritos. A presente invenção, proporciona ainda métodos de preparação ou utilização de uma célula hospedeira fúngica, unicelular ou multicelular, diminuída ou esgotada de uma actividade genética alg (isto é actividades alg, incluindo actividades enzimáticas equivalentes em células hospedeiras não fúngicas) e introduzindo na célula hospedeira pelo menos uma actividade glicosidase. Numa concretização 79 preferida, a actividade glicosidase é introduzida provocando a expressão de uma ou mais do que uma actividade manosidase dentro da célula hospedeira, por exemplo por meio da activação de uma actividade manosidase ou por meio da expressão de uma molécula de ácido nucleico de uma actividade manosidase na célula hospedeira. Noutra concretização, o método envolve a preparação ou utilização de uma célula hospedeira diminuída ou esgotada da actividade de uma ou mais do que uma enzima que transfere um resíduo açúcar para a ramificação 1,6 dos precursores oligossacárido ligadas a lípido (figura 13) . Uma célula hospedeira da presente invenção é seleccionada para ou é geneticamente manipulada por meio da introdução de uma mutação em um ou mais do que um dos genes codificadores de uma enzima que transfere um resíduo açúcar (por exemplo imanosilatos) para a ramificação 1,6 de um precursor oligossacárido ligado a lípido. 0 resíduo açúcar é mais preferencialmente manose, de preferência é um resíduo glucose, GlcNAc, galactose, ácido siálico, fucose ou fosfato GlcNAc. Numa concretização preferida, a actividade de uma ou mais do que uma enzima que manosila a ramificação 1,6 dos precursores oligossacárido ligados a lípido é diminuída ou esgotada. 0 método pode ainda incluir a etapa de introdução na célula hospedeira de pelo menos uma actividade glicosidase (vide abaixo).

Ainda noutra concretização, a presente invenção proporciona um método de produção de uma glicoproteína semelhante à humana num hospedeiro não-humano, em que a glicoproteína inclui um N-glicano com pelo menos dois GlcNAcs ligados a uma estrutura "core" trimanose. 80

Em cada concretização anterior, o método é dirigido à preparação de uma célula hospedeira em que os precursores oligossacárido ligados a lipido são enriquecidos em estruturas ManxGlcNAc2, em que x é 3, 4 ou 5 (figura 14) . Estas estruturas são transferidas no RE da célula hospedeira para cadeias de polipeptideo nascentes por uma oligossacariltransferase e podem ser processadas por meio de tratamento com glicosidases (por exemplo, a-manosidases) e glicosiltransferases (por exemplo, GnTl) para produzir N-glicanos com estruturas nucleares GlcNAcManxGlcNAc2, em que x é 3, 4 ou 5 e é preferencialmente 3 (figuras 14 e 15) . Como se vê na figura 14, N-glicanos com uma estrutura "core" GlcNAcManxGlcNAc2, em que x é maior que 3, podem ser convertidos em GlcNAcMan3GlcNAc2, por exemplo por meio de tratamento com uma actividade manosidase a-1,3 e/ou a-1,2-1,3, onde aplicável.

Processamento adicional de GlcNAcMan3GlcNAc2 por meio de tratamento com glicosiltransferases (por exemplo GnTII) produz estruturas nucleares GlcNAc2Man3GlcNAc2 que podem então ser modificadas facultativamente, por exemplo, por meio de tratamento ex vivo ou por meio de expressão heteróloga na célula hospedeira de um conjunto de enzimas de glicosilação, incluindo glicosiltransferases, transportadores de açúcar e manosidases (vide abaixo) para se tornarem N-glicanos semelhantes aos humanos. As glicoproteinas semelhantes às humanas preferidas que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção incluem as que compreendem N-glicanos com sete ou menos, três ou menos resíduos manose, compreendem um ou mais açúcares seleccionados do grupo constituído por galactose, GlcNAc, ácido siálico e fucose e compreendem pelo menos uma 81 ramificação oligossacárido compreendendo a estrutura NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man.

Numa concretização, a célula hospedeira diminuiu ou esgotou a actividade manosiltransferase Dol-P-Man :MansGlcNAc2-PP-Dol, que é a actividade envolvida na primeira etapa de manosilação de Man5GlcNAc2-PP-Dol para Man6GlcNAc2-PP-Dol do lado luminal do RE (por exemplo, ALG3 figura 13; figura 14). Em S.cerevisiae, esta enzima é codificada pelo gene ALG3. Como anteriormente descrito, células de S.cerevisiae com uma mutação alg3-l hipomórfica acumulam Man5GlcNAc2-PP-Dol e células com uma eliminação em alg3 parecem transferir estruturas Man5GlcNAc2 para cadeias de polipeptideo nascentes no RE. Assim, na presente concretização, as células hospedeiras irão acumular N-glicanos enriquecidos em estruturas Man5GlcNAc2 que podem então ser convertidas em GlcNAc2Man3GlcNAc2 por meio de tratamento com glicosidases (por exemplo, com actividades a-1,2-manosidase, a-1,3-manosidase ou a-1,2-1,3-manosidase) e actividades glicosiltransferases (por exemplo, GnTI, GnTii) (figura 14; figura 35B).

Como descrito no exemplo 10, iniciadores degenerados foram concebidos com base num alinhamento de sequências de proteína Alg3 de S.cerevisiae, D.melanogaster e humanos (H.sapiens) (figuras 16 e 17) e foram utilizados para amplificar um produto de ADN genómico de P.pastoris. O produto PCR resultante foi utilizado como uma sonda para identificar e isolar um clone genómico de P.pastoris compreendendo uma grelha de leitura aberta (open reading frame - ORF) que codifica uma proteína com identidade de sequência global de 35% e semelhança de sequência de 53% com o gene ALG3 de S. cerevisiae (figuras 18 e 19). Este 82 gene de P.pastoris é designado como "PpALG3". O gene ALG3 foi identificado e isolado de modo semelhante a partir de e K.lactis (exemplo 10, figuras 20 e 21).

Assim, são descritos no presente documento uma molécula de ácido nucleico isolada, com uma sequência de ácido nucleico compreendendo ou consistindo em pelo menos quarenta e cinco, de preferência pelo menos 50, mais preferencialmente pelo menos 60 e o mais preferido 75 ou mais resíduos nucleótido do gene ALG3 (figura 18) de P.pastoris e o gene ALG3 de K.lactis (figura 20) e respectivos homólogos, variantes e derivados. São também descritas moléculas de ácido nucleico que hibridam em condições rigorosas nas moléculas de ácido nucleico descritas. De modo semelhante, são apresentados os polipeptídeos isolados (incluindo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados e análogos) codificados pelas moléculas de ácido nucleico (produtos genéticos ALG3 de P.pastoris e K.lactis são apresentados nas figuras 18 e 20). São também descritos os vectores, incluindo vectores de expressão, que compreendem as moléculas de ácido nucleico mencionadas, tal como descrito mais adiante.

Utilizando iniciadores específicos dos genes foi feita uma construção para eliminar o gene PpALG3 do genoma de P.pastoris (exemplo 10) . Esta estirpe foi utilizada para gerar uma célula hospedeira esgotada em actividade manosiltransferase Dol-P-Man :Man5GlcNAc2-PP-Dol e produzir precursores Man5GlcNAc2-PP-Dol ligados a lípido, que são transferidos para cadeias de polipeptídeo nascentes para produzir N-glicanos com uma estrutura hidrato de carbono Man5GlcNAc2. 83

Como descrito no exemplo 11, uma célula hospedeira assim pode ser manipulada geneticamente por meio de expressão de manosidases adequadas para produzir N-glicanos com a estrutura hidrato de carbono "core" Man3GlcNAc2. A expressão de GnTs na célula hospedeira da presente invenção (por exemplo por meio de marcação de uma molécula de ácido nucleico ou uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico como se descreverá posteriormente) permite que a célula hospedeira modificada produza N-glicanos com uma ou duas estruturas GlcNAc ligadas a cada ramificação da estrutura "core" Man3 (isto é GlcNAci Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 ou GlcNAc3Man3GlcNAc2; ver figura 15) . Estas estruturas podem ser sujeitas a mais processamento utilizando métodos da presente invenção para produzir N-glicanos semelhantes aos humanos em proteínas que penetram na via de secreção da célula hospedeira.

Numa concretização preferida o método da presente invenção envolve a preparação ou utilização de uma célula hospedeira que tanto é (a) diminuida ou esgotada quanto à actividade de um gene alg ou em uma ou mais do que uma actividades que manosilam N-glicanos na ramificação a-1,6 da estrutura hidrato de carbono "core" Man3GlcNAc2 ("Man3") e (b) diminuída ou esgotada na actividade de uma a-1,6-manosiltransferase iniciadora, isto é, uma enzima específica de iniciação que inicia manosilação da cadeia exterior (na ramificação a-1,3 da estrutura "core" Man3) . Em S. cerevísíae, esta enzima é codificada pelo gene 0CH1. A ruptura do gene ochl em S.cerevisiae resulta num fenotipo em que falta completamente aos açúcares N-ligados a cadeia exterior polimanose. Abordagens anteriores para a obtenção de 84 glicosilação de tipo mamífero em estirpes fúngicas implicaram a inactivação de 0CH1 {vide, por exemplo, Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:26298-304). A interrupção da actividade a-1,6-manosiltransferase iniciadora numa célula hospedeira da presente invenção pode ser opcional, no entanto (conforme a célula hospedeira seleccionada) visto que a enzima Ochlp exige uma Man8GlcNAc2 para uma iniciação eficiente da cadeia exterior manose. Assim, as células hospedeiras seleccionadas ou produzidas de acordo com a presente invenção, que acumulam oligossacáridos ligados a lípidos com sete ou menos resíduos manose, irão produzir, após a transferência, N-glicanos hipoglicosilados que muito provavelmente serão substratos fracos para Ochlp (vide, por exemplo Nakayama et al. (1997) FEBS Lett. 412 (3) :547-50) .

Modificação genética ou selecção de hospedeiros com actividade N-acetilglucosaminiltransferase III A presente invenção proporciona um método para a produção de uma glicoproteína semelhante à humana nas células hospedeiras da presente invenção por meio da expressão de uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III (incluindo uma enzima completa, respectivos homólogos, variantes, derivados e fragmentos cataliticamente activos). Numa concretização, a célula hospedeira da presente invenção (por exemplo P. pastoris) é manipulada geneticamente para produzir mais N-glicanos semelhantes aos humanos, por exemplo por meio de activação de uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III ou por meio de expressão a partir de uma molécula de ácido nucleico de uma actividade x N-acetilglucosaminiltransferase III. Utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, são 85 concebidos iniciadores especificos de gene para complementar as regiões homólogas do gene GnTIII, de preferência um gene GnTIII de mamifero (por exemplo GnTIII de ratinho) (figura 24), cujas sequências são facilmente disponibilizadas na técnica (por exemplo n° de acesso GenBank L39373) e são amplificadas por PCR.

Numa concretização, a presente invenção proporciona um método de produção de uma glicoproteina semelhante à humana numa célula hospedeira da invenção (por exemplo P.pastoris), em que a glicoproteina inclui um N-glicano com um GlcNAc bissectante numa estrutura "core" trimanose ou trimanosilo (Man3GlcNAc2) . Nesta concretização, GlcNAcMan3GlcNAc2 (que pode ser produzido por meio da reacção de um núcleo trimanose com actividade N-acetilglucosaminiltransferase I ("GnTI"), mas que é tipicamente produzida por meio de encurtamento de GlcNAcMan5GlcNAc2 por uma actividade α-1,3/α-1,6-manosidase, tal como manosidase II (Hamilton et al. (2003) Science 301:1244-46)) é feita reagir com uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase III para produzir um GlcNAc2Man3GlcNAc2 bissectado. Assim, a presente invenção proporciona actividade GnTIII, que transfere β-1,4 GlcNAc em substratos que são capazes de aceitar o GlcNAc bissectante em eucariotas inferiores.

Noutra concretização, a presente invenção proporciona um método de produção de uma glicoproteina semelhante à humana numa célula hospedeira da invenção (por exemplo P.pastoris) , em que a glicoproteina inclui um N-glicano com um GlcNAc bissectante numa estrutura "core" trimanose ou trimanosilo (Man3GlcNAc2) com pelo menos dois GlcNAcs ligados ao núcleo trimanose. Nesta concretização, faz-se 86 reagir Man3GlcNAc2 com uma actividade GnTI e depois com uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase II (#GnTII") e uma actividade GnTIII (por ordem facultativa) para produzir GlcNAc3Man3GlcNAc2 bissectado (figura 38) . Deverá ser evidente que a estrutura "core" de trimanosilo bissectado da presente concretização pode também conter um grupo manosilo adicional no lugar de um residuo GlcNAc. Por exemplo, GlcNAcMan4GlcNAc2 pode ser feito reagir com uma actividade GnTIII para produzir um GlcNAc2Man4GlcNAc2 bissectado. A presente invenção proporciona um método de produção de uma glicoproteina mais semelhante à humana numa célula hospedeira da invenção (por exemplo P.pastoris), em que a glicoproteina inclui um N-glicano com pelo menos dois GlcNAcs ligados a uma estrutura "core" pentamanose (Man5GlcNAc2) e que exibe um N-glicano bissectado. Assim, nesta concretização, uma estrutura "core" pentamanose (Man5GlcNAc2) é feita reagir com actividade GnTIII para produzir uma estrutura GlcNAcMan5GlcNAc2 e GlcNAc2Man5GlcNAc2 bissectada.

Numa concretização alternativa, uma estrutura "core" pentamanose produzida por mutação dos genes ichl e alg3 é feita reagir com a-1,2-manosidase, actividades GnTI, GnTII e GnTIII e UDP-GlcNAc para produzir um glicano GlcNAc3Man3GlcNAc2 bissectado (figura 35B) . Noutra concretização, uma estrutura "core" pentamanose é feita reagir com actividades GnTI e GnTIII (por ordem ou combinação facultativa) para produzir uma estrutura GlcNAc2Man5GlcNAc2 bissectada (figura 37) . 87

Como descrito, utilizando o método da biblioteca de ADN combinatório, como descrito mais à frente, uma construção pVA53, compreendendo o lider S.cerevisiae MNN2(s) (Número de acesso GenBank NP_009571) fundida a um dominio GnTIII cataliticamente activo de ratinho (GnTIII A32) é expressa numa estirpe de P .pastoris YSH-1 (exemplo 13) produzindo assim N-glicanos com estrutura GlcNAc2Man5GlcNAc2 bissectada (exemplo 20) . A figura 26 (fundo) mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe anteriormente mencionada, que é designada PBP26 (figura 36) , exibindo um pico predominante a 1461 m/z [d] correspondendo a GlcNAc2Man5GlcNAc2. (Para comparação, a figura 26 (topo) mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe YSH-1 sem a construção pVA53. O pico predominante a 1461 m/z [d] corresponde ao glicano não modificado: GlcNAcMmsGlcNAc2) Assim, numa concretização, um hospedeiro da presente invenção é caracterizado pela suas capacidade para produzir pelo menos temporariamenet, N-glicanos que exibem pelo menos 50 % mole de uma estrutura GlcNAc2Man5GlcNAc2 com um GlcNAc bissectante. A percentagem em mole dos glicanos é relativa à percentagem de glicanos neutros totais, como detectado por MALDI-TOF. Pressupõe-se que, por exemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2, com um GlcNAc bissectante, é produzido a 20% e GlcNAc3Man3GlcNAc2 é produzido a 25% numa proteína alvo, que a quantidade total de GlcNAc2Man3GlcNAc2 produzido temporariamente é 45% porque GlcNAc3Man3GlcNAc2 é um produto de GlcNAc2Man3GlcNAc2 com um GlcNAc bissectante que reagiu com GnTII. 88

De modo semelhante, como descrito, uma construção pVA55, compreendendo o líder S.cerevisiae MNN2(s) (Número de acesso GenBank NP_009571) fundida a um domínio GnTIII cataliticamente activo de ratinho (GnTIII Δ32) é expressa numa estirpe de P.pastoris (YSH-1) produzindo assim N-glicanos com estrutura GlcNAcMansGlcNAc2 e estrutura GlcNAc2Man5GlcNAc2 de N-glicanos bissectados. Como se mostra na figura 27 (fundo), estas estruturas correspondem a picos a 1463 m/z e 1667 m/z, respectivamente. (Para comparação, a figura 27 (topo) mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe YSH-1 sem a construção pVA53. 0 pico predominante corresponde ao GlcNAcMan5GlcNAc2 não modificado a 1461 m/z [d]) Assim, noutra concretização, um hospedeiro da presente invenção é caracterizado pela suas capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem pelo menos 20 mole de uma estrutura GlcNAc2Man5GlcNAc2 ou pelo menos 20 % em mole de uma estrutura GlcNAc2Man3GlcNAc2 com um GlcNAc bissectante. É também descrita uma construção pVA53, compreendendo o líder S.cerevisiae MNN2(s) (Número de acesso GenBank NP_009571) fundida a um domínio GnTIII cataliticamente activo de ratinho (GnTIII Δ32) é expressa numa estirpe de P.pastoris (YSH-44) (exemplo 15) produzindo assim N-glicanos com estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 bissectada (exemplo 20). A figura 30 mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe anteriormente mencionada, que é designada YSH-57, exibindo um pico predominante a 1542 m/z [y] correspondendo 89 ao glicano bissectado GlcNAc3Man3GlcNAc2. (Para comparação, a figura 29 mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe YSH-44 sem a construção pVA53. 0 pico predominante a 1356 m/z [x] na figura 29 corresponde ao glicano não modificado: GlcNAc2Man3GICNAc2.) Assim, numa concretização, um hospedeiro da presente invenção é caracterizado pela suas capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem pelo menos 80 % mole de uma estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 com um GlcNAc bissectante. A percentagem em mole dos glicanos é relativa à percentagem de glicanos neutros totais, como detectado por MALDI-TOF.

Em alternativa é também descrita uma construção pVA53, compreendendo o líder S.cerevisiae MNN2(s) (Número de acesso GenBank NP_009571) fundida a um domínio GnTIII cataliticamente activo de ratinho (GnTIII Δ32) é expressa numa estirpe de P.pastoris (PBP6-5) (exemplo 11) produzindo assim N-glicanos com estrutura GlcNAc2Man3GlcNAc2 e uma estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 bissectado. Como se mostra na figura 32 (fundo), estas estruturas correspondem a picos a 1463 m/z e 1.543 m/z, respectivamente. Assim, numa concretização, um hospedeiro da presente invenção é caracterizado pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem pelo menos 20 % mole de uma estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 com um GlcNAc bissectante numa célula hospedeira mutante alg3. A presente invenção fornece métodos para a produção de uma glicoproteína semelhate à humana numa célula hospedeira da presente invenção, em que a glicoproteína compreende uma 90 estrutura "core" Man5GlcNAc2 ou uma estrutura "core" Man3GlcNAc2 e em que a estrutura "core" é ainda modificada em dois ou maisk GlcNAcs. Nalgumas concretizações da presente invenção 10% ou mais das estruturas nucleares são modificadas em dois ou mais GlcNAcs. Noutras concretizações preferidas modifica-se 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou ainda mais das estruturas nucleares. Numa concretização muito preferida, um dos GlcNAcs é um GlcNAc bissectado.

Noutro aspecto da presente invenção, é utilizada uma biblioteca de ácidos nucleicos combinatória, que codifica pelo menos um dominio catalítico GnTIII, para expressar uma actividade GnTIII numa célula hospedeira da invenção (exemplo 18) . De preferência, uma biblioteca da invenção compreende uma sub-biblioteca de sequências líder fundidas em grelha numa única molécula de ácido nucleico ou uma sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências GnTIII, um ou mais do que uma das quais codifica um domínio catalítico com actividade GnTIII na célula hospedeira. Em alternativa, uma única molécula de ácido nucleico ou uma sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico, compreendendo sequências líder, é fundida em grelha a uma sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências GnTIII, um ou mais do que uma das quais codifica um domínio catalítico com actividade GnTIII na célula hospedeira da invenção, (ver abaixo) A expressão destas e outras bibliotecas combinatórias é executada numa célula hospedeira que expressa uma glicoproteína alvo, cujas estruturas N-glicano asão analizadas para determinar se há expressão de GnTIII e a respectiva quantidade. Pode ser empregue uma vasta gama de enzimas GnTIII cataliticamente activas numa célula hospedeira, utilizando 91 métodos e bibliotecas da presente invenção. Neste contexto da presente invenção, que permite um especialista criar e delinear entre enzimas GnTIII com pouca ou nenhuma actividade e enzimas que são activamente expressas e que produzem níveis predominantes de um intermediário oligossacárido bissectado, tal como GlcNAc2Man5GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2 ou GlcNAc2Man3GlcNAc2 nas células hospedeiras. Como descrito mais abaixo, a correcta marcação de uma enzima responsável por uma dada etapa na via de glicosilação para a localização subcelular apropriada são factores importantes na produção de glicoproteínas com N-glicanos com as estruturas desejadas. A utilização de bibliotecas combinatórias de proteínas de fusão para gerar populações diversas de quimeras enzimáticas e a selecção destas bibliotecas em células transformadas proporciona um método poderoso de identificação de estirpes hospedeiras com a actividade interessante numa localização apropriada. Em concretizações preferidas da presente invenção, a actividade enzimática está localizada de forma que uma glicoproteína contendo N-glicano expressa na célula é capaz de fazer reagir com a actividade durante o processo de secreção. Ne, todas as combinações de domínio líder/catalítico produzem as actividades enzimáticas desejadas, contudo. É criada uma grande variedade de combinações de domínio líder/catalítico, sendo apenas algumas úteis na produção dos intermediários presentemente desejados. Ainda assim, a presente invenção engloba mesmo as combinações que presentemente não exibem uma actividade enzimática desejada na célula hospedeira exemplificada. A figura 28 (fundo) mostra uma construção pVB51, compreendendo o líder GNT(s) de K.lactis (Número de 92 acesso GenBank AF106080) fundida a um domínio GnTIII cataliticamente activo de ratinho (GnTIII Δ32) expresso numa estirpe de P.pastoris YSH-1 que não exibe logo actividade GnTIII. (Para comparação, a figura 28 (topo) mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe YSH-1 sem a construção pVA53. 0 pico predominante corresponde ao GlcNAcMan5GlcNAc2 não modificado a 1461 m/z). É observado o pico predominante na figura 28 (fundo) a 1463 m/z que corresponde à massa de GicNAcMan5GlcNAc2. É também observado um segundo pico a 1726 m/z, que não corresponde à massa de GicNAc2Man5GlcNAc2. Considera-se que estas e outras modificações semelhantes podem ser úteis com ou sem ligeiras modificações, utilizando técnicas bem conhecidas quando são expressas, por exemplo em outras células hospedeiras, incluindo aquelas que foram modificadas para produzire, glicoformas semelhantes às humanas. A utilização de bibliotecas combinatórias para gerar populações diversas de quimeras enzimáticas e a selecção destas bibliotecas em células transformadas permite ainda a identificação de estirpes em que a actividade enzimática é substancialmente intracelular. 0 exemplo 6, abaixo, proporciona um exemplo de condições de análise úteis para a medição de actividade a-1,2-manosidase extracelular. Exemplos 22 e 23 proporcionam também exemplos de análises da actividade glicosiltransferase (GnTIII) no meio. Vide também o quadro 9, seguinte e Choi et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100(9):5022-27. Para o objectivo da presente invenção, uma actividade enzimática é 93 substancialmente intracelular quando menos de 10% da actividade enzimática é mensurável no meio extracelular.

Como descrito nos exemplos 11, 12, 13, 14, 15, e 19-21, uma célula hospedeira pode ser geneticamente modificada por meio da expressão de glicosiltransferases apropriadas (por exemplo N-acetilglucosaminiltransferase) para produzir N-glicanos com as estruturas hidrato de carbono desejadas (por exemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2) . A expressão de GnTs na célula hospedeira (por exemplo por meio de marcação de uma molécula de ácido nucleico ou uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico, como descrito mais abaixo e em Choi et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100(9):5022-27 e WO 02/00879) permite que a célula hospedeira modificada produza N-glicanos com GlcNAc bissectante na manose média. Estas estruturas podem ser sujeitas a mais processamento utilizando métodos da presente invenção para produzir N-glicanos semelhantes aos humanos em proteinas que penetram na via de secreção da célula hospedeira.

Numa concretização mais preferida, a co-expressão de transportador (es) UDP-açúcar e transferase (s) UDP-açúcar irão tapar os resíduos a-1,6 e a-1,3 terminais, bem como a manose média com GlcNAc, resultando no precursor para o complexo de tipo mamífero (por exemplo GlcNAc3Man3GlcNAc2) e N-glicosilação híbrida. Estas cadeias oligossacáridos N-ligados, com ligação peptídeo servem então de precursosr para mais modificações numa estrutura oligossacárido de tipo mamífero. A subsequente expressão de galactosiltransferases e manipulação genética da capacidade para transferir ácido siálico para os terminais (vide 94 figura 1B) irá produzir uma estrutura N-glicano de tipo mamífero (por exemplo semelhante à humana).

Modificação genética ou selecção de hospedeiros com actividade N-acetilglucosaminiltransferase IV, V, VI ou IX A presente invenção proporciona novos hospedeiros fúngicos unicelulares ou multicelulares com actividade N-acetilglucosaminiltransferase para catalizar a formação de uma ligação glicosídica GlcNAcpl,4 ou GlcNAcpl,6 na ramificação MANAL,6 e/ou Manai,3 de uma substrato oligossacárido (por exemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2) na presença de um nucleótido açúcar UDP-GlcNAc. A transferência de resíduos GlcNAc é geralmente preferida na presença de um transportador UDP-GlcNAc. A presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico recombinantes codificadoras de proteínas com actividade N-acetilglucosaminiltransferase e métodos de expressão da enzima activa na via secretória da levedura. Além disso, a presente invenção proporciona estruturas oligossacárido produzidas a partir de dos hospedeiros transformados que são úteis para administração terapêutica. Catalizando a transferência do GlcNAc açúcar a partir de UDP-GlcNAc para os substratos oligossacárido por uma actividade N-acetilglucosaminiltransferase são formadas glicoformas multiantenárias numa proteína, as quais são depois ampliadas por galactosiltransferase e sialiltrasnferase. A presente invenção proporciona ainda um método de preparação de uma glicoproteína semelhante à humana numa célula hospedeira eucariota inferior por meio da expressão de um ácido nucleico codificador do domínio catalítico da N-acetilglucosaminiltransferase IV exógeno GnT IVB (Δ 104- 95

53) humano, fundido aos nucleótidos 1-108 do gene MNN2 de S.cerevisiae juntamente com as actividades N-acetilglucosaminiltransferase V, VI ou IX (incluindo uma enzima completa, respectivos homólogos, variantes, derivados e fragmentos cataliticamente activos). Numa concretização, uma célula hospedeira da presente invenção (por exemplo P.pastoris) é manipulada geneticamente para produzir mais N-glicanos semelhantes aos humanos, por exemplo por meio de activação das actividades N-acetilglucosaminiltransferase IV, V, VI, IX ou por meio de expressão a partir de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção codificadora de actividades N-acetilglucosaminiltransferase IV, V, VI, IX da presente invenção (figura 39). Utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, são concebidos iniciadores específicos de gene para hibridar para as regiões homólogas da família glicosiltransferas, tal como sequências genéticas GnTIV, V, VI, IX, facilmente disponibilizadas na técnica (por exemplo bases de dados GenBank, SwissProt) e são amplificadas por PCR. Expressão de N-acetilglucosaminiltransferase IV

De acordo com a presente invenção, uma célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular é transformada com uma sequência de nucleótidos codificadora do domínio catalítico da N-acetilglucosaminiltransferase IV exógeno GnT IVB (Δ 104-53) humano, fundido aos nucleótidos 1-108 do gene MNN2 de S.cerevisiae, que catalisa a adição de um resíduo açúcar β(1,4) N-acetilglucosamina ("GlcNAc") na ramificação Manai, 3 do GlcNAc β1,2 - Manai,6 (GlcNAc β 1,2 Manai,3) Man β1,4 - GlcNAc . 1,4 - ΰΙοΝΑοβ 1,4 - Asn de um substrato oligossacárido. A adição de um 61οΝΑοβ1,4 por GnTIV para a 96 ramificação Manai,3 do substrato aceitador (por exemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2) rende um N-glicano chamado triantenular.

Numa concretização, a presente invenção proporciona um método de produção de uma glicoproteina semelhante à humana num encariota inferior (por exemplo P.pastoris), em que a glicoproteina inclui uma estrutura N-glicano triantenular numa estrutura oligossacárido (por exemplo

GlcNAc3Man3GlcNAc2) . Nesta concretização, o substrato oligossacárido GlcNAcMan5GlcNAc2 (Choi et al., (2003) Proc Natl Acad Sei USA 2003 Abr 29;100 (9):5022-7) é encurtado por uma actividade a-1,3/ a-1,6-manosidase, tal como manosidase II (Hamilton et al. (2003) Science 301:1244 produzindo o substrato GlcNAc2Man3GlcNAc2, que, por sua vez é feito reagir com a actividade N- acetilglucosaminiltransferase IV mencionada para produzir uma estrutura triantenular: GlcNAC3Man3GlcNAc2 (figura 39). Duas isoenzimas A e B GnTIV são apresentadas nas figuras 41 e 42. Numa concretização preferida, é introduzido um fragmento de gene codificador da gNTIV humana (figura 42) , ligada em grelha aos nucleótidos 1-108 da sequência de peptideo marcadora de S.cerevisiae MNN2(s) e é expresso em P.pastoris YSH-44 (exemplo 15). Assim, noutra concretização, um hospedeiro da presente invenção é caracterizado pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem, preferencialmente pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 % em mole uo mais da estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2. Numa concretização ainda mais preferida, o substrato oligossacárido GlcNAc3Man3GlcNAc2 é um substrato para uma reacção de galactosiltransferase. Assim, a presente invenção proporciona uma actividade GnTIV, qeu cataliza a transferência de resíduos GlcNAc para 97 substratos oligossacárido, formando uma ligação glicosídica GlcNAcp-l,4 na ramificação Manai,3 de um substrato oligossacárido (por exemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2) em eucariotas inferiores.

Numa concretização preferida, utilizando uma biblioteca de ADN combinatório e métodos da invenção, uma construção pPB144 (figura 40A), compreendendo o lider S.cerevisiae MNN2(s) (Número de acesso GenBank NP_009571) fundido a um domínio GnTIII cataliticamente activo de ser humano (GnTIVB Δ104) é expressa numa estirpe de P.pastoris YSH-44 (exemplo 15) produzindo assim estruturas GlcNAc3Man3GlcNAc2 triantenárias N-glicanos (exemplo 25) . A figura 47 mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe transformada como PBP43, exibindo um pico predominante a 1543 m/z [y], que corresponde à estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 triantenular N-glicano. (vide figura 29 para comparação, que mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertadis de uma proteína kringle 3, expressa em células FSH-44, produtoras de GlcNAc2Man3GlcNAc2) . Assim, nalgumas concretizações, um hospedeiro da presente invenção é caracterizado pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem pelo menos 50 % mole de uma estrutura triantenular GlcNAc3Man3GlcNAc2. Noutra concretização, a célula hospedeira da presente invenção produz a estrutura triantenular GicNAc3Man3GlcNAc2, catalizada por GnTIV, numa quantidade que é pelo menos 60, 70, 80, mais preferencialmente 90 % em mole ou superior. Aqui e doravante, a percentagem em mole dos glicanos é 98 relativa à percentagem de glicanos neutros totais, como detectado por MALDI-TOF.

Expressão de N-acetilglucosaminiltransferase IV e V

Noutro aspecto da presente invenção, uma célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular que é geneticamente manipulada ou seleccionada para produzir o substrato oligossacárido triantenular (por exemplo GicNAc3Man3GlcNAc2) é transformada com um ácido nucleico codificador da actividade N-acetilglucosaminiltransferase V ("GnTV"), que catalisa a adição de um resíduo açúcar β (1,6) N-acetilglucosamina ("GlcNAc") na ramificação Manll,6 do GlcNAc β1,2 - Manai,6 (GlcNAc β 1,4 (GlcNAc β 1,2) Manai,3) Man β 1,4 - GlcNAcp 1,4 - GlcNAcpi,4 - Asn de um substrato oligossacárido. A adição de um GlcNAcpi,6 por GnTV para o substrato aceitador (por exemplo GlcNAc3Man3GlcNAc2) na presença de resíduos GlcNAc rende um N-glicano triantenular: GlcNAc4Man3GlcNAc2 De preferência, a actividade GnTV da presente invenção é expressa em células hospedeiras fúngicas unicelulares ou multicelulares, produtoras de glicanos triantenários, por exemplo em PBP43 de P.pastoris, onde a actividade GnTV cataliza a tranferência de um resíduo GlcNAc para a ramificação Manai, 6 do substrato oligossacárido GicNAc3Man3GlcNAc2, formando uma ligação glicosídica GlcNAcp 1,6.

Numa concretização, utilizando o método da biblioteca de ADN combinatória da invenção, YSH-44 de P.pastoris é transformado com as construções de fusão GnTIVB/S. cerevisiae MNN2 (s) e GnTV/S.cerevisiae MNN2 (s) . A figura 49 mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe 99 designada como PBP46, exibindo um pico predominante a 1747 m/z [z], que corresponde à estrutura GlcNAc4Man3GlcNAc2 triantenular N-glicano e um pico residual a 1543 m/z [y] , qeu corresponde à estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 triantenular N-glicano.

Noutro exemplo, utilizando o método da biblioteca de ADN combinatória da invenção, YSH-44 de P.pastoris é transformado com uma combinação diferente da fusão da enzima e lider: Plasmideo pPB128, contendo construções de fusão GnTIVA(A82)/S.cerevisiae MNN2(s) e plasmideo pPB140, contendo construções de fusão GnTV(Δ145)/S.cerevisiae MNN2(s). A figura 50 mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe transformada designada PBP94, exibindo um pico predominante a 1743 m/z [z], que corresponde à estrutura GlcNAc4Man3GlcNAc2 triantenular N-glicano.

Assim, nalgumas concretizações, um hospedeiro da presente invenção proporciona uma célula hospedeira, caracterizada pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem, preferencialmente pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 % em mole uo mais da estrutura N-glicano desejada GlcNAc4Man3GlcNAc2. Numa concretização mais preferida, ao expressar as actividades GnTIV e GnTV da presente invenção, a célula hospedeira produz a estrutura N-glicano multiantenular desejada.

Nem todas as combinações de domínio líder/catalítico produzem as actividades enzimáticas desejadas na produção de estruturas glicano multiantenárias. É criada uma grande variedade de combinações de domínio líder/catalítico, utilizando os métodos e bibliotecas da invenção, sendo 100 apenas algumas úteis na produção dos intermediários presentemente desejados. Ainda assim, a presente invenção engloba mesmo as combinações que presentemente não exibem uma actividade enzimática desejada na célula hospedeira exemplificada. Considera-se que estas e outras combinações semelhantes podem ser úteis com ou sem ligeiras modificações, utilizando técnicas bem conhecidas quando são expressas, por exemplo noutras células hospedeiras, incluindo aquelas que foram modificadas para produzir glicoformas semelhantes às humanas.

Expressão de N-acetilglucosaminiltransferase V

Noutro exemplo descrito, um ácido nucleico codificador da actividade GnTV é expresso em células hospedeiras produtoras das estruturas nucleares GlcNAc2Man3GlcNAc2, resultando na formação de estruturas GicNAc3Man3GlcNAc2 triantenárias. A sequência GnTV conhecida é descrita na figura 43. Num exemplo, utilizando o método da biblioteca de ADN combinatório descrito, uma construção pPB140 (figura 40B), compreendendo o lider S.cerevisiae MNN2(s) (Número de acesso GenBank NP_009571) fundido a um domínio GnTV cataliticamente activo de ratinho (GnTV Δ145) é expressa numa estirpe de P.pastoris YSH-44 (exemplo 15) produzindo assim a estruturas GlcNAc3Man3GlcNAc2 N-glicano triantenárias (exemplo 25) . A figura 48 mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa na estirpe transformada, designada PBP32, exibindo um pico predominante a 1559 m/z [y] , que corresponde à estrutura N-glicano triantenular e um segundo pico a 1355 m/z [u] , que corresponde à estrutura GlcNAc3Man3GlcNAc2 N-glicano triantenular. (vide figura 29 101 para comparação, que mostra o espectro MALDI-TOF de N-glicanos libertados de uma proteína kringle 3, expressa em células YSH-44, produtoras de GlcNAc2Man3GlcNAc2) . Assim, um hospedeiro mencionado é caracterizado pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem pelo menos 40 % mole de uma estrutura triantenular. GlcNAc3Man3GICNAc2. De preferência, o hospedeiro mencionado produz pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 % em mole ou estrutura triantenular maior, catalizada por GnTV.

Expressão de N-acetilglucosaminiltransferase VI A invenção proporciona também uma célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular transformada com um ácido nucleico codificador da actividade N-acetilglucosaminiltransferase VI ("GnTVI"), que catalisa a transferência de um residuo açúcar β(1,4) N-acetilglucosamina na ramificação Manai,6 do GlcNAc β1,4 -(GlcNAc β 1,2) Manual, 6 (GlcNAc β 1,4 (GlcNAc β 1,2) Manai,3) Man β1,4 - 61οΝΑοβ 1,4 - 01οΝΑοβ1,4 - Asn de um substrato oligossacárido. A adição de um 61οΝΑοβ1,4 por GnTIV a um substrato aceitador (por exemplo GlcNAc4Man3GlcNAc2) rende um N-glicano chamado penta-antenário. A adição do resíduo GlcNAc forma uma ligação glicosídica 61οΝΑοβ1,4 no susbtrato oligossacárido. Numa concretização, um ácido nucleico codificador da actividade GnTVI é expresso numa célula hospedeira produtora de N-glicanos pentaantenários, tais como GicNAc5Man3GlcNAc2 Noutra concretização, utilizando um fragmento de ADN codificador da actividade GnTVI, tal como o apresentado na figura 44, uma construção de plasmídeo compreendendo o líder S.cerevisiâe MNN2(s) (Número de acesso GenBank 102 NP_009571) fundido a um dominio GnTVI cataliticamente activo de de Gallus gallus é expressa numa estirpe de P.pastoris YSH-44 produzindo assim estruturas

GlcNAc5Man3GlcNAc2 N-glicano penta-antenárias. Assim, uma célula hospedeira da invenção é caracterizada pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que produzem N-glicanos penta-antenários numa percentagem detectável.

Expressão de N-acetilglucosaminiltransferase IX

Noutra concretização, o ácido nucleico codificador da actividade GnTIX (por exemplo GenBank AN NP_945193) é expresso numa célula hospedeira da invenção em que a actividade GnTIX cataliza a transferência de resíduos GlcNAc para substratos aceitadores de glicanos complexos (por exemplo GicNAc2Man3GlcNAc2) na ausência de GnTIV, GnTV ou GnTVI. Reevlou-se que o ácido nucleico codificador da actividade GnTIX, que normalmente parece ser expresso exclusivamente no cérebro, cataliza a síntese de um oligossacárido N-ligado únic em células mutantes CHO (Raju et al., (1998) J Biol Chem 273, 14090-14098). A expressão de um GnTIX recombinante humano revelou que a actividade GnTV, catalizadora da transferência de GlcNAc para a posição 6-OH da ramoficação manose ligada a α 1,6 do oligossacárido GicNAc2Man3GlcNAc2-PA através da ligação βΐ,β, para além da actuar como ramificação manose ligada a al, 3- (J Biol Chem. 2003 Out 31,-278 (44) :43102-9) . GnTIX é capaz de catalizar a transferência de GlcNAc para a posição 6-OH da manose na sequência GlcNAcpi,2-Manal.

Assim, a presente invenção proporciona um método de produção de estruturas glicano tetra-antenárias em 103 P.pastoris, utilizando um ácido nucleico codificador da actividade GnTIX (figura 45). De preferência, a introdução e expressão da actividade GnTIX cataliza a transferência de resíduos GlcNAc para o susbtrato aceitador GicNAc2Man3GlcNAc2, produtor de GicNAc4Man3GlcNAc2 e GicNAc3Man3GlcNAc2. A expressão pela célula hospedeira de actividade GnTIX cataliza a transferência de resíduos GlcNAc para a posição 6-OH, de preferência em ambas as ramificações Manai,3 e Manai,6 do substrato oligossacárido GicNAc2Man3GlcNAc2 produtor da estrutura tetra-antenária GicNAc4Man3GlcNAc2. Numa concretização, uma célula hospedeira, produtora do substrato aceitador GicNAc2Man3GlcNAc2, tal como P. pastoris YSH-44, é transformada com um plasmídeo (tal como pPB176), compreendendo um gene codificador da actividade GnTIX (Δ43) fundido em grelha com o líder S.cerevisiae MNN2 (s) (exemplo 29). A célula hospedeira é caracterizada pela sua capacidade para produzir pelo menos temporariamente, N-glicanos que exibem pelo menos 5 % ou de preferência mais de actividade GNTIX catalizadora da transferência de GlcNAc para a posição 6-OH da ramificação manose ligada a al,6 do oligossacárido GicNAc2Man3GlcNAc2 através da ligação β1,6 para além de actuar na ramificação ligada a al,3 do substrato oligossacárido.

Adicionalmente, o ácido nucleico codificador da actividade GnTIX pode ser codão optimizado para a eficiência translacional em levedura utilizando procedimentos bem conhecidos. A figura 46 mostra o fragmento de ADN optimizado codão que codifica parte GnTIX humano sem o domínio TM (443), sisntetizado a partir de oligonucleótidos por meio de PCR. 104

Variações de glicanos multi-antenários A presente invenção está adaptada à produção de uma variedade de glicanos multi-antenários que são adequados para fins terapêuticos. Prevê-se que os glicanos com as mesmas ligações GlcNAcp- podem aumentar a semi-vida das proteínas. Assim, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira eucariota inferior compreendendo N-glicanos com pelo menos dois resíduos GlcNAc ou a ramificação Manai,3 ou Manai,6 do intermediário oligossacárido "core" trimanose (por exemplo Man3GlcNAc2) . Numa concretização, a célula hospedeira eucariota inferior compreende pelo menos dois resíduos GlcNAcpi,4 na ramificação Manai,3 e Manai,6 do intermediário oligossacárido "core" trimanose (por exemplo Man3GlcNAc2) . Noutra concretização, a célula hospedeira eucariota inferior compreende pelo menos dois resíduos GlcNAcpl,6 na ramificação Manai,3 e Manai,6 do intermediário oligossacárido "core" trimanose (por exemplo Man3GlcNAc2) . Ainda noutra concretização, a célula hospedeira eucariota inferior compreende pelo menos dois resíduos GlcNAcpl,2 na ramificação Manai,3 e Manai,6 do intermediário oligossacárido "core" trimanose (por exemplo Man3GlcNAc2) .

Como indicado abaixo, enquanto as células hospedeiras fúngicas, unicelulares ou multicelulares são hospedeiros preferidos para a produção de proteínas terapêuticas utilizando os métodos da invenção, a presente invenção é também útil para modificar perfis N-glicano de glicoproteínas feitas em qualquer célula hospedeira 105 eucariota, de preferência numa célula hospedeira não humana (por exemplo de mamífero). Células hospedeiras da presente invenção

Uma célula hospedeira preferida da invenção é uma célula fúngica unicelular ou multicelular, por exemplo levedura, um fungo filamentoso unicelular ou multicelular. Células fúngicas unicelulares e multicelulares que são capazes de produzir glicoproteínas com o N-glicano Man5GlcNAc2 ligado são particularmente úteis uma vez que (a) lhes falta um elevado grau de manosilação (por exemplo maior que 8 manoses por N-glicano ou especialmente 30 a 40 manoses) revelam uma imunogenicidade reduzida nos seres humanos e (b) o N-glicano é um substrato para mais reacções de glicosilaçâo formarem uma glicoforma ainda mais semelhante a do ser humano, por exemplo por meio da acção de GlcNAc transferase I (figura 1B; β1,2 GnTI) para formar GlcNAcMansGlcNAc2. É obtido um rendimento superior a 30 % em mole, mais preferencialmente um rendimento de 50, 60, 70, 80, 90 ou mesmo 100 % em mole de glicoproteínas com N-glicanos com uma estrutura Man5GlcNAc2. Numa concretização preferida, revela-se que mais de 50% da estrutura

Man5GlcNAc2 é um substrato para uma actividade GnTI e pode servir como um substrato desses in vivo.

Eucariotas inferiores da invenção preferidos incluem, sem constituir limitação: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaef adens, Pichia minutia (por exemplo, Ogataea minute, Pichia iindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., 106

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp. , Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa.

Em cada concretização anterior, o método é orientado para a preparação de uma célula hospedeira em que os precursores oligossacáridos são enriquecidos em Man5GlcNAc2. Estas estruturas são desejáveis poruqe podem ser processadas por tratamento in vitro, utilizando por exemplo o método de Maras e Contreras, da patente norte-americana no 5 834 251. Numa concretização preferida, contudo, os precursores enriquecidos em Man5GlcNAc2 são processados por pelo menos uma outra reacção de glicosilação in vivo - com glicosidases (por exemplo α-manosidases) e glicosiltransferases (por exemplo GnTI) - para produzir N-glicanos semelhantes oas humanos.

Os precursores oligossacáridos enriquecidos em Man5GlcNAc2, por exemplo, são preferencilamente processados para os que têm estruturas nucleares GlcNAcManxGlcNAc2, em que x é maior que 3, 4 ou 5 e preferencialmente 3. N-glicanos com uma estrutura "core" GlcNAcManxGlcNAc2, em que x é maior que 3, podem ser convertidos em GlcNAcMan3GlcNAc2, por exemplo por meio de tratamento com uma actividade manosidase a-1,3 e/ou a-1,6-1,3, onde aplicável. Processamento adicional de GlcNAcMan3GlcNAc2 por meio de tratamento com glicosiltransferases (por exemplo GnTII) produz estruturas nucleares GlcNAc2Man3GlcNAc2 que podem então ser modificadas facultativamente, por exemplo, por meio de tratamento ex vivo ou por meio de expressão 107 heteróloga na célula hospedeira de um conjunto de enzimas de glicosilação adicionais, incluindo glicosiltransferases, transportadores de açúcar e manosidases (vide abaixo) para se tornarem N-glicanos semelhantes aos humanos. As glicoproteinas semelhantes as humanas preferidas que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção incluem as que compreendem N-glicanos com sete ou menos, três ou menos resíduos manose e que compreendem um ou mais açúcares seleccionados do grupo constituído por galactose, GlcNAc, ácido siálico e fucose.

Outra célula hospedeira não-humana preferida da presente invenção é uma célula fúngica unicelular ou multicelular, que é diminuída ou esgotada na actividade de um ou mais do que um gene alg (incluindo actividade enzimática que é um homólogo ou equivalente de uma actividade alg). Outra célula hospedeira preferida da invenção é diminuída ou esgotada na actividade de uma ou mais do que uma enzima (diferente de actividades alg) que manosila a ramificação a-1,6 da estrutura oligossacárido ligada a lípido. Enquanto as células hospedeiras fúngicas unicelulares ou multicelulares são preferidas, imagina-se uma grande variedade de células hospedeiras com as propriedades anteriormente mencionadas como sendo úteis nos métodos da presente invenção. As células vegetais, por exemplo, podem ser manipuladas geneticamente para exprimirem uma glicoproteína semelhante à humana de acordo com a presente invenção. Do mesmo modo, uma variadade de células hospedeiras não-humanas, de mamífero, podem ser alteradas para expressar glicoproteinas mais semelhantes às humanas, utilizando os métodos da presente invenção. Uma célula hospedeira apropriada pode ser geneticamente modificada ou 108 pode ser utilizado um dos muitos mutantes já descritos em leveduras. Uma célula hospedeira preferida da invenção, como presentemente exemplificado, é o mutante hipermanosilação-menos (OCHl) em Pichia pastoris, que foi ainda modificado para eliminar o gene alg3. A invenção proporciona ainda células hospedeiras fúngicas adicionais, unicelulares ou multicelulares, capazes de produzir glicoproteinas com N-glicanos bissectados, tal como GicNAcMan5GlcNAc2, GicNAc2Man5GlcNAc2, GicNAc2Man3GlcNAc2 e preferencialmente GicNAc3Man3GlcNAc2. Numa concretização preferida da presente invenção, as células hospedeiras, tal como definidas nas reivindicações compreendem uma actividade GnTIII. Numa concretização mais preferida, as células hospedeiras, tal como definidas nas reivindicações, compreendem ainda uma ou mais do que uma actividade seleccionada de entre: GnTI, GnTII e GnTV. As células hospedeiras preferidas expressam GnTI, GnTII e GnTIII e expressam adicionalmente o GnTIV como definido nas reivindicações e/ou GnTV. Ainda mais preferencialmente, uma ou mais do que uma actividade GnT das células hospedeiras é substancialmente intracelular.

Assim, em concretizações preferidas da invenção, células hospedeiras compreendendo uma ou mais do que uma actividade GnT produzem N-glicanos compreendendo estruturas, incluindo, sem se limitar a GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan4GlcNAc2 ou GlcNAcMan5GlcNAc2, capazes de reagir com uma actividade enzimática GnTIII para produzir N-glicanos bissectados correspondentes. As actividades enzimáticas convertem assim as glicoproteinas contendo estes N-glicanos em formas com propriedades novas e mais desejáveis. Porque se pressupõe que actualmente que GnTIII 109 inibe actividade GnT adicional em células de mamifero, o especialista na técnica deverá ter em consideração que uma reacção de glicosilação sequencial pode ou não ser importante. A presente invenção contempla, no entanto, a adição de GnTI e GnTII por qualquer ordem ou juntos. Deve-se também pressupor que outras actividades enzimáticas na célula, tal como por exemplo, uma ou mais do que uma actividade manosidase desejada (por exemplo a-1,2-manosidase, manosidase I, manosidase II) podem actuar de forma concertada com as actividades GnT para gerar mais outras glicoproteinas semelhantes às humanas de interesse (vide figura 1B) .

Numa concretização preferida, uma manosidase II ou respectivo fragmento cataliticamente activo é introduzido na célula hospedeira da invenção para encurtar as ramificações contendo manose al,3 e al,6 de uma estrutura "core" pentamanose bissectada, tal como GicNAc2MansGlcNAc2. Os glicanos resultantes (por exemplo GicNAc2Man4GlcNAc2 e GicNAc2Man3GlcNAc2 bissectado) são substratos preferidos para posterior modificação N-glicano semelhante à humana.

Noutra concretização da invenção, as células hospedeiras compreendem uma estrutura "core" Man5GlcNAc2 ou uma estrutura "core" Man3GlcNAc2 que é modificada por um ou mais do que um GlcNAc. Deve-se pressupor que qualquer uma das estruturas nucleares podem incluir outras modificações para além da modificação GlcNAc. De preferência, 10% ou mais das estruturas nucleares são modificadas por GlcNAcs. O mais preferido é 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou ainda mais das estruturas nucleares.

Formação de N-glicanos complexos 110 A formação da síntese de N-glicano complexo é um processo sequencial, pelo qual resíduos açúcar específicos são removidos e ligados à estrutura oligossacárido "core". Em eucariotas superiores, esta é conseguida por meio de exposição sequencial do substrato a várias enzimas de processamento. Estas enzimas executam reacções específicas, dependendo da sua localização particular no interior da cascata de processamento inteira. Esta "linha de montagem" consiste em RE, Golgi cis, mediano e trans e rede Golgi trans com respectivo ambiente de processamento específico. Para re-criar o processamento das glicoproteínas humanas no Golgi e RE de eucariotas inferiores, têm de ser expressas numerosas enzimas (por exemplo glicosiltransferases, glicosidases, fosfatases e transportadores) e especificamente marcadas para estes organelos e, de preferência, numa localização do forma a que funcionem mais eficientemente relativamente ao seu ambiente, bem como em relação a outroas enzimas na via.

Uma vez que um objectivo dos métodos descritos consiste em conseguir uma estirpe robusta produtora de proteína, capaz de ter um bom desempenho num processo de fermentação industrial, a integração de múltiplos genes no cromossoma da célula hospedeira envolve planeamento cuidadoso. Como anteriormente descrito elimina-se preferencialmente um ou mais do que um gene codificador de enzimas conhecidas como sendo características de reacções de glicosilação não-humanas. A estirpe celular manipulada é transformada com uma gama de genes diferentes, codificadores das actividades desejadas, e estes genes são transformados de um modo estável, garantindo que a actividade desejada é mantida ao longo do processo de fermentação. 111

Qualquer combinação das actividades enzimáticas seguintes pode ser geneticamente simplesmente ou multiplamente manipulada no hospedeiro, utilizando métodos da presente invenção: sialiltransferases, manosidases, fucosiltransferases, galactosiltransferases, GlcNActransferases, transportadores específicos do RE e Golgi (por exemplo transportadores simporta e antiporta para UDP-galactose e outros precursores) outras enzimas envolvidas no processamento de oligossacáridos e enzimas envolvidas na síntese de precursores oligossacáridos activados, tal como UDP-galactose, ácido CMP-N-acetilneuramínico. De preferência, as actividades enzimáticas são introduzidas em uma ou várias moléculas de ácido nucleico (ver também abaixo) . As moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas simplesmente ou multiplamente, por exemplo no contexto de uma biblioteca de ácidos nucleicos, tal como uma biblioteca combinatória da presente invenção. Deve-se subentender, no entanto, que actividades enzimáticas simples ou múltiplas podem ser introduzidas na célula hospedeira de qualquer forma, incluindo, sem constituir limitação, métodos de libertação de proteína e/ou o uso de uma ou mais do que uma molécula de ácido nucleico sem necessariamente utilizar uma biblioteca de ácido nucleico ou biblioteca combinatória da invenção.

Expressão de glicosiltransferases para produzir N-glicanos complexos:

Com a informação da sequência de ADN, o perito na especialidade pode clonar moléculas de ADN codificadoras de actividades GnT (por exemplo, exemplo 3, 8, 11, 15 e 18). Utilizando técnicas normalizadas, bem conhecidas dos 112 peritos na especialidade, moléculas de ácido nucleico, codificadoras de GnTI, II, 111, IV ou V (ou codificadoras dos respectivos fragmentos cataliticamente activos) podem ser inseridos em vectores de expressão apropriados, sob o controlo transcricional de promotores e outroas sequências de controlo da expressão, capazes de executar a transcrição numa célula hospedeira seleccionada da invenção, por exemplo hospedeiro fúngico tal como Pichia sp., Kluyveromyces sp. e Aspergillus sp., tal como presentemente descrito, de forma que uma ou mais do que uma destas enzimas GnT de mamífero possam ser activamente expressas numa célula hospedeira eleita para a produção de uma glicoproteína complexa semelhante à do ser humano (por exemplo, exemplos 8, 20 e 21) . Várias glicosiltransferases individuais têm sido clonadas e expressas em S.cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) e outros fungos, sem, contudo, demonstrar o resultado desejado de "humanização" no padrão de glicosilação do organismo (Yoshida et al. (1999) Glycobiology 9(1):53—8; Kalsner et al. (1995) Glycoconj. J. 12(3):360-370). Especulou-se que a estrutura hidrato de carbono necessária para aceitar açúcares por meio da acção destas glicosiltransferases não estaria presente em quantidade suficiente, o que muito provavelmente contribuiu para a falta de formação de N-glicanos complexos.

Um método preferido da presente invenção proporciona a expressão funcional de um GnT, tal como GnTI, GnTII, e GnTIII no aparelho de Golgi cis, mediano ou trans, bem como garante um fornecimento suficiente de UDP-GlcNAc (por exemplo por meio da expressão de um transportador UDP-GlcNAc, ver exemplos abaixo). 113 Método Para Fornecimento De Precursores De NucleótidoAçúcar Ao Aparelho De Golgi:

Para que uma glicosiltransferase funcione satisfatoriamente no Golgi, é necessário que a enzima exija uma concentração suficiente de um açúcar nucleótido adequado, que é o dador de elevada energia da fracção açúcar adicionada a uma glicoproteina nascente. Em seres humanos, a totalidade da gama de precursores de açúcar no nucleótido(por exemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuraminico, UDP-galactose, etc.) são sintetizados geralmente no citosol e transportados para o Golgi, onde são ligados ao oligossacárido "core" pelas glicosiltransferases.

Para replicar este processo em células hospedeiras não humanas, tal como eucariotas inferiores têm de ser expressos transportadores específicos do nucleósido açúcar no Golgi para garantir níveis adequados de precursores de açúcar nucleósido. (Sommers e Hirschberg, 1981 J. Cell Biol. 91 (2): A406-A406; Sommers e Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez e Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138: 709-715). Estes açúcares nucleótido podem ser fornecidos para os compartimentos adequados, por exemplo expressando no microorganismo hospedeiro um gene exógeno, codificador de um transportador de um nucleótido açúcar. A escolha da enzima transportadora é influenciada pela natureza da glicosiltransferase exógena utilizada. Por exemplo, uma transferase GlcNAc pode exigir um transportador UDP-GlcNAc, uma fucosiltransferase pode exigir um transportador GDP-fucose, uma galactosiltransferase pode exigir um transportador UDP- 114 galactose ou uma sialiltransferase pode exigir um transportador ácido siálico CMP. A proteína transportadora adicionada faz passar um açúcar nucleótidodo citosol para o aparelho de Golgi, onde o açúcar nucleótidopode ser feito reagir pela glicosiltransferase, por exemplo para alongar um N-glicano. A reacção liberta um nucleótido-difosfato ou monofosfato, por exemplo UDP, GDP ou CMP. Os nucelósidos monofosfato podem ser exportados directamente do Golgi em troca de açúcares trifosfato nucleósidos por um mecanismo antiporta. A acumulação de um difosfato nucleósido, contudo, inibe mais actividade de uma glicosiltransferase. Uma vez que esta reacção parece ser importante para uma glicosilação eficiente, é frequentemente desejável proporcionar uma cópia expressada de um gene codificador de uma difosfatase nucleótido. A difosfatase (específica para UDP ou GDP conforme apropriado) hidroliza o difosfonucleósido para se obter nucleósido-monofosfato e fosfato inorgânico.

Em seguida são descritas enzimas transportadoras adequadas, que são tipicamente de origem mamífera. Estas enzimas podem ser geneticamente manipuladas numa célula hospedeira seleccionada, utilizando os métodos da invenção.

Noutro exemplo, a2,3-sialiltransferase ou a2,6-sialiltransferase tapam resíduos de galactose com ácido siálico no Golgi trans e TNG de ser humano, conduzindo à forma amdura da glicoproteína (figura 1B) . Para tornar a manipular geneticamente esta etapa de processamento numa levedura ou fungo metabolicamente modificado irá implicar (1) actividade a2,3-sialiltransferase ou a2,6-sialiltransferase e (2) um fornecimento suficiente de ácido 115 CM EP-N-acetil neuramínico no Golgi trans de levedura. Para obter actividade a2,3-sialiltransferase suficiente no Golgi trans, por exemplo, o domínio catalítico de uma sialiltransferase (por exemplo de ser humano) tem de ser orientado para o Golgi trans em fungos (vide anterior). Do mesmo modo, os transportadores têm de ser modificados geneticamente para permitir o transporte de ácido CM EP-N-acetil neuramínico para o Golgi trans. Actualmente, não há qualquer indicação de que os fungos sintetizem ou mesmo transportem quantidades suficientes de ácido CM EP-N-acetil neuramínico para o Golgi. Consequentemente, para garantir um adequado fornecimento de substrato para as glicosiltransferases correspondentes é necessário modificar metabolicamente a produção de ácido CMO-siálico no fungo. UDP-N-acetilglucosamina

Foi clonado o cADN do transportador UDP-N-acetilglucosamina, que foi reconhecido através de uma pesquisa de homologia na base de dados de etiquetas de sequências expressas (dbEST) (Ishida (1999) J. Biochem.126(1):68-77). 0 transportador de membrada do Golgi de mamífero para UDP-N-acetilglucosamina foi clonado por correcção fenotípica com cADN de células renais de canídeo (MDCK) de um mutante de Kluyveromyces lactis recentemente caracterizado, deficiente no transporte do Golgi do açúcar nucleótido anterior (Guillen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(14):7888-7892). Os resultados demonstram que o gene transportador de UDP-GlcNAc de Golgi de mamífero possui toda a informação necessária para que a proteína seja expressa e marcada funcionalmente para o aparelho de Golgi da levedura e que duas proteínas com sequências de aminoácidos muito diferentes podem transportar o mesmo 116 soluto dentro da mesma membrana Golgi (Guillen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(14):7888-7892).

Assim, é possível incorporar a expressão de um transportador UDP-GlcNAc numa célula hospedeira por meio de uma construção de ácido nucleico, que pode conter, por exemplo: (1) uma região em que a contrução transformada é mantida na célula (por exemplo, origem da replicação ou uma região que medeia a intrgração cromossómica), (2) um gene marcador que permite a selecção de células que foram transformadas, incluindo marcadores contra-seleccionáveis e recicláveis, tal como ura3 ou T-urfl3 (Soderholm et al. (2001) Biotechniques 31(2):306-10) ou outros marcadores de selecção bem caracterizados (por exemplo, his4, bla, Sh ble etc.), (3) gene ou respectivo fragmento codificador de um transportador UDP-GlcNAc funcional (por exemplo de K. lactis, (Abeijon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 93:5963-5968) ou de H.Sapiens (Ishida et al. (1996) J. Biochem. (Toquio) 120(6):1074-8) e (4) um promotor que activa a expressão da biblioteca da construção de fusão do domínio localização/catalítico. GDP-fucose O transportador de GDP-fucose membrana de Golgi de fígado de rato foi identificado e purificado por Puglielli e Hirschberg 1999 J. Biol. Chem. 274(50):35596-35600. O gene correspondente não foi identificado, no entanto pode ser utilizada sequenciação N-terminal para conceber sondas oligonucleótido específicas do gene correspondente. Estes oligonucleótidos podem ser utilizados como sondas para clonar o gene codificador do transportador GDP-fucose. UDP-galactose 117

Dois genes heterólogos gmal2(+), codificadores de alfa 1,2-galactosiltransferase (alfa 1,2 GalT) de Schizosaccharomyces pombe e (hUGT2) codificando o transportador UDP-galactose humano (UDP-Gal) foram expressos funcionalmente em S.cerevisiae para examinar as condições intracelulares necessárias para a galactosilação. A correlação entre a galactosilação da proteína e a actividade de transporte UDP-galactose indicou que foi antes um fornecimento exógeno de transportador UDP-Gal em vez de alfa 1,2 GalT que desempenhou um papel fundamentar para a glicosilação eficiente em S.cerevisiae (Kainuma (1999) Glycobiology 9(2): 133-141). Do mesmo modo, foi clonado um transportador UDP-galactose de S.pombe (Segawa, H., et al. 1999 FEBS Letters 451(3): 295-298). Ácido CMP-N-acetilneramínico (ácido CMP-siálico). 0 transportador de CMP-ácido siálico humano (hCST) foi clonado e expresso em células Lee 8 CHO (Aoki et al. (1999) J. Biochem. (Tokr) 126 (5) : 940-50; Eckhardt et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248(1):187-92). A expressão funcional do transportador CMP-ácido siálico de murino foi conseguida em Saccharomyces cerevisiae (Berninsone, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19): 12616-9). Encontrou-se ácido siálico nalguns fungos, no entanto não é evidente se o sistema hospedeiro eleito será capaz de fornecer níveis suficientes de ácido CMP-siálico. O ácido siálico tanto pode ser fornecido no meio como integrando no genoma hospedeiro vias fúngicas alternativas envolvidas na síntese do ácido siálico.

