JP4792387B2 - 下等真核生物細胞におけるクラス2マンノシダーゼおよびクラスiiiマンノシダーゼの発現 - Google Patents
下等真核生物細胞におけるクラス2マンノシダーゼおよびクラスiiiマンノシダーゼの発現 Download PDFInfo
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Description
本出願は、米国出願第10/616,082号に対する優先権を主張し、この出願は、2000年6月28日に出願された米国仮出願第60/214,358号、2000年6月30日に出願された米国仮出願第60/215,638号、および2001年3月30日に出願された米国仮出願第60/279,997号の米国特許法第119条(e)下の利益を主張する、2001年6月27日に出願された米国出願第09/892,591号の一部継続出願である、2003年2月20日に出願された米国出願第10/371,877号の一部継続出願であり、これらの出願の各々が、その全体が、参考として本明細書中に援用される。
本発明は、下等真核生物におけるタンパク質グリコシル化の分野、具体的には、Manα1,3および/またはManα1,6グリコシル結合の加水分解に対して基質特異性を有するマンノシダーゼ酵素の導入に関する。本発明は、さらに、マンノシダーゼ酵素、および加水分解の結果として生じたN−グリカンまたはN−グリカン含有中間体をコードする遺伝子を含む新規な宿主細胞に関する。
(ヒトおよび下等真核生物におけるグリコシル化経路)
DNAが転写され、タンパク質に翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセシングは糖残基の結合、グリコシル化として知られるプロセスを含む。異なる生物は異なるグリコシル化酵素(グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ)を生産し、利用可能な異なる基質(ヌクレオチド糖)を有し、従って、同一タンパク質のものでさえ、グリコシル化パターンならびに個々のオリゴ糖の組成は、特定のタンパク質が発現される、宿主系に依存して異なる。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、その場合でも、非常に非特異的方法でのみグリコシル化する(Moens and Vanderleyden,1997 Arch Microbiol.168(3):169−175)。繊維状真菌および酵母のような下等真核生物は、主として、マンノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加する。得られたグリカンは、「高−マンノース」タイプのグリカンまたはマンナンとして知られている。植物細胞および昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)は、さらにもう1つの方法でタンパク質をグリコシル化する。対照的に、ヒトのような高等真核生物においては、裸のオリゴ糖側鎖をトリミングして、いくつかのマンノース残基を除去し、典型的には、下等真核生物のN−グリカンでは見られないさらなる糖残基で延長される。例えば、R.K.Bretthauer,et al.Biotechnology and Applied Biochemistory,1999,30,193−200;W.Martinet,et al.Biotechnolgy Letters,1998,20,1171−1177;S.Weikert,et al.Nature Biotechnology,1999,17,1116−1121;M.Maliassard,et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,267,169−173;Jarvis,et al.,Current Opinion in Biotechnology,1998,9:528−533;およびM Takeuchi,1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology,1997,9,S29−S35参照。
動物糖タンパク質のN−グリカンは、典型的には、ガラクトース、フコース、および末端シアル酸を含む。これらの糖は酵母および繊維状真菌で生産される糖タンパク質では見出されない。ヒトにおいては十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体(例えば、UDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−N−アセチルノイラミン酸、UDP−ガラクトース、GDP−フコース等)がサイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それらはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される(Sommers and Hirschberg,1981 J.Cell Biol.91(2):A406−A406;Sommers and Hirschberg 1982 J.Biol.Chem.257(18):811−817;Perez and Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:709−715)。
糖トランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ(例えば、マンノシダーゼ)は ERおよびゴルジ装置の内部(ルミナル)表面をライニングし、それにより、それがERおよびゴルジネットワークを進行するにつれ、糖タンパク質の順次のプロセシングを可能とする「触媒」表面を提供する。シス、メジアルおよびトランスのゴルジの多数区画ならびにトランス−ゴルジネットワーク(TGN)は、グリコシル化反応の順序だった系列が起こり得る異なる場所を提供する。糖タンパク質が後期ゴルジまたはTGNにおいてERにおける合成から十分な成熟まで進行するにつれ、それは、特異的炭水化物構造が合成され得るように、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスファラーゼに順次に暴露される。これらの酵素をその各オルガネラに保持し、係留する正確なメカニズムを明らかにするために多くの研究が捧げられてきた。進化する図式は複雑であるが、証拠は、ステム領域、膜にわたる領域および小胞体テイルは、個々に、あるいは共同して、酵素を個々のオルガネラの膜に向け、それにより、関連する触媒ドメインをその座に局在化することを示唆する(例えば、Gleeson,P.A.(1998)Histochem.Cell Biol.109,517−532参照)。
ヒトまたは動物から単離されたかなりの数のタンパク質が翻訳後に修飾され、グリコシル化は最も重要な修飾のうちの一つである。全ての治療タンパク質の推定70%がグリコシル化され、かくして、現在、ヒトと類似の様式でグリコシル化できる生産システム(すなわち、宿主細胞)に頼っている。いくつかの研究はグリコシル化が(1)免疫原性、(2)薬物動態学特性、(3)トラフィッキングおよび(4)治療タンパク質の効率を決定することにおいて重要な役割を演じることを示している。かくして、製薬産業によるかなりの努力は、できる限り「ヒューマノイド」または「ヒト様」である糖タンパク質を得るためのプロセスを開発することに向けられてきた。今日、ほとんどの糖タンパク質は哺乳動物宿主系で作られる。これは、細胞によって発現されるタンパク質のシアル化(すなわち、シアル酸の末端添加)の程度を増強させるそのような哺乳動物細胞の遺伝子操作を含むことができ、これは、そのようなタンパク質の薬物動態学特性を改良することが知られている。別法として、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそのヌクレオチド糖(例えば、2,3−シアリルトランスフェラーゼおよびCMP−シアル酸)を用いるそのような糖のインビトロ付加によって、シアリル化の程度を改良することができる。
小胞体におけるタンパク質に移動されたコアオリゴ糖構造は基本的には哺乳動物および下等真核生物で同一であるが、実質的な差が、真菌および哺乳動物のゴルジ装置で起こるその後のプロセシング反応で見出されている。事実、異なる下等真核生物の間でさえ、かなり多様なグリコシル化構造が存在する。このことは、歴史的には、哺乳動物発現系よりも優れた注目すべき利点にも拘らず、組換えヒト糖タンパク質の生産のための宿主としての下等真核生物の使用を妨げてきた。
α−1,2−マンノシダーゼ活性は、哺乳動物において複雑なN−グリカン形成のための主な中間体であるMan5GlcNAc2を形成するためのMan8GlcNAc2のトリミングで必要である。以前の研究は、切形されたマウス、真菌およびヒトα−1,2−マンノシダーゼがメチロトロピック酵母P.Pastorisで発現され得、Man8GlcNAc2からのMan5GlcNAc2へのトリミング活性を呈することができることを示した(Lal et al.,Glycobiology 1998 Oct;8(10):981−95;Tremblay et al.,Glycobiology 1998 Jun;8(6):585−95,Callewaert et al.(2001)FEBS Lett.503(2−3):173−8)。しかしながら、今日、P.pastorisからの分泌された糖タンパク質でのMan8GlcNAc2からMan5GlcNAc2への高レベルのインビボトリミングを示す報告は存在しない。
多数のクラス2マンノシダーゼ精製され特徴付けられている:マウスマンノシダーゼII、ヒトーマンノシダーゼIIおよびDrosophilaマンノシダーゼII(図24はマンノシダーゼのクラスの系統発生樹を示す)。クラス2マンノシダーゼ酵素は一般にゴルジに局在化されたN−結合オリゴ糖上のα1,3およびα1,6マンノースグリコシド結合の加水分解を担う。少なくとも5つのタイプのクラス2マンノシダーゼが同定されている、すなわち:(1)ゴルジα−マンノシダーゼII;(2)ゴルジα−マンノシダーゼIIx;(3)リソソームα−マンノシダーゼ;(4)サイトゾルα−マンノシダーゼ;および(5)マウスおよびブタの精子または精巣上体組織から特徴付けられた酵素。Moremen K.W.,Biochimica Biophysica Acta 1573(2002)225−235。
ゴルジα−マンノシダーゼII(EC.3.2.1.114)は、短いN−末端細胞質テイル、ストークセグメントによって大きなルミナルC−末端触媒部分に連結された単一−スパン膜貫通ドメインから構成される、サイズがほぼ125kDaであるII型膜貫通タンパク質である。Moremen and Touster,J.Biol.Chem.,260,6654−6662;Moremen and Touster,J.Biol.Chem.,261,10945−10951。マンノシダーゼIIの機能は、分泌経路におけるN−グリカンのプロセシングに必須である。哺乳動物細胞においては、この特別な酵素は基質GlcNAcMan5GlcNAc2上のManα1,3およびManα1,6グリコシド結合を加水分解することが確立されている。その後のN−グリカンプロセシングは他のグリコシル化酵素(例えば、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ)によって触媒され、その基質(UDP−GlcNAc、UDP−GalNAc、CMP−シアル酸)およびその各トランスポーターとの所望のグリコ形態を生じる。例えば、個々に引用してその全体が援用される。WO 02/00879参照。
ヒトα−マンノシダーゼIIx(α−マンノシダーゼIIイソタイプ)をコードする遺伝子が特徴付けられている。Ogawa et al.,Eur.J.Biochem.242,446−453(1996)。α−マンノシダーゼIIx酵素の過剰発現はCHO細胞におけるMan6GlcNAc2のMan4GlcNAc2への変換を導く。Oh−eda et al.,Eur.J.Biochem.268,1280−1288(2001)。マンノシダーゼの二つのタイプ(IIおよびIIx)はゴルジにおけるN−グリカンのプロセシングに密接に関連している。このゴルジα−マンノシダーゼIIxはα−マンノシダーゼIIに対する66%同一性を有し、Man6GlcNAc2オリゴ糖のManα1,6およびManα1,3を加水分解する類似の触媒活性を有する。より最近の研究は、α−マンノシダーゼIIx−欠陥雄マウスにおける不妊性の明らかな表現型を明らかとした。Biochim Biophys Acta.2002 Dec 19;1573(3):382−7。一つの研究は、α−マンノシダーゼIIx−欠陥マウス精巣が、GlcNAc−末端複合体タイプのN−グリカンの低下したレベルを示したことを見出した。
もう1つのタイプのクラス2のマンノシダーゼが、真核生物細胞のリソソームに見出されており、糖タンパク質の異化(分解)に関与する。中性pH最適値を有するゴルジマンノシダーゼII酵素とは異なり、リソソームマンノシダーゼIIは低いpH最適値(pH4.5)を有し、広い天然基質特異性を有し、合成基質p−ニトロフェニルーα−マンノシダーゼに向けて活性であり、スワインソニンによる阻害に対して感受性である。Daniel et al.,(1994)Glycobiology 4,551−566;Moremen et al.,(1994)Glycobiology 4,113−125。構造的には、リソソームα−マンノシダーゼは、ゴルジ酵素の細胞質テイル、膜貫通ドメイン、およびステム領域の代わりにN−末端シグナル配列を有する。Moremen,K.W.,Biochimica Biophysica Acta 1573(2002)225−235。ヒトリソソームα−マンノシダーゼ(EC 3.2.1.24)はクローン化されており、Pichia pastorisで発現されている。Liao et al.,J Biol Chem 1996 Nov 8:271(45):28348−58。Dictyostelium discoideumに由来するリソソームα−マンノシダーゼおよびマウスゴルジα−マンノシダーゼII(α1,3−/1.6−マンノシダーゼ活性を処理する糖タンパク質)の間のアミノ酸配列保存の領域に基づき、マウスリソソームα−マンノシダーゼをコードするcDNAをクローン化した。Merkle et al.,Biochim Biophys Acta 1997 Aug 29;1336(2):132−46。リソソームα−マンノシダーゼにおける欠陥は、α−マンノシドーシスといわれるヒト遺伝病をもたらす。
サイトゾルα−マンノシダーゼIIは他のクラス2マンノシダーゼとはあまり類似ではなく、触媒活性に対してZn2+よりもCo2+を好むようである。Moremen,K.W.,Biochimica Biophysica Acta 1573(2002)225−235。リソソームα−マンノシダーゼIIのように、それは糖タンパク質の異化に関与する。サイトゾルα−マンノシダーゼIIは、タンパク質分解廃棄のために細胞質へレトロ−移動された(retro−translocated)ERのルーメン中で不適切に折り畳まれた糖タンパク質を異化する。Duvet et al.,Biochem.J.335(1998)389−396;Grard et al.,Biochem.J.316(1996)787−792。構造的にはこの酵素は切断可能なシグナル配列または膜貫通ドメインを有しない。
例えば、Man5GlcNAc2からMan3GlcNAc2へ変換する、オリゴ糖のManα1,3およびManα1,6グリコシド結合のトリミングにやはり関与するクラスIIIマンノシダーゼが最近クローン化され同定されている。今日、このクラスのタンパク質の二つのメンバーのみが知られている。同定された最初のメンバーは、古典的なゴルジマンノシダーゼII活性を欠くが、コアマンノース−1,3分岐でのGlcNAcの存在とは独立している、Man5GlcNAc2を直接的にMan3GlcNAc2に変換する別のメカニズムを保有する貧血マウスに由来するものであった(D.Chui,et al.Cell 1997 90:157−167)。このクラスIIIマンノシダーゼは未だクローン化されるべきであるが、同様の活性を持つタンパク質はSf9細胞からクローン化されている(Z.Kawar,et al.J.Biol.Chem.2001 276(19):16335−16340)。クローン化し、特徴付けすべきクラスIIIマンノシダーゼの唯一のメンバーは、鱗翅目昆虫細胞株Sf9起源である(D.Jarvis,et al.Glycobiology 1997 7:113−127)。このSf9ゴルジマンノシダーゼIIIはMan5GlcNAc2をMan3GlcNAc2に変換し、そして、ゴルジマンノシダーゼIIとは異なり、GlcNAcMan5GlcNAc2をプロセシングしない。このクラスのマンノシダーゼのユニークな特徴は、Manα1,3/1,6活性を保有することに加えて、それがクラスIゴルジマンノシダーゼのようにα−1,2マンノシダーゼ活性を保有することである。さらに、ゴルジマンノシダーゼI酵素のように、このSf9マンノシダーゼIIIはMan9GlcNAc2よりも効率的にMan8GlcNAc2をトリミングする。
本発明は、下等真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生する方法を提供し、この方法は、クラス2マンノシダーゼ酵素またはクラスIIIマンノシダーゼ酵素の触媒活性フラグメントを発現する工程を包含する。
標的化シグナルペプチドにインフレーム融合し、かつ下等真核生物宿主細胞における発現の際に、Manα1,3グリコシド結合およびManα1,6グリコシド結合のいずれかまたは両方を含むオリゴ糖基質を、インビボで、基質のManα1,3結合および/またはManα1,6結合の少なくとも10%がインビボで加水分解される程度まで加水分解し得るマンノシダーゼ触媒ドメインを含む。
標的化シグナルペプチドにインフレーム融合し、かつ下等真核生物宿主細胞における発現の際に、インビボで、Manα1,3グリコシド結合、Manα1,6グリコシド結合またはManα1,2グリコシド結合を含むオリゴ糖基質を、基質のManα1,3結合、Manα1,6結合またはManα1,2結合の検出可能な部位がインビボで加水分解される程度まで、加水分解し得るマンノシダーゼ触媒ドメインを含む。
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関係して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法および技術は、一般的には、当該分野で周知の従来法に従って行われる。一般的には、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質化学および核酸化学、ならびに本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法および技術は当該分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質を生産する方法を提供する。後により詳細に記載するように、高マンノース構造の生産に関与する1以上の酵素を天然では発現しない、またはそれを発現しないようにされている真核生物宿主細胞は出発宿主細胞として選択される。そのような選択された宿主細胞は、ヒト様糖タンパク質を生産するように必要な1以上の酵素、または他の因子を発現するように作製される。所望の宿主株は、一度に1つ以上の酵素を発現するように操作することができる。加えて、1以上の酵素または活性をコードする核酸分子を用いて、本発明の宿主株を操作することができる。好ましくは、潜在的に有用な酵素(例えば、異種細胞下標的化配列とインフレームにて連結された触媒的に活性な酵素断片を含むキメラ酵素)をコードする核酸分子のライブラリーを(例えば、酵素断片を含むサブ−ライブラリーと細胞下標的化配列との連結によって)創製し、最も最適な活性を持つ1以上の酵素を有する、またはほとんどの「ヒト様」糖タンパク質を生産する株は、ライブラリーの1以上のメンバーで標的宿主細胞を形質転換することによって選択することができる。
当業者は、天然から宿主細胞、例えば、インビボでかなりのレベルのMan5GlcNAc2を生産する現存する真菌または他の下等真核生物を選択することができる。しかしながら、合計N−グリカンの1.8%過剰でインビボにてそのような構造を供することが示された下等真核生物は未だない(例えば、Marasら,1997,Eur.J.Biochem.249,701−707)。あるいは、そのような宿主細胞は、インビボでMan5GlcNAc2構造を生産するように遺伝子的に作製することができる。米国特許第5,595,900号に記載されたもののような方法を用いて、目的の標的宿主細胞または生物における特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌクレオチドトランスポーターの不存在または存在を同定することができる。
本発明の方法は、改変された、好ましくはヒト−様N−グリカン構造を有する糖タンパク質を生産する宿主細胞の作製に関する。好ましい実施形態において、この方法は、オリゴ糖前駆体がMan5GlcNAc2で豊富である宿主細胞の作製に関する。好ましくは、高マンノース構造の生産に関与する1以上の酵素を発現しない真核生物宿主細胞が用いられる。そのような宿主細胞は、天然で見出すことができるか、例えば、酵母における既に記載された多くのそのような変異体の一つで出発して作製することができるか、あるいはそれから得ることができる。かくして、選択された宿主細胞に応じて、非−ヒトグリコシル化反応の特徴であることが知られた酵素をコードする1つのまたは多数の遺伝子を欠失しなければならない。そのような遺伝子およびその対応するタンパク質は多数の下等真核生物(例えば、S.cerevisiae、T.reesei、A.nidulana等)において広く特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性およびその各遺伝子配列のリストを供する。これらの遺伝子はマンノシルトランスフェラーゼ、例えば、1,3マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiaeにおけるMNN1(Graham、1991)1,2マンノシルトランスフェラーゼ(例えば、S.cerevisiaeからのKTR/KREファミリー)、1,6−マンノシルトランスフェラーゼ(S.cerevisiaeからのOCH1)、マンノシルリン酸トランスフェラーゼおよびそれらのレギュレーター(S.cerevisaeからのMNN4およびMNN6)および異常な、すなわち、非ヒトグリコシル化反応に関与するさらなる酵素の群から選択されるようである。これらの遺伝子の多くは、事実、個々に欠失されており、改変されたグリコシル化プロフィールを持つ生きた表現型を生起させる。その例は、表1(前記)に示される。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ、すなわちMan3GlcNAc2コア構造のα−1,3アーム上で外部鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素の活性が減少した、または枯渇した宿主細胞の操作または使用を含む。S.cerevisiaeにおいて、この酵素はOCH1遺伝子によってコードされる。S.cerevisiaeにおけるOCH1遺伝子の破壊の結果、N結合型糖がポリ−マンノース外側鎖を完全に欠く表現型をもたらす。真菌株において哺乳動物型グリコシル化を得るための従前のアプローチはOCH1の不活化を必要とした(例えば、Chibaら(1998)J.Biol.Chem.273:26298−304参照)。しかしながら、本発明の宿主細胞における開始α−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、(選択された宿主細胞に応じて)、任意であり得る。というのはOch1p酵素は、効率的なマンノース外側鎖開始のために無傷のMan8GlcNAc2を必要とするからである。かくして、7以下のマンノース残基を有するオリゴ糖を蓄積する本発明に従って選択されるかまたは生産された宿主細胞は、Och1pに対する貧弱な基質であるような低グリコシル化N−グリカンを生産することができる(例えば、Nakayamaら(1997)FEBS Lett.412(3):547−50参照)。
本発明は、加えて、触媒的に活性なクラス2マンノシダーゼ(EC.3.2.1.114)(そのホモログ、改変体、誘導体および触媒的に活性なフラグメント)をコードする遺伝子を発現させることによって、下等真核生物宿主細胞においてよりヒト様の糖タンパク質を作製する方法を提供する。
本発明はまた、クラス2酵素の触媒的に活性なドメインがオリゴ糖、例えば、GlcNAcMan5GlcNAc2構造上のManα1,3および/またはManα1,6グリコシド結合を加水分解して、GlcNAcMan3GlcNAc2(下等真核生物におけるさらなるN−グリカンプロセシングのための所望の中間体)を生成するメカニズムを含む。最初の実施形態において、グリコシド結合の加水分解は順次に起こる。該酵素は少なくとも1つのグリコシド結合を加水分解し、立体配座的に回転して、他のグリコシド結合を加水分解する。第二の実施形態において、グリコシド結合の加水分解は同時に起こる。生じた中間体はさらなるゴルジプロセシングのための基質であり、ここで、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(GnTs)、ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalTs)およびシアリルトランスフェラーゼ(STs)のような他のグリコシル化酵素は順次にそれを修飾して、所望のグリコ形態を生じ得る。図36AはマンノシダーゼII経路を介して生産されたオリゴ糖中間体(例えば、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAcMan4GlcNAc2)を示し、図36BはマンノシダーゼIIx経路を介して生産されたオリゴ糖中間体(例えば、Man4GlcNAc2、Man5GlcNAc2)を示す。
マンノシダーゼII酵素の保存された領域をコードする配列を発現するのは本発明の特徴である。本発明は、昆虫、哺乳動物、植物および虫を含めた種々の供給源からのマンノシダーゼII遺伝子の保存された領域を含む単離された核酸分子を提供する。
438
Gln Phe Gly Thr Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Ala Leu(配列番号:9)
を有する12アミノ酸残基よりなる第五のアミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
463
Leu Ser Gly Asp Phe Phe Thr Tyr Ala Asp Arg Ser Asp His(配列番号:10)
を有する14アミノ酸残基よりなる第六のアミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
477
Tyr Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ser Arg Pro Phe Tyr Arg Arg Met Asp Arg Val Leu Glu(配列番号:11)
を有する20アミノ酸残基よりなる第7番目のアミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
524
Ala Arg Arg Glu Leu Gly Leu Phe Gln His His Asp Ala Ile Thr Gly Thr Ala Arg Asp His Val Val Val Asp Tyr Gly(配列番号:12)
を有する27アミノ酸残基よりなる第八のアミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
788
Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asp Gly Glu Ala(配列番号:13)
を有する11アミノ酸残基よりなる第九のアミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片も提供する。
867
Phe Tyr Thr Asp Leu Asn Gly Phe Gln Met Gln Lys Arg Arg(配列番号:14)を有する14アミノ酸残基よりなる第十アミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
904
Lys Leu Pro Leu Gln Ala Asn Tyr Tyr Pro Met Pro Ser Met Ala Tyr Ile Gln Asp Ala Asn Thr Arg Leu Thr Leu Leu Thr Gly Gln Pro Leu Gly Val Ser Ser Leu Ala Ser Gly Gln Leu Glu Val Met Leu Asp Arg Arg Leu Met Ser Asp Asp Asn Arg Gly Leu Gly Gln Gly Val Leu Asp Asn Lys(配列番号:15)を有する66アミノ酸残基よりなる第十一アミノ酸配列を含むクラス2マンノシダーゼの触媒的に活性な断片を提供する。
また、本発明は、Manα1,2/Manα1,3/Manα1,6に対する基質特異性を有するマンノシダーゼが下等真核生物宿主に導入されることも提供する。
また、本発明の方法は、クラスIII酵素の触媒的に活性なドメインが、オリゴ糖、例えば、Man5GlcNAc2またはMan8GlcNAc2構造上のManα1,3および/またはManα1,6および/またはManα1,2グリコシド結合を加水分解して、Man3GlcNAc2(下等真核生物におけるさらなるN−グリカンプロセシングのための所望の中間体)を生成させるメカニズムも含む。
(本発明の宿主細胞)
本発明の好ましい宿主細胞は下等真核生物細胞、例えば、酵母、単細胞および多細胞または繊維状真菌である。しかしながら、広く種々の宿主細胞が本発明の方法で有用であると考えられる。例えば、植物細胞または昆虫細胞は、本発明に従ってヒト様糖タンパク質を発現するように操作することができる。同様に、本発明の方法を用い、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞を改変して、よりヒト様の、またはそうでなければ改変された糖タンパク質を発現させることができる。当業者が認識するように、(ヒト細胞を含めた)任意の真核生物宿主細胞は本発明のライブラリーと組み合わせて用いて、1以上のキメラタンパク質を発現させることができ、これは、該タンパク質の活性が修飾され、好ましくは増強される宿主細胞において、細胞下位置、例えば、オルガネラに標的化される。そのようなタンパク質は、好ましくは、必ずしもそうではないが、本明細書中で例示したように、タンパク質グリコシル化に関与する酵素である。いずれのタンパク質コード配列も標的化し、本明細書中に記載された方法を用い、真核生物宿主細胞において修飾された活性につき選択することができることが予測される。
複合体N−グリカン合成の形成は、それにより特異的糖残基が除去され、コアオリゴ糖構造に結合される順次のプロセスである。高等真核生物においては、これは、種々のプロセシング酵素に順次に暴露された基質を有することによって達成される。これらの酵素は、全プロセシングカスケード内のそれらの特定の位置において特異的反応を行う。この「組立てライン」はER、初期、メディアルおよび後期ゴルジ、およびトランスゴルジネットワークよりなり、全てはその特異的プロセシング環境を持つ。下等真核生物のゴルジおよびERにおいてヒト糖タンパク質のプロセシングを再度創製するには、多数の酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼおよびトランスポーター)が発現され、これらのオルガネラへ、好ましくは、それらが、それらの環境ならびに経路における他の酵素に対して最も効果的に機能するような位置に特異的に標的化されなければならない。
DNA配列情報を用い、当業者はGnT活性をコードするDNA分子をクローン化することができる(例えば、実施例3)。当業者によく知られた標準的な技術を用い、GnTI、II、III、IVまたはVをコードする(またはその触媒的に活性な断片をコードする)核酸分子を、本明細書中に記載されたように、プロモーター、および本発明の選択された宿主細胞、例えば、Pichia sp.、Kluyveromyces sp.およびAspergillus sp.のような真菌宿主において転写を駆動することができる他の発現制御配列の転写制御下にある適当な発現ベクターに挿入することができ、従って、これらの哺乳動物GnT酵素の1以上を、ヒト−様複合体糖タンパク質の生産のために選択された宿主細胞で活発に発現させることができる(例えば、実施例8、15、17、19)。
ゴルジにおいて満足して機能するグリコシルトランスフェラーゼについては、酵素は、新成糖タンパク質に結合した糖部位の高エネルギードナーである適当なヌクレオチド糖の十分な濃度を必要とする。ヒトにおいては、十分な範囲のヌクレオチド糖前駆体(例えば、UDP−N−アセチルグルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、CMP−N−アセチルノイラミン酸、UDP−ガラクトース等)は、一般には、サイトゾルで合成され、ゴルジに輸送され、そこで、それはグリコシルトランスフェラーゼによってコアオリゴ糖に結合される。
発現された配列タグデータベース(dbEST)における相同性サーチを介して認識されたヒトUDP−N−アセチルグルコサミントランスポーターのcDNAがクローン化されている(Ishida,1999 J.Biochem.126(1):68−77)。UDP−N−アセチルグルコサミンについての哺乳動物ゴルジ膜トランスポーターは、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送が欠乏した最近特徴付けられたKluyveromyces lactis変異体のイヌ腎臓細胞(MDCK)からのcDNAでの表現型修正によってクローン化された(Guillen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(14):7888−7892)。結果は、哺乳動物ゴルジUDP−GlcNAcトランスポーター遺伝子が、発現され、酵母のゴルジ装置へ機能的に標的化されるべきタンパク質についての必要な情報の全てを有し、非常に異なるアミノ酸配列を持つ2つのタンパク質は同一ゴルジ膜内の同一溶質性を輸送することができることを示す(Geullen et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(14):7888−7892)。
ラット肝臓ゴルジ膜GDP−フコーストランスポーターは、Puglielli,L.and C.B.Hirschberg (Puglielli、1999 J.Biol.Chem.274(50):35596−35600)によって同定され、精製されている。対応する遺伝子は同定されていないが、N−末端配列決定は、対応する遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブの設計で用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして用いて、GDP−フコーストランスポーターをコードする遺伝子をクローン化することができる。
2つの異種遺伝子、Schizosaccharomyces pombeからのアルファ1,2−ガラクトシルトランスフェラーゼ(アルファ1,2 GalT)をコードするgmal2(+)、およびヒトUDP−ガラクトース(UDP−Gal)トランスポーターをコードする(hUGT2)は、ガラクトシル化に必要な細胞内条件を調べるために、S.cerevisiaeにおいて機能的に発現されている。糖タンパク質ガラクトシル化およびUDP−ガラクトース輸送活性の間の修正は、アルファ1,2GalTよりはむしろUDP−Galトランスポーターの外因的供給がS.cerevisiaeにおける十分なガラクトシル化についての鍵となる役割を演じたことを示した(Kainuma, 1999 Glycobiology 9(2): 133−141)。同様に、S.pombeからのUDP−ガラクトーストランスポーターがクローン化された(Segawa,1999 Febs Letters 451(3):295−298)。
ヒトCMP−シアル酸トランスポーター(hCST)はクローン化され、Lec8 CHO細胞で発現されている(Aoki et al.(1999) J.Biochem.(Tokyo)126(5):940−50; Eckhardt et al.(1997)Eur.J.Biochem.248(1):187−92)。マウスCMP−シアル酸トランスポーターの機能的発現はSaccharomyces cerevisiaeで達成された(Berninsone et al.(1997)J.Biol.Chem.272(19):12616−9)。シアル酸はいくつかの真菌で見出されているが、選択された宿主系が十分なレベルのCMP−シアル酸を供給できるかは明らかでない。シアル酸は培地または、別法として、シアル酸合成に関与する真菌経路いずれかに供給することができ、また宿主ゲノムに組込むこともできる。
糖が糖タンパク質に移動されると、ヌクレオシド二リン酸または一リン酸いずれかが糖ヌクレオチド前駆体から放出される。一リン酸はアンチポートメカニズムによってヌクレオシド三リン酸糖に代えての交換において直接的に輸出することができるが、ジホスホノヌクレオシド(例えば、GDP)はホスファターゼ(例えば、GDPase)によって切断されて、輸出されるに先立ってヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じなければならない。この反応は十分なグリコシル化で重要であるように見える。というのは、S.cerevisiaeからのGDPaseはマンノシル化で重要であることが判明しているからである。しかしながら、この酵素はUDPに向けての活性の10%を有するに過ぎない(Berninsone et al.(1994) J.Biol.Chem.269(1):207−211)。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてUDP−特異的ジホスファターゼ活性を有しない。というのは、それらはゴルジにおける糖タンパク質合成のためにUDP−糖前駆体を利用しないからである。Schizosaccharomyces pombe、ガラクトース残基を(UDP−ガラクトースからの)細胞壁多糖に加える酵母は、特異的UDPase活性を有することが判明しており、これは、さらに、そのような酵素についての要件を示唆する(Berninsone et al.(1994) J.Biol.Chem.269(1):207−211)。UDPはグリコシルトランスフェラーゼの優れた阻害剤であることが知られており、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジのルーメンにおけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるのに重要である。
種々の発現ベクターを用いて、本発明のヌクレオチド配列を発現することができる(例えば、実施例13参照)。この配列は、宿主細胞の形質転換用の適当なベクター中の発現制御配列に操作可能に結合させることができる。1つの実施形態において、本発明の配列は、GAPDHプロモーター、NotI AscI PacI制限部位カセット、CycII転写ターミネーター、P.pastoris YSH−1(Ampr)における発現用のura3選択カセットを含むpJN348と命名されたベクターに操作可能に連結されている。
本発明は、さらに、Man5GlcNAc2炭水化物構造の生産のための酵素または複数酵素をコードする1以上の核酸分子を非−ヒト宿主細胞に取込む工程を含む、この細胞においてヒト−様糖タンパク質を生産する方法を提供する。1つの好ましい実施形態において、Man8GlcNAc2またはMan9GlcNAc2からのMan5GlcNAc2の生産に関与する1以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を宿主に導入する。本発明は、加えて、1以上のグリコシル化酵素または活性をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む、宿主細胞において改変された糖タンパク質を作製する方法に関する。好ましい酵素活性はUDP−GlcNAcトランスフェラーゼ、UDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ、GDP−フコシルトランスフェラーゼ、CMP−シアリルトランスフェラーゼ、UDP−GlcNAcトランスポーター、UDP−ガラクトーストランスポーター、GDP−フコーストランスポーター、CMP−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、宿主は、1つの活性の産物がもう1つの活性、例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する糖トランスポーター、例えば、GnTIおよびUDP−GlcNAcトランスポーター活性の基質レベルを増加させる2以上の酵素活性を発現するように選択されるか、または作製される。もう1つの好ましい実施形態において、宿主は、引き続いてのグリコシル化反応を阻害することができる産物を除去する活性、例えば、UDP−またはGDP−特異的ジホスファターゼ活性を発現するように選択されるかまたは作製される。
本発明の1つの実施形態において、ヒト−様糖タンパク質は、標的化細胞下区画において他の酵素のpH最適値と同様なpH最適値を有するように選択されたグリコシル化酵素を細胞の細胞下区画に導入することによって、非−ヒト真核生物宿主細胞において効率的に作製される。例えば、S.cerevisiaeのERおよびゴルジ装置において活性はほとんどの酵素は、約6.5および7.5の間にあるpH最適値を有する(表3参照)。タンパク質のグリコシル化は高度に進化しかつ効果的なプロセスである故に、ERおよびゴルジの内部pHもまた約6〜8の範囲にある。しかしながら、真菌宿主における組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を低下させる全ての従前のアプローチは、pH5.0程度のpH最適値を有する酵素を導入した(Martinet et al.(1998) Biotech.Letters 20(12):1171−1177、およびChiba et al.(1998)J.Biol.Chem.273(41):26298−26304)。pH7.0において、それらのマンノシダーゼのインビトロ決定活性はそれらの使用点、すなわち、N−グリカン上でのMan5GlcNAc2の効果的なインビボ生産のための、ERおよび初期ゴルジにおいて不十分な活性であるような10%未満まで低下される。
本発明のある種の方法は、好ましくは(必ずしも必要ではないが)、1以上の核酸ライブラリーを用いて行われる。本発明のコンビナトーリアル核酸ライブラリーの例示的特徴は、それが、細胞標的化シグナルペプチドをコードする配列、および標的化すべきタンパク質(例えば、限定されるものではないが、グリコシル化を媒介するものを含めた酵素またはその触媒ドメイン)をコードする配列を含むことである。
融合構築物のコンビナトーリアルDNAライブラリーは、一般に、(例えば、C−末端欠失を作製することによって、天然タンパク質のN−末端ドメインに由来する1以上の細胞標的シグナルペプチド(「標的化ペプチド」)を特徴とする。しかしながら、いくつかの標的化ペプチドは天然タンパク質(例えば、SEC12)のC−末端に由来する。ERまたはゴルジの膜−結合タンパク質は、好ましくは、ペプチド配列を標的化するための源として用いられる。これらのタンパク質は、長さが変化する、サイトゾルテイル(ct)、膜貫通ドメイン(tmd)およびステム領域(sr)をコードする配列を有する。これらの領域はタンパク質配列整列および公知のホモログおよび/または他の局在化されたタンパク質との比較(例えば、疎水性プロットの比較)によって認識可能である。
いくつかの場合において、本発明のコンビナトリアル核酸ライブラリーは存在する遺伝子または野生型遺伝子から直接組立てることができる。好ましい実施形態において、上記DNAライブラリーは、2以上のサブライブラリーの融合から組立てられる。サブライブラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されたタンパク質ドメイン(例えば、グリコシル化活性を有するもの)をコードする非常に多数の新規な遺伝子構築物を創製することが、可能である。
1つの有用なサブライブラリーは、グリコシダーゼ(例えば、マンノシダーゼ)、グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ)、GlcNAcトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのような酵素をコードするDNA配列を含む。触媒ドメインは、操作されるべき宿主から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。哺乳動物酵素、植物酵素、昆虫酵素、爬虫類酵素、藻類酵素または真菌酵素は、全て有用であり、これは、最適温度および最適pHに関して広いスペクトルの生化学特性を示すように選択されるべきである。好ましい実施形態において、遺伝子を切断し、そのいくつかがその酵素の触媒ドメインをコードする断片を得る。内因性標的化配列を除去することによって、次いで、それらの酵素を再度方向付けし、他の細胞遺伝子座で発現させ得る。
別の有用なサブライブラリーは、ER、ゴルジ、またはトランスゴルジネットワーク内の特定の位置へのタンパク質の局在化をもたらす標的化シグナルペプチドをコードする、核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、操作されるべき宿主生物から、ならびに他の関連する生物または関連しない生物から、選択され得る。一般に、そのような配列は、3つのカテゴリー:(1)一緒にかまたは個々に、タンパク質をゴルジの内膜(腔膜)に係留させる、サイトゾルテイル(ct)、膜貫通ドメイン(tmd)、およびステム領域(sr)の一部またはステム領域の全てをコードする、N末端配列;(2)HDELテトラペプチド(配列番号105)またはKDELテトラペプチド(配列番号106)のようなC末端で一般に見出される検索シグナル;および(3)ゴルジ中に局在化することが知られている種々のタンパク質(例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター)由来の膜貫通領域;に入る。
この実施形態の方法は、宿主中に形質転換された核酸(例えば、DNAライブラリー)が非常に多様な配列を含み、それにより、少なくとも1つの形質転換体が、望まれる表現型を示す確率を増加させる場合に、最も効果的である。単一アミノ酸変異は、例えば、糖タンパク質プロセシング酵素の活性を劇的に改変し得る(Romeroら(2000)J.Biol.Chem.275(15):11071−4)。従って、形質転換に先立ち、DNAライブラリーまたは構成サブライブラリーが、1つ以上の技術に供されて、さらなる配列多様性が生成され得る。例えば、1回以上の遺伝子シャッフリング、エラープローンPCR、インビトロ変異誘発、または配列多様性を生じるための他の方法が、融合構築物のプール内により多様性の配列を得るために実施され得る。
上記したオープンリーディングフレーム配列に加えて、発現制御配列(例えば、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および宿主生物への融合構築物の形質転換に際して、融合タンパク質の効果的な転写および翻訳を確保する必要であり得るような他の機能的配列)を持つ各ライブラリー構築物を提供することが、一般には好ましい。
少なくとも1つの選択マーカー(薬物耐性を付与するためまたは宿主代謝障害を補完するための遺伝子)を、各構築物に提供することもまた、好ましい。そのマーカーの存在は、形質転換体のその後の選択において有用である。例えば、酵母においては、URA3遺伝子、HIS4遺伝子、SUC2遺伝子、G418遺伝子、BLA遺伝子、またはSH BLE遺伝子が、使用され得る。多数の選択マーカーが、公知であり、そして酵母宿主細胞、真菌宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞および他の真核生物宿主細胞で用いるために利用可能である。
次いで、上記核酸ライブラリーが、宿主生物中に形質転換される。酵母においては、DNA移入のための任意の簡便な方法(例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法、またはスフェロプラスト法)が、使用され得る。繊維状真菌細胞および植物細胞において、従来の方法としては、粒子ボンバードメント(bombardment)、エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。高密度培養(例えば、酵母における発酵)に適した安定な株を生成するために、上記DNAライブラリー構築物を、宿主染色体中に組込むことが、望ましい。好ましい実施形態において、組込みは、当該分野で周知の技術を用いて、相同組換えを介して生じる。例えば、DNAライブラリーのエレメントに、宿主生物の配列に対して相同な隣接配列を設ける。このようにして、組込みは、所望される遺伝子も必須遺伝子も破壊することなく、宿主ゲノムにおいて規定された部位で起こる。
DNAライブラリーを用いて宿主株を形質転換した後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程で、または種々のアッセイもしくは検出方法のいずれかを用いる一連の表現型の富化および/または除去工程によって行われ得る。表現型特徴付けは、手動により、または自動高スループットスクリーニング機器を用いて、行なわれ得る。通常、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在化される細胞表面上にタンパク質N−グリカンを提示する。
好ましいコンビナトリアルDNAライブラリーの構築が、図2に模式的に示され、実施例4に記載される。その融合構築物は、多数のベクター(例えば、当該分野で周知の発現ベクター)に作動可能に連結され得る。広く種々のそのような融合構築物が、表6に示したような代表的な活性を用いて組立てられた。標的化ペプチド/触媒ドメインの組合せは、本発明に従って、ER、ゴルジおよびトランスゴルジネットワークにおいて、標的化マンノシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性で用いるために組み立てられ得る。驚くべきことに、同じ触媒ドメインは、用いる標的化ペプチドのタイプに応じ、N−グリコシル化パターンに対する多大な影響に対して何の影響も有さないものであり得る(例えば、表7、実施例4)。
本発明のコンビナトリアルDNAライブラリーに由来するマンノシダーゼ融合構築物の代表的な例は、pFB8であり、これは、マウスα−マンノシダーゼIA(Genbank AN 6678787)の187N末端アミノ酸除去物に対してインフレーム連結した短縮型Saccharomyces SEC12(m)標的化ペプチド(SwissProt P11655からのSEC12の988〜1296ヌクレオチド)を有する。従って、本明細書中で用いる命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド/触媒ドメイン領域を、Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIAΔ187と呼ぶ。コードされた融合タンパク質は、そのマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、SEC12標的化ペプチド配列によってERに局在化し、Man5GlcNAc2構造を有するN−グリカンをインビボで生成可能である(実施例4;図6Fおよび7B)。
