ES2384929T3 - Producción de glicoproteínas modificadas que tienen estructuras multiantenarias - Google Patents

Abstract

Una célula huésped de hongo unicelular o pluricelular que es capaz de producir glicoproteínas que comprendenuna estructura central de N-glicano triantenaria, en la que la célula huésped se modifica por ingeniería genética paraproducir glicoproteínas que tienen un N-glicano GlcNAc2Man3GlcNAc2 y en el que la célula huésped incluye ademásuna molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V) deratón (Δ145) fusionado a los aminoácidos 1-36 del péptido señal de dirección celular de MNN2 de S. cerevisiae, quedirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

Description

Producción de glicoproteínas modificadas que tienen estructuras multiantenarias.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones mediante los cuales células huésped eucariotas no humanas, tales como células de hongos unicelulares y pluricelulares, pueden modificarse genéticamente para producir proteínas glicosiladas (glicoproteínas) que tienen patrones de glicosilación similares a los de glicoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos humanos o animales.

Antecedentes de la invención

Rutas de Glicosilación en Seres Humanos y Eucariotas Inferiores

Después de que el ADN se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento post-traduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glicosilación (glicosil transferasas y glicosidadasa) y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótidos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se expresa la proteína particular: las bacterias normalmente no glicosilan las proteínas, y si lo hacen solamente es de una manera muy inespecífica (Moens and Vanderleyden (1997) Arch Microbiol. 168(3): 169-175). Los eucariotas inferiores tales como los hongos filamentosos y las levaduras añaden principalmente manosa y azúcares de manosil fosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano del tipo de “alto contenido de manosa” o un manano. Las células vegetales y las células de insecto (tales como las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra forma. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como los seres humanos, la cadena lateral de oligosacárido naciente puede cortarse para retirar varios restos de manosa y alargarse con restos de azúcar adicionales que normalmente no se encuentran en los N-glicanos de los eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, Bretthauer, y col. (1999) Biotechnology and Applied Biochemistry 30: 193-200; Martinet, y col. (1998) Biotechnology Letters 20:1171-1177; Weikert, y col. (1999) Nature Biotechnology, 17: 1116-1121; M. Malissard, y col. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications 267: 169-173; Jarvis, y col., (1998) Current Opinion in Biotechnology 9: 528-533; and Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9: S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo de mamífero comienza con una serie de reacciones secuenciales en cuyo transcurso se añaden restos de azúcar y se retiran mientras que la proteína se desplaza a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de las proteínas secretadas. De esta manera, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas huésped y eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de las proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999). La estructura de un N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las primeras etapas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 se ensamblan por una serie secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplástico (ER) (Figura 13) e (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el doliquil pirofosfato de anclaje de lípidos a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define por un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (SEC ID Nº: 1 y 2) en la que Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne (1990) Protein Eng. 3: 433-42). El procesamiento adicional por glucosidasas y manosidasas se produce en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi en sus primeras fases, en el que los restos de manosa adicionales se retiran por alfa (α)-1,2-manosidasas específicas de Golgi. El procesamiento continúa según avanza la proteína a través del aparato de Golgi. En el aparato de Golgi medio, varias enzimas de modificación, incluyendo N-acetilglucosaminil transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcar específicos. Finalmente, en el trans-Golgi, las galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) producen una estructura de glicoproteína que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias, que contienen galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glicano humano típico se muestra en la Figura 1B. Véanse también en las Figuras 14 y 15 etapas implicadas en el procesamiento de N-glicano de tipo de mamífero.

En todos los eucariotas estudiados hasta la fecha, las glicoproteínas proceden de un precursor de oligosacárido unido a lípidos común Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y el procesamiento de los oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido central por células fúngicas, por ejemplo, levadura, difiere significativamente de los humanos según se desplaza a lo largo de la ruta de secreción.

En levaduras, estas etapas se catalizan por manosil transferasas que residen en el aparato de Golgi, tales como Och1p, Mnt1p y Mnn1p, que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por lo tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosil transferasa. Se ha mostrado que mutantes de S. cerevisiae, deficientes en la actividad manosiltransferasa (por ejemplo mutantes och1 o mn9) son no letales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura. También puede que tener que eliminarse otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasas, dependiendo de las rutas de glicosilación particulares del huésped.

Precursores de Nucleótidos de Azúcar

Los N-glicanos de las glicoproteínas animales normalmente incluyen galactosa, fucosa y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en las glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, la serie completa de precursores de azúcar de nucleótidos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al interior del aparato de Golgi, donde se unen al oligosacárido central por glicosiltransferasas (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91(2): A406-A405; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715).

Las reacciones de transferencia de glicosilo normalmente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente en el intercambio por azúcares de nucleósido trifosfato por un mecanismo de antiporte, los difosfonucleósidos (por ejemplo GDP) tienen que escindirse por fosfatasas (por ejemplo GDPasa) para producir nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción es importante para una glicosilación eficaz, por ejemplo, se ha descubierto que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo esta GDPasa tiene una actividad reducida en un 90 % hacia UDP (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Los eucariotas inferiores normalmente carecen de una actividad difosfatasa específica de UDP en el aparato de Golgi ya que no usan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteínas basada en el aparato de Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha descubierto que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (procedentes de UDP-galactosa) se ha descubierto que tiene una actividad UDPasa específica, lo que indica el posible requisito de dicha enzima (Beminsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1): 207-211). Se sabe que el UDP es un potente inhibidor de las glicosiltransferasas y la eliminación de este producto secundario de glicosilación puede ser importante para prevenir la inhibición de glicositransferasa en el lumen del aparato de Golgi (Khatara y col. (1974) Eur. J. Biochem. 44: 537-560). Véase Berninsone y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(24): 1456414567; Beaudet y col. (1998) Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects 292: 397-413.

Procesamiento Secuencial de N-glicanos por Actividades Enzimáticas Compartimentalizadas

Las azúcar transferasas y glicosidasas (por ejemplo, manosidasas) revisten la superficie interna (luminal) del RE y el aparato de Golgi y por lo tanto proporcionan una superficie “catalítica” que permite el procesamiento secuencial de glicoproteínas según avanzan a través de la red de RE y aparato de Golgi. Los múltiples compartimentos del aparato de Golgi cis, medio y trans y la red trans-Golgi (TGN) proporcionan las diferentes localidades en las que puede tener lugar la secuencia ordenada de reacciones de glicosilación. Según avanza una glicoproteína desde la síntesis en el RE hasta la maduración completa en la última parte del aparato de Golgi o TNG, se expone secuencialmente a diferentes glucosidasas, manosidasas y glicosiltransferasas de tal forma que puede sintetizarse una estructura de carbohidratos específica. Se ha dedicado mucho trabajo a revelar el mecanismo exacto mediante el cual estas enzimas se retienen y se anclan a su orgánulo respectivo. El panorama de evolución es complejo, pero los indicios sugieren que la región central, la región transmembrana y la cola citoplásmica, individualmente o asociadas, dirigen enzimas a la membrana de orgánulos individuales y de esta manera localizan el dominio catalítico asociado en ese locus (véase, por ejemplo Gleeson (1998) Histochem. Cell Biol. 109: 517-532).

En algunos casos, se observó que estas interacciones específicas funcionaban entre especies. Por ejemplo, el dominio transmembrana de α2, 6-ST de ratas, una enzima que se sabe que se localiza en el trans-Golgi de animal, se mostró que también localizaba un gen indicador (invertasa) en el Golgi de levadura (Schwientek y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Sin embargo, el mismo dominio transmembrana como parte de una α2,6-ST de longitud completa quedaba retenido en el RE y no se transportaba adicionalmente al Golgi de levadura (Krezdorn y col. (1994) Eur. J. Biochem. 220(3): 809-17). Tampoco se sintetizaba en levaduras el GaIT de longitud completa de seres humanos, a pesar de los niveles de transcripción demostrablemente elevados. Por el contrario, la región transmembrana del mismo GaIT humano fusionado a un indicador de invertasa pudo dirigir la localización al Golgi de levadura, aunque a bajos niveles. Schwientek y colaboradores han mostrado que la fusión de 28 aminoácidos de una manosiltransferasa de levadura (MNT1), una región que contiene una cola citoplásmica, una región transmembrana y ocho aminoácidos de la región principal, al dominio catalítico de GaIT humana son suficientes para la localización en el Golgi de una GaIT activa. Otras galactosiltransferasas parecen basarse en interacciones con enzimas residentes en orgánulos particulares porque, después de la eliminación de su región transmembrana, siguen pudiendo localizarse de manera apropiada.

La localización inapropiada de una enzima de glicosilación puede impedir el funcionamiento apropiado de la enzima en la ruta. Por ejemplo, Aspergillus nidulans, que tiene numerosas α-1,2-manosidasas (Eades y Hintz (2000) Gene 255(1): 25-34), no añade GlcNAc a Man5GlcNAc2 cuando se transforma con el gen GnTI de conejo, a pesar de un alto nivel global de actividad GnTI (Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). GnTI, aunque se expresa activamente, puede localizarse incorrectamente de tal forma que la enzima no esté en contacto con sus dos sustratos: UDP-GlcNAc y un sustrato Man5GlcNAc2 productivo (no todas las estructuras Man5GlcNAc2 son productivas; véase más adelante). Como alternativa, el organismo huésped puede no proporcionar un nivel adecuado de UDP-GlcNAc en el Golgi o la enzima puede localizarse de manera apropiada pero sin embargo se inactiva en su nuevo entorno. Además, las estructuras de Man3GlcNAc2 presentes en la célula huésped pueden diferir en estructura Man5GlcNAc2 encontrada en mamíferos. Maras y colaboradores descubrieron que aproximadamente un tercio de los N-glicanos de la celobiohidrolasa I (CBHI) obtenida a partir de T. reesei puede cortarse para dar Man5GlcNAc2 por una 1,2 manosidasa de A. saitoi in vitro. Sin embargo, menos de un 1 % de esos N-glicanos podrían servir como sustrato productivo para GnTI. Maras y col (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707. La mera presencia de Man5GlcNAc2, por lo tanto, no asegura que pueda conseguirse el procesamiento adicional in vivo de Man5GlcNAc2. Los que se requiere es su formación de una estructura Man5GlcNAc2 reactiva con GuTI productiva. Aunque Man5GlcNAc2 podría producirse en la célula (aproximadamente un 20 % en moles), solo una pequeña fracción podría convertirse en Man5GlcNAc2 (menos de aproximadamente un 5 %, véase Chiba y col. documento WO 01/14522).

Hasta la fecha no hay ninguna forma fiable para predecir si una manosidasa o glicosiltransferasa expresada heterólogamente particular en un eucariota inferior (1) se traducirá suficientemente, (2) será catalíticamente o (3) se localizará en el orgánulo apropiado dentro de la ruta de secreción. Como estos tres puntos son necesarios para efectuar los patrones de glicosilación en eucariotas inferiores, sería deseable un esquema sistemático para conseguir la función catalítica deseada y la retención apropiada de enzimas en ausencia de herramientas predictivas, que actualmente no están disponibles.

Producción de Glicoproteínas Terapéuticas

Un número significativo de proteínas aisladas a partir de seres humanos o animales se modifican posttraduccionalmente, siendo la glicosilación una de las modificaciones más significativas. Una estimación del 70 % de todas las proteínas terapéuticas se glicosilan y, por lo tanto, actualmente se basan en un sistema de producción (es decir, una célula huésped) que es capaz de glicosilar de una manera similar a la de los seres humanos. Varios estudios han mostrado que la glicosilación juega un papel importante para determinar (1) la inmunogenicidad, (2) las propiedades farmacocinéticas, (3) el tráfico y (4) la eficacia de proteínas terapéuticas. Por lo tanto, no es sorprendente que se hayan dirigido esfuerzos sustanciales por la industria farmacéutica al desarrollo de procesos para obtener glicoproteínas que sean tan “humanoides” o “parecidas a las humanas” como sea posible. Hasta la fecha, la mayoría de las glicoproteínas se fabrican en un sistema huésped de mamífero. Esto puede implicar la modificación por ingeniería genética de dichas células de mamífero para aumentar el grado de sialilación (es decir, la adición terminal de ácido siálico) de proteínas expresadas por las células, que se sabe que mejora las propiedades farmacocinéticas de dichas proteínas. Como alternativa, se puede mejorar el grado de sialilación por adición in vitro de dichos azúcares usando glicosiltransferasas conocidas y sus respectivos azúcares de nucleótidos (por ejemplo 2,3-sialiltransferasa y CMP-ácido siálico).

Aunque la mayoría de los eucariotas superiores realizan reacciones de glicosilación que son similares a las encontradas en seres humanos, las proteínas humanas recombinantes expresadas en los sistemas huésped mencionados anteriormente difieren invariablemente de su homólogo humano “natural” (Raju y col. (2000) Glycobiology 10(5): 477-486). Por lo tanto se ha dirigido un trabajo de desarrollo extensivo a encontrar formas para mejorar el “carácter humano” de proteínas fabricadas en estos sistemas de expresión. Esto incluye la optimización de las condiciones de fermentación y la modificación genética de huéspedes de expresión de proteínas mediante la introducción de genes que codifican enzimas implicadas en la formación de glicoformas de tipo humano. Goochee y col. (1999) Biotechnology 9(12):1347-55; Andersen y Goochee (1994) Curr Opin Biotechnol. 5(5): 546-49; Werner y col. (1998) Arzneimittelforschung. 48(8): 870-80; Weikert y col. (1999) Nat Biotechnol. 17(11): 1116-21; Yang y Butler (2000) Biotech. Bioeng. 68: 370-80. Aún no se han resuelto los problemas intrínsecos asociados con los sistemas de expresión de mamífero.

Producción de Glicoproteínas Usando Microorganismos Eucariotas

Aunque la estructura oligosacárido central transferida a una proteína en el retículo endoplásmico es básicamente idéntica en mamíferos y eucariotas inferiores, se han encontrado diferencias sustanciales en las reacciones de procesamiento posteriores que tienen lugar en el aparato de Golgi de hongos y mamíferos. De hecho, incluso entre diferentes eucariotas inferiores existe una gran diversidad de estructuras de glicosilación. Esto ha impedido históricamente el uso de eucariotas inferiores como huéspedes para la producción de glicoproteínas humanas recombinantes a pesar de ventajas por lo demás notables con respecto a los sistemas de expresión de mamífero.

Las glicoproteínas terapéuticas producidas en un microorganismo huésped tal como levadura que usa la ruta de glicosilación endógena del huésped difieren estructuralmente de las producidas en células de mamífero y normalmente muestran una eficacia terapéutica muy reducida. Dichas glicoproteínas normalmente son inmunogénicas en seres humanos y muestran una semivida (y por lo tanto una bioactividad) reducida in vivo después de la administración (Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9: S29-S35). Ciertos receptores específicos en seres humanos y animales (es decir, receptores de manosa de macrófagos) pueden reconocer restos de manosa terminales y promover la rápida eliminación de la glicoproteína extraña del torrente sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad o alergenicidad de las proteínas.

5 Para la producción de proteínas recombinantes, tanto intracelulares como secretadas, se han usado satisfactoriamente tanto levaduras como hongos filamentosos (Cereghino y Cregg (2000) FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45-66; Harkki y col. (1989) BioTechnology 7(6): 596; Berka y col. (1992) Abstr.Papers Amer. Chem. Soc. 203: 121-BIOT; Svetina y col. (2000) J. Biotechnol. 76(2-3): 245-251). Diversas levaduras, tales como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha, han jugado papeles particularmente importantes como

10 sistemas de expresión eucariotas porque pueden crecer a altas densidades celulares y secretar grandes cantidades de proteínas recombinantes. De forma similar, se han usado hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassa y otros para producir eficazmente glicoproteínas a escala industrial. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, las glicoproteínas expresadas en cualquiera de estos microorganismos y eucariotas difieren sustancialmente en la estructura de N-glicano de las producidas en animales. Esto ha impedido el

15 uso de levaduras u hongos filamentosos como huéspedes para la producción de muchas glicoproteínas terapéuticas.

Aunque la glicosilación en levaduras y hongos es muy diferente de la de los seres humanos, se comparten algunos elementos comunes. La primera etapa, la transferencia de la estructura de oligosacárido central a la proteína naciente, está altamente conservada en todos los eucariotas incluyendo levaduras, hongos, plantas y seres 20 humanos (compárense las Figuras 1A y 1B). Sin embargo, el procesamiento posterior del oligosacárido central, difiere significativamente en levaduras e implica la adición de varios azúcares de manosa. Esta etapa se cataliza por manosiltransferasas que residen en el Golgi (por ejemplo OCH1, MNT1, MNN1, etc.), que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante no es deseable para la producción de proteínas humanoides y por lo tanto es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Se ha mostrado 25 que mutantes de S. cerevisiae deficientes en la actividad manosiltransferasa (por ejemplo mutantes och1 o mnn9) son no letales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura. Otras enzimas del procesamiento de oligosacáridos tales como la manosilfosfato transferasa, también pueden tener que eliminarse dependiendo del patrón de glicosilación endógeno particular del huésped. Después de reducir las reacciones de glicosilación endógenas indeseadas, tiene que modificarse por ingeniería genética la formación de N

30 glicanos complejos en el sistema del huésped. Esto requiere la expresión estable de varias enzimas y transportadores de nucleótidos de azúcar. Además, se tienen que localizar estas enzimas de forma que se asegure un procesamiento secuencial de la estructura de glicosilación en maduración.

Se han realizado varios esfuerzos para modificar las rutas de glicosilación de microorganismos eucariotas para proporcionar glicoproteínas más adecuadas para uso como agentes terapéuticos de mamíferos. Por ejemplo, se han

35 clonado y expresado por separado varias glicosiltransferasas en S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos (Yoshida y col. (1999) Glycobiology 9(1): 53-8, Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3): 360370). Sin embargo, no se obtuvieron N-glicanos que se parecieran a los fabricados en células humanas.

Las levaduras producen una diversidad de manosiltransferasa, por ejemplo, 1,3-manosiltransferasas tales como MN1 en S. cerevisiae; Graham y Emr (1991) J. Cell. Biol. 114(2): 207-218), 1,2-manosiltransferasas (por ejemplo la 40 familia KTR/KRE de S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferasas (por ejemplo OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores (por ejemplo MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas en reacciones de glicosilación endógenas. Muchos de estos genes se han delecionado individualmente dando lugar a organismos viables que tienen perfiles de glicosilación alterados. En la Tabla 1 se muestran Ejemplos.

Tabla 1. Ejemplos de cepas de levadura que tienen manosilación alterada

Cepa N-glicano (tipo silvestre) Mutación N-glicano (mutante) Referencia

S. pombe

Man>9GlcNAc2 OCH1 Man8GlcNAc2

S. cerevisiae

Man>9GlcNAc2 OCH1/MNN1 Man8GlcNAc2

S. cerevisiae

Man>9GlcNAc2 OCH1/MNN1/MNN 4 Man8GlcNAc2

P. pastoris

Hiperglicosilado OCH1 (complete deleción) No hiperglicosilado

Yoko-o y col. (2001) FEBS Lett. 489(1): 7580

Nakanishi-Shindo y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(35): 26338-26345

Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273, 2629826304

Welfide, Publicación de Solicitud Japonesa Nº 8336387

Cepa N-glicano (tipo silvestre) Mutación N-glicano (mutante) Referencia

Contreras y col. WO

P. pastoris Man>8GlcNAc2 OCH1 (ruptura) Man>8GlcNAc2

02/00856 A2

La Publicación de la Solicitud de Patente Japonesa Nº 8-336387 desvela la deleción de un homólogo de OCH1 en Pichia pastoris. En S. cerevisiae, OCH1 codifica una 1,6-manosiltransferasa, que añade una manosa a la estructura de glicano Man8GlcNAc2 para producir Man9GlcNAc2. La estructura Man9GlcNAc2, que contiene tres restos de 1,6 manosa, entonces es un sustrato para 1,2-, 1,6-y 1,3-manosiltransferasas adicionales in vivo, conduciendo a las glicoproteínas hipermanosiladas que son características de S. cerevisiae y que normalmente pueden tener 30.40 restos de manosa por N-glicano. Como la OchIp inicia la transferencia de 1,6 manosa al núcleo de Man8GlcNAc2, con frecuencia se denomina “1,6 manosiltransferasa de iniciación” para distinguirla de otras 1,6 manosiltransferasas que actúan después en el Golgi. En una cepa mutante och1 mnn1 mnn4 de S. cerevisiae, se acumulan proteínas glicosiladas con Man8GlcNAc2 y no se produce la hipermanosilación. Sin embargo, Man8GlcNAc2 no es un sustrato para glicosiltransferasas de mamífero, tales como la UDP-GlcNAc transferasa I humana, y por consiguiente, el uso de esta cepa mutante, por sí misma, no es útil para producir proteínas de tipo mamífero, es decir, las que tienen patrones de glicosilación complejos o híbridos.

Se pueden cortar estructuras de Man8GlcNAc2 para dar un isómero Man5GlcNAc2 en S. cerevisiae (aunque aún tiene que demostrarse un corte de alta eficacia mayor del 50 % in vivo) mediante modificación por ingeniería genética de una manosidasa fúngica de A. saitoi en el retículo endoplásmico (ER). Los inconvenientes de este enfoque son dobles: (1) no está claro si las estructuras de Man5GlcNAc2 formadas efectivamente se forman in vivo (en lugar de haberse secretado y modificado adicionalmente por manosidasas fuera de la célula); y (2) no está claro si algunas de las estructuras de Man5GlcNAc2 formadas, si efectivamente se formaron in vivo, son la isoforma correcta para ser un sustrato productivo para la modificación posterior con N-glicano por la GlcNAc transferasa I (Maras y col. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 701-707).

Con el objetivo de proporcionar una glicoproteína más de tipo humano procedente de un huésped fúngico, la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 desvela un procedimiento para producir una glicoproteína híbrida derivada de Trichoderma reseei. Un N-glicano híbrido solo tiene restos de manosa en el brazo Manα1-6 de la estructura de manosa central y una o dos antenas complejas en el brazo de Manuα1-3. Aunque esta estructura tiene utilidad, el procedimiento tiene el inconveniente de que tienen que realizarse numerosas etapas enzimáticas in vitro, lo cual es costoso y requiere mucho tiempo. Las enzimas aisladas son caras de preparar y necesitan sustratos costosos (por ejemplo UDP-GlcNAc). El procedimiento tampoco permite la producción de glicanos complejos sobre una proteína deseada.

Actividad Manosidasa Intracelular Implicada en el Corte de N-glicanos

La actividad alfa-1,2-manosidasa es necesaria para el corte de Man8GlcNAc2 para formar Man5GlcNAc2, que es un intermedio importante para la formación de N-glicanos complejos en mamíferos. Un trabajo previo ha mostrado que puede expresarse α-1,2-manosidasa murina, fúngica y humana truncada en la levadura metilotrópica P. pastoris y presenta actividad de recorte de Man8GlcNAc2 a Man5GlcNAc2 (Lal y col. (1998) Glycobiology 8(10): 981-95; Tremblay y col. (1998) Glycobiology 8 (6): 585-95, Callewaert y col. (2001) FEBSLett. 503(2-3): 173-8). Sin embargo, hasta la fecha, no existe ningún informe que muestre el alto nivel de recorte in vivo de Man8GlcNAc2 a Man5GlcNAc2 en una glicoproteína secretada de P. pastoris.

Además, la mera presencia de una α-1,2-manosidasa en la célula, por sí misma, no asegura un recorte intracelular apropiado de Man8GlcNAc2 a Man5GlcNAc2. (Véase, por ejemplo Contreras y col. documento WO 02/00856 A2, en el que una manosidasa marcada con HDEL de T. reesel se localiza principalmente en el RE y se coexpresa con un indicador de hemaglutinina (HA) de influenza sobre el cual no pudo detectarse prácticamente Man5GlcNAc2. Véase también Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (41): 26298-26304, en el que una fusión quimérica de α-1,2manosidasa/dominio transmembrana de Och1p localizada en el ER, primera parte del Golgi y citosol de S. cerevisiae no tenía actividad de recorte de manosidasa. Por consiguiente, la mera localización de una manosidasa en el RE o Golgi es insuficiente para asegurar la actividad de la enzima respectiva en ese orgánulo diana. (Véase también, Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, que muestra que la α-1,2-manosidasa de T. reesei, aunque se localiza intracelularmente, aumentaba en lugar de disminuir el grado de manosilación. Hasta la fecha, no hay ningún informe que demuestre la localización intracelular de una α-1.2-manosidasa heteróloga activa en levaduras u hongos usando una secuencia de localización transmembrana.

Aunque es útil obtener por ingeniería genética cepas que sean capaces de producir Man5GlcNAc2 como estructura de N-glicano primaria, cualquier intento de modifica adicionalmente estas estructuras precursoras de alto contenido de manosa para parecerse más a los glicanos humanos requiere etapas adicionales in vivo o in vitro. En la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 (mencionado anteriormente) se describen procedimientos para humanizar adicionalmente glicanos de fuentes fúngicas y de levadura in vitro. Si se tiene que humanizar adicionalmente Man5GlcNAc2 in vivo, se tiene que asegurar que las estructuras de Man5GlcNAc2 generadas, efectivamente, se generan intracelularmente y no son el producto de la actividad manosidasa en el medio. La formación de N-glicanos complejos en levaduras u hongos requerirá que se generen altos niveles de Man5GlcNAc2 dentro de la célula porque solo los glicanos de Man5GlcNAc2 intracelulares pueden procesarse adicionalmente para dar N-glicanos híbridos y complejos in vivo. Además, se tiene que demostrar que la mayor parte de las estructuras de Man5GlcNAc2 generadas son efectivamente un sustrato para la GnTI y por lo tanto permiten la formación de N-glicanos híbridos y complejos.

Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos para producir glicoproteínas caracterizadas por un alto contenido de Man5GlcNAc2 intracelular que puedan procesarse adicionalmente en estructuras de glicoproteínas de tipo humano en células huésped eucariotas no humanas, y particularmente en levaduras y hongos filamentosos.

N-acetilglucosaminiltransferasas

Las N-acetilglucosaminiltransferasas (“GnT”) pertenecen a otra clase de enzimas de glicosilación que modifican Noligosacáridos en la ruta de secreción. Dichas glicosiltransferasas catalizan la transferencia de un monosacárido de donantes de nucleótidos de azúcar específicos a una posición hidroxilo particular de un monosacárido en una cadena de glicano en crecimiento en uno de dos posibles enlaces anométicos (α o β). Dennis y col. (1999) Bioessays 21(5): 412-21. Las GnT específicas añaden N-acetilglucosamina ("GlcNAc") sobre el brazo de Manα1,6 o el brazo de Manα1,3 de un sustrato de N-glicano por ejemplo Man5GlcNAc2 (“núcleo de manosa-5”) y Man3GlcNAc2 (una “estructura central interna”)). El producto de reacción (por ejemplo GlcNAcMan5GlcNAc2 o GlcNAc2Man3GlcNAc2) después puede modificarse para dar estructuras de N-oligosacáridos bi-, tri-, tetra-y pentaantenarias.

La N-acetilglucosaminiltransferasa III (“GnTIII”) es una enzima que cataliza la adición de un GlcNAc, sobre la manosa del centro del núcleo de trimanosa (Manα1,6 (Manα1,3) Man β1,4 -GlcNAc β1,4 -GlcNAc β1,4 -Asn) de un N-oligosacárido. La adición por GnTIII de un GlcNAc de bisección a un sustrato aceptor (por ejemplo núcleo de trimanosa) produce un denominado N-glicano biseccionado. Por ejemplo, la adición por GnTIII de un GlcNAc de bisección a la estructura GlcNAcMan3GlcNAc2 puede producir un N-glicano biseccionado, GlcNAc2Man3GlcNAc2. De forma similar, la adición por GnTIII de un GlcNAc de bisección a una estructura GlcNAc2Man3GlcNAc2 produce otro N-glicano biseccionado, GlcNAc3Man3GlcNAc2. Esta última estructura se ha implicado en una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Umana y col (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80. Pueden formarse otros N-glicanos biseccionados por la acción de GnTIII. Por ejemplo, GlcNAcMan4GlcNAc2 puede convertirse en GlcNAc2Man4GlcNAc2 biseccionado, Man5GlcNAc2 puede convertirse en GlcNAcMan5GlcNAc2 biseccionado y GlcNAcMan5GlcNAc2 puede convertirse en GlcNAc2Man5GlcNAc2 biseccionado. Véase, por ejemplo, Nar-asimhan (1982) J. Biol. Chem. 257: 10235-42. Hasta ahora solo se ha mostrado actividad GnTIII en células de mamífero.

La remodificación por ingeniería genética de glicoformas de inmunoglobulinas expresadas por células de mamífero es una tarea tediosa y problemática. Especialmente en el cado de GnTIII, donde la sobreexpresión de esta enzima se ha implicado en la inhibición del crecimiento, tuvieron que emplearse procedimientos que implicaban una expresión génica regulada (inducible) para producir inmunoglobulinas con N-glicanos biseccionados. Umana y col. (1999) Biotechnol Bioeng. 65(5): 542-9; Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80; Umana y col. documento WO 03/011878; Patente de Estados Unidos Nº 6.602.684. Dicho efecto de inhibición del crecimiento complica la capacidad de coexpresar la proteína diana y GnTIII y puede imponer un límite superior sobre la sobreexpresión de GnTIII. Patente de Estados Unidos Nº 6.602.684. Puede ser necesaria la optimización cuidadosa de los niveles de expresión de GnTIII. Id. Como se ha descrito anteriormente, sin embargo, el desarrollo de células huésped y eucariotas inferiores usadas en dicho sistema de producción de proteínas requiere que se modifiquen adicionalmente las rutas de glicosilación endógenas de las células huésped.

Se sabe que las enzimas GnTIV, GnTV y GnTIX expresadas en células de mamífero catalizan la transferencia de restos de GlcNAc en una conformación particular sobre sustratos de oligosacáridos que producen estructuras de glicano multiantenarias. La UDP-N-acetilglucosamina:α1,3-D-manósido β1,4-N-acetilglucosaminil-transferasa (GnTIV; EC 2.4.1.145) cataliza la transferencia de GlcNAc desde UDP-GlcNAc en restos en enlaces β1,4 al α1,3-Dmanósido en GlcNAcβ1-2Manα1-6 (GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn (Gleeson y Schachter, J Biol Chem. 1983 May 25;258 (10): 6162-73; Schachter y col., (1989) Methods Enzymol., 179, 351-397). La UDP-Nacetilglucosamina:α-6-D-manósido β1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa (GnTV; EC 4.1.155) cataliza la adición de una N-acetilglucosamina al núcleo de α1,6 manosil en un enlace β1,6 que forma N-glicanos tri y tetraantenarios.

De forma similar, la expresión de GnTVI en células aviares cataliza la transferencia de restos de GlcNAc a sustratos de oligosacáridos. Específicamente, la UDP N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc):GlcNAcβ1-6(GlcNAc β1-2)ManalR[GlcNAc a Man] β1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa VI(GnTVI) cataliza la formación de N-glicanos pentaantenarios (Sakamoto y col., J. Biol. Chem. 2000 Nov 17;275(46): 36029-34). El gen que codifica GnTVI se ha purificado y aislado recientemente Taniguchi y col., documento JP2002209587A2.

No se han sintetizado los sustratos necesarios para producir estructuras multiantenarias complejas en huésped fúngicos hasta hace poco (Hamilton y col., Science. 2003 Aug 29;301 (5637): 1244-6). Las células de mamífero normalmente producen una serie de glicanos complejos tales como glicoformas biantenarias, triantenarias, tetraantenarias e incluso pentaantenarias mediante la reacción secuencial de GnT específicas. En el aparato de Golgi de dichas células, el procesamiento con N-glicano de glicoproteínas produce predominantemente estructuras biantenarias, además de la formación de estructuras triantenarias y tetraantenarias. Actualmente se entiende que en la formación de glicanos complejos, GnT específicas catalizan enlaces β-GlcNAc específicos (por ejemplo β1,2; β1,4; β1,6), produciendo glicanos multiantenarios en células de mamífero. Sin embargo, estas células no pueden producir cualquier glicoforma homogénea con un alto rendimiento.

Recientemente, se han modificado por ingeniería genética eucariotas inferiores para producir glicanos complejos en formas homogéneas a niveles significativos (Hamilton y col., Science 2003 Aug 29; 301(5637): 1244-6). La capacidad de producir glicanos de complejos multiantenarios en eucariotas inferiores proporcionaría grandes cantidades de proteínas plegadas apropiadamente y glicosiladas a escala industrial a bajo coste, de una forma más rápida, más segura y de mayor calidad. Por lo tanto, lo que se necesita es un sistema de producción de proteínas que utilice la capacidad intrínseca de sólidos títulos de producto tales como los producidos en células huésped y eucariotas inferiores (por ejemplo levaduras y hongos filamentosos), que sea capaz de producir N-glicanos multiantenarios (y opcionalmente biseccionados) sobre las proteínas, especialmente proteínas terapéuticas, expresadas en estás células.

Sumario de la invención

Se han creado células huésped y líneas celulares que tienen rutas de glicosilación modificadas genéticamente que permite que realicen una secuencia de reacciones enzimáticas que imitan el procesamiento de glicoproteínas en mamíferos, especialmente en seres humanos. Las proteínas recombinantes expresadas en estos huéspedes modificados por ingeniería genética producen glicoproteínas más similares, si no sustancialmente idénticas, a sus homólogos de mamífero, por ejemplo, humanos. Las células huésped de la invención, por ejemplo, células huésped de hongos unicelulares y desarrolladas en cultivo, se modifican para producir N-glicanos, tales como N-glicanos biseccionados, u otras estructuras producidas a lo largo de rutas de glicosilación humanas. Este resultado se consigue usando una combinación de modificación por ingeniería genética y/o selección de cepas que, por ejemplo, no expresan enzimas que crean las estructuras indeseables características de las glicoproteínas fúngicas y que, por ejemplo, expresan enzimas heterólogas capaces de producir una glicoproteína “de tipo humano”.

De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de glicoproteínas que usa un huésped y eucariota inferior tal como un hongo unicelular o filamentoso que tiene un patrón de glicosilación diferente del de los seres humanos, para modificar la composición de glicosilación y las estructuras de las proteínas fabricadas en un organismo huésped (“célula huésped”) de forma que se parezcan más a las estructuras de carbohidratos encontradas en las proteínas de mamífero, por ejemplo, humanas. El procedimiento permite obtener una célula huésped modificada por ingeniería genética que puede usarse para expresar y fijar como diana cualquier gen deseable, por ejemplo, uno implicado en la glicosilación, por procedimientos que están bien establecidos en la bibliografía científica y se conocen generalmente por el experto en el campo de la expresión de proteínas. Se crean

o seleccionan células huésped con oligosacáridos modificados. Para la producción de proteínas terapéuticas, este procedimiento puede adaptarse para modificar por ingeniería genética líneas celulares en las que puede obtenerse cualquier estructura de glicosilación deseada.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona procedimientos para fabricar una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped de la invención mediante la introducción en la célula de una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III. En una realización preferida, la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III se expresa en la célula huésped de la invención, y en una realización incluso más preferida, esta expresión da como resultado la producción de N-glicanos que comprenden estructuras biseccionadas GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 o GlcNAc2Man5GlcNAc2. En otra realización preferida, la actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III es sustancialmente intracelular. En otra realización preferida de la invención, la glicoproteína que incluye los N-glicanos con estructuras biseccionadas se aísla de la célula huésped y eucariota inferior. En una realización incluso más preferida, la glicoproteína producida en la célula huésped es una proteína terapéutica.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped y eucariota inferior que incluye tanto una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III como una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa II. En una realización preferida, la célula huésped que incluye la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III produce N-glicanos que comprenden estructuras de GlcNAcMan3GlcNAc2 que son capaces de reaccionar con esta actividad. En una realización más preferida, la actividad produce un glicano biseccionado. La célula huésped y eucariota inferior de algunas realizaciones de la invención, de esta manera, puede incluir un N-glicano con un glicano biseccionado. En una realización preferida, el N-glicano incluye más de un 10 % en moles del glicano biseccionado. En algunas realizaciones, la célula huésped incluye un N-glicano que comprende estructuras biseccionadas de GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 o GlcNAc2Man5GlcNAc2. En una realización preferida, la célula huésped incluye una estructura central de Man5GlcNAc2 o una estructura central de Man3GlcNAc2 que se modifican por un GlcNAc de bisección. En una realización incluso más preferida, la célula produce más de un 10 % en moles de la estructura modificada.

En otra realización de la invención, la célula huésped y eucariota inferior contiene una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa I además de la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III. En una realización preferida, las actividades son sustancialmente intracelulares. En otra realización preferida, la célula produce Nglicanos que comprenden GlcNAcMan3GlcNAc2 que son capaces de reaccionar con la actividad GnTIII. En una realización incluso más preferida, la actividad GnTIII de la célula produce un glicano biseccionado.

En otra realización, la célula huésped y eucariota inferior de la invención contiene tanto una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III como una actividad manosidasa II. En una realización preferida, la célula huésped contiene además una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa I. En otra realización preferida, la célula huésped contiene además una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa II. En otra realización preferida, la célula huésped contiene además tanto una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa I como una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa II.

La presente invención también proporciona procedimientos para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped y eucariota inferior mediante la introducción en la célula de una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa IV. En una realización preferida, la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa IV se expresa en la célula, y en una realización incluso más preferida, esta expresión da como resultado la producción de N-glicanos que comprenden una estructura GlcNAcMan3GlcNAc2. En otra realización preferida, la actividad Nacetilglucosaminiltransferasa IV es sustancialmente intracelular. En otra realización preferida de la invención, la glicoproteína que incluye los N-glicanos con estructuras triantenarias se aísla a partir de la célula huésped y eucariota inferior. En una realización más preferida, el N-glicano incluye más de un 90 % en moles del glicano triantenario. En una realización incluso más preferida, la glicoproteína producida en la célula huésped es una proteína terapéutica.

De esta manera, en otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped eucariota inferior que incluye tanto una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa IV como una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa V. En una realización preferida, la célula huésped que incluye las actividades N-acetilglucosaminiltransferasa IV y V produce Nglicanos que comprenden estructuras de and GlcNAc4Man3GlcNAc2. En una realización más preferida, la actividad produce un glicano tetraantenario. La célula huésped de la invención de algunas realizaciones de la invención, por lo tanto, puede incluir un N-glicano con un glicano tetraantenario. En algunas realizaciones, la célula huésped incluye un N-glicano que comprende estructuras de GlcNAc3Man3GlcNAc2 y GlcNAc4Man3GlcNAc2. En una realización preferida, la célula huésped incluye una estructura central de GlcNAcMan5GlcNAc2 que está modificada por una GnT IV o una estructura central de GlcNAc2Man3GlcNAc2 que está modificada por una GnT IV y GnT V. En una realización preferida, el N-glicano incluye más de un 70 % en moles del glicano tetraantenario. En una realización incluso más preferida, la célula produce más de un 75 % en moles de glicanos tetraantenarios.

También se describe en el presente documento una célula huésped y eucariota inferior que incluye una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa VI. La célula huésped descrita que expresa la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa VI produce N-glicanos que comprenden estructuras de GlcNAc5Man3GlcNAc2 (por ejemplo glicanos pentaantenarios). La célula huésped de hongo unicelular y pluricelular descrita en el presente documento, por lo tanto, puede incluir un N-glicano con un glicano pentaantenar. En algunos casos, la célula huésped incluye un Nglicano que comprende estructuras de GlcNAc5Man3GlcNAc2. La célula huésped descrita incluye una estructura central de GlcNAc2Man3GlcNAc2 que se modifica por una GnT VI.

En otra realización, la invención proporciona procedimientos para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped y eucariota inferior mediante la introducción en la célula de una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa IX. En una realización preferida, la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa IX se expresa en la célula, y en una realización incluso más preferida, esta expresión da como resultado la producción de N-glicanos que comprenden estructuras de GlcNAc3Man3GlcNAc2 y GlcNAc4Man3GlcNAc2. En otra realización preferida, la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa IX es sustancialmente intracelular. En otra realización preferida de la invención, la glicoproteína que incluye los N-glicanos con estructuras multiantenarias se aísla de la célula huésped de hongo unicelular y pluricelular. En una realización incluso más preferida, la glicoproteína producida en la célula huésped es una proteína terapéutica.

En otra realización de la invención, la célula huésped de hongo unicelular y pluricelular contiene una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa I y una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa II. En una realización preferida, las actividades son sustancialmente intracelulares. En otra realización preferida, la célula producen N-glicanos que comprenden GlcNAc2Man3GlcNAc2 que son capaces de reaccionar con la actividad GnTV produciendo glicanos triantenarios. En una realización incluso más preferida, la actividad GnTV de la célula produce glicanos tetraantenarios.

En otra realización, la célula huésped eucariota inferior de la invención contiene tanto una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa IV como una actividad manosidasa II. En una realización preferida, la célula huésped contiene además una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa. En otra realización preferida, la célula huésped contiene además una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa II. En otra realización preferida, la célula huésped contiene además una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa V.

En ciertas realizaciones preferidas, la célula huésped de la invención es deficiente en una actividad OCH1 manosiltransferasa. Dicha célula puede ser deficiente, por ejemplo, en una actividad Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PPDol manosiltransferasa. En otra realización adicional, la célula huésped de la invención puede comprender además una actividad α1,2-manosidasa I. En otra realización, la célula huésped puede comprender además un transportador de nucleótidos de azúcar. Preferentemente, la célula huésped comprende un transportador de UDP-GlcNAc en el que la transferencia de restos de GlcNAc se facilita por una cualquiera de las actividades Nacetilglucosaminiltransferasa mencionadas anteriormente.

La presente invención también proporciona glicoproteínas que se fabrican por los procedimientos de la invención. En una realización, la glicoproteína incluye un GlcNAc de bisección sobre una estructura central de Man5GlcNAc2 o Man3GlcNAc2 y se produce en una célula huésped y eucariota inferior. En otra realización, la glicoproteína incluye un GlcNAc de bisección unido a una estructura central de Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2 o GlcNAc2Man3GlcNAc2 y se produce en una célula huésped y eucariota inferior. En una realización preferida, más del 10 % en moles de las estructuras centrales de la glicoproteína de la invención se modifican por el GlcNAc de bisección.

En otra realización más, la invención proporciona una glicoproteína que incluye una estructura triantenaria tal como GlcNAc3Man3GlcNAc2 y se produce en una célula huésped de hongo unicelular y pluricelular. En una realización preferida, más del 90 % en moles de las estructuras centrales de la glicoproteína de la invención se modifican por la GnTTV. En otra realización, la glicoproteína incluye una estructura tetraantenaria tal como GlcNAc4Man3GlcNAc2 y se produce en una célula huésped y eucariota inferior. En una realización más preferida, más del 75 % en moles de las estructuras centrales de la glicoproteína de la invención se modifican por la GnTV de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen las glicoproteínas de tipo humano producidas en una célula huésped y eucariota inferior. También se describen en el presente documento vectores que codifican proteínas que tienen una o más actividades N-acetilglucosaminiltransferasa III, IV, V. VI y IX y que contienen secuencias peptídicas de dirección unidas. Como una realización de la invención, dicho vector es capaz de expresar en la célula huésped de la invención una enzima que tiene actividad Nacetilglucosaminiltransferasa V que es sustancialmente intracelular, donde dicha enzima comprende el dominio catalítico GnTV de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1 a 36 del péptido señal de dirección celular MNN2 de

S. cerevisiae, que dirige el dominio catalítico al RE o aparato de Golgi de dicha célula huésped. En una realización preferida, las proteínas codificadas por los vectores se localizan en una célula huésped y eucariota inferior de tal forma que producen N-glicanos que tienen estructuras biseccionadas y/o multiantenarias. La invención también se caracteriza por las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un diagrama esquemático de una ruta de N-glicosilación fúngica típica.

La Figura 1B es un diagrama esquemático de una ruta de N-glicosilación humana típica.