Expressão de difosfatases: 118

Quando os açúcares são trnasferidos para uma glicoproteína é libertado um nucleótido difosfato ou monofosfato dos precursores de nucleótido açúcar. Enquanto os monofosfatos podem ser directamente exportados, em troca de açúcares trifosfato nucleótido por um mecanismo antiporta, os difosfonucleótidos (por exemplo GDP) têm de ser clivados por fosfatases (por exemplo GDPase) para se obter nucleótidos mono-fosfatos e fosfatos inorgânicos antes de serem exportados. Esta reacção parece ser importante para uma glicosilação eficiente, na medida em que se constatou que a GDPase de S.cerevisiae é necessária para a manosilação. No entanto, a enzima tem apenas 10% da actividade em relação à UDP (Berninsone et aL, 1994 J. BioL Chem. 269(1):207-211). As células eucariotas inferiores não têm, frequentemente, actividade difosfatase específica no Golgi, uma vez que não utilizam precursores açúcar-UDP para a síntese de glicoproteínas nos Golgi. Constatou-se que a Schizosaccharomyces pombe, uma levedura que se verificou adicionar resíduos de galactose aos polissacarídeos da membrana celular (da UDP-galactose), tem actividade UDPase específica, indicando a necessidade de uma enzima destas (Berninsone et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(1):207-211). A UDP é conhecida como um potente inibidor das gi icosiltransferases e a remoção deste subproduto da glicosilação é importante para prevenir a inibição da glicosiltransferase no lúmen do Golgi (Khatara et al. (1974) Eur. J. Biochem. 44:537-560). Métodos de alteração de N-glicanos num hospedeiro por meio da expressão de uma actividade enzimática marcada a partir de uma molécula de ácido nucleico 119 São também descritos métodos para a produção de uma glicoproteína semelhante à humana numa célula hospedeira não humana, compreendendo a etapa de introdução na célula de uma ou mais do que uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima ou enzimas para a produção da estrutura hidrato de carbono Man5GlcNAc2. Como descrito, uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma ou mais do que uma actividade de manosidase, envolvida na produção de MansGlcNAc2 de ManeGlcNAc2 ou ManeGlcNAc2 é introduzida no hospedeiro. A invenção refere-se ainda a métodos de preparação de glicoproteinas alteradas numa célula hospedeira, compreendendo a etapa de introdução na célula hospedeira de uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma ou mais do que uma enzima ou actividade de glicosilação. As actividades enzimáticas preferidas são seleccionadas do grupo constituído por transferase UDP-GlcNAc, UDP-galactosiltransferase, GDP-fucosiltransferase, CMP-sialiltransferase, transportador UDP-G IcNAc, transportador UDP-galactose, transportador GDP-fucose, transportador ácido CMP-siálico e difosfatases nucleótido. Numa concretização particularmente preferida, o hospedeiro é seleccionado ou geneticamente modificado para expressar duas ou mais actividades enzimáticas nas quais o produto de uma actividade aumenta os niveis de substrato da outra actividade, por exemplo uma glicosiltransferase e um transportador açúcar correspondente, por exemplo, actividades transportadores GnTI e UDP-GlcNAc. Noutra concretização preferida, o hospedeiro é seleccionado ou geneticamente codificado para expressar uma actividade para remover os produtos que possam posteriormente inibir as 120 reacções de glicosilação, por exemplo uma actividade difosfatase específica de UDP ou GDP.

Os métodos preferidos da invenção envolvem a expressão de uma ou mais do que uma actividade enzimática a partir de uma molécula de ácido nucleico numa célula hospedeira e compreendem a etapa de marcação de pelo menos uma actividade enzimática para uma localização sub-celular desejada (por exemplo um organelo), formando uma proteína de fusão que compreende um domínio catalítico da enzima e um peptídeo de sinal de marcação celular, por exemplo, um peptídeo de sinal heterólogo que não é normalmente ligado a ou associado ao domínio catalítico. A proteína de fusão é codificada por pelo menos uma construção genética ("construção de fusão") compreendendo um fragmento de ácido nucleico codificador de um peptídeo de sinal de marcação celular ligado à mesma grelha de leitura translacional ("in frame") a um fragmento de ácido nucleico codificador de uma enzima (por exemplo enzima de glicosilação) ou um respectivo fragmento cataliticamente activo. 0 componente peptídeo de sinal de marcação da construção de fusão ou proteína é preferencialmente derivado de um membro do grupo constituído por: Proteínas ligadas à membrana do RE ou Golgi, sinais de recuperação, proteínas de membrana tipo II, proteínas de membrana tipo I, transportadores de açúcar nucleótido transmembranar, manosidases, sialiltransferases, glucosidases, manosiltransferases e fosfomanosiltransferases. O componente domínio catalítico da construção de fusão ou proteína é preferencialmente derivado de uma glicosidase, manosidase ou actividade glicosiltransferase derivada de um 121 membro do grupo constituído por GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, GalT, Fucosiltransferase e Sialiltransferase. 0 domínio catalítico tem, preferencialmente um pH óptimo dentro de 1,4 unidades de pH do nível óptimo de pH de outras enzimas representativas no organelo em que a enzima está localizada ou possui uma actividade óptima a um pH entre 5,1 e 8,0. Numa concretização preferida, o domínio catalítico codifica uma manosidase seleccionada do grupo constituído por manosidase C. elegans IA, manosidase C. elegans IB, manosidase D. melanogaster IA, manosidase H. sapiens IB, manosidase P. citrinum I, manosidase ratinho IA, manosidase ratinho IB, manosidase A. nidulans IA, manosidase A. nidulans IB, manosidase A. nidulans IC, manosidase ratinho II, manosidase C. elegans II, manosidase H. sapiens II, manosidase fix e manosidase III.

Selecção de uma enzima de glicosilação: pH óptimo e localização subcelular

Numa concretização da presente invenção, uma glicoproteína semelhante à humana é feita de modo eficiente numa célula hospedeira eucariota não humana por meio da introdução num compartimento sub-celular da célula uma enzima de glicosilação seleccionada por ter um pH óptimo semelhante ao pH óptimo de outras enzimas no compartimento sub-celular marcado. Por exemplo, a maioria das enzimas que estão activas no RE e aparelho de Golgi de S. cerevisiae têm pH óptimos, situados entre 6,5 e 7,5 (consultar quadro 3). Uma vez que a glicosilação de proteínas é um processo muito desenvolvido e eficiente, pode-se concluir que o pH interno do RE e do aparelho de Golgi se situa também entre cerca de 6 e 8. No entanto, todas as anteriores abordagens para reduzir a manosilação por acção de manosidases 122 recombinantes em hospedeiros finais introduziram enzimas que têm um pH óptimo de cerca de 5,0 (Martinet et al. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, and Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(41): 26298-26304). A pH 7,0, a actividade destas manosidases determinada ín vítro fica reduzida a menos de 10 %, que é actividade provavelmente insuficiente no ponto de utilização, nomeadamente o RE e GOlgi cis, para a produção in vivo eficiente de Man5GlcNAc2 em N-glicanos. Assim, uma concretização preferida da presente invenção marca uma enzima de glicosilação seleccionada (ou respectivo domínio catalítico) por exemplo uma α-manosidase, para uma localização sub-celular na célula hospedeira (por exemplo um organelo) em que o pH óptimo da enzima ou domínio está situado entre as unidades de pH 1,4 do pH óptimo médio de outras enzimas marcadoras representativas, localizadas no(s) mesmo(s) organelo(s). O pH óptimo da enzima a ser marcada para um organelo específico deve ser equivalente ao pH óptimo de outras enzimas encontradas no mesmo organelo, de forma a maximizar a actividade por enzima unitária. O quadro 3 resume a actividade das manosidases de várias fontes e respectivos pH óptimos. O quadro 4 resume as respectivas localizações sub-celulares típicas.

Quadro 3. Manosidases e respectivo pH óptimo.

Fonte Enzima pH óptim 0 Referência Aspergillus saitoi a-1,2-manosidase 5.0 Ichishima et al. (1999) Biochem. J. 123 339 (Pt 3) :589-597 Trichoderma reesei oí-1,2-mano sida se 5.0 Maras et aL (2000) J. BiotechnoL 77 (2-3) :255-263 Penicillium citrinum oí-D-1,2-manosidase 5.0 Yoshida et aL (1993) Biochem. J. 290(Pt 2):349-354 C. elegans a-1,2-manosidase 5.5 see Figure 11 Aspergillus nidulans a-1,2-manosidase 6.0 Eades and Hintz (2000) Gene 255 (1) :25-34 Homo sapiens IA(Golgi) a-1,2-manosidase 6.0 Homo sapiens IB (Golgi) a-1,2-manosidase 6.0 Lepidopteran insect cells a-1,2-Man6-manosidase tipo I 6.0 Ren et al. (1995) Biochem. 34(8): 2489-2495 Homo sapiens a-D-manosidase 6.0 Chandrasekaran et aL (1984) Câncer Res. 44 (9) :4059-68 Xanthomonas manihotis a-1,2,3-manosidase 6.0 U.S. Pat. No. 6,300,113 124

Mouse IB (Golgi) oí-1,2-manosidase 6.5 Schneikert and Herscovics (1994) Glycobiology. 4 (4):445-50 Bacillus sp. (segregado) oí-D-1,2-manosidase 7.0 yiaruyama et aL (1994) Carbohydrate Res. 251:89-98

Numa concretização preferida, uma enzima ou domínio catalítico específico é marcado para uma localização sub-celular na célula hospedeira por meio de uma construção de fusão quimérica, codificadora de uma proteína compreendendo um peptídeo de sinal marcador celular que não é normalmente associado ao domínio enzimático. De preferência, é marcada uma enzima ou domínio para o RE, o Golgi cis, mediano ou trans ou o aparelho de Golgi trans da célula hospedeira.

Numa concretização mais preferida, a enzima de glicosilação marcada é uma manosidase, uma glicosiltransferase ou uma glicosidase. Numa concretização especialmente preferida, a actividade manosidase é marcada para o RE ou Golgi cis, onde ocorrem as primeiras reacções de glicosilação. Enquanto este método é útil para a produção de uma glicoproteína semelhante à humana numa célula hospedeira não humana será evidente que o método é também útil, masi no geral, para modificar perfis hidrato de carbono de uma glicoproteína em qualquer célula hospedeira eucariota, incluindo células hospedeiras humanas. A marcação de sequências que medeiam a retenção de proteínas em certos organelos da via secretória da célula hospedeira são bem conhecidas e descritas na literatura 125 científica, tal como será discutido mais pormenorizadamente relativamente às bibliotecas para selecção de sequências de marcação e enzimas marcadas. Estas sequências de marcação subcelular podem ser utilizadas isoladas ou em combinação para parcar uma enzima de glicosilação seleccionada (ou respectivo domínio catalítico) para uma localização subcelular específica numa célula hospedeira, isto é especialmente para uma onde a enzima terá actividade intensificada ou óptima com base no pH óptimo ou a presença de outros factores estimulantes.

Ao tentar encurtar estruturas de elevado teor de manose para se obter Man5GlcNAc2 no RE ou no aparelho de Golgi de S. cerevisiae, por exemplo, é possível escolher qualquer enzima ou combinação de enzimas que (1) possua(m) um pH óptimo suficientemente próximo (isto é entre pH 5,2 e pH 7,8) e (2) é/são conhecidas por gerar, isoladamente ou conjuntamente, a estrutura Man5GlcNAc2 isomérica específica necessária para aceitar a subsequente adição de GlcNAc por GnTI. Qualquer enzima ou combinação de enzimas que tenha(m) revelado gerar uma estrutura que possa ser convertida em GlcNAcMan5GlcNAc2 por GnTI in vitro constituiria uma opção adequada. Estes conceitos podem ser obtidos a partir da literatura científica ou por meios experimentais. Por exemplo, é possível determinar se uma manosidase potencial pode converter Man8GlcNAc2-2AB (2-aminobenzamida) em Man5GlcNAc2-PA e verificar depois possibilidade de a estrutura Man5GlcNAc2-2AB servir como substrato para GnTI e UDP-GlcNAc produzir GlcNAcMan5GlcNAc2 in vitro. Por exemplo, manosidase IA de origem humana ou de murino seria uma opção adequada (vide, por exemplo, por exemplo 4). Os exemplos descritos utilizam oligomanose N-ligada rotulada 126 2-aminobenzamida, seguido de análise HPLC para esta determinação

Quadro 4. Localização celular e pH óptimos de várias enzimas de S. cerevisiae relacionadas com glicosilação.

Gene Actividade Localizaç ão pH óptimo Referência (s) KTR1 oí-1,2- manosiltransfera se Golgi 7.0 Romero et al (1997) Biochem. J. 321(Pt 2): 289-295 MNS1 oí—1,2-manosidase RE 6.5 Lipari et al. (1994) Glycobiology. Qct; 4 (5): 697-702 CWH41 -- manosiltransfera se de glucosidase I RE Golgi 6.8 7-8 Lehele and Tanner (1974) Biochim. Biophys. Acta 350 (1):225-235 KRE2 oí—1,2 — manosiltransfera se Golgi 6.5-9.0 Romero et al (1997) Biochem. J. 321(Pt 2) : 289-295

Assim, uma enzima de glicosilação, tal como uma enzima a-1,2-manosidase utilizada de acordo com a invenção possui uma actividade óptima a pH entre 5,1 e 8,0. Numa forma de 127 realização preferida, a enzima tem uma actividade óptima a um pH entre 5,5 e 7,5. A enzima de manosidase C.elegans, por exemplo, funciona bem nos métodos da invenção e possui um pH óptimo aparente de cerca de 5,5). As manosidases preferidas incluem as que se encontram listadas no quadro 3 com pH óptimos apropriados, por exemplo Aspergillus nidulans, Homo sapiens IA (Golgi), Homo sapiens IB (Golgi), célula de insecto lepidóptero (IPLB-SF21AE), Homo sapiens, IB de rato (Golgi) e Xanthomonas manihotis, Drosophila melanogaster e C. elegans.

Uma experiência que ilustra o pH óptimo para uma enzima de a-1,2-manosidase encontra-se descrita no exemplo 7. Uma proteína de fusão quimérica BB27-2 (manosidase IB Δ31 de Saccharomyces MNN10 (s)/C. elegans) que escapa para o meio foi sujeita a vários níveis de pH para determinar a actividade óptima da enzima. Os resultados da experiência demonstram que a a-1,2-manosidase possui um nível óptimo de pH de cerca de 5,5 para a sua função.

Numa forma de realização preferida é expresso um único gene de manosidase clonado no organismo hospedeiro. No entanto, nalguns casos poderá ser desejável expressar vários genes de manosidase diferentes ou várias cópias de um gene em particular a fim de atingir uma produção adequada de Man5GlcNAc2. Nos casos em que são utilizados múltiplos genes, as manosidases codificadas devem todas ter pH óptimos, dentros dos limites preferidos de 5,1 a 8,0 ou especialmente entre 5,5 e 7,5. As actividades de manosidase preferidas incluem a-1,2-manosidase derivada de ratinho, humano, lepidóptero, Aspergillus nidulans ou Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum, X. laevis ou A. nidulans. 128

Alteração in vivo da glicosilação da célula hospedeira utilizando a biblioteca de ADN combinatória

Alguns métodos da invenção são executados de preferência (mas não obrigatoriamente) utilizando uma ou mais do que um biblioteca de ácidos nucleicos. Um aspecto exemplar de uma biblioteca de ácidos nucleicos combinatória da invenção reside no facto de incluir sequências codificadoras dos peptideos de sinal de marcação celular e sequências codificadoras de proteínas a serem marcadas, por exemplo enzimas ou respectivos domínios catalíticos, incluindo, sem constituir limitação, os que medeiam a glicosilação).

Como presentemente descrito, uma biblioteca de ácidos nucleicos combinatória inclui: (a) pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos codificadoras de diferentes peptideos de sinal de marcação celular e (b) pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo a ser marcado. Outra biblioteca de ácidos nucleicos combinatória presentemente descrita inclui: (a) pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificadora de um peptídeo de sinal de marcação celular e (b) pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos codificadoras de um polipeptídeo a ser marcado para uma célula hospedeira. Como descrito mais abaixo, uma sequência de ácidos nucleicos derivada de (a) e uma sequência de ácido nucleico derivada de (b) são ligadas para produzir uma ou mais construções de fusão codificadoras de um peptídeo de sinal de marcação celular ligadas funcionalmente a um domínio polipeptídeo de interesse. Um exemplo de uma ligação funcional existe quando o peptídeo de sinal de marcação celular é ligado ao 129 domínio polipeptídeo de interesse, na mesma grelha de leitura translacional ("in frame") .

Como presentemente descrito, uma biblioteca de ADN combinatória expressa uma ou mais do que uma proteína de fusão, compreendendo peptídeos de sinal de marcação celular ligados in-frame aos domínios catalíticos da enzima. A proteína de fusão codificada compreende preferencialmente um domínio catalítico de uma enzima envolvida na modificação semelhante à do mamífero ou do ser humano de N-glicanos. Como presentemente descrito, o domínio catalítico é derivado de uma enzima seleccionado do grupo constituído por manosidases, glicosiltransferases e outras glicosidases ligadas in-frame a um ou mais do que um peptídeo de sinal. 0 domínio enzimático pode ser exógeno e/ou endógeno à célula hospedeira. Um peptídeo de sinal particularmente preferido é um normalmente associado a uma proteína sujeita a transporte do RE para Golgi.

A biblioteca de ADN combinatória aqui descrita pode ser utilizada para produzir e localizar enzimas in vivo, envolvidas na modificação de N-glicano semelhante a mamífero ou ser humano. As construções de fusão da biblioteca de ADN combinatória são manipuladas geneticamente de forma que as enzimas codificadas estão localizadas no RE, Golgi ou rede Golgi trans da célula hospedeira, onde estão envolvidos na produção de N-glicanos particulares numa glicoproteína de interesse. A localização de enzimas modificadoras de N-glicano da presente invenção é atingida através de um mecanismo de ancoragem ou através de interacção proteína-proteína, onde o peptídeo de localização construído a partir da biblioteca de ADN 130 combinatória localiza para um organelo desejado da via secretória, tal como o RE, Golgi ou rede Golgi trans.

Um exemplo de um N-glicano útil, que é produzido eficientemente e em quantidades suficientes para posterior modificação em reacções de glicosilação semelhantes às humanas (complexo) é Man5GlcNAc2. Uma quantidade suficiente de Man5GlcNAc2 é necessária numa glicoproteína de interesse para continuar o processmento semelhante ao humano in vivo (por exemplo mais de 30 % em mole) O intermediário Man5GlcNAc2 pode ser utilizado como um substrato para modificação N-glicano adicional, para produzir GlcNAcMan5GlcNAc2 (figura 1B; vide acima). Assim, a biblioteca de ADN combinatória descrita pode ser utilizada para produzir enzimas que posteriormente produzem GlcNAcMan5GlcNAc2 ou outro N-glicano complexo desejado numa quantidade útil.

Um outro aspecto das construções de fusão produzidas utilizando a biblioteca de ADN combinatória da presente invenção consiste em que actividade de encurtamento de N-glicano intracelular frequentemente quase completa na célula hospedeira geneticamente manipulada. As construções e fusão preferidas, produzidas pela biblioteca de ADN combinatória da invenção codifica uma enzima de glicosilação, por exemplo uma manosidase que é efectivamente localizada para um compartimento intracelularda célula hospedeira, exibindo assim muito pouca e preferencialmente nenhuma actividade extracelular. As construções de fusão preferidas da presente invenção que codificam uma enzima de manosidase mostram que localizam onde os N-glicanos são modificados, nomeadamente no RE e no Golgi. As enzimas de fusão da presente invenção são 131 endereçadas para estes organelos específicos na via secretória, onde localizam e actuam nos N-glicanos, tal como Man8GlcNAc2 para produzir Man5GlcNAc2 numa glicoproteína de interesse.

As construções de fusão de GnTIII geradas a partir de uma biblioteca de ADN combinatória para produzirem glicanos bissectados foram testadas para determinar qualquer actividade extracelular. Um exemplo de uma construção de fusão GnTIII que exibe alteração in vivo da glicosilação da célula hospedeira é designada pVA53. Após transformar YSH-1 de P.pastoris com a construção de fusão pVA53, o sobrenadante foi analisado para detectar qualquer actividade GNTIII ex vivo A figura 33 não mostra qualquer mudança evidente no substrato padrão GlcNAcMan5GlcNAc2 nas condições que revelariam actividade GnTIII extracelular no meio (exemplo 22) . De modo semelhante, a figura 34 não mostra actividade GnTIII extracelular detectável no meio em YSH-57 de P.pastoris a reagir com o substrato GlcNAc2Man3GlcNAc2 (exemplo 23) .

As enzimas produzidas pela biblioteca de ADN combinatória da presente invenção podem modificar N-glicanos de uma glicoproteína de interesse como se demonstra para as proteínas K3 ou IFN-β expressas em P.pastoris, como se mostra nas figuras 5, 6 e 25-34 (ver também exemplos 2, 4 e 18-23). No entanto, considera-se que outros tipos de glicoproteínas, sem constituir limitação, incluindo eritroproteína, citoquinas como interferão-a, interferão-β, interferão-γ, interferão-ω e granulocito-CSF, factores de coagulação tais como factor VIII, factor IX e proteína humana C, cadeia α do receptor IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinase, quimase e inibidor 132 da tripsina ureia, proteína de ligação IGF, factor de crescimento da epiderme, factor de libertação da hormona de crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor-2 de crescimento endotelial vascular, factor-1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegirina, a-1 antitripsina, DNase II, α-fetoproteínas, ΔΑΤ, rhTBP-1 (onercept, também conhecido por proteína de ligação TNF 1), TACI-Ig (activador transmembranar, modulador de cálcio e ligando interactor de ciclofilina), FSH (hormona folículo-estimulante) , GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteína 1 do tipo glucagon) agonista do receptor IL-1, sTNFr (enbrel, também conhecido por receptora solúvel de TNF combinada a porção Fc) ATUI, rh Trombina, glucocerebrosidase e CTLA4-Ig (linfócitos T citotóxicos associados com Antigénio 4 -Ig) podem ser glicosilados desta forma.

Construção de uma biblioteca de ADN combinatória de construções de fusão:

Uma biblioteca de ADN combinatória de construções de fusão apresenta um ou mais do que um peptídeo de sinal de endereçamento celular ("peptídeos endereçadores"), geralmente derivados de domínios N-terminais de proteínas nativas (por exemplo, fazendo eliminações C-terminais). No entanto, alguns peptídeos de endereçamento são derivados do terminal C de proteínas nativas (por exemplo SEC12) . As proteínas ligadas à membrana do RE ou Golgi são preferencialmente utilizadas como uma fonte de sequências de peptídeo de endereçamento. Estas proteínas têm sequências codificadoras de uma cauda citosólica (ct), um domínio transmembranar (TMD) e uma região tronco (SR) de diferentes comprimentos. Estas regiões são reconhecíveis pelos alinhamentos da sequência proteica e comparações com 133 homólogos ancVor de outras proteínas localizadas (por exemplo comparação de gráficos de hidrofobia).

Os peptídeos de endereçamento são presentemente indicados como curto (s), médio (m) e longo (1) relativamente às partes de uma membrana tipo II. A sequência de peptídeo de endereçamento indicada como sendo curta (s) corresponde ao domínio transmembranar (tmd) da proteína ligada à membrana. A sequência de peptídeo de endereçamento indicada como sendo longa (1) corresponde à extensão do domínio transmembranar (tmd) e região tronco (sr). A sequência de peptídeo de endereçamento indicada como sendo média (m) corresponde ao domínio transmembranar (tmd) e aproximadamente metade da extensão da região tronco (sr) . As regiões do domínio catalítico estão indicadas pelo número de eliminação de nucleótido, relativamente à sua enzima de glicosilação de tipo selvagem.

Sub-bibliotecas

Nalguns casos, a biblioteca de ácido nucleico combinatória da invenção pode ser elaborada directamente a partir de genes existentes ou de tipo selvagem. De preferência, a biblioteca de ADN é elaborada a partir da fusão de duas ou mais sub-bibliotecas. Por meio da ligação "in-frame das sub-bibliotecas é possível criar um grande número de novas construções genéticas codificadoras de domínios proteicos endereçados úteis, tal como os que têm actividades de glicosilação.

Sub-bibliotecas do domínio catalítico codificadoras de actividades de glicosilação

Uma sub-biblioteca útil inclui sequências de ADN, codificadoras de enzimas, tal como glicosidases (por 134 exemplo, manosidases), glicosiltransferases (por exemplo, fucosiltransferases, galactosiltransferases, glucosiltransferases), GlcNAc transferases e sialiltransferases. Podem ser seleccionados domínios catalíticos a partir do hospedeiro a ser geneticamente modificado, bem como de outros organismos relacionados ou não relacionados. As enzimas de mamífero, vegetais, insectos, algas ou fungos são todas úteis e devem ser escolhidas para representas um amplo espectro de propriedades bioquímicas relativamente à temperatura e pH óptimo. De preferência, os genes são truncados para se obter fragmentos codificadores dos domínios catalíticos das enzimas. Por meio da remoção de sequências endereçadas endógenas, as enzimas podem ser então reorientadas e expressas noutros loci celulares. A escolha destes domínios catalíticos pode ser guiada pelo conhecimento do ambiente específico em que o domínio catalítico deverá depois estar activo. Por exemplo, se uma enzima de glicosilação específica deve estar activa no Golgi trans e todas as enzimas conhecidas do organismo hospedeiro no Golgi trans têm um certo pH óptimo, então é escolhido um domínio catalítico que exibe actividade adequada e preferencialmente máxima a esse pH com anteriormente discutido.

Sub-bibliotecas de sequência de peptídeo de endereçamento

Outra sub-biblioteca útil inclui sequências de ácido nucleico codificadoras de peptídeos de sinal, que têm como resultado a localização de uma proteína para uma localização específica no RE, Golgi ou rede Golgi trans. Podem ser seleccionados estes peptídeos de endereçamento a 135 partir do hospedeiro a ser geneticamente modificado, bem como de outros organismos relacionados ou não relacionados. Em geral, estas sequências dividem-se em três categorias: (1) sequências N-terminal codificadoras de uma cauda citosólica (ICT), um dominio transmembrada (tmd) e parte ou toda uma região tronco (SR) que juntos ou individualmente ancoram proteínas à membrana interna (lumenal) do Golgi; (2) sinais de recuperação que são encontrados, em geral, no terminal C, tal como o tetrapeptideo HDEL (SEQ ID NO:41) ou KDEL (SEQ ID NO:42) e (3) regiões transmembranar de várias proteínas, por exemplo transportadores de açúcar nucleótido, que são conhecidos por se localizarem no Golgi.

No primeiro caso, em que o peptideo de endereçamento consiste em vários elementos (ct, tmd e sr) a biblioteca é concebida de forma que ct, o tmd e várias partes da região tronco são representadas. Assim, uma sub-biblioteca de sequências de peptideo de endereçamento inclui sequências ct, tmd e/ou sr destas proteínas ligadas à membrana do RE ou do Golgi. Nalguns casos será desejável proporcionar a sub-biblioteca com comprimentos variados da sequência sr. Este aspecto poderá ser realizado por meio de PCR, utilizando iniciadores que ligam ao terminal 5' do ADN codificador da região citosólica e empregando uma série de iniciadores opostos, que ligam a diversas partes da região tronco.

Ainda outras fontes úteis de sequências de peptideo de endereçamento incluem peptídeos de sinal de recuperação, por exemplo o tetrapeptideo HDEL ou KDEL, que se encontram tipicamente no terminal C das proteínas que são transportadas retrogradamente para o RE ou Golgi. Ainda outras fontes de sequências de peptídeos de sinal incluem 136 (a) proteínas de membrana tipo II, (b) as enzimas listadas no quadro 3, (c) transportadores de açúcar nucleótidotransmembrana, que estão localizados no Golgi e (d) as sequências indicadas no quadro 5.

Quadro 5. Fontes de sequências úteis de endereçamento compartimentai

Gene ou sequência Organismo Função Localização do produto genético MNSI A. nidulans a-1,2-manosidase RE MNSI A. niger 3-1,2-manosidase RE MNSI S. cerevisiae 2-1,2-manosidase RE GLSI S. cerevisiae glucosidase RE GLSI A. niger glucosidase RE GLSI A. nidulans glucosidase RE HDEL no terminal C Universal em fungos Sinal de recuperação RE SEC12 S. cerevisiae Proteína de vesícula COPII RE/Golgi SEC12 A. niger Proteína de RE/Golgi 137 vesícula COPII 0CH1 S. cerevísíae 1,6- manosiltransferase Golgi (cis) OCH1 P.pastoris 1,6- manosiltransferase Golgi (cis) MNN9 S. cerevísíae Complexo 1,6-manosiltransferase Golgi MNN9 A. níger não determinado Golgi VAN1 S. cerevísíae não determinado Golgi VAN1 A. níger não determinado Golgi ANP1 S. cerevísíae não determinado Golgi HOCI S. cerevísíae não determinado Golgi MNN10 S. cerevísíae não determinado Golgi MNN10 A. níger não determinado Golgi MNN11 S. cerevísíae não determinado Golgi (cis) MNN11 A. níger não determinado Golgi (cis) MNT1 S. 1,2- Golgi (cis, 138 cerevisiae manosiltransferase mediano) KTR1 P. pastoris não determinado Golgi (mediano) KRE2 P. pastoris não determinado Golgi (mediano) KTR3 P. pastoris não determinado Golgi (mediano) MNN2 S. cerevisiae 1,2- manosiltransferase Golgi (mediano) KTRl S. cerevisiae não determinado Golgi (mediano) KTR2 S. cerevisiae não determinado Golgi (medial) MNN1 S. cerevisiae 1,3- manosiltransferase Golgi (trans) MNN6 S. cerevisiae fosfomanosiltransfe rase Golgi (trans) 2,6 ST H. sapiens 2,6- sialiltransferase Rede Golgi trans UDP-Gal T S. pombe Transportador UDP-Gal Golgi

Em qualquer caso, a preferência vai toda para a selecção das sequências de peptideo de endereçamento que sejam apropriadas para que a actividade enzimática ou actividades 139 em particular funcionem a um nivel óptimo na sequência das reacções de glicosilação desejadas. Por exemplo, no desenvolvimento de um microrganismo modificado, capaz de sialilação terminal de N-glicanos nascentes, um processo que ocorre no Golgi trans em seres humanos, é desejável utilizar uma sub-biblioteca de sequências de peptideos de endereçamento derivada das proteínas de Golgi trans. De modo semelhante, o encurtamento de Man8GlcNAc2 por uma a-1,2-manosidase, para se obter Man5GlcNAc2 é uma etapa inicial na formação de N-glicano complexo em seres humanos (figura 1B) . Por conseguinte é desejável que esta reacção ocorra no RE ou Golgi cis de um microrganismo hospedeiro manipulado. É utilizada uma sub-biblioteca codificadora do RE e sinais de retenção de Golgi cis. É então construída uma série de construções da proteína de fusão (isto é biblioteca de ADN combinatória) ligando de modo funcional uma ou uma série de sequências de peptídeo de endereçamento a um ou uma série de domínios catalíticos codificadores de sequências. De preferência, este objectivo é atingido pela ligação in-frame de uma sub-biblioteca incluindo sequências de peptídeo de endereçamento codificadoras do ADN (acima) com uma sub-biblioteca incluindo enzimas de glicosilação codificadoras do ADN ou respectivos fragmentos com actividade catalítica (vide abaixo) . A biblioteca resultante inclui genes sintéticos codificadores de proteínas de fusão contendo sequência de peptídeo de endereçamento. Nalguns casos será desejável proporcionar uma sequência de peptídeo de endereçamento no terminal N de uma proteína de fusão ou, noutros casos, no terminal C. Nalguns casos as sequências de peptídeo de endereçamento podem ser inseridas na grelha de leitura 140 aberta de uma enzima, desde que a estrutura proteica dos domínios entrelaçados individualmente não seja interrompida. Cada tipo de proteína de fusão é construído (de modo faseado ou semi-aleatoriamente) e podem ser seleccionadas as construções óptimas com a transformação de células hospedeiras e caracterização dos padrões de glicosilação em células transformadas, utilizando métodos da invenção.

Alteração da glicosilação da célula hospedeira utilizando construções de fusão de bibliotecas combinatórias A construção de uma biblioteca de ADN combinatória preferida é ilustrada de forma esquemática na figura 2 e descrita no exemplo 4. A construção de fusão pode ser ligada operacionalmente a uma variedade de vectores, tal como vectores de expressão bem conhecidos na técnica. Uma grande variedade destas construções de fusão foi elaborada utilizando actividades representativas, como se mostra no quadro 6. As combinações de domínios peptídeo/catalítico de endereçamento pode ser elaborada para utilização e, actividades de manosidase, glicosiltransferase e glicosidase de endereçamento no RE, Golgi e rede trans Golgi, de acordo com a invenção. Surpreendentemente, o mesmo domínio catalítico pode não ter efeito ou ter um efeito muito profundo nos padrões de N-glicosilação, dependendo do tipo de peptídeo de endereçamento utilizado (vide, por exemplo quadro 7, exemplo 4).

Construções de fusão de manosidase

Um exemplo representativo de uma construção de fusão de manosidase derivado de uma biblioteca de ADN combinatória da invenção é pFB8, que é um peptídeo de endereçamento 141

Saccharomyces SEC12 (m) truncado (988-1296 nucleótidos de SEC12 de SwissProt P11655) ligado ín frame a uma eliminação de 187 aminoácidos N-terminais de uma α-manosidase IA de ratinho (GenBank AN 6678787). A nomenclatura utilizada refere-se, assim, à região do dominio peptideo/catalitico de endereçamento de uma enzima de glicosilação como Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase IA de ratinho A187. A proteína de fusão codificada localiza no RE por meio de uma sequência de peptídeo de endereçamento SEC12, enquanto retém a sua actividade do domínio catalítico de manosidase e é capaz de produzir N-glicanos ín vivo com uma estrutura MansGlcNAc2 (exemplo 4, figuras 6F e 7B) . A construção de fusão pGC5, Saccharomyces MNS/(m)/manosidase IA de ratinho A99 é outro exemplo de uam construção de fusão com actividade de encurtamento de manosidase intracelular (exemplo 4, figuras 5D e 8B). A construção de fusão pBC18-5 (Saccharomyces VANl(s)/manosidase C.elegans IB A80) é ainda outro exemplo de uma construção de fusão eficiente, capaz de produzir N-glicanos com uma estrutura Man5GlcNAc2 in vivo. Ao criar uma biblioteca de ADN combinatória destas e de outras construções de fusão manosidase, de acordo com a invenção, um perito na especialidade pode distinguir e seleccionar as construções com uma actividade de encurtamento intracelular óptima dos com actividade fraca ou ausente. Os métodos de utilização das bibliotecas de ADN combinatórias descritas são vantajosos porque apenas poucas construções de fusão de manosidase podem produzir um N-glicano particular desejado in vivo.

Além disso, a actividade de encurtamento de manosidase pode ser específica de uma proteína de interesse específica. Assim, pressupõe-se ainda que nem todas as construções de 142 fusão do domínio catalítico peptídeo de endereçamento/manosidase podem funcionar a um nível uniformemente bom para produzir a glicosilação adequada numa glicoproteína de interesse. Assim, uma proteína de interesse pode ser introduzida numa célula hospedeira transfectada com uma biblioteca de ADN combinatória para identificar uma ou várias construções de fusão que expressam uma actividade de manosidase óptima para a proteína de interesse. Um perito na especialidade será capaz de produzir e seleccionar contrução (ões) de fusão óptimas, utilizando a abordagem da biblioteca de ADN combinatória descrita.

Além disso é evidente que outras construções de fusão destas, exibindo domínios catalíticos de manosidase activos localizados (ou mais geralmente, domínios de qualquer enzima) podem estar a empregar técnicas tais como as exemplificadas no exemplo 4 e presentemente descritas. Será uma questão de experimentação de rotina para um perito na especialidade fazer e utilizar a biblioteca de ADN combinatória da presente invenção para optimizar, por exemplo a produção de MansGlcNAc2 de uma biblioteca de construções de fusão num vector de expressão específico introduzido numa célula hospedeiras particular.

Construções de fusão de glicosiltransferase

Do mesmo modo, foi feita uma biblioteca de ADN combinatória de glicosiltransferase utilizando os métodos presentemente descritos. Uma biblioteca de ADN combinatória de sequências derivadas das actividades glicosiltransferase I (GnTI) foi elaborada com peptídeos de endereçamento e seleccionada para uma produção eficiente em células hospedeiras 143 eucariotas inferiores de uma estrutura N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 numa glicoproteina marcadora. Foi identificada uma construção de fusão que demonstrou produzir GlcNAcMan5GlcNAc2 (pBPl04), Saccharomyces MNN9 (s)/GnTI humano A38 (exemplo 8). Uma grande variedade destas construções de fusão foi elaborada (exemplo 8, quadro 10). Outras combinações de domínios catalíticos peptídeo de endereçamento/GnTI podem ser facilmente elaboradas com a biblioteca de ADN combinatória. É também evidente para um perito na especialidade que podem ser feitas outras construções de fusão destas exibindo actividade glicosiltransferase, como se demonstra no exemplo 8. Será uma questão de experimentação de rotina para um perito na especialidade utilizar o método da biblioteca de ADN combinatória presentemente descrito para optimizar a produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 utilizando uma construção de fusão seleccionada num vector de expressão específico e uma linha de células hospedeiras.

Como anteriormente mencionado, para as construções de fusão de manosidase, nem todas as construções de fusão do domínio catalítico peptídeo de endereçamento/manosidase podem funcionar a um nível uniformemente bom para produzir a glicosilação adequada numa glicoproteina de interesse. No entanto, um perito na especialidade será capaz de produzir e seleccionar contrução(ões) de fusão óptimas, utilizando a abordagem da biblioteca de ADN combinatória descrita. 0 exemplo 8 ilustra uma concretização preferida de uma biblioteca de ADN combinatória compreendendo peptídeos de endereçamento e construções de fusão do domínio catalítico GnTI envolvidos na produção de glicoproteínas com estrutura predominantemente GlcNAcMan5GlcNAc2. 144

Utilização de múltiplas construções de fusão para alterar a glicosilação da célula hospedeira

Noutro exemplo de utilização dos métodos e bibliotecas da invenção para alterar a glicosilação da célula hospedeira, transformou-se uma estirpe de P.pastoris com uma eliminação 0CH1, que expressa uma proteína relatora (K3), com múltiplas construções de fusão isoladas de bibliotecas combinatórias da invenção para converter N-glicanos com alto teor de manose em N-glicanos semelhantes aos humanos (exemplo 8) . Primeiro, a construção de fusão de manosidase pFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de ratinhos IA 4187) foi transformado numa estirpe de P. pastoris sem a actividade manosiltransferase iniciadora 1,6 (isto é eliminação ochl; exemplo 1) . Segundo, o pPB103 com um gene K.lactis MNN2-2 (Genbank AN AF106080) que codifica o transportador UDP-GlcNAc foi construído para aumentar ainda mais a produção de GlcNAcMan5GlcNAc2. A adição do transportador UDP-GlcNAc aumentou significativamente a produção de GlcNAcMan5GlcNAc2 na estirpe de P.pastoris, como ilustrado na figura 10B. Terceiro, pPB104 ocmpreendendo Saccharomyces MNN9 (sj/GnTI humano A38 foi introduzido na estirpe. Esta estirpe de P.pastoris é designada como "PBP-3". (ver figura 36)

Um perito na especialidade pressupõe que as células hospedeiras, tais como as estirpes de leveduras anteriormente descritas podem ser sequencialmente transformadas e/ou co-transformadas com um ou mais do que um vectores de expressão. Pressupõe-se também que a ordem da transformação é mais particularmente relevante na produção da glicoproteína de interesse. Um perito reconhece que as modificações de rotina dos procedimentos divulgados 145 no presente documento podem proporcionar melhores resultados na produção da glicoproteína de interesse. A importância da utilização de uma sequência de peptideo de endereçamento com uma sequência do domínio catalítico particular torna-se imediatamente evidente a partir das experiências descritas. A biblioteca de ADN combinatória proporciona uma ferramenta para a construção de fusões enzimáticas que estão envolvidas na modificação de N-glicanos numa glicoproteína de interesse, que é especialmente útil na produção de glicoproteínas de tipo humano, (no entanto, qualquer fusão enzimática pode ser seleccionada utilizando as bibliotecas e métodos descritos). Os transformantes desejados que exprimem a-1,2-manosidase activa, adequadamente endereçada, produzem K3 com N-glicanos da estrutura Man5GlcNAc2, como se mostra nas figuras 5D e 5E. Isto confere uma massa molecular reduzida ao glicano clivado, comparativamente ao K3 da estirpe de eliminação progenitora 0CH1, tal como detectada por espectrometria de massa MALDI-TOF na figura 5C.

De modo semelhante, a mesma abordagem foi utilizada para produzir outra glicoproteína segregada: IFN-p compreendendo predominantemente Man5GlcNAc2. 0 Man5GlcNAc2 foi removido por digestão com PNGase (Papac et al. (1998) Glycobiology 8: 445-454) e sujeito a MALDI-TOF como se mostra nas figuras 6A - 6F. Um único pico saliente em 1254 (m/z) confirma a produção de Man5GlcNAc2 em IFN-β nas figuras 6E (pGC5) (Saccharomyces MNS/(m)/manosidase de ratinho IB A99) e 6F (pFB8) (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de ratinho ΙΑ A187). Além disso, detectou-se o N-glicano híbrido GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] na estirpe de P.pastoris PBP-3 compreendendo pFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de 146 ratinho ΙΑ A187), pPB104 Saccharomyces MNN9 (m)/manosidase GnTI humano A38) e pPB103 (gene K. lactis MNN2-2) por MALDI-TOF (figura 10) .

Após identificação de transformantes com um elevado graus de encurtamento de manose foram efectuadas experiências adicionais para confirmar a ocorrência da actividade de manosidase (encurtamento) in vivo e que não foi predominantemente o resultado de actividade extracelular no meio de cultura (exemplo 6; figuras 7-9).

Embora a presente invenção seja exemplificada utilizando o organismo hospedeiro P.pastoris, os peritos na especialidade pressupõem que outras células hospedeiras eucariota, incluindo outras espécies de levedura e hospedeiros fúngicos, podem ser alteradas como descrito para produzir glicoproteinas tipo humano. Subentende-se que as técnicas descritas para identificação e interrupção de genes de glicosilação de célula hospedeira, por exemplo 0CH1 são aplicáveis a estes e/ou outros genes homólogos ou funcionais relacionados, em outras células hospedeiras eucariotas tal como outras leveduras e estirpes fúngicas. Como descrito no exemplo 9, os genes ochl mnnl foram eliminados de K. lactis para manipular geneticamente uma célula hospedeira, conduzindo a N-glicanos que são completamente convertidos em Man5GlcNAc2 pela 1,2-manosidase (figura 12C). 0 gene MNN1 foi clonado a partir de K. lactis como descrito no exemplo 9. As sequências de ácido nucleico e de aminoácido deduzido do gene MNN1 de K. lactis são apresentadas na SEQ ID NO:43 e 44, respectivamente. Utilizando iniciadores específicos dos genes foi feita uma 147 construção para eliminar o gene MNN1 do genoma de K. lactis (exemplo 9) . As células hospedeiras esgotadas nas actividades ochl e mnnl produzem N-glicanos com uma estrutura hidrato de carbono Man9GlcNAc2 (vide por exemplo, figura 12B). Estas células hospedeiras podem ser manipuladas utilizando por exemplo métodos da invenção e as bibliotecas presentemente descritas para produzir glicoproteinas de tipo mamifero e de tipo humano.

Assim, são descritos no presente documento uma molécula de ácido nucleico isolada, com uma sequência de ácido nucleico compreendendo ou consistindo em pelo menos quarenta e cinco, de preferência pelo menos 50, mais preferencialmente pelo menos 60 e o mais preferido 75 ou mais resíduos nucleótido do gene MNNl de K. lactis (SEQ ID NO: 43) e respectivos homólogos, variantes e derivados. São também descritas moléculas de ácido nucleico que hibridam em condições rigorosas nas moléculas de ácido nucleico descritas. De modo semelhante, são apresentados os polipeptídeos isolados (incluindo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados e análogos) codificados pelas moléculas de ácido nucleico são presentemente descritos. São também descritos os vectores, incluindo vectores de expressão, que compreendem as moléculas de ácido nucleico mencionadas, tal como descrito mais adiante. De modo semelhante, são apresentadas as células hospedeiras transformadas com as moléculas de ácido nucleico ou vectores.

Outro aspecto da presente invenção está relacionado com uma estirpe hospedeira fúngica unicelular ou multicelular, que expressa glicoproteinas que compreendem N-glicanos 148 modificados, semelhantes aos executados pelas células humanas.

Preferencialmente, as enzimas de glicosilação ou domínios catalíticos e semelhantes são marcados para uma zona subcelular ao longo da via de secreção da célula hospedeira, onde actuam e, preferencialmente, onde são concebida ou seleccionadas para funcionar de forma mais eficaz.

As células vegetais e de insectos podem igualmente ser geneticamente manipuladas no sentido de alterar a glicolização das proteínas expressas, utilizando a biblioteca combinatória e métodos aqui descritos Mais ainda, a glicolização em células de mamíferos, incluindo as células humanas, pode igualmente ser modificada utilizando a biblioteca combinatória e métodos presentemente descritos. Pode ser viável, por exemplo, optimizar uma actividade enzimática específica ou modificar as proporções relativas de vários N-glicanos efectuadas numa célula hospedeira de um mamífero utilizando a biblioteca combinatória e métodos presentemente descritos.

Constituem exemplos de modificações da glicosilação que podem ser efectuadas utilizando este método: (1) manipulação genética de um microrganismo eucariota para encurtar resíduos de manose de Man8GlcNAc2, para se obter um N-glicano Man5GlcNAc2; (2) manipulação genética de uma célula hospedeira eucariota para adicionar um resíduo N-acetilglucosamina (GlcNAc) a Man5GlcNAc2 por meio da acção de transferase I GlcNAc; (3) manipulação genética de uma célula hospedeira eucariota para expressar de forma funcional uma enzima, tal como uma N-acetilglucosamina 149 transferase (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI), manosidase II, fucosiltransferase, galactosil tranferase (GalT) ou sialiltransferases (ST) .

Por meio da repetição do método, podem ser manipuladas vias de glicosilação cada vez mais complexas num hospedeiro alvo, tal como um microrganismo eucariota inferior. Numa concretização preferida, o organismo hospedeiro da presente invenção é transformado duas ou mais vezes com bibliotecas de ADN, incluindo sequências codificadoras das actividades de glicosilação. A selecção dos fenotipos desejados pode ser executada após cada ronda de transformação ou, em alternativa, após terem ocorrido várias transformações. As vias de glicosilação complexas podem ser rapidamente manipuladas deste modo.

Reacções Sequenciais de Glicosilação

Numa concretização preferida, estas bibliotecas de domínio peptídico/catalítico de marcação são desenhadas concebidas para incorporar informação existente sobre a natureza sequencial de reacções de glicosilação em células eucarioticas mais evoluídas elevadas As reacções que sabemos ocorrer no início do curso do processamento das glicoproteínas requerem a marcação de enzimas que catalisam tais reacções na porção cis do Golgi ou do RE. Por exemplo, o encurtamento de Man8GlcNAc2 para Man5GlcNAc2 por manosidases é uma etapa inicial na formação de N-glicano complexo (Figuras 1B e 35A). E porque o processamento da proteína é iniciado no RE, sendo que depois avança através do aparelho de Golgi cis, mediano e trans, é desejável que esta reacção ocorra no RE ou no Golgi cis. Ao conceber uma biblioteca para a localização da manosidase I, por exemplo, 150

tenta fazer-se coincidir os sinais de marcação do RE e do aparelho de Golgi cis com o domínio catalítico da manosidase I

Gerar Diversidade Adicional de Sequências O método presentemente descrito é mais eficaz quando um ácido nucleico, por exemplo, uma biblioteca de ADN, transformada no hospedeiro, contém uma grande diversidade de sequências, aumentando assim a probabilidade de pelo menos um transformante venha a exibir o fenotipo desejado. Mutações de aminoácidos isoladas, por exemplo, podem alterar drasticamente a actividade das enzimas que processam a glicoproteína (Romero et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(15):11071-4) Assim, antes da transformação, uma biblioteca de ADN ou uma sub-biblioteca constituinte podem ser sujeitas a uma ou mais do que uma técnica para gerar uma diversidade adicional de sequências. Por exemplo, uma sucessão de transposição genética, error prone PCR, mutagénese in vitro ou outros métodos para gerar diversidade de sequências podem ser executados como forma de obter uma maior diversidade de sequências dentro do grupo de elementos de fusão.

Sequências de Controlo de Expressão

Para além das sequências de grelha de leitura aberta descritas, é geralmente preferível proporcionar a cada construção de biblioteca as sequências de controlo da expressão, tal como os promotores, terminadores de transcrição , intensificadores, locais de ligação de ribossomas e outras sequências funcionais que possam ser necessárias para garantir a efectiva transcrição e 151 translação das s de fusão após transformação das construções de fusão no organismo hospedeiro.

Os componentes vectoriais adequados, por exemplo, marcadores seleccionáveis, sequências de controlo de expressão (ex. Promotores, intensificadores, terminadores e semelhantes) e, opcionalmente, sequências necessárias para replicação autónoma numa célula hospedeira, são seleccionados como uma função para escolher a célula hospedeira especifica Os critérios de selecção para os componentes de vector adequados para utilização num determinado mamífero ou numa célula hospedeira eucariota são rotineiros. As células hospedeiras eucarióticas inferiores preferidas da invenção incluem Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minutia (por exemplo, Ogataea minute, Pichia iindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa. Quando o hospedeiro é Pichia pastoris, os promotores adequados incluem, por exemplo, os promotores A0X1, A0X2, DAS e P40.

Marcadores Seleccionáveis É também preferível proporcionar cada construção com pelo menos um marcador seleccionável, tal como um gene de resistência a medicamentos ou que complemente uma lesão 152 metabólica do hospedeiro. A presença do marcador é útil na selecção subsequente de transformantes, por exemplo, em leveduras podem ser utilizados os genes URA3, H154, SUC2, G418, BLA ou SH BLE. Conhecem-se inúmeros marcadores seleccionáveis que se encontram disponíveis para utilização em leveduras, fungos, plantas, insectos, mamíferos e outras células hospedeiras eucariotas.

Transformação A biblioteca de ácido nucleico é depois transformada no organismo hospedeiro. Na levedura pode ser empregue qualquer método conveniente de transferência de ADN, tal como electroporação, o método do cloreto de lítio ou o método dos esferoplastos. Para os fungos filamentosos e células vegetais, os métodos convencionais incluem bombardeamento de partículas, electroporação e transformação mediada por agrobactérias Para produzir uma estirpe estável, adequada para cultura de elevada densidade (fermentação em levedura), será desejável integrar as construções da biblioteca de ADN no cromossoma hospedeiro. Preferencialmente, a integração ocorre através de uma recombinação homóloga, utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, aos elementos da biblioteca de DNA são atribuídas sequências homólogas de flanqueamento para sequências do organismo hospedeiro. Deste modo, ocorre a integração num local definido no genoma hospedeiro, sem interrupção de genes desejáveis ou essenciais. É especialmente preferido que o ADN da biblioteca seja integrado no sítio de um gene indesejado, num cromossoma hospedeiro, efectuando a interrupção ou eliminação do gene. Por exemplo, a integração nos locais dos genes 0CH1, MNN1 153 ou MNN4 permite a expressão do ADN da biblioteca desejado enquanto impede a expressão de enzimas envolvidas na hipermanosilação de levedura de glicoproteinas. A biblioteca de DNA pode igualmente ser inserida no hospedeiro através de uma molécula de ácido nucleico, plasmídeo, vector (por exemplo, vector virai or retroviral), cromossoma e pode ser introduzida como uma molécula de ácido nucleico autónoma ou homóloga ou por integração homóloga ou andomizada no genoma hospedeiro. Em qualquer caso, em geral é desejável incluir com cada construção de ADN de biblioteca pelo menos um gene marcador seleccionável, para permitir uma pronta selecção de organismos hospedeiros que tenham sido transformados com estabilidade. Os genes marcadores recicláveis, tal como ura3, que podem ser seleccionados para ou contra, são especialmente adequados.

Processos de Triagem e de Selecção

Após a transformação da estirpe hospedeira com a biblioteca de ADN, são seleccionados os transformantes com o fenotipo de glicosilação desejado. A selecção pode ser executada numa etapa única ou por meio de uma série de enriquecimentos fenotípicos e/ou etapas de depleção, utilizando qualquer um de uma variedade de análises ou métodos de detecção. A caracterização fenotipica pode ser efectuada manualmente ou utilizando um equipamento de rastreio de elevado débito automático. Vulgarmente, um microrganismo hospedeiro apresenta N-glicanos proteicos à superfície da célula, onde estão localizadas várias glicoproteinas. 154 É possível, por exemplo, rastrear estas células que possuem uma concentração mais elevada de GlcNAc terminal na superfície da célula, ou aquelas células que secretam a proteína com o conteúdo mais elevado de GlcNAc terminal. Tal rastreio pode basear-se num método visual, tal como um procedimento de coloração, a capacidade de ligar determinados anticorpos de ligação específicos para GlcNAc terminais ou lectinas conjugadas a um marcador (tais lectinas encontram-se disponíveis junto dos E.Y. Laboratories Inc., San Mateo, CA), a capacidade reduzida de determinadas lectinas se ligarem a resíduos de manose terminais, a capacidade de incorporar um açúcar com marcação radioactiva in vitro, ligação a corantes ou superfícies carregadas alterada, ou pode ser realizado através da utilização de um aparelho de Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) (separador de células activadas por fluorescência) em conjunto com uma lectina ou um anticorpo marcado com um fluoróforo (Guillen et al. (1998) Proc. Natl. Acad Sei. USA 95(14):7888-7892).

Em conformidade, podem ser rastreadas células intactas para detectar um fenotipo de glicosilação desejado, expondo as células a uma lectina ou anticorpo que se liga especificamente ao N-glicano desejado. Uma ampla variedade de lectinas específicas de oligossacáridos encontra-se comercialmente disponível (EY Laboratories, San Mateo, CA). Em alternativa, anticorpos contra N-glicanos humanos ou animais específicos encontram-se disponíveis comercialmente ou podem ser produzidos por meio de técnicas convencionais. Uma lectina ou anticorpo apropriado pode ser conjugado numa molécula repórter, tal como um cromóforo, fluoróforo, radioisótopo ou uma enzima com um substrato cromogénico 155 (Guillen et al., 1998. Proc. Natl.Acad. Sei. USA 95(14): 7888-7892). 0 rastreio pode então ser executado utilizando métodos analíticos, tal como espectrofotometria, fluorometria, selecção celular activada por fluorescência ou contagem da cintilação. Noutros casos, poderá ser necessário analisar glicoproteínas ou N-glicanos isolados a partir de células transformadas. 0 isolamento de proteínas pode ser efectuado por meio de técnicas conhecidas na técnica. Preferencialmente, uma proteína relatora é segregada para o meio e purificada por cromatografia de afinidade (por exemplo, afinidade Ni ou cromatografia de afinidade glutationa - S-transferase). Em casos em que se prefere um N-glicano isolado, pode ser utilizada uma enzima tal como endo-p-N-acetilglucosaminidase (Genzyme Co., Boston, MA; New England Biolabs, Beverly, MA) para clivar os N-glicanos das glicoproteínas. As proteínas isoladas ou os N-glicanos podem então ser analisados por meio de cromatografia líquida (por exemplo HPLC), espectroscopia de massa ou outros meios adequados. A patente norte-americana n° 5,595,900 explica vários métodos, por meio dos quais podem ser identificadas estruturas hidrato de carbono extracelulares desejadas. Preferencialmente, o espectrómetro de massa MALDI-TOF é utilizado para analisar N-glicanos clivados.

Antes da selecção de um transformante desejado, poderá ser desejável eliminar da população transformada as células com fenotipos indesejados. Por exemplo, quando o método é utilizado para manipular uma actividade de manosidase funcional em células, os transformantes desejados terão níveis inferiores de manose na glicoproteína celular. A 156 exposição da população transformada a um radioisótopo letal de manose no meio esgota a população de transformantes com fenotipos indesejados, isto é níveis elevados de manose incorporada (Huffaker and Robbins (1983) Proc Natl Acad Sei USA. 80(24):7466-70). Em alternativa, pode ser utilizada uma lectina citotóxica ou anticorpo, orientados para um N-glicano indesejado, para esgotar uma população transformada de fenotipos indesejados (por exemplo, Stanley e Siminovitch (1977) Somatic Cell Genet 3(4):391-405). A patente norte-americana n° 5,595,900 explica vários métodos, por meio dos quais podem ser identificadas estruturas hidrato de carbono extracelulares desejadas. Uma execução repetida desta estratégia permite a manipulação genética sequencial de cada vez mais glicanos complexos em células eucariotas inferiores.

Para se detectarem células hospedeiras que tenham, na sua superfície, um grau elevado de GlcNAcMan3GlcNAc2 intermediário N-glicano semelhante ao humano, por exemplo, é possível proceder à selecção de transformantes para uma transferência mais eficaz de GlcNAc pela GlcNAc Transferase de UDP-GlcNAc num ensaio celular in vítro. Esta selecção pode ser conduzida cultivando as células que abrigam a biblioteca transformada sob pressão selectiva numa placa de ágar e ao se transferirem colónias individuais para placas de microtitulação de 96-poços. Após cultivo das células, estas são centrifugadas, e resuspensas num tampão e após adição de UDP-GlcNAc e GnTII, a libertação de UDP é determinada por HPLC ou ensaio ligado à enzima por UDP. Alternativamente, pode utilizar-se UDP-GlcNAc com marcação radioactiva e GnTII, lavar as células e depois aguardar pela libertação da n-acetilglucosaminidase GlcNAc 157 radioactiva. Esta operação pode ser efectuada manualmente ou utilizando um equipamento de rastreio de elevado débito automático. Espera-se que os transformantes que libertam mais UDP, no primeiro ensaio, ou mais GlcNAc com marcação radioactiva no segundo, tenham um nivel mais elevado de GlcNAcMan3GlcNAc2 na superfície, sendo que, deste modo, constituam o fenótipo desejado. É igualmente possível adaptar ensaios semelhantes para se observarem os N-glicanos em proteínas segregadas.

Em alternativa, pode optar-se por qualquer outra selecção adequada, como o ensaio de ligação de lectinas, que tem capacidade de revelar padrões de glicosilação alterados na superfície de células transformadas. Neste caso, a reduzida ligação das lectinas específica das manoses terminais pode ser considerada um instrumento de selecção bastante adequado. Por exemplo, lectina de Galantus nivalis liga especif icamente a oí-1,3-manose terminal, a qual se espera que seja reduzida caso exista actividade de manosidase II no Golgi. É igualmente possível enriquecer os transformantes desejados, conduzindo uma fase de separação cromatográfica que permita a remoção de células que contenham um elevado teor em manose terminal. Esta fase de separação poderia ser conduzida com uma coluna de lectina que liga principalmente células com um teor elevado de manose terminal (por exemplo, lectina de Galantus nivalis ligada a agarose, Sigma, St.Louis, MO) ao contrário das que têm um teor baixo de manose terminal.

Mais ainda, é possível criar directamente estas construções de proteínas de fusão, considerando que esta informação adicional sobre a localização de enzimas modificadoras de hidrato de carbono activo em diferentes células eucariotas 158 inferiores se encontra disponível em literatura científica. Por exemplo, sabe-se que o pi,4-GalTr humano pode ser fundido no domínio da membrana de MNT, manosiltransferase de S.cerevisiae, e localizado no aparelho de Golgi ao mesmo tempo que retém a sua actividade catalítica (Schwientek et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(10):5483-9) Se S.cerevisiae ou organismo relacionado é o hospedeiro a ser geneticamente manipulado, é então possível incluir directamente essas descobertas na estratégia global de forma a se obter N-glicanos complexos a partir de tal hospedeiro. Foram identificados inúmeros fragmentos genéticos destes em P.pastoris, que estão relacionados com glicosiltransferases em S.cerevisiae e, deste modo, foi possível utilizar os mesmos para o efeito.

Locais de Integração

Uma vez que o objectivo último deste esforço de manipulação genética é uma estirpe robusta produtora de proteína, capaz de ter um bom desempenho num processo de fermentação industrial, a integração de múltiplos genes no cromossoma (por exemplo, fúngico) hospedeiro envolve planeamento cuidadoso. A estirpe manipulada geneticamente terá, muito provavelmente, de ser transformada com uma gama de genes diferentes e estes genes terão de ser transformados de um modo estável para garantir que a actividade desejada é mantida ao longo do processo de fermentação. Como presentemente descrito, qualquer combinação das actividades enzimáticas desejadas poderá ter de ser manipulada no hospedeiro de expressão da proteína fúngica, por exemplo, sialiltransferases, manosidases, fucosiltransferases, galactosiltransferases, glucosiltransferases, GlcNActransferases, transportadores específicos do RE e 159

Golgi (por exemplo transportadores simporta e antiporta para USP-galactose e outros precursores) outras enzimas envolvidas no processamento de oligossacáridos e enzimas envolvidas na síntese de precursores oligossacáridos activados, tal como UDP-galactose, ácido CMP-N-acetilneuramínico. 0 quadro 6 apresenta exemplos dos métodos preferidos de modificação da glicosilação numa célula hospedeira eucariota inferior, tal como a Pichia pastor.

Quadro 6. Algumas concretizações preferidas para modificação da glicosilação em microrganismos eucariotas inferiores.