同様に、グリコシルトランスフェラーゼコンビナトリアルDNAライブラリーが、本発明の方法を用いて生成された。グリコシルトランスフェラーゼI(GnTI)活性に由来する配列のコンビナトリアルDNAライブラリーが、標的化ペプチドを用いて組み立てられ、マーカー糖タンパク質上でのGlcNAcMan5GlcNAc2N−グリカン構造の下等真核生物宿主細胞における効率的な生成につき選択された。GlcNAcMan5GlcNAc2(Saccharomyces MNN9(s)/ヒトGnTI Δ38)生じることが示された融合構築物(pPB104)、が同定された(実施例8)。広く種々のそのようなGnTI融合構築物を、組み立てた(実施例8、表10)。標的化ペプチド/GnTI触媒ドメインの他の組合せは、コンビナトリアルDNAライブラリーを生成することによって容易に組み立て得る。また、グリコシルトランスフェラーゼ活性を示す他のそのような融合構築物は、実施例8に示すように生成され得ることが、当業者にとって明らかである。本明細書中に記載されたコンビナトリアルDNAライブラリー方法を用いて、特定の発現ベクターおよび宿主細胞系において選択された融合構築物を用い、GlnNAcMan5GlcNAc2生成を最適化することは、当業者にとって慣用的実験である。
本発明の方法およびライブラリーを用いて宿主細胞のグリコシル化を改変する別の例において、レポータータンパク質(K3)を発現するOCH1欠失を持つP.pastoris株を、本発明のコンビナトリアルライブラリーから単離された多重融合構築物で形質転換して、高マンノースN−グリカンをヒト様N−グリカンに変換した(実施例8)。まず、マンノシダーゼ融合構築物pFB8(Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIAΔ187)を、1,6開始マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くP.pastoris株(すなわち、och1欠失;実施例1)に形質転換した。第二に、UDP−GlcNAcトランスポーターをコードするK.lactis MNN2−2遺伝子(Genbank AN AF106080)を含むpPB103を構築して、GlcNAcMan5GlcNAc2のさらなる生成を増加させた。UDP−GlcNAcトランスポーターの付加は、図10Bに示すように、P.pastoris株においてGlcNAcMan5GlcNAc2の生成を有意に増加させた。第3に、Saccharomyces MNN9(s)/ヒトGnTI Δ38を含むpPB104を、この株に導入した。このP.pastoris株を「PBP−3」という。
本発明の方法によって提供されるように、ゴルジα−マンノシダーゼIIのコンビナトリアルDNAライブラリーを、数個のマンノシダーゼII酵素の触媒ドメインを一群の細胞標的化ペプチドシグナルに融合させることによって、生成した(実施例14)。得られた500個を超えるコンビナトリアル融合構築物を、レポーターK3上で複合グリコシル化のヒト前駆体であるGlcNAcMan5GlcNAc2 YSH−1(実施例17)を生成し得るP.pastoris株に導入した。ほんの少数の株(約<5%)のみが、GlcNAcMan5GlcNAc2をGlcNAcMan3GlcNAc2へと定量的に変換し得た。これらの株を単離し、引き続いて、数百個のGnTII/リーダーペプチド融合物のコンビナトリアルライブラリーで形質転換した。GlcNAc2Man3GlcNAc2の存在についてのスクリーニングは、株YSH−44によって例示されるように、均一な複合グリカンを分泌することが可能である株の単離を可能とした(実施例19)。
本発明をP.pastoris宿主生物を用いて例示するが、酵母宿主および真菌宿主の他の種を含めた他の真核生物宿主細胞を、本明細書中に記載したように改変して、ヒト様糖タンパク質を生成し得ることが、当業者に理解されるべきである。望ましくない宿主細胞グリコシル化遺伝子(例えば、OCH1)の同定および破壊のための本明細書中に記載した技術は、他の酵母および真菌株のような他の真核生物宿主細胞におけるこれらおよび/または他の相同遺伝子または機能的に関連した遺伝子について適用可能であることが、理解される。実施例9に記載されたように、och1 mnn1遺伝子が、K.lactisから欠失されて、1,2−マンノシダーゼによってMan5GlcNAc2へと完全に変換されるN−グリカンに導く宿主細胞を操作した(図12C)。
好ましい具体例において、そのような標的化ペプチド/触媒ドメインライブラリーは、高等真核生物において、グリコシル化反応の一連の性質についての既存の情報を組み込むように設計される。糖タンパク質プロセシングの間に初期に起こることが公知の反応は、そのような反応を触媒する酵素をゴルジまたはERの初期部分に標的化する工程を必要とする。例えば、マンノシダーゼによるMan8GlcNAc2のMan5GlcNAc2へのトリミングは、複合体N−グリカン形成における初期の工程である。タンパク質プロセシングはERで開始され、次いで、初期、中間および後期ゴルジを通じて進行するので、この反応はERまたは初期ゴルジで生じさせることが望ましい。従ってマンノシダーゼI局在化のためのライブラリーを設計する場合、例えば、ERおよび初期ゴルジ標的化シグナルをマンノシダーゼIの触媒ドメインと対応させるよう試みられる。
この遺伝子工学の試みの1つの最終的な目標は、産業醗酵プロセスにおいて首尾よく実行し得る頑強なタンパク質生産株であるので、宿主(例えば、真菌)染色体への複数遺伝子の組込みは、好ましくは、注意深い設計を含む。操作された株は、ある範囲の異なる遺伝子で形質転換されなければならないようであり、これらの遺伝子は、安定に形質転換されて、所望の活性が醗酵プロセスを介して維持されることを確実としなければならないであろう。本明細書中に記載されたように、種々の所望の酵素活性(例えば、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、GlcNAcトランスフェラーゼ、ERおよびゴルジ特異的トランスポーター(例えば、UDP−ガラクトースおよび他の前駆体についてのsynおよびアンチポートトランスポーター)、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、およびUDP−ガラクトース、CMP−N−アセチルノイラミン酸のような活性化されたオリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素)のいずれかの組合せを真菌タンパク質発現宿主中に作製し得る。Pichia pastorisのような下等真核生物宿主細胞においてグリコシル化を修飾するための好ましい方法の例を表6に示す。
本明細書中に記載された方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に用いられる糖タンパク質を生成するのに有用である。特異的グリコ形態を有する糖タンパク質は、例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、マンノース−6−リン酸は、タンパク質を、少数を挙げればゴーシェ病、ハンター病、フルラー病、シャイエ病、ファブリー病およびテイ−サックス病のようなリソソーム貯蔵障害に関連する数種の酵素の適切な機能に必須であり得るリソソームに指向することが示されている。同様に、グリカン側鎖への1以上のシアル酸残基の付加は、投与後に、インビボで治療糖タンパク質の寿命を増大させ得る。従って、宿主細胞(例えば、下等真核生物または哺乳動物)は、細胞中で発現された糖タンパク質における末端シアル酸の程度を増加させるように遺伝的に操作され得る。あるいは、シアル酸は、シアル酸トランスフェラーゼおよび適切な基質を用いて投与の前に、インビトロで目的のタンパク質に結合され得る。増殖培地組成における変化を、ヒト様グリコシル化に関与する酵素活性の発現に加えて使用して、ヒト形態により密接に似ている糖タンパク質を生成し得る(Weikertら、(1999)Nature Biotechnology 17,1116−1121;Wernerら、(1998)Arzneimittelforschung 48(8):870−880;AndersenおよびGoochee(1994)Cur.Opin.Biotechnol.5:546−549;YangおよびButler(2000)Biotechnol.Bioengin.68(4):370−380)。モノクローナル抗体への特異的グリカン修飾(例えば、二分されたGlcNAcの付加)は、抗体依存性細胞傷害性を改良することが示されており(Umanaら、(1999)Nat.Biotechnol.17(2):176−80)、これは、抗体または他の治療タンパク質の生成に望ましくあり得る。
本発明のさらなる局面において、ゴルジαマンノシダーゼ酵素によって産生された新しく形成されたグリカンは、その後のグリコシル化反応のための基質である。1つの実施形態において、GnT II、UDP−GlcNAcおよび、必要に応じてUDP−GlcNAcトランスポーターは、GlcNAcを用いて、P.pastoris YSH−37で生産されたオリゴ糖の新しく形成されたManα1,6分枝をキャップして、GlcNAc2Man3GlcNAc2を形成する(実施例19)。別の実施形態において、他のGnT(例えば、GnT III、GnT IV、GnT V)は、一過性GlcNAc2Man3GlcNAc2基質と反応する。この基質は、今度は、ガラクトシルトランスフェラーゼのための基質となり(実施例25)、そしてさらなるプロセシングがシアリルトランスフェラーゼを用いて生じる。
(P.pastorisにおけるOCH1遺伝子のクローニングおよび破壊)
P.pastoris OCH1配列(日本国特許出願公開番号8−336387号)に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド
(Man5GlcNAc2−含有IFN−β前駆体を生成するためのP.pastorisのα―1,2−マンノシダーゼを用いた操作)
α−1,2−マンノシダーゼは、Man8GlcNAc2をトリミングして、複合体N−グリカン形成のための必須の中間体であるMan5GlcNAc2を得るのに必要である。Man5GlcNAc2前駆体の生成は必須であるが、それは、ハイブリッドおよび複合体グリカンの生成に必ずしも十分ではない。なぜなら、Man5GlcNAc2の特異的異性体は、GnTIについての基質であってもなくてもよいからである。P.pastorisのoch1変異体は、aoxプロモーターの制御下で分泌されるヒトインターフェロンβを発現するように操作される。DNAライブラリーは、ヒトマンノシダーゼIB(α−1,2−マンノシダーゼ)の触媒ドメインと、初期ゴルジおよびER局在化ペプチドをコードする配列を含むサブ−ライブラリーとのインフレーム連結によって構築される。次いで、DNAライブラリーを宿主生物に形質転換し、その結果、個々の形質転換体が各々、インターフェロンβならびにライブラリーからの合成マンノシダーゼ遺伝子を発現する遺伝的に混合された集団が生じる。個々の形質転換体コロニーを培養し、インターフェロンの生成をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下で、90%を超える分泌されたタンパク質はグリコシル化インターフェロンβである。
(ヒト様糖タンパク質の生成のためのα−1,2−マンノシダーゼ、GnTIを発現するoch1変異体株の作製)
P.pastoris OHC1遺伝子の1215bpのオープンリーディングフレームならびに2685bp上流および1175bp下流をPCRによって増幅し(WO 02/00879も参照のこと)、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)にクローン化し、これをpBK9と命名した。複数栄養要求性マーカーを含むoch1ノックアウト株を作製するために、100μgのpJN329、SfiI制限部位が隣接したoch1::URA3変異体対立遺伝子を含むプラスミドをSfiIで消化し、これを用いて、エレクトロポレーションによって、P.pastoris株JC308(Cereghinoら、Gene 263(2001)159−169)を形質転換した。室温における10日間の、ウラシルを欠く規定された培地上でのインキュベーションに続き、1000のコロニーを選択し、再度画線培養した。37℃では増殖できないが、室温では増殖したURA+クローンをコロニーPCRに供して、och1::URA3変異体対立遺伝子の正しい組込みについて試験した。予測されたPCRパターンを呈した1つのクローンをYJN153と命名した。ヒトプラスミノーゲン(K3)のクリングル3ドメインをモデルタンパク質として用いた。K3遺伝子を含むNeoRでマークしたプラスミドを株YJN153に形質転換し、K3を発現する得られた株をBK64−1と命名した。
(コンビナトリアルDNAライブラリーを用いる優勢なN−グリカン構造としてのMan5GlcNAc2を生成するためのP.pastorisの操作)
誘導性AOXIプロモーターの制御下で、ヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメイン(K3)のようなタンパク質を発現し、それを分泌するように、P.pastorisのoch1変異体(実施例1および3を参照のこと)を作成した。ヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメイン(K3)をモデルタンパク質として用いた。Pfu turboポリメラーゼ(Strategene,La Jolla,CA)を用いて、K3をコードするDNAフラグメントを増幅し、pPICZαA(Invitrogen,Carlsbad,CA)のEcoRIおよびXbaI部位にクローン化し、C−末端6−Hisタグが得られた。K3のN−結合グリコシル化効率を改良する(Hayesら、1975 J.Arch.Biochem.Biophys.171,651−655)ために、部位特異的変異誘発を用いてPro46をSer46で置き換えた。得られたプラスミドをpBK64と命名した。PCR構築物の正確な配列を、DNA配列決定によって確認した。
+最高程度のMan5GlcNAc2トリミング(30/51)を有するクローンを、培地の上清中のマンノシダーゼ活性についてさらに分析した。大部分(28/30)は、上清中に検出可能なマンノシダーゼ活性を示した(例えば図4B)。2つの構築物のみが倍地中のマンノシダーゼ活性を欠如するが、高いMan5GlcNAc2レベルを示した(例えば、図4C)。
標的化ペプチドに融合したα−1,2−マンノシダーゼ触媒ドメインのコンビナトリアルDNAライブラリーの作製は、多数の生物からの種々の長さのN−末端欠失を含むマンノシダーゼドメインの増幅を必要とした。この目的にアプローチするために、α−1,2−マンノシダーゼの全長オープンリーディングフレーム(ORF)を、以下の源:Homo sapiens,Mus musculus.Drosophila melanogaster,Caenorhabditis elegans、Aspergillus nidulansおよびPenicillium citrinumから得られたcDNAまたはゲノムDNAのいずれかからPCR増幅した。各場合において、PCR反応を行うのに必要な試薬に加え、所望のマンノシダーゼ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でDNAをインキュベートした。例えば、M.musculus α−1,2−マンノシダーゼIAのORFを増幅するために、5’−プライマー
プラスミド構築における最初の工程は、ノックアウトすべき遺伝子の5’および3’領域についてのスペースホールダー(space holder)としての、P.pastoris(Boehmら、Yeast 1999年5月;15(7):563−72)のKEX1遺伝子のDNA領域を含むユニバーサルプラスミドの組を作製する工程を包含した。プラスミドはまた、栄養要求性マーカーについてのスペースホールダーとしてのS.cerevisiae Ura−ブラスター(Alaniら、Genetics 116,541−545.1987)、および外来性遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を有する発現カセットを含んだ。P.pastoris KEX1−5’領域の0.9kbのフラグメントは、プライマー
(コンビナトーリアル局在化/マンノシダーゼライブラリーの特徴付け)
P.pastorisゲノムへのマンノシダーゼ構築物の組込みを確認するためにコロニーPCRによってスクリーニングした陽性形質転換体(実施例4)を、1%酵母抽出物、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH6.0、1.34%酵母窒素ベース、4×10−5%ビオチン、および1%グリセロールよりなる増殖培地としての50mlのBMGY緩衝化メタノール−複合培地中で、室温にて、引き続いてOD600nm2−6まで増殖し、その時点で、5mlのBMMY中での室温での24時間のレポータータンパク質の誘導に先立ち、10mlのBMMY(増殖培地としての1%酵母抽出物、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH6.0、1.34%酵母窒素ベース、4×10−5ビオチン、および1.5%メタノールよりなる 緩衝化メタノール−複合培地)で洗浄した。その結果、レポータータンパク質を単離し、実施例3に記載したように分析して、そのグリカン構造を特徴付けた。表6中の標的化ペプチドを用い、ERまたはゴルジいずれかに局在化されたマンノシダーゼ触媒ドメインは、Man5GlcNAc2を圧倒的に含有するグリカンに対してMan8GlcNAc2を圧倒的に含有するグリカンのトリミングのかなりのレベルを示した。これは、レポーター糖タンパク質のグリカン構造を、図5Cおよび6CにおけるP.pastoris och1ノックアウトのそれと、図5D、5E、6D〜6Fに示したM.musculusマンノシダーゼ構築物で形質転換された同株との間で比較する場合で明らかである。図5および6は、P.pastirisにおいて有意なマンノシダーゼ活性を示すコンビナトーリアルDNAライブラリーから創製された構築物の発現を示す。pGC5(Saccharomyces MNS1(m)/マウスマンノシダーゼIBΔ99(図5Dおよび6E)の発現は、Man5GlcNAc2にトリミングされた全てのグリカンのほぼ30%を有するタンパク質を生じ、他方、pF8(Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIAΔ187)(図6F)の発現はほぼ50%のMan5GlcNAc2を生じ、pBC18−5(Saccharomyces VAN1(s)/C.elegansマンノシダーゼIBΔ80)(図5E)の発現は70%のMan5GlcNAc2を生じた。
(アルファ−1,2−マンノシダーゼによるインビボでのトリミング)
実施例4の新規な作製された株が、事実、インビボにて所望のMan5GlcNAc2構造を生じたことを確認するために、細胞上澄みをマンノシダーゼ活性につきテストした(図7〜9参照)。後記した各構築物/宿主株については、HPLCを1.0ml/分の流速にて、Altechの4.0mm×250mmカラム(Avondale,PA,USA) Econosil−NH2樹脂(5μm)を用いて30℃にて40分間行った。図7および8において、標準的なMan9GlcNAc2[b]の分解は、Man8GlcNAc2二関連するピークを生じるように起こることが示された。図7において、Man9GlcNAc2[b]標準は24.61分で溶出し、Man5GlcNAc2[a]は18.59分で溶出した。図8において、Man9GlcNAc2は21.37分で溶出し、Man5GlcNAc2は15.67分で溶出した。図9において、標準Man8GlcNAc2[b]は20.88分で溶出することが示された。
(作製されたα−1,2−マンノシダーゼのpH最適アッセイ)
プラスミドpBB27−2((SwissProt50108からの)Saccharomyces MNN10(s)/C.elegansマンノシダーゼIB Δ31)を含むP.pastoris細胞を室温にてBMGY中で約17のOD600まで増殖させた。これらの細胞の約80μLを600μLのBMGY中に接種し、一晩増殖させた。引き続いて、細胞を遠心によって収穫し、BMMYに移して、AOX1プロモーターの制御下のK3(ヒトプラスミノーゲンからのクリングル3)の生産を誘導した。インキュベーションの24時間の後、細胞を遠心によって除去して、実質的に透明な上澄(pH6.43)を得た。上澄をマンノシダーゼpH最適アッセイのために取り出した。蛍光−標識Man8GlcNAc2(0.5μg)を、種々のpHに調整された20μLの上澄に加え(図11)、室温にて8時間インキュベートした。インキュベーションの後、Econosil NH2 4.6×250mm、5ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム(Altech,Avondane,PA)を用いるHPLCによって試料を分析した。流速は40分間で1.0ml/分であり、カラムは30℃に維持した。3分間のイソクラフィック溶出(68%A:32%B)の後、直線溶媒グラジエント(68%A:32%B〜40%A:60%B)を27分間にわたって使用して、グリカン(18)を溶出させた。溶媒A(アセトニトリル)および溶媒B(ギ酸アンモニウム、50mM、pH4.5)。カラムをランの間の20分間、溶媒(68%A:32%B)で平衡化した。
(構造GlcNAcMan5GlcNAc2を持つN−グリカンを生産するためのP.pastorisの作製)
GlcNAcトランスフェラーゼI活性は、複合体およびハイブリッドN−グリカンの成熟化に必要である(米国特許第5,834,251号)。Man5GlcNAc2は単にマンノシダーゼIIによってトリミングでき、これは、GlcNAcトランスフェラーゼIによるN−アセチルグルコサミンの、トリマンノースステムの末端α−1,3マンノース残基への付加の後における、ヒトグリコ形態の形成に必要な工程である(Schachter, 1991 Glycobiology 1(5):453−461)。従って、Homo sapiensからのGlcNAcトランスフェラーゼI遺伝子の適当に標的化された触媒ドメイン;およびKTRホモログであるS.cerevisiae:D2、D9およびJ3からのホモログに基づき、S.cerevisiaeおよびP.pastoris推定α−1,2−マンノシルトランスフェラーゼからのGLS、MNS、SEC、MNN9、VAN1、ANP1、HOC1、MNN10、MNN11、MNT1、KTR1、KTR2、MNN2、MNN5、YUR1、MNN1、およびMNN6からの局在化配列をコードするDNA断片を含むコンビナトーリアルDNAライブラリーを調製した。図10は、限定されるものではないが、P.pastorisおよびK.lactis GnTIからのSECおよびOCH1のような標的化ペプチド配列を含む(表6および表10参照)。
K3を発現するP.pastoris株(Δoch1、arg−、ade−、his−)を、順次、以下のベクターで形質転換した。まず、pFB8(Saccharomyces SEC12(m)/マウスマンノシダーゼIA Δ187)を、エレクトロポレーションによって、P.pastoris株において形質転換した。第二に、BamHIおよびBglII酵素で消化されたpBLADX−SXプラスミド(Cereghino et al.,Gene 263(2001)159−169)にクローン化された(UDP−GlcNAcトランスポーターをコードする)Kluyveromyces lactis MNN2−2遺伝子(Genbank AN AF106080)を含有するpPB103をP.pastoris株において形質転換した。第三に、NotI−PacI断片としてpJN336にクローン化された遺伝子をコードするSaccharomyces MNN9(s)/ヒトGnTI Δ38を含むpPB104を、P.pastoris株に形質転換した。
(構造Man5GlcNAc2を持つN−グリカンを生産するためのK.lactis細胞の作製)
K.lactis OCH1遺伝子の同定および破壊
出芽酵母S.cerevisiaeのOCH1遺伝子は、分泌されたタンパク質上のMan8GlcNAc2N−グリカン構造への第一のゴルジ局在化マンノース付加を担う1,6−マンノシルトランスフェラーゼをコードする(Nakanishi−Shindo et al.(1993),J.Biol.Chem.;268(35):26338−45)。このマンノース移動は、一般には、N−グリカン構造の真菌特異的ポリマンノシル化における鍵となる最初の工程として認識される(Nakanishi−Shindo et al.(1993)J.Biol.Chem.268(35):26338−26345; Nakayama et al.(1992) EMBO J.11(7):2511−19;Morin−Ganet et al,Traffic 1(1):56−68.(Jan 2000))。S.cerevisiaeにおけるこの遺伝子の欠失の結果、かなり短いN−グリカン構造がもたらされ、これは、上昇した温度においてこの典型的なポリマンノシル化または増殖欠陥を含まない(Nakayama et al.(1992) EMBO J.11(7):2511−19)。
S.cerevisiae MNN1はゴルジα−1,3−マンノシルトランスフェラーゼについての構造遺伝子である。MNN1の産物は762−アミノ酸タイプII膜タンパク質である(Yip et al., Proc Natl Acad Sci USA.91(7):2723−7.(1994))。mnn1変異体から単離されたN−結合およびO−結合オリゴ糖双方はα−1,3−マンノース結合を欠く(Raschke et al.,J Biol Chem., 248(13):4660−6.(Jul10,1973))。
(株、培養条件および試薬)
以下の実施例では、以下の株、培養条件および試薬を用いた。Escherichia coli 株TOP10またはDH5αを組換えDNA作業で用いた。
(Man3GlcNAc2を生産するための発現ベクターのクローニングおよび創製)
制限および修飾酵素はNew England BioLabs(Beverly,MA)からのものであった。シャトルベクターpVM2は、プライマーVJM104およびVJM106(各々、
pJN348発現ベクターはプラスミドpBLURA−SX(2)に基づく。まず、ベクターpJN261からのGAPDH/CYC1発現カセットを含むBamHI断片を、BamHIおよびBglIIで切断してあるpBLURA−SXにクローン化して、プラスミドpJN338を得た。引き続いて、後者のプラスミドをNotIおよびPacIで切断し、インビトロでアニーリングしてある2つのオリゴヌクレオチドExprI
(局在化シグナル/マンノシダーゼI触媒ドメイン融合の創製)
マウスマンノシダーゼIAの増幅。マウスマンノシダーゼIA(Genbank:N 008548, Lal & Moremen 1994)の触媒ドメインをコードする遺伝子配列をマウス肝臓cDNA(cLONTECH)から増幅した。簡単に述べれば、順方向プライマーmMIAΔ187−AscIおよび逆方向プライマーmMIA−PacI(各々、
(マンノシダーゼII構築物の創製)
アミノ酸75〜1108をコードするショウジョウバエマンノシダーゼII(GenBank:X77652, Foster and Roberts 1995)の触媒ドメインを、55℃にてアニーリングし、5分間延長することによって、上記で概説した熱サイクリング条件下でExTaq DNAポリメラーゼを用い、ショウジョウバエ卵巣cDNAから増幅した。順方向プライマーdMannIIΔ74 AscIおよび逆方向プライマーdMannII PacI(各々、
(マンノシダーゼII触媒ドメインライブラリー)
活性を示すマンノシダーゼII触媒ドメインおよびリーダーのライブラリーを表11に以下に示す。本明細書中で用いるように、(+)の数は%中性グリカンのGlcNAcMan3GlcNAc2生産の相対的レベルを示す。表示(−)はGlcNAcMan3GlcNAc2の見掛けの生産がないことを示す。表示(+)はGlcNAcMan3GlcNAc2の20%未満の生産を示す。表示(++)はGlcNAcMan3GlcNAc2の約20〜30%の生産を示す。表示(+++)はGlcNAcMan3GlcNAc2の約30〜40%の生産を示す。表示(++++)はGlcNAcMan3GlcNAc2の約40〜50%の生産を示す。表示(+++++)はGlcNAcMan3GlcNAc2の50%を超える生産を示す。表示(NG)は、融合構築物で形質転換されたいずれのコロニーからも見掛けのグリカンは検出されないことを示す。
(GnTII発現構築物の創製)
S.cerevisiae MNN9遺伝子のN−末端部分と融合したヒトGnTI遺伝子を含むGnTI発現ベクター(pNA15)の構築は従前に記載されている(Choi et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2003 Apr 29;100(9):5022−7)。同様にして、ラットGnTII遺伝子をクローン化した。ラットGnTII遺伝子(GenBank受託番号U21662)を、RAT1
レポータータンパク質の発現、N−結合グリカンの精製および放出
アルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターの制御下で、K3ドメインをモデル糖タンパク質として用い、Choi et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2003 Apr 29;100(9):5022−7)に報告されているように、ヘキサヒスチジンタグを用いて精製した。グリカンを放出させ、従前に報告されている方法(Papac et al.,A.J.S.(1998) Glycobiology 8,445−454)の修飾によって、糖タンパク質から分離した。糖タンパク質を還元し、カルボキシメチル化した後、膜をブロックし、ウェルを水で3回洗浄した。タンパク質を、1ミリユニットのN−グルカナーゼ(Glyko)を含有する30μlの10mM NH4HCO3 pH8.3の添加によって脱グリコシル化した。37℃における16時間のインキュベーションの後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固した。
クリングル3は、Beckman BioMek 2000試料−取扱ロボット(Beckman/Coulter Ranch Cucamonga,CA)にて96−ウェルフォーマットを用いて精製した。クリングル3は、C−末端ヘキサ−ヒスチジンタグを用い、発現から精製した。ロボット精製は、そのHisBind樹脂についてNovagenによって供されたプロトコルの適合であった。簡単に述べれば、150uL(μL)の沈降した容量の樹脂を96−ウェル溶解物−結合プレートのウェルに注ぎ、3容量の水で洗浄し、5容量の50mM NiSO4を充填し、3容量の結合緩衝液(5mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス−HCLpH7.9)で洗浄した。タンパク質発現培地を3:2の培地/PBS(60mM PO4、16mM KCl、822mM NaCl pH7.4)希釈し、カラムに負荷した。排出の後、カラムを10容量の結合緩衝液および6容量の洗浄緩衝液(30mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス−HCl pH7.9)で洗浄し、タンパク質を6容量の溶出緩衝液(1Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス−HCl pH7.9)で溶出させた。溶出した糖タンパク質を凍結乾燥によって蒸発固化させた。
従前に報告されている方法(Papac,et al.A.J.S.(1998) Glycobiology 8,445−454)の修飾によって、グリカンを放出させ、糖タンパク質から分離した。96−ウェルMultiScreen IP(Immobilon−Pmembran)プレート(Millipore)のウェルを100uLのメタノールで湿らせ、3×150uLの水および50uLのRCM緩衝液(8M尿素、360mMトリス、3.2mM EDTA pH8.6)で洗浄し、各添加の後に、温和な真空にて排出した。乾燥したタンパク質試料を30uLのRCM緩衝液に溶解させ、10uLのRCM緩衝液を含有するウェルに移した。ウェルを排出させ、RCM緩衝液で2回洗浄した。タンパク質を、37℃における1時間の、RCM緩衝液中の60uLの0.1M DTTの希釈によって減少させた。ウェルを300uLの水で3回洗浄し、60uLの0.1Mヨードー酢酸の添加によって、室温にて暗所で30分間カルボキシメチル化した。ウェルを水で3回洗浄し、室温にて1時間、100uLの水中の1%PBP360の添加によって膜をブロックした。ウェルを排出し、300uLの水で3回洗浄し、1ミリユニットのN−グリカナーゼ(Glyko)を含有する30uLの10mM NH4HCO3 pH8.3の添加によって脱グリコシル化した。37℃における16時間の後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固させた。
グリカンの分子量は、遅延抽出を用いるVoyager DE PRO直線MALDI−TOF(Applied Biosciences)を用いて測定した。各ウェルからの乾燥したグリカンを15μlの水に溶解させ、0.5μlをステンレス鋼で試料プレートにスポットし、0.5μlのS−DHBマトリックス(1:1水/アセトニトリル0.1%TFA中の9mg/mlのジヒドロ安息香酸、1mg/mlの5−メトキシサリチル酸)と混合し、乾燥させた。4nsパルス時間でのパルス窒素レーザー(337nm)での照射によってイオンを発生させた。機器を、125ns遅延および20kVの加速電圧での遅延抽出モードにて操作した。グリッド電圧は93.00%であり、ガイドワイヤー電圧は0.1%であり、内部圧力は5×10−7トール未満であり、低質量ゲートは875Daであった。スペクトルは100〜200レーザーパルスの合計から発生させ、500MHzディジタイザーで獲得した。Man5GlcNAc2オリゴ糖を外部分子量標準として用いた。全てのスペクトルは陽性イオンモードの機器で発生させた。
タンパク質はLaemmli(Laemmli 1970)に従ってSDS/PAGEによって分離した。
(酵母株YSH−1(Δoch1、α1,2−マンノシダーゼ、GnTI)の創製)
以前に報告されているP.pastoris株BK64(Choi et al.Proc Natl Acad Sci USA.2003 Apr 29;100(9):5022−7)、OCH1ノック−アウトを保有し、かつヒトプラスミノーゲンのクリングル3ドメイン(K3)を発現するトリプル栄養要求株(ADE、ARG、HIS)を宿主株として用いた。BK64を制限酵素EcoNIで線状化したプラスミドpPB103で形質転換して、K.lactis UDP−N−アセチルグルコサミントランスポーターを宿主細胞に導入し、このようにして、株PBP−1を得た。制限酵素EcoNIで線状化したプラスミドpFB8での形質転換によってマウスMnsIをこの株に導入し、株PBP−2を得た。株PBP−2から単離したタンパク質からのK3グリカンの分析は、存在する一次グリコ形態がMan5GlcNAc2であったことを示した。
(酵母株YSH−37(マンノシダーゼIIを発現するP.pastoris)の創製)
YSH−1(実施例17)を、制限酵素ApaIで線状化したD.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNN2(s)プラスミド(pKD53)で形質転換し、株YSH−37を得た。株YSH−37(図14)で生産されたK3グリカン構造の分析は、1140m/zにおける支配的グリコ形態が、1303m/zにおけるGlcNAcMan3GlcNAc2[b]および他のグリコ形態GlcNAcMan4GlcNAc2[c]および1465m/zにおけるGlcNAcMAn5GlcNAc2[d]の質量に対応することを示す。
(酵母株YSH−44の創製)
株YSH−37(実施例18)を、制限酵素EcoRIで線状化したラットGnTII/MNN2(s)リーダー、pTC53をコードするプラスミドで形質転換した。得られた株YSH−44は、陽性モードMALDI−TOF質量分析によって、GlcNAc2Man3GlcNAc2[x]に対応する、1356m/zにおける単一グリコ形態を有するK3 N−グリカンを生産した(図15)。
従前に報告されている方法(Papac, et al.A.J.S.(1998) Glycobiology 8,445−454)の修飾によって、YSH−44からのグリカンを放出し、糖タンパク質から分離した。タンパク質を還元させ、カルボキシメチル化し、かつ膜をブロックした後、ウェルを水で3回洗浄した。タンパク質を、1ミリユニットのN−グルカナーゼ(Glyko,Novato,CA)を含有する30μlの10mM NH4HCO3 pH8.3の添加によって脱グリコシル化した。37℃における16時間の消化の後、グリカンを含有する溶液を遠心によって取り出し、蒸発乾固させた。次いで、グリカンをsSC210A speed vac(Thermo Savant, Halbrook,NY)で乾燥した。乾燥したグリカンを37℃の50mM NH4Ac pH5.0に一晩いれ、1mUのヘキソース(Glyko,Novato,CA)を加えた。グリカンを分析し、Man3GlcNAc2[a]の質量に対応する933m/zにおいて図16に示した単一グリカンを含有することが示された。
(見掛けのマンノシダーゼII活性を持たない酵母株の創製)
YSH−1を、制限酵素EcoRIで線状化したD.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNN9(m)をコードするプラスミド、プラスミドpKD16で形質転換した。得られた株は、陽性モードのMALDI−TOF質量分析によると、Man5GlcNAc2[d]に対応する1464m/zにおいて単一のグリコ形態を生じた(図18)。この株は、このようにして、少なくともK3レポーター糖タンパク質のグリコシル化に関しては、D.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNS1(l)融合構築物からの見掛けのマンノシダーゼII活性を発現しなかった。
(マンノシダーゼII活性を有する酵母株の創製)
YSH−1を、制限酵素EcoRIで線状化したD.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNS1(1)をコードするプラスミド、プラスミド(pKD6)で形質転換した。得られた株(図19)で発現されたK3糖タンパク質のN−グリカンプロフィールは、Mal5GlcNAc2[d]の質量に対応する1464m/zにおける支配的ピーク、および1139m/zにおけるGlcNAcMan3GlcNAc2[b]および1302m/zにおけるGlcNAcMAn4GlcNAc2[c]に対応する他のピークを呈した。得られた酵母株は、このようにして、D.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNS1(1)融合構築物からのいくらかの検出可能なマンノシダーゼII活性を発現した。
(マンノシダーゼII活性を有する酵母株YSH−27の創製)
YSH−1は、制限酵素EcoRIで線状化したD.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae GLS1(s)プラスミド(pKD1)で形質転換した。得られた株YSH−27で発現されたK3糖タンパク質のN−グリカンプロフィールは、GlcNAcMan3GlcNAc2[b]の質量に対応する1139m/zにおいて支配的なピークを呈した(図20)。得られた株YSH−27は、このようにして、D.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae GLS1(s)融合構築物からの有意なレベルのマンノシダーゼII活性を呈した。
(酵母株YSH−74の創製(低マンノシダーゼII活性))
YSH−1を、制限酵素EcoRIで線状化したD.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNS1(m)プラスミド(pKD5)で形質転換した。得られた株YSH−74で発現されたK3糖タンパク質のN−グリカンは、GlcNAcMan3GlcNAc2[b]の質量に対応する1140m/zにおける支配的なピーク、および1302m/zにおけるGlcNAcMan4GlcNAc2[c]および1464m/zにおけるGlcNAcMan5GlcNAc2[d]に対応する他のピークを呈した(図21)。得られた株YSH−74は、少なくともK3レポーター糖タンパク質のグリコシル化に関しては、D.melanogasterマンノシダーゼIIΔ74/S.cerevisiae MNS1(m)融合構築物からのマンノシダーゼII活性の普通のレベルを発現した。YSH−74からのグリカンを、GlcNAcMan3GlcNAc2[b]の質量に対応する1141m/zで支配的ピークを呈するグリカンをもたらすA.saitoi α−1,2マンノシダーゼ(Glyko,Nevato,CA)での消化によってさらに分析した。
(マンノシダーゼアッセイ)
蛍光標識Man8GlcNAc2(0.5μg)を20μLの上澄に添加し、室温にて30時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を、Econosil NH2 4.6×250mm、5ミクロンビーズ、アミノ−結合シリカカラム(Altech,Avondale,PA)でのHPLCによって分析した。流速は40分間1.0ml/分であり、カラムを30℃に維持した。3分間のイソクラティック溶出(68%A:32%B)の後、直線溶媒グラジエント(68%A:32%B〜40%A:60%B)を27分間にわたって使用して、グリカンを溶出させた(Turco,S.J.(1981)Anal.Biochem.118,278−283)。溶媒A(アセトニトリル)および溶媒Bはギ酸アンモニウムの水溶液、50mM、pH4.5であった。カラムをランの間20分間、溶媒(68%A:32%B)で平衡化させた。
(インビトロガラクトース移動)
株YSH−44から得られたN−結合グリカンGlcNAc2Man3GlcNAc2をガラクトース移動に対する基質として用いた。20mgのこのグリカンを、37℃にて10〜20時間、50mM NH4HCO3、1mM MnCl2、pH7.5中の75mg UDP−Galおよび10〜50mUのβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(ウシ乳、Calbiochem)と共にインキュベートした。図17は、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2の質量に対応する1665m/zにおけるユニ形態ピークを呈する陽性モードMALDI−TOF質量分析を示す。陰性コントロール、マイナスガラクトシルトランスフェラーゼは上記したように行い、基質GlcNAc2Man3GlcNAc2へのグルコースの移動は示さなかった。
(クラスIIIマンノシダーゼの下等真核生物への導入)
昆虫Sf9細胞からのクラスIIIマンノシダーゼ(Jarvis et al.Glycobiology 1997 7:113−127)をコードするcDNAを、5’および3’末端に特異的なプライマーを用いて増幅した。引き続いて、cDNAを酵母組込みプラスミドにサブクローンして、分泌されたレポータータンパク質のN−グリコシル化パターンに対するこのタンパク質の効果を調べた。多数の切形産物が生産されて、例えば実施例14に記載されているように、異なる標的化リーダー断片を持つクラスIIIマンノシダーゼ構築物のライブラリーを得た。所望の宿主株において単独で発現されることに加え、得られた融合タンパク質は他のグリコシル化修飾酵素と組み合わせて発現させて、所望のN−グリカン構造の生産を増強させる。
Claims (14)
- 酵母、単細胞または多細胞糸状真菌宿主細胞中で、キメラ酵素をコードする核酸を前記宿主細胞に発現させる工程を含む、糖タンパク質を生産する方法であって、上記キメラ酵素は、
(a)D.メラノガスター(D.melanogaster) マンノシダーゼ1IΔ74触媒ドメインを、Gls1−s,Mns1−s,Mns1−m,S.Sec−s,S.sec−m,S.sec−l,P.sec−s,P−sec−m,Mnn9−s,Van1−s,Van1−m,Van1−l,Anp1−s,Anp1−m,Anp1−l,Hoc1−s,Hoc1−m,Hoc1−l,Mnn10−m,Mnn11−s,Mnt1−m,J3−m,Ktr1−s,Ktr2−s,Gnt1−s,Gnt1−m,Gnt1−l,Mnn2−s,Mnn2−m,Mnn2−l,Mnn5−m,Mnn1−s,Mnn1−m,Mnn1−l,Mnn6−sおよびMnn6−mからなる群より選択される細胞標的シグナルペプチドに融合させてなるもの、または、
(b)C.エレガンス(C.elegans) マンノシダーゼ1IΔ108触媒ドメインを、Gls1−s,Mns1−s,Mns1−m,S.Sec−s,S.sec−m,S.sec−l,P.sec−s,Van1−s,Van1−m,Van1−l,Anp1−s,Hoc1−m,Mnn10−s,Mnn10−m,Mnn10−l,Mnn11−s,Mnt1−s,Mnt1−m,Mnt1−l,D2−s,D2−m,D9−m,J3−m,Ktr2−s,Gnt1−s,Gnt1−m,Mnn2−s,Mnn2−m,Mnn2−l,Mnn5−s,Mnn5−m,Yur1−l,Mnn1−s,Mnn1−mおよびMnn6−mからなる群より選択される細胞標的シグナルペプチドに融合させてなるものを含み、前記キメラ酵素は、インビボでGlcNAcMan5GlcNAc2基質のManα−1,3結合および/またはManα−1,6結合の40%以上を加水分解しうる、方法。 - 糖タンパク質が、GlcNAcMan3GlcNAc2 であるN-グリカンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記糖タンパク質が、オリゴ糖分岐Manα1,3(Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asnを含む前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マンノシダーゼ触媒ドメインが、Manα1,3およびManα1,6グリコシド結合を含むオリゴ糖基質のManα1,3およびManα1,6双方の結合をインビボで加水分解することができる、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴ糖基質がGlcNAcβ1,2Manα1,3(Manα1,6Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;GlcNAcβ1,2Manα1,3(Manα1,3 Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asn;およびGlcNAcβ1,2Manα1,3(Manα1,3 Manα1,6 Manα1,6)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAc−Asnであることを特徴とする請求項1または4記載の方法。
- 前記マンノシダーゼ活性が過剰発現される前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マンノシダーゼ触媒ドメインが、さらに、Manα1,2結合を加水分解できる前記請求項いずれか1項に記載の方法。
- 前記マンノシダーゼ活性が5.0〜8.0のpH最適値を有する前記請求項いずれか1項に記載の方法。
- 前記マンノシダーゼ触媒ドメインが宿主細胞のER、ゴルジ装置またはトランスゴルジネットワークのうちの少なくとも1つ内に局在化される請求項8記載の方法。
- さらに、宿主細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む前記請求項いずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞がピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラマエ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・オプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルキューム(Pichia guercuum)、ピキア・ピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア種(Pichia sp.)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニドウランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム種(Fusarium sp)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)およびノイロスポラ・クロッサ(Neurospora crassa)よりなる群から選択される前記請求項いずれか1項に記載の方法。
- 宿主細胞がピキア・パストリス(Pichia pastoris)である請求項11記載の方法。
- 該糖タンパク質が治療タンパク質である、前記請求項いずれか1項に記載の方法。
- 前記治療タンパク質はエリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性Ige受容体α−鎖、IgG、IgG断片、IgM、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシン阻害剤、IGF−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮成長因子−2、骨髄系先祖阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1−抗トリプシン、α−フェトタンパク質、AAT、rhTBP−1(オネルセプト、またはTNF結合タンパク質1)、TACI−Ig(膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドインターアクター)、FSH(小胞刺激ホルモン)、GM−CSF、FCを有するまたは有さないGLP−1(グルカゴン様タンパク質1)、IL−1受容体アゴニスト、sTNFr(エンブレル、または可溶性TNF受容体Fc融合)ATIII、rhトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびCTLA4−Ig(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig)よりなる群から選択される請求項13記載の方法。
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ATE440959T1 (de) * | 2000-06-28 | 2009-09-15 | Glycofi Inc | Verfahren für die herstellung modifizierter glykoproteine |
US20060029604A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-09 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
TWI324181B (en) | 2001-04-16 | 2010-05-01 | Martek Biosciences Corp | Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms |
US20060034829A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a MAN3GLCNAC2 glycoform |
US20060024292A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
EP2359685B1 (en) * | 2001-12-27 | 2013-12-04 | GlycoFi, Inc. | Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures |
US6964784B2 (en) * | 2002-03-07 | 2005-11-15 | Optigenex, Inc. | Method of preparation and composition of a water soluble extract of the bioactive component of the plant species uncaria for enhancing immune, anti-inflammatory, anti-tumor and dna repair processes of warm blooded animals |
US7332299B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
CA2558635A1 (en) * | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Glycofi, Inc. | Method of engineering a cytidine monophosphate-sialic acid synthetic pathway in fungi and yeast |
JP2008512354A (ja) * | 2004-07-21 | 2008-04-24 | グライコフィ, インコーポレイテッド | Man3GlcNAc2グリコフォームを支配的に含む免疫グロブリン |
TW200720439A (en) * | 2005-03-25 | 2007-06-01 | Glycart Biotechnology Ag | Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function |
WO2007028144A2 (en) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Glycofi, Inc | Immunoglobulins comprising predominantly a glcnacman3glcnac2 glycoform |
EP1937305A4 (en) * | 2005-09-09 | 2008-10-08 | Glycofi Inc | IMMUNOGLOBULIN COMPRISING A MAN7GLCNAC2 OR MAN8GLCNAC2 PREDOMINANT GLYCOFORM |
EP1954815B1 (en) | 2005-11-15 | 2015-02-25 | GlycoFi, Inc. | Production of glycoproteins with reduced o-glycosylation |
RU2479629C2 (ru) * | 2007-03-07 | 2013-04-20 | Гликофи, Инк. | Продукция гликопротеинов с модифицированным фукозилированием |
PL2125894T3 (pl) | 2007-03-22 | 2019-08-30 | Biogen Ma Inc. | Białka wiążące, w tym przeciwciała, pochodne przeciwciał i fragmenty przeciwciał, które swoiście wiążą się z CD154 i ich zastosowania |
CA2682578C (en) | 2007-04-03 | 2015-05-26 | Oxyrane Uk Limited | Glycosylation of molecules |
US8637435B2 (en) * | 2007-11-16 | 2014-01-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Eukaryotic cell display systems |
AU2009215739A1 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Glycofi, Inc. | Vectors and yeast strains for protein production |
EP2263089B1 (en) * | 2008-03-03 | 2015-01-28 | GlycoFi, Inc. | Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes |
US8067339B2 (en) * | 2008-07-09 | 2011-11-29 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Surface display of whole antibodies in eukaryotes |
AU2009282228A1 (en) | 2008-08-12 | 2010-02-18 | Glycofi, Inc. | Improved vectors and yeast strains for protein production: Ca2+ ATPase overexpression |
CA2751730A1 (en) | 2009-02-25 | 2010-09-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Metabolic engineering of a galactose assimilation pathway in the glycoengineered yeast pichia pastoris |
WO2010107709A1 (en) | 2009-03-16 | 2010-09-23 | Martek Biosciences Corporation | Protein production in microorganisms of the phylum labyrinthulomycota |
EP2435476A4 (en) * | 2009-05-27 | 2013-04-17 | Synageva Biopharma Corp | ANTIBODIES OBTAINED FROM BIRDS |
JP5990102B2 (ja) | 2009-09-29 | 2016-09-07 | ユニフェルシテイト ヘント | ホスホ−6−マンノースへのマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合の加水分解 |
MX2012004994A (es) | 2009-10-30 | 2012-06-12 | Merck Sharp & Dohme | Metodo para producir proteinas terapeuticas en pichia pastoris que carecen de actividad de dipeptidil aminopeptidasa. |
CA2777487A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for the production of recombinant proteins with improved secretion efficiencies |
DK2501805T3 (en) | 2009-11-19 | 2019-04-15 | Oxyrane Uk Ltd | Yeast strains producing mammalian-like complex N-Glycans |
EP2519636B8 (en) * | 2009-12-28 | 2017-08-09 | DSM IP Assets B.V. | Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae |
US20110195448A1 (en) * | 2009-12-28 | 2011-08-11 | James Casey Lippmeier | Recombinant Thraustochytrids that Grow on Xylose, and Compositions, Methods of Making, and Uses Thereof |
EP3505632B1 (en) | 2009-12-28 | 2022-08-03 | Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. | Production of heterologous polypeptides in microalgae, microalgal extracellular bodies, compositions, and methods of making and uses thereof |
CA2788992A1 (en) | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for increasing n-glycosylation site occupancy on therapeutic glycoproteins produced in pichia pastoris |
MX339809B (es) | 2010-05-27 | 2016-06-09 | Merck Sharp & Dohme Corp * | Metodo para preparar anticuerpos con propiedades mejoradas. |
KR101983572B1 (ko) * | 2010-09-29 | 2019-05-29 | 옥시레인 유케이 리미티드 | 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 캡핑제거 및 인산화 n-글리칸의 탈만노실이 가능한 만노시다제 및 당단백질의 활용을 통한 포유류 세포의 촉진방법 |
SG189110A1 (en) | 2010-09-29 | 2013-05-31 | Oxyrane Uk Ltd | De-mannosylation of phosphorylated n-glycans |
CN103764837A (zh) | 2011-02-25 | 2014-04-30 | 默沙东公司 | 用于生产具有修饰的o-糖基化的蛋白的酵母菌株 |
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BR112014022624A2 (pt) | 2012-03-15 | 2017-07-11 | Oxyrane Uk Ltd | métodos e materiais para tratamento de doença de pompe |
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WO2014064203A1 (en) | 2012-10-26 | 2014-05-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Lyve-1 antagonists for preventing or treating a pathological condition associated with lymphangiogenesis |
WO2014090948A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Serpin spn4a and biologically active derivatives thereof for use in the treatment of cancer |
KR20160002681A (ko) | 2013-01-16 | 2016-01-08 | 인썸(인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰메디칼르) | 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(fgr3) 폴리펩티드 |
RU2015143696A (ru) | 2013-03-14 | 2017-04-19 | Байер Хелскеа Ллк | МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АНТИТРОМБИНА β |
EP2789686A1 (en) * | 2013-04-11 | 2014-10-15 | Greenovation Biotech GmbH | Expression of phosphorylated glycoproteins in plants |
WO2015013116A1 (en) * | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for reducing the extent of o-mannosylation of glycoproteins |
WO2015044379A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | A dyrk1a polypeptide for use in preventing or treating metabolic disorders |
CA2954974A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Glykos Finland Oy | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
CN107810271B (zh) * | 2014-11-20 | 2021-09-28 | 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发公司 | 用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法 |
CN106619543A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-10 | 首都医科大学 | 抗肿瘤海鞘多肽cs5931冻干粉针制剂及其制备方法 |
CN115369049B (zh) * | 2021-05-17 | 2023-12-15 | 北京化工大学 | 一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用 |
EP4309666A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-24 | Technische Universität Dresden | M-csf for use in the prophylaxis and/or treatment of viral infections in states of immunosuppression |
WO2024017998A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Technische Universität Dresden | M-csf for use in the prophylaxis and/or treatment of viral infections in states of immunosuppression |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001014522A1 (fr) * | 1999-08-19 | 2001-03-01 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Nouvelles variantes de levure et procede de production de glycoproteine |
Family Cites Families (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4414329A (en) * | 1980-01-15 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
US4617274A (en) * | 1981-10-29 | 1986-10-14 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
US4885242A (en) * | 1984-10-30 | 1989-12-05 | Phillips Petroleum Company | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4808537A (en) * | 1984-10-30 | 1989-02-28 | Phillips Petroleum Company | Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use |
US5166329A (en) * | 1985-10-25 | 1992-11-24 | Phillips Petroleum Company | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia |
US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
US4818700A (en) * | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
US4935349A (en) * | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
US4812405A (en) * | 1986-02-18 | 1989-03-14 | Phillips Petroleum Company | Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation |
US4925796A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
US4857467A (en) * | 1986-07-23 | 1989-08-15 | Phillips Petroleum Company | Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia |
US5002876A (en) * | 1986-09-22 | 1991-03-26 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of human tumor necrosis factor |
US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
US4929555A (en) * | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
US5047335A (en) * | 1988-12-21 | 1991-09-10 | The Regents Of The University Of Calif. | Process for controlling intracellular glycosylation of proteins |
US5122465A (en) * | 1989-06-12 | 1992-06-16 | Phillips Petroleum Company | Strains of pichia pastoris created by interlocus recombination |
US5032519A (en) * | 1989-10-24 | 1991-07-16 | The Regents Of The Univ. Of California | Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes |
US5324663A (en) * | 1990-02-14 | 1994-06-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures |
US5595900A (en) * | 1990-02-14 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures |
CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
US5962294A (en) * | 1992-03-09 | 1999-10-05 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for the identification and synthesis of sialyltransferases |
US5602003A (en) * | 1992-06-29 | 1997-02-11 | University Of Georgia Research Foundation | N-acetylglucosaminyltransferase V gene |
WO1994026906A2 (en) * | 1993-05-14 | 1994-11-24 | The Upjohn Company | CLONED DNA ENCODING A UDP-GALNAc:POLYPEPTIDE,N-ACETYLGALACTOS AMINYLTRANSFERASE |
US5484590A (en) * | 1993-09-09 | 1996-01-16 | La Jolla Cancer Research Foundation | Expression of the developmental I antigen by a cloned human cDNA encoding a member of a β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene family |
US6300113B1 (en) * | 1995-11-21 | 2001-10-09 | New England Biolabs Inc. | Isolation and composition of novel glycosidases |
US6204431B1 (en) * | 1994-03-09 | 2001-03-20 | Abbott Laboratories | Transgenic non-human mammals expressing heterologous glycosyltransferase DNA sequences produce oligosaccharides and glycoproteins in their milk |
DE69531686T2 (de) * | 1994-06-13 | 2004-07-15 | Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. | Glycosyltransferase kodierendes gen und seine verwendung |
US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
US5849904A (en) * | 1994-12-22 | 1998-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Isolated nucleic acid molecules which hybridize to polysialyl transferases |
US5834251A (en) * | 1994-12-30 | 1998-11-10 | Alko Group Ltd. | Methods of modifying carbohydrate moieties |
JP2810635B2 (ja) * | 1995-04-03 | 1998-10-15 | 理化学研究所 | 新規糖鎖合成酵素 |
JPH08336387A (ja) | 1995-06-12 | 1996-12-24 | Green Cross Corp:The | ピキア属酵母由来の糖鎖伸長タンパク及びそのdna |
US5910570A (en) * | 1995-11-13 | 1999-06-08 | Pharmacia & Upjohn Company | Cloned DNA encoding a UDP-GalNAc: polypeptide N-acetylgalactosaminy-ltransferase |
ATE374816T1 (de) | 1996-08-02 | 2007-10-15 | Austin Research Inst | Verbesserte nukleinsäuren, welche für eine chimäre glycosyltransferase kodieren |
CN1273586C (zh) | 1996-12-12 | 2006-09-06 | 麒麟麦酒株式会社 | β1→4N-乙酰葡糖胺基转移酶和编码该酶的基因 |
US5945314A (en) * | 1997-03-31 | 1999-08-31 | Abbott Laboratories | Process for synthesizing oligosaccharides |
US7244601B2 (en) | 1997-12-15 | 2007-07-17 | National Research Council Of Canada | Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides |
JPH11221079A (ja) | 1998-02-04 | 1999-08-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 糖転移酵素および該酵素をコードするdna |
EP2261229A3 (en) | 1998-04-20 | 2011-03-23 | GlycArt Biotechnology AG | Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity |
EP2264166B1 (en) | 1999-04-09 | 2016-03-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
WO2001025406A1 (en) | 1999-10-01 | 2001-04-12 | University Of Victoria Innovation & Development Corporation | Mannosidases and methods for using same |
CA2388777A1 (en) | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Human Genome Sciences, Inc. | 18 human secreted proteins |
WO2001060860A2 (en) | 2000-02-17 | 2001-08-23 | Millennium Predictive Medicine, Inc. | Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use |
US6410246B1 (en) | 2000-06-23 | 2002-06-25 | Genetastix Corporation | Highly diverse library of yeast expression vectors |
US7795002B2 (en) * | 2000-06-28 | 2010-09-14 | Glycofi, Inc. | Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
ATE440959T1 (de) * | 2000-06-28 | 2009-09-15 | Glycofi Inc | Verfahren für die herstellung modifizierter glykoproteine |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US20060034828A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform |
US20060029604A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-09 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
US20060024304A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GlcNAc2 glycoform |
US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US20060034830A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GalGlcNAcMan5GLcNAc2 glycoform |
US6803225B2 (en) | 2000-06-30 | 2004-10-12 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology | Protein glycosylation modification in Pichia pastoris |
US7064191B2 (en) | 2000-10-06 | 2006-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for purifying antibody |
AU2002305903A1 (en) | 2001-05-25 | 2002-12-09 | Incyte Genomics Inc. | Carbohydrate-associated proteins |
WO2003025148A2 (en) | 2001-09-19 | 2003-03-27 | Nuvelo, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
SG177002A1 (en) | 2001-10-10 | 2012-01-30 | Novo Nordisk As | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
US20060024292A1 (en) | 2001-12-27 | 2006-02-02 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
US20060034829A1 (en) * | 2001-12-27 | 2006-02-16 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a MAN3GLCNAC2 glycoform |
EP2359685B1 (en) | 2001-12-27 | 2013-12-04 | GlycoFi, Inc. | Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures |
NZ534880A (en) * | 2002-03-19 | 2008-04-30 | Plant Res Int Bv | Optimizing glycan processing in plants |
US7252933B2 (en) | 2002-06-26 | 2007-08-07 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology | Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast |
US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
JP4861830B2 (ja) * | 2003-12-24 | 2012-01-25 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 糖タンパク質の産生において、グリカンのマンノシルリン酸化を除去する方法 |
CA2558635A1 (en) * | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Glycofi, Inc. | Method of engineering a cytidine monophosphate-sialic acid synthetic pathway in fungi and yeast |
CA2565125A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-10 | Glycofi, Inc. | Methods for reducing or eliminating alpha-mannosidase resistant glycans in the production of glycoproteins |
WO2007028144A2 (en) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Glycofi, Inc | Immunoglobulins comprising predominantly a glcnacman3glcnac2 glycoform |
-
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001014522A1 (fr) * | 1999-08-19 | 2001-03-01 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Nouvelles variantes de levure et procede de production de glycoproteine |
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