JP2006518600A - 複数のアンテナ構造を有する改変型糖タンパク質の生成 - Google Patents

複数のアンテナ構造を有する改変型糖タンパク質の生成 Download PDF

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Abstract

本発明は、改変型オリゴ糖を有する真核生物宿主細胞に関し、この細胞は、一組のグリコシルトランスフェラーゼ、糖および糖ヌクレオチドトランスポーターの異種発現によって、哺乳動物の例えばヒト治療糖タンパク質の生成のための宿主株になるようにさらに改変され得る。このプロセスは、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現して標的とするために使用され得る、操作された宿主細胞を提供する。改変型脂質結合型オリゴ糖を有する宿主細胞が、生成または選択される。その操作された宿主細胞において生成されるＮ−グリカンは、ＧｎＴＩＩＩ活性、ＧｎＴＩＶ活性、ＧｎＴＶ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性、またはＧｎＴＩＸ活性を示す。このＮ−グリカンは、二分されかつ／または複数のアンテナを有するＮ−グリカン構造を生じ、１つ以上の酵素、糖、糖ヌクレオチドトランスポーターの異種発現によって、ヒト様糖タンパク質を生じるようにさらに改変され得る。

Description

（関連出願の引用）
本出願は、２００３年１０月７日に出願された米国特許出願番号１０／６８０，９６３の一部継続出願であり、この米国特許出願番号１０／６８０，９６３は、２００３年２月２０日出願された米国特許出願番号１０／３７１，８７７の一部継続出願であり、この米国特許出願番号１０／３７１，８７７は、２００１年６月２７日に出願された米国特許出願番号０９／８９２，５９１の一部継続出願であり、この米国特許出願番号０９／８９２，５９１は、２０００年６月２８日に出願された米国仮出願番号６０／２１４，３５８、２０００年６月３０日出願された米国仮出願番号６０／２１５，６３８、および２００１年３月３０日に出願された米国仮出願番号６０／２７９，９９７の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を主張する。これらの出願の各々は、その全体が、参考として本明細書中に援用される。
（発明の分野）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞（例えば、真菌細胞または他の真核生物細胞）が、動物細胞（特に、ヒト細胞）によって生成される糖タンパク質のグリコシル化パターンと類似するグリコシル化パターンを有するグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を生成するように遺伝子改変され得る、方法および組成物に関する。これらは、ヒトまたは動物の治療剤として有用である。
（発明の背景）
（ヒトおよび下等真核生物におけるグリコシル化経路）
ＤＮＡが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは、グリコシル化として知られるプロセスである、糖残基の結合を含む。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、グリコシル化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して、異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、そしてグリコシル化する場合でも、非常に非特異的方法でのみグリコシル化する（ＭｏｅｎｓおよびＶａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，１９９７ Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６８（３）：１６９−１７５）。糸状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マンノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高マンノース」型のグリカンまたはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、なお別の方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのような高等真核生物においては、発生期のオリゴ糖側鎖がトリミングされて、いくつかのマンノース残基が除去され得、下等真核生物のＮ−グリカンでは典型的には見られないさらなる糖残基で延長され得る。例えば、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒら，（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ ３０：１９３−２００；Ｍａｒｔｉｎｅｔら，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０：１１７１−１１７７；Ｗｅｉｋｅｒｔら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１１１６−１１２１；Ｍ．Ｍａｌｉａｓｓａｒｄら，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２６７：１６９−１７３；Ｊａｒｖｉｓら，（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５２８−５３３；ならびにＴａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：Ｓ２９−Ｓ３５参照。
哺乳動物型のオリゴ糖構造の合成は、一連の系列的反応で開始し、この系列の経過において、当該タンパク質が宿主生物における分泌経路に沿って転移する間に、糖残基が付加および除去される。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分泌されるタンパク質の得られるグリコシル化パターンを決定する。従って、下等真核生物宿主細胞で発現されるタンパク質の得られるグリコシル化パターンは、ヒトおよび他の哺乳動物のような高等真核生物で発現されるタンパク質のグリコシル化パターンとはかなり異なる（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９）。典型的な真菌Ｎ−グリカンの構造を図１Ａに示す。
ヒトグリコシル化の初期の工程は、少なくとも２つの異なる段階に分けることができる：（ｉ）脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜での系列的な一連の反応によって組み立てられ（図１３）、そして（ｉｉ）該脂質からのこのオリゴ糖の転移は、ドリチルピロホスフェートを、デノボ合成されたタンパク質に係留させる。特異的転移の部位は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（配列番号１および配列番号２）（Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって規定される（Ｇａｖｅｌおよびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．３：４３３−４２）。グリコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらなるプロセシングは、発生期の糖タンパク質が初期ゴルジ装置に転移する前にＥＲで起こり、そこで、さらなるマンノース残基はゴルジ特異的アルファ（α）−１，２−マンノシダーゼによって除去される。タンパク質がゴルジを通って進むにつれ、プロセシングは継続する。ゴルジ中間嚢において、Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶ）、マンノシダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含めた多数の修飾酵素が、特定の糖残基を付加および除去する。最後に、トランス−ゴルジ（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ）において、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）は糖タンパク質構造を生じ、これがゴルジから遊離される。糖タンパク質にそのヒト特徴を与えるものは、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび高度の末端シアル酸を含有する、ビ−アンテナ構造、トリ−アンテナ構造およびテトラ−アンテナ構造によって特徴付けられるこの構造である。典型的なヒトＮ−グリカンの構造を図１Ｂに示す。哺乳動物型Ｎ−グリカンプロセシングに関与する工程については、図１４および図１５もまた参照のこと。
現在までに研究された全ての真核生物において、糖タンパク質は、共通する脂質結合オリゴ糖前駆体Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ドリコール−ピロホスフェートに由来する。小胞体内では、ドリコールピロホスフェート結合オリゴ糖の合成およびプロセシングは全ての公知の真核生物の間で同一である。しかしながら、真菌細胞（例えば、酵母）によるコアオリゴ糖のさらなるプロセシングは、それが分泌経路に沿って転移するにつれ、ヒトとはかなり異なる。
酵母においては、これらの工程は、順次にマンノース糖をコアオリゴ糖に加えるＯｃｈ１ｐ、Ｍｎｔ１ｐおよびＭｎｎ１ｐのような、ゴルジに存在するマンノシルトランスフェラーゼによって触媒される。得られる構造は、ヒト様タンパク質の生産には望ましくなく、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除するのが望ましい。マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は、致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖おいて低下したマンノース含有量を呈することが示されている。他のオリゴ糖プロセシング酵素（例えば、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ）はまた、宿主の特定のグリコシル化パターンに依存して、排除されなければならないかもしれない。
（糖ヌクレオチド前駆体）
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および糸状真菌で生産される糖タンパク質では見出されない。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコースなど）が細胞質ゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される（ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；ＰｅｒｅｚおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３８：７０９−７１５）。
グリコシル転移反応は、典型的には、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸である副産物を生じる。一リン酸は、交互輸送機構によってヌクレオチド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸送され得るが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送されるに先立って、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、ヌクレオシド一リン酸および無機ホスフェートを生じなければならない。この反応は効率的なグリコシル化に重要であり；例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必要であることが判明している。しかしながら、そのＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに向けて９０％低下した活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、典型的にはゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を欠く。なぜなら、それはゴルジベースの糖タンパク質合成のためにＵＤＰ糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加えることが判明している酵母）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、そのような酵素についての潜在的要件を示す（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが公知であり、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの管腔においてグリコシルトランスフェラーゼの阻害を妨げるのに重要であり得る（Ｋｈａｔａｒａら（１９７４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：５３７−５６０）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４）：１４５６４−１４５６７；Ｂｅａｕｄｅｔら（１９９８）Ａｂｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ２９２：３９７−４１３参照。
（区画化された酵素活性によるＮ−グリカンの順次のプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）はＥＲおよびゴルジ装置の内部（ルミナル）表面をライニングし、それにより、それがＥＲおよびゴルジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とする「触媒」表面を提供する。シスゴルジ、ゴルジ中間嚢およびトランスゴルジの多数区画ならびにトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）は、グリコシル化反応の順序だった系列が起こり得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはＴＧＮにおいてＥＲにおける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特定の炭水化物構造が合成され得るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラーゼに順次に暴露される。これらの酵素をその各細胞小器官に保持し、係留する正確な機構を明らかにするために、多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、証拠は、ステム領域、膜貫通領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して、酵素を個々の細胞小器官の膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその遺伝子座に局在化することを示唆する（例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ（１９９８）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９，５１７−５３２参照）。
いくつかの場合において、これらの特異的相互作用は、種をまたいで機能することが見出された。例えば、ラット由来のα２，６−ＳＴ（該動物のトランス−ゴルジに局在化することが知られている酵素）の膜貫通ドメインは、酵母ゴルジにおいてやはりレポーター遺伝子（インベルターゼ）を局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。しかしながら、全長α２，６−ＳＴの一部と非常に同一の膜貫通ドメインはＥＲに保持され、酵母のゴルジにさらには輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｒｎら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０（３）：８０９−１７）。ヒト由来の全長ＧａｌＴは、明らかに高い転写レベルにも拘らず、酵母では合成さえされなかった。対照的に、インベルターゼレポーターに融合された同じヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低いレベルにも拘らず、酵母ゴルジへの局在化を方向付け得た。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者は、酵母マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＴ１）の２８アミノ酸、細胞質テイルを含む領域、膜貫通領域およびステム領域の８つのアミノ酸を、ヒトＧａｌＴの触媒領域へ融合させることが、活性なＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることを示した。他のガラクトシルトランスフェラーゼは特定の細胞小器官に存在する酵素との相互作用に依拠するようである。なぜならば、その膜貫通領域の除去の後には、それは依然として適切に局在化できるからである。
グリコシル化酵素の不適切な局在化は、その経路における酵素の適切な機能を妨げ得る。例えば、多数のα−１，２−マンノシダーゼを有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＥａｄｅｓおよびＨｉｎｔｚ（２０００）Ｇｅｎｅ ２５５（１）：２５−３４）は、ＧｎＴＩ活性の高い総じてのレベルにも拘らず、ウサギＧｎＴＩ遺伝子で形質転換される場合に、ＧｌｃＮＡｃをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加しない（Ｋａｌｓｎｅｒら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。ＧｎＴＩは、活発に発現されるものの、該酵素がその基質の双方：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび生産的Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基質（全てのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が生産的というのではない；後記参照）と接触しないように不正確に局在化され得る。あるいは、宿主生物は、ゴルジにおいて適切なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供しないかもしれず、またはこの酵素は、適切に局在化され得るが、それにも拘らず、その新しい環境で不活性であるかもしれない。さらに、宿主細胞に存在するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、哺乳動物で見出されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とは構造が異なり得る。Ｍａｒａｓおよび共同研究者は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから得られたセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）からのＮ−グリカンの約３分の１が、インビトロにて、Ａ．Ｓａｉｔｏｉ １，２−マンノシダーゼよってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされ得ることを見出した。しかしながら、それらのＮ−グリカンの１％未満がＧｎＴＩに対する生産的基質として働くことができた。Ｍａｒａｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７。従って、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の単なる存在は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるインビボプロセシングが達成され得ることを保証しない。必要なのは、生産的なＧｎＴＩ反応性Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の形成である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は細胞で生産され得るが（約２７モル％）、小さな割合のみが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る（約５％未満、Ｃｈｉｂａら ＷＯ ０１／１４５２２参照）。
現在まで、下等真核生物における特定の異種的に発現されたグリコシルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼが（１）十分に翻訳されるか、（２）触媒的に活性であるか、または（３）分泌経路内で適切な細胞小器官に局在化されるかを予測する信頼できる方法はない。これらの全ての３つは、下等真核生物においてグリコシル化パターンに影響する必要があるので、現在利用できない、予測ツールの非存在下で酵素の所望の触媒機能および適切な保持を達成するための系統的なスキームが望まれる。
（治療糖タンパク質の生産）
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療タンパク質の推定７０％がグリコシル化され、従って、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化し得る生産系（すなわち、宿主細胞）に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が（１）免疫原性、（２）薬物動態学特性、（３）トラフィッキングおよび（４）治療タンパク質の効力を決定することにおいて重要な役割を演じることを示している。従って、製薬産業によるかなりの努力が、可能な限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得るためのプロセスを開発することに向けられてきたことは、驚くべきことではない。現在まで、ほとんどの糖タンパク質は哺乳動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパク質のシアル化（すなわち、シアル酸の末端添加）の程度を増強させるための、そのような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含み得、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性を改良することが公知である。あるいは、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそのそれぞれのヌクレオチド糖（例えば、２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸）を用いるそのような糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改良し得る。
ほとんどの高等真核生物は、ヒトで見出されるものと類似のグリコシル化反応を行うが、前記宿主系で発現される組換えヒトタンパク質は、不変的に、その「天然」ヒト対応物とは異なる（Ｒａｊｕら（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １０（５）：４７７−４８６）。従って、広範な開発研究が、これらの発現系で作られるタンパク質の「ヒト特性」を改良する方法を見出すことに向けられてきた。これは、醗酵条件の最適化、およびヒト様グリコ形態の形成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タンパク質発現宿主の遺伝的修飾を含む。Ｇｏｏｃｈｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９（１２）：１３４７−５５；ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＧｏｏｃｈｅｅ（１９９４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（５）：５４６−４９；Ｗｅｒｎｅｒら（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．４８（８）：８７０−８０；Ｗｅｉｋｅｒｔら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１１）：１１１６−２１；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８；３７０−８０。全ての哺乳動物発現系に関する固有の問題は解決されていない。
（真核生物微生物を用いる糖タンパク質の生産）
小胞体においてタンパク質に転移されるコアオリゴ糖構造は、基本的には、哺乳動物と下等真核生物とで同一であるが、かなりの差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こるその後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、かなり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系よりも優れたその他の注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための宿主としての下等真核生物の使用を妨げてきた。
内因性宿主グリコシル化経路を利用して、酵母のような微生物宿主で生産される治療糖タンパク質は、哺乳動物細胞で生産されたものと構造的に異なり、典型的には、大いに低下した治療効力を示す。そのような糖タンパク質は、典型的には、ヒトにおいては免疫原性であり、投与の後にはインビボで低下した半減期（従って、低下した生物活性）を示す（Ｔａｋｅｕｃｈｉ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，Ｓ２９−Ｓ３５）。ヒトおよび動物における特異的受容体（すなわち、マクロファージマンノース受容体）は、末端マンノース残基を認識し得、そして血流からの外来性糖タンパク質の迅速なクリアランスを促進し得る。さらなる悪影響はタンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルギー性の変化を含み得る。
酵母および糸状真菌は、共に、細胞内組換えタンパク質と分泌組換えタンパク質との両方の生産のために、首尾よく用いられてきた（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ（２０００）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１）：４５−６６；Ｈａｒｋｋｉら（１９８９）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６）：５９６；Ｂｅｒｋａら（１９９２）Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐｅｒｓ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３：１２１−ＢＩＯＴ；Ｓｖｅｔｉｎａら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：２４５−２５１）。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのような種々の酵母は、真核生物発現系として特に重要な役割を演じてきた。何故ならば、それらは、高い細胞密度まで増殖し得、そして大量の組換えタンパク質を分泌し得るからである。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａなどのような糸状真菌は、産業スケールで糖タンパク質を効率的に生産するのに用いられてきた。しかしながら、前記したように、これらの真核生物微生物のいずれかにおいて発現される糖タンパク質は、動物におけるものとはＮ−グリカン構造が実質的に異なる。このことは、多くの治療糖タンパク質のための生産のための宿主としての、酵母または糸状真菌の使用を妨げてきた。
酵母および真菌におけるグルコシリ化は、ヒトにおけるものと非常に異なるが、いくつかの共通する要素が共有されている。第一の工程、コアオリゴ糖構造の新成タンパク質への転移は、酵母、真菌、植物およびヒトを含めた全ての真核生物で高度に保存されている（図１Ａと図１Ｂとを比較のこと）。しかしながら、コアオリゴ糖のその後のプロセシングは、酵母においてかなり異なり、数個のマンノース糖の付加を含む。この工程は、ゴルジに存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１など）によって触媒され、これらは、マンノース糖をコアオリゴ糖に順次に付加する。得られた構造は、ヒューマノイドタンパク質の生産には望ましくなく、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下または排除することが望ましい。マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１またはｍｎｎ９変異体）は致死的ではなく、酵母糖タンパク質のオリゴ糖において低下したマンノース含有量を呈することが示されている。また、マンノシルリン酸トランスフェラーゼのような他のオリゴ糖プロセシング酵素もまた、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに依存して、排除されなければならないかもしれない。望ましくない内因性グリコシル化反応を低下させた後、複合Ｎ−グリカンの形成が宿主系で操作されなければならない。これは、いくつかの酵素および糖ヌクレオチドトランスポーターの安定な発現を必要とする。さらに、成熟化するグリコシル化構造の順次のプロセシングが確実になるように、これらの酵素を局在化する必要がある。
哺乳動物治療剤として用いるためにより適した糖タンパク質を提供するために真核生物微生物のグリコシル化経路を改変しようとする、いくつかの努力がなされてきた。例えば、数個のグリコシルトランスフェラーゼが別々にクローン化され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌で発現されている（Ｙｏｓｈｉｄａら（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（１）：５３−８，Ｋａｌｓｎｅｒら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。しかしながら、ヒト細胞で作製されたものに似ているＮ−グリカンは得られなかった。
酵母は、多様なマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１のような１，３−マンノシルトランスフェラーゼ；ＧｒａｈａｍおよびＥｍｒ（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２０７−２１８）、１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそのレギュレーター（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、ならびに内因性グリコシル化反応に関与するさらなる酵素を生産する。これらの遺伝子の多くは個々に欠失され、改変されたグリコシル化プロフィールを有する生きた生物を生じる。その例を表１に示す。
（表１．改変されたマンノシル化を有する酵母株の例）
Figure 2006518600
 日本国特許出願公開第８−３３６３８７号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１ホモログの欠失を開示している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＯＣＨ１は、マンノースをグリカン構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に付加してＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせる１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。次いで、３つの１，６マンノース残基を含むＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造は、インビボにてさらなる１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、１，６−マンノシルトランスフェラーゼおよび１，３−マンノシルトランスフェラーゼに対する基質となり、これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特徴的であって、典型的には、Ｎ−グリカン当たり３０〜４０のマンノース残基を有し得る高マンノシル化糖タンパク質に導く。Ｏｃｈ１ｐは、１，６マンノースのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コアへの転移を開始するので、それは、しばしば、それをゴルジにおいて後に作用する他の１，６マンノシルトランスフェラーゼから区別するために、「開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ」と呼ばれる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１ ｍｎｎ１ ｍｎｎ４変異体株において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２でグリコシル化されたタンパク質が蓄積し、超マンノシル化は起こらない。しかしながら、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２は、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのような哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼに対する基質ではなく、従って、それ自身での、その変異体株の使用は、哺乳動物様タンパク質（すなわち、複合グリコシル化パターンまたはハイブリッドグリコシル化パターンを有する）を生産するのに有用ではない。
Ａ．ｓａｉｔｏｉに由来する真菌マンノシダーゼを小胞体（ＥＲ）内へ操作することによって、（インビボにて５０％より高い高効率トリミングは未だ証明されていないが）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２異性体にトリミングすることができる。このアプローチの欠点は二倍にある：（１）形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が実際に（分泌され、細胞外部でマンノシダーゼによってさらに修飾されたというよりはむしろ）インビボで形成されたか否かは明確ではなく；そして（２）いずれかの形成されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は、もし実際にインビボで形成されたならばＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるその後のＮ−グリカン修飾に対する生産的な基質である正しいアイソフォームであるかは明らかでない（Ｍａｒａｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７）。
真菌宿主に由来するよりヒト様の糖タンパク質を提供する目的で、米国特許５，８３４，２５１号は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉに由来するハイブリッド糖タンパク質を生産する方法を開示する。ハイブリッドＮ−グリカンは、コアマンノース構造のＭａｎα１−６アーム上にマンノース残基のみ、およびＭａｎα１−３アーム上に１または２の複雑なアンテナを有する。この構造は有用性を有するが、該方法は、多数の酵素工程がインビトロで行われなければならず、これは、コスト高で時間を消費するという不利を有する。単離された酵素は、調製するのにコスト高であり、コスト高の基質（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を必要とする。また、該方法は所望のタンパク質上での複雑なグリカンの生成を可能としない。
（Ｎ−グリカントリミングに関与する細胞内マンノシダーゼ活性）
α−１，２−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物における複合Ｎ−グリカン形成のための主な中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングのために必要である。以前の研究は、短縮型のマウスα−１，２−マンノシダーゼ、真α−１，２−マンノシダーゼ菌およびヒトα−１，２−マンノシダーゼが、メチロトロピック酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミング活性を呈することができることを示した（Ｌａｌら（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８（１０）：９８１−９５；Ｔｒｅｍｂｌａｙら（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８（６）：５８５−９５，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０３（２−３）：１７３−８）。しかしながら、今日まで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから分泌された糖タンパク質でのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在しない。
さらに、細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼの単なる存在は、単独では、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への適切な細胞内トリミングを保証しない（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＤＥＬタグ化マンノシダーゼが主としてＥＲに局在化され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が事実上検出され得ないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）レポータータンパク質と共に共発現される、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２参照。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲ、初期ゴルジおよび細胞質ゾルに局在化されたキメラα−１，２−マンノシダーゼ／Ｏｃｈ１ｐ膜貫通ドメイン融合物がマンノシダーゼトリミング活性を有しない、Ｃｈｉｂａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６２９８−２６３０４も参照されたし）。従って、ＥＲまたはゴルジにおけるマンノシダーゼの単なる局在化は、その標的化された細胞小器官において各酵素の活性を保証するには不十分である（また、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のα−１，２−マンノシダーゼが、細胞内に局在化しつつ、マンノシル化の程度を減少させるよりはむしろ増加させたことを示す、Ｍａｒｔｉｎｅｔら（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）：１１７１−１１７７も参照されたし）。現在まで、膜貫通局在化配列を用いる、酵母または真菌いずれかにおける活性な異種α−１，２−マンノシダーゼの細胞内の局在化を示す報告はない。
一次Ｎ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産生し得る株を操作することは有用であるが、ヒトグリカンにより近く似せるようにこれらの高マンノース前駆体構造をさらに修飾しようとするいずれの試みも、さらなるインビボ工程またはインビトロ工程を必要とする。インビトロにて真菌および酵母由来のグリカンをさらにヒト化する方法は、米国特許第５，８３４，２５１号（前出）に記載されている。もし、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をさらにインビボでヒト化すべきならば、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が、事実、細胞内で生じ、培地中でのマンノシダーゼ活性の生成物ではないことを保証しなければならない。酵母または真菌における複合Ｎ−グリカン形成は、高レベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、細胞内で生成されること必要とする。なぜならば、細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンのみが、インビボで、ハイブリッドＮ−グリカンおよび複合Ｎ−グリカンにプロセシングされ得るからである。さらに、生じたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の大部分が、実際に、ＧｎＴＩに対する基質であり、ハイブリッドＮ−グリカンおよび複合Ｎ−グリカンの形成を可能とすることを示さなければならない。
従って、非ヒト真核生物宿主細胞、および特に、酵母および糸状真菌において、ヒト様糖タンパク質構造へさらにプロセシングされ得る、高い細胞内Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含有量によって特徴付けられる糖タンパク質を生産するための方法に対する必要性が存在する。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（「ＧｎＴ」）は、分泌経路においてＮ結合型オリゴ糖を修飾するグリコシル化酵素の別のクラスに属する。このようなグリコシルトランスフェラーゼは、特定の糖ヌクレオチドドナーに由来する単糖を、２つのあり得るアノマー結合のうちの１つ（αまたはβのいずれか）において、伸長しているグリカン鎖における単糖の特定のヒドロキシル位置へと転移することを触媒する。Ｄｅｎｎｉｓら（１９９９）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２１（５）：４１２−２１。特定のＧｎＴは、Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧＩｃＮＡｃ」）を、Ｎ−グリカン基質（例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（「マンノース−５コア」）およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「内部コア構造」））のＭａｎα１，６アームまたはＭａｎα１，３アームに付加する。その反応生成物（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）は、次いで、バイアンテナ（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖構造、トリアンテナ（ｔｒｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖構造、およびテトラアンテナ（ｔｅｔｒａ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ結合型オリゴ糖構造へと修飾され得る。
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）は、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノースコア（Ｍａｎα１，６（Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ）の真ん中のマンノースへのＧＩｃＮＡｃの付加を触媒する酵素である。ＧｎＴＩＩＩによるアクセプター基質（例えば、トリマンノースコア）への二分している（ｂｅｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃの付加は、いわゆる、二分型（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）Ｎ−グリカンを生じる。例えば、ＧｎＴＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造への二分しているＧｌｃＮＡｃの付加は、二分型Ｎ−グリカン（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を生じ得る。同様に、Ｇｎ ＴＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃ２ＭＡｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造への二分しているＧｌｃＮＡｃの付加は、別の二分型Ｎ−グリカン（ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を生じる。この後者の構造は、より大きな抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関係付けられている。Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６〜８０。他の二分型Ｎ−グリカンが、Ｇｎ ＴＩＩの作用による形成され得る。例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２が、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２へと変換され得、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、二分型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと変換され得、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと変換され得る。例えば、Ｎａｒａｓｈｉｍｈａｎ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０２３５〜４２参照のこと。これまでは、ＧｎＴ ＩＩＩ活性は、哺乳動物細胞においてのみしか示されていない。
哺乳動物細胞により発現される免疫グロブリンの糖形態を再操作することは、冗長なわずらわしい作業である。特にＧｎＴ ＩＩＩの場合、この酵素の過剰発現は、増殖阻害に関係付けられており、調節性（誘導性）遺伝子発現に関与する方法は、二分型Ｎ−グリカンを伴う免疫グロブリンを生成するために使用されなければならなかった。Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．６５（５）：５４２〜９；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６〜８０；Ｕｍａｎａら、ＷＯ ０３／０１１８７８；米国特許第６，６０２，６８４号。そのような増殖阻害硬化は、標的タンパク質とＧｎＴ ＩＩＩとを同時発現させる能力を複雑にし、ＧｎＴ ＩＩＩ過剰発現に対して上限を課し得る。米国特許第６，６０２，６８４号。ＧｎＴ ＩＩＩの発現レベルを注意深く最適化することが、必要であり得る（同書）。しかし、上記のように、そのよな生成系において使用される下等真核生物宿主細胞の開発には、その宿主細胞の内因性グリコシル化経路がさらに改変されることが必要である。
哺乳動物細胞において発現される酵素ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＶおよびＧｎＴ ＩＸは、特定の立体構造のＧｌｃＮＡｃ残基が、オリゴ糖基質上へと転移して、複数のアンテナを有するグリカン構造を生成するのを触媒することが公知である。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミニン：α１，３−Ｄ−マンノシドβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ ＩＶ；ＥＣ２．４．１．１４５）は、β１，４結合中の残基のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮａｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ上のα１，３−Ｄ−マンノシドへの転移を触媒する（ＧｌｅｅｓｏｎおよびＳｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８３ Ｍａｙ ２５；２５８（１０）：６１６２〜７３；Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７９，３５１〜３９７）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：α−６−Ｄ−マンノシドβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＶ；ＥＣ４．１．１５５）は、β１，６結合中のα１，６マンノシルへとＮ−アセチルグルコサミンを付加してトリアンテナＮ−グリカンおよびテトラアンテナＮ−グリカンを形成するのを触媒する。
同様に、鳥類細胞におけるＧｎＴ ＶＩの発現は、オリゴ糖基質上へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒する。具体的には、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）：ＧｌｃＮａｃβ１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２）Ｍａｎα１−Ｒ[ＧｌｃＮａｃ→Ｍａｎ]β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ（ＧｎＴ ＶＩ）は、ペンタアンテナＮ−グリカンの形成を触媒する（Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ｎｏｖ １７；２７５（４６）：３６０２９〜３４）。ＧｎＴ ＶＩをコードする遺伝子は、最近、精製されて単離されている。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＪＰ２００２２０９５８７Ａ２。
複雑な複数のアンテナを有する構造を生成するために必要な基質は、最近まで、真菌宿主において合成されていない（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３ Ａｕｇ ２９；３０１（５６３７）：１２４４〜６）。哺乳動物細胞は、代表的には、一群の複合グリカン（例えば、バイアンテナ糖形態、トリアンテナ糖形態、テトラアンテナ糖形態、およびペンタアンテナ糖形態さえ）を、特異的なＧｎＴの連続反応を介して生成する。そのような細胞のゴルジ装置において、糖タンパク質のＮ−グリカンプロセシングは、トリアンテナ構造およびテトラアンテナ構造の形成に加えて、バイアンテナ構造を優勢に生成する。複合グリカンの形成において、特異的ＧｎＴが、特定のβ−ＧｌｃＮＡｃ結合（β１，２；β１，４；β１，６）を触媒して、哺乳動物細胞において複数のアンテナを有するグリカンを生成することが現在理解されている。これらの細胞は、しかし、高収率ではどのような均一な糖形態も生成不能である。
最近、下等真核生物が、有意なレベルで均一な形態の複合グリカンを生成するように操作された（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３ Ａｕｇ ２９；３０１（５６３７）：１２４４〜６）。下等真核生物において複数のアンテナを有する複合グリカンを生成する能力は、大量の適切にフォールディングされグリコシル化されたタンパク質を、産業規模で低コストにて、より迅速な時間、より安全かつ高品質で提供する。従って、必要とされるものは、固有の高生成力価の能力（例えば、下等真核生物宿主細胞（例えば、酵母および糸状真菌）において生成される能力）を利用するタンパク質生成系であって、複数のアンテナを有する（そして必要に応じて二分型である）Ｎ結合型グリカンを、これらの細胞において発現されるタンパク質（特に、治療タンパク質）上に生成する、タンパク質生成系である。
（発明の要旨）
哺乳動物（特に、ヒト）における糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反応を行うことが可能な遺伝子改変されたグリコシル化経路を有する宿主細胞および細胞株を、開発した。これらの操作された宿主において発現される組換えタンパク質は、それらの哺乳動物に、実質的に同一ではないかもしれないが、より類似している糖タンパク質（例えば、ヒト対応物）を与える。本発明の宿主細胞（例えば、培養下で増殖される下等真核微生物および他の非ヒト真核生物宿主細胞）は、Ｎ−グリカン（例えば、二分型Ｎ−グリカン、またはヒトグリコシル化経路に沿って生成される他の構造）を生成するように改変される。この結果は、例えば、真菌糖タンパク質に特徴的な望ましくない構造を作り出す酵素を発現せず、かつ、例えば、「ヒト様」糖タンパク質を生成し得る異種酵素を発現する、株の操作および／または選択の組み合わせを使用して達成される。
本発明は、従って、（１）下等真核生物宿主（例えば、単細胞真菌もしくは糸状真菌）、または（２）ヒトとは異なるグリコシル化パターンを有する任意の非ヒト真核生物を使用して、哺乳動物において見出される糖質構造によりよく似ているように、宿主生物（「宿主細胞」）において生成されるタンパク質（例えば、ヒトタンパク質）のグリコシル化組成および構造を改変する、糖タンパク質生成方法を提供する。そのプロセスにより、学術文献において十分に確立され、かつタンパク質発現の分野の当業者に周知の方法を用いて、任意の所望の遺伝子（例えば、グリコシル化に関与する遺伝子）を発現し標的とするために使用され得る、操作された宿主細胞を得ることが可能となる。改変されたオリゴ糖を有する宿主細胞が、作り出されるかまたは選択される。治療タンパク質の生成のためには、この方法は、任意の望ましいグリコシル化構造が獲得され得る細胞株を操作するように、適合され得る。
従って、一実施形態において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を下等真核生物宿主細胞に導入することによって、その細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、その細胞において発現され、なおより好ましい実施形態において、この発現は、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２二分型構造、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２二分型構造、またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２二分型構造を含む、Ｎ−グリカンの生成を生じる。別の好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性は、実質的に細胞内にある。本発明の別の好ましい実施形態において、その二分型構造を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞から単離される。なおより好ましい実施形態において、その宿主細胞において生成される糖タンパク質は、治療タンパク質である。
別の局面において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性の両方を含む、下等真核生物宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む宿主細胞は、この活性と反応し得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含むＮ−グリカンを生成する。より好ましい実施形態において、この活性は、二分型グリカンを生成する。従って、本発明のいくつかの実施形態の下等真核生物宿主細胞は、二分型グリカンを有するＮ−グリカンを含み得る。好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンは、１０モル％を超える上記二分型グリカンを含む。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２二分型構造、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２二分型構造またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２二分型構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。好ましい実施形態において、その宿主細胞は、二分しているＧｌｃＮＡｃにより修飾される、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を含む。なおより好ましい実施形態において、その細胞は、１０モル％を超える上記の修飾された構造を生成する。
本発明の別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性、加えて、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を含む。好ましい実施形態において、その活性は、実質的に細胞内にある。別の好ましい実施形態において、その細胞は、ＧｎＴ ＩＩＩ活性と反応し得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含むＮ−グリカンを生成する。さらにより好ましい実施形態において、その細胞のＧｎＴ ＩＩＩ活性は、二分型グリカンを生成する。
別の実施形態において、本発明の下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性の両方を含む。好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性の両方をさらに含む。
本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性を下等真核生物宿主細胞に導入することによって、その細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性は、その細胞において発現され、なおより好ましい実施形態において、この発現は、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む、Ｎ−グリカンの生成を生じる。別の好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性は、実質的に細胞内にある。本発明の別の好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞から単離される。なおより好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンは、９０モル％より多いトリアンテナグリカンを含む。なおより好ましい実施形態において、その宿主細胞において生成される糖タンパク質は、治療タンパク質である。
従って、別の局面において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性の両方を含む、下等真核生物宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性を含む宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含むＮ−グリカンを生成する。より好ましい実施形態において、この活性は、テトラアンテナグリカンを生成する。従って、本発明のいくつかの実施形態の下等真核生物宿主細胞は、テトラアンテナグリカンを有するＮ−グリカンを含み得る。好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンは、１０モル％を超える上記二分型グリカンを含む。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造およびＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。好ましい実施形態において、その宿主細胞は、ＧｎＴ ＩＶにより修飾されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、あるいはＧｎＴ ＩＶおよびＧｎＴ Ｖにより修飾されるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を含む。好ましい実施形態において、そのＮ−グリカンは、７０モル％より多いテトラアンテナグリカンを含む。なおより好ましい実施形態において、その細胞は、７５モル％を超えるテトラアンテナグリカンを生成する。