La Figura 2 representa la construcción de una biblioteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión. La Figura 2A representa la inserción de un fragmento peptídico de dirección en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). La Figura 2B muestra la subbliliotecas de péptidos de dirección generados que tienen sitios de restricción NotI-AscI. La Figura 2C representa la inserción de una región de dominio catalítico en pJN347, un vector pUC19 modificado. La Figura 2D muestra la subbiblioteca de dominios catalíticos generados que tienen sitios de restricción NotI, AscI y PacI. La Figura 2E representa una construcción de fusión particular generada a partir de la subbiblioteca de péptidos de dirección y la subbiblioteca de dominios catalíticos.

La Figura 3 ilustra la secuencia de ácido nucleico de marco de lectura abierto de α-1,2-manosidasa IA de M. musculus (SEC ID Nº: 48) y la secuencia polipeptídica codificada (SEC ID Nº: 49). Las secuencias de los cebadores de PCR usados para generar los truncamientos N-terminales están subrayadas.

La Figura 4 ilustra la modificación por ingeniería genética de vectores con múltiples marcadores auxotróficos e integración genética de proteínas diana en el locus OCH1 de P. pastoris.

Las Figuras 5A -5E muestran el análisis MALDI-TOF que demuestra la producción del dominio kringle 3 de glicoproteínas de plasminógeno humano (K3) que tienen Man5GlcNAc2 como estructura de N-glicano predominante en P. pastoris. La Figura 5A representa el glicano Man5GlcNAc2 [a] convencional (Glyko, Novato, CA) y Man5GlcNAC2 + Na+ [b]. La Figura 5B muestra glicanos liberado por PNGasa de K3 de tipo silvestre. Los N-glicanos mostrados son los siguientes: Man9GlcNAC2 [d]; Man10GlcNAc2 [e]; Man11GlcNAc2 [f]; Man12GlcNAc2 [g]. La Figura 5C representa la deleción de och1 que da como resultado la producción de Man8GlcNAc2 [c] como N-glicano predominante. Las Figuras 5D y 5E muestran la producción de Man5GlcNAc2 [b] después del recorte in vivo de Man8GlcNAc2 con una α-1,2-manosidasa quimérica. El N-glicano predominante se indica por un pico con una masa (m/z) de 1253 coherente con su identificación como Man5GlcNAc2 [b].

Las Figuras 6A -6F muestran el análisis MALDI-TOF que demuestra la producción de glicoproteínas IFN-β que tienen Man5GlcNAc2 como estructura de N-glicano predominante en P. pastoris. La Figura 6A muestra el Man5GlcNAc2 [a] convencional y Man5GlcNAc2+ Na+ [b] como patrón (Glyko, Novato, CA). La Figura 6B muestra glicanos liberados por PNGasa de IFN-β de tipo silvestre. La Figura 6C representa el knock-out de och1 que produce Man8GlcNAc2 [c]; Man9GlcNAc2 [d]; Man10GlcNAc2 [e]; Man11GlcNAc2 [f]; Man12GlcNAc2 [g]; y la ausencia de producción de Man5GlcNAc2 [b].

La Figura 6D muestra una cantidad relativamente pequeña de Man5GlcNAc2 [b] entre otros N-glicanos intermedios Man8GlcNAc2 [c] a Man12GlcNAc2 [g]. La Figura 6E muestra una cantidad significativa de Man5GlcNAc2 [b] con respecto a los otros glicanos Man8GlcNAc2 [c] y Man9GlcNAc2 [d] producidos por pGC5 (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99). La Figura 6F muestra la producción predominante de Man5GlcNAc2 [b] sobre la glicoproteína IFN-β secretada por pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón). El Nglicano se indica por un pico con una masa (m/z) de 1254 coherente con su identificación como Man5GlcNAc2 [b].

La Figura 7 muestra un cromatograma líquido de alta resolución para: (A) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de P. pastoris, ∆och1 transformado con manosidasa pFB8, que demuestra la ausencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante; y (C) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB después de la exposición a manosidasa de T. reesei (control positivo).

La Figura 8 muestra un cromatograma líquido de alta resolución para: (A) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de P. pastoris, ∆och1 transformado con manosidasa pGC5, que demuestra la ausencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante; y (C) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB después de la exposición a manosidasa de T. reesei (control positivo)

La Figura 9 muestra un cromatograma líquido de alta resolución para: (A) Man9GlcNAc2 convencional marcado con 2-AB (control negativo); (B) sobrenadante de medio de P. pastoris, ∆och1 transformado con manosidasa pBC18-5, que demuestra la ausencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante; y (C) sobrenadante de medio de P. pastoris, ∆och1 transformado con pDD28-3, que demuestra actividad en el sobrenadante (control positivo).

Las Figuras 10A-10B demuestran la actividad de un transportador de UDP-GlcNAc en la producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 en P. pastoris. La Figura 10A representa una cepa de P. pastoris (YSH-3) con un GnTI humano pero sin el transportador de UDP-GlcNAc que da como resultado alguna producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] pero una producción predominante de Man5GlcNAc2 [a]. La Figura 10B representa la adición del transportador de UDP-GlcNAc de K. lactis en una cepa (PBP-3) con el GnTI humano, que dio como resultado la producción predominante de GlcNAcMan5GlcNAc2 [b]. El único pico prominente de masa (m/z) en 1457 es coherente con su identificación como GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] como se muestra en la Figura 10B.

La Figura 11 muestra un pH óptimo de una enzima manosidasa heteróloga codificada por pBB27-2 (MNN10 (s) de Saccharomyces / manosidasa IB ∆31 de C. elegans) expresado en P. pastoris.

Las Figuras 12A-12C muestran el análisis MALDI-TOF de N-glicanos liberados de un extracto sin células de K. lactis. La Figura 12A muestra los N-glicanos liberados de las células de tipo silvestre, que incluye N-glicanos del tipo de alto contenido de manosa. La Figura 12B muestra los N-glicanos liberados de células con och1 mnn1 deleccionado, que revelan un pico característico de masa (m/z) a 1908 coherente con su identificación como Man9GlcNAc2 [d]. La Figura 12C muestra los N-glicanos liberados de células con och1 mnn1 deleccionado después de la digestión de α-1,2-manosidasa in vitro correspondiente a un pico coherente con Man5GlcNAc2.

La Figura 13 es un esquema de la estructura del oligosacárido unido a doliquil pirofosfato.

La Figura 14 es un esquema de la generación de GlcNAc2Man3GlcNAc2-N-glicanos de células huésped fúngicas que son deficientes en las actividades alg3, alg9 o alg12.

La Figura 15 es un esquema de reacciones de procesamiento necesarias para producir estructuras de oligosacárido de tipo de mamífero en una célula huésped fúngica con un genotipo alg3 och1.

La Figura 16 muestra comparaciones de secuencias de Alg3 de S. cerevisiae (Blast) (SEC ID Nº 9–20, respectivamente, en orden de aparición)

La Figura 17 muestra las secuencias de ALG3 (SEC ID Nº 21) y Alg3p (SEC ID Nº 22) de S. cerevisiae

La Figura 18 muestra las secuencias de ALG3 (SEC ID Nº 23) y Alg3p (SEC ID Nº 24) de P. pastoris

La Figura 19 muestra comparaciones de secuencias de ALG3 de P. pastoris (Blast) (SEC ID Nº 23-31, respectivamente, en orden de aparición)

La Figura 20 muestra secuencias de ALG3 (SEC ID Nº 33) y Alg3p (SEC ID Nº 34) de K. lactis

La Figura 21 muestra comparaciones de secuencias de ALG3 de K. lactis (Blast) (SEC ID Nº 35-40, respectivamente, en orden de aparición)

La Figura 22 muestra un modelo de una inmunoglobulina IgG. La cadena pesada y la cadena ligera pueden, basándose en una estructura secundaria y terciaria similar, subdividirse en dominios. Las dos cadenas pesadas (dominios VH, CH1, CH2 y CH3) están unidas a través de tres puentes disulfuro. Las cadenas ligeras (dominio VL y CL) están unidas por otro puente disulfuro a la parte CH1 de la cadena pesada y, junto con los fragmentos CH1 y VH, constituyen la región Fab. Los antígenos se unen a la parte terminal de la región Fab. Se han localizado funciones efectoras, tales como unión al receptor Fc-gamma en el dominio CH2, cadena abajo de la región de bisagra y se ven influenciadas por la N-glicosilación de la asparagina 297 en la cadena pesada.

La Figura 23 es una vista general esquemática de un vector de expresión de IgG1 modular.

La Figura 24 muestra las secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº 45) y de aminoácidos (SEC ID Nº 46) de GnIII de

M. musculus.

La Figura 25 (superior) es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producida en una YSH-1 de P. pastoris que presenta un pico predominante a 1461 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d]; la Figura 25 (inferior) muestra un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producida en una YSH-1 de P. pastoris transformada con manosidasa II∆74 de

D. melanogaster /MNN2(s) de S. cerevisiae que muestra un pico predominante a 1140 m/z correspondiente a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] y otros picos correspondientes a GlcNAcMan4GlcNAc2 [c] a 1303 m/z y GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] a 1465 m/z. Esta cepa se denominó YSH-37.

La Figura 26 (superior) es el análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producida en YSH-1 de P. pastoris como se muestra en la Figura 25 (superior); la Figura 26 (inferior) es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris YSH1 transformadas con una construcción pVA53 (MNN2(s) de S. cerevisiae /mGnTIII). El pico a 1463 m/z corresponde a la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] y el pico a 1666 m/z corresponde a la masa de GlcNAc2MansGlcNAc2 [a].

La Figura 27 (superior) es el análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producida en YSH-1 de P. pastoris como se muestra en la Figura 25 (superior); la Figura 27 (inferior) es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris YSH1 transformadas con una construcción pVA55 (MNN2(s) de S. cerevisiae /mGnTIII). El pico a 1463 m/z corresponde a la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] y el pico a 1667 m/z corresponde a la masa de GlcNAc2Man5GlcNAc2 [a].

La Figura 28 (superior) es el análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producida en P. pastoris YSH-1 como se muestra en la Figura 25 (superior); la Figura 28 (inferior) es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris YSH1 transformadas con una construcción pVA51 (GNT1(s) de K. lactis / mGnTIII). El pico predominante a 1463 m/z corresponde a la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] y se observa un segundo pico a 1726 m/z [e], que no corresponde a la masa de GlcNAc2Man5GlcNAc2.

La Figura 29 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris YSH-44. El pico predominante a 1356 m/z corresponde a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x].

La Figura 30 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris YSH-44 transformadas con una construcción pVA53 (MNN2(s) de S. cerevisiae/mGnTIII). El pico a 1340 m/z corresponde a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x] y el pico a 1542 m/z corresponde a la masa de GlcNAc3Man3GlcNAc2 [y].

La Figura 31 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris PBP6-5. El pico predominante a 1340 m/z corresponde a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x].

La Figura 32 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en células P. pastoris PBP6-5 transformadas con una construcción pVA53 (MNN2(s) de S. cerevisiae/mGnTIII). El pico a 1340 m/z corresponde a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x] y el pico a 1543 m/z corresponde a la masa de GlcNAc3Man3GlcNAc2 [y].

La Figura 33 muestra un cromatograma líquido de alta resolución, que demuestra la ausencia de actividad de GnTIII extracelular (pVA53) en el sobrenadante. El N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 purificado a partir de K3 expresada en la cepa PBP-3 se añadió a: BMMY (A); UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C); y el sobrenadante de YSH-57 + UDP-GlcNAc 1 mM (D).

La Figura 34 muestra un cromatograma líquido de alta resolución, que demuestra la ausencia de actividad GnTIII extracelular (pVA53) en el sobrenadante. El N-glicano GlclvAc2Man3GlcNAc2 purificado a parir de K3 expresada en la cepa YSH-44 se añadió a: BMMY (A); UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); y el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C).

La Figura 35 es un diagrama esquemático que compara las rutas de glicosilación normales en humanos y P.

pastoris (Panel A) con una ruta de N-glicosilación humanizada obtenida por ingeniería genética en eucariotas inferiores (Panel B). La ruta obtenida por ingeniería genética representa la construcción de la cepa PBP6-5 de P. pastoris que después de la modificación con GnTIII se convierte en la cepa PBP38 de P. pastoris.

La Figura 36 es un diagrama esquemático que muestra la glicoforma secretada predominante producida por cada una de las cepas de P. pastoris designadas y la modificación génica usada para modificar por ingeniería genética cada una de las cepas.

La Figura 37 es una representación estructural de la transferencia de un GlcNAc al intermedio de oligosacárido, GlcNAcMan5GlcNAc2, producida en glicoproteínas en una célula huésped eucariota inferior, usada por GnTIII.

La Figura 38 es una representación estructural de la transferencia de un GlcNAc al intermedio de oligosacárido, GlcNAcMan3GlcNAc2, producido en glicoproteínas en una célula huésped eucariota inferior, catalizada por GnTII, y la posterior transferencia de un GlcNAc al producto de esa reacción, GlcNAc2Man3GlcNAc2, catalizada por GnTIII.

La Figura 39 es un diagrama esquemático que muestra transferencia de restos de GlcNAc en intermedios de oligosacárido catalizada por GnTIV, GnTV, GnTVI y GnTIX en P. pastoris.

La Figura 40 muestra tres mapas plasmídicos representativos. Figura 40A: pPB144 que contiene un fragmento génico que codifica GnTIV de ratón; Figura 40B: pPB140 que contiene un fragmento génico que codifica GnTV humana; y Figura 40C: pPB176 que contiene un fragmento génico que codifica GnTIX de ratón usada para la transformación en un huésped P. pastoris.

La Figura 41 muestra el gen que codifica la manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-Nacetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima A, (MGAT4A) con el número de acceso NM_012214.

La Figura 42 muestra el gen que codifica la manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-Nacetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima B (MGAT4B) con el número de acceso NM_014275.

La Figura 43 muestra el gen que codifica la N-acetilglucosaminiltransferasa V de Mus musculus (Mgat5) con el número de acceso AF474154.

La Figura 44 muestra el gen que codifica la N-acetilglucosaminiltransferasa VI de Gallus gallus con el número de acceso AB040608.

La Figura 45 muestra el gen que codifica la N-acetilglucosaminiltransferasa X de Homo sapiens con el número de acceso AB109185.1.

La Figura 46 muestra el fragmento de ADN de codones optimizados que codifica parte de la Nacetilglucosaminiltransferasa IX humana que carece del dominio TM (Δ43).

La Figura 47 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en P. pastoris PBP43. La cepa de levadura P. pastoris YSH-44 se transformó con pPB144 que contenía la construcción de fusión MNN2(s) de S. cerevisiae/GnTIV humana. El pico a 1543 m/z corresponde a la masa de GlcNAc3GlcNAc2 [y].

La Figura 48 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en P. pastoris PBP32. La cepa de levadura P. pastoris YSH-44 se transformó con pPB140 que contenía la fusión de MNN2(s) de S. cerevisiae/GnTV de ratón. El pico a 1559 m/z corresponde a la masa de GlcNAc3Man3GlcNAc2 [y].

La Figura 49 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en P. pastoris PBP46. La cepa de levadura P. pastoris YSH-44 se transformó con pPB140 y pPB144. El pico a 1543 m/z corresponde a la masa de GlcNAc3Man3GlcNAc2 [y] y el pico a 1747 m/z corresponde a la masa de GlcNAc4Man3GlcNAc2 [z].

La Figura 50 es un análisis MALDI-TOF-EM de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 expresada en P. pastoris PBP94. La cepa de levadura P. pastoris YSH-44 se transformó con pPB128 que contenía la construcción de fusión MNN2(s) de S. cerevisiae/GnTV de ratón y pPB140 que contenía la construcción de fusión MNN2(s) de S. cerevisiae/GnTV de ratón. El pico predominante a 1743 m/z corresponde a la masa de GlcNAc4Man3GlcNAc2 [z].

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados entendidos comúnmente por los expertos en la materia. Además, a menos que lo requiera el contexto, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos plurales incluirán los singulares. Los procedimientos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. En general, las nomenclaturas usadas en relación con y las técnicas de bioquímica, enzimología, biología molecular y celular, microbiología, genética y química de proteínas y de ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son las nomenclaturas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica.

Los procedimientos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique otra cosa. Véase, por ejemplo, Sambrook y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). Las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, biología molecular y celular, bioquímica de proteínas, enzimología y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son las nomenclaturas bien conocidas usadas comúnmente en la técnica.

Se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tendrán los siguientes significados:

Como se usa en el presente documento, la expresión “N-glicano” se refiere a un N-oligosacárido, por ejemplo, uno que está unido por un enlace asparagina-N-acetilglucosamina a un resto de asparagina de un polipéptido. Los Nglicanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 (“Man” se refiere a manosa; “Glc” se refiere a glucosa; y “NAc” se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). La expresión “núcleo de trimanosa” usada con respecto al N-glicano también se refiere a la estructura Man3GlcNAc2 (“Man3”). El término “núcleo de pentamanosa” o “núcleo de Manosa-5” o “Man5” usado con respecto al N-glicano se refiere a la estructura Man5GlcNAc2. Los N-glicanos difieren con respecto al número de ramificaciones (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GlcNAc, fucosa y ácido siálico) que están unidos a la estructura central de Man3. Los N-glicanos se clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por ejemplo, alto contenido de manosa, complejo o híbrido).

Un N-glicano del tipo de “alto contenido de manosa” tiene cinco o más restos de manosa. Un N-glicano de tipo de “complejo” normalmente tiene al menos un GlcNAc unido al brazo de 1,3 manosa y al menos un GlcNAc unido al brazo de 1,6 manosa del núcleo de trimanosa. Los N-glicanos complejos también pueden tener restos de galactosa (“Gal”) que opcionalmente están modificados con ácido siálico o derivados (“NeuAc”, donde “Neu” se refiere a ácido neuramínico y “Ac” se refiere a acetilo). Un N-glicano complejo normalmente tiene al menos una ramificación que termina en un oligosacárido tal como, por ejemplo: NeuNAc-; NeuAcα2-6GalNAcα1-; NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα1-; NeuAcα2-3/6Galβ1-4GlcNAcβ1-; GlcNAcα1-4Galβ1-(mucinas solo); Fucα1-2Galβ1-(grupo sanguíneo H). Pueden aparecer ésteres sulfato en restos de galactosa, GalNAc y GlcNAc, y pueden aparecer ésteres de fosfato en restos de manosa. NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo) puede estar O-acetilatedo o reemplazarse por NeuGl (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glicanos complejos también pueden tener sustituciones intracatenarias que comprenden GlcNAc “de bisección” y fucosa central (“Fuc”). Un N-glicano “híbrido” tiene al menos un GlcNAc en el extremo del brazo de 1,3 manosa del núcleo de trimanosa y cero o más manosas en el brazo de 1,6 manosa del núcleo de trimanosa.

El término “predominante” o “predominantemente” usado con respecto a la producción de N-glicano se refiere a una estructura que representa el pico principal detectado por análisis de ionización de desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo-espectrometría de masas (MALDI-TOF).

Las abreviaturas usadas en el presente documento son de uso común en la técnica, véanse, por ejemplo, las abreviaturas de azúcares anteriores. Otras abreviaturas comunes incluyen “PNGasa”, que se refiere al péptido Nglicosidasa F (EC 3.2.2.18); “GlcNAc Tr” o “GnT”, que se refiere a enzimas N-acetilglucosaminil transferasas; “NANA” que se refiere a ácido N-acetilneuramínico.

Como se usa en el presente documento, una “glicoproteína humanizada” o una “glicoproteína de tipo humano” se refiere, como alternativa, a una proteína que tiene unidos a la misma N-glicanos que tienen menos de cuatro restos de manosa, e intermedios de glicoproteínas sintéticas (que también son útiles y pueden manipularse adicionalmente in vitro o in vivo) que tienen al menos cinco restos de manosa. Preferentemente, las glicoproteínas producidas de acuerdo con la invención contienen al menos un 30 % en moles, preferentemente al menos un 40 % en moles y más preferentemente un 50, 60, 70, 80, 90 o incluso un 100 % de moles del intermedio de Man5GlcNAc2, al menos transitoriamente. Esto puede conseguirse, por ejemplo, modificando por ingeniería genética una célula huésped de la invención para expresar una enzima de glicosilación “mejor”, es decir, más eficaz. Por ejemplo, una manosidasa se selecciona del tal forma que tenga una actividad óptima en las condiciones presentes en el sitio en la célula huésped en el que las proteínas se glicosilan y se introduce en la célula huésped preferentemente dirigiendo la enzima a un orgánulo de la célula huésped en el que se desea la actividad.

El término “enzima”, cuando se usa en el presente documento en relación con la alteración de la glicosilación de la célula huésped, se refiere a una molécula que tiene al menos una actividad enzimática, e incluye enzimas de longitud completa, fragmentos catalíticamente activos, quimeras, complejos y similares. Un “fragmento catalíticamente activo” de una enzima se refiere a un polipéptido que tiene un nivel detectable de actividad funcional (enzimática). La actividad enzimática es “sustancialmente intracelular” cuando menos del 10 % de la actividad enzimática es medible fuera de la célula en comparación con la medible a partir de células lisadas.

Una célula huésped eucariota inferior, cuando se usa en el presente documento en relación con perfiles de glicosilación, se refiere a cualquier célula eucariota que produce normalmente N-glicanos que contienen un alto contenido de manosa, y por lo tanto se entiende que incluye algunas células animales o vegetales y células eucariotas inferiores más típicas, incluyendo células fúngicas y de algas uni-y pluricelulares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ruta de secreción” se refiere a la línea de ensamblaje de diversas enzimas de glicosilación a la que se expone secuencialmente un precursor de oligosacárido unido a lípidos y un sustrato de N-glicano, siguiendo el flujo molecular de una cadena polipeptídica naciente desde el citoplasma al retículo endoplásmico (ER) y los compartimentos del aparato de Golgi. Se dice que las enzimas están localizadas a lo largo de esta ruta. Una enzima X que actúa sobre un glicano unido a lípidos o un N-glicano antes que la enzima y se dice que está o actúa “aguas arriba” de la enzima Y; de forma similar, la enzima Y está o actúa “aguas abajo” de la enzima X.

La expresión “péptido de dirección” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que codifican un péptido señal de dirección que media la localización (o retención) de una secuencia asociada a localizaciones subcelulares, por ejemplo, orgánulos.

La expresión “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. El término incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico sintético) y moléculas de ARN (por ejemplo ARNm o ARN sintético) así como análogos de ADN o ARN que contienen análogos de nucleótido no naturales, enlaces internucleosídicos no nativos o ambos. El ácido nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, tricatenario, en cuádruplex, parcialmente bicatenario, ramificado, en horquilla, circular o en conformación en candado. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede incluir cadenas tanto con sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Pueden estar modificados química o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como apreciará fácilmente el experto en la materia. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada a través de la formación de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que enlaces peptídicos sustituyen a enlaces fosfato en el esqueleto de la molécula.

A menos que se indique otra cosa, un “ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº X” se refiere a un ácido nucleico, del que al menos una parte tiene (i) la secuencia de la SEC ID Nº X o (ii) una secuencia complementaria a la SEC ID Nº X. La elección entre las dos se dicta por el contexto. Por ejemplo, si el ácido nucleico se usa como sonda, la elección entre los dos se dicta por el requisito de que la sonda sea complementaria a la diana deseada.

Un ácido nucleico o polinucleótido (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) “aislado” o “sustancialmente puro” es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que está asociado naturalmente. El término incluye un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno natural, (2) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza o (4) no aparece en la naturaleza. El término “aislado” o “sustancialmente puro” también puede usarse en relación con aislados de AND recombinantes o clonados, análogos de polinucleótidos sintetizados químicamente o análogos de polinucleótidos que se sintetizan biológicamente por sistemas heterólogos.

Sin embargo, “aislado” no requiere necesariamente que el ácido nucleico o polinucleótido descrito de esta manera se haya retirado físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo se considera “aislada” en el presente documento si una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia que no es adyacente de forma natural a esta secuencia de ácido nucleico endógena) está colocada adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, de tal forma que la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógena se altera. A modo de Ejemplo, una secuencia promotora no nativa puede sustituir (por ejemplo, por recombinación homóloga) al promotor nativo de un gen en el genoma de una célula humana, de tal forma que este gen tenga un patrón de expresión alterado. Este gen ahora estaría “aislado” porque está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de forma natural.

Un ácido nucleico también se considera “aislado” si contiene cualquier modificación que no aparece de forma natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera “aislada” si contiene una inserción, deleción o una mutación puntual introducida artificialmente, por ejemplo, por intervención humana. Un “ácido nucleico aislado” también incluye un ácido nucleico integrado en un cromosoma de la célula huésped en un sitio heterólogo, una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un “ácido nucleico aislado” puede carecer sustancialmente de otro material celular, o carecer sustancialmente de medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o carecer sustancialmente de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usa en el presente documento, la frase “variante degenerada” de una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que pueden traducirse, de acuerdo con el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de las secuencias de ácido nucleico se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean en una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, normalmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más normalmente de al menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente de al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más normalmente de al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferentemente de al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. Hay varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas pueden compararse usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98).

Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros de defecto proporcionados en la Versión 6,1 de GCG.

La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”; cuando se hace referencia a un ácido nucleico o un fragmento del mismo, indica que, cuando está alineado óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay una identidad de secuencias de nucleótidos en al menos aproximadamente un 50 %, más preferentemente un 60 % de las bases nucleotídicas, normalmente al menos aproximadamente un 70 %, más normalmente al menos aproximadamente un 80 %, preferentemente al menos aproximadamente un 90 % y más preferentemente al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, como se mide por cualquier algoritmo de identidad de secuencias bien conocido, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se ha analizado anteriormente.

Como alternativa, existe una homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo hibrida con otro ácido nucleico, con una cadena de otro ácido nucleico, o con la cadena complementaria del mismo, en condiciones de hibridación rigurosas. “Condiciones de hibridación rigurosas” y “condiciones de lavado rigurosas” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos dependen de varios parámetros físicos diferentes. La hibridación de ácidos nucleicos se verá afectada por condiciones tales como la concentración de sal, temperatura, disolventes, la composición de bases de las especies que hibridan, la longitud de las regiones complementarias y el número de desacoplamientos de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos que hibridan, como apreciarán fácilmente los expertos en la materia. Un experto habitual en la materia sabe cómo variar estos parámetros para conseguir una rigurosidad particular de hibridación.

En general, la “hibridación rigurosa” se realiza a aproximadamente 25 ºC por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para el híbrido de ADN específico en una serie de condiciones particulares. El “lavado riguroso” se realiza a temperaturas aproximadamente 5 ºC por debajo de la Tm para el híbrido de ADN específico en una serie particular de condiciones. La Tm es la temperatura a la que el 50 % de las secuencias diana hibridan con una sonda que corresponde perfectamente. Véase Sambrook y col., supra, página 9,51.

Para los fines del presente documento, se definen “condiciones de alta rigurosidad” para la hibridación en fase de solución como hibridación acuosa (es decir, sin formamida) en SSC 6X (donde SSC 20X contiene NaCl 3,0 M y citrato sódico 0,3 M), SDS al 1 % a 65 ºC durante 8-12 horas, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 65 ºC durante 20 minutos. Se apreciará por el experto en la materia que la hibridación a 65 ºC se producirá a diferentes velocidades dependiendo de varios factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que están hibridando.

El término “mutado”, cuando se aplica a secuencias de ácido nucleico indica que en una secuencia de ácido nucleico pueden insertarse, delecionarse o cambiarse nucleótidos en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia. Una única alteración puede realizarse en un locus (una mutación puntual) o pueden insertarse, delecionarse o cambiarse múltiples nucleótidos en un solo locus. Además, puede realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico puede mutarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica incluyendo pero sin limitación técnicas de mutagénesis tales como “PCR propensa a error” (un procedimiento para realizar PCR en condiciones en las que la fidelidad de copia de la ADN polimerasa es baja, de tal forma que se obtiene una alta proporción de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud entera del producto de PCR. Véase, por ejemplo, Leung y col. (1989) Technique 1:11-15 y Caldwell y Joyce (1992) PCR Methods Aplic. 2:28-33); y “mutagénesis dirigida a oligonucleótido” (un procedimiento que permite la generación de mutaciones específicas de sitio en cualquier segmento de ADN clonado de interés. Véase, por ejemplo, Reid pelo-Olson y col (1988) Science 241:53-57). El término “vector” como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral (analizado con más detalle más adelante). Ciertos vectores pueden realizar replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de esta manera se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores preferidos pueden dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión”).

Las secuencias de control de la expresión “unidas operativamente” se refieren a una asociación en la que la secuencia de control de la expresión es contigua al gen de interés para controlar el gen de interés, así como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

La expresión “secuencia de control de la expresión” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para afectar a la expresión de secuencias codificantes a las que están unidos operativamente. Las secuencias de control de la expresión son secuencias que controlan la transcripción, acontecimientos post-transcripcionales y la traducción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de inicio de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras, señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación, secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico, secuencias que aumentan la eficacia de traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas); secuencias que aumentan la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desea, secuencias que aumentan la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas y secuencia de terminación de la transcripción. La expresión “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias compañeras de fusión.

La expresión “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”), como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico tal como un vector recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden hacer referencia no sólo a la célula u objeto particular, sino a la descendencia de dicha célula. Como pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones posteriores debido a cualquier mutación o influencia ambiental, dicha descendencia, efectivamente, puede no ser idéntica a la célula parental, pero se siguen incluyendo dentro del alcance de la expresión “célula huésped” como se usa en el presente documento. Una célula huésped recombinante puede ser una célula o línea celular aislada desarrollada en cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismos vivos.

El término “péptido”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que normalmente tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y más normalmente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. El término como se usa en el presente documento incluye análogos y miméticos que imitan la función estructural y por lo tanto la función biológica.

El término “polipéptido”, como se usa en el presente documento, incluye tanto proteínas naturales como proteínas no naturales, y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de los mismos. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender varios dominios diferentes de los que cada uno tiene uno o más actividades distintas.

La expresión “proteína aislada” o “polipéptido aislado” es una proteína o polipéptido que gracias a su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes naturales que lo acompañan en su estado nativo, (2) cuando existe en una pureza no encontrada en la naturaleza, donde puede declararse pureza con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, carece de otras proteínas de la misma especie) (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido encontrado en la naturaleza o incluye análogos o derivados de aminoácidos no encontrados en la naturaleza o enlaces distintos de los enlaces peptídicos convencionales). De esta manera, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que procede naturalmente se “aislará” de sus componentes asociados naturalmente. Un polipéptido o proteína también puede volverse sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en este campo Como se define de esta manera, “aislado” no necesariamente requiere que la proteína, polipéptido, péptido u oligopéptido descrito de esta manera se haya retirado físicamente de su entorno nativo.

El término “fragmento de polipéptido” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con un polipéptido de longitud completa. En una realización preferida, el fragmento de polipéptido es una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoácidos

o el fragmento es idéntico a las posiciones correspondientes en la secuencia natural. Los fragmentos normalmente tienen una longitud de al menos 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 12, 14, 16 ó 18 aminoácidos, más preferentemente una longitud de al menos 20 aminoácidos, más preferentemente una longitud de al menos 25, 30, 35, 40 ó 45 aminoácidos, incluso más preferentemente una longitud de al menos 50 ó 60 aminoácidos e incluso más preferentemente una longitud de al menos 70 aminoácidos.

Un “derivado modificado” se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en la secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en el polipéptido nativo. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, marcaje, por ejemplo, con radionuclidos y diversas modificaciones enzimáticas, como apreciarán fácilmente los expertos en la materia. En la técnica se conocen bien una diversidad de procedimientos para marcar polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles para tales fines, e incluyen isótopos radiactivos tales como 125I, 32P, 3SS y 3H, ligandos que se unen a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y antiligandos que pueden servir como miembros de pares de unión específicos para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el cebador, requisitos de estabilidad, y la instrumentación disponible. En la técnica son bien conocidos los procedimientos para marcar polipéptidos. Véase Ausubel y col, current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002), incorporado en el presente documento por referencia.

Un “mutante de polipéptido” o “muteína” se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción, duplicación, deleción, redisposición o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo silvestre. Una muteína puede tener una o más mutaciones o sustituciones puntuales de aminoácidos, en la que un solo aminoácido en una posición se ha cambiado por otro aminoácido, una o más inserciones y/o deleciones, en la que se han insertado o delecionado respectivamente uno o más aminoácidos en la secuencia de la proteína natural, y/o truncamientos de la secuencia de aminoácidos en el extremo amino, carboxi o en ambos extremos. Una muteína puede tener la misma actividad biológica en comparación con la proteína natural, pero preferentemente tiene una actividad biológica diferente.

Una muteína tiene al menos un 70 % de homología de secuencia total con su homólogo de tipo silvestre. Incluso se prefieren más las muteínas que tienen un 80 %, 85 % o 90 % de homología de secuencia total con la proteína de tipo silvestre. En una realización incluso más preferida, una muteína presenta un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente un 97 %, incluso más preferentemente un 98 % e incluso más preferentemente un 99 % de identidad de secuencia total. La homología de secuencia puede medirse por cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, tal como Gap o Bestfit.

Son sustituciones de aminoácidos preferidas aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran la afinidad de unión o la actividad enzimática y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos.

Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). También pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como ácidos α, α-disustituidos, N-alquil aminoácidos y otros aminoácidos no convencionales. Los Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N, N, N-trimetillisina, εN-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina-, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación en polipéptidos usada en el presente documento, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso convencional y la convención.

Una proteína tiene “homología” o es “homóloga” a una segunda proteína si la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Como alternativa, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos “similares”. (De esta manera, la expresión “proteínas homólogas” se define para hacer referencia a que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares). En una realización preferida, una proteína homóloga es una que presenta un 60 % de homología de secuencia con la proteína de tipo silvestre, es más preferida una homología de secuencia del 70 %. Incluso son más preferidas proteínas homólogas que presentan un 80 %, 85 % o 90 % de homología de secuencia con la proteína de tipo silvestre. En otra realización aún más preferida, una proteína homóloga presenta un 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Como se usa en el presente documento, la homología entre dos regiones de secuencias de aminoácidos (especialmente con respecto a las similitudes estructurales previstas) se interpreta como que implica similitud en función.

Cuando “homólogo” se usa en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que el resto en posiciones que no son idénticas con frecuencia difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es una en la que un resto de aminoácidos se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los expertos en la materia conocen bien medios para realizar este ajuste (véase, por ejemplo, Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98).

Cada uno de los siguientes seis grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) serina (S), treonina (T), 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), 3) asparagina (N), glutamina (Q), 4) arginina (R), lisina (K), 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), alanina (A), valina (V) y 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

La homología de secuencia para polipéptidos, que también se denomina porcentaje de identidad de secuencia, normalmente se mide usando un software de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group (GCG) University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares usando medidas de homología asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1.

Un algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de molécula inhibidora con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST (Altschul y col (1990) J. Mol Biol. 215:403-410,. Gish y States (1993) Nature Genet 3:266-272; Madden y col (1996) Meth Enzymol 266:131-141; Altschul y col (1997) Nucleic Acids Res.25 :3389-3402; Zhang y Madden (1997) Genoma Res. 7:649656), especialmente blastp o tblastn (Altschul y col, 1997). Son parámetros preferidos para BLASTp: valor de expectación: 10 (por defecto) filtro: seg (por defecto) coste para abrir un hueco: 11 (por defecto), coste para extender un hueco: 1 (por defecto), alineamientos Máx: 100 (por defecto ) tamaño de palabra: 11 (por defecto), nº de descripciones: 100 (por defecto) matriz de penalización: BLOWSLTM62.

La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas con respecto a la homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 restos de aminoácidos, normalmente de al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente de al menos aproximadamente 24 restos, normalmente de al menos aproximadamente 28 restos y preferentemente de más de aproximadamente 35 restos. Cuando se explora una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos. La exploración de bases de datos usando secuencias de aminoácidos puede medirse por algoritmos distintos del blastp conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden compararse secuencias polipeptídicas usando FASTA, un programa en GCG versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (véase Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos puede determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), como se proporciona en GCG Versión 6.1.

La expresión “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento acoplado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles porque pueden construirse para que contengan dos o más elementos funcionales deseados de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferentemente al menos 20 ó 30 aminoácidos, incluso más preferentemente al menos 40, 50 ó 60 aminoácidos, aún más preferentemente al menos 75, 100 ó 125 aminoácidos. Las proteínas de fusión pueden producirse de forma recombinante construyendo una secuencia de ácido nucleico que codifique el polipéptido o un fragmento del mismo en fase con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido diferente y después expresando la proteína de fusión. Como alternativa, una proteína de fusión puede producirse químicamente por entrecruzamiento del polipéptido o un fragmento del mismo a otra proteína.

El término “región”, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región se define por una parte contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

El término “dominio” como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden ser co-extensivos con regiones o partes de los mismos; los dominios también pueden incluir regiones distintas no contiguas de una biomolécula. Los Ejemplos de dominios de proteínas incluyen, pero sin limitación, un dominio Ig, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico.

Como se usa en el presente documento, el término “molécula” significa cualquier compuesto, incluyendo pero sin limitación una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc., y dicho compuesto puede ser natural o sintético.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. A continuación se describen procedimientos y materiales ejemplares, aunque también pueden usarse en la práctica de la presente invención procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento y serán evidentes para los expertos en la materia.

En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones prevalecerán. Los materiales, procedimientos y Ejemplos son sólo ilustrativos y no deben considerarse limitantes.

A lo largo de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, se entenderá que la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende” implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

Procedimientos para producir glicoproteínas de tipo humano en células huésped y eucarióticas inferiores

La presente invención proporciona procedimientos para producir una glicoproteína que tiene glicosilación de tipo humano en una célula huésped de hongo unicelular y pluricelular. Como se describe con más detalle más adelante, una célula huésped de hongo unicelular y pluricelular que no se expresa de forma natural, o que se ha modificado por ingeniería genética para que no exprese, una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras de alto contenido de manosa se selecciona como célula huésped de partida. Dicha célula huésped seleccionada se modifica por ingeniería genética para expresar una o más enzimas u otros factores necesarios para producir glicoproteínas de tipo humano. Una cepa huésped deseada puede modificar por ingeniería genética una enzima o más de una enzimas a la vez. Además, una molécula de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades puede usarse para modificar por ingeniería genética una cepa huésped de la invención. Preferentemente, una biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codifica enzimas potencialmente útiles (por ejemplo, enzimas quiméricas que comprenden un fragmento de enzima catalíticamente activo ligado en fase a una secuencia de dirección subcelular heteróloga) se crea (por ejemplo, por ligamiento de sub-bibliotecas que comprenden fragmentos enzimáticos y secuencias de dirección subcelulares) y una cepa que tiene una o más enzimas con actividades óptimas o que produce la mayor cantidad de glicoproteínas “de tipo humano” puede seleccionarse transformando células huésped diana con uno o más miembros de la biblioteca.

En particular, los procedimientos descritos en el presente documento permiten obtener, in vivo, estructuras de Man5GlcNAc2 con un alto rendimiento, al menos transitoriamente, con el objetivo de modificarlas adicionalmente para producir N-glicanos complejos. Un esquema satisfactorio para obtener estructuras de Man5GlcNAc2 adecuadas en rendimientos apropiados en una célula huésped, tal como un organismo eucariota inferior, generalmente implica dos enfoques paralelos: (1) reducción de estructuras de alto contenido de manosa obtenidas por actividades manosiltransferasas endógenas, si las hay y (2) retirada de 1,2-α-manosa por manosidasas para producir altos niveles de estructuras de Man5GlcNAc2 adecuadas que pueden hacerse reaccionar adicionalmente dentro de la célula huésped para formar glicoformas de tipo humano complejas.

Por consiguiente, una primera etapa implica la selección o creación de una célula huésped eucariótica, por ejemplo, un eucariota inferior, capaz de producir una estructura precursora específica de Man5GlcNAc2 que puede aceptar GlcNAc in vivo mediante la acción de una GlcNAc transferasa I (“GnTI”). En una realización, el procedimiento implica producir o usar una célula huésped eucariota no humana con la actividad 1,6 manosiltransferasa reducida con respecto al N-glicano en una glicoproteína. Preferentemente, en la célula huésped se reduce una actividad 1,6 manosiltransferasa de iniciación (véase más adelante). Dicha célula huésped carecerá de una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras de alto contenido de manosa que son indeseables para producir glicoproteínas de tipo humano.

Después se introducen una o más actividades enzimáticas en dicha célula huésped para producir N-glicanos dentro de la célula huésped caracterizados porque tienen al menos un 30 % en moles de las estructuras de carbohidrato Man5GlcNAc2 (“Man5”). Se necesitan estructuras de Man5GlcNAc2 para la formación de N-glicanos complejos: Man5GlcNAc2 tiene que formarse in vivo en un alto rendimiento (por ejemplo, por encima del 30 %), al menos transitoriamente, ya que las reacciones de glicosilación de tipo de mamífero y humano posteriores requieren Man5GlcNAc2 o un derivado del mismo.

Esta etapa también requiere la formación de una estructura isomérica particular de Man5GlcNAc2 dentro de la célula con un alto rendimiento. Aunque se necesitan estructuras de Man5GlcNAc2 para la formación de N-glicanos complejos, su presencia de ningún modo es suficiente. Esto es porque Man5GlcNAc2 puede aparecer en diferentes formas isoméricas, que pueden servir o no como sustrato para Ia GlcNAc transferasa I. Como la mayoría de las reacciones de glicosilación no se completan, una proteína glicosilada particular generalmente contiene una serie de estructuras de carbohidrato diferentes (es decir, glicoformas) en su superficie. De esta manera, la mera presencia de cantidades muy pequeñas (es decir, menos del 5 %) de una estructura particular tal como Man5GlcNAc2 tiene poca relevancia práctica para producir glicoproteínas del tipo de mamífero o de tipo humano. Es la formación de un intermedio de Man5GlcNAc2 que acepta GlcNAc transferasa I (Figura 1B) en alto rendimiento (es decir, por encima del 30 %) lo que se requiere. La formación de este intermedio es necesaria para permitir la posterior síntesis in vivo de N-glicanos complejo en sobre proteínas glicosiladas de interés (proteínas diana).

Por consiguiente, algunos o todos los Man5GlcNAc2 producidos por la célula huésped seleccionada tienen que ser un sustrato productivo para actividades enzimáticas a lo largo de una ruta de glicosilación de mamífero, por ejemplo, pueden servir como sustrato para una actividad GlcNAc transferasa I in vivo, formando de esta manera el intermedio de N-glicano de tipo humano GlcNAcMan5GlcNAc2 en la célula huésped. En una realización preferida, al menos un 10 %, más preferentemente al menos un 30 % y aún más preferentemente un 50 % o más del intermedio de Man5GlcNAc2 producido en la célula huésped de la invención es un sustrato productivo para GnTI in vivo. Se entiende que si, por ejemplo, se produce GlcNAcMan5GlcNAc2 se produce a un 10 % y Man5GlcNAc2 se produce a un 25 % en una proteína diana, la cantidad total de Man5GlcNAc2 producido transitoriamente es del 35 % porque GlcNAcMan5GlcNAc2 es un producto de Man5GlcNAc2.

Un experto habitual en la técnica puede seleccionar células huésped de la naturaleza, por ejemplo, hongos existentes u otros eucariotas inferiores que producen niveles significativos de Man5GlcNAc2 in vivo. Sin embargo, por el momento ningún eucariota inferior ha mostrado proporcionar dichas estructuras in vivo por encima del 1,8 % de los N-glicanos totales (véase, por ejemplo, Maras y col (1997) Eur. J. Biochem. 249:701-707). Como alternativa, dichas células huésped pueden modificarse por ingeniería genética para producir la estructura Man5GlcNAc2 in vivo. Pueden usarse procedimientos tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 para identificar la ausencia o presencia de glicosiltransferasas particulares, manosidasas y transportadores de nucleótidos de azúcar en un organismo o célula huésped diana de interés.