Estrutura desejada Activida des catalíti cas adequada s Fontes adequada s de sequênci as de localiza ção Eliminaçõ es genéticas adequadas Transport adores e/ou fosfatase s adequados Man5GlcNAc2 oí-1,2- Mnsl (N- 0CH1/MNN1 Nenhum manosida terminal /MNN4 se , s. (murino, cerevisi humano, ae) Ochl Bacillus (N- sp., terminal A.nidula , S. ns) cerevisi ae, P. 160 pastoris ) Ktrl Mnn9 hntl (S. cerevisi ae) KDEL, HDEL (C-terminal ) GlcNAcMan5GlcNAC2 GlcNAc Transfer ase I, (humano, murino, ratinho, etc.) Ochl (N-terminal , S. cerevisi ae, P. pastoris ) KTR1 (N- terminal ) Mnnl (N- terminal , S. cerevisi ae) Mntl (N- terminal , S. cerevisi ae) OCH1/MNN1 /MNN4 UDP- GlcNAe transport ador (humano, murino, K. lactis) UDPase (humano) 161 GDPase (N- terminal f S. cerevisi ae Estrutura desejada Activida des catalíti cas adequada s Fontes adequada s de sequênci as de localiza ção Eliminaçõ es genéticas adequadas Transport adores e/ou fosfatase s adequados GlcNAcMan3GlcNAc2 Manosida se II Ktrl dnnl (N-terminal , s. cerevisi ae) Mnti (N- terminal , S. cerevisi ae) Kre2/Mnt 1 (S. cerevisi ae) Kre2 0CH1/MNN1 /MNN4 UDP- GlcNAe transport ador (humano, murino, K. lactis) UDPase (humano) 162 GicNAc (2-4) -Man3GlcNAc2 (P. pastoris ) Ktrl (S. cerevisi ae) Ktri (P pastoris ) Mnnl (S. cerevisi ae)

GicNAc Transfer ase II, III, IV, IV (humano, murino)

Mnnl (N- terminal , S. cerevisi ae) Mnti (N- terminal , S. cerevisi ae) Kre2/Mnt 1 (S. 0CH1/MNN1 /MNN4 UDP- GlcNAe transport ador (humano, murino, K. lactis) UDPase (humano) cerevisi ae) Kre2 (P pastoris ) Ktrl 163 (S. cerevisi ae) Ktr-I (P. pastoris ) Mnnl (S. cerevisi ae) Gâl (1-4) GicNAC (2-4) — Man3GlcNAc2 β-1,4- Galactos il transfer ase (humano) Mnnl (N-terminal , S. cerevisi ae) Mnti (N- terminal , s. cerevisi ae) Kre2/Mnt 1 (S. cerevisi ae) Kre2 (P. pastoris ) Ktrl (S. cerevisi ae) Ktr-I (P. 0CH1/MNN1 /MNN4 UDP- Galactose transport ador (humano, S.pombe) 164 pastoris ) Mnnl (S. cerevisi ae) Estrutura desejada Activida des catalíti cas adequada s Fontes adequada s de sequênci as de localiza ção Eliminaçõ es genéticas adequadas Transport adores e/ou fosfatase s adequados NANA(i-4) Gal (i-4) GicNAc (2-4)— Man3GlcNAc2 oí-2, 6-Sialiltr ansferas e (humano) a-2, 3- Sialiltr ansferas e Ktrl Mnnl (N-terminal , S. cerevisi ae) Mnti (N- terminal , s. cerevisi ae) Kre2/Mnt 1 (S. cerevisi ae) Kre2 (P pastoris ) Ktrl 0CH1/MNN1 /MNN4 CMP-ácido siálico transport ador (humano) 165

formação de N-glicanos complexos numa célula hospedeira como a eucariota inferior envolve tanto a eliminação como a adição de determinadas actividades glicosiltransferases e um esguema abrangente tentará coordenar ambos os requisitos. Os genes que codificam enzimas indesejáveis servem de potenciais locais de integração a genes desejáveis. Por exemplo, a actividade 1,6-manosiltransferase é uma marca de glicosilação em muitas eucariotas inferiores conhecidas. 0 gene que codifica alfa-1,6 manosiltransferase (0CH1) foi clonado de S. cerevisiae e as mutações do gene dão lugar a um fenotipo viável com manosilação reduzida. 0 locus do gene que codifica actividade alfa-1,6 manosiltransferase é, por conseguinte, um alvo primário para a integração de genes que codificam a actividade glicosiltransferase. Da mesma forma, pode-se escolher uma gama de outros locais de integração cromossómico que, baseados num evento de interrupção de genes nesse locus, se espera que: (1) melhore a capacidade das células de glicosilar de uma forma mais humana, (2) melhore a capacidade das células de segregar proteínas, (3) 166 reduza a proteólise de proteínas estranhas e (4) melhore outras características do processo que facilitem a purificação ou o próprio processo de fermentação.

Glicoproteínas Alvo

Os métodos descritos na presente invenção são úteis para a produção de glicoproteínas, em especial glicoproteínas utilizadas a título terapêutico em seres humanos. As glicoproteínas com glicoformas específicas podem ser especialmente úteis, por exemplo no endereçamento de proteínas terapêuticas. Por exemplo, foi demonstrado que a manose-6-fosfato endereça proteínas directas para o lisosoma, o que pode ser essencial para o bom funcionamento de várias enzimas relacionadas com doenças do armazenamento lisosomal como por exemplos as doenças de Gaucher, de Hunter, de Hurler, de Scheie, de Fabry e de Tay-Sachs. Da mesma forma, a adição de um ou mais resíduos de ácido siálico à cadeia lateral glicano pode aumentar o tempo de vida de uma glicoproteína terapêutica in vivo após a administração. Assim, as células hospedeiras, como as de uma eucariota inferior ou as de mamífero, podem ser geneticamente manipuladas de modo a aumentar a extensão do ácido siálico terminal em glicoproteínas expressas nas células. Em alternativa, o ácido siálico pode ser conjugado com a proteína de interesse in vitro antes da administração, utilizando uma transferase de ácido siálico e um substrato apropriado. As alterações na composição do meio de crescimento podem ser empregues em adição à expressão de actividades enzimáticas envolvidas na glicosilação semelhante à humana por forma a produzir glicoproteínas mais semelhantes às formas humanas (Weikert et al. (1999) Nature Biotechnology 17, 1116-1121; Werner et 167 al. (1998) Arzneimittelforschung 48(8):870-880; Andersen and Goochee (1994) Cur. Opin. Biotechnol. 5:546-549; Yang and Butler (2000) Biotecfinol.Bioengin. 68(4):370-380). Foi demonstrado que a modificação especifica de glicanos para anticorpos monoclonais (por exemplo, adicionando interferão-α GicNAc) melhora citotoxicidade celular dependente de anticorpos (Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-80), o que pode ser desejável para a produção de anticorpos ou outras proteínas terapêuticas.

As proteínas terapêuticas são tipicamente administradas por meio de injecção, por via oral, pulmonar ou outras vias. Exemplos de glicoproteínas alvo adequadas que podem ser produzidas de acordo com a invenção incluem, sem constituir limitação: eritroproteína, citoquinas como interferão-a, interferão-β, interferão-γ, interferão-o e granulocito-CSF, factores de coagulação tais como factor VIII, factor IX e proteína humana C, cadeia α do receptor IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinase, quimase e inibidor da tripsina ureia, proteína de ligação IGF, factor de crescimento da epiderme, factor de libertação da hormona de crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor-2 de crescimento endotelial vascular, factor-1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegirina, a-1 antitripsina, DNase IT, α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, também conhecido por proteína de ligação TNF 1), TACI-Ig (activador transmembranar, modulador de cálcio e ligando interactor de ciclofilina), FSH (hormona folículo-estimulante), GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteína 1 do tipo glucagon) agonista do receptor IL-1, sTNFr (enbrel, também conhecido por receptora solúvel de TNF combinada à 168 porção Fc) ATUI, rh Trombina, glucocerebrosidase e CTLA4-Ig (linfócitos T citotóxicos associados com Antigénio 4 - ig) ·

Expressão de OnT-111 para impulsionar a funcionalidade dos anticorpos A adição de resíduos de N-acetilglucosamina à estrutura GlcNAcMan3GlcNAc2 pelas N-acetilglucosaminiltransferases II e III produz o famoso glicano bissectado GlcNAC3Man3GlcNAc2 (Figura 15) . Esta estrutura tem sido implicada em importante citotoxicidade celular dependente de anticorpos (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) (Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80). A re- modificação genética das glicoformas de imunoglobulinas expressas por células de mamífero é uma tarefa entediante e penosa. Especialmente no caso de GnTIII, em que a sobreexpressão desta enzima tem sido implicada na inibição do crescimento, tiveram de ser empregues métodos que envolvem expressão genética regulada (induzível) para produzir imunoglobulinas com N-glicanos bissectados. (1999) Biotechnol Bioeng. 65(5):542—9; Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-80); Umana et al. WO 03/011878; Patente norte-americana n° 6,602,684.

Assim sendo, noutra forma de concretização, a invenção fornece sistemas e métodos de produção de N-glicanos semelhantes aos humanos com um N-acetilglucosamina (GlcNAc) bissectante numa estrutura "core" trimanose ou pentamanose. Numa concretização preferencial, a invenção fornece um sistema e um método de produção de imunoglobulinas com N-glicanos bissectantes. Os sistemas e métodos descritos na presente não sofrerão de problemas anteriores, isto é, de 169 citotoxicidade associada à sobre-expressão de GnTIII ou ADCC, uma vez que as células hospedeiras da invenção são manipuladas e seleccionadas para serem células viáveis e preferencialmente robustas que produzem N-glicanos com glicoformas do tipo humano substancialmente modificadas, como o GlcNAc2Man3GlcNAc2. Deste modo, a adição de N-acetilglucosamina bissectante numa célula hospedeira da invenção terá um efeito negligenciável no fenotipo de crescimento ou na viabilidade dessas células hospedeiras.

Além disso, o trabalho de outras pessoas tem demonstrado que não existe uma correlação linear entre os níveis de expressão GnTIII e o grau de ADCC. Umana et al. (1999)

Nature Biotechnol. 17:176-80. Deste modo, encontrar o nível óptimo de expressão em células de mamífero e mantê-lo através de um processo de fermentação aprovado pelo FDA parece constituir um desafio. Contudo, em células da invenção, tais como as células fúngicas, encontrar um promotor de potência apropriado para criar um nível de expressão GnTIII robusto, fiável e óptimo é uma tarefa comparativamente fácil para alguém com competências na técnica.

Uma célula hospedeira como a estirpe de levedura capaz de produzir glicoproteínas com N-glicanos bissectantes é manipulada através da introdução dentro da célula hospedeira da invenção de uma actividade GnTIII (Exemplo 12) . De preferência, a célula hospedeira é transformada com um ácido nucleico que codifica a GnTIII (vide, ex, Figura 24) ou um domínio da mesma com actividade enzimática, opcionalmente fundido a peptideo de sinal de marcação celular heterólogo (isto é, utilizando as bibliotecas e métodos associados descritos na presente). As células 170 manipuladas para expressar GnTIII produzirão títulos de anticorpos mais elevados do que conseguem as células dos mamíferos. Produzirão igualmente anticorpos com maior potência relativamente a ADCC.

Tem sido demonstrado que os anticorpos produzidos por linhas de células de mamíferos transfectadas com GnTIII são tão eficazes como os anticorpos produzidos por linhas de células não transfectadas, mas com uma concentração 10-20 vezes inferior (Davies et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 74(4):288-94). Um aumento da produtividade do veículo de produção da invenção em relação aos sistemas de mamíferos por um factor de vinte, e um aumento de dez vezes da potência resultará numa melhoria da produtividade líquida de duzentos. Deste modo, a invenção fornece um sistema e um método de produção de títulos elevados de um anticorpo com elevada potência (ou seja, até várias ordens de magnitude mais potente do que pode ser actualmente produzido). O sistema e método é seguro e fornece anticorpos com elevada potência a baixo custo em curtos períodos de tempo. As células hospedeiras manipuladas para expressarem GnTTII conforme descrito na presente produzem imunoglobulinas com N-glicanos bissectados a taxas de pelo menos 50 mg/litro/dia até pelo menos 500 mg/litro/dia. Além disso, cada molécula de imunoglobulina (Ig) (incluindo GlcNAcs bissectantes) é mais potente do que a mesma molécula Ig produzida sem GlcNAcs bissectantes.

Produção de estruturas multiantenárias para funcionalidade melhorada das glicoproteínas Sínteses de estruturas tetraantenárias foram consideradas importantes para a actividade biológica in vivo de uma 171 variedade de proteínas como a EPO e glicoproteínas ácidas al. Takeuchi et al., Proc Natl Acad Sei USA. 1989 Oct; 86 (20) :7819-22; Boris et al., Inflammation (1990) 14, 315-323. Os estudos farmacocinéticos demonstraram que a estrutura volumosa da ramificação tetraantenular evita que a EPO seja filtrada na urina. A modificação de proteínas, por exemplo com conjugados químicos (ou seja, polietilenoglicol) foi concebida para retardar a remoção de glicoproteínas potencialmente terapêuticas. Nestes termos, numa concretização, a presente invenção fornece métodos para sintetizar glicoproteínas que incluem múltiplas estruturas antenárias em células hospedeiras fúngicas unicelulares ou multicelulares (P.pastoris) que têm uma melhor actividade biológica in vivo e são eliminadas menos rapidamente do que as mesmas glicoproteínas com antenularidade reduzida. Essencialmente, as glicoproteínas produzidas de acordo com os métodos da presente invenção (ver também WO 02/00879 e WO 03/056914 incorporados no presente como referência) melhoraram a eficácia terapêutica.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar vários aspectos da invenção. Estes exemplos não devem ser encarados como limitadores: os mesmos são incluídos apenas para fins de ilustração. EXEMPLO 1

Clonagem e disrupçâo do gene OCHl em P.pastoris Geração de um mutante OCHl de P.pastoris: 172

Uma ORF 1215 bp do gene 0CH1 P. pastoris que codifica uma manosiltransferase putativa a-1,6 foi amplificada do X genómico de P. pastoris (estirpe X-33, Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando oligonucleótidos 5'-ATGGCGAAGGCA-GATGGCAGT-3' (SEQ ID NO:3) e 5'-TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC-3' (SEQ ID NO: 4) que foram concebidos com base na sequência 0CH1 P. pastoris (Publicação de pedido de patente japonesa No. 8-336387). Posteriormente, 2685 bp a montante e 1175 bp a jusante da ORF do gene 0CH1 foram amplificados a partir de uma biblioteca de DNA genómico de P. pastoris (Boehm, T. et al. (1999) Yeast 15(7):563-72) utilizando os oligonucleótidos internos 5'-ACTGCCATCTGCCT-TCGCCAT-3' (SEQ ID NO:47) no gene 0CH1 e oligonucleótidos 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' T7 (SEQ ID NO: 48) e 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' T3 (SEQ ID NO:49) na cadeia principal da biblioteca que possui lambda plasmideo ΖΑΡ II (Stratagene, La Jolla, CA) . 0 fragmento 5075 bp resultante foi clonado no vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e designado pBK9.

Após a montagem de uma construção de um knockout de genes que substituía a grelha de leitura OCHl com um gene de resistência HIS4, P. pastoris foi transformado e as colónias foram rastreadas quanto a sensibilidade de temperatura a 37°C. Os mutantes OCHl de S. cerevisiae são sensíveis à temperatura e crescem lentamente a elevadas temperaturas. Deste modo é possível identificar homólogos funcionais de OCHl em P.pastoris complementando um mutante OCHl de S. cerevisiae com uma biblioteca de ADN ou cADN de P.pastoris. Cerca de 20 estirpes sensíveis a temperatura foram ainda sujeitas a um rastreio PCR da colónia para 173 identificação de colónias com um gene Ochl eliminado. Foram obtidas várias delecções ochl. 0 pBK9.1 linearizado, que tem sequência 2.1 kb a montante e sequência 1.5 kb a jusante da cassete do gene 0CH1 que possui o gene Pichia HIS4, foi transformado em P. pastoris BKl [GS115 (his4 Invitrogen Corp., San Diego, CA) possuindo o gene humano IFN-p no locus A0X1] para produzir um knock out do gene 0CH1 de tipo selvagem. 0 rastreio inicial de transformantes foi executado com meio de retirada de histidina seguido de replica plating (plaqueamento em réplica) de modo a seleccionar as colónias sensíveis à temperatura. Vinte das duzentas colónias positivas para histidina apresentaram uma fenotipo sensível à temperatura a 37°C. Para excluir a integração aleatória de pBK9.1 no genoma Pichia, os 20 isolados sensíveis a temperatura foram sujeitos a PCR de colónia utilizando iniciadores específicos à sequência a montante do local de integração e à ORF HIS4. Duas das vinte colónias não tinham ochl e voltaram a ser analisadas com uma transferência de Southern e uma transferência de Western indicando a ruptura funcional do ochl pela construção knock-out do och 1. O DNA genómico foi digerido com duas enzimas de restrição separadas, BglII e Cia I, de modo a confirmar o knock-out do och 1 e confirmar a integração na grelha de leitura aberta. A transferência de Western mostrou mutantes ochl com falta de uma banda discreta produzida no tipo selvagem GS115 a 46.2 kDa. EXEMPLO 2 174

Manipulação de P.pastoris com a-1,2-manosidase para produzir precursores IFN-I3 que contenham Man5GlcNAc2

Uma a-1,2-manosidase é necessária para o encurtamento de Man5GlcNAc2, para se obter Man5GlcNAc2, um intermediário essencial para a formação de N-glicanos complexos. Embora a produção de um precursor Man5GlcNAc2 seja essencial, não é necessariamente suficiente para a produção de glicanos híbridos e complexos porque o isómero específico de Man5GlcNAc2 pode ser ou não um substrato para GnTI. Um mutante 0CH1 de P. pastoris é manipulado para exprimir interferão-β humano secretado, sob o controlo de um promotor aox. A biblioteca de ADN é construída pela ligação in-frame do domínio catalítico de manosidase humana IB (uma a-1,2-manosidase) com uma sub-biblioteca incluindo sequências codificadoras de peptídeos de localização Golgi e RE. A biblioteca de ADN é depois transformada no organismo hospedeiro, resultando numa população geneticamente misturada, em que transformantes individuais exprimem interferão-β, bem como um gene de manosidase sintético da biblioteca. As colónias de transformantes individuais são cultivadas e a produção do interferão é induzida por meio da adição de metanol. Nestas condições, mais de 90 % da proteína segregada inclui interferão-β glicosilado.

Os sobrenadandes syo purificados para remover sais e contaminantes de baixo peso molecular por meio de cromatografia de fase inversa sílica C18. Os transformantes desejados que exprimem a-1,2-manosidase activa, adequadamente endereçada, produzem interferão-β, incluindo N-glicanos com a estrutura Man5GlcNAc2, a qual possui uma massa molecular reduzida em comparação com o interferão-β 175 da estirpe progenitora. 0 interferão-β é analisado por espectroscopia de massa MALDI-TOF e as colónias que expressam a forma desejada de interferão-β são identificadas. EXEMPLO 3

Geração de uma estirpe mutante ochl que expressa uma a-1,2-manosidase, GnTI e GnTII para produção de uma glicoproteina semelhante à humana. A grelha de leitura aberta 1215 bp do gene 0CH1 P. pastoris, bem como 2685 bp a montante e 1175 bp a jusante foram amplificados pelo PCR (vide também WO 02/00879), clonados para o vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e designados pBK9. Para criar uma estirpe de knockout Ochl com marcadores auxotrópicos múltiplos, 100 lig de pJN329, um plasmideo com alelo mutante ochl::URA3 flanqueado com sitios de restrição Sfil foi digerido com Sfil e utilizado para transformar a estirpe P. pastoris JC308 (Cereghino et al. (2001) Gene 263:159-169) por electroporação. Após a incubação no meio definido com falta de uracilo durante 10 dias a temperatura ambiente, foram escolhidas e reaplicadas 1000 colónias. Os clones URA+ que não conseguiram crescer a 37°C, mas que cresceram à temperatura ambiente, foram sujeitos a PCR de colónia de modo a testar a correcta integração do alelo mutante ochl::URA3. Um clone que apresentou o padrão PCR esperado foi designado YJN153. O domínio 3 Kringle de plasminogénio humano (K3) foi utilizado como proteína modelo. Um plasmideo marcado com NeoR que continha o gene K3 foi transformado na estirpe YJN153 e uma estirpe resultante, expressando K3, foi 176 chamada de BK64-1. 0 plasmídeo pPBl03 que contém o gene Kluyveromyces lactis MNN2-2 que codifica um transportador Golgi UDP-N-acetilglucosamina foi construído através de clonagem de um fragmento rombo Bglll-Hindlll do vector pDL02 (Abeijon et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93:5963-5968) em Bgll I e BamHI digerido e com pontas rombas pBLADE-SX que contêm o gene ADE1 P. pastoris (Cereghino et al. (2001) Gene 263:159-169). Este plasmídeo foi linearizado com EcoNI e transformado em estirpe BK64-1 por electroporação e uma estirpe que se confirmou conter o MNN2-2 por análise PCR foi designado PBPl.

Foi gerada uma biblioteca de construções manosidase que inclui fusões in-frame dos domínios líder de várias proteínas de membrana tipo I ou tipo II de S. cerevisiae e P. pastoris fundidas com os domínios catalíticos de vários genes a-1,2-manosidase provenientes de humanos, ratinhos, moscas, vermes e levedura (vide, por exemplo, W002/0087 9) . Esta biblioteca foi criada num vector de integração P. pastoris HIS4 e seleccionada por linearização com Sall, transformando por electroporação na estirpe PBPl e analisando os glicanos libertados da proteína relatora K3. Uma construção activa escolhida foi uma quimera dos nucleótidos 988-1296 (C-terminal) do gene SEC12 da levedura fundido com uma eliminação N-terminal do gene a-1,2-manosidase IA do rato (Figura 3), a que faltam os nucleótidos 187. Uma estirpe P. pastoris expressando esta construção foi designada PBP2.

Uma biblioteca de construções GnTI foi gerada, incluindo fusões in-frame da mesma biblioteca líder com os domínios catalíticos dos genes GnTI provenientes de humanos, vermes, sapos e moscas (WO 02/00879). Esta biblioteca foi criada 177 num vector de integração HIS4 P. pastoris e seleccionada por linearização com Aatl I, transformando por electroporação na estirpe PBP1 e analisando os glicanos libertados da K3. Uma construção activa escolhida foi uma quimera dos primeiros 120 bp do gene MNN9 de S. cerevisiae até uma eliminação do gene humano GnTI que faltava aos primeiros 154 bp. Uma estirpe P. pastoris expressando esta construção foi designada PBP-3. (Vide igualmente Figura 36) .

Uma biblioteca de construções GnTI foi gerada, incluindo fusões in-frame da mesma biblioteca lider com os domínios catalíticos dos genes GnTI provenientes de humanos e ratos (WO 02/00879). Esta biblioteca foi criada num vector de integração P. pastoris que contém o gene NSTR que confere resistência à droga nourseothricin. Os plasmídeos da biblioteca foram linearizados com EcoRI, transformados em estirpe RDP27 por electroporação e as estirpes resultantes foram seleccionadas através de análise dos glicanos libertados de K3 purificado.

Materiais para as seguintes reacções: MOPS, cacodilato de sódio, cloreto de manganês, UDP-galactose e ácido CMP-N-acetilneuramínico eram de Sigma. O ácido trifluoroacético (TFA) era de Sigma/Aldrich, Saint Louis, MO. Ratazana recombinante a2,6-sialiltransferase de Spodoptera frugiperda e 131,4-galactosiltransferase de leite bovino eram de Calbiochem (San Diego, CA). A Proteína N-glucosidase F, as mnnosidases e os oligossacáridos eram de Glyko (San Rafael, CA) . A resina DEAE ToyoPearl era de TosoHaas. A resina quelante de metal "HisBind" era de 178

Novagen (Madison, WI) . As placas lysate-clearing de 96 poços eram de Promega (Madison, WI). As placas de 96 poços com ligação de proteína eram de Millipore (Bedford, MA). Os sais e os agentes tampão eram de Sigma (St. Louis, MO) . As matrizes MALDI eram de Aldrich (Milwaukee, WI).

Purificação da proteína A Kringle 3 foi purificada com um formato de 96 poços num robot de manuseamento de amostras Beckman BioMek 2000 (Beckman/ Coulter Ranch Cucamonga, CA) . A Kringle 3 foi purificada do meio de expressão com uma etigueta de hexa-histidina C-terminal. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo previsto por Novagen para a respectiva resina HisBind. Em suma, um volume definido de 150uL (pLL) de resina é vertido para os poços de uma placa lysate-binding de 96 poços, é lavado com 3 volumes de água e carregado com 5 volumes de 50mM NiS04 e lavado com 3 volumes de tampão de ligação (5mM imidazol, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCL pH7.9). O meio de expressão da proteína é diluído 3:2, meio/PBS (60mM P04, 16mM KCI, 822mM NaCl pH7.4) e carregado nas colunas. Após a drenagem, as colunas são lavadas com 10 volumes de tampão de ligação e 6 de tampão de lavagem (30mM imidazol, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCI pH7.9) e a proteína é eluída com 6 volumes de tampão de eluição (1M imidazol, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCI pH7.9). As glicoproteínas eluídas são evaporadas até à secura por liofilização.

Libertação de Glicanos N-ligados 179

Os glicanos são libertados e separados das glicoproteínas através de uma modificação de um método previamente descrito (Papac, et al. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454) . Os poços de uma placa (Millipore) de 96 poços MultiScreen IP (membrana Immobilon-P) são humectados com 1 OOuL de metanol, lavados com 3X150uL de água e 50uL de tampão ROM (8M ureia, 360mM Tris, 3,2mM EDTA pH8.6), drenando com um vácuo suave após cada adição. As amostras de proteínas secas são dissolvidas em 30uL de tampão ROM e transferidas para os poços que contêm lOuL de tampão ROM. Os poços são drenados e lavados duas vezes com o tampão ROM. As proteínas são reduzidas através da adição de 60uL de 0.1M DTT em tampão ROM durante lh a 37°C. Os poços são lavados três vezes com 300uL de água e carboximetilato através da adição de 60uL de ácido iodoacético 0.1M durante 30 minutos às escuras à temperatura ambiente. Os poços são novamente lavados três vezes com água e com as membranas bloqueadas pela adição de lOOuL de 1°A, PVP 360 na água durante lh à temperatura ambiente. Os poços são drenados e lavados três vezes com 300uL de água e deglicosilato através da adição de 30uL de lOmM NH4HC03 pH 8.3 que contenha miliunidade de N-glicanase (Glyko). Após 16 horas a 37°c, a solução que contém os glicanos foi removida por centrifugação e evaporada até à secura.

Dessorção ionização laser assistida por matriz-espectrometria de massa por tempo de voo

Os pesos moleculares dos glicanos foram determinados com um espectrómetro de massa Voyager DE PRO linear MALDI-TOF (biociências aplicadas) utilizando extracção retardada. Os 180 glicanos secos de cada alvéolo foram dissolvidos em 15uL de água e 0.5uL colocados em placas de amostra de aço inoxidável e misturados com 0.5uL de matriz S-DHB (9mg/mL de ácido dihydroxy benzóico, 1 mg/mL de ácido 5-metoxisalicílico em 1:1 água/acetonitrilo 0.1% TFA) e postos a secar.

Foram gerados iões por irradiação com um laser de nitrogénio pulsado (337nm) com um tempo de pulsação de 4ns. O instrumento foi feito funcionar na extracção retardada com um atraso de 125ns e uma estirpe de aceleração de 20kV. A estirpe de rede era de 93.00%, a estirpe do passa-fio de 0.10%, a pressão interna era inferior a 5 X 10-7 torr e o limite de massa inferior era de 875Da. Foram gerados espectros da quantia de 100-200 impulsos de laser e foram adquiridos com um digitalizador de 2 GHz. Foi utilizado oligossacárido Man5GlcNAc2 como peso molecular externo padrão. Todos os espectros foram gerados com o instrumento no modo ião positivo. A precisão de massa dos espectros era de 0,5%. A massa dos N-glicanos eluida da coluna é geralmente associada a um aducto de ião positivo que aumenta a massa pelo molecular do ião positivo. Os aductos mais comuns são H+, Na+ e K+. EXEMPLO 4

Manipulação de P. pastoris para produzir Man5GlcNAc2 enquanto estrutura predominante do N-Glicano utilizando uma biblioteca de ADN Combinatorial. 181

Um mutante ochl de P. pastoris (vide Exemplos 1 e 3) foi manipulado para expressar e segregar proteínas como o domínio 3 kringle de plasminogénio humano (K3) sob o controlo do promotor ADXI induzível. 0 domínio 3 Kringle de plasminogénio humano (K3) foi utilizado como proteína modelo. Um fragmento de ADN codificador do K3 foi amplificado com polimerase Pfu turbo (Strategene, La Jolla, CA) e clonado em EcoRI e Xba/locais de pPICZaA (Invitrogen, Carlsbad, CA), resultando numa etiqueta C-terminal 6- His. De modo a melhorar a eficácia da glicosilação N-ligada de K3 (Hayes et al. 1975 J. Arch. Biochem. Biophys. 171, 651-655), Pro46 foi substituído por Ser46 com mutagénese dirigida ao sítio. 0 plasmídeo resultante foi designado pBK64. A sequência correcta da construção PCR foi confirmada pela sequenciaçâo de ADN. Uma biblioteca combinatorial de DNA foi construída junto à ligação in-frame de domínios catalíticos de a-1,2-manosidase de murino IB (Genbank AN 6678787) e IA (Genbank AN 6754619) com uma sub-biblioteca incluindo sequências codificadoras Cop II vesícula, RE e peptídeos de localização Golgi trans de acordo com a tabela 6. A biblioteca combinada de ADN foi utilizada para gerar construções de fusão individuais que foram depois transformados em K3 expressando organismos hospedeiros, resultando numa população geneticamente misturada em que transformantes individuais exprimem K3, bem como uma um sinal de localização/gene de fusão manosidase da biblioteca. Os transformantes individuais foram cultivados e a produção de K3 foi induzida através da transferência para um recipiente com metanol. Nestas condições, após 24 horas de indução, mais de 90 % da proteína no recipiente era K3. A proteína relatora K3 foi 182 purificada a partir do sobrenadante para se remover sais e contaminantes com baixo peso molecular por cromatografia de afinidade. Após a purificação de afinidade, a proteína foi dessalinizada por cromatografia de exclusão por tamanho numa resina Sephadex G10 (Sigma, St. Louis, MO) e foi directamente submetida a análise MALDI-TOF descrita abaixo ou foram removidos os N-glicanos por digestão PNGase conforme descrito abaixo (libertação de N-glicanos) e sujeita a análise MALDI-TOF Miele et al. (1997) Biotechnol. Appl. Biochem. 25:151-157.

Após esta abordagem, foi obtido um conjunto diverso de transformantes; alguns não apresentaram qualquer modificação dos N-glicanos comparativamente à estirpe de knockout Ochl; e outros apresentaram um grau elevado de encurtamento da manose (Figuras 5D e 5E). Os transformantes desejados que exprimem a-1,2-manosidase activa, adequadamente endereçada, produziram K3 com N-glicanos da estrutura Man5GlcNAc2. Isto confere uma massa molecular reduzida à glicoproteína comparativamente ao K3 da estirpe de eliminação progenitora ochl, uma diferença que foi prontamente detectada por espectrometria de massa MALDI-TOF (Figura 5) . 0 Quadro 7 indica os níveis relativos de produção de Man5GlcNAc2.

Quadro 7. Uma biblioteca combinatorial representativa de ADN de sequências de localizaçâo/domínios catalíticos que apresentam níveis relativos de produção de Man5GlcNAc2. 183

Domínios catalíticos Sequências de peptídeo endereçadores MNSI (s) MNSI (m) MNSI (1) SEC12 (s) SEC12(m) Manosidase de ratinho FB4 FB5 FB6 FB7 FB 8 ΙΑ Δ187 -H- + - -H- + -H-+ Manosidase de ratinho GB 4 GB 5 GB 6 GB7 GB8 1B Δ58 -H- + + -H- + Manosidase de ratinho GC4 GC5 GC6 GC7 GC8 1B Δ99 - i-H- + + + Manosidase de ratinho GD4 GD5 GD6 GD7 GD8 1B Δ170 - - + +

Quadro 8. Outra biblioteca combinatorial de ADN de sequências de localização/domínios catalíticos que apresentam níveis relativos de produção de Man5GlcNAc2. 184

Sequências de peptídeo endereçadores Domínios catalíticos VAN1 (s) VAN1(m) VAAr KD MNN10 (s) MNN10(m) .MNN10(1) nanosida se de C. elegans 1B A80 BC18-5 +++++ BC19 ++++ BC20 +++ BC27 +++++ BC28 +++++ BC29 +++ nanosida se de C. elegans 1B A31 BB18 +++++ BB19 +++++ BB20 ++++ + BB18 +++++ BB19 +++++ BB20 +++++

Peptídeos de marcação foram seleccionados de MNS I (SwissProt P32906) em S. cerevisiae (longos, médios e curtos) (vide supra Biblioteca de Ácido Nucleico; Biblioteca Combinatorial de ADN de Construções de Fusão) e SEC12 (SwissProt P11655) em S. cerevisiae (988-1140 nucleótidos: curtos) e (988-1296: médios). Embora a maioria das sequências de peptídeos de marcação fossem eliminações N-terminais, algumas sequências de peptídeos de marcação, como a SEC12, eram eliminações C-terminais. Os domínios catalíticos utilizados nesta experiência foram seleccionados a partir de manosidase IA de ratinho com um eliminação N-terminal de 187 aminoácidos e manosidase 1B de ratinho com eliminação dos aminoácidos 58, 99 e 170. O número de (+)s, tal como presentemente utilizado, indica os níveis relativos de produção de Man5GlcNAc2. A notação (-) indica nenhuma produção aparente de Man5GlcNAc2. A notação (+) indica produção de Man5GlcNAc2 inferior a 10%. A notação 185 (++) indica produção de Man5GlcNAc2 de 10-20%. A notação (+++) indica produção de Man5GlcNAc2 de 20-40%. A notação (++++) indica produção de Man5GlcNAc2 de cerca de 50%. A notação (+++++) indica produção de Man5GlcNAc2 superior a 50%.

Quadro 9 mostra a quantidade relativa de Man5GlcNAc2 em K3 secretado. Seiscentas e oito (608) estirpes diferentes de P. pastoris Aochl foram geradas pela transformação das mesmas com uma única construção de uma biblioteca genética combinatorial que foi gerada com a fusão de dezanove (19) domínios catalíticos a-1,2 manosidase com trinta e duas (32) sequências líder fúngicas de RE e Golgi-cis.

Quantidade de Man5GlcNAc2 em K3 segregado (% do total de glicanos) Número de construções (%) N.D* 19 (3.1) 0-10% 341 (56.1) 10-20% 50 (8.2) 20-40% 75 (12.3) 40-60% 72 (11.8) Mais de 60% 51 (8.4) f Total 608 (100) * Várias construções de fusão não foram testadas porque os palsmídeos correspondentes não puderam ser propagados 186 para E.coli antes da transformação em P.pastoris + foi analisada ainda a actividade manosidase de clones com o maior grau de encurtamento Man5GlcNAc2 (30/51) no sobrenadante do meio. A maioria (28/30) revelou actividade manosidase detectável no sobrenadante (por exemplo figura 4B) Apenas duas contruções revelaram altos níveis de MansGlcNAc2 durante o rastreir da actividade manosidase no meio (por exemplo figura 4C) O Quadro 7 mostra duas construções pFB8 e pGC5, entre outras, que apresentam MansGlcNAc2. O Quadro 8 mostra uma construção preferencial, pBC18-5, uma a-1,2-manosidasese alvo YANl(s) S. cerevisiae (de Swiss Prot 23642) ligada in-frame com uma manosidase IB C. elegans (Genbank AN CAA98114) com eliminação N-terminal de 80 aminoácidos (Saccharomyces Vanl(s)/ manosidase IB Δ80 C. elegans) . Esta construção de fusão produz igualmente uma estrutura Man5GlcNAc2 predominante, conforme ilustrado na Figura 5E. Mostrou-se que esta construção produzia Man5GlcNAc2 superior a 50% (+++++).

Geração de uma localização combinatorial/biblioteca manosidase: A geração de uma biblioteca combinatória de ADN de domínios catalíticos a-1,2-mannosidase fundidos com peptídeos de marcação exigiu a amplificação de domínios manosidase com varias extensões de eliminações N-terminais de vários organismos. Para abordar este objectivo, grelhas de leitura aberta (ORF) com extensão total de a-1,2-manosidases foram amplificadas por PCR quer do cADN quer do ADN genómico 187 obtidos das seguintes fontes: Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Aspergillus nidulans e Penicillium citrinum. Em cada um dos casos, o ADN foi incubado na presença de iniciadores oligonucleótidos específicos para a sequência manosidase desejada, além de reagentes exigidos para realização da reacção PCR. Por exemplo, para amplificar o ORF da a-1,2-mannosidase IA M. musculus, o iniciador 5' ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC (SEQ ID NO:52) e o iniciador 3' TCATTTCTCTTTGCCAT-CAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEO ID NO:53) foram incubados na presença de Pfu ADN polimerase (Stratagene, La Jolla, CA) e amplificados sob as circunstâncias recomendadas por Stratagene utilizando os parâmetros cíclicos: 94°C para 1 minuto (1 ciclo); 94°C para 30 segundos, 68°C para 30 segundos, 72°C para 3 minutos (30 ciclos). Após a amplificação da sequência de ADN codificadora, a ORF foi incubada a 72 °C durante 5 minutos com 1U Taq ADN polimerase (Promega, Madison, WI) antes da ligação ao pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformada em TOPIO quimicamente competente E. coli, conforme recomendado por Invitrogen. O produto PCR clonado foi confirmado pela sequência ABI utilizando iniciadores específicos para a ORF manosidase.

Para gerar as truncagens N-terminal desejadas de cada manosidase, a ORF completa de cada manosidase foi utilizada como modelo numa ronda subsequente de reacções PCR em que a posição de emparelhamento do iniciador 5' foi específica aos terminais 5' da truncagem desejada e o iniciador 3' permaneceu específico ao terminal 3' original da ORF. Para facilitar a subclonagem do fragmento manosidase truncado no vector de expressão de levedura, pJN347 (Figura 2C) os 188 locais de restrição Ascl e Pacl foram manipulados em cada produto de truncagem, nos terminais 5' e 3' respectivamente. 0 número e a posição das truncagens do N-terminal gerados para cada ORF manosidase dependeram da posição da região transmembranar (TM) relativamente ao domínio catalítico (DC). Por exemplo, se a região tronco localizada entre a TM e o DC tiver sido inferior a 150bp, então apenas foi gerada uma truncagem para essa proteína. Se, no entanto, a região tronco tiver sido maior do que 150bp então foram geradas mais uma ou duas truncagens consoante a extensão da região tronco.

Um exemplo de como as truncagens da manosidase IA M. musculus (Genbank AN 6678787) foram geradas encontra-se descrito na presente, com uma abordagem semelhante a ser utilizada pelas outras manosidases. A Figura 3 ilustra o ORF da a-1,2-manosidase IA M. musculus com a transmembranar prevista e os domínios catalíticos realçados a negrito. Com base nesta estrutura, foram designados três iniciadores 5' (posições de emparelhamento sublinhadas na Figura 3) para gerar as eliminações N-terminal A65-, A105- e A187. Utilizando a eliminação N-terminal A65 como exemplo, o iniciador 5' utilizado foi o 5'-GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC-3' (SEQ ID NO:54) (com o local de restrição Ascl realçado a negrito) em conjunto com o iniciador 3' 5'-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCT-TCTGTTCACGG-3' (SEQ ID NO:55) (com o local de restrição Pacl realçado a negrito) . Estes dois iniciadores foram utilizados para amplificar um fragmento 1561 bp sob as condições acima mencionadas para amplificação da extensão total de manosidase IA ORF M. musculus. Além disso, à semelhança do 189 produto obtido para a ORF de extensão completa, o produto truncado foi igualmente incubado com Taq ADN polimerase, ligado a pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA), transformado em TOPIO e ABI sequenciado. Após a amplificação e confirmação da sequência do fragmento manosidase truncado, o plasmideo resultante, pCR2.1-465mMannIA, foi digerido com Ascl e Pacl no tampão #4 do New England Biolabs (Beverly, MA) durante 16h a 37 °C. Paralelamente, o pJN347 (Figura 2C) foi digerido com as mesmas enzimas e incubado conforme descrito supra. Após a digestão, foi extraído gel tanto da medula de pJN347 (Figura 2C) como do domínio catalítico truncado e foram ligados utilizando o Kit de Ligação Rápida (New England Biolabs, Beverly, MA), conforme recomendado pelos fabricantes, e transformado em células DH5a quimicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 0 PCR de colónia foi utilizado para confirmar a geração da construção IAA65 de manosidase pJN347 de ratinho.

Depois de gerada uma biblioteca de domínios catalíticos a-1,2-manosidase truncados no vector de expressão de levedura pJN347 (Figura 2C) o passo restante de geração da biblioteca de peptídeo de marcação/domínio catalítico foi a clonagem in-frame das sequências do peptídeo de marcação (Figura 2). Tanto as construções pJN347-manosidase (Figura 2D) como as construções de peptídeos de marcação pCR2.lT0P0 (Figura 2B) foram incubadas de um dia para o outro a 37°C em tampão #4 do New England Biolabs na presença das enzimas de restrição Notl e Ascl. Após a digestão, foi extraído gel tanto da medula de pJN347-manosidase como das regiões do peptídeo de marcação e foram ligados utilizando o Kit de Ligação Rápida (New England Biolabs, Beverly, MA), conforme 190 recomendado pelos fabricantes, e transformado em células DH5a quimicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Posteriormente, as construções peptideo de marcação/manosidase pJN347 foram ABI sequenciadas para confirmar que as fusões geradas eram in-frame. A dimensão estimada da biblioteca final de peptideo de marcação/alpha-1,2-manosidase contém mais de 1300 construções geradas pela abordagem acima descrita. A figura 2 ilustra a construção da biblioteca combinatorial de ADN.

Manipulação genética de estirpe knock out de P.pastoris OCH1 com múltiplos marcadores auxotróficos. O primeiro passo na construção de plasmídeo envolveu a criação de um conjunto de plasmideos universais com regiões do ADN do gene KEX1 de P. pastoris (Boehm et al. Yeast 1999 May;15(7):563-72) como suporte de espaço para as regiões 5' e 3' dos genes a serem sujeitos a knock out. Os plasmideos contêm também o método de Ura-blaster de S. cerevisiae (Alani et al. (1987) Genetics 116:541-545) como suporte de espaço para os marcadores auxotróficos, e uma cassete de expressão com sitio de clonagem múltipla para inserção de um gene estranho. Foi amplificado um fragmento 0.9-kb da região KEX1-5' de P. pastoris por meio de PCR usando os iniciadores GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCA GA (SEQ ID NO:56) e GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEQ ID NO:57) e o ADN genómico de P. pastoris como modelo e clonado para Saci, sítios Sal de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA). Este plasmídeo resultante foi 191 cortado com BamHI e Sall, e um fragmento 0.8-kb da região KEX1-3' que tinha sido amplificado usando os iniciadores CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEQ ID NO:58) e GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGG ATGACTCTTTTC (SEQ ID NO:59)foi clonado para sitios abertos criando o pJN262. Este plasmideo foi cortado com Baml-II e o 3.8-kb BamHI, fragmento/BO de pNKY51 (Alani et al. (1987) Genetics 116:541-545) foi inserido em ambas as orientações possíveis resultando nos plasmídeos pJN263 (Figura 4A) e pJN284 (Figura 4B).

Foi criada uma cassete de expressão com Notl e Pacl como sítios de clonagem. 0 promotor GAPDH de P. pastoris foi amplificado usando os iniciadores CGGGATCCCTCGAGAGATC 111111 GTAGAAATGTCTTGGTGCCT (SEQ ID NO:60) e GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA (SEQ ID NO: 61) e o plasmideo pGAPZ-A (lnvitrogen) como modelo e clonado no BamHI, sítios Sphl de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) (Figura 4B) . O plasmideo resultante foi cortado com Spel e Sphl e a região do terminador de transcrição CYC1("TT") que tinha sido amplificado usando os iniciadores CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEQ ID NO:62) e

G GACATG CATG CG G ATCCCTTAAG AG CC G G CAGCTTGCAAATT AAAGCCTTCGAGCGTCCC (SEQ ID NO:63) e o plasmideo pPlCZ-A (lnvitrogen) como um modelo foi clonado nos sítios abertos criando um pJN261 (Figura 4B) . 192

Um plasmídeo de knock out para o gene 0CH1 de P. pastoris foi criado por digestão do pJN263 com Sall e Spel e um fragmento de ADN 2.9-kb da região 0CH1-5', que tinha sido amplificado usando os iniciadores GAACCACGTCGACGGCCATTGCGGCCAAAACC 111111 CCTATT CAAACACAAGGCATTGC (SEQ ID NO:64) e CTCCAATACTAGTCGAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEQ ID NO:65) e o ADN genómico de P. pastoris como um modelo foi clonado nos sitios abertos (Figura 4C) . Este plasmídeo resultante foi cortado com BamHI e Sall, e um fragmento 1,0-kb da região KEX1-3' que tinha sido amplificado usando os iniciadores TGGAAGGTT-TAAACAAAGCTAGAGTAAAATAGATATAGCGAG ATTAGAGAATG (SEQ ID NO:66)e o AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATGTAGTTCCCGTT TTCATC (SEQ ID NO:67) foi inserido para gerar o pJN298 (Figura 4C) . Para permitir a possibilidade de usar simultaneamente o plasmídeo para introduzir um novo gene, foi clonada a cassete de expressão BamHI de pJN261 (Figura 4B) no sítio único BamHI de pJN298 (Figura 4C) para criar o pJN299 (Figura 4E) . A cassete Ura3-blaster de P. pastoris foi construída usando uma estratégia similar conforme descrita em Lu et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:141-146. Um fragmento 2.0-kb Pstl Spel de P. pastoris URA3 foi inserido no Pstl, Xba/sítios de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para criar o pJN306 (Figura 4D). Depois, foi clonado um fragmento ADN 0.7-kb de Saci, Pvull da estrutura aberta de leitura lacZ no Saci, sítios Smal para originar o pJN308 (Figura 4D) . Seguindo-se a digestão de pJN308 (Figura 4D) com Pstl, e tratamento com polimerase de ADN T4, o 193 fragmento Saci - Pt/LH/ de lacZ que tinha sido enfraquecido com polimerase de ADN T4 foi inserido gerando o pJN315 (Figure 4D). A cassete /acZ/URA3 foi libertada pela digestão com Saci and Sphl, enfraquecida com polimerase de ADN T4 e clonada na medula de pJN299 que tinha sido digerida com Pme/and Afllland enfraquecida com polimerase de ADN T4. Este plasmideo foi denominado de pJN337 (Figura 4F) .

Foi criado um marcado plasmideo de expressão HIS4 cortando o pJN261 (Figura 4F) com EcolCRI (Figura 4F). Um fragmento 2.7kb do gene de Pichia pastoris H1S4 que tinha sido amplificado usando os indicadores GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA AAAATACGG (SEQ ID NO:68) e GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTA AAATCTCTAA (SEQ ID NO:69), corte com NgoMIV e Swal e enfraquecimento com polimerase de ADN T4, foi ligado ao sitio aberto. Este plasmideo foi denominado de pJN337 (Figura 4F) . Para construir um plasmideo com um sitio de clonagem múltipla indicado para a construção de uma biblioteca de fusão, o pJN337 foi cortado com Notl e Pacl e os dois oligonucleótidos GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEQ ID NO:70) e TAAGGCGCGCCGAAT-TCATTTAAATCTGCAGGGC (SEQ ID NO:71) que tinham sido emparelhados in vitro foram ligados em sítios abertos, criando o pJN347 (Figura 4F).

Para criar uma estirpe de knock out ochl contendo marcadores múltiplos auxotróficos, foram digeridas 100 j.Lg de pJN329 com Sfil e usadas para transformar a estirpe de pastoris strain JC308 (Cereghino et al. (2001) Gene 194 263:159-169) por electroporação. Depois da transformação, as placas de saída URA foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 dias. Foram recolhidas e aplicadas por esgotamento mil (1000) colónias. Todos os 1000 clones foram depois aplicados por esgotamento em 2 conjuntos de placas de saída URA. Foi incubado um conjunto à temperatura ambiente, enquanto que o segundo conjunto foi incubado a 37°C. Os clones que não conseguiram crescer à temperatura de 37°C, mas cresceram à temperatura ambiente, foram sujeitos à colónia PCR para testar um correcto knock out OCHI. Um clone que mostrou o esperado sinal PCR (cerca de 4.5 kb) foi denominado de YJN153. EXEMPLO 5

Caracterização da Biblioteca de ADN Combinatória

Os transformantes positivos rastreados por Colony-PCR que confirmam a integração da construção manosidase no genoma de P. pastoris desenvolveram-se depois à temperatura ambiente num meio complexo em tampão de metanol 50ml BMGY com 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 100 mM de tampão de potássio fosfato, pH 6,0, 1,34% de Yeast Nitrogen Base, 4 X 10‘5% biotina e glicerol 1% como meio de cultura) até ODgoonm 2-6, quando foram lavados com lOml de BMMY (meio complexo em tampão de metanol) com 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 100 mM em tampão de potássio fosfato, pH 6,0, 1,34% de Yeast Nitrogen Base, 4 X 10“5% de biotina, e 1,5% de metanol como meio de cultura) antes da indução da proteína repórter durante 24 horas à temperatura ambiente em 5ml de BMMY. Consequentemente, a proteína repórter foi isolada e analisada conforme descrito no 195

Exemplo 3 para caracterizar a sua estrutura de glicano. Usando os peptídeos alvo na Tabela 6, os domínios catalíticos de manosidase localizados tanto no RE ou no Golgi mostraram um significativo nível de encurtamento de um glicano contendo predominantemente MansGlcNAc2 para um glicano contendo predominantemente Man5GlcNAc2. Algo evidente quando a estrutura de glicano da glicoproteína de repórter é comparada com a de P. pastoris och 1 knock-out nas Figuras 5C e 6C e a mesma estirpe transformada com as construções M. musculus manosidase, conforme mostram as Figuras 5D, 5E, 6D - 6F. As Figuras 5 e 6 mostram uma expressão de construções geradas a partir da biblioteca de ADN combinatória com uma significativa actividade de manosidase em P. pastoris. A expressão de pGC5 (Saccharomyces MNS1(m)/manosidase de ratos IB 499) (Figuras 5D e 6E) produziu uma proteína que tem aproximadamente 30% de todos os glicanos encurtados para Man5GlcNAc2, enquanto a expressão de pFB8 (Saccharomyces SEC/2(m)/manosidase de ratos IA 4187) (Figura 6F) produziu aproximadamente 50°/0 de Man5GlcNAc2 e a expressão de pBC18-5 (Saccharomyces VANl(sy C. elegans manosidase IB 480) (Figura 5E) produziu 70% de Man5GlcNAc2. EXEMPLO 6

Encurtamento in vivo por a-1,2-manosidase

Para assegurar que as novas estirpes manipuladas do Exemplo 4 produziram de facto a pretendida estrutura Man5GlcNAc2 in vivo, os supernatantes de células foram testados para uma actividade de manosidase (ver Figuras 7 - 9) . Para cada estirpe de contrução/hospedeiro descrita abaixo, foi 196 realizado uma HPLC a 30°C com uma coluna de 4,0mm x 250 mm Altech (Avondale, PA, USA) resina Econosil-NH2(511,m) a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min por 40 min. Nas Figuras 7 e 8, a degradação do padrão Man9GlcNAc2 [b] foi visualizado com resultado num pico que se correlaciona com Man8GlcNAc2. Na Figura 7, o padrão Man9GlcNAc2 [b] eluiu aos 24,61 min e o Man5GlcNAc2 [a] aos 18,59 min. Na Figura 8, a Man9GlcNAc2 eluiu aos 21,37 min e o Man5GlcNAc2 aos 15,67 min. Na Figura 9, o padrão Man8GlcNAc2 [b] eluiu aos 20,88 min.

As células de P. pastoris com plasma id pFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de ratinhos IA 41887) desenvolveram a 30°C em BMGY para um OD600 de cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para BMMY no sentido de induzir a produção de K3 (kringle 3 do plasminogénio humano) sob o controlo de um promotor A0X1. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para originar um sobrenadante claro. Foi removida uma aliquota do sobrenadante para ensaios de manosidase e o restante foi usado para a recuperação de um k3 solúvel segregado. Uma simples purificação com cromatografia de CM-sefarose e um gradiente de eluiçâo de 25mM NaAc, pH 5,0 para 25mM NaAc, pH5.0,lM NaCl, resultou numa eluição de k3 com uma pureza de 95% entre 300-500mM NaCl. É mostrada na Figura 6F, uma análise de N-glicano dos glicanos derivados de k3. A aliquota removida anteriormente do sobrenadante foi testada em termos de presença de uma actividade de manosidase segregada. Foi adicionado um padrão de oligo-manose 9 de ligação N e rotulado 2-aminobenzamida (Man9-2-AB) (Glyko, Novato, CA) a: BMMY (Figura 7A), o sobrenadante da aliquota acima (Figura 7B), e BMMY contendo lOng de 75mU/mL de a-1,2-manosidase de 197

Trichoderma reesei (obtida de Contreras et al., WO 02/00856 A2) (Figura 7C). Após a incubação durante 24 horas à temperatura ambiente, as amostras foram analisadas por HPLC com coluna de amino-silica para determinar a extensão do encurtamento pela manosidase.

As células de P. pastoris com plasmideo pGC5 (Saccharomyces MNS/(m)/manosidase de ratos IB 499) desenvolveram-se e foram analisadas de forma similar. As células desenvolveram-se à temperatura ambiente em BMGY para um OD600 de cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para BMMY para induzir a produção de K3 sob controlo de um promotor A0X1. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para originar um claro sobrenadante. Foi removida uma aliquota do sobrenadante para ensaios de manosidase e o restante foi usado para a recuperação de um k3 solúvel secretado. Uma simples purificação com cromatografia de CM-sefarose e um gradiente de eluição de 25mM NaAc, pH 5,0 para 25mM NaAc, pH 5,0, 1M NaCl, resultou numa eluição k3 pura de 95% entre 300-500mM NaCl. É mostrada na Figura 5D uma análise de N-glicano dos glicanos derivados de k3. A aliquota removida anteriormente do sobrenadante foi testada em termos de presença de uma actividade de manosidase segregada, conforme mostra a Figura 8B. Foi adicionado um padrão de Man9-2-AB (Glyko, Novato, CA) a: BMMY (Figura 8A), o sobrenadante da aliquota acima (Figura 8B), e BMMY contendo lOng de 75mU/mL de u-1,2-manosidase de Trichoderma reesei (obtida de Contreras et al., WO 02/00856 A2) (Figura 8C) . Após a incubação durante 24 horas à temperatura ambiente, as amostras foram 198 analisadas por aminosílica HPLC para determinar a extensão do encurtamento de manosidade. 0 Man9-2-AB foi usado como substrato e é evidente que após 24 horas de incubação, a actividade de manosidase era virtualmente ausente no sobrenadante da digestão da estirpe pFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de ratos IA A187)(Figura 7B) e na digestão de estirpe pGC5 (SaccharomycesMNSl(m)/manosidase de ratos IB A99)(Figura 8) enquanto que o controlo positivo (a-1,2-manosidase purificada de T. reesei obtida de Contreras) leva a uma completa conversão de Man9GlcNAc2 para Man5GlcNAc2 nas mesmas condições, conforme mostram as Figuras 7C e 8C. Tratam-se de dados conclusivos que mostram um encurtamento da manosidase in vivo na estirpe pGC5 de P. pastoris; e estirpe pFB8, que é distintamente diferente da que foi reportada até à data (Contreras et al., WO 02/00856 A2) . A Figura 9 substancia a localização e a actividade de uma enzima de manosidase. A P. pastoris com pBC18-5 (Saccharomyces VANl(s)/C. elegans manosidase IB A80) desenvolveu-se à temperatura ambiente em BMGY para um OD600 de cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para BMMY no sentido de induzir a produção de K3 sob o controlo de um promotor A0X1. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para originar um claro sobrenadante. Foi removida uma aliquota do sobrenadante para ensaios de manosidase e o restante foi usado para a recuperação de um solúvel segregado k3. Uma simples purificação com cromatografia de CM-sefarose e um gradiente de eluição de 25mM NaAc, pH5.0 para 25mM NaAc, pH5.0,lM NaCl, resultou numa eluição k3 pura de 95% entre 300-500mM NaCl. É 199 mostrada na Figura 5E uma análise de N-glicano dos glicanos derivados de k3. A aliquota removida anteriormente do sobrenadante foi testada em termos de presença de uma actividade de manosidase segregada, conforme mostra a Figura 9B. Foi adicionado um padrão comercialmente disponível de Man8-2-AB (Glyko, Novato, CA) a: BMMY (Figura 9A), sobrenadante da aliquota acima pBCl 8-5 (Saccharomyces VANl(s)/C. elegans mannosidase IB A80) (Figura 9B), e BMMY com meios de uma diferente construção de fusão pDD28-3 (Saccharomyces MNN10(m) (de SwissP rot 50108)/H. sapiens mannosidase IB A99) (Figura 9C) . Após a incubação durante 24 horas à temperatura ambiente, as amostras foram analisadas por aminosílica HPLC para determinar a extensão do encurtamento de manosidade. A Figura 9B mostra que a actividade de manosidade intracelular em comparação com uma construção de fusão pDD28-3 (Saccharomyces MNN10(m) H. sapiens mannosidase IB A99) exibe um resultado negativo (Figura 9C) . EXEMPLO 7

Ensaio ideal pH de manipulação c(-1,2-manosidase

As células de P. pastoris com plasma id pBB27-2 (Saccharomyces MNN10(s) (from SwissProt 50108)/C. elegans mannosidase IB A31)foram desenvolvidas à temperatura ambiente em BMGY para um OD600 de cerca de 17. Cerca de 80111_ destas células foram inoculadas em 600[LL BMGY e desenvolveram-se durante a noite. Depois, as células foram colhidas por centrifugação e transferidas para EMMY para induzir a produção de K3 (kringle 3 de plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. Após 24 horas de 200 indução, as células foram removidas por centrifugação para originar um claro sobrenadante pH 6.43). O sobrenadante foi removido para ensaios ideais de pH de manosidade. O Man8GlcNAc2 rotulado por fluorescência (0.5 lig) foi adicionado a 204 de um sobrenadante ajustado a vários pH (Figura 11) e incubado durante 8 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, a amostra foi analisada por HPLC com Econosil NH2 4.6 X 250 mm, 5 contas micron, coluna de sílica com ligação amino (Altech, Avondale, PA) . A taxa de fluxo foi de 1.0 ml/min durante 40 minutos e a coluna foi mantida a 30°C. Após eluição isocrática (68°A, A:32% B) durante 3 min, foi empregue um gradiente solvente linear (68% A:32% B para 40% A:60% B) durante 27 min para eluir os glicanos (18). O solvente A (acetonitrilo) e o solvente B (ammonium formate, 50 mM, pH 4.5. A coluna foi equilibrada com solvente (68% A:32% B) durante 20 min entre os ciclos. EXEMPLO 8

Manipulação de P. pastoris para produzir N-glicanos com a estrutura GIcHAcMan5GIcHAc2 A actividade de GlcNAc Transferase I é necessária para a maturação de N-glicanos complexos e híbridos(U.S. Pat. No. 5,834,251). 0 Man5GlcNAc2 só pode ser encurtado por manosidase II, uma etapa necessária na formação de glicoformas humanas, após a adição de GlcNAc ao resíduo a-1,3-manose terminal por GlcNAc transferase I (Schachter, 1991 Glycobiology 1(5):453-461). Sendo assim, foi preparada uma biblioteca de ADN combinatória incluindo fragmentos de ADN com códigos de domínios catalíticos de genes de GlcNAc Transferase I de C. elegans e Homo sapiens; e sequências de 201 localização de GLS, MNS, SEC, MNN9, VAN1, ANP1, HOC1, MNN10, MNN11, MNT1, KTR1, KTR2, MNN2, MNN5, YURI, MNN1, e MNN6 de S. cerevisiae e P. pastoris de a-1,2-manosiltransferases putativas com base na homologia de S. cerevisiae: D2, D9 e J3, homologos de KTR. A Tabela inclui mas não limita as sequências de peptideos alvo como a SEC e OCH1, de P. pastoris e K. lactis GnTI, (Ver a Tabela 6 e a Tabela 10)

Quadro 10. Uma biblioteca combinatória representativa de sequências de peptideos/ domínio catalítico para a UDP-N-Acetylglucosaminyl Transferase I (GnTI)

Peptídeo alvo OCHI (s) OCHI(m) OCHI (I) A1NN9(s) MIVIV9 (m) Human, GnTI, A38 PB105 PB106 PB 107 PB104 N/A Human, GnTI, A86 NB 12 NB 13 NB 14 NB15 NB C. elegans, GnTI, A88 0A12 0A13 0A14 0A15 0A16 C. elegans, GnTI, A35 PAI 2 PAI 3 PAI 4 PAIS PAI 6 C. elegem, GnTI, A63 PB 12 PB13 PB 14 PB15 PB16 X. leavis, GnTI, A33 QA12 QA13 QA14 QA15 QA16 202 X. leavis, QB12 QB13 QB 14 QB15 QB 16 GnTI, AI03

As sequências leavisGnTlpeptide foram seleccionadas de OCH1 em P. pastoris (longo, médio e curto) (ver Exemplo 4) e MNN9 (SwissProt P39107) em S. cerevisiae (curto e médio). Os dominios catliticos foram seleccionados do GnTI humano com uma eliminação de N-terminal de aminoácido 38 e 86, C. elegans (gly-12) GnTI com um amino 35 e 63, eliminação ácida bem como C. elegans (gly-14) GnTI com uma eliminação N-terminal de aminoácido 88 e X. leavisGnTl com uma eliminação de N-terminal de aminoácido 33 e 103, respectivamente.

Uma porção do gene com código da N-acetiglucosaminil Transferase I (MGATI, Accession# NM002406), com falta de primeiro 154 bp, foi amplificada por meio de PCR utilizando oligonucleótidos 5'-TGGCAGGCGCGCCTCAGTCAGCGCTCTCG-3' (SEQ ID NO:72) e 5'-AGGTTAATTA AGTGCTAATTCCAGCTAGG-3' (SEQ ID NO:73) e vector pHG4.5 (ATCC# 79003) como modelo. O produto PCR resultante foi clonado no pCR2.1-TOPO e a correcta sequência foi confirmada. A seguinte digestão com Ascl e Pacl (ie.,GnTI cated foi inserida no plasmídeo pJN346 para criar pNA. Após digestão de pJN271 witMan5GlcNAc2Ascl, a inserção de 120 bp foi ligada no pNA para gerar uma fusão in-frame do domínio de transmembranar MNN9 com GnTI, criando um pNA15. O organismo hospedeiro é uma estirpe de P. pastoris, que é deficiente em hipermanosilação (por exemplo, um mutante OCHl), proporciona o substrato UDP-GlcNAc no Golgi e/ou RE (Le., contém um transportador UDP-GlcNAc funcional), e proporciona N-glicanos com a estrutura Man5GlcNAc2 no Golgi 203 e/ou R (por exemplo, P. pastorispFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de ratos IA 4187) do mencionado acima). Primeiro, o P. pastoris pFB8 foi transformado com pPB103 contendo o gene de Kluyveromyces lactis MNN2-2(Genbank AN AF106080) (que codifica o transportador UDP-GlcNAc) clonado em BamHI e Bglllsite do plasmídeo de pBLADE-SX (Cereghino et ai. (2001) Gene 263:159-169). Depois, a biblioteca de ADN combinatória mencionada que codifica uma combinação de genes de localização GnTI exógenos e endógenos foi transformada e as colónias foram seleccionadas e analisadas em termos de presença da construção GnTI pela colónia. A nossa eficiência ao nível da transformação e integração foi em termos gerais acima dos 80%, podendo ser omitida a crivagem por PCR assim que tiverem sido estabelecidos os parâmetros de transformação robusta.

Purificação da proteína Ο K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de 96 poços no robô de laboratório Beckman Biomek 2000. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo previsto por Novagen para a respectiva resina HisBind. Poderá ser levado a cabo um outro método de crivagem usando um anti-corpo de ligação GlcNAc de terminal específico, ou uma lectina como a lectina de GSII a partir de Griffonia simplificolia, que liga o GlcNAc terminal(EY Laboratories, San Mateo, CA) . Estes crivos poderão ser automatizados usando lectinas ou anti-corpos que tenham sido modificados com rótulos fluorescentes como FITC ou analisados por MALDI-TOF. Ο K3 segregado poderá ser purificado por cromatografia Ni-afinidade, quantificado e iguais quantidades de proteína 204 poderão ser ligadas a 96-well2ml,te de elevada proteína. Após bloqueio com BSA, as placas poderão ser sondadas com uma lectina GSII-FACS e crivadas com uma resposta máxima de 250 ul. Um método preferido de detecção das proteínas glicosiladas acima envolve a crivagem por espectrometria de massa MALDI-TOF, a seguir à purificação por afinidade de k3 segregado a partir do sobrenadante de transformantes cultivados em 96 poços. As colónias transformadas foram colhidas e desenvolveram-se para uma OD600 de 10 numa placa de 96 poços e 2ml em BMGY a 30°C. As células foram colhidas por centrifugação, lavadas em BMMY e resuspensas em 250 ul de BMMY. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação, o sobrenadante foi recuperado e o k3 foi purificado a partir do sobrenadante por cromatografia de afinidade com Ni. Os N-glicanos foram libertados e analisados por espectrometria de massa por extracção MALDI-TOF, conforme descrita.

Em resumo, os métodos da invenção produziram estirpes de P. pastoris que produzem GlcNAcMan5GlcNAc2 a um rendimento elevado, conforme mostra a Figura 10B. Pelo menos 60% dos N-glicanos são GlcNAcMan5GlcNAc2. Até à data, não existe qualquer estudo que descreva a formação de GlcNAcMan5GlcNAc2 nas glicoproteínas solúveis secretadas em qualquer levedura. Os resultados apresentados mostram que a adição do transportador de UDP-GlcNAc juntamente com a actividade de GnTI produz uma estrutura predominante GlcNAcMan5GlcNAc2 que é confirmada pelo pico a 1457 (m/z) (Figura 10B). 205

Construção da estirpe PBP-3: A estirpe de P. pastoris que expressa K3, (Aochl, arg-, ade-, his-) foi transformada sucessivamente nos seguintes vectores. Primeiro, o pFB8 (Saccharomyces SEC12 (m)/manosidase de ratos IA 4187) foi transformado na estirpe de P. pastoris por electroporação. Segundo, o pPB103 com o gene Kluyveromyces lactis MNN2-2(Genbank AN AF106080) (que codifica o transportador UDP-GlcNAc transporter) clonado no plasmideo pBLADE-SX(Cereghino et al. (2001) Gene 263:159-169) digerido com enzimas BamHI e

Bglll foi transformado na estirpe de P. pastoris. Terceiro, o pPB104 com Saccha-romyces MNN9(s)/GnTI 438 humano que codifica o gene clonado como fragmento Notl-Pacl no pJN336, foi transformado na estirpe de P. pastoris. EXEMPLO 9

Manipulação de células K. lactis para produzir N-glicanos com identificação Man5GlcNAc2 e interrupção do gene K. lactis OCH1 O gene OCH1 do fermento em desenvolvimento de S. cerevisiae codifica uma 1,6-manosiltransferase que é responsável pela primeira adição de manose localizada em Golgi à estrutura de N-glicano Man8GlcNAc2 em proteínas segregadas (Nakanishi-Shindo et al. (1993) J. Biol. Chem.; 268(35):26338-45). Esta transferência de manose é geralmente reconhecida como um passo inicial chave na polimanosilação específica fúngica de estruturas de N-glicanos (Nakanishi-Shindo et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (35):26338-26345; Nakayama et al. (1992) EM BO J. 11(7):2511-19; Morin-Ganet et al (2000) Traffic 1(1):56-68). A eliminação deste gene em resultados de S. cerevisiae 206 numa estrutura de N-glicanos significativamente mais curta que não inclua esta polimanosilação típica ou um defeito a nível de crescimento em elevadas temperaturas (Nakayama et al. (1992) ENIBO J. 11(7):2511-19). A sequência de chips de S. cerevisiae wfoi alinhada com homólogos conhecidos de Candida albicans (Genbank accession # AAL49987), e P. pastoris junto com proteínas Hocl de S. cerevisiae (Neiman et al (1997) Genetics 145(3):637-45 e K. lactis (base de dados PENDANT EST database) que estão relacionadas mas com distintas manosiltransferases. As regiões de elevada homologia em comum entre homólogos Ochl p mas distintos dos hómologos Hocl p foram usados para conceber pares de iniciadores degenerados que foram direccionados contra ADN genómico da estirpe K. lactis MG1/2 (Bianchi et al (1987) Current Genetics 12:185-192). A amplificação PCR com iniciadores RCD33 (CCAGAAGAATTCAATTYTGYCART-GG) (SEQ ID NO:74) e RCD34 (CAGTGAAAATACCTGGNCCNGTCCA) (SEQ ID NO:75) resultou num produto de 302 bp que foi clonado e sequenciado, tendo sido mostrada a tradução prevista para ter um elevado grau de homologia para proteínas (>55% to S. cerevisiae Ochlp). O produto PCR de 302 bp PCR foi usado para testar uma transferência de Southern do ADN genómico da estirpe de K. lactis(MG1/2) com elevado rigor (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . A hibridização foi observada num padrão consistente com um único gene que indica que este segmento de 302 bp corresponde a uma porção do genoma de K. lactis e K. lactis (KIOCH1) contém uma única cópia do gene. Para clonar todo o gene KOCHI gene, foi usada a transferência de Southern para 207 mapear o locus genómico. Em conformidade, foi clonado um fragmento de 5.2 kb BamHIIPstl por digestão do ADN genómico e ligação desses fragmentos com cerca de 5.2 kb em pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) to create a K. lactis subgenomic library. Esta biblioteca subgenómica foi transformada em E. coli e foram testadas várias centenas de clones por colónia PCR usando RCD 33/34. O clone 5.2 kb que contém o gene previsto de KIOCHl foi sequenciado e uma estrutura de leitura de 1362 bp que codifica uma proteína prevista que é 46.5°A, idêntica ao gene OCH1 de S. cerevisiae. A sequência de 5.2 kb foi usada para fazer iniciadores para a construção de um alelo de eliminação ochl::KANR usando um método de sobreposição PCR (Davidson et al. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15). Este alelo de eliminação foi transformado em duas tensões de K. lactis e as colónias resistentes G418 seleccionadas. Estas colónias foram crivadas tanto por PCR como por sensibilidade da temperatura para obter uma estirpe eliminada para o OCH1 ORF. Os resultados da experiência mostram que as tensões que revelam um padrão mutante PCR, que foi caracterizado por análise de crescimento a várias temperaturas e uma análise de carbohidratos de N-glicanos de proteínas de paredes de células segregadas a seguir à seguinte digestão de PNGase. A mutação de ochl conferiu uma sensibilidade de temperatura que permitiu o crescimento de tensões a 30°C mas não a 35°C. A Figura 12A mostra uma análise MALDI-TOF de uma estirpe de K. lactis do tipo selvagem que produz N-glicanos de Man8GlcNAc2 [c] e mais elevado.

Identificação, clonagem e interrupção do gene MNN1 de K. lactis 208 S. cerevisiae MNN1 é o gene estrutural da Golgi a-1,3-manosiltransferase. O produto de MNN1 l uma proteína de membrana do tipo II de aminoacido 762 (Yip et al. (1994) Proc Natl Acad Sei USA. 91(7):2723-7). Tanto os oligossacáridos de ligação N como de ligação 0 isolados de m nn 1 mutantes não apresentavam ligações de a-l,3-manose (Raschke et al. (1973) J Biol Chem. 248(13):4660-66). A sequência Mnnlp de S. cerevisiae foi usada para procurar as sequências genómicas traduzidas de K. lactis(PEDANT). Foi identificada uma sequência de ADN de 405 bp que codifica um fragmento putativo de proteína de semelhança significativa com Mnnlp. Um segmento interno desta sequência foi consequentemente amplificado por PCR com iniciadores KMNl (TGCCATCTTT-TAGGTCCAGGCCCGTTC) (SEQ ID NO:76) e KMN2 (GATCCCACGACGCATCGTATTTCTTTC), (SEQ ID NO:77) e usado para testar uma transferência de Southern do ADN genómico da estirpe de K. lactis (MG1/2) . Com base nos dados da hibridização de Southern foi clonado um fragmento 4.2 Kb BamH/-Pst através de uma biblioteca de tamanho seleccionado como a descrita. Foi identificado um único clone com o gene de K. lactis MNNl por toda a colónia de PCR usando os iniciadores KMNl e KMN2 e sequenciado. Neste clone, foi identificado um ORF de 2241 bp que codifica uma proteína prevista que era 34% idêntica ao gene MNNl de S. cerevisiae. Os iniciadores foram concebidos para a construção de um alelo de eliminação mnnl::NAT13 usando um método de sobreposição PCR (Davidson et al. (2002) Microbiol. 148(Pt 8):2607-15).

Este alelo de interrupção foi transformado numa estirpe de K. lactis por electroporação e os transformantes resistentes de nourseotricina foram seleccionados e 209 amplificados por PCR para uma inserção homóloga do alelo de interrupção. As tensões que revelam um padrão de PCR mutante podem ser sujeitas a uma análise de carbohidratos de N-glicanos de um gene de repórter conhecido. A Figura 12B representa os N-glicanos da estirpe de eliminação de K. lactis ochl mnnl observada a seguir à digestão de PNGase, o MALD I-TO F conforme descrito. 0 pico predominante a 1908 (m/z) indicou que [d] é consistente com a massa de Man9GlcNAc

Poderão ser usados métodos e reagentes adicionais em metodologias para modificar a glicosilação, conforme descrito na literatura : U.S . Patent No. 5,955,422, U.S. Patent No. 4,775,622, U.S. Patent No. 6,017,743, U.S. Patent No. 4,925,796, U.S. Patent No. 5,766,910, U.S. Patent No. 5,834,251, U.S. Patent No. 5,910,570, U.S. Patent No. 5,849,904, U.S. Patent NO. 5,955,347, U.S. Patent No. 5,962,294, U.S. Patent No. 5,135,854, U.S. Patent No. 4,935,349, U.S. Patent No. 5, 707,828, e U.S.

Patent No. 5,047,335. Os sistemas de expressão de fermento poderão ser obtidas de fontes como: American Type Culture Collection, Rockville, MD. Vectors, comercialmente disponíveis a partir de várias fontes. EXEMPLO 10

Identificação, clonagem e eliminação do gene ALG3 em P. pastoris e X. lactis.

Os iniciadores degenerados foram gerados com base num alinhamento de sequências de proteína Alg3 de S. cerevisiae, H. sapiens e D. melanogaster e fora usados para amplificar um produto de 83 bp do ADN genómico de P. pastoris: 210 5'-GGTGTTTTGTTTTCTAGATCTTTGCAYTAYCARTT-3' (S EQ ID NO:78) e 5'-AGAATTTGGTGGGTAAGAATTCCARCACCAYTCRTG-3' (SEQ ID NO:79). O produto PCR resultante foi clonado no vector pCR2.1 (lnvitrogen, Carlsbad, CA) e a análise de sequência revelou homologia com os hmólogos conhecidos ALG3I RHK1INOT56 (Genbank NC_001134.2, AF309689, NC_003424.1). Consequentemente, 1929 bp a montante e 2738 bp a jusante do produto PCR inicial foram amplificados da biblioteca de ADN genómica de P. pastoris (Boehm (1999) Yeast 15(7):563-72) usando os oligonucleótidos 5'-CCTAAGCTGGTATGCGTTCTCTTTGCCAT-ATC-3' (SEQ ID NO:80) e 5'-GCGGCATAAACAATAATAGATGCTATAAAG-3' (SEQ ID NO:81) junto com T3 (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') (SEQ ID NO:4 9) e T7 (5' -GTAA TACGACTCACTATAGGGC-3') (SEQ ID NO:48) (Integrated ADN Technologies, Coralville, IA) na estrutura da biblioteca com plasmideo lambda ΖΑΡ II (Stratagene, La Jolla, CA). Os fragmentos resultantes foram clonados no vector pCR2.1-TOPO(lnvitrogen) e sequenciados. Desta sequência, foi identificado um ORF de 1395 bp que codifica uma proteína com uma identidade de 35% 3 uma semelhança de 53% com o gene ALG3 de S. cerevisiae. O gene foi denominado de PpALG3. A sequência de PpALG3 foi usada para criar um conjunto de iniciadores para gerar uma construção de eliminação do gene PpALG3 por sobreposição de PCR (Davidson et al (2002) Microbiol. 148 (Pt 8):2607-15). O iniciadores que se seguem foram usados para amplificar as regiões 1 kb DE 51 and 3' do gene pALG3 ORF e KANR, respectivamente: RCD142 (5'-CCACATCATCCGTGCTACATATAG-3') (SEQ ID NO:82), 211 RCD144 (5'-ACGAGGCAAGCTAAACAGATCTCGAAGTATCGAGGGTTAT CCAG-3') (SEQ ID NO:83), RCD145 (5'-CCATCCAGTGTCGAAAACGAGCCAATGGTTCATGTCTATA AATC-3') (SEQ ID NO:84), RCD147 (5'-AGCCTCAGCGCCAACAAGCGATGG-3') (SEQ ID NO:85), RCD 143 (5'-CTGGATAACCCTCGATACTTCGAGATCTGTTTAGCTTGCC TCGT- 3') (SEQ ID NO:86), and RCD146 (5'- GATTTATAGACATGAACCATTGGCTCGTTTTCGACACTGG ATGG-3') (SEQ ID NO:87) .

Consequentemente, os iniciadores RCD142 e RCD147 foram usados para sobreposição dos três produtos PCR resultantes num único alelo de eliminação 3.6 kb alg3::KANR.

Identificação, clonagem e eliminação do gene ALG3 em X. lactis.

As sequências ALG3p de S. cerevisiae, Drosophila melanogaster, Homo sapiens etc foram alinhadas com sequências lactis (base de dados PENDANT EST). Foram usadas as regiões de elevada homologia que estavam em homólogos comuns mas distintos em sequência exacta dos homólogos, para conceber pares de iniciadores degenerados que foram direccionados contra ADN genómico da estirpe K. lactis MG1/2 (Bianchi et al, 1987) . No caso de ALG3, a amplificação de PCR com iniciadores KAL-1 (5'— ATCCTTTACCGATGCTGTAT-3') (SEQ ID NO:88) e KAL-2 (5' - ATAACAGTATGTGTTACACGCGTGTAG-3') (SEQ ID NO:89) resultou num produto que foi clonado e sequenciado e a tradução prevista mostrou ter um elevado grau de homologia com as proteínas Alg3p proteins (>50% com S. cerevisiae Alg3p). 212 0 produto PCR foi usado para realizar uma transferência de Southern do ADN genómico da estirpe de K. lactis(MG1/2) com elevado rigor (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . A hibridização foi observada num padrão consistente com um único gene. Esta transferência de Southern foi usada o locus genómico. Os fragmentos genómicos foram clonados pela digestão do ADN genómico e pela ligação desses fragmentos na dimensão apropriada no pUC 19 para criar uma biblioteca subgenómica de K lactis. Esta biblioteca subgenómica foi transformada em E. coli e várias centenas de clones foram testados pela colónia PCR, usando os iniciadores KAL-1 e KAL-2. Os clones contendo os genes previstos KIALG3 e KIALG61 foram sequenciados, tendo sido identificadas as estruturas de leitura aberta. Os iniciadores para construção de um alelo de eliminação alg3::NA TR, usando um método de sobreposição PCR (Davidson et al. (2002) Microbiol. 148(Pt 8):2607-15), foram concebidos e o alelo de eliminação resultante foi transformado em duas tensões de K. lactis, tendo sido seleccionadas colónias NAT-resistentes. Estas colónias foram crivadas por PCR e foram obtidos transformantes, nos quais o ALG3 ORF foi substituído com o alelo mutante ochl:NATR. EXEMPLO 11 A geração de uma estirpe do mutante alg3 ochl com expressão a-1,2-manosidase, GnTl e GnTII para produção de uma glicoproteína como a humana.

Foi gerada uma construção de eliminação alg3::KANR de P. pastoris conforme a descrita no Exemplo 10. Aproximadamente 213 514 do produto PCR resultante foi transformado na estirpe PBP-3 (ver Exemplo 3), e as colónias foram seleccionadas no meio YPD contendo 20014/ml G418. Uma estirpe de 20 crivadas por PCR foi confirmada como contendo a correcta integração do alelo mutante alg3::KANR e falta do alelo de tipo selvagem. Esta estirpe foi denominada de RDP27 (Figura 36).

Foi então gerada uma biblioteca de construções GnTII constituída por fusões em frame da biblioteca líder com domínios catalíticos dos genes GnTII de fontes humanas e de ratos(WO 02/00879). Esta biblioteca foi criada num vector de integração de P. pastoris entendo o gene NSTR, conferindo resistência à nourseotricina de drogas. Os plasmídeos da biblioteca foram linearizados com EcoRI, transformados em estirpe RDP27 por electroporação e as estirpes resultantes foram seleccionadas através de análise dos glicanos libertados de K3 purificado. Uma estirpe de P. pastoris com expressão do gene GnTII de ratos em frame com a construção S. cerevisiae MNN9 (s) foi denominada de PBP6-5 (Figura 36).

Geração de construções de expressão Gnlll A construção de um vector de expressão GnTI (pNA15) contendo um gene humano GnTI gene fundido com a parte N-terminal do gene de S. cerevisiae MNN9 é descrita em Choi et al. (2003) Proc Natl Acad Sei USA. 100 (9):5022-27. O gene de ratos GnTI I foi clonado da mesma forma. O gene de ratos GnTII (GenBank número de acesso U21662) foi amplificado por PCR usando Takara EX The polimerase (Panvera) a biblioteca cADN de fígado de ratos (Clontech) com os iniciadores RATl (5'-TTCCTCACT-GCAGTCTTCTATAACT-3') (SEQ ID NO:90) e RAT2 (5'-TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3') 214 (SEQ ID NO: 91). O produto PCR foi depois clonado no vector pCR2.1-TOPO (lnvitrogen) e sequenciado. Usando este vector como modelo, o fragmento the Ascl-Pacl de GnTII, que codifica os aminoácidos 88-443, foi amplificado com polimerase Pfu Turbo(Stratagene)e os iniciadores, RAT44 (5'-TTGGCGCGCCTCCCTAGTGTACCAGTTGAACTTTG-3') (SEQ ID NO:92) e RATll (5'-GATTAATTAACTCACTGCAGTCTTCTATAACT -3') (SEQ ID NO:93) respectivamente, Ascl introduzido eos sitios de restrição Pacl estão sublinhados). Após confirmação por sequência, o domínio catlítico do GnTII de ratos foiclonado a jusante do promotor PMAl como um fragmento Ascl-Pacl em pBP124. Na fase final, o fragmento do gene que codifica o sinal de localização de S. cerevisiae Mnn2 foi clonado de pJN281 como um fragmento de Notl-Ascl para gerar uma fusão em frame com o domínio catalítico de GnTII, para gerar plasmídeo pTC53. EXEMPLO 12

Clonagem e expressão de GnTIII para produzir a bissectação de GlcNAcs que resultam na funcionalidade de anticorpos A adição de uma N-acetilglucosamina à estrutura GlcNAc2Man3GlcNAc2 por N-acetilglucosaminiltransferases III resulta no chamado N-glicano bissectado (Ver Figura 15) . Esta estrutura tem sido implicada em importante citotoxicidade celular dependente de anticorpos (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) (Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-80).

Uma célula hospedeira como estirpe de fermento capaz de produzir glicoproteínas com N-glicanos bissectados é 215 manipulada de acordo com a invenção, introduzindo na célula hospedeira uma actividade GnTIII. Preferencialmente, a célula hospedeira é transformada com ácido nucleico que codifica o GnTIII (por exemplo, um mamífero como o CnTIII de murino, mostrada na Figura 24) ou um domínio contendo uma actividade enzmática, opcionalmente fundida com um peptídeo alvo de sinal de célula heteróloga (por exemplo, usando as bibliotecas e os métodos associados da invenção.)

Os IgGs consistem em duas cadeias pesadas (VH, CHI, CH2 e CH3 na Figura 22), interligadas na região charneira através de três pontes de disulfureto, e duas cadeias leves (VL, CL na Figura 22) . As cadeias leves (domínios VL e CL) estão ligados por uma outra ponte à porção CHI da cadeia pesada e junto com o fragmento CHI e VH constituem a chamada região de Fab. Os antigenes ligam-se à porção de terminal da região Fab. A porção Fc dos IgGs consiste no CH3, o CH2 e a região de charneira e é responsável pela exerçâo das chamadas funções efectoras (ver abaixo). A função principal dos anticorpos é a ligação a um antigene. Contudo, a não ser que a ligação a um antigene desactive directamente o antigene (como no caso das toxinas bacterianas), uma mera ligação só fará sentido se resultar nas chamadas funções efectoras. Os anticorpos da subclasse de IgG exercem duas principais funções efectoras: a activação do sistema de complemento e a indução de fagocitose. 0 sistema de complemento consiste num complexo grupo de proteínas no soro envolvido no controlo de eventos inflamatórios, na activação de fagocitos e na destruição lítica de membranas celulares. A activação complementar começa com a ligação do complexo Cl à porção Fc de dois IgGs na proximidade. 0 Cl consiste num molécula, Clq, e duas moléculas, Clr e Cis. A 216 fatocitose é iniciada através da interacção entre o fragmento IgG's Fc e os Fc-gama-receptores (FcyRI, II e III na Figura 22). Os receptores Fc são primeiramente expressos na superfície de células efectoras do sistema imunitário, em particular macrófageo, monócitos, células mielóides e células dendriticas. A porção CH2 alberga um sitio de N-glicosilação conservado na asparagina 297 (Asn297). Os N-glicanos Asn297 são muito heterógeneos e conhecidos por afectarem a ligação do receptor Fc e complementarem a activação. Apenas uma minoria (i.e., cerca de 15-20°/0) de IgGs suporta uma desialilação, e 3-10% têm um N-glicano monosialilado N-glycan (revisto por Jefferis (2001) Biopharm. 14:19-26). De forma muit interessante, a estrutura minimal de N-glicano mostrou ser necessário que os anticorpos totalmente funcionais capazes de uma activação complementar e de uma ligação ao receptor Fc é um pentassacarídeo com resíduos terminais de N-acetilglucosamina GlcNAc2Man3) (revisto por Jefferis, R., Glicosilação de anticorpos humanos IgG. BioPharm, 2001). Os anticorpos com menos do que um N-glicano de GlcNAc2Man3 ou sem N-glicosilação no Asn297 poderão ainda ser capazes de ligar um antigene mas não conseguirão quase de certeza activar os eventos cruciais a jusante como a fagocitose e a activação complementar. Para além disso, os anticorpos com N-glicanos do tipo fúngico anexados a Asn297 irão com toda a certeza solicitar uma resposta imunitária num organismo mamífero que irá substituir esse anticorpo inútil como glicoproteína terapêutica.

Clonagem e expressão de GnTIII 217 0 fragmento de ADN que codifica parte da proteína GnTIII de ratos sem o domínio TM é amplificado por PCR do ADN genómico de murino(ou outro mamífero) usando os iniciadores anteriores(5'-TCCTGGCGCGCCTTCCCGAGAGAACTGGCCTCCCTC-3')(SEQ ID NO:94) e reversos(5'-AATTAATTAACCCTAGCCCTCCGCTGTATCCAACTTG-3') (SEQ ID NO:95). Esses iniciadores incluem os sítios de restrição Ascl e Pact que podem ser usados no vectr indicado para a fusão da biblioteca líder.

As sequências em ácido nucleico (SEQ ID NO:45) e de aminoácido (SEQ ID NO:46) de murino GnTIII são mostradas na

Figura 24.

Clonagem de sequências de codificação da imunoglobulina

Os protocolos para a clonagem de regiões variáveis de anticorpos, incluindo as sequências de iniciadores, foram já publicadas anteriormente. As fontes de anticorpos e genes de codificação poderão ser, entre outras,células B humanas imunizadas in vitro(ver,por exemplo, Borreback et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3995-3999), linfócitos de sangue periférico ou células B humanas únicas (ver, por exemplo Lagerkvist et al. (1995) Biotechniques 18:862-869; e Terness et al. (1997) Hum. lmmunol. 56:17-27) e ratos transgénicos com imunoglobulina loci humana, permitindo a criação de linhas celulares de hibridomas.

Usando as técnicas de ADN recombinantes padronizadas, as sequências de ácido nucleico com codificação de anticorpos poderão ser clonadas. AS fontes de informação genética com codificação da imunoglobulina de interesse são tipicamente preparações RNA totais a partir de células de interesse, 218 como os linfócitos de sangue ou as linhas celulares de hibridomas. Por exemplo, empregando um protocolo com base no PCR com iniciadores específicos, as regiões variáveis poderão ser clonadas por meio de uma transcrição reversa de um iniciador de sequência específica hibridizando ao sítio de domínio IgG CHI e um segundo iniciador que codifica os aminoácidos 111-118 da região constante de murino kappa. Os VH e VK que codificam os cDNAs poderão depois ser amplificados como foi publicado anteriormente (ver por exemplo, Graziano et al. (1995) J lmmunol. 155(10):4996-5002; Welschof et al. (1995) J. lmmunol. Methods 17 9:203— 214; e Orlandi et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3833). Os procedimentos para todas as imunoglobulinas (cadeias pesadas e leves) foram também publicadas (ver por exemplo, Buckel et al. (1987) Gene 51:13-19; Recinos et al. (1994) Gene 149: 385-386; Recinos et al. (1995) Gene 158:311-12). Foram descritos protocolos adicionais para a clonagem e geração de fragmentos de anticorpos e construções de expressão de anticorpos em Antibody Engineering, Kontermann e Dilbel (2001), Eds., Springer Verlag: Berlin Heidelberg New York.

Os plasmídeos de expressão fúngica que codificam a cadeia pesada e leve de imunoglobulinas foram descritas (ver por exemplo Abdel-Salam et al. (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:157-164; e Ogunjimi et al. (1999) Biotechnology Letters 21:561-567). Pode assim gerar-se plasmídeos de expressão que albergam regiões constantes de imunoglobulinas. Para facilitar a clonagem de regiões variáveis nestes vectores de expressão, poderão ser colocados sítios de restrição adequados na proximidade dos terminais das regiões variáveis. As regiões constantes 219 poderão ser construídas de forma a que as regiões variáveis possam ser facilmente fundidas em frame por aquelas por meio de uma simples digestão de restrição / experiência de ligação. A Figura 23 mostra uma perspectiva esquemática de uma construção de expressão desse género, concebida de uma forma muito modular, permitindo uma fácil troca de promotores, terminadores de transcrição, domínios alvo de integração e até mesmo marcadores de selecção.

Tal como mostra a Figura 23, os domínios VL e VH de escolha poderão ser facilmente clonados em frame com as regiões CL e CH, respectivamente. A integração inicial é alvo de P. pastoris AOX locus (ou locus homólogo numa outra célula fúngica) e o promotor AOX induzível por metanol irá conduzir a expressão. De forma alternativa, poderá ser usada uma outra cassete de promotor constitutivo ou induzido. Sendo assim, caso se pretenda, as regiões de 5 ΆΟΧ e 3Ά0Χ, bem como os fragmentos de terminador de transcrição (TT), poderão ser facilmente substituídas por diferentes domínios de TT, promotores, e alvo de integração, no sentido de optimizar a expressão. Inicialmente é empregue o sinal de segregação do factor alfa com o sítio de protease KEX de padrãopara facilitar a segregação de cadeias pesadas e leves. As propriedades do vector de expressão poderá ser mais refinadas usando as técnicas padronizadas. Um vector de expressão de Ig, como o descrito acima, é introduzido numa célula hospedeira da invenção que expressa GnTIII, preferencialmente no aparelho Golgi da célula hospedeira. As moléculas Ig expressas nessa célula hospedeira incluem os N-glicanos com GlcNAcs de bissectação. EXEMPLO 13 220

Geração de estirpe de fermento YSH-1 (Aochl, al,2-manosidase, GnTI) A estirpe BK64 de P. pastoris reportada anteriormente (Choi et al. (2003) Proc Natl Acad Sei USA. 100(9):5022-7), uma auxotrofia tripla(ADE, ARG, HIS) com o knock out OCH1 e que expressa o domínio de kringle 3 (K3) do plasminógenio humano, foi usada como estirpe hospedeira. A BK64 foi transformada com o plasmídeo pPB103 linearizado com a enzima de restrição EcoNI para introduzir o transportador de K. lactis UDP-N-acetilglucosamina na célula hospedeira, criando assim a estirpe PBP-1. O Mnsl de ratos foi introduzida nesta estirpe pela transformação com o plasmídeo pFB8 linearizado com a enzima de restrição EcoNI, gerando a estirpe PBP-2. A análise do glicano K3 a partir de proteínas isoladas da estirpe PBP-2 demonstrou que o glicoforma primário presente era Man5GlcNAc2. O PBP-2 foi consequentemente transformado com o plasmídeo GnTI humano pNA15 linearizado com a enzima de restrição Aatll, generando a estirpe PBP-3. A análise das glicoformas de K3 produzidas na estirpe PBP-3 demonstrou que o glicano híbrido GlcNAcMan5GlcNAc2 era a estrutura predominante. Para recuperar o marcador URA3 de PBP-3, esta estirpe desenvolveu-se em YPD antes da selecção nos meios mínimis contendo 5-Fluoroorotic (5-FOA, BioVectra) e uracil (Boeke et al. (1984) Mol. Gen. Genet. 197:345-34 6). A estirpe recuperada Uraminus que produz as glicoformas GicNAeMan5GlcNAc2 foi denominada de YSH-1 (Figura 36) . 0 perfil de N-glicano da estirpe YSH-1 é mostrado na Figura 25 (topo) e exibe um pico predominante a 1465 m/z correspondendo à massa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] . 221 EXEMPLO 14

Geração de estirpe de fermento YSH-37 (P. pastoris com expressão de manosidade II) 0 YSH-1 (Exemplo 13) foi transformado com o plasmideo de manosidase D. melanogaster 11474/S. cerevisiae MNN2(s) (pKD53) linearizado com a enzima de restrição Apal, que gera a estirpe YSH-37 (Figura 36). Análise das estruturas de glicano produzidas na estirpe YSH-37 (Figura 25 (inferior) ) demonstraram que a glicoforma predominante a 114C m/z corresponde à massa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] e outros glicoformas GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] a 1303 m/z e GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] a 1465 m/z. EXEMPLO 15

Geração de estirpe de fermento YSH-44 A estirpe YSH-37 (Exemplo 14) foi transformada com um plasmideo que codifica um líder GnTII/MNN2 de ratos (s), pTC53, linearizado com a enzima de restrição EcoRl. A estirpe resultante, YSH-44 (Figura 36), produziu um N-glicano de k3 com uma glicoforma simples a 1356 m/z, correspondendo à massa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x] , pela espectrometria de massa de modo positivo MALDI-TOF(Figura 29) .

Digestão de 13-N-acetilhexosaminidase

Os glicanos de YSH-44 foram libertados e separados das glicoproteínas por modificação de um método anteriormente reportado (Papac, et al. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Após as proteínas terem sido reduzidas e carboximetiladas e as membranas bloqueadas, os poços foram lavados três vezes com água. A proteína foi deglicosilada 222 por adição de 30[Llof 10 mM NH4HC03 pH 8.3 contendo uma milunidade de N-glicanase (Glyko, Novato, CA) . Após uma digestão de 16 horas a 37°C, a solução contendo os glicanos foi removida por centrifugação e evaporada até ficar seca. Os glicanos foram depois secos em asC210A a velocidade vac (Thermo Savant, Halbrook, NY) . Os glicanos secos foram colocados em 50 mM NH4Ac pH 5.0 a 37°C, durante a noite, e foi adicionado ImU de hexos (Glyko, Novato, CA). EXEMPLO 16

Construção do plasmideo pJN 348 0 plasmideo pBLURA-SX (de Jim Cregg) foi digerido com BamHI e Bg///para libertar a cassete de expressão AOX. O fragmento BamHI contendo a cassete de expressão GAPDH/CYC1 de pJN261 (Figura 4B) (Exemplo 4) foi depois ligado na estrutura pBLURA-SX para criar pJN338. O plasmideo pJN338 foi cortado com Notl e Pacl e os dois oligonucleótidos 5'-GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT-3' (SEQ ID NO:96) e 5'-TAAGGCGCGCC GAATTCATTTAAATCTGCAGGGC-3' (SEQ ID NO:97) que tinham sido emparelhados in vítro, foram ligados a sítios abertos para criar pJN348. EXEMPLO 17

Construção de um plasmideo de integração pRCD259 O PpURA3 contendo o vector pJN348 de expressão GAPDH foi linearizado com Xhol e enfranquecido com polimerase de ADN T4 e fosfatase intestinal de vitela (CIP). O marcador de resistência HYG foi digerido a partir de pAG32 com Bg///e Saci, e enfraquecido, depois ligado a pJN348 para criar pRCD259 que pode ser usado como vector de expressão HYG que integra o locus PpURA3. 223 EXEMPLO 18

Geração de construções de fusão GnTIII

As construções de fusão entre os mamíferos e as sequências alvo de fermento foram feitas usando os genes MgaL de ratos (GenBank número de acesso L39373, Bhaumik et al., 1995). Os três fragmentos correspondendo às eliminações N-terminaios A32, A86 e A212 dos genes GnTIII de ratos foram amplificadas por PCR usando polimerase Pfu Turbo (Stratagene; com os iniciadores anteriores MG3-B (5'-TCCTGGCGCGCCTTCCCGAGAGAACTGGCCTCCCTC-3 ' ) (SEQ ID NO:98), MG3-C (5'-CCGAGGCGCGCCACAGAGGAACTGCACCGGGTG-3') (SEQ ID NO:99), MG3-D (5'- ACCGAGGCGCGCCATCAACGCCATCAACATCAACCAC-3') (SEQ ID NO: 100), e reversos MG3-A (5'-AATTAATTAACCCTAGCCCTCCGCTGTATCCAACTTG-3') (SEQ ID NO:101). Os produtos PCR foram depois clonados no vector pJN 348 como fragmentos Ascl-Pacl e sequenciados. Os vectores resultantes pVA (GnTTII 432), pVB (GnTIII 486) e pVC (GnTIII 4212) foram digeridos com enzimas Notl-Ascl e usados para a ligação com a biblioteca de lideres de fermento(líderes 20-67). Os peptídeos alvo são fundidos nos domínios catalíticos seleccionados do gene de ratos GnTIII com eliminações de N-terminais dos aminoácidos 32, 86, with 32, 86 e 212. Por exemplo, os peptídeos alvo MNN2 de S. cerevisiae (longo, médio e curto) e GNT1 de K. lactis (curto e médio) (ver Exemplo 11) são mostrados na Tabela 11. 224

Tabela 11. Uma biblioteca combinatória representativa de sequências de peptideos alvo/ domínios catalíticos exibindo uma UDP-N- actividade acetilglucosaminiltransferase (GnTHI) em P.pastoris YSH-1 l/l 0 u Peptídeo alvo s. cerevisiae MNN2(s) S. cerevisiae MNN2(m) S. cerevisiae MNN2(I) K. lactis GNT1(m) Rato Gana A32 50% (pVA53) 30-40% (pVA54) 20-30% (pVA55) 0% (pVA51) GnTIII de ratos A86 20-30% (pVB53) 30-40% (pVB54) 20-30% (pVB55) 0% (pVB51) Domínios catalít Gnilll de ratos 0% 0% 0% 0% A212 0VC53) (pVC54) (pVC55) (pVC51) EXEMPLO 19

Manipulação de P. pastoris para produzir GlcHAcMan5GIcHAc2 bissectada A estirpe de P. pastoris que produz GlcNAcMan5GlcNAc2 (PBP-3) (ver Exemplo 8) foi seleccionada em 5- FOA, seleccionando pela perda do marcador URA3+ e um ura3-fenotipo. Esta estirpe, denominada de YSH-1 (Figura 36), foi transformada com a biblioteca de domínios catalíticos 225 de N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)(vectores pVA, pVB e pVC) e líderes. Os transformantes desenvolveram-se a 30°C em BMGY para um OD600 de cerca de 10, colhidos por centrifugação e transferidos para BMMY para induzir a produção de K3 (kringle 3 a partir do plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. Ο K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de 96 poços no robô de laboratório Beckman Biomek 2000. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo fornecido pela Novagen para a respectiva resina HisBind (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram libertados por digestão PNGase (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram analisados com um MALDI-TOF MS (Exemplo 3). As actividades GnTIII são mostradas na Tabela 11. O número de (+)s, conforme usado aqui, indica os níveis relativos de produção de N-glicanos bissectados de glicanos neutros c'/. As sequências de peptídeos alvo foram seleccionadas a partir do grupo com: Saccharomyces GLS1, Saccharomyces MNS1, Saccharomyces SEC12, Pichia SEC, Pichia OCHl, Saccharomyces Μ N N9, Saccharomyces VAN1, Saccharomyces ANP1, Saccharomyces HOC1, Saccharomyces MNN10, Saccharomyces MNN11, Saccharomyces MNT1, Pichia D2, Pichia D9, Pichia J3, Saccharomyces KTR1, Saccharomyces KTR2, Kluyveromyces GnTI, Saccharomyces M NN2, SaccharomycesMNN5, Saccharomyces YURI , SaccharomycesMNNl e SaccharomycesMNN6. Os transformantes pVA53 com GlcNAc de bissectação(por exemplo, GlcNAc2Man5GleNAc2) foram denominados de PBP26 (Figura 36). EXEMPLO 20

Manipulação de P. pastoris YSH-44 para produzir GlcNAc3Man3GlcNAc2 bissectado 226

Para a expressão de GnTIII na estirpe YSH-44 (Figura 36), as contruções GnTIII a partir dos vectores pVA53, pVB53,pVA54 e pVB54 foram transferidos como fragmentos Notl-Pacl para pRCD259 no sentido de gerar os vectores pPB135, pPB137, pPBl36 e pPB 138. Os vectores com marcador de resistência HYG e gene URA 3 de P. pastoris URA3 como sequência alvo para integração genómica. Os plasmideos são linearizados com Sall, transformados na estirpe YSH-44 por electroporação, seleccionados no meio contendo higromicina e as tensões resultantes são crivadas por análise dos glicanos libertos a partir do K3 purificado. Os transformantes desenvolveram-se a 24 °C em BMGY para um OD600 de cerca de 10, colhidos por centrifugação e transferidos para BMMY para induzir a produção de K3 (kringle 2 a partir do plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. Ο K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de 96 poços no robô de laboratório Beckman Biomek 2000 (Exemplo 3) . A purificação robótica é uma adaptação do protocolo fornecido pela Novagen para a respectiva resina HisBind (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram libertados por digestão PNGase. Os N-glicanos foram analisados com um MALDI-TOF MS (Exemplo 3). Os transformantes pPB135 com GlcNAc de bissectação (por exemplo, GlcNAc2Man5GleNAc2) foram denominados de YSH-57 (Figura 36) . A Tabela 11 contém a actividade do GnTIII de ratos. EXEMPLO 21

Manipulação de P. pastoris YSH-5 para produzir

GlcNAc3Man3GlcNAc2 bissectado 227 Ο Ρ. pastoris YSH-5 (Exemplo 11) foi transformado com o plasmídeo pPB135 (Tabela 11) que codifica um domínio catalítico GnTIII de ratos (432) ligado em frame a um peptídeo alvo de S. cerevisiae MNN2. Os transformantes desenvolveram-se a 30°C em BMGY para um OD600 de cerca de 10, colhidos por centrifugação e transferidos para BMMY para induzir a produção de K3 (kringle 3 a partir do plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. O K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de 96 poços no robô de laboratório Beckman Biomek 2000. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo fornecido pela Novagen para a respectiva resina HisBind (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram libertados por digestão PNGase (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram analisados com um MALDI-TOF MS (Exemplo 3). Os transformantes com GlcNAc de bissectação(por exemplo, GlcNAc2Man3GlcNAc2) foram denominados de PBP-38 (Figura 36). A Tabela 11 contém a actividade do GnTIII de ratos. EXEMPLO 22 O ensaio da actividade GnTIII in vitro usando substrato GlcNAcMan5GlcNAc2 na estirpe de P. pastoris manipulada YSH-57

Para testar qualquer potencial da actividade GnTIII ex vivo na estirpe de P. pastoris, os sobrenadantes da cultura de células YSH-57 foram testados para a actividade GnTIII. AS células YSH-57 de P. pastoris desenvolveram-se a 24°C em BMGY para um OD600 de cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para BMMY para induzir a produção de K3 (kringle 3 a partir do plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. 228

Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para originar um claro sobrenadante. Foi removida uma aliquota do sobrenadante para ensaios GnTIII e o restante foi usado para a recuperação de um solúvel segregado k3. 0 K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de 96 poços no robô de laboratório Beckman Biomek 2000. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo fornecido pela Novagen para a respectiva resina HisBind (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram libertados por digestão PNGase (Exemplo 3) . A aliquota removida anteriormente do sobrenadante foi testada em termos de presença de uma actividade GnTIII segregada. GlcNAcMan5GlcNAc2 purificada a partir do K3 expresso na estirpe PBP-3 foi adicionado a: BMMY (A) 1 mM UDP-GlcNAc (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em BMMY (B) ; o sobrenadante de YSH-44 foi transformado com pVA53 [YSH-57] (C) ; o sobrenadante de YSH-57 + 1 mM UDP-GlcNAc (D). Após a incubação durante 8 horas à temperatura ambiente, as amostras foram analisadas por aminosilica HPLC para determinar a extensão da actividade GnTIII. EXEMPLO 23 O ensaio da actividade GnTIII ín vitro usando substrato GlcNAc2Man3GlcNAc2 na estirpe de P. pastoris manipulada YSH-57

Para testar qualquer potencial da actividade GnTIII ex vivo na estirpe de P. pastoris, os sobrenadantes da cultura de células YSH-57 foram testados para a actividade GnTIII. AS células YSH-57 de P. pastoris desenvolveram-se a 24°C em BMGY para uma OD600 de cerca de 10. As células foram colhidas por centrifugação e transferidas para BMMY para 229 induzir a produção de K3 (kringle 3 a partir do plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. Após 24 horas de indução, as células foram removidas por centrifugação para originar um claro sobrenadante. Foi removida uma aliquota do sobrenadante para ensaios GnTIII e o restante foi usado para a recuperação de um solúvel segregado k3. 0 K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de 96 poços no robô de laboratório Beckman Biomek 2000. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo fornecido pela Novagen para a respectiva resina HisBind (Exemplo 3) . Os N-glicanos foram libertados por digestão com PNGase (Exemplo 3) . A aliquota removida anteriormente do sobrenadante foi testada em termos de presença de uma actividade GnTIII segregada. GlcNAcMan5GlcNAc2 purificada a partir do K3 expresso na estirpe YSH-44 foi adicionada a: BMMY (A) 1 mM UDP-GlcNAc (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em BMMY (B); o sobrenadante de YSH-44 foi transformado com pVA53 [YSH-57] (C). Depós de uma incubação durante 8 horas à temperatura ambiente, as amostras foram analisadas por aminosilica HPLC para determinar a extensão da actividade GnTIII. EXEMPLO 24

Clonagem e expressão de GnTIV em P. pastoris O fragmento de ADN que codifica parte da proteína GnTIV humana (MGAT45) com falta de domínio TM foi amplificado por PCR a partir do cDNA humano usando iniciadores de MGV-2 anteriores (5'-AAATCAAGTGGATGAAGGACATGTGGC3') e MGV-3 de reverso (5'-AGCGATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3'), clonado no 230 vector pCR2.1-TOPO (Invitogen), e sequenciado. Para clonar no vector adequado para a fusão com biblioteca de lideres, foram amplificados por PCR fragmentos de ADN com iniciadores que incluem sitios de restrição Ascl e Pact. iniciadores posteriores Ascl: HGIV-ASC1 (5'-TGGGCGCGCCAAACTGATTGCTTATCAACGAGAA-3') , HGIV-ASC2 (5 ' -AGTGGGCGCGCCTTGAATAAGTTTTCA-GATAATACC-3'), HGIV-ASC3 (5'-AAGGGCGCGCCCAAGTGCCAAGTATTTATTATC-3'). O iniciador de reverso Pact HGIV-PAC (5'— AGTTAATTAATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3'). As sequências de ácido nucleico e aminoácido do GnTIV humano são mostradas na Figura 41.

De forma semelhante, o fragmento de ADN que codifica parte da isoenzima de proteina GnTIV humana (MGAT4B) com falta de domínio TM foi amplificado por PCR a partir do cDNA humano usando iniciadores anteriores HGIVB-2 (5' — AAATCAAGTGGATGAAGGACATGTGGC3') e de reverso HGIVB-3(5'-AGCGATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3'), clonado no vector pCR2.1-TO PO (Invitogen), e sequenciado. Para clonar no vector adequado para a fusão com biblioteca de líderes, foram amplificados por PCR fragmentos de ADN com iniciadores que incluem sítios de restrição Ascl e Pact. iniciadores posteriores Ascl: HGIVB-A1 (5' — AGCGGGCGCGCCGGCGACGTTGTGGACGTTTAC-3'), HGIVB-A2 (5' -CCGTGGCGCGCCTCACACCGGCACGT-GCTGCAC-3') . O iniciador de reverso Pact HGIVB-P (5'-TGTTAATTAAGCTTAGTCGGCC 11111 CAGGAAG-3'). As sequências de ácido nucleico e aminoácido do GnTIV B humano são mostradas na Figura 42. 231

Quadro 12: Plasmídeos contendo Domínio/líder catalítico Construções de fusão GnTV ou GnTIV paraestruturas vector HYG Expressão de hultiantenário vector KAN GnT V de ratos A95-53 pPB14 6 A145-53 pPBl25 pPBl40 A45-54 pPB130 A209-53 pPB12 6 A209-54 pPB 131 GnT IVA humano A32-53 pPB127 A82-53 pPBl28 pPBl41 A103-53 pPB12 9 A32-54 pPB132 A82-54 pPBl33 A103-54 pPB134 GnT IVB humano A32-53 pPBl4 3 A104-53 pPB14 4 232

GnT IX humano A43-53 pPB176 EXEMPLO 25

Estirpe de P. pastoris que produz estruturas de glicano triantenário A estirpe de P. pastoris YSH-44 (Exemplo 15) que produz estruturas de glicano complexas foi transformada com o plasmideo pPB144 (Tabela 12) contendo um fragmento de genes com código de domínio catalítico GnTIVB humano (A104) ligado em frame a um peptídeo alvo de S. cerevisiae MNN2(s) [nucleótidos 1-108] . O plasmideo pPB144 também contém um marcador de resistência HYG e o gene URA3 de P. pastoris URA3 como sequência alvo para integração genómica. Os plasmídeos de 1 lig foram linearizados com Sall, transformados na estirpe YSH-44 por electroporação, seleccionados no meio contendo higromicina e as tensões resultantes foram crivadas por análise dos glicanos libertos a partir do K3 purificado. Os transformantes desenvolveram-se a 30°C em BMGY para um OD600 de cerca de 100, colhidos por centrifugação e transferidos para BMMY para induzir a produção de K3 (kringle 3 a partir do plasminogénio humano) sob controlo de um promotor A0X1. O K3 foi purificado a partir do meio por cromatografia Ni-afinidade utilizando um formato de poços 96 no robô de laboratório Beckman Biomek 2000. A purificação robótica é uma adaptação do protocolo fornecido pela Novagen para a respectiva resina HisBind. Os N-glicanos foram libertados por digestão PNGase (Exemplo 3). Os N-glicanos foram analisados com um MALDI-TOF MS (Exemplo 3). Os 233 transformantes mostrando uma transferência de resíduos de GlcNAc no Manai,3 braços da estrutura de oligossacárido (por exemplo, GlcNAc2Man3GlcNAc2), foram denominados PBP43 (Figura 47) . A análise de N-glicanos proporcionam um pico predominante de 1543 rniz [lf],e indica que é consistente com a massa do glicano GlcNAc3Man3GlcNAc2. EXEMPLO 26

Clonagem e expressão de GnTV em P. pastoris 0 fragmento de ADN que codifica parte da proteína GnTV de ratos (MGAT45) com falta de domínio TM foi amplificado por PCR a partir do cDNA de murina usando os iniciadores anteriores MGV-2 (5'-AAATCAAGTGGATGAAGGACATGTGGC3') e reversos MGV-3 (5'-AGCGATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3'), clonado no vector pCR2.1-T0P0 (Invitogen), e sequenciado. Para clonar no vector adequado para a fusão com biblioteca de líder, foram amplificados por PCR fragmentos de ADN com iniciadores que incluem sítios de restrição Notl e Pacl. iniciadores posteriores Ascl: MGV-ASC1 (5'-TATGGGCGCGCCGAT-CATAACTCATTGGCGGAAATC-3'), MGV-ASC2 (5' - GAAGGGCGCGCCTTGCCTCCTATGGATGGCTACCCCCAC-3'), MGV-ASC3 (5 ' -TGGGGCGCGCCGGCAAGCTCGAGTCAAAGGTGGACAAT-3'). iniciador de reverso Pacl MGV-PAC (5'-AGTTAATTAATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3'). As sequências de ácido nucleico e aminoácido do GnTV de ratos são mostradas na Figura 43. EXEMPLO 27

Estirpe de P. pastoris com expressão de GnTV A estirpe de P. pastoris YSH-44 (Exemplo 15) que produz estruturas de glicano complexas foi transformada com o 234 plasmídeo pPB144 (Tabela 12) contendo um fragmento de genes com código de domínio catalítico GnTVB de ratos (A45) ligado em frame a um peptídeo alvo de S. cerevisiae MNN2(s). As condições de cultura foram as mesmas que no Exemplo 25. A proteína de repórter K3 a partir de dois transformantes foi analisada usando MALDI-TOF. Um pico a 1559 rrilz [y] é consistente com a massa do glicano GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Figura 48) . Um pico secundário a 1355 rniz [y] é consistente com a massa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Figura 48) . EXEMPLO 28

Estirpe de P. pastoris que produz estruturas tetra-antenárias de glicoproteinas A estirpe de P. pastoris PBP43(Exemplo 25) que produz estruturas triantenárias de glicano (por exemplo, GlcNAc3Man3GlcNAc2) foi transformada com o plasmídeo pPB140 (Figura 40B) que codifica o GnTV de ratos (Exemplo 27) . 0 vector pPB140 contém marcador de resistência KAN e gene HIS3 de P. pastoris como sequência alvo para integração genómica. Os plasmídeos de 1 lig foram linearizados com Kpnl, transformados na estirpe PBP43 por electroporação, seleccionados no meio contendo canomicina e as tensões resultantes foram crivadas por análise dos glicanos libertos a partir do K3 purificado. As condições de cultura foram as mesmas que no Exemplo 25. A análise da proteína de repórter k3 por MALDI-TOF mostrou um pico predominante a 1747 rniz [z], que é consistente com a massa do glicano tetra-antenário GlcNAc3Man3GlcNAc2. A digestão de hexosaminidase (Ver Exemplo 15) dos glicanos resultantes 235 mostraram massa do pico correspondendo a Man3GlcNAc2 (dados não visualizados).

Numa segunda experiência, o P. pastoris YSH-44 foi transformado com pPB128 e pPB140 (Tabela 12). Análise dos transformantes da proteína de repórter K3 por MALDI-TOF mostrou um pico predominante a 1743 m/z [z]; que é consistente com a massa do glicano tetra-antenário GlcNAc4Man3GlcNAc2 (Figura 50) . EXEMPLO 29

Clonagem e expressão de GnTIX em P. pastoris

As sequências de ácido nucleico e aminoácido do GnTIX humano(AB109185.1) são mostrados na Figura 45. O fragmento de ADN optimizado por codão que codifica parte do GnTIX humano com falta do domínio TM (443) foi sintetizado a partir de oligonucleótidos usando PCR (Figura 46). O fragmento de ADN que codifica o domínio catalítico de GnTIX foi ligado em frame a peptídeos alvo derivados de S. cerevisiae MNN2(s). O plasma resultante id pPBl76 (Figuras 40C) foi linearizado com Kpnl e transformado na estirpe YSH-44 de P. pastoris (Exemplo 15) que produz estruturas tetra-antenárias de glicano. As condições de cultura foram as mesmas que no Exemplo 25. A proteína de repórter K3 a partir de um transformante foi analisada usando MALDI-TOF. 236

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0114522 A, Chiba [0011] • JP 8336387 A [0020] [0021] [0321] • WO 0200856 A2, Contreras [0020] [0025] [0163] [0355] [0356] [0357] • US 5834251 A [0023] [0026] [0219] [0360] [0375] • WO 03011878 A, Umana [0030] [0314] • US 6602684 B [0030] [0314] • JP 2002209587 A, Taniguchi [0032] • US 5595900 A [0156] [0305] [0306] • WO 0200879 A [0197] [0319] [0326] [0328] [0329] [0330] [0383] • WO 03056914 A [0319] • US 5955422 A [0375] • US 4775622 A [0375] • US 6017743 A [0375] • US 4925796 A [0375] • US 5766910 A [0375] • US 5910570 A [0375] • US 5849904 A [0375] • US 5955347 A [0375] 237 • US 5962294 A [0375] • US 5135854 A [0375] • US 4935349 A [0375] • US 5707828 A [0375] • US 5047335 A [0375]

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Lisboa, 15/02/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Células hospedeira fúngica unicelular ou multicelular, capaz de produzir glicoproteínas compreendendo uma estrutura "core" de N-glicano triantenular, em que a célula hospedeira é manipulada geneticamente para produzir glicoproteínas com um N-glicano GlcNAc2Man3GlcNAc2 e em que a célula hospedeira inclui ainda um ácido nucleico que codifica o domínio catalítico da N-acetilglucosaminiltransferase IV exógeno GnTIVB humano (Δ104-53) fundido aos nucleótidos 1-108 do gene MNN2 de S. cerevisiae, actuando como peptídeo de sinal de endereçamento celular que normalmente não é associado ao domínio catalítico que endereça o domínio catalítico mencionado para o RE ou aparelho de Golggi da célula hospedeira.

2. Célula hospedeira da reivindicação 1, em que a estrutura triantenular produzida na célula hospedeira mencionada compreende a ramificação oligossacarídica GlcNAcpl,2 -Manai,6 (GlcNAcpl,4 GlcNAcpl,2 Manai,3) Μβηβ1,4 - GlcNAcpl,4 - GlcNAcpi,4 - Asn.

3. Célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular da reivindicação 1 ou 2, em que a célula hospedeira mencionada inclui ainda um ácido nucleico que codificado um domino catalítico da N-acetilglucosaminiltransferase exógeno para produzir uma glicoproteína com uma estrutura "core" de N-glicano tetraantenular fundida a um peptídeo de sinal de endereçamento celular que normalmente não é associado 2 ao domínio catalítico, que endereça o domínio catalítico para o RE ou aparelho de Golgi da célula hospedeira.

4. Célula hospedeira fúngica unicelular ou multicelular de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a célula hospedeira mencionada inclui ainda um ácido nucleico que codifica um domino catalítico da N- acetilglucosaminiltransferase IX exógeno fundido a um peptídeo de sinal de endereçamento celular que normalmente não é associado ao domínio catalítico, que endereça o domínio catalítico para o RE ou aparelho de Golgi da célula hospedeira para produzir a glicoproteína com uma estrutura "core" de N-glicano tetraantenular.

5. Célula hospedeira da reivindicação 3 ou 4, em que as estruturas tetraantenárias mencionadas produzidas pela célula hospedeira mencionada compreendem estruturas GlcNAc4Man3GlcNAc2 capazes de mais reacções por GnTVI.

6. Célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a célula hospedeira mencionada compreende um ácido nucleico que codifica uma enzima com actividade de N-acetilglucosaminiltransferase III.

7. Célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a célula hospedeira mencionada é deficitária numa actividade de manosiltransferase 0CH1 e/ou actividade de manosiltransferase Dol-P-Man:Man5GlcNAc2- PP-Dol. 3

8. A célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 1 7, em que a célula hospedeira mencionada é ainda manipulada geneticamente para expressar níveis mais elevados de actividade de transportador de UDP-GlcNAc para aumentar os níveis de UDP-GlcNAc na célula.

9. Célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a célula hospedeira é seleccionada a partir do grupo constituído por Pichia pastoris, Pichia finlandíca, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minutia, Ogataea minute, Pichia iindneri, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum e Neurospora crassa.

10. Célula hospedeira da reivindicação 9, em que a célula hospedeira é P.pastoris.

11. Célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a glicoproteína é uma proteína terapêutica.

12. Célula hospedeira da reivindicação 11, em que a proteína terapêutica é seleccionada a partir do grupo 4 constituído por domínios kringle de plasminogénio humano, eritropoietina, citoquinas, factores de coagulação, cadeia α do receptor IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinase, quimase e inibidor da tripsina ureia, proteína de liqação ao IGF, factor de crescimento da epiderme, factor de libertação da hormona de crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor-2 de crescimento endotelial vascular, factor-1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegirina, antitripsina α-l , DNase II, α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (proteína 1 de ligação a TNF ), TACI-Ig (activador transmembranar e modulador de cálcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona folículo-estimulante), GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteína 1 do tipo glucagon), agonista do receptor IL-1, sTNFr (proteína de fusão Fc com o receptor de TNF solúvel) ATUI, rh Trombina, glucocerebrosidase e CTLA4-Ig (Antigénio 4-Ig associado aos linfócitos T citotóxicos).

13. Método de produção de uma glicoproteína compreendendo a expressão de um ácido nucleico que codifica a glicoproteína numa célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Método da reivindicação 13, em que a glicoproteína mencionada compreende N-glicanos com estruturas triantenárias. 5

15. Método da reivindicação 13, em que a glicoproteina mencionada compreende N-glicanos com estruturas tetraantenárias.

16. Método de qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que a glicoproteina mencionada compreende ainda um residuo GlcNAc bissectado.

17. Método de qualquer uma das reivindicações 13 a 16, em que a glicoproteina mencionada não tem fucose.

18. Método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que a proteína terapêutica é seleccionada do grupo constituído por domínios kringle de plasminogénio humano, eritropoietina, citoquinas, factores de coagulação, cadeia α do receptor IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinase, quimase e inibidor da tripsina ureia, proteína de ligação a IGF, factor de crescimento da epiderme, factor de libertação da hormona de crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, factor-2 de crescimento endotelial vascular, factor-1 inibidor do progenitor mielóide, osteoprotegirina, antitripsina α-l, DNase II, α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (proteína 1 de ligação a TNF), TACI-Ig (activador transmembranar e modulador de cálcio e interactor do ligando de ciclofilina), FSH (hormona folículo-estimulante), GM-CSF, GLP-1 com e sem FC (proteína 1 do tipo glucagon) agonista do receptor IL-1, sTNFr (proteína de fusão Fc com o receptor de TNF solúvel) ATUI, rh Trombina, 6 glucocerebrosidase e CTLA4-Ig (Antigénio 4-Ig associado aos linfócitos T citotóxicos).

19. Método de qualquer uma das reivindicações 13 a 18, compreendendo ainda a etapa de isolamento da glicoproteína do hospedeiro.

20. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de glicoproteína produzida por qualquer uma das células hospedeiras das reivindicações 1 a 11, em que mais de 50 % em moles das estruturas "core" de N-glicano das glicoproteínas na composição mencionada possuem estruturas triantenárias.

21. Composição farmacêutica da reivindicação 20, em que as estruturas triantenárias compreendem pelo menos três GlcNAcs num oligossacárido Man3GlcNAc2.

22. Composição farmacêutica da reivindicação 20 ou 21, em que algumas ou todas as estruturas triantenárias compreendem a ramificação oligossacarídica GlcNAcpi,2 -Manai, 6 (GlcNAcpl,4 GlcNAcpi,2 Manai,3) Μ3ηβ1,4 GlcNAcpl,4 - GlcNAcpl,4 - Asn.

23. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em que mais de 50 % em moles ou mais de 75 % em moles das estruturas "core" de N-glicano são ainda modificadas por GnTV.

24. Composição farmacêutica da reivindicação 23, em que algumas ou todas as estruturas modificadas por GnTv 7 compreendem a ramificação oligossacaridica GlcNAcpl,2 GlcNAcpl,2 - Manai,6 (GlcNAcpl,4 GlcNAcpl,2 Manai,3) Manpi,4 - GlcNAcpl,4 - GlcNAcpl,4 - Asn.

25. Composições farmacêuticas de qualquer uma das reivindicações 20 a 24, em que a glicoproteina mencionada na composição mencionada não tem fucose.

26. Vector capaz de expressar numa célula hospedeira fúngica multicelular ou multicelular uma enzima com actividade de N-acetilglucosaminiltransferase IV (GnTIV) que é substancialmente intracelular, em que a enzima mencionada compreende o dominio catalítico GnTIVB humano (Δ104-53) fundido ao peptideo de sinal de endereçamento celular de S.cerevisiae MNN2 (1-36), normalmente não associado ao dominio catalítico que endereça o domínio catalítico para o RE ou aparelho de Golgi da célula hospedeira mencionada. Lisboa, 15/02/2010