本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性を含む、下等真核生物宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、上記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性を含む宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含むＮ−グリカン（例えば、ペンタアンテナグリカン）を生成する。従って、本発明のいくつかの実施形態の下等真核生物宿主細胞は、ペンタアンテナグリカンを有するＮ−グリカンを含み得る。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。好ましい実施形態において、その宿主細胞は、ＧｎＴ ＶＩにより修飾される、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を含む。
別の実施形態において、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性を下等真核生物宿主細胞に導入することによって、その細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性は、その細胞において発現され、なおより好ましい実施形態において、この発現は、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造およびＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む、Ｎ−グリカンの生成を生じる。別の好ましい実施形態において、そのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性は、実質的に細胞内にある。本発明の別の好ましい実施形態において、複数のアンテナを有する構造を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、下等真核生物宿主細胞から単離される。なおより好ましい実施形態において、その宿主細胞において生成される糖タンパク質は、治療タンパク質である。
本発明の別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性の両方を含む。好ましい実施形態において、その活性は、実質的に細胞内活性である。別の好ましい実施形態において、その細胞は、トリアンテナグリカンを生成するＧｎＴ ＩＶと反応し得るＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む、Ｎ−グリカンを含む。なおより好ましい実施形態において、その細胞のＧＮＴ Ｖ活性は、テトラアンテナグリカンを生成する。
別の好ましい実施形態において、本発明の下等真核生物宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性およびマンノシダーゼＩＩ活性の両方を含む。好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む。別の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性をさらに含む。
特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＯＣＨ１マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いている。このような細胞は、例えば、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠いていることもある。なお別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、α−１，２−マンノシダーゼＩ活性をさらに含む。別の実施形態において、その宿主細胞は、糖ヌクレオチドトランスポーターをさらに含み得る。好ましくは、その宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含み、ＧｌｃＮＡｃ残基の転移は、上記のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性のうちのいずれか１つによって促進される。
本発明はまた、本発明のプロセスによって生成される糖タンパク質を提供する。一実施形態において、その糖タンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造に二分しているＧｌｃＮＡｃを含み、下等真核生物宿主細胞において生成される。別の実施形態において、その糖タンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造に結合した、二分しているＧｌｃＮＡｃを含み、下等真核生物宿主細胞において生成される。好ましい実施形態において、本発明の糖タンパク質の１０モル％を超えるコア構造が、二分しているＧｌｃＮＡｃにより修飾される。
なお別の実施形態において、本発明は、テトラアンテナ構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を含み、かつ下等真核生物宿主細胞において生成される、糖タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明の糖タンパク質のコア構造のうちの９０モル％よりも多くが、ＧｎＴ ＩＶによって修飾される。別の実施形態において、その糖タンパク質は、テトラアンテナ構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を含み、かつ下等真核生物宿主細胞において生成される。より好ましい実施形態において、本発明の糖タンパク質のコア構造のうちの７５モル％よりも多くが、ＧｎＴ Ｖによって修飾される。
別の局面において、本発明は、下等真核生物宿主細胞において生成されるヒト様糖タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。１種以上のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性を有し、かつ結合した標的化ペプチド配列を含む、タンパク質をコードするベクターもまた、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、そのベクターによってコードされるタンパク質は、下等真核生物宿主細胞が、二分型構造および／または複数のアンテナを有する構造を有するＮ−グリカンを生成するように、その下等真核生物宿主細胞において局在化される。
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本発明の方法および技術は、一般には、他に示されない限り、当該分野で周知の従来法に従って、そして本明細書中に引用されかつ本明細書中にわたって議論される種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋｕｒｔ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｏｉｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第Ｉ巻 １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第ＩＩ巻 １９７６ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。本明細書中に記載される分子生物学および細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、および医化学および医薬化学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連して用いられる命名法、およびその実験室的手法および技術は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許文献および他の参考文献は、参考として援用される。
以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解されるべきである。
本明細書中で用いられる場合、用語「Ｎ−グリカン」はＮ−結合オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合したもの）をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」は、マンノースをいい；「Ｇｌｃ」は、グルコースをいい；そして「ＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルをいい；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンをいう）。Ｎ−グリカンに関して用いられる用語「トリマンノースコア」もまた、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）をいう。Ｎ−グリカンに関して使用される用語「ペンタマンノースコア」または「マンノース−５コア」または「Ｍａｎ５」は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をいう。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に結合された周辺の糖（例えば、ＧｌｃＮａｃ、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝した成分に従って分類される（例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド）。
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、代表的には、トリマンノースコアの１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有し得、この残基は、必要に応じて、シアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで、「Ｎｅｕ」とはノイラミン酸をいい、そして「Ａｃ」はアセチルをいう）で修飾される。複合Ｎ−グリカンは、代表的には、例えば：ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３／６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−；ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−（ムチンのみ）；Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−（血液型Ｈ）のような、オリゴ糖で終わる少なくとも１つの分枝を有する。硫酸エステルは、ガラクトース残基、ＧａｌＮＡｃ残基、およびＧｌｃＮＡｃ残基で生じ得、そしてリン酸エステルは、マンノース残基で生じ得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）はＯ−アセチル化され得るか、またはＮｅｕＧｌ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）によって置換され得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「分枝している」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースアームに０またはそれ以上のマンノースを有する。
Ｎ−グリカンの産生に関して用いられる用語「優勢な」または「優勢に」とは、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析によって検出される主要なピークを表す構造をいう。
本明細書中で用いられる略語は、当該分野における共通の用法である（例えば、上記の糖の略語を参照のこと）。他の共通の略語としては、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）をいう「ＰＮＧａｓｅ」；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素をいう「ＧｌｃＮＡｃ Ｔｒ」または「ＧｎＴ」；Ｎ−アセチルノイラミン酸をいう「ＮＡＮＡ」が挙げられる。
本明細書中で用いられる場合、「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様糖タンパク質」とは、３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンがそれに結合しているタンパク質、および少なくとも５つのマンノース残基を有する合成糖タンパク質中間体（これもまた有用であり、さらにインビトロまたはインビボで操作され得る）を代替的にいう。好ましくは、本発明により産生される糖タンパク質は、少なくとも一時的には、少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、または１００モル％さえのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体を含む。これは、例えば、本発明の宿主細胞を、「より優れた」、すなわちより効率的なグリコシル化酵素を発現するように操作することによって、達成され得る。例えば、マンノシダーゼは、タンパク質がグリコシル化されて、好ましくは、活性が望まれる宿主細胞の細胞小器官に対してこの酵素を標的化することによって宿主細胞中に導入される、宿主細胞中の部位に存在する条件下で、最適な活性を有するように選択される。
用語「酵素」とは、宿主細胞グリコシル化を変化させることに関連して用いられる場合、少なくとも１つの酵素活性を有する分子をいい、全長酵素、触媒活性フラグメント、キメラ、複合体などを含む。酵素の「触媒活性フラグメント」とは、検出可能なレベルの機能的（酵素的）活性を有するポリペプチドをいう。酵素活性は、溶解した細胞から測定可能なものと比較して、その酵素活性の１０％未満が、細胞の外側で測定可能である場合、「実質的に細胞内」である。
下等真核生物宿主は、グリコシル化プロフィールと関連して本明細書中で用いられる場合、高マンノース含有Ｎ−グリカンを通常産生する任意の真核生物細胞をいい、従って、いくつかの動物細胞または植物細胞および最も代表的な下等真核生物細胞（単細胞および多細胞の真菌細胞および藻細胞が挙げられる）を包含することが意図される。
本明細書中で用いられる場合、用語「分泌経路」とは、種々のグリコシル化酵素の構築ラインをいい、この系に対して、細胞質から小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置の区画への新生ポリペプチド鎖の分子の流れに従って、脂質結合オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が順に曝露される。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前に脂質結合グリカンまたはＮ−グリカンに作用する酵素Ｘは、酵素Ｙに対して「上流」にあるか、または「上流」で作用するといわれ；同様に、酵素Ｙは酵素Ｘから「下流」にあるか、または「下流」に作用する。
本明細書中で用いられる場合、用語「標的化ペプチド」とは、細胞標的シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいい、この細胞標的シグナルペプチドは、細胞下の位置（例えば、細胞小器官）に対する関連配列の局在化（または保持）を媒介する。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態をいう。該用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド間結合、または双方を含むＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含む。核酸は、いずれのトポロジー的立体配座でもあり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐状、ヘアピン状、環状、または南京錠様の立体配座であり得る。この用語は、一本鎖形態のＤＮＡおよび二本鎖形態のＤＮＡを含む。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに前記の合成形態および混合ポリマーの、センス鎖とアンチセンス鎖との両方を含み得る。当業者に容易に認識されるように、それらは化学的に改変されていても、生化学的に改変されていてもよく、あるいは非天然ヌクレオチド塩基を含んでいてもよいし、誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような改変としては、例えば、標識、メチル化、１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部位（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター、アルキレーターおよび改変された結合（例えば、αアノマー核酸など））が挙げられる。また、指定された配列に、水素結合および他の化学的相互作用を介して結合する、それらの能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当該分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子の骨格中のリン酸結合に代えて置き換えるものを含む。
他に示されない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その少なくとも一部が（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。その２つの間の選択は文脈によって決定される。例えば、もし核酸がプローブとして用いられる場合、その２つの間の選択はプローブがその所望の標的に対して相補的であるという要件によって決定される。
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）は、その天然宿主細胞においてネイティブなポリヌクレオチドに天然では伴う他の細胞構成要素（例えば、それに対して天然に会合するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列）から実質的に分離されたものである。該用語は、（１）その天然に存在する環境から取り出されてしまっている核酸またはポリヌクレオチド、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない核酸またはポリヌクレオチド、（３）天然には結合していないポリヌクレオチドに作動可能に連結している核酸またはポリヌクレオチド、あるいは（４）天然には存在しない核酸またはポリヌクレオチドを含む。用語「単離された」または「実質的に純粋な」は、組換えＤＮＡ単離体もしくはクローンＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチドアナログに関して用いることもできる。
しかしながら、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチドが、その天然の環境から物理的にそれ自体が取り出されてしまっていることを必ずしも必要としない。例えば、もし異種配列（すなわち、内因性核酸配列に天然では隣接しない配列）が、生物のゲノム中の内因性核酸配列の発現が改変されるように、この内因性核酸配列に隣接して置かれるならば、この内因性核酸配列は、本明細書中では、「単離された」とみなされる。その例として、非ネイティブプロモーター配列は、ヒト細胞のゲノム中の遺伝子が改変された発現パターンを有するように、この遺伝子の天然プロモーターに代えて（例えば、相同組換えによって）置き換えることができる。この遺伝子は今や「単離された」ものとなっている。何故ならば、それは、天然ではそれに近接する配列の少なくともいくつかから分離されているからである。
また、核酸が、ゲノム中の対応する核酸では天然には起こらないいずれかの改変を含む場合、この核酸は、「単離された」と考えられる。例えば、もし内因性コード配列が、例えば、ヒト介入によって人工的に導入された挿入、欠失または点変異を含むならば、それは「単離された」と考えられる。「単離された核酸」としては、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物が挙げられる。さらに、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含み得ないか、あるいは組換え技術によって生産される場合、培養培地を実質的に含み得ないか、あるいは化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含み得ない。
本明細書中で用られる場合、参照核酸配列の「縮重改変体」との語句は、標準的な遺伝暗号に従い、翻訳されて参照核酸配列から翻訳されたものと同一なアミノ酸配列を供するように翻訳され得る核酸配列を含む。
核酸配列の文脈における用語「配列同一性パーセント」または「同一な」とは、最大対応性に対して整列させた場合に同一である、２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９つのヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに用いることができる当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて、ポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最良の重複の領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８、その全体が本明細書中に参考として援用される）。例えば、核酸配列の間の配列同一性パーセントは、デフォルトパラメーター（スコアリングマトリックスのための６のワードサイズおよびＮＯＰＡＭ因子）でＦＡＳＴＡを用いてか、あるいは本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供されるようなデフォルトパラメーターでＧａｐを用いて、決定され得る。
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはそのフラグメントに言及する場合、もう１つの核酸（またはその相補鎖）と、ヌクレオチドの適切な挿入または欠失を伴って最適に整列させた場合に、前記したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのようないずれかの周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
あるいは、核酸またはそのフラグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、もう１つの核酸、もう１つの核酸の鎖、その相補鎖にハイブリダイズする場合に、かなりの相同性または類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的な領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数のような条件によって影響される。当業者であれば、どのようにしてこれらのパラメーターを変化させ、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するかを知っている。
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドについての熱融解温度（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は条件の特定の組の下で、特異的なＤＮＡハイブリッドについてのＴｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。本明細書中に参考として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲、頁９．５１参照。本明細書中での目的では、「高ストリンジェンシー条件」は、液相ハイブリダイゼーションでは、８〜１２時間の６５℃における６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳでの水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、続いての２０分間の６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよびパーセント同一性を含めた多数の因子に応じて異なる速度で起こることは当業者に認識される。
用語「変異した」は、核酸配列に適用する場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入され得るか、欠失され得るか、または変化され得ることを意味する。単一の改変は遺伝子座でなすことができ（点変異）、あるいは多数のヌクレオチドを単一遺伝子座において挿入し、欠失し、または変化させることができる。加えて、１以上の改変を、核酸配列内のいずれかの数の遺伝子座で行うことができる。核酸配列は、限定されるものではないが、「エラープローンＰＣＲ」（点変異の高い率がＰＣＲ産物の全長に沿って得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行うプロセス；例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５ならびにＣａｌｂｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．，２：２８−３３参照）；および「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発」（目的の任意のクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の生成を可能とするプロセス；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７参照）のような変異誘発技術が挙げられる、当該分野で公知のいずれかの方法によって変異させることができる。
本明細書中で用いる用語「ベクター」は、それが結合したもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子をいうことを意図する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターはコスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここに、さらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結することができる（後により詳細に議論する）。ある種のベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、従って、宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それに作動可能に連結されるゲノムの発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）といわれる。
「作動可能に連結した」発現制御配列とは、発現制御配列が目的の遺伝子と連続して、目的の遺伝子を制御する結合、ならびにトランス、またはある距離を置いて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列をいう。
本明細書中で用いる用語「発現制御配列」とは、それに作動可能に連結したコード配列の発現に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物の場合には、そのような制御配列としては、一般には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列が挙げられる。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現に必須である全ての構成要素を含むことを意図し、また、その配列が有利であるさらなる構成要素（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）も含み得る。
本明細書中で用いる場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中へ組換えベクターのような核酸が導入されている細胞をいうことを意図する。そのような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫をもいうことを意図することが、理解されるべきである。ある種の改変は、変異または環境の影響のいずれかに起因して、継続する世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でない可能性があるが、依然として、本明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、単離された細胞であっても、培養で増殖された細胞系であってもよく、あるいは生きた組織または生物中に存在する細胞であってもよい。
本明細書中で用いられる用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸未満の長さ、より典型的には約３０アミノ酸未満の長さのものをいう。本明細書中で用いられる該用語は、アナログ、ならびに構造および従って生物学的機能を模倣する模倣物を含む。
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、天然に存在するものと天然には存在しないものとの両方のタンパク質、ならびにそのフラグメント、変異体、誘導体およびアナログを含む。ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、その各々が、１以上の区別される活性を有する多数の異なるドメインを含み得る。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導の源により、（１）そのネイティブ状態でそれに伴う天然に会合した構成要素に会合しないタンパク質またはポリペプチド、（２）それが天然で見出されない純度で存在する場合、その純度を他の細胞物質の存在に関連して調整できる（例えば、同一種由来の他のタンパク質はない）タンパク質またはポリペプチド、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるタンパク質またはポリペプチド、あるいは（４）天然に存在しない（例えば、それは天然で見出されるポリペプチドのフラグメントであるか、あるいはそれは天然で見出されないアミノ酸アナログまたは誘導体、あるいは標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成されたか、またはそれが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然に会合した構成要素から「単離」されている。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に会合した構成要素を実質的に含まないようにされ得る。そのように定義されたように、「単離された」は、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されてしまっていることを必ずしも必要としない。
本明細書中で用いる用語「ポリペプチドフラグメント」とは、全長ポリペプチドと比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、ポリペプチドフラグメントは、そのフラグメントのアミノ酸配列が天然に存在する配列における対応する位置と同一である連続配列である。フラグメントは、典型的には少なくとも５、６、７、８，９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
「改変された誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含む、あるいはネイティブポリペプチドに見出されないアミノ酸を取り込んだポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。そのような改変としては、例えば、当業者に容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種での標識）、および種々の酵素的改変が挙げられる。そのような目的で有用な、ポリペプチドを標識するための多様な方法、および多様な置換基または標識は、当該分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈのような放射性同位体、標識抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗リガンドを含む。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合体化の容易性、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野で周知である。本明細書中で参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２の補遺）参照。
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、天然または野生型のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成または置換を含むポリペプチドをいう。ムテインは、ある位置における単一アミノ酸が別のアミノ酸に変化されている１以上のアミノ酸点置換、１以上のアミノ酸が天然に存在するタンパク質の配列において、各々、挿入または欠失されている１以上の挿入および／もしくは欠失、ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端いずれかまたは双方におけるアミノ酸配列の短縮を有することができる。ムテインは、天然に存在するタンパク質と比較して、同一の生物学的活性を有することができるが、好ましくは、異なる生物学的活性を有する。
ムテインは、その野生型対応物に対して、少なくとも７０％の総じての配列相同性を有する。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の総じての配列相同性を有するムテインである。なおより好ましい実施形態においては、ムテインは、９５％の配列同一性、なおより好ましくは９７％、なおより好ましくは９８％、なおより好ましくは９９％の総じての配列同一性を呈する。配列相同性は、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔのような、任意の一般的な配列分析アルゴリズムによって測定され得る。
好ましいアミノ酸置換は（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変するアミノ酸置換、（４）結合親和性または酵素活性を改変するアミノ酸置換、および（５）そのようなアナログの他の物理化学的特性または機能的特性を付与するか、または改変するアミノ酸置換である。
本明細書中で用いられる場合、２０の慣用的アミノ酸およびその略語は慣用的用法に従う。本明細書中に参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非慣用的アミノ酸のような非天然アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドのための適切な構成要素であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチド表記においては、標準用法および約束に従い、左手方向はアミノ酸末端方向であって、右手方向はカルボキシ末端方向である。
もしタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有するならば、そのタンパク質は第二のタンパク質に対して「相同性」を有し、あるいはそれに対して「相同」である。あるいは、もし２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有するならば、タンパク質は第二のタンパク質に対して相同性を有する（従って、用語「相同タンパク質」とは、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して６０％の配列相同性、より好ましくは７０％配列相同性を呈するものである。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％配列相同性を呈する相同タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相同タンパク質は９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を呈する。本明細書中で用いられる場合、（特に、予測された構造類似性に関して）アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性は、機能において類似性を意味するものと解釈される。
「相同な」がタンパク質またはペプチドに関連して用いられる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換だけ異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が相互に保存的置換だけ異なる場合、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的性質を修正するように上方に調整することができる。この調整をなす手段は当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８参照）。
以下の６つの群は、各々、相互に代えての保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
配列同一性パーセントともいうポリペプチドについての配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウエアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５参照。タンパク質分析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含めた、種々の置換、欠失および他の改変に帰属される相同性の尺度を用いて類似の配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔ ｆｉｔ」のようなプログラムを含み、これは、デフォルトパラメーターを用いて、異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドのような密接に関連するポリペプチドの間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するために使用され得る。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１参照。
阻害分子配列を、異なる生物からの非常に多数の配列を含むデータベースと比較する場合の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎら．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐについての好ましいパラメーターは：期待値：１０（デフォルト）：フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを拡大するためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードのサイズ１１：（デフォルト）；記載の番号：１００（デフォルト）：ペナルティマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
相同性について比較されたポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５を超える。非常に多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列はＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラム）を用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列とサーチ配列との間の最良な重複の領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８参照）。例えば、アミノ酸配列の間の配列同一性パーセントは、本明細書中に参考として援用される、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用いて決定することができる。
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列にカップリングしたポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質由来の２以上の所望の機能的エレメントを含むように構築することができるので有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチドからの少なくとも１０の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームであるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって、組換えにより生産することができる。別法として、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントをもう一つのタンパク質に架橋させることによって化学的に生産することができる。
本明細書中で用いる用語「領域」とは、生体分子の一次構造の物理的に連続する部分をいう。タンパク質の場合には、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義される。
本明細書中で用いる用語「ドメイン」とは、生体分子の既知の機能または疑われる機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、領域またはその部分と同じ範囲であり得；ドメインは、生体分子の別個の非連続領域を含むこともできる。タンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが挙げられる。
本明細書中で用いられる場合、用語「分子」は、限定されるものではないが、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含めた任意の化合物を意味し、そのような化合物は、天然または合成のものであり得る。
他に定義しない限り、本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一な意味を有する。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載したのと同様なまたは同等な方法および材料も本発明の実施で用いることができ、それは当業者に明らかである。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の文献は本明細書にその全体が参考として援用される。矛盾がある場合、定義を含めた本明細書が優先する。材料、方法および例は説明のためだけのものであり、限定する意図のものではない。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」または「を含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、他のいかなる整数も整数の群も排除するものではないと理解される。
（下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産する方法）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を天然では発現しないか、またはそれを発現しないように操作されている真核生物宿主細胞が、出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な１以上の酵素、または他の因子を発現するように操作される。所望の宿主株は、一度に１つ以上の酵素を発現するように操作することができる。加えて、１以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本発明の宿主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素（例えば、異種細胞下標的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素フラグメントを含むキメラ酵素）をコードする核酸分子のライブラリーが（例えば、酵素フラグメントを含むサブライブラリーと細胞下標的化配列との連結によって）創製され、そして最適な活性を持つ１以上の酵素を有するか、または最も「ヒト様」の糖タンパク質を生産する株が、ライブラリーの１以上のメンバーで標的宿主細胞を形質転換することによって、選択され得る。
特に、本明細書中に記載された方法は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造をさらに改変して複合Ｎ−グリカンを得る目的で、少なくとも一時的に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を高い収率でインビボで得ることを可能とする。下等真核生物のような宿主細胞において適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を適当な収率で得るための成功したスキームは、一般には、２つの平行したアプローチ：（１）もしあれば、内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性によって作製された高マンノース構造を低下させること、および（２）１，２−α−マンノースをマンノシダーゼによって除去して、さらに宿主細胞の内部で反応されて複合体ヒト様グリコ形態を形成することができる高レベルの適当なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を得ることを含む。
従って、第一の工程は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）の作用によってインビボでＧｌｃＮＡｃを許容し得るＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的前駆体構造を生産し得る、真核生物宿主細胞（例えば、下等真核生物）の選択または創生を含む。一つの実施形態において、この方法は、糖タンパク質上のＮ−グリカンに関して１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製すること、またはそれを用いることを含む。好ましくは、宿主細胞は、開始１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性（後記参照）が枯渇したものである。そのような宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するのに望ましくない高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を欠く。
次いで、１以上の酵素活性を、そのような宿主細胞に導入して、少なくとも３０モル％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ５」）炭水化物構造を有することによって特徴付けられるＮ−グリカンを、宿主細胞内で生産する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合Ｎ−グリカン形成に必要である：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、少なくとも一時的に、高い収率で（例えば、３０％を超えて）インビボで形成されなければならない。なぜなら、引き続いての哺乳動物様およびヒト様のグリコシル化反応はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはその誘導体を必要とするからである。
この工程は、高い収率での、細胞内でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特定の異性体構造の形成も必要とする。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造は複合Ｎ−グリカン形成に必要であるが、その存在は決して十分ではない。これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩに対する基質として働くことができる、またはできない異なる異性体形態で存在し得るからである。殆どのグリコシル化反応は完全ではないので、特定のグリコシル化タンパク質は、一般に、その表面に、ある範囲の異なる炭水化物構造（すなわち、グリコ形態）を含む。従って、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のような特定の構造の微量の（すなわち、５％未満の）単なる存在は、哺乳動物様糖タンパク質またはヒト様糖タンパク質を生産するのにほとんど現実的な関連性はない。必要なのは、高い収率での（すなわち、３０％を超える）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを許容するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体（図１Ｂ）の形成である。この中間体の形成は、目的のグリコシル化タンパク質（標的タンパク質）上の複合Ｎ−グリカンの引き続いてのインビボでの合成を可能とするのに必要である。
従って、選択された宿主細胞によって生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のいくつかまたは全ては、哺乳動物グリコシル化経路に沿った酵素活性に対する生産的基質でなければならず、例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性に対する基質としてインビボで働くことができ、それにより、宿主細胞においてヒト様Ｎ−グリカン中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成する。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞において生産されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは５０％以上は、インビボにてＧｎＴＩに対する生産的基質である。もし、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が１０％で生産され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が標的タンパク質上で２５％で生産されるならば、一時的に製造されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の合計量は３５％であることが理解される。なぜならば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産物だからである。
当業者は、天然由来の宿主細胞（例えば、インビボでかなりのレベルのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産する現存する真菌または他の下等真核生物）を選択し得る。しかしながら、合計Ｎ−グリカンの１．８％を超えてインビボにてそのような構造を供することが示された下等真核生物は未だない（例えば、Ｍａｒａｓら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，７０１−７０７参照）。あるいは、そのような宿主細胞は、インビボでＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生産するように遺伝子的に操作することができる。米国特許第５，５９５，９００号に記載されたもののような方法を用いて、目的の標的宿主細胞または生物における特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌクレオチドトランスポーターの非存在または存在を同定することができる。
（望ましくない宿主細胞グリコシル化酵素の不活化）
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト様Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは、高マンノース構造の生産に関与する１以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用いられる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既に記載された多くのそのような変異体の一つで出発して操作され得るか、あるいはこの変異体から誘導されて操作され得る。従って、選択された宿主細胞に応じて、非ヒトグリコシル化反応の特徴であることが既知である酵素をコードする１つまたは多数の遺伝子を、欠失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は、多数の下等真核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎａなど）において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを提供する。これらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、１，３マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１）（Ｇｒａｈａｍ、１９９１）、１，２マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレギュレーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＭＮＮ４およびＭＮＮ６））、ならびに異常な、すなわち、非ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるようである。これらの遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシル化プロフィールを持つ生きた表現型を生じる。その例は、表１に示される。
必要な操作工程を例示するために本明細書中に記載したように、本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓの過マンノシル化−マイナス（ｏｃｈ１）変異体である。他の下等真核生物のようにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせるためにα−１，２−マンノシダーゼと共にＥＲ中にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造を保有する（図１Ａ）。数個のマンノシルトランスフェラーゼの作用を介して、次いで、この構造はマンナンとしても知られた過マンノシル化された構造（Ｍａｎ＞９ＧｌｃＮＡｃ２）に変換される（図３５Ａ）。加えて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、マンノシルリン酸トランスフェラーゼの作用を介して、非末端リン酸基を炭水化物構造へ付加することができることが判明した。これは、マンノース糖の付加よりはむしろ除去を包含する、哺乳動物細胞で行われる反応とは異なる（図３５Ａ）。存在するＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造を過マンノシル化する真核生物宿主細胞（例えば、真菌）の能力を排除するのは特に重要である。これは、超マンノシル化しない宿主細胞を選択すること、またはそのような細胞を遺伝的に操作することのいずれかによって、達成され得る。
超マンノシル化プロセスに関与した遺伝子は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、同定されており、これらの遺伝子中に変異を作り出すことによって、「望ましくない」グリコ形態の生産を低下させることができる。そのような遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような他の下等真核生物で見出される現存のマンノシルトランスフェラーゼまたはそれらのレギュレーター（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４，ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）に対する相同性によって、あるいは宿主株を変異誘発し低下したマンノシル化を持つグリコシル化表現型を選択することによって同定することができる。公知のマンノシルトランスフェラーゼおよびマンノシルリン酸トランスフェラーゼの間の相同性に基づき、ＰＣＲプライマー（その例は表２に示される）を設計することができるか、そのような酵素をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントをプローブとして用いて、標的または関連生物のＤＮＡライブラリーにおいてホモログを同定することができる。別法として、関連生物において特定のグリコシル化表現型を補うその能力によってバンノシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的ホモログを同定することができる。
（表２．ＰＣＲプライマー）
Figure 2006518600
 脚注：Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ、Ｎ＝ＧまたはＡまたはＴまたはＣ。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を得るためには、例えば、以下の工程を行う：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、高温では遅く成長する。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーで補うことによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＯＣＨ１の機能的ホモログを同定することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体は、例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能でありＲｅｓＧｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。高温において正常な増殖表現型を呈する変異体は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡライブラリーで形質転換された後は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１ホモログを有するようである。そのようなライブラリーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分的に消化し、制限酵素を不活化した後、消化されたＤＮＡを、適合する制限酵素で消化されている適当なベクターに連結することによって作り出すことができる。
適切なベクターとしては、例えば、Ｔｒｐ１マーカーを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドであるｐＲＳ３１４（ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＨｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：１９−２７頁）、およびＵＲＡ３マーカーを含有する改変されたｐＵＣ１９に基づく高コピー（２μ）プラスミドであるｐＦＬ４４Ｓ（Ｂｏｎｎｅａｕｄら（１９９１）Ｙｅａｓｔ ７：６０９−６１５頁）が挙げられる。そのようなベクターは、学術研究者によって通常用いられ、同様なベクターは多数の異なる販売業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手可能である。さらなる例としては、ｐＹＥＳ／ＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２μ複製起点に基づく酵母発現プラスミド、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＹｅｐ２４クローニングビヒクルが挙げられる。
染色体ＤＮＡおよびベクターの連結の後、ＤＮＡライブラリーを、特定の変異を持つＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に形質転換し、対応する表現型の修正を選択することができる。野生型表現型を回復することができるＤＮＡフラグメントをサブクローニングし、配列決定した後、このフラグメントを用いて、当業者に周知のインビボ変異誘発および／または組換え技術を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１によってコードされた遺伝子産物の活性を排除することができる。
あるいは、もし目的の特定の宿主細胞（例えば、真菌）の全ゲノム配列が知られているならば、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのようないくつかの情報源から入手可能な、公に利用可能なＤＮＡデータベースを単に検索することによって、そのような遺伝子を同定することができる。例えば、与えられたゲノム配列、または公知の１，６マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）からの配列を含むデータベースを検索することによって、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードできる（必ずしも必要でない）そのような宿主細胞ゲノムにおいて高い相同性の遺伝子を同定することができる。しかしながら、核酸配列相同性単独は、同一の活性を有する酵素をコードするホモログを同定し、単離したことを証明するには十分ではない。今日まで、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１欠失が非常に重要な開始１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を排除することを示すデータは存在しない（Ｍａｒｔｉｎｅｔら（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）（Ｄｅｃ．１９９８）：１１７１−１１７７；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ０２／００８５６ Ａ２）。従って、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子ホモログがその機能を現実にコードすることを証明するデータはない。その証明はここに初めて提供される。
いくつかのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンノシルトランスフェラーゼに対するホモログは、これらのアプローチを用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同定されている。相同な遺伝子は、しばしば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質のマンノシル化に関与する遺伝子と同様な機能を有し、従って、それらの欠失を用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは、同様に、同様なグリコシル化経路を持つ任意の他の宿主細胞（例えば、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞）において、グリコシル化パターンを操作することができる。
遺伝子ノック−アウトの創製は、一旦与えられた標的遺伝子配列が決定されると、当該分野におけるよく確立された技術であり、当業者が行うことができる（例えば、Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４：２８１参照）。宿主生物の選択は、良好な形質転換および遺伝子破壊技術の利用可能性によって影響され得る。
もしいくつかのマンノシルトランスフェラーゼがノックアウトされるべきであれば、例えば、ＡｌａｎｉおよびＫｌｅｃｋｎｅｒ（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６：５４１−５４５によって開発された方法は、選択マーカー（例えば、酵母におけるＵＲＡ３マーカー）の反復された使用を可能として、全ての望ましくない内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性を順次に排除することができる。この技術は他者によって改良されているが、基本的には、逆選択マーカーに隣接する２つの反復ＤＮＡ配列の使用を含む。例えば、ＵＲＡ３をマーカーとして用いて、構築物を取り込んだ形質転換体の選択を確実とすることができる。ＵＲＡ３マーカーに直接反復物を隣接させることによって、まず、構築物を取り込み、従って、標的遺伝子を破壊した形質転換体を選択することができる。形質転換体の単離、およびその特徴付けの後、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に対して耐性であるものを、第二ラウンドにて逆選択することができる。５−ＦＯＡを含有するプレート上で生存することができるコロニーは、先に述べた反復を含む交差事象を介して再度ＵＲＡ３マーカーを失っている。このアプローチは、従って、同一マーカーの反復された使用を可能とし、さらなるマーカーを必要とすることなく複数遺伝子の破壊を容易とする。他の選択マーカーおよび逆選択マーカーを持つ別の真核生物宿主細胞で用いるのに適合された、遺伝子の順次の排除のための同様な技術もまた、用いられ得る。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）またはマンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮＮ６、またはｌｂｄ変異体を相補する遺伝子）のような特定のマンノシルトランスフェラーゼ、またはレギュレーター（ＭＮＮ４）の排除は、この生物の操作された株の創製を可能とし、該株は主にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を合成し、これを用いて、より複雑なグリコ形態構造（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト細胞）で生産されるもの）に似るようにグリコシル化パターンをさらに改変することができる。この方法の好ましい実施形態は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて同様なまたは同一の生化学的機能を排除して、遺伝子的に変更されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株で生産された糖タンパク質のグリコシル化構造を改変するために生化学的グリコシル化活性をコードするＤＮＡ配列を利用する。
本明細書中で例示したような酵母におけるグリコシル化経路を操作するのに用いられる方法は、引き続いての修飾のために好ましい基質を生産するために糸状菌で用いることができる。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒおよび他の糸状菌におけるグリコシル化経路を改変するための戦略は、酵母においてヒト様糖タンパク質を生産するように株を操作することに関して本明細書中に記載したのと同様なプロトコルを用いて、開発することができる。１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＫＴＲ／ＫＲＥホモログ）に関与する望まない遺伝子活性を改変または排除する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌は好ましい宿主である。なぜならば、それは１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くからであり、それゆえ、この宿主において超マンノシル化遺伝子活性（例えば、ＯＣＨ１）は予測されない。対照的に、グリコシル化に関与する他の所望の活性（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ））は、本発明の標的化方法を用いて宿主に導入される。
（減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作または選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（すなわち、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造のα−１，３アーム上で外部鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素）活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の作製または使用を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＯＣＨ１遺伝子の破壊の結果、Ｎ結合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を得るための従前のアプローチは、ＯＣＨ１の不活化を必要とした（例えば、Ｃｈｉｂａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−３０４参照）。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、（選択された宿主細胞に応じて）、任意であり得る。なぜなら、Ｏｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために、インタクトなＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を必要とするからである。従って、７以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積する、本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Ｏｃｈ１ｐに対する貧弱な基質であるような低グリコシル化Ｎ−グリカンを生産し得る（例えば、Ｎａｋａｙａｍａら（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２（３）：５４７−５０参照）。
ＯＣＨ１遺伝子は、記載されているように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（実施例１６）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ（実施例９）からクローン化された。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のＯＣＨ１遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を、配列番号７および配列番号８に記載する。遺伝子特異的プライマーを用いて、各クローンから構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＯＣＨ１遺伝子を欠失させた（各々、実施例１および９）。開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇し、かつＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖構造を有するＮ−グリカンを生産するように操作された宿主細胞は、それにより、得られた（例えば、図５、６および１２；実施例４および９参照）。
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子（配列番号７）の少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含む、またはそれよりなる核酸配列を有する単離された核酸分子、ならびにそのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む）が提供される。また、さらに本明細書中で記載するように、本発明の上記核酸分子を含む、ベクター（発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
本発明は、さらに、ａｌｇ遺伝子活性（すなわち、非真菌宿主細胞における同等な酵素活性を含めたａｌｇ活性）が減少した、または枯渇した非ヒト真核生物宿主細胞を作製し、または用い、少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を宿主細胞に導入する方法を提供する。好ましい実施形態において、グリコシダーゼ活性は、宿主細胞内で１以上のマンノシダーゼ活性の発現を引き起こすことによって、例えば、宿主細胞において、マンノシダーゼ活性の活性化によって、またはマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって、導入される。
別の実施形態において、この方法は、糖残基を脂質結合オリゴ糖前駆体の１，６アームに転移する１種以上の酵素の活性を減少させたかまたは除去した宿主細胞を作製するかまたは使用することを包含する（図１３）。本発明の宿主細胞は、脂質結合オリゴ糖前駆体の１，６アームに糖残基（例えば、マンノシレート）を転移する酵素をコードする遺伝子のうちの１種以上における変異について選択されるか、またはこれらの遺伝子のうちの１種以上において変異を導入することによって、操作される。その糖残基は、より好ましくは、マンノースであり、好ましくは、グルコース、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、フコースまたはＧｌｃＮＡｃリン酸残基である。好ましい実施形態において、脂質結合オリゴ糖前駆体の１，６アームをマンノシル化する１種以上の酵素の活性を、減少させるかまたは除去する。この方法は、宿主細胞に少なくとも１種以上のグリコシダーゼ活性を導入する工程をさらに包含し得る（以下を参照のこと）。
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク質を生産する方法を提供し、ここで、糖タンパク質は、トリマンノースコア構造に結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。
各々上記の実施形態において、その方法は、脂質結合オリゴ糖前駆体がＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２構造（ここでＸは、３、４または５である）を富化される宿主細胞を作製することに関する（図１４）。これらの構造は、宿主細胞のＲＥにおいて、生成しようとしているポリペプチド鎖に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって転移され、グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩ）で処理して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２コア構造（ここでＸは、３、４または５であり、好ましくは３である）を有するＮ−グリカンを生成することによってプロセシングされ得る（図１４および１５）。図１４に示されるように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２コア構造（ここでＸは、３より大きい）を有するＮ−グリカンは、適用可能である場合には、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に（例えば、α−１，３マンノシダーゼ活性および／またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性で処理することによって）変換され得る。
グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、エキソビボ処理によって、または宿主細胞における一連のグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含める）の異種発現によって、修飾して、ヒト様Ｎ−グリカンとなるようにされ得る。本発明に従って生産され得る好ましいヒト様糖タンパク質としては、７以下個または３個以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含むヒト様糖タンパク質の；ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアリル酸、およびフコースからなる群より選択される１以上の糖を含むヒト様糖タンパク質；ならびに構造ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮａｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含むヒト様糖タンパク質が挙げられる。
一実施形態において、その宿主細胞は、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性が減少したかまたは除去されている。この活性は、ＥＲの管側において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ＤｏｌからＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへの第１のマンノシル化工程に関与する活性である（例えば、ＡＬＧ３ 図１３；図１４）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ３遺伝子によってコードされる。上記のように、漏出性のａｌｇ３−１変異を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５ＧＩｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し、ａｌｇ３が欠失した細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を、ＥＲ内で生成しているポリペプチド鎖に転移するようである。従って、この実施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が富化されたＮ−グリカンを蓄積する。この構造は、次いで、グリコシダーゼ活性（例えば、α−１，２マンノシダーゼ、α−１，３マンノシダーゼ、またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性）およびグリコシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ）での処理によってＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る（図１４；図３５Ｂ）。
実施例１０に記載されるように、縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡｌｇ３タンパク質配列、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＡｌｇ３タンパク質配列およびヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）に由来するＡｌｇ３タンパク質配列のアライメント（図１６および１７）に基づいて設計し、これらを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡから生成物を増幅した。得られたＰＣＲ生成物を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３遺伝子に対する３５％の全体的な配列同一性および５３％の配列類似性を有するタンパク質をコードする（図１８および１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムクローンを同定および単離するために、プローブとして使用した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子は、本明細書で「ＰｐＡＬＧ３」といわれる。そのＡＬＧ３遺伝子を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓから同様に同定および単離した（実施例１０；図２０および２１）。
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｓ ＡＬＧ３遺伝子（図１８）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３遺伝子（図２０）のうちの少なくとも４５個、好ましくは５０個、より好ましくは少なくとも６０個および最も好ましくは７５個以上のヌクレオチド残基を含むかまたはそれらからなる核酸配列、ならびにそれらのホモログ、改変体および誘導体を有する核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で上記の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体およびアナログを含む）が、提供される（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３遺伝子生成物およびＫ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３遺伝子生成物は、図１８および図２０に示される）。さらに、本明細書にさらに記載されるような、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）もまた、提供される。
遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムからＰｐＡＬＧ３遺伝子を欠失させる構築物を、作製した（実施例１０）。この株を使用して、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性が除去された宿主細胞を生成し、脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ前駆体を生成した。この前駆体は、生成しているポリペプチド鎖に転移されて、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を有するＮ−グリカンを生成する。
実施例１１に記載されるように、このような宿主細胞は、望ましいＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア糖質構造を有するＮ−グリカンを生成するために、適切なマンノシダーゼの発現によって操作され得る。宿主細胞における（例えば、以下に記載のように、核酸分子または核酸分子ライブラリーを標的化することによる）ＧｎＴの発現は、改変された宿主細胞が、Ｍａｎ３コア構造の各アームに結合した１つまたは２つのＧｌｃＮＡ構造（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；図１５を参照のこと）を有するＮ−グリカンを生成することを可能にする。これらの構造は、本発明の方法をさらに使用してプロセシングされて、宿主細胞の分泌経路に入るタンパク質上にヒト様Ｎ−グリカンを生成し得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ａｌｇ遺伝子の活性またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア糖質構造のα−１，６アーム上のＮ−グリカンをマンノシル化する１以上の活性において、減少されるかもしくは除去され；かつ（ｂ）開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（すなわち、（Ｍａｎ３コア構造のα−１，３アーム上での）外側鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素）の活性において減少されるかまたは除去される、宿主細胞を作製するかまたは使用することを包含する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｏｃｈ１遺伝子の破壊は、Ｎ結合型糖が、ポリマンノース外側鎖を完全に欠いている表現型を生じる。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を得るための以前のアプローチは、ＯＣＨ１の不活性化を要した（例えば、Ｃｈｉｂａら．（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−３０４を参照のこと）。しかし、本発明の宿主細胞におけるその開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、必要に応じる。なぜなら、（選択される宿主細胞に依存して）Ｏｃｈ１ｐ酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のためにインタクトなＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃを要するからである。従って、本発明に従って選択されるかまたは生成される宿主細胞は、７個以下のマンノース残基を有する脂質結合オリゴヌクレオチドを蓄積し、転移後に、Ｏｃｈ１ｐについての不十分な基質であるようである低グリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｎ−グリカンを生成する（例えば、Ｎａｋａｙａｍａら（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２（３）：５４７−５０を参照のこと）。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を有する宿主の操作または選択）
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性（全長の酵素、そのホモログ、改変体、誘導体、および触媒的に活性なフラグメントを含む）を発現することによって、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性の活性化によってかまたはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を核酸分子から発現することによって、よりヒト様のＮ−グリカンを生成するように操作される。当該分野で周知の技術を使用して、遺伝子特異的プライマーは、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子（好ましくは、哺乳動物ＧｎＴＩＩＩ遺伝子（例えば、マウスＧｎＴＩＩＩ））の相同領域に相補的であるように設計される（図２４）。これらの配列は、当該分野で容易に入手可能であり（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ３９３７３）、ＰＣＲ増幅される。
一実施形態において、本発明は、下等真核生物細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。ここでこの糖タンパク質は、トリマンノースまたはトリマンノシル（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）コア構造上に二分しているＧｌｃＮＡｃを示すＮ−グリカンを含む。この実施形態において、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（これは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（「ＧｎＴＩ」）活性とトリマンノースコアとを反応させることにより生成され得るが、代表的には、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をα−１，３−マンノシダーゼ活性／α−１，６−マンノシダーゼ活性（例えば、マンノシダーゼＩＩ）によりトリミングすることにより生成される（Ｈａｍｉｌｔｏｎら．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−４６））。これは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性と反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する。従って、本発明は、ＧｎＴＩＩＩ活性を提供し、この活性は、β−１，４ ＧｌｃＮＡｃを、下等真核生物細胞において二分しているＧｌｃＮＡｃを受容し得る基質上へと転移する。
別の実施形態において、本発明は、下等真核生物（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供し、ここでその糖タンパク質は、トリマンノースコアに結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するトリマンノースまたはトリマンノシル（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）コア構造上に二分しているＧｌｃＮＡｃを示す、Ｎ−グリカンを含む。この実施形態において、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｎＴＩ活性と反応し、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（「ＧｎＴＩＩ」）活性およびＧｎＴＩＩＩ活性（いずれの順でも）と反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する（図３８）。この実施形態の二分型トリマンノシルコア構造がまた、ＧｌｃＮＡｃ残基の代わりにさらなるマンノシル基を含み得ることが、理解されるべきである。例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２は、ＧｎＴＩＩＩ活性と反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を生成し得る。
本発明はまた、下等真核生物（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてよりヒト様の糖タンパク質を生成するための方法を提供し、ここでその生成される糖タンパク質は、ペンタマンノースコア構造（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）に結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有し、かつ二分型Ｎ−グリカンを示す、するＮ−グリカンを含む。従って、この実施形態において、ペンタマンノースコア構造（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）は、ＧｎＴＩＩＩ活性と反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造およびＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する。
代替的実施形態において、ｏｃｈ１遺伝子およびａｌｇ３遺伝子の変異を介して生成されるペンタマンノースコア構造は、α１，２−マンノシダーゼ活性、ＧｎＴＩ活性、ＧｎＴＩＩ活性およびＧｎＴＩＩＩ活性ならびにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを生成する（図３５Ｂ）。別の実施形態において、ペンタマンノースコア構造は、ＧｎＴＩ活性およびＧｎＴＩＩＩ活性と（いずれの順番でもよいし、組み合わせてもよい）反応して、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する（図３７）。
より好ましい実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、以下に記載のように、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５３構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−１（実施例１３）において発現され、それにより、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンを生成する（実施例２０）。図２６（下）は、上記の株（ＰＢＰ２６と名付けられる（図３６））において発現されたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１６６６ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ａ］を示し、このピークは、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対応する（比較のために、図２６（上）は、ｐＶＡ５３構築物を欠いている株ＹＳＨ−１において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。１４６１ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｄ］は、非修飾グリカン：ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対応する）。従って、一実施形態において、本発明の宿主は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する、少なくとも５０モル％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造または少なくとも５０モル％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。そのグリカンのモル％は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出される総中性グリカンの％に関する。例えば、二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、標的タンパク質上に少なくとも２０％で生成され、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が標的タンパク質上に２５％で生成される場合、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する一時的に生成されるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の総量は、４５％であることが、理解される。なぜなら、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｎＴＩＩとさらに反応する）の生成物であるからである。
同様に、別の実施形態において、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（１）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５５構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−１）において発現され、それによって、Ｎ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２および二分型Ｎ−グリカンＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する。図２７（下）に示されるように、これらの構造は、それぞれ、１４６３ｍ／ｚおよび１６６７ｍ／ｚにおけるピークに対応しする（比較のために、図２７（上）は、ｐＶＡ５３構築物を欠いている株ＹＳＨ−１において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。その優勢なピークは、１４６１ｍ／ｚにおける修飾ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する）。従って、別の実施形態において、本発明の宿主は、少なくとも一時的に、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する、少なくとも２０モル％ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造または少なくとも２０モル％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を示すＮ−グリカンを生成するその能力によって、特徴付けられる。
なおより好ましい実施形態において、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５３構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−４４（実施例１５）において発現され、それにより、二分型ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンを生成する（実施例２０）。図３０は、上記の株（ＹＳＨ−５７と名付けられる）において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１５４２ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｙ］を示し、二分型グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する（比較のために、図２９は、ｐＶＡ５３構築物を欠いている株ＹＳＨ−４４において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。図２９の１３５６ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｘ］は、修飾グリカン：ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する）。従って、一実施形態において、本発明の宿主は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する、少なくとも８０モル％のＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成するその能力によって、特徴付けられる。そのグリカンのモル％は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出される総中性グリカンのパーセントに対する。
あるいは、別の実施形態において、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（ＧｎＴＩＩＩΔ３２）に融合されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＶＡ５３構築物は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＰＢＰ６−５）（実施例１１）において発現され、それによって、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造および二分型ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する、Ｎ−グリカンを生成する。図３２に示されるように、これらの構造は、それぞれ、１３４０ｍ／ｚおよび１５４３ｍ／ｚにおけるピークに対応する。従って、別の実施形態において、本発明の宿主は、ａｌｇ３変異宿主細胞において二分しているＧｌｃＮＡｃを有する少なくとも２０モル％のＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成するその能力によって、特徴付けられる。
本発明は、下等真核生物においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供し、ここでその糖タンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を含み、そしてそのコア構造は、２以上のＧｌｃＮＡｃでさらに修飾される。本発明のいくつかの実施形態において、そのコア構造の１０％以上は、２以上のＧｌｃＮＡｃで修飾される。他の好ましい実施形態において、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上の上記コア構造が、そのように修飾される。非常に好ましい実施形態において、それらのＧｌｃＮＡｃのうちの１つは、二分しているＧｌｃＮＡｃである。
本発明の別の局面において、少なくとも１つのＧｎＴＩＩＩ触媒ドメインをコードするコンビナトリアル核酸ライブラリーが、下等真核生物宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を発現するために使用される（実施例１８）。好ましくは、本発明のライブラリーは、単一の核酸分子にインフレームで融合されたリーダー配列のサブライブラリー、またはＧｎＴＩＩＩ配列を含む核酸分子のサブライブラリーを含み、これらの核酸分子のうちの１つ以上が、宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を有する触媒ドメインをコードする。あるいは、単一の核酸分子またはリーダー配列を含む核酸分子のライブラリーは、ＧｎＴＩＩＩ配列を含む核酸分子のサブライブラリーにインフレームで融合され、これらの核酸分子のうちの１以上が、宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を有する触媒ドメインをコードする（以下を参照のこと）。これらおよび他のこのようなコンビナトリアルライブラリーの発現は、標的糖タンパク質を発現する宿主細胞において行われ、その標的糖タンパク質のＮ−グリカン構造が、ＧｎＴＩＩＩが発現されるか否か、およびどの程度発現されるかを決定するために、分析される。広い範囲の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩ酵素が、本発明の方法およびライブラリーを使用して宿主細胞において発現されう得る。当業者が、宿主細胞において、ほとんどまたは全く活性を有さないＧｎＴＩＩＩ酵素と、活発に発現されて優勢なレベルの望ましい二分型オリゴ糖中間体（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を生成する酵素との間を作りだして示すことを可能にするのが、本発明のこの局面である。
以下にさらに記載されるように、グリコシル化経路における所定の工程を担う酵素を適切な細胞下位置に適切に標的化すること、およびその細胞下位置の特定のｐＨにおいて酵素活性が十分であることは、望ましい構造を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質の生成において重要な要因である。酵素キメラの多様な集団を生成するための融合タンパク質のコンビナトリアルライブラリーの使用、および形質転換細胞におけるこれらのライブラリーのスクリーニングは、適切な位置において目的の活性を有する宿主株を同定するための強力な方法を提供する。本発明の好ましい実施形態において、その酵素活性は、宿主細胞において発現されるＮ−グリカン含有糖タンパク質が、分泌プロセスの間にその活性と反応し得るように、位置付けられる。
リーダー／触媒ドメインの全ての組み合わせが、望ましい酵素活性を生じるわけではない。しかし、広く種々のリーダー／触媒ドメインの組み合わせが作り出され、そのうちのごくわずかが、本発明で望ましい中間体を生成するにあたって有用であり得る。本発明は、にもかかわらず、例示される宿主細胞において望ましい酵素活性を現在は示さない組み合わせもなお包含する。図２８（下）は、ＧｎＴＩＩＩ活性を容易には示さない、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｙ８Ｈ−１において発現されるマウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＩＩドメイン（ＧｎＴＩＩＩ Δ３２）に融合されたＫ．ｌａｃｔｉｓ ＧＮT（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１０６０８０）を含むｐＶＢ５１構築物を示す（比較のために、図２８（上）は、ｐＶＡ５３構築物を欠いている株ＹＳＨ−１において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。その優勢なピークは、１４６１ｍ／ｚにおける非修飾ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。図２８（下）の１４６３ｍ／ｚにおける優勢なピーク（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２，の質量に相関する）が、観察される。１７２６ｍ／ｚにおける第２のピーク（これは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の質量に相関しない）もまた、観察される。例えば、他の宿主細胞（ヒト様糖形態を生成するように改変された宿主細胞を含む）において、これらおよび他のこのような組み合わせが発現される場合、これらの組み合わせは、当該分野で周知の技術を使用して改変しても改変しなくても有用であり得ることが、予測される。
酵素キメラの多様な集団を生成するためのコンビナトリアルライブラリーの使用、および形質転換細胞におけるこれらのライブラリーのスクリーニングにより、その酵素活性が実質的に細胞内にある株が同定されることが、さらに可能になる。以下の実施例６は、細胞外α−１，２−マンノシダーゼ活性を測定するために有用なアッセイ条件の例を提供する。実施例２２および２３はまた、培地中でのグリコシルトランスフェラーゼ活性（ＧｎＴＩＩＩ）についてのアッセイの例を提供する。以下の表９、およびＣｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２２−２７もまた参照のこと。本発明の目的のために、酵素活性は、その酵素活性の１０％未満が細胞外培地において測定可能である場合に、実質的に細胞内にある。
実施例１１、１２、１３、１４、１５、および１９〜２１において記載される場合、宿主細胞は、望ましい糖質構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を有するＮ−グリカンを生成するために、適切なグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）の発現によって操作され得る。その宿主細胞における（例えば、以下およびＣｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２２−２７およびＷＯ０２／００８７９に記載される、核酸分子または核酸分子のライブラリーを標的化することによる）ＧｎＴの発現は、その改変された宿主細胞が中間のマンノース上に二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを生成することを可能にする。これらの構造は、本発明の方法をさらに使用して、宿主細胞の分泌経路に入るタンパク質上にヒト様Ｎ−グリカンを生成するようにプロセシングされ得る。
より好ましい実施形態において、適切なＵＤＰ−糖−トランスポーターおよびＵＤＰ−糖−トランスフェラーゼの同時発現は、末端のα−１，６残基およびα−１，３残基、ならびにＧｌｃＮＡｃを有する中間のマンノースをキャップし、哺乳動物型の複合Ｎ―グリコシル化（例えば、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）および混成型Ｎ−グリコシル化のための前駆体を生じる。これらのペプチド結合Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、次いで、哺乳動物型オリゴ糖構造に対するさらなる修飾のための前駆体として働く。ガラクトシルトランスフェラーゼのその後の発現、および末端にシアリル酸を転移する能力を遺伝的に操作すること（図１Ｂを参照のこと）は、哺乳動物型（例えば、ヒト様）Ｎ−グリカン構造を生成する。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性を有する宿主の操作または選択）
本発明は、糖ヌクレオチドＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下でオリゴ糖のＭａｎα１，６アームおよび／またはＭａｎα１，３アーム上でのＧｌｃＮＡｃβ１，４グリコシド結合またはＧｌｃＮＡｃβ１，６グリコシド結合の形成を触媒する、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する新規な下等真核生物宿主を提供する。そのＧｌｃＮａｃ残基の転移は、一般的には、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの存在下が好ましい。本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする組換え核酸分子、および酵母分泌経路において活性な酵素を発現するための方法を提供する。さらに、本発明は、治療投与のために有用な形質転換細胞から生成されるオリゴ糖構造を提供する。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性によりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから上記オリゴ糖基質上へと糖ＧｌｃＮＡｃを転移するのを触媒することによって、複数のアンテナを有する糖形態が、タンパク質上に形成され、その後、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼによって伸長される。
本発明はさらに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性（全長の酵素、そのホモログ、改変体、誘導体、および触媒的に活性なフラグメントを含む）を発現することによって、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。一実施形態において、宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸの活性の活性化によってかまたはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸの活性を核酸分子から発現することによって、よりヒト様のＮ−グリカンを生成するように操作される（図３９）。当該分野で周知の技術を使用して、遺伝子特異的プライマーは、グリコシルトランスフェラーゼファミリーのメンバー（例えば、ＧｎＴ ＩＶ遺伝子配列、ＧｎＴ Ｖ遺伝子配列、ＧｎＴ ＶＩ遺伝子配列、ＧｎＴ ＩＸ遺伝子配列）の相同領域にハイブリダイズするように設計される。これらの配列は、当該分野で容易に入手可能であり（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース）、ＰＣＲ増幅される。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶの発現）
本発明の一局面において、下等真核生物が、オリゴ糖構造のＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＡｓｎのＭａｎα１，３アーム上での糖残基β（１，４）Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）の付加を触媒する酵素Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ（「ＧｎＴ ＩＶ」）をコードするヌクレオチド配列で形質転換される。アクセプター糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のＭａｎα１，３アーム上への、ＧｎＴ ＩＶによるＧｌｃＮＡｃβ１，４の付加により、いわゆるトリアンテナＮ−グリカンが生じる。
一実施形態において、本発明は、下等真核生物細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてヒト様糖タンパク質を生成するための方法を提供する。ここでこの糖タンパク質は、オリゴ糖構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）上にあるトリアンテナＮ−グリカン構造を含む。この実施形態において、上記オリゴ糖構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００３ Ａｐｒ ２９；１００（９）：５０２２〜７）が、α−１，３−マンノシダーゼ活性／α−１，６−マンノシダーゼ活性（例えば、マンノシダーゼＩＩ）によりトリミングすることにより生成される（Ｈａｍｉｌｔｏｎら．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−４６））。これは、次に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性と反応して、トリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する（図３９）。好ましい実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ（ｓ）標的化ペプチド配列のヌクレオチド１〜１０８にインフレームで連結されているヒトＧｎＴ ＩＶをコードする遺伝子フラグメント（図４２）が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４中に導入されてその中で発現される（実施例１５）。従って、特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％以上の望ましいＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を好ましくは示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。なおより好ましい実施形態において、オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応の基質である。従って、本発明は、下等真核生物において、オリゴ糖基質上にＧｌｃＮＡｃ残基を転移して、オリゴ糖基質（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のＭａｎα１，３アーム上でＧｌｃＮＡｃβ１−４グリコシド結合を形成するのを触媒する、ＧｎＴ ＩＶ活性を提供する。
より好ましい実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＩＶドメイン（ＧｎＴＩＶ Δ１０４）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＰＢ１４４構築物（図４０Ａ）が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−４４（実施例１５）において発現され、それにより、トリアンテナＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する（実施例２５）。図４７は、ＰＢＰ４３と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１５４３ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｙ］を示し、このピークは、トリアンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する（比較のために、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成するＹＳＨ−４４において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す、図２９を参照のこと）。従って、特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも５０モル％のＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を好ましくは示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも６０モル％、７０モル％、８０モル％、より好ましくは９０モル％以上の量で、ＧｎＴＩＶにより触媒されるトリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する。本明細書全体を通して、上記グリカンのモル％は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより検出される総中性グリカンのパーセントに関する。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶの発現）
本発明の別の局面において、下等真核生物宿主細胞が、トリアンテナオリゴ糖構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を生成するように操作または選択され、この宿主細胞は、オリゴ糖構造のＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４（ＧｌｃＮＡｃβ１，２）Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＡｓｎのＭａｎα１，６アーム上での糖残基β（１，６）Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）の付加を触媒する酵素Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ Ｖ」）をコードする核酸配列で形質転換される。ＧｌｃＮＡｃ残基の存在下でのアクセプター糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）の、ＧｎＴ ＶによるＧｌｃＮＡｃβ１，６の付加により、テトラアンテナＮ−グリカンであるＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が生じる。好ましくは、本発明のＧｎＴ Ｖ活性が、トリアンテナグリカンを生成する下等真核生物宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４３）において発現され、この宿主細胞において、オリゴ糖基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎα１，６アーム上へＧｌｃＮＡｃ残基を転移してＧｌｃＮＡｃβ１，６グリコシド結合を形成するのをＧｎＴ Ｖ活性が触媒する、
一実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、ＧｎＴＩＶＢ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融合構築物およびＧｎＴＶ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融合構築物で形質転換される。図４９は、ＰＢＰ４６と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１７４７ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｚ］（このピークは、テトラアンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する）および１５４３ｍ／ｚにおける残基ピーク［ｙ］（このピークは、トリアンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する）を示す。
別の実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、ＧｎＴＩＶＡ（Δ８２）／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融合構築物を含むプラスミドｐＰＢ１２８と、ＧｎＴＶ（Δ１４５）／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）融合構築物を含むプラスミドｐＰＢ１４０との、酵素およびリーダー融合物の異なる組み合わせで形質転換される。図５０は、ＰＢＰ９４と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１７４７ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｚ］を示し、このピークは、テトラアンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。
従って、特定の実施形態において、本発明は、少なくとも５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％以上の望ましいＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって特徴付けられる、宿主細胞を提供する。より好ましい実施形態において、ＧｎＴＩＶ活性およびＧｎＴＶ活性を発現することによって、上記宿主細胞は、望ましい複数のアンテナを有するＮ−グリカン構造を生成する。
リーダー／触媒ドメインの全ての組み合わせが、複数のアンテナを有するグリカン構造の生成において望ましい酵素活性を生じるわけではない。本発明の方法およびライブラリーを使用して、広く種々のリーダー／触媒ドメインの組み合わせが作り出され、そのうちのごくわずかが、本発明で望ましい中間体を生成するにあたって有用であり得る。本発明は、にもかかわらず、例示される宿主細胞において望ましい酵素活性を現在は示さない組み合わせもなお包含する。例えば、他の宿主細胞（ヒト様糖形態を生成するように改変された宿主細胞を含む）において、これらおよび他のこのような組み合わせが発現される場合、これらの組み合わせは、当該分野で周知の技術を使用して改変しても改変しなくても有用であり得ることが、予測される。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶの発現）
本発明の別の実施形態において、ＧｎＴＶ活性をコードする核酸が、コアＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する宿主において発現されて、トリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の形成がもたらされる。公知のＧｎＴＶ配列が、図４３において提供される。一実施形態において、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を使用して、マウス由来の触媒的に活性なＧｎＴＶドメイン（ＧｎＴＶ Δ１４５）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むｐＰＢ１４０構築物（図４０Ｂ）が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−４４（実施例１５）において発現され、それにより、トリアンテナＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する（実施例２５）。図４８は、ＰＢＰ３２と呼ばれる形質転換株において発現されたクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。これは、１５５９ｍ／ｚにおいて優勢なピーク［ｙ］（このピークは、テトラアンテナＮ−グリカン構造に対応する）および１３５５ｍ／ｚにおける第二ピーク［ｕ］（これは、トリアンテナＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する）（比較のために、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成するＹＳＨ−４４において発現されるクリングル３タンパク質から遊離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す、図２９を参照のこと）。従って、特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも４０モル％のトリアンテナ構造ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。好ましくは、本発明の宿主は、少なくとも５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％以上の、ＧｎＴＶにより触媒されるトリアンテナ構造を生成する。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩの発現）
本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ「ＧｎＴＶＩ」）活性をコードする核酸で形質転換された下等真核生物宿主細胞も提供し、この活性は、オリゴ糖構造のＧｌｃＮＡｃβ１，４（ＧｌｃＮＡｃβ１，２）Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４（ＧｌｃＮＡｃβ１，２）Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＡｓｎのＭａｎα１，６アーム上での糖残基β（１，４）Ｎ−アセチルグルコサミンの転移を触媒する。アクセプター糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）への、ＧｎＴ ＶＩによるＧｌｃＮＡｃβ１，４の付加により、いわゆるペンタアンテナＮ−グリカンが生じる。ＧｌｃＮＡｃ残基の付加により、オリゴ糖基質上にＧｌｃＮＡｃβ１，４グリコシド残基が形成される。一実施形態において、ＧｎＴＶＩ活性をコードする核酸が、ペンタアンテナＮ−グリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を生成する宿主において発現される。別の実施形態において、ＧｎＴＶＩ活性をコードするＤＮＡフラグメント（例えば、図４４において示される）を使用して、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ由来の触媒的に活性なＧｎＴＶＩドメインに融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００９５７１）を含むプラスミド構築物が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−４４において発現され、それにより、ペンタアンテナＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する。従って、本発明の宿主細胞は、検出可能な部分でペンタアンテナＮ−グリカン生成するＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。
（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸの発現）
別の実施形態において、ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＮ ＮＰ＿９４５１９３）が、宿主細胞において発現され、この宿主細胞において、ＧＮＴＩＶも、ＧＮＴＶも、ＧｎＴＶＩもない状態で複合グリカンアクセプター基質（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）上へのＧｌｃＮＡｃ残基の転移をＧｎＴＩＸ活性が触媒する。ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸（これは、通常は、脳において独占的に発現されるようである）は、ＣＨＯマウス細胞において独特なＮ結合型オリゴ糖の合成を触媒することが示されている（Ｒａｊｕら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，１４０９０〜１４０９８）。組換えヒトＧｎＴＩＸの発現は、ＧｎＴＶ活性を示し、β１，６結合を介してオリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＡのα１，６結合マンノースアームの６−ＯＨ位置へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒し、それに加えて、α１，３結合マンノースアーム上で作用した（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｏｃｔ ３１；２７８（４４）：４３１０２〜９）。ＧｎＴＩＸは、配列ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１におけるマンノースの６−ＯＨ位置へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒することが可能である。
従って、本発明は、ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸（図４５）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてテトラアンテナグリカン構造を生成する方法を提供する。好ましくは、ＧｎＴＩＸ活性の導入および発現によって、アクセプター基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２上へとＧｌｃＮＡｃ残基が転移されてＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が生成されるのを触媒する。ＧｎＴＩＸ活性の宿主発現は、コアＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖基質のＭａｎα１，３アームおよびＭａｎα１，６アームの好ましくは両方の６−ＯＨ位置にＧｌｃＮＡｃ残基が転移するのを触媒する。一実施形態において、アクセプター基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成する宿主細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４）が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）リーダーにインフレームで融合されたＧＮＴＩＸ活性（Δ４３）をコードする遺伝子を含むプラスミド（例えば、ｐＢ１７６）で形質転換される（実施例２９）。その宿主細胞は、β１，６結合を介してオリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のα１，６結合マンノースの６−ＯＨ位置へのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒し、さらに、そのオリゴ糖基質のα１，３結合マンノースに対して作用する、好ましくは少なくとも５モル％以上のＧｎＴＩＸ活性を示すＮ−グリカンを少なくとも一時的に生成する能力によって、特徴付けられる。
さらに、ＧｎＴＩＸ活性をコードする核酸が、周知の手順を使用して、酵母における翻訳効率についてコドンを最適化され得る。図４６は、ＰＣＲを使用してオリゴヌクレオチドから合成されたＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＧｎＴＩＸの一部をコードする、コドンを最適化されたＤＮＡフラグメントを提供する。
（複数のアンテナを有するグリカンの変化形）
本発明は、治療目的のために適切な種々の複数のアンテナを有するグリカンを生成するように適合される。同じＧｌｃＮＡｃβ結合を有するグリカンは、そのタンパク質の半減期を増加し得ることが、企図される。従って、本発明は、トリマンノースコアオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡＣ残基を有するＮ−グリカンを含む、下等真核生物宿主細胞を提供する。一実施形態において、その下等真核生物宿主は、トリマンノースコアオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６アーム上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃβ１，４残基を含む。別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、トリマンノースコアオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６アーム上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃβ１，６残基を含む。なお別の実施形態において、その下等真核生物宿主細胞は、トリマンノースコアオリゴ糖中間体（例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６アーム上に少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃβ１，２残基を含む。
下記のように、下等真核生物宿主細胞は、本発明の方法を使用して治療タンパク質を生成するために好ましい宿主ではあるが、本発明はまた、任意の真核生物宿主細胞（好ましくは、非ヒト（例えば、哺乳動物）宿主細胞）において生成される糖タンパク質のＮ−グリカン形態を改変するためにも有用である。
（本発明の宿主細胞）
本発明の好ましい宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、酵母、単細胞および多細胞または糸状真菌）である。しかしながら、広範な種々の宿主細胞が、本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従って、ヒト様糖タンパク質を発現するように操作され得る。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク質を発現させる得る。当業者が認識するように、（ヒト細胞を含めた）任意の真核生物宿主細胞は、本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、１以上のキメラタンパク質を発現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強される宿主細胞における細胞下位置（例えば、オルガネラ）に標的化される。そのようなタンパク質は、好ましくは、本明細書中で例示したように、タンパク質グリコシル化に関与する酵素であるが、必ずしもそうではない。任意のタンパク質コード配列も、本明細書中に記載された方法を用いて、標的化され得、そして真核生物宿主細胞において修飾された活性について選択され得ることが予測される。
結合されたＮ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖タンパク質を生産することができる下等真核生物が特に有用である。何故ならば、（ａ）高度なマンノシル化を欠き（例えば、Ｎ−グリカン当たり８マンノースを超え、または特に３０〜４０マンノース）、それらはヒトにおいて低下した免疫原性を示し；そして（ｂ）Ｎ−グリカンは、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によって（図１Ｂ；β１，２ＧｎＴＩ）、なおよりヒト様のグリコ形態を形成するためのさらなるグリコシル化反応のための基質であるからである。３０モル％より大きい、より好ましくは５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、または１００モル％さえの、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンを持つ糖タンパク質の収率が得られる。好ましい実施形態において、５０％を超えるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造が、ＧｎＴＩ活性に対する基質であり、インビボにてそのような基質として働くことができることが示される。
本発明の好ましい下等真核生物としては、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ（例えば、Ｏｇａｔａｅ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。
各上記実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２で富化された宿主細胞を作製することに関する。これらの構造は望ましい。何故ならば、それらは、次いで、例えば、ＭａｒａｓおよびＣｏｎｔｒｅｒａｓ、米国特許第５，８３４，２５１号の方法を用い、インビトロでの処理によってプロセシングされ得るからである。しかしながら、好ましい実施形態においては、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化された前駆体は−−グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩ）で−−インビボでの少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応によって処理されて、ヒト様Ｎ−グリカンを生じる。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が富化されたオリゴ糖前駆体は、好ましくは、Ｘが３、４または５であり、好ましくは３であるＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するものへとプロセシングされる。Ｘが３より大きなＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮ−グリカンは、例えば、適用可能であれば、α−１，３マンノシダーゼ活性および／またはα−１，６マンノシダーゼ活性での処理によって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換することができる。グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を生じ、これは、次いで、所望であれば、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ（後記参照）を含めたさらなるグリコシル化酵素の宿主細胞におけるエキソビボ処理によって、または異種発現によって修飾して、ヒト様Ｎ−グリカンとなることができる。
本発明に従って生産することができる好ましいヒト様糖タンパク質は、７以下、または３以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含むもの；およびガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、およびフコースよりなる群から選択される１以上の糖を含むものを含む。
本発明の別の好ましい非ヒト宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、単細胞または糸状の真菌）であり、これは、１種以上のａｌｇ遺伝子活性（ａｌｇ活性に対するホモログまたは等価物である酵素活性を含む）の活性が減少または除去されている。本発明の別の好ましい宿主細胞は、脂質結合オリゴ糖構造のα−１，６アームをマンノシル化する１種以上の酵素の活性（ａｌｇ活性以外）が減少または除去されている。
下等真核生物宿主細胞が好ましいが、上記の特性を有する広範な種々の宿主細胞は、本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞は、本発明に従ってヒト様糖タンパク質を発現するように操作することができる。同様に、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞は、本発明の方法を用い、よりヒト様の糖タンパク質を発現するように改変することができる。適当な宿主細胞が操作され得るか、あるいは酵母において既に記載された多くのそのような変異体の１つが用いられ得る。本明細書中で例示したように、本発明の好ましい宿主細胞は、ａｌｇ３を欠失するようにさらに改変されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける高マンノシル化−マイナス（ＯＣＨ１）変異体である。
本発明は、二分型Ｎ−グリカン（例えば、二分型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、および好ましくはＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を有する糖タンパク質を生成し得る下等真核生物宿主細胞をさらに提供する。本発明の好ましい実施形態において、その宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を含む。より好ましい実施形態において、その宿主細胞は、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＶ、およびＧｎＴＶから選択される１種以上の活性をさらに含む。好ましい宿主細胞は、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩを発現する。他の好ましい宿主細胞は、ＧｎＴＩＶおよび／またはＧｎＴＶをさらに発現する。なおより好ましくは、その宿主細胞の１種以上のＧｎＴ活性は、実質的に細胞内活性である。
従って、本発明の好ましい実施形態において、１種以上のＧｎＴ活性を含む宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ酵素活性と反応して、対応する二分型Ｎ−グリカンを生成し得る構造（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が挙げられるが、これらに限定されない）を含むＮ−グリカンを生成する。その酵素活性は、それにより、これらのＮ−グリカンを含む糖タンパク質を、新たなかつより望ましい特性を有する形態に変換する。ＧｎＴＩＩＩは、哺乳動物細胞においてさらなるＧｎＴ活性を阻害することが現在理解されているので、当業者は、その連続的なグリコシル化反応が、重要であっても重要でなくてもよいことを理解するはずである。しかし、本発明は、いずれの順でも、あるいは一緒でもＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩＩの付加を意図する。その細胞内の他の酵素活性（例えば、１種以上の望ましいマンノシダーゼ活性（例えば、α１，２マンノシダーゼ、マンノシダーゼＩ、マンノシダーゼＩＩ））が、ＧｎＴ活性と協働して、目的のさらに他のヒト様糖タンパク質を生成するように作用し得る（図１Ｂを参照のこと）こともまた、理解されるべきである。
好ましい実施形態において、マンノシダーゼＩＩまたはその触媒的に活性なフラグメントは、二分型５マンノースコア構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）のα１，３マンノースを含むアームおよびα１，６マンノースを含むアームを切り取るために、宿主細胞に導入される。得られたグリカン（例えば、二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）は、その後のヒト様Ｎ−グリカン修飾のための好ましい基質である。
本発明の別の実施形態において、その宿主細胞は、２つ以上のＧｌｃＮＡｃにより修飾される、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を含む。いずれのコア構造も、ＧｌｃＮＡｃによる修飾に加えて、さらなる修飾を含み得ることが理解されるべきである。好ましくは、１０％以上のコア構造が、ＧｌｃＮＡｃにより修飾される。最も好ましくは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上のコア構造が、ＧｌｃＮＡｃ修飾を含む。
（複合Ｎ−グリカンの形成）
複合Ｎ−グリカン合成の形成は、それにより特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖構造に結合される連続的プロセスである。高等真核生物においては、これは、基質を種々のプロセシング酵素に連続的に暴露させることによって達成される。これらの酵素は、全プロセシングカスケード内のそれらの特定の位置に依存して、特異的反応を行う。この「組立てライン」はＥＲ、初期ゴルジ、ゴルジ中間嚢および後期ゴルジ、ならびにトランスゴルジネットワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物のゴルジおよびＥＲにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよびトランスポーター）が発現され、これらのオルガネラへ、好ましくは、それらが、それらの環境ならびに経路における他の酵素に対して最も効率的に機能するような位置に特異的に標的化されなければならない。
本明細書中で記載した方法の１つの目標は、産業醗酵プロセスにおいてよく行うことができる頑強なタンパク質生産株を達成することにあるので、複数の遺伝子の、宿主細胞染色体への組込みは、注意深い計画を含む。上記したように、非ヒトグリコシル化反応に特徴的であることが知られている酵素をコードする１以上の遺伝子は、好ましくは、欠失される。操作された細胞株は、所望の活性をコードするある範囲の異なる遺伝子で形質転換され、これらの遺伝子は安定な様式で形質転換され、それにより、所望の活性が醗酵プロセスを通じて維持されるのを保証する。
以下の酵素活性のいずれの組合せも、本発明の方法を用いて単一でまたは複数で宿主中へ操作することができる：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲ特異的トランスポーターおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体に対するｓｙｎポートトランスポーターおよびアンチポートトランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、ならびにＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素。好ましくは、酵素活性を、１以上の核酸分子に導入することができる（下記も参照）。核酸分子は単一でまたは複数で、例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーのような核酸ライブラリーの意味で導入することができる。しかしながら、単一または複数の酵素活性を、限定されるものではないが、タンパク質送達方法および／または本発明の核酸ライブラリーもコンビナトリアルライブラリーも必ずしも用いることのない１以上の核酸分子の使用を含めたいずれかの方法で宿主細胞に導入することができることが、理解されるべきである。
（複合Ｎ−グリカンを生産するためのグリコシルトランスフェラーゼの発現）
ＤＮＡ配列情報を用い、当業者はＧｎＴ活性をコードするＤＮＡ分子をクローン化することができる（例えば、実施例３、８、１１、１５および１８）。当業者に周知である標準的な技術を用い、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶまたはＧｎＴＶをコードする（またはその触媒的に活性なフラグメントをコードする）核酸分子を、本明細書中に記載されたように、プロモーター、および本発明の選択された宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種のような真菌宿主）において転写を駆動することができる他の発現制御配列の転写制御下にある適当な発現ベクターに挿入することができ、従って、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素の１以上を、ヒト様複合型糖タンパク質の生産のために選択された宿主細胞で活発に発現させることができる（例えば、実施例８、２０、および２１）。
数個の個々のグリコシルトランスフェラーゼが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴＩ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴＩ）および他の真菌においてクローン化され、そして発現されているが、生物のグリコシル化パターンに対する「ヒト化」の所望の結果を証明しない（Ｙｏｓｈｉｄａら．（１９９９） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（１）：５３−８； Ｋａｌｓｎｅｒら．（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０−３７０）。そのようなグリコシルトランスフェラーゼの作用によって糖を許容するのに必要な炭水化物構造は十分な量で存在せず、それは複合Ｎ−グリカン形成の欠如に最も寄与したようであると推測された。
本発明の好ましい方法は、初期ゴルジ、ゴルジ中間嚢または後期ゴルジ装置における、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩのような他のＧｎＴの機能的発現を提供し、そして（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現によって；後記の実施例を参照）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を保証する。
（糖ヌクレオチド前駆体をゴルジ装置に提供するための方法）
グリコシルトランスフェラーゼがゴルジにおいて満足して機能するためには、酵素は、新成糖タンパク質に付加される糖部分の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖の十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトースなど）は、一般には、サイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される。
下等真核生物のような非ヒト宿主細胞においてこのプロセスを複製するためには、糖ヌクレオシド特異的トランスポーターがゴルジで発現されて、ヌクレオシド糖前駆体の適切なレベルが確保されなければならない（ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８１） Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；ＰｅｒｅｚおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３８：７０９−７１５）。ヌクレオチド糖は、例えば、宿主微生物において糖ヌクレオチドトランスポーターをコードする外因性遺伝子を発現させることによって、適切な区画に提供され得る。トランスポーター酵素の選択は、用いられる外因性グリコシルトランスフェラーゼの性質によって影響される。例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを必要とし得、フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコーストランスポーターを必要とし得、ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを必要とし得、そしてシアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを必要とし得る。
付加されたトランスポータータンパク質は、ヌクレオチド糖をサイトゾルからゴルジ装置へ運び、そこで、ヌクレオチド糖はグリコシルトランスフェラーゼによって反応して、例えば、Ｎ−グリカンを伸長させ得る。この反応は、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸（例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰまたはＣＭＰ）を遊離する。ヌクレオシド一リン酸は、アンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換においてゴルジから直接的に輸出することができる。しかしながら、ヌクレオシド二リン酸の蓄積は、グリコシルトランスフェラーゼのさらなる活性を阻害する。この反応は、効率的なグリコシル化のために重要なようであるので、ヌクレオチド二リン酸をコードする遺伝子の発現されたコピーを提供するのがしばしば望ましい。（適切にはＵＤＰまたはＧＤＰに特異的な）ジホスファターゼはジホスホヌクレオシドを加水分解して、ヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じる。
典型的には哺乳動物起源である適当なトランスポーター酵素は後記する。そのような酵素は、本発明の方法を用い、選択された宿主細胞に操作することができる。
別の例において、α２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６−シアリルトランスフェラーゼは、ガラクトース残基を、ヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおいてシアル酸でキャップを施し、糖タンパク質の成熟形態に導く（図１Ｂ）。このプロセシング工程を、代謝的に操作された酵母または真菌へ再度操作することは、酵母の後期ゴルジにおいて、（１）α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性および（２）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給を必要とする。後期ゴルジにおいて十分なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を得るためには、例えば、（例えば、ヒト由来の）公知のシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、真菌における後期ゴルジに向けられなければならない（上記参照）。同様に、トランスポーターは、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の輸送を可能とするように操作されなければならない。現在、真菌が十分量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成し、またはそれをゴルジに輸送さえできることを示すものはない。その結果、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の適切な供給を確保するためには、真菌へのＣＭＰ−シアル酸の生産を代謝的に操作しなければならない。
（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン）
発現Ｓ配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性サーチを介して認識された、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターのｃＤＮＡがクローン化されている（Ｉｓｈｉｄａ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）由来のｃＤＮＡでの表現型修正によってクローン化された（Ｇｕｉｌｌｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。結果は、哺乳動物ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター遺伝子が、タンパク質が発現されて酵母のゴルジ装置へ機能的に標的化されるために必要な情報の全てを有すること、および非常に異なるアミノ酸配列を持つ２つのタンパク質が、同一ゴルジ膜内の同一溶質を輸送し得ることを示す（Ｇｕｉｌｌｅｎら．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
従って、例えば、（１）それによって形質転換された構築物が細胞中に維持される領域（例えば、複製起点、または染色体組込みを媒介する領域）、（２）ｕｒａ３またはＴ−ｕｒｆｌ３（Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍら．（２００１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１（２）：３０６−１０）または他のよく特徴付けられた選択マーカー（例えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、Ｓｈ ｂｌｅなど）のような逆選択マーカーおよびリサイクル可能マーカーを含めた、形質転換されている細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子、（３）機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする遺伝子またはそのフラグメント（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来（Ａｂｅｉｊｏｎ， （１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）、またはＨ．ｓａｐｉｅｌｓ由来（Ｉｓｈｉｄａ ら．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０（６）：１０７８−８））、および（４）上記した局在化／触媒ドメイン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーターを含み得る核酸構築物によって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現を宿主細胞に取込むことができる。
（ＧＤＰ−フコース）
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコーストランスポーターは、ＰｕｇｌｉｅｌｌｉおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００）によって同定され、精製されている。対応する遺伝子は同定されていないが、Ｎ末端配列決定は、対応する遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブの設計で用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。
（ＵＤＰ−ガラクトース）
２つの異種遺伝子、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のα１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，２ ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２（＋）、およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）トランスポーターをコードする（ｈＵＧＴ２）は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシル化とＵＤＰ−ガラクトース輸送活性との間の相関は、α１，２ＧａｌＴよりはむしろＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターの外因的供給がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける十分なガラクトシル化についての鍵となる役割を演じたことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９（２）：１３３−１４１）。同様に、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターが、クローニングされた（Ｓｅｇａｗａ（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５１（３）：２９５−２９８）。
（ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸））
ヒトＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）はクローン化され、Ｌｅｃ８ ＣＨＯ細胞で発現されている（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２６（５）：９４０−５０； Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８（１）：１８７−９２）。マウスＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの機能的発現はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２６１６−９）。シアル酸はいくつかの真菌で見出されているが、選択された宿主系が十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給できるかは明らかでない。シアル酸は培地または、別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路いずれかに供給することができ、また宿主ゲノムに組込むこともできる。
（ジホスファターゼの発現）
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸いずれかが糖ヌクレオチド前駆体から遊離される。一リン酸はアンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）はホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなければならない。この反応は十分なグリコシル化のために重要であるようである。というのは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＧＤＰａｓｅはマンノシル化で重要であることが判明しているからである。しかしながら、この酵素はＵＤＰに向けての活性の１０％を有するに過ぎない（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有しない。というのは、それらはゴルジにおける糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ガラクトース残基を（ＵＤＰ−ガラクトースからの）細胞壁多糖に加える酵母）は、特異的ＵＤＰａｓｅ活性を有することが判明しており、これは、さらに、そのような酵素についての要件を示唆する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１）。ＵＤＰはグリコシルトランスフェラーゼの強力な阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの腔におけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるのに重要である（Ｋｈａｒａｔａら、（１９７４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：５３７−５６０）。
（核酸分子からの標的化酵素活性を発現させることにより宿主においてＮ−グリカンを改変するための方法）
本発明は、さらに、非ヒト宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産するための方法を提供し、この方法は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の生産のための酵素または複数酵素をコードする１以上の核酸分子を、この細胞に導入する工程を包含する。１つの好ましい実施形態において、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生産に関与する１以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入する。本発明は、加えて、１以上のグリコシル化酵素または活性をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タンパク質を作製する方法に関する。好ましい酵素活性はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、宿主は、１つの活性の産物が別の活性、例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する糖トランスポーター、例えば、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性の基質レベルを増加させる２以上の酵素活性を発現するように選択されるか、または操作される。別の好ましい実施形態において、宿主は、引き続いてのグリコシル化反応を阻害することができる産物を除去する活性、例えば、ＵＤＰ特異的またはＧＤＰ特異的なジホスファターゼ活性を発現するように選択されるかまたは操作される。
本発明の好ましい方法は、宿主細胞において核酸分子からの１以上の酵素活性を発現させることを含み、酵素の触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチド、例えば、通常は触媒ドメインに連結またはそれに会合していない異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質を形成することによって、少なくとも１つの酵素活性を所望の細胞下位置（例えば、オルガネラ）へ標的化する工程を含む。融合タンパク質は、酵素（例えば、グリコシル化酵素）、またはその触媒的に活性なフラグメントをコードする核酸フラグメントへ同一翻訳リーディングフレームにて（「インフレーム」）連結された細胞標的化シグナルペプチドをコードする核酸フラグメントを含む少なくとも１つの遺伝子構築物（「融合構築物」）によってコードされる。
融合構築物またはタンパク質の標的化シグナルペプチド成分は、好ましくは、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、検索シグナル、タイプＩＩ膜タンパク質、タイプＩタンパク質、膜スパニングヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来する。
融合構築物またはタンパク質の触媒ドメイン成分は、好ましくは、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼよりなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性に由来する。触媒ドメインは、好ましくは、酵素が局在化されたオルガネラにおける他の代表的な酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨユニット内にｐＨ最適値を有するか、あるいは５．１と８．０との間のｐＨにおいて最適活性を有する。好ましい実施形態において、触媒ドメインはＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩよりなる群から選択されるマンノシダーゼをコードする。
（グリコシル化酵素の選択：ｐＨ最適値および細胞下位置）
本発明の１つの実施形態において、ヒト様糖タンパク質は、標的化細胞下区画において他の酵素のｐＨ最適値と同様なｐＨ最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素を細胞の細胞下区画に導入することによって、非−ヒト真核生物宿主細胞において効率的に作製される。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよびゴルジ装置において活性はほとんどの酵素は、約６．５と７．５との間にあるｐＨ最適値を有する（表３参照）。タンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ＥＲおよびゴルジの内部ｐＨもまた約６〜８の範囲にある。しかしながら、真菌宿主における組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、ｐＨ５．０程度のｐＨ最適値を有する酵素を導入している（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（１２）：１１７１−１１７７、およびＣｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６２９８−２６３０４）。ｐＨ７．０において、それらのマンノシダーゼのインビトロ決定活性はそれらの使用点、すなわち、Ｎ−グリカン上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の効果的なインビボ生産のための、ＥＲおよび初期ゴルジにおいて不十分な活性であるような１０％未満まで低下される。
従って、本発明の好ましい実施形態は、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒ドメイン）、例えば、α−マンノシダーゼを宿主細胞における細胞下位置（例えば、オルガネラ）へ標的化し、そこで、酵素またはドメインのｐＨ最適値は、同一オルガネラに局在化された他の代表的なマーカー酵素の平均ｐＨ最適値の１．４ｐＨユニット内にある。特定のオルガネラへ標的化されるべき酵素のｐＨ最適値は、同一オルガネラで見出された他の酵素のｐＨ最適値とマッチングさせて、得られた単位酵素当たりの活性を最大化すべきである。表３は、種々の源からのマンノシダーゼの活性およびそれらの各ｐＨ最適値をまとめる。表４は、それらの典型的な細胞下位置をまとめる。
（表３．マンノシダーゼおよびそれらのｐＨ最適値）
Figure 2006518600
 好ましい実施形態において、特定の酵素または触媒ドメインは、通常は酵素ドメインに会合していない細胞標的化シグナルペプチドを含むタンパク質をコードするキメラ融合構築物によって、宿主細胞中の細胞下位置に標的化される。好ましくは、酵素またはドメインは宿主細胞のＥＲ、初期ゴルジ、メディアルゴルジもしくは後期ゴルジ、またはトランスゴルジ装置に標的化される。
より好ましい実施形態において、標的化グリコシル化酵素はマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼである。特に好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、ＥＲまたはシスゴルジに標的化され、そこで、グリコシル化の初期反応が起こる。この方法は非ヒト宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を生産するのに有用であるが、この方法は、ヒト宿主細胞を含めたいずれかの真核生物宿主細胞において糖タンパク質の炭水化物プロフィールを修飾するのにより一般的には有用でもあることを認識されるであろう。
宿主細胞分泌経路のある種のオルガネラにおいてタンパク質の滞留を媒介する標的化配列は周知であり、標的化配列および標的化された酵素の選択用のライブラリーに関して後により詳細に議論するように、科学文献および公のデータベースに記載されている。そのような細胞下標的化配列は、単独、または組合せて用いて、選択されたグリコシル化酵素（またはその触媒ドメイン）を宿主細胞における特定の細胞下位置（すなわち、特に酵素がｐＨ最適値または他の同様な因子の存在に基づいて増強されたまたは最適な活性を有する細胞下位置）に標的化することができる。
高マンノース構造をトリミングして、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置においてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じさせようと試みる場合、例えば、（１）十分に近いｐＨ最適値（すなわち、ｐＨ５．２とｐＨ７．８との間）を有し、そして（２）単独で、または協働して、ＧｎＴＩによるＧｌｃＮＡｃの引き続いての付加を許容するのに必要な特定の異性体Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を作り出すことが知られている、任意の酵素または酵素の組合せを選択することができる。インビトロにてＧｎＴＩによってＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換することができる構造を作り出すことが知られているいずれかの酵素または酵素の組合せは、適当な選択を構成する。この知識は、科学文献から、あるいは実験的に得ることができる。例えば、潜在的マンノシダーゼがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ（２−アミノベンズアミド）をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＢに変換することができるかを判断することができ、次いで、得られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−２ＡＢ構造がＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する基質として働いて、インビトロでＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えることができることを証明することができる。ヒトまたはマウス源からのマンノシダーゼＩＡは、例えば、適切な選択であろう（例えば、実施例４参照）。本明細書中に記載した例は、２−アミノベンズアミド標識Ｎ結合オリゴマンノースを利用し、その後、この判断を行うためにＨＰＬＣ分析を利用する。
（表４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種々のグリコシル化関連酵素の細胞位置およびｐＨ最適値）
Figure 2006518600
 従って、本発明に従って用いられるα−１，２−マンノシダーゼ酵素のようなグリコシル化酵素は、５．１と８．０との間のｐＨにおいて最適な活性を有する。好ましい実施形態において、この酵素は５．５と７．５との間のｐＨにおいて最適な活性を有する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼ酵素は、例えば、本発明の方法でよく働き、約５．５の見掛けのｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼとしては適当なｐＨ最適値を有する表３に列挙したもの、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＡ（ゴルジ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＢ（ゴルジ）、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫細胞（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、マウスＩＢ（ゴルジ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓが挙げられる。
α−１，２−マンノシダーゼ酵素についてのｐＨ最適値を示す実験を実施例７に記載する。培地に漏出するキメラ融合タンパク質ＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ３１）を種々のｐＨ範囲に供して、酵素の最適活性を決定した。実験の結果は、α−１，２−マンノシダーゼはその機能に対して約５．５の最適ｐＨを有することを示す（図１１）。
好ましい実施形態において、単一のクローン化マンノシダーゼ遺伝子は宿主生物において発現される。しかしながら、いくつかの場合、数個の異なるマンノシダーゼ遺伝子、または１つの特定の遺伝子の数個のコピーを発現させて、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の適切な生産を達成するのが望ましいであろう。複数遺伝子を用いる場合、コードされたマンノシダーゼは、好ましくは、全て、約５．１〜約８．０、または特に約５．５と約７．５との間の好ましい範囲内にｐＨ最適値を有する。好ましいマンノシダーゼ活性はマウス、ヒト、Ｌｅｐｉｂｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓまたはＡ．ｎｉｂｕｌａｎｓに由来するα−１，２−マンノシダーゼを含む。
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる宿主細胞グリコシル化のインビボ改変）
本発明のある種の方法は、好ましくは（必ずしも必要ではないが）、１以上の核酸ライブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパク質（例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素またはその触媒ドメイン）をコードする配列を含むことである。
１つの実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）異なる細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列；および（ｂ）標的化すべきポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。別の実施形態において、コンビナトリアル核酸ライブラリーは、（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、および（ｂ）宿主細胞へ標的化すべきポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列を含む。後にさらに記載するように、（ａ）に由来する核酸配列、および（ｂ）に由来する核酸配列を連結させて、目的のポリペプチドドメインに機能的に連結した細胞標的化シグナルペプチドをコードする１以上の融合構築物を生じさせる。機能的結合の１つの例は、細胞標的化シグナルペプチドが同一翻訳リーディングフレームにて（「インフレーム」）目的のポリペプチドドメインに連結される場合である。
好ましい実施形態において、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、触媒酵素ドメインにインフレーム連結した細胞標的化シグナルペプチドを含む１以上の融合タンパク質を発現させる。コードされた融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ−グリカンの哺乳類様修飾またはヒト様修飾に関与する酵素の触媒ドメインを含む。より好ましい実施形態において、触媒ドメインは、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および１以上の標的化シグナルペプチドにインフレームに連結した他のグリコシダーゼよりなる群から選択される酵素に由来する。酵素ドメインは、宿主細胞に対して外因性および／または内因性であり得る。特に好ましいシグナルペプチドは、ＥＲからゴルジへの輸送を受けるタンパク質に通常は会合したものである。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、哺乳類様Ｎ−グリカン修飾またはヒト様Ｎ−グリカン修飾に関与する酵素をインビボで生産し、局在化するのに用い得る。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの融合構築物は、コードされた酵素が、それが目的の糖タンパク質上で特定のＮ−グリカンを生産することに関与する宿主細胞のＥＲ、ゴルジまたはトランス−ゴルジネットワークに局在化されるように操作される。本発明のＮ−グリカン修飾酵素の局在化は、付着機構（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を介して、またはタンパク質−タンパク質相互作用を介して達成され、ここに、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーから構築した局在化ペプチドは、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークのような分泌経路の所望の細胞小器官に局在化される。
十分に、かつヒト様（複合）グリコシル化反応によってさらなる修飾用の十分な量が生産される有用なＮ−グリカンの例は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。十分な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、インビボでのさらなるヒト様プロセシングのために目的の糖タンパク質に必要とされる（例えば、３０モル％より多く）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２中間体は、さらなるＮ−グリカン修飾用の基質として用いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産し得る（図１Ｂ；上記参照）。従って、本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて、引き続いて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、または他の所望の複合Ｎ−グリカンを有用な量で生産する酵素を生産し得る。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いて生産された融合構築物のさらなる局面は、それらが、操作された宿主細胞において十分かつしばしば完全に近い細胞内Ｎ−グリカントリミング活性を可能とすることである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生産された好ましい融合構築物は、グリコシル化酵素（例えば、マンノシダーゼ）をコードし、これは、細胞内宿主細胞区画に効果的に局在化され、それにより、細胞外活性をほとんど、好ましくは全く呈しない。マンノシダーゼ酵素をコードする本発明の好ましい融合構築物は、Ｎ−グリカンが修飾される場所（すなわち、ＥＲおよびゴルジ）に局在化されることが示されている。本発明の融合酵素は分泌経路中のそのような特定の細胞小器官に標的化され、そこでは、それらは局在化され、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンに作用して、目的の糖タンパク質上でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生産する。
二分されたグリカンを産生するようにコンビナトリアルＤＮＡライブラリーから作製されたＧｎＴＩＩＩ融合構築物を、任意の細胞外活性を決定するためにアッセイした。宿主細胞のグリコシル化のインビボでの変化を示すＧｎＴＩＩＩ融合構築物の例は、ｐＶＡ５３と称される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１を融合構築物ｐＶＡ５３で形質転換した後に、任意のエキソビボＧｎＴＩＩＩ活性を検出するために、その上清を試験した。図３３は、培地中で細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を明らかにする条件下で、標準的な基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の明白な変化を示さない（実施例２２）。同様に、図３４は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−５７中での、基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２と反応する検出可能な細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を示さない（実施例２３）。
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーによって生産された酵素は、各々、図５、６および２５〜３４に示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたＫ３またはＩＦＮ−βタンパク質について示されたように、目的の糖タンパク質上でＮ−グリカンを修飾することができる（また、実施例２、４および１８〜２３参照）。しかしながら、限定されるものではないが、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωのようなサイトカイン、および顆粒球−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子のような凝固因子、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、セイメース、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻害因子１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、α−フェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ））、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１レセプターアゴニストを伴うか伴わないＧＬＰ−１、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、ａｋａ可溶性ＴＮＦレセプターＦｃ融合）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）を含めた他のタイプの糖タンパク質も、このようにしてグリコシル化され得るのが認識される。
（融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築）
融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、一般に、（例えば、Ｃ末端欠失を作製することによって）天然タンパク質のＮ末端ドメインに由来する１以上の細胞標的シグナルペプチド（「標的化ペプチド」）を特徴とする。しかしながら、いくつかの標的化ペプチドは、天然タンパク質（例えば、ＳＥＣ１２）のＣ末端に由来する。ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源として用いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）をコードする配列を有する。これらの領域はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび／または他の局在化されたタンパク質との比較（例えば、疎水性プロットの比較）によって認識可能である。
標的化ペプチドはここではタイプＩＩ膜の一部に対して短い（ｓ）、中程度（ｍ）および長い（ｌ）として示される。短い（ｓ）と示された標的化ペプチド配列は膜−結合タンパク質の膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）に対応する。長い（ｌ）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびステム領域（ｓｒ）の長さに対応する。中程度（ｍ）と示された標的化ペプチド配列は膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）の長さのほぼ半分に対応する。触媒ドメイン領域は、ここでは、その野生型グリコシル化酵素に対するヌクレオチド欠失の数によって示される。
（サブライブラリー）
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝子または野生型遺伝子から直接構築することができる。好ましい実施形態において、上記ＤＮＡライブラリーは、２以上のサブライブラリーの融合から構築される。サブライブラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン（例えば、グリコシル化活性を有するもの）をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製することが、可能である。
（グリコシル化活性をコードする触媒ドメインサブライブラリー）
１つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。触媒ドメインは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。哺乳類酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素は、全て有用であり、これは、最適温度および最適ｐＨに関して広いスペクトルの生化学特性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、そのいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードするフラグメントを得る。内因性標的化配列を除去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座で発現させ得る。
そのような触媒ドメインの選択は、その触媒ドメインが引き続いて活性であるべき特定の環境についての知識によって誘導され得る。例えば、特定のグリコシル化酵素が後期ゴルジにおいて活性であり、かつ後期ゴルジにおける宿主生物の全ての公知の酵素が特定のｐＨ最適値を有するか、あるいは後期ゴルジが特定のｐＨを有することが公知である場合、上記したように、そのｐＨにおいて十分な（好ましくは最大の）活性を示す触媒ドメインを、選択する。
（標的化ペプチド配列サブライブラリー）
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、３つのカテゴリー：（１）一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜（腔膜）に係留させる、サイトゾルテイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）の一部またはステム領域の全てをコードする、Ｎ末端配列；（２）ＨＤＥＬテトラペプチド（配列番号４１）またはＫＤＥＬテトラペプチド（配列番号４２）のようなＣ末端で一般に見出される検索シグナル；および（３）ゴルジ中に局在化することが知られている種々のタンパク質（例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター）由来の膜貫通領域；に分類される。
最初の場合において、標的化ペプチドが種々のエレメント（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）からなる場合、上記ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよびステム領域の種々の部分が提示されるように設計される。従って、標的化ペプチド配列のサブライブラリーの好ましい実施形態は、ＥＲまたはゴルジの膜結合型タンパク質由来のｃｔ配列、ｔｍｄ配列および／またはｓｒ配列を含む。いくつかの場合、種々の長さのｓｒ配列を持つサブライブラリーを提供することが、望ましいものであり得る。これは、サイトゾル領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するプライマーを用い、かつステム領域の種々の部分に結合する一連の対向プライマーを使用するＰＣＲによって、達成され得る。
標的化ペプチド配列のさらに他の有用な供給源としては、ＥＲまたはゴルジへと逆方向輸送されるタンパク質のＣ末端において代表的には見出される、検索シグナルペプチド（例えば、テトラペプチドＨＤＥＬまたはＫＤＥＬ）が挙げられる。標的化ペプチド配列のさらに他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）表３に列挙した酵素、（ｃ）ゴルジに局在化される膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、および（ｄ）表５において言及される配列、が挙げられる。
（表５．有用な区画標的化配列の供給源）
Figure 2006518600
Figure 2006518600
 いずれの場合においても、特定の酵素活性に適する標的化ペプチド配列を選択して、所望のグリコシル化反応の系列内で最適に機能することが、非常に好ましい。例えば、新生Ｎ−グリカンの末端シアリル化（ヒトにおいて後期ゴルジで起こるプロセス）が可能な改変された宿主微生物を開発するにおいて、後期ゴルジタンパク質に由来する標的化ペプチド配列のサブライブラリーを利用することが、望ましい。同様に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与えるようにα−１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のトリミングすることは、ヒトにおける複合Ｎ−グリカン形成における初期工程である（図１Ｂ）。従って、この反応を、操作された宿主微生物のＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが、望ましい。ＥＲ滞留シグナルおよび初期ゴルジ滞留シグナルをコードするサブライブラリーが、使用される。
次いで、一連の融合タンパク質構築物（すなわち、コンビナトリアルＤＮＡライブラリー）が、１つまたは一連の標的化ペプチド配列を、触媒ドメインをコードする１つまたは一連の配列に機能的に連結させることによって構築する。好ましい実施形態において、これは、標的化ペプチド配列（上記）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーを、グリコシル化酵素または触媒的に活性なそのフラグメント（後記参照）をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーへとイン−フレーム連結することよって、達成される。
得られたライブラリーは、標的化ペプチド配列を含有する融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。いくつかの場合、融合タンパク質のＮ末端に、あるいは他の場合にはＣ末端に、標的化ペプチド配列を提供することが、望ましい。いくつかの場合、標的化ペプチド配列は、酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入され得、但し、個々の折り畳まれたドメインのタンパク質構造は、破壊されないものとする。融合タンパク質の各タイプは、（段階的指向性様式または半ランダム様式にて）構築され、最適な構築物は、本発明の方法を用いて、宿主細胞の形質転換、および形質転換された細胞におけるグリコシル化パターンの特徴付けに基づいて、選択され得る。
（コンビナトリアルライブラリーからの融合構築物を用いる宿主細胞グリコシル化の改変）
好ましいコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築が、図２に模式的に示され、実施例４に記載される。その融合構築物は、多数のベクター（例えば、当該分野で周知の発現ベクター）に作動可能に連結され得る。種々のそのような融合構築物が、表６に示したような代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド／触媒ドメインの組合せは、本発明に従って、ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マンノシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用いるために組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチドのタイプに応じ、Ｎ−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有さないものであり得る（例えば、表７、実施例４）。
（マンノシダーゼ融合構築物）
本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の代表的な例は、ｐＦＢ８であり、これは、マウスα−マンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）の１８７Ｎ末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結した短縮型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）標的化ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１６５５からのＳＥＣ１２の９８８〜１２９６ヌクレオチド）を有する。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド／触媒ドメイン領域を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、ＳＥＣ１２標的化ペプチド配列によってＥＲに局在化し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である（実施例４；図６Ｆおよび７Ｂ）。
融合構築物ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９）は、細胞内マンノシダーゼトリミング活性を有する融合構築物の別の例である（実施例４；図５Ｄおよび８Ｂ）。融合構築物ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有するＮ−グリカンをインビボで生成可能である効率的な融合構築物のさらに別の例である。本発明によるこれらのマンノシダーゼ融合構築物および他のそのようなマンノシダーゼ融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを作製することによって、当業者は、最適細胞内トリミング活性を有する構築物を、比較的低い活性を持つかまたは活性を全く持たない構築物から区別し、そしてそれを選択し得る。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる方法は、選択された少数のマンノシダーゼ融合構築物のみが、特に望ましいＮ−グリカンをインビボで生成し得るので、有利である。
さらに、マンノシダーゼトリミング活性は、目的の特定のタンパク質に対して特異的であり得る。従って、全ての標的化ペプチド／マンノシダーゼ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じさせ得るというわけではないことが、さらに理解されるべきである。従って、目的のタンパク質は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた宿主細胞に導入されて、目的のタンパク質にとって最適なマンノシダーゼ活性を発現する１以上の融合構築物が同定され得る。当業者は、本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生じさせて選択することが可能であり得る。
さらに、局在化された活性なマンノシダーゼ触媒ドメイン（またはより一般的には、任意の酵素のドメイン）を示す他のそのような融合構築物は、実施例４に例示される技術および本明細書中に記載された技術のような技術を用いて、生成され得ることが、明らかである。本発明のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成しそれを用いて、例えば、特定の宿主細胞中に導入された特定の発現ベクターにおける融合構築物のライブラリーからのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
（グリコシルトランスフェラーゼ融合構築物）
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、本発明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性に由来する配列のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てられ、マーカー糖タンパク質上でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成についてスクリーニングされた。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８）を生じることが示された融合構築物（ｐＰＢ１０４）、が同定された（実施例８）。多種多様なそのようなＧｎＴＩ融合構築物を構築した（実施例８、表１０）。標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを生成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示す他のそのような融合構築物は、実施例８に示すように生成され得ることが、当業者にとって明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルＤＮＡライブラリー方法を用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物を用い、ＧｌｎＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
マンノシダーゼ融合構築物について上で述べたように、全ての標的化ペプチド／ＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物が同等によく機能して、本明細書中に記載するように目的の糖タンパク質上で適切なグリコシル化を生じるというわけではない。しかしながら、当業者は、本明細書中に記載したＤＮＡライブラリーアプローチを用い、最適な融合構築物を生成してそれを選択することが可能である。実施例８は、標的化ペプチドと、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を持つ糖タンパク質の生成に関与するＧｎＴＩ触媒ドメイン融合構築物とを含む、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの好ましい実施形態を示す。
（宿主細胞グリコシル化を改変するための多重融合構築物の使用）
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例において、レポータータンパク質（Ｋ３）を発現するＯＣＨ１欠失を持つＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質転換して、高マンノースＮ−グリカンをヒト様Ｎ−グリカンに変換した（実施例８）。まず、マンノシダーゼ融合構築物ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）を、１，６開始マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（すなわち、ｏｃｈ１欠失；実施例１）に形質転換した。第二に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするＫ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含むｐＰＢ１０３を構築して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のさらなる生成を増加させた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加は、図１０Ｂに示すように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株においてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を有意に増加させた。第３に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、この株に導入した。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を「ＰＢＰ−３」という（図３６参照）。
上記した酵母株のような宿主細胞は、１以上の発現ベクターで順次に形質転換および／または共形質転換され得ることが、当業者によって理解される。また、形質転換の順番は、目的の糖タンパク質を生成するのに特には関係しないことも、理解される。当業者は、本明細書中に開示された手法の慣用的改変は、目的の糖タンパク質の生成において改良された結果を提供し得ることを認識する。
特定の触媒ドメイン配列を持つ特定の標的化ペプチド配列を用いることの重要性は、本明細書中に記載された実験から容易に明らかになる。コンビナトリアルＤＮＡライブラリーは、ヒト様糖タンパク質を生成するのに特に有用な、目的の糖タンパク質上でのＮ−グリカンの改変に関与する酵素融合物を構築するためのツールを提供する。（しかしながら、本発明のライブラリーおよび方法を用い、任意の酵素融合物が、選択され得る）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、図５Ｄおよび５Ｅに示されたように、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを持つＫ３を生じる。これは、図５ＣにおいてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検出されたように、親ＯＣＨ１欠失株のＫ３と比較して、切断されたグリカンに減少した分子質量を与える。
同様に、同じアプローチを用いて、別の分泌型糖タンパク質（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を優勢に含むＩＦＮ−β）を生成した。このＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、ＰＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｐａｐａｃら．，１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）によって除去し、図６Ａ〜６Ｆに示すようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに供した。１２５４（ｍ／ｚ）における単一の顕著なピークは、図６Ｅ（ｐＧＣ５）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）および図６Ｆ（ｐＦＢ８）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）において、ＩＦＮ−β上でのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成を確認する。さらに、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）、ｐＰＢ１０４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８）およびｐＰＢ１０３（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ−３において、ハイブリッドＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された（図１０）。
高度なマンノーストリミングで形質転換体を同定した後、さらなる実験を行って、マンノシダーゼ（トリミング）活性がインビボで起こり、これは、優勢には、増殖培地中での細胞外活性の結果ではないことを確認した（実施例６；図７〜９）。
本発明をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主生物を用いて例示するが、酵母宿主および真菌宿主の他の種を含めた他の真核生物宿主細胞を、本明細書中に記載したように改変して、ヒト様糖タンパク質を生成し得ることが、当業者に理解されるべきである。望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子（例えば、ＯＣＨ１）の同定および破壊のための本明細書中に記載した技術は、他の酵母および真菌株のような他の真核生物宿主細胞におけるこれらおよび／または他の相同遺伝子または機能的に関連した遺伝子について適用可能であることが、理解される。実施例９に記載されたように、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１遺伝子が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓから欠失されて、１，２−マンノシダーゼによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと完全に変換されるＮ−グリカンに導く宿主細胞を操作した（図１２Ｃ）。
ＭＮＮ１遺伝子を、実施例９に記載されたようにＫ．ｌａｃｔｉｓからクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列は、各々、配列番号４３および配列番号４４に示される。遺伝子特異的プライマーを用い、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのゲノムからＭＮＮ１遺伝子を欠失するように、構築物を操作した（実施例９）。ｏｃｈ１活性およびｍｎｎ１活性を除去した宿主細胞は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を有するＮ−グリカンを生じる（例えば、図１２Ｂ参照）。そのような宿主細胞は、例えば、本発明の方法およびライブラリーを用いてさらに操作して、哺乳動物様糖タンパク質またはヒト様糖タンパク質を生成され得る。
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子（配列番号４３）の少なくとも４５ヌクレオチド残基、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド残基、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド残基、最も好ましくは７５のヌクレオチド残基以上を含む核酸配列を有する単離された核酸分子、またはそれらのヌクレオチド残基からなる核酸配列を有する単離された核酸分子、およびそれらのホモログ、改変体および誘導体を提供する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされた単離ポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体およびアナログを含む）が提供される。加えて、さらに本明細書中で記載するような、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）も提供される。同様に、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換された宿主細胞が、提供される。
従って、本発明の別の局面は、ヒト細胞によって生成されるものと似ている改変されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を発現する、非ヒト真核生物宿主株に関する。従って、酵母細胞および真菌細胞以外の種における本発明の方法の実行が、企図され、これは本発明に含まれる。本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーを用いて、任意の真核生物宿主細胞系におけるグリコシル化経路を改変する構築物を選択し得ることが、企図される。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーは、植物、藻類および昆虫、ならびに他の真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む）で用いて、宿主細胞分泌経路に沿った望む位置において、タンパク質（グリコシル化酵素またはその触媒ドメインを含む）を局在化し得る。好ましくは、グリコシル化酵素または触媒ドメインなどは、宿主細胞分泌経路に沿って亜細胞位置に標的化され、その場所で、それらの酵素は、機能可能であり、好ましくは、それらが最も効率的に機能するように設計または選択される。
植物および昆虫細胞を、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用い、発現されたタンパク質のグリコシル化を改変するように作製し得る。さらに、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞におけるグリコシル化はまた、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用いて修飾され得る。例えば、本発明のコンビナトリアルライブラリーおよび方法を用いて、特定の酵素活性を最適化するか、あるいは哺乳動物宿主細胞において作製された種々のＮ−グリカンの相対的割合を修飾することが可能であり得る。
本発明のこの実施形態に従った方法を用いて作用され得るグリコシル化に対する修飾の例は：（１）Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からのマンノース残基をトリミングして、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを生じるように真核生物宿主細胞を操作する工程；（２）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に付加するように真核生物宿主細胞を操作する工程；（３）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）またはシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のような酵素を機能的に発現するように真核生物宿主細胞を操作する工程である。
この方法を反復することによって、徐々に複雑なグリコシル化経路を、下等真核生物微生物のような標的宿主に操作し得る。１つの好ましい実施形態において、宿主微生物は、グリコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーで２回以上形質転換する。所望の表現型の選択は、各ラウンドの形質転換の後に、あるいは、数回の形質転換が生じた後に行われ得る。複合グリコシル化経路はこのようにして迅速に操作され得る。
（連続的グリコシル化反応）
好ましい例において、そのような標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーは、高等真核生物において、グリコシル化反応の連続的性質についての既存の情報を組み込むように設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、そのような反応を触媒する酵素をゴルジまたはＥＲの初期部分に標的化する工程を必要とする。例えば、マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングは、複合Ｎ−グリカン形成における初期の工程である（図１Ｂおよび３５Ａ）。タンパク質プロセシングはＥＲで開始され、次いで、初期ゴルジ、内側ゴルジおよび後期ゴルジを通じて進行するので、この反応はＥＲまたは初期ゴルジで生じさせることが望ましい。従ってマンノシダーゼＩ局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、ＥＲおよび初期ゴルジ標的化シグナルをマンノシダーゼＩの触媒ドメインと対応させるよう試みられる。
（さらなる配列多様性の生成）
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸（例えば、ＤＮＡライブラリー）が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも１つの形質転換体が、望まれる表現型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る（Ｒｏｍｅｒｏら（２０００））。従って、形質転換に先立ち、ＤＮＡライブラリーまたは構成サブライブラリーが、１つ以上の技術に供されて、さらなる配列多様性が生成され得る。例えば、１回以上の遺伝子シャッフリング、エラープローンＰＣＲ、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じるための他の方法が、融合構築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得る。
（発現制御配列）
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列（例えば、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必要であり得るような他の機能的配列）を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一般には好ましい。
適切なベクター構成要素（例えば、選択マーカー、発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）および必要に応じて、宿主細胞における自律複製に必要な配列が、どの特定の宿主細胞が選択されるかの関数として選択される。特定の哺乳動物または下等真核生物宿主細胞で用いるための適切なベクター構成要素についての選択基準は、慣用的である。本発明の好ましい下等真核生物宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。宿主がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、適切なプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＰ４０プロモーターが挙げられる。
（選択マーカー）
少なくとも１つの選択マーカー（薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完するための遺伝子）を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、ＵＲＡ３遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＳＵＣ２遺伝子、Ｇ４１８遺伝子、ＢＬＡ遺伝子、またはＳＨ ＢＬＥ遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物宿主細胞で用いるために利用可能である。
（形質転換）
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、ＤＮＡ移入のための任意の簡便な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法、またはスフェロプラスト法）が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞において、従来の方法としては、粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養（例えば、酵母における発酵）に適した安定な株を生成するために、上記ＤＮＡライブラリー構築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、ＤＮＡライブラリーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規定された部位で起こる。
特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体における望まれない遺伝子の部位中に組み込まれ、その遺伝子の破壊または欠失をもたらす。例えば、ＯＣＨ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子またはＭＮＮ４遺伝子の部位への組込みは、糖タンパク質の酵母超マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に関与する酵素の発現を妨げつつ、所望のライブラリーＤＮＡの発現を可能とする。他の実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、核酸分子、プラスミド、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター）、染色体を介して宿主中に導入され得、自律核酸分子としてか、または宿主ゲノム中への相同組み込みもしくはランダム組込みによって、導入され得る。いずれの場合においても、一般には、安定に形質転換された宿主生物の容易な選択を可能とするために、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を各ライブラリーＤＮＡ構築物とともに含ませることが、一般に望ましい。そのために、またはそれに抗して選択され得る再生可能なマーカー遺伝子（例えば、ｕｒａ３）は、特に適切である。
（スクリーニングおよび選択プロセス）
ＤＮＡライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および／または除去工程によって行われ得る。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用いて、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上にタンパク質Ｎ−グリカンを提示する。
例えば、細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞につき、または最高末端ＧｌｃＮＡｃ含有量にてタンパク質を分泌する細胞につき、スクリーニングし得る。そのようなスクリーニングは、染色手順のような目に見える方法、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体またはマーカー結合体化レクチン（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）に結合する能力、特異的レクチンが末端マンノース残基に結合する能力の低下、インビトロで放射性標識糖を取り込む能力、染料または荷電表面への改変された結合に基づいてスクリーニングされ得るか、あるいは発蛍光団標識レクチンまたは発蛍光団標識抗体と組み合せた蛍光支援細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを用いることによって達成され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
従って、所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチンまたは抗体に細胞を暴露することによって、インタクトな細胞が、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニングされ得る。広汎な種類のオリゴ糖特異的レクチンは、（例えば、ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから）市販されている。あるいは、特異的ヒトＮ−グリカンに対する抗体または動物Ｎ−グリカンに対する抗体は、市販されているか、あるいは標準技術を用いて製造され得る。適切なレクチンまたは抗体は、レポーター分子（例えば、発色団、発蛍光団、放射性同位体、または発色性基質を有する酵素）に結合体化され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎら．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１４）：７８８８−７８９２）。
次いで、スクリーニングは、分析方法（例えば、分光測定法、蛍光比色法、蛍光活性化細胞ソーティング、またはシンチレーションカウンティング）を用いて実施され得る。他の場合には、形質転換された細胞からの単離された糖タンパク質またはＮ−グリカンを分析することが、必要であり得る。タンパク質単離は、当該分野で公知の技術によって行われ得る。好ましい実施形態において、レポータータンパク質が、培地に分泌され、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアフィニティークロマトグラフィー）によって精製される。単離されたＮ−グリカンが好ましい場合、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｄｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のような酵素を用いて、糖タンパク質からＮ−グリカンが切断され得る。次いで、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析法、または他の適切な手段によって、単離されたタンパク質またはＮ−グリカンが、分析され得る。米国特許第５，５９５，９００号は、所望の細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。好ましい実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて、切断されたＮ−グリカンが分析される。
所望の形質転換体の選択に先立ち、望まない表現型を有する細胞の形質転換された集団を除去することが、望ましいものであり得る。例えば、その方法を用いて機能的マンノシダーゼ活性を細胞中に操作する場合、所望の形質転換体は、細胞糖タンパク質において、より低レベルのマンノースを有する。培地中のマンノースの致死的放射性同位体への形質転換された集団の暴露は、望まない表現型（すなわち、高レベルの取り込まれたマンノース）を有する形質転換体の集団を除去する（ＨｕｆｆａｋｅｒおよびＲｏｂｂｉｎｓ（１９８３）ＰＷ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８０（２４）：７４６６−７０）。あるいは、細胞傷害性レクチンまたは望ましくないＮ−グリカンに対する抗体を用いて、望まない表現型の形質転換集団を除去し得る（例えば、ＳｔａｎｌｅｙおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ（１９７７），Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ３（４）：３９１−４０５）。米国特許第５，５９５，９００号は、望まれる細胞外糖質構造を持つ細胞を同定し得るいくつかの方法を教示する。この戦略を反復して行うと、下等真核生物において、より多くの複合グリカンの連続操作が可能となる。
高度のヒト様Ｎ−グリカン中間体であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をその表面に有する宿主細胞を検出するためには、例えば、インビトロ細胞アッセイにおいて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼによるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効果的な転移を可能とする形質転換体につき選択し得る。このスクリーニングは、寒天プレート上での選択圧下で形質転換されたライブラリーを保有する細胞を増殖させること、個々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに移すことによって、実施され得る。細胞を増殖させた後、細胞は遠心分離され、細胞は、緩衝液中に再懸濁され、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩの添加の後、ＵＤＰの遊離が、ＨＰＬＣまたはＵＤＰについての酵素連結アッセイによって、測定される。あるいは、放射性標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴＩＩを用い得、細胞を洗浄し得、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって放射性ＧｌｃＮＡｃの遊離を探索し得る。これはすべて、手動により行っても、あるいは高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化されてもよい。第一のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを遊離する形質転換体、または第二のアッセイにおいてより多くの放射性標識ＧｌｃＮＡｃを遊離する形質転換体は、その表面により高い程度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し、従って、所望の表現型を構成すると予測される。同様なアッセイもまた、同様に、分泌タンパク質上のＮ−グリカンを見るように適合され得る。
あるいは、形質転換細胞の表面上の改変されたグリコシル化パターンを明らかにし得る他の適切な任意のスクリーニング（例えば、レクチン結合アッセイ）を用い得る。この場合、末端マンノースに対して特異的なレクチンの結合減少は、適切な選択ツールであり得る。Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノースに特異的に結合し、これは、十分なマンノシダーゼＩＩ活性がゴルジに存在する場合には低下することが、予測される。また、高い末端マンノース含有量を含む細胞の除去を可能とするクロマトグラフィー分離工程を行うことによって、所望の形質転換体を富化し得る。この分離工程は、低い末端マンノース含有量を有する細胞よりも、高い末端マンノース含有量を持つ細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したＧａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて行う。
加えて、異なる下等真核生物宿主において活性な糖質改変酵素の局在化についてのさらなる情報は科学文献にて入手可能となるので、そのような融合タンパク質構築物を直接作製し得る。例えば、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒは、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のマンノシルトランスフェラーゼ）の膜ドメインに融合され得、その触媒活性を保有しつつゴルジ装置に局在化され得ることが、公知である（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−９）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような知見を全体的戦略に直接的に組み込んで、そのような宿主から複合Ｎ−グリカンを取得し得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるいくつかのそのような遺伝子フラグメントが同定されており、これらはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるグリコシルトランスフェラーゼに関連する。従って、これらは、その目的で使用され得る。
（組込み部位）
この遺伝子工学の試みの１つの最終的な目標は、産業的醗酵プロセスにおいて首尾よく実行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体への複数遺伝子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換されて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならないであろう。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体についてのｓｙｎおよび交互輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素）のいずれかの組合せを真菌タンパク質発現宿主中に作製し得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような下等真核生物宿主細胞においてグリコシル化を改変するための好ましい方法の例を表６に示す。
（表６．下等真核微生物におけるグリコシル化を改変するためのいくつかの好ましい実施形態）
Figure 2006518600
Figure 2006518600
 下等真核生物のような宿主細胞への複合Ｎ−グリカンの形成を操作するためのいずれかの戦略は特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性の除去ならびに付加の両方を含むので、包括的なスキームは、両方の要件を協調させる試みであろう。望ましくない酵素をコードする遺伝子は、望ましい遺伝子についての潜在的組込み部位として働く。例えば、１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性は、多くの既知の下等真核生物におけるグリコシル化の特徴である。α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＯＣＨ１）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化され、この遺伝子における変異は低下したマンノシル化と共に生存可能な表現型を生じる。従って、α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子の組込み用のプライミング標的である。同様に、その遺伝子座における遺伝子破壊事象に基づいて、（１）よりヒト様の様式でグリコシル化する細胞の能力を改良し、（２）タンパク質を分泌する細胞の能力を改良し、（３）外来性タンパク質のタンパク質分解を低減させ、そして（４）その精製または醗酵プロセス自体を容易にするプロセスの他の特徴を改良することが期待されるある範囲の他の染色体組込み部位を選択し得る。
（標的糖タンパク質）
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられる糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−６−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャイエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様に、グリカン側鎖への１以上のシアリン酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タンパク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞（例えば、下等真核生物または哺乳動物）は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアリン酸の程度を増加させるように遺伝的に操作され得る。あるいは、シアリン酸は、シアリン酸トランスフェラーゼおよび適切な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増殖培地組成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用して、ヒト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る（Ｗｅｉｋｅｒｔら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，１１１６−１１２１；Ｗｅｒｎｅｒら、（１９９８）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（８）：８７０−８８０；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８（４）：３７０−３８０）。モノクローナル抗体への特異的グリカン修飾（例えば、二分されたＧｌｃＮＡｃの付加）は、抗体依存性細胞傷害性を改良することが示されており（Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉｌ．１７（２）：１７６−８０）、これは、抗体または他の治療タンパク質の生成に望ましくあり得る。
治療タンパク質は、代表的には、注射、経口、肺または他の手段によって投与される。本発明に従って生成され得る適した標的糖タンパク質の例としては、エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω）、および顆粒球−ＣＳＦ、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子）、およびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン類、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ−結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子２、骨髄前駆体阻害因子１、オステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、αフェトタンパク質、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（オネルセプト、別名ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンドインターアクター）、ＦＳＨ（小胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様プロテイン１）ＩＬ−１レセプターアゴニスト、ｓＴＮＦｒ（エンブレル、別名可溶性ＴＮＦレセプターＦｃ融合物）ＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。
（抗体機能性を高めるＧｎＴ−ＩＩＩの発現）
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩおよびアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのＮ−アセチルグルコサミン残基の付加は、いわゆる二分型Ｎ−グリカンであるＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生じる（図１５）。この構造は、より大きな抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与していた（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０）。哺乳類細胞により発現される免疫グロブリンのグリコ形態の再操作は、単調として進まず、かつ煩わしい仕事である。特にＧｎＴＩＩＩの場合（この酵素の過剰発現が増殖阻害に関与している場合）、調節された（誘導性の）遺伝子発現を含む方法が、二分型Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンを生成するために使用されなければならなかった（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．６５（５）：５４２−９；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０；Ｕｍａｎａら ＷＯ０３／０１１８７８；米国特許第６，６０２，６８４号）。
従って、別の実施形態において、本発明は、トリマンノースコア構造またはペンタマンノースコア構造上に二分型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するヒト様Ｎ−グリカンを生成するためのシステムおよび方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、二分型Ｎ−グリカンを有する免疫グロブリンを生成するためのシステムおよび方法を提供する。本明細書中に記載されるシステムおよび方法は、以前の問題（例えば、ＧｎＴＩＩＩの過剰発現またはＡＤＣＣと関連した細胞傷害性）にあった欠点がない。なぜなら、本発明の宿主細胞は、実質的に修飾されたヒト型グリコ形態（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を有するＮ−グリカンを生成する生細胞（好ましくは、強い細胞）であるように操作され、選択されるからである。従って、本発明の宿主細胞における二分型Ｎ−アセチルグルコサミンの付加は、増殖表現型またはそれらの宿主細胞の生存性に対してごくわずかな影響しか有さない。
さらに、他の研究者による研究によって、ＧｎＴＩＩＩ発現レベルとＡＤＣＣの程度との間に線形的な相関はないことが示された。Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０。従って、哺乳動物細胞における最適な発現レベルを見いだし、ＦＤＡによって認可された発行プロセス全体を通してその最適なレベルを維持することは、困難であると思われる。しかし、本発明の宿主細胞（例えば、真菌細胞）において、強い、信頼性のあるかつ最適なＧｎＴＩＩＩ発現レベルを確立するための適切な強度のプロモーターを見いだすことは、当業者にとって比較的容易な作業である。
Ｎ−グリカンを二分することにより糖タンパク質を生産し得る酵母株のような宿主細胞は、本発明に従って、宿主細胞にＧｎＴＩＩＩ活性を誘導することによって操作される（実施例１２）。好ましくは、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸（例えば、図２４参照）、または酵素活性を有するそのドメインを用いて形質転換され、必要に応じて、（例えば、本発明のライブラリーおよび関連する方法を使用して）異種細胞シグナル標的化ペプチドに融合される。ＧｎＴＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、哺乳類細胞が生じ得る抗体力価よりも高い抗体力価を生じる。それらの宿主細胞はまた、ＡＤＣＣに関してより高い効力を有する抗体を生産する。
ＧｎＴＩＩＩでトランスフェクトされた哺乳類細胞株によって生産された抗体は、トランスフェクトされていない細胞株によって生産された抗体と同じくらいに有効であることが示されているが、１０〜２０分の１低い濃度においてである（Ｄａｖｉｓら、（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４（４）：２８８−９４）。２０の因子による哺乳類系を上回る本発明の生産ビヒクルの生産性の増加、および効力の１０倍増加は、２００の正味の生産性の改善を生じる。従って、本発明は、高い効力（例えば、現在生じ得る効力よりも強力な数オーダーの大きさまで）を有する抗体の高い力価を生じるためのシステムおよび方法を提供する。そのシステムおよび方法は、安全であり、かつ短い期間で強力な抗体を提供する。本発明に従ってＧｎＴＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、少なくとも一日当たり５０ｍｇ／リットル〜５００ｍｇ／リットルの速度で、二分されたＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを生産する。さらに、各免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（二分したＧｌｃＮＡｃを含む）は、二分したＧｌｃＮＡｃなしで生産された同じＩｇ分子よりも強力である。
（改善された糖タンパク質機能性のための複数のアンテナ構造の生成）
テトラアンテナ構造の合成は、種々のタンパク質（例えば、ＥＰＯおよびα１−酸性糖タンパク質）のインビボでの生物学的活性にとって重要であることが見出されている。Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９ Ｏｃｔ；８６（２０）：７８１９〜２２；Ｂｏｒｉｓら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（１９９０１４，３１５〜３２３。薬物動態研究によって、テトラアンテナ分岐の嵩高い構造は、ＥＰＯが尿中へろ過されるのを防ぐことが示された。タンパク質を、例えば、化学結合体（例えば、ポリエチレングリコール）で改変すると、潜在的な治療糖タンパク質のクリアランスを遅らせることが考案された。従って、一実施形態において、本発明は、下等真核生物（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において複数のアンテナ構造を含む糖タンパク質を合成するための方法を提供し、この糖タンパク質は、より良好なインビボの生物学的活性を有し、そして減少したアンテナを有する同じ糖タンパク質よりも迅速には排泄されない。本質的には、本発明の方法に従って生成される糖タンパク質（また、本明細書中に援用されるＷＯ０２／００８７９およびＷＯ０３／０５６９１４を参照のこと）は、治療効力を改善している。
以下の実施例は、本発明の組成物および方法を説明する。これらの実施例は限定するものとして解釈されるべきではなく：実施例は説明の目的のみのために含まれる。
（実施例１）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１遺伝子のクローニングおよび破壊）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１配列（日本国特許出願公開番号８−３３６３８７号）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド
Figure 2006518600
 （配列番号３）および
Figure 2006518600
 （配列番号４）
を用いて、推定α−１，６マンノシルトランスフェラーゼをコードするＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐ ＯＲＦを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ（Ｘ−３３株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から増幅した。その後、ＯＣＨ１遺伝子における内部オリゴヌクレオチド
Figure 2006518600
 （配列番号４７）、ならびにライブラリー担持プラスミドλＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格における
Figure 2006518600
 （配列番号４８）オリゴヌクレオチドおよび
Figure 2006518600
 （配列番号４９）オリゴヌクレオチドを用いて、ＯＣＨ１遺伝子のＯＲＦの２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリー（Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．ら、Ｙｅａｓｔ １９９９ ５月；１５（７）：５６３−７２）から増幅した。得られた５０７５ｂｐフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。
ＨＩＳ４耐性遺伝子でＯＣＨ１リーディングフレームを置換した遺伝子ノックアウト構築物を構築した後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換し、コロニーを３７℃における温度感受性についてスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は温度感受性であり、上昇した温度における成長が遅い。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを補完することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１の機能的ホモログを同定することができる。約２０の温度感受性株を、さらに、コロニーＰＣＲスクリーニングに供して、欠失したｏｃｈ１遺伝子でコロニーを同定した。数個のｏｃｈ１欠失を得た。
ＰｉｃｈｉａＨＩＳ４遺伝子を保有するＯＣＨ１遺伝子カセットの２．１ｋｂ上流配列および１．５ｋｂ下流配列を有する直線化ｐＢＫ９．１を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＢＫ１［ＡＯＸ１遺伝子座においてヒトＩＦＮ−β遺伝子を保有するＧＳ１１５（ｈｉｓ４ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）］に形質転換して、野生型ＯＣＨ１遺伝子をノックアウトした。形質転換体の初期スクリーンニングは、ヒスチジンドロップ−アウト培地を用いて行い、その後、レプリカプレーティングを行って、温度感受性コロニーを選択した。２００のヒスチジン−陽性コロニーのうち２０が、３７℃における温度感受性表現型を示した。ＰｉｃｈｉａゲノムへのｐＢＫ９．１のランダムな組込みを排除するために、２０の温度−感受性単離体を、組込み部位の上流配列、およびＨＩＳ４ ＯＲＦに特異的なプライマーを用いてコロニーＰＣＲに供した。２０のコロニーのうち２つはｏｃｈ１障害性であり、サザンブロットおよびウェスタンブロットを用いてさらに分析し、これは、ｏｃｈ１ノック−アウト構築物による機能性ｏｃｈ１破壊を示す。２つの別々の制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩを用いてゲノムＤＮＡを消化して、ｏｃｈ１のノックアウトを確認し、オープンリーディングフレームにおける組込みを確認した。ウェスタンブロットは、４６．２ｋＤａにおいてＧＳ１１５野生型で生じた区別されるバンドを欠くｏｃｈ１変異体を示した。
（実施例２）
（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２含有ＩＦＮ−β前駆体を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのα―１，２−マンノシダーゼを用いた操作）
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をトリミングして、複合Ｎ−グリカン形成のための必須の中間体であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を得るのに必要である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび複合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の特異的異性体は、ＧｎＴＩについての基質であってもなくてもよいからである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体は、ａｏｘプロモーターの制御下で分泌されるヒトインターフェロンβを発現するように操作される。ＤＮＡライブラリーは、ヒトマンノシダーゼＩＢ（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびＥＲ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築される。次いで、ＤＮＡライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体が各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インターフェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、分泌されたタンパク質の９０％より多くはグリコシル化インターフェロンβである。
上澄みを精製して、Ｃ１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去する。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、親株のインターフェロンβと比較して低下した分子質量を有する、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを含むインターフェロンβを生成する。精製されたインターフェロンβをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、インターフェロンβの所望の形態を発現するコロニーを同定する。
（実施例３）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩを発現するｏｃｈ１変異体株の作製）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＨＣ１遺伝子の１２１５ｂｐのオープンリーディングフレームならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流をＰＣＲによって増幅し（ＷＯ ０２／００８７９も参照のこと）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、これをｐＢＫ９と命名した。複数の栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９、ＳｆｉＩ制限部位が隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子を含むプラスミドをＳｆｉＩで消化し、これを用いて、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ ２６３（２００１）１５９−１６９）を形質転換した。室温における１０日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに続き、１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したＵＲＡ＋クローンをコロニーＰＣＲに供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異体対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたＰＣＲパターンを呈した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。ヒトプラスミノーゲン（Ｋ３）のクリングル３ドメインをモデルタンパク質として用いた。Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏＲでマークしたプラスミドを株ＹＪＮ１５３に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株をＢＫ６４−１と命名した。
ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターをコードするＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子を含むプラスミドｐＰＢ１０３を、ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）からの平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＤＥ１遺伝子（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、（２００１）Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９）を含むＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消化した平滑末端ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸにクローン化することによって、構築した。このプラスミドをＥｃｏＮＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＢＫ６４−１に形質転換し、１つの株はＰＣＲ分析によりＭＮＮ２−２を含むと確認され、これをＰＢＰ１と命名した。
ヒト、マウス、ハエ、虫および酵母源からの数個のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の触媒ドメインと融合させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの数個のＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのインフレーム融合物を含むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを作製した（例えば、ＷＯ ０２／００８７９を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４組込みベクターにおいて作製し、ＳａｌＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ１に形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から遊離されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。１つの活性な選択された構築物は、１８７ヌクレオチドを失った、マウスα―１，２−マンノシダーゼＩＡ遺伝子（図３）のＮ末端欠失と融合させた酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８−１２９６ヌクレオチド（Ｃ末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ２と命名した（図３６もまた参照のこと）。
ヒト、虫、カエルおよびハエ源からのＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同じリーダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ ０２／００８７９）。このライブラリーをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＲＧ４組込みベクターにおいて作製し、そして、ＡａｔＩＩで直線化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ２に形質転換し、Ｋ３から遊離されたグリカンを分析することによってスクリーニングした。選択された１つの活性な構築物は、最初の１５４ｂｐが失われた、ヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子の最初の１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＰＢＰ３と命名した。
ヒトおよびラット源からのＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメインを有するリーダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ ０２／００８７９）。このライブラリーを、薬物ノロセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を与えるＮＳＴＲ遺伝子を含む、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組込みベクターにおいて作製した。これらのライブラリープラスミドを、ＥｃｏＲＩで線状化し、エレクトロポレーションによって株ＲＤＰ２７内に形質転換し、そしてこの得られた株を、精製したＫ３から遊離されるグリカンの分析によって、スクリーニングした。
（以下の反応のための材料）
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａ製であった。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製であった。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラットα２，６−シアリルトランスフェラーゼ、および牛乳由来のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。タンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦ、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）製であった。ＤＥＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓ製であった。金属キレート化「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。９６ウェル溶解−清浄化プレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。タンパク質結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製であった。塩および緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。ＭＡＬＤＩマトリックスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）製であった。
（タンパク質の精製）
クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）３を、９６ウェル形式で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００サンプル取り扱いロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒａｎｃｈ Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）で精製した。Ｋｒｉｎｇｌｅ ３を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、発現培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｖａｇｅｎによって、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂について提供されるプロトコルの適合である。簡単に言えば、１５０ｕＬ（μＬ）の沈降した体積の樹脂を、９６ウェルの溶解−結合プレートのウェルに注ぎ、３倍体積の水で洗浄し、そして５倍体積の５０ｍＭ ＮｉＳＯ４を充填し、そして３倍体積の結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９））で洗浄する。このタンパク質発現培地を、３：２で、培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ ＰＯ４，１６ｍＭ ＫＣｌ、８２２ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で希釈し、そしてカラムに充填する。排液後、このカラムを、１０倍体積の結合緩衝液および６倍体積の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄し、そしてタンパク質を、６倍体積の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で溶出する。溶出した糖タンパク質を、凍結乾燥によって、蒸発乾固させる。
（Ｎ結合型グリカンの遊離）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から遊離させ、そして分離する。９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを、１００ｕＬのメタノールで湿らせ、３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ Ｔｒｉｓ，３．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６））で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で排液する。乾燥したタンパク質サンプルを、３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液に溶解し、そして１０ｕＬのＲＣＭ緩衝液を含むウェルに移す。これらのウェルを排液し、そしてＲＣＭ緩衝液で２回洗浄する。ＲＣＭ緩衝液中６０ｕＬの０．１Ｍ ＤＴＴの添加によって、３７℃で１時間、タンパク質を還元する。これらのウェルを、３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして６０ｕＬの０．１Ｍヨード酢酸の添加によって、室温で暗所で３０分間カルボキシメチル化する。これらのウェルを、水で再度３回洗浄し、そしてその膜を、水中１％のＰＶＰ ３６０（１００ｕＬ）の添加によって、室温で１時間ブロックする。これらのウェルを排液し、そして３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして１ミリ単位のＮ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｋｏ）を含有する１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）の３０μＬの添加によって、脱グリコシル化する。３７℃で１６時間後、このグリカンを含有する溶液を遠心分離によって除去し、そして蒸発乾固させた。
（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法）
グリカンの分子量を、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析計を使用して、遅延抽出を用いて決定した。各ウェルからの乾燥したグリカンを、１５ｕＬの水に溶解し、そして０．５ｕＬをステンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして０．５ｕＬのＳ−ＤＨＢマトリックス（１：１の水／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ中９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸、１ｍｇ／ｍＬの５−メトキシサリチル酸）と混合し、そして乾燥させた。
イオンを、４ｎｓのパルス時間のパルス化窒素レーザー（３３７ｎｍ）を用いて照射することによって、生成させた。この器具を、１２５ｎｓの遅延および２０ｋＶの加速電圧を用いて、遅延抽出モードで操作した。格子電圧は、９３．００％であり、格子ワイヤ電圧は、０．１０％であり、内圧は、５×１０−７トル未満であり、そして低質量ゲートは８７５Ｄａであった。スペクトルを、１００〜２００のレーザーパルスの合計から生成し、そして２ＧＨｚデジタイザーで獲得した。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖を、外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを、陽イオンモードでこの器具を用いて生成した。このスペクトルの推定質量精度は、０．５％であった。
このカラムから溶出したＮ−グリカンの質量は、一般的に陽イオン付加物と会合しており、陽イオンの分子量によって質量は増加する。最も一般的な付加物は、Ｈ＋、Ｎａ＋、およびＫ＋である。
（実施例４）
（コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを用いる優勢なＮ−グリカン構造としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
誘導性ＡＯＸＩプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体（実施例１および３を参照のこと）を作成した。ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）をモデルタンパク質として用いた。Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、Ｋ３をコードするＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化し、Ｃ−末端６−Ｈｉｓタグを得た。Ｋ３のＮ−結合グリコシル化効率を改良する（Ｈａｙｅｓら、１９７５ Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７１，６５１−６５５）ために、部位特異的変異誘発を用いてＰｒｏ４６をＳｅｒ４６で置き換えた。得られたプラスミドをｐＢＫ６４と命名した。ＰＣＲ構築物の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを、表６に従って、Ｃｏｐ ＩＩ小胞、ＥＲ、および初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）およびＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６７５４６１９）触媒ドメインとのイン−フレーム連結によって構築した。組み合わされたＤＮＡライブラリーを用いて、個々の融合構築物を生成し、次いで、これをＫ３発現宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体各々がＫ３ならびにライブラリーからの局在化シグナル／マンノシダーゼ融合遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団を得た。個々の形質転体を培養し、Ｋ３の産生を、メタノール含有培地への移動によって誘導した。これらの条件下で、誘導の２４時間後に、培地中のタンパク質の９０％より多くはＫ３であった。Ｋ３レポータータンパク質を上清から精製して、Ｎｉ―アフィニティークロマトグラフィーによって塩および低分子量夾雑物を除去した。アフィニティー精製に続き、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０樹脂（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を脱塩し、後記するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に直接的に供するか、あるいはＮ−グリカンを後記するようなＰＮＧａｓｅ消化によって除去し（Ｎ−グリカンの遊離）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に供した（Ｍｉｅｌｅら、１９９７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，１５１−１５７）。
このアプローチに続き、多様な組の形質転換体が得られた；いくつかはｏｃｈ１ノックアウト株と比較してＮ−グリカンの修飾を示さず；他のものは高度なマンノーストリミングを示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。適切に標的化された活性なα−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを有するＫ３を産生した。これは、親ｏｃｈ１欠失株のＫ３と比較して、糖タンパク質に対して低下した分子質量を付与し、この差はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって容易に検出された（図５）。表７は、相対的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生レベルを示す。
（表７．Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
Figure 2006518600
 （表８．Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２生成の相対レベルを示す局在化配列／触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルＤＮＡライブラリー）
Figure 2006518600
 標的化ペプチドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（長、中程度および短）（前出を参照のこと、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）におけるＭＮＳＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３２９０６）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（９８８〜１１４０ヌクレオチド：短）および（９８８〜１２９６：中程度）におけるＳＥＣ１２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ１１６５５）から選択した。標的化ペプチド配列の大部分はＮ末端欠失であったが、ＳＥＣ１２のようないくつかの標的化ペプチド配列はＣ末端欠失であった。この実験で用いた触媒ドメインは、１８７アミノ酸Ｎ−末端欠失を含むマウスマンノシダーゼ１Ａ；および５８、９９および１７０アミノ酸欠失を含むマウスマンノシダーゼ１Ｂから選択した。本明細書中で使用される場合、（＋）の数は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２産生の相対的レベルを示す。表示（−）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の明白な産生が無いことを示す。表示（＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の１０％未満の産生を示す。表示（＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約１０〜２０％の産生を示す。表示（＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約２０〜４０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約５０％の産生を示す。表示（＋＋＋＋＋）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の５０％を超える産生を示す。
表９は、分泌されたＫ３に対するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の相対的な量を示す。１９のα−１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを３２の真菌ＥＲ、およびシス−ゴルジリーダーに融合させることによって作製されたコンビナトリアル遺伝子ライブラリーからの単一構築物で各々を形質転換することによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Δｏｃｈ１）の６０８の異なる株を作製した。
（表９）
Figure 2006518600
 ＊数個の融合構築物は試験しなかった。なぜなら、対応するプラスミドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへの形質転換の前にＥ．ｃｏｌｉ中で増殖し得なかったからである。
＋最高程度のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２トリミング（３０／５１）を有するクローンを、培地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分（２８／３０）は、上清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した（例えば図４Ｂ）。２つの構築物のみが培地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２レベルを示した（例えば、図４Ｃ）。
表７は、とりわけ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示す２つの構築物ｐＦＢ８およびｐＧＣ５を示す。表８は、
より好ましい構築物である、ｐＢＣ１８−５（８０アミノ酸Ｎ−末端欠失を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｖａｎ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＣＡＡ９８１１４）にインフレーム連結したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＡＮ１（ｓ）標的化ペプチド配列（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２３６４２由来））、を示す。この融合構築物はまた、図５Ｅに示すように、優勢なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成する。この構築物は、５０％を超えるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成することが示された（＋＋＋＋＋）。
（コンビナトリアル局在化／マンノシダーゼライブラリーの作製）
標的化ペプチドに融合したα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの作製は、多数の生物からの種々の長さのＮ−末端欠失を含むマンノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−１，２−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以下の源：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍから得られたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかからＰＣＲ増幅した。各場合において、ＰＣＲ反応を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でＤＮＡをインキュベートした。例えば、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを増幅するために、５’−プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号５２）および３’−プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号５３）をＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下でインキュベートし、循環パラメーター：９４℃で１分間（１サイクル）；９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間（３０サイクル）を用いるＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって推奨される条件下で増幅した。増幅に続いて、ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への連結の前に１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に７２℃にて５分間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されるように、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。クローン化されたＰＣＲ産物は、マンノシダーゼＯＲＦに特異的なプライマーを用いるＡＢＩ配列決定によって確認した。
各マンノシダーゼの所望のＮ−末端短縮形を作製するために、各マンノシダーゼの完全なＯＲＦを、ＰＣＲ反応の後のラウンドでテンプレートとして用い、ここで、５’プライマーのアニーリング位置は所望の短縮形の５’末端に特異的であり、３’プライマーはＯＲＦの元来の３’末端に特異的なままであった。酵母発現ベクターへの短縮形マンノシダーゼフラグメントのサブクローニングを容易にするために、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位をそれぞれ、５’および３’末端において、各短縮産物に操作した。各マンノシダーゼＯＲＦについて作製されたＮ−末端短縮形の数および位置は、触媒ドメイン）（ＣＤ）に関して膜貫通（ＴＭ）領域の位置に依存した。例えば、ＴＭおよびＣＤの間に位置したステム領域が１５０ｂｐ未満である場合、そのタンパク質についての１つの短縮形のみが生じた。しかしながら、ステム領域が１５０ｂｐよりも長い場合、ステム領域の長さに応じて１以上の短縮形が作製された。
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼＩＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ６６７８７８７）についての短縮形をいかにして作製したかの例を本明細書に記載し、同様なアプローチを他のマンノシダーゼについて用いた。図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡのＯＲＦを示し、予測された膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを太字で強調した。この構造に基づいて、３つの５’プライマーを設計して（図３において下線を施したアニーリング位置）、Δ６５−、Δ１０５−およびΔ１８７−Ｎ−末端欠失を作製した。Δ６５Ｎ−末端欠失を例として用いた、使用された５’プライマーは、
Figure 2006518600
 （配列番号５４）（ＡｓｃＩ制限部位は太字で強調する）＋３’プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号５５）（ＰａｃＩ制限部位は太字で強調する）であった。これらのプライマーの両方を用いて、全長Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ１Ａ ＯＲＦを増幅するための上記にて概説した条件下で１５６１ｂｐフラグメントを増幅した。さらに、全長ＯＲＦで得られた産物のように、短縮産物もまたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、ＴＯＰ１０に形質転換し、ＡＢＩ配列決定した。短縮マンノシダーゼフラグメントの配列を増幅し、確認した後に、得られたプラスミド、ｐＣＲ２．１−Δ６５ｍＭａｎｎＩＡを、３７℃にて１６時間、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中でＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。平行して、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）を同一酵素で消化し、上記のようにインキュベートした。消化後、ｐＪＮ３４７（図２Ｃ）骨格および短縮触媒ドメインの両方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。コロニーＰＣＲを用いて、ｐＪＮ３４７−マウスマンノシダーゼＩＡΔ６５構築物の生成を確認した。
酵母発現ベクターｐＪＮ３４７（図２Ｃ）において短縮α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインのライブラリーを生成し、標的化ペプチド／触媒ドメインライブラリーの生成における残りの工程は、標的化ペプチド配列（図２）をイン−フレームクローン化することであった。ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ構築物（図２Ｄ）およびｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−標的化ペプチド構築物（図２Ｂ）両方を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩの存在下で、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液＃４中で３７℃において一晩インキュベートした。消化に続き、ｐＪＮ３４７−マンノシダーゼ骨格および標的化ペプチド領域の双方をゲル抽出し、製造業者によって推奨されているように、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて連結し、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。引き続いて、ｐＪＮ３４７−標的化ペプチド／マンノシダーゼ構築物をＡＢＩ配列決定して、生成された融合がイン−フレームであることを確認した。最終標的化ペプチド／α−１，２−マンノシダーゼライブラリーの推定サイズは、上記アプローチによって生成された１３００を超える構築物を含む。図２は、コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。
（複数栄養要求性マーカーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１ノックアウト株の操作）
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の５’および３’領域についてのスペースホールダー（ｓｐａｃｅ ｈｏｌｄｅｒ）としての、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｂｏｅｈｍら、Ｙｅａｓｔ １９９９年５月；１５（７）：５６３−７２）のＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含むユニバーサルプラスミドの組を作製する工程を包含した。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｕｒａ−ブラスター（Ａｌａｎｉら（１９８７）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６，５４１−５４５）、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を有する発現カセットを含んだ。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋｂのフラグメントは、プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号５６）および
Figure 2006518600
 （配列番号５７）、ならびにテンプレートとしてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ，ＳａｌＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号５８）および
Figure 2006518600
 （配列番号５９）を用いて増幅されたＫＥＸ１−３’領域の０．８ｋｂのフラグメントを開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６２を作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ｐＮＫＹ５１（Ａｌａｎｉら（１９８７）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１６，５４１−５４５）の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを可能な双方の向きに挿入し、その結果、プラスミドｐＪＮ２６３（図４Ａ）およびｐＪＮ２８４（図４Ｂ）を得た。
発現カセットをクローニング部位としてのＮｏｔＩおよびＰａｃＩを用いて作製した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号６０）および
Figure 2006518600
 （配列番号６１）と、テンプレートとしてのプラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用いて増幅し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ部位にクローン化した（図４Ｂ）。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号６２）および
Figure 2006518600
 （配列番号６３）と、テンプレートとしてのプラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用いて増幅したＣＹＣ１転写ターミネーター領域（「ＴＴ」）を開いた部位にクローン化し、ｐＪＮ２６１を作製した（図４Ｂ）。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子についてのノックアウトプラスミドをｐＪＮ２６３をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化することによって作製し、プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号６４）および
Figure 2006518600
 （配列番号６５）と、テンプレートとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡとを用いて増幅したＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを開いた部位にクローン化した（図４Ｃ）。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで切断し、プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号６６）および
Figure 2006518600
 （配列番号６７）を用いて生成したＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを挿入して、ｐＪＮ２９８を生成した（図４Ｃ）。プラスミドを同時に用いて新しい遺伝子を導入する可能性を可能とするために、ｐＪＮ２６１のＢａｍＨＩ発現カセット（図４Ｂ）をｐＪＮ２９８（図４Ｃ）の固有のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ２９９を作製した（図４Ｅ）。
Ｌｕら、（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：１４１−１４６に記載されている同様な戦略を用い、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｕｒａ３−ブラスターカセットを構築した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３の２．０ｋｂのＰｓｔＩ、ＳｐｅＩフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＰｓｔＩ，ＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＪＮ３０６を作製した（図４Ｄ）。次いで、ｌａｃＺオープンリーディングフレームの０．７ｋｂのＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントをＳａｃＩ、ＳｍａＩ部位にクローン化して、ｐＪＮ３０８を得た（図４Ｄ）。ＰｓｔＩでのｐＪＮ３０８（図４Ｄ）の消化、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理に続いて、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｌａｃＺ由来のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを挿入し、ｐＪＮ３１５を作製した（図４Ｄ）。ｌａｃＺ／ＵＲＡ３カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩでの消化によって遊離し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｐＪＮ２９９の骨格にクローン化した。得られたプラスミドをｐＪＮ３２９と命名した（図４Ｅ）。
ｐＪＮ２６１（図４Ｆ）をＥｃｏＩＣＲＩで切断することによって、ＨＩＳ４でマークした発現プラスミドを作製した（図４Ｆ）。ＮｇｏＭＩＶおよびＳｗａＩで切断したプライマー
Figure 2006518600
 （配列番号６８）および
Figure 2006518600
 （配列番号６９）を用いて増幅し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化したＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４遺伝子の２．７ｋｂのフラグメントを、次いで、開いた部位に連結した。このプラスミドをｐＪＮ３３７と命名した（図４Ｆ）。融合ライブラリーの構築に適した多重クローニング部位を有するプラスミドを構築するために、ｐＪＮ３３７をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、インビトロでアニーリングした２つのオリゴヌクレオチド
Figure 2006518600
 （配列番号７０）および
Figure 2006518600
 （配列番号７１）を開いた部位に連結し、ｐＪＮ３４７を作製した（図４Ｆ）。
複数栄養要求性マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９をＳｆｉＩで消化し、これを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ２６３（２００１）１５９−１６９）をエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換に続いて、ＵＲＡドロップアウトプレートを室温で１０日間インキュベートした。１０００のコロニーを選択し、再度画線培養した。次いで、全ての１０００のクローンを２組のＵＲＡドロップアウトプレート上で画線培養した。１つの組を室温にてインキュベートし、他方、第二の組を３７℃でインキュベートした。３７℃では増殖できないが、室温では増殖したクローンをコロニーＰＣＲに供して、正しいＯＣＨ１ノックアウトについて試験した。予測されたＰＣＲシグナル（約４．５ｋｂ）を示した１つのクローンをＹＪＮ１５３と命名した。
（実施例５：コンビナトリアルＤＮＡライブラリーの特徴付け）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロニーＰＣＲによってスクリーニングした陽性形質転換体（実施例４）を、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロールよりなる増殖培地としての５０ｍｌのＢＭＧＹ緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてＯＤ６００ｎｍ２−６まで増殖し、その時点で、５ｍｌのＢＭＭＹ中での室温での２４時間のレポータータンパク質の誘導に先立ち、１０ｍｌのＢＭＭＹ（増殖培地としての１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５ビオチン、および１．５％メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培地）で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、実施例３に記載される通りに分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表６中の標的化ペプチドを用い、ＥＲまたはゴルジいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を主に含有するグリカンに対してＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を主に含有するグリカンのトリミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカン構造を、図５Ｃおよび６ＣにおけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｏｃｈ１ノックアウトのそれと、図５Ｄ、５Ｅ、６Ｄ〜６Ｆに示したＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓマンノシダーゼ構築物で形質転換された同株との間で比較する場合で明らかである。図５および６は、Ｐ．ｐａｓｔｉｒｉｓにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトリアルＤＮＡライブラリーから創製された構築物の発現を示す。ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢΔ９９（図５Ｄおよび６Ｅ）の発現は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングされた全てのグリカンのほぼ３０％を有するタンパク質を生じ、他方、ｐＦ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡΔ１８７）（図６Ｆ）の発現はほぼ５０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じ、ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢΔ８０）（図５Ｅ）の発現は７０％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じた。
（実施例６）
（α−１，２−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング）
実施例４の新規な操作された株が、事実、インビボにて所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じたことを確実にするために、細胞上澄みをマンノシダーゼ活性につきテストした（図７〜９を参照のこと）。後記した各構築物／宿主株については、ＨＰＬＣを１．０ｍｌ／分の流量にて、Ａｌｔｅｃｈの４．０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ） Ｅｃｏｎｏｓｉｌ−ＮＨ２樹脂（５μｍ）を用いて３０℃にて４０分間行った。図７および８において、標準的なＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の分解は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークを生じるように起こることが示された。図７において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］標準は２４．６１分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］は１８．５９分で溶出した。図８において、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は２１．３７分で溶出し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は１５．６７分で溶出した。図９において、標準Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］は２０．８８分で溶出することが示された。
プラスミドｐＦＤ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、３０℃にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。遠心分離によって細胞を収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の生産を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収に用いた。ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図６Ｆに示す。上澄のより早く取り出されたアリコートを、さらに、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。２−アミノベンズアミド標識Ｎ結合型オリゴマンノース９（Ｍａｎ９−２−ＡＢ）の商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図７Ａ）、上記アリコートからの上澄（図７Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図７Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
プラスミドｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を同様に増殖させ、アッセイした。細胞を室温にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収に用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３が得られた。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｄに示す。上澄のより早く取り出されたアリコートを、さらに、図８Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ９−２−ＡＢの商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図８Ａ）、上記アリコートからの上澄（図８Ｂ）、および（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２から得られた）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの１０ｎｇの７５ｍＵ／ｍＬのα−１，２−マンノシダーゼを含有するＢＭＭＹ（図８Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を測定した。
Ｍａｎ９−２−ＡＢを基質として用い、２４時間のインキュベーション後に、マンノシダーゼ活性は、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）株消化物（図７Ｂ）およびｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）株消化物（図８Ｂ）の上澄に実質的に存在しなかったことは明らかであり、他方、陽性コントロール（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓから得られたＴ．ｒｅｅｓｅｉからの精製されたα−１，２−マンノシダーゼ）は、図７Ｃおよび８Ｃに示すように、同一条件下でＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への完全な変換を導く。これは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＧＣ５株；およびｐＦＢ８株におけるインビボマンノシダーゼトリミングを示す決定的なデータであり、これは、今日までに報告されているものとは明らかに異なる（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら、ＷＯ ０２／００８５６ Ａ２）。
図９は、さらに、マンノシダーゼ酵素の局在化および活性を立証する。ｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｍ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを、ＢＭＧＹ中で室温にてＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３の生産を誘導した。２４時間の誘導の後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄を得た。上澄のアリコートをマンノシダーゼアッセイのために取り出し、残りを分泌された可溶性Ｋ３の回収のために用いた。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０〜２５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いる単一精製工程の結果、３００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出する９５％純度のＫ３を得た。Ｋ３由来グリカンのＮ−グリカン分析を図５Ｅに示す。上澄のより早く取り出されたアリコートを、さらに、図９Ｂに示すように、分泌されたマンノシダーゼ活性の存在につきテストした。Ｍａｎ８−２−ＡＢの商業的に入手可能な標準（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を、ＢＭＭＹ（図９Ａ）、上記アリコートｐＢＣ１８−５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ８０）からの上澄（図９Ｂ）、および異なる融合構築物ｐＤＤ２８−３（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）からの培地を含有するＢＭＭＹ（図９Ｃ）に加えた。室温での２４時間のインキュベーションの後、試料をアミノシリカＨＰＬＣによって分析して、マンノシダーゼトリミングの程度を決定した。図９Ｂは、陰性結果を呈する融合構築物ｐＤＤ２８−３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｍ）／Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ９９）と比較した細胞内マンノシダーゼ活性を示す（図９Ｃ）。
（実施例７）
（操作されたα−１，２−マンノシダーゼのｐＨ最適アッセイ）
プラスミドｐＢＢ２７−２（（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ５０１０８からの）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を室温にてＢＭＧＹ中でＯＤ６００＝約１７まで増殖させた。これらの細胞の約８０μＬを６００μＬのＢＭＧＹ中に接種し、一晩増殖させた。引き続いて、細胞を遠心分離によって収穫し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下のＫ３（ヒトプラスミノーゲンからのクリングル３）の生産を誘導した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離によって除去して、実質的に透明な上澄（ｐＨ６．４３）を得た。上澄をマンノシダーゼｐＨ最適アッセイのために取り出した。蛍光標識Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．５μｇ）を、種々のｐＨに調整された２０μＬの上澄に加え（図１１）、室温にて８時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ ＮＨ２ ４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム（Ａｌｔｅｃｈ，Ａｖｏｎｄａｎｅ，ＰＡ）を用いるＨＰＬＣによって試料を分析した。流量は４０分間で１．０ｍｌ／分であり、カラムを３０℃に維持した。３分間のイソクラフィック溶出（６８％Ａ：３２％Ｂ）の後、直線溶媒勾配（６８％Ａ：３２％Ｂ〜４０％Ａ：６０％Ｂ）を２７分間にわたって使用して、グリカン（１８）を溶出させた。溶媒Ａ（アセトニトリル）および溶媒Ｂ（ギ酸アンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）。カラムを実施している（ｒｕｎ）間の２０分間、溶媒（６８％Ａ：３２％Ｂ）で平衡化した。
（実施例８）
（構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性は、複合Ｎ−グリカンおよびハイブリッドＮ−グリカンの成熟化に必要である（米国特許第５，８３４，２５１号）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は単にマンノシダーゼＩＩによってトリミングされ得、これは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによるＮ−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−１，３マンノース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １（５）：４５３−４６１）。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ遺伝子の適切に標的化された触媒ドメインと；ＫＴＲホモログであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｄ２、Ｄ９およびＪ３からの相同性に基づき、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの推定α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼからのＧＬＳ、ＭＮＳ、ＳＥＣ、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＡＮＰ１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＭＮＴ１、ＫＴＲ１、ＫＴＲ２、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＹＵＲ１、ＭＮＮ１、およびＭＮＮ６からの局在化配列とをコードするＤＮＡフラグメントを含むコンビナトリアルＤＮＡライブラリーを調製した。表１０は、限定されるものではないが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｕｃｔｉｓ ＧｎＴＩからのＳＥＣおよびＯＣＨ１のような標的化ペプチド配列を含む（表６および表１０参照）。
（表１０．標的化ペプチド配列／ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）の触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルライブラリー）
Figure 2006518600
 標的化ペプチド配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（長、中程度および短）におけるＯＣＨ１（実施例４参照）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ短および中程度におけるＭＮＮ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ３９１０７）から選択した。触媒ドメインを、各々、３８および８６アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つヒトＧｎＴＩ、３５および６３アミノ酸欠失を持つＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１２）ＧｎＴＩならびに８８アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｇｌｙ−１４）ＧｎＴＩならびに３３および１０３アミノ酸Ｎ−末端欠失を持つＸ．ｌｅａｖｉｓ ＧｎＴＩから選択した。
最初の１５４ｂｐを欠く、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＭＧＡＴＩ、登録番号ＮＭ００２４０６）をコードする遺伝子の一部を、オリゴヌクレオチド
Figure 2006518600
 （配列番号７２）および
Figure 2006518600
 （配列番号７３）と、テンプレートとしてのベクターｐＨＧ４．５（ＡＴＣＣ番号７９００３）とを用いるＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化し、正しい配列を確認した。ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化に続き、短縮型ＧｎＴＩをプラスミドｐＪＮ３４６に挿入して、ｐＮＡを創製した。ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩでのｐＪＮ２７１の消化の後、１２０ｂｐインサートをｐＮＡに連結して、ＭＮＮ９膜貫通ドメインとＧｎＴＩとのイン−フレーム融合物を作製し、ｐＮＡ１５を創製した。
宿主生物はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株であり、これは超マンノシル化を欠損し（例えば、ＯＣＨ１変異体）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供し（すなわち、機能的ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターを含み）、ゴルジおよび／またはＥＲにおける構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを提供する（例えば、上記からのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７））。まず、ｐＢＬＡＤＥ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら（２００１），Ｇｅｎｅ ２６３１５９−１６９）のＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐＦＢ８を形質転換した。次いで、外因性または内因性のＧｎＴＩ／局在化遺伝子の組合せをコードする上記コンビナトリアルＤＮＡライブラリーを形質転換し、コロニーを選択し、コロニーＰＣＲによってＧｎＴＩ構築物の存在につき分析した。我々の形質転換および組込み効率は、一般には、８０％を超え、ＰＣＲスクリーニングは、一旦頑強な形質転換パラメーターが確立されれば省略することができる。
（タンパク質精製）
Ｋ３は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００試料−取扱ロボットにて９６ウェルフォーマットを用いてＮｉアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から精製した。ロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって供されたプロトコルの適合であった。別のスクリーニング方法は、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体または末端ＧｌｃＮＡｃに結合するレクチン（例えば、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃｏｌｉａ由来のＧＳＩＩレクチン）（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）を使用して行われ得る。これらのスクリーニングは、ＦＩＴＣのような蛍光標識で改変されたレクチンまたは抗体を使用することによって自動化し得るか、あるいはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析され得る。
分泌されたＫ３は、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得、定量され得、等量のタンパク質が、高タンパク質結合型９６ウェルプレートに結合され得る。ＢＳＡでブロッキングした後、プレートを、ＧＳＩＩ−ＦＡＣＳレクチンでプローブし得、最大蛍光応答についてスクリーニングした。上記の糖タンパク質を検出する好ましい方法は、９６ウェル培養形質転換体の上清から分泌Ｋ３をアフィニティー精製した後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってスクリーニングすることを含む。形質転換されたコロニーは拾い上げられ、３０℃において、ＢＭＧＹ中、２ｍｌの９６ウェルプレートにおいてＯＤ６００＝約１０にまで増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、ＢＭＭＹで洗浄し、２５０μｌのＢＭＭＹで再懸濁した。２４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって除去し、その上清を回収し、Ｋ３を上清からＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。そのＮ−グリカンを遊離させ、本明細書に記載のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ遅延抽出質量分析によって分析した。
まとめると、本発明の方法は、図１０Ｂに示されるように、高収率でＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を生成する。そのＮ−グリカンの６０％は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。今日までに、いずれの酵母においても分泌された可溶性形態でのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形成を記載した報告は存在しない。本明細書に示される結果は、ＧｎＴＩ活性とともにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加が、１４５７（ｍ／ｚ）におけるピークによって確認される、優勢なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を生成することを示す（図１０Ｂ）。
（株ＰＢＰ−３の構築）
Ｋ３を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（Δｏｃｈ１、ａｒｇ−、ａｄｅ−、ｈｉｓ−）を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）を、エレクトロポレーションによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第二に、ＢａｍＨＩ酵素およびＢｇｌＩＩ酵素で消化されたｐＢＬＡＤＸ−ＳＸプラスミド（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら（２００１），Ｇｅｎｅ ２６３１５９−１６９）にクローン化された（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ２−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＦ１０６０８０）を含有するｐＰＢ１０３を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株において形質転換した。第三に、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩフラグメントとしてｐＪＮ３３６にクローン化された遺伝子をコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９（ｓ）／ヒトＧｎＴＩ Δ３８を含むｐＰＢ１０４を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換した。
（実施例９）
（構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を持つＮ−グリカンを生産するためのＫ．ｌａｃｔｉｓ細胞の操作）
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子の同定および破壊）
出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１遺伝子は、分泌されたタンパク質上のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６８（３５）：２６３３８−４５）。このマンノース転移は、一般には、Ｎ−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノシル化における鍵となる最初の工程として認識される（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３５）：２６３３８−２６３４５；Ｎａｋａｙａｍａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−１９；Ｍｏｒｉｎ−Ｇａｎｅｔら，Ｔｒａｆｆｉｃ １（１）：５６−６８）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるこの遺伝子の欠失の結果、かなり短いＮ−グリカン構造がもたらされ、これは、高温におけるこの典型的なポリマンノシル化も増殖欠損も含まない（Ｎａｋａｙａｍａら（１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．１１（７）：２５１１−９）。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＯｃｈ１ｐ配列を、関連するが異なるマンノシルトランスフェラーゼであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｎｅｉｍａｎら（１９９７），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５（３）：６３７−４５およびＫ．ｌａｃｔｉｓ （ＰＥＮＤＥＮＴ ＥＳＴデータベース）のＨｏｃ１タンパク質と共に、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＬ４９９８７）、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの既知のホモログと整列させた。Ｏｃｈ１ｐホモログの間では共通するが、Ｈｏｃ１ｐホモログとは異なる高相同性の領域を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２，１８５−１９２（１９８７））からのゲノムＤＮＡに対する縮重プライマーの対を設計した。プライマーＲＣＤ３３
Figure 2006518600
 （配列番号７４）およびＲＣＤ３４
Figure 2006518600
 （配列番号７５）でのＰＣＲ増幅の結果、３０２ｂｐ産物が得られ、これをクローン化し、配列決定し、予測された翻訳はＯｃｈ１タンパク質に対して高度な相同性を有することが示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｏｃｈ１ｐに対して＞５５％）。
３０２ｂｐ ＰＣＲ産物を用いて、高ストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）でのＫ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。ハイブリダイゼーションが、単一遺伝子と合致するパターンで観察され、これは、この３０２ｂｐセグメントがＫ．ｌａｃｔｉｓゲノムの一部に対応し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＫｌＯＣＨ１）がこの遺伝子の単一コピーを含むことを示す。全ＫｌＯＣＨ１遺伝子をクローン化するために、サザンブロットを用いて、ゲノム遺伝子座をマッピングした。従って、ゲノムＤＮＡを消化し、５．２ｋｂの範囲のフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作ることによって、５．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントをクローン化した。このサブゲノムライブラリーをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローンをＲＣＤ３３／３４を用いるコロニーＰＣＲによってテストした。予測されたＫｌＯＣＨ１遺伝子を含む５．２ｋｂクローンを配列決定し、予測されたタンパク質をコードする１３６２ｂｐのオープンリーディングフレームは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣＨ１遺伝子と４６．５％同一である。この５．２ｋｂ配列を用いて、ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１５）を用い、ｏｃｈ１：：ＫＡＮＲ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを作製した。この欠失対立遺伝子を２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、Ｇ４１８耐性コロニーを選択した。これらのコロニーを双方のＰＣＲによって、および温度感受性につきスクリーニングして、ＯＣＨ１ ＯＲＦが欠失した株を得た。実験の結果は、変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株を示し、これは、種々の温度における増殖の分析、およびＰＮＧａｓｅ消化の後における分泌されたタンパク質および細胞壁タンパク質のＮ−グリカン糖質分析によって特徴付けした。ｏｃｈ１変異は、株を３０℃では増殖させるが３５℃では増殖させない、温度感受性を付与した。図１２Ａは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびそれより高次のＮ−グリカンを生産する野生型Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子の同定、クローニングおよび破壊）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１は、ゴルジα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼについての構造遺伝子である。ＭＮＮ１の産物は、７６２アミノ酸タイプＩＩ膜タンパク質である（Ｙｉｐら（１９９４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１（７）：２７２３−７）。ｍｎｎ１変異体から単離されたＮ結合オリゴ糖およびＯ結合オリゴ糖双方はα−１，３−マンノース結合を欠く（Ｒａｓｃｈｋｅら（１９７３），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２４８（１３）：４６６０−６）。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭｎｎｌｐ配列を用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ翻訳ゲノム配列（ＰＥＤＡＮＴ）をサーチした。Ｍｎｎｌｐに対して有意な類似性の推定タンパク質フラグメントをコードする１つの４０５ｂｐのＤＮＡ配列を同定した。この配列の内部セグメントを、引き続いて、プライマーＫＭＮ１
Figure 2006518600
 （配列番号７６）およびＫＭＮ２
Figure 2006518600
 （配列番号７７）でＰＣＲ増幅し、これを用いて、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブした。サザンハイブリダイゼーションデータに基づき、４．２Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、本明細書中に記載したように、サイズで選択されたライブラリーを作ることによってクローン化した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子を含む単一クローンを、プライマーＫＭＮ１およびＫＭＮ２を用いる全コロニーＰＣＲによって同定し、配列決定した。このクローン内で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１遺伝子に３４％同一である予測されたタンパク質をコードする２２４１ｂｐ ＯＲＦが同定された。ＰＣＲ重複方法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ ８）：２６０７−１５））を用い、ｍｎｎ１：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子の構築のためにプライマーを設計した。
エレクトロポレーションによって、この破壊対立遺伝子をＫ．ｌａｃｔｉｓの株に形質転換し、ヌーセオトリシン耐性形質転換体を選択し、破壊対立遺伝子の相同挿入のためにＰＣＲ増幅した。変異体ＰＣＲパターンを明らかにする株は、公知のレポーター遺伝子のＮ−グリカン糖質分析に供し得る。
図１２Ｂは、本明細書中に記載されたように、ＰＮＧａｓｅ消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに続いて観察されたＫ．ｌａｃｔｉｓ ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失株からのＮ−グリカンを示す。［ｄ］として示される１９０８（ｍ／ｚ）における優勢なピークはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の質量と合致する。
グリコシル化を修飾するための方法で用いることができるさらなる方法および試薬は米国特許第５，９５５，４２２号、米国特許第４，７７５，６２２号、米国特許第６，０１７，７４３号、米国特許第４，９２５，７９６号、米国特許第５，７６６，９１０号、米国特許第５，８３４，２５１号、米国特許第５，９１０，５７０号、米国特許第５，８４９，９０４号、米国特許第５，９５５，３４７号、米国特許第５，９６２，２９４号、米国特許第５，１３５，８５４号、米国特許第４，９３５，３４９号、米国特許第５，７０７，８２８号および米国特許第５，０４７，３３５号のような文献に記載されている。適当な酵母発現系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤのような源から得ることができる。ベクターは種々の源から商業的に入手可能である。
（実施例１０）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡｌｇ３タンパク質配列、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓに由来するＡｌｇ３タンパク質配列、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＡｌｇ３タンパク質配列のアラインメントに基づいて作製し、これを用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡから８３ｂｐ生成物を増幅した：
Figure 2006518600
 （配列番号７８）および
Figure 2006518600
 （配列番号７９）。得られたＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、配列分析により、既知のＡＬＧ３／ＲＨＫ１／ＮＯＴ５６ホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００１１３４．２、ＡＦ３０９６８９、ＮＣ＿００３４２４．１）に対する相同性を明らかにした。その後、最初のＰＣＲ生成物の１９２９ｂｐ上流および２７３８ｂｐ下流を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリーから、内部オリゴヌクレオチド
Figure 2006518600
 （配列番号８０）および
Figure 2006518600
 （配列番号８１）
ならびに上記ライブラリーを保有するプラスミドλＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の骨格中のＴ３
Figure 2006518600
 （配列番号４９）およびＴ７
Figure 2006518600
 （配列番号４８）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いて、増幅した（Ｂｏｅｈｍ（１９９９）Ｙｅａｓｔ １５（７）：５６３−７２）。得られたフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。この配列から、（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３遺伝子に対して３５％同一性および５３％類似性を有するタンパク質をコードする、１３９５ｂｐ ＯＲＦが同定された。この遺伝子を、ＰｐＡＬＧ３と名付けた。
ＰｐＡＬＧ３の配列を使用して、プライマーセットを作製し、ＰＣＲ重複によりＰｐＡＬＧ３遺伝子の欠失構築物を作製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ８）：２６０７−１５）。以下のプライマーを使用して、それぞれ、そのＰｐＡＬＧ３ ＯＲＦの５’側にある１ｋｂ領域および３’側にある１ｋｂ領域と、ＫＡＮＲ遺伝子とを増幅した：ＲＣＤ１４２
Figure 2006518600
 （配列番号８２）、ＲＣＤ１４４
Figure 2006518600
 （配列番号８３）、ＲＣＤ１４５
Figure 2006518600
 （配列番号８４）、ＲＣＤ１４７
Figure 2006518600
 （配列番号８５）、ＲＣＤ１４３
Figure 2006518600
 （配列番号８６）、およびＲＣＤ１４６
Figure 2006518600
 （配列番号８７）。
その後、プライマーＲＣＤ１４２およびＲＣＤ１４７を使用して、３つの得られたＰＣＲ生成物を重ねて、単一の３．６ｋｂ ａｌｇ３：：ＫＡＮＲ 欠失対立遺伝子を得た。
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＬＧ３ｐ配列、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＡＬＧ３ｐ配列、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓなどに由来するＡＬＧ３ｐ配列を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ配列と整列させた（ＰＥＮＤＡＮＴ ＥＳＴデータベース）。共通するホモログに存在するが、そのホモログとは正確な配列においては異なる高い相同性の領域を使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉら，１９８７）に由来するゲノムＤＮＡに対する１対の縮重プライマーを作製した。ＡＬＧ３の場合、プライマーＫＡＬ−１
Figure 2006518600
 （配列番号８８）およびＫＡＬ−２
Figure 2006518600
 （配列番号８９）でのＰＣＲ増幅により生成物が生じ、これを、クローニングし、配列決定し、その推定翻訳物は、Ａｌｇ３ｐタンパク質に対して高い程度の相同性を有することが示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３ｐに対して＞５０％）。
そのＰＣＲ生成物を使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）に由来するゲノムＤＮＡのサザンブロットを、高ストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）でプローブした。ハイブリダイゼーションは、単一の遺伝子と一致したパターンで観察された。このサザンブロットを使用して、ゲノム遺伝子座をマッピングした。ゲノムＤＮＡを消化し、適切なサイズ範囲におけるそれらのフラグメントをｐＵＣ１９に連結して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作製することによって、ゲノムフラグメントをクローニングした。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百個のクローンを、プライマーＫＡＬ−１およびＫＡＬ−２を使用して、コロニーＰＣＲによって試験した。この推定ＫｌＡＮＧ３遺伝子およびＫｌＡＬＧ６１遺伝子を含むクローンを配列決定し、オープンリーディングフレームを同定した。
ａｌｇ３：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子の構築物についてのプライマー（ＰＣＲ重複法を用いる）（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ８）：２６０７−１５）を設計し、得られた欠失対立遺伝子を、２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、ＮＡＴ耐性コロニーを選択した。これらのコロニーをＰＣＲによってスクリーニングし、ＡＬＧ３ ＯＲＦが、ｏｃｈ１：：ＮＡＴＲ変異対立遺伝子で置き換わった形質転換体を得た。
（実施例１１）
（ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩを発現する、ａｌｇ３ ｏｃｈ１変異株の生成）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｌｇ３：：ＫＡＮＲ欠失構築物を、実施例１０に記載のように生成した。約５μｇの得られたＰＣＲ生成物を、株ＰＢＰ−３（実施例３を参照のこと）に形質転換し、コロニーを、２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＰＤ培地で選択した。ＰＣＲによってスクリーニングした２０株のうちの１株が、そのａｌｇ３：：ＫＡＮＲ変異対立遺伝子の正確な組み込みを含み、野生型対立遺伝子を欠いていることを、確認した。この株を、ＲＤＰ２７（図３６）と名付けた。
次いで、ＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを生成した。このライブラリーは、ヒト供給源およびラット供給源に由来するＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメイン（ＷＯ０２／００８７９）との、リーダーライブラリーのインフレーム融合物から構成された。このライブラリーを、ＮＳＴＲ遺伝子（これは、薬物ニューロセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与する）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組み込みベクターにおいて、作製した。このライブラリープラスミドをＥｃｏＲＩで線状にし、株ＲＤＰ２７にエレクトロポレーションにより形質転換し、得られた株を、精製Ｋ３から遊離させたグリカンの分析によってスクリーニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９（ｓ）構築物にインフレームで融合したラットＧｎＴＩＩを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、ＰＢＰ６−５と名付けた（図３６）。
（ＧｎＴＩＩ発現構築物の生成）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ９遺伝子のＮ末端部分と融合したヒトＧｎＴＩ遺伝子を含むＧｎＴＩ発現ベクター（ｐＮＡ１５）の構築は、Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００（９）：５０２２−２７に記載される。同様の様式において、ラットＧｎＴＩＩ遺伝子をクローニングした。そのラットＧｎＴＩＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２１６６２）を、Ｔａｋａｒａ ＥＸ ＴａｑＴＭポリメラーゼ（Ｐａｎｖｅｒａ）を用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から以下のプライマー：ＲＡＴ１
Figure 2006518600
 （配列番号９０）およびＲＡＴ２
Figure 2006518600
 （配列番号９１）でＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ生成物を次いで、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。このベクターをテンプレートとして用いて、ＧｎＴＩＩのＡｓｃＩ−ＰａｃＩフラグメント（アミノ酸８８〜４４３をコードする）を、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにそれぞれプライマーＲＡＴ４４
Figure 2006518600
 （配列番号９２）およびＲＡＴ１１
Figure 2006518600
 （配列番号９３）を用いて増幅した（導入したＡｓｃＩ制限部位およびＰａｃＩ制限部位に下線を付す）。配列決定による確認後、ラットＧｎＴＩＩの触媒ドメインを、ｐＢＰ１２４中のＡｓｃＩ−ＰａｃＩフラグメントとして、ＰＭＡ１プロモーターの下流にクローニングした。最終工程において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｎｎ２局在シグナルをコードする遺伝子フラグメントを、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてｐＪＮ２８１からクローニングして、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインとのインフレーム融合物を生成し、プラスミドｐＴＣ５３を作製した。
（実施例１２）
（抗体機能性を高める二分しているＧｌｃＮＡｃを生成するためのＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
Ｎ−アセチルグルコサミンをＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩにより付加することにより、いわゆる二分型Ｎ−グリカンが生じる（図１５を参照のこと）。この構造は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に大きく関与していた（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０）。
二分型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を生成し得る酵母株のような宿主細胞を、本発明に従って、その宿主細胞にＧｎＴＩＩＩ活性を導入することによって操作する。好ましくは、その宿主細胞を、必要に応じて、異種細胞のシグナル標的化ペプチドに（例えば、本発明のライブラリーおよび関連した方法を用いて）融合したＧｎＴＩＩＩ（例えば、図２４に示される、マウスのような哺乳動物のＧｎＴＩＩＩ）または酵素活性を有するそのドメインをコードする核酸分子で、形質転換する。
ＩｇＧは、２つの重鎖（図２２におけるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）（これは、３つのジスルフィド架橋を介してヒンジ領域に相互に連結される）、および２つの軽鎖（図２２におけるＶＬ、ＣＬ）からなる。その軽鎖（ドメインＶＬおよびＣＬ）は、別のジスルフィド架橋により、重鎖のＣＨ１部分に、ＣＨ１およびＶＨフラグメントと一緒に連結され、いわゆるＦａｂ領域を構成する。抗原は、このＦａｂ領域の末端部分に結合する。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＣＨ３領域、ＣＨ２領域およびヒンジ領域からなり、いわゆるエフェクター機能の発揮を担う（以下を参照のこと）。
抗体の主な機能は、抗原への結合である。しかし、抗原に直接結合して、（例えば、細菌毒素の場合のように）抗原を不活性化しない場合、いわゆるエフェクター機能が誘発されなければ、単なる結合は意味がない。ＩｇＧサブクラスの抗体は、２つの主要なエフェクター機能を発揮する：補体系の活性化およびファゴサイトーシスの誘導である。補体系は、炎症事象の制御、ファゴサイトーシスの活性化、および細胞膜の溶解による破壊に関与する、血清タンパク質の複雑な群からなる。補体活性化は、Ｃ１複合体が２つのＩｇＧのＦｃ部分へ極めて近接して結合することで開始する。Ｃ１は、１つの分子Ｃ１ｑ、なｒびに２つの分子Ｃ１ｒおよびＣ１ｓからなる。ファゴサイトーシスは、ＩｇＧのＦｃフラグメントとＦｃ−γレセプター（図２２におけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩｌおよびＦｃγＲＩＩＩ）との間の相互作用を介して開始される。Ｆｃレセプターは、免疫系のエフェクター細胞（特にマクロファージ、単球、骨髄細胞および樹状細胞）の表面に主に発現される。
そのＣＨ２部分は、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）において保存されたＮ−グリコシル化部位を有する。そのＡｓｎ２９７のＮ−グリカンは、非常に不均一であり、かつＦｃレセプター結合および補体活性化に影響を及ぼすことが公知である。ＩｇＧのごく少数（すなわち、約１５〜２０％）が、脱シアル化されたＮ−グリカンを有し、３〜１０％が、モノシアル化Ｎ−グリカンを有する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ（２００１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１４：１９−２６に総説されている）。興味深いことに、補体活性化およびＦｃレセプター結合が可能な十分に機能的な抗体に必要であることが示された最小のＮ−グリカン構造は、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する五糖（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３）である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏＰｈａｒｍ，２００１において総説されている）。Ａｓｎ２９７においてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｎ−グリカン未満しか有さないかまたはＮ−グリコシル化が全くない抗体は、なお抗原に結合し得るが、ファゴサイトーシスおよび補体活性化のような重要な下流事象をほとんど活性化しないようである。さらに、Ａｓｎ２９７に真菌型Ｎ−グリカンが結合した抗体は、おそらく、哺乳動物において免疫応答を誘発し、抗体を治療タンパク質として役に立たなくする。
（ＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
ＴＭドメインを欠いているマウスＧｎＴＩＩＩタンパク質の部分をコードするＤＮＡフラグメントを、マウス（または他の哺乳動物）のゲノムＤＮＡから、順方向プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号９４）および逆方向プライマー
Figure 2006518600
 （配列番号９５）を用いてＰＣＲ増幅する。これらのプライマーは、ＡｓｃＩ制限部位およびＰａｃＩ制限部位を含み、これらの部位は、リーダーライブラリーとの融合に適したベクターへのクローニングに使用され得る。
マウスＧｎＴＩＩＩの核酸配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）は、図２４に示される。
（免疫グロブリンコード配列のクローニング）
抗体の可変領域のクローニングのためのプロトコル（プライマー配列を含む）は、以前に公開されている。抗体源およびコード遺伝子は、とりわけ、インビトロで免疫されたヒトＢ細胞（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｃｋら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３９９５−３９９９を参照のこと）、末梢血リンパ球または単一のヒトＢ細胞（例えば、Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：８６２−８６９；およびＴｅｒｎｅｓｓら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６：１７−２７を参照のこと）およびヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウス（これは、ハイブリドーマ細胞株の作製を可能にする）であり得る。
標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、抗体をコードする核酸配列を、クローニングし得る。目的の免疫グロブリンをコードする遺伝情報の供給源は、代表的には、目的の細胞からの総ＲＮＡ調製物（例えば、血液リンパ球またはハイブリドーマ細胞株）である。例えば、特異的プライマーを使用するＰＣＲベースのプロトコルを使用することによって、可変領域を、ＩｇＧ ＣＨ１ドメイン部位にハイブリダイズする配列特異的プライマーおよびおよびマウスκ定常領域のアミノ酸１１１〜１１８をコードする第２のプライマーから開始される逆転写を介して、クローニングし得る。そのＶＨおよびＶＫのコードｃＤＮＡは、次いで、以前に公開されているように増幅され得る（例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２；Ｗｅｌｓｃｈｏｆら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９：２０３−２１４；およびＯｒｌａｎｄｉら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３を参照のこと）。免疫グロブリン全体（重鎖および軽鎖）のクローニング手順もまた、公開されている（例えば、Ｂｕｃｋｅｌら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５１：１３−１９；Ｒｅｃｉｎｏｓら（１９９４）Ｇｅｎｅ １４９：３８５−３８６；Ｒｅｃｉｎｏｓら（１９９５）Ｇｅｎｅ １５８：３１１−１２を参照のこと）。抗体フラグメントのクローニングおよび生成ならびに抗体発現構築物のためのさらなるプロトコルは、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２００１）編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする真菌発現プラスミドが、記載されている（例えば、Ａｂｄｅｌ−Ｓａｌａｍら（２００１）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｒａｌ．５６：１５７−１６４；およびＯｇｕｎｊｉｍｉら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１：５６１−５６７を参照のこと）。従って、免疫グロブリンの定常領域を有する発現プラスミドが生成され得る。これらの発現ベクターへの可変領域のクローニングを容易にするために、適切な制限部位を、可変領域の末端に極めて近く配置し得る。この定常領域は、可変領域が単一の制限消化／連結実験によってそれらにインフレームで容易に融合されうるように、構築され得る。図２３は、種々のモジュール様式で設計されたそのような発現構築物の模式図を示し、プロモーター、転写ターミネーター、組み込み標的化ドメインおよびさらに選択マーカーの容易な交換を可能にする。
図２３に示されるように、選択されたＶＬドメインおよびＶＨドメインは、それぞれ、ＣＬ領域およびＣＨ領域とインフレームで容易にクローニングされ得る。最初の組み込みを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ遺伝子座（または別の真菌細胞における相同な遺伝子座）に標的化し、そのメタノール誘導性ＡＯＸプロモーターは発現を駆動する。あるいは、任意の他の望ましい構成的プロモーターカセットまたは誘導性プロモーターカセットを使用し得る。従って、望ましいのであれば、その５’ＡＯＸ領域および３’ＡＯＸ領域ならびに転写ターミネーター（ＴＴ）フラグメントを、異なるＴＴ、プロモーター、および組み込み標的化ドメインで容易に置き換えて、発現を最適化し得る。最初に、標準的なＫＥＸプロテアーゼ部位を有するα因子分泌シグナルを使用して、重鎖および軽鎖の分泌を容易にする。発現ベクターの特性を、標準的な技術を使用して、さらに洗練し得る。
Ｉｇ発現ベクター（例えば、上記のもの）は、ＧｎＴＩＩＩを、好ましくは、宿主細胞のゴルジ装置において発現する、本発明の宿主細胞に導入される。このような宿主細胞において発現されるＩｇ分子は、二分しているＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。
（実施例１３）
（酵母株ＹＳＨ−１（Δｏｃｈ１，α１，２−マンノシダーゼ，ＧｎＴＩ）の生成）
以前に報告されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＫ６４（Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００（９）：５０２２−７）（ＯＣＨ１ノックアウトを有し、ヒトプラスミノゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）を発現する三重栄養要求株（ＡＤＥ、ＡＲＧ、ＨＩＳ））を、宿主株として使用した。ＢＫ６４を、制限酵素ＥｃｏＮＩで線状にしたプラスミドｐＰＢ１０３で形質転換して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターを宿主細胞に導入し、このようにして、株ＰＢＰ−１を作製した。マウスＭｎｓＩを、制限酵素ＥｃｏＮＩで線状にしたプラスミドｐＦＢ８で形質転換することによってこの株に導入し、株ＰＥＰ−２を生成した。株ＰＢＰ−２から単離されたタンパク質のＫ３グリカン分析により、存在する主な糖形態がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であることが実証された。
ＰＢＰ−２を、その後、制限酵素ＡａｔＩＩで線状にしたヒトＧｎＴＩプラスミドｐＮＡ１５で形質転換し、株ＰＢＰ−３を生成した。株ＰＢＰ−３において生成されたＫ３糖形態の分析により、混成型グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が主な構造であることが実証された。ＵＲＡ３マーカーをＰＢＰ−３から回収するために、この株を、５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ（５−ＦＯＡ，ＢｉｏＶｅｃｔｒａ）およびウラシル（Ｂｏｅｋｅら．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６）を含む最小培地での選択の前に、ＹＰＤ中で増殖させた。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を生成する、その回収されたＵｒａ−株を、ＹＳＨ−１と名付けた（図３６）。株ＹＳＨ−１からのそのＮ−グリカンプロフィールを図２５（上）に示す。このプロフィールは、１４６５ｍ／ｚにおける優勢なピークを示し、このピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する。
（実施例１４）
（酵母株ＹＳＨ−３７（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現マンノシダーゼＩＩ）の作製）
ＹＳＨ−１（実施例１３）を、制限酵素ＡｐａＩで線状化したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）プラスミド（ｐＫＤ５３）で形質転換し、株ＹＳＨ−３７（図３６）を作製した。ＹＳＨ−３７において産生されたＫ３グリカン構造の分析（図２５（下））は、１１４０ｍ／ｚにおいて支配的な糖形態が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応すること、ならびに１３０３ｍ／ｚにおける他の糖形態ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］、および１４６５ｍ／ｚにおけるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］を示した。
（実施例１５）
（酵母株ＹＳＨ−４４の作製）
株ＹＳＨ−３７（実施例１４）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化したラットＧｎＴＩＩ／ＭＮＮ２（ｓ）リーダーをコードするプラスミド（ｐＴＣ５３）で形質転換した。得られた株のＹＳＨ−４４（図３６）は、ポジティブモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって１３５６ｍ／ｚ（これは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応する）における単一の糖形態を有する、Ｋ３ Ｎ−グリカンを産生した（図２９）。
（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化）
ＹＳＨ−４４由来のグリカンを、糖タンパク質から、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら．Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８，４４５−４５４）の改変によって、遊離させ、そして分離した。これらのタンパク質を還元し、そしてカルボキシメチル化し、そしてその膜をブロックした後に、ウェルを水で３回洗浄した。このタンパク質を、１ミリ単位のＮ−グリカナーゼを含有する１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（３０μｌ）の添加によって、脱グリコシル化した。３７℃で１６時間の消化後、このグリカンを含有する溶液を遠心分離によって除去し、そして蒸発乾固させた。次いで、これらのグリカンを、ａＳＣ２１０Ａ ｓｐｅｅｄ ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓａｖａｎｔ，Ｈａｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）で乾燥させた。この乾燥させたグリカンを、３７℃で５０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．０）中に一晩置き、そして１ｍＵのヘキソース（ｈｅｘｏｓ）（Ｇｌｙｃｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を添加した。
（実施例１６）
（プラスミドｐＪＮ ３４８の構築）
プラスミドｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ（Ｊｉｍ Ｃｒｅｇｇから）を、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化して、ＡＯＸ発現カセットを遊離した。次いで、ｐＪＮ２６１由来のＧＡＰＤＨ／ＣＹＣ１発現カセットを含有するＢａｍＨＩフラグメント（図４Ｂ）（実施例４）を、ｐＢＬＵＲＡ−ＳＸ骨格に連結して、ｐＪＮ３３８を作製した。プラスミドｐＪＮ３３８を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで切断し、そしてインビトロでアニーリングされた２つのオリゴヌクレオチド
Figure 2006518600
 （配列番号９６）および
Figure 2006518600
 （配列番号９７）を、開いた部位に連結して、ｐＪＮ３４８を作製した。
（実施例１７）
（組込みプラスミドｐＲＣＤ２５９の構築）
ＧＡＰＤＨ発現ベクターｐＪＮ３４８を含有するＰｐＵＲＡ３を、ＸｈｏＩで線状化し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。ＨＹＧ耐性マーカーを、ｐＡＧ３２から、ＢｇＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、そして平滑化し、次いで、ｐＪＮ３４８に連結して、ｐＲＣＤ２５９を作製した。このｐＲＣＤ２５９は、ＰｐＵＲＡ３遺伝子座において組み込むＨＹＧ発現ベクターとして使用され得る。
（実施例１８）
（ＧｎＴＩＩＩ融合構築物の作製）
哺乳動物ＧｎＴＩＩＩと酵母標的化配列との間の融合構築物を、マウスＭｇａｔ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３９３７３、Ｂｈａｕｍｉｋら、１９９５）を使用して作製した。マウスＧｎＴＩＩＩ遺伝子のＮ末端決質Δ３２、Δ８６、およびΔ２１２に対応する３つのＤＮＡフラグメントを、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、順方向プライマーＭＧ３−Ｂ
Figure 2006518600
 （配列番号９８）、ＭＧ３−Ｃ
Figure 2006518600
 （配列番号９９）、ＭＧ３−Ｄ
Figure 2006518600
 （配列番号１００）、および逆方向プライマーＭＧ３−Ａ
Figure 2006518600
 （配列番号１０１）を用いて、ＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ生成物を、次いで、ｐＪＮ３４８ベクターにＡｓｃＩ−ＰａｃＩフラグメントとしてクローニングし、配列決定した。得られたベクターｐＶＡ（ＧｎＴＩＩＩΔ３２）、ｐＶＢ（ＧｎＴＩＩＩΔ８６）、およびｐＶＣ（ＧｎＴＩＩＩΔ２１２）を、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ酵素で消化し、酵母リーダーライブラリー（リーダー２０〜６７）との連結のために使用した。これらの標的化ペプチドを、３２アミノ酸Ｎ末端欠失、８６アミノ酸Ｎ末端欠失、２１２アミノ酸Ｎ末端欠失を有する、マウスＧｎＴＩＩＩから選択される触媒ドメインに融合する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＭＮＮ２標的化ペプチド（長、中間および短）およびＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するＧＮＴＩ（中間および短）（実施例１１を参照のこと）を、表１１に示す。
（表１１．Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１においてＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を示す標的化ペプチド配列／触媒ドメインの代表的なコンビナトリアルライブラリー）
Figure 2006518600
 （実施例１９）
（二分型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＰＢＰ−３）（実施例８を参照のこと）を、５−ＦＯＡに対して対比選択し、それにより、ＵＲＡ３＋マーカーおよびｕｒａ３−表現型の遺伝子座について選択する。この株（ＹＳＨ−１と名付けた（図３６））を、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）触媒ドメインのライブラリー（ベクターｐＶＡ、ｐＶＢ、およびｐＶＣ）ならびにリーダーで形質転換した。形質転換体を、ＢＭＧＹ中で、ＯＤ６００＝約１０になるまで３０℃で増殖させ、遠心分離によって採取し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノゲンのクリングル３）の生成を誘導した。Ｋ３を、９６ウェル形式を利用して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験ロボットでＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される、彼らのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてのプロトコルの適合形である（実施例３）。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離させた（実施例３）。Ｎ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（実施例３）で分析した。そのＧｎＴＩＩＩ活性を、表１１に示す。（＋）の数は、本明細書で用いられる場合、中性グリカン％のうちの二分型Ｎ−グリカン生成の相対レベルを示す。標的化ペプチド配列を、以下からなる群より選択した：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧＬＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２、Ｐｉｃｈａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＴ１、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６。二分しているＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を示すそのｐＶＡ５３形質転換体を、ＰＢＰ２６と名付けた（図３６）。
（実施例２０）
（二分型ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４の操作）
株ＹＳＨ−４４におけるＧｎＴＩＩＩの発現のために（図３６）、ベクターｐＶＡ５３、ｐＶＢ５３、ｐＶＡ５４、およびｐＶＢ５４からのＧｎＴＩＩＩ構築物を、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩフラグメントとしてｐＲＣＤ２５９に移して、ベクターｐＰＢ１３５、ｐＰＢ１３７、ｐＰＢ１３６、およびｐＰＢ１３８を作製した。そのベクターは、ＨＹＧ耐性マーカーおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３遺伝子を、ゲノム組み込みのための標的化タンパク質として含む。プラスミドをＳａｌＩで線状にし、株ＹＳＨ−４４にエレクトロポレーションによって形質転換し、ハイグロマイシンを含む培地で選択し、得られた株を、精製Ｋ３から遊離されたグリカンの分析によりスクリーニングする。形質転換体を、ＢＭＧＹ中、ＯＤ６００＝約１０になるまで２４℃で増殖させ、遠心分離によって採取し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノゲンのクリングル３）の生成を誘導した。Ｋ３を、９６ウェル形式を利用して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験ロボットでＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した（実施例３）。そのロボット精製は、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される、彼らのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてのプロトコルの適合形である（実施例３）。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離させた（実施例３）。Ｎ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した（実施例３）。二分しているＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を示すｐＰＢ１３５形質転換体を、ＹＳＨ−５７と名付けた（図３６）。表１１は、マウスＧｎＴＩＩＩの活性を示す。
（実施例２１）
（二分型ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５の操作）
そのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５（実施例１１）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２に由来する標的化ペプチドにインフレームで連結したマウスＧｎＴＩＩＩ触媒ドメイン（Ａ３２）をコードするプラスミドｐＰＢ１３５（表１１）で形質転換した。形質転換体を、ＢＭＧＹ中で、ＯＤ６００が約１０になるまで３０℃で増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、ＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノゲンのクリングル３）の生成を誘導した。Ｋ３を、９６ウェル形式を利用して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験ロボットでＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。そのロボット精製は、Ｎｏｖａｇｅｎによって提供される、彼らのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてのプロトコルの適合形である（実施例３）。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化によって遊離させた（実施例３）。二分しているＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を示す形質転換体を、ＰＢＰ−３８と名付けた（図３６）。表１１は、マウスＧｎＴＩＩＩの活性を示す。
（実施例２２）
（操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７において基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を使用する、インビトロＧｎＴＩＩＩ活性のアッセイ）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７におけるあらゆる潜在的なエキソビボＧｎＴＩＩＩ活性を試験するために、細胞培養上清を、ＧｎＴＩＩＩ活性について試験した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−５７細胞を、ＢＭＧＹ中で２４℃でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、そしてＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の産生を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって回収して、本質的に透明な上清を得た。この上清のアリコートを、ＧｎＴＩＩＩアッセイのために取り出し、そして残りを、分泌された可溶性Ｋ３の回収のために使用した。Ｋ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験室ロボットでの９６ウェル形式を利用するＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって、培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｂａｇｅｎによって、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して提供されるプロトコルの適合形である（実施例３）。これらのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化（実施例３）によって遊離させた。先に取り出した上清のアリコートを、分泌されたＧｎＴＩＩＩ活性の存在について、さらに試験した。ＰＢＰ−３株において発現されたＫ３から精製されたＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；ｐＶＡ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）；ＹＳＨ−５７の上清＋１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ；（Ｄ）。室温で８時間のインキュベーション後、サンプルを、アミノシリカＨＰＬＣによって分析して、ＧｎＴＩＩＩ活性の程度を決定した。
（実施例２３）
（操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７における、基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を用いるインビトロＧｎＴＩＩＩ活性アッセイ）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ−５７におけるあらゆる潜在的なエキソビボＧｎＴＩＩＩ活性を試験するために、細胞培養上清を、ＧｎＴＩＩＩ活性について試験した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−５７細胞を、ＢＭＧＹ中で２４℃でＯＤ６００＝約１０まで増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、そしてＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、Ｋ３（ヒトプラスミノーゲン由来のクリングル３）の産生を誘導した。２４時間の誘導後、細胞を遠心分離によって回収して、本質的に透明な上清を得た。この上清のアリコートを、ＧｎＴＩＩＩアッセイのために取り出し、そして残りを、分泌された可溶性Ｋ３の回収のために使用した。Ｋ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験室ロボットでの９６ウェル形式を利用するＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって、培地から精製した。このロボットによる精製は、Ｎｏｂａｇｅｎによって、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂に対して提供されるプロトコルの適合形である（実施例３）。これらのＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ消化（実施例３）によって遊離させた。先に取り出した上清のアリコートを、分泌されたＧｎＴＩＩＩ活性の存在について、さらに試験した。ＹＳＨ−４４株において発現されたＫ３から精製されたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；ｐＶＡ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）。室温で８時間のインキュベーション後、サンプルを、アミノシリカＨＰＬＣによって分析して、ＧｎＴＩＩＩ活性の程度を決定した。
（実施例２４）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｎＴＩＶのクローニングおよび発現）
ヒトＧｎＴＩＶタンパク質アイソエンザイムＡ（ＭＧＡＴ４Ａ）の、ＴＭドメインを欠く部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトｃＤＮＡから、順方向プライマーＨＧＩＶ−２
Figure 2006518600
 および逆方向プライマーＨＧＩＶ−３
Figure 2006518600
 を使用してヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、配列決定した。リーダーライブラリーとの融合物のために適切なベクター中にクローニングするために、ＤＮＡフラグメントを、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーおよびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ順方向プライマー：ＨＧＩＶ−ＡＳＣ１
Figure 2006518600
 、ＨＧＩＶ−ＡＳＣ２
Figure 2006518600
 、ＨＧＩＶ−ＡＳＣ３
Figure 2006518600
 。ＰａｃＩ逆方向プライマーＨＧＩＶ−ＰＡＣ
Figure 2006518600
 。ヒトＧｎＴＩＶ Ａの核酸配列およびアミノ酸配列が、図４１に示される。
同様に、ヒトＧｎＴＩＶタンパク質アイソエンザイムＢ（ＭＧＡＴ４Ｂ）の、ＴＭドメインを欠く部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトｃＤＮＡから、順方向プライマーＨＧＩＶＢ−２
Figure 2006518600
 および逆方向プライマーＨＧＩＶＢ−３
Figure 2006518600
 を使用してヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列決定した。リーダーライブラリーとの融合物のために適切なベクター中にクローニングするために、ＤＮＡフラグメントを、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーおよびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ順方向プライマー：ＨＧＩＶＢ−Ａ１
Figure 2006518600
 、ＨＧＩＶＢ−Ａ２
Figure 2006518600
 。ＰａｃＩ逆方向プライマーＨＧＩＶＢ−Ｐ
Figure 2006518600
 。ヒトＧｎＴＩＶ Ｂの核酸配列およびアミノ酸配列が、図４２に示される。
（表１２．複数のアンテナを有する構造の発現のためのＧｎＴＶ融合構築物またはＧｎＴＩＶ融合構築物を含む、プラスミド）
Figure 2006518600
 （実施例２５）
（トリアンテナグリカン構造を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
複合グリカン構造を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４株（実施例１５）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）［ヌクレオチド１〜１０８］標的化ペプチドにインフレームで連結されたヒトＧｎＴＩＶＢ触媒ドメイン（Δ１０４）をコードする遺伝子フラグメントを含むプラスミドｐＰＢ１４４（表１２）で形質転換した。プラスミドｐＰＢ１４４はまた、ＨＹＧ耐性マーカーと、ゲノム組み込みのための標的化配列としてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＵＲＡ３遺伝子とを含む。１μｇプラスミドを、ＳａｌＩを用いて線状化し、エレクトロポレーションによって株ＹＳＨ−４４中に形質転換し、ハイグロマイシンを含む培地上で選択した。生じた株を、精製Ｋ３から遊離されたグリカンの分析によってスクリーニングした。形質転換体を、ＢＭＧＹ中で３０℃にてＯＤ６００＝約１００まで増殖させ、遠心分離によって収集し、そしてＢＭＭＹに移して、ＡＯＸ１プロモーターの制御下でのＫ３（ヒトプラスミノゲン由来のクリングル３）の生成を誘導した。Ｋ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢｉｏＭｅｋ ２０００実験室ロボットにて９６ウェル形式を使用するＮｉアフィニティクロマトグラフィーによって、培地から精製した。このロボット精製は、そのＨｉｓＢａｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって提供されるプロトコル（実施例３）の適合形である。そのＮ−グリカンを、ＰＮＧアーゼ消化（実施例３）によって遊離させた。そのＮ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（実施例３）を用いて分析した。オリゴ糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）のＭａｎα１，３アーム上へのＧｌｃＮＡｃ残基の転移を示す形質転換体を、ＰＢＰ４３（図４７）と名付けた。Ｎ−グリカンの分析により、１５４３ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｙ］が提供され、これは、グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する。
（実施例２６）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｎＴＶのクローニングおよび発現）
ＴＭドメインを欠くマウスＧｎＴＶタンパク質の一部（ＭＧＡＴ４５）をコードするＤＮＡフラグメントを、順方向ＭＧＶ−２プライマー
Figure 2006518600
 および逆方向ＭＧＶ−３プライマー
Figure 2006518600
 を使用して、マウスｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして配列決定した。リーダーライブラリーとの融合物のために適切なベクター中にクローニングするために、ＤＮＡフラグメントを、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーおよびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ順方向プライマー：ＭＧＶ−ＡＳＣ１
Figure 2006518600
 、ＭＧＶ−ＡＳＣ２
Figure 2006518600
 、ＭＧＶ−ＡＳＣ３
Figure 2006518600
 。ＰａｃＩ逆方向プライマーＭＧＶ−ＰＡＣ
Figure 2006518600
 。マウスＧｎＴＶの核酸配列およびアミノ酸配列が、図４３に示される。
（実施例２７）
（ＧｎＴＶを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
複合グリカン構造を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４株（実施例１５）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）に由来する標的化ペプチドにインフレームで連結されたマウスＧｎＴＶ触媒ドメイン（Δ４５）をコードする遺伝子フラグメントを含むプラスミドｐＰＢ１４０（表１２）で形質転換した。培養条件は、実施例２５と同じであった。２つの形質転換体由来のＫ３レポータータンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して分析した。１５５９ｍ／ｚにおけるピーク［ｙ］は、グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図４８）。１３５５ｍ／ｚにおけるピーク［ｕ］は、グリカンＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する。
（実施例２８）
（糖タンパク質上でテトラアンテナ構造を生成するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
テトラグリカン構造（例えば、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を生成するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４３株（実施例２５）を、マウスＧｎＴＶをコードするプラスミドｐＰＢ１４０（図４０Ｂ）で形質転換した。このベクターｐＰＢ１４０は、ＫＡＮ耐性マーカーと、ゲノム組み込みのための標的化配列としてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ３遺伝子とを含む。１μｇのプラスミドを、ＫｐｎＩを用いて線状化し、エレクトロポレーションによって株ＰＢＰ４３中に形質転換し、カナマイシンを含む培地上で選択した。生じた株を、精製Ｋ３から遊離されたグリカンの分析によってスクリーニングした。培養条件は、実施例２５と同じであった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるＫ３レポータータンパク質の分析は、１７４７ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｚ］を示した。これは、テトラアンテナグリカンＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図４９）。生じたグリカンのヘキソサミニダーゼ消化（実施例１５参照）によって、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークの質量が示された（データは示さない）。
第二の実験において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４を、ｐＰＢ１２８およびｐＰＢ１４０（表１２）で形質転換した。Ｋ３レポータータンパク質を生成する形質転換体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる分析によって、１７４３ｍ／ｚにおける優勢なピーク［ｚ］が示された。このピークは、テトラアンテナグリカンＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図５０）。
（実施例２９）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＧｎＴＩＸのクローニングおよび発現）
ヒトＧｎＴＩＸ（ＡＢ１０９１８５．１）の核酸配列およびアミノ酸配列が、図４５に示される。ＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＧｎＴＩＸの一部をコードするコドンを最適化したＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲを使用してオリゴヌクレオチドから合成した（図４６）。ＧｎＴＩＸ触媒ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）に由来する標的化ペプチドにインフレームで連結した。生じたプラスミドｐＰＢ１７６（図４０Ｃ）を、ＫｐｎＩを用いて線状化し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４株（実施例１５）中に形質転換して、複合テトラアンテナグリカン構造を生成した。培養条件は、実施例２５と同じであった。形質転換体由来のＫ３レポータータンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用して分析した。
図１Ａは、代表的な真菌Ｎ−グリコシル化経路の模式図である。 図１Ｂは、代表的なヒトＮ−グリコシル化経路の模式図である。 図２は、融合構築物のコンビナトリアルＤＮＡライブラリーの構築を示す。図２Ａは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）への、標的化ペプチドフラグメントの挿入を示す。図２Ｂは、制限部位ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩを有する産生された標的化ペプチドサブライブラリーを示す。図２Ｃは、改変されたｐＵＣ１９ベクターであるｐＪＮ３４７への、触媒ドメイン領域の挿入を示す。図２Ｄは、制限部位ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを有する、産生された触媒ドメインサブライブラリーを示す。図２Ｅは、標的化ペプチドサブライブラリーおよび触媒ドメインサブライブラリーから産生された、１つの特定の融合構築物を示す。 図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号４８）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号４９）を示す。Ｎ末端短縮物を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図３は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ α−１，２−マンノシダーゼＩＡオープンリーディングフレーム核酸配列（配列番号４８）およびコードされたポリペプチド配列（配列番号４９）を示す。Ｎ末端短縮物を生成するために使用されたＰＣＲプライマーの配列は、下線が引かれている。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図４Ａ〜４Ｆは、複数の栄養要求性マーカーを含むベクターの操作、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＯＣＨ１遺伝子座への標的タンパク質の遺伝的組込みを示す。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するヒトプラスミノゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）糖タンパク質の生成を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図５Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］グリカン（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］を示す。図５Ｂは、Ｋ３野生型からＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。示したＮ−グリカンは以下の通りである：Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］。図５Ｃは、優勢なＮ−グリカンとしてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］の産生を生じるｏｃｈ１欠失を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、キメラα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のインビボトリミングの後の、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の産生を示す。優勢なＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と合致する、質量（ｍ／ｚ）１２５３を有するピークによって示される。 図６Ａ〜６Ｆは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、優勢なＮ−グリカン構造としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有するＩＦＮ−β糖タンパク質の産生を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。図６Ａは、標準的なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］および標準物質としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｎａ＋［ｂ］（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を示す。図６Ｂは、ＩＦＮ−β野生型からＰＮＧａｓｅによって遊離されたグリカンを示す。図６Ｃは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］；Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］；Ｍａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２［ｅ］；Ｍａｎ１１ＧｌｃＮＡｃ２［ｆ］；Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］を産生するｏｃｈ１ノックアウト；およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の非産生を示す。図６Ｄは、他の中間体Ｎ−グリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］〜Ｍａｎ１２ＧｌｃＮＡｃ２［ｇ］のうちで、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］が相対的に少量であることを示す。図６Ｅは、ｐＧＣ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＢ Δ９９）によって産生された他のグリカンＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対して、有意な量のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］を示す。図６Ｆは、ｐＦＢ８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＳＥＣ１２（ｍ）／マウスマンノシダーゼＩＡ Δ１８７）による分泌糖タンパク質ＩＦＮ−βにおける、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生を示す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としてのその同定と一致する、質量（ｍ／ｚ）１２５４を含むピークによって示される。 図７は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＦＢ８マンノシダーゼで形質転換されたΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは、上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露の後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。 図８は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＧＣ５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼへの曝露後に２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ポジティブコントロール）。 図９は、以下についての高速液体クロマトグラムを示す：（Ａ）２−ＡＢで標識されたＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準物質（ネガティブコントロール）；（Ｂ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＢＣ１８−５マンノシダーゼで形質転換したΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは上清中の細胞外マンノシダーゼ活性の欠如を示す；および（Ｃ）培地Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＤＤ２８−３で形質転換されたΔｏｃｈ１）培地の上清であり、これは、上清中の活性を示す（ポジティブコントロール）。 図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの活性を示す。図１０Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］のいくらかの産生を生じるが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の優勢な産生を生じるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターなしに、ヒトＧｎＴＩで形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＹＳＨ−３）を示す。図１０Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の優勢な産生をもたらした、ヒトＧｎＴＩで形質転換された株（ＰＢＰ−３）におけるＫ．ｌａｃｔｉｓに由来するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの付加を示す。質量（ｍ／ｚ）１４５７での単一の突出したピークは、図１０Ｂに示されるようにＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］としての同定と一致する。 図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現されたｐＢＢ２７−２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１０（ｓ）／Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ Δ３１）によってコードされた異種マンノシダーゼ酵素のｐＨ最適値を示す。 図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの無細胞抽出物から遊離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。図１２Ａは、高マンノース型Ｎ−グリカンを含む、野生型細胞から遊離されたＮ−グリカンを示す。図１２Ｂは、ｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から遊離されたＮ−グリカンを示し、これは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］としてのその同定と一致して、１９０８における質量（ｍ／ｚ）の明瞭なピークを示す。図１２Ｃは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と一致するピークに対応する、インビトロα−１，２−マンノシダーゼ消化後のｏｃｈ１ ｍｎｎ１欠失細胞から遊離されたＮ−グリカンを示す。 図１３は、ドリキル（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）ピロリン酸結合オリゴ糖の構造の模式図である。 図１４は、ａｌｇ３活性、ａｌｇ９活性、またはａｌｇ１２活性を欠いている真菌宿主細胞に由来するＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の生成の模式図である。 図１５は、ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子型を有する真菌宿主細胞における哺乳動物型オリゴ糖構造を生成するために必要なプロセシング反応の模式図である。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１６は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号９〜２０）。 図１７は、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＬＧ３配列（配列番号２１）およびＡｌｇ３ｐ配列（配列番号２２）を示す。 図１８は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列（配列番号２３）およびＡｌｇ３ｐ配列（配列番号２４）配列を示す。 図１９は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号２３〜３１）。 図１９は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号２３〜３１）。 図１９は、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号２３〜３１）。 図２０は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３配列（配列番号３３）およびＡｌｇ３ｐ配列（配列番号３４）配列を示す。 図２１は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＡＬＧ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す（それぞれ、現れる順に、配列番号３５〜４０）。 図２２は、ＩｇＧ免疫グロブリンのモデルを示す。重鎖および軽鎖は、類似する二次構造および三次構造に基づいて、ドメインにさらに分けられ得る。２つの重鎖（ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）は、３つのジスルフィド架橋を介して連結されている。それらの軽鎖（ドメインＶＬおよびＣＬ）は、別のジスルフィド架橋によってその重鎖のＣＨ１部分へと連結され、ＣＨ１フラグメントおよびＶＨフラグメントと一緒になって、Ｆａｂ領域を形成する。抗原は、そのＦａｂ領域の末端部分に結合する。エフェクター機能（例えば、Ｆｃ−γ−レセプター結合）は、そのＣＨ２ドメイン（そのヒンジ領域のすぐ下流にある）に局在化しており、その重鎖におけるアスパラギン２９７のＮ−グリコシル化によって影響を受ける。 図２３は、モジュラーＩｇＧ１発現ベクターの模式図である。 図２４は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉｓ ＧｎＴ ＩＩＩの核酸配列（配列番号４５）およびアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。 図２５（上）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応する、１４６１ｍ／ｚにおいて優勢なピークを示す、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。図２５（下）は、１１４０ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｂ］の質量に対応する優勢なピークを示し、１３０３ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２［ｃ］に対応する他のピーク、および１４６５ｍ／ｚにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］に対応する他のピークを示す、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩΔ７４／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示す。この株を、ＹＳＨ−３７と名付けた。 図２６（上）は、図２５（上）に示される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である；図２６（下）は、ｐＶＡ５３構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｓ ＹＳＨ−１細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１４６３ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応し、１６６６ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の質量に対応する。 図２７（上）は、図２５（上）に示される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である；図２７（下）は、ｐＶＡ５５構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１４６３ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応し、１６６７ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ａ］の質量に対応する。 図２８（上）は、図２５（上）に示され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１において生成されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である；図２８（下）は、ｐＶＢ５１構築物（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＧＮＴ１（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−１細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１４６３ｍ／ｚにおける優勢なピークは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２［ｄ］の質量に対応し、１７２６ｍ／ｚにおける第二のピーク［ｅ］が観察され、この第二のピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の質量に対応しない。 図２９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３５６ｍ／ｚにおける優勢なピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応する。 図３０は、ｐＶＡ５３構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３４０ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応し、１５４２ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｙ］の質量に対応する。 図３１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３４０ｍ／ｚにおける優勢なピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応する。 図３２は、ｐＶＡ５３構築物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ｍＧｎＴＩＩＩ）で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ６−５細胞において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１３４０ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｘ］の質量に対応し、１５４３ｍ／ｚにおけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２［ｙ］の質量に対応する。 図３３は、上清中に細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を欠いている（ｐＶＡ５３）ことを実証する高速液体クロマトグラムを示す。ＰＢＰ−３株において発現されるＫ３から精製されたＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；ｐＶＡ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）；およびＹＳＨ−５７の上清＋１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｄ）。 図３４は、上清において細胞外ＧｎＴＩＩＩ活性を欠いている（ｐＶＡ５３）ことを実証する高速液体クロマトグラムを示す。ＹＳＨ−４４株において発現されるＫ３から精製されたＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を、以下に添加した：ＢＭＭＹ（Ａ）；ＢＭＭＹ中の１ｍＭ ＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（Ｂ）；およびｐＶＡ５３で形質転換したＹＳＨ−４４［ＹＳＨ−５７］の上清（Ｃ）。 図３５は、ヒトおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｓにおける通常のグリコシル化経路（パネルＡ）と、下等真核生物において操作されたヒト化Ｎ−グリコシル化経路（パネルＢ）とを比較する模式図である。その操作された経路は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ６−５の構築を示し、これは、ＧｎＴＩＩＩで改変された後にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＢＰ３８になる。 図３６は、指定のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の各々によって生成される優勢な分泌糖形態、およびそれらの株の各々を操作するために使用される遺伝子改変を示す、模式図である。 図３７は、ＧｎＴＩＩＩによって触媒される、ＧｌｃＮＡｃを、下等真核生物宿主細胞における糖タンパク質において生成されるオリゴ糖中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に転移する構造的模式図である。 図３８は、ＧｎＴＩＩによって触媒される、ＧｌｃＮＡｃを、下等真核生物宿主細胞における糖タンパク質において生成されるオリゴ糖中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に転移し、その後、ＧｎＴＩＩＩによって触媒される、その反応の生成物ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２にＧｌｃＮＡｃを転移する構造的模式図である。 図３９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ、およびＧｎＴＩＸによって触媒される、オリゴ糖中間体上へのＧｌｃＮＡｃの転移を示す構造的模式図である。 図４０は、３つの例示的なプラスミド地図を示す。図４０Ａは、マウスＧｎＴ ＩＶをコードする遺伝子フラグメントを含むｐＢ１４４を示す。図４０Ｂは、ヒトＧｎＴ ＩＶをコードする遺伝子フラグメントを含むｐＢ１４０を示す。図４０Ｃは、宿主Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける形質転換のために使用されるマウスＧｎＴ ＩＸをコードする遺伝子フラグメントを含むｐＢ１７６を示す。 図４１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＡ（ＭＧＡＴ４Ａ）（登録番号ＮＭ＿０１２２１４）をコードする遺伝子を示す。 図４１は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＡ（ＭＧＡＴ４Ａ）（登録番号ＮＭ＿０１２２１４）をコードする遺伝子を示す。 図４２は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＢ（ＭＧＡＴ４Ｂ）（登録番号ＮＭ＿０１４２７５）をコードする遺伝子を示す。 図４２は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのマンノシル（α１，３−）−糖タンパク質β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アイソザイムＢ（ＭＧＡＴ４Ｂ）（登録番号ＮＭ＿０１４２７５）をコードする遺伝子を示す。 図４３は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｍｇａｔ５）（登録番号ＡＦ４７４１５４）をコードする遺伝子を示す。 図４３は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｍｇａｔ５）（登録番号ＡＦ４７４１５４）をコードする遺伝子を示す。 図４４は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ（登録番号ＡＢ０４０６０８）をコードする遺伝子を示す。 図４４は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ（登録番号ＡＢ０４０６０８）をコードする遺伝子を示す。 図４５は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ（登録番号ＡＢ１０９１８５．１）をコードする遺伝子を示す。 図４５は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ（登録番号ＡＢ１０９１８５．１）をコードする遺伝子を示す。 図４６は、ＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸの一部をコードする、コドンを最適化したＤＮＡフラグメントを示す。 図４６は、ＴＭドメインを欠く（Δ４３）ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸの一部をコードする、コドンを最適化したＤＮＡフラグメントを示す。 図４７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４３において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／ヒトＧｎＴ ＩＶ融合構築物で形質転換された。１５４３におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量［ｙ］に相当する。 図４８は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ３２において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／マウスＧｎＴ Ｖ融合構築物で形質転換された。１５５９におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量［ｙ］に相当する。 図４９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ４６において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。１５４３におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量［ｙ］に相当し、１７４７におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量［ｚ］に相当する。 図５０は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＢＰ９４において発現されるクリングル３糖タンパク質から単離されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＹＳＨ−４４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／マウスＧｎＴ ＩＶＡ融合構築物を含むｐＰＢ１２８と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ２（ｓ）／マウスＧｎＴ Ｖ融合構築物を含むｐＰＢ１４０とで形質転換された。１７４３におけるピークは、ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量［ｚ］に相当する。

Claims (51)

  1. 下等真核生物宿主細胞中で糖タンパク質を生成するためのプロセスであって、
    該細胞中に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性からなる群より選択されるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を導入する工程、
    を包含し、該糖タンパク質は、トリマンノースコア上に少なくとも３つのアンテナを含む、プロセス。
  2. 下等真核生物宿主細胞中で糖タンパク質を生成するためのプロセスであって、
    該細胞において、ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造；およびＧｌｃＮＡｃβ１，６ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造を含む、複数のアンテナを有するＮ−グリカンを生成する１つ以上の酵素活性を発現させる工程、
    を包含する、プロセス。
  3. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記活性は、実質的に細胞内活性である、プロセス。
  4. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記宿主細胞から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、プロセス。
  5. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、プロセス。
  6. 請求項５に記載のプロセスであって、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ ｓｐ．からなる群より選択される、プロセス。
  7. 請求項６に記載のプロセスであって、前記宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、プロセス。
  8. 請求項１または２に記載のプロセスであって、前記糖タンパク質は、治療タンパク質である、プロセス。
  9. 請求項８に記載のプロセスであって、前記治療タンパク質は、ヒトプラミノゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、カイメース、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、脈管内皮増殖因子２、骨髄前駆体阻害因子１、オステオプロテゲリン、α１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α−フェトタンパク質、ＦＳＨ、およびペプチドホルモンからなる群より選択される、プロセス。
  10. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶＩ活性、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＸ活性を含む、宿主細胞。
  11. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ活性を含む、宿主細胞。
  12. 請求項１０または１１に記載の宿主細胞であって、前記活性は、実質的に細胞内活性である、宿主細胞。
  13. 請求項１０または１１に記載の宿主細胞であって、該細胞は、ＧｎＴ ＩＶ活性、ＧｎＴ Ｖ活性、またはＧｎＴ ＶＩ活性と反応可能であるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含むＮ−グリカンを生成する、宿主細胞。
  14. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖上に少なくとも３つのＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを含む、宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記Ｎ−グリカンは、少なくとも５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％以上のトリアンテナグリカンを含む、宿主細胞。
  16. 請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記Ｎ−グリカンは、少なくとも７０モル％、８０モル％、９０モル％以上のトリアンテナグリカンを含む、宿主細胞。
  17. 下等真核生物宿主細胞であって、ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮａｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造；およびＧｌｃＮＡｃβ１，６ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎα１，３）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ａｓｎ構造を含む、複数のアンテナを有するＮ−グリカンを含む、宿主細胞。
  18. 請求項１０、１１、１４、または１７に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、宿主細胞。
  19. 請求項１８に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔｉａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ ｓｐ．からなる群より選択される、宿主細胞。
  20. 請求項１９に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、宿主細胞。
  21. 下等真核生物宿主細胞であって、ＧｌｃＮＡｃβ１，４トランスフェラーゼもしくはＧｌｃＮＡｃβ１，６トランスフェラーゼによって改変された、トリマンノースコア（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）構造もしくはＭａｎ５コア構造（ＧｌｃＮａｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を含む、宿主細胞。
  22. 請求項２１に記載の宿主細胞であって、該細胞は、７０モル％を超える前記改変型構造を生成する、宿主細胞。
  23. 請求項２１に記載の宿主細胞であって、該細胞は、９０モル％を超える前記改変型構造を生成する、宿主細胞。
  24. 下等真核生物宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ活性を含む、宿主細胞。
  25. 請求項２４に記載の宿主細胞であって、前記活性は、実質的に細胞内活性である、宿主細胞。
  26. 請求項２４に記載の宿主細胞であって、該細胞は、ＧｎＴ Ｖ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性、またはＧｎＴ ＩＸ活性と反応可能であるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含むＮ−グリカンを生成する、宿主細胞。
  27. 請求項２４に記載の宿主細胞であって、前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性は、複数のアンテナを有するグリカンを生成する、宿主細胞。
  28. 下等真核生物宿主細胞であって、ＧｎＴ ＩＶ活性、ＧｎＴ Ｖ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性またはＧｎＴ ＩＸ活性と、マンノシダーゼＩＩ活性とを含む、宿主細胞。
  29. 請求項２８に記載の宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性をさらに含む、宿主細胞。
  30. 請求項２９に記載の宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、宿主細胞。
  31. 請求項２８に記載の宿主細胞であって、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ活性およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性をさらに含む、宿主細胞。
  32. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠損している、宿主細胞。
  33. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性が欠損している、宿主細胞。
  34. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、α−１，２−マンノシダーゼＩ活性をさらに含む、宿主細胞。
  35. 請求項１０、１１、２４、または２８のうちのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをさらに含む、宿主細胞。
  36. 請求項１に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  37. 請求項２に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  38. 請求項５に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  39. 請求項６に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  40. 請求項７に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  41. 請求項８に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  42. 請求項９に記載のプロセスによって生成される糖タンパク質。
  43. 糖タンパク質であって、下等真核生物宿主細胞において生成されたＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造上に、少なくとも３つのＧｌｃＮＡｃβ１，４残基または少なくとも３つのＧｌｃＮＡｃβ１，６残基を含む、糖タンパク質。
  44. 糖タンパク質であって、下等真核生物宿主細胞において生成された基質ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、基質ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、基質Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造、または基質Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造のＭａｎα１，３アームもしくはＭａｎα１，６アームのうちのいずれかに結合している、ＧｌｃＮＡｃβ１，４残基を含む、糖タンパク質。
  45. 請求項４４に記載の糖タンパク質であって、前記コア構造のうちの７０モル％より多くが、ＧｎＴ ＩＶによって改変されている、糖タンパク質。
  46. 請求項４４に記載の糖タンパク質であって、前記コア構造のうちの５０モル％より多くが、ＧｎＴ Ｖによって改変されている、糖タンパク質。
  47. 請求項３６〜４６のうちのいずれか１項に記載の糖タンパク質を含む、薬学的組成物。
  48. 下等真核生物宿主においてＧｎＴ ＩＶ活性、ＧｎＴ Ｖ活性、ＧｎＴ ＶＩ活性、ＧｎＴ ＩＸ活性を発現可能である、ベクター。
  49. 下等真核生物宿主細胞であって、トリマンノースコアオリゴ糖中間体のＭａｎα１，３アームまたはＭａｎ１，６アームのいずれかにて少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃ残基を有するＮ−グリカンを含む、宿主細胞。
  50. 請求項４９に記載の下等真核生物宿主細胞であって、前記トリマンノースコアオリゴ糖中間体のＭａｎα１，３アームおよびＭａｎ１，６アームにて２つのＧｌｃＮＡｃβ１，４残基をさらに含む、宿主細胞。
  51. 請求項４９に記載の下等真核生物宿主細胞であって、前記トリマンノースコアオリゴ糖中間体のＭａｎα１，３アームおよびＭａｎ１，６アームにて２つのＧｌｃＮＡｃβ１，６残基をさらに含む、宿主細胞。
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