Inactivación de enzimas de glicosilación de la célula huésped indeseables

Los procedimientos de la invención se refieren a la obtención de células huésped que producen glicoproteínas que tienen estructuras de N-glicano alteradas, y preferentemente de tipo humano. En una realización preferida, los procedimientos se dirigen a la obtención de células huésped en las que los precursores de oligosacáridos están enriquecidos en Man5GlcNAc2. Preferentemente, se usa una célula huésped eucariota que no expresa una o más enzimas implicadas en la producción de estructuras de alto contenido de manosa. Dicha célula huésped puede encontrarse en la naturaleza o puede modificarse por ingeniería genética, por ejemplo, partiendo de o a partir de uno de muchos de los mutantes ya descritos en levaduras. De esta manera, dependiendo de la célula huésped seleccionada, tendrán que delecionarse uno o varios genes que codifican enzimas que se sabe que son características de reacciones de glicosilación no humanas. Dichos genes y sus proteínas correspondientes se han caracterizado extensivamente en varios eucariotas inferiores (por ejemplo, S. cerevisiae, T. reesei, A. nidulans, etc.), proporcionando de esta manera una lista de glicosiltransferasas conocidas en eucariotas inferiores, sus actividades y sus secuencia genética respectiva. Probablemente estos genes se seleccionarán entre el grupo de manosiltransferasas, por ejemplo 1,3 manosiltransferasas (por ejemplo, MNN1 en S. cerevisiae) (Graham, 1991), 1,2 manosiltransferasas (por ejemplo, la familia KTRIKRE de S. cerevisiae), 1,6 manosiltransferasas (OCH1 de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores (MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas en reacciones de glicosilación aberrantes, es decir, no humanas. Muchos de estos genes efectivamente se han delecionado individualmente dando lugar a fenotipos viables con perfiles de glicosilación alterados. Los Ejemplos se muestran en la Tabla 1.

Las células huésped y eucariotas inferiores preferidas de la invención, como se describe en el presente documento para ejemplificar las etapas de manipulación requeridas, son mutantes de hipermanosilación-menos (och1) de Pichia pastoris o K. lactis. Al igual que otros eucariotas inferiores, P. pastoris procesa las estructuras de Man9GlcNAc2 en el RE con una α-1,2-manosidasa para producir Man8GlcNAc2 (Figura 1A). Mediante la acción de varias manosiltransferasas, esta estructura después se convierte en estructuras hipermanosiladas (Man>9GlcNAc2), también conocidas como mananos (Figura 35A). Además, se ha descubierto que P. pastoris puede añadir grupos fosfato no terminales, mediante la acción de manosilfosfato transferasas, en la estructura de carbohidratos. Esto difiere de las reacciones realizadas en células de mamífero, que implican la retirada en lugar de la adición de azúcares de manosa (Figura 35A). Tiene una importancia particular para eliminar la capacidad de la célula huésped eucariótica, por ejemplo, hongo, para hipermanosilar una estructura Man8GlcNAc2 existente. Esto puede conseguirse seleccionando una célula huésped que no hipermanosile u obteniendo por ingeniería genética dicha célula.

Se han identificado genes que están implicados en el proceso de hipermanosilación, por ejemplo, en Pichia pastoris y creando mutaciones en estos genes, se puede reducir la producción de glicoformas “indeseables”. Dichos genes pueden identificarse por homología con manosiltransferasas existentes o sus reguladores (por ejemplo, OCH1, MNN4, MNN6, MNN1) encontrados en otros eucariotas inferiores tales como C. albicans, Pichia angusta o S. cerevisiae o mediante mutagénesis de la cepa huésped y selección de un fenotipo de glicosilación con manosilación reducida. Basándose en homologías entre manosiltransferasas conocidas y manosilfosfato transferasas, se pueden diseñar cebadores de PCR (de los que se muestran Ejemplos en la Tabla 2), o usar genes o fragmentos génicos que codifican dichas enzimas como sondas para identificar homólogos en bibliotecas de ADN de la diana o un organismo relacionado. Como alternativa, se puede identificar un homólogo funcional que tenga actividad

5 manosiltransferasa por su capacidad de complementar fenotipos de glicosilación particulares en organismos relacionados.

Tabla 2. Cebadores de PCR

Cebador de PCR A

Cebador de PCR B Gen (es) Diana en P. pastoris Homólogos

ATGGCGAAGGCA GATGGCAGT (SEC ID Nº: 3)

TTAGTCCTTCCAA CTTCCTTC (SEC ID Nº: 4) 1,6-manosiltransferasa OCH1 S. cerevisiae, Pichia albicans

TAYTGGMGNGTN GARCYNGAYATH AA (SEC ID Nº: 5)

GCRTCNCCCCANC KYTCRTA (SEC ID Nº: 6) 1,2 manosiltransferasa Familia KTR/KRE, S. cerevisiae

Leyenda: M = A o C, R = A o G, W = A o T, S = C o G, Y= C o T, K = G o T, V = A o C o G, H = A o C o T, D = A o G o T, B = C o G o T, N = G o A o T o C.

Para obtener el gen o genes que codifican la actividad 1,6-manosiltransferasa en P. pastoris, por ejemplo, se

10 realizarían las siguientes etapas: los mutantes OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a la temperatura y crecen lentamente a temperaturas elevadas. Por lo tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante OCH1 de S. cerevisiae con una biblioteca de ADN o ADNc de P. pastoris. Se dispone de mutantes de S. cerevisiae, por ejemplo, de Stanford University, y están disponibles en el mercado en ResGen, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Los mutantes que presentan un fenotipo de crecimiento normal a

15 temperatura elevada, después de haberse transformado con una biblioteca de ADN de P. pastoris, probablemente llevarán un homólogo OCH1 de P. pastoris. Dicha biblioteca puede crearse por digestión parcial de ADN cromosómico de P. pastoris con una enzima de restricción adecuada y, después de inactivar la enzima de restricción, ligamiento del ADN digerido en un vector adecuado, que se ha digerido con una enzima de restricción compatible.

20 Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, pRS314, un plásmido de bajo número de copias (CEN6/ARS4) basado en pBluescript que contiene el marcador Trp1 (Sikorski y Hieter (1989) Genetics 122:19-27) y pFL44S, un plásmido de alto número de copias (2 µ) basado en un pUC19 modificado que contiene el marcador URA3 (Bonneaud y col (1991) Yeast 7:609-615). Dichos vectores se usan comúnmente por investigadores académicos y están disponibles vectores similares en varios vendedores diferentes (por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad, CA)),

25 Pharmacia (Piscataway, NJ), New England Biolabs (Beverly, MA)). Otros Ejemplos incluyen pYES/GS, origen de replicación de 2 µ basado en el plásmido de expresión de levadura de Invitrogen, o el vehículo de clonación Yep24 de New England Biolabs

Después del ligamiento del ADN cromosómico y el vector, se puede transformar la biblioteca de ADN en una cepa de S. cerevisiae con una mutación específica y seleccionar la corrección del fenotipo correspondiente. Después de

30 subclonar y secuenciar el fragmento de ADN que puede restaurar el fenotipo de tipo silvestre, se puede usar este fragmento para eliminar la actividad del producto génico codificado por OCH1 en P. pastoris usando mutagénesis in vivo y/o técnicas de recombinación bien conocidas por los expertos en la materia.

Como alternativa, si la secuencia genómica entera de una célula huésped particular, por ejemplo hongo, de interés se conoce, se puede identificar dichos genes simplemente explorando bases de datos de ADN disponibles para el 35 público, que están disponibles en varias fuentes, tales como NCBI, Swissprot. Por ejemplo, explorando una secuencia genómica dada o una base de datos con secuencias de un gen de 1,6 manosiltransferasa conocido (por ejemplo, OCH1 de S. cerevisiae), se pueden identificar genes de alta homología en dicho genoma de célula huésped que puede codificar (pero no lo hace necesariamente) proteínas que tienen actividad 1,6-manosiltransferasa. La homología de secuencias de ácido nucleico sola, sin embargo, no es suficiente para demostrar que se ha

40 identificado y aislado un homólogo que codifica una enzima que tiene la misma actividad. Hasta la fecha, por ejemplo, no existen datos que demuestren que una deleción de OCH1 en P. pastoris elimina la actividad 1,6manosiltransferasa de iniciación crucial (Martinet y col (1998) Biotech. Letters 20 (12) :1171-1177, Contreras y col documento WO 02/00856 A2). De esta manera, ningún dato demuestra que el homólogo del gen OCH1 de P. pastoris codifique esa función. Esta demostración se proporciona por primera vez en el presente documento.

45 Se han identificado homólogos de varias manosiltransferasas de S. cerevisiae en P. pastoris usando estos enfoques. Los genes homólogos con frecuencia tienen funciones similares a los genes implicados en la manosilación de proteínas en S. cerevisiae y, por lo tanto, su deleción puede usarse para manipular el patrón de glicosilación en P. pastoris o, por analogía, en cualquier otra célula huésped, por ejemplo, células fúngicas, vegetales, de insectos o animales, con rutas de glicosilación similares.

La creación de knock-outs de genes, una vez que se ha determinado una secuencia de gen diana dada, es una técnica bien establecida en este campo y puede realizarse por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Rothstein (1991) Methods in Enzymology 194:281). La elección de un organismo huésped puede verse influenciada por la disponibilidad de buenas técnicas de transformación y alteración de genes.

Si se van a inactivar varias manosiltransferasas, el procedimiento desarrollado por Alani y Kleckner (1987) Genetics

116: 541-545, por ejemplo, permite el uso repetido de un marcador de selección, por ejemplo, el marcador URA3 en levadura, para eliminar secuencialmente toda la actividad manosiltransferasa endógena indeseable. Esta técnica se ha refinado por otros, pero básicamente implica el uso de dos secuencias de ADN repetidas, que flanquean un marcador de contraselección. Por ejemplo: URA3 puede usarse como marcador para asegurar la selección de un transformante que tiene integrada una construcción. Flanqueando el marcador URA3 con repeticiones directas se pueden seleccionar primero los transformantes que han integrado la construcción y de esta manera que han alterado el gen diana. Después del aislamiento de los transformantes y su caracterización, se puede contraseleccionar en una segunda vuelta los que son resistentes a ácido 5-fluoroorótico (5-FOA). Las colonias que pueden sobrevivir en placas que contienen 5-FOA han perdido el marcador URA3 de nuevo a través de un acontecimiento cruzado en el que están implicadas las repeticiones mencionadas anteriormente. Este enfoque de esta manera permite el uso repetido del mismo marcador y facilita la alteración de múltiples genes sin requerir marcadores adicionales. También pueden usarse técnicas similares para la eliminación secuencial de genes adaptadas para uso en otras células huésped eucariotas con otros marcadores de selección y contraselección.

La eliminación de manosiltransferasas específicas, tales como 1,6 manosiltransferasa (OCH1) o manosilfosfato transferasas (MNN6, o genes que complementan mutantes lbd) o reguladores (MNN4) en P. pastoris permite crear cepas de este organismo modificadas por ingeniería genética que sintetizan principalmente Man8GlcNAC2 y que pueden usarse para modificar adicionalmente el patrón de glicosilación para que se parezca a estructuras de glicoformas más complejas, por ejemplo, las producidas en células de mamíferos, por ejemplo, en células humanas. Una realización preferida de este procedimiento usa secuencias de ADN que codifican actividades de glicosilación bioquímicas para eliminar funciones bioquímicas similares o idénticas en P. pastoris para modificar la estructura de glicosilación de glicoproteínas producidas en la cepa de P. pastoris alterada genéticamente.

Los procedimientos usados para modificar por ingeniería genética la ruta de glicosilación en levaduras como se ejemplifica en el presente documento pueden usarse en hongos filamentosos para producir un sustrato preferido para una modificación posterior. Pueden desarrollarse estrategias para modificar rutas de glicosilación en A. niger y otros hongos filamentosos, por ejemplo, usando protocolos análogos a los descritos en el presente documento para modificar por ingeniería genética cepas para producir glicoproteínas de tipo humano en levaduras. Las actividades génicas indeseadas implicadas en la actividad 1,2 manosiltransferasa, por ejemplo, homólogos de KTRIKRE, se modifican o eliminan. Un hongo filamentoso, tal como Aspergillus, es un huésped preferido porque carece de la actividad 1,6 manosiltransferasa y como tal, no sería de esperar una actividad génica de hipermanosilación, por ejemplo, OCH1 en este huésped. Por el contrario, usando los procedimientos de dirección de la invención se introducen en el huésped otras actividades deseadas (por ejemplo, α-1,2-manosidasa, transportador UDP-GlcNAc, glicosiltransferasa (GnT), galactosiltransferasa (GaIT) y sialiltransferasa (ST)) implicadas en la glicosilación.

Obtención por ingeniería genética o selección de huéspedes que tienen disminuida la actividad α-1,6 manosiltransferasa de iniciación

En una realización preferida, el procedimiento de la invención implica la obtención o uso de una célula huésped que tiene disminuida o anulada la actividad de una α-1,6-manosiltransferasa de iniciación, es decir, una enzima específica de iniciación que inicia la manosilación de la cadena externa en el brazo α-1,3 de la estructura central de Man3GlcNAc2. En S. cerevisiae, esta enzima se codifica por el gen OCH1. La alteración del gen OCH1 en S. cerevisiae da como resultado un fenotipo en los que N-azúcares carecen completamente de la cadena externa de poli-manosa. Los enfoques previos para obtener glicosilación de tipo de mamífero en cepas fúngicas han requerido la inactivación de OCH1 (véase, por ejemplo, Chiba et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 26298-304). La alteración de la actividad de α-1,6-manosiltranferasa de iniciación en una célula huésped de la invención puede ser opcional, sin embargo (dependiendo de la célula huésped seleccionada) ya que la enzima Och1p requiere un Man8GlcNAc2 intacto para una iniciación eficaz de la cadena externa de manosa. De esta manera, las células huésped seleccionadas o producidas de acuerdo con la presente invención que acumulan oligosacáridos que tienen siete o menos restos de manosa pueden producir N-glicanos hipoglicosilados que probablemente serán manos sustratos para Och1p (véase, por ejemplo, Nakayama et al. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).

El gen OCH1 se clonó a partir de P. pastoris (Ejemplo 1) y K. lactis (Ejemplo 9) como se describe. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos del gen OCH1 de K. lactis se exponen en las SEC ID Nº: 7 y 8. Usando cebadores específicos de genes, se preparó una construcción de cada clon para delecionar el gen OCH1 del genoma de P. pastoris y K. lactis (Ejemplos 1 y 9, respectivamente). De esta manera se obtuvieron células huésped que tenían eliminada la actividad α-1,6-manosiltransferasa de iniciación y modificadas por ingeniería genética para producir N-glicanos que tenían una estructura de carbohidratos Man5GlcNAc2 (véanse, por ejemplo, las Figuras 5,6 y 12; Ejemplos 4 y 9).

De esta manera, en el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o que consiste en al menos cuarenta y cinco, preferentemente al menos 50, más preferentemente al menos 60 y aún más preferentemente 75 o más restos nucleotídicos del gen OCH1 de K. lactis (SEC ID Nº: 7) y homólogos, variantes y derivados de los mismos. También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma similar, se proporcionan polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. También se describen en el presente documento vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden las moléculas de ácido nucleico anteriores de la invención, como se describe adicionalmente en el presente documento. De forma similar, se proporcionan células huésped transformadas con las moléculas de ácido nucleico o vectores descritos en el presente documento.

La presente invención proporciona además procedimientos para producir o usar una célula huésped de hongo unicelular y pluricelular con una actividad del gen alg disminuida o anulada (es decir, actividades alg, incluyendo actividades enzimáticas equivalentes en células huésped no fúngicas) e introducir en la célula huésped al menos una actividad glicosidasa. En una realización preferida, la actividad glicosidasa se introduce causando la expresión de una o más actividades manosidasa dentro de la célula huésped, por ejemplo, por activación de una actividad manosidasa, o por expresión de una molécula de ácido nucleico de una actividad manosidasa, en la célula huésped.

En otra realización, el procedimiento implica producir o usar una célula huésped en la que se ha disminuido o anulado la actividad de una o más enzimas que transfieren un resto de azúcar al brazo 1,6 de precursores de oligosacáridos unidos a lípidos (Figura 13). Una célula huésped de la invención se selecciona o se modifica por ingeniería genética introduciendo una mutación en uno o más de los genes que codifican una enzima que transfiere un resto de azúcar (por ejemplo, manosilatos) al brazo 1,6 de un precursor de oligosacáridos unido a lípidos. El resto de azúcar más preferentemente es manosa, preferentemente es una glucosa, GlcNAc, galactosa, ácido siálico, mucosa o un resto de GlcNAc fosfato. En una realización preferida, la actividad de una o más enzimas que manosilan el brazo 1,6 de precursores de oligosacáridos unidos a lípidos se disminuye o se anula. El procedimiento puede comprender además la etapa de introducir en la célula huésped al menos una actividad glicosidasa (véase más adelante).

En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para proporcionar una glicoproteína de tipo humano en un huésped no humano, en el que la glicoproteína comprende un N-glicano que tiene al menos dos GlcNAc unidas a una estructura central de trimanosa.

En cada una de las realizaciones anteriores, el procedimiento se dirige a producir una célula huésped en la que los precursores de oligosacáridos unidos a lípidos están enriquecidos en las estructuras de ManxGlcNAc2, donde X es 3, 4 ó 5 (Figura 14). Estas estructuras se transfieren en el RE de la célula huésped sobre cadenas polipeptídicas nacientes por una oligosacaril-transferasa y después pueden procesarse por tratamiento con glicosidasas (por ejemplo, α-manosidasas) y glicosiltransferasas (por ejemplo, GnT1) para producir N-glicanos que tienen estructuras centrales de GlcNAcManxGlcNAc2, en las que X es 3, 4 ó 5, y preferentemente es 3 (Figuras 14 y 15). Como se muestra en la Figura 14, los N-glicanos que tienen una estructura central de GlcNAcManxGlcNAc2, en la que X es mayor que 3 pueden convertirse en GlcNAcMan3GlcNAc2, por ejemplo, por tratamiento con una actividad α-1,3 y/o α-1,2-1,3 manosidasa, cuando sea aplicable.

El procesamiento adicional de GlcNAcMan3GlcNAc2 por tratamiento con glicosiltransferasas (por ejemplo, GnTII) produce estructuras centrales de GlcNAcMan3GlcNAc2 que después pueden modificarse, cuando se desee, por ejemplo, por tratamiento ex vivo o por expresión heteróloga en la célula huésped de una serie de enzimas de glicosilación, incluyendo glicosiltransferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante) para convertirse en N-glicanos de tipo humano. Las glicoproteínas de tipo humano preferidas que pueden producirse de acuerdo con la invención incluyen las que comprenden N-glicanos que tienen siete omenos, o tres o menos, restos de manosa; comprenden uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste en galactosa, GlcNac, ácido sialico y mucosa; y comprenden al menos una ramificación de oligosacáridos que comprende la estructura NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man.

En una realización, la célula huésped tiene disminuida o anulada la actividad Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol Manosiltransferasa, que es una actividad implicada en la primera etapa de manosilación de Man5GlcNAc2-PP-Dol a Man6GlcNAc2-PP-Dol en el lado luminal del RE (por ejemplo, ALG3 Figura 13; Figura 14). En S. cerevisiae, esta enzima se codifica por el gen ALG3. Como se ha descrito anteriormente, las células de S. cerevisiae que llevan una mutación alg3-1 con fugas acumulan Man5GlcNAc2-PP-Dol y las células que tienen una deleción en alg3 parecen transferir estructuras Man5GlcNAc2 a cadenas polipeptídicas nacientes dentro del RE. Por consiguiente, en esta realización, las células huésped acumularán N-glicanos enriquecidos en estructuras de Man5GlcNAc2 que después pueden convertirse en GlcNAc2Man3GleNAc2 por tratamiento con glicosiladas (por ejemplo, con actividades α-1,2manosidasa, α-1,3-manosidasa o α-1,2-1,3-manosidasa) y actividades glicosiltransferasas (por ejemplo, Inti, GnTII) (Figura 14; Figura 35B).

Como se describe en el Ejemplo 10, se diseñaron cebadores degenerados basándose en el alineamiento de secuencias de la proteína Alg3 de S. cerevisiae, D. melanogaster y seres humanos (H. sapiens) (Figuras 16 y 17)y se usaron para amplificar un producto del ADN genómica de P. pastoris. El producto de PCR resultante se usó como sonda para identificar y aislar un clon genómico de P. pastoris que comprendía una marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia total del 35 % y una similitud de secuencia del 53 % con el gen ALG3 de S. cerevisiae (Figuras 18 y 19). Este gen de P. pastoris se denomina en el presente documento “PpALG2”. El gen ALG3 se identificó de forma similar y se aisló a partir de K. lactis (Ejemplo 10; Figuras 20 y 21).

De esta manera, esta memoria descriptiva describe también una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en al menos cuarenta y cinco, preferentemente al menos 50, más preferentemente al menos 60 y aún más preferentemente 75 o más restos nucleotídicos del gen ALG3 de P. pastoris (Figura 18) y el gen ALG3 de K. lactis (Figura 20) y homólogos, variantes y derivados de la misma. También se describen moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma similar, se describen polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico (en las Figuras 18 y 20 se muestran productos del gen ALG3 de P. pastoris y K. lactis). Además, también se describen vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden dicha molécula de ácido nucleico, como se describe adicionalmente en el presente documento.

Usando cebadores específicos de gen, se fabricó una construcción para delecionar el gen PpALG3 del genoma de

P. pastoris (Ejemplo 10). Esta cepa se usó para generar una célula huésped con la actividad Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol Manosiltransferasa anulada y produce precursores de Man5GlcNAc2-PP-Dol unidos a lípidos que se transfieren a cadenas polipeptídicas nacientes para producir N-glicanos que tienen una estructura de carbohidratos Man5GlcNAc2.

Como se describe en el Ejemplo 11, dicha célula huésped puede modificarse por ingeniería genética por expresión de manosidasas apropiadas para producir N-glicanos que tiene la estructura de carbohidratos central Man3GlcNAc2 deseada. La expresión de GnT en la célula huésped (por ejemplo, por dirección de una molécula de ácido nucleico o una biblioteca de moléculas de ácido nucleico como se describe más adelante) permite que la célula huésped modificada produzca N-glicanos que tienen una o dos estructuras de GlcNAc unidas a cada brazo de la estructura central de Man3 (es decir, GlcNAc1Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 o GlcNAc3Man3GlcNAc2; véase la Figura 15). Estas estructuras pueden procesarse adicionalmente usando los procedimientos de la invención para producir N-glicanos de tipo humano sobre proteínas que entran en la ruta de secreción de la célula huésped.

En una realización preferida, el procedimiento de la invención implica la fabricación o uso de una célula huésped que

(a) tiene disminuida o anulada la actividad de un gen alg o una o más actividades que manosilan N-glicanos en el brazo α-1,6 de la estructura de carbohidratos central de Man3GlcNAc2 (“Man3”); y (b) tiene disminuida o anulada la actividad de una α-1,6-manosiltransferasa de iniciación, es decir, una enzima específica de iniciación que inicia la manosilación de la cadena externa (en el brazo α-1,3 de la estructura central de Man3). En S. cerevisiae, esta enzima se codifica por el gen OCH1. La alteración del gen och1 en S. cerevisiae da como resultado un fenotipo en el que los N-azúcares carecen completamente de la cadena externa de poli-manosa. Los enfoques previos para obtener glicosilación de tipo de mamífero en cepas fúngicas han requerido la inactivación de OCH1 (véase, por ejemplo, Chiba et al. (1998) J. Biol.Chem. 273: 26298-304). La alteración de la actividad α-1,6-manosiltransferasa de iniciación en una célula huésped de la invención es opcional, sin embargo (dependiendo de la célula huésped seleccionada), ya que la enzima Och1p requiere un Man8GlcNAc intacto para una iniciación eficaz de la cadena externa de manosa. De esta manera, las células huésped seleccionadas o producidas de acuerdo con la presente invención, que acumulan oligosacáridos unidos a lípidos que tienen siete o menos restos de manosa, después de la transferencia, producirán N-glicanos hipoglicosilados que probablemente serán malos sustratos para Och1p (véase, por ejemplo, Nakayama et al. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).

Modificación por ingeniería genética o selección de huéspedes que tienen actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III

La invención proporciona además un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en las células huésped de la invención mediante la expresión de una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III (incluyendo una enzima de longitud completa, homólogos, variantes, derivados y fragmentos catalíticamente activos de la misma). En una realización, la célula huésped de la invención (por ejemplo, P. pastoris) se modifica por ingeniería genética para producir N-glicanos de tipo más humano, por ejemplo, por activación de una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III o mediante la expresión en una molécula de ácido nucleico de una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa III. Usando técnicas bien conocidas en este campo, se diseñan cebadores específicos de genes para complementar las regiones homólogas de un gen de GnTIII, preferentemente un gen de GnTIII de mamífero (por ejemplo, GnTIII de ratón) (Figura 24), cuyas secuencias están disponibles en la técnica (por ejemplo Genbank Nº de Acceso L39373) y se amplifican por PCR.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped de la invención (por ejemplo, P. pastoris), en el que la glicoproteína comprende un N-glicano que presenta un GlcNAc de bisección en una estructura central de trimanosa o trimanosilo (Man3GlcNAc2). En esta realización GlcNAcMan3GlcNAc2 (que puede producirse por reacción de un núcleo de trimanosa con la actividad Nacetilglucosaminiltransferasa I (“GnTI”), pero que normalmente se produce por recorte de GlcNAcMan5GlcNAc2 por una actividad α-1,3/α-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II (Hamilton et al. (2003) Science 301: 1244-46)) se hace reaccionar con una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III para producir un GlcNAc2Man3GlcNAc2 biseccionado. Por consiguiente, la invención proporciona actividad GnTIII, que transfiere β-1,4 GlcNAc a sustratos que pueden aceptar el GlcNAc de bisección en eucariotas inferiores.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped de la invención (por ejemplo, P. pastoris), en el que la glicoproteína comprende un N-glicano que presenta un GlcNAc de bisección en una estructura central de trimanosa o trimanosilo (Man3GlcNAc2) que tiene al menos dos GlcNAc unidos al núcleo de trimanosa. En esta realización, Man3GlcNAc2 se hace reaccionar con una actividad GnTI y después con una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa II (“GnTII”) y una actividad GnTIII (en cualquier orden) para producir un GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionado (Figura 38). Debe apreciarse que la estructura central de trimanosilo biseccionada de esta realización también puede contener un grupo manosilo adicional en lugar de un resto de GlcNAc. Por ejemplo, GlcNAcMan4GlcNAc2 puede hacerse reaccionar con una actividad GnTIII para producir un GlcNAc2Man4GlcNAc2 biseccionado.

La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo más humano en una célula huésped de la invención (por ejemplo, P. pastoris), en el que la glicoproteína producida comprende un N-glicano que tiene al menos dos GlcNAc unidos a una estructura central de pentamanosa (Man3GlcNAc2) y que presenta un N-glicano biseccionado. Por consiguiente, en esta realización, una estructura central de pentamanosa (Man5GlcNAc2) se hace reaccionar con la actividad GnTIII para producir una estructura GlcNAcMan5GlcNAc2 biseccionada y GlcNAc2Man5GlcNAc2.

En una realización alternativa, una estructura central de pentamanosa producida mediante la mutación de los genes och1 y alg3 se hace reaccionar con actividades α1,2-manosidasa, GnTI, GnTII yGnTIII y UDP-GlcNAc para producir un glicano GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionada (Figura 35B). En otra realización, una estructura central de pentamanosa se hace reaccionar con actividades GnTI y GnTIII (en cualquier orden o en combinación) para producir una estructura GlcNAc2Man5GlcNAc2 biseccionada (Figura 37).

En una realización más preferida, usando el procedimiento de biblioteca de ADN combinatoria de la invención, como se describe más adelante, se expresa una construcción pVA53 que comprende el líder de MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso del GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII ∆32) en una cepa de P. pastoris YSH-1 (Ejemplo 13) produciendo de esta manera N-glicanos que tienen una estructura GlcNAc2Man5GlcNAc2 biseccionada (Ejemplo 20). La Figura 26 (inferior) representa el espectro MALDITOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en la cepa mencionada anteriormente, que se denomina PBP26 (Figura 36), que presenta un pico predominante a 1666 m/z [a], que corresponde a GlcNAc2Man5GlcNAc2 biseccionado. (Como comparación, la Figura 26 (superior) presenta el espectro MALDI-TOF N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-1 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante a 1461 m/z [d] corresponde al glicano no modificado: GlcNAcMan5GlcNAc2). Por consiguiente, en una realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos de forma transitoria, N-glicanos que presentan al menos un 50 % en moles de GlcNAc2Man5GlcNAc2 o al menos un 50 % en moles de una estructura GlcNAc2Man3GlcNAc2 que tiene un GlcNAc de bisección. El porcentaje en moles de los glicanos usa como referencia el porcentaje de glicanos neutros totales como se detecta por MALDITOF. Se entiende que si, por ejemplo, se produce GlcNAc2Man3GlcNAc2 que tiene un GlcNAc de bisección al 20 % y se produce GlcNAc3Man3GlcNAc2 al 25 % en una proteína diana, la cantidad total de GlcNAc2Man3GlcNAc2 producido transitoriamente que tiene un GlcNAc de bisección es un 45 %, porque GlcNAc3Man3GlcNAc2 es un producto de un GlcNAc2Man3GlcNAc2 que tiene un GlcNAc de bisección que ha reaccionado adicionalmente con GnTII.

De forma similar, en otra realización, se expresa una construcción pVA55 que comprende el líder de MNN2(1) de S. cerevisiae (Nº de Acceso del GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII ∆32) en una cepa de P. pastoris (YSH-1) produciendo de esta manera N-glicanos GlcNAcMan5GlcNAc2 y la estructura GlcNAc2Man5GlcNAc2 de N-glicanos biseccionados. Como se muestra en la Figura 27 (inferior), estas estructuras corresponden a picos 1463 m/z y 1667 m/z, respectivamente. (Como comparación, la Figura 27 (superior) representa el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-1 que carece de la construcción pV 4S3. El pico predominante corresponde a GlcNAcMan5GlcNAc2 no modificado a 1461 m/z [d].) Por consiguiente, en otra realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan al menos un 20 % en moles de un GlcNAc2Man5GlcNAc2 o al menos un 20 % en moles de una estructura GlcNAC2Man3GlcNAc2 que tiene un GlcNAc de bisección.

En una realización incluso más preferida, se expresa una construcción pVA53 que comprende el líder de MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso del GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII ∆32) en una cepa de P. pastoris YSH-44 (Ejemplo 15) produciendo de esta manera N-glicanos que tienen una estructura dGlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionado (Ejemplo 20). La Figura 30 representa el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en la cepa mencionada anteriormente denominada YSH-57, que presenta un pico predominante a 1542 m/z [y], que corresponde al glicano biseccionado GlcNAc3Man3GlcNAc2. (Como comparación, la Figura 29 presenta el espectro MALDI-TOF de Nglicanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-44 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante a 1356 m/z [x] en la Figura 29 corresponde al glicano no modificado: GlcNAc2Man3GlcNAc2). Por consiguiente, en una realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan al menos un 80 % en moles de una estructura dGlcNAc3Man3GlcNAc2 que tiene un GlcNAc de bisección. El porcentaje en moles de los glicanos toma como referencia el porcentaje de glicanos neutros totales como se detecta por MALDI-TOF.

Como alternativa, en otra realización, se expresa una construcción pVA53 que comprende el líder de MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso del GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII ∆32) en una cepa de P. pastoris (PBP6-5) (Ejemplo 11) produciendo de esta manera N-glicanos que tienen una estructura GlcNAc2Man3GlcNAc2 y una estructura GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionada. Como se muestra en la Figura 32, estas estructuras corresponden a picos a 1340 m/z y 1543 m/z, respectivamente. Por consiguiente, en otra realización, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan al menos un 20 % en moles de una estructura GlcNAc3Man3GlcNAc2 que tiene un GlcNAc de bisección en una célula huésped mutante alg3.

La invención proporciona procedimientos para producir una glicoproteína de tipo humano en una eucariota inferior, en los que la glicoproteína comprende una estructura central de Man5GlcNAc2 o una estructura central de Man3GlcNAc2 y en los que la estructura central se modifica adicionalmente por dos o más GlcNAc. En algunas realizaciones de la invención, un 10 % o más de las estructuras centrales se modifican por los dos o más GlcNAc. En otras realizaciones preferidas, se modifican de esta manera el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso más de las estructuras centrales. En una realización altamente preferida, uno de los GlcNAc es un GlcNAc de bisección.

En otro aspecto de la invención, se usa una biblioteca de ácido nucleico combinatoria que codifica al menos un dominio catalítico de GnTIII para expresar una actividad GnTIII en una célula huésped eucariota inferior (Ejemplo 18). Preferentemente, una biblioteca de la invención comprende una sub-biblioteca de secuencias líder fusionadas en fase con una sola molécula de ácido nucleico o una sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico que comprende secuencias de GnTIII, codificando uno o más de ellas un dominio catalítico que tienen actividad GnTIII en la célula huésped. Como alternativa, una sola molécula de ácido nucleico o una sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias líder se fusiona en fase a una sub-biblioteca de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de GnTIII, de las que una o más codifican un dominio catalítico que tiene actividad GnTIII en la célula huésped de la invención (véase más adelante). La expresión de éstas y otras bibliotecas combinatorias se realiza en una célula huésped que expresa una glicoproteína diana cuyas estructuras de Nglicanos se analizan para determinar si y cuánta cantidad de GnTIII se expresa. Puede producirse una amplia serie de enzimas GnTIII catalíticamente activas en una célula huésped usando los procedimientos y bibliotecas de la invención. Es este aspecto de la invención el que permite al experto en la materia crear y delinear entre enzimas GnTIII que tienen poca o ninguna actividad y las enzimas que se expresan activamente y que producen niveles predominante o un intermedio de oligosacárido biseccionado tal como GlcNAc2Man2GleNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2

o GlcNAc2Man3GlcNAc2 en las células huésped.

Como se describe adicionalmente más adelante, la dirección apropiada de una enzima responsable de una etapa dada en la ruta de glicosilación en la localización subcelular apropiada y la suficiencia de la actividad enzimática al pH particular de esa localización subcelular son factores importantes en la producción de glicoproteínas que tienen N-glicanos con las estructuras deseadas. El uso de bibliotecas combinatorias de proteínas de fusión para generar diversas poblaciones de quimeras enzimáticas y la exploración de estas bibliotecas en células transformadas proporciona un procedimiento poderoso para identificar cepas huésped con la actividad de interés en la localización apropiada. En realizaciones preferidas de la invención, la actividad enzimática se localiza de tal forma que una glicoproteína que contiene N-glicano expresada en la célula sea capaz de reaccionar con la actividad durante el proceso de secreción.

Sin embargo no todas las combinaciones de líder/dominios catalíticos producen actividades enzimáticas deseadas. De la amplia diversidad de combinaciones de líder/dominio catalítico creadas, sólo unas pocas pueden ser útiles para producir los intermedios deseados en el presente documento. La presente invención, sin embargo, incluye incluso las combinaciones que no presentan actualmente una actividad enzimática deseada en la célula huésped ejemplificada. La Figura 28 (inferior) muestra una construcción pVB51 que comprende el líder de GNT(s) de K. lactis (Nº de Acceso de GenBank AF106080) fusionado a un dominio de GnTIII catalíticamente activo de ratón (GnTIII ∆32) expresado en la cepa de P. pastoris YSH-1, que no presenta fácilmente la actividad GnTIII. (Como comparación, la Figura 28 (superior) presenta el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en la cepa YSH-1 que carece de la construcción pVA53. El pico predominante corresponde a GlcNAcMan5GlcNAc2 no modificado a 1461 m/z). Se observa el pico predominante en la Figura 28 (inferior) a 1463 m/z, que se correlaciona con la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2. También se observa un segundo pico a 1726 m/z, que no se correlaciona con la masa de GlcNAc2Man5GlcNAc2. Se contempla que éstas y otras combinaciones similares pueden ser útiles, con o sin ligeras modificaciones usando técnicas bien conocidas en este campo, cuando se expresan, por ejemplo, en otras células huésped incluyendo las que se han modificado para producir glicoformas de tipo humano.

El uso de bibliotecas combinatorias para generar diversas poblaciones de quimeras enzimáticas y la exploración de estas bibliotecas en células transformadas permite además identificar cepas en las que la actividad enzimática es sustancialmente intracelular. El Ejemplo 6, proporcionado más adelante, proporciona un Ejemplo de condiciones de ensayo útiles para medir la actividad α-1,2-manosidasa extracelular. Los Ejemplos 22 y 23 también proporcionan Ejemplos de ensayos de actividad glicosiltransferasa (GnTIII) en el medio. Véase también, la Tabla 9, proporcionada más adelante, y Choi et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(9): 5022-27. Para los fines de la invención, una actividad enzimática es sustancialmente intracelular cuando menos del 10 % de la actividad enzimática se mide en el medio extracelular.

Como se describe en los Ejemplos 11, 12, 13, 14, 15 y 19-21, una célula huésped puede modificarse por ingeniería genética mediante la expresión de glicosiltransferasas apropiadas (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa) para producir N-glicanos que tienen la estructura de carbohidratos deseado (por ejemplo, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2). La expresión de GnT en la célula huésped (por ejemplo, mediante la dirección de una molécula de ácido nucleico o una biblioteca de moléculas de ácido nucleico como se describe más adelante y en Choi y col. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(9): 5022-27 y el documento WO 02/00879) permite que la célula huésped modificada produzca N-glicanos que tienen el GlcNAc de bisección en la manosa central. Estas estructuras pueden procesarse adicionalmente usando los procedimientos de la invención para producir N-glicanos de tipo humano en proteínas que entran en la ruta de secreción de la célula huésped.

En una realización más preferida, la co-expresión de transportadores de UDP-azúcar apropiados y UDP transferasas protegerá los restos α-1,6 y α-1,3 terminales, así como la manosa central con GlcNAc, dando como resultado el precursor del complejo de tipo de mamífero (por ejemplo GlcNAc3Man3GlcNAc2) y N-glicosilación híbrida. Estas cadenas de N-oligasacárido unidas a péptidos después sirven como precursor para una modificación adicional para obtener una estructura de oligasacárido de tipo de mamífero. La posterior expresión de galactosil-transferasas y la modificación por ingeniería genética de la capacidad de transferir ácido siálico al extremo (véase la Figura 1B) producirá una estructura de N-glicano de tipo de mamífero (por ejemplo, de tipo humano).

Modificación por ingeniería genética o selección de huéspedes que tienen actividad Nacetilglucosaminiltransferasa IV, V, VI o IX

La presente invención proporciona nuevos huéspedes fúngicos unicelulares o pluricelulares que tienen actividad Nacetilglucosaminiltransferasa que catalizan la formación de un enlace glicosídico GlcNAc1,4 o GlcNAc1,6 en el brazo de Manα1,6 y/o en el brazo de Manα1,3 de un sustrato de oligosacárido (por ejemplo, GlcNAc2Man3GlcNAc2) en presencia de un nucleótido de azúcar UDP-GlcNAc. La transferencia de los restos de GlcNAc generalmente se prefiere en presencia de un transportador de UDP-GlcNAc. La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican proteínas que tienen actividad N-acetilglucosaminiltransferasa y procedimientos para expresar la enzima activa en la ruta de secreción de levaduras. Además, la presente invención proporciona estructuras de oligosacárido producida a partir de los huéspedes transformados que son útiles para la administración terapéutica. Catalizando la transferencia del azúcar GlcNAc desde UDP-GlcNAc a los sustratos de oligosacárido por una actividad N-acetilglucosaminiltransferasa, se forman glicoformas multiantenarias en una proteína, que después se extienden por galactosiltransferasa y sialiltranferasas.

La invención además proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped y eucariota inferior mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de N-acetilglicosaminiltransferasa V (GnTV) de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1 a 36 del péptido señal de dirección celular de MNN2 de S. cerevisiae (53), que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped. Este procedimiento también puede incluir la expresión de actividades N-acetilglucosaminiltransferasa IV, VI o IX (incluyendo una enzima de longitud completa, homólogos, variantes, derivados y fragmentos catalíticamente activos de los mismos) en dichas células huésped. En una realización, una célula huésped de la invención (por ejemplo, P. pastoris) se modifica por ingeniería genética para producir más N-glicanos de tipo humano, por ejemplo, por activación de actividades N-acetilglucosaminiltransferasa IV, V, VI, IX o por expresión a partir de una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica las actividades N-acetilglucosaminiltransferasa IV, V, VI, IX (Figura 39). Usando técnicas bien conocidas en el campo, se diseñan cebadores específicos de genes para hibridar con regiones homólogas de miembros de la familia de las glicosiltransferasas, tales como secuencias de genes de GnTIV, V, VI, IX, que se pueden adquirir fácilmente en la técnica (por ejemplo, bases de datos Genbank, SwissProt) y se amplifican por PCR.

Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa IV

En un primer aspecto de la invención, una célula huésped eucariota inferior se transforma con una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima N-acetilglucosaminiltransferasa IV (“GnTIV”) que cataliza la adición de un resto de azúcar β(1,4) N-acetilglucosamina (“GlcNAc”) en el brazo Manα1,3 del GlcNAc β 1,2 -Manα1,6 (GlcNAc β 1,2 Manα1,3) Man β1,4 – GlcNAc β 1,4 -GlcNAcβ 1,4 -Asn de un sustrato de oligosacárido. La adición de un GlcNAcβ1,4 por GnTIV sobre el brazo Manα1,3 del sustrato aceptor (por ejemplo, GlcNAc2Man3GlcNAc2) produce un denominado N-glicano triantenario.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en un eucariota inferior (por ejemplo, P. pastoris) en el que la glicoproteína comprende una estructura de N-glicano triantenaria en una estructura de oligosacárido (por ejemplo, GlcNAc3Man3GlcNAc2). En esta realización, el sustrato de oligosacárido GlcNAcMansGlcNAc2 (Choi et al., (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 2003 Apr 29; 100(9): 5022-7) se recorta por una actividad α-1,3/α-1,6-manosidasa, tal como Manosidasa II (Hamilton et al. (2003) Science 301: 1244 produciendo el sustrato GlcNAc2Man3GlcNAc2, que a su vez se hace reaccionar con una actividad Nacetilglucosaminiltransferasa IV para producir una estructura triantenaria: GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Figura 39). En las Figuras 41 y 42 se exponen dos isoenzimas de GnTIV A y B. En una realización preferida, se introduce un fragmento génico que codifica GnTIV humana (Figura 42) ligado en fase a los nucleótidos 1-108 de la secuencia del péptido de dirección de MNN2(s) de S. cerevisiae y se expresa en P. pastori YSH-44 (Ejemplo 15). De esta manera, en ciertas realizaciones, una célula huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan preferentemente al menos un 50, 60, 70, 80, 90 % en moles o más de la estructura de N-glicano deseada GlcNAc3Man3GlcNAc2. En una realización incluso más preferida, el sustrato de oligosacárido GlcNAc3Man3GlcNAc2 es un sustrato para una reacción de transferencia de galactosilo. Por consiguiente, la invención proporciona una actividad GnTIV, que cataliza la transferencia de restos de GlcNAc sobre sustratos de oligosacárido que forman un enlace glicosídico GlcNAcβ-1,4 en el brazo de Manα1,3 de un sustrato de oligosacárido (por ejemplo, GlcNAc2Man3GlcNAc2) en eucariotas inferiores.

En una realización más preferida, usando una biblioteca de ADN combinatoria y procedimientos de la invención, se expresa la construcción pPB144 (Figura 40A), que comprende el líder de MMV2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso del GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTIV catalíticamente activo de ser humano (gnTIVB α104) en una cepa de P. pastoris YSH-44 (Ejemplo 15) produciendo de esta manera estructuras de N-glicano triantenarias GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Ejemplo 25). La Figura 47 presenta el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados de una proteína kringle 3 expresada en una cepa transformada denominada PBP43, que presenta un pico predominante a 1543 m/z [y], que corresponde a la estructura de N-glicano triantenaria GlcNAc3Man3GlcNAc2. (Como comparación, véase la Figura 29, que presenta el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en células YSH-44 que producen GlcNAc2Man3GlcNAc2). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, una célula huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, Nglicanos que presentan preferentemente al menos un 50 % en moles de una estructura triantenaria GlcNAc3Man3GlcNAc2. En otra realización, la célula huésped de la presente invención produce la estructura triantenaria GlcNAc3Man3GlcNAc2 catalizada por GnTIV en una cantidad que es al menos un 60, 70, 80, más preferentemente un 90 % en moles o mayor. Aquí y a lo largo del presente documento, el porcentaje en moles de los glicanos hace referencia al porcentaje de glicanos neutros totales detectados por MALDI-TOF EM.

Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa IV y V

En otro aspecto de la invención, una célula huésped de hongo unicelular y pluricelular que se ha modificado por ingeniería genética o seleccionado para producir un sustrato de oligasacárido triantenario (por ejemplo, GlcNAc3Man3GlcNAc2), se transforma con un ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de Nacetilglucosaminiltransferasa V (“GnTV”) de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1 a 36 del péptido señal de dirección celular MNN2 de S. cerevisiae (53) que cataliza la adición de un resto de azúcar β (1,6) Nacetilglucosamina (“GlcNAc”) en el brazo Manα1,6 del GlcNAc β1,2 -Manα1,6 (GlcNAc β 1,4 (GlcNAc β 1,2) Manα1,3) Man β1,4 -GlcNAc β1,4 -GlcNAcβ 1,4 -Asn de un sustrato de oligosacárido. La adición de un GlcNAcβ1,6 por GnTV sobre el sustrato aceptor (por ejemplo, GlcNAc3Man3GlcNAc2) en presencia de restos de GlcNAc produce un N-glicano tetraantenario: GlcNAc4Nan3GlcNAc2. Preferentemente, la actividad GnTV de la presente invención se expresa en una célula de hongo unicelular y pluricelular que produce glicanos triantenarios, por ejemplo en P. pastoris PBP43 en la que la actividad GnTV cataliza la transferencia de un resto de GlcNAc al brazo Manα1,6 del sustrato de oligasacárido GlcNAc3Man3GlcNAc2 formando un enlace glicosídico GlcNAcβ 1,6.

En una realización, usando el procedimiento de biblioteca de ADN combinatoria de la invención, P. pastoris YSH-44 se transforma con las construcciones de fusión GnTIVB/MNN2(s) de S.cerevisiae y GnTV/MNN2(s) de S. cerevisiae. La Figura 49 presenta el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en una cepa transformada denominada PBP46, que presenta un pico predominante a 1747 m/z [z], que corresponde a la estructura de N-glicano tetraantenaria GlcNAc4Man3GlcNAc2 y un pico residual a 1543 m/z [y] que corresponde a la estructura de N-glicano triantenaria GlcNAc3Man3GlcNAc2.

En otra realización, usando el procedimiento de biblioteca de ADN combinatoria de la invención, P. pastoris YSH-44 se transforma con una combinación diferente de fusión de enzima y líder: plásmido pPB128 que contiene construcciones de fusión GnTIVA(∆82)/MNN2(s) de S. cerevisiae y plásmido pPB140 que contiene construcciones de fusión GnTV(∆1445)/MNN2(s) de S. cerevisiae. La Figura 50 presenta el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en una cepa transformada denominada PBP94, que presenta un pico predominante a 1743 m/z [z], que corresponde a la estructura de N-glicano tetraantenaria GlcNAc4Man3GlcNAc2.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula huésped caracterizada por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan al menos un 50, 60, 70, 80, 90 % en moles o más de la estructura de N-glicano deseada GlcNAc4Man3GlcNAc2. En una realización más preferida, mediante la expresión de las actividades GnTIV y GnTV, la célula huésped produce la estructura de N-glicano antenar múltiple deseada.

No todas las combinaciones de líder/dominios catalíticos producen actividades enzimáticas deseadas en la producción de estructuras de glicano multi-antenarias. Se crea una amplia diversidad de combinaciones de líder/dominio catalítico usando los procedimientos y bibliotecas de la invención, de los que sólo algunos pueden ser útiles para producir los intermedios deseados en el presente documento. La presente invención, sin embargo, incluye incluso las combinaciones que no presentan en ese momento una actividad enzimática deseada en una célula huésped ejemplificada. Se contempla que éstas y otras combinaciones similares pueden ser útiles, con o sin ligeras modificados usando técnicas bien conocidas en este campo, cuando se expresa, por ejemplo, en otras células huésped incluyendo las que se han modificado para producir glicoformas de tipo humano.

Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa V

En otra realización de la invención un ácido nucleico que codifica la actividad GnTV de la invención se expresa en células huésped que producen las estructuras centrales de GlcNAc3Man3GlcNAc2 dando como resultado la formación de estructuras triantenarias GlcNAc3Man3GlcNAc2. Se proporciona la secuencia de GnTV conocida en la Figura 43. En una realización, la construcción pPB140 (Figura 40B) que comprende el líder de MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso de GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTV catalíticamente activo de ratón (GnTV∆145) se expresa en una cepa de P. pastoris YSH-44 (Ejemplo 15) produciendo de esta manera estructuras de N-glicano triantenarias GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Ejemplo 25). La Figura 48 presenta el espectro MALDI-TOF de Nglicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en la cepa transformada denominada PBP32, que presenta un pico predominante a 1559 m/z [y], que corresponde a la estructura de N-glicano tretraantenar y un segundo pico a 1355 m/z [u] que corresponde a la estructura N-glicano triantenaria GlcNAc3Man3GlcNAc2. (Como comparación, véase la Figura 29 que presenta el espectro MALDI-TOF de N-glicanos liberados a partir de una proteína kringle 3 expresada en células YSH-44 que produce GlcNAc2Man3GlcNAc2). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, un huésped de la presente invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan al menos un 40 % en moles de la estructura triantenaria: GlcNAc3Man3GlcNAc2. Preferentemente, el huésped de la presente invención produce al menos un 50, 60, 70, 80, 90 % en moles o más de estructuras triantenarias catalizadas por GnTV.

Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa VI

La invención también proporciona una célula huésped de hongo unicelular y pluricelular transformada con un ácido nucleico que codifica la actividad N-acetilglucosaminiltransferasa VI (“GnTVT”) que cataliza la transferencia de un resto de azúcar β(1,4) N-acetilglucosamina en el brazo Manα1,6 del GlcNAc β1,4 (GlcNAc β 1,2) Manα1,6 (GlcNAc β1,4 (GlcNAc β 1,2) Manα1,3) Man β1,4 -GlcNAc β1,4 -GlcNAc 1,4 -Asn de un sustrato de oligosacárido. La adición de un GlcNAcβ1,4 por GnTVI a un sustrato aceptor (por ejemplo, GlcNAc4Man3GlcNAc2) produce un denominado N-glicano pentaantenar: La adición del resto de GlcNAc forma un enlace glicosídico GlcNAcβ1,4 en el sustrato de oligosacárido. En una realización, un ácido nucleico que codifica la actividad GnTVI se expresa en una célula huésped que produce N-glicanos pentaantenarios tales como GlcNAc5Man3GlcNAc2. En otra realización, usando un fragmento de ADN que codifica la actividad GnTVI tal como uno expuesto en la Figura 44, se expresa una construcción plasmídica que comprende el líder de MNN2(s) de S. cerevisiae (Nº de Acceso de GenBank NP_009571) fusionado a un dominio de GnTVI catalíticamente activo de Gallus gallus en una cepa de P. pastoris YSH-44 produciendo de esta manera estructuras de N-glicano pentaantenar GlcNAc5Man3GlcNAc2. Por consiguiente, una célula huésped de la invención se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente N-glicanos que producen N-glicanos pentaantenarios en un resto detectable.

Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa IX

En otra realización, un ácido nucleico (que codifica la actividad GnTIX (por ejemplo, GenBank ANNP 945193) se expresa en una célula huésped de la invención en la que la actividad GnTIX cataliza la transferencia de restos de GlcNAc sobre sustratos aceptores de glicano complejos (por ejemplo, GlcNAc3Man3GlcNAc2) en ausencia de GnTIV, GnTV o GnTVI. Se ha mostrado que el ácido nucleico que codifica la actividad GnTIX, que normalmente parece expresarse exclusivamente en el cerebro, cataliza la síntesis de un N-oligasacárido único en células mutantes CHO (Raju et al., (1998) J Biol Chem 273, 14090-14098). La expresión de una GnTIX humana recombinante mostró actividad GnTV, catalizando la transferencia de GlcNAc a la posición 6-OH de un brazo de manosa unido por α1,6 del oligasacárido GlcNAc2Man3GlcNAc2-PA a través de un enlace β1,6 además de la acción sobre el brazo de manosa unido por enlace α1,3 (J Biol Chem. 2003 Oct 31; 278(44): 43102-9). La GnTIX puede catalizar la transferencia de GlcNAc a la posición 6-OH de manosa en la secuencia GlcNAcβ1,2-Manα1.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para producir estructuras de glicano tretraantenarias en P. pastoris usando un ácido nucleico que codifica la actividad GnTIX (Figura 45). Preferentemente, la introducción y expresión de la actividad GnTIX cataliza la transferencia de restos de GlcNAc al sustrato aceptor GlcNAc2Man3GlcNAc2 produciendo GlcNAc4Man3GlcNAc2 y GlcNAc3Man3GlcNAc2. La expresión en la célula huésped de la actividad GnTIX cataliza la transferencia de restos de GlcNAc a la posición 6-OH preferentemente sobre los dos brazos Manα1,3 y Manα1,6 del sustrato de oligasacárido central GlcNAc2Man3GlcNAc2 produciendo la estructura tetraantenaria GlcNAc4Man3GlcNAc2. En una realización, una célula huésped que produce el sustrato aceptor GlcNAc2Man3GlcNAc2, tal como P. pastoris YSH-44, se transforma con un plásmido (tal como pPB176) que comprende un gen que codifica la actividad GnTIX (∆43) fusionado en fase al líder de MNN2(2) de S. cerevisiae (Ejemplo 29). La célula huésped se caracteriza por su capacidad de producir, al menos transitoriamente, N-glicanos que presentan al menos un 5 % en moles o preferentemente más actividad GnTIX que cataliza la transferencia de GlcNAc en la posición 6-OH del brazo de manosa unido por enlace α1,6 del oligosacárido GlcNAc2Man3GlcNAc2 a través de un enlace β1,6 además de actuar sobre el brazo de manosa unido por enlace α1,3 del sustrato de oligosacárido.

Además, el ácido nucleico que codifica la actividad GnTIX puede tener los codones optimizados para la eficacia de traducción en levaduras usando procedimientos bien conocidos. La Figura 46 proporciona el fragmento de ADN con codones optimizados que codifica parte del GnTIX humano que carece del dominio TM (∆43) sintetizado a partir de oligonucleótidos usando PCR.

Variaciones de múltiples glicanos antenarios

La presente invención está adaptada para producir una diversidad de glicanos de múltiples antenas que son adecuados para fines terapéuticos. Se contempla que los glicanos que tienen los mismos enlaces GlcNAcβ pueden aumentar la semivida de las proteínas. Por consiguiente, la invención proporciona una célula huésped eucariota inferior que comprende N-glicanos que tienen al menos dos restos de GlcNAc en el brazo Manα1,3 o Manα1,6 del intermedio de oligosacárido central de trimanosa (por ejemplo, Man3GlcNAc2). En una realización, la célula huésped eucariota inferior comprende al menos dos restos de GlcNAcβ1,4 en el brazo Manα1,3 y Manα1,6 del intermedio d.e oligosacárido central de trimanosa (por ejemplo, Man3GlcNAc2). En otra realización, la célula huésped eucariota inferior comprende al menos dos restos de GlcNAcβ1,6 en el brazo Manα1,3 y Manα1,6 del intermedio de oligosacárido central de trimanosa (por ejemplo, Man3GlcNAc2). En otra realización, la célula huésped eucariota inferior comprende al menos dos restos de GlcNAcβ1,2 en el brazo Manα1,3 y Manα1,6 del intermedio de oligosacárido central de trimannosa (por ejemplo, Man3GlcNAc2).

Como se indica más adelante, aunque las células huésped de hongos unicelulares y pluricelulares son huéspedes preferidos para producir proteínas terapéuticas usando los procedimientos de la invención, la presente invención también es útil para modificar perfiles de N-glicanos de glicoproteínas obtenidas en cualquier célula huésped eucariota, preferentemente en una célula huésped no humana (por ejemplo, de mamífero).

Células huésped de la invención

Una célula huésped preferida de la invención es una célula de hongo unicelular y pluricelular, por ejemplo, levadura.

Las células de hongos unicelulares y pluricelulares que pueden producir glicoproteínas que tienen el N-glicano Man5GlcNAc2 unido son particularmente útiles porque (a) carecen de un alto grado de manosilación (por ejemplo, mayor de 8 manosas por N-glicano, o especialmente 30-40 manosas), muestran inmunogenicidad reducida en seres humanos; y (b) el N-glicano es un sustrato para reacciones de glicosilación adicionales para formar una glicoforma incluso más de tipo humano, por ejemplo, mediante la acción de la GlcNAc transferasa I (Figura 1B; β1,2 GnTI) para formar GlcNAcMan5GlcNAc2. Se obtiene un rendimiento mayor del 30 % en moles, más preferentemente un rendimiento del 50, 60, 70, 80, 90 o incluso del 100 % en moles, teniendo las glicoproteínas con N-glicanos una estructura Man5GlcNAc2. En una realización preferida, se muestra que más del 50 % de la estructura Man5GlcNAc2 es un sustrato para una actividad GnTI y puede servir como dicho sustrato in vivo.

Los eucariotas inferiores preferidos de la invención incluyen, pero sin limitación: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minutia (por ejemplo, Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

En cada una de las realizaciones anteriores, el procedimiento se refiere a la obtención de una célula huésped en la que los precursores de oligosacáridos están enriquecidos en Man5GlcNAc2. Estas estructuras son deseables porque después pueden procesarse por tratamiento in vitro, por ejemplo, usando el procedimiento de Maras y Contreras, Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251. En una realización preferida, sin embargo, los precursores enriquecidos en Man5GlcNAc2 se procesan por al menos una reacción de glicosilación adicional in vivo -con glicosidasas (por ejemplo, alfa-manosidasa) y glicosiltransferasas (por ejemplo, GnTI) -para producir N-glicanos de tipo humano. Los precursores de oligosacáridos enriquecidos en Man5GlcNAc2, por ejemplo, preferentemente se procesan para obtener los que tienen estructuras centrales de GlcNAcManxGlcNAc2, en las que X es 3, 4 ó 5 y preferentemente es

3. Los N-glicanos que tienen una estructura central de GlcNAcManxGlcNAc2 en la que X es mayor que 3 pueden convertirse en GlcNAcMan3GlcNAc2, por ejemplo, por tratamiento con una actividad α-1,3 y/o α-1,6-manosidasa, cuando sea aplicable. El procesamiento adicional de GlcNAcMan3GlcNAc2 por tratamiento con glicosiltransferasas (por ejemplo, GnTII) produce estructuras centrales de GlcNAc2Man3GlcNAc2 que después pueden modificarse, como se desee, por ejemplo, por tratamiento ex vivo o por expresión heteróloga en la célula huésped de enzimas de glicosilación adicionales incluyendo glicosiltransferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante), para convertirse en N-glicanos de tipo humano.

Las glicoproteínas de tipo humano preferidas que pueden producirse de acuerdo con la invención incluyen las que comprenden N-glicanos que tienen siete o menos, o tres o menos, restos de manosa; y las que comprenden uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste en galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa.

Otra célula huésped no humana preferida de la invención es un hongo unicelular o filamentoso, que tiene disminuida o anulada la actividad de una o más actividades del gen alg (incluyendo una actividad enzimática que es homóloga o equivalente a una actividad de alg). Otra célula huésped preferida de la invención tiene disminuida o anulada la actividad de una o más enzimas (distintas de las actividades de alg) que monosilan el brazo α-1,6 de una estructura de oligosacárido unida a lípidos.

Aunque se prefieren células huésped de hongos unicelulares y pluricelulares, se prevé que una amplia diversidad de células huésped que tienen las propiedades mencionadas anteriormente son útiles en los procedimientos de la invención. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética células vegetales para expresar una glicoproteína de tipo humano de acuerdo con la invención. De forma similar, puede alterarse una diversidad de células huésped de mamífero no humano para expresar más glicoproteínas de tipo humano usando los procedimientos de la invención. Puede modificarse por ingeniería genética una célula huésped apropiada, o puede usarse uno de los numerosos mutantes ya descritos en levaduras. Una célula huésped preferida de la invención, se ejemplifica en el presente documento, es un mutante de hipermanosilación-menos (OCH1) en Pichia pastoris que se ha modificado adicionalmente para delecionar el gen alg3.

La invención además proporciona células huésped de hongos unicelulares y pluricelulares capaces de producir glicoproteínas que tienen N-glicanos biseccionados, tales como GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAc2Man5GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 y preferentemente GlcNA3Man3GlcNAc2 biseccionados. En una realización preferida de la invención, las células huésped definidas en las reivindicaciones comprenden una actividad GnTIII. En una realización más preferida, la célula huésped de la invención comprende además una o más actividades seleccionadas entre: GnTI, GnTII y GnTIV y GnTV. Las células huésped preferidas expresan GnTI, GnTII y GnTIII y expresan adicionalmente GnTIV y/o GnTV. Incluso más preferentemente, dichas una o más actividades GnT de las células huésped son sustancialmente intracelulares.

De esta manera, en realizaciones preferidas de la invención, las células huésped que comprenden dichas una o más actividades GNT producen N-glicanos que comprenden estructuras, incluyendo pero sin limitación GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan4GlcNAc2 o GlcNAcMan5GlcNAc2, que son capaces de reaccionar con una actividad enzimática GnTIII para producir N-glicanos biseccionados correspondientes. De este modo, las actividades enzimáticas convierten glicoproteínas que contienen estos N-glicanos en formas con propiedades nuevas y más deseables. Como actualmente se entiende que GnTIII inhibe la actividad GnT adicional en células de mamífero, el experto en la materia debe apreciar que la reacción de glicosilación secuencial puede ser o no de importancia. Sin embargo, la presente invención contempla la adición de GnTI y GnTIII en cualquier orden o conjuntamente. También debe entenderse que otras actividades enzimáticas dentro de la célula, tales como, por ejemplo, una o más actividades manosidasa deseadas (por ejemplo, α 1,2 manosidasa, manosidasa I, manosidasa II) pueden actuar conjuntamente con las actividades GnT para generar otras glicoproteínas de tipo humano adicionales de interés (véase la Figura 1B).

En una realización preferida, una manosidasa II o un segmento catalíticamente activo de la misma se introduce en la célula huésped de la invención para cortar los brazos que contienen α1,3 y α1,6 manosa de una estructura central de pentamanosa biseccionada tal como GlcNAc2Man5GlcNAc2. Los glicanos resultantes (por ejemplo, GlcNAc2Man4GlcNAc2 y GlcNAc2Man3GlcNAc2 biseccionados) son sustratos preferidos para una modificación de Nglicano de tipo humano posterior.

En otra realización de la invención, la células huésped comprende una estructura central de Man5GlcNAc2 o una estructura central de Man3GlcNAc2 modificada por dos o más GlcNAc. Debe entenderse que cualquier estructura central puede incluir una modificación adicional a parte de la modificación por GlcNAc. Preferentemente, el 10 % o más de las estructuras centrales se modifican por GlcNAc. Más preferentemente, el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso más de las estructuras centrales contienen la modificación por GlcNAc.

Formación de N-glicanos complejos

La formación de la síntesis de N-glicanos complejos es un proceso secuencial mediante el cual se retiran restos de azúcar específicos y se unen a la estructura de oligosacárido central. En eucariotas superiores, esto se consigue al tener el sustrato expuesto secuencialmente a diversas enzimas de procesamiento. Estas enzimas realizan reacciones específicas dependiendo de su localización particular dentro de la cascada de procesamiento entera. Esta “línea de ensamblaje” consiste en ER, Golgi anterior, medio y posterior, y la red del trans Golgi todos con sus entornos de procesamiento específicos. Para volver a crear el procesamiento de glicoproteínas humanas en el Golgi y RE de eucariotas inferiores, tienen que expresarse numerosas enzimas (por ejemplo, glicosiltransferasas, glicosidasas, fosfatasas y transportadores) y dirigirse específicamente a estos orgánulos, y preferentemente, en una localización tal que funcionan de la forma más eficaz en relación con su entorno así como a otras enzimas de la ruta.

Como un objetivo de los procedimientos descritos en el presente documento es conseguir una cepa de producción de proteínas sólida que pueda comportarse bien en un proceso de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma de la célula huésped implica una planificación cuidadosa. Como se ha descrito anteriormente, preferentemente se delecionan uno o más genes que codifican enzimas que se sabe que son característica de reacciones de glicosilación no humanas. La cepa de células modificadas por ingeniería genética se transforma con una serie de genes diferentes que codifican actividades deseadas, y estos genes se transforman de una forma estable, asegurando de esta manera que la actividad deseada se mantiene a lo largo de todo el proceso de fermentación.

Cualquier combinación de las siguientes actividades enzimáticas puede modificarse por ingeniería genética de forma individual o múltiple en el huésped usando procedimientos de la invención: sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos del RE y Golgi (por ejemplo, transportadores sin porte y antiporte para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacáridos activados tales UDP-galactosa y CMP-ácido N-acetilneuramínico. Preferentemente, las actividades enzimáticas se introducen en una o más moléculas de ácido nucleico (véase también más adelante). Las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse de forma individual o múltiple, por ejemplo, en el contexto de una biblioteca de ácidos nucleicos tal como una biblioteca combinatoria de la invención. Sin embargo, también debe entenderse que en una célula huésped pueden introducirse actividades enzimáticas individuales o múltiples de cualquier forma, incluyendo, pero sin limitación, los procedimientos de liberación de proteínas y/o mediante el uso de una o más moléculas de ácido nucleico sin usar necesariamente una biblioteca de ácidos nucleicos o biblioteca combinatoria de la invención.

Expresión de glicosiltransferasas para producir N-glicanos complejos:

Con la información de la secuencia de ADN, el experto en la materia puede clonar moléculas de ADN que codifican actividades GnT (por ejemplo, Ejemplos 3, 8, 11, 15 y 18). Usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia, pueden insertarse moléculas de ácido nucleico que codifican GnTI, II, III, IV o V (o que codifican fragmentos catalíticamente activos de las mismas) en vectores de expresión apropiados bajo el control transcripcional de promotores y otras secuencias de control de la expresión capaces de dirigir la transcripción en una célula huésped seleccionada de la invención, por ejemplo, un huésped fúngico tal como Pichia sp., Kluyveromyces sp. y Aspergillus sp., como se describe en el presente documneto, de tal forma que una o más de estas enzimas GnT de mamífero puedan expresarse activamente en una célula huésped de elección para la producción de una glicoproteína compleja de tipo humano (por ejemplo, Ejemplos 8, 20 y 21).

Se han clonado y expresado varias glicosiltransferasas individuales en S. cerevisiae (GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos, sin embargo, sin que se demuestre el resultado deseado de “humanización” en el patrón de glicosilación de los organismos (Yoshida y col (1999) Glycobiology 9(1):53-8;. Kalsner y col (1995) Glycoconj J. 12(3):360-370). Se especuló que la estructura de carbohidratos necesaria para aceptar azúcares por la acción de dichas glicosiltransferasas no estaba presente en cantidades suficientes, lo cual muy probablemente contribuía a la ausencia de la formación de N-glicanos complejos.

Un procedimiento preferido de la invención permite la expresión funcional de una GnT, tal como GnTI, GnTII y GnTIII, en el aparato de Golgi anterior, medio o posterior, además de asegurar un suministro suficiente de UDP-GlcNAc (por ejemplo, por expresión de un transportador de UDP-GlcNAc, véanse los Ejemplos proporcionados más adelante).

Procedimientos para proporcionar precursores de azúcares de nucleótidos al aparato de Golgi

Para que una glicosiltransferasa funcione satisfactoriamente en el Golgi, la enzima requiere una concentración suficiente de un azúcar de nucleótido apropiado, que es el donante de alta energía del resto de azúcar añadido a una glicoproteína naciente. En seres humanos, la serie completa de precursores de azúcar de nucleótido (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, etc.) generalmente se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido central por glicosiltransferasas.

Para replicar este proceso en células huésped no humanas, tales como eucariotas inferiores, tienen que expresarse transportadores específicos de nucleósidos de azúcar en el Golgi para asegurar niveles adecuados de precursores de azúcar de nucleósido (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol 91(2):A406-A406; Sommers y Hirschberg (1982)

J. Biol. Chem. 257(18):811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138:709-715). Los azúcares de nucleótido pueden proporcionarse a los compartimientos apropiados, por ejemplo, por expresión en el microorganismo huésped de un gen exógeno que codifica un transportador de nucleótido-azúcar. La elección de la enzima transportadora se ve influenciada por la naturaleza de la glicosiltransferasa exógena que se va a usar. Por ejemplo, una GlcNAc transferasa puede requerir un transportador de UDP-GlcNAc, una fucosiltransferasa puede requerir un transportador de GDP-fucosa, una galactosiltransferasa puede requerir un transportador de UDPgalactosa y una sialiltransferasa puede requerir un transportador de CMP-ácido siálico.

La proteína transportadora añadida transporta un azúcar de nucleótido desde el citosol al aparato de Golgi, donde el azúcar de nucleótido puede reaccionar mediante la glicosiltransferasa, por ejemplo, para alargar un N-glicano. La reacción libera un nucleósido difosfato o monofosfato, por ejemplo, UDP, GDP o CMP. Los nucleósidos monofosfatos pueden exportarse directamente desde el Golgi en un intercambio con azúcares nucleósido trifosfato por un mecanismo antiporte. La acumulación de un nucleósido difosfato, sin embargo, inhibe la actividad adicional de una glicosiltransferasa. Como esta reacción parece ser importante para una glicosilación eficaz, con frecuencia es deseable proporcionar una copia expresada de un gen que codifica una nucleótido difosfatasa: la difosfatasa (específico para UDP o GDP según sea apropiado) hidroliza el difosfonucleósido para producir un nucleósido monofosfato y fosfato inorgánico.

A continuación se describen enzimas transportadoras adecuadas, que normalmente proceden de mamífero. Dichas enzimas pueden modificarse por ingeniería genética en una célula huésped seleccionada usando los procedimientos de la invención.

En otro Ejemplo, la τ 2,3 o α 2,6-sialiltransferasa protege restos de galactosa con ácido siálico en el trans-Golgi y TGN de seres humanos conduciendo a una forma madura de la glicoproteína (Figura 1B). Para volver a conseguir por ingeniería genética esta etapa de procesamiento en una levadura u hongo modificado por ingeniería genética metabolícamente se requierá (1) la actividad α 2,3 o α 2,6-sialiltransferasa y (2) un suministro suficiente de CMP-Nácido acetil neuramínico, en el Golgi posterior de levaduras. Para obtener suficiente actividad α 2,3-sialiltransferasa en el Golgi posterior, por ejemplo, el dominio catalítico de una sialiltransferasa conocida (por ejemplo, en seres humanos) tiene que dirigirse al Golgi posterior en hongos (véase anteriormente). De forma similar, tienen que modificarse por ingeniería genética los transportadores para permitir el transporte de CMP-ácido N-acetilneuramínico en el Golgi posterior. Actualmente no hay ninguna indicación de que los hongos sinteticen o incluso puedan transportar cantidades suficientes de CMP-ácido N-acetilneuramínico al interior del Golgi. Por consiguiente, para asegurar el suministro adecuado de sustrato para las glicosiltransferasas correspondientes, se tiene que modificar metabólicamente la producción de CMP-ácido siálico en el hongo.

UDP-N acetilglucosamina

El ADNc del transportador de la UDP-N-acetilglucosamina humana, que se reconoció mediante una búsqueda de homología en la base de datos tags de secuencias expresadas (dbEST) se ha clonado (Ishida (1999) J. Biochem.126 (1):68-77). El transportador en la membrana del Golgi de mamífero para la UDP-N-acetilglucosamina se clonó por corrección fenotípica con ADNc procedente de células renales caninas (MDCK) de un mutante de Kluyveromyces lactis caracterizado recientemente deficiente en el transporte del Golgi del azúcar de nucleótido anterior (Guillen y col (1998) Proc . Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7888-7892). Los resultados demuestran que el gen transportador de UDP-GlcNAc del Golgi de mamífero tiene toda la información necesaria para que la proteína se exprese y se dirija funcionalmente al aparato de Golgi de levaduras y que dos proteínas con secuencias de aminoácidos muy diferentes pueden transportar el mismo soluto dentro de la misma membrana del Golgi (Guillen y col (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7888-7892).

Por consiguiente, se puede incorporar la expresión de un transportador de UDP-GlcNAc en una célula huésped por medio de una construcción de ácido nucleico que puede contener, por ejemplo: (1) una región mediante la cual la construcción transformada se mantiene en la célula (por ejemplo, origen de replicación o una región que media la integración cromosómica), (2) un gen marcador que permite la selección de células que se han transformado, incluyendo marcadores de contra-selección y reciclables tales como ura3 o T-urf13 (Soderholm y col ( 2001) Biotechniques 31(2):306-10) u otros marcadores de selección bien caracterizados (por ejemplo, his4, bla, Sh ble, etc.), (3) un gen o fragmento del mismo que codifica un transportador de UDP-GlcNAc funcional (por ejemplo, de K. lactis (Abeijon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5963-5968), o de H. sapiens (Ishida y col (1996) J. Biochem. (Tokio) 120 (6):1074-8) y (4) un promotor que activa la expresión de la biblioteca de construcción de fusión del dominio de localización/catalítico mencionada anteriormente.

GDP-Fucosa

El transportador de GDP-fucosa de la membrana del Golgi de hígado de rataloe han identificado y purificado Puglielli y Hirschberg (1999) J. Biol. Chem. 274(50):35596-35600. Sin embargo, no se ha identificado el gen correspondiente; puede usarse secuenciación N-terminal para el diseño de sondas oligonucleotídicas específicas para el gen correspondiente. Estos oligonucleótidos pueden usarse como sondas para clonar el gen que codifica el transportador de GDP-fucosa.

UDP-Galactosa

Se han expresado funcionalmente dos genes heterólogos, gmal2(+) que codifica la alfa 1,2-galactosiltransferasa (alfa 1,2 GalT) de Schizosaccharomyces pombe y (hUGT2) que codifica el transportador de UDP-galactosa (LTDPGal) humano, en S. cerevisiae para examinar las condiciones intracelulares necesarias para la galactosilación. La correlación entre la galactosilación de proteínas y la actividad de transporte de UDP-galactosa indicó que un suministro exógeno del transportador de UDP-Gal, en lugar de la alfa 1,2 GalT, jugaba un papel clave para una glicosilación eficaz en S. cerevisiae (Kainuma (1999) Glycobiology 9(2):133-141). De forma similar, se clonó un transportador de UDP-galactosa de S. pombe (Segawa (1999) FEBS Letters 451(3) :295-298).

CMP-ácido-N-acetilneuramínico (CMP-ácido siálico).

El transportador de CMP-ácido siálico humano (hCST) se ha clonado y expresado en células CHO Lec 8 (Aoki y col (1999) J. Biochem (Tokio) 126 (5):940-50; Eckhardt y col (1997) Eur. J. Biochem. 248(1):187-92). La expresión funcional del transportador de CMP-ácido siálico murino se consiguió en Saccharomyces cerevisiae (Berninsone y col (1997) J. Biol. Chem. 272(19):12616-9). Se ha encontrado ácido siálico en algunos hongos, sin embargo no está claro si el sistema huésped elegido podrá suministrar suficientes niveles de CMP-ácido siálico. El ácido siálico puede suministrarse en el medio o, como alternativa, también pueden integrarse en el genoma del huésped rutas fúngicas implicadas en la síntesis de ácido siálico.

Expresión de difosfatasas:

Cuando se transfieren azúcares a una glicoproteína, se libera un nucleósido difosfato o monofosfato de los precursores de nucleótido de azúcar. Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente mediante intercambio por azúcares nucleósido trifosfato por un mecanismo antiporte, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) tienen que escindirse por fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción parece ser importante para una glicosilación eficaz, ya que se ha descubierto que la GDPasa de S. cerevisiae es necesaria para la manosilación. Sin embargo, la enzima sólo tiene un 10 % de actividad hacia UDP (Berninsone y col (1994) J. Biol. Chem. 269(1):207-211). Los eucariotas inferiores con frecuencia no tienen actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi ya que no usan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteínas en el Golgi. Se descubrió que Schizosaccharomyces pombe, una levadura que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (procedentes de UDP-galactosa), tenía actividad UDPasa específica, lo que sugiere además el requisito de dicha enzima (Berninsone y col (1994) J. Biol. Chem. 269

(1) :207-211). Se sabe que el UDP es un potente inhibidor de glicosiltransferasas y la eliminación de este producto secundario de glicosilación es importante para prevenir la inhibición de la glicosiltransferasa en el lumen del Golgi (Khatara y col (1974) Eur. J. Biochem. 44:537-560) .

Procedimientos para alterar N-glicanos en un huésped mediante la expresión de una actividad enzimática dirigida a partir de una molécula de ácido nucleico

También se describen en el presente documento procedimientos para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped no humana, que comprende la etapa de introducir en la célula una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima o enzimas para la producción de la estructura de carbohidratos Man5GlcNAc2. Como se describe en el presente documento, en el huésped se introduce una molécula de ácido nucleico que codifica una o más actividades manosidasas implicadas en la producción de Man5GlcNAc2 a partir de Man8GlcNAc2

o Man9GlcNAc2. La invención además se refiere a procedimientos para producir glicoproteínas alteradas en una célula huésped, que comprenden la etapa de introducir en la célula huésped una molécula de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades de glicosilación. Las actividades enzimáticas preferidas se seleccionan entre el grupo que consiste en UDP-GlcNAc transferasa, UDP-galactosiltransferasa, GDP-fucosiltransferasa, CMPsialiltransferasa, transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa, transportador de CMP-ácido siálico y nucleótido difosfatasas. En una realización particularmente preferida, el huésped se selecciona o se obtiene por ingeniería genética para expresar dos o más actividades enzimáticas en las que el producto de una actividad aumenta los niveles de sustrato de otra actividad, por ejemplo, una glicosiltransferasa y un transportador de azúcar correspondiente, por ejemplo, actividades GnTI y de transportador de UDP-GlcNAc. En otra realización preferida, el huésped se selecciona o se obtiene por ingeniería genética para expresar una actividad para retirar productos que pueden inhibir reacciones de glicosilación posteriores, por ejemplo, una actividad difosfatasa específica de UDP o GDP.

Los procedimientos preferidos de la invención implican la expresión de una o más actividades enzimáticas a partir de una molécula de ácido nucleico en una célula huésped y comprenden la etapa de dirigir al menos una actividad enzimática a una localización subcelular deseada (por ejemplo, un orgánulo) mediante la formación de una proteína de fusión que comprende un dominio catalítico de la enzima y un péptido señal de dirección celular, por ejemplo, un péptido señal heterólogo que normalmente no está ligado o asociado al dominio catalítico. La proteína de fusión se codifica por al menos una construcción genética (“construcción de fusión”) que comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular ligado en el mismo marco de lectura de traducción (“en fase”) a un fragmento de ácido nucleico que codifica una enzima (por ejemplo, enzima de glicosilación), o un fragmento catalíticamente activo de la misma.

El componente de péptido señal de dirección de la construcción o proteína de fusión preferentemente procede de un miembro del grupo que consiste en: proteínas unidas a la membrana de RE o Golgi, señales de recuperación, proteínas de membrana de tipo II, proteínas de membrana de tipo I, transportadores de nucleótido-azúcar

transmembrana, manosidasas, sialiltransferasas, glucosidasas, manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas.

El componente de dominio catalítico de la construcción o proteína de fusión preferentemente procede de una actividad glicosidasa, manosidasa o glicosiltransferasa derivada de un miembro del grupo que consiste en GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, GalT, fucosiltransferasa y sialiltransferasa. El dominio catalítico 5 preferentemente tiene un pH óptimo dentro de 1,4 unidades de pH del pH medio óptimo de otras enzimas representativas en el orgánulo en el que se localiza la enzima, o tiene una actividad óptima a un pH comprendido entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, el dominio catalítico codifica una manosidasa seleccionado del grupo que consiste en manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón,

10 manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans, manosidasa II de H. sapiens, manosidasa lix y manosidasa III.

Selección de una enzima de glicosilación: pH óptimo y localización subcelular

En una realización de la invención, una glicoproteína de tipo humano se obtiene eficazmente en una célula huésped eucariota no humana mediante la introducción en un compartimiento subcelular de la célula de una enzima de 15 glicosilación seleccionada para tener un pH óptimo similar al pH óptimo de otras enzimas en el compartimento subcelular diana. Por ejemplo, la mayoría de las enzimas que son activas en el RE y el aparato de Golgi de S. cerevisiae tienen valores óptimos de pH que están comprendidos entre aproximadamente 6,5 y 7,5 (véase la Tabla 3). Como la glicosilación de proteínas es un proceso muy evolucionado y eficaz, el pH interno del RE y el Golgi probablemente también estará en el intervalo de aproximadamente 6-8. Todos los enfoques previos para reducir la

20 manosilación por la acción de manosidasas recombinantes en huéspedes fúngicos, sin embargo, han introducido enzimas que tienen un pH óptimo de aproximadamente pH 5,0 (Martinet y col (1998) Biotech. Letters 20(12):11711177, y Chiba y col (1998) J. Biol. Chem. 273(41)26298-26304). A pH 7,0, la actividad determinada in vitro de esas manosidasas se reduce a menos del 10 %, que probablemente es una actividad insuficiente en su punto de uso, particularmente, el RE y Golgi anterior, para la producción in vivo eficaz de Man5GlcNAc2 en N-glicanos.

25 Por consiguiente, una realización preferida de la presente invención dirige una enzima de glicosilación seleccionada (o dominio catalítico de la misma), por ejemplo, una α manosidasa a una localización subcelular en la célula huésped (por ejemplo, un orgánulo) donde el pH óptimo de la enzima o dominio está dentro de 1,4 unidades de pH del pH medio óptimo de otras enzimas marcadoras representativas localizados en el mismo orgánulo u orgánulos. El pH óptimo de la enzima a dirigir a un orgánulo específico debe corresponder con el pH óptimo de otras enzimas

30 encontradas en el mismo orgánulo para maximizar la actividad por unidad de enzima obtenida. La Tabla 3 resume la actividad de manosidasas de diversas fuentes y sus óptimos de pH respectivos. La Tabla 4 resume sus localizaciones subcelulares típicas.

Tabla 3. Manosidasas y su pH óptimo

Fuente

Enzima pH óptimo Referencia

Aspergillus saitoi

α-1,2-manosidasa 5,0 Ichishima y col (1999) Biochem. J. 339(Pt 3):589597

Trichoderma reesei

α-1,2-manosidasa 5,0 Maras y col. (2000) J. Biotechnol. 77(2-3):255-263

Penicillium citrinum

α-D-1,2-manosidasa 5,0 Yoshida y col. (1993) Biochem. J. 290(Pt 2):349354

C. elegans

α-1,2-manosidasa 5,5 Véase la Figura 11

Aspergillus nidulans

α-1,2-manosidasa 6,0 Eades y Hintz (2000) Gene 255(1):25-34

Homo sapiens IA(Golgi)

α-1,2-manosidasa 6,0

Homo sapiens IB (Golgi)

α-1,2-manosidasa 6,0

Lepidopteran

Tipo I α-1,2-Man6 6,0 Ren y col (1995)

Células de insecto

manosidasa Biochem. 34(8):2489-2495

Homo sapiens

α-D-manosidasa 6,0 Chandrasekaran y col (1984) Cancer Res.

44(9):4059-68

Xanthomonas manihotis

α-1,2,3-manosidasa 6,0 Patente de Estados Unidos Nº 6.300.113

IB de ratón (Golgi)

α-1,2-manosidasa 6,5 Schneikert y Herscovics (1994) Glycobiology. 4(4):445-50

Bacillus sp. (secretado)

α-D-1,2-manosidasa 7,0 Maruyma y col (1994) Carbohydrate Res. 251:8998

En una realización preferida, una enzima o dominio catalítico particular se dirige a una localización subcelular en la célula huésped por medio de una construcción de fusión quimérica que codifica una proteína que comprende un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio enzimático. Preferentemente, una

5 enzima o dominio se dirige al ER, el Golgi anterior, medio o posterior, o al aparato trans-Golgi de la célula huésped.

En una realización más preferida, la enzima de glicosilación dirigida es una manosidasa, glicosiltransferasa o una glicosidasa En una realización especialmente preferida, la actividad manosidasa se dirige al RE o cis Golgi, donde tiene lugar las primeras reacciones de glicosilación. Aunque este procedimiento es útil para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped no humana, se apreciará que el procedimiento también es útil,

10 más generalmente, para modificar perfiles de carbohidratos de una glicoproteína en cualquier célula huésped eucariótica, incluyendo células huésped humanas.

Las secuencias de dirección que median la retención de proteínas en ciertos orgánulos de la ruta de secreción de la célula huésped son bien conocidas y se describen en la bibliografía científica y en bases de datos públicas, como se analiza con más detalle más adelante con respecto a bibliotecas para la selección de secuencias de dirección y

15 enzimas dirigidas.

Dichas secuencias de dirección subcelulares pueden usarse solas o en combinación para dirigir una enzima de glicosilación seleccionada (o dominio catalítico de la misma) a una localización subcelular particular en una célula huésped, es decir, especialmente a una localización en la que la enzima tendrá una actividad aumentada u óptima basada en el pH óptimo o la presencia de otros factores de estimulación.

20 Cuando se intenta recortar estructuras de alto contenido de manosa para producir Man5GlcNAc2 en el RE o el aparato de Golgi de una célula huésped tal como S. cerevisiae, por ejemplo, se puede elegir una enzima o combinación de enzimas que (1) tengan un valor de pH óptimo suficientemente próximo (es decir, entre pH 5,2 y pH 7,8) y (2) se sepa que generan, individualmente o en conjunto, la estructura Man5GlcNAc2 isomérica específica necesaria para aceptar la adición posterior de GlcNAc por GnTI. Cualquier enzima o combinación de enzimas que se

25 muestra que generan una estructura que puede convertirse en GlcNAcMan5GlcNAc2 por GnTI in vitro constituiría una elección apropiada. Este conocimiento puede obtenerse por la bibliografía científica o experimentalmente. Por ejemplo, se puede determinar si una manosidasa potencial puede convertir Man8GlcNAc2-2AB (2 aminobenzamida) en Man5GlcNAc2-AB y después verificar que la estructura Man5GlcNAc2-2AB obtenida puede proporcionar un sustrato para GnTI y UDP-GlcNAc para dar GlcNAcMan5GlcNAc2 in vitro. Por ejemplo, la manosidasa IA de una

30 fuente humana o murina sería una elección apropiada (por ejemplo, véase el Ejemplo 4). Los Ejemplos descritos en el presente documento usan N-oligomanosa maracda con 2-aminobenzamida seguido de análisis de HPLC para realizar esta determinación.

Tabla 4. Localización Celular y pH óptimo de diversas enzimas relacionadas con la glicosilación de S. cerevisiae.

Gen

Actividad Localización pH óptimo Referencias

KTR1

α-1,2 manosiltransferasa Golgi 7,0 Romero y col. (1997) Biochem. J. 321(Pt 2):289-295

MNS1

α-1,2-manosidasa ER 6,5 Lipari y col. (1994) Glycobiology. Oct;4(5):697-702

CWH41

glucosidasa I ER 6,8

-

manosiltransferasa Golgi 7,8 Lehele y Tanner (1974) Biochim.

Biophys. Acta 350(1):225-235

KRE2

α-1,2 manosiltransferasa Golgi 6,5-9,0 Romero y col. (1997) Biochem. J. 321 (Pt 2):289-295

Por consiguiente, una enzima de glicosilación tal como una enzima alfa-1,2-manosidasa usada de acuerdo con la invención tiene una actividad óptima a un pH comprendido entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, la enzima tiene una actividad óptima a un pH comprendido entre 5,5 y 7,5. La enzima manosidasa de C. elegans, por ejemplo,

5 funciona bien en los procedimientos de la invención y tiene un pH óptimo aparente de aproximadamente 5,5). Las manosidasas preferidas incluyen las indicadas en la Tabla 3 que tienen óptimos de pH apropiados, por ejemplo, Aspergillus nidulans, Homo sapiens IA (Golgi), Homo sapiens IB (Golgi), Lepidopteran insect cells (IPLB-SF21AE), Homo sapiens, mouse IB (Golgi), Xanthomonas manihotis, Drosophila melanogaster y C. elegans.

En el Ejemplo 7 se describe un experimento que ilustra el pH óptimo para una enzima α-1,2-manosidasa. Una

10 proteína de fusión quimérica BB27-2 (MNN10 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆31 de C. elegans), que se difunde al medio se sometió a diversos intervalos de pH para determinar la actividad óptima de la enzima. Los resultados del experimento muestran que la α-1,2-manosidasa tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,5 para su función (Figura 11).

En una realización preferida, un gen de manosidasa clonado individual se expresa en el organismo huésped. Sin

15 embargo, en algunos casos puede ser deseable expresar varios genes de manosidasa diferentes, o varias copias de una gen particular, para conseguir la producción adecuada de Man5GlcNAc2. En casos en los que se usan múltiples genes, las manosidasas codificados preferentemente tendrán valores óptimos de pH dentro del intervalo preferido de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 8,0, o especialmente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,5. Las actividades manosidasa preferidas incluyen alfa-1,2-manosidasas derivadas de ratón, humano, Lepidoptera,

20 Aspergillus nidulans o Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum, X. laevis o A. nidulans.

Alteración in vivo de glicosilación de la célula huésped usando una biblioteca de ADN combinatoria

Ciertos procedimientos de la invención preferentemente (pero no necesariamente) se realizan usando una o más bibliotecas de ácido nucleico. Una característica ejemplar de una biblioteca de ácidos nucleicos combinatoria de la invención es que comprende secuencias que codifican péptidos señal de dirección celular y secuencias que

25 codifican proteínas a dirigir (por ejemplo, enzimas o dominios catalíticos de las mismas, incluyendo pero sin limitación las que median la glicosilación).

Como se describe en el presente documento una biblioteca combinatoria de ácidos nucleicos comprende: (a) al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes péptidos señal de dirección celular; y (b) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido a dirigir. Otra biblioteca combinatoria de ácidos 30 nucleicos descrita en el presente documento comprende: (a) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular; y (b) al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido a dirigir al interior de una célula huésped. Como se describe adicionalmente más adelante, una secuencia de ácido nucleico derivada de (a) y una secuencia de ácido nucleico derivada de (b) se unen para producir una o más construcciones de fusión que codifican un péptido señal de dirección celular unido funcionalmente a un dominio

35 polipeptídico de interés. Un Ejemplo de una asociación funcional es cuando el péptido señal de dirección celular se une al dominio polipeptídico de interés en el mismo marco de lectura de traducción (“en fase”).

Como se describe en el presente documento, una biblioteca de ADN combinatoria expresa una o más proteínas de fusión que comprenden péptidos señal de dirección celular unidos en fase a dominios de enzimas catalíticas. La proteína de fusión codificada preferentemente comprende un dominio catalítico de una enzima implicada en la

40 modificación de N-glicanos de tipo de mamífero o de tipo humano. Como también se describe en el presente documento, el dominio catalítico procede de una enzima seleccionada del grupo que consiste en manosidasas, glicosiltransferasas y otras glicosidasas que se unen en fase a uno o más péptidos señal de dirección. El dominio de la enzima puede ser exógeno y/o endógeno para la célula huésped. Un péptido señal particularmente preferido es uno asociado normalmente con una proteína que se somete al transporte al RE o al Golgi.

45 La biblioteca de ADN combinatoria descrita en el presente documento puede usarse para producir o localizar enzimas in vivo implicadas en la modificación de N-glicanos de tipo de mamífero o de tipo humano. Las construcciones de fusión de la biblioteca de ADN combinatoria se modifican por ingeniería genética de forma que las enzimas codificadas se localicen en el ER, Golgi o en la red trans-Golgi de la célula huésped donde están implicadas en la producción de N-glicanos particulares en una glicoproteína de interés. La localización de las enzimas de

50 modificación de N-glicano de la presente invención se consigue mediante un mecanismo de anclaje o mediante interacción proteína-proteína donde el péptido de localización construido a partir de la biblioteca de ADN combinatoria se localiza en un orgánulo deseado de la ruta de secreción tal como el ER, Golgi o la red trans-Golgi.

Un ejemplo de un N-glicano útil, que se produce eficazmente y en cantidades suficientes para una modificación adicional por reacciones de glicosilación de tipo humano (complejas) es Man5GlcNAC2. En una glicoproteína de interés se necesita una cantidad suficiente de Man5GlcNAc2 para el procesamiento adicional de tipo humano in vivo (por ejemplo, más de un 30 % en moles). El intermedio de Man5GlcNAc2 puede usarse como sustrato para una modificación de N-glicano adicional para producir GlcNAcMan5GlcNAc2 (Figura 1B: véase anteriormente). Por consiguiente, la biblioteca de ADN combinatoria descrita en el presente documento puede usarse para producir enzimas que posteriormente producen GlcNAcMan5GlcNAc2, u otros N-glicanos complejos deseados, en una cantidad útil.

Otro aspecto de las construcción de fusión producidas usando la biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención es que permiten una actividad de recorte de N-glicano intracelular suficiente y con frecuencia casi completa en la célula huésped modificada por ingeniería genética. Las construcciones de fusión preferidas producidas por la biblioteca de ADN combinatoria de la invención codifican una enzima de glicosilación, por ejemplo, una manosidasa que se localiza eficazmente en un compartimento intracelular de la célula huésped y de esta manera presenta una actividad extracelular muy pequeña y preferentemente nula. Se muestra que las construcciones de fusión preferidas de la presente invención que codifican una enzima manosidasa se localizan donde se modifican los N-glicanos, particularmente el RE y el Golgi. Las enzimas de fusión de la presente invención se dirigen a dichos orgánulos particulares en la ruta de secreción donde se localizan y actúan sobre N-glicanos tales como Man8GlcNAc2 para producir Man5GlcNAc2 en una glicoproteína de interés.

Se ensayaron construcciones de fusión de GnTIII generadas a partir de una biblioteca de ADN combinatoria para producir glicanos biseccionados para determinar cualquier actividad extracelular. Un Ejemplo de una construcción de fusión de GnTIII que presenta alteración in vivo de la glicosilación de la célula huésped se denomina pVA53. Después de la transformación de P. pastoris YSH-1 con la construcción de fusión pVA53, se ensayó el sobrenadante para detectar cualquier actividad GnTIII ex vivo. La Figura 33 no muestra ningún cambio aparente en el sustrato convencional GlcNAcMan5GlcNAc2 en condiciones que rebelarían actividad GnTIII extracelular en el medio (Ejemplo 22). De forma similar, la Figura 34 no muestra una actividad GnTIII extracelular detectable en el medio de P. pastoris YSH-57 que reacciona con el sustrato GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Ejemplo 23).

Las enzimas producidas por la biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención puede modificar N-glicanos en una glicoproteína de interés como se muestra para las proteínas K3 o IFN-β expresadas en P. pastoris, como se muestra en las Figuras 5, 6 y 25-34 (véanse los Ejemplos 2, 4 y 18-23). Sin embargo, se aprecia que otros tipos de glicoproteínas, sin limitación, incluyendo eritropoyetina, citocinas tales como interferón-α, interferón-β, interferón-γ, interferón-ω y factor estimulante de colonias de granulocitos (granulocitos-CSF), factores de coagulación tales como el factor VIII, factor IX y proteína C humana, cadena α del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa e inhibidor de urea tripsina, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor-2 de crecimiento del endotelio vascular, factor-1 inhibidor del progenitor de mieloides, osteoprotegerina, antitripsina α1, DNasa II, α-feto proteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína 1 de unión a TNF alfa), TACI-Ig (activador transmenbrana y modulador de calcio y elemento de interacción de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimuladora del folículo), GM-CSF, GLP-1 con y sin FC (proteína 1 similar a glucagón), agonista del receptor de IL1, sTNFr (enbrel, fusión Fc del receptor de TNF soluble alfa) ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos -Ig) pueden glicosilarse de esta manera.

Construcción de una biblioteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión:

Una biblioteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión caracteriza a uno o más péptidos señal de dirección celular (“péptidos de dirección”) generalmente derivados de dominios N-terminales de proteínas nativas (por ejemplo, mediante la realización de deleciones C-terminales). Sin embargo, algunos péptidos de dirección proceden del extremo C de proteínas nativas (por ejemplo SEC12). Como fuente de secuencias de péptidos de dirección preferentemente se usan proteínas unidas a la membrana del RE o el Golgi. Estas proteínas tienen secuencias que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmenbrana (tmd) y una región troncal (sr) que varían en longitud. Estas regiones se pueden reconocer por alineamientos de secuencias de proteínas y comparaciones con homólogos conocidos y/u otras proteínas localizadas (por ejemplo, comparando gráficos de hidrofobia).

Los péptidos de dirección se indican en el presente documento como corto (c), medio (m) y largo (l) con respecto a las partes de una membrana de tipo II. La secuencia del péptido de dirección indicada como corta (c) corresponde al dominio transmenbrana (tmd) de la proteína unida a la membrana. La secuencia del péptido de dirección indicada como larga (l) corresponde a la longitud del dominio transmenbrana (tmd) y la región troncal (sr). La secuencia del péptido de dirección indicada como media (m) corresponde al dominio transmenbrana (tmd) y aproximadamente a la mitad de la longitud de la región troncal (sr). Las regiones del dominio catalítico se indican en el presente documento por el número de deleción de nucleótido con respecto a su enzima de glicosilación de tipo silvestre.

Sub-bibliotecas

En algunos casos, una biblioteca de ácidos nucléicos combinatoria de la invención puede ensamblarse directamente a partir de genes existentes o de tipo silvestre. Preferentemente, la biblioteca de ADN se ensambla a partir de la fusión de dos o más sub-bibliotecas. Mediante el ligamiento en fase de las sub-bibliotecas, es posible crear un gran número de construcciones genéticas nuevas que codifican dominios de proteínas dirigidas útiles tales como las que tienen actividades de glicosilación.

5 Sub-bibliotecas de dominios catalíticos que codifican actividades de glicosilación

Una sub-biblioteca útil incluye secuencias de ADN que codifican enzimas tales como glicosidasas (por ejemplo manosidasas), glicosiltransferasas (por ejemplo, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas), GlcNAc transferasas y sialiltransferasas. Pueden seleccionarse dominios catalíticos del huésped a modificar por ingeniería genética, así como de otros organismos relacionados o no relacionados. Son útiles enzimas de mamífero,

10 de plantas, de insectos, de reptiles, de algas o fúngicas y deben elegirse para representar un amplio espectro de propiedades bioquímicas con respecto a los valores óptimos de temperatura y pH. Preferentemente, los genes se truncan para proporcionar fragmentos de los que algunos codifican los dominios catalíticos de las enzimas. Mediante la retirada de secuencias de dirección endógenas, las enzimas pueden redirigirse y expresarse en otros loci celulares.

15 La elección de dichos dominios catalíticos puede guiarse por el conocimiento del entorno particular en el que el dominio catalítico posteriormente va a ser activo. Por ejemplo, si una enzima de glicosilación particular va a ser activa en el Golgi posterior, y todas las enzimas conocidas del organismo huésped en el Golgi posterior tienen un cierto valor óptimo de pH, o se sabe que el Golgi posterior tiene un pH particular, entonces se elige un dominio catalítico que presente una actividad adecuada, y preferentemente máxima, a ese pH, como se ha analizado

20 anteriormente.

Sub-bibliotecas de secuencias de péptido de dirección

Otra sub-biblioteca útil incluye secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos señal de dirección que dan como resultado la localización de una proteína en una localización particular dentro del ER, Golgi o la red trans Golgi. Estos péptidos de dirección pueden seleccionarse del organismo huésped a modificar por ingeniería genética así 25 como de otros organismos relacionados o no relacionados. Generalmente dichas secuencias se incluyen en tres categorías: (1) secuencias N-terminales que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmenbrana (tmd) y parte o todo de una región troncal (sr), que conjuntamente o individualmente anclan proteínas a la membrana interna (luminal) del Golgi; (2) señales de recuperación que generalmente se encuentran en el extremo C tales como el tetrapéptido HAZEL (SEC ID Nº 41) o KDEL (SEC ID Nº 42); y (3) regiones transmenbrana de diversas proteínas,

30 por ejemplo, transportadores de nucleótido-azúcar, que se sabe que se localizan en el Golgi.

En el primer caso, cuando el péptido de dirección consiste en varios elementos (ct, tmd y sr), la biblioteca se denomina de tal forma que la ct, el tmd y las diversas partes de la región troncal estén representados. Por consiguiente, una sub-biblioteca de secuencias de péptidos de dirección incluye preferentemente secuencias de ct, tmd y/o sr de proteínas unidas a la membrana del RE o Golgi. En algunos casos, puede ser deseable proporcionar la

35 sub-biblioteca con longitudes variables de secuencia de sr. Esto puede conseguirse mediante PCR usando cebadores que se unen al extremo 5’ del ADN que codifica la región citosólica y empleando una serie de cebadores opuestos que se unen a diversas partes de la región troncal.

Otras fuentes adicionales útiles de secuencias de péptidos de dirección incluyen péptidos señal de recuperación, por ejemplo, los tetrapéptidos HDEL o KDEL, que normalmente se encuentran en el extremo C de proteínas que se

40 transportan de forma retrógrada al RE o Golgi. Otras fuentes adicionales de secuencias de péptidos de dirección incluyen (a) proteínas de membrana de tipo II, (b) las enzimas indicadas en la Tabla 3, (c) transportadores de nucleótido-azúcar transmenbrana que se localizan en el Golgi y (d) secuencias indicadas en la Tabla 5.

Tabla 5. Fuentes de secuencias de dirección compartimentales útiles

Gen o Secuencia

Organismo Función Localización del Producto Génico

MNSI

A. nidulans α-1,2-manosidasa RE

MNSI

A. niger α-1,2-manosidasa RE

MNSI

S. cerevisiae α-1,2-manosidasa RE

GLSI

S. cerevisiae glucosidasa RE

GLSI

A. niger glucosidasa RE

GLSI

A. nidulans glucosidasa RE

HDEL en el extremo C

Universal en hongos señal de recuperación RE

SEC12

S. cerevisiae proteína de vesícula COPII RE/Golgi

SEC12

A. niger proteína de vesícula COPH RE/Golgi

OCH1

S. cerevisiae 1,6-manosiltransferasa Golgi (cis)

OCH1

P. pastoris 1,6-manosiltransferasa Golgi (cis)

MNN9

S. cerevisiae complejo 1,6manosiltransferasa Golgi

MNN9

A. niger no determinado Golgi

VAN1

S. cerevisiae no determinado Golgi

VAN1

A. niger no determinado Golgi

ANP1

S. cerevisiae no determinado Golgi

HOCI

S. cerevisiae no determinado Golgi

MNN10

S. cerevisiae no determinado Golgi

MNN10

A. niger no determinado Golgi

MNN11

S. cerevisiae no determinado Golgi (cis)

MNN11

A. niger no determinado Golgi (cis)

MNT1

S. cerevisiae 1,2-manosiltransferasa Golgi (cis, medio)

KTR1

P. pastoris no determinado Golgi (medio)

KRE2

P. pastoris no determinado Golgi (medio)

KTR3

P. pastoris no determinado Golgi (medio)

MNN2

S. cerevisiae 1,2-manosiltransferasa Golgi (medio)

KTR1

S. cerevisiae no determinado Golgi (medio)

KTR2

S. cerevisiae no determinado Golgi (medio)

MNN1

S. cerevisiae 1,3-manosiltransferasa Golgi (trans)

MNN6

S. cerevisiae fosfomanosiltransferasa Golgi (trans)

2,6 ST

H. sapiens 2,6-sialiltransferasa red trans Golgi

UDP-Gal T

S. pombe Transportador de UDP-Gal Golgi

En cualquier caso, es muy preferido que se seleccionen secuencias del péptido de dirección que sean apropiadas para que la actividad o actividades enzimáticas particulares funcionen óptimamente dentro de la secuencia de reacciones de glicosilación deseadas. Por ejemplo, para desarrollar un microorganismo modificado capaz de realizar 5 una sialilación terminal de N-glicanos nacientes, un proceso que se produce en el Golgi posterior en seres humanos, es deseable usar una sub-biblioteca de secuencias de péptidos de dirección derivadas de proteínas del Golgi posterior. De forma similar, el recorte de Man8GlcNAc2 por una α-1,2-manosidasa para dar Man5GlcNAc2 es una etapa temprana en la formación de N-glicanos complejos en seres humanos (Figura 1B). Por lo tanto, es deseable que esta reacción se produzca en el RE o el Golgi anterior de un microorganismo huésped modificado por ingeniería

10 genética. Se usa una sub-biblioteca que codifica señales de retención en el RE y Golgi anterior.

Después se construye una serie de construcciones de proteínas de fusión (es decir, una biblioteca de ADN combinatoria) uniendo funcionalmente una o una serie de secuencias de péptidos de dirección a una o una serie de secuencias que codifican dominios catalíticos. Preferentemente, esto se consigue mediante ligamiento en fase de una sub-biblioteca que comprende ADN que codifica secuencias de péptidos de dirección (anteriores) con una sub15 biblioteca que comprende ADN que codifica enzimas de glicosilación o fragmentos catalíticamente activos de las

mismas (véase más adelante).

La biblioteca resultante comprende genes sintéticos que codifican proteínas de fusión que contienen secuencias de péptidos de dirección. En algunos casos es deseable proporcionar una secuencia de péptido de dirección en el extremo N de una proteína de fusión, o en otros casos en el extremo C. En algunos casos, pueden insertarse secuencias de péptidos de dirección dentro del marco de lectura abierto de una enzima, siempre que no se altere la estructura proteica de los dominios plegados individuales. Cada tipo de proteína de fusión se construye (de una forma dirigida por etapas o semi-aleatoria) y pueden seleccionarse construcciones óptimas tras la transformación de células huésped y la caracterización de patrones de glicosilación en células transformadas usando procedimientos de la invención.

Alteración de la glicosilación de la célula huésped usando construcciones de fusión de bibliotecas combinatorias:

La construcción de una biblioteca de ADN combinatoria preferida se ilustra esquemáticamente en la Figura 2 y se describe en el Ejemplo 4. La construcción de fusión puede unirse operativamente a una multitud de vectores, tales como vectores de expresión bien conocidas en la técnica. Se ensambló una amplia diversidad de dichas construcciones de fusión usando actividades representativas como las mostradas en la Tabla 6. Pueden ensamblarse combinaciones de péptidos de dirección/dominios catalíticos para uso en la dirección de actividades manosidasa, glicosiltransferasa y glicosidasa al ER, Golgi y a la red trans Golgi de acuerdo con la invención. Sorprendentemente, el mismo dominio catalítico puede tener desde un efecto nulo a un efecto muy profundo sobre los patrones de N-glicosilación, dependiendo del tipo de péptido de dirección usado (véase, por ejemplo, la Tabla 7, Ejemplo 4).

Construcciones de fusión de manosidasa

Un Ejemplo representativo de una construcción de fusión de manosidasa derivada de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pFB8, que es un péptido de dirección de SEC12(m) de Saccharomyces truncado (988-1296 nucleótidos de SEC12 de SwissProt P11655) ligado en fase a una deleción de 187 aminoácidos N-terminales de una α-manosidasa IA de ratón (Genbank AN 6678787). La nomenclatura usada en el presente documento, de esta manera, se refiere a la región de péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de glicosilación como SEC12 (m) de Saccharomyces manosidasa IA ∆187 de ratón. La proteína de fusión codificada se localiza en el RE por medio de la secuencia del péptido de dirección SEC12 mientras que conserva su actividad del dominio catalítico de manosidasa y es capaz de producir N-glicanos in vivo que tienen una estructura Man5GlcNAc2 (Ejemplo 4; Figuras 6F y 7B).

La construcción de fusión pGC5, MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón, es otro Ejemplo de una construcción de fusión que tiene actividad de recorte manosidasa intracelular (Ejemplo 4; Figuras 5D y 8B). La construcción de fusión pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆80 de C. elegans) es otro Ejemplo de una construcción de fusión eficaz capaz de producir N-glicanos que tienen una estructura Man5GlcNAc2 in vivo. Mediante la creación de una biblioteca de ADN combinatoria de estas y otras construcciones de fusión de manosidasa de acuerdo con la invención, un experto en la materia puede distinguir y seleccionar las construcciones que tienen una actividad de recorte intracelular óptima de las que tiene una actividad relativamente baja o nula. Los procedimientos que usan bibliotecas de ADN combinatorias descritas en el presente documento son ventajosos porque sólo unas pocas construcciones de fusión de manosidasa seleccionadas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.

Además, la actividad de recorte de manosidasa puede ser específica para una proteína particular de interés. De esta manera, debe entenderse adicionalmente que no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de manosidasa pueden funcionar igualmente bien para producir la glicosilación apropiada en una glicoproteína de interés. Por consiguiente, una proteína de interés puede introducirse en una célula huésped transfectada con una biblioteca de ADN combinatoria para identificar una o más construcciones de fusión que expresan una actividad manosidasa óptima para la proteína de interés. Un experto en la materia podrá producir y seleccionar construcciones de fusión óptimas usando el enfoque de biblioteca de ADN combinatoria descrito en el presente documento.

Además, es evidente que pueden obtenerse otras construcciones de fusión similares que presenten dominios catalíticos de manosidasa activos localizados (o más generalmente dominios de cualquier enzima) usando técnicas tales como las ejemplificadas en el Ejemplo 4 y descritas en el presente documento. Será una materia de experimentación rutinaria para un experto en la materia producir y usar la biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención para optimizar, por ejemplo, la producción de Man5GlcNAc2 a partir de una biblioteca de construcciones de fusión en un vector de expresión particular introducido en una célula huésped particular.

Construcciones de fusión de glicosiltransferasa

De forma similar, se fabricó una biblioteca de ADN combinatoria de glicosiltransferasa usando los procedimientos descritos en el presente documento. Una biblioteca de ADN combinatoria de secuencias derivadas de actividades glicosiltranferasa I (GnTI) se ensambló con péptidos de dirección y se exploró con respecto a la producción eficaz en una célula huésped eucariota inferior de una estructura de N-glicano GlcNAcMan5GlcNAc2 en una glicoproteína marcadora. Se identificó una construcción de fusión que se mostraba que producía GlcNAcMan5GlcNAc2 (pPB104), MNN9(s) de Saccharomyces/GnTI ∆38 humana (Ejemplo 8). Se ensambló una amplia diversidad de dichas construcciones de fusión de GnTI (Ejemplo 8, Tabla 10). Otras combinaciones de péptido de dirección/dominios catalíticos de GnTI pueden ensamblarse fácilmente mediante la obtención de una biblioteca de ADN combinatoria. También es evidente para un experto en la materia que pueden producirse, como se demuestra en el Ejemplo 8, otras construcciones de fusión similares que presentan actividad glicosiltransferasa. Será una materia de experimentación rutinaria para un experto en la materia el uso del procedimiento de biblioteca de ADN combinatoria descrito en el presente documento para optimizar la producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 usando una construcción de fusión seleccionada en un vector de expresión particular y una línea de células huésped.

Como se ha indicado anteriormente para las construcciones de fusión de manosidasa, no todas las construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de GnTI funcionarán igualmente bien para producir la glicosilación apropiada en una glicoproteína de interés como se describe en el presente documento. Sin embargo, un experto en la materia podrá producir y seleccionar construcciones de fusión óptimas usando un enfoque de biblioteca de ADN como se describe en el presente documento. El Ejemplo 8 ilustra una realización preferida de una biblioteca de ADN combinatoria que comprende péptidos de dirección y construcciones de fusión de dominio catalítico de GnTI implicadas en la producción de glicoproteínas con una estructura predominantemente GlcNACMan5GlcNAc2.

Uso de Múltiples Construcciones de Fusión para Alterar la Glicosilación de Células Huésped

En otro Ejemplo del uso de los procedimientos y bibliotecas de la invención para alterar la glicosilación de células huésped, una cepa de P. pastoris con una deleción OCH1 que expresa una proteína indicadora (K3) se transformó con múltiples construcciones de fusión aisladas a partir de bibliotecas combinatorias de la invención para convertir N-glicanos de alto contenido de manosa en N-glicanos de tipo humano (Ejemplo 8). En primer lugar, la construcción de fusión de manosidasa pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) se introdujo por transformación en una cepa de P. pastoris que carecía de la actividad manosil transferasa de iniciación 1,6 (es decir, delección och1; Ejemplo 1). En segundo lugar, se construyó pPB103 que comprendía un gen a MNN2-2 de K. lactis (GenbankAN AF106080) que codificaba un transportador de UDP-GlcNAc para aumentar la producción adicional de GlcNAcMan5GlcNAc2. La adición del transportador de UDP-GlcNAc aumentó la producción de GlcNAcMan5GlcNAc2 significativamente en la cepa de P. pastoris como se ilustra en la Figura 10B. En tercer lugar, se introdujo pPB104 que comprendía MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI ∆38 humana en la cepa. Esta cepa de P. pastoris se denomina “PBP-3" (Véase la Figura 36).

El experto en la materia entenderá que las células huésped tales como las cepas de levadura descritas anteriormente pueden transformarse y/o co-transformarse secuencialmente con uno o más vectores de expresión. También se entiende que el orden de transformación no es particularmente relevante para la producción de la glicoproteína de interés. El experto en la materia reconoce modificaciones rutinarias de los procedimientos desvelados en el presente documento pueden proporcionar resultados mejorados en la producción de la glicoproteína de interés.

La importancia del uso de una secuencia de un péptido de dirección particular con una secuencia de un dominio catalítico particular se pone de manifiesto fácilmente por los experimentos descritos en el presente documento. La biblioteca de ADN combinatoria proporciona una herramienta para construir fusiones enzimáticas que están implicadas en la modificación de N-glicanos en una glicoproteína de interés, que es especialmente útil para la producción de glicoproteínas de tipo humano. (Sin embargo, puede seleccionarse cualquier fusión enzimática usando bibliotecas y procedimientos descritos en el presente documento). Los transformantes deseados que expresan la α1,2-manosidasa activa, dirigida de manera apropiada, producen K3 con N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2 como se muestra en las Figuras 5D y 5E. Esto confiere una masa molecular reducida al glicano escindido en comparación con la proteína K3 de la cepa de deleción OCH1 parental, como se detectó por espectrometría de masas MALDI-TOF en la Figura 5C.

De forma similar, se usó el mismo enfoque para producir otra glicoproteína secretada: IFN-β que comprende predominantemente Man5GlcNAc2. El Man5GlcNAc2 se retiró por digestión con PNGasa (Papac y col. (1998) Glycobiology 8: 445-454) y se sometió a MALDI-TOF como se muestra en las Figuras 6A-6F. Un solo pico prominente a 1254 (m/z) confirma la producción de Man5GlcNA2 en IFN-β en las Figuras 6E (pGC5) (MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón) y 6F (pFB8) (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón). Además, en la cepa PBP-3 de P. pastoris que comprende pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón), pPB104 (MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI ∆38 humana) y pPB103 (gen MNN2-2 de K. lactis), se detectó el N-glicano híbrido GlcNAcMan5GlcNAc2 [b] por MALDI-TOF (Figura 10).

Después de identificar los transformantes con un alto grado de recorte de manosa, se realizaron experimentos adicionales para confirmar que la actividad manosidasa (de recorte) se producía in vivo y no era predominantemente el resultado de una actividad extracelular en el medio de crecimiento (Ejemplo 6; Figuras 7-9).

Aunque la presente invención se ejemplifica usando un organismo huésped de P. pastoris, los expertos en la materia entenderán que otras células huésped y eucariotas, incluyendo otras especies de huéspedes de levadura y fúngicos, pueden alterarse como se describe en el presente documento para producir glicoproteínas de tipo humano. Se entiende que las técnicas descritas en el presente documento para la identificación y alteración de genes de glicosilación de células huésped indeseables, por ejemplo, OCH1, son aplicables para estos y/u otros genes homólogos o funcionalmente relacionados en otras células huésped y eucariotas tales como otras cepas de levaduras y hongos. Como se describe en el Ejemplo 9, se delecionaron genes och1 mnnI de K. lactis para obtener por ingeniería genética una célula huésped que condujera a N-glicanos que se convierten completamente en Man5GlcNAc2 por la 1,2-manosidasa (Figura 12C).

El gen MNN1 se clonó a partir de K. lactis como se describe en el Ejemplo 9. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos deducida del gen MNN1 de K. lactis se muestran en las SEC ID Nº: 43 y 44, respectivamente. Usando cebadores específicos de genes, se realizó una construcción para delecionar el gen MNN1 del genoma de K. lactis (Ejemplo 9). Las células huésped con las actividades och1 y mnn1 anuladas producen N-glicanos que tienen una estructura de carbohidratos Man9GlcNAc2 (véase, por ejemplo la Figura 12B). Dichas células huésped pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente usando, por ejemplo, procedimientos y bibliotecas de la invención descritas en el presente documento, para producir glicoproteínas de tipo de mamífero o de tipo humano.

De esta manera, en el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en al menos cuarenta y cinco, preferentemente al menos 50, más preferentemente al menos 60 y aun más preferentemente 75 o más restos de nucleótidos del gen MNN1 de K. lactis (SEC ID Nº: 43) y homólogos, variantes y derivados de la misma. También se describen moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma similar, se proporcionan polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Además, en el presente documento se describen vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico.

De forma similar, se proporcionan células huésped transformadas con las moléculas de ácido nucleico o vectores.

Otro aspecto de la presente invención, de esta manera, se refiere a una cepa huésped fúngica unicelular y pluricelular que expresa glicoproteínas que comprenden N-glicanos modificados que se parecen a los fabricados por las células humanas a lo largo de la ruta de secreción de la célula huésped donde son capaces de funcionar, y preferentemente donde se diseñan o seleccionan para funcionar de la forma más eficaz.

También pueden modificarse por ingeniería genética células vegetales y de insectos para alterar la glicosilación de proteínas expresadas usando la biblioteca combinatoria y procedimientos descritos en el presente documento. Además, también puede modificarse la glicosilación en células de mamífero, incluyendo células humanas, usando la biblioteca combinatoria y procedimientos descritos en el presente documento. Puede ser posible, por ejemplo, optimizar una actividad enzimática particular o modificar de otra manera las proporciones relativas de diversos Nglicanos obtenidos en una célula huésped de mamífero usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos descritos en el presente documento.

Son ejemplos de modificaciones de la glicosilación que puede verse afectada usando dicho procedimiento: (1) obtención por ingeniería genética de una célula huésped y eucariota para recortar restos de manosa de Man8GlcNAc2 para producir un N-glicano Man5GlcNAc2; (2) obtención por ingeniería genética de una célula huésped y eucariota para añadir un resto de N-acetilglucosamina (GlcNAc) a Man5GlcNAc2 por la acción de GlcNAc transferasa I; (3) obtención por ingeniería genética de una célula huésped y eucariota para expresar funcionalmente una enzima tal como N-acetilglucosaminil Transferasa III (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI), manosidasa II, fucosiltransferasa (FT), galactosil transferasa (GalT) o una sialiltransferasa (ST).

Repitiendo el procedimiento, pueden obtenerse por ingeniería genética rutas de glicosilación cada vez más complejas en un huésped diana, tal como un microorganismo y eucariota inferior. En una realización preferida, el organismo huésped de la invención se transforma dos o más veces con bibliotecas de ADN que incluyen secuencias que codifican actividades de glicosilación. La selección de los fenotipos deseados puede realizarse después de cada vuelta de transformación o, como alternativa, después de que se hayan producido varias transformaciones. De esta manera, pueden obtenerse rápidamente por ingeniería genética rutas de glicosilación compleja.

Reacciones de Glicosilación Secuenciales

En una realización preferida, dichas bibliotecas de péptido de dirección/dominio catalítico se diseñan para incorporar información existente sobre la naturaleza secuencial de reacciones de glicosilación en eucariotas superiores. Las reacciones que se sabe que se producen pronto en el transcurso del procesamiento de una glicoproteína requieren la dirección de enzimas que catalizan dichas reacciones a una parte anterior del Golgi o el RE. Por ejemplo, el recorte de Man8GlcNAc2 para dar Man5GlcNAc2 por manosidasas es una etapa temprana en la formación de Nglicanos complejos (Figuras 1B y 35A). Como el procesamiento de proteínas se inicia en el RE y después avanza a través del Golgi anterior, medio y posterior, es deseable que esta reacción se produzca en el RE o en el Golgi anterior. Cuando se diseña una biblioteca para la localización de manosidasa I, por ejemplo, se intenta que las señales de dirección al RE y Golgi anterior correspondan con el dominio catalítico de manosidasa I.

Generación de Diversidad de Secuencia Adicional

El procedimiento descrito en el presente documento es máximamente eficaz cuando un ácido nucleico, por ejemplo, una biblioteca de ADN introducida por transformación en el huésped, contiene una gran diversidad de secuencias, aumentando de esta manera la probabilidad de que al menos un transformante presente el fenotipo deseado. Por ejemplo, las mutaciones de aminoácidos individuales pueden alterar espectacularmente la actividad de enzimas de procesamiento de glicoproteínas (Romero y col. (2000) J. Biol. Chem. 275(15):11071-4). Por consiguiente, antes de la transformación, una biblioteca de ADN o una subbiblioteca constituyente puede someterse a una o más técnicas para generar una diversidad de secuencia adicional. Por ejemplo, pueden realizarse una o más vueltas de combinación de genes, PCR propensa a error, mutagénesis in vitro u otros procedimientos para generar diversidad de secuencias, para obtener una gran diversidad de secuencias dentro del grupo de construcciones de fusión.

Secuencias de Control de la Expresión

Además de las secuencias en marco de lectura abierto descritas anteriormente, generalmente es preferible proporcionar cada construcción de biblioteca con secuencias de control de la expresión, tales como promotores, terminadores de la transcripción, potenciadores, sitios de unión a ribosomas y otra secuencias funcionales que pueden ser necesarias para asegurar la transcripción y traducción eficaz de las proteínas de fusión tras la introducción de las construcciones de fusión en el organismo huésped por transformación.

Se seleccionan componentes del vector adecuados, por ejemplo, marcadores de selección, secuencias de control de la expresión (por ejemplo promotor, potenciadores, terminadores y similares) y, opcionalmente, secuencias necesarias para la replicación autónoma en una célula huésped, en función de la célula huésped particular que se elija. Los criterios de selección de los componentes del vector adecuados para su uso en una célula huésped de mamífero o eucariota inferior particular son rutinarios. Las células huésped y eucariotas inferiores preferidas de la invención incluyen Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp. Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa. Cuando el huésped es Pichia pastoris, los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores AOX1, AOX2, GAPDH y P40.

Marcadores de Selección

También es preferible proporcionar cada construcción con al menos un marcador de selección, tal como un gen para impartir la existencia a fármacos o para complementar una lesión metabólica del huésped. La presencia del marcador es útil en la selección posterior de transformantes; por ejemplo, en levadura, pueden usarse los genes URA3, HIS4, SUC2, G418, BLA o SH BLE. Se conocen una multitud de marcadores de selección y están disponibles para uso en levaduras, hongos, células vegetales, de insecto, de mamífero y otras células huésped eucariotas.

Transformación

La biblioteca de ácido nucleico después se usa para transformar el organismo huésped. En levadura, puede usarse cualquier procedimiento conveniente de transferencia de ADN, tal como electroporación, el procedimiento de cloruro de litio o el procedimiento de esferoplastos. En hongos filamentosos y células vegetales, los procedimientos convencionales incluyen bombardeo de partículas, electroporación y transformación mediada por agrobacterium. Para producir una cepa estable adecuada para cultivo de alta densidad (por ejemplo fermentación en levaduras), es deseable integrar las construcciones de biblioteca de ADN en el cromosoma del huésped. Preferentemente, la integración se realiza mediante recombinación homóloga, usando técnicas bien conocidas en este campo. Por ejemplo, se proporcionan elementos de biblioteca de ADN con secuencias flanqueantes homólogas a secuencias del organismo huésped. De esta manera, la integración se produce en un sitio definido en el genoma del huésped, sin alteración de genes deseables o esenciales.

Se prefiere especialmente integrar el ADN de la biblioteca en el sitio de un gen indeseado en el cromosoma del huésped, realizando la alteración o delección del gen. Por ejemplo, la integración en los sitios de los genes OCH1, MNN1 o MNN4 permite la expresión del ADN de la biblioteca deseado mientras que se impide la expresión de enzimas implicadas en la hipermanosilación de glicoproteínas en levaduras. También puede introducirse ADN de la biblioteca en el huésped a través de una molécula de ácido nucleico, plásmido, vector (por ejemplo vector viral o retroviral), cromosoma y puede introducirse como una molécula de ácido nucleico autónoma o por integración homóloga o aleatoria en el genoma del huésped. En cualquier caso, generalmente es deseable incluir con cada construcción de ADN de la biblioteca al menos un gen de marcador de selección para permitir la selección temprana de organismos huésped que se han transformado de forma estable. Son especialmente adecuados genes marcadores reciclables tales como ura3, que pueden seleccionarse a favor o en contra.

Procedimientos de Exploración y Selección

Después de la transformación de la cepa huésped con la biblioteca de ADN, se seleccionan los transformantes que presentan un fenotipo de glicosilación deseado. La selección puede realizarse en una sola etapa o por una serie de etapas de enriquecimiento fenotípico y/o reducción usando cualquiera de una diversidad de ensayos o procedimientos de detección. La caracterización fenotípica puede realizarse de forma manual o usando un equipo de exploración de alto rendimiento automático. Comúnmente, un microorganismo huésped presenta N-glicanos en proteínas de la superficie celular, donde se localizan diversas glicoproteínas.

Se pueden seleccionar las células que tienen la mayor concentración de GlcNAc terminal en la superficie celular, por ejemplo, o las células que secretan la proteína con el mayor contenido de GlcNAc terminal. Dicha selección puede basarse en un procedimiento visual, tal como un procedimiento de tinción, en la capacidad de unir anticuerpos de unión a GlcNAc terminal específicos o lectinas conjugadas con un marcador (dichas lectinas están disponibles en

E.Y. Laboratories Inc., San Mateo, CA), la capacidad reducida de lectinas específicas de unirse a restos de manosa terminales, la capacidad de incorporar un azúcar marcado radiactivamente in vitro, la unión alterada a colorantes o superficies cargadas, puede realizarse usando un dispositivo de Clasificación de Células Asistida por Fluorescencia (FACS) junto con un anticuerpo o lectina marcada con fluoróforo (Guillen y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci: USA 95(114): 7888-7892).

Por consiguiente, entre las células intactas puede seleccionarse un fenotipo de glicosilación deseado por exposición de las células a una lectina o anticuerpo que se une específicamente al N-glicano deseado. En el mercado están disponibles una amplia diversidad de lectinas específicas de oligosacáridos (por ejemplo, en EY Laboratories, San Mateo, CA). Como alternativa, en el mercado están disponibles anticuerpos contra N-glicanos humanos o animales específicos o pueden producirse usando técnicas convencionales. Una lectina o anticuerpo apropiado puede conjugarse con una molécula indicadora, tal como un cromóforo, fluoróforo o radioisótopo o una enzima que tenga un sustrato cromogénico (Guillen y col., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14): 7888-7892).

Después puede realizarse la exploración usando procedimientos analíticos tales como espectrofotometría, fluorimetría, clasificación de células activada por fluorescencia o recuento de centelleo. En otros casos, puede ser necesario analizar glicoproteínas aisladas o N-glicanos en las células transformadas. El aislamiento de proteínas puede realizarse por técnicas conocidas en este campo. Preferentemente, una proteína indicadora se secreta al medio y se purifica por cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad Ni o cromatografía de afinidad de glutatión-S-transferasa). En casos en los que se prefiere un N-glicano aislado, puede usarse una enzima tal como endo-β-N-acetilglucosaminidasa (Genzyme Co., Boston, MA; New England Biolabs, Beverly, MA) para escindir los N-glicanos de glicoproteínas. Después pueden analizarse las proteínas o N-glicanos aislados por cromatográfica líquida (por ejemplo HPLC), espectroscopía de masas u otros medios adecuados. La Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 enseña varios procedimientos por medio de los cuales pueden identificarse células con estructuras de carbohidrato extracelulares deseadas.

Preferentemente, se usa espectrometría de masas MALDI-TOF para analizar los N-glicanos escindidos.

Antes de la selección de un transformante deseado, puede ser deseable reducir la población transformada de células que tienen fenotipos indeseados. Por ejemplo, cuando el procedimiento se usa para obtener por ingeniería genética una actividad manosidasa funcional en células, los transformantes deseados tendrán menores niveles de manosa en la glicoproteína celular. La exposición de la población transformada a un radioisótopo letal de manosa en el medio reduce la población de transformantes que tienen el fenotipo indeseado, es decir, altos niveles de manosa incorporada (Huffaker y Robbins (1983) Proc Natl Acad Sci USA. 80(24): 7466-70). Como alternativa, puede usarse un anticuerpo o lectina citotóxica, dirigida contra un N-glicano indeseable para reducir una población transformada de fenotipos indeseados (por ejemplo, Stanley y Siminovitch (1977) Somatic Cell Genet 3 (4): 391-405). La Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900 enseña varios procedimientos por medio de los cuales pueden identificarse células con estructuras de carbohidrato extracelulares deseadas. La realización repetida de esta estrategia permite la obtención por ingeniería genética secuencial de glicanos más numerosos y más complejos en eucariotas inferiores.

Para detectar células huésped que tienen en su superficie un alto grado de intermedio de N-glicano de tipo humano GlcNAcMan3GlcNAc2, por ejemplo, se pueden seleccionar transformantes que permitan la transferencia más eficaz de GlcNAc por GlcNAc transferasa desde UDP-GlcNAc en un ensayo celular in vitro. Esta exploración puede realizarse cultivando células que llevan la biblioteca transformada a presión selectiva en una placa de agar y transfiriendo colonias individuales a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Después de cultivar las células, las células se centrifugan, las células se resuspenden en tampón y después de la adición de UDP-GlcNAc y GnTII, se determina la liberación de TJDP por HPLC o un ensayo ligado a enzimas para UDP. Como alternativa, se puede usar UDP-GlcNAc marcado radiactivamente y GnTII, lavar las células y después buscar la liberación de GlcNAc radiactivo por N-acetilglucosaminidasa. Todo esto puede realizarse manual o automáticamente mediante el uso de un equipo de exploración de alto rendimiento. Es de esperar que los transformantes que liberan más UDP, en el primer ensayo, o más GlcNAc marcado radiactivamente en el segundo ensayo, tengan un mayor grado de GlcNAcMan3GlcNAc2 en su superficie y por lo tanto constituyan el fenotipo deseado. Pueden adaptarse ensayos similares para observar también los N-glicanos en proteínas secretadas.

Como alternativa, se puede usar cualquier otra exploración adecuada tal como un ensayo de unión de lectina que puede revelar patrones de glicosilación alterados en la superficie de células transformadas. En este caso, la unión reducida de lectinas específicas a manosas terminales puede ser una herramienta de selección adecuada. La lectina de Galantus nivalis se une específicamente a α-1,3-manosa terminal, lo cual es de esperar que se reduzca si está presente suficiente actividad manosidasa II en el Golgi. También se pueden enriquecer con respecto a los transformantes deseados realizando una etapa de separación cromatográfica que permita la eliminación de células

5 que contienen un alto contenido de manosa terminal. Esta etapa de separación se realizaría con una columna de lectina que se une específicamente a células con un alto contenido de manosa terminal (por ejemplo, la lectina de Galantus nivalis unida a agarosa, Sigma, St. Louis, MO) con respecto a las que tienen un bajo contenido de manosa terminal.

Además, se puede crear directamente dichas construcciones de proteínas de fusión, ya que en la bibliografía

10 científica está disponible información adicional sobre la localización de enzimas modificadoras de carbohidratos activas en diferentes huéspedes y eucariotas inferiores. Por ejemplo, se sabe que β1,4-GalTr humano puede fusionarse al dominio de membrana de MNT, una manosiltransferasa de S. cerevisiae, y localizarse en el aparato de Golgi mientras se conserva su actividad catalítica (Schwientek y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Si S. cerevisiae o un organismo relacionado él es huésped a modificar por ingeniería genética se puede incorporar

15 directamente dichos descubrimientos en la estrategia global para obtener N-glicanos complejos a partir de dicho huésped. Se han identificado varios de dichos fragmentos génicos en P. pastoris que están relacionados con glicosiltransferasas en S. cerevisiae y, por lo tanto, podrían usarse para este fin.

Sitios de Integración

Como un objetivo final de este esfuerzo de ingeniería genética es una cepa sólida de producción de proteínas que

20 pueda comportarse bien en un proceso de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma del huésped (por ejemplo hongo) preferentemente implica una planificación cuidadosa. La cepa modificada por ingeniería genética probablemente tendrá que transformarse con una serie de genes diferentes, y estos genes tendrán que transformar de una forma estable para asegurar que se mantiene la actividad deseada a lo largo de todo el proceso de fermentación. Como se describe en el presente documento, en el huésped de expresión

25 de proteínas fúngico puede introducirse por ingeniería genética cualquier combinación de diversas actividades enzimáticas deseadas, por ejemplo, sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos del RE y Golgi (por ejemplo, transportadores sinporte y antiporte para UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos, y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacáridos activados tales como UDP

30 galactosa, CMP-ácido N-acetilneuramínico. En la Tabla 6 se muestra Ejemplos de procedimientos preferidos para modificar la glicosilación en una célula huésped eucariota inferior, tal como Pichia pastoris.

Tabla 6. Algunas realizaciones preferidas para modificar la glicosilación en un microorganismo eucariota inferior

Estructura Deseada

Actividades Catalíticas Adecuadas Fuentes Adecuadas de Secuencias de Localización Deleciones Génicas Adecuadas Transportadore s y/o Fosfatasas Adecuados

Man5GlcNAc2

α-1,2manosidasa (murina, humana, Bacillus sp., A. nidulans) Mns1 (extremo N, S. cerevisiae) Och1 (extremo N, S. cerevisiae, P. pastoris) Ktr1 Mnn9 Mnt1 (S. cerevisiae) KDEL, HDEL (extremo C) OCH1 MNN4 MNN6 Ninguno

Estructura Deseada

Actividades Catalíticas Adecuadas Fuentes Adecuadas de Secuencias de Localización Deleciones Génicas Adecuadas Transportadore s y/o Fosfatasas Adecuados

GlcNAcMan5GlcNAc2

GlcNAc Transferasa l, (humana, murina, rata etc.) Och1 (extremo N, S. cerevisiae, P. pastoris) KTR1 (extremo N) Mnn1 (extremo N, S. cerevisiae) Mnt1 (extremo N, S. cerevisiae) GDPasa (extremo N, S. cerevisiae) OCH1 MNN4 MNN6 Transportador de UDP-GlcNAc (humano, murino, K. lactis) UDPasa (humana)

GlcNAcMan3GlcNAc2

manosidasa II Ktr1 Mnn1 (extremo N, S. cerevisiae) Mnt1 (extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae) OCH1 MNN4 MNN6 Transportador de UDP-GlcNAc (humano, murino, K. lactis) UDPasa (humana)

GlcNAC(2-4)-Man3GlcNAc2

GlcNAc Mnn1 OCH1 MNN4 Transportador

Transferasa II,

(extremo N, S. MNN6OCH1 de UDP-GlcNAc

III, IV, V (humana, murina)

cerevisiae) Mnt1 (extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktrl (P. pastoris) Mnnl (S. cerevisiae) MNN4 MNN6 (humano, murino, K. lactis) UDPasa (humana)

Estructura Deseada

Actividades Catalíticas Adecuadas Fuentes Adecuadas de Secuencias de Localización Deleciones Génicas Adecuadas Transportadore s y/o Fosfatasas Adecuados

Cal(1-4)GlcNAC(2-4)-Man3GlcNAc2

β-1,4Galactosil transferasa (humano) Mnn1 (Extremo N, S. cerevisiae) Mnt1 (Extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae) transportador de UDP-Galactosa (humano, S.pombe)

NANA(1-4)-Gal(1-4)GlcNAc(2-4)-Man3GlcNAc2

α-2,6Sialiltransfer asa (humana) α-2,3Sialiltransfer Asa KTR1 MNN1 (Extremo N, S. cerevisiae) MNT1 (Extremo N, S. cerevisiae) Kre2/Mnt1 (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) Ktrl (P. pastoris) MNN1 (S. cerevisiae) OCH1 MNN4 MNN6 Transportador de CMP-ácido Siálico (humano)

Como cualquier estrategia para modificar por ingeniería genética la formación de N-glicanos complejos en una célula huésped tal como un eucariota inferior implica tanto la eliminación como la adición de actividades glicosiltransferasa particulares, un esquema exhaustivo intentará coordinar los dos requisitos. Los genes que codifican enzimas que 5 son indeseables sirven como sitios de integración potenciales para genes que son deseables. Por ejemplo, la actividad 1,6 manosiltransferasa es un rasgo característico de la glicosilación en muchos eucariotas inferiores conocidos. El gen que codifica la alfa-1,6 manosiltransferasa (OCH1) se ha clonado a partir de S. cerevisiae y mutaciones en el gen dan lugar a un fenotipo viable con manosilación reducida. Por lo tanto, el locus génico que codifica la actividad alfa-1,6 manosiltransferasa es una diana principal para la integración de genes que codifican la

10 actividad glicosiltransferasa. De una manera similar, se puede elegir una serie de sitios de integración cromosómica distintos que, basándose en un acontecimiento de alteración génica en ese locus, es de esperar que: (1) mejoren la capacidad de las células para glicosilar de una forma más humana, (2) mejoren la capacidad de las células para secretar proteínas, (3) reduzcan la proteólisis de proteínas extrañas y (4) mejoren otras características del proceso que facilitan la purificación del propio proceso de fermentación.

15 Glicoproteínas Diana

Los procedimientos descritos en el presente documento son útiles para producir glicoproteínas, especialmente glicoproteínas usadas terapéuticamente en seres humanos. Pueden ser especialmente útiles glicoproteínas que tienen glicoformas específicas, por ejemplo, en la dirección de proteínas terapéuticas. Por ejemplo, se ha mostrado que la manosa-6-fosfato dirige proteínas al lisosoma, lo cual puede ser esencial para el funcionamiento apropiado de 20 varias enzimas relacionadas con trastornos de almacenamiento lisosomal tales como enfermedad de Gaucher, de Hunter, de Hurler, de Scheie, de Fabry y de Tay-Sashs, por mencionar solo algunas. De forma similar, la adición de uno o más restos de ácido siálico a una cadena lateral de glicano puede aumentar la duración de una glicoproteína terapéutica in vivo después de la administración. Por consiguiente, pueden modificarse por ingeniería genética

células huésped (por ejemplo, eucariotas inferiores o de mamífero) para aumentar el grado de ácido siálico terminal en glicoproteínas expresadas en las células. Como alternativa, el ácido siálico puede conjugarse con la proteína de interés in vitro antes de la administración usando una ácido siálico transferasa y un sustrato apropiado. Pueden emplearse cambios en la composición del medio de crecimiento además de la expresión de actividades enzimáticas implicadas en la glicosilación de tipo humano para producir glicoproteínas que se parezcan más a formas humanas (Weikert y col. (1999) Nature Biotechnology 17, 1116-1121; Werner y col. (1998) Arzneimittelforschung 48(8): 870880; Andersen y Goochee (1994) Cur. Opin. Biotechnol. 5: 546-549; Yang y Butler (2000) Biotechnol. Bioengin. 68(4): 370-380). Se ha mostrado que modificaciones de glicano específicas en anticuerpos monoclonales (por ejemplo, la adición de GlcNAc de bisección) mejora la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80), que puede ser deseable para la producción de anticuerpos u otras proteínas terapéuticas.

Las proteínas terapéuticas normalmente se administran por inyección, por vía oral, pulmonar u otros medios. Los Ejemplos de glicoproteínas de dirección adecuadas que pueden producirse de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación: eritropoyetina, citocinas tales como interferón-α, interferón-β, interferón-γ, interferón-ω y factor estimulante de colonias de granulocitos (granulocito-CSF), factores de coagulaciones tales como factor VIII, factor IX; y proteína C humana, cadena α de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa e inhibidor de urea tripsina, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina factor 2 del crecimiento del endotelio vascular, factor 1 inhibidor del progenitor de mieloides, osteoprotegerina, antitripsina α-1, DNasa II, α-feto proteínas, AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína 1 de unión a TNF alfa), TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio y elemento de interacción del ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimuladora del folículo) GM-CSF, GLP-1 con y sin FC (proteína 1 similar a glucagón), agonista del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel, fusión Fc del receptor de TNF soluble alfa), ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos-Ig).

Expresión de GnT-III para Reforzar la Funcionalidad de Anticuerpos

La adición de restos de N-acetilglucosamina a la estructura GlcNAcMan3GlcNAc2 por Nacetilglucosaminiltransferasas II y III produce un denominado N-glicano biseccionado GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Figura 15). Esta estructura se ha implicado en una mayor citotoxidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80). La remodificación por ingeniería genética de glicoformas de inmunoglobulinas expresadas por células de mamífero es una tarea tediosa y problemática. Especialmente en el caso de GnTIII, en el que la sobre expresión de esta enzima se ha implicado en la inhibición del crecimiento, tenían que emplearse procedimientos que implicaban una expresión génica regulada (inducible) para producir inmunoglobulinas con N-glicanos biseccionados (Umana y col. (1999) Biotechnol Bioeng. 65(5): 542-9; Umana y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80); Umana y col. documento WO 03/011878; Patente de Estados Unidos Nº

6.602.684.

Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona sistemas y procedimientos para producir N-glicanos de tipo humano que tienen N-acetilglucosamina de bisección (GlcNAc) en una estructura central de trimanosa o pentamanosa. En una realización preferida, la invención proporciona un sistema y procedimiento para producir inmunoglobulinas que tienen N-glicanos biseccionados. Este sistema y procedimientos descritos en el presente documento no padecerán los problemas previos, por ejemplo citotoxicidad asociada con la sobreexpresión de GnTIII

o ADCC, ya que las células huésped de la invención se modifican por ingeniería genética y seleccionan para ser viables y preferentemente células sólidas que producen N-glicanos que tienen glicoformas de tipo humano sustancialmente modificadas tales como GlcNAc2Man3GlcNAc2. De esta manera, la adición de una Nacetilglucosamina de bisección en una célula huésped de la invención tendrá un efecto insignificante sobre el fenotipo de crecimiento o la viabilidad de esas células huésped.

Además, el trabajo de otros investigadores ha mostrado que no hay una correlación lineal entre los niveles de expresión de GnTIII y el grado de ADCC. Umana y col. (1999) Nature Biotechnol. 17: 176-80. De esta manera, el descubrimiento del nivel de expresión óptimo en células de mamífero y el mantenimiento mediante un proceso de fermentación aprobado por la FDA parece ser un desafío. Sin embargo, en las células de la invención, tales como células fúngicas, el descubrimiento de un promotor de intensidad apropiada para establecer un nivel de expresión de GnTIII sólido, fiable y óptimo es una tarea comparativamente fácil para un experto en la materia.

Una célula huésped tal como una cepa de levadura capaz de producir glicoproteínas con N-glicanos de bisección se obtiene por ingeniería genética introduciendo en la célula huésped de la invención una actividad GnTIII (Ejemplo 12). Preferentemente, la célula huésped se transforma con un ácido nucleico que codifica GnTIII (véase, por ejemplo, la Figura 24) o un dominio de la misma que tiene actividad enzimática, opcionalmente fusionado a un péptido de dirección señal celular heterólogo (por ejemplo, usando las bibliotecas y procedimientos asociados descritos en el presente documento). Las células huésped modificadas por ingeniería genética para expresar GnTIII producirán mayores títulos de anticuerpo que los que pueden producir las células de mamífero. También producirán anticuerpos con mayor potencia con respecto a ADCC.

Se ha mostrado que los anticuerpos producidos por líneas celulares de mamífero transfectadas con GnTIII son tan eficaces como los anticuerpos producidos por líneas celulares no transfectadas, pero a una concentración 10-20 veces menor (Davies y col. (2001) Biotechnol. Bioeng. 74(4): 288-94). Un aumento de productividad del vehículo de producción de la invención con respecto a sistemas de mamífero en un factor de 20, y un aumento de 10 veces de potencia dará como resultado una mejora de productividad neta de 200. De esta manera, la invención proporciona un sistema y un procedimiento para producir altos títulos de un anticuerpo que tiene alta potencia (por ejemplo hasta varios órdenes de magnitud más potente que el que puede producirse actualmente). El sistema y procedimiento es seguro y proporciona anticuerpos de alta potencia a bajo coste en cortos periodos de tiempo. Las células huésped modificadas por ingeniería genética para expresar GnTIII de acuerdo con la invención producen inmunoglobulinas que tienen N-glicanos biseccionados en proporciones de al menos 50 mg/litro/día a al menos 500 mg/litro/día. Además, cada molécula de inmunoglobulina (Ig) (que comprende GlcNAc) de bisección es mas potente que la misma molécula de Ig producida sin GlcNAc de bisección.

Producción de Estructuras Multiantenarias Para Mejorar la Funcionalidad de Glicoproteínas

Se ha descubierto que la síntesis de estructuras tetraantenarias es importante para la actividad biológica in vivo de una diversidad de proteínas tales como EPO y α1-glicoproteínas ácidas. Takeuchi y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Oct; 86(20): 7819-22; Boris y col., Inflammation (1990) 14, 315-323. Los estudios farmacocinéticos han demostrado que la estructura voluminosa de la ramificación tetraantenaria impide la filtración de EPO en la orina. Se ha descubierto que la modificación de proteínas, por ejemplo, con conjugados químicos (por ejemplo polietilenglicol), retrasa la eliminación de glicoproteínas potencialmente terapéuticas. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona procedimientos para sintetizar glicoproteínas que comprenden estructuras multiantenarias en células de hongos unicelulares y pluricelulares (P. pastoris) que tienen mejor actividad biológica in vivo y se eliminan menos rápidamente que la misma glicoproteína que tiene una menos estructuras antenarias. Esencialmente, las glicoproteínas producidas de acuerdo con los procedimientos de la presente invención (véanse también los documentos WO 02/00879 y WO 03/056914 incorporados en el presente documento por referencia) tienen eficacia terapéutica mejorada.

A continuación se proporcionan Ejemplos que ilustran diversos aspectos de la invención. Estos Ejemplos no deben considerarse limitantes; los Ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos.

Ejemplo 1

Clonación y Alteración del gen OCH1 en P. pastoris

Generación de un mutante OCH1 de P. pastoris:

Una ORF de 1215 pb del gen OCH1 de P. pastoris que codifica una supuesta α-1,6 manosiltransfrerasa se amplificó a partir del ADN genómico de P. pastoris (cepa X-33 Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los oligonucleótidos 5’ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT-3’ (SEC ID Nº: 3) y 5’. TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC-3’ (SEC ID Nº: 4) que se diseñaron basándose en la secuencia de OCHI de P. pastoris (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Nº 8336387). Posteriormente, se amplificaron 2685 pb aguas arriba y 1175 pb aguas debajo de la ORF del gen de OCH1 a partir de una biblioteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm, T. y col. (1999) Yeast 15(7): 563-72) usando los oligonucleótidos internos 5’-ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT-3’ (SEC ID Nº 47) del gen OCH1, y oligonucleótidos 5’GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ T7 (SEC ID Nº: 48) y 5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’ T3 (SEC ID Nº 49) en el esqueleto del plásmido lambda ZAP II que lleva la biblioteca (Stratagene, La Jolla, CA). El fragmento de 5075 pb resultante se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se denominó pEK9.

Después del ensamblaje de una construcción knockout del gen que sustituyó el marco de lectura de OCH1 con un gen de resistencia HIS4, se transformó P. pastoris y se exploraron colonias con respecto a la sensibilidad a la temperatura a 37 ºC. Los mutantes OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a la temperatura y crecen lentamente a temperaturas elevadas. Por lo tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un mutante de OCH1 de S. cerevisiae con un ADN o una biblioteca de ADN de P. pastoris. Aproximadamente 20 cepas sensibles a la temperatura se sometieron adicionalmente a una exploración de PCR de colonias para identificar colonias con un gen OCH1 delecionado. Se obtuvieron varias deleciones de OCH1.

El pBK9.1 linealizado, que tiene una secuencia de 2,1 kb aguas arriba y una secuencia de 1,5 kb aguas abajo del casete del gen OCH1 que lleva el gen HIS4 de Pichia, se introdujo por transformación en P. pastoris BK1 [GS115 (his4 Invitrogen Corp., San Diego, CA) que llevaba el gen IFN-β humano en el locus AOX1] para inactivar (knock out) el gen OCH1 de tipo silvestre. La selección inicial de transformantes se realizó usando medio con reducción de histidina seguido por el cultivo repetido en placas para seleccionar las colonias sensibles a la temperatura. Veinte de doscientas colonias positivas para histidina mostraron un fenotipo sensible a la temperatura a 37 ºC. Para excluir la integración aleatoria de pBK9.1 en el genoma de Pichia, los 20 aislados sensibles a la temperatura se sometieron a PCR de colonias usando cebadores específicos para la secuencia aguas arriba del sitio de integración y para la ORF de HIS4. Dos de veinte colonias eran defectuosas en och1 y se analizaron adicionalmente usando transferencia de Southern y una transferencia de Western que indicaba la alteración de och1 funcional por la construcción knock-out para och1. El ADN genómico se digirió usando dos enzimas de restricción distintas BglII y ClaI para confirmar el knock-out de och1 y para confirmar la integración en el marco de lectura abierto. La transferencia de Western mostró mutantes och1 que carecían de una banda discreta producida en el GS115 de tipo silvestre a 46,2 kDa.

Ejemplo 2

Modificación por Ingeniería Genética de P. pastoris con α-1,2-manosidasa para Producir Precursores de IFNβ que contienen Man5GlcNAc2

Se requiere una α-1,2-manosidasa para el recorte de Man8GlcNAc2 para producir Man5GlcNAc2, un intermedio esencial para la formación de N-glicanos complejos. Aunque la producción de un precursor de Man5GlcNAc2 es esencial, necesariamente no es suficiente para la producción de glicanos híbridos y complejos porque el isómero específico de Man5GlcNAc2 puede ser o no un sustrato para GnTI. Un mutante ochI de P. pastoris se modifica por ingeniería genética para expresar interferón β humano secretado bajo el control de un promotor αox. Se construye una biblioteca de ADN por el ligamiento en fase del dominio catalítico de manosidasa IB humana (una α-1,2manosidasa) con una subbiblioteca que incluye secuencias que codifican péptidos de localización en el Golgi anterior y RE. LA biblioteca de ADN después se usa para transformar el organismo huésped, dando como resultado una población genéticamente mixta en la que cada uno de los transformantes individuales expresa interferón-β así como un gen de manosidasa sintético de la biblioteca. Se cultivan colonias transformantes individuales y la producción de interferón se induce mediante la adición de metanol. En estas condiciones, más del 90 % de la proteína secretada es interferón-β glicosilado.

Los sobrenadantes se purifican para retirar sales y contaminantes de bajo peso molecular por cromatografía de fase inversa en sílice C18. Los transformantes deseados que expresan la α-1,2-manosidasa activa, dirigida de manera apropiada, producen interferón-β que incluye N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2, que tiene una masa molecular reducida en comparación con el interferón-β de la cepa parental. El interferón-β purificado se analiza por espectroscopía de masas MALDI-TOF y se identifican las colonias que expresan la forma deseada de interferón-β.

Ejemplo 3

Generación de una cepa mutante och1 que expresa una α-1,2-manosidasa, GnTI y GnTII para la producción de una glicoproteína de tipo humano

El marco de lectura abierto de 1215 pb del gen OCH1 de P. pastoris así como 2685 pb agujas arriba y 1175 pb aguas abajo se amplificó por PCR (véase también el documento WO 02/00879), se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se denominó pBK9. Para crear una cepa knockout para och1 que contenía múltiples marcadores auxótroficos, se digirieron 100 µg de pJN329, un plásmido que contenía un alelo mutante och1::URA3 flanqueado con sitios de restricción SfiI con SfiI y se usaron para transformar la cepa JC308 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169) por electroporación. Después de la incubación en medio definido que carecía de uracilo durante 10 días a temperatura ambiente, se seleccionaron 1000 colonias y se volvieron a sembrar en estrías. Los clones URA+ que no podían crecer a 37 ºC, pero crecían a temperatura ambiente, se sometieron a PCR de colonias para ensayar la integración correcta del alelo mutante och1::URA3. Un clon que presentaba el patrón de PCR esperado se denominó YJN153. El dominio Kringle 3 del plasminógeno humano (K3) se usó como proteína modelo. Un plásmido marcado con NeoR que contenía el gen K3 se usó para transformar la cepa YJN153 y la cepa resultante, que expresaba K3, se denominó BK64-1.

El plásmido pPB103, que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis que codifica un transportador de UDP-Nacetilglucosamina de Golgi se construyó por clonación de un fragmento BglII-HindIII romo del vector pDL02 (Abeijon y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 5963-5968) en pBLADE-SX digerido con BglII y BamHI y de extremos romos que contenía el gen ADE1 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169). Este plásmido se linealizó con EcoNI y se usó para transformar la cepa BK64-1 por electroporación y se confirmó que una cepa contenía el MNN2-2 por análisis de PCR y se denominó PBP1.

Se generó una biblioteca de construcciones de manosidasa, que comprendía fusiones en fase de los dominios líder de varias proteínas de membrana de tipo I o tipo II de S. cerevisiae y P. pastoris fusionadas con los dominios catalíticos de varios genes de α-1,2-manosidasa de origen humano, de ratón, mosca, de gusano y de levadura (véase, por ejemplo, el documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración HIS4 de P. pastoris y se exploró por linealización con SalI, transformación por electroporación en la cepa PBP1 y análisis de los glicanos liberados de la proteína indicadora K3. Una construcción activa elegida fue una quimera de los 988-1296 nucleótidos (extremo C) del gen SEC12 de levadura fusionado con una deleción N-terminal del gen α-1,2manosidasa IA de ratón (Figura 3), que carecía de los 187 nucleótidos. Una cepa de P. pastoris que expresaba esta construcción se denominó PBP2.

Se generó una biblioteca de construcciones GnTI, que comprendía fusiones en fase de la misma biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTI de origen humano, gusano, rana y mosca (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración ARG4 de P. pastoris y se exploró por linealización con AatII, transformación por electroporación en la cepa PBF2, y análisis de los glicanos liberados a partir de K3. Una construcción activa elegida fue una quimera de las primeras 120 pb del gen MNN9 de S. cerevisiae fusionado a una deleción del gen de GnTI humano, que carecía de las primeras 154 pb. La cepa de P. pastoris que expresaba esta construcción se denominó PBP-3. (Véase también la Figura 36).

Se generó una biblioteca de construcciones de GnTII, que comprendía fusiones en fase de la biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTII de origen humano y de rata (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de P. pastoris que contenía el gen NSTR que confería resistencia al fármaco nourseotricina. Los plásmidos de la biblioteca se linearizaron con EcoRI, se introdujeron por transformación en la cepa RDP27 por electroporación y las cepas resultantes se exploraron por análisis de los glicanos liberados a partir de K3 purificada.

Materiales para las siguientes reacciones

El MOPS, cacodilato sódico, cloruro manganeso, UDP-galactosa y CMP-ácido N-acetilneuramínico se obtuvieron de Sigma. El ácido trifluoroacético (TFA) se obtuvo de Sigma/Aldrich, Saint Louis, MO. La α2,6-sialiltransferasa de rata recombinante de Spodoptera frugiperda y la β1,4-galactosiltransferasa de leche bobina se obtuvieron de Calbiochem (San Diego, CA). La proteína N-glicosidasa F, las manosidasas y oligosacáridos se obtuvieron de Glyko (San Rafael, CA). La resina DEAE ToyoPearl se obtuvo de TosoHaas. El quelante metálico resina “HisBind” se obtuvo de Novagen (Madison, WI). Las placas de aclaramiento de lisado de 96 pocillos se obtuvieron de Promega (Madison, WI). Las placas de 96 pocillos de union de proteínas se obtuvieron de Millipore (Bedford, MA). Las sales y agentes tamponantes se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). Las matrices MALDI se obtuvieron de Aldrich (Milwaukee, WI).

Purificación de proteínas

Kringle 3 se purificó usando un formato de 96 pocillos en un robot de manipulación de muestras Beckman BioMek 2000 (Beckman/Coulter Ranch Cucamonga, CA). Kringle 3 se purificó a partir del medio de expresión usando un marcador de hexa-histidina C-terminal. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind. En resumen, se vierte volumen sedimentado de 150 ul (µl) de resina en los pocillos de una placa de unión de lisado de 96 pocillos, se lava con 3 volúmenes de agua y se carga con 5 volúmenes de NiSO4 50 mM y se lava con 3 volúmenes de tampón de unión (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). El medio de expresión de proteínas se diluye 3:2, media/PBS (PO4 60 mM, KCl 16 mM, NaCl 822 mM pH 7,4) y se carga en las columnas. Después del drenaje, las columnas se lavan con 10 volúmenes de tampón de unión y 6 volúmenes de tampón de lavado (imidazol 30 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20mM pH 7,9) y la proteína se eluye con 6 volúmenes de tampón de elución (imidazol 1M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20mM pH 7,9). Las glicoproteínas eluidas se evaporan a sequedad por liofilización.

Liberación de N-glicanos

Los glicanos se liberan y separan de las glicoproteínas por una modificación de un procedimiento presentado previamente (Papac, y col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Los pocillos de una placa MultiScreen IP (membrana Immobilon-P) de 96 pocillos (Millipore) se humedecen con 100 ul de metanol, se lavan con 3X150 ul de agua y 50 ul de tampón RCM (urea 8M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM pH 8,6), drenando con vacío suave después de cada adición. Las muestras de proteína secas se disuelven en 30 ul de tampón RCM y se transfieren a los pocilos que contienen 10 ul de tampón RCM. Los pocillos se drenan y se lavan dos veces con tampón RCM. Las proteínas se reducen por la adición de 60 ul de DTT 0,1 M en tampón RCM durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavan tres veces con 300 ul de agua y se carboximetilan por adición de 60 ul de ácido yodoacético 0,1 M durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan de nuevo tres veces con agua y las membranas se bloquean por la adición de 100 ul de PVP 360 al 1 % en agua durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se drenan y se lavan tres veces con 300 ul de agua y se desglicosila por la adición de 30 ul de NH4HCO3 10 mM pH 8,3 que contienen una miliunidad de N-glicanasa (Glyko). Después de 16 horas a 37 ºC, la solución que contenía los glicanos se retiró por centrifugación y se evaporó a sequedad.

Espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo

Los pesos moleculares de los glicanos se determinaron usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF lineal Voyager DE PRO (Applied Biosciences) usando extracción retrasada. Los glicanos secos de cada pocillo se disolvieron en 15 ul de agua y se salpicaron 0,5 ul en placas de muestra de acero inoxidable y se mezclaron con 0,5 us-de matriz S-DHB (9 mg/ml de ácido dihidroxibenzoico, 1 mg/ml de ácido 5-metoxisalicílico en 1:1 de agua/acetonitrilo al 0,1 % de TFA) y se dejaron secar.

Se generaron iones por irradiación con un láser de nitrógeno por pulsos (337 nm) con un tiempo de pulso de 4 ns. El instrumento se hizo funcionar en el modo de extracción retrasado con un retraso de 125 ns y un voltaje de aceleración de 20 kV. El voltaje de la rejilla fue del 93,00 %, el voltaje del alambre guía fue de 0,10 %, la presión interna fue menor de 5 X 10-7 tor, y la apertura de masa baja fue de 875 Da. Se generaron espectros a partir de la suma de 100-200 pulsos láser y se adquirieron con un digitalizador de 2 GHz. Como patrón de peso molecular externo se usó el oligosacáridos Man5GlcNAc2. Todos los espectros se generaron con el instrumento en el modo de ión positivo. La precisión de masa estimada de los espectros fue del 0,5 %.

La masa de los N-glicanos eluidos de la columna generalmente está asociada con un adupto de ión positivo, que aumenta la masa por el peso molecular del ión positivo. Los aductos más comunes son H+, Na+ y K+.

Ejemplo 4

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris para producir Man5GlcNAc2 como estructura de N-glicano predominante usando una biblioteca de ADN combinatoria.

Se modificó por ingeniería genética un mutante och1 de P. pastoris (véanse los Ejemplos 1 y 3) para expresar y secretar proteínas tales como el dominio kringle 3 del plasminógeno humano (K3) bajo el control del promotor 5 inducible AOXI. Como proteína modelo se usó el dominio Kringle 3 del plasminógeno humano (K3). Se amplificó un fragmento de ADN que codificaba el K3 usando Pfu turbo polimerasa (Strategene, La Jolla, CA) y se clonó en sitios EcoRI y XbaI de pPICZαA (Invitrogen, Carlsbad, CA), dando como resultado un marcador 6-His C-terminal. Para mejorar la eficacia de N-glicosilación de K3 (Hayer y col. 1975 J. Arch. Biochem. Biophys. 171, 651-655), Pro46 se reemplazó por Ser46 usando mutagénesis dirigida. El plásmido resultante se denominó pBK64. La secuencia

10 correcta de la construcción de PCR se confirmó por secuenciación de ADN.

Se construyó una biblioteca de ADN combinatoria por el ligamiento en fase de dominios catalíticos IB (Genbank AN 6678787) e IA (GenBank AN 6754619) de α-1,2-manosidasa murina con una sub-biblioteca que incluía secuencias que codificaban péptidos de localización en la vesícula Cop II, RE y Golgi anterior de acuerdo con la Tabla 6. La biblioteca de ADN combinada se usó para generar construcciones de fusión individual, que después se introdujeron 15 por transformación en el organismo huésped de expresión de K3, dando como resultado una población genéticamente mixta en la que cada uno de los transformantes individuales expresa K3 así como un gen de fusión de señal de localización/manosidasa de la biblioteca. Se cultivaron transformantes individuales y la producción de K3 se indujo por transferencia a un medio que contenía metanol. En estas condiciones, después de 24 horas de inducción, más del 90 % de la proteína en el medio era K3. La proteína indicadora K3 se purificó del sobrenadante

20 para retirar sales y contaminantes de bajo peso molecular por cromatografía de afinidad de Ni. Después de la purificación por afinidad, la proteína se desalificó por cromatografía de exclusión molecular en una resina Sephadex G10 (Sigma, St. Louis, MO) y se sometió directamente al análisis MALDI-TOF descrito más adelante o los Nglicanos se retiraron por digestión con PNGasa como se describe más adelante (Liberación de N-glicanos) y se sometió a análisis MALDI-TOF Miele y col. (1997) Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 151-157.

25 Siguiendo este enfoque, se obtuvo una serie diversa de transformantes; algunos mostraron modificación de los Nglicanos en comparación con la cepa knockout para och1; y otros mostrados un alto grado de recorte de manosa (Figura 5D y 5E). Los transformantes deseados que expresaban la α-1,2-manosidasa activa, dirigida aproximadamente produjeron K3 con N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2. Esto confiere una masa molecular reducida a la glicoproteína en comparación con la K3 de la cepa de deleción de och1 parental, una diferencia que se

30 detectó fácilmente por espectrometría de masas MALDI-TOF (Figura 5). La Tabla 7 indica los niveles de producción relativos de Man5GlcNAc2.

Tabla 7. Una biblioteca de ADN combinatoria representativa de secuencias de localización/dominios catalíticos que presenta niveles relativos de producción de Man5GlcNAc2

Secuencias de péptidos de dirección

Dominios Catalíticos

MNS1(s) MNS1(m) MNS1(l) SEC12(s) SEC12(m)

Manosidasa de ratón 1A ∆187

FB4 ++ FB5 + FB6 - FB7 ++ FB8 ++++

Manosidasa de ratón 1B ∆58

GB4 ++ GB5 + GB6 + GB7 ++ GB8 +

Manosidasa de ratón 1B ∆99

GC4 - GC5 +++ GC6 + GC7 + GC8 +

Manosidasa de ratón 1B ∆170

GD4 - GD5 - GD6 - GD7 + GD8 +

Tabla 8. Otra biblioteca de ADN combinatoria de secuencias de localización/dominios catalíticos que presentan niveles relativos de producción de Man5GlcNAc2

Secuencias de péptidos de dirección

Dominios Catalíticos

VAN1(s) VAN1(m) VAN1(l) MNN10(s) MNN10(m) MNN10(l)

manosidasa 1B ∆80 de C. elegans

BC18-5 +++++ BC19 ++++ BC20 +++ BC27 +++++ BC28 +++++ BC29 +++

manosidasa 1B ∆31 de C. elegans

BB18 +++++ BB19 +++++ BB20 ++++ BB18 +++++ BB19 +++++ BB20 ++++

Los péptidos de dirección se seleccionaron entre MNS I (SwissProt P32906) en S. cerevisiae (largo, medio y corto)

5 (véase anteriormente Nucleic Acid Libraries; Combinatorial DNA Library of Fusion Constructs) y SEC12 (SwissProt P11655) en S. cerevisiae (988-1140 nucleótidos: corto) y (988-1296: medio). Aunque la mayoría de las secuencias de péptidos de dirección eran deleciones N-terminales, algunas secuencias de péptidos de dirección, tales como SEC12 eran deleciones C-terminales. Los dominios catalíticos usados en este experimento se seleccionaron entre manosidasa 1A de ratón con una deleción N-terminal de 187 aminoácidos; y manosidasa 1B de ratón con una

10 deleción de 58, 99 y 170 aminoácidos. El número de (+), como se usa en el presente documento, indica los niveles relativos de producción de Man5GlcNAc2. La notación (-) indica ausencia de producción aparente de Man5GlcNAc2. La notación (+) indica una producción menor del 10 % de Man5GlcNAc2. La notación (++) indica una producción de aproximadamente un 10-20 % de Man5GlcNAc2. La notación (+++) indica una producción de aproximadamente un 20-40 % de Man5GlcNAc2. La notación (++++) indica una producción de aproximadamente el 50 % de Man5GlcNAc2.

15 La notación (+++++) indica una producción mayor del 50 % de Man5GlcNAc2.

La Tabla 9 muestra la cantidad relativa de Man5GlcNAc2 en K3 secretada. Se generaron seiscientas ocho (608) cepas diferentes de P. pastoris ∆och1 por transformación con una sola construcción de una biblioteca genética combinatoria que se generó por fusión de diecienueve (19) dominios catalíticos de α-1,2 manosidasa en treinta dos

(32) líderes de RE fúngico y cis-Golgi.

20 Tabla 9

Cantidad de Man5GlcNAc2 en K3 secretada (% de glicanos totales

Número de construcciones (%)

N.D.*

19 (3,1)

0-10 %

341 (56,1)

10-20 %

50 (8,2)

20-40 %

75 (12,3)

40-60 %

72 (11,8)

Más del 60 %

51 (8,4) †

Total

608 (100)

* No se ensayaron varias construcciones de fusión porque los plásmidos correspondientes no podían propagarse en E. coli antes de la transformación de P. pastoris. † Los clones con el mayor grado de recorte de Man5GlcNAc2 (30/51) se analizaron adicionalmente con respecto a la actividad manosidasa en el sobrenadante del medio. La mayoría (28/30) presentaron una actividad manosidasa detectable en el sobrenadante (por ejemplo, Figura 4B). Sólo dos construcciones presentarons altos niveles de Man5GlcNAc2, mientras que carecían de actividad manosidasa en el medio (por ejemplo Figura 4C).

La Tabla 7 muestra dos construcciones pFB8 y PGC5, entre otras, que presentan Man5GlcNAc2. La Tabla 8

muestra una construcción más preferida, pBC18-5, una secuencia del péptido de dirección VAN1(s) de S. cerevisiae (de SwissProt 23642) ligada en fase a una deleción N-terminal de 80 aminoácidos de la manosidasa IB de C. elegans (Genbank AN CAA98114) (Van1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆80 de C.elegans). Esta construcción de fusión también produce una estructura Man5GlcNAc2 predominante, como se muestra en la Figura 5E. Se mostró que esta construcción producía más de un 50 % de Man5GlcNAc2 (+++++).

Generación de una biblioteca combinatorial de localización/manosidasa

La generación de una biblioteca de AND combinatorial de dominios catalíticos de α-1,2-manosidasa fusionados a péptidos de dirección requería la amplificación de dominios manosidasa con longitudes variable de deleciones N-terminales de varios organismos. Para conseguir este objetivo, se amplificaron por PCR los marcos de lectura abiertos (ORF) de longitud completa de α-1,2-manosidasas a partir de ADNc o ADN genómico obtenido de las siguientes fuentes: Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Aspergillus nidulans y Penicillium citrinum. En cada caso, se incubó ADN en presencia de cebadores oligonucleotídicos específicos para la secuencia de manosidasa deseada además de reactivos necesarios para realizar la reacción de PCR. Por ejemplo, para amplificar la ORF de la α-1,2-manosidasa IA de M. musculus, se incubador el 5’ ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC (SEC ID Nº: 52) y el cebador 3 TCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEC ID Nº: 53) en presencia de ADN polimerasa de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) y se amplificaron en las condiciones recomendadas por Stratagene usando los parámetros de ciclos: 94 ºC durante 1 min (1 ciclo); 94 ºC durante 30 s, 68 ºC durante 30 s, 72 ºC durante 3 min (30 ciclos). Después de la amplificación, la secuencia de ADN que codificaba la ORF se incubó a 72 ºC durante 5 min con 1U de ADN polimerasa Taq (Promega, Madison, WI) antes del ligamiento en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se usó para transformar E. coli químicamente competentes TOP10 como recomienda Invitrogen. El producto PCR clonado se confirmó por secuenciación ABI usando cebadores específicos para la ORF de manosidasa.

Para generar los truncamientos N-terminales deseados de cada manosidasa, la ORF completa de cada manisodasa se usó como molde en una vuelta posterior de reacciones de PCR en las que la posición de hibridación del cebador 5’ era específica para el extremo 5’ del truncamiento deseado y el cebador 3’ se mantuvo específico para el extremo 3’ original de la ORF. Para facilitar la subclonación del fragmento de manosidasa truncado en el vector de expresión de levadura, pJN347 (Figura 2C), se obtuvieron por ingeniería genética sitios de restricción AscI y PacI en cada producto de truncamiento, en los extremos 5’ y 3’ respectivamente. El número y posición de los truncamientos N-terminales generados para cada ORF de manosidasa dependían de la posición de la región transmembrana TM en relación con el dominio catalítico (CD). Por ejemplo, si la región troncal localizada entre la TM y el CD era menor de 150 pb, sólo generaba un truncamiento para esa proteína. Sin embargo, si la región troncal era mayor de 150 pb, se generaban uno o dos truncamientos más dependiendo de la longitud de la región troncal.

En el presente documento se describe un Ejemplo de cómo se generaron truncamientos para la manosidasa IA de

M. musculus (Genbank AN 6678787), usándose un enfoque similar para las otras manosidasas. La Figura 3 ilustra la ORF de la α-1,2-manosidasa IA de M. musculus con los dominios transmembrana y catalíticos previstos destacados en negrita. Basándose en esta estructura, se diseñaron tres cebadores 5’ (posiciones de hibridación subrayadas en la Figura 3) para generar las deleciones N-terminales ∆65, ∆105 y ∆187. Usando la deleción N-terminal ∆65 como Ejemplo, el cebador 5’ usado era 5’GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCCAC-3’ (SEC ID Nº: 54) (con el sitio de restricción AscI destacado en negrita) junto con el cebador 3’ 5’CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3’ (SEC ID Nº: 55) (con el sitio de restricción PacI destacado en negritas). Todos estos cebadores se usaron para amplificar un fragmento de 1561 pb en las condiciones indicadas anteriormente para amplificar la ORF de manosidasa 1A de M. musculus de longitud completa. Además, al igual que el producto obtenido para ORF de longitud completa, el producto truncado también se incubó con ADN polimerasa Taq, se ligó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se usó para transformar TOP10 y se secuenció por ABI. Después de haberse amplificado y confirmado la secuencia del fragmento de manosidasa truncado, el plásmido resultante, pCR2.1-∆65mMannIA, se dirigió con AscI y PacI en tampón nº 4 de New England Biolabs (Beverly, MA) durante16 h a 37 ºC. En paralelo, el pJN347 (Figura 2C) se dirigió con las mismas enzimas y se incubó como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión; tanto el esqueleto de pJN347 (Figura 2C) como el dominio catalítico truncado se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit de Ligamiento Quick (New England Biolabs, Beverly, MA), como se recomienda por los fabricantes, y se usó para transformar células DH5 químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usó PCR de colonias para confirmar la generación de la construcción pJN347-manosidasa de ratón LA∆65.

Una vez generada una biblioteca de dominios catalíticos de α-1,2-manosidasa truncados en el vector de expresión de levadura pJN347 (Figura 2C), la etapa que quedaba para generar la biblioteca de péptido de dirección/dominio catalítico era la clonación fase de las secuencias peptídicas de dirección (Figura 2). Tanto las construcciones pJN347-manosidasa (Figura 2D) como las construcciones pCR2.1TOPO-péptido de dirección (Figura 2B) como tales se incubaron durante una noche a 37 ºC en tampón nº 4 de New England Biolabs en presencia de las enzimas de restricción NotI y AscI. Después de la digestión, tanto el esqueleto de pJN347-manosidasa como las regiones del péptido de dirección se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit de Ligamiento Quick (New England Biolabs, Beverly, MA), como recomiendan los fabricantes, y se usaron para transformar células de DH5α químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Posteriormente, las construcciones pJN347-péptido de dirección/manosidasa se secuenciaron por ABI para confirmar que las fusiones generadas estaban en fase. El tamaño estimado de la biblioteca de péptido de dirección/alfa-1,2-manosidasa final contiene más de 1300 construcciones generadas por el enfoque descrito anteriormente. La Figura 2 ilustra la construcción de ADN combinatoria.

Modificación por ingeniería genética para una cepa knock-out para OCH1 de P. pastoris con múltiples marcadores autotróficos

La primera etapa en la construcción del plásmido implicaba la creación de una serie de plásmidos universales que contenían regiones de ADN del gen KEX1 de P. pastoris (Boehm et al. Yeast 1999 May; 15(7): 563-72) como portadores de espacio para las regiones 5’ y 3’ de los genes a inactivar (knocked out). Los plásmidos también contenían el Ura-blaster de S. cerevisiae (Alani y col. (1987) Genetics 116: 541-545) como portador de espacio para los marcadores autotróficos, y un casete de expresión con un sitio de clonación múltiple para la inserción de un gen extraño. Un fragmento de 0,9 kb de la región KEX1-5’ de P. pastoris se amplificó por PCR usando cebadores GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCA GA (SEC ID Nº: 56) y GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEC ID Nº: 57) y ADN genómico de P. pastoris como molde y se clonó en los sitios SacI, SalI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA). El plásmido resultante se cortó con BamHI y SalI, y un fragmento de 0,8 kb de la región KEX1-3’ que se había amplificado usando los cebadores CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEC ID Nº: 58) y GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGG ATGACTCTTTTC (SEC ID Nº: 59) se clonó en los sitios abiertos creando pJN626. Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento BamHI, BgIII de 3,8 kb se pNKY51 (Alani y col. (1987) Genetics 116: 541-545) se insertó en las dos orientaciones posibles dando como resultado los plásmidos pJN263 (Figura 4A) y pJN284 (Figura 4B).

Se creó un casete de expresión con NotI y PacI como sitios de clonación. El promotor GAPDH de P. pastoris se amplificó usando los cebadores CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT (SEC ID Nº: 60) y GGACATCAGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA (SEC ID Nº: 61) y el plásmido pGAPZ-A (Invitrogen) como molde y se clonó en los sitios BamHI, SphI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) (Figura 4B). El plásmido resultante se cortó con SpeI y SphI y la región de terminación de la transcripción CYC1 (“TT”) que se había amplificado usando los cebadores CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEQ ID Nº: 62) y GGACATGCATGCGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCC(SEC ID Nº: 63) y el plásmido pPICZ-A (Invitrogen) como molde se clonó en los sitios abiertos creando pJN261 (Figura 4B).

Se creó un plásmido knockout para el gen OCHI de P. pastoris por digestión de pJN263 con SalI y SpeI y un fragmento de 2,9-kb de la región 5’ de OCH1, que se había amplificado usando los cebadores GAACCACGTCGACGGCCATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATT CAAACACAAGGCATTGC (SEC ID Nº: 64) y CTCCAATACTAGTCGAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEC ID Nº: 65) y ADN genómico de P. pastoris como molde, se clonó en los sitios abiertos (Figura 4C). El plásmido resultante se cortó con EcoRI y PmeI y un fragmento de ADN de 1,0-kb de la región 3’ de OCH1 que se había generado usando los cebadores TGGAAGGTTTAAACAAAGCTAGAGTAAAATAGATATAGCGAGATTAGAGAATG (SEC ID Nº: 66) y AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATGTAGTTCCCGTT TTCATC (SEC ID Nº: 67) se insertó para generar pJN298 (Figura 4C). Para permitir la posibilidad de usar simultáneamente el plásmido para introducir un nuevo gen, el casete de expresión BamHI de pJN261 (Figura 4B) se clonó en el único sitio BamHI de pJN298 (Figura 4C) para pJN299 (Figura 4E).

El casete Ura3-blaster de P. pastoris se construyó usando una estrategia similar a la descrita en Lu y col. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 141-146. Un fragmento PstI, SpeI de 2,0-kb de URA3 de P. pastoris se insertó en los sitios PstI, XbaI de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear pJN306 (Figura 4D). Después, un fragmento de SacI, PvuII de 0,7-kb del marco de lectura abierto de lacZ se clonó en los sitios de SacI, SmaI para producir pJN308 (Figura 4D). Después de la digestión pJN308 (Figura 4D) con PstI, y tratamiento con AND polimerasa de T4, el fragmento SacI -PvuII de lacZ que se había convertido en un fragmento de extremos romos con la ADN polimerasa de T4 se insertó generando pJN315 (Figura 4D). El casete lacZ/URA3 se liberó por digestion con SacI y SphI, se convirtió en un fragmento de extremos romos con ADN polimerasa de T4 y se clonó en el esqueleto de pJN299 que se había digerido con PmeI y AflII y sus extremos se habían hecho romos con ADN polimerasa de T4. El plásmido resultante se denominó pJN329 (Figura 4E).

Se creó un plásmido de expresión marcado con HIS4 cortando pJN261 (Figura 4F) con EcoICRI (Figura 4F). Un fragmento de 2,8 kb del gen HIS4 de Pichia pastoris que se había amplificado usando los cebadores GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA AAAATACGG (SEC ID Nº: 68) y GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTA AAATCTCTAA (SEC ID Nº: 69) cortado con NgoMIV y Swal y después se convirtió en un fragmento de extremos romos usando ADN polimerasa de T4, después se ligó al sitio abierto. Este plásmido se denominó pJN337 (Figura 4F). Para construir un plásmido con un sitio de clonación múltiple adecuado para la construcción de la biblioteca de fusión, pJN337 se cortó con NotI y PacI y los dos oligonucleótidos GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEC ID Nº: 70) y TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC (SEC ID Nº: 71) que se habían hibridado in vitro se ligaron en los sitios abiertos, creando pJN347 (Figura 4F).

Para crear una cepa defectiva para och1 que contenía múltiples marcadores autoxtróficos, se digirieron 100 µg de pJN329 con SfiI y se usaron para transformar la cepa JC308 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159169) por electroporación. Después de la transformación, las placas con reducción de URA se incubaron a temperatura ambiente durante 10 días. Se seleccionaron mil (1000) colonias y se volvieron a sembrar en estrías. Los 1000 clones después se sembraron en estrías en 2 series de placas con reducción de URA. Una serie se incubó a temperatura ambiente, mientras que la segunda serie se incubó a 37 ºC. Los clones que no pudieron crecer a 37 ºC, pero crecían en temperatura ambiente, se sometieron a PCR de colonias para ensayar el knockout de OCH1 correcto. Un clon que mostró la señal de PCR esperada (aproximadamente 4,5 kb) se denominó YJN153.

Ejemplo 5

Caracterización de la biblioteca de ADN combinatoria

Posteriormente se cultivaron transformantes positivas seleccionados por PCR de colonias que confirmaba la integración de la construcción de manosidasa en el genoma de P. pastoris a temperatura ambiente en 50 ml de medio complejo de metanol tamponado con BMGY consistente en extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, tampón fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34 %, biotina al 105 % 4 X y glicerol al 1 % como medio de crecimiento) hasta una DO600nm de 2-6, momento en el cual se lavaron con 10 ml de medio BMMY (medio complejo de metanol tamponado consistente en extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, tampón fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34 %, biotina al 105 % 4 X y metanol al 1,5 % como medio de crecimiento) antes de la inducción de la proteína indicadora durante 24 horas a temperatura ambiente en 5 ml de BMMY. Por consiguiente, la proteína indicadora se aisló y se analizó como se describe en el Ejemplo 3 para caracterizar su estructura de glicano. Usando los péptidos de dirección de la Tabla 6, los dominios catalíticos de manosidasa localizados en el RE o el Golgi mostraron un nivel significativo de recorte de un glicano que contenía predominantemente Man8GlcNAc2 para dar un glicano que contenía predominantemente Man5GlcNAc2. Esto es evidente cuando la estructura de glicano de la glicoproteína indicadora se compara entre la de el knock-out de och1 de P. pastoris en las Figuras 5C y 6C y la misma cepa transformada con construcciones de manosidasa de M. musculus como se muestra en las Figuras 5D, 5E, 6D – 6F. Las Figuras 5 y 6 muestran la expresión de construcciones generadas a partir de la biblioteca de ADN combinatoria que muestran una actividad manosidasa significativa en P. pastoris. La expresión de pGC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón) (Figuras 5D y 6E) produjo una proteína que tiene aproximadamente un 30 % de todos los glicanos recortas para dar Man5GlcNAc2, mientras que la expresión de pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) (Figura 6F) produjo aproximadamente un 50 % de Man5GlcNAc2 y la expresión de pBC 18-5 pFB8 (VAN1 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆80 de C. elegans) (Figura 5E) produjo a un 70 % de Man5GlcNAc2.

Ejemplo 6

Recorte in vivo por α-1,2-manosidasa

Para asegurarse de que el Ejemplo 4 nuevo obtenido por ingeniería genética de hecho producía la estructura Man5GlcNAc2 deseada in vivo, los sobrenadantes celulares se ensayaron con respecto a la actividad manosidasa (véanse las Figuras 7-9). Para cada construcción/cepa huésped descrita más adelante, se realizó HPLC a 30 ºC con una columna de 4,0 mm x 250 mm de resina Altech (Avondale, PA, USA) Econosil-NH2 (5 µm) a un caudal de 1,0 ml/min durante 40 min. En las Figuras 7 y 8, se mostró que se producía la degradación del patrón de Man9GlcNAc2

[b]

dando como resultado un pico que se correlaciona con Man8GlcNAc2. En la Figura 7, el patrón de Man9GlcNAc2

[b]

eluyó a 24,61 min y Man5GlcNAc2 [a] eluyó a 18,59 min. En la Figura 8, Man9GlcNAc2 eluyó a 21,37 min y Man5GlcNAc2 a 15,67 min. En la Figura 9, se mostró que el patrón Man8GlcNAc2 [b] eluía a 20,88 min.

Se cultivaron células de P. pastoris que comprendían el plásmido pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) a 30 ºC en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente transparente. Se retiró una alícuota del sobrenadante para realizar ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretado. Una sola etapa de purificación usando cromatografía de CM-sepharose y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado K3 pura en un 95 % que eluía entre NaCl 300-500 mM. En la Figura 6F se muestra el análisis de N-glicano de los glicanos derivados de K3. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente con respecto a la presencia de actividad manosidasa secretada. Se añadió un patrón disponible en el mercado de oligomanosa 9 de tipo unida a N marcada con 2-aminobenzamida (Man9-2-AB) (Glyko, Novato, CA) a: BMMY (Figura 7A), el sobrenadante de la alícuota anterior (Figura 7B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de α-1,2-manosidasa de Trichoderma reesi (obtenida en Contreras y col., documento WO 02/00856 A2) (Figura 7C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el grado de recorte de manosidasa.

De forma similar se cultivaron y ensayaron células de P. pastoris que comprendían el plásmido pPC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón). Las células se cultivaron a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente transparente. Una alícuota se retiró del sobrenadante para ensayos de manosidasas y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretado. Una sola etapa de purificación usando cromatografía de CM-sepharose y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 pura en un 95 % que eluía entre NaCl 300-500 mM. El análisis de N-glicanos de los glicanos derivados de K3 se muestra en la Figura 5E. La alícuota retirada previamente del sobrenadante se ensayó adicionalmente con respecto a la presencia de actividad manosidasa secretada como se muestra en la Figura 8B. Se añadió un patrón disponible en el mercado de Man9-2-AB (Glyko, Novato, CA) a: BMMY (Figura 8A), sobrenadante de la alícuota anterior (Figura 8B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de α-1,2-manosidasa de Trichoderma reesi (obtenida de Contreras y col., documento WO 02/00856 A2) (Figura 8C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el grado de recorte de manosidasa.

Como sustrato se usó Man9-2-AB y es evidente que después de 24 horas de incubación, la actividad manosidasa estaba prácticamente ausente en el sobrenadante del producto de digestión de la cepa pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) (Figura 7B) y el producto de digestión de la cepa pGC5 (MNS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆99 de ratón) (Figura 8B) mientras que el control positivo (α-1,2-manosidasa purificada de T. reesi obtenida de Contreras) conduce a una conversión completa de Man9GlcNAc2 en Man5GlcNAc2 en las mismas condiciones, como se muestra en las Figuras 7C y 8C. Estos son datos concluyentes que muestran el recorte por manosidasa in vivo en la cepa pGC5 de P. pastoris; y la cepa pFB8, que es claramente diferente de los que se había notificado hasta la fecha (Contreras y col., documento WO 02/00856 A2).

La Figura 9 sustancia adicionalmente a la localización y actividad de la enzima manosidasa. Se cultivó P. pastoris que comprendía pBC18-5 (VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB ∆80 de C. elegans) a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente transparente. Se retiró una alícuota del sobrenadante para los ensayos de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretado. Una sola etapa de purificación usando cromatografía de CM-sepharose y un gradiente de elución de NaAc 25 mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3 pura en un 95 % que eluía entre NaCl 300-500 mM. El análisis de N-glicanos de los glicanos derivados de K3 se muestra en la Figura 5E. La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente con respecto a la presencia de actividad manosidasa secretada como se muestra en la Figura 9B. Se añadió un patrón disponible en el mercado de Man8-2AB (Glyko, Novato, CA) a: BMMY (Figura 9A), sobrenadante de la alícuota anterior de pBC18-5 (VAN1 (s) de Saccharomyces/manosidasa IB Δ80 de C. elegans) (Figura 9B) y BMMY que contenía medio de una construcción de fusión diferente pDD28-3 (MNN10 (m) de Saccharomyces (de SwissProt 50108)/manosidasa IB Δ99 de H. sapiens) (Figura 9C). Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de aminosílice para determinar el grado de recorte por manosidasa. La Figura 9B demuestra la actividad manosidasa intracelular en comparación con una construcción de fusión pDD28-3 (MNN10 (m) de Saccharomyces/ manosidasa IB Δ99 de H. sapiens) que presentaba un resultado negativo (Figura 9C).

Ejemplo 7

Ensayo de Valor Óptimo de pH de α-1,2-manosidasa Modificado por Ingeniería Genética

Se cultivaron células de P. pastoris que comprendían el plásmido pBB27-2 (MNN10 de Saccharomyces MNN10 (s) (de SwissProt 50108)/manosidasa IB ∆31 de C. elegans) a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente 17. Aproximadamente 80 µl de estas células se inocularon en 600 µl de BMGY y se cultivaron durante una noche. Posteriormente, las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente transparente (pH 6,43). El sobrenadante se retiró para ensayos de óptimo de pH de manosidasa. Se añadió Man8GlcNAc2 marcado con fluorescencia (0,5 µg) a 20 µl de sobrenadante ajustado a diversos valores de pH (Figura 11) e incubado durante 8 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, la muestra se analizó por HPLC usando una columna de sílice unido a amino, de perlas de 5 micrómetros, Econosil NH2 4,6 X 250 mm (Altech, Avondale, PA). El caudal fue de 1,0 ml/min durante 40 min y la columna se mantuvo a 30 ºC. Después de eluir isocráticamente (68 % de A:32 % de B) durante 3 min, se empleó un gradiente lineal de disolvente (68 % de

A:32 % de B a 40 % de A:60 % de B) durante 27 min para eluir los glicanos (18). Disolvente A (acetonitrilo) y disolvente B (formiato amónico 50 mM, pH 4,5). La columna se equilibró con disolvente (68 % de A:32 % de B) durante 20 min entre ensayos.

Ejemplo 8

Modificación por Ingeniería Genética de P. pastoris para producir N-glicanos con la Estructura GlcNAcMan5GlcNAc2

Se requiere la actividad GlcNAc Transferasa I para la maduración de N-glicanos complejos e híbridos (Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251). Man5GlcNAc2 solo puede recortarse por la manosidasa II, una etapa necesaria en la 5 formación de glicoformas humanas, después de la adición de N-acetilglucosamina al resto de α-1,3 manosa terminal del tronco de trimanosa por la GlcNAc Transferasa I (Schachter, 1991 Glycobiology 1 (5): 453-461). Por consiguiente, se preparó una biblioteca de ADN combinatoria que incluía fragmentos de ADN que codificaban dominios catalíticos dirigidos convenientemente de genes de GlcNAc Transferasa I de C. elegans y Homo sapiens; y secuencias de localización de GLS, MNS, SEC, MNN9, VAN1, ANP1. HOC1, MNN10, MNN11, MNT1, KTR1, KTR2,

10 MNN2, MNN5, YUR1, MNN1 y MNN6 de supuestas α-1,2-manosiltransferasas de S. cerevisiae y P. pastoris basándose en la homología de S. cerevisiae: D2, D9 y J3, que son homólogos de KTR. La Tabla 10 incluye, pero sin limitación, secuencias de péptidos de dirección tales como SEC y OCH1, de GnTI de P. pastoris yK lactis, (véase la Tabla 6 y la Tabla 10)

Tabla 10. Una biblioteca combinatoria representativa de secuencias de péptidos de dirección/dominio 15 catalítico para la UDP-N-Acetilglucosaminil Transferasa I (GnTI)

Péptido de dirección

Dominio Catalítico

OCHI(s) OCHI(m) OCHI(m) MNN9(s) MNN9(m)

Human, GnTI, ∆38

PB105 PB106 PB107 PB104 N/A

Human, GnTI, ∆86

NB12 NB13 NB14 NB15 NB

C. elegans, GnTI, ∆88

OA12 OA13 OA14 OA15 OA16

C. elegans, GnTI, ∆35

PA12 PA13 PA14 PA15 PA16

C. elegans. GnTI, ∆63

PB12 PB13 PB14 PB15 PB16

X. leavis, GnTI, ∆33

QA12 QA13 QA14 OA15 QA16

X. leavis, GnTI, ∆103

QB12 OB13 QB14 OB15 QB16

Se seleccionaron secuencias de péptidos de dirección de OCHI en P. pastoris (largas, medias y cortas) (véase el Ejemplo 4) y MNN9 (SwissProt P39107) en S. cerevisiae (cortas y medias). Los dominios catalíticos se seleccionaron a partir de GnTI humana con una deleción N-terminal de 38 y 86 aminoácidos, GnTI de C. elegans

20 (gly-12) con una deleción de 35 y 63 aminoácidos así como GnTI de C. elegans (gly-14) con una deleción N-terminal de 88 aminoácidos y GnTI de X. leavis con una deleción N-terminal de 33 y 103 aminoácidos, respectivamente.

Una parte del gen que codificaba N-actilglucosaminil Transferasa I (MGATI, Nº de Acceso NM002406), que carecía de las primeras 154 pb, se amplificó por PCR usando oligonucleótidos 5’TGGCAGGCGCGCCTCAGTCAGCGCTCTCG-3’ (SEC ID Nº: 72) yd 5’

25 AGGTTAATTAAGTGCTAATTCCAGCTAGG-3’ (SEC ID Nº: 73) y el vector pHG4.5 (ATCC Nº 79003) como molde. El producto de PCR resultante se clonó en pCR2.1-TOPO y se confirmó la secuencia correcta. Después de la digestión con AscI y PacI la GnTI truncada se insertó en el plásmido pJN346 para crear pNA. Después de la digestión de pJN271 con NotI y AscI, el inserto de 120 pb se ligó a pNA para generar una fusión en fase del dominio transmembrana de MNN9 con la GnTI, creando pNA 15.

30 El organismo huésped es una cepa de P. pastoris que es deficiente en la hipermanosilación (por ejemplo, un mutante och1), proporciona el sustrato UDP-GlcNAc en el Golgi y/o RE (es decir, contiene un transportador de UDP-GlcNAc funcional) y proporciona N-glicanos de la estructura Man5GlcNAc2 en el Golgi y/o RE (por ejemplo, pFB8 de

P. pastoris (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) de anteriormente). En primer lugar, se transformó P. pastoris pFB8 con pPB103 que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN 35 AF106080) (que codificaba el transportador de UDP-GlcNAc) clonado en un sitio BamHI y BglII del plásmido pBLADE-SX (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169). Después, la biblioteca de AND combinatorial mencionada anteriormente que codifica una combinación de genes de localización/GnTI exógena o endógena se usó para la transformación y se seleccionaron colonias y se analizaron con respecto a la presencia de la construcción de GnTI por PCR de colonias. La eficacia de transformación e integración de los presentes solicitantes generalmente está por

40 encima del 80 % y puede omitirse la selección por PCR una vez que se han establecido parámetros sólidos de transformación.

Purificación de Proteínas

Se purificó K3 a partir del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por 45 Novagen para su resina HisBind. Puede realizarse otro procedimiento de exploración usando el anticuerpo de unión

a GlcNAc terminal específico, o una lectina tal como la lectina GSII de Griffonia simplificolia, que se une a GlcNAc terminal (EY Laboratories, San Mateo, CA). Estas exploraciones pueden automatizarse usando lectinas o anticuerpos que se han modificado con marcadores fluorescentes tales como FITC o analizarse por MALDI-TOF.

La K3 secretada puede purificarse por cromatografía de afinidad de Ni, cuantificarse y pueden unirse cantidades iguales de proteína a una placa de 96 pocillos de alta unión de proteína. Después de bloquear con BSA, las placas pueden sondarse con una lectina GSII-FACS y explorarse con respecto a la respuesta fluorescente máxima. Un procedimiento preferido para detectar las proteínas glicosiladas anteriores implica la exploración por espectrometría de masas MALDI-TOF después de la purificación de afinidad de K3 secretada del sobrenadante de transformantes cultivados en placas de 96 pocillos. Se seleccionaron colonias transformadas y se cultivaron a una DO600 de 10 en una placa de 96 pocillos, de 2 ml, en BMGY a 30 ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron en BMMY y se resuspendieron en 250 µ de BMMY. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron pro centrifugación, el sobrenadante se recuperó y la K3 se purificó del sobrenadante por cromatografía de afinidad de Ni. Los N-glicanos se liberaron y analizaron por espectrometría de masas de extracción retrasada MALDI-TOF como se describe en el presente documento.

En resumen, los procedimientos de la invención producen cepas de P. pastoris que produce GlcNAcMan5GlcNAc2 en alto rendimiento, como se muestra en la Figura 10B. Al menos un 60 % de los N-glicanos son GlcNAcMan5GlcNAc2. Hasta la fecha no existe ningún informe que describa la formación de GlcNAcMan5GlcNAc2 en glicoproteínas solubles secretadas en ninguna levadura. Los resultados presentados en el presente documento muestran que la adición del transportador de UDP-GlcNAc junto con la actividad GnTI produce una estructura predominantemente GlcNAcMan5GlcNAc2, que se confirma por el pico a 1457 (m/z) (Figura 10B).

Construcción de la cepa PBF-3:

La cepa de P. pastoris que expresa K3 (∆och1, arg-, ade-, his-) se transforma sucesivamente con los siguientes vectores. En primer lugar, pFB8 (SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA ∆187 de ratón) se usó para transformar la cepa de P. pastoris por electroporación. En segundo lugar, pPB103 que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis (Genbank AN AF106080) (que codifica el transportador de UDP-GlcNAc) clonado en el plásmido pBLADE-SX (Cereghino y col. (2001) Gene 263: 159-169) digerido con enzimas BamHI y BglII se usa para transformar la cepa de P. pastoris. En tercer lugar, pPB104 que contenía MNN9(s) de Saccharomyces/gen codificante de GnTI ∆38 humana clonado como un fragmento NotI-PacI en pJN336 se usó para transformar la cepa de P. pastoris.

Ejemplo 9

Modificación por Ingeniería Genética de células K. lactis para producir N-glicanos con la estructura Man5GlcNAc2

Identificación y Alteración del gen OCH1 de K. lactis

El gen OCH1 de la levadura de gemación S. cerevisiae codifica una 1,6-manosiltransferasa que es responsable de la primera adición de manosa localizada en el Golgi para dar la estructura de N-glicano MansGlcNAc2 en proteínas secretadas (Nakanishi-Shindo y col. (1993) J. Biol. Chem.; 268(35): 26338-45). Esta transferencia de manosa generalmente se conoce como la etapa inicial clave en la polimanosilación específica fúngica de estructuras de Nglicano (Nakanishi-Shindo y col. (1993) J. Biol. Chem. 268 (35): 26338-26345;Nakayamay col. (1992) EMBOJ. 11(7): 2511-19; Morin-Ganet y col (2000) Traffic 1(1): 56-68). La deleción de este gen en S. cerevisiae da como resultado una estructura de N-glicanos significativamente más corta que no incluye esta polimanosilación típica o un defecto de crecimiento a temperaturas elevadas (Nakayama y col. (1992) EMBO J. 11(7): 2511-19).

La secuencia Och1p de S. cerevisiae se alineó con homólogos conocidos de Candida albicans (Nº de acceso del Genbank AAL49987), y P. pastoris junto con las proteínas Hoc1 de S. cerevisiae (Neiman y col (1997) Genetics 145(3): 637-45 y K. lactis (base de datos PENDANT EST) que son manosiltransferasas relacionadas pero distintas. Se usaron regiones de alta homología que estaban en común entre homólogos de Och1p pero distintas de los homólogos de Hoc1p para diseñar pares de cebadores degenerados que se dirigieron contra el ADN genómico de la cepa MG1/2 de K. lactis (Bianchi y col (1987) Current Genetics 12: 185-192). La amplificación por PCR con cebadores RCD33 (CCAGAAGAATTCAATTYTGYCARTGG) (SEC ID Nº: 74) y RCD34 (CAGTGAAAATACCTGGNCCNGTCCA) (SEC ID Nº: 75) dio como resultado un producto de 302 pb que se clonó y secuenció y se mostró que la traducción prevista tenía un alto grado de homología con proteínas Och1 (>55 % con Och1p de S. cerevisiae).

El producto de PCR de 302 pb se usó para sondar una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa de

K. lactis (MG1/2) con alta rigurosidad (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se observe hibridación en un patrón coherente con un solo gen que indicaba que este segmento de 302 pb corresponde a una parte del genoma de K. lactis y K. lactis (KlOCH1) contiene una sola copia del gen. Para clonar el gen KlOCH1 entero, se usó la transferencia de Southern para localizar el locus genómico. Por consiguiente, se clonó un fragmento BoynHI/PstI de 5,2 kb por digestión del ADN genómico y ligamiento de estos fragmentos en el intervalo de 5,2 kb en pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear una biblioteca subgenómica de K. lactis. Esta biblioteca subgenómica se usó para transformar E. coli y se ensayaron varios cientos de clones por PCR de colonias usando RCD 33/34. El clon de 5,2 kb que contenía el gen de KlOCH1 previsto se secuenció y un marco de lectura abierto de 1362 pb que codificaba una proteína prevista que es idéntica en un 46,5 % al gen OCH1 de S. cerevisiae. La secuencia de 5,2 kb se usó para obtener cebadores para la construcción de un alelo de deleción och1::KANR usando un procedimiento de solapamiento de PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15). Este alelo de deleción se usó para transformar dos cepas de

K. lactis y se seleccionaron colonias resistentes a G418. Estas colonias se exploraron por PCR y con respecto a la sensibilidad a la temperatura para obtener una cepa con la ORF de OCH1 delcionada. Los resultados del experimento muestran cepas que revelan un patrón de PCR mutante, que se caracterizaron por análisis de crecimiento a diversas temperaturas y análisis de carbohidratos de N-glicano de proteínas secretadas y de la pared celular después de digestión con PNGasa. La mutación och1 confería una sensibilidad a la temperatura que permitió que las cepas crecieran a 30 ºC pero no a 35 ºC. La Figura 12A muestra un análisis MALDI-TOF de una cepa de K. lactis de tipo silvestre que produce N-glicanos de Man8GlcNAc2 [c] y superiores.

Identificación, clonación y alteración del gen MNN1 de K. lactis

MNN1 de S. cerevisiae es el gen estructural para la α-1,3-manosiltransferasa del Golgi. El producto de MNN1 es una proteína de membrana de tipo II de 762 aminoácidos (Yip y col. (1994) Proc Natl Acad Sci USA. 91(7): 2723-7). Tanto los N-oligosacáridos como los O-oligosacáridos aislados de mutantes mnn1 carecen de enlaces α-1,3-manosa (Raschke y col. (1973) J Biol Chem. 248(13): 4660-66).

La secuencia de Mnn1p de S. cerevisiae se usó para explorar las secuencias genómicas traducidas de K. lactis (PEDANT). Se identificó una secuencia de AND de 405 pb que codificaba un supuesto fragmento de proteína de similitud significativa con Mnn1p. Un segmento interno de esta secuencia posteriormente se amplificó por PCR con cebadores KMN1 (TGCCATCITTTAGGTCCAGGCCCGTTC) (SEC ID Nº: 76) y KMN2 (GATCCCACGACGCATCGTATTTCTTTC), (SEC ID Nº: 77) y se usaron para sondar una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa de K. lactis (MG1/2). Basándose en los datos de hibridación de Southern, se clonó un fragmento BamHI-PstI de 4,2 kb generando una biblioteca seleccionada por tamaños como se describe en el presente documento. Se identificó un solo clon que contenía el gen MNN1 de K. lactis por PCR de colonias enteras usando cebadores KMN1 y KMN2 y se secuenció. Dentro de este clon, se identificó una ORF de 2241 pb que codificaba una proteína prevista que era idéntica en un 4 % al gen MNN1 de S. cerevisiae. Se diseñaron cebadores para la construcción de un alelo de deleción mnn1::NATR usando el procedimiento de solapamiento por PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15).

El alelo de alteración se usó para transformar una cepa de K. lactis por electroporación y se seleccionaron transformantes resistentes nurseotricina y se amplificaron por PCR para la inserción homóloga del alelo de alteración. Las cepas que revelan un patrón de PCR mutante pueden someterse a análisis de carbohidratos de Nglicano de un gen indicador conocido.

La Figura 12B representa los N-glicanos de la cepa de deleción K. lactis och1 mnn1 observados después de la digestión con PNGasa del MALDI-TOF como se describe en el presente documento. El pico predominante a 1908 (m/z) indicado como [d] es coherente con la masa de Man9GlcNAc2.

Otros y reactivos adicionales que pueden usarse en los procedimientos para modificar la glicosilación se describen en la bibliografía, tal como en la Patente de Estados Unidos Nº 5.955.422, Patente de Estados Unidos Nº 4.775.622, Patente de Estados Unidos Nº 6.017.743, Patente de Estados Unidos Nº 4.925.796, Patente de Estados Unidos Nº 5.766.910, Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251, Patente de Estados Unidos Nº 5.910.570, Patente de Estados Unidos Nº 5.849.904, Patente de Estados Unidos Nº 5.955.347, Patente de Estados Unidos Nº 5.962.294, Patente de Estados Unidos Nº No. 5.135.854, Patente de Estados Unidos Nº 4.935.349, Patente de Estados Unidos Nº

5.707.828 y Patente de Estados Unidos Nº 5.047.335. Pueden obtenerse sistemas de expresión en levadura apropiados a partir de fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD. Los vectores están disponibles en el mercado a partir de una diversidad de fuentes.

Ejemplo 10

Identificación, clonación y deleción del gen ALG3 en P. pastoris y K. lactis.

Se generaron cebadores degenerados basándose en un alineamiento de secuencias de la proteína Alg3 de S. cerevisiae, H. sapiens y D. melanogaster y se usaron para amplificar un producto de 83 pb de ADN genómico de P. pastoris: 5'-GGTGTTTTGTTTTCTAGATCTTTGCAYTAYCARTT-3 '(SEC ID Nº: 78) y 5'AGAATTTGGTGGGTAAGAATTCCARCACCAYTCRTG-3' (SEC ID Nº: 79). El producto de PCR resultante se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el análisis de la secuencia reveló homología con homólogos ALG3/RHK1/NOT56 conocidos (GenBank NC_001134.2, AF309689, NC_003424.1). Posteriormente, se amplificaron 1929 pb aguas arriba y 2738 pb aguas abajo del producto del producto de PCR inicial a partir de una biblioteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm (1999) Yeast 15 (7):563-72) usando los oligonucleótidos internos 5'CCTAAGCTGGTATGCGTTCTCTTTGCCATATC-3' (SEC ID Nº: 80) y 5'GCGGCATAAACAATAATAGATGCTATAAAG-3' (SEC ID Nº: 81) junto con T3 (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') (SEC ID Nº: 49) y T7 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3') (SEC ID Nº: 48) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) en el esqueleto de la biblioteca que llevaba el plásmido lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). Los fragmentos resultantes se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron. A partir de esta secuencia, se identificó una ORF de 1395 pb que codifica una proteína con una identidad del 35 % y una similitud del 53 % con el gen ALG3 de S. cerevisiae (usando programas BLAST). El gen se denominó PpALG3.

La secuencia de PpALG3 se usó para crear una serie de cebadores para generar una construcción de deleción del gen PpALG3 por solapamiento por PCR (Davidson y col (2002) Microbiol 148(Pt 8):2607-15). Se usaron los proporcionados a continuación para amplificar regiones de 1 kb 5' y 3' de la ORF de PpALG3 y el gen KANR, respectivamente:

RCD142 (5'-CCACATCATCCGTGCTACATATAG-3') (SEC ID Nº: 82),

RCD144 (5'-ACGAGGCAAGCTAAACAGATCTCGAAGTATCGAGGGTTAT CCAG-3') (SEC ID Nº: 83),

RCD 145 (5'-CCATCCAGTGTCGAAAACGAGCCAATGGTTCATGTCTATA AATC-3') (SEC ID Nº: 84),

RCD147 (5'-AGCCTCAGCGCCAACAAGCGATGG-3') (SEC ID Nº: 85),

RCD143 (5'-CTGGATAACCCTCGATACTTCGAGATCTGTTTAGCTTGCC TCGT-3') (SEC ID Nº: 86) y

RCD146 (5'-GATTTATAGACATGAACCATTGGCTCGTTTTCGACACTGG ATGG-3') (SEC ID Nº: 87).

Posteriormente, se usaron cebadore RCD142 y RCD147 para solapar los tres productos de PCR resultantes en un solo alelo de deleción de 3,6 kb alg3 :: KANR .

Identificación, clonación y deleción del gen ALG3 en K. lactis.

Las secuencias ALG3p de S. cerevisiae, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, etc. se alinearon con secuencias de K. lactis (base de datos PENDANT EST). Se usaron regiones de alta homología que estaban en homólogos comunes pero distintos en secuencia exacta de los homólogos para crear pares de cebadores degenerados que se dirigieron contra el ADN genómico de la cepa MG1/2 de K. lactis (Bianchi y col, 1987). En el caso de ALG3, la amplificación por PCR con cebadores KAL-1 (5'-ATCCTTTACCGATGCTGTAT-3') (SEC ID Nº: 88) y KAL-2 (5'ATAACAGTATGTGTTACACGCGTGTAG-3') (SEC ID Nº: 89) dio como resultado un producto que se clonó y secuenció y se mostró que la traducción prevista tenía un alto grado de homología con proteínas Alg3p (> 50 % con Alg3p de S. cerevisiae).

El producto de PCR se usó para sondear una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa de K. lactis (MG1/2) con alta rigurosidad (Sambrook y col, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se observó hibridación en un patrón coherente con un solo gen. Esta transferencia de Southern se usó para localizar los locis genómicos. Se clonaron fragmentos genómicos por digestión de ADN genómico y ligamiento de estos fragmentos en el intervalo de tamaños apropiado en pUC19 para crear una biblioteca subgenómico de K. lactis. Esta biblioteca subgenómica se usó para transformar E. coli y se ensayaron varios cientos de clones por PCR de colonias, usando los cebadores KAL-1 y KAL-2. Los clones que contenían los genes KlALG3 y KlALG61 previstos se secuenciaron y se identificaron los marcos de lectura abiertos.

Se diseñaron cebadores para la construcción de un alelo de deleción alg3::NATR, usando un procedimiento de solapamiento por PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol 148(Pt 8):2607-15), y el alelo de deleción resultante se usó para transformar dos cepas de K. lactis y se seleccionaron colonias resistentes a NAT. Estas colonias se exploraron por PCR y se obtuvieron transformantes en los que la ORF de ALG3 se había reemplazado por el alelo mutante och1::NATR .

Ejemplo 11

Generación de una cepa mutante alg3 och1 que expresa una α-1,2-manosidasa, GnTI y GnTII para la producción de una glicoproteína de tipo humano.

Se generó ua construcción de deleción alg3 :: KANR de P. pastoris como se describe en el Ejemplo 10. Aproximadamente 5 µg del producto de PCR resultante se usaron para transformar la cepa PBP-3 (véase el Ejemplo 3) y se seleccionaron colonias en medio YPD que contenía 200 µg/ml de G418. Se confirmó que una cepa de 20 exploradas por PCR contenía la integración correcta del alelo mutante alg3 :: KANR y carecía del alelo de tipo silvestre. Esta cepa se denominó RDP27 (Figura 36).

Después se generó una biblioteca de construcciones de GnTII, que comprendía fusiones en fase de la biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTII de fuentes humanas y de rata (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de P. pastoris que contenía el gen NSTR que confería resistencia al fármaco nourseotricina. Los plásmidos de la biblioteca se linealizaron con EcoRI, usaron para transformar la cepa RDP27 por electroporación y las cepas resultantes se exploraron por análisis de los glicanos liberados a partir de K3 purificadas. Una cepa de P. pastoris que expresaba la GnTII de rata fusionada en fase a la construcción de MNN9

(s) de S. cerevisiae se denominó PBP6-5 (Figura 36).

Generación de construcciones de expresión de GnTII

La construcción de un vector de expresión de GnTI (pNA15) que contiene un gen de GnTI humano fusionado con la parte N-terminal del gen MNN9 de S. cerevisiae se describe en Choi y col (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100 (9):5022-27. De una forma similar, se clonó el gen de GnTII de rata. El gen GnTII de rata (número de acceso del GenBank U21662) se amplificó por PCR usando la polimerasa Takara Ex Taq™ (Panvera) de la biblioteca de ADNc de hígado de rata (Clontech) con cebadores RAT1 (5'-TTCCTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3') (SEC ID Nº: 90) y RAT2 (5'-TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3') (SEC ID Nº: 91). El producto de PCR después se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Usando este vector como molde, se amplificó el fragmento AscI-PacI de GnTII, que codificaba los aminoácidos 88-443 con Pfu Turbo polimerasa (Stratagene) y cebadores,

RAT44 (5'-TTGGCGCGCCTCCCTAGTGTACCAGTTGAACTTTG-3') (SEC ID Nº: 92) y

RAT11 (5'-GATTAATTAACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3 ') (SEC ID Nº: 93), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados). Después de la confirmación por secuenciación, el dominio catalítico de GnTII de rata se clonó aguas abajo del promotor PMA1 como un fragmento AscI-PacI en pBP124. En la etapa final, el fragmento génico que codificaba la señal de localización de Mnn2 de S. cerevisiae se clonó a partir de pJN281 como un fragmento NotIa AscI para generar una fusión en fase con el dominio catalítico de GnTII para generar el plásmido pTC53.

Ejemplo 12

Clonación y expresión de GnTIII para producir GlcNAc de bisección que refuerza la funcionalidad de anticuerpos

La adición de una N-acetilglucosamina a la estructura GlcNAc2Man3GlcNAc2 por N-acetilglucosaminiltransferasas-III produce un N-glicano denominado biseccionado (véase la Figura 15). Esta estructura se ha implicado en una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Umana y col (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-80).

Una célula huésped tal como una cepa de levadura capaz de producir glicoproteínas con N-glicanos biseccionados se obtiene por ingeniería genética de acuerdo con la invención, introduciendo en la célula huésped una actividad GnTIII. Preferentemente, la célula huésped se transforma con un ácido nucleico que codifica GnTIII (por ejemplo, un mamífero tal como la GnTIII murina mostrada en la Figura 24) o un dominio de la misma que tiene actividad enzimática, opcionalmente fusionada a un péptido señal de dirección celular heterólogo (por ejemplo, usando las bibliotecas y procedimientos asociados de la invención).

Las IgG consisten en dos cadenas pesadas (VH, CH1, CH2 y CH3 en la Figura 22), interconectadas en la región de bisagra a través de tres puentes disulfuro, y dos cadenas ligeras (VL, CL en la Figura 22). Las cadenas ligeras (dominios VL y CL) están unidas por otro puente disulfuro a la parte CH1 de la cadena pesada y junto con el fragmento CH1 y VH constituyen la denominada región Fab. Los antígenos se unen a la parte terminal de la región Fab. La región Fc de las IgG consiste la región CH3, la región CH2 y la región de bisagra y es responsable de las denominadas funciones efectoras (véase más adelante).

La función primaria de los anticuerpos es la unión a un antígeno. Sin embargo, aunque la unión al antígeno directamente inactiva el antígeno (tal como en el caso de las toxinas bacterianas), la mera unión es insignificante a menos que se activen las denominadas funciones efectoras. Los anticuerpos de la subclase IgG ejercen dos funciones efectoras principales: la activación del sistema de complemento y la inducción de fagocitosis. El sistema de complemento consiste en un grupo complejo de proteínas séricas implicadas en el control de acontecimientos inflamatorios, en la activación de fagocitos y en la destrucción lítica de membranas celulares. La activación del complemento comienza con la unión del complejo C1 a la parte Fc de dos IgG muy próximas. C1 consiste en una molécula, C1q, y dos moléculas C1r y C1s. La fagocitosis se inicia mediante una interacción entre el fragmento Fc de las IgG y receptores Fc-gamma (FcγRI, II y III en la Figura 22). Los receptores Fc principalmente se expresan en la superficie de las células efectoras del sistema inmune, en particular macrófagos, monocitos, células mieloides y células dendríticas.

La parte CH2 lleva un sitio de N-glicosilación conservado en la asparagina 297 (Asn297). Los N-glicanos Asn297 son muy heterogéneo y se sabe que afectan a la unión al receptor Fc y la activación del complemento. Sólo una minoría (es decir, aproximadamente un 15-20 %) de IgG llevan un N-glicano disialilado, y un 3-10 % tienen un N-glicano monosialilado (revisado en Jefferis (2001) Biopharm. 14:19-26). De forma interesante, la estructura mínima de Nglicano que se ha mostraado que es necesario para anticuerpos completamente funcionales capaces de activar el complemento y de unirse al receptor Fc es un pentasacárido con restos de N-acetilglucosamina terminales (GlcNAc2Man3) (revisado en Jefferis, R, Glycosylation of human IgG Antibodies. BioPharm, 2001). Los anticuerpos con menos de un N-glicano GlcNAc2Man3 o sin N-glicosilación en Asn297 podría ser capaces de unirse a un antígeno, pero lo mas probable es que no activen acontecimientos aguas abajo cruciales tales como la fagocitosis y la activación del complemento. Además, los anticuerpos con N-glicanos de tipo fúngico unidos a Asn297 con toda probabilidad solicitarán una respuesta inmune en un organismo de mamífero que hará que el anticuerpo sea inútil como una glicoproteína terapéutica.

Clonación y expresión de GnTIII

El fragmento de ADN que codifica parte de la proteína GnTIII de ratón que carece del dominio TM se amplifica por PCR a partir de ADN genómico murino (o de otro mamífero) usando los cebadores directo (5'TCCTGGCGCGCCTTCCCGAGAGAACTGGCCTCCCTC-3') (SEC ID Nº: 94) e inverso (5'AATTAATTAACCCTAGCCCTCCGCTGTATCCAACTTG-3') (SEC ID Nº: 95) Estos cebadores incluyen sitios de restricción AscI y PacI que pueden usarse para la clonación en el vector adecuado para la fusión con la biblioteca líder.

En la Figura 24 se muestran secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº: 45) y de aminoácidos (SEC ID Nº: 46) de GnTIII murina.

Clonación de Secuencias que codifican inmunoglobulinas

Previamente se han publicado protocolos para la clonación de las regiones variables de anticuerpos, incluyendo secuencias cebadoras. Las fuentes de anticuerpos y genes codificantes pueden ser, entre otras, linfocitos B humanos inmunizados in vitro (véase, por ejemplo, Borreback y col. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA. 85:39953999), linfocitos de sangre periférica o linfocitos B humanos individuales (véase, por ejemplo, Lagerkvist y col (1995) Biotechniques 18:862-869 y Terness y col (1997) Hum Iminunol 56:17-27) y ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulinas humanas, que permiten la creación de líneas celulares de hibridoma.

Usando técnicas de ADN recombinante convencionales, pueden clonarse secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. Las fuentes para la información genética que codifican inmunoglobulinas de interés normalmente son preparaciones de ARN total de células de interés, tales como linfocitos sanguíneos o líneas celulares de hibridoma. Por ejemplo, empleando un protocolo basado en PCR con cebadores específicos, pueden clonarse regiones variables mediante transcripción inversa iniciada a partir de un cebador específico de secuencia que híbrida con el sitio del dominio CH1 de IgG y un segundo cebador que codifica los aminoácidos 111-118 de la región constante kappa murina. Los ADNc que codifican VH y VK después pueden amplificarse como se ha publicado previamente (véase, por ejemplo, Graziano y col (1995) J. Immunol 155(10):4996-5002; Welschof y col (1995) J. Immunol Methods 179:203-214, y Orlandi y col (1988) Proc Natl Acad Sci USA. 86:3833). También se han publicado procedimientos de clonación para inmunoglobulinas enteras (cadenas pesada y ligera) (véase, por ejemplo, Buckel y col (1987) Gene 51:13-19; Recinos y col (1994) Gene 149: 385-386; Recinos y col (1995) Gene 158:311-12). Se han descrito protocolos adicionales para la clonación y generación de fragmentos de anticuerpo y construcciones de expresión de anticuerpos en Antibody Engineering, Kontermann and Dübel (2001), Eds, Springer Verlag. Berlín Heidelberg Nueva York.

Se han descrito plásmidos de expresión fúngica que codifican cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Abdel-Salam y col (2001) Appl Microbiol Biotechnol 56:157-164, y Ogunjimi y col (1999). Biotechnology Letters 21:561-567). De esta manera, se pueden generar plásmidos de expresión que llevan las regiones constantes de inmunoglobulinas. Para facilitar la clonación de regiones variables en estos vectores de expresión, pueden ponerse sitios de restricción adecuados muy cerca del extremo de las regiones variables. Las regiones constantes pueden construirse de tal forma que las regiones variables puedan fusionarse fácilmente en fase con las mismas mediante un simple experimento de digestión de restricción/ligamiento. La Figura 23 muestra una visión general esquemática de dicha construcción de expresión, diseñada de una forma muy modular, que permite un fácil intercambio de promotores, terminadores de la transcripción, dominios de dirección de integración e incluso marcadores de selección.

Como se muestra en la Figura 23, los dominios VL así como los dominios VH elegidos pueden clonarse fácilmente en fase con regiones CL y CH, respectivamente. La integración inicial se dirige al locus AOX de P. pastoris (o un locus homólogo en otra célula fúngica) y el promotor AOX inducible por metanol dirigirá la expresión. Como alternativa, puede usarse cualquier otro casete de promotor constitutivo o inducible deseado. De esta manera, si se desea, las regiones 5'AOX y 3'AOX así como fragmentos terminadores de la transcripción (TT) pueden reemplazarse fácilmente con diferentes TT, promotores y dominios de dirección de integración para optimizar la expresión. Inicialmente, se emplea la señal de secreción del factor alfa con el sitio de proteasa KEX convencional para facilitar la secreción de cadenas pesada y ligera. Las propiedades del vector de expresión pueden refinarse adicionalmente usando técnicas convencionales.

Un vector de expresión de Ig tal como el descrito anteriormente se introduce en una célula huésped de la invención que expresa GnTIII, preferentemente en el aparato de Golgi de la célula huésped. Las moléculas de Ig expresadas en dicha célula huésped comprenden N-glicanos que tienen GlcNAc de bisección.

Ejemplo 13

Generación de la cepa de levadura YSH-1 (∆och1, α1,2-manosidasa, GnTI)

Como cepa huésped se usó la cepa BK64 de P. pastoris indicada previamente (Choi y col (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100(9):5022-7), un auxótrofo triple (ADE, ARG, HIS) que posee el Knock-out de OCH1 y que expresa el dominio kringle 3 (K3) de plasminógeno humano. BK64 se transformó con el plásmido pPB103 linearizado con la enzima de restricción EcoNI para introducir el transportador de UDP-N-acetilglucosamina de K. lactis en la célula huésped, creando de esta manera la cepa PBP-1. El MnSI de ratón se introdujo en esta cepa por transformación con el plásmido pFB8 linearizado con la enzimas de restricción EcoNI, generando la cepa PBP-2. El análisis de glicanos de K3 a partir de proteínas aisladas de la cepa PBP-2 demostró que la glicoforma principalmente presente era Man5GlcNAc2.

PBP-2 posteriormente se transformó con el plásmido de GnTI humano pNA15 linealizado con la enzima de restricción AatII, generando la cepa PBP-3. El análisis de las glicoformas de K3 producidas en la cepa PBP-3 demostró que el glicano híbrido GlcNAcMan5GlcNAc2 era la estructura predominante. Para recuperar el marcador de URA3 a partir de PBP-3, esta cepa se cultivó en YPD antes de la selección en medio mínimo que contenía 5fluoroorótico (5-FOA, BioVectra) y uracilo (Boeke y col (1984) Mol. Gen. Genet. 197:345-346). La cepa Ura-menos recuperada que producía glicoformas GlcNAcMan5GlcNAc2 se denominó YSH-1 (Figura 36). El perfil de N-glicanos de la cepa YSH-1 se muestra en la Figura 25 (superior) y presenta un pico predominante a 1465 m/z que corresponde a la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 [d].

Ejemplo 14

Generación de la cepa de levadura YSH-37 (P. pastoris que expresa manosidasa II)

YSH-1 (Ejemplo 13) se transformó con el plásmido de manosidasa II∆74 de D. melanogaster/MNN2 (s) de S. cerevisiae (pKD53) linearizado con la enzimas de restricción ApaI, generando la cepa YSH-37 (Figura 36). El análisis de las estructuras de glicano de K3 producidas en la cepa YSH-37 (Figura 25 (inferior)) demostró que la glicoforma predominante a 1140 m/z corresponde a la masa de GlcNAcMan3GlcNAc2 [b] y otras glicoformas GlcNAcMan4GleNAc2 [c] a 1303 m/z y GlcNAcMan5GlcNAc2 [d] a 1465 m/z.

Ejemplo 15

Generación de la cepa de levadura YSH-44

La cepa YSH-37 (Ejemplo 14) se transformó con un plásmido que codificaba un líder de GnTII/MNN2 (s) de rata, pTC53, linealizado con la enzima de restricción EcoRI. La cepa resultante, YSH-44 (Figura 36), produjo un Nglicano de K3 que tenía una sola glicoforma a 1356 m/z, correspondiente a la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2 [x], por espectrometría de masas MALDI-TOF de modo positivo (Figura 29) .

Digestión con β-N-acetilhexosaminidasa

Los glicano s de YSH-44 se liberaron y separaron de las glicoproteínas por una modificación de un procedimiento indicado previamente (Papac y col. A.J.S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Después de que las proteínas se redujeran y carboximetilaran y las membranas se bloquearon, los pocillos se lavaron tres veces con agua. La proteína se desglicosiló por la adición de 30 µl de NFi4HCO3 10 mM pH 8,3 que contenía una mili unidad de Nglicanasa (Glyko, Novato, CA). Después de una digestión de 16 horas a 37 ºC, la solución que contenía los glicanos se retiró por centrifugación y se evaporó a sequedad. Los glicanos después se secaron en un speed vac aSC210A (Thermo Savant, Halbrook, NY). Los glicanos secados se pusieron en NH4Ac 50 mM pH 5,0 a 37 ºC durante una noche y se añadió 1 mU de hexosa (Glyko, Novato, CA).

Ejemplo 16

Construcción del plásmido pJN 348

El plásmido pBLURA-SX (de Jim Cregg) se digirió con BamHI y BglII para liberar el casete de expresión AOX. El fragmento BamHI que contenía el casete de expresión de GAPDH/CYC1 de pJN261 (Figura 4B) (Ejemplo 4) después se ligó al esqueleto de pBLURA-SX para crear pJN338. El plásmido pJN338 se cortó con NotI y PacI y los dos oligonucleótidos 5'-GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT-3' (SEC ID Nº: 96) y 5'TAAGGCGCGCC GAATTCATTTAAATCTGCAGGGC3' (SEC ID Nº: 97) que se habían hibridado in vitro, se ligaron a los sitios abiertos, para crear pJN348.

Ejemplo 17

Construcción de un plásmido de integración pRCD259

El vector de expresión de GAPDH que contenía PpURA3 pJN348 se linealizó con XhoI y sus extremos se hicieron romos con ADN polimerasa de T4 y se trató con fofatasa intestinal bobina (CIP). El marcador de resistencia HYG se digirió a partir de pAG32 con BglII y SacI y sus extremos se hicieron romos, después se ligó en pJN348 para crear pRCD259 que puede usarse como vector de expresión de HYG que integra el locus PpURA3.

Ejemplo 18

Generación de construcciones de fusión de GnTIII

5 Se prepararon construcciones de fusión entre GnTIII de mamífero y secuencias de dirección de levadura usando el gen Mgat3 de ratón (número de acceso del GenBank L39373, Bhaumik y col. 1995). Tres fragmentos de AND correspondientes a las deleciones N-terminales ∆32, ∆86 y ∆212 del gen de GnTIII de ratón se amplificaron por PCR usando la Pfu Turbo polimerasa (Stratagene) con cebadores directos

MG3-B (5’-TCCTGGCGCGCCTTCCCGAGAGAACTGGCCTCCCTC-3’) (SEC ID Nº: 98),

10 MG3-C (5’-CCGAGGCGCGCCACAGAGGAACTGCACCGGGTG-3’) (SEC ID Nº: 99),

MG3-D (5’-ACCGAGGCGCGCCATCAACGCCATCAACATCAACCAC-3’) (SEC ID Nº: 100),

e inversos

MG3-A (5’-AATTAATTAACCCTAGCCCTCCGCTGTATCCAACTTG-3’) (SEC ID Nº: 101). Los productos de PCR después se clonaron en el vector pJN 348 como fragmentos AscI-PacI y se secuenciaron. Los vectores resultantes

15 pVA (GnTIII ∆32), pVB (GnTIII ∆86) y pVC (GnTIII ∆212) se digirieron con enzimas NotI-AscI y se usaron para el ligamiento con la biblioteca líder de levadura (líderes 20-67). Estos péptidos de dirección se fusionan a los dominios catalíticos seleccionados de la GnTIII de ratón con deleciones N-terminales de 32, 86 y 212 aminoácidos. Por ejemplo, el péptido de dirección de MNN2 de S. cerevisiae (largo, medio y corto) y GNT1 de K. lactis (corto y medio) (véase el Ejemplo 11) se muestran en la Tabla 11.

20 Tabla 11. Una biblioteca combinatoria representativa de secuencias de péptidos de dirección/dominios catalíticos que presentan actividad UDP-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) en P. pastoris YSH-1

Péptido de dirección

Dominio catalítico

S. cerevisiae MNN2(s) S. cerevisiae MNN2(m) S. cerevisiae MNN2(l) K. lactis GNT1(m)

GnTIII ∆32 de ratón

50 % (pVA53) 30-40 % (pVA54) 20-30 % (pVA55) 0 % (pVA51)

GnTIII ∆86 de ratón

20-30 % (pVB53) 30-40 % (pVB54) 20-30 % (pVB55) 0 % (pVB51)

GnTIII ∆212 de ratón

0 % (pVC53) 0 % (pVC54) 0 % (pVC55) 0 % (pVC51)

Ejemplo 19

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris para producir GlcNAc2Man5GlcNAc2 biseccionado

25 La cepa de P. pastoris que produce GlcNAcMan5GlcNAc2 (PBP-3) (véase el Ejemplo 8) se sometió a contraselección en 5-FOA, seleccionando de esta manera la pérdida del marcador URA3+ y un fenotipo ura3-. Esta cepa, denominada YSH-1 (Figura 36) se transformó con la biblioteca de dominios catalíticos de Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) (vectores pVA, pVB y pVC) y líderes. Los transformantes se cultivaron a 30ºC en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY

30 para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glicanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). Los N-glicanos se analizaron con un EM MALDI-TOF (Ejemplo 3). Las actividades de GnTIII se muestran en la Tabla 11. El número de

35 (+), como se usa en el presente documento, indica los niveles relativos de producción de N-glicano biseccionado de % de glicanos neutros. Se seleccionaron secuencias de péptidos de dirección a partir del grupo consistente en: GLS1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, OCH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP1 de Saccharomyces, HOCI de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de

40 Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de Saccharomyces. Los transformantes pVA53 que presentaban el GlcNAc de bisección (por ejemplo GlcNAc2Man5GlcNAc2) se denominaron PBP26 (Figura36).

Ejemplo 20

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris YSH-44 para producir GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionado

Para la expresión de GnTIII en la cepa YSH-44 (Figura 36), se transfirieron construcciones de GnTIII de vectores pVA53, pVB53, pVA54 y pVB54 como fragmentos NotI-PacI en pRCD259 para generar vectores pPB135, pPB137, pPB136 y pPB138. Los vectores contienen el marcador de resistencia a HYG y el gen URA3 de P. pastoris como secuencia de dirección para la integración genómica. Los plásmidos se linealizan con SalI, se usan para transformar la cepa YSH-44 por electroporación, se seleccionan en medio que contiene higromicina y las cepas resultantes se exploran por análisis de los glicanos liberados a partir de K3 purificada. Los transformantes se cultivaron a 24ºC en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 procedente de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000 (Ejemplo 3). La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glicanos se liberaron por digestión con PNGasa. Los N-glicanos se analizaron con un EM MALDI-TOF (Ejemplo 3). Los transformantes de pPB135 que presentaban el GlcNAc de bisección (por ejemplo GlcNAc2Man5GlcNAc2) se denominaron YSH-57 (Figura 36). La Tabla 11 representa la actividad del GnTIII de ratón.

Ejemplo 21

Modificación por ingeniería genética de P. pastoris PBP6-5 para producir GlcNAc3Man3GlcNAc2 biseccionado

La cepa P. pastoris PBP6-5 (Ejemplo 11) se transformó con el plásmido pPB135 (Tabla 11) que codifica un dominio catalítico de GnTIII de ratón (∆32) ligado en fase a un péptido de dirección derivado de MNN2 de S. cerevisiae. Los transformantes se cultivaron a 30ºC en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glicanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). Los N-glicanos se analizaron con un EM MALDI-TOF (Ejemplo 3). Los transformantes que presentaban el GlcNAc de bisección (por ejemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2) se denominaron PBP-38 (Figura 36). La Tabla 11 representa la actividad de la GnTIII de ratón.

Ejemplo 22

Ensayo de actividad de GnTIII in vitro usando sustrato GlcNAcMan5GlcNAc2 en la cepa de P. pastoris modificada por ingeniería genética YSH-57

Para ensayar cualquier actividad de GnTIII ex vivo potencial en la cepa de P. pastoris, se ensayaron sobrenadantes de cultivo de células YSH-57 con respecto a la actividad GnTIII. Se cultivaron células YSH-57 de P. pastoris a 24ºC en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente transparente. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de GaTIII y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glicanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente con respecto a la presencia de actividad GnTIII secretada. GlcNAcMan5GlcNAc2 purificado a partir de K3 expresada en la cepa PBP-3 se añadió a: BMMY (A) UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en BMMY (B); el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C); el sobrenadante de YSH-57 + UDP-GlcNAc 1 mM (D). Después de la incubación durante 8 horas a temperatura ambiente las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el grado de actividad de GnTIII.

Ejemplo 23

Actividad de GnTIII in vitro usando sustrato GlcNAc2Man3GlcNAc2 en la cepa de P. pastoris YSH-57 modificada por ingeniería genética

Para ensayar cualquier actividad potencial de GnTIII ex vivo en la cepa de P. pastoris YSH-57 se ensayaron sobrenadantes de cultivo celular con respecto a la actividad de GnTIII. Se cultivaron células YSH-57 de P. pastoris a 24ºC en BMGY a una DO600 de aproximadamente 10. Las células se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 procedente de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron por centrifugación para producir un sobrenadante esencialmente transparente. Se retiró una alícuota del sobrenadante para ensayos de GnTIII y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glicanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). La alícuota retirada anteriormente del sobrenadante se ensayó adicionalmente con respecto a la presencia de actividad GnTIII secretada. Se añadió GlcNAc2Man3GlcNAc2 purificado a partir de K3 expresada en la cepa YSH-44 a: BMMY (A) UDP-GlcNAc 1 mM (Sigma Chemical Co., St.

5 Louis, MO)) en BMMY (B); el sobrenadante de YSH-44 transformado con pVA53 [YSH-57] (C). Después de la incubación durante 8 horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron por HPLC de amino sílice para determinar el grado de actividad de GnTIII.

Ejemplo 24

Clonación y expresión de GnTIV en P. pastoris

10 El fragmento de ADN que codifica parte de la isoenzima A de la proteína GnTIV humana (MGAT4A) que carece del domino TM se amplificó por PCR a partir de ADNc humano usando cebadores directo HGIV-2 (5’CTGATTGCTTATCAACGAGAATTCCTTG-3’) e inverso HGIV-3 (5’-TGTTGGTTTCTCAGATGATCAGTTGGTG-3’), clonados en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Para la clonación en un vector adecuado para la fusión con una biblioteca líder, los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR con cebadores que incluyen sitios de

15 restricción AscI y PacI. Los cebadores directos de AscI: HGIV-ASC1 (5’TGGGCGCGCCAAACTGATTGCTTATCAACGAGAA-3’), HGIV-ASC2 (5’AGTGGGCGCGCCTTGAATAAGTTTTCAGATAATACC-3’), HGIV-ASC3 (5’AAGGGCGCGCCCAAGTGCCAAGTATTTATTATC-3’). Cebador inverso PacI HGIVPAC (5’GTTTAATTAAGATCAGTTGGTGGCTTTTTTAATATG-3’). Las secuencias de ácido nucleico de aminoácidos de la

20 GnTIV A humana se muestran en la Figura 41.

De forma similar, el fragmento de ADN que codifica parte de la isoenzima B de la proteína GnTIV humana (MGAT4B) que carece del dominio TM se amplificó por PCR a partir de ADNc humano usando cebadores directo HGIVB-2 (5’-AGCGGCCAGAAAGGCGACGTTGTGGAC-3’) e inverso HGIVB-3 (5’TACCCTCAGAAGCCCGCAGCTTAGTC-3’) se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Para la 25 clonación en un vector adecuado para la fusión con una biblioteca líder, los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR con cebadores que incluyen sitios de restricción AscI y PacI. Cebadores directos AscI: HGIVB-A1 (5’AGCGGGCGCGCCGGCGACGTTGTGGACGTTTAC-3’), HGIVB-A2 (5’CCGTGGCGCGCCTCACACCGGCACGTGCTGCAC-3’). Cebador inverso PacI HGIVB-P (5’TGTTAATTAAGCTTAGTCGGCCTTTTTCAGGAAG-3’). En la Figura 42 se muestran las secuencias de ácido

30 nucleico de amino ácidos de GnTIV B humana.

Tabla 12: Plásmidos que contienen construcciones de fusión de GnTV o GnTIV para la expresión de estructuras multiantenarias

Dominio catalítico/líder

Vector de HYG Vector de KAN

GnTV de ratón

∆95-53

pPB146

∆145-53

pPB125 pPB140

∆145-54

pPB130

∆209-53

pPB126

∆209-54

pPB131

GnT IVA humana

∆32-53

pPB127

∆82-53

pPB128 pPB141

∆103-53

pPB129

∆32-54

pPB132

∆82-54

pPB133

∆103-54

pPB134

GnT IVB humana

∆32-53

pPB143

∆104-53

pPB144

GnT IX humana

∆43-53

pPB176

Ejemplo 25

Cepa de P. pastoris que produce estructuras de glicano triantenarias

La cepa YSH-44 de P. pastoris (Ejemplo 15) que produce estructuras de glicanos complejos se transformó con el

5 plásmido pPB144 (Tabla 12) que contenía un fragmento génico que codificaba el dominio catalítico de GnTIVB humano (∆104) ligado en fase a un péptido de dirección de MNN2(s) de S. cerevisiae [nucleótidos 1-108]. El plásmido pPB144 también contiene un marcador de resistencia a HYG y el gen URA3 de P. pastoris como secuencia de dirección para la integración genómica. Se linealizó 1 µg de plásmidos con SAlI, se usó para transformar la cepa YSH-44 por electroporación, se seleccionó el medio que contenía higromicina y las cepas

10 resultantes se exploraron por análisis de los glicanos liberados a partir de K3 purificada. Los transformantes se cultivaron a 30ºC en BMGY a una DO600 y aproximadamente 100, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 procedente de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. K3 se purificó del medio por cromatografía de afinidad de Ni usando un formato de 96 pocillos en un robot de laboratorio Beckman BioMek 2000. La purificación robótica es una adaptación del protocolo proporcionado

15 por Novagen para su resina HisBind (Ejemplo 3). Los N-glicanos se liberaron por digestión con PNGasa (Ejemplo 3). Los N-glicanos se analizaron con un EM MALDI-TOF (Ejemplo 3). Los transformantes que presentaban la transferencia de restos de GlcNAc al brazo de Manα1,3 de la estructura de oligosacárido (por ejemplo GlcNAc2Man3GlcNAc2) se denominaron PBP43 (Figura 47). El análisis de los N-glicanos proporciona un pico predominante a 1543 m/z [y] que es coherente con la masa del glicano GlcNAc3Man3GlcNAc2.

20 Ejemplo 26

Clonación y expresión de GnTV en P. pastoris

El fragmento de ADN que codifica parte de la proteína GnTV de ratón (MGAT45) que carece del dominio TM se amplificó por PCR a partir de ADNc murino usando cebadores directo MGV-2 (5’AAATCAAGTGGATGAAGGACATGTGGC3’) e inverso MGV-3 (5’-AGCGATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3’), 25 se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Para la clonación en el vector adecuado para la fusión con la biblioteca líder, los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR con cebadores que incluyen sitios de restricción AscI y PacI. Cebadores directos de AscI: MGV-ASC1 (5’TATGGGCGCGCCGATCATAACTCATTGGCGGAAATC-3’), MGV-ASC2 (5’GAAGGGCGCGCCTTGCCTCCTATGGATGGCTACCCCCAC-3’), MGV-ASC3 (5’

30 TGGGGCGCGCCGGCAAGCTCGAGTCAAAGGTGGACAAT-3’). Cebador inverso de PacI MGV-PAC (5’AGTTAATTAATGCTATAGGCAGTCTTTGCAGAG-3’). Las secuencias de ácido nucleico de aminoácidos de la GnTV de ratón se muestran en la Figura 43.

Ejemplo 27

Cepas de P. pastoris que expresa GnTV

35 La cepa YSH-44 de P. pastoris (Ejemplo 15) que produce estructuras de glicano complejas se transformó con el plásmido pPB144 (Tabla 12) que contenía un fragmento génico que codificaba el dominio catalítico de GnTV de ratón (∆45) ligado en fase a un péptido de dirección derivado de MNN2(s) de S. cerevisiae. Las condiciones de cultivo fueron las mismas que en el Ejemplo 25. Las proteínas indicadoras K3 de dos transformantes se analizaron usando MALDI-TOF. Un pico a 1559 m/z [y] es coherente con la masa del glicano GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Figura

40 48). Un pico secundario a 1355 m/z [u] es coherente con la masa de GlcNAc2Man3GlcNAc2.

Ejemplo 28

Cepa de P. pastoris que produce estructuras tetraantenarias en glicoproteínas

La cepa PBP43 de P. pastoris (Ejemplo 25) que producía estructuras de glicano triantenarias (por ejemplo GlcNAc3Man3GlcNAc2) se transformó con el plásmido pPB140 (Figura 40B) que codificaba la GnTV de ratón 45 (Ejemplo 27). El vector pPB140 contiene un marcador de resistencia a KAN y el gen HIS3 de P. pastoris como secuencia de dirección para la integración genómica. Se linealizó 1 µg de plásmidos con KpnI, se usó para transformar la cepa FBF43 por electroporación, se seleccionó en medio que contenía canamicina y las cepas resultantes se exploraron por análisis de los glicanos liberados a partir de K3 purificada. Las condiciones de cultivo

fueron las mismas que en el Ejemplo 25. El análisis de la proteínas indicadora K3 por MALDI-TOF mostró un pico predominante a 1747 m/z [z] que es coherente con la masa del glicano tetraantenario GlcNAc4Man3GlcNAc2 (Figura 49). La digestión con hexosaminidasa (véase el Ejemplo 15) de los glicanos resultantes mostró la masa del pico correspondiente a Man3GlcNAc2 (datos no mostrados).

En un segundo experimento, P. pastoris YSH-44 se transformó con pPB128 y pPB140 (Tabla 12). El análisis de los transformantes que producían la proteína indicadora K3 por MALDI-TOF mostró un pico predominante al 1743 m/z [z], que es coherente con la masa del glicano tetraantenario GlcNAc4Man3GlcNAc2 (Figura 50).

Ejemplo 29

Clonación y expresión de GnTIX en P. pastoris

Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de la GnTIX humana (AB109185.1) se muestran en la Figura

45. El fragmento de ADN de codones optimizados que codifica parte de la GnTIX humana que carece del dominio TM (∆43) se sintetizó a partir de oligonucleótidos usando PCR (Figura 46). El fragmento de ADN que codifica el dominio catalítico de GnTIX se ligó en fase a un péptido de dirección derivado de MNN2(s) de S. cerevisiae. El plásmido resultante pPB176 (Figura 40C) se linealizó con KpnI y se usó para transformar la cepa YSH-44 de P. pastoris (Ejemplo 15) produciendo estructuras de glicano tetraantenarioes complejas. Las condiciones de cultivo fueron las mismas que en el Ejemplo 25. La proteína indicadora K3 de un transformante se analizó usando EM MALDI-TOF.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> GlycoFi, Inc.

<120> PRODUCCIÓN DE GLICOPROTEÍNAS MODIFICADAS QUE TIENEN ESTRUCTURAS MULTIANTENARIAS

<130> L2572 EP/1 S3

<150> 10/680.963

<151>

<150> 10/371.877

<151>

<160> 125

<170> PatentIn Ver. 3.2

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: motivo ilustrativo"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)

<223> cualquier aminoácido excepto prolina

<400> 1

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: motivo ilustrativo"

<220>

<221> MOD RES

<222> (2)

<223> cualquier aminoácido excepto prolina

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 3 atggcgaagg cagatggcag t 21

<210> 4

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 4 ttagtccttc caacttcctt c 21

<210> 5

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<220>

<221> modified_base

<222> (9)

<223> a, t, c, g

<220>

<221> modified_base

<222> (12)

<223> a, t, c, g

<220>

<221> modified_base

<222> (18)

<223> a, t, c, g

<400> 5 taytggmgng tngarcynga yathaa 26

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<220>

<221> modified_base

<222> (6)

<223> a, t, c, g

<220>

<221> modified base

<222> (12)

<223> a, t, c, g

<400> 6 gcrtcncccc anckytcrta 20

<210> 7

<400> 7 000

<210> 8

<400> 8 000

<210> 9

<211> 458

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<221> MOD RES

<222> (304) .. (318)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD RES

<222> (416) .. (436)

<223> Aminoácido variable

<400> 9

<210> 10

<211> 458

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 10

<210> 11

<211> 443 5 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<221> MOD RES 10 <222> (333) .. (347)

<223> Aminoácido variable

<400> 11

<210> 12

<211> 373

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 269

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 13

<210> 14

<211> 258

<212> PRT

<213> Drosophila sp.

<400> 14

<210> 15

<211> 60

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 15

<210> 16

<211> 58

<212> PRT

<213> Drosophila sp.

<400> 16

<210> 17

<211> 267

<212>

PRT 15 <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 17

<210> 18

<211> 257

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

<400> 18

<210> 19

<211> 60

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 19

<210> 20

<211> 59

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

<400> 20

<210> 21

<211> 1377

<212>

ADN 15 <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 21

<210> 22

<211> 458

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 22

<210> 23

<211> 1395

<212> ADN

<213> Pichia pastoris

<400> 23

<212> PRT

<213> Pichia pastoris

<400>

24 10

<210> 25

<211> 418 5 <212> PRT

<213> Pichia pastoris

<220>

<221>

MOD RES 10 <222> (209) .. (223)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221>

MOD_RES 15 <222> (235) .. (246)

<223> Aminoácido variable

<400> 25

<210> 26

<211> 398

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 26

<210> 27

<211> 387 5 <212> PRT

<213> Pichia pastoris

<220>

<221>

MOD_RES 10 <222> (183) .. (197)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221>

MOD_RES 15 <222> (209)..(220)

<223> Aminoácido variable

<400> 27

<210> 28

<211> 373

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 28

<210> 29

<211> 390 5 <212> PRT

<213> Pichia pastoris

<220>

<221> MOD_RES 10 <222> (176) .. (190)

<223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (202)..(213)

<223> Aminoácido variable

<400> 29

<210> 30

<211> 355

<212> PRT

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 30

<210> 31

<211> 390

<212> PRT 5 <213> Pichia pastoris

<220>

<221> MOD RES

<222>

(175) .. (190) 10 <223> Aminoácido variable

<220>

<221> MOD RES

<222>

(202) .. (213) 15 <223> Aminoácido variable

<400> 31

<210> 32

<211> 363

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 32

<210> 33

<211> 428

<212> ADN

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 33

<210> 34

<211> 141

<212> PRT 15 <213> Kluyveromyces lactis

<400> 34

<210> 35

<211> 118

<212> PRT

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 35

<210> 36

<211> 117

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 36

<210> 37

<211> 103

<212> PRT

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 37

<210> 38

<211> 106

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 15

<400> 38

<210> 39

<211> 548

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 2124

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 4

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial <220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Motivo sintético"

<400> 41

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Motivo sintético"

<400> 42

<210> 43

<211> 740

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 43

<210> 44

<211> 3226

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 44

<210> 45

<211> 1617

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 45

<210> 46

<211> 535

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 46

<210> 47

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 47 actgccatct gccttcgcca t 21

<210> 48

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 48 gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 49 aattaaccct cactaaaggg 20

<210> 50

<211> 464

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 50

<210> 51

<211> 2046

<212> ADN

<213> Gallus gallus

<400> 51

<210> 52

<211> 36 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente 10 <223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 52 atgcccgtgg ggggcctgtt gccgctcttc agtagc 36

15 <210> 53

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 53 tcatttctct ttgccatcaa tttccttctt ctgttcacgg 40

<210> 54

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 54 ggcgcgccga ctcctccaag ctgctcagcg gggtcctgtt ccac 44

<210> 55

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 55 ccttaattaa tcatttctct ttgccatcaa tttccttctt ctgttcacgg 50

<210> 56

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 56 ggcgagctcg gcctacccgg ccaaggctga gatcatttgt ccagcttcag a 51

<210> 57

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 57 gcccacgtcg acggatccgt ttaaacatcg attggagaog ctgacaccgc tacta 55

<210> 58

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 58 cgggatccac tagtatttaa atcatatgtg cgagtgtaca actcttccca catgg 55

<210> 59

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 59 ggacgcgtcg acggcctacc cggccgtacg aggaatttct cggatgactc ttttc 55

<210> 60

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 60 cgggatccct cgagagatct tttttgtaga aatgtcttgg tgcct 45

<210> 61

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 61

<210> 62

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 62 ccttgctagc ttaattaacc gcggcacgtc cgacggcggc ccargggtcc ca 52

<210> 63

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 63

<210> 64

<211> 61

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 64

<210> 65

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 65 ctccaatact agtcgaagat tatctcctac ggtgcctgga ctc 43

<210> 66

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 66 tggaaggttt aaacaaagct agagtaaaat agatatagcg agattagaga atg 53

<210> 67

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 67 aagaattcgg ctggaaggcc ttgtaccttg atgtagttcc cgttttcatc 50

<210> 68

<211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético”

<400> 68 gcccaagccg gccttaaggg atctcctgat gactgactca ctgataataa aaatacgg 58

<210> 69

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<221> fuente

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<400> 69 gggcgcgtat ttaaatacta gtggatctat cgaatctaaa tgtaagttaa aatctctaa 59

<210> 70

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 70 ggccgcctgc agatttaaat gaattcggcg cgccttaat 39

<210> 71

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 71 taaggcgcgc cgaattcatt taaatctgca gggc 34

<210> 72

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 72 tggcaggcgc gcctcagtca gcgctctcg 29

<210> 73

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 73 aggttaatta agtgctaatt ccagctagg 29

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<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 74 ccagaagaat tcaattytgy cartgg 26

<210> 75

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

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<220>

<221> modified_base

<222> (17)

<223> a, t, c, g, otro o desconocido

<220>

<221> modified_base

<222> (20)

<223> a, t, c, g, otro o desconocido

<400> 75 cagtgaaaat acctggnccn gtcca 25

<210> 76

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 76 tgccatcttt taggtccagg cccgttc 27

<210> 77

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

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<221> fuente

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<400> 77 gatcccacga cacatcctat ttctttc 27

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

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<221> fuente

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<400> 78 ggtgttttgt tttctagatc tttgcaytay cartt 35

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<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 79 agaatttggt gggtaagaat tccarcacca ytcrtg 36

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 80 cctaagctgg tatgcgttct ctttgccata tc 32

<210> 81

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 81 gcggcataaa caataataga tgctataaag 30

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<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 82 ccacatcatc cgtgctacat atag 24

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<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 83 acgaggcaag ctaaacagat ctcgaagtat cgagggttat ccag 44

<210> 84

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 84 ccatccagtg tcgaaaacga gccaatggtt catgtctata aatc 44

<210> 85

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 85 agcctcagcg ccaacaagcg atgg 24

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<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 86 ctggataacc ctcgatactt cgagatctgt ttagcttgcc tcgt 44

<210> 87

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 87 gatttataga catgaaccat tggctcgttt tcgacactgg atgg 44

<210> 88

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 88 atcctttacc gatgctgtat 20

<210> 89

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 89 ataacagtat gtgttacacg cgtgtag 27

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<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente <223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 90 ttcctcactg cagtcttcta taact 25

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 91 tggagaccat gaggttccgc atctac 26

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<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 92 ttagcgcgcc tccctagtgt accagttgaa ctttg 35

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<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 93 gattaattaa ctcactgcag tcttctataa ct 32

<210> 94

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 94 tcctggcgcg ccttcccgag agaactgccc tccctc 36

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<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 95 aattaattaa ccctagccct ccgctgtatc caacttg 37

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<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 96 ggccgcctgc agatttaaat gaattcggcg cgccttaat 39

<210> 97

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 97 taaggcgcgc cgaattcatt taaatctgca gggc 34

<210> 98

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 98 tcctggcgcg ccttcccgag agaactggcc tccctc 36

<210> 99

<211> 33 <212 ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 99 ccgaggcgcg ccacagagga actgcaccgg gtg 33

<210> 100

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 100 accgaggcgc gccatcaacg ccatcaacat caaccac 37

<210> 101

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente <223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 101 aattaattaa ccctagccct ccgctgtatc caacttg 37

<210> 102

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 102 ctgattgctt atcaacgaga attccttg 28

<210> 103

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 103 tgttggtttc tcagatgatc agttggtg 28

<210> 104

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 104 tgggcgcgcc aaactgattg cttatcaacg agaa 34

<210> 105

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 105 agtgggcgcg ccttgaataa gttttcagat aatacc 36

<210> 106

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 106 aagggcgcgc ccaagtgcca agtatttatt atc 33

<210> 107

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 107 gtttaattaa gatcagttgg tggctttttt aatatg 36

<210> 108

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

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<400> 108 agcggccaga aaggcgacgt tgtggac 27

<210> 109

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota -"Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 109 taccctcaga agcccgcagc ttagtc 26

<210> 110

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 110 agcgggcgcg ccggcgacgt tgtggacgtt tac 33

<210> 111

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 111 ccgtggcgcg cctcacaccg gcacgtgctg cac 33

<210> 112

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente <223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 112 tgttaattaa gcttagtcgg cctttttcag gaag 34

<210> 113

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 113 aaatcaagtg gatgaaggac atgtggc 27

<210> 114

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 114 agcgatgcta taggcagtct ttgcagag 28

<210> 115

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 115 tatgggcgcg ccgatcataa ctcattggcg gaaatc 36

<210> 116

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<900> 116

<400> 116 gaagggcgcg ccttgcctcc tatggatggc tacccccac 39

<210> 117

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético"

<400> 117 tggggcgcgc cggcaagctc gagtcaaagg tggacaat 38

<210> 118

<211> 33

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético" 10

<400> 118 agttaattaa tgctataggc agtctttgca gag 33

<210> 119 15 <211> 792

<212> FRT

<213> Homo sapiens

<400> 119

<210> 120

<211> 2476

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 120

<210> 121

<211> 2268

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 121

<210> 122

<211> 535

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 122

<210> 123

<211> 2115

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 123

<210> 124

<211> 1968

<212> ADN 15 <213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1965)

<400> 124

<210> 125

<211> 655

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 125

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una célula huésped de hongo unicelular o pluricelular que es capaz de producir glicoproteínas que comprenden una estructura central de N-glicano triantenaria, en la que la célula huésped se modifica por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tienen un N-glicano GlcNAc2Man3GlcNAc2 y en el que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V) de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1-36 del péptido señal de dirección celular de MNN2 de S. cerevisiae, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

2. 2.

   La célula huésped de la reivindicación 1, en la que las estructuras triantenarias producidas en dicha célula huésped comprenden una N-acetilglucosamina añadida al núcleo de alfa 1,6 manosilo en un enlace beta 1,6.

3. 3.

   La célula huésped de hongo unicelular o pluricelular de la reivindicación 1 ó 2, en la que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa IV (GnT IV) exógena fusionado a un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped para producir una glicoproteína que tiene una estructura central de N-glicano tetraantenario.

4. 4.

   La célula huésped de hongo unicelular o pluricelular de la reivindicación 1 a 3, en la que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa IX (GnT IX) exógena fusionado a un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped para producir una glicoproteína que tiene una estructura central de N-glicano tetraantenario.

5. 5.

   La célula huésped de la reivindicación 3 ó 4, en la que dichas estructuras tetraantenarias producidas por dicha célula huésped comprenden estructuras de GlcNAc4Man3GlcNAc2 que son capaces de experimentar reacciones adicionales por la N-acetilglucosaminiltransferasa VI (GnT VI).

6. 6.

   La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha célula huésped comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que tiene actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III).

7. 7.

   La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha célula huésped es deficiente en una actividad OCH1 manosiltransferasa y/o actividad Dol-P-Man:MansGlcNAc2-PP-Dol manosiltransferasa.

8. 8.

   La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha célula huésped se modifica por ingeniería genética adicionalmente para expresar mayores niveles de actividad del transportador de UDP-GlcNAc para aumentar los niveles de UDP-GlcNAc en la célula.

9. 9.

   La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minutia, Ogataea minuta, Pichia lindneri, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

10. 10.

    La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

11. 11.

    La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la glicoproteína es una proteína terapéutica.

12. 12.

    La célula huésped de la reivindicación 11, en la que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo que consiste en dominios kringle de plasminógeno humano, eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de urea tripsina, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor-2 de crecimiento del endotelio vascular, factor-1 inhibidor de progenitor de mieloides, osteoprotegerina, antitripsina α-1, DNasa II, α-feto proteínas, AAT, rhTBP-I (proteína 1 de unión a TNF), TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio y elemento de interacción de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimuladora del folículo), GM-CSF, GLP-1 con o sin FC (proteína 1 similar a glucagón), antagonista del receptor de IL-1, sTNRr (fusión Fc del receptor de TNF soluble), ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4-Ig).

13. 13.

    Un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende expresar un ácido nucleico que codifica la glicoproteína en una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. 14.

    El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos que tienen estructuras triantenarias.

15. 15.

    El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos que tienen estructuras tetraantenarias.

16. 16.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha glicoproteína comprende además un resto de GlcNAc biseccionado.

17. 17.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha glicoproteína carece de fucosa.

18. 18.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que dicha glicoproteína se selecciona entre el grupo que consiste en dominios kringle de plasminógeno humano, eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de urea tripsina, proteína de unión IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor-2 de crecimiento del endotelio vascular, factor-1 inhibidor de progenitor de mieloide, osteoprotegerina, antitripsina α-1, DNasa II, α-feto proteínas, AAT, rhTBPI(proteína 1 de unión a TNF), TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio y elemento de interacción de ligando de ciclofilina), FSH (hormona estimuladora del folículo), GM-CSF, GLP-1 con o sin FC (proteína 1 similar al glucagón), agonista del receptor de IL-1, sTNRr (fusión Fc del receptor de TNF soluble), ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4-Ig).

19. 19.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que comprende además la etapa de aislar la glicoproteína a partir del huésped.

20. 20.

    Una composición farmacéutica que comprende una composición de glicoproteína producida por una cualquiera de las células huésped de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dichas glicoproteínas dentro de dicha composición carecen de fucosa y en la que más de un 50 % en moles de las estructuras centrales de N-glicano de las glicoproteínas en dicha composición tienen estructuras triantenarias.

21. 21.

    La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que dichas estructuras triantenarias comprenden al menos tres GlcNAc en un oligosacárido de Man3GlcNAc2.

22. 22.

    La composición farmacéutica de la reivindicación 20 ó 21, en la que algunas o todas las estructuras triantenarias comprenden una N-acetilglucosamina añadida al núcleo alfa 1,6 manosilo en un enlace beta 1,6 en la ramificación del oligosacárido.

23. 23.

    La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que más de un 50 % en moles

    o más de un 75 % en moles de las estructuras centrales de N-glicano están modificadas adicionalmente por GnT IV.

24. 24.

    La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en la que algunas o todas las estructuras modificadas por GnT IV comprenden la ramificación de oligosacárido GlcNAc β1,6 GlcNAc β 1,2 -Manal,6 (GlcNAc β1,4 GlcNAc β1,2 Manal,3) Man β1,4 -GlcNAc β 1,4 -GlcNAcβ1,4 -Asn.

25. 25.

    Un vector capaz de expresar en una célula huésped de hongo unicelular o pluricelular una enzima que tiene actividad N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V) que es sustancialmente intracelular, en el que dicha enzima comprende el dominio catalítico de GnT V de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1-36 del péptido señal de dirección celular MNN2 de S. cerevisiae, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de dicha célula huésped.

    IINICIANDO ACTIVIDAD

    Marco de lectura abierto de alfa-1,2-manosidasa IA de M. musculus. Los dominios transmembrana y catalítico están destacados en negrita respectivamente. La secuencia de los cebadores usados para generar los truncamientos N-terminales están subrayados y el principio de cada fragmento de proteína respectivo se indica con una flecha

    ILeyendas:

    Figura 41

    Manosil (alfa-1,3-)-glicoprotein beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima A (MGAT4A) Número de acceso NM_012214.

    Manosil (alfa-1,3-)-glicoprotein beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima A (MGAT4A), ARNm

    Figura 41 (Cont.)

    Figura 42

    Manosil (alfa-1,3-)-glicoprotein beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima B (MGAT4B) Número de acceso NM_014275.

    Manosil (alfa-1,3-)glicoprotein beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima B (MGAT4B), ARNm

    Figura 44 (Cont.)

    Figura 43

    N-acetilglucosaminiltransferasa V de Mus musculus (Mgat5) Número de acceso AF474154.

    N-acetilglucosaminiltransferasa V de Mus musculus (Mgat5), ARNm

    Figura 43 (Cont.)

    Figura 44

    N-acetilglucosaminiltransferasa VI de Gallus gallus, GnT-VI; número de acceso AB040608

    ARNm de GnT-VI de Gallus gallus para N-acetilglucosaminiltransferasa VI, cds completo

    Figura 44 (Cont.)

    Figura 45

    GnT-XI, N-acetilglucosaminiltransferasa IX de Homo sapiens (GnT IX)

    ARNm de GnT-IX de Homo sapiens para N-acetilglucosaminiltransferasa IX, cds completo; número de acceso AB109185.1

    Figura 46 Figura 46 (Cont.)