ES2338324T3 - Expresion de manosidasa de clase ii y manosidasa de clase iii en celulas eucariotas inferiores. - Google Patents
Expresion de manosidasa de clase ii y manosidasa de clase iii en celulas eucariotas inferiores. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende (a) un dominio catalítico de manosidasa seleccionado de la Tabla 11, fusionado a (b) un péptido señal de dirección celular seleccionado de la Tabla 11, en el que dicha enzima quimérica mostrada en la Tabla 11 es capaz de hidrolizar in vivo más del 40% de los enlaces Man α-1,3 y/o Man α-1,6 de un sustrato de GlcNAcMan5GlcNAc2.
Description
Expresión de manosidasa de clase II y manosidasa
de clase III en células eucariotas inferiores.
La presente invención se refiere al campo de
glicosilación de proteínas en levaduras u hongos filamentosos
unicelulares o multicelulares, específicamente la introducción de
una enzima manosidasa que tiene especificidad de sustrato para
hidrólisis de enlaces glucosídicos Man\alpha 1,3 y/o Man\alpha
1,6. La presente invención se refiere además a células huésped
novedosas que comprenden genes que codifican una enzima manosidasa y
N-glicano o intermedios que contienen N-glicano
producidos como resultado de la hidrólisis.
Después de que el ADN se transcribe y se traduce
en una proteína, el procesamiento post-traduccional
adicional implica la unión de restos de azúcar, un procedimiento
conocido como glicosilación. Organismos diferentes producen enzimas
de glicosilación diferentes, (glicosiltransferasas y glicosidasas),
y tienen sustratos diferentes (azúcares nucleótidicos) disponibles,
de forma que los patrones de glicosilación, así como la composición
de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína,
serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que la
proteína particular se esté expresando. Las bacterias típicamente no
glicosilan las proteínas y, si lo hacen, sólo de una manera muy
inespecífica (Moens y Vanderleyden, 1997 Arch Microbiol.
168(3): 169-175). Los eucariotas inferiores,
tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente los
azúcares manosa y manosil fosfato. El glicano resultante se conoce
como un glicano o un manano de tipo "de alto contenido en
manosa". Las células vegetales y células de insecto (tales como
las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra manera. Por el
contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la
cadena lateral de oligosacáridos naciente se puede cortar para
retirar varios restos de manosa y alargar con restos de azúcar
adicionales que típicamente no se encuentran en N-glicanos de
eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer, y col.
Biotechnology and Applied Biochemistry, 1999, 30,
193-200; W. Martinet, y col. Biotechnology Letters,
1998, 20, 1171-1177; Weikert S., y col. , Nature
Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; Malissard M., y
col. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000,
267,169-173; Jarvis, y col., Current Opinion in
Biotechnology, 1998, 9: 528-533; y M. Takeuchi, 1
Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9,
S29-S35.
La síntesis de una estructura de oligosacárido
de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones en
secuencia durante el transcurso de las cuales se añaden y se retiran
restos de azúcares mientras que la proteína se mueve a lo largo de
la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a
lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped
determinan los patrones de glicosilación resultantes de proteínas
secretadas. Por tanto, el patrón de glicosilación resultante de
proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores
difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de proteínas
expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y
otros mamíferos (Bretthauer, 1999). La estructura de un
N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.
Las etapas tempranas de glicosilación humana
pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los
oligosacáridos Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2} enlazados a lípidos
se ensamblan mediante un conjunto de reacciones en secuencia en la
membrana del retículo endoplasmático (RE) y (ii) la transferencia de
este oligosacárido desde el pirofosfato de dolichilo anclado a
lípido a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la
transferencia específica está definido por un resto de asparagina
(ASN) en la secuencia
Asn-Xaa-Ser/Thr donde Xaa puede ser
cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne, 1990
Protein Eng. 3: 433-42). El procesamiento adicional
mediante glicosidasas y manosidasas ocurre en el RE antes de que la
glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano,
donde los restos de manosa adicionales se retiran mediante alfa
manosidasas (\alpha-1, 2-) específicas de Golgi.
El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través
del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras,
incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII,
GnTIII, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y
retiran restos de azúcares específicos. Finalmente, en el Golgi
trans, las galactosiltranferasas (GalT) y Sialiltransferasas (ST)
producen una estructura de la glicoproteína que se libera a partir
del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-,
tri- y tetra-antenarias, que contiene galactosa,
fucosa, N-acetilglucosamina y un ácido siálico terminal de
grado elevado, que proporciona a las glicoproteínas sus
características humanas. La estructura de un N-glicano humano
típico se muestra en la Figura 1B.
En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas
se obtienen a partir de un precursor oligosacárido enlazado a
lípido común
Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2}-dolichol-pirofosfato.
Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y procesamiento de
oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolichol son idénticos entre
todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento
adicional del oligosacárido de núcleo mediante células fúngicas,
por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido
que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente del
de humanos ya que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica
la adición de varios azúcares manosa.
En levadura, estas etapas están catalizadas por
las manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mntlp
y Mnnlp, que añaden secuencialmente azúcares manosa al oligosacárido
de núcleo. La estructura resultante es indeseable para la
producción de proteínas de tipo humano y, por tanto, es deseable
reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de
S. cerevisiae, que carecen de actividad
manosil-transferasa (por ejemplo, mutantes de Och1
o mnn9) han demostrado ser no mortales y presentan contenido de
manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura,
pareciéndose más, por tanto, a oligosacáridos de eucariotas
superiores.
\vskip1.000000\baselineskip
Los N-glicanos de glicoproteínas animales
típicamente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal.
Estos azúcares no se encuentran en glicoproteínas producidas en
levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, el intervalo
completo de precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo,
UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina,
ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa,
GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se
transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido de núcleo
mediante glicosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, J. Cell Biol
1981. 91 (2): A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982
J. Biol. Chem. 257 (18): 811-817; Pérez y Hirschberg
1987 Methods in Enzymology 138:709-715).
Las reacciones de transferencia de glicosilo
típicamente producen un producto secundario que es un nucleósido
difosfato o monofosfato. Mientras los monofosfatos se pueden
exportar directamente como intercambio por azúcares trifosfato de
nucleósido mediante un mecanismo de antiportador, los
difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir
mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos
de nucleósidos y fosfato inorgánico antes exportarse. Esta reacción
es importante para la glicosilación eficaz; por ejemplo, se ha
observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S.
cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, que
GDPasa tiene una actividad reducida en el 90% hacia UDP (Berninsone
y col., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1): 207-211). Los
eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad difosfatasa
específica de UDP en el Golgi, ya que los mismos no utilizan
precursores de UDP-azúcar para la síntesis de
glicoproteína basada en Golgi. Schizosaccharomyces pombe,
una levadura que se ha observado que añade restos de galactosa a
polisacáridos de la pared celular (a partir de
UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad
de UDPasa específica, indicando el requerimiento potencial de una
enzima de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. .
269(1): 207-211). Se conoce que UDP es un
inhibidor potente de glicosiltransferasas y la remoción de este
producto secundario de la glicosilación puede ser importante para
evitar la inhibición de glicosil-transferasa en el
lumen del Golgi (Khatara y col., 1974). Véase Berninsone, P., y col.
1995. J. Biol. Chem. 270(24): 14564-14567;
Beaudet, L, y col. 1998 Abc Transporters: Biochemical, Cellular, and
Molecular Aspects. 292: 397-413.
\vskip1.000000\baselineskip
Las transferasas y glicosidasas de azúcar (por
ejemplo, manosidasas) surcan la superficie interna (luminal) del RE
y el aparato de Golgi y, por lo tanto, proporcionan una superficie
"catalítica" que permite el procesamiento secuencial de las
glicoproteínas a medida que avanzan a través del RE y la red de
Golgi. Los múltiples compartimentos del Golgi cis, medio y trans y
la Red trans del Golgi (TGN), proporcionan los emplazamientos
diferentes en los que la secuencia ordenada de reacciones de
glicosilación se puede producir. A medida que una glicoproteína
avanza desde la síntesis en el RE hasta la maduración completa en el
Golgi tardío o TGN, se expone secuencialmente a diferentes
glicosidasas, manosidasas y glicosiltransferasas de forma que se
puede sintetizar una estructura de carbohidrato específica. Se ha
dedicado mucho trabajo a descubrir el mecanismo exacto mediante el
cual estas enzimas se retienen y anclan a su organelo respectivo.
La situación en desarrollo es compleja, pero la evidencia sugiere
que la región troncal, la región transmembrana y la cola
citoplasmática, individualmente o en conjunto, dirigen las enzimas
hacia la membrana de los organelos individuales y de ese modo
localizan el dominio catalítico asociado en ese locus (véase, por
ejemplo, Gleeson, PA (1998) Histochem. Cell Biol. 109,
517-532).
En algunos casos, estas interacciones
específicas se observó que funcionaban a través de las especies. Por
ejemplo, el dominio transmembrana de \alpha2,6-ST
de ratas, una enzima que se conoce que se localiza en el Golgi
trans del animal, también demostró localizar un gen informador
(invertasa) en el Golgi de levadura (Schwientek y col. (1995) J.
Biol. Chem. 270(10): 5483-9). Sin embargo, el
mismo dominio transmembrana como parte de una
\alpha2,6-ST de longitud completa se retuvo en el
RE y no se transportó adicionalmente al Golgi de levadura (Krezdom
y col. (1994) Eur. J. Biochem. 220(3):
809-17). Una GalT de longitud completa de seres
humanos ni siquiera se sintetizaba en levaduras, a pesar de niveles
de transcripción que se podía demostrar que eran elevados. Por el
contrario, la región transmembrana de la misma GalT humana fusionada
a un informador de invertasa fue capaz de dirigir la localización
al Golgi de levadura, aunque a niveles de producción bajos.
Schwientek y sus colaboradores han demostrado que fusionar 28
aminoácidos de una manosiltransferasa de levadura (MNT1),
una región que contiene una cola citoplasmática, una región
transmembrana y ocho aminoácidos de la región troncal, al dominio
catalítico de GalT humana son suficientes para la localización en
Golgi de una GalT activa. Otras galactosiltransferasas parecen
depender de interacciones con enzimas residentes en organelos
particulares debido a que, después de la remoción de su región
transmembrana, las mismas todavía son capaces de localizarse
correctamente.
La localización inapropiada de una enzima de
glicosilación puede evitar el funcionamiento apropiado de la enzima
en la ruta. Por ejemplo, Aspergillus nidulans, que tiene
muchas \alpha-1,2-manosidasas
(Eades y Hintz, 2000 Gene 255(1): 25-34), no
añade GlcNAc a Man_{5}GlcNAc_{2} cuando se transforma con el gen
GnTI de conejo, a pesar de un nivel global elevado de actividad de
GnTI (Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J. 12(3):
360-370). GnTI, aunque se expresa activamente, puede
estar localizada de forma incorrecta de forma que la enzima no esté
en contacto con ambos de sus sustratos: UDP-GlcNAc y
un sustrato Man_{5}GlcNAc_{2} productivo (no todas las
estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} son productivas; véase más
adelante). Como alternativa, el organismo huésped puede no
proporcionar un nivel adecuado de UDP-GlcNAc en el
Golgi o la enzima puede estar localizada apropiadamente pero, sin
embargo, inactiva en su nuevo entorno. Además, las estructuras
Man_{5}GlcNAc_{2} presentes en la célula huésped pueden diferir
en estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} encontradas en mamíferos.
Maras y colaboradores han observado que aproximadamente un tercio de
los N-glicanos de celobiohidrolasa I (CBHI) obtenidos a
partir de T. reesei se pueden cortar a Man_{5}GlcNAc_{2}
mediante 1,2 manosidasa de A. saitoi in vitro. Sin embargo,
menos del 1% de esos N-glicanos podría servir como un
sustrato productivo para GnTI. Maras y col., 1997, Eur. J. Biochem.
249, 701-707. Por lo tanto, la simple presencia de
Man_{5}GlcNAc_{2}, no asegura que se pueda conseguir el
procesamiento in vivo adicional de Man_{5}GlcNAc_{2}. Lo
que se necesita es la formación de una estructura de
Man_{5}GlcNAc_{2} reactiva con GnTI productiva. Aunque
Man_{5}GlcNAc_{2} se podría producir en la célula
(aproximadamente el 27% en mol), sólo una pequeña fracción se
podría convertir en Man_{5}GlcNAc_{2} (menos de aproximadamente
el 5%, véase el documento Chiba WO 01/14522).
Hasta la fecha, no existe una manera fiable de
predecir si una glicosiltransferasa o manosidasa expresada de forma
heteróloga particular en un eucariota inferior se (1) traducirá de
forma suficiente, (2) será catalíticamente activa o (3) se
localizará en el organelo apropiado dentro de la ruta secretora.
Debido a que para lograr los patrones de glicosilación en
eucariotas inferiores todos estos tres son necesarios, sería
deseable un esquema sistemático para conseguir la función
catalítica deseada y la retención apropiada de enzimas en ausencia
de herramientas predictivas, que no están disponibles
actualmente.
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Un número significativo de proteínas aisladas a
partir de seres humanos o animales se modifican
post-traduccionalmente, siendo la glicosilación una
de las modificaciones más significativas. Aproximadamente el 70% de
todas las proteínas terapéuticas están glicosiladas y, por tanto,
actualmente dependen de un sistema de producción (es decir, célula
huésped) que sea capaz de glicosilar de una manera similar a los
seres humanos. Varios estudios han demostrado que la glicosilación
juega un papel importante en la determinación de (1)
inmunogenicidad, (2) propiedades farmacocinéticas, (3) tránsito y
(4) eficacia de proteínas terapéuticas. Por tanto, no es
sorprendente que los esfuerzos sustanciales por la industria
farmacéutica se hayan dirigido a desarrollar procedimientos para
obtener glicoproteínas que sean tan "humanoides" o "similares
a humanos" como sea posible. Hasta la fecha, la mayoría de las
glicoproteínas se preparan en un sistema de huésped mamífero. Esto
puede implicar la ingeniería genética de tales células de mamífero
para potenciar el grado de sialilación (es decir, adición terminal
de ácido siálico) de las proteínas expresadas por las células, que
se conoce que mejora las propiedades farmacocinéticas de tales
proteínas. Como Alternativa, se puede mejorar el grado de
sialilación mediante adición in vitro de tales azúcares
usando glicosiltransferasas conocidas y sus azúcares nucleotídicos
respectivos (por ejemplo, 2,3-sialiltransferasa y
ácido CMP-siálico).
Aunque la mayoría de los eucariotas superiores
realizan reacciones de glicosilación que son similares a las
encontradas en seres humanos, las proteínas humanas recombinantes
expresadas en los sistemas huésped mencionados anteriormente
difieren invariablemente de su homólogo humano "natural" (Raju
y col. (2000) Glycobiology 10(5): 477-486).
Por tanto, el trabajo de desarrollo extensivo se ha dirigido a
encontrar maneras de mejorar el "carácter humano" de proteínas
preparadas en estos sistemas de expresión. Esto incluye la
optimización de condiciones de fermentación y la modificación
genética de huéspedes de expresión de proteínas mediante la
introducción de genes que codifican enzimas implicadas en la
formación de glicoformas similares a humano. Goochee y col. (1999)
Biotechnology 9(12): 1347-55; Andersen y
Goochee (1994) Curr Opin Biotechnol. 5(5):
546-49; Werner y col. (1998) Arzneimittelforschung.
48(8): 870-80; Weikert y col. (1999) Nat
Genet. 17(11): 1116-21; Yang y Butler (2000)
Biotech. Bioeng. 68: 370-80. Los problemas
intrínsecos asociados con todos los sistemas de expresión de
mamífero no han sido resueltos.
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Aunque la estructura de oligosacárido de núcleo
transferida a una proteína en el retículo endoplasmático es
básicamente idéntica en mamíferos y eucariotas inferiores, se han
encontrado diferencias sustanciales en las reacciones de
procesamiento posteriores que ocurren en el aparato de Golgi de
hongos y mamíferos. De hecho, incluso entre los eucariotas
inferiores diferentes existe una gran variedad de estructuras de
glicosilación. Esto ha evitado históricamente el uso de eucariotas
inferiores como huéspedes para la producción de glicoproteínas
humanas recombinantes a pesar de las ventajas de otra forma
importantes sobre los sistemas de expresión de mamífero.
Las glicoproteínas terapéuticas producidas en un
huésped de microorganismo tal como levadura utilizando la ruta de
glicosilación de huésped endógena difiere estructuralmente de las
que se producen en células de mamífero y típicamente muestran
eficacia terapéutica enormemente reducida. Tales glicoproteínas son
típicamente inmunógenas en seres humanos y muestran una semivida
reducida (y por tanto bioactividad) in vivo después de la
administración (Takeuchi (1997) Trenes in Glycoscience and
Glycotechnology 9, S29-S35). Los receptores
específicos en seres humanos y animales (es decir, receptores de
manosa de macrófagos) pueden reconocer restos de manosa y promover
la eliminación rápida de la glicoproteína extraña del torrente
sanguíneo. Los efectos secundarios adicionales pueden incluir
cambios en el plegamiento, la solubilidad, la susceptibilidad a
proteasas, el tránsito, el transporte, la
compartimenta-
lización, la secreción, el reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad, o alergenicidad de las proteínas.
lización, la secreción, el reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad, o alergenicidad de las proteínas.
Tanto las levaduras como los hongos filamentosos
se han usado satisfactoriamente para la producción de proteínas
recombinantes, tanto intracelulares como secretadas (Cereghino, JL y
JM Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1):
45-66; Harkki, A., y col. 1989
Bio-Technology 7(6): 596; Berka, RM, y col.
1992 Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203: 121-BIOT;
Svetina, M., y col. 2000 J. Biotechnol.
76(2-3): 245-251). Diversas
levaduras, tales como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia
methanolica y Hansenula polymorpha, han jugado papeles
particularmente importantes como sistemas de expresión eucariotas
debido a que son capaces de crecer hasta densidades celulares
elevadas y secretar grandes cantidades de proteína recombinante.
Análogamente, los hongos filamentosos, tales como Aspergillus
niger, Fusarium sp, Neurospora crassa y otros, se han usado
para producir eficazmente glicoproteínas a escala industrial. Sin
embargo, como se ha indicado anteriormente, las glicoproteínas
expresadas en cualquiera de estos microorganismos eucariotas
difieren sustancialmente en la estructura de N-glicano de
aquellas en los animales. Esto ha evitado el uso de levaduras u
hongos filamentosos como huéspedes para la producción de muchas
glicoproteínas terapéuticas.
Aunque la glicosilación en levaduras y hongos es
muy diferente a la de seres humanos, se comparten algunos elementos
comunes. La primera etapa, la transferencia de la estructura del
oligosacárido de núcleo a la proteína naciente, se conserva
altamente en todos los eucariotas, incluyendo levaduras, hongos,
plantas y seres humanos (comparar Figuras 1A y 1B). Sin embargo, el
procesamiento posterior de los oligosacáridos de núcleo difiere
significativamente en levaduras e implica la adición de varios
azúcares manosa. Esta etapa está catalizada por manosiltransferasas
que residen en el Golgi (por ejemplo, OCH1, NMT1, MNN1,
etc.), que añaden de forma secuencial azúcares manosa al
oligosacárido de núcleo. La estructura resultante es indeseable para
la producción de proteínas humanoides y, por tanto, es deseable
reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de
S. cerevisiae que carecen de actividad manosiltransferasa
(por ejemplo, mutantes OCH1 o mnn9) han demostrado
ser no mortales y presentan un contenido de manosa reducido en el
oligosacárido de glicoproteínas de levadura. Otras enzimas
procesadoras de oligosacáridos, tales como manosilfosfato
transferasas, también pueden tener que eliminarse dependiendo del
patrón de glicosilación endógeno particular del huésped. Después de
reducir las reacciones de glicosilación endógenas indeseadas, la
formación de N-glicanos complejos se tiene que manipular con
ingeniería genética en el sistema de huésped. Esto requiere la
expresión estable de varias enzimas y transportadores de
nucleótidos de azúcar. Además, se tienen que localizar estas enzimas
de forma que se asegure un procesamiento secuencial de la estructura
de glicosilación de maduración.
Se han realizado varios esfuerzos para modificar
las rutas de glicosilación de microorganismos eucariotas para
proporcionar glicoproteínas más adecuadas para uso como agentes
terapéuticos de mamíferos. Por ejemplo, se han clonado por separado
varias glicosiltransferasas y expresado en S. cerevisiae
(GalT, GnTI), Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos
(Yoshida y col. (1999) Glycobiology 9(1):
53-8, Kalsner y col. (1995) Glycoconj. J.
12(3): 360-370). Sin embargo, no se han
obtenido N-glicanos que se parezcan a los que se han
preparado en células humanas.
Las levaduras producen una diversidad de
manosiltransferasas (por ejemplo,
1,3-manosiltransferasas tales como MNN1 en
S. cerevisiae; Graham y Emr, 1991 J. Cell. Biol.
114(2): 207-218),
1,2-manosiltransferasas (por ejemplo, familia
KTR/KRE de S. cerevisiae),
1,6-manosiltransferasas (por ejemplo, OCH1
de S. cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus
reguladores (por ejemplo, MNN4 y MNN6 de S.
cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas
reacciones glicosilación endógena. Muchos de estos genes se han
suprimido individualmente dando origen a organismos viables que
tienen perfiles de glicosilación alterados. Los ejemplos se muestran
en la Tabla 1.
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La Publicación de Solicitud de Patente Japonesa
Nº 8-336387 describe la supresión de un homólogo de
OCH1 en Pichia pastoris. En S. cerevisiae,
OCH1 codifica una 1,6-manosiltransferasa, que
añade una manosa a la estructura de glicano Man_{8}GlcNAc_{2}
para producir Man_{9}GlcNAc_{2}. La estructura de
Man_{9}GlcNAc_{2}, que contiene tres restos de 1,6 manosa,
entonces es un sustrato para 1,2-, 1,6- y
1,3-manosiltransferasas adicionales in vivo,
conduciendo a las glicoproteínas hipermanosiladas que son
características de S. cerevisiae y que típicamente tienen
30-40 restos de manosa por N-glicano .
Debido a que el Ochlp inicia la transferencia de 1,6 manosa al
núcleo Man_{8}GlcNAc_{2}, con frecuencia se denomina "1,6
manosiltransferasa iniciadora" para distinguirla de otras 1,6
manosiltransferasas que actúan posteriormente en el Golgi. En una
cepa mutante de och1 mnn1 mnn4 de S. cerevisiae, las
proteínas glicosiladas con Man_{8}GlcNAc_{2} se acumulan y la
hipermanosilación no ocurre. Sin embargo, Man_{8}GlcNAc_{2} no
es un sustrato para glicosiltransferasas de mamífero, tales como
UDP-GlcNAc transferasa I y, por consiguiente, el
uso de esa cepa mutante, por sí misma, no es útil para producir
proteínas similares a mamífero, es decir, con patrones de
glicosilación complejos o híbridos.
Se pueden cortar las estructuras
Man_{8}GlcNAc_{2} hasta un isómero Man_{5}GlcNAc_{2} en
S. cerevisiae (aunque todavía se tiene que demostrar una
eficiencia alta de corte mayor del 50% in vivo) modificando
genéticamente una manosidasa fúngica de A. saitoi en el
retículo endoplasmático (RE). Los defectos de ese enfoque son
dobles: (1) no está claro si las estructuras Man_{5}GlcNAc_{2}
se forman, de hecho, in vivo (en lugar de haberse secretado
y modificado adicionalmente por manosidasas fuera de la célula); y
(2) es no está claro si cualquiera de las estructuras de
Man_{5}GlcNAc_{2} formadas, de hecho formadas in vivo,
son la isoforma correcta para ser un sustrato productivo para la
modificación de N-glicano posterior mediante por GlcNAc
transferasa I (Maras y col., 1997, Eur. J. Biochem. 249,
701-707).
Con el objeto de proporcionar una glicoproteína
más de tipo humano obtenida a partir de un huésped fúngico, la
Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 describe un procedimiento
para producir una glicoproteína híbrida obtenida a partir de
Trichoderma reseei. Un N-glicano híbrido sólo tiene
restos de manosa en el brazo Man\alpha1-6 de la
estructura de manosa de núcleo y una o dos antenas complejas en el
brazo Man\alpha1-3. Aunque esta estructura tiene
utilidad, el procedimiento tiene la desventaja de que se tienen que
realizar numerosas etapas enzimáticas in vitro, lo cual es
costoso y requiere mucho tiempo. Las enzimas aisladas son costosas
de preparar y necesitan sustratos costosos (por ejemplo,
UDP-GlcNAc). El procedimiento tampoco permite la
producción de glicanos complejos en una proteína deseada.
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Se requiere actividad
alfa-1,2-manosidasa para el corte de
Man_{8}GlcNAc_{2} para formar Man_{5}GlcNAc_{2}, que es un
intermedio principal para la formación de N-glicano complejo
en mamíferos. El trabajo previo ha demostrado que la
\alpha-1,2-manosidasa fúngica y
humana truncada murina se puede expresar en la levadura
metilotrópica P. pastoris y presentar actividad de corte de
Man_{8}GlcNAc_{2} a Man_{5}GlcNAc_{2} (Lal y col.,
Glycobiology 1998 8 Oct (10): 981-95; Tremblay y
col. Glycobiology 1998 Jun; 8 (6): 585-95,
Callewaert y col. (2001) FEBS Lett. 503 (2-3):
173-8). Sin embargo, hasta la fecha, no existen
informes que muestren el nivel elevado de corte in vivo de
Man_{8}GlcNAc_{2} a Man_{5}GlcNAc_{2} en una glicoproteína
secretada a partir de P. pastoris.
Además, la simple presencia de una
\alpha-1,2-manosidasa en la
célula, por sí misma, no asegura el corte intracelular apropiado de
Man_{8}GlcNAc_{2} a Man_{5}GlcNAc_{2}. (Véase, por ejemplo,
Contreras y col. WO 02/00856 A2, en el que una manosidasa marcada
con HDEL de T. reesei se localiza principalmente en el RE y
se co-expresa con una proteína informadora de
hemaglutinina de influenza (HA) en la que no se pudo detectar
prácticamente ninguna Man_{5}GlcNAc_{2}. Véase también Chiba y
col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (41): 26298-26304,
en el que una fusión de
\alpha-1,2-manosidasa
quimérica/dominio transmembrana Och1p localizada en el RE, Golgi
temprano y citosol S. cerevisiae, no tenía actividad de corte
de manosidasa. Por consiguiente, la simple localización de una
manosidasa en el RE o Golgi es insuficiente para asegurar la
actividad de la enzima respectiva en ese organelo dirigido. (Véase
también, Martinet y col. (1998) Biotech. Letters 20(12):
1171-1177, que muestra que
\alpha-1,2-manosidasa de T.
reesei, aunque se localiza intracelularmente, aumentaba en
lugar de disminuir el alcance de manosilación). Hasta la fecha, no
existen informes que demuestren la localización intracelular de una
\alpha-1,2-manosidasa heteróloga
activa en levaduras u hongos usando una secuencia de localización
transmembrana.
Aunque es útil modificar por ingeniería genética
cepas que sean capaces de producir Man_{5}GlcNAc_{2} como la
estructura de N-glicano primaria, cualquier intento de
modificar adicionalmente estas estructuras precursoras con alto
contenido en manosa para que se parezcan más a glicanos humanos
requiere etapas in vivo o in vitro adicionales. Los
procedimientos para humanizar adicionalmente glicanos a partir de
fuentes fúngicas y de levadura in vitro se describen en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251 (mencionada anteriormente).
Si se tiene que humanizar adicionalmente Man_{5}GlcNAc_{2} in
vivo, se tiene que asegurar que las estructuras de
Man_{5}GlcNAc_{2} generadas sean, de hecho, se generen
intracelularmente y no sean el producto de actividad manosidasa en
el medio. La formación de N-glicano complejo en levaduras u
hongos requerirá que se generen niveles elevados de
Man_{5}GlcNAc_{2} dentro de la célula debido a que sólo los
glicanos Man_{5}GlcNAc_{2} intracelulares se pueden procesar
adicionalmente hasta N-glicanos híbridos y complejos in
vivo. Además, se tiene que demostrar que la mayoría de las
estructuras de Man_{5}GlcNAc_{2} generadas son, de hecho, un
sustrato para GnTI y, por tanto, permiten la formación de
N-glicanos híbridos y complejos.
Por consiguiente, existe la necesidad de
procedimientos para producir glicoproteínas caracterizadas por un
contenido de Man_{5}GlcNAc_{2} intracelular elevado que se
puedan procesar adicionalmente en estructuras de glicoproteína
similares a humano en las células huésped eucariotas no humanas y,
particularmente, en levaduras y hongos filamentosos.
\vskip1.000000\baselineskip
Varias manosidasas de clase 2 se han purificado
y caracterizado: manosidasa II de ratón, manosidasa II humana y
manosidasa II de Drosophila (la Figura 24 muestra un árbol
filogenético de las clases de manosidasas). Se ha observado que las
enzimas manosidasa de Clase 2 son responsables de la hidrólisis de
enlaces glicosídicos \alpha1,3, y \alpha1,6 manosa en
oligosacáridos enlazados a N localizados generalmente en el
Golgi. Al menos cinco tipos de manosidasas de Clase 2 se han
identificado, concretamente: (1) \alpha-manosidasa
II de Golgi; (2) \alpha-manosidasa IIx de Golgi;
(3) \alpha-manosidasa lisosomal; (4)
\alpha-manosidasa citosólica; y (5) una enzima
caracterizada a partir de esperma o tejidos epididimarios de ratón y
cerdo. Moremen KW., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002)
225-235.
La anemia diseritropoyética congénita humana de
tipo II se ha asociado con la carencia del gen de
\alpha-manosidasa II funcional como se ha
mostrado en ratones. Chui y col. Cell 1997 11 Jul; 90(1):
157-67. Este defecto genético se denomina HEMPAS
(multinuclearidad eritroblástica hereditaria con ensayo de lisis de
suero acidificado positivo) y la investigación adicional avanza
hacia el estudio del papel de \alpha-manosidasa
II. Por ejemplo, una mutación de un gen único que codifica
\alpha-manosidasa II ha demostrado dar como
resultado una enfermedad autoinmune sistémica similar al lupus
eritematoso sistémico humano. Chui y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 2001 98: 1142-1147.
La importancia de la actividad enzimática en la
formación de glicoproteínas se ha establecido; sin embargo, la
expresión eficaz de tal actividad para la producción de
glicoproteínas terapéuticas no se ha conseguido en células
eucariotas inferiores.
\vskip1.000000\baselineskip
La \alpha-manosidasa II de
Golgi (EC. 3.2.1.114) es una proteína transmembrana de tipo II, de
aproximadamente 125 kDa de tamaño, compuesta de una cola
citoplasmática N-terminal corta, un dominio transmembrana
único conectado por un segmento de tronco con una porción
catalítica C-terminal luminal grande. Moremen y
Touster, J. Biol. Chem., 260, 6654-6662; y Touster
Moremen, J. Biol. Chem., 261, 10945-10951. La
función de la manosidasa II es básica en el procesamiento de
N-glicanos en la ruta secretora. En células de mamífero, se
ha establecido que esta enzima particular hidroliza los enlaces
glicosídicos Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6 en el sustrato
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. El procesamiento de N-glicano
posterior está catalizado por otras enzimas de glicosilación (por
ejemplo, N-acetilglicosaminiltransferasas,
galactosiltransferasas, sialiltransferasas) para producir la
glicoformas deseadas con sus sustratos (UDP-GlcNAc,
UDP-GalNAc, ácido CMP-Siálico) y sus
transportadores respectivos. Véase, por ejemplo, el documento WO
02/00879, que se incorpora como referencia en este documento en su
totalidad.
Un clon parcial que codifica la
\alpha-manosidasa II de Golgi se ha aislado a
partir de una biblioteca de ADNc \lambdagt11 de hígado de rata.
Moremen, KW. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1989 Jul; 86(14):
5276-80. La \alpha-manosidasa II
de Golgi de ratón y la \alpha-manosidasa II humana
también se han caracterizado y expresado en células COS. Moremen y
Robbins, J. Cell. Biol. 1991 Dic; 115 (6): 1521-34.
La investigación conducida en la enzima
\alpha-manosidasa II de Golgi muestra que existe
similitud considerable con el dominio C-terminal de
esta clase de enzima. Además, los estudios de especificidad de
sustrato muestran que la hidrólisis de los enlaces glicosídicos
\alpha1,3 y/o \alpha1,6 mediante la enzima
\alpha-manosidasa II de Golgi requiere un GlcNAc
terminal en el sustrato de oligosacárido.
La \alpha-manosidasa II de
Golgi de Drosophila melanogaster se ha aislado usando el ADNc
de \alpha-manosidasa II de Golgi murina y ha
demostrado tener similitud considerable con regiones de otras
\alpha-manosidasas. Foster y col. Gene 154 (1995)
183-186. El trabajo previo ha demostrado que las
secuencias de ADNc de Drosophila y ratón traducen secuencias
de aminoácidos de identidad del 41% y similitud del 61%. La
expresión de la secuencia de \alpha-manosidasa II
de Golgi de Drosophila en células CHOP (células CHO que
expresan de forma estable antígeno T grande de polioma) ha
demostrado ser activa y también ha demostrado localizarse
principalmente en el aparato de Golgi. Rabouille y col. J. Cell.
Sci. 1999 Oct; 112 (Pt 19) : 3319-30.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica la
\alpha-manosidasa IIx humana
(\alpha-manosidasa de isotipo II) se ha
caracterizado. Ogawa y col. Eur. J. Biochem. 242,
446-453 (1996). La sobreexpresión de la enzima
\alpha-manosidasa IIx conduce a la conversión de
Man_{6}GlcNAc_{2} en Man_{4}GlcNAc_{2} en células CHO.
Oh-eda, y col. Eur. J. Biochem. 268,
1280-1288 (2001). Los dos tipos de
\alpha-manosidasas (II y IIx) están íntimamente
relacionadas con el procesamiento de N-glicanos en el Golgi.
Esta \alpha-manosidasa IIx de Golgi tiene una
identidad del 66% con \alpha-manosidasa II y
tiene una actividad catalítica similar para hidrolizar el
Man\alpha1,6 y Man\alpha1,3 del oligosacárido
Man_{6}GlcNAc_{2}. Estudios más recientes han revelado un
fenotipo de infertilidad obvio en ratones macho sin
\alpha-manosidasa IIx. Biochim Biophys Acta. 2002
19 Dic; 1573(3): 382-7. Un estudio ha
encontrado que los testículos de ratón sin
\alpha-manosidasa IIx mostraban niveles reducidos
de N-glicanos de tipo complejo terminados en GlcNAc.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro tipo de manosidasa de clase 2 se encuentra
en el lisosoma de las células eucariotas y está implicado en el
catabolismo de glicoproteínas (degradación). A diferencia de la
enzima manosidasa II de Golgi, que tiene un pH neutro óptimo, la
manosidasa II lisosomal tiene un pH óptimo bajo (pH 4,5), tiene
especificidad de sustrato natural amplia, es activa hacia el
sustrato sintético
p-nitrofenil-\alpha-manosidasa
y es sensible a la inhibición mediante swainsonina. Daniel y col.,
(1994) Glycobiology 4, 551-566; Moremen y col.,
(1994) Glycobiology, 4, 113-125. Estructuralmente,
la \alpha-manosidasa lisosomal tiene una secuencia
señal N-terminal en lugar de la cola citoplasmática, dominio
transmembrana y región de tronco de la enzima de Golgi. Moremen,
KW, Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002) 225-235.
La \alpha-manosidasa lisosomal humana (EC
3.2.1.24) se ha clonado y expresado en Pichia pastoris. Liao
y col., J Biol Chem 1996 8 Nov; 271 (45): 28348-58.
Basándose en regiones de conservación de secuencia de aminoácidos
entre la \alpha-manosidasa lisosomal de
Dictyostelium discoideum y la
\alpha-manosidasa II de Golgi murina (una
glicoproteína que procesa la actividad de
\alpha1,3/1,6-manosidasa) se ha clonado un ADNc
que codifica la \alpha-manosidasa lisosomal
murina. Merkle y col., Biochim Biophys Acta 1997 29 Agosto; 1336
(2): 132-46. Una deficiencia en la
\alpha-manosidasa lisosomal da como resultado una
enfermedad genética humana denominada
\alpha-manosidosis.
\vskip1.000000\baselineskip
La \alpha-manosidasa II
citosólica es menos similar a las otras manosidasas de Clase 2 y
parece preferir Co^{2+} sobre Zn^{2+} para la actividad
catalítica. Moremen, KW., Biochimica Biophysica Acta 1573 (2002)
225-235. Al igual que la
\alpha-manosidasa II lisosomal, está implicada en
el catabolismo de glicoproteínas. La
\alpha-manosidasa II citosólica cataboliza las
glicoproteínas plegadas de forma inapropiada en el lumen del RE que
se han trasladado de forma retrógrada al citoplasma para desecho
proteolítico. Duvet y col., Biochem. J. 335 (1998)
389-396; Grard y col., Biochem. J. 316 (1996)
787-792. Estructuralmente, esta enzima no tiene
secuencia señal escindible o dominio transmembrana.
Las manosidasas adicionales que muestran
características de manosidasas de Clase 2 se han descrito, pero
todavía se tienen que clonar para la comparación directa mediante
alineamiento de secuencias. Moremen, KW., Biochimica Biophysica Acta
1573 (2002) 225-235.
\vskip1.000000\baselineskip
Las manosidasas de Clase III, que también están
implicadas en el corte de los enlaces glicosídicos Man\alpha1,3 y
Man\alpha1,6 de un oligosacárido, por ejemplo, convirtiendo
Man_{5}GlcNAc_{2} en Man_{3}GlcNAc_{2}, se han clonado e
identificado recientemente. Hasta la fecha, sólo se conocen dos
miembros de esta clase de proteínas. El primer miembro identificado
era de un ratón anémico que no tenía la actividad manosidasa II de
Golgi clásica, pero poseía un mecanismo alternativo para convertir
Man_{5}GlcNAc_{2} directamente en Man_{3}GlcNAc_{2}, que
era independiente de la presencia de GlcNAc en la rama de
manosa-1,3 de núcleo (D. Chui, y col. Cell. 1997
90: 157-167). Estas manosidasas de clase III todavía
tienen que clonarse, pero una proteína con actividad similar se ha
clonado a partir de células Sf9 (Z. Kawar, y col. J. Biol.
Chem . 2001 276(19): 16335-16340). El
único miembro de las manosidasas de clase III que se tiene que
clonar y caracterizar se origina de la línea de células de insectos
lepidópteros Sf9 (D. Jarvis, y col. Glyco-biology
1997 7: 113-127). Esta manosidasa III de Golgi de
Sf9 convierte Man_{5}GlcNAc_{2} en Man_{3}GlcNAc_{2} y, a
diferencia de la manosidasa II de Golgi, no procesa
GlcNAcMan_{6}GlcNAc_{2}. Una característica única de esta clase
de manosidasas es que, además de poseer actividad
Man\alpha1,3/1,6, las mismas también poseen actividad
\alpha-1,2 manosidasa similar a manosidasa de
Golgi de clase I. Además, al igual que las enzimas manosidasa I de
Golgi, esta manosidasa III de Sf9 corta Man_{8}GlcNAc_{2} más
eficazmente que Man_{9}GlcNAc_{2}.
El documento EP 1211310 describe mutantes de
levadura novedosos capaces de producir una glicoproteína en la que
una cadena de azúcar de alto contenido en manosa,
Man_{5}GlcNAc_{2} o GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} está unida a un
resto de asparagina de una proteína; y un procedimiento para
producir la cadena de azúcar y la glicoproteína mediante una
técnica de glicoingeniería usando los mutantes. Este documento
describe adicionalmente la introducción de genes para la
biosíntesis de una cadena de azúcar de tipo mamífero en los
mutantes, para producir glicoproteínas que tienen una cadena de
azúcar de tipo mamífero.
Choi y col. (PNAS, 2003, 100(9):
5022-7) describe un enfoque en el que la ruta
secretora de Pichia pastoris se volvía a modificar por
ingeniería genética para realizar reacciones de glicosilación
secuenciales que mimetizan el procesamiento temprano de
N-glicanos en seres humanos y otros mamíferos superiores.
La expresión recombinante de una proteína
informadora humana en estas cepas modificadas por ingeniería
genética condujo a la formación de una glicoproteína con
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} como el N-glicano principal.
Dada la utilidad de las actividades de enzima
manosidasa en el procesamiento de N-glicanos, sería deseable
tener un procedimiento para producir glicoproteínas similares a
humano en células huésped eucariotas inferiores que comprenda la
etapa de expresar una \alpha-manosidasa II
catalíticamente activa que tenga una especificidad de sustrato por
Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6 en un oligosacárido.
La invención proporciona un procedimiento para
producir una glicoproteína de tipo humano en una célula huésped de
levadura o de hongo filamentoso unicelular o multicelular que
comprende la etapa de expresión de un ácido nucleico que codifica
una enzima quimérica que comprende un dominio catalítico de
manosidasa fusionado a un péptido señal de dirección celular, donde
dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo más del
40% de los enlaces Man\alpha1,3 y/o Man\alpha1,6 de un sustrato
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. El dominio catalítico de manosidasa y
el péptido señal de dirección celular se seleccionan entre la Tabla
11 descrita en este documento más adelante.
Preferiblemente, el N-glicano deseado
producido es GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}. En otra realización
preferida, el N-glicano deseado se caracteriza por que
tiene, al menos, la rama de oligosacárido Man\alpha1,3
(Man\alpha1,6) Man\beta1,4-GlcNAc
\beta1,4-GlcNAc \beta1-Asn. La
glicoproteína preferiblemente se aísla a partir de la célula
huésped. En otra realización preferida, la actividad enzimática de
manosidasa es capaz de hidrolizar in vivo los enlaces tanto
de Man\alpha1,3 como Man\alpha1,6 de un sustrato de
oligosacárido que comprende un enlace glicosídico Man\alpha1,3 y
Man\alpha1,6.
En otra realización preferida, el sustrato de
oligosacárido se caracteriza como GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3
(Man\alpha1,6 Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn;
GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3 (Man\alpha1,3 Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn;
y GlcNAc\beta1,2Man\alpha1,3 (Man\alpha1,3 Man\alpha1,6
Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn.
En una realización preferida, la actividad
manosidasa se caracteriza como una actividad manosidasa de Clase 2.
En una realización más preferida, la actividad manosidasa de Clase 2
tiene una especificidad de sustrato por GlcNAc\beta1,2
Man\alpha1,3 (Man\alpha1,6 Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn;
GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3 (Man\alpha1,3 Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn;
o GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3 (Man\alpha1,3 Man\alpha1,6
Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn.
En una realización aún más preferida, la actividad manosidasa de
Clase 2 es una que normalmente se encuentra en el aparato de Golgi
de una célula huésped eucariota superior.
En una cualquiera de las realizaciones
anteriores, la actividad manosidasa está preferiblemente
sobreexpresada. En otra realización preferida, la manosidasa es
capaz además de hidrolizar un enlace Man\alpha1,2. Las actividades
manosidasa de la invención preferiblemente tienen un pH óptimo de
aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.
En otra realización la actividad manosidasa se
localiza dentro de la ruta secretora de la célula huésped.
Preferiblemente, la actividad manosidasa se expresa a partir de un
polipéptido localizado dentro de al menos uno del RE, aparato de
Golgi o la red trans del Golgi de la célula huésped.
En una realización preferida, la actividad
manosidasa se expresa a partir de un ácido nucleico que codifica un
polipéptido que comprende un dominio catalítico de manosidasa
fusionado a un péptido señal de dirección celular. En una
realización más preferida, la actividad manosidasa se expresa a
partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican
un dominio catalítico de manosidasa nativo para la célula huésped.
En otra realización más preferida, la actividad manosidasa se
expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que
codifican un dominio catalítico de manosidasa heterólogo a la célula
huésped.
En otra realización preferida, la actividad
enzimática de manosidasa se selecciona entre el grupo constituido
por Manosidasa II de Arabidopsis thaliana, Manosidasa II de
C. elegans, manosidasa II de Ciona intestinalis,
manosidasa II de Drosophila, manosidasa II Humana, manosidasa
II de Ratón, manosidasa II de Rata, manosidasa II lisosomal Humana y
manosidasa II citoplasmática Humana.
En otra realización preferida, el polipéptido se
expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que
codifican un péptido diana nativo para la célula huésped.
En otra realización preferida, el polipéptido se
expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que
codifican un péptido diana heterólogo para el dominio catalítico de
manosidasa.
En una realización preferida, la célula huésped
se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris,
Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia
membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia
salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia
methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis,
Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense,
Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y
Neurospora crassa. En una realización más preferida, la
célula huésped es Pichia pastoris.
La solicitud proporciona además glicoproteínas y
N-glicanos producidos por uno de los procedimientos
anteriores. En una realización preferida, la glicoproteína es una
proteína terapéutica. En una realización más preferida, la proteína
terapéutica se selecciona entre el grupo constituido por
eritropoyetina, citoquinas tales como
interferón-\alpha,
interferón-\beta,
interferón-\gamma,
interferón-\omega y CSF de granulocitos, factores
de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C
humana, cadena \alpha del receptor de IgE soluble, IgG,
fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa e
inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IgF, factor de
crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del
crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de
crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores
mieloides 1, osteoprotegerina, \alpha-1
antitripsina, ADNasa II, \alpha-fetoproteínas,
AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína de Unión a TNF aka
1),TACI-lg (activador transmembrana y modulador de
calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona
estimulante de folículo), GM-CSF,
GLP-1 con y sin FC (proteína similar a glucagón 1),
agonistas del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel,
fusión Fc de receptor de TNF soluble aka) ATIII, rhTrombina,
glucocerebrosidasa e IgG de CTLA4 (Ig de Antígeno 4 asociado con
Linfocito T Citotóxico).
La solicitud describe además una biblioteca de
ácidos nucleicos que comprende al menos dos construcciones
genéticas diferentes, donde al menos una construcción genética
comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica una
manosidasa de Clase 2, IIx o dominio catalítico III ligado en marco
con un fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido señal de
dirección celular que normalmente no está asociado con el mismo.
Se describe que el dominio catalítico de
manosidasa se selecciona entre el grupo constituido por: Manosidasa
II de Arabidopsis thaliana, Manosidasa II de C
elegans, manosidasa II de Ciona intestinalis, manosidasa
II de Drosophila, manosidasa II Humana, manosidasa II de
Ratón, manosidasa II de Rata, manosidasa IIx Humana, manosidasa III
de células de insecto, manosidasa II lisosomal Humana y manosidasa
II citoplasmática Humana.
Se describen fragmentos de ácido nucleico que
codifican un péptido de dirección celular, seleccionado entre el
grupo constituido por: GLS 1 de Saccharomyces, MNS1 de
Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de
Pichia, OCH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces,
VAN1 de Saccharomyces, ANP1 de Saccharomyces, HOC1 de
Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de
Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de
Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTR1 de
Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de
Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de
Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de
Saccharomyces y MNN6 de
Saccharomyces.
Saccharomyces.
La solicitud describe además un vector que
comprende una construcción de fusión obtenida a partir de una
cualquiera de las bibliotecas anteriores enlazada a una secuencia
de control de expresión, donde dicho péptido señal de dirección
celular se dirige a al menos uno del RE, Golgi o red trans del
Golgi. La secuencia de control de expresión se describe como que es
inducible o constitutiva. El vector, tras la expresión en una célula
huésped, se describe como que codifica una actividad manosidasa
implicada en la producción de
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} o
Man_{4}GlcNAc_{2} in vivo.
La solicitud describe además una célula huésped
que comprende al menos uno de los vectores anteriores. El vector se
describe como que se selecciona entre el grupo de vectores
denominados pKD53, pKD1, pKD5, pKD6 y
pKD16.
pKD16.
Otra realización de la invención proporciona un
polipéptido quimérico que comprende un dominio catalítico de
manosidasa fusionado en fase a un péptido señal de dirección y, tras
la expresión en la célula huésped de levadura o de hongo
filamentoso unicelular o multicelular, es capaz de hidrolizar in
vivo un sustrato de oligosacárido que comprende cualquiera o
ambos enlaces glicosídicos Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6 hasta el
alcance de que al menos el 10% de los enlaces Man\alpha1,3 y/o
Man\alpha1,6 del sustrato se hidrolizan in vivo.
Otra realización de la invención proporciona un
polipéptido quimérico que comprende un dominio catalítico de
manosidasa fusionado en fase a un péptido señal de dirección y, tras
la expresión en una célula huésped de levadura o de hongo
filamentoso unicelular o multicelular, capaz de hidrolizar in
vivo un sustrato de oligosacárido que comprende un enlace
gliosídico Man\alpha1,3, Man\alpha1,6, o Man\alpha1,2 hasta
el alcance de que un resto detectable del enlace Man\alpha1,3,
Man\alpha1,6 o Man\alpha1,2 del sustrato se hidroliza in
vivo.
Otra realización de la invención proporciona un
ácido nucleico que codifica el polipéptido quimérico anterior o una
célula huésped que comprende el polipéptido quimérico anterior.
Otra realización de la invención proporciona una
célula huésped que comprende el ácido nucleico anterior.
Otra realización de la invención proporciona una
composición de glicoproteína producida en la célula huésped
anterior. En una realización más preferida, se proporciona un
N-glicano producido en la célula huésped. Más
preferiblemente, la composición de glicoproteína se caracteriza como
uniforme.
\newpage
Otra realización de la invención proporciona un
polinucleótido aislado que comprende o está constituido por una
secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo constituido
por las regiones conservadas SEC ID Nº: 5-SEC ID Nº:
15.
La Figura 1A es un diagrama esquemático de una
ruta de N-glicosilación fúngica típica.
La Figura 1B es un diagrama esquemático de un
ruta de N-glicosilación humana típica.
La Figura 2 representa la construcción de una
biblioteca de ADN combinatoria de construcciones de fusión. La
Figura 2A diagrama la inserción de un fragmento de péptido de
dirección en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA).
La Figura 2B muestra la sub-biblioteca de péptido de
dirección generado que tiene sitios de restricción
NotI-AscI. La Figura 2C diagrama la inserción
de una región de dominio catalítico en pJN347, un vector de pUC19
modificado. La Figura 2D muestra la sub-biblioteca
de dominio catalítico generada que tiene sitios de restricción
NotI, AscI y PacI. La Figura 2E representa una
construcción de fusión particular generada a partir de la
sub-biblioteca de péptido de dirección y la
sub-biblioteca de dominio catalítico.
La Figura 3 ilustra la secuencia de ácido
nucleico de fase de lectura abierta de \alpha-1,2
manosidasa IA de M. musculus (SEC ID Nº: 1) y secuencia de
polipéptido codificado (SEC ID Nº: 2). Las secuencias de los
cebadores de PCR usados para generar los truncamientos
N-terminal están subrayadas.
Las Figuras 4A-4F ilustran la
ingeniería genética de vectores con múltiples marcadores auxótrofos
e integración genética de proteínas diana en el locus OCH1 de
P. pastoris.
Las Figuras 5A-5E muestran
análisis de MALDI-TOF que demuestran la producción
de dominio de kringle 3 de glicoproteínas de plasminógeno humano
(K3) que tienen Man_{5}GlcNAc_{2} como la estructura de
N-glicano predominante en P. pastoris. La Figura 5A
representa el glicano Man_{5}GlcNAc_{2} [a] convencional (Glyko,
Novato, CA) y Man_{5}GlcNAc_{2} + Na + [b]. La Figura 5B muestra
glicanos liberados por PNGasa a partir de tipo silvestre K3. Los
N-glicanos mostrados son los siguientes:
Man_{9}GlcNAc_{2} [d]; Man_{10}GlcNAc_{2} [e];
Man_{11}GlcNAc_{2} [f]; Man_{12}GlcNAc_{2} [g]. La Figura 5C
representa la supresión de och1 que da como resultado la
producción de Man_{8}GlcNAc_{2} [c] como el N-glicano
predominante. Las Figuras 5D y 5E muestran la producción de
Man_{5}GlcNAc_{2} [b] después del corte in vivo de
Man_{8}GlcNAc_{2} con una
\alpha-1,2-manosidasa quimérica.
El N-glicano predominante se indica mediante un pico con una
masa (m/z) de 1253 coherente con su identificación como
Man_{5}GlcNAc_{2} [b].
Las Figuras 6A-6F muestran
análisis de MALDI-TOF que demuestran la producción
de glicoproteínas de IFN-\beta que tienen
Man_{5}GlcNAc_{2} como la estructura de N-glicano
predominante en P. pastoris. La Figura 6A muestra el
Man_{5}GlcNAc_{2} [a] y Man_{5}GlcNAc_{2} + Na+ [b] como el
patrón (Glyko, Novato, CA). La Figura 6B muestra glicanos liberados
por PNGasa a partir de IFN-\beta de tipo silvestre. La
Figura 6C representa la eliminación de och1 que produce
Man_{8}GlcNAc_{2} [c]; Man_{9}GlcNAc_{2} [d];
Man_{10}GlcNAc_{2} [e]; Man_{11}GlcNAc_{2} [f];
Man_{12}GlcNAc_{2} [g]; y la no producción de
Man_{5}GlcNAc_{2} [b]. La Figura 6D muestra una cantidad
relativamente pequeña de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] entre otros
N-glicanos intermedios Man_{8}GlcNAc_{2} [c] a
Man_{12}GlcNAc_{2} [g]. La Figura 6E muestra una cantidad
significativa de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] en relación con los otros
glicanos Man_{8}GlcNAc_{2} [c] y Man_{9}GlcNAc_{2} [d]
producidos por pGC5 (MS1 (m) de Saccharomyces/manosidasa IB
\Delta99 de ratón). La Figura 6F muestra la producción
predominante de Man_{5}GlcNAc_{2} [b] de la glicoproteína
secretada IFN-\beta mediante pFB8 (SEC12 de
Saccharomyces (m)/manosidasa IA \Delta187 de ratón). El
N-glicano está indicado por un pico con una masa (m/z) de
1254 coherente con su identificación como Man_{5}GlcNAc_{2}
[b].
La Figura 7 muestra un cromatograma líquido de
alto rendimiento para: (A) Man_{9}GlcNAc_{2} convencional
marcado con 2-AB (control negativo); (B)
sobrenadante de medio de cultivo de P. pastoris, \Delta
och1 transformado con manosidasa de pFB8, que demuestra una
carencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante y
(C) Man_{9}GlcNAc_{2} convencional marcado con
2-AB después de exposición a manosidasa de T.
reesei (control positivo).
La Figura 8 muestra un cromatograma líquido de
alto rendimiento para: (A) Man_{9}GlcNAc_{2} convencional
marcado con 2-AB (control negativo); (B)
sobrenadante de medio de cultivo de P. pastoris, \Delta
och1 transformado con manosidasa de pGC5, que demuestra una
carencia de actividad manosidasa extracelular en el sobrenadante y
(C) Man_{9}GlcNAc_{2} convencional marcado con
2-AB después de exposición a manosidasa de T.
reesei (control positivo).
La Figura 9 muestra un cromatograma líquido de
alto rendimiento para: (A) Man_{9}GlcNAc_{2} convencional
marcado con 2-AB (control negativo); (B)
sobrenadante de medio de cultivo de P. pastoris, \Delta
och1 transformado con manosidasa de pBC18-5,
que demuestra una carencia de actividad manosidasa extracelular en
el sobrenadante y (C) sobrenadante de medio de P.
pastoris, A och1 transformado con pDD28-3, que
demuestra actividad en el sobrenadante (control positivo).
Las Figuras 10A-10B demuestran
la actividad de un transportador de UDP-GlcNAc en la
producción de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en P. pastoris. La Figura 10A representa una cepa de P. pastoris (YSH-3) transformada con un GnTI humano pero sin que el transportador UDP-GlcNAc dé como resultado alguna producción de GlcNAcMan_{5}
GlcNAc_{2} [b] sino una producción predominante de Man_{5}GlcNAc_{2} [a]. La Figura 10B representa la adición de transportador UDP-GlcNAc de K. lactis en una cepa (PBP-3) transformada con la GnTI humano, que dio como resultado la producción predominante de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b]. El pico prominente único de masa (m/z) en 1457 es coherente con su identificación como GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b] como se muestra en la Figura 10B.
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en P. pastoris. La Figura 10A representa una cepa de P. pastoris (YSH-3) transformada con un GnTI humano pero sin que el transportador UDP-GlcNAc dé como resultado alguna producción de GlcNAcMan_{5}
GlcNAc_{2} [b] sino una producción predominante de Man_{5}GlcNAc_{2} [a]. La Figura 10B representa la adición de transportador UDP-GlcNAc de K. lactis en una cepa (PBP-3) transformada con la GnTI humano, que dio como resultado la producción predominante de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b]. El pico prominente único de masa (m/z) en 1457 es coherente con su identificación como GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b] como se muestra en la Figura 10B.
La Figura 11 muestra un pH óptimo de una enzima
manosidasa heteróloga codificada por pBB27-2 (MNN10
de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta31 de C.
elegans) expresada en P. pastoris.
Las Figuras 12A-12C muestran
análisis de MALDI-TOF-MS de
N-glicanos liberados a partir de un extracto sin células de
K. lactis. La Figura 12A muestra los N-glicanos
liberados a partir de células de tipo silvestre, que incluye
N-glicanos de alto contenido en manosa. La Figura 12B muestra
los N-glicanos liberados a partir de células con och1
y mnn1 suprimidos, que revelan un pico claro de masa (m/z) en
1908 coherente con su identificación como Man_{9}GlcNAc_{2} [d].
La Figura 12C muestra los N-glicanos liberados a partir de
células con och1 mnn1 suprimidos después de digestión con
\alpha-1,2-manosidasa in
vitro correspondiente a un pico coherente con
Man_{5}GlcNAc_{2}.
La Figura 13 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de glicoproteína Kringle 3 producidos en P.
pastoris YSH-1 (mutante con supresión
och1 transformado con \alpha-manosidasa y
GnT I) que muestra un pico predominante en 1465 m/z correspondiente
a la masa de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d].
La Figura 14 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de glicoproteína kringle 3 producidos en una P.
pastoris YSH-1 transformada con
manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNN2 (s) de S.
cerevisiae que muestra un pico predominante en 1140 m/z
correspondiente a la masa de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] y otros
picos correspondientes a GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] en 1303 m/z
y GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] en 1465 m/z. Esta cepa se denominó
YSH-37.
La Figura 15 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una
P. pastoris YSH-37 transformada con
GnT II de rata/líder de MNN2 (s) que muestra un pico predominante en
1356 m/z correspondiente a la masa de
GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [x]. Esta cepa se denominó
YSH-44.
La Figura 16 muestra una análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una
P. pastoris YSH-44
(GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [b] producido como se muestra en
la Figura 15) que muestra un pico predominante en 933 m/z
correspondiente a la masa de Man_{3}GlcNAc_{2} [a] después de
digestión con \beta-N-acetilhexosaminidasa.
La Figura 17 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una
P. pastoris YSH-44
(GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [b] producido como se muestra en
la Figura 15) que muestra un pico predominante en 1665 m/z que
corresponde a la masa de Gal_{2}GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}
después de la adición de \beta1,4-galactosil
transferasa in vitro.
La Figura 18 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una
P. pastoris YSH-1 transformada con
manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNN9(m) de
S. cerevisiae que muestra un pico predominante en 1464 m/z
correspondiente a la masa de Man_{5}GlcNAc_{2} [d].
La Figura 19 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una
P. pastoris YSH-1 transformada con
manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNS1 (1) de S.
cerevisiae que muestra un pico predominante en 1464 m/z
correspondiente a la masa de Man_{5}GlcNAc_{2} [d] y otros picos
correspondientes a GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] en 1139 m/z y
GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] en 1302 m/z.
La Figura 20 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en una
P. pastoris YSH-1 transformada con
manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/GLS1 (s) de S.
cerevisiae que muestra un pico predominante en 1139 m/z que
corresponde a la masa de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b]. Esta cepa
se denominó YSH-27.
La Figura 21 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de glicoproteína kringle 3 producidos en una P.
pastoris YSH-1 transformada con
manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNS1 (m) de S.
cerevisiae que muestra un pico predominante en 1140 m/z
correspondiente a la masa de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] y otros
picos correspondientes a GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] en 1302 m/z
y GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] en 1464 m/z. Esta cepa se denominó
YSH-74.
La Figura 22 muestra un análisis de
MALDI-TOF-MS de N-glicanos
aislados a partir de glicoproteína kringle 3 producidos en una P.
pastoris YSH-74 digeridos con una
\alpha-1,2 manosidasa de T. reesei/A.
saitoi que muestra un pico predominante en 1141 m/z que
corresponde a la masa de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b].
La Figura 23 muestra una Comparación de
Secuencia de BLAST de manosidasa II, manosidasa IIx y manosidasas de
Clase III conocidas e hipotéticas (SEC ID Nº: 96, 92, 93, 99, 98,
97, 94, 95 y 100-102, respectivamente en orden de
aparición).
La Figura 24 muestra un árbol filogenético de
las clases de manosidasa.
La Figura 25 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 49) de Manosidasa II de Arabidopsis
thaliana (NM_121499) y proteína codificada (SEC ID Nº: 95).
La Figura 26 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 50) de Manosidasa II de C. elegans
(NM_073594) y proteína codificada (SEC ID Nº: 92).
La Figura 27 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 51) de manosidasa II de Ciona
intestinalis (AK116684) y proteína codificada (SEC ID Nº:
94).
La Figura 28 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 52) de manosidasa II de D.
melanogaster (X77652) y proteína codificada (SEC ID Nº: 96).
La Figura 29 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 53) de manosidasa II humana (U31520) y
proteína codificada (SEC ID Nº: 97).
La Figura 30 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 54) de manosidasa II de ratón (X61172) y
proteína codificada (SEC ID Nº: 98).
La Figura 31 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 55) de manosidasa II de rata (XM_218816) y
proteína codificada (SEC ID Nº: 93).
La Figura 32 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 56) de manosidasa IIx humana (D55649) y
proteína codificada (SEC ID Nº: 99).
La Figura 33 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 57) de manosidasa II de célula de insecto
(AF005034) y proteína codificada (SEC ID Nº: 100).
La Figura 34 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 58) de manosidasa II lisosomal humana
(NM_000528) y proteína codificada (SEC ID Nº: 101).
(NM_000528) y proteína codificada (SEC ID Nº: 101).
La Figura 35 muestra una secuencia de
nucleótidos (SEC ID Nº: 59) de manosidasa II citoplasmática humana
(N_006715) y proteína codificada (SEC ID Nº: 102).
La Figura 36 ilustra intermedios de
oligosacáridos producidos usando actividades manosidasa II,
manosidasa IIx y manosidasa III.
A menos que se defina de otra manera en este
documento, los términos científicos y técnicos usados con relación
a la presente invención tendrán los significados comprendidos
comúnmente por los expertos en la materia. Además, a menos que el
contexto lo requiera de otra manera, los términos singulares
incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el
singular. Los procedimientos y técnicas de la presente invención
generalmente se realizan de acuerdo con procedimientos
convencionales bien conocidos en la técnica. En general, las
nomenclaturas usadas en relación con y las técnicas de bioquímica,
enzimología, biología molecular y celular, microbiología, genética
y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en
este documento son bien conocidas y se usan comúnmente en la
técnica.
Los procedimientos y técnicas de la presente
invención en general se realizan de acuerdo con procedimientos
convencionales bien conocidos en la técnica y como se ha descrito en
diversas referencias generales y más específicas que se citan y
analizan a través de toda la presente memoria descriptiva a menos
que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook y col.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel y col.,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Associates (1992, y Suplementos hasta 2002); Hariow y Lane
Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Introduction to
Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press
(2003); Worthington Enzyme Manual, Wor-thington
Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A
Proteins Vol 1.1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A
Proteins Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1999). Las nomenclaturas usadas en
relación con y los procedimientos y técnicas de laboratorio de
biología molecular y celular, bioquímica de proteínas, enzimología
y química medicinal y farmacéutica descritos en este documento son
aquellos bien conocidos y usados comúnmente en la técnica.
Las siguientes expresiones, a menos que se
indique de otra manera, se debe apreciar que tienen los siguientes
significados:
Como se usa en este documento, el término
"N-glicano" se refiere a un oligosacárido enlazado a
N, por ejemplo, uno que está unido por un enlace de
asparagina-N-acetilglucosamina a un resto de asparagina de
un polipéptido. Los N-glicanos tienen un núcleo pentasacárido
común de Man_{3}GlcNAc_{2} ("Man" se refiere a manosa;
"Glc" se refiere a glucosa y "NAc" se refiere a
N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina).
La expresión "núcleo trimanosa" usada con respecto al
N-glicano también se refiere a la estructura
Man_{3}GlcNAc_{2} ("Man_{3}"). Los N-glicanos
difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden
azúcares periféricos (por ejemplo, fucosa y ácido siálico) que se
añaden a la estructura de núcleo Man_{3}. Los N-glicano se
clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por
ejemplo, alto contenido de manosa, complejo o híbrido).
Un N-glicano de tipo "alto contenido de
manosa" tiene cinco o más restos de manosa. Un N-glicano
de tipo "complejo" típicamente tiene al menos un GlcNAc unido
al brazo 1,3 manosa y al menos un GlcNAc unido al brazo 1,6 manosa
del núcleo trimanosa. Los N-glicanos complejos también pueden
tener restos de galactosa ("Gal") que están opcionalmente
modificados con ácido siálico o sus derivados ("NeuAc", donde
"Neu" se refiere a ácido neuramínico y "Ac" se refiere a
acetilo). Un N-glicano complejo típicamente tiene al menos
una rama que termina en un oligosacárido tal como, por ejemplo,
NeuNAc-; NeuAca2-6Ga1NAca1-;
NeuAca2-3Galb1-3GalNAca1-;
NeuAca2-3/6Galb1-4GlcNAcb1-;
GlcNAcal-4Galb1- (sólo mucinas);
Fuca1-2Galb1- (grupo sanguíneo H). Los ésteres de
sulfato pueden aparecer en restos de galactosa, GalNAc y GlcNAc y
los ésteres de fosfato pueden estar presentes en restos de manosa.
NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo) pueden estar
O-acetilados o reemplazados por NeuGI (ácido
N-glicolilneuramínico). Los N-glicanos complejos
también pueden tener sustituciones intracadena que comprenden
GlcNAc "bisecantes" y fucosa de núcleo ("Fuc"). Un
N-glicano "híbrido" tiene al menos un GlcNAc en el
extremo del brazo 1,3 manosa del núcleo trimanosa y cero o más
manosas en el brazo 1,6 manosa del núcleo trimanosa.
El término "predominante" o
"predominantemente" usado con respecto a la producción de
N-glicano se refiere a una estructura que presenta el pico
principal detectado mediante análisis de espectrometría de masa de
deserción e ionización por láser asistida por
matriz-tiempo de vuelo
(MALDI-TOF).
Las abreviaturas usadas en este documento son de
uso común en la técnica, véanse, por ejemplo, abreviaturas de
azúcares, anteriormente. Otras abreviaturas comunes incluyen
"PNGasa", que se refiere a N-glicosidasa peptídica F
(EC 3.2.2.18); "GlcNAc Tr" o "GnT", que se refieren a
enzimas N-acetilglucosaminil Transferasa; "NANA" se
refiere a ácido N-acetilneuramínico.
Como se usa en este documento, una
"glicoproteína humanizada" o una "glicoproteína de tipo
humano" se refiere como alternativa a una proteína que tiene
unida a la misma N-glicanos que tienen tres o menos restos de
manosa e intermedios de glicoproteínas sintéticas (que también son
útiles y se pueden manipular adicionalmente in vitro o in
vivo). Preferiblemente, las glicoproteínas producidas de acuerdo
con la invención contienen al menos el 20% en mol, preferiblemente
del 20-30% en mol, más preferiblemente del
30-40% en mol, aún más preferiblemente del
40-50% en mol y aún más preferiblemente del
50-100% en mol del intermedio
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, al menos transitoriamente. Esto se
puede conseguir, por ejemplo, modificando por ingeniería genética
una célula huésped de la invención para que exprese una enzima de
glicosilación "mejor", es decir, más eficaz. Por ejemplo, se
selecciona una manosidasa II de forma que la misma tendrá actividad
óptima en las condiciones presentes en el sitio en la célula
huésped en el que las proteínas se glicosilan y se introduce en la
célula huésped preferiblemente dirigiendo la enzima a un organelo de
la célula huésped donde se desea la actividad.
El término "enzima", cuando se usa en este
documento con relación a la alteración de la glicosilación de la
célula huésped, se refiere a una molécula que tiene al menos una
actividad enzimática e incluye enzimas de longitud completa,
fragmentos catalíticamente activos, quiméricos, complejos y
similares. Un "fragmento catalíticamente activo" de una enzima
se refiere a un polipéptido que tiene un nivel detectable de
actividad funcional (enzimática). La actividad enzimática es
"sustancialmente intracelular" cuando las enzimas de
procesamiento posterior tienen la capacidad de producir
aproximadamente el 51% de las glicoformas deseadas in
vivo.
Una célula huésped eucariota inferior, cuando se
usa en este documento con relación a perfiles de glicosilación, se
refiere a cualquier célula eucariota que produce de forma normal
N-glicanos que contienen manosa elevada y, por tanto, tiene
por objeto incluir algunas células animales o vegetales y la mayoría
de las células eucariotas inferiores típicas, incluyendo células
fúngicas y de algas uni y multicelulares.
Como se usa en este documento, la expresión
"ruta de secreción" se refiere a la línea de ensamblaje de
diversas enzimas de glicosilación a la que se exponen
secuencialmente un precursor de oligosacárido enlazado a lípido y
un sustrato de N-glicano, siguiendo el flujo molecular de una
cadena polipeptídica naciente desde el citoplasma hasta el retículo
endoplasmático (RE) y los compartimentos del aparato de Golgi. Las
enzimas se dice que se localizan a lo largo de esta ruta. Una
enzima X que actúa sobre un glicano enlazado a lípido o un
N-glicano antes de una enzima Y se dice que es o actúa
"cadena arriba" de la enzima Y; de forma similar, la enzima Y
está o actúa "cadena abajo" de la enzima X.
La expresión "péptido de dirección" como se
usa en este documento se refiere a secuencias de nucleótido o
aminoácidos que codifican un péptido señal de dirección celular que
media la localización (o retención) de una secuencia asociada a
emplazamientos subcelulares, por ejemplo, organelos.
Las expresiones "polinucleótido" o
"molécula de ácido nucleico" se refieren a una forma polimérica
de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Las expresiones
incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico o
sintético) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm o ARN sintético),
así como análogos de ADN o ARN que contienen análogos nucleotídicos
no naturales, enlaces internucleósido no nativos o ambos. El ácido
nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por
ejemplo, el ácido nucleico puede ser de hélice única, de doble
hélice, de triple hélice, en cuádruplex, parcialmente de doble
hélice, ramificado, en horquilla, circular o en una conformación de
candado. La expresión incluye formas de hélice única y de doble
hélice de ADN. Una molécula de ácido nucleico de esta invención
puede incluir hebras tanto sentido como antisentido de ARN, ADNc,
ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los
anteriores. Los mismos se pueden modificar químicamente o
bioquímicamente o pueden contener bases nucleotídicas no naturales o
derivatizadas, como podrán apreciar fácilmente los expertos en la
materia. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas,
metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen
natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales
como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos,
fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc), enlaces cargados
(por ejemplo, fósforotioatos, fósforoditioatos, etc), restos
colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo,
acridina, psoralen, etc), enlaces quelantes, alquilantes y
modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc).
También se incluyen moléculas sintéticas que mimetizan los
polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada
a través de un enlace de hidrógeno y otras interacciones químicas.
Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,
aquellas en las que los enlaces fosfato sustituyen a los enlaces
peptídicos en la estructura principal de la molécula.
A menos que se indique de otra manera, un ácido
nucleico que comprende "SEC ID Nº X" se refiere a un ácido
nucleico, al menos una parte del mismo que tiene (i) la secuencia de
SEC ID Nº: X o (ii) una secuencia complementaria a SEC ID Nº: X. La
elección entre las dos está determinada por el contexto. Por
ejemplo, si el ácido nucleico se usa como una sonda, la elección
entre los dos está determinada por la necesidad de que la sonda sea
complementaria a la diana deseada.
Un ácido nucleico o polinucleótido
"aislado" o "sustancialmente puro" (por ejemplo, un ARN,
ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado
de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al
polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo,
ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que está
naturalmente asociado. Las expresiones abarcan un ácido nucleico o
polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno de origen
natural, (2) no está asociado con todo o una parte de un
polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se
encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un
polinucleótido al cual no está enlazado en la naturaleza o (4) no
está presente en la naturaleza. Las expresiones "aislado" o
"sustancialmente puro" también se pueden usar con referencia a
aislados de ADN recombinante o clonado, análogos polinucleotídicos
químicamente sintetizados o análogos polinucleotídicos que se
sintetizan biológicamente mediante sistemas heterólogos.
Sin embargo, "aislado" no necesariamente
requiere que el ácido nucleico o polinucleótido descrito se haya
retirado físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una
secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo
se considera "aislada" en este documento si se coloca una
secuencia heteróloga (es decir, una secuencia que no es adyacente
de forma natural a esta secuencia de ácido nucleico endógena)
adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, de forma que
la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógena está
alterada. A modo de ejemplo, una secuencia promotora no nativa se
puede sustituir (por ejemplo, mediante recombinación homóloga) por
el promotor nativo de un gen en el genoma de una célula humana, de
forma que este gen tiene un patrón de expresión alterado. Este gen
ahora estaría "aislado" debido a que está separado de al menos
algunas de las secuencias que lo flanquean de manera natural.
Un ácido nucleico también se considera
"aislado" si el mismo contiene cualquier modificación que no
está presente de forma natural en el ácido nucleico correspondiente
en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se
considera "aislada" si la misma contiene una inserción,
supresión o una mutación puntual introducida artificialmente, por
ejemplo, mediante intervención humana. Un "ácido nucleico
aislado" también incluye un ácido nucleico integrado en un
cromosoma de una célula huésped en un sitio heterólogo, una
construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un
"ácido nucleico aislado" puede estar sustancialmente libre de
otro material celular o sustancialmente libre de medio de cultivo
cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente
libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza
químicamente.
Como se usa en este documento, la expresión
"variante degenerada" de una secuencia de ácido nucleico de
referencia abarca secuencias de ácido nucleico que se pueden
traducir, de acuerdo con el código genético convencional, para
proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la que se
traduce a partir de la secuencia de ácido nucleico de
referencia.
La expresión "porcentaje de identidad de
secuencia" o "idéntico" en el contexto de secuencias de
ácido nucleico se refiere a los restos en las dos secuencias que
son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. La
longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser a lo
largo de un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos,
habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más
habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente
al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos
aproximadamente 32 nucleótidos y preferiblemente al menos
aproximadamente 36 o más nucleótidos. Existen varios algoritmos
diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la
identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias
polinucleótidicas se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit,
que son programas en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics
Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona
alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las
regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de
búsqueda (Pearson, 1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de
secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar
usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de
6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con
sus parámetros por defecto como se proporcionan en GCG Versión
6.1.
La expresión "homología sustancial" o
"similitud sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico o
fragmento del mismo, indica que, cuando están óptimamente alineados
con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro
ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad de
secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 50%, más
preferiblemente el 60% de las bases nucleotídicas, habitualmente al
menos aproximadamente el 70%, más habitualmente al menos
aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el
90% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, el 96%,
el 97%, el 98% o el 99% de las bases nucleotídicas, medido por
cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales
como FASTA, BLAST o Gap, como se ha descrito anteriormente.
Como alternativa, existe homología o similitud
sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo se
hibrida a otro ácido nucleico, a una hebra de otro ácido nucleico o
a la hebra complementaria del mismo, en condiciones de hibridación
rigurosas. "Condiciones de hibridación rigurosas" y
"condiciones de lavado rigurosas" en el contexto de
experimentos de hibridación de ácido nucleico dependen de varios
parámetros físicos diferentes. La hibridación de ácido nucleico
estará afectada por condiciones tales como la concentración de sal,
temperatura, disolventes, la composición de base de las especies de
hibridación, longitud de las regiones complementarias y el número
de falta de coincidencias de bases nucleotídicas entre los ácidos
nucleicos que se están hibridando, como apreciarán fácilmente los
expertos en la materia. Un experto en la materia sabe cómo variar
estos parámetros para conseguir una rigurosidad de hibridación
particular.
En general, la "hibridación rigurosa" se
realiza aproximadamente a 25ºC por debajo del punto de fusión
térmico (T_{m}) para el híbrido de ADN específico en un conjunto
particular de condiciones. Se realiza "lavado riguroso" a
temperaturas de aproximadamente 5ºC menores que el T_{m} para el
híbrido de ADN específico en un conjunto particular de condiciones.
El T_{m} es la temperatura a la cual el 50% de la secuencia diana
se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Véase, Sambrook y
col ., mencionado anteriormente , página 9.51,
incorporado en este documento como referencia. Para los propósitos
de este documento, se definen "condiciones de rigurosidad
elevadas" para hibridación en fase de solución como hibridación
acuosa (es decir, sin formamida) en 6X SSC (donde 20X SSC contiene
NaCl 3,0 M y citrato sódico 0,3 M), SDS al 1% a 65ºC durante
8-12 horas, seguido por dos lavados en 0,2X SSC,
SDS al 0,1% a 65ºC durante 20 minutos. El experto apreciará que la
hibridación a 65ºC ocurrirá a diferentes velocidades
dependiendo
de varios factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se están hibridando.
de varios factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se están hibridando.
El término "mutado" cuando se aplica a
secuencias de ácido nucleico se refiere a que se pueden insertar,
suprimir o cambiar nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico
en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia.
Se puede realizar una alteración única en un locus (una mutación
puntual) o se pueden insertar, suprimir o cambiar múltiples
nucleótidos en un locus único. Además, se pueden realizar una o más
alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de
ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico se puede mutar
mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica que incluye,
pero sin limitación, técnicas de mutagénesis tales como "PCR
propensa a error" (un procedimiento para realizar PCR en
condiciones en las que la fidelidad de la copia de la ADN
polimerasa es baja, de forma que se obtiene un alto índice de
mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del
producto de PCR. Véase, por ejemplo, Leung, D. W., y col.,
Technique, 1, págs. 11-15 (1989) y Caldwell, R. C.
& Joyce G. F., PCR Methods Applic, 2, págs.
28-33 (1992)); y "mutagénesis dirigida a
oligonucleótido" (un procedimiento que posibilita la generación
de mutaciones específicas de sitio en cualquier segmento de ADN
clonado de interés. Véase, por ejemplo,
Reidhaar-Olson, J. F. & Sauer, R. T., y col.,
Science, 241, págs. 53-57 (1988)).
El término "vector" como se usa en este
documento tiene por objeto referirse a una molécula de ácido
nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha
unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un
bucle de ADN de doble hélice circular en el que se pueden ligar
segmentos de ADN adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos,
cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales
de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el
que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral
(analizado con más detalle más adelante). Determinados vectores son
capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que los
mismos se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de
replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores se
pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la
introducción en la célula huésped y, de ese modo, se replican junto
con le genoma del huésped. Además, determinados vectores preferidos
son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales ellos
están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en este
documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente,
"vectores de expresión").
Secuencias de control de expresión "unidas
operativamente" se refiere a un enlace en el que la secuencia de
control de expresión está contigua al gen de interés para controlar
el gen de interés, así como secuencias de control de expresión que
actúan en trans o a distancia para controlar el gen de
interés.
La expresión "secuencia de control de
expresión" como se usa en este documento se refiere a secuencias
polinucleótidicas que son necesarias para influir sobre la
expresión de secuencias codificantes a las que las mismas están
unidas operativamente. Las secuencias de control de expresión son
secuencias que controlan la transcripción, acontecimientos
postraduccionales y la traducción de secuencias de ácido nucleico.
Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias
apropiadas de inicio de la transcripción, de terminación, promotoras
y potenciadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales
como señales de corte y empalme y de poliadenilación, secuencias
que estabilizan ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la
eficacia de traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosoma);
secuencias que potencian la estabilidad de proteína y, cuando se
desea, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La
naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del
organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control
generalmente incluyen secuencias promotoras, de sitio de unión a
ribosoma y de terminación de la transcripción. La expresión
"secuencias de control" tiene por objeto incluir, como mínimo,
todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y
también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es
provechosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero
de fusión.
La expresión "célula huésped recombinante"
(o simplemente "célula huésped"), como se usa en este
documento, tiene por objeto referirse a una célula en la que se ha
introducido un ácido nucleico tal como un vector recombinante. Se
debe apreciar que tales expresiones tienen por objeto referirse no
sólo a la célula objeto particular sino a la progenie de una célula
de este tipo. Debido a que pueden ocurrir determinadas
modificaciones en generaciones subsiguientes debido a mutación o
influencias ambientales, tal progenie puede o no, de hecho, ser
idéntica a la célula parental, pero aún están incluidas dentro del
alcance de la expresión "célula huésped" como se usa en este
documento. Una célula huésped recombinante puede ser una célula
aislada o una línea celular desarrollada en cultivo o puede ser una
célula que reside en un tejido u organismo vivo.
El término "péptido" como se usa en este
documento se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que
típicamente tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos de largo y
más típicamente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de largo.
El término como se usa en este documento abarca análogos y miméticos
que mimetizan la función estructural y, por tanto, la biológica.
El término "polipéptido" como se usa en
este documento abarca proteínas tanto de origen natural como de
origen no natural y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de
las mismas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
Además, un polipéptido puede comprender varios dominios diferentes
cada uno de los cuales tiene una o más actividades diferentes.
La expresión "proteína aislada" o
"polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que, en
virtud de su origen o su fuente de obtención (1) no está asociada
con componentes asociados de forma natural que la acompañan en su
estado nativo (2) cuando existe en una pureza no encontrada en la
naturaleza, donde la pureza se puede considerar con respecto a la
presencia de otro material celular (por ejemplo, está libre de otras
proteínas de la misma especie) (3) se expresa mediante una célula a
partir de diferentes especies o (4) no está presente en la
naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido
encontrado en la naturaleza o incluye análogos o derivados de
aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza o enlaces
diferentes a los enlaces peptídicos convencionales). Por tanto, un
polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un
sistema celular diferente a la célula de la cual se origina de
forma natural estará "aislado" de sus componentes asociados de
forma natural. Un polipéptido o proteína también se puede volver
sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural
mediante aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas
bien conocidas en el campo. Por tanto, como se ha definido,
"aislado" no necesariamente requiere que la proteína,
polipéptido, péptido u oligopéptido descrito de esta manera se haya
retirado físicamente de su entorno nativo.
La expresión "fragmento polipeptídico" como
se usa en este documento se refiere a un polipéptido que tiene una
supresión amino terminal y/o carboxi terminal en comparación con un
polipéptido de longitud completa. En una realización preferida, el
fragmento polipeptídico es una secuencia contigua en la que una
secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones
correspondientes en la secuencia de origen natural. Los fragmentos
típicamente tienen al menos 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos de largo,
preferiblemente al menos 12, 14, 16 ó 18 aminoácidos, más
preferiblemente al menos 20 aminoácidos de largo, más
preferiblemente al menos 25, 30, 35, 40 ó 45 aminoácidos, aún más
preferiblemente al menos 50 ó 60 aminoácidos de largo y lo más
preferible es que tenga al menos 70 aminoácidos de largo.
Un "derivado modificado" se refiere a
polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente
homólogos en secuencia estructural primaria pero que incluyen, por
ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o
in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en
el polipéptido nativo. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo,
acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación,
ubiquitinación, marcaje, por ejemplo, con radionúclidos y diversas
modificaciones enzimáticas, como será apreciado fácilmente por los
expertos en la materia. Una diversidad de procedimientos para marcar
polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles con tales
propósitos se conocen bien en la técnica e incluyen isótopos
radiactivos tales como ^{125}l, ^{32}P, ^{35}S y ^{3}H,
ligandos que se unen a antiligandos marcados (por ejemplo,
anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y
antiligandos que pueden servir como miembros de par de unión
específicos para un ligando marcado. La elección del marcador
depende de la sensibilidad requerida, de la facilidad de
conjugación con el cebador, de los requerimientos de estabilidad y
los instrumentos disponibles. Los procedimientos para marcar
polipéptidos se conocen bien en la técnica. Véase, Ausubel y col.,
Current Potocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates
(1992 y suplementos hasta 2002).
Un "mutante polipeptídico" o "muteína"
se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción,
duplicación, supresión, rearreglo o sustitución de uno o más
aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una
proteína nativa o de tipo silvestre. Una muteína puede tener una o
más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que un
aminoácido único en una posición se ha cambiado por otro aminoácido,
una o más inserciones y/o supresiones, en la que uno o más
aminoácidos se insertan o suprimen, respectivamente, en la
secuencia de la proteína de origen natural y/o truncamientos de la
secuencia de aminoácidos en cualquiera o ambos extremos amino o
carboxilo. Una muteína puede tener la misma pero preferiblemente
tiene una actividad biológica diferente en comparación con la
proteína de origen natural.
Una muteína tiene una homología de secuencia
global de al menos el 70% con su homólogo de tipo silvestre.
Incluso más preferidas son las muteínas que tienen una homología de
secuencia global del 80%, el 85% o el 90% con la proteína de tipo
silvestre. En una realización aún más preferida, una muteína muestra
una identidad de secuencia global del 95%, aún más preferiblemente
del 97%, aún más preferiblemente el 98% e incluso más
preferiblemente el 99%. La homología de secuencia se puede medir por
cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, tal como Gap o
Bestfit.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son
aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2)
reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de
unión para formar complejos proteicos, (4) alteran la afinidad de
unión o actividad enzimática y (5) confieren o modifican otras
propiedades físicoquímicas o funcionales de tales análogos.
Como se usa en este documento, los veinte
aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso
convencional. Véase Immunology-A Synthesis (2ª
Edición, E. S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates,
Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo,
D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos
convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos
\alpha, \alpha disustituídos, aminoácidos N-alquilo y
otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes
adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos
de aminoácidos no convencionales incluyen
4-hidroxiprolina,
\gamma-carboxi-glutamato,
\varepsilon-N,N,N-trimetillisina,
\varepsilon-N-acetillisina, O-fosfoserina,
N-acetilserina, N-formilmetionina,
3-metilhistidina, 5-hidroxilisina,
s-N-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos
(por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la nomenclatura
de polipéptidos usada en este documento, la dirección hacia la
izquierda es la dirección amino-terminal y la
dirección hacia la derecha es la dirección
carboxi-terminal, de acuerdo con el uso y la
convención convencional.
Una proteína tiene "homología" o es
"homóloga" a una segunda proteína si la secuencia de ácido
nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la
secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Como
alternativa, una proteína tiene homología con una segunda proteína
si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos
"similares". (Por tanto, la expresión "proteínas
homólogas" se define como que se refiere a que las dos proteínas
tienen secuencias de aminoácidos similares). En una realización
preferida, una proteína homóloga es una que muestra una homología
de secuencia del 60% con la proteína de tipo silvestre y más
preferiblemente es una homología de secuencia del 70%. Incluso más
preferidas son las proteínas homólogas que muestran una homología
de secuencia del 80%, el 85% o el 90% con la proteína de tipo
silvestre. En una realización aún más preferida, una proteína
homóloga muestra una identidad de secuencia del 95%, el 97%, el 98%
o el 99%. Como se usa en este documento, la homología entre dos
regiones de secuencia de aminoácidos (especialmente con respecto a
similitudes estructurales pronosticadas) se interpreta como que
implica similitud de función.
Cuando se usa "homólogo" con referencia a
proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los restos
que no son idénticos con frecuencia difieren en sustituciones de
aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido
conservativa" es una en la que un resto aminoacídico se sustituye
por otros restos aminoacídicos que tiene una cadena lateral (grupo
R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o
hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos
conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales
de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de
aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el
porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología se
puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa
de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien
conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo,
Pearson y col., 1994).
Cada uno de los siguientes seis grupos contiene
aminoácidos que son sustituciones conservativas los uno de los
otros: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido
Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R),
Lisina (K); 5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina (M), Alanina
(A), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano
(W).
La homología de secuencia para polipéptidos, a
la que también se hace referencia como porcentaje de identidad de
secuencia, se mide típicamente usando software de análisis de
secuencia. Véase, por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis
de Secuencia de Genetics Computer Group (GCG), University of
Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison,
Wisconsin 53705. El software de análisis de secuencia empareja
secuencias similares usando la medida de homología asignada a
diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones,
incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo,
GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que
se pueden usar con parámetros por defecto para determinar la
homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos
íntimamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de
diferentes especies u organismos o entre una proteína de tipo
silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión
6.1.
Un algoritmo preferido cuando se compara una
secuencia de molécula inhibidora con una base de datos que contiene
un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa
informático BLAST (Altschul, S. F. y col. (1990) J. Mol. Biol.
215: 403-410; Gish y States (1993) Nature Genet. 3:
266-272; Madden, T. L. y col. (1996) Meth. Enzymol.
266: 131-141; Altschul, S. F. y col. (1997) Nucleic
Acids Res.25: 3389-3402; Zhang, J: y Madden, T. L.
(1997) Genome Res. 7: 649-656), especialmente blastp
o tblastn (Altschul y col ., 1997). Los parámetros preferidos
de BLASTp son: valor de Expectación: 10 (por defecto); Filtro: s
(por defecto); Coste de apertura de un hueco: 11 (por defecto);
Coste para extender un hueco: 1 (por defecto); Alineamientos
máximos: 100 (por defecto); Tamaño de palabra: 11 (por defecto); Nº
de descripciones: 100 (por defecto); Matriz de Penalización:
BLOWSUM62.
La longitud de las secuencias polipeptídicas
comparadas para determinar homología generalmente será de al menos
aproximadamente 16 restos aminoacídicos, habitualmente al menos
aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos
aproximadamente 24 restos, típicamente al menos aproximadamente 28
restos y preferiblemente más de aproximadamente 35 restos. Cuando
se realiza una búsqueda en una base de datos que contiene secuencias
de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar
las secuencias de aminoácidos. La búsqueda de bases de datos que
usan secuencias de aminoácidos se puede medir mediante algoritmos
diferentes a blastp conocidos en la técnica. Por ejemplo, las
secuencias polipeptídicas se pueden comparar usando FASTA, un
programa en GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y
porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor
solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson,
1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre
secuencias de aminoácidos se puede determinar usando FASTA con sus
parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de
puntuación PAM250), como se proporciona en GCG Versión 6.1.
El término "motivo" con referencia a las
regiones conservadas indica el resto aminoacídico que se encuentra
habitualmente en proteínas y que se conoce convencionalmente como
alanina (Ala o A), valina (Val o V), leucina (Leu o L), isoleucina
(lle o I); prolina (Pro o P), fenilalanina (Phe o F), triptófano
(Trp o W), metionina (Met o M), glicina (Gly o G), serina (Ser o
S), treonina (Thr o T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y),
asparagina (Asn o N), glutamina (Gln o Q), ácido aspártico (Asp o
D), ácido glutámico (Glu o E), lisina (Lys o K), arginina (Arg o R)
e histidina (His o H).
La expresión "proteína de fusión" se
refiere a una polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento
acoplado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de
fusión son útiles debido a que las mismas se pueden construir para
que contengan dos o más elementos funcionales deseados a partir de
dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al
menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más
preferiblemente al menos 20 ó 30 aminoácidos, aún más
preferiblemente al menos 40, 50 ó 60 aminoácidos y todavía más
preferiblemente al menos 75, 100 ó 125 aminoácidos. Las proteínas
de fusión se pueden producir de forma recombinante construyendo una
secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o un
fragmento del mismo en fase con una secuencia de ácido nucleico que
codifica una proteína o péptido diferente y después expresando la
proteína de fusión. Como alternativa, una proteína de fusión se
puede producir químicamente entrecruzando el polipéptido o un
fragmento del mismo con otra proteína.
El término "región" como se usa en este
documento se refiere a una parte físicamente contigua de la
estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una
región está definida por una parte contigua de la secuencia de
aminoácidos de esa proteína.
El término "dominio" como se usa en este
documento se refiere a una estructura de una biomolécula que
contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula.
Los dominios pueden ser coextensivos con regiones o porciones de
los mismos; los dominios también pueden incluir regiones diferentes
no contiguas de una biomolécula. Los ejemplos de dominio de
proteína incluyen, pero sin limitación, un dominio de Ig, un dominio
extracelular, un dominio transmembrana y un dominio
citoplasmático.
Como se usa en este documento, el término
"molécula" se refiere a cualquier compuesto, incluyendo, pero
sin limitación, una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar,
nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc y un compuesto de este tipo
puede ser natural o sintético.
A menos que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tiene el
mismo significado que el apreciado de forma común por un experto en
la materia a quien se refiere esta invención. Los procedimientos y
materiales ilustrativos se describen más adelante, aunque los
procedimientos y materiales similares o equivalentes a los
descritos en este documento también se pueden usar en la práctica de
la presente invención y serán evidentes para los expertos en la
materia.
En caso de conflicto, la presente memoria
descriptiva, incluyendo definiciones, controlará. Los materiales,
procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no tienen por
objeto ser limitantes.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las
reivindicaciones, la palabra "comprender" o variaciones tales
como "comprende" o "que comprende", se apreciará que
implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros
indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o
grupo de números enteros.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona procedimientos para
producir una glicoproteína que tiene glicosilación de tipo humano
en una célula huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular
o multicelular. Como se describe con más detalle más adelante, una
célula huésped eucariota que no expresa de manera natural o que está
modificada genéticamente para que no exprese, una o más enzimas
implicadas en la producción de estructuras con alto contenido en
manosa se selecciona como una célula huésped de partida. Una célula
huésped seleccionada de este tipo se modifica genéticamente para
expresar una o más enzimas u otros factores necesarios para producir
glicoproteínas similares a humano. Una cepa huésped deseada se
puede modificar por ingeniería genética una enzima o más de una
enzima a la vez. Además, una molécula de ácido nucleico que codifica
una o más enzimas o actividades se puede usar para modificar por
ingeniería genética una cepa huésped de la invención.
Preferiblemente, se crea una biblioteca de moléculas de ácido
nucleico que codifican enzimas potencialmente útiles (por ejemplo,
enzimas quiméricas que comprenden un fragmento enzimático
catalíticamente activo ligado en fase a una secuencia de dirección
subcelular heteróloga) (por ejemplo, mediante ligamientos de
sub-bibliotecas que comprenden fragmentos
enzimáticos y secuencias de dirección subcelulares) y una cepa que
tiene una o más enzimas con actividades opcionales o que producen
las glicoproteínas más "similares a humano" se pueden
seleccionar transformando células huésped diana con uno o más
elementos de la biblioteca.
En particular, los procedimientos descritos en
este documento posibilitan la obtención, in vivo, de
estructuras Man_{5}GlcNAc_{2} en alto rendimiento, al menos
transitoriamente, con el propósito de modificarla adicionalmente
para producir N-glicanos complejos. Un esquema satisfactorio
para obtener estructuras Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas en
rendimientos apropiados en una célula huésped, tal como una levadura
u hongo filamentoso unicelular o multicelular, generalmente implica
dos enfoques paralelos: (1) reducir la estructuras con alto
contenido en manosa preparadas mediante actividades
manosiltransferasa endógena, si existe alguna y (2) retirar
1,2-\alpha-manosa mediante
manosidasas para producir niveles elevados de estructuras
Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas que se pueden someter a reacción
adicional dentro de la célula huésped para formar glicoformas
complejas similares a humano.
Por consiguiente, una primera etapa implica la
selección o creación de una célula huésped eucariota, por ejemplo,
una levadura u hongo filamentoso unicelular o multicelular, capaz de
producir una estructura precursora específica de
Man_{5}GlcNAc_{2} que es capaz de aceptar GlcNAc in vivo
mediante la acción de una GlcNAc transferasa 1 ("GnTI"). En
una realización, el procedimiento implica preparar o usar una célula
huésped de levadura o de hongo filamentoso unicelular o
multicelular agotada en una actividad 1,6 manosil transferasa con
respecto al N-glicano o una glicoproteína. Preferiblemente,
la célula huésped está agotada en una actividad 1,6
manosiltransferasa iniciadora (véase más adelante). Una célula
huésped de este tipo carecerá de una o más enzimas implicadas en la
producción de estructuras con alto contenido en manosa que son
indeseables para producir glicoproteínas similares a humano.
Después, se introducen una o más actividades
enzimáticas en una célula huésped de este tipo para producir
N-glicanos dentro de la célula huésped caracterizados por que
tienen al menos el 30% en mol de las estructuras de carbohidrato
Man_{5}GlcNAc_{2} ("Man_{5}"). Las estructuras de
Man_{5}GlcNAc_{2} son necesarias para la formación de
N-glicano complejo: Man_{5}GlcNAc_{2} se tiene que formar
in vivo en un alto rendimiento (por ejemplo, en más del
30%), al menos transitoriamente, ya que las reacciones de
glicosilación similares a mamífero y a humano posteriores requieren
Man_{5}GlcNAc_{2} o un derivado del mismo.
Esta etapa también requiere la formación de una
estructura isomérica particular de Man_{5}GlcNAc_{2} dentro de
la célula en un rendimiento alto. Mientras que las estructuras de
Man_{5}GlcNAc_{2} son necesarias para la formación de
N-glicano complejo, su presencia no es suficiente de ninguna
manera. Esto es debido a que Man_{5}GlcNAc_{2} puede estar
presente en diferentes formas isoméricas, que pueden o no servir
como un sustrato para GlcNAc transferasa I. Como la mayoría de las
reacciones de glicosilación no son completas, una proteína
glicosilada particular generalmente contiene una diversidad de
estructuras de carbohidrato diferentes (es decir, glicoformas)
sobre su superficie. Por tanto, la simple presencia de cantidades
traza (es decir, menos del 5%) de una estructura particular similar
a Man_{5}GlcNAc_{2} es de poca relevancia práctica para
producir glicoproteínas similares a mamífero o a humano. Es la
formación de un intermedio Man_{5}GlcNAc_{2} aceptor de GlcNAc
transferasa l (Figura 1B) en alto rendimiento (es decir, por encima
del 30%) lo que se requiere. La formación de este intermedio es
necesaria para posibilitar la síntesis in vivo posterior de
N-glicanos complejos o proteínas glicosiladas de interés
(proteínas diana).
Por consiguiente, alguno o todo el
Man_{5}GlcNAc_{2} producido por la célula huésped seleccionada
tiene que ser un sustrato productivo para actividades enzimáticas a
lo largo de una ruta de glicosilación de mamífero, por ejemplo,
puede servir como sustrato para actividad de GlcNAc transferasa I
in vivo, formando de ese modo el intermedio N-glicano
de tipo humano GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en la célula huésped. En
una realización preferida, al menos el 10%, más preferiblemente el
30% y más preferiblemente el 50% o más del intermedio
Man_{5}GlcNAc_{2} producido en la célula huésped de la
invención es un sustrato productivo para GnTI in vivo. Se
aprecia que si, por ejemplo, se produce GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}
al 10% y se produce Man_{5}GlcNAc_{2} al 25% en una proteína
diana, la cantidad total de Man_{5}GlcNAc_{2} producido de forma
transitoria es el 35% debido a que GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} es un
producto de Man_{5}GlcNAc_{2}.
Un experto en la materia puede seleccionar
células huésped de la naturaleza, por ejemplo, hongos u otros
eucariotas inferiores existentes que producen niveles
significativos de Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo. Sin embargo,
hasta el momento ningún eucariota inferior ha demostrado
proporcionar tales estructuras in vivo en más del 1,8% de
los N-glicanos totales (véase, por ejemplo, Maras y col.,
1997, Eur. J. Biochem. 249, 701-707). Como
alternativa, tales células huésped se pueden modificar por
ingeniería genética para producir la estructura
Man_{5}GlcNAc_{2} in vivo. Los procedimientos tales como
los que se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900
se pueden usar para identificar la ausencia o presencia de
glicosiltransferasas, manosidasas y transportadores de nucleótidos
de azúcar particulares en una célula huésped diana u organismo de
interés.
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Los procedimientos de la invención se refieren a
preparar células huésped que producen glicoproteínas que tienen
estructuras de N-glicano alteradas y preferiblemente
similares a humano. En una realización preferida, los
procedimientos se refieren a preparar células huésped en las que los
precursores de oligosacáridos tienen alto contenido de
Man_{5}GlcNAc_{2}. Preferiblemente, se usa una célula huésped
eucariota que no expresa una o más enzimas implicadas en la
producción de estructuras con alto contenido en manosa. Una célula
huésped de este tipo se puede encontrar en la naturaleza o se puede
fabricar por ingeniería genética, por ejemplo, comenzando con u
obteniéndose a partir de uno de muchos mutantes tales como los que
ya se han descrito en levaduras. Por tanto, dependiendo de la
célula huésped seleccionada, se tendrán que suprimir uno o varios
genes que codifican enzimas que se conoce que son características de
reacciones de glicosilación no humanas. Tales genes y sus proteínas
correspondientes se han caracterizado exhaustivamente en varios
eucariotas inferiores (por ejemplo, S. cerevisiae, T. reesei, A.
nidulans etc.), proporcionando de ese modo una lista de
glicosiltransferasas conocidas en eucariotas inferiores, sus
actividades y sus secuencias genéticas respectivas. Estos genes
probablemente se seleccionan entre el grupo de manosiltransferasas,
por ejemplo, 1,3 manosiltransferasas (por ejemplo, MNN1 en
S. cerevisiae) (Graham, 1991), 1,2 manosiltransferasas (por
ejemplo, familia KTR/KRE de S. cerevisiae),
1,6-manosiltransferasas (OCH1 de S.
cerevisiae), manosilfosfato transferasas y sus reguladores
(MNN4 y MNN6 de S. cerevisiae) y enzimas
adicionales que están implicadas en reacciones de glicosilación
aberrantes, es decir, no humanas. Muchos de estos genes se han
suprimido, de hecho, individualmente dando origen a fenotipos
viables con perfiles de glicosilación alterados. Los ejemplos se
muestran en la Tabla 1
(anteriormente).
(anteriormente).
Las células huésped eucariotas inferiores
preferidas de la invención, como se describe en este documento para
ilustrar las etapas de manipulación necesarias, son mutantes sin
hipermanosilación (och1) de Pichia pastoris o K.
lactis. Al igual que otros eucariotas inferiores, P.
pastoris procesa las estructuras de Man_{9}GlcNAc_{2} en el
RE con una \alpha-1,2-manosidasa
para producir Man_{8}GlcNAc_{2} (Figura 1A). A través de la
acción de varias manosiltransferasas, esta estructura después se
convierte en estructuras hipermanosiladas
(Man_{>9}GlcNAc_{2}), también conocidas como mananos. Además,
se ha observado que P. pastoris es capaz de añadir grupos
fosfato no terminales, a través de la acción de manosilfosfato
transferasas, a la estructura de carbohidrato. Esto difiere de las
reacciones realizadas en células de mamífero, que implican la
remoción en lugar de la adición de azúcares de manosa. Esto es de
particular importancia para eliminar la capacidad de la célula
huésped eucariota, por ejemplo, hongos, de hipermanosilar una
estructura de Man_{8}GlcNAc_{2} existente. Esto se puede
conseguir seleccionando una célula huésped que no hipermanosile o
modificando por ingeniería genética una célula de este tipo.
Los genes que están implicados en el
procedimientos de hipermanosilación se han identificado, por
ejemplo, en Pichia pastoris y creando mutaciones en estos
genes, se puede reducir la producción de glicoformas
"indeseables". Tales genes se pueden identificar mediante
homología con manosiltransferasas existentes o sus reguladores (por
ejemplo, OCH1, MNN4, MNN6, MNN1) encontrados en otros
eucariotas inferiores tales como C. albicans, Pichia angusta
o S. cerevisiae o mutagenizando la cepa huésped y
seleccionando un fenotipo de glicosilación con manosilación
reducida. Basándose en homologías entre manosiltransferasas y
manosilfosfato transferasas conocidas, se pueden diseñar cebadores
de PCR (ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 2, SEC ID
Nº: 60-91 son ejemplos adicionales de cebadores) o
usar genes o fragmentos génicos que codifican tales enzimas como
sondas para identificar homólogos en bibliotecas de ADN del
organismo diana o un organismo relacionado. Como alternativa, se
puede identificar un homólogo funcional que tiene actividad
manosiltransferasa por su capacidad para complementar fenotipos de
glicosilación particulares en organismos relacionados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Para obtener el gen o genes que codifican
actividad 1,6-manosiltransferasa en P.
pastoris, por ejemplo, se pueden realizar las siguientes
etapas: mutantes OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a
temperatura y son de crecimiento lento a temperaturas elevadas. Por
tanto, se pueden identificar homólogos funcionales de OCH1
en P. pastoris complementando un mutante OCH1 de S.
cerevisiae con un ADN o biblioteca de ADNc de P.
pastoris. Los mutantes de S. cerevisiae están
disponibles, por ejemplo, en la Universidad de Stanford y están
disponibles en el mercado en ResGen, Invitrogen Corp. (Carlsbad,
CA). Los mutantes que muestran un fenotipo de crecimiento normal a
temperatura elevada, después de haberse trasformado con una
biblioteca de ADN de P. pastoris, tienen probabilidad de
portar un homólogo de OCH1 de P. pastoris. Una
biblioteca de este tipo se puede crear digiriendo parcialmente ADN
cromosómico de P. pastoris con una enzima de restricción
adecuada y, después de inactivar la enzima de restricción, ligando
el ADN digerido en un vector adecuado, que se ha digerido con una
enzima de restricción compatible.
Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo,
pRS314, un plásmido de copia baja (CEN6/ARS4) basado en pBluescript
que contiene el marcador Trp1 (Sikorski, R. S., y Hieter, P., 1989,
Genetics 122, pág. 19-27) y pFL44S, un plásmido de
copias elevadas (2 \mu) basado en un pUC19 modificado que contiene
el marcador URA3 (Bonneaud, N., y col., 1991, Yeast 7, págs.
609-615). Tales vectores se usan comúnmente por los
investigadores académicos y vectores similares están disponibles en
varios distribuidores diferentes (por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad,
CA); Pharmacia (Piscataway, NJ); New England Biolabs (Beverly,
MA)). Los ejemplos adicionales incluyen pYES/GS, plásmido de
expresión en levadura basado en origen de replicación de 2 \mu o
vehículo de clonación Yep24 de New England Biolabs.
Después del ligamiento del ADN cromosómico y el
vector, se puede transformar la cepa de S. cerevisiae con
una biblioteca de ADN con una mutación específica y seleccionar la
corrección del fenotipo correspondiente. Después de subclonar y
secuenciar el fragmento de ADN que es capaz de restaurar el fenotipo
de tipo silvestre, se puede usar este fragmento para eliminar la
actividad del producto génico codificado por OCH1 en P.
pastoris usando mutagénesis in vivo y/o técnicas se
recombinación bien conocidas por expertos en la materia.
Como alternativa, si la secuencia genómica
entera de una célula huésped particular, por ejemplo, hongo, de
interés se conoce, se pueden identificar tales genes simplemente
realizando búsquedas en bases de datos de ADN disponibles al
público, que están disponibles en varias fuentes, tales como NCBI y
Swissprot. Por ejemplo, realizando una búsqueda de una secuencia
genómica o base de datos dadas con secuencias a partir de un gen de
1,6-manosiltranferasa conocido (por ejemplo,
OCH1 de S. cerevisiae), se pueden identificar genes
de homología elevada en un genoma de célula huésped de este tipo que
puede (aunque no necesariamente) codificar proteínas que tienen
actividad 1,6-manosiltransferasa. Sin embargo, la
homología de secuencia de ácido nucleico sola no es suficiente para
probar que se ha identificado y aislado un homólogo que codifica una
enzima que tiene la misma actividad. Hasta la fecha, por ejemplo,
no existen datos que muestren que una supresión de OCH1 en
P. pastoris elimina la actividad
1,6-manosiltransferasa iniciadora crucial. (Martinet
y col. Biotech. Letters 20(12) (Dic. 1998):
1171-1177; Contreras y col. WO 02/00856 A2). Por
tanto, ningún dato prueba que el homólogo de gen de OCH1 de
P. pastoris codifica realmente esa función. Esa demostración
se proporciona por primera vez en este documento.
Los homólogos de varias manosiltransferasas de
S. cerevisiae se han identificado en P. pastoris
usando estos enfoques. Los genes homólogos con frecuencia tienen
funciones similares a los genes implicados en la manosilación de
proteínas en S. cerevisiae y, por tanto, su supresión se
puede usar para manipular el patrón de glicosilación en P.
pastoris o, por analogía, en cualquier otra célula huésped, por
ejemplo, células de hongos, plantas, insectos o animales, con rutas
de glicosilación similares.
La creación de knock-outs
génicos, una vez que se ha determinado una secuencia génica diana
determinada, es una técnica bien establecida en el campo y la puede
realizar un experto en la materia (véase, por ejemplo, R Rothstein,
(1991) Methods in Enzymology, vol. 194, pág. 281). La elección de un
organismo huésped puede estar influida por la disponibilidad de
buenas técnicas de transformación y alteración génica.
Si se tienen que eliminar varias
manosiltransferasas, el procedimiento desarrollado por Alani y
Kleckner, (Genetics 116: 541-545 (1987)), por
ejemplo, posibilita el uso repetido de un marcador seleccionable,
por ejemplo, el marcador URA3 en levaduras, para eliminar de
forma secuencial toda la actividad manosiltransferasa endógena
indeseable. Esta técnica se ha perfeccionado por otros, pero
básicamente implica el uso de dos secuencias de ADN repetidas, que
flanquean un marcador contra seleccionable. Por ejemplo: se puede
usar URA3 como un marcador para asegurar la selección de un
transformante que ha integrado una construcción. Flanqueando el
marcador URA3 con repeticiones directas se puede seleccionar
en primer lugar transformantes que han integrado la construcción y,
por tanto, han alterado el gen diana. Después del aislamiento de los
transformantes y su caracterización, se puede contra seleccionar en
un segundo ciclo aquellos que sean resistentes a ácido
5-fluoroorótico (5-FOA). Las
colonias que son capaces de sobrevivir en placas que contienen
5-FOA han perdido el marcador URA3 de nuevo
a través de un acontecimiento de cruzamiento que implica las
repeticiones mencionadas anteriormente. Por tanto, este enfoque
permite el uso repetido del mismo marcador y facilita la alteración
de múltiples genes sin necesidad de marcadores adicionales. También
se pueden usar técnicas similares para eliminación secuencial de
genes adaptadas para uso en otras células huésped eucariotas con
otros marcadores seleccionables y contra seleccionables.
La eliminación de manositransferasas
específicas, tales como 1,6-manosiltransferasa
(OCH1) o manosilfosfato transferasas (MNN6, o genes
que complementan mutantes Ibd) o reguladores (MNN4) en
P. pastoris posibilita la creación de cepas modificadas por
ingeniería genética de este organismo que sintetizan principalmente
Man_{8}GlcNAc_{2} y que se pueden usar para modificar
adicionalmente el patrón de glicosilación para que se parezca más a
estructuras de glicoformas complejas, por ejemplo, las que se
producen en mamíferos, por ejemplo, células humanas. Una
realización preferida de este procedimiento utiliza secuencias de
ADN que codifican actividades de glicosilación bioquímica para
eliminar funciones bioquímicas similares o idénticas en P.
pastoris para modificar la estructura de glicosilación de
glicoproteínas producidas en la cepa de P. pastoris alterada
genéticamente.
Los procedimientos usados para modificar por
ingeniería genética la ruta de glicosilación en levaduras como se
ha ilustrado en este documento, se pueden usar en hongos
filamentosos para producir un sustrato preferido para modificación
posterior. Las estrategias para modificar la ruta de glicosilación
en A. niger y otros hongos filamentosos, por ejemplo, se
pueden desarrollar usando protocolos análogos a los que se han
descrito en este documento para modificar genéticamente cepas para
producir glicoproteínas similares a humano en levaduras. Las
actividades génicas indeseadas implicadas en la actividad 1,2
manosiltransferasa, por ejemplo, homólogos KTR/KRE, se
modifican o eliminan. Un hongo filamentoso, tal como
Aspergillus, es un huésped preferido debido a que carece de
la actividad 1,6 manosiltransferasa y, como tal, no se esperaría una
actividad génica de hipermanosilación, por ejemplo, OCH1, en
este huésped. Por el contrario, otras actividades deseadas (por
ejemplo, \alpha-1,2-manosidasa,
transportador UDP-GlcNAc, glicosiltransferasa (GnT),
galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST)) implicadas
en glicosilación se introducen en el huésped usando los
procedimientos de dirección de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el procedimiento
de la invención implica preparar o usar una célula huésped cuya
actividad
\alpha-1,6-manosiltransferasa
iniciadora está disminuida o agotada, es decir, una enzima
específica de iniciación que inicia la cadena exterior de
manosilación en el brazo \alpha-1,3 de la
estructura de núcleo Man_{3}GlcNAc_{2}. En S.
cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen OCH1.
La alteración del gen OCH1 en S. cerevisiae da como
resultado un fenotipo en el que los azúcares enlazados a N
carecen completamente de la cadena exterior de polimanosa. Los
enfoques anteriores para obtener glicosilación de tipo mamífero en
cepas de hongos han requerido la inactivación de OCH1 (véase,
por ejemplo, Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273:
26298-304). Sin embargo, la alteración de la
actividad iniciadora de
\alpha-1,6-manosiltransferasa en
una célula huésped de la invención puede ser opcional (dependiendo
de la célula huésped seleccionada) ya que la enzima Ochlp requiere
un Man_{8}GlcNAc_{2} intacto para la iniciación de cadena
exterior de manosa eficaz. Por tanto, las células huésped
seleccionadas o producidas de acuerdo con esta invención que
acumulan oligosacáridos que tienen siete o menos restos de manosa
pueden producir N-glicanos hipoglicosilados que
proba-
blemente serán sustratos malos de Och1p (véase, por ejemplo, Nakayama y col. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).
blemente serán sustratos malos de Och1p (véase, por ejemplo, Nakayama y col. (1997) FEBS Lett. 412(3): 547-50).
El gen OCH1 se clonó a partir de P.
pastoris (Ejemplo 1) y K. lactis (Ejemplo 9), como se ha
descrito. La secuencia de ácido nucleico y aminoácidos del gen
OCH1 de K. lactis se exponen en SEC ID Nº: 3 y 4.
Usando cebadores específicos de genes, se preparó una construcción a
partir de cada clon para suprimir el gen OCH1 del genoma de
P. pastoris y K. lactis (Ejemplos 1 y 9,
respectivamente). Células huésped agotadas en actividad
\alpha-1,6-manosiltransferasa
iniciadora y modificadas genéticamente para producir
N-glicanos que tienen estructura de carbohidrato
Man_{5}GlcNAc_{2} se obtuvieron de ese modo (véanse, por
ejemplo, los Ejemplos 4 y 9).
La solicitud describe una molécula de ácido
nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que
comprende o está constituida por al menos cuarenta y cinco,
preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 60 y más
preferiblemente 75 o más restos de nucleótidos del gen OCH1
de K. lactis (SEC ID Nº: 3) y homólogos, variantes y
derivados del mismo. La solicitud también describe moléculas de
ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las
moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma
similar, se describen polipéptidos aislados (incluyendo muteínas,
variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) codificados
por las moléculas de ácido nucleico de la invención. También se
describen vectores, incluyendo vectores de expresión, que
comprenden las moléculas de ácido nucleico anteriores de la
invención, como se ha descrito adicionalmente en este documento. De
forma similar, se describen células huésped transformadas con las
moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención.
La invención proporciona además procedimientos
para preparar o usar una célula huésped eucariota no humana
disminuida o agotada en una actividad de gen alg (es decir,
actividades alg, incluyendo actividades enzimáticas
equivalentes en células huésped no fúngicas) e introduciendo en la
célula huésped al menos una actividad glicosidasa. En una
realización preferida, la actividad glicosidasa se introduce
provocando la expresión de una o más actividades manosidasa dentro
de la célula huésped, por ejemplo, mediante activación de actividad
manosidasa o mediante expresión a partir de una molécula de ácido
nucleico de una actividad manosidasa, en la célula huésped.
En otra realización, la invención proporciona un
procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en un
huésped no humano, en el que la glicoproteína comprende un
N-glicano que tiene al menos dos GlcNAc unidos a una
estructura de núcleo trimanosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona adicionalmente
un procedimiento para preparar glicoproteínas más similares a
humano en células huésped eucariotas inferiores expresando un gen
que codifica una manosidasa de Clase 2 catalíticamente activa (EC.
3.2.1.114) (homólogos, variantes, derivados y fragmento
catalíticamente activo de la misma).
Mediante el uso de técnicas conocidas en el
campo, se diseñan cebadores específicos de genes para complementar
las regiones homólogas de los genes de manosidasa de Clase 2 (por
ejemplo, \alpha-manosidasa II de D.
melanogaster) para amplificar por PCR el gen de manosidasa.
A través de la expresión de una manosidasa de
Clase 2 activa en una célula a partir de un ácido nucleico que
codifica la manosidasa de Clase 2, una célula huésped (por ejemplo
P. pastoris) se modifica genéticamente para producir
glicoproteínas más similares a humanos (véanse, por ejemplo,
Ejemplos 17-25).
En un aspecto de la solicitud, se describe un
procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en un
eucariota inferior (por ejemplo, P. pastoris) construyendo
una biblioteca de enzimas \alpha-manosidasa II.
En una realización preferida, una sub-biblioteca de
secuencias de \alpha-manosidasa II de D.
melanogaster (por ejemplo, Genbank Nº de Acceso X77652) se
fusiona a una sub-biblioteca de secuencias de
péptidos de dirección MNN2 de S. cerevisiae. En una
realización más preferida de la invención, un huésped de P.
pastoris que produce GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} se transforma
con una construcción de fusión que comprende Manosidasa II
\Delta74 de D. melanogaster/MNN2(s). Véase
Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de abril de 2003;
100(9): 5022-7 y el documento WO 02/00879,
que describen procedimientos para preparar glicoproteínas similares
a humano en eucariotas inferiores que tienen la estructura de
N-glicano anterior, que ahora se denomina P. pastoris
YSH-1.
La descripción describe además una secuencia de
\alpha-manosidasa II de Golgi que se selecciona
entre, rata, ratón, ser humano, orugas, plantas e insectos. Tales
secuencias están disponibles en bases de datos tales como Swissprot
y Genbank. Por ejemplo, secuencias para los siguientes genes se
encontraron en Genbank: Manosidasa II de Arabidopsis
thaliana (NM_121499); Manosidasa II de C. elegans
(NM_073594); manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116684);
manosidasa II de Drosophila melanogaster (X77652); manosidasa
II humana (U31520); manosidasa II de ratón (X61172); manosidasa II
de rata (XM_ 218816); manosidasa IIx humana (D55649); manosidasa
III de células de insecto (AF005034); manosidasa II lisosomal humana
(NM_000528); y manosidasa II citosólica humana (NM_006715) (Figuras
25-35, SEC ID Nº: 49-59,
respectivamente). Debido a la similitud de secuencia elevada y la
presencia de la actividad Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6, la
manosidasa II citoplasmática y la manosidasa II lisosomal se
denominarán colectivamente en este documento manosidasas de Clase
2.
Otras manosidasas que muestran la actividad de
\alpha-manosidasa II de Golgi incluyen, entre
otras, manosidasa III de insecto (AF005034) y manosidasa IIx humana
(D55649). Se describe que estas manosidasas, propiamente dichas, se
usan para generar una biblioteca de ADN combinatoria de enzimas
catalíticamente activas.
En otro aspecto de la invención, se fusiona una
sub-biblioteca de secuencias de péptidos de
dirección (líderes) seleccionadas entre el grupo constituido por
GLS1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de
Saccharomyces, SEC de Pichia, OCH1 de Pichia,
MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP 1
de Saccharomyces, HOC1 de Saccharomyces, MNN10 de
Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de
Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3
de Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de
Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de
Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de
Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de
Saccharomyces a secuencias que codifican dominios de
manosidasa II catalíticamente activos. La combinación de la
biblioteca de líder/dominio catalítico se ilustra en la Tabla 11
(Ejemplo 14).
Las construcciones de fusión de
\alpha-manosidasa II de Golgi generadas de acuerdo
con la presente invención presentan la actividad de corte de
\alpha-1,3 y \alpha-1,6
manosidasa. Por ejemplo, la construcción de fusión de manosidasa II
catalíticamente activa escinde los enlaces glicosídicos
Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6 presentes en
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} en P.
pastoris YSH-1. En otro ejemplo, una
construcción de fusión de manosidasa IIx catalíticamente activa
escinde los enlaces glicosídicos de Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6
presentes en Man_{6}GlcNAc_{2} en Man_{4}GlcNAc_{2}.
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La presente invención también abarca el
mecanismo en el que el dominio catalíticamente activo de las enzimas
de Clase 2 hidrolizan los enlaces glicosídicos Man\alpha1,3 y/o
Man\alpha1,6 en un oligosacárido, por ejemplo, estructura de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} para producir
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}, un intermedio deseado para
procesamiento de N-glicano adicional en un eucariota
inferior. En una primera realización, la hidrólisis de los enlaces
glicosídicos ocurre de forma secuencial. La enzima hidroliza al
menos un enlace glicosídico y gira conformacionalmente para
hidrolizar el otro enlace glicosídico. En una segunda realización,
la hidrólisis de los enlaces glicosídicos ocurre de forma
simultánea. El intermedio producido es un sustrato para
procesamiento de Golgi adicional en el que otras enzimas de
glicosilación tales como N-acetilglucosaminiltransferasas
(GnT), galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) se
pueden modificar posteriormente para producir una glicoforma
deseada. La Figura 36A ilustra los intermedios de oligosacáridos
(por ejemplo GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} y
GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2}) producidos a través de la ruta de
manosidasa II y la Figura 36B ilustra los intermedios de
oligosacárido (por ejemplo, Man_{4}GlcNAc_{2} y
Man_{5}GlcNAc_{2}) producidos a través de la ruta de manosidasa
IIx.
\vskip1.000000\baselineskip
Es una característica de la presente invención
expresar secuencias que codifican regiones conservadas de la enzima
manosidasa II. La presente invención proporciona moléculas de ácido
nucleico aisladas que comprenden las regiones conservadas del gen de
manosidasa II de diversas fuentes incluyendo insectos, mamíferos,
plantas y orugas.
Varias secuencias de ácido nucleico de longitud
completa que codifican la enzima manosidasa II se han identificado y
secuenciado. Las secuencias de enzima manosidasa II se exponen en
SEC ID Nº: 49 a SEC ID Nº: 59. Un alineamiento de secuencias de
manosidasa II conocida (es decir, Drosophila melanogaster
alineada con otras secuencias de insecto, animal y plantas) muestra
un motivo altamente conservado entre los aminoácidos
144-166 y aminoácidos 222-285
(Figura 23). Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se
refiere a un procedimiento para proporcionar a una célula huésped un
ácido nucleico que codifica una actividad enzimática de manosidasa
de Clase 2 donde el ácido nucleico se caracteriza por tener las
regiones de manosidasa II conservadas anteriores.
Además, el alineamiento de secuencia adicional
revela varios puentes disulfuro cistina-cistina
altamente conservados entre los aminoácidos 338-345
y los aminoácidos 346-360 como se muestra en la
Figura 23. Estos puentes disulfuro pueden jugar una parte integral
en la unión y reconocimiento de sustrato, por ejemplo, manteniendo
la arquitectura de la proteína.
La presente invención también proporciona
fragmentos catalíticamente activos de manosidasas de Clase 2 que
comprenden regiones de secuencia de aminoácidos conservadas,
especialmente una primera secuencia de aminoácidos constituida por
23 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 145 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K E Q N e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 146 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V y L
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 147 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F I H y L
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 148 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V I L y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 149 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V I L y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 150 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 151 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 152 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S T y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 153 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 154 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N C D y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 156 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 157 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 158 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 159 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I L K y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 160 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q M K y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 161 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T y Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 162 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 163 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E D y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 164 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E K D R Q y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 165 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 166 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F y C.
La presente invención proporciona además un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácidos conservadas,
especialmente una segunda secuencia de aminoácidos constituida por
57 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 222 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 223 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F I y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 224 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V A T y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 225 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T G N y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 226 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 227 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 228 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W y Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 229 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 230 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 231 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P T y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 232 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 233 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 234 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 235 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N T C y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 236 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S A P T y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 237 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H y C.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 238 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W Y I y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 239 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R H F Y G y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 240 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N S y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 241 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V M L I y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 242 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I V y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 243 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L T G D y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 244 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q E y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 245 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 246 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T F I A y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 247 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E L y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 248 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 249 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q H P M N y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 250 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T E P Q M H R y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 251 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W P F y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 252 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I V y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 253 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K Q R E N y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 254 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q N R K D y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 255 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F H N y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 256 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M I L y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 257 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 258 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V A G y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 259 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T I K V R y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 260 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 261 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T Q R K y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 262 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A S N T y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 263 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S H G A y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 264 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 265 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A S H y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 266 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 267 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 268 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 269 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 271 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H L e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 272 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S T G y C.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 273 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P S A R y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 274 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T S E e I.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 275 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M V Q y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 276 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P A y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 277 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y H S y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 278 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I L y W.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 279 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 280 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q T R K N D A y W.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 281 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K S R Q y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 282 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S A y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 283 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G N y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 284 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F I y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 285 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K T S E y D.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácidos conservadas,
especialmente una tercera secuencia de aminoácidos constituida por
33 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 325 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H P y S.
\newpage
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 326 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M I L N T y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 327 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M Q A e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 328 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 329 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F L y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 330 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y D F y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 331 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S I T e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 332 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y G y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 333 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D S V y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 334 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I V y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 335 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P K y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 336 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H S N y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 337 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T G y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 338 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por C Y y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 339 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G N y C.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 340 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 341 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D E H P y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 342 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P R y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 343 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K S A N y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 344 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V I y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 345 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por C y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 346 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por C L W y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 347 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q S D y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 348 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F V y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 349 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D L y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 350 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F C y W.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 351 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R K A y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 352 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R K D y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 353 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M L I y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 354 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G P R y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 355 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S E G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 356 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F G y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 357 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G R K y L.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácidos conservadas,
especialmente una cuarta secuencia de aminoácidos constituida por 28
restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia:
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 380 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M I K T e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 381 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I F y C.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 382 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V Y L I y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 383 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D E N y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 384 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q E V y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 385 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W Y y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 386 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R D T y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 387 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K R A y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 388 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K I Q y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 389 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A S G y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 390 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E Q R K T S y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 391 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L Y y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 392 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 393 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R P y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 394 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T N S H y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 395 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N S K D y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 396 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V T H y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 397 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I V T y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 398 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L F V y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 399 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I Q V A y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 400 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P I T y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 401 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 403 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D S y C.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 404 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 405 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F e I.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 406 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 407 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F Y y R.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas
especialmente una quinta secuencia de aminoácidos constituida por 12
restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 438 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q K L y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 439 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F e Y.
\newpage
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 440 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G S y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 441 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 442 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L P y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 443 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q S E L A y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 444 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E D C y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 445 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 446 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F L y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 447 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D K R N W y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 448 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A K T E y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 449 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V L M y G.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas,
especialmente una sexta secuencia de aminoácidos constituida por 14
restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 463 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L F y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 464 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S K H y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 465 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G D y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 466 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 467 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 468 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 469 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T S V P y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 470 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 471 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A S y K.
\newpage
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 472 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 473 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R I y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 474 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S D E Q F P y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 475 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D Q S H y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 476 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N H D E y Q.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas,
especialmente una séptima secuencia de aminoácidos constituida por
20 restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 477 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 478 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por W y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 479 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S T y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 481 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 482 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 483 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T V S y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 484 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S T y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 485 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 487 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F A y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 488 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H Y F L y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 489 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 490 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R Q S M A e I.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 491 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M L Q V e Y.
\newpage
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 492 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D E y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 494 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V I Q y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 495 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M F S y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 496 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M Q E Y y R.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas,
especialmente una octava secuencia de aminoácidos constituida por 27
restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 524 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A L y W.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 525 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R N y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 526 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R Q E y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 527 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E A T y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 528 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 529 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S G A y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 530 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 531 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F L y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 532 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q y L
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 534 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 535 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 536 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G A y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 537 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I V e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 538 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T y S.
\newpage
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 539 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 540 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 541 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 542 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K R y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 543 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T D E S Q e I.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 544 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H A W Y S y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 545 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 546 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V M A y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 547 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V L Q y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 548 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 549 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 550 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E G A y C.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas,
especialmente una novena secuencia de aminoácidos constituida por 11
restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 789 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A y W.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 790 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 791 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 792 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 793 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L K M R y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 794 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 795 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N D A y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 796 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G N Y Q y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 797 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P E Q N y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 798 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A G S K y T.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas,
especialmente una décima secuencia de aminoácidos constituida por 14
restos aminoacídicos que tiene la siguiente secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 867 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F T e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 868 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F S y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 869 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T I y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 870 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 871 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L T Q S y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 872 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N S y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 873 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G T y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 874 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M F A Y y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 875 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q R y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 876 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F M V I Y y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 877 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I Q S L y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 878 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K P R E y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 879 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 880 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R M T E V e Y.
\newpage
La presente invención proporciona además un
fragmento catalíticamente activo de una manosidasa de Clase 2 que
comprende regiones de secuencia de aminoácido conservadas,
especialmente una décimo primera secuencia de aminoácidos
constituida por 66 restos aminoacídicos que tiene la siguiente
secuencia.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 904 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N T Q E y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 905 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T R K H S Q M y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 906 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R Q y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 907 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 908 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T S y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 909 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 910 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L H y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 911 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T S y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 912 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G A R N y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 913 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q H R y C.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 914 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P A S y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 915 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L Q e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 917 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G V y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 918 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 919 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 920 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 921 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A S G K E R y V.
\newpage
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 922 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S N D E P y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 924 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E Q W R y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 925 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L e I.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 926 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 927 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I V L y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 928 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por M I F V y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 929 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q L M V y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 930 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D H y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 931 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 933 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L T y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 934 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A S M V L y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 935 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S Q R Y y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 936 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 937 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 938 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E N G F y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 939 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 940 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 941 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L V I y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 942 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G Q E S y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 943 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q E y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 944 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 945 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V L I y R.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 946 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L R K H Q M y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 947 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 948 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N y F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 949 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K L R G y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 950 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P R I A S e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 951 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V T M G y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 952 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L V C A P T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 953 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H A N E V F W y M.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 954 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I H R L S V Q y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 955 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F N R y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 956 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R V H W G y K.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 957 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I R y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 958 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V L M H y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 959 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L I A F.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 960 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E V y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 961 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K P R S L y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 962 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V M R W N L y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 963 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N S T I P D y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 964 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por N S L V A G y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 965 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por C S M G V I Q y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 966 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por V S N A T y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 967 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por R G P M T A y D.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 968 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P N E K y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 969 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S K V E A K e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 970 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K Q E S R y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 971 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L E Q D K N y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 972 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H E S K T y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 973 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P R S K y N.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 974 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A V T L P e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 975 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por G S A R y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 976 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Y F N y V.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 977 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L H y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 978 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por T S y L
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 979 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S H L M y Q.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 980 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A V L y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 981 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A G S V y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 982 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por H Y D L y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 983 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K L M I Q Y y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 984 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A T S I L y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 985 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S T G y E.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 986 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por Q W M S A R y P
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 987 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por S Y F L E H M y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 988 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L M F V y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 989 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L H N y A.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 990 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D Y T A y H.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 991 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por P y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 992 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por L P A F V I Q y W.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 993 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por D V L I R N y S.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 994 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por K V A P y T.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 995 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F M L e Y.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 996 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por I P V A S y L.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 997 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por F G V L N A y P.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 998 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por A D A S N K y G.
En otra realización preferida, el resto
aminoacídico en la posición 999 de la primera secuencia se
selecciona entre el grupo constituido por E A K R G T y S.
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En este documento también se describe que una
manosidasa que tiene especificidad de sustrato por
Man\alpha1,2/
Man\alpha1,3/Man\alpha1,6 se introduce en un huésped eucariota inferior.
Man\alpha1,3/Man\alpha1,6 se introduce en un huésped eucariota inferior.
En una realización, una manosidasa de clase III
capaz de hidrolizar los enlaces glicosídicos
Man\alpha1,2/Man\alpha1,3/
Man\alpha1,6 se expresa en huésped eucariota inferior. Mediante la expresión de manosidasas de Clase III in vivo, solas o en conjunto con otras enzimas modificadoras de N-glicano, se obtiene el corte eficaz de estructuras con alto contenido en manosa en Man_{3}GlcNAc_{2} en glicoproteínas de huésped.
Man\alpha1,6 se expresa en huésped eucariota inferior. Mediante la expresión de manosidasas de Clase III in vivo, solas o en conjunto con otras enzimas modificadoras de N-glicano, se obtiene el corte eficaz de estructuras con alto contenido en manosa en Man_{3}GlcNAc_{2} en glicoproteínas de huésped.
Como se ha descrito en este documento, la
manosidasa III de Sf9 (Genbank gi:2245567 (D. Jarvis, y col.
Glycobiology 1997 7: 113-127)) se clona en un
plásmido de integración de levadura bajo el control de un promotor
constitutivo o inducible (véase el Ejemplo 26). La cantidad de
actividad manosidasa de Clase II se optimiza mientras que se
limitan los efectos secundarios en la célula. Esto implica alterar
la fuerza del promotor y puede incluir usar un promotor inducible o
regulable de otra manera para controlar mejor la expresión de estas
proteínas.
Además, de expresar la manosidasa de Clase III
de tipo silvestre, las formas modificadas de la manosidasa de Clase
III se pueden expresar para potenciar la localización y actividad
celular. Esto se consigue a través del enfoque de biblioteca de ADN
combinatoria de la invención fusionando longitudes variables del
dominio catalítico de manosidasa o manosidasas de Clase III con
regiones de dirección de levadura endógenas, como se ha descrito en
este documento.
\vskip1.000000\baselineskip
En este documento también se describe el
mecanismo en el que el dominio catalíticamente activo de enzimas de
Clase III hidroliza los enlaces glicosídicos Man\alpha1,3 y/o
Man\alpha1,6 y/o Man\alpha1,2 en unas estructuras de
oligosacárido, por ejemplo, Man_{5}GlcNAc_{2} o
Man_{8}GlcNAc_{2} para producir Man_{3}GlcNAc_{2}, un
intermedio deseado para procesamiento adicional de N-glicano
en un eucariota inferior.
Como se ha descrito en este documento, la
hidrólisis de los enlaces glicosídicos ocurre de forma secuencial.
La enzima hidroliza al menos un enlace glicosídico y gira
conformacionalmente para hidrolizar los otros enlaces
glicosídicos.
Como se describe también en este documento, la
hidrólisis de los enlaces glicosídicos de Man\alpha1,6 y
Man\alpha1,3 ocurre también simultáneamente. Adicionalmente se
describe que la enzima específicamente hidroliza los enlaces
glicosídicos Man\alpha1,2. El intermedio producido es un sustrato
para procesamiento de Golgi adicional en el que otras enzimas de
glicosilación tales como N-acetilglucosaminiltransferasas
(GnT), galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST) se
pueden modificar posteriormente para producir una glicoforma
deseada. La Figura 36C ilustra los interme-
dios de oligosacárido (por ejemplo Man_{4}GlcNAc_{2}, Man_{3}GlcNAc_{2}) producidos a través de la ruta de manosidasa III.
dios de oligosacárido (por ejemplo Man_{4}GlcNAc_{2}, Man_{3}GlcNAc_{2}) producidos a través de la ruta de manosidasa III.
\vskip1.000000\baselineskip
Una célula huésped preferida de la invención es
una levadura, un hongo unicelular o multicelular filamentoso. Sin
embargo, se describe una amplia variedad de células huésped como
útiles en los procedimientos de la invención. Se describe que las
células vegetales o células de insecto, por ejemplo, se modifican
genéticamente para expresar una glicoproteína de tipo humano de
acuerdo con la invención. Análogamente, se describe una diversidad
de células huésped no humanas de mamífero que expresan más
glicoproteínas similares a humano o alteradas de otra manera usando
los procedimientos de la invención. La solicitud describe además que
cualquier célula huésped eucariota (incluyendo una célula humana)
se puede usar junto con una biblioteca de la invención para expresar
una o más proteínas quiméricas que se dirigen a un emplazamiento
subcelular, por ejemplo, organelo, en la célula huésped donde la
actividad de la proteína se modifica y, preferiblemente está
potenciada. Una proteína de este tipo es preferiblemente, pero no
lo es necesariamente, una enzima implicada en la glicosilación de
proteínas, como se ha ilustrado en este documento. Se prevé que
cualquier secuencia codificante de proteína se puede dirigir y
seleccionar para actividad modificada en una célula huésped
eucariota usando los procedimientos descritos en este documento.
Los eucariotas inferiores que son capaces de
producir glicoproteínas que tienen el Man_{5}GlcNAc_{2} unido a
N-glicano son particularmente útiles debido a que (a) carecen
de un grado de manosilación (por ejemplo, mayor de 8 manosas por
N-glicano o especialmente 30-40 manosas), las
mismas muestran inmunogenicidad reducida en seres humanos y (b) el
N-glicano es un sustrato para reacciones de glicosilación
adicionales para formar una glicoforma incluso más de tipo humano,
por ejemplo, mediante la acción de la GlcNAc transferasa I (Figura
1B; \beta1,2 GnTI) para formar GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Se
obtiene un rendimiento de más del 30% en mol, más preferiblemente
un rendimiento del 50-100% en mol, con
glicoproteínas con N-glicanos que tienen una estructura de
Man_{5}GlcNAc_{2}. En una realización preferida, se muestra que
más del 50% de la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} es un
sustrato para una actividad de GnTI y puede servir como un sustrato
de este tipo in vivo.
Las levaduras u hongos unicelulares o
multicelulares filamentosos preferidos de la invención incluyen,
pero sin limitación: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia
trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia
opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum,
Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp.,
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha,
Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans,
Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Trichoderma reseei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp. Fusarium
gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.
En cada realización anterior, el procedimiento
se refiere a la preparación de una célula huésped en la que los
precursores de oligosacáridos están enriquecidos en
Man_{5}GlcNAc_{2}. Estas estructuras son deseables debido a que
las mismas se pueden procesar posteriormente mediante tratamiento
in vitro, por ejemplo, usando el procedimiento de Maras y
Contreras, Patente de los Estados Unidos Nº 5.834.251. Sin embargo,
en una realización preferida, los precursores con alto contenido en
Man_{5}GlcNAc_{2} se procesan mediante al menos una reacción de
glicosilación adicional in vivo, con glicosidasas (por
ejemplo, \alpha-manosidasa) y
glicosiltransferasas (por ejemplo, GnTI), para producir
N-glicanos similares a humano. Los precursores de
oligosacárido con altos contenidos de Man_{5}GlcNAc_{2}, por
ejemplo, se procesan preferiblemente a aquellos que tienen
estructuras de núcleo GlcNAcMan_{x}GlcNAc_{2}, donde X es 3. El
procesamiento adicional de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} mediante
tratamiento con glicosiltranferasa (por ejemplo, GnTII) produce
estructuras de núcleo de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} que
después se pueden modificar, según se desee, por ejemplo, mediante
tratamiento ex vivo o mediante expresión heteróloga en la
célula huésped de enzimas de glicosilación adicionales, incluyendo
glicosiltrans-
ferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante), para volverse N-glicanos similares a humano.
ferasas, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante), para volverse N-glicanos similares a humano.
Las glicoproteínas similares a humano preferidas
que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen aquellas
que comprenden N-glicanos que tienen siete o menos o tres o
menos restos de manosa y que comprenden uno o más azúcares
seleccionados entre el grupo constituido por galactosa, GlcNAc,
ácido siálico y fucosa.
Una célula huésped apropiada se puede modificar
por ingeniería genética o se puede usar uno de muchos de tales
mutantes descritos anteriormente en levadura. Una célula huésped
preferida de la invención, como se ilustra en este documento, es un
mutante sin hipermanosilación (OCH1) en Pichia
pastoris.
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La formación de síntesis de N-glicanos
complejos es un procedimiento secuencial mediante el cual se retiran
restos de azúcares específicos y se unen a la estructura de
oligosacárido del núcleo. En eucariotas superiores, esto se
consigue exponiendo el sustrato secuencialmente a diversas enzimas
de procesamiento. Estas enzimas realizan reacciones específicas
dependiendo de su emplazamiento particular dentro de la cascada de
procesamiento completa. Esta "línea de ensamblaje" está
constituida por RE, Golgi temprano, medio y tardío y la red de Golgi
trans, todos con su entorno de procesamiento específico.
Para recrear el procesamiento de glicoproteínas humanas en el Golgi
y RE de eucariotas inferiores, se tienen que expresar y dirigir
específicamente a estos organelos numerosas enzimas (por ejemplo,
glicosiltransferasas, glicosidasas, fosfatasas y transportadores)
y, preferiblemente, en un emplazamiento de forma que las mismas
funcionen más eficazmente con relación a su entorno así como con
otras enzimas en la ruta.
Debido a que un objetivo de los procedimientos
descritos en este documento es conseguir una cepa de producción de
proteína sólida que sea capaz de funcionar bien en un procedimiento
de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el
cromosoma de la célula huésped implica una planificación cuidadosa.
Como se ha descrito anteriormente, preferiblemente se suprimen uno
o más genes que codifican enzimas que se conoce que son
características de reacciones de glicosilación no humanas. La cepa
celular modificada por ingeniería genética se transforma con una
diversidad de genes diferentes que codifican actividades deseadas y
estos genes se transforman de una manera estable, asegurando de ese
modo que la actividad deseada se mantenga a través del procedimiento
de fermentación.
Cualquier combinación de las siguientes
actividades enzimáticas se puede modificar genéticamente de forma
única o de forma múltiple en el huésped usando los procedimientos de
la invención: sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas,
galactosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores
específicos de RE y Golgi (por ejemplo, transportadores simportador
y antiportador para UDP-galactosa y otros
precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de
oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de
oligosacárido activados tales como UDP-galactosa y
ácido CMP-N-acetilneuramínico. Preferiblemente, las
actividades enzimáticas se introducen en una o más moléculas de
ácido nucleico (véase también más adelante). Las moléculas de ácido
nucleico se pueden introducir únicamente o de forma múltiple, por
ejemplo, en el contexto de una biblioteca de ácidos nucleicos tal
como una biblioteca combinatoria de la invención. Sin embargo, se ha
de apreciar, que las actividades enzimáticas únicas o múltiples se
pueden introducir en una célula huésped de cualquier modo,
incluyendo pero sin limitación, procedimientos de administración de
proteínas y/o mediante el uso de una o más moléculas de ácido
nucleico sin usar necesariamente una biblioteca de ácidos nucleicos
o biblioteca combinatoria de la invención.
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Con información de secuencia de ADN, el experto
puede clonar moléculas de ADN que codifican actividades de GnT (por
ejemplo, Ejemplo 3). Usando técnicas convencionales bien conocidas
por los expertos en la materia, las moléculas de ácido nucleico que
codifican GnTI, II, III, IV o V (o que codifican fragmentos
catalíticamente activos de los mismos) se pueden insertar en
vectores de expresión apropiados bajo el control transcripcional de
promotores y otras secuencias de control de expresión capaces de
dirigir la transcripción en una célula huésped seleccionada de la
invención, por ejemplo, en un huésped fúngico tal como Pichia
sp., Kluyveromyces sp. y Aspergillus sp., como se ha
descrito en este documento, de forma que una o más de estas enzimas
GnT de mamífero se puedan expresar activamente en una célula huésped
de elección para producción de glicoproteína compleja de tipo humano
(por ejemplo, Ejemplos 8, 15, 17 y 19).
Varias glicosiltransferasas individuales se han
clonado y expresado en S. cerevisiae (GalT, GnTI),
Aspergillus nidulans (GnTI) y otros hongos, sin demostrar,
sin embargo, el resultado deseado de "humanización" en el
patrón de glicosilación de los organismos (Yoshida y col. (1999)
Glycobiology 9(1): 53-8; Kalsner y col.
(1995) Glycoconj. J. 12(3): 360-370). Se ha
especulado que la estructura de carbohidrato necesaria para aceptar
azúcares mediante la acción de tales glicosiltransferasas no estaba
presente en cantidades suficientes, lo que más probablemente
contribuyó a la carencia de formación de N-glicanos
complejos.
Un procedimiento preferido de la invención
proporciona la expresión funcional de una glicosiltransferasa, tal
como GnTI, GnTII y GnTIII (u otras GnT tales como GnTIV y GnTVI y
combinaciones de cualquiera de los anteriores) en el aparato de
Golgi temprano, medio o tardío, así como asegura un suministro
suficiente de UDP-GlcNAc (por ejemplo, mediante
expresión de un transportador de UDP-GlcNAc; véase
más adelante).
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Para que una glicosiltransferasa funcione de
forma satisfactoria en el Golgi, la enzima necesita una
concentración suficiente de un azúcar nucleotídico apropiado, que
es el donador de alta energía del resto de azúcar añadido a una
glicoproteína naciente. En seres humanos, la variedad completa de
precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo,
UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina,
ácido CMP-N-acetilneuramínico,
UDP-galactosa, etc.) generalmente se sintetizan en
el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen a los
oligosacáridos de núcleo mediante glicosiltransferasas.
Para replicar este procedimiento en células
huésped no humanas tales como eucariotas inferiores, se tienen que
expresar transportadores específicos de nucleósido de azúcar en el
Golgi para asegurar niveles adecuados de precursores de azúcares
nucleosídicos (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol.
91(2): A406-A406; Sommers y Hirschberg
(1982) J. Biol. Chem. 257(18): 811-817; Perez
y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138:
709-715). Los azúcares nucleotídicos se pueden
proporcionar a los compartimentos apropiados, por ejemplo,
expresando en el microorganismo huésped un gen exógeno que codifica
un transportador nucleotídico de azúcar. La elección de la enzima
transportadora está influida por la naturaleza de la
glicosiltransferasa exógena que se esté usando. Por ejemplo, una
GlcNAc transferasa puede necesitar un transportador de
UDP-GlcNAc, una fucosiltransferasa puede necesitar
un transportador de GDP-fucosa, una
galactosiltransferasa puede necesitar un transportador de
UDP-galactosa y una sialistransferasa puede
necesitar un transportador de ácido CMP-siálico.
La proteína transportadora añadida lleva un
azúcar nucleotídico desde el citosol hasta el aparato de Golgi,
donde el azúcar nucleotídico se puede someter a reacción mediante la
glicosiltransferasa, por ejemplo, para alargar un N-glicano.
La reacción libera un difosfato o monofosfato nucleosídico, por
ejemplo, UDP, GDP o CMP. Los monofosfatos nucleosídicos se pueden
exportar directamente desde el Golgi mediante intercambio por
azúcares trifosfato nucleosídicos mediante un mecanismo
antiportador. Sin embargo, la acumulación de un difosfato
nucleosídico, inhibe la actividad adicional de una
glicosiltransferasa. Ya que esta reacción parece ser importante
para la glicosilación eficaz, frecuentemente es deseable
proporcionar una copia expresada de un gen que codifica una
difosfatasa nucleotídica. La difosfatasa (específica para UDP o GDP
según sea apropiado) hidroliza el difosfonucleósido para producir
un monofosfato nucleosídico y fosfato inorgánico.
Las enzimas transportadoras adecuadas, que
típicamente son de origen mamífero, se describen más adelante. Tales
enzimas se pueden modificar por ingeniería genética en una célula
huésped seleccionada usando los procedimientos de la invención.
En otro ejemplo, \alpha2,3 o \alpha2,6
sialiltransferasa protege restos de galactosa con ácido siálico en
el Golgi trans y TGN de seres humanos conduciendo a una forma
madura de la glicoproteína (Figura 1B). Para volver a someter a
ingeniería genética esta etapa de procesamiento en una levadura u
hongo sometido a ingeniería genética de forma metabólica se
requerirá (1) actividad \alpha2,3 o \alpha2,6 sialiltransferasa
y (2) un suministro suficiente de ácido
CMP-N-acetilneuramínico en el Golgi tardío de levadura. Para
obtener suficiente actividad \alpha2,3 sialiltransferasa en el
Golgi tardío, por ejemplo, el dominio catalítico de una
sialiltransferasa conocida (por ejemplo, de seres humanos) se tiene
que dirigir al Golgi tardío en hongos (véase anteriormente).
Análogamente, los transportadores se tienen que someter a ingeniería
genética para permitir el transporte de ácido
CMP-N-acetilneuramínico en el Golgi tardío. Actualmente no
existen indicios de que los hongos sinteticen o incluso puedan
transportar cantidades suficientes de ácido
CMP-N-acetilneuramínico en el Golgi. Por consiguiente, para
asegurar un suministro adecuado de sustrato para las
glicosiltransferasas correspondientes, se tiene que modificar por
ingeniería genética metabólicamente la producción de ácido
CMP-siálico en el hongo.
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El ADNc de transportador humano de
UDP-N-acetilglucosamina, que se reconoció a través de una
búsqueda de homología en las bases de datos de etiquetas de
secuencia expresadas (dbEST), se ha clonado (Ishida, 1999 J.
Biochem. 126(1): 68-77). El transportador de
membrana de Golgi de mamífero para UDP-N-acetilglusamina se
clonó mediante corrección fenotípica con ADNc a partir de células de
riñón caninas (MDCK) de un mutante caracterizado recientemente de
Kluyveromyces lactis que carecía de transporte de Golgi del
azúcar nucleotídico anterior (Guillen y col. (1998) Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 95(14): 7888-7892). Los
resultados demuestran que el gen de transportador de
UDP-GlcNAc de Golgi de mamífero tiene toda la
información necesaria para que la proteína se exprese y se dirija
funcionalmente al aparato de Golgi de levadura y que dos proteínas
con secuencias de aminoácidos muy diferentes pueden transportar el
mismo soluto dentro de la misma membrana de Golgi (Guillen y col.
(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(14):
7888-7892).
Por consiguiente, se puede incorporar la
expresión de un transportador de UDP-GlcNAc en una
célula huésped por medio de una construcción de ácido nucleico que
puede contener, por ejemplo: (1) una región mediante la cual la
construcción transformada se mantiene en la célula (por ejemplo, un
origen de replicación o una región que media la integración
cromosómica), (2) un gen marcador que permite la selección de
células que se ha transformado, incluyendo marcadores contra
seleccionables y reciclables tales como ura3 o
T-urfl3 (Soderholm y col. (2001)
Biotechniques 31(2): 306-10) u otros
marcadores de selección bien caracterizados (por ejemplo, his4,
bla, Sh ble etc.), (3) un gen o fragmento del mismo que codifica
un transportador de UDP-GlcNAc funcional (por
ejemplo, de K. lactis, (Abeijon, (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 93: 5963-5968) o de H. sapiens
(Ishida y col. (1996) J. Biochem. (Tokyo) 120(6):
1074-8) y (4) un promotor que activa la expresión de
la biblioteca de construcción de fusión de dominio de
localización/catalítico mencionado. El Ejemplo 8 muestra la adición
del gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis
(Genbank NA AP106080) que codifica el transportador de
UDP-GlcNAc en un PBP-3 de P.
pastoris. Las Figura 10A y 10B comparan los perfiles de
N-glicano de MALDI-TOF de una cepa de P.
pastoris sin el transportador de UDP-GlcNAc y
una cepa de P. pastoris con el transportador de
UDP-GlcNAc (PBP-3), respectivamente.
El PBP-3 de P. pastoris muestra un pico
prominente único en 1457 (m/z) coherente con su identificación como
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b].
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El transportador de GDP-fucosa
de membrana de Golgi de hígado de rata se ha identificado y
purificado por Puglielli, L. y C. B. Hirschberg (Puglielli, 1999 J.
Biol. Chem. 274(50): 35596-35600). El gen
correspondiente no se ha identificado, sin embargo, se puede usar
secuenciación N-terminal para el diseño de sondas
oligonucleotídicas específicas para el gen correspondiente. Estos
oligonucleótidos se pueden usar como sondas para clonar el gen que
codifica el transportador de GDP-fucosa.
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Dos genes heterólogos, gmal2(+) que
codifican alfa 1,2-galactosiltransferasa (alfa 1,2
GalT) de Schizosaccharomyces pombe y (hUGT2) que
codifica transportador de UDP-galactosa humano
(UDP-Gal), se han expresado funcionalmente en S.
cerevisiae para examinar las condiciones intracelulares
necesarias para la galactosilación. La correlación entre la
galactosilación de proteínas y la actividad de transporte de
UDP-galactosa ha indicado que un suministro exógeno
de transportador de UDP-Gal, en lugar de alfa 1,2
GalT jugaba un papel clave para la galactosilación eficaz en S.
cerevisiae (Kainuma, 1999 Glycobiology 9(2):
133-141). Análogamente, se ha clonado un
transportador de UDP-galactosa de S. pombe
(Segawa, 1999 Febs Letters 451(3):
295-298).
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El transportador de ácido
CMP-siálico humano (hCST) se ha clonado y expresado
en células CHO Lee 8 (Aoki y col. (1999) J. Biochem. (Tokyo)
126(5): 940-50; Eckhardt y col. (1997) Eur.
J. Biochem. 248(1): 187-92). La expresión
funcional del transportador de ácido CMP-siálico
murino se consiguió en Saccharomyces cerevisiae (Berninsone
y col. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):
12616-9). En algunos hongos se ha encontrado ácido
siálico, sin embargo, no está claro si el sistema huésped elegido
será capaz de suministrar niveles suficientes de ácido
CMP-Siálico. El ácido siálico se puede suministrar
en el medio o, como alternativa, también se pueden integrar rutas
fúngicas implicadas en la síntesis de ácido siálico en el genoma del
huésped.
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Cuando se transfieren azúcares en una
glicoproteína, se libera un difosfato o monofosfato nucleosídico a
partir de los precursores nucleotídicos de azúcar. Mientras que los
monofosfatos se pueden exportar directamente como intercambio por
azúcares trifosfato nucleosídicos mediante un mecanismo
antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen
que escindir mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir
monofosfatos nucleosídicos y fosfatos inorgánicos antes de
exportarse. Esta reacción parece ser importante para la
glicosilación eficaz, ya que se ha encontrado que la GDPasa de
S. cerevisiae es necesaria para la manosilación. Sin
embargo, la enzima sólo tiene el 10% de la actividad hacia UDP
(Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269(1):
207-211). Con frecuencia, los eucariotas inferiores
no tienen actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi ya
que no utilizan precursores de UDP-azúcar para la
síntesis de glicoproteína en el Golgi. Schizosaccharomyces
pombe, una levadura que añade restos de galactosa a los
polisacáridos de la pared celular (a partir de
UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad
de UDPasa específica, sugiriendo además la necesidad de una enzima
de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem.
269(1): 207-211). Se conoce que UDP es un
inhibidor potente de glicosiltransferasas y la remoción de este
producto secundario de la glicosilación es importante para evitar la
inhibición de la glicosiltransferasa en el lumen del Golgi.
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Se puede usar una diversidad de vectores de
expresión para expresar las secuencias de nucleótidos de la presente
invención (véase, por ejemplo, el Ejemplo 13). Las secuencias se
pueden unir operativamente a una secuencia de control de expresión
en un vector adecuado para transformación de una célula huésped. En
una realización, una secuencia de la presente invención está unida
operativamente a un vector denominado pJN348, que comprende un
promotor GAPDH, un casete de sitio de restricción NotI AscI
PacI, un terminador transcripcional Cycll, el casete de
selección ura3 para expresión en una P. pastoris
YSH-1 (Amp^{r}).
En una realización preferida, el vector
comprende un fragmento catalíticamente activo de una enzima
manosidasa II como se ha expuesto en la descripción anterior. Otros
vectores de expresión adecuados para uso en levaduras y hongos
filamentosos se conocen bien en la técnica.
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La presente invención proporciona además un
procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una
célula huésped no humana que comprende la etapa de introducir en la
célula una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una
enzima o enzimas para producción de la estructura de carbohidrato
Man_{5}GlcNAc_{2}. En una realización preferida, una molécula
de ácido nucleico que comprende una o más actividades manosidasas
implicadas en la producción de Man_{5}GlcNAc_{2} a partir de
Man_{8}GlcNAc_{2} o Man_{9}GlcNAc_{2} se introduce en el
huésped. La invención se refiere además a procedimientos para
preparar glicoproteínas alteradas en una célula huésped que
comprenden la etapa de introducir en la célula huésped una molécula
de ácido nucleico que codifica una o más enzimas o actividades de
glicosilación. Las actividades enzimáticas preferidas se seleccionan
entre el grupo constituido por UDP-GlcNAc
transferasa, UDP-galactosiltransferasa,
GDP-fucosiltransferasa,
CMP-sialiltransferasa, transportador de
UDP-GlcNAc, transportador de
UDP-galactosa, transportador de
GDP-fucosa, transportador de ácido
CMP-siálico y difosfatasas nucleotídicas. En una
realización particularmente preferida, el huésped se selecciona o
se modifica por ingeniería genética para expresar dos o más
actividades enzimáticas en las que el producto de una actividad
aumenta los niveles de sustrato de otra actividad, por ejemplo, una
glicosiltransferasa y un transportador de glucosa correspondiente,
por ejemplo, GnTI y actividades de transportador de
UDP-GlcNAc. En otra realización preferida, el
huésped se selecciona o se modifica por ingeniería genética para
expresar una actividad para retirar productos que pueden inhibir
reacciones de glicosilación posteriores, por ejemplo, una actividad
de difosfatasa específica de UDP o GDP.
Los procedimientos preferidos de la invención
implican expresar una o más actividades enzimáticas a partir de una
molécula de ácido nucleico en una célula huésped y comprenden la
etapa de dirigir al menos una actividad enzimática a un
emplazamiento subcelular deseado (por ejemplo, un organelo) formando
una proteína de fusión que comprende un dominio catalítico de la
enzima y un péptido señal de dirección celular, por ejemplo, un
péptido señal heterólogo que normalmente no está ligado a o asociado
con el dominio catalítico. La proteína de fusión está codificada
por al menos una construcción genética ("construcción de
fusión") que comprende un fragmento de ácido nucleico que
codifica un péptido señal de dirección celular ligado en la misma
fase de lectura traduccional ("en fase") a un fragmento de
ácido nucleico que codifica una enzima (por ejemplo, enzima de
glicosilación) o fragmento catalíticamente activo de la misma.
El componente de péptido señal de dirección de
la construcción de fusión o proteína preferiblemente se obtiene a
partir de un miembro del grupo constituido por: proteínas unidas a
membrana del RE o Golgi, señales de recuperación, proteínas de
membrana de Tipo II, proteínas de membrana de Tipo I,
transportadores de azúcares nucleotídicos transmembrana,
manosidasas, sialiltransferasas, glicosidasas, manosiltransferasas y
fosfomanosiltranferasas.
El componente de dominio catalítico de la
construcción de fusión o proteína preferiblemente se obtiene a
partir de una actividad glicosidasa, manosidasa o
glicosiltransferasa obtenida a partir de un miembro del grupo
constituido por GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, GalT,
Fucosiltransferasa y Sialiltransferasa. El domino catalítico
preferiblemente tiene un pH óptimo dentro de 1,4 unidades de pH del
pH promedio óptimo de otras enzimas representativas en el organelo
en el que está localizada la enzima o tiene una actividad óptima a
un pH de entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, el dominio
catalítico codifica una manosidasa seleccionada entre el grupo
constituido por manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB
de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster,
manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P.
citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón,
manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A.
nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de
ratón, manosidasa II de C. elegans y manosidasa II de H.
sapiens.
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En una realización, una glicoproteína de tipo
humano se prepara eficazmente en una célula de levadura u hongo
unicelular o multicelular filamentoso introduciendo en un
compartimento subcelular de la célula una enzima de glicosilación
seleccionada para tener un pH óptimo similar al pH óptimo de otras
enzimas en el compartimento subcelular al que se dirige. Por
ejemplo, la mayoría de las enzimas que son activas en el RE y el
aparato de Golgi de S. cerevisiae tienen pH óptimos que
están entre aproximadamente 6,5 y 7,5 (véase la Tabla 3). Debido a
que la glicosilación de proteínas en un procedimiento altamente
evolucionado y eficaz, el pH interno del RE y del Golgi
probablemente también está en el intervalo de aproximadamente
6-8. Sin embargo, todos los enfoques anteriores
para reducir la manosilación mediante la acción de manosidasa
recombinantes en huéspedes fúngicos han introducido enzimas que
tienen un pH óptimo de aproximadamente pH 5,0 (Martinet y col.
(1998) Biotech. Letters 20(12): 1171-1177, y
Chiba y col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (41):
26298-26304). A pH 7,0 la actividad determinada
in vitro de esas manosidasas se reduce hasta menos del 10%,
lo que probablemente es actividad insuficiente en su punto de uso,
concretamente, el RE y el Golgi temprano, para la producción in
vivo eficaz de Man_{5}GlcNAc_{2} o N-glicanos.
Por consiguiente, una realización preferida de
esta invención dirige una enzima de glicosilación seleccionada (o
dominio catalítico de la misma), por ejemplo, una
\alpha-manosidasa, a un emplazamiento subcelular
en la célula huésped (por ejemplo, un organelo) donde el pH óptimo
de la enzima o dominio está dentro de 1,4 unidades del pH promedio
óptimo de otras enzimas marcadoras representativas localizadas en el
mismo o los mismos organelos. El pH óptimo de la enzima que se
tiene que dirigir a un organelo específico debe coincidir con el pH
óptimo de otras enzimas encontradas en el mismo organelo para
maximizar la actividad por unidad de enzima obtenida. La Tabla 3
resume la actividad de manosidasas de diversas fuentes y sus pH
óptimos respectivos. La Tabla 4 resume sus emplazamientos
subcelulares típicos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En una realización preferida, una enzima
particular o dominio catalítico se dirige a un emplazamiento
subcelular en la célula huésped por medio de una construcción de
fusión quimérica que codifica una proteína que comprende un péptido
señal de dirección celular que no está normalmente asociado con el
dominio enzimático. Preferiblemente, una enzima o dominio se dirige
al RE, el Golgi temprano, medio o tardío o el aparato de Golgi
trans de la célula huésped.
En una realización más preferida, la enzima de
glicosilación dirigida es una manosidasa, glicosiltransferasa o una
glicosidasa. En una realización especialmente preferida, la
actividad manosidasa se dirige al RE o Golgi cis, donde ocurren las
reacciones tempranas de glicosilación. Mientras que este
procedimiento es útil para producir una glicoproteína de tipo
humano en una célula huésped no humana, se apreciará que el
procedimiento que se describe que también es útil más generalmente
para modificar los perfiles de carbohidrato de una glicoproteína en
cualquier célula huésped eucariota, incluyendo células huésped
humanas.
La secuencia de dirección que media en la
retención de proteínas en determinados organelos de la ruta
secretora de la célula huésped se conoce bien y se ha descrito en
la bibliografía científica y bases de datos públicas, como se ha
analizado con más detalle más adelante con respecto a bibliotecas
para selección de secuencias de dirección y enzimas dirigidas.
Tales secuencias de dirección subcelular se pueden usar solas o en
combinación para dirigir una enzima de glicosilación seleccionada
(o dominio catalítico de la misma) a un emplazamiento subcelular
particular en una célula huésped, es decir, especialmente a uno
donde la enzima tendrá una actividad potenciada u óptima basándose
en el pH óptimo o la presencia de otros factores estimulantes.
Cuando se intenta cortar las estructuras con
alto contenido en manosa para producir Man_{5}GlcNAc_{2} en el
RE o el aparato de Golgi de una célula huésped tal como S.
cerevisiae, por ejemplo, se puede elegir cualquier enzima o
combinación de enzimas que (1) tenga un pH óptimo suficientemente
cercano (es decir entre pH 5,2 y pH 7,8) y (2) se conoce que
genera, sola o en conjunto, la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}
isomérica específica necesaria para aceptar la adición posterior de
GlcNAc por GnTI. Cualquier enzima o combinación de enzimas que
demuestre que genera una estructura que se puede convertir en
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} por GnTI in vitro podría
constituir una elección apropiada. Este conocimiento se puede
obtener a partir de la bibliografía científica o de forma
experimental.
Por ejemplo, se puede determinar si una
manosidasa potencial puede convertir
Man_{8}GlcNAc_{2}-2AB
(2-aminobenzamida) en
Man_{5}GlcNAc_{2}-AB y después verificar que la
estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}-2AB obtenida
pueda servir como un sustrato para GnTI y
UDP-GlcNAc para producir GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}
in vitro. Manosidasa IA a partir de una fuente humana o
murina, por ejemplo, sería una elección apropiada (véase, por
ejemplo, el Ejemplo 4). Los ejemplos descritos en este documento
utilizan oligomanosa enlazada a N marcada con
2-aminobenzamida seguido por análisis de HPLC para
realizar esta determinación.
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Por consiguiente, una enzima de glicosilación
tal como una enzima
\alpha-1,2-manosidasa usada de
acuerdo con la invención tiene una actividad óptima en un pH de
entre 5,1 y 8,0. En una realización preferida, la enzima tiene una
actividad óptima a un pH de entre 5,5 y 7,5. La enzima manosidasa de
C. elegans, trabaja bien en los procedimientos de la
invención y tiene un pH óptimo aparente de aproximadamente 5,5. Las
manosidasas preferidas incluyen las que se enumeran en la Tabla 3
que tienen un pH óptimo apropiado, por ejemplo, Aspergillus
nidulans, IA (Golgi) de Homo sapiens, IB (Golgi) de
Homo sapiens, células de insectos Lepidópteros
(IPLB-SF21AE), Homo sapiens, IB (Golgi) de
ratón, Xanthomonas manihotis, Drosophila melanogaster y C.
elegans.
El experimento que ilustra el pH óptimo de una
enzima \alpha-1,2-manosidasa se
describe en el Ejemplo 7. Una proteína de fusión quimérica
BB27-2 (MNN10 (s) de Saccharomyces/
manosidasa IB \Delta31 de C. elegans), que se filtra al
medio se sometió a diversos intervalos de pH para determinar la
actividad óptima de la enzima. Los resultados del experimento
muestran que la
\alpha-1,2-manosidasa tiene un pH
óptimo de aproximadamente 5,5 para su función (Figura 11).
En una realización preferida, un gen de
manosidasa único clonado se expresa en el organismo huésped. Sin
embargo, en algunos casos puede ser deseable expresar varios genes
de manosidasa diferentes o varias copias de un gen particular, para
conseguir la producción adecuada de Man_{5}GlcNAc_{2}. En los
casos en los que se usan múltiples genes, las manosidasas
codificadas preferiblemente tienen pH óptimos dentro del intervalo
preferido de aproximadamente 5,1 a aproximadamente 8,0 o
especialmente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,5. Las
actividades manosidasa preferidas incluyen
\alpha-1,2-manosidasas obtenidas a
partir de ratón, seres humanos, Lepidoptera, Aspergillus
nidulans o Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster,
P. citrinum, X. laevis o A. nidulans.
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La presente solicitud describe además una o más
bibliotecas de ácido nucleico. Una característica ejemplar de una
biblioteca de ácido nucleico combinatoria de la invención es que la
misma comprende secuencias que codifican péptidos señal de
dirección celulares y secuencias que codifican proteínas que se
tienen que dirigir (por ejemplo, enzimas o dominios catalíticos de
las mismas, incluyendo, pero sin limitación, las que median la
glicosilación).
Se describe que una biblioteca de ácido nucleico
combinatoria comprende: (a) al menos dos secuencias de ácido
nucleico que codifican diferentes péptidos señal de dirección
celular; y (b) al menos una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido que se tiene que dirigir. Se describe que
una biblioteca de ácido nucleico combinatoria comprende: (a) al
menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal
de dirección celular y (b) al menos dos secuencias de ácido
nucleico que codifican un polipéptido que se tiene que dirigir a
una célula huésped. Como se ha descrito adicionalmente más adelante,
una secuencia de ácido nucleico obtenida a partir de (a) y una
secuencia de ácido nucleico obtenida a partir de (b) se ligan para
producir una o más construcciones de fusión que codifican un
péptido señal de dirección celular unido funcionalmente a un domino
polipeptídico de interés. Un ejemplo de un enlace funcional es
cuando el péptido señal de dirección celular se liga con el dominio
polipeptídico de interés en el mismo marco de lectura traduccional
("en marco").
Se describe una biblioteca de ADN combinatoria
que expresa una o más proteínas de fusión que comprenden péptidos
señal de dirección celular ligados en fase a dominios enzimáticos
catalíticos. La proteína de fusión codificada puede comprender un
dominio catalítico de una enzima implicada en modificación de
N-glicanos de mamífero o similares a humano. Se describe que
el dominio catalítico se obtiene a partir de una enzima seleccionada
entre el grupo constituido por manosidasas, glicosiltransferasas y
otras glicosidasas que se liga en fase a uno o más péptidos señal
de dirección. El domino enzimático puede ser exógeno y/o endógeno a
la célula huésped. Un péptido señal particularmente preferido es
uno que está normalmente asociado con una proteína que experimenta
transporte de RE a Golgi.
Se describe que la biblioteca de ADN
combinatoria de la presente invención se usa para producir y
localizar in vivo enzimas implicadas en la modificación de
N-glicano similar a mamífero o a humano. Las construcciones
de fusión de la biblioteca de ADN combinatoria se modifican por
ingeniería genética de forma que las enzimas codificadas se
localizan en el RE, Golgi o la red de Golgi trans de la
célula huésped en la que los mismos están implicados en la
producción de N-glicano particulares o una glicoproteína de
interés. La localización de enzimas modificadoras de
N-glicano de la presente invención se consigue a través de un
mecanismo de anclaje o a través de interacción
proteína-proteína donde el péptido de localización
construido a partir de la biblioteca de ADN combinatoria se
localiza en un organelo deseado de la ruta secretora tal como el RE,
Golgi o la red de Golgi trans.
Un ejemplo de un N-glicano útil, que se
produce eficazmente en cantidades suficientes para modificación
adicional mediante reacciones de glicosilación similares a humano
(complejas) es Man_{5}GlcNAc_{2}. Se necesita una cantidad
suficiente de Man_{5}GlcNAc_{2} en una glicoproteína de interés
para procesamiento de tipo humano adicional in vivo (por
ejemplo, más del 30% en mol). El intermedio Man_{5}GlcNAc_{7}
se puede usar como un sustrato para modificación de N-glicano
adicional para producir GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} (Figura 1B;
véase anteriormente). Por consiguiente, se describe que la
biblioteca de ADN combinatoria de la presente invención se puede
usar para producir enzimas que posteriormente producen
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} u otros N-glicanos complejos
deseados en una cantidad útil.
Un aspecto adicional de las construcciones de
fusión producidas usando una biblioteca de ADN combinatoria es que
las mismas posibilitan actividad de corte suficiente y, con
frecuencia, casi completa de N-glicano intracelular en la
célula huésped modificada por ingeniería genética. Las
construcciones de fusión producidas mediante la biblioteca de ADN
combinatoria codifican una enzima de glicosilación, por ejemplo, una
manosidasa, que se localiza eficazmente en un compartimento de
célula huésped intracelular y, de ese modo, muestra muy poca o,
preferiblemente, ninguna actividad extracelular. Se demuestra que
las construcciones de fusión descritas en la presente solicitud que
codifican enzima manosidasa se localizan donde los N-glicanos
se modifican, concretamente, el RE y el Golgi. Las enzimas de
fusión descritas se dirigen a tales organelos particulares en la
ruta secretora donde las mismas localizan y actúan sobre los
N-glicanos tales como Man_{8}GlcNAc_{2} para producir
Man_{5}GlcNAc_{2} en una glicoproteína de interés.
Las enzimas producidas mediante la biblioteca de
ADN combinatoria como se ha descrito en este documento pueden
modificar N-glicanos en una glicoproteína de interés como se
muestra para las proteínas K3 o IFN-\beta expresadas en
P. pastoris, como se muestra en las Figuras 5 y 6,
respectivamente (véanse también los Ejemplos 2 y 4). Sin embargo,
se aprecia que otros tipos de glicoproteínas incluyendo, sin
limitación, eritropoyetina, citoquinas tales como
interferón-\alpha,
interferón-\beta,
interferón-\gamma,
interferón-\omega y CSF de granulocitos, factores
de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C
humana, cadena \alpha del receptor de IgE soluble, IgG,
fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa e
inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IGF, factor de
crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del
crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de
crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitor
mieloide 1, osteoprotegerina, \alpha-1
antitripsina, ADNasa II, \alpha-fetoproteínas,
AAT, rhTBP-1 (onercept, proteína de unión a TNF aka
1), TACI-lg (activador transmembrana y modulador de
calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona
estimulante de folículo), GM-CSF,
GLP-1 con y sin FC (proteína similar a glucagón 1),
agonistas del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel,
fusión de Fc de receptor de TNF soluble aka), ATIII, Trombina rh,
glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Ig de Antígeno 4
asociado con Linfocito T Citotóxico) se pueden glicosilar de esta
manera.
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Una biblioteca de ADN combinatoria de
construcciones de fusión presenta uno o más péptidos señal de
dirección celular ("péptidos de dirección") generalmente
obtenidos a partir de dominios N terminales de proteínas
nativas (por ejemplo, realizando supresiones C terminales). Sin
embargo, algunos péptidos de dirección se obtienen a partir del
extremo C de proteínas nativas (por ejemplo, SEC12). Las
proteínas unidas a membrana del RE o del Golgi preferiblemente se
usan como una fuente para dirigir secuencias peptídicas. Estas
proteínas tienen secuencias que codifican una cola citosólica (ct),
un dominio transmembrana (tmd) y una región de tronco (sr) que
varían en longitud. Estas regiones se reconocen por alineamiento de
secuencias de proteína y comparaciones con homólogos conocidos y/u
otras proteínas localizadas (por ejemplo, comparando
representaciones de hidrofobicidad).
Los péptidos de dirección se indican en este
documento como cortos (s), medios (m) y largos (1) con relación a
las partes de una membrana de tipo II. La secuencia de péptido de
dirección indicada como corta (s) corresponde al dominio
transmembrana (tmd) de la proteína unida a membrana. La secuencia de
péptido de dirección indicada como larga (1) corresponde a la
longitud del domino transmembrana (tmd) y la región de tronco (sr).
La secuencia de péptido de dirección indicada como media (m)
corresponde al dominio transmembrana (tmd) y aproximadamente la
mitad de la longitud de la región de tronco (sr). Las regiones de
dominio catalítico se indican en este documento mediante el número
de supresión nucleotídica con respecto a su enzima de glicosilación
de tipo silvestre.
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En algunos casos, una biblioteca de ácido
nucleico combinatoria como se ha descrito en este documento se puede
ensamblar directamente a partir de genes existentes o de tipo
silvestre. La biblioteca de ADN se ensambla a partir de la fusión
de dos o más sub-bibliotecas. Mediante el ligamiento
en fase de las sub-bibliotecas, es posible crear un
gran número de construcciones genéticas novedosas que codifican
dominios de proteína dirigidas útiles tales como aquellas que tienen
actividades de glicosilación.
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Una sub-biblioteca útil incluye
secuencias de ADN que codifican enzimas tales como glicosidasas (por
ejemplo, manosidasas), glicosiltransferasas (por ejemplo,
fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glicosiltransferasas),
GlcNAc transferasas y sialiltransferasas. Los dominios catalíticos
se pueden seleccionar entre el huésped que se tiene que modificar
por ingeniería genética, así como entre otros organismos
relacionados y no relacionados. Todas las enzimas de mamíferos,
plantas, insectos, reptiles, algas u hongos son útiles y se deben
elegir para representar un amplio espectro de propiedades
bioquímicas con respecto a temperatura y pH óptimos. Los genes se
pueden truncar para proporcionar fragmentos, algunos de los cuales
codifican los dominios catalíticos de las enzimas. Mediante la
remoción de secuencias de dirección endógenas, las enzimas después
se pueden redirigir y expresar en otros loci celulares.
La elección de tales dominios catalíticos puede
estar guiada por el conocimiento del entorno particular en el que
el dominio catalítico tendrá que posteriormente activarse. Por
ejemplo, si una enzima de glicosilación particular tiene que ser
activa en el Golgi tardío y todas las enzimas conocidas del
organismo huésped en el Golgi tardío tienen un pH óptimo
determinado o el Golgi tardío se conoce que tiene un pH particular,
entonces se elige un dominio catalítico que muestra actividad
adecuada y, preferiblemente máxima, a ese pH, como se ha descrito
anteriormente.
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Otra sub-biblioteca útil incluye
secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos señal de
dirección que dan como resultado la localización de una proteína en
un emplazamiento particular dentro del RE, Golgi o red de Golgi
trans. Estos péptidos de dirección se pueden seleccionar
entre el organismo huésped que se tiene que modificar por
ingeniería genética así como entre otros organismos relacionados o
no relacionados. En general, tales secuencias caen en tres
categorías: (1) secuencias N-terminal que codifican una cola
citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd) y parte o toda una
región de tronco (sr), los cuales juntos o individualmente anclan
las proteínas a la membrana interna (luminal) del Golgi; (2) señales
de recuperación que generalmente se encuentran en el extremo C
tales como el tetrapéptido HDEL (SEC ID Nº: 105) o KDEL (SEC ID Nº:
106) y (3) regiones transmembrana de diversas proteínas, por
ejemplo, transportadores de azúcar nucleotídico, que se conoce que
se localizan en el Golgi.
\newpage
En el primer caso, cuando el péptido señal está
constituido por diversos elementos (ct, tmd y sr), la biblioteca se
diseña de forma que la ct, el tmd y diversas partes de la región de
tronco estén representadas. Por consiguiente, una realización
preferida de la sub-biblioteca de secuencias de
péptido de dirección incluye secuencias de ct, tmd y/o sr de
proteínas unidas a membrana del RE o Golgi. En algunos casos, puede
ser deseable proporcionar a la sub-biblioteca
diversas longitudes de secuencia sr. Esto se puede conseguir
mediante PCR usando cebadores que se unen al extremo 5' del ADN que
codifica la región citosólica y empleando una serie de cebadores
opuestos que se unen a diversas partes de la región de tronco.
Otras fuentes útiles de secuencias de péptidos
de dirección incluyen péptidos señal de recuperación, por ejemplo,
los tetrapéptidos HDEL (SEC ID Nº: 105) o KDEL (SEC ID Nº: 106), que
típicamente se encuentran en el extremo C de proteínas que se
transportan de forma retrógrada en el RE o Golgi. Otras fuentes de
secuencias de péptidos de dirección incluyen (a) proteínas de
membrana de tipo II, (b) las enzimas enumeradas en la Tabla 3, (c)
transportadores de azúcares nucleotídicos transmembrana que se
localizan en el Golgi y (d) secuencias a las que se hace referencia
en la Tabla 5.
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En cualquier caso, se describe que se
seleccionan secuencias de péptidos de dirección que son apropiadas
para la actividad o actividades enzimáticas particulares para
funcionar óptimamente dentro de la secuencia de las reacciones de
glicosilación deseadas. Por ejemplo, para desarrollar un
microorganismo huésped modificado capaz de sialilación terminal de
N-glicanos nacientes, un procedimiento que ocurre en el Golgi
tardío en seres humanos, es deseable utilizar una
sub-biblioteca de secuencias de péptido de dirección
obtenidos a partir de proteínas de Golgi tardío. De forma similar,
el corte de Man_{8}GlcNAc_{2} mediante una
\alpha-1,2-manosidasa para
producir Man_{5}GlcNAc_{2} es una etapa temprana en la formación
de N-glicano complejo en seres humanos (Figura 1B). Por lo
tanto, es deseable que esta reacción ocurra en el RE o Golgi
temprano de un microorganismo huésped modificado por ingeniería
genética. Se usa una sub-biblioteca que codifica
señales de retención de RE y Golgi temprano.
Una serie de construcciones de proteína de
fusión (es decir, una biblioteca de ADN combinatoria) después se
construye uniendo funcionalmente una o una serie de secuencias de
péptidos de dirección a una o una serie de secuencias que codifican
dominios catalíticos. Esto se consigue mediante el ligamiento en
fase de una sub-biblioteca que comprende ADN que
codifica secuencias de péptido de dirección (anteriormente) con una
sub-biblioteca que comprende ADN que codifica
enzimas de glicosilación o fragmentos catalíticamente activos de las
mismas (véase más adelante).
La biblioteca resultante comprende genes
sintéticos que codifican proteínas de fusión que contienen
secuencias de péptidos de dirección. En algunos casos es deseable
proporcionar una secuencia de péptido de dirección en el extremo N
de una proteína de fusión o en otros casos en el extremo C. En
algunos casos, las secuencias de péptidos de dirección se pueden
insertar dentro de la fase de lectura abierta de una enzima, con la
condición de que la estructura de proteína de dominios plegados
individuales no se altere. Cada tipo de proteína de fusión se
construye (de una manera dirigida gradualmente o semialeatoria) y
las construcciones óptimas se pueden seleccionar tras la
transformación de células huésped y la caracterización de patrones
de glicosilación en células transformadas usando procedimientos de
la invención.
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El procedimiento descrito es más eficaz cuando
un ácido nucleico, por ejemplo, una biblioteca de ADN transformada
en el huésped contiene una gran diversidad de secuencias, aumentando
de ese modo la probabilidad de que al menos un transformante
mostrará el fenotipo deseado. Por ejemplo, las mutaciones de
aminoácido único pueden alterar drásticamente la actividad de
enzima de procesamiento de glicoproteínas (Romero y col. (2000) J.
Biol. Chem. 275(15): 11071-4). Por
consiguiente, antes de la transformación, una biblioteca de ADN o
una sub-biblioteca constituyente se puede someter a
una o más técnicas para generar diversidad de secuencia adicional.
Por ejemplo, se pueden realizar uno o más ciclos de transposición
de genes, PCR propensa a error, mutagénesis in vitro u otros
procedimientos para generar diversidad de secuencias, para obtener
una diversidad de secuencias mayor dentro de la combinación de
construcciones de fusión.
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Además de las secuencias de fase de lectura
abierta descritas anteriormente, cada construcción de biblioteca
puede estar provista de secuencias de control de expresión, tales
como promotores, terminadores de transcripción, potenciadores,
sitios de unión a ribosoma y otras secuencias funcionales que pueden
ser necesarias para asegurar la transcripción y traducción eficaz
de la proteína de fusión tras la transformación de construcciones de
fusión en el organismo huésped.
Se seleccionan componentes de vector adecuados,
por ejemplo, marcadores seleccionables, secuencias de control de
expresión (por ejemplo, promotores, potenciadores, terminadores y
similares) y, opcionalmente, secuencias necesarias para replicación
autónoma en una célula huésped, como una función de cuál célula
huésped particular se elige. Los criterios de selección para los
componentes de vector adecuados para uso en una célula huésped de
mamífero o eucariota inferior particular son de rutina. Las células
huésped eucariotas inferiores preferidas de la invención incluyen
Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia
koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia
thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi,
Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha,
Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans,
Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp. Fusarium
gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.
Cuando el huésped es Pichia pastoris, los promotores
adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores AOX1, AOX2,
GAPDH y P40.
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También se ha descrito que cada construcción
puede estar provista de al menos un marcador seleccionable, tal
como un gen para impartir resistencia a fármaco o para complementar
una lesión metabólica de huésped. La presencia del marcador es útil
en la selección posterior de transformantes; por ejemplo, en
levadura se pueden usar los genes URA3, HIS4, SUC2, G418,
BLA, o SH BLE. Se conocen y están disponibles una
multitud de marcadores seleccionables para uso en levaduras, hongos,
plantas, insectos, mamíferos y otras células huésped eucariotas.
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La biblioteca de ácido nucleico después se
transforma en el organismo huésped. En levaduras, se puede usar
cualquier procedimiento conveniente de transferencia de ADN, tal
como electroporación, el método de cloruro de litio o el método de
esferoplasto. En hongos filamentosos y células vegetales, los
procedimientos convencionales incluyen bombardeo de partículas,
electroporación y transformación mediada por agrobacterium. Para
producir una cepa estable adecuada para cultivo de alta densidad
(por ejemplo, fermentación en levadura), es deseable integrar las
construcciones de la biblioteca de ADN en el cromosoma del huésped.
En una realización preferida, la integración ocurre a través de
recombinación homóloga usando técnicas bien conocidas en el campo.
Por ejemplo, los elementos de biblioteca de ADN están provistos de
secuencias flanqueantes homólogas a secuencias del organismo
huésped. De esta manera, la integración ocurre en un sitio definido
del genoma del huésped, sin alteración de genes deseables o
esenciales.
Se describe que el ADN de biblioteca se integra
en el sitio de un gen indeseado en un cromosoma huésped, logrando
la alteración o supresión del gen. Por ejemplo, la integración en
los sitios de los genes OCH1, MNN1 o MNN4 permite la
expresión del ADN de biblioteca deseada mientras que evita la
expresión de enzimas implicadas en la hipermanosilación de
glicoproteínas en levaduras. Además se describe que el ADN de
biblioteca se puede introducir en el huésped a través de una
molécula de ácido nucleico, plásmido, vector (por ejemplo, vector
viral o retroviral), cromosoma y se puede introducir como una
molécula de ácido nucleico autónoma o mediante integración homóloga
o aleatoria en el genoma del huésped. En cualquier caso,
generalmente es deseable incluir con cada construcción de
biblioteca de ADN al menos un gen de marcador seleccionable para
permitir la selección fácil de organismos huésped que se han
transformado de forma estable. Los genes de marcadores reciclables
tales como URA3, que se pueden seleccionar por o en contra,
son especialmente adecuados.
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Después de la transformación de la cepa huésped
con la biblioteca de ADN, se seleccionan los transformantes que
presentan un fenotipo de glicosilación deseado. La selección se
puede realizar en una etapa única o mediante una serie de etapas de
enriquecimiento y/o agotamiento fenotípico usando cualquiera de una
diversidad de ensayos o procedimientos de detección. La
caracterización fenotípica se puede realizar manualmente o usando
equipo de exploración de alto rendimiento automático. Comúnmente,
un microorganismo huésped presenta N-glicanos de proteína en
la superficie celular, donde se localizan diversas
glicoproteínas.
Por ejemplo, se pueden explorar células que
tengan la concentración más alta de GlcNAc terminal en la superficie
celular o las células que secreten la proteína con el contenido más
alto de GlcNAc terminal. Una exploración de este tipo puede estar
basada en un procedimiento visual, como un procedimiento de tinción,
la capacidad de unir anticuerpos de unión a GlcNAc terminales
específicos o lectinas conjugadas a un marcador (tales lectinas
están disponibles en E.Y. Laboratories Inc., San Mateo, CA), la
capacidad reducida de lectinas específicas de unirse a restos de
manosa terminales, la capacidad de incorporar un azúcar marcado
radiactivamente in vitro, unión alterada a colorantes o
superficies cargadas o se puede conseguir usando un dispositivo de
Separación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) junto con
una lectina o anticuerpo marcado con fluoróforo (Guillen y col.
(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(14):
7888-7892).
Por consiguiente, las células intactas se pueden
explorar para un fenotipo de glicosilación deseado exponiendo las
células a una lectina o anticuerpo que se une específicamente al
N-glicano deseado. Una amplia diversidad de lectinas
específicas de oligosacáridos está disponible en el mercado (por
ejemplo, en EY Laboratories, San Mateo, CA). Como alternativa, los
anticuerpos para N-glicanos humanos o animales específicos
están disponibles en el mercado o se pueden producir utilizando
técnicas convencionales. Una lectina o anticuerpo apropiado se
puede conjugar a una molécula informadora, tal como un cromóforo,
fluoróforo, isótopo radiactivo o una enzima que tenga un sustrato
cromogénico (Guillen y col., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
95(14): 7888-7892).
Después la exploración se puede realizar usando
procedimientos analíticos tales como espectrofotometría,
fluorimetría, separación de células activadas por fluorescencia o
recuento de escintilación. En otros casos, puede ser necesario
analizar glicoproteínas o N-glicanos aislados a partir de
células transformadas. El aislamiento de proteínas se puede
realizar mediante técnicas conocidas en el campo. En una realización
preferida, se secreta una proteína informadora en el medio y se
purifica mediante cromatografía por afinidad (por ejemplo,
cromatografía por afinidad a Ni o a
glutatión-S-transferasa). En los
casos en los que se prefiere un N-glicano aislado, se puede
usar una enzima tal como
endo-\beta-N-acetilglucosaminidasa (Genzyme
Co., Boston, MA; New England Biolabs, Beverly, MA) para escindir
los N-glicanos de las glicoproteínas. Las proteínas o
N-glicanos aislados después se pueden analizar mediante
cromatografía líquida (por ejemplo, HPLC), espectroscopía de masa u
otros medios adecuados. La Patente de los Estados Unidos Nº
5.595.900 muestra varios procedimientos mediante los cuales las
células con estructuras de carbohidrato extracelular deseadas se
pueden identificar. En una realización preferida, se usa
espectrometría de masa de MALDI-TOF para analizar
los N-glicanos escindidos.
Antes de la selección de un transformante
deseado, puede ser deseable agotar la población de células
transformadas que tienen fenotipos indeseados. Por ejemplo, cuando
se usa el procedimiento para modificar por ingeniería genética una
actividad manosidasa funcional en células, los transformantes
deseados tendrán niveles menores de manosa en glicoproteína
celular. La exposición de la población transformada a un isótopo
radiactivo mortal de manosa en el medio agota la población de
transformantes que tienen el fenotipo indeseado, es decir, niveles
elevados de manosa incorporada (Huffaker TC y Robbins PW., Proc Natl
Acad Sci EE.UU. 1983 Dic; 80(24): 7466-70).
Como alternativa, se puede usar una lectina o anticuerpo citotóxico,
dirigido contra un N-glicano indeseable, para agotar una
población transformada de fenotipos indeseados (por ejemplo, Stanley
P y Siminovitch L. Somatic Cell Genet 1977 Jul; 3(4):
391-405). La Patente de Estados Unidos Nº 5.595.900
muestra varios procedimientos en los que las células con unas
estructuras de carbohidrato extracelular deseadas se pueden
identificar. La realización de esta estrategia de forma repetida
permite la modificación por ingeniería genética secuencial de más y
más glicanos complejos en eucariotas inferiores.
Por ejemplo, para detectar células huésped que
tienen en su superficie un grado elevado del intermedio de
N-glicano de tipo humano GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} se
pueden seleccionar transformantes que permiten la transferencia más
eficaz de GlcNAc mediante GlcNAc Transferasa desde
UDP-GlcNAc en un ensayo celular in vitro.
Esta exploración se puede realizar cultivando las células que portan
la biblioteca transformada en presión selectiva en una placa de
agar y transfiriendo colonias individuales a una placa de
microtitulación de 96 pocillos. Después de cultivar las células,
las células se centrifugan, las células se resuspenden en tampón y
después de la adición de UDP-GlcNAc y GnTII, se
determina la liberación de UDP mediante HPLC o un ensayo ligado a
enzima para UDP. Como alternativa, se pueden usar
UDP-GlcNAc y GnTII marcados radiactivamente, lavar
las células y después buscar la liberación de GlcNAc radiactivo
mediante N-actilglucosaminidasa. Todo esto se puede realizar
manualmente o se puede automatizar a través del uso de equipo de
exploración de alto rendimiento. Los transformantes que liberan más
UDP en el primer ensayo o más GlcNAc marcado radiactivamente en el
segundo ensayo se espera que tengan un alto grado de
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} en su superficie y, por tanto,
constituyen el fenotipo deseado. Se pueden adaptar ensayos similares
para buscar también los N-glicanos en proteínas
secretadas.
Como alternativa, se puede usar cualquier otra
exploración adecuada tal como un ensayo de unión a lectina que sea
capaz de revelar patrones de glicosilación alterados en la
superficie de células transformadas. En este caso la unión reducida
de lectinas específicas a manosas terminales puede ser una
herramienta de selección adecuada. Lectina de Galantus
nivalis se une específicamente a \alpha-1,3
manosa terminal, que se espera que esté reducida si existe
suficiente actividad manosidasa II presente en el Golgi. También se
puede aumentar el contenido de transformantes deseados realizando
una etapa de separación cromatográfica que permite la remoción de
células que contienen un contenido de manosa terminal elevado. Esta
etapa de separación se podría realizar con una columna de lectina
que se una específicamente a células con un contenido de manosa
terminal elevado (por ejemplo, lectina de Galantus nivalis
unida a agarosa, Sigma, St. Louis, MO) por encima de aquellas que
tienen un contenido de manosa terminal bajo.
Además, se pueden crear directamente tales
construcciones de proteína de fusión, ya que está disponible en la
bibliografía científica información adicional a cerca de la
localización de enzimas modificadoras de carbohidrato activas en
diferentes huéspedes eucariotas inferiores. Por ejemplo, se conoce
que \beta1,4-GalTr humana se puede fusionar al
dominio de membrana de MNT, una manosiltransferasa de S.
cerevisiae y localizarse en el aparato de Golgi mientras que
conserva su actividad catalítica (Schwientek y col. (1995) J. Biol.
Chem. 270(10): 5483-9). Si el huésped que se
tiene que modificar por ingeniería genética es S. cerevisiae
o un organismo relacionado, se pueden incorporar directamente tales
hallazgos en la estrategia global para obtener N-glicanos
complejos a partir de un huésped de este tipo. Se han identificado
varios de tales fragmentos génicos en P. pastoris que están
relacionados con glicosiltransferasas en S. cerevisiae y, por
tanto, se podrían usar con ese propósito.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de una biblioteca de ADN
combinatoria preferida se ilustra esquemáticamente en la Figura 2 y
se describe en el Ejemplo 4. La construcción de fusión se puede unir
operativamente a muchos vectores, tales como vectores de expresión
bien conocidos en la técnica. Una amplia diversidad de tales
construcciones de fusión se ha ensamblado durante actividades
representativas como se muestra en la Tabla 6. Las combinaciones de
péptidos de dirección/dominios catalíticos se pueden ensamblar para
uso en la dirección de actividades de manosidasa,
glicosiltransferasa y glicosidasa en el RE, Golgi y la red de Golgi
trans de acuerdo con la invención. De forma sorprendente, el
mismo dominio catalítico puede no tener efecto o hasta un efecto muy
profundo en los patrones de N-glicosilación, dependiendo del
tipo de péptido de dirección usado (véase, por ejemplo, Tabla 7,
Ejemplo 4).
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Un ejemplo representativo de una construcción de
fusión de manosidasa obtenida a partir de una biblioteca de ADN
combinatoria de la invención es pFB8, que tiene un péptido de
dirección trucando SEC12(m) de Saccharomyces
(988-1296 nucleótidos de SEC12 de SwissProt
P11655) ligado en fase a una supresión de 187 aminoácidos
N-terminal de una \alpha-manosidasa IA de
ratón (Genbank NA 6678787). Por tanto, la nomenclatura usada en
este documento se refiere a la región de péptido de
dirección/dominio catalítico de una enzima de glicosilación como
SEC 12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187
de ratón. La proteína de fusión codificada se localiza en el RE por
medio de la secuencia de péptido de dirección SEC12 mientras
conserva su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es
capaz de producir N-glicanos in vivo que tienen una
estructura de Man_{3}GlcNAc_{2} (Ejemplo 4; Figuras 6F y
7B).
La construcción de fusión pGC5,
MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de
ratón, es otro ejemplo de una construcción de fusión que tiene
actividad de corte de manosidasa intracelular (Ejemplo 4; Figuras
5D y 8B). La construcción de fusión pBC18-5
(VAN1(s) de Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de
C. elegans) es otro ejemplo de una construcción de fusión
eficaz capaz de producir N-glicanos in vivo que
tienen una estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}. Mediante la creación
de una biblioteca de ADN combinatoria de estas y otras
construcciones de fusión de manosidasa tales de acuerdo con la
invención, un experto puede distinguir y seleccionar aquellas
construcciones que tengan actividad de corte intracelular óptima de
aquellas que tengan actividad relativamente baja o ninguna
actividad. Los procedimientos que usan en bibliotecas de ADN
combinatorias de la invención son provechosos debido a que sólo
unas
pocas construcciones de fusión de manosidasa selectas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.
pocas construcciones de fusión de manosidasa selectas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.
Además, la actividad de corte de manosidasa
puede ser específica para una proteína particular de interés. Por
tanto, se debe apreciar además que no todas las construcciones de
fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de manosidasa
pueden funcionar igualmente bien para producir la glicosilación
apropiada en una glicoproteína de interés. Por consiguiente, una
proteína de interés se puede introducir en una célula huésped
transfectada con una biblioteca de ADN combinatoria para identificar
una o más construcciones de fusión que expresan una actividad
manosidasa óptima para la proteína de interés. Un experto en la
materia será capaz de producir y seleccionar construcción o
construcciones de fusión óptimas usando el enfoque de biblioteca de
ADN combinatoria descrito en este documento.
Además, es evidente que se pueden preparar otras
construcciones de fusión tales que muestran dominios catalíticos de
manosidasa activos localizados (o más generalmente, dominios de
cualquier enzima) usando técnicas tales como las que se han
ilustrado en el Ejemplo 4 y se han descrito en este documento. Será
un asunto de experimentación de rutina para un experto en la
materia preparar y usar la biblioteca de ADN combinatoria de la
presente invención, para optimizar, por ejemplo, la producción de
Man_{5}GlcNAc_{2} a partir de una biblioteca de construcciones
de fusión en un vector de expresión particular introducido en una
célula huésped particular.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar, se preparó una biblioteca de
ADN combinatoria de glicosiltransferasa usando los procedimientos
de la invención. Una biblioteca de ADN combinatoria de secuencias
obtenidas a partir de actividades glicosiltransferasa I (GnTI) se
ensamblaron con péptidos de dirección y se exploraron para la
producción eficaz en una célula huésped eucariota inferior de una
estructura de N-glicano GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en una
glicoproteína marcadora. Se ha identificado una construcción de
fusión, MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humano
(Ejemplo 8) que mostraba que producía GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}
(pPB104). Se ensambló una gran diversidad de tales
construcciones de fusión de GnTI (Ejemplo 8, Tabla 10). Otras
combinaciones de péptido de dirección/dominios catalíticos de GnTI
se pueden ensamblar fácilmente preparando una biblioteca de ADN
combinatoria. También es evidente para un experto en la materia que
otras construcciones de fusión tales que muestran actividad
glicosiltransferasa se pueden preparar como se ha demostrado en el
Ejemplo 8. Será un asunto de experimentación de rutina para un
experto en la materia el uso de un procedimiento de biblioteca de
ADN combinatoria descrito en este documento para optimizar la
producción de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} usando una construcción de
fusión seleccionada en un vector de expresión y una línea de
células huésped particular.
Como se ha indicado anteriormente para las
construcciones de fusión de manosidasa, no todas las construcciones
de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico de GnTI
funcionarán igualmente bien para producir la glicosilación
apropiada en una glicoproteína de interés como se ha descrito en
este documento. Sin embargo, un experto en la materia será capaz de
producir y seleccionar construcción o construcciones de fusión
óptimas usando un enfoque de biblioteca de ADN como se ha descrito
en este documento. El Ejemplo 8 ilustra una realización preferida
de una biblioteca de ADN combinatoria que comprende péptidos de
dirección y construcciones de fusión de domino catalítico de GnTI
implicados en la producción de glicoproteínas con estructura
principalmente de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro ejemplo del uso de los procedimientos y
bibliotecas de la invención para alterar la glicosilación de células
huésped, una cepa de P. pastoris con una supresión de
OCH1 que expresa una proteína informadora (K3) se transformó
con múltiples construcciones de fusión aisladas a partir de
bibliotecas combinatorias de la invención para convertir
N-glicanos con alto contenido en manosa en N-glicanos
similares a humano (Ejemplo 8). En primer lugar, la construcción de
fusión de manosidasa pFB8 (SEC12 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) se transformó
en una cepa de P. pastoris que carecía de actividad 1,6
manosiltransferasa iniciadora (es decir, supresión och 1;
Ejemplo 1). En segundo lugar, se construyó pPB103 que
comprendía un gen MNN2-2 de K. lactis
(Genbank NA AF106080) que codifica un transportador de
UDP-GlcNAc para aumentar la producción adicional de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. La adición del transportador de
UDP-GlcNAc aumentó la producción de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} significativamente en la cepa de P.
pastoris como se ha ilustra en la Figura 10B. En tercer lugar,
pPB104 que comprende MNN9 (s) de Saccharomyces/GnTI
\Delta38 humano se introdujo en la cepa. Esta cepa de P.
pastoris se denomina "PBP-3".
Un experto en la materia aprecia que las células
huésped tales como las cepas de levadura descritas anteriormente se
pueden transformar secuencialmente y/o cotransformar con uno o más
vectores de expresión. También se aprecia que el orden de
transformación no es particularmente relevante en la producción de
la glicoproteína de interés. El experto reconoce que las
modificaciones de rutina de los procedimientos descritos en este
documento pueden proporcionar resultados mejorados en la producción
de la glicoproteína de interés.
La importancia del uso de una secuencia de
péptido de dirección particular con una secuencia de dominio
catalítico particular se hace fácilmente evidente a partir de los
experimentos descritos en este documento. La biblioteca de ADN
combinatoria proporciona una herramienta para construir fusiones de
enzimas que están implicadas en la modificación de
N-glicanos en una glicoproteína de interés, que es
especialmente útil para producir glicoproteínas similares a humano.
(Sin embargo, cualquier fusión de enzima se puede seleccionar usando
bibliotecas y procedimientos de la invención). Los transformantes
deseados que expresan
\alpha-1,2-manosidasa
apropiadamente dirigida y activa producen K3 con N-glicanos
en la estructura Man_{5}GlcNAc_{2} como se muestra en las
Figuras 5D y 5E. Esto confiere una masa molecular reducida al
glicano escindido en comparación con el K3 de la cepa con supresión
OCH1 parental, como se detectó mediante espectrometría de
masa MALDI-TOF en la Figura 5C.
De forma similar, se usó el mismo enfoque para
producir otra glicoproteína secretada: IFN-\beta que
comprendía principalmente Man_{5}GlcNAc_{2}. El
Man_{5}GlcNAc_{2} se retiró mediante digestión con PNGasa
(Papac y col. 1998 Glycobiology 8,445-454) y se
sometió a MALDI-TOF como se muestra en las Figuras
6A-6F. Un pico prominente único en 1254 (m/z)
confirma la producción de Man_{5}GlcNA_{2} en IFN-\beta
en las Figuras 6E (pGC5) (MNS1 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) y 6F
(pFB8) (SEC 12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA
\Delta187 de ratón). Además, en la cepa PBP-3 de
P. pastoris que comprende pFB8 (SEC12 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187), pPB104 (MNN9
(s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humano) y pPB103
(gen MNN2-2 de K. lactis), se detectó
el híbrido N-glicano GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [b] mediante
MALDI-TOF (Figura 10).
Después de identificar los transformantes con un
alto grado de corte de manosa, se realizaron experimentos
adicionales para confirmar que la actividad manosidasa (corte)
ocurría in vivo y que no era principalmente el resultado de
actividad extracelular en el medio de cultivo (Ejemplo 6; Figuras
7-9).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito en la presente solicitud, se
preparó una biblioteca de ADN combinatoria de
\alpha-manosidasa II de Golgi fusionando el
dominio catalítico de varias enzimas manosidasa II a una serie de
señales peptídicas de dirección celulares (Ejemplo 14). Las más de
500 construcciones de fusión combinatorias resultantes se
introdujeron en una cepa de P. pastoris capaz de producir el
precursor humano de la glicosilación compleja,
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} YSH-1 (Ejemplo
17) en la K3 informadora. Sólo un pequeño subgrupo de cepas
(aproximadamente < 5%) fueron capaces de convertir
cuantitativamente GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}. Estas cepas se aislaron y se
transformaron posteriormente con una biblioteca combinatoria de
varios cientos de fusiones GnTII/péptido líder. La exploración para
determinar la presencia de GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}
permitió el aislamiento de cepas que eran capaces de secretar
glicano complejo homogéneo, como se ilustra mediante la cepa
YSH-44 (Ejemplo 19).
Un ejemplo representativo de una construcción de
fusión de \alpha-manosidasa II de Golgi obtenida a
partir de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es
pKD53, que es un péptido de dirección de
MNN2(s) de S. cerevisiae truncado
(1-108 nucleótidos de MNN2 de SwissProt
P38069) ligado en fase a una supresión de 74 aminoácidos
N-terminal de una \alpha-manosidasa II de
Golgi de D. melanogaster (Genbank NA X77652). Por tanto, la
nomenclatura usada en este documento se refiere a la región de
péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de
glicosilación como MNN2(s) de S.
cerevisiae/manosidasa II \Delta74 de D. melanogaster.
La proteína de fusión codificada se localiza en el Golgi por medio
de la secuencia de péptido de dirección de MNN2(s)
mientras que conserva su actividad de dominio catalítico de
manosidasa y es capaz de producir N-glicanos in vivo
que tienen una estructura de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}
predominante (Ejemplo 18).
Otro ejemplo de una construcción de fusión de
\alpha-manosidasa II de Golgi obtenida a partir de
una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pKD1,
que es un péptido de dirección de GLS1 (s) de
Saccharomyces truncado (1-102 nucleótidos de
GLS1 de SwissProt P53008) ligado en fase a una supresión de
74 aminoácidos N-terminal de una
\alpha-manosidasa II de Golgi de D.
melanogaster (Genbank NA X77652). Por tanto, la
nomenclatura usada en este documento se refiere a la región de
péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de
glicosilación como GLS1 (s) de
Saccharomyces/manosidasa II \Delta74 de D.
melanogaster. La proteína de fusión codificada se localiza en
el Golgi por medio de la secuencia de péptido de dirección de
GLS1(s) mientras que conserva su actividad de dominio
catalítico de manosidasa y es capaz de producir in vivo
N-glicanos que tienen una estructura de
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} predominante (Ejemplo 22).
Otro ejemplo de una construcción de fusión de
\alpha-manosidasa II de Golgi obtenida a partir de
una biblioteca de ADN combinatoria de la invención es pKD5,
que un péptido de dirección de MNS1(m) de
Saccharomyces truncado (1-246 nucleótidos de
MNS1 de SwissProt P32906) ligado en fase a una
supresión de 74 aminoácidos N-terminal de una
\alpha-manosidasa II de Golgi de D.
melanogaster (Genbank AN X77652). Por tanto, la
nomenclatura usada en este documento se refiere a la región de
péptido de dirección/dominio catalítico de una enzima de
glicosilación como MNS1(m) de Saccharomyces/manosidasa
II \Delta74 de D. melanogaster. La proteína de fusión
codificada se localiza en el Golgi por medio de la secuencia de
péptido de dirección de MNS1(m) mientras que conserva
su actividad de dominio catalítico de manosidasa y es capaz de
producir in vivo N-glicanos que tienen una estructura de
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} predominante (Ejemplo 23). A diferencia
de la uniformidad de N-glicanos presentes en
YSH-27, la Figura 21 muestra una mezcla
heterogénea de N-glicanos producidos por
YSH-74. Sin embargo, la actividad de corte
aparentemente mediocre de esta enzima manosidasa II indica la
heterogeneidad como adiciones de Man\alpha1,1 como se ha sugerido
en la Figura 23, donde el pico de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}
aparece después de la digestión de YSH-74 con
\alpha-1,2-manosidasa de A.
saitoi. Mediante la creación de una biblioteca de ADN
combinatoria de estas y otras construcciones de fusión de
manosidasa de acuerdo con la invención, un experto puede distinguir
y seleccionar aquellas construcciones que tienen actividad de corte
intracelular óptima de aquellas que tienen actividad relativamente
baja o ninguna actividad. Los procedimientos que usan bibliotecas
de ADN combinatorias de la invención son provechosos debido a que
sólo unas pocas
construcciones de fusión de manosidasa selectas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.
construcciones de fusión de manosidasa selectas pueden producir un N-glicano particularmente deseado in vivo.
Además, la actividad de corte de manosidasa
puede ser específica para una proteína particular de interés. Por
tanto, se ha de apreciar adicionalmente que no todas las
construcciones de fusión de péptido de dirección/dominio catalítico
de manosidasa pueden funcionar igualmente bien para producir la
glicosilación apropiada en una glicoproteína de interés. La Figura
18 no muestra actividad aparente en una YSH-1
de P. pastoris transformada con una construcción de fusión
de \alpha-manosidasa II de Golgi obtenida a partir
de una biblioteca de ADN combinatoria de la invención pKD16,
que son péptidos de dirección de MNN9(m) de
Saccharomyces truncados (1-273 nucleótidos
de MNN9 de SwissProt P39107) ligados en fase a una
supresión de 74 aminoácidos N-terminal de una
\alpha-manosidasa II de Golgi de D.
melanogaster (Genbank NA X77652). Por consiguiente, una proteína
de interés se puede introducir en una célula huésped transformada
con una biblioteca de ADN combinatoria para identificar una o más
construcciones de fusión que expresan una actividad manosidasa
óptima para la proteína de interés. Un experto en la materia será
capaz de producir y seleccionar una construcción o construcciones
de fusión óptimas usando el enfoque de biblioteca de ADN
combinatoria descrito en este documento.
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Aunque la presente invención se ilustra usando
un organismo huésped de P. pastoris, se ha de apreciar por
los expertos en la materia que otras especies de levadura y
huéspedes fúngicos se pueden alterar como se ha descrito en este
documento para producir glicoproteínas similares a humano. Las
técnicas descritas en este documento para identificación y
alteración de genes de glicosilación de célula huésped indeseables,
por ejemplo, OCH1, se entiende que se pueden aplicar para
estos y/u otros genes homólogos o funcionalmente relacionados en
otras cepas de levadura y hongos. Como se ha descrito en el Ejemplo
9, los genes ochl mnnl se suprimieron de K. lactis
para modificar por ingeniería genética una célula huésped
conduciendo a N-glicanos que se convierten completamente en
Man_{5}GlcNAc_{2} por 1,2-manosidasa (Figura
12C).
El gen MNN1 se clonó a partir de K.
lactis como se ha descrito en el Ejemplo 9. El ácido nucleico y
las secuencias de aminoácidos deducidas del gen MNN1 de K.
lactis se muestran en las SEC ID Nº: 16 y 17, respectivamente.
Usando cebadores específicos de genes, se ha preparado una
construcción para suprimir el gen MNN1 del genoma de K.
lactis (Ejemplo 9). Las células huésped agotadas en actividades
de ochl y mnnl producen N-glicanos que tienen
una estructura de Carbohidrato de Man_{9}GlcNAc_{2} (véase, por
ejemplo, la Figura 10). Tales células huésped se pueden modificar
por ingeniería genética adicionalmente usando, por ejemplo,
procedimientos y bibliotecas de la invención, para producir
glicoproteínas similares a humano o mamífero.
Se describe una molécula de ácido nucleico
aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende o
está constituida por al menos cuarenta y cinco, preferiblemente al
menos 50, más preferiblemente al menos 60 y más preferiblemente 75
o más restos de nucleótidos del gen MNN1 de K. lactis
(SEC ID Nº: 16) y homólogos, variantes y derivados de la misma. La
solicitud también describe moléculas de ácido nucleico que se
hibridan en condiciones rigurosas a las moléculas de ácido nucleico
descritas anteriormente. De forma similar, se proporcionan los
polipéptidos aislados (incluyendo muteínas, variantes alélicas,
fragmentos, derivados y análogos) codificados por las moléculas de
ácido nucleico de la invención. Además, también se proporcionan
vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden una
molécula de ácido nucleico de la invención, como se ha descrito
adicionalmente en este documento. De forma similar, se proporcionan
las células huésped transformadas con las moléculas de ácido
nucleico o vectores de la invención.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere a una cepa huésped eucariota no humana que expresa
glicoproteínas que comprenden N-glicanos modificados que se
parecen a aquellos preparados por células humanas. Se contempla que
se puede usar una biblioteca de ácido nucleico combinatoria como se
ha descrito en este documento anteriormente para seleccionar
construcciones que modifiquen la ruta de glicosilación en cualquier
sistema de célula huésped eucariota. Por ejemplo, las bibliotecas
combinatorias como se han descrito anteriormente también se pueden
usar en plantas, algas e insectos y en otras células huésped
eucariotas incluyendo células de mamíferos y humanas, para
localizar proteínas, incluyendo enzimas de glicosilación o dominios
catalíticos de las mismas, en un emplazamiento deseado a lo largo
de una ruta secretora de una célula huésped. Preferiblemente, las
enzimas de glicosilación o dominios catalíticos y similares se
dirigen a un emplazamiento subcelular a lo largo de la ruta
secretora de la célula huésped donde las mismas son capaces de
funcionar y, preferiblemente, donde las mismas se diseñan o
seleccionan para que funcionen más eficazmente.
Las células huésped preferidas de la presenten
invención incluyen Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia
trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia
opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia
guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia
sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula
polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida
albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp.,
Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora
crassa.
Además se describe que las células de plantas e
insectos también se pueden modificar por ingeniería genética para
alterar la glicosilación de proteínas expresadas usando la
biblioteca combinatoria y los procedimientos de la solicitud. Se
describe adicionalmente que la glicosilación en células de mamífero,
incluyendo células humanas, también se puede modificar usando la
biblioteca combinatoria y los procedimientos de la solicitud. Por
ejemplo, se describe para optimizar una actividad enzimática
particular o modificar de otra manera las proporciones relativas de
diversos N-glicanos preparados en una célula huésped de
mamífero usando la biblioteca combinatoria y los procedimientos de
la invención.
Los ejemplos de modificaciones a la
glicosilación que se pueden afectar usando un procedimiento de
acuerdo con esta realización de la invención son: (1) modificación
por ingeniería genética de una célula huésped eucariota para cortar
restos de manosa de Man_{8}GlcNAc_{2} para producir un
N-glicano de Man_{5}GlcNAc_{2}; (2) modificación por
ingeniería genética de una célula huésped eucariota para añadir un
resto de N-acetilglucosamina (GleNAc) a
Man_{5}GlcNAc_{2} mediante la acción de GleNAc transferasa I;
(3) modificación por ingeniería genética de una célula huésped
eucariota para que exprese funcionalmente una enzima tal como una
N-acetilglucosaminil Transferasa (GnTI, GnTII, GnTIII,
GnTIV, GnTV, GnTVI), manosidasa II, fucosiltransferasa (FT),
galactosiltranferasa (GalT) o una sialiltransferasa (ST).
Mediante la repetición del procedimiento, se
pueden modificar por ingeniería genética rutas de glicosilación
cada vez más complejas en un huésped diana, tal como un
microorganismo eucariota inferior. En una realización preferida, el
organismo huésped se transforma dos o más veces con bibliotecas de
ADN incluyendo secuencias que codifican actividades de
glicosilación. La selección de fenotipos deseados se puede realizar
después de cada ciclo de transformación o, como alternativa,
después de que varias transformaciones han ocurrido. Las rutas de
glicosilación complejas se pueden modificar por ingeniería genética
rápidamente de esta manera.
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En una realización preferida, tales bibliotecas
de péptido de dirección/dominio catalítico se diseñan para
incorporar información existente sobre la naturaleza secuencial de
las reacciones de glicosilación en eucariotas superiores. Las
reacciones que se conoce que ocurren temprano en el transcurso del
procesamiento de glicoproteína requieren la dirección de enzimas
que catalizan tales reacciones a una parte temprana del Golgi o el
RE. Por ejemplo, el corte de Man_{8}GlcNAc_{2} a
Man_{5}GlcNAc_{2} mediante manosidasas es una etapa temprana en
la formación de N-glicano complejo. Debido a que el
procesamiento de proteínas se inicia en el RE y después avanza a
través del Golgi temprano, medio y tardío, es deseable que esta
reacción ocurra en el RE o Golgi temprano. Cuando se diseña una
biblioteca para localización de manosidasa I, por ejemplo, se puede
intentar que coincidan señales de dirección de RE y Golgi temprano
con el dominio catalítico de manosidasa I.
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Como un objetivo final de este esfuerzo de
modificación por ingeniería genética está una cepa de producción de
proteína sólida que sea capaz de funcionar bien en un procedimiento
de fermentación industrial, la integración de múltiples genes en el
cromosoma del huésped (por ejemplo, hongo) preferiblemente implica
una planificación cuidadosa. La cepa modificada por ingeniería
genética probablemente puede tener que transformarse con una
variedad de genes diferentes y estos genes tendrán que transformarse
de una manera estable para asegurar que la actividad deseada se
mantenga a través del procedimiento de fermentación. Como se ha
descrito en este documento, cualquier combinación de diversas
actividades enzimáticas deseadas se pueden modificar por ingeniería
genética en el huésped de expresión de proteína fúngico, por
ejemplo, sialiltransferasa, manosidasa, fucosiltransferasa,
galactosiltransferasa, glicosiltransferasa, GlcNAc transferasa,
transportadores específicos de RE y Golgi (por ejemplo,
transportadores simportador y antiportador para
UDP-galactosa y otros precursores), otras enzimas
implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas
implicadas en la síntesis de precursores de oligosacárido activados
tales como UDP-galactosa y ácido
CMP-N-acetilneuramínico. Los
ejemplos de los procedimientos preferidos para modificar la
glicosilación en una célula huésped eucariota inferior, tal como
Pichia Pastoris, se muestran en la Tabla 6.
Como cualquier estrategia para modificar por
ingeniería genética la formación de N-glicanos complejos en
una célula huésped tal como un eucariota inferior implica tanto la
eliminación como la adición de actividades glicosiltransferasa
particulares, un esquema completo intentará coordinar ambos
requerimientos. Los genes que codifican enzimas que son indeseables
sirven como sitios de integración potencial para genes que son
deseables. Por ejemplo, la actividad de 1,6 manosiltransferasa es
un sello de glicosilación en muchos eucariotas inferiores
conocidos. El gen que codifica alfa-1,6
manosiltransferasa (OCH1) se ha clonado a partir de S.
cerevisiae y las mutaciones en el gen dan origen a un fenotipo
viable con manosilación reducida. El locus génico que codifica la
actividad de alfa-1,6 manosiltransferasa es, por lo
tanto, una diana principal para la integración de genes que
codifican actividad glicosiltransferasa. De una manera similar, se
puede elegir una variedad de otros sitios de integración
cromosómicos que, basándose en un acontecimiento de alteración
génica en ese locus, se espera que: (1) mejoren la capacidad de las
células de glicosilar de una manera más de tipo humano, (2) mejoren
la capacidad de la célula de secretar proteínas, (3) reduzcan la
proteólisis de proteínas extrañas y (4) mejoren otras
características del procedimiento que faciliten la purificación o el
propio procedimiento de fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos descritos en este documento
son útiles para producir glicoproteínas, especialmente
glicoproteínas usadas terapéuticamente en seres humanos. Las
glicoproteínas que tienen glicoformas específicas pueden ser
especialmente útiles, por ejemplo, en la dirección de proteínas
terapéuticas. Por ejemplo,
manosa-6-fosfato ha demostrado
dirigir las proteínas al lisosoma, lo que puede ser básico para la
función apropiada de varias enzimas relacionadas con trastornos de
almacenamiento lisosomal tales como enfermedad de Gaucher, de
Hunter, de Hurler, de Scheie, de Fabry y de
Tay-Sachs, para mencionar sólo unos pocos.
Análogamente, la adición de uno o más restos de ácido siálico a la
cadena lateral de glicano puede aumentar la vida de una
glicoproteína terapéutica in vivo después de la
administración. Por consiguiente, las células huésped (por ejemplo,
eucariotas inferiores o mamífero) se pueden modificar genéticamente
para aumentar el alcance de ácido siálico terminal en
glicoproteínas expresadas en las células. Como alternativa, el ácido
siálico se puede conjugar a la proteína de interés in vivo
antes de la administración usando una transferasa de ácido siálico y
un sustrato apropiado. Los cambios en la composición del medio de
cultivo se pueden emplear además de la expresión de las actividades
enzimáticas implicadas en glicosilación de tipo humano para producir
glicoproteínas que se parezcan más a formas humanas (Weikert y col.
(1999) Nature Biotechnology 17, 1116-1121; Werner y
col. (1998) Arzneimittelforschung 48(8):
870-880; Andersen y Goochee (1994) Cur. Opin.
Biotechnol. 5: 546-549; Yang y Butler (2000)
Biotechnol.Bioengin. 68(4): 370-380). Las
modificaciones de glicano específicas a anticuerpos monoclonales
(por ejemplo, la adición de un GlcNAc bisecante) han demostrado
mejorar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (Umana y
col. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2): 176-80),
que puede ser deseable para la producción de anticuerpos u otras
proteínas terapéuticas.
Las proteínas terapéuticas típicamente se
administran mediante inyección, por vía oral o por vía pulmonar u
otros medios. Los ejemplos de glicoproteínas diana adecuadas que se
pueden producir de acuerdo con la invención incluyen, sin
limitación: eritropoyetina, citoquinas tales como
interferón-\alpha,
interferón-\beta,
interferón-\gamma,
interferón-\omega y CSF de granulocitos, factores
de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C
humana, cadena \alpha de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos
de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa e inhibidor de
tripsina urea, proteína de unión a IgF, factor de crecimiento
epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento,
proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de crecimiento
endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores mieloides
1, osteoprotegerina, \alpha-1 antitripsina, ADNasa
II, \alpha-fetoproteínas, AAT,
rhTBP-1 (onercept, proteína de unión a TNF aka 1),
TACI-lg (activador transmembrana y modulador de
calcio e interactor de ligando de ciclofilina), FSH (hormona
estimulante de folículos), GM-CSF,
GLP-1 con y sin FC (proteína similar a glucagón 1),
agonistas del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel,
fusión Fc de receptor TNF soluble aka), ATIII, Trombina rh,
glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (Ig de Antígeno 4
asociado con Linfocito T Citotóxico).
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional de la invención, los
glicanos recién formados producidos mediante la enzima
\alpha-manosidasa II de Golgi son sustratos para
reacciones de glicosilación posteriores. En una realización, GnT II,
UDP-GlcNAc y opcionalmente el transportador de
UDP-GlcNAc protegen la rama Man\alpha1,6 recién
formada del oligosacárido producido en P. pastoris
YSH-37 con un GlcNAc para formar
GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} (Ejemplo 19). En otra
realización, otras GnT (por ejemplo, GnT III, GnT IV, GnT V)
reaccionan ante el sustrato transitorio
GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}. Este sustrato, a su vez, se
vuelve un sustrato para galactosiltransferasas (Ejemplo 25) y el
procesamiento adicional ocurre con sialiltransferasas.
Los siguientes son ejemplos que ilustran las
composiciones y procedimientos de esta invención. Estos ejemplos no
se deben interpretar como limitantes: los ejemplos se incluyen sólo
con propósitos de ilustración.
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Una ORF de 1215 pb del gen OCH1 de P.
pastoris que codifica una \alpha-1,6
manosiltransferasa supuesta se amplificó a partir de ADN genómico
de P. pastoris (cepa X-33, Invitrogen,
Carlsbad, CA) usando los oligonucleótidos
5'-ATGGCGAAGGCAGATGGCAGT-3' (SEC ID
Nº: 18) y
5'-TTAGTCCTTCCAACTTCCTTC-3' (SEC ID
Nº: 19) que se diseñaron basándose en la secuencia de OCH1
de P. pastoris (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa
Nº 8-336387). Posteriormente, se amplificaron 2685
pb cadena arriba y 1175 pb cadena debajo de la ORF del gen
OCH1 a partir de una biblioteca de ADN genómico de P.
pastoris (Boehm, T. y col. Yeast 1999 Mayo; 15(7):
563-72) usando los oligonucleótidos internos
5'-ACTGCCATCTGCCTTCGCCAT-3' (SEC ID
Nº: 20) en el gen OCH1 y oligonucleótidos
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' T7 (SEC
ID Nº: 21) y
5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' T3 (SEC
ID Nº: 22) en la estructura principal de la biblioteca que porta el
plásmido lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). El fragmento de
5075 pb resultante se clonó en el vector pCR2.1-TOPO
(Invitrogen, Carlsbad, CA) y se denominó pBK9.
Después de ensamblar una construcción con
eliminación génica que sustituía la fase de lectura de OCH1
con un gen de resistencia HIS4, P. pastoris se transformó y
las colonias se exploraron para determinar la sensibilidad de
temperatura a 37ºC. Los mutantes de OCH1 de S.
cerevisiae son sensibles a la temperatura y crecen lentamente a
temperaturas elevadas. Por tanto, se pueden identificar homólogos
funcionales de OCH1 en P. pastoris complementando un
mutante de OCH1 de S. cerevisiae con un ADN o
biblioteca de ADNc de P. pastoris. Aproximadamente 20 cepas
sensibles a la temperatura se sometieron adicionalmente a
exploración por PCR de colonia para identificar colonias con un gen
och1 suprimido. Se obtuvieron varias supresiones de
och1.
El pBK9.1 linealizado, que tiene una secuencia
cadena arriba de 2,1 kb y una secuencia cadena abajo de 1,5 kb de
un casete de gen de OCH1 que porta el gen HIS4 de
Pichia, se transformó en BK1 de P. pastoris [GS115
(his4 Invitrogen Corp., San Diego, CA) que portaba el gen
IFN-\beta humano en el locus AOX1] para
eliminar el gen OCH1 de tipo silvestre. La exploración
inicial de los transformantes se realizó usando medio con histidina
retirada seguido por réplica en placas para seleccionar las colonias
sensibles a temperatura. Veinte de doscientas colonias positivas a
histidina mostraron un fenotipo sensible a temperatura a 37ºC. Para
excluir la integración aleatoria de pBK9.1 en el genoma de
Pichia, los 20 aislados sensibles a temperatura se
sometieron a PCR de colonia utilizando cebadores específicos para la
secuencia cadena arriba del sitio de integración y para ORF de
HIS4. Dos de veinte colonias no tenían och1 y se
analizaron adicionalmente usando una transferencia de Southern y
una transferencia de Western indicando la alteración de och1
funcional mediante la construcción sin och1. Los ADN
genómicos se digirieron usando dos enzimas de restricción separadas
BglII y ClaI para confirmar la eliminación de
och1 y para confirmar la integración en la fase de lectura
abierta. La transferencia de Western mostró mutantes de och1
que carecían de una banda específica producida en el GS 115 de tipo
silvestre a 46,2 kDa.
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Se requiere una
\alpha-1,2-manosidasa para el
corte de Man_{8}GlcNAc_{2} para producir Man_{5}GleNAc_{2},
un intermedio esencial para la formación de N-glicano
complejo. Mientras la producción de un precursor de
Man_{5}GlcNAc_{2} es esencial, no es necesariamente suficiente
para la producción de glicanos híbridos y complejos debido a que el
isómero específico de Man_{5}GlcNAc_{2} puede o no ser un
sustrato para GnTI. Un mutante de och1 de P. pastoris
se modifica por ingeniería genética para expresar
interferón-\beta humano secretado bajo el control
de un promotor aox. Se construye una biblioteca de ADN
mediante el ligamiento en fase del dominio catalítico de manosidasa
IB humana (una
\alpha-1,2-manosidasa) con una
sub-biblioteca que incluye secuencias que codifican
péptidos de localización de Golgi temprano y RE. Después, el
organismo huésped se transforma con la biblioteca de ADN, dando
como resultado una población genéticamente mixta en la que cada uno
de los transformantes individuales expresa
interferón-\beta así como un gen de manosidasa
sintético a partir de la biblioteca. Las colonias transformantes
individuales se cultivan y la producción de interferón se induce
mediante la adición de metanol. En estas condiciones, más del 90% de
la proteína secretada es interferón-\beta
glicosilado.
Los sobrenadantes se purifican para retirar
sales y contaminantes de peso molecular bajo mediante cromatografía
en fase inversa de H_{18} sílice. Los transformantes deseados que
expresan \alpha-1,2-manosidasa
activa dirigida apropiadamente producen
interferón-\beta incluyendo N-glicanos de
la estructura Man_{5}GlcNAc_{2}, que tiene una masa molecular
reducida en comparación con el interferón-\beta de
la cepa parental. El interferón-\beta purificado
se analiza mediante espectroscopía de masa MALDI-TOF
y las colonias que expresan la forma deseada de
interferón-\beta se identifican.
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La fase de lectura abierta de 1215 pb del gen
OCH1 de P. pastoris así como 2685 pb cadena arriba y
1175 pb cadena abajo se amplificaron por PCR (véase también el
documento WO 02/00879), se clonaron en el vector
pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se denominó pBK9. Para
crear una cepa sin och1 que contenga múltiples marcadores
auxótrofos, 100 \mug de pJN329, un plásmido que contiene un alelo
mutante och1::URA3 flanqueado con sitios de restricción
Sfil se digirió con Sfil y se usó para transformar la
cepa JC308 de P. pastoris (Cereghino y col. Gene 263 (2001)
159-169) mediante electroporación. A continuación de
la incubación en medio definido sin uracilo durante 10 días a
temperatura ambiente, 1000 colonias se escogieron y se volvieron a
sembrar en estrías. Los clones URA^{+} que no eran capaces de
crecer a 37º, pero que crecieron a temperatura ambiente se
sometieron a PCR de colonia para ensayar la integración correcta del
alelo mutante och1::URA3. Un clon que mostraba el patrón de
PCR esperado se denominó YJN153. El dominio Kringle 3 de
plasminógeno humano (K3) se usó como una proteína modelo. Un
plásmido marcado con Neo^{R} que contenía el gen K3 se transformó
en la cepa YJN153 y una cepa resultante, que expresaba K3, se
denominó
BK64-1.
BK64-1.
El plásmido pPB103, que contenía el gen
MNN2-2 de Kluyveromyces lactis que
codifica un transportador de UDP-N-acetilglucosamina de
Golgi se construyó clonando un fragmento romo de
BglII-HindIII a partir del vector pDL02 (Abeijon y
col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:
5963-5968) en pBLADE-SX digerido
con BglII y BamHI y con extremos romos que contenía el
gen ADE1 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene
263: 159-169). Este plásmido se linealizó con
EcoNI y se transformó en la cepa BK64-1
mediante electroporación y una cepa que se confirmó que contenía el
MNN2-2 mediante análisis de PCR se denominó
PBP1.
Se generó una biblioteca de construcciones de
manosidasa, que comprendía fusiones en fase de los dominios líder
de varias proteínas de membrana de tipo I o tipo II de S.
cerevisiae y P. pastoris fusionadas con dominios
catalíticos de varios genes de
\alpha-1,2-manosidasa de fuentes
humanas, de ratón, de mosca, de oruga y de levadura (véase, por
ejemplo, el documento WO02/00879, incorporado en este documento como
referencia). Esta biblioteca se creó en un vector de integración
HIS4 de P. pastoris y se exploró linealizando con
SalI, transformando mediante electroporación en la cepa PBP1
y analizando los glicanos liberados a partir de la proteína
informadora K3. Una construcción activa escogida era una quimera de
los nucleótidos 988-1296 (extremo C) del gen
SEC12 de levadura fusionado con una supresión
N-terminal del gen de
\alpha-1,2-manosidasa IA de ratón
(Figura 3), al que le faltaban los 187 nucleótidos. Una cepa de
P. pastoris que expresa esta construcción se denominó
PBP2.
Se generó una biblioteca de construcciones de
GnTI, que comprendía fusiones en fase de la misma biblioteca líder
con los dominios catalíticos de genes de GnTI a partir de fuentes
humanas, de orugas, de rana y de mosca (documento WO 02/00879).
Esta biblioteca se creó en un vector de integración ARG4 de
P. pastoris y se exploró linealizando con AatII,
transformando mediante electroporación en la cepa PBP2 y analizando
los glicanos liberados a partir de K3. Una construcción activa
escogida fue una quimera de los primeros 120 pb del gen
NFNN9 de S. cerevisiae fusionado a una supresión del
gen de GnTI humana, al que le faltaban los primeros 154 pb. Una cepa
de P. pastoris que expresaba esta construcción se denominó
PBP3.
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Un mutante de och1 de P. pastoris
(véanse los Ejemplos 1 y 3) se modificó por ingeniería genética
para expresar y secretar proteínas tales como el dominio kringle 3
de plasminógeno humano (K3) bajo el control del promotor inducible
AOX1. El dominio Kringle 3 de plasminógeno humano (K3) se usó
como una proteína modelo. Un fragmento de ADN que codifica el K3 se
amplificó usando polimerasa Pfu turbo (Strategene, La Jolla, CA) y
se clonó en los sitios EcoRI y XbaI de pPICZ\alphaA
(Invitrogen, Carlsbad, CA), dando como resultado una etiqueta 6 His
C-terminal. Para mejorar la eficacia de
glicosilación enlazada a N de K3 (Hayes y col. 1975 J. Arch.
Biochem. Biophys. 171, 651-655), Pro_{46} se
reemplazó con Ser_{46} usando mutagénesis dirigida. El plásmido
resultante se denominó pBK64. La secuencia correcta de la
construcción de PCR se confirmó mediante secuenciación de ADN.
Se construyó una biblioteca de ADN combinatoria
mediante el ligamiento en fase de dominios catalíticos de
\alpha-1,2-manosidasa IB (Genbank
NA 6678787) e IA (Genbank NA 6754619) murinas con una
sub-biblioteca que incluía secuencias que
codificaban los péptidos de localización de vesícula, RE y de Golgi
temprano Cop II de acuerdo con la Tabla 6. La biblioteca de ADN
combinada se usó para generar construcciones de fusión individuales,
que después se transformaron en el organismo huésped que expresaba
K3, dando como resultado una población genéticamente mixta en la
que cada uno de los transformantes individuales expresa K3 así como
un gen de fusión de señal de localización/manosidasa a partir de la
biblioteca. Los transformantes individuales se cultivaron y la
producción de K3 se indujo mediante transferencia a un medio que
contenía metanol. En estas condiciones, después de 24 horas de
inducción, más del 90% de la proteína en el medio era K3. La
proteína informadora K3 se purificó a partir del sobrenadante para
retirar las sales y los contaminantes de bajo peso molecular
mediante cromatografía de afinidad a Ni. A continuación de la
purificación por afinidad, la proteína se desaló mediante
cromatografía de exclusión por tamaño en una resina Sephadex G10
(Sigma, St. Louis, MO) y se sometió directamente a análisis de
MALDI-TOF descrito más adelante o los
N-glicanos se retiraron mediante digestión con PNGasa como
se ha descrito más adelante (Liberación de N-glicanos) y se
sometió a análisis de MALDI-TOF Miele y col. 1997
Biotechnol. Appl. Biochem. 25, 151-157.
A continuación de este enfoque, se obtuvo un
conjunto diverso de transformantes; algunos no mostraron
modificación de los N-glicanos en comparación con la cepa
sin och1 y otros mostraron un grado alto de corte de manosa
(Figuras 5d y 5E). Los transformantes deseados que expresan
\alpha-1,2-manosidasa activa
dirigida apropiadamente produjeron K3 con N-glicanos de la
estructura Man_{5}GlcNAc_{2}. Esto confiere una masa molecular
reducida a la glicoproteína en comparación con la K3 de la cepa con
supresión och1 parental, una diferencia que se detectaba
fácilmente mediante espectrometría de masa MALDI-TOF
(Figura 5). La Tabla 7 indica los niveles de producción de
Man_{5}GlcNAc_{2} relativos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los péptidos de dirección se seleccionaron entre
MNS I (SwissProt P32906) en S. cerevisiae (largo,
medio y corto) (véase, anteriormente, Bibliotecas de Ácidos
Nucleicos; Biblioteca de ADN Combinatoria para Construcciones de
Fusión) y SEC12 (SwissProt P11655) en S. cerevisiae
(988-1140 nucleótidos: corto) y
(988-1296: medio). Aunque la mayoría de las
secuencias de péptido de dirección eran supresiones
N-terminal, algunas secuencias de péptidos de
dirección, tales como SEC12, eran supresiones
C-terminal. Los dominios catalíticos usados en este
experimento se seleccionaron entre manosidasa 1A de ratón con una
supresión N-terminal de 187 aminoácidos y
manosidasa 1B de ratón con una supresión de 58, 99 y 170
aminoácidos. El número de (+), como se usa en este documento,
indica los niveles relativos de producción de Man_{5}GlcNAc_{2}.
El símbolo (-) indica que no hay producción aparente de
Man_{5}GlcNAc_{2}, el símbolo (+) indica menos del 10% de
producción de Ma_{n}sGlcNAc_{2}. El símbolo (++) indica una
producción de aproximadamente el 10-20% de
Man_{5}GlcNAc_{2}. El símbolo (+++) indica una producción de
aproximadamente el 20-40% de Man_{5}GlcNAc_{2}.
El símbolo con (++++) indica una producción de aproximadamente el
50% de Man_{5}GlcNAc_{2}. El símbolo con (+++++) indica una
producción mayor del 50% de Man_{5}GlcNAc_{2}.
La Tabla 9 muestra las cantidades relativas de
Man_{5}GlcNAc_{2} detectadas en una glicoproteína informadora
K3 secretada. Se generaron seiscientas ocho (608) cepas diferentes
de P. pastoris (\Deltaoch1) transformando cada una
con una construcción única a partir de una biblioteca genética
combinatoria que se había generado fusionando diecinueve (19)
dominios catalíticos de
\alpha-1,2-manosidasa a treinta y
dos (32) líderes de RE fúngicos y de Golgi cis.
La Tabla 7 muestra dos construcciones
pFB8 y pGC5, entre otras, que posibilitan que una
célula huésped transformada elabore glicoproteína K3 que presenta
Man_{5}GlcNAc_{2}. La Tabla 8 muestra una construcción más
preferida, pBC18-5, una secuencia de péptido
de dirección VAN1 (s) de S. cerevisiae (de SwissProt
23642) ligada en fase a una manosidasa IB de C. elegans
(Genbank NA CAA98114) con una supresión N-terminal
de 80 aminoácidos (Van1 (s) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans).
Esta construcción de fusión también produce una estructura de
Man_{5}GlcNAc_{2} predominante, como se muestra en la Figura 5E.
Esta construcción de fusión de manosidasa demostró producir más del
50% de Man_{5}GlcNAc_{2} (+++++).
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La generación de una biblioteca de ADN
combinatoria de dominios catalíticos de
\alpha-1,2-manosidasa fusionada a
péptidos de dirección necesitó la amplificación de dominios de
manosidasa con diversas longitudes de supresiones N-terminal
a partir de varios organismos. Para conseguir este objetivo, las
fases de lectura abiertas de longitud completa (ORF) de
\alpha-1,2-manosidasas se
amplificaron por PCR a partir de ADNc o ADN genómico obtenido a
partir de las siguientes fuentes: Homo sapiens, Mus musculus,
Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Aspergillus
nidulans y Penicillium citrinum. En cada caso, el ADN se
incubó en presencia de cebadores de oligonucleótidos específicos
para la secuencia de manosidasa deseada además de reactivos
necesarios para realizar la reacción de PCR. Por ejemplo, para
amplificar la ORF de la
\alpha-1,2-manosidasa IA de M.
musculus, el cebador
5'-ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC (SEC ID Nº: 23) y el cebador 3'-TCATTTCTCTTTG
CCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEC ID Nº: 24) se incubaron en presencia de ADN polimerasa PfU (Stratagene, La Jolla, CA) y se amplificaron en las condiciones recomendadas por Stratagene usando los parámetros de ciclación: 94ºC durante 1 min (1 ciclo); 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 3 min (30 ciclos). A continuación de la amplificación la secuencia de ADN que codifica la ORF se incubó a 72ºC durante 5 min con 1 U de Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, Wl) antes del ligamiento en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformó en E. coli químicamente competente TOP10, como recomendó Invitrogen. El producto de PCR clonado se confirmó mediante secuenciación ABI usando cebadores específicos para la ORF de manosidasa.
5'-ATGCCCGTGGGGGGCCTGTTGCCGCTCTTCAGTAGC (SEC ID Nº: 23) y el cebador 3'-TCATTTCTCTTTG
CCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG (SEC ID Nº: 24) se incubaron en presencia de ADN polimerasa PfU (Stratagene, La Jolla, CA) y se amplificaron en las condiciones recomendadas por Stratagene usando los parámetros de ciclación: 94ºC durante 1 min (1 ciclo); 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 3 min (30 ciclos). A continuación de la amplificación la secuencia de ADN que codifica la ORF se incubó a 72ºC durante 5 min con 1 U de Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, Wl) antes del ligamiento en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformó en E. coli químicamente competente TOP10, como recomendó Invitrogen. El producto de PCR clonado se confirmó mediante secuenciación ABI usando cebadores específicos para la ORF de manosidasa.
Para generar los truncamientos
N-terminales deseados de cada manosidasa, la ORF
completa de cada manosidasa se usó como el molde en un ciclo
posterior de reacciones de PCR en las que la posición de hibridación
del cebador 5' era específica para el extremo 5' del truncamiento
deseado y el cebador 3' permaneció específico para el extremo 3'
original de la ORF. Para facilitar la subclonación del fragmento de
manosidasa truncado en el vector de expresión de levadura, los
sitios de restricción AscI y PacI de pJN347 (Figura
2C) se modificaron por ingeniería genética en cada producto de
truncamiento, en los extremos 5' y 3' respectivamente. El número y
posición de los truncamientos N-terminales generados
para cada ORF de manosidasa dependían de la posición de la región
transmembrana (TM) en relación con el dominio catalítico (DC). Por
ejemplo, si la región de tronco localizada entre la TM y la DC era
menor de 150 pb, entonces sólo se generó un truncamiento para esa
proteína. Sin embargo, si la región de tronco era más larga que 150
pb entonces se generaron uno o dos truncamientos más dependiendo de
la longitud de la región de tronco.
Un ejemplo de cómo se generaron los
truncamientos para la manosidasa IA de M. musculus (Genbank
NA 6678787) se describe en este documento, usándose un enfoque
similar para las otras manosidasas. La Figura 3 ilustra la ORF de
la \alpha-1,2-manosidasa IA de
M. musculus estando los dominios transmembrana y catalíticos
pronosticados destacados en negritas. Basándose en esta estructura,
se diseñaron tres cebadores 5' (posiciones de hibridación
subrayadas en la Figura 3) para generar las supresiones
N-terminales \Delta65-, \Delta105- y
\Delta187-. Usando la supresión N-terminal
\Delta65 como un ejemplo el cebador 5' usando fue
GGCGCGCCGACTCCTCCAAGCTGCTCAGCGGGGTCCTGTTCC
AC-3' (SEC ID Nº: 25) (con el sitio de restricción AscI destacado en negrita) junto con el cebador 3' 5'-CCTTAATTA
ATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEC ID Nº: 26) (con el sitio de restricción PacI destacado en negrita). Ambos de estos cebadores se usaron para amplificar un fragmento de 1561 pb en las condiciones indicadas anteriormente para amplificar la ORF de manosidasa IA de M. musculus de longitud completa. Además, al igual que el producto obtenido para la ORF de longitud completa, el producto truncado también se incubó con Taq ADN polimerasa, se ligó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), se transformó en TOP10 y se secuenció por ABI. Después de haber amplificado y confirmado la secuencia del fragmento de manosidasa truncado, el plásmido resultante, pCR2.1-A65mMannIA, se digirió con AscI y PacI en tampón Nº 4 de New England Biolabs (Beverly, MA) durante 16 h a 37ºC. Paralelamente, pJN347 (Figura 2C) se digirió con las mismas enzimas y se incubó como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión, tanto la estructura principal de pJN347 (Figura 2C) como el dominio catalítico truncado se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit Quick Ligation (New England Biolabs, Beverly, MA), como lo recomendaron los fabricantes y se transformó en células DH5\alpha químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usó PCR de colonia para confirmar la generación de la construcción pJN347-Manosidasa IA\Delta65 de ratón.
AC-3' (SEC ID Nº: 25) (con el sitio de restricción AscI destacado en negrita) junto con el cebador 3' 5'-CCTTAATTA
ATCATTTCTCTTTGCCATCAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEC ID Nº: 26) (con el sitio de restricción PacI destacado en negrita). Ambos de estos cebadores se usaron para amplificar un fragmento de 1561 pb en las condiciones indicadas anteriormente para amplificar la ORF de manosidasa IA de M. musculus de longitud completa. Además, al igual que el producto obtenido para la ORF de longitud completa, el producto truncado también se incubó con Taq ADN polimerasa, se ligó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), se transformó en TOP10 y se secuenció por ABI. Después de haber amplificado y confirmado la secuencia del fragmento de manosidasa truncado, el plásmido resultante, pCR2.1-A65mMannIA, se digirió con AscI y PacI en tampón Nº 4 de New England Biolabs (Beverly, MA) durante 16 h a 37ºC. Paralelamente, pJN347 (Figura 2C) se digirió con las mismas enzimas y se incubó como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión, tanto la estructura principal de pJN347 (Figura 2C) como el dominio catalítico truncado se extrajeron en gel y se ligaron usando el Kit Quick Ligation (New England Biolabs, Beverly, MA), como lo recomendaron los fabricantes y se transformó en células DH5\alpha químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usó PCR de colonia para confirmar la generación de la construcción pJN347-Manosidasa IA\Delta65 de ratón.
Habiendo generado una biblioteca de dominios
catalíticos de
\alpha-1,2-manosidasa truncada en
el vector de expresión de levadura pJN347 (Figura 2C) la etapa
restante para generar la biblioteca de péptido de dirección/dominio
catalítico era clonar en fase las secuencias de péptido de dirección
(Figura 2). Tanto las construcciones de
pJN347-manosidasa (Figura 2D) como las
construcciones de pCR2.1TOPO-péptido de dirección
(Figura 2B) se incubaron durante una noche a 37ºC en tampón Nº 4 de
New England Biolabs en presencia de las enzimas de restricción
NotI y AscI. A continuación de la digestión, tanto la
estructura principal de pJN347-manosidasa como las
regiones de péptidos de dirección se extrajeron en gel y se ligaron
usando el Kit Quick Ligation (New England Biolabs, Beverly, MA),
como lo recomendaron los fabricantes y se transformó en células
DH5\alpha químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Posteriormente, las construcciones de pJN347-péptido
de dirección/manosidasa se secuenciaron por ABI para confirmar que
las fusiones generadas estaban en fase. El tamaño estimado de la
biblioteca final de péptido de
dirección/alfa-1,2-manosidasa
contiene más de 1300 construcciones generadas mediante el enfoque
descrito anteriormente. La Figura 2 ilustra la construcción de la
biblioteca de ADN combinatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa en la construcción de plásmidos
implicó crear un conjunto de plásmidos universales que contenían
regiones de ADN del gen KEX1 de P. pastoris (Boehm y
col. Yeast 1999 Mayo; 15(7): 563-72) como
separadores para las regiones 5' y 3' de los genes que se tenían
que eliminar. Los plásmidos también contenían los
Ura-blaster de S. cerevisiae (Alani y col.,
Genetics 116, 541-545. 1987) como un separador para
los marcadores auxótrofos y un casete de expresión con un sitio de
clonación múltiple para inserción de un gen extraño. Un fragmento
de 0,9 kb de la región KEX1-5' de P. pastoris
se amplificó por PCR usando los cebadores
GGCGAGCTCGGCC
TACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCA GA (SEC ID Nº: 27) y GCCCACGTCGACGGATCCGT
TTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEC ID Nº: 28) y ADN genómico de P. pastoris como un molde y se clonó en los sitios SacI, SaIl de pUC 19 (New England Biolabs, Beverly, MA). El plásmido resultante se cortó con BamHI y SaIl y un fragmento de 0,8 kb de la región KEX1-3' que se había amplificado usando los cebadores CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEC ID Nº: 29) y GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGGATGACTCTTTTC (SEC ID Nº: 30) se clonó en los sitios abiertos creando pJN262. Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento de 3,8 kb de BamHI, BglII de pNKY51 (Alani y col., Genetics 116, 541-545. 1987) se insertó en ambas orientaciones posibles dando como resultado los plásmidos pJN263 (Figura 4A) y pJN284 (Figura 4B).
TACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAGCTTCA GA (SEC ID Nº: 27) y GCCCACGTCGACGGATCCGT
TTAAACATCGATTGGAGAGGCTGACACC GCTACTA (SEC ID Nº: 28) y ADN genómico de P. pastoris como un molde y se clonó en los sitios SacI, SaIl de pUC 19 (New England Biolabs, Beverly, MA). El plásmido resultante se cortó con BamHI y SaIl y un fragmento de 0,8 kb de la región KEX1-3' que se había amplificado usando los cebadores CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCC ACATGG (SEC ID Nº: 29) y GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGGATGACTCTTTTC (SEC ID Nº: 30) se clonó en los sitios abiertos creando pJN262. Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento de 3,8 kb de BamHI, BglII de pNKY51 (Alani y col., Genetics 116, 541-545. 1987) se insertó en ambas orientaciones posibles dando como resultado los plásmidos pJN263 (Figura 4A) y pJN284 (Figura 4B).
Se creó un casete de expresión con NotI y
PacI como sitios de clonación. El promotor GAPDH de P.
pastoris se amplificó usando los cebadores
CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGCCT (SEC ID Nº: 31)
y
GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGACAA
(SEC ID Nº: 32) y plásmido pGAPZ-A (Invitrogen)
como molde y se clonó en los sitios BamHI y SphI de pUC19
(New England Biolabs, Beverly, MA) (Figura 4B). El plásmido
resultante se cortó con SpeI y SphI y la región
terminadora de transcripción CYC1 ("TT") que se había
amplificado usando cebadores
CCTTGCTAGCTTAAT
TAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEC ID Nº: 33) y GGACATGCATGCGGATCCCT
TAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCC (SEC ID Nº: 34) y el plásmido pPICZ-A (Invitrogen) como un molde se clonó en los sitios abiertos creando pJN261 (Figura 4B).
TAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCA CGGGTCCCA (SEC ID Nº: 33) y GGACATGCATGCGGATCCCT
TAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCC (SEC ID Nº: 34) y el plásmido pPICZ-A (Invitrogen) como un molde se clonó en los sitios abiertos creando pJN261 (Figura 4B).
Un plásmido con el gen OCH1 eliminado de
P. pastoris se creó digiriendo pJN263 con SalI y
SpeI y un fragmento de ADN de 2,9 kb de la región
OCH1-5', que se había amplificado usando los
cebadores
GAACCACGTCGACGGC
CATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATTCAAACACAAGGCATTGC (SEC ID Nº: 35) y CTCCAATACTAGTC
GAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEC ID Nº: 36) y ADN genómico de P. pastoris como un molde, se clonó en los sitios abiertos (Figura 4C). El plásmido resultante se cortó con EcoRI y PmeI y un fragmento de ADN de 1,0 kb de la región OCH1-3' que se había generado usando los cebadores TGGAAGGTTTAAACAAAGCTAGAGTAA
AATAGATATAGCGAGATTAGAGAATG (SEC ID Nº: 37) y AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATG
TAGTTCCCGTT TTCATC (SEC ID Nº: 38) se insertó para generar pJN298 (Figura 4C). Para permitir la posibilidad de usar simultáneamente el plásmido para introducir un gen nuevo, el casete de expresión BamHI de pJN261 (Figura 4B) se clonó en el sitio único BamHI de pJN298 (Figura 4C) para crear pJN299 (Figura 4E).
CATTGCGGCCAAAACCTTTTTTCCTATTCAAACACAAGGCATTGC (SEC ID Nº: 35) y CTCCAATACTAGTC
GAAGATTATCTTCTACGGTGCCTGGACTC (SEC ID Nº: 36) y ADN genómico de P. pastoris como un molde, se clonó en los sitios abiertos (Figura 4C). El plásmido resultante se cortó con EcoRI y PmeI y un fragmento de ADN de 1,0 kb de la región OCH1-3' que se había generado usando los cebadores TGGAAGGTTTAAACAAAGCTAGAGTAA
AATAGATATAGCGAGATTAGAGAATG (SEC ID Nº: 37) y AAGAATTCGGCTGGAAGGCCTTGTACCTTGATG
TAGTTCCCGTT TTCATC (SEC ID Nº: 38) se insertó para generar pJN298 (Figura 4C). Para permitir la posibilidad de usar simultáneamente el plásmido para introducir un gen nuevo, el casete de expresión BamHI de pJN261 (Figura 4B) se clonó en el sitio único BamHI de pJN298 (Figura 4C) para crear pJN299 (Figura 4E).
El casete Ura3-blaster de P.
pastoris se construyó usando una estrategia similar a la
descrita en Lu y col. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:
141-146. Un fragmento de PstI, SpeI de 2,0 kb
de URA3 de P. pastoris se insertó en los sitios
PstI, XbaI de pcU19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para
crear pJN306 (Figura 4D). Después un fragmento de ADN SacI,
PvulI de 0,7 kb de la fase de lectura abierta lacZ se
clonó en los sitios SacI, SmaI para producir pJN308 (Figura
4D). A continuación de la digestión de pJN308 (Figura 4D) con
PstI y tratamiento con T4 ADN polimerasa, el fragmento
SacI-PvulI de lacZ al que se habían
hecho los extremos romos con T4 ADN polimerasa se insertó generando
pJN315 (Figura 4D). El casete lacZ/URA3 se liberó mediante
digestión con SacI y SphI, sus extremos se volvieron
romos con T4 ADN polimerasa y se clonó en la estructura principal
de pJN299 que se había digerido con PmeI y AfIII y al
que se habían hecho los extremos romos con T4 ADN polimerasa. El
plásmido resultante se denominó pJN329 (Figura 4E).
Un plásmido de expresión marcado con HIS4
se creó cortando pJN261 (Figura 4F) con EcoICRI (Figura 4F). Un
fragmento de 2,7 kb del gen HIS4 de Pichia pastoris
que se había amplificado usando los cebadores
GCCCAAGCCGG
CCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG (SEC ID Nº: 39) y GGGCGCGTATT
TAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTCTAA (SEC ID Nº: 40) se cortó con NgoMIV y Swal y después sus extremos se hicieron romos usando T4 ADN polimerasa, después se ligó en el sitio abierto. Este plásmido se denominó pJN337 (Figura 4F). Para construir un plásmido con un sitio de clonación múltiple adecuado para construcción de biblioteca de fusión, pJN337 se cortó con NotI y PacI y los dos oligonucleótidos GGCCGCCTG
CAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEC ID Nº: 41) y TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTG
CAGGGC (SEC ID Nº: 42), que se habían hibridado in vitro se ligaron en los sitios abiertos, creando pJN347 (Figura 4F).
CCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG (SEC ID Nº: 39) y GGGCGCGTATT
TAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTCTAA (SEC ID Nº: 40) se cortó con NgoMIV y Swal y después sus extremos se hicieron romos usando T4 ADN polimerasa, después se ligó en el sitio abierto. Este plásmido se denominó pJN337 (Figura 4F). Para construir un plásmido con un sitio de clonación múltiple adecuado para construcción de biblioteca de fusión, pJN337 se cortó con NotI y PacI y los dos oligonucleótidos GGCCGCCTG
CAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT (SEC ID Nº: 41) y TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTG
CAGGGC (SEC ID Nº: 42), que se habían hibridado in vitro se ligaron en los sitios abiertos, creando pJN347 (Figura 4F).
Para crear una cepa sin och 1 que
contenga múltiples marcadores auxótrofos, 100 \mug de pJN329 se
digirieron con Sfil y se usaron para transformar la cepa
JC308 de P. pastoris (Cereghino y col. Gene 263 (2001)
159-169) mediante electroporación. A continuación de
la transformación, las placas con URA retirado se incubaron a
temperatura ambiente durante 10 días. Mil (1000) colonias se
escogieron y se volvieron a sembrar en estrías. Todos los 1000
clones después se sembraron en estrías en 2 conjuntos de placas con
URA retirado. Un conjunto se incubó a temperatura ambiente,
mientras que el segundo conjunto se incubó a 37ºC. Los clones que no
fueron capaces de crecer a 37ºC, pero crecieron a temperatura
ambiente, se sometieron a PCR de colonia para ensayar la
eliminación de OCH1 correcta. Un clon que mostraba la señal
de PCR esperada (aproximadamente 4,5 kb) se denominó YJN153.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes positivos (Ejemplo 4)
explorados mediante PCR de colonia para confirmar la integración de
la construcción de manosidasa en el genoma de P. pastoris se
cultivaron posteriormente a temperatura ambiente en 50 ml de medio
complejo de metanol tamponado con BMGY que consistía en extracto de
levadura al 1%, peptona al 2%, tampón de fosfato potásico 100 mM,
pH 6,0, base de nitrógeno de levadura al 1,34%, biotina al 4 X
10^{-5}% y glicerol al 1% como un medio de cultivo) hasta
DO_{600nm} 2-6, punto en el cual los mismos se
lavaron con 10 ml de medios de BMMY (medio complejo de metanol
tamponado constituido por extracto de levadura al 1%, peptona al
2%, tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base de nitrógeno de
levadura al 1,34%, biotina 4 X 10^{-5}% y metanol al 1,5% como un
medio de cultivo) antes de la inducción de la proteína informadora
durante 24 horas a temperatura ambiente en 5 ml de BMMY. Por
consiguiente, la proteína informadora se aisló y se analizó como se
ha descrito en el Ejemplo 3 para caracterizar su estructura de
glicano. Usando los péptidos de dirección de la Tabla 6, los
dominios catalíticos de manosidasa localizados en el RE o el Golgi
mostraron un nivel significativo de corte de un glicano que contenía
principalmente Man_{8}GlcNAc_{2} a un glicano que contenía
principalmente Man_{5}GlcNAc_{2}. Esto es evidente cuando la
estructura de glicano de la glicoproteína informadora se compara
entre la de P. pastoris sin och1 en las Figuras 5C y
6C y la misma cepa transformada con construcciones de manosidasa de
M. musculus como se muestra en las Figuras 5D, 5E,
6D-6F. Las Figuras 5 y 6 muestran la expresión de
construcciones generadas a partir de la biblioteca de ADN
combinatoria que muestran actividad manosidasa significativa en
P. pastoris. La expresión de pGC5 (MNS1 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) (Figuras 5D y
6E) produjo una proteína que tenía aproximadamente el 30% de todos
los glicanos cortados a Man_{5}GlcNAc_{2}, mientras que la
expresión de pFB8 (SEC12 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) (Figura 6F)
produjo aproximadamente el 50% de Man_{5}GlcNAc_{2} y la
expresión de pBC18-5 (VAN1(s) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans)
(Figura 5E) produjo el 70% de Man_{5}GlcNAc_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Para asegurar que las cepas modificadas por
ingeniería genética novedosas del Ejemplo 4 producían de hecho la
estructura de Man_{5}GlcNAc_{2} deseada in vivo, los
sobrenadantes celulares se ensayaron para determinar la actividad
de manosidasa (véanse las Figuras 7-9). Para cada
construcción/cepa huésped descrita más adelante, se realizó HPLC a
30ºC con una columna de 4,0 mm x 250 mm de resina
Econosil-NH_{2} de Altech (Avondale, PA, EE.UU)
(5 \mum) a un caudal de 1,0 ml/min durante 40 min. En las Figuras
7 y 8 se demostró que ocurría la degradación del
Man_{9}GlcNAc_{2} [b] convencional dando como resultado un pico
que se correlaciona con Man_{8}GlcNAc_{2}. En la Figura 7, el
Man_{9}GlcNAc_{2} [b] convencional se eluyó a 24,61 min y
Man_{5}GlcNAc_{2} [a] se eluyó a 18,59 min. En la Figura 8,
Man_{9}GlcNAc_{2} se eluyó a 21,37 min y Man_{5}GlcNAc_{2}
a 15,67 min. En la Figura 9, el Man_{8}GlcNAc_{2} [b]
convencional demostró que se eluía a 20,88 min.
Células de P. pastoris que comprenden
plásmido pFB8 (SEC12 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IA \Delta197 de ratón) se
cultivaron a 30ºC en BMGY hasta una DO600 de aproximadamente 10. Las
células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a
BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 a partir de
plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1.
Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante
centrifugación para producir un sobrenadante básicamente
transparente. Una alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos
de manosidasa y el resto se usó para la recuperación de K3 soluble
secretada. Una etapa de purificación única usando cromatografía de
CM-sefarosa y un gradiente de elución de NaAc 25
mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3
al 95% pura que se eluía en NaCl entre 300-500 mM.
El análisis de N-glicano de los glicanos obtenidos de K3 se
muestra en la Figura 6F. La alícuota retirada anteriormente del
sobrenadante se ensayó además para determinar la presencia de
actividad manosidasa secretada. Un patrón disponible en el mercado
de oligomanosa 9 de tipo enlazado a N marcado con
2-aminobenzamida
(Man9-2-AB) (Glyko, Novato, CA) se
añadió a: BMMY (Figura 7A), el sobrenadante de la alícuota anterior
(Figura 7B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de
\alpha-1,2-manosidasa de
Trichoderma reesei (obtenido de Contreras y col., WO
02/00856 A2) (Figura 7C). Después de la incubación durante 24 horas
a temperatura ambiente, las muestras se analizaron mediante HPLC de
amino sílice para determinar el alcance de corte de manosidasa.
Células de P. pastoris que comprenden el
plásmido pGC5 (MNS1(m) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) se
cultivaron y se ensayaron de forma similar. Las células se
cultivaron a temperatura ambiente en BMGY hasta una DO600 de
aproximadamente 10. Las células se recogieron mediante
centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción
de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24
horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación
para producir un sobrenadante básicamente transparente. Una
alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el
resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una
etapa de purificación única usando cromatografía de
CM-sefarosa y un gradiente de elución de NaAc 25
mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3
al 95% pura que se eluía en NaCl entre 300-500 mM.
El análisis de N-glicano de los glicanos obtenidos de K3 se
muestran en la Figura 5D. La alícuota retirada anteriormente del
sobrenadante se ensayó además para determinar la presencia de
actividad manosidasa secretada como se muestra en la Figura 8B. Un
patrón disponible en el mercado de
Man9-2-AB (Glyko, Novato, CA) se
añadió a: EMMY (Figura 8A), sobrenadante de la alícuota anterior
(Figura 8B) y BMMY que contenía 10 ng de 75 mU/ml de
\alpha-1,2-manosidasa de
Trichoderma reesei (obtenido de Contreras y col., WO
02/00856 A2) (Figura 8C). Después de la incubación durante 24 horas
a temperatura ambiente, las muestras se analizaron mediante HPLC de
amino sílice para determinar el alcance de corte de manosidasa.
Man9-2-AB se usó
como un sustrato y es evidente que después de 24 horas de
incubación, la actividad manosidasa estaba prácticamente ausente en
el sobrenadante de la digestión de la cepa pFB8 (SEC12(m) de
Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón) (Figura
7B) y digestión de la cepa pGC5 (MNS1(m) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de ratón) (Figura 8B)
mientras el control positivo
(\alpha-1,2-manosidasa purificada
de T. reesei obtenida de Contreras) conduce a conversión
completa de Man_{9}GlcNAc_{2} en Man_{5}GlcNAc_{2} en las
mismas condiciones, como se muestra en las Figuras 7C y 8C. Estos
son datos concluyentes que muestran el corte de manosidasa in
vivo en la cepa pGC5 de P. pastoris y la cepa pFB8, que
es definitivamente diferente de lo que se ha indicado hasta la
fecha (Contreras y col., WO 02/00856 A2).
La Figura 9 confirma además la localización y la
actividad de la enzima manosidasa. P. pastoris que comprende
pBC18-5 (VAN1(s) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans) se
cultivó a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de
aproximadamente de 10. Las células se recogieron mediante
centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción
de K3 bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24
horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación
para producir un sobrenadante básicamente transparente. Una
alícuota del sobrenadante se retiró para ensayos de manosidasa y el
resto se usó para la recuperación de K3 soluble secretada. Una
etapa de purificación única usando cromatografía de
CM-sefarosa y un gradiente de elución de NaAc 25
mM, pH 5,0 a NaAc 25 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, dio como resultado una K3
al 95% pura que se eluye en NaCl entre 300-500 mM.
El análisis de N-glicano de los glicanos obtenidos a partir
de K3 se muestra en la Figura 5E. La alícuota retirada anteriormente
del sobrenadante se ensayó además para determinar la presencia de
actividad manosidasa secretada como se muestra en la Figura 9B. Un
patrón disponible en el mercado de
Man8-2-AB (Glyko, Novato, CA) se
añadió a: a BMMY (Figura 9A), sobrenadante de la alícuota anterior
de pBC18-5 (VAN1(s) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta80 de C. elegans)
(Figura 9B) y medios que contenían BMMY a partir de una construcción
de fusión diferente pDD28-3 (MNN10(m) de
Saccharomyces (de SwissProt 50108)/manosidasa IB \Delta99
de H. sapiens) (Figura 9C). Después de incubación durante 24
horas a temperatura ambiente, las muestras se analizaron mediante
HPLC de amino sílice para determinar el alcance del corte de
manosidasa. La Figura 9B demuestra la actividad de manosidasa
intracelular en comparación con una construcción de fusión
pDD28-3 (MNN10(m) de
Saccharomyces/manosidasa IB \Delta99 de H. sapiens)
que muestra un resultado negativo (Figura 9C).
\vskip1.000000\baselineskip
Células de P. pastoris que comprenden
plásmido pBB27-2 (MNN10(s) de
Saccharomyces (de SwissProt50108)/
manosidasa IB \Delta31 de C. elegans) se cultivaron a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente 17. Aproximadamente 80 \mul de estas células se inocularon en 60 \mul de BMGY y se cultivaron durante una noche. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 a partir de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación para producir un sobrenadante básicamente transparente (pH 6,43). El sobrenadante se retiró para ensayos de pH óptimo de manosidasa. Se añadió Man_{8}GlcNAc_{2} marcado con fluorescencia (0,5 \mug) a 20 \mul de sobrenadante ajustado a diversos pH (Figura 11) y se incubó durante 8 horas a temperatura ambiente. A continuación de la incubación la muestra se analizó mediante HPLC usando una columna de sílice unida a amino Econosil NH2 4,6 X 250 mm, perla de 5 micrómetros (Altech, Avondale, PA). El caudal fue 1,0 ml/min durante 40 min y la columna se mantuvo a 30ºC. Después de eluir isocráticamente (A 68%:B 32%) durante 3 min, se empleó un gradiente de disolvente lineal (A 68%:B 32% a A 68%:B 60%) durante 27 min para eluir los glicanos (18). Disolvente A (acetonitrilo) y disolvente B (formato de amonio, 50 mM, pH 4,5. La columna se equilibró con disolvente (A 68%:B 32%) durante 20 min entre los desarrollos.
manosidasa IB \Delta31 de C. elegans) se cultivaron a temperatura ambiente en BMGY a una DO600 de aproximadamente 17. Aproximadamente 80 \mul de estas células se inocularon en 60 \mul de BMGY y se cultivaron durante una noche. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación y se transfirieron a BMMY para inducir la producción de K3 (kringle 3 a partir de plasminógeno humano) bajo el control de un promotor AOX1. Después de 24 horas de inducción, las células se retiraron mediante centrifugación para producir un sobrenadante básicamente transparente (pH 6,43). El sobrenadante se retiró para ensayos de pH óptimo de manosidasa. Se añadió Man_{8}GlcNAc_{2} marcado con fluorescencia (0,5 \mug) a 20 \mul de sobrenadante ajustado a diversos pH (Figura 11) y se incubó durante 8 horas a temperatura ambiente. A continuación de la incubación la muestra se analizó mediante HPLC usando una columna de sílice unida a amino Econosil NH2 4,6 X 250 mm, perla de 5 micrómetros (Altech, Avondale, PA). El caudal fue 1,0 ml/min durante 40 min y la columna se mantuvo a 30ºC. Después de eluir isocráticamente (A 68%:B 32%) durante 3 min, se empleó un gradiente de disolvente lineal (A 68%:B 32% a A 68%:B 60%) durante 27 min para eluir los glicanos (18). Disolvente A (acetonitrilo) y disolvente B (formato de amonio, 50 mM, pH 4,5. La columna se equilibró con disolvente (A 68%:B 32%) durante 20 min entre los desarrollos.
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La actividad de GlcNAc Transferasa I es
necesaria para la maduración de N-glicanos complejos e
híbridos (Patente de los Estados Unidos Nº 5.834.251).
Man_{5}GlcNAc_{2} se puede cortar sólo mediante manosidasa II,
una etapa necesaria en la formación de glicoformas humanas, después
de la adición de N-acetilglucosamina al resto
\alpha-1,3 manosa terminal del tronco trimanosa
mediante GlcNAc Transferasa I (Schachter, 1991 Glycobiology
1(5): 453-461). Por consiguiente, se preparó
una biblioteca de ADN combinatoria incluyendo fragmentos de ADN que
codifican dominios catalíticos dirigidos adecuadamente de genes de
GlcNAc Transferasa I a partir de C. elegans y Homo
sapiens; y secuencias de localización a partir de GLS, MNS,
SEC, MNN9, VAN1, ANP1, HOC1, MNN10, MNN11, MNT1, KTR1, KTR2, MNN2.
MNN5, YUR1, MNN1 y MNN6 y a partir de
\alpha-1,2-manosiltransferasas
supuestas de S. cerevisiae y P. pastoris basándose en la
homología de S. cerevisiae: D2, D9 y J3, que son homólogos
KTR. La Tabla 10 incluye, pero no se limita a secuencias de
péptidos de dirección tales como SEC y OCH1 de GnTI
de P. pastoris y K. lactis (véase la Tabla 6 y Tabla
10).
Se seleccionaron secuencias de péptidos de
dirección a partir de OCH1 en P. pastoris (largo,
medio y corto) (véase el Ejemplo 4) y MNN9 (SwissProt
P39107) en S. cerevisiae corto y medio. Los dominios
catalíticos se seleccionaron a partir de GnTI humana con una
supresión N-terminal de 38 y 86 aminoácidos, GnTI de C.
elegans (gli-12) con una supresión de 35 y 63
aminoácidos, así como GnTI de C. elegans
(gli-14) con una supresión N-terminal de 88
aminoácidos y GnTI de X. leavis con una supresión
N-terminal de 33 y 103 aminoácidos, respectivamente.
Una porción del gen que codifica
N-acetilglucosaminil-Transferasa I humana
(MGATI, Número de Acceso
NM002406), que carece de los primeros 154 pb, se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos 5'-TGGCAGGCGC
GCCTCAGTCAGCGCTCTCG-3' (SEC ID Nº: 43) y 5'-AGGTTAATTAAGTGCTAATTCCAGCTAGG-3' (SEC ID Nº: 44) y el vector pHG4.5 (ATCC Nº 79003) como molde. El producto de PCR resultante se clonó en pCR2.1-TOPO y la secuencia correcta se confirmó. A continuación de la digestión con AscI y PacI la GnTI truncada se insertó en el plásmido pJN346 para crear pNA. Después de la digestión de pJN271 con NotI y AscI, el inserto de 120 pb, se le ligó pNA para generar una fusión en fase del dominio transmembrana de MNN9 con la GnTI, creando pNA15.
NM002406), que carece de los primeros 154 pb, se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos 5'-TGGCAGGCGC
GCCTCAGTCAGCGCTCTCG-3' (SEC ID Nº: 43) y 5'-AGGTTAATTAAGTGCTAATTCCAGCTAGG-3' (SEC ID Nº: 44) y el vector pHG4.5 (ATCC Nº 79003) como molde. El producto de PCR resultante se clonó en pCR2.1-TOPO y la secuencia correcta se confirmó. A continuación de la digestión con AscI y PacI la GnTI truncada se insertó en el plásmido pJN346 para crear pNA. Después de la digestión de pJN271 con NotI y AscI, el inserto de 120 pb, se le ligó pNA para generar una fusión en fase del dominio transmembrana de MNN9 con la GnTI, creando pNA15.
El organismo huésped es una cepa de P.
pastoris que carece de hipermanosilación (por ejemplo, un
mutante och1), proporciona el sustrato
UDP-GlcNAc en el Golgi y/o RE (es decir, contiene un
transportador de UDP-GlcNAc funcional) y
proporciona un N-glicanos de la estructura
Man_{5}GlcNAc_{2} en el Golgi y/o RE (por ejemplo, pFB8 de
P. pastoris (SEC12 (m) de
Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187 de ratón)
anteriormente). En primer lugar, pFB8 de P. pastoris se
transformó con pPB103 que contenía el gen
MNN2-2 de Kluyveromyces lactis
(Genbank NA AF106080) (que codifica transportador de
UDP-GlcNAc) clonado en el sitio BamHI y
BglII del plásmido pBLADE-SX (Cereghino y
col. Gene 263 (2001) 159-169). Después, la
biblioteca de ADN combinatoria mencionada anteriormente que codifica
una combinación de GnTI exógena o endógena/genes de localización se
transformó y se seleccionaron colonias y se analizaron para
determinar la presencia de la construcción de GnTI mediante PCR de
colonia. La eficacia de transformación e integración generalmente
estuvo por encima del 80% y la exploración por PCR se puede omitir
una vez que se han establecido parámetros de transformación
sólidos.
En resumen, los procedimientos de la invención
producen cepas de P. pastoris que producen
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en alto rendimiento, como se muestra en
la Figura 10B. Al menos el 60% de los N-glicanos son
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Hasta la fecha, no existen informes
que describan la formación de GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en
glicoproteínas solubles secretadas en ninguna levadura. Los
resultados presentados en este documento muestran que la adición
del transportador de UDP-GlcNAc junto con la
actividad de GnTI produce una estructura de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} predominante, que se confirma mediante
el pico a 1457 (m/z) (Figura 10B).
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La cepa de P. pastoris que expresa K3,
(\Deltaochl, arg-, ade-, his-) se transformó sucesivamente
con los siguientes vectores. En primer lugar, pFB8
(SEC12 (m) de Saccharomyces/manosidasa IA \Delta187
de ratón) se transformó en la cepa de P. pastoris mediante
electroporación. En segundo lugar, pPB103 que contiene gen
MNN2-2 de Kluyveromyces lactis
(Genbank NA AF106080) (que codifica transportador de
UDP-GlcNAc) clonado en el plásmido
pBLADE-SX (Cereghino y col. Gene 263 (2001)
159-169) digerido con las enzimas BamHI y
Bg/II se transformó en la cepa de P. pastoris. En
tercer lugar, pPB104 que contiene gen que codifica
MNN9(s) de Saccharomyces/GnTI \Delta38 humana
clonado como fragmento NotI-Pacl en pJN336 se
transformó en la cepa de P. pastoris.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen OCH1 de la levadura en germinación
S. cerevisiae codifica una
1,6-manosiltransferasa que es responsable de la
primera adición de manosa localizada en Golgi a la estructura de
N-glicano Man_{8}GlcNAc_{2} en proteínas secretadas
(Nakanishi-Shindo y col. (1993), J. Biol. Chem.;
268(35): 26338-45). Esta transferencia de
manosa generalmente se reconoce como la etapa inicial clave en la
polimanosilación específica de hongos de estructuras de
N-glicano (Nakanishi-Shindo y col. (1993) J.
Biol. Chem. 268(35): 26338-26345; Nakayama y
col. (1992) EMBO J. 11(7): 2511-19;
Morin-Ganet y col., Traffic 1(1):
56-68. (Enero 2000)). La supresión de este gen en
S. cerevisiae da como resultado una estructura de
N-glicano significativamente más corta que no incluye esta
polimanosilación típica o un defecto de crecimiento a temperaturas
elevadas (Nakayama y col. (1992) EMBO J. 11(7):
2511-19).
La secuencia Och1p de S.
cerevisiae se alineó con homólogos conocidos de Candida
albicans (Nº de acceso de GenBank AAL49987) y P.
pastoris junto con las proteínas de Hoc1 de S.
cerevisiae (Neiman y col., Genetics, 145(3):
637-45 (Mar 1997) y K. lactis (base de datos
PENDANT EST), que son manosiltransferasas relacionadas pero
diferentes. Las regiones de alta homología que estaban en común
entre homólogos de Och1p pero diferentes de los homólogos de
Hoc1p se usaron para diseñar pares de cebadores degenerados
que se dirigieron frente a ADN genómico de la cepa MG1/2 de K.
lactis (Bianchi y col., Current Genetics 12,
185-192 (1987)). La amplificación por PCR con
cebadores RCD33 (CCAGAAGAATTCAATTYTGYCARTGG) (SEC ID Nº: 45) y RCD34
(CAGTGAAAA
TACCTGGNCCNGTCCA) (SEC ID Nº:46) dio como resultado un producto de 302 pb que se clonó y se secuenció, y la traducción pronosticada demostró tener un grado elevado de homología con proteínas de Och1 (>55% con Och1p de S. cerevisiae).
TACCTGGNCCNGTCCA) (SEC ID Nº:46) dio como resultado un producto de 302 pb que se clonó y se secuenció, y la traducción pronosticada demostró tener un grado elevado de homología con proteínas de Och1 (>55% con Och1p de S. cerevisiae).
El producto de PCR de 302 pb se usó para sondear
una transferencia de Southern de ADN genómico de la cepa (MG1/2) de
K. lactis con rigurosidad elevada (Sambrook y col., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se observó hibridación en un
patrón coherente con un gen único indicando que este segmento de
302 pb corresponde a una porción del genoma de K. lactis y
K. lactis (KIOCH1) contiene una copia única del gen.
Para clonar el gen KIOCH1 entero, se usó la transferencia de
Southern para cartografiar el locus genómico. Por consiguiente, se
clonó un fragmento de 5,2 kb de BamHI/PstI digiriendo
ADN genómico y ligando esos fragmentos en el intervalo de 5,2 kb en
pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) para crear una biblioteca
subgenómica de K. lactis. Esta biblioteca subgenómica se
transformó en E. coli y varios cientos de clones se ensayaron
mediante PCR de colonia usando RCD 33/34. El clon de 5,2 kb que
contiene el gen KIOCH1 pronosticado se secuenció y una fase
de lectura abierta de 1362 pb que codifica una proteína
pronosticada que es el 46,5% idéntica al OCH1 de S.
cerevisiae. La secuencia de 5,2 kb se usó para preparar
cebadores para la construcción de un alelo de supresión
och1::KAN^{R} usando un procedimiento de solapamiento por
PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148 (Pt8):
2607-15). Este alelo de supresión se transformó en
dos cepas de K. lactis y se seleccionaron colonias
resistentes a G418. Estas colonias se exploraron tanto por PCR como
para sensibilidad a temperatura para obtener una cepa suprimida
para la ORF de OCH1. Los resultados del experimento muestran
cepas que revelan un patrón de PCR mutante, que se caracterizaron
por análisis del crecimiento a diversas temperaturas y análisis de
carbohidratos N-glicanos de proteínas secretadas y de pared
celular a continuación de digestión con PNGasa. La mutación de
och1 confirió una sensibilidad a temperatura que permitió
que las cepas crecieran a 30ºC, pero no a 35ºC. La Figura 12A
muestra un análisis de MALDI-TOF de una cepa de
K. lactis de tipo silvestre, que produce N-glicanos de
Man_{8}GlcNAc_{2} [c] y superiores.
\vskip1.000000\baselineskip
MNN1 de S. cerevisiae es el gen
estructural para la
\alpha-1,3-manosiltransferasa de
Golgi. El producto de MNN1 es una proteína de membrana de
tipo II de 762 aminoácidos (Yip y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU.
91(7): 2723-7. (1994)). Oligosacáridos tanto
enlazados a N como enlazados a O aislados a partir de mutantes de
mnn1 carecen de enlaces
\alpha-1,3-manosa (Raschke y col.,
J Biol Chem., 248(13): 4660-6. (10 de Julio
de 1973).
La secuencia de Mnn1p de S.
cerevisiae se usó para buscar las secuencias genóminas
traducidas de K. lactis (PEDANT). Se ha identificado una
secuencia de ADN de 405 pb que codifica un fragmento proteico
supuesto de similitud significativa con Mnn1p. Un segmento
interno de esta secuencia posteriormente se amplificó por PCR con
los cebadores KMN1 (TGCCATCTTTTAGGTCCAGGCCCGTTC) (SEC ID Nº: 47) y
KMN2 (GATCCCACGACG
CATCGTATTTCTTTC), (SEC ID Nº: 48) y se usó para sondear una transferencia de Southern de ADN genómico a partir de la cepa (MG1/2) de K. lactis. Basándose en los datos de hibridación del Southern se clonó un fragmento de 4,2 Kb BamHI-PstI generando una biblioteca seleccionada por tamaño como se ha descrito en este documento. Un clon único que contenía el gen MNN1 de K. lactis se identificó mediante PCR de colonia completa, usando los cebadores KMN1 (SEC ID Nº: 47) y KMN2 (SEC ID Nº: 48) y se secuenció. Dentro de este clon se identificó una ORF de 2241 pb que codificaba una proteína pronosticada que era el 34% idéntica al gen MNN1 de S. cerevisiae. Se diseñaron cebadores para construcción de un alelo de supresión mnn1::NAT^{R} usando el procedimiento de solapamiento por PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15).
CATCGTATTTCTTTC), (SEC ID Nº: 48) y se usó para sondear una transferencia de Southern de ADN genómico a partir de la cepa (MG1/2) de K. lactis. Basándose en los datos de hibridación del Southern se clonó un fragmento de 4,2 Kb BamHI-PstI generando una biblioteca seleccionada por tamaño como se ha descrito en este documento. Un clon único que contenía el gen MNN1 de K. lactis se identificó mediante PCR de colonia completa, usando los cebadores KMN1 (SEC ID Nº: 47) y KMN2 (SEC ID Nº: 48) y se secuenció. Dentro de este clon se identificó una ORF de 2241 pb que codificaba una proteína pronosticada que era el 34% idéntica al gen MNN1 de S. cerevisiae. Se diseñaron cebadores para construcción de un alelo de supresión mnn1::NAT^{R} usando el procedimiento de solapamiento por PCR (Davidson y col. (2002) Microbiol. 148(Pt 8): 2607-15).
Este alelo de alteración se transformó en una
cepa de K. lactis mediante electroporación y se seleccionaron
transformantes resistentes a nourseotricina y se amplificaron por
PCR para inserción homóloga del alelo de alteración. Las cepas que
revelaron un patrón de PCR mutante se pueden someter a análisis de
carbohidratos N-glicano de un gen informador conocido.
La Figura 12B representa los N-glicanos
de la cepa de supresión de och1 mnn1 de K. lactis
observados a continuación de digestión con PNGasa de
MALDI-TOF como se ha descrito en este documento. El
pico predominante en 1908 (m/z) indicaba que [d] es coherente con la
masa de Man_{9}GlcNAc_{2}.
En la bibliografía se describen procedimientos y
reactivos adicionales que se pueden usar en los procedimientos para
modificar la glicosilación, tales como la Patente de Estados Unidos.
Nº 5.955.422, la Patente de Estados Unidos. Nº 4.775.622, la
Patente de Estados Unidos Nº 6.017.743, la Patente de Estados
Unidos. Nº 4.925.796, la Patente de Estados Unidos Nº 5.766.910, la
Patente de Estados Unidos Nº 5.834.251, la Patente de Estados
Unidos Nº 5.910.570, la Patente de Estados Unidos Nº 5.849.904, la
Patente de Estados Unidos Nº 5.955.347, la Patente de Estados
Unidos Nº 5.962.294, la Patente de Estados Unidos Nº 5.135.854, la
Patente de Estados Unidos Nº 4.935.349, la Patente de Estados
Unidos Nº 5.707.828, y la Patente de Estados Unidos Nº 5.047.335.
Se pueden obtener sistemas de expresión de levadura apropiados a
partir de fuentes tales como la Colección Americana de Cultivos
Tipo, Rockville, MD. Los vectores están disponibles en el mercado a
partir de una diversidad de fuentes.
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Para los ejemplos más adelante, se usaron las
siguientes cepas, condiciones de cultivo y reactivos. Se usaron las
cepas TOP10 o DH5\alpha de Escherichia coli para trabajo de
ADN recombinante.
Se realizó expresión de proteínas a temperatura
ambiente en un formato de placa de 96 pocillos con medio complejo
de glicerol tamponado (BMGY) constituido por extracto de levadura al
1%, peptona al 2%, tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, base
de nitrógeno de levadura al 1,34%, biotina al 4 X 10^{-5}% y
glicerol al 1% como un medio de cultivo. El medio de inducción fue
medio complejo de metanol tamponado (BMMY) constituido por metanol
al 1,5% en lugar de glicerol en BMGY.
Las enzimas de restricción y modificación fueron
de New England Biolabs (Beverly, MA).
Los oligonucleótidos se obtuvieron de la
instalación de Dartmouth College Core (Hanover, NH) o Integrated DNA
Technologies (Coralville, IA).
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Las enzimas de restricción y modificación fueron
de New England Biolabs (Beverly, MA). El vector lanzadera pVM2 se
generó a partir pUC19 mediante PCR inversa (Sambrook, J., Fritsch,
E. F., y Maniatis, T. (1989) en: Molecular Cloning, a Laboratory
Manual 2ª Edición, Cold Spring Harbor N.Y.: Cold Spring Harbor
Laboratory Press) usando los cebadores VJM104 y VJM106
(5'-GCGGCCGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACT-3'
(SEC ID Nº: 107) y
5'-GGGGCGCGCCTTAATTAACGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT-3'
(SEC ID Nº: 108), respectivamente, los sitios de restricción
introducidos NotI, AscI y PacI están subrayados).
El plásmido de transferencia pJN285 es un
derivado del plásmido pJN266 insertado que se construyó de la
siguiente manera. Un fragmento de 0,9 kb de la región
PpKEK1-5' se amplificó por PCR, usando los
cebadores Kex55
(5'-GGCGAGCTCGGCCTACCCGGCCAAGGCTGAGATCATTTGTCCAG
CTTCAGA 3', SEC ID Nº: 27) y Kex53
(5'-GCCCACGTCGACGGATCCGTTTAAACATCGATTGGAG
AGGCTGACACCGCTACTA-3', SEC ID Nº: 28) a partir de
ADN genómico de Pichia pastoris y se clonó en pUC19 digerido
con SacI y SalI. El plásmido resultante se cortó con
BamHI y SaII y un fragmento de 0,8 kb de la región
KEX1-3' que se había amplificado usando los
cebadores Kex35
(5'-CGGGATCCACTAGTATTTAAATCATATGTGCGAGTGTACAACTCTTCCCACATGG-3',
SEC ID Nº: 29) y Kex33
(5'-GGACGCGTCGACGGCCTACCCGGCCGTACGAGGAATTTCTCGGATGACTCTTTTC-3',
SEC ID Nº: 30) se clonó en pJN262 digerido con las mismas enzimas.
Este plásmido se cortó con BamHI y el fragmento de
BamHI-BgIll de 3,8 kb de pNKY51 (1) se insertó en cada
una de las dos orientaciones posibles dando como resultado los
plásmidos pJN263 y pJN264. Para crear un casete de expresión con
sitios de clonación NotI y PacI y, el promotor
GAPDH de P. pastoris se amplificó usando los cebadores
Gap5
(5'-CGGGATCCCTCGAGAGATCTTTTTTGTA
GAAATGTCTTGGTGCCT-3', SEC ID Nº: 31) y Gap3 (5'-GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATA
GTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA-3', SEC ID Nº: 32) y el plásmido pGAPZ-A (Invitrogen) como molde y se clonó en los sitios BamHI-SphI de pUC19. El plásmido resultante se cortó con SpeI y SphI y la región terminadora de transcripción CYC1 de S. cerevisiae, que se había amplificado a partir de pPICZ-A (Invitrogen) usando los cebadores Cyc5 (5'-CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCA-3', SEC ID Nº : 33) y Cyc3 (5'-GGACATGCATG CGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTC CC-3', SEC ID Nº: 34), se clonó en los sitios abiertos creando pJN261. El casete de expresión GAPDH/CYC1 se liberó mediante digestión con BamHI y se clonó en pJN263 dando como resultado el plásmido pJN265 o en pJN264 dando como resultado los plásmidos pJN266 y pJN267 (dependiendo de la orientación del inserto). Posteriormente, el plásmido pJN266 se cortó con NgoMIV y SwaI para liberar el casete URA-blaster, y un fragmento de NgoMIV-SwaI que contenía el gen PpHIS4, que se había amplificado a partir de pPIC3.5 (Invitrogen) usando los cebadores JNHIS1 (5'-GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG-3', SEC ID Nº: 39) y JNHIS2 (5'-GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTC
TAA-3', SEC ID Nº: 40), se clonó en los sitios abiertos para crear pJN285.
GAAATGTCTTGGTGCCT-3', SEC ID Nº: 31) y Gap3 (5'-GGACATGCATGCACTAGTGCGGCCGCCACGTGATA
GTTGTTCA ATTGATTGAAATAGGGACAA-3', SEC ID Nº: 32) y el plásmido pGAPZ-A (Invitrogen) como molde y se clonó en los sitios BamHI-SphI de pUC19. El plásmido resultante se cortó con SpeI y SphI y la región terminadora de transcripción CYC1 de S. cerevisiae, que se había amplificado a partir de pPICZ-A (Invitrogen) usando los cebadores Cyc5 (5'-CCTTGCTAGCTTAATTAACCGCGGCACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCA-3', SEC ID Nº : 33) y Cyc3 (5'-GGACATGCATG CGGATCCCTTAAGAGCCGGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTC CC-3', SEC ID Nº: 34), se clonó en los sitios abiertos creando pJN261. El casete de expresión GAPDH/CYC1 se liberó mediante digestión con BamHI y se clonó en pJN263 dando como resultado el plásmido pJN265 o en pJN264 dando como resultado los plásmidos pJN266 y pJN267 (dependiendo de la orientación del inserto). Posteriormente, el plásmido pJN266 se cortó con NgoMIV y SwaI para liberar el casete URA-blaster, y un fragmento de NgoMIV-SwaI que contenía el gen PpHIS4, que se había amplificado a partir de pPIC3.5 (Invitrogen) usando los cebadores JNHIS1 (5'-GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG-3', SEC ID Nº: 39) y JNHIS2 (5'-GGGCGCGTATTTAAATACTAGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTC
TAA-3', SEC ID Nº: 40), se clonó en los sitios abiertos para crear pJN285.
El vector de expresión pJN348 se basa en
plásmido pBLURA-SX (2). En primer lugar un fragmento
de BamHI que contiene el casete de expresión
GAPDH/CYC1 del vector pJN261 se clonó en
pBLURA-SX que se había cortado con BamHI y
BglII para crear el plásmido pJN338. Posteriormente, el
último plásmido se cortó NotI y PacI y los dos
oligonucleótidos Exprl
(5'-GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAAT-3',
SEC ID Nº: 41) y Expr2
(5'-TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC-3'
(SEC ID Nº: 42), el sitio de restricción AscI está subrayado)
que se habían hibridado in vitro, se ligaron en los sitios
abiertos, para crear pJN348.
El vector de expresión pPB124 se construyó en
varias etapas, basándose en el vector pBLADE-SX
descrito por Cereghino y col. Gene 263 (2001)
159-169. En primer lugar, el fragmento BamHI
que contiene el casete de expresión GAPDH/CYC1 del vector
pJN261 (descrito en Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2003 29 de
abril; 100 (9): 5022-7) se clonó en el vector
pBLADE-SX después de la digestión con
BamHI-BglIi. A continuación, el fragmento de
XhoI-NotI que contiene promotor GAPDH de P.
pastoris se reemplazó con el promotor del gen PMA1 de
P. pastoris que se amplificó con cebadores PMA1
(5'-TTCCTCGAGATTCAAGCGAATGAGAATAATG-3',
SEC ID Nº: 109) y PMA2
(5'-TTGCGGCCGCGAAGTTTTTAAAGGAAAGAGATA-3',
SEC ID Nº: 110). El vector resultante después se digirió con
enzimas XbaI-BamHI para retirar el marcador
ADE1, y después de reacción de llenado se ligó con un
fragmento de extremos romos BgIll-SacI que
contiene marcador de resistencia a nourseotricina del vector pAG25
(Goldstein y McCusker, Yeast. Oct de 1999 ; 15(14):
1541-53).
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Amplificación de manosidasa IA de ratón.
La secuencia génica que codifica el dominio catalítico de manosidasa
IA de ratón (Genbank: NM_008548, Lai y Moremen 1994) se amplificó a
partir de ADNc de hígado de ratón (Clontech). En resumen, el
cebador directo mMIA\Delta187-AscI y el cebador inverso
mMIA-PacI
(5'-GGCGCGCCGAGCCCGCT
GACGCCACCATCCGTGAGAAGAGGGC-3', (SEC ID Nº: 111) y 5'-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCAT
CAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEC ID Nº: 26), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados) se usaron para amplificar los aminoácidos 188-655 de la ORF de manosidasa IA de ratón a partir de ADNc de hígado de ratón (Clontech) con ADN polimerasa Pfu (Stratagene). Las condiciones usadas para la ciclación térmica fueron: 94ºC durante 1 min, 1 ciclo; 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 3 min, 30 ciclos. Posteriormente, se añadió 1 \mul de Taq ADN polimerasa (Promega) y la reacción se incubó además a 72ºC durante 10 min ligando el producto de 1,4 Kb en pCR2.1, dando el plásmido pSH9. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, la manosidasa IA de ratón se digirió con las enzimas de restricción AscI y PacI antes de subclonación en el vector pVM2, digerido con las mismas enzimas de restricción, generando el plásmido pSH21.
GACGCCACCATCCGTGAGAAGAGGGC-3', (SEC ID Nº: 111) y 5'-CCTTAATTAATCATTTCTCTTTGCCAT
CAATTTCCTTCTTCTGTTCACGG-3' (SEC ID Nº: 26), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados) se usaron para amplificar los aminoácidos 188-655 de la ORF de manosidasa IA de ratón a partir de ADNc de hígado de ratón (Clontech) con ADN polimerasa Pfu (Stratagene). Las condiciones usadas para la ciclación térmica fueron: 94ºC durante 1 min, 1 ciclo; 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 3 min, 30 ciclos. Posteriormente, se añadió 1 \mul de Taq ADN polimerasa (Promega) y la reacción se incubó además a 72ºC durante 10 min ligando el producto de 1,4 Kb en pCR2.1, dando el plásmido pSH9. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, la manosidasa IA de ratón se digirió con las enzimas de restricción AscI y PacI antes de subclonación en el vector pVM2, digerido con las mismas enzimas de restricción, generando el plásmido pSH21.
Para facilitar la localización posterior de la
manosidasa IA de ratón truncada en el Golgi de levadura una región
de la proteína Sec12 de S. cerevisiae (aminoácidos
331-432, que codifican el dominio transmembrana) se
amplificó con los cebadores SC125 y SC122
(5'-ATGTGGCGGCGGCCGCCACCATGAACACTATCCACATAATAAAAT
TACCGCTTAACTACGCC-3', (SEC ID Nº: 112) y 5'-GGCGCGCCCCACGCCTAGCACTTTTATGGAATCTACGC
TAGGTAC-3' (SEC ID Nº: 113), respectivamente, los sitios de restricción NotI y AscI introducidos están subrayados) en presencia de Taq ADN polimerasa y ADN genómico de S. cerevisiae, produciendo el plásmido pJN305. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy el fragmento Sec12, digerido con las enzimas de restricción NotI y AscI, se subclonó en pSH21 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pSH29. Posteriormente, el fragmento NotI/PacI de pSH29, que codifica el fragmento Sec12 en fase con la manosidasa IA de ratón truncada, se subclonó en pJN285 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pFB8.
TACCGCTTAACTACGCC-3', (SEC ID Nº: 112) y 5'-GGCGCGCCCCACGCCTAGCACTTTTATGGAATCTACGC
TAGGTAC-3' (SEC ID Nº: 113), respectivamente, los sitios de restricción NotI y AscI introducidos están subrayados) en presencia de Taq ADN polimerasa y ADN genómico de S. cerevisiae, produciendo el plásmido pJN305. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy el fragmento Sec12, digerido con las enzimas de restricción NotI y AscI, se subclonó en pSH21 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pSH29. Posteriormente, el fragmento NotI/PacI de pSH29, que codifica el fragmento Sec12 en fase con la manosidasa IA de ratón truncada, se subclonó en pJN285 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pFB8.
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El dominio catalítico de una manosidasa II de
Drosophila (GenBank: X77652, Foster y Roberts 1995), que
codifica los aminoácidos 75-1108, se amplificó a
partir de ADNc de ovario de Drosophila usando ExTaqADN
polimerasa en las condiciones de termociclado descritas
anteriormente, hibridando a 55ºC y prolongando durante 5 minutos.
Se usó el cebador directo dMannII\Delta74_AscI y el cebador
inverso dMannII_PacI y
(5'-GGCGCGCCCGCGACGATCCAATAA
GACCTCCAC-3' (SEC ID Nº: 69) y 5'-CCTTAATTAATCAGCTTGAGTGACTGCTCACATAAGCGGCGG-3'
(SEC ID Nº: 71), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados). A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, el plásmido se denominó pSH214. Posteriormente, el fragmento de manosidasa II de Drosophila se retiró de este plásmido mediante digestión con las enzimas de restricción AscI y PacI y se subclonó en pJN348 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pSH220.
GACCTCCAC-3' (SEC ID Nº: 69) y 5'-CCTTAATTAATCAGCTTGAGTGACTGCTCACATAAGCGGCGG-3'
(SEC ID Nº: 71), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI introducidos están subrayados). A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, el plásmido se denominó pSH214. Posteriormente, el fragmento de manosidasa II de Drosophila se retiró de este plásmido mediante digestión con las enzimas de restricción AscI y PacI y se subclonó en pJN348 digerido con las mismas enzimas, generando el plásmido pSH220.
Para facilitar la localización posterior del
dominio de manosidasa II de Drosophila truncado al Golgi,
una región de la proteína Mnn2 de S. cerevisiae (aminoácidos
1-36, que codifican el dominio transmembrana) se
amplificó con los cebadores Mnn25 y Mnn21
(5'-AGTAAAATGCGGCCGCCACCATGCTGCTTACCAAAAGGTTTTCAAAGCTGT
TC-3' (SEC ID Nº: 114) y 5'-GGCGCGCCCCGACGTGTTCTCATCCATGTATTTGTTTGTAATGAC-3' (SEC ID Nº: 115), respectivamente, los sitios de restricción NotI y AscI introducidos están subrayados) en presencia de Taq ADN polimerasa y ADN genómico de S. cerevisiae, produciendo el plásmido pJN281. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, el fragmento de Mnn2 se digirió con las enzimas de restricción NotI y AscI y se subclonó en pSH220 digerido con las mismas enzimas, produciendo una fusión en fase de la señal de localización Mnn2 con el dominio catalítico de manosidasa II de Drosophila, generando el plásmido pKD53. El pH óptimo de este dominio catalítico de manosidasa II de Drosophila modificado por ingeniería genética se determinó que era pH 6,2 usando un ensayo de pH básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 7.
TC-3' (SEC ID Nº: 114) y 5'-GGCGCGCCCCGACGTGTTCTCATCCATGTATTTGTTTGTAATGAC-3' (SEC ID Nº: 115), respectivamente, los sitios de restricción NotI y AscI introducidos están subrayados) en presencia de Taq ADN polimerasa y ADN genómico de S. cerevisiae, produciendo el plásmido pJN281. A continuación de la confirmación del producto de PCR mediante secuenciación terminal Taq DyeDeoxy, el fragmento de Mnn2 se digirió con las enzimas de restricción NotI y AscI y se subclonó en pSH220 digerido con las mismas enzimas, produciendo una fusión en fase de la señal de localización Mnn2 con el dominio catalítico de manosidasa II de Drosophila, generando el plásmido pKD53. El pH óptimo de este dominio catalítico de manosidasa II de Drosophila modificado por ingeniería genética se determinó que era pH 6,2 usando un ensayo de pH básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 7.
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La biblioteca de dominios catalíticos de
manosidasa II y líderes que muestran actividad se muestran más
adelante en la Tabla 11. El número de (+), como se usan en este
documento, indica los niveles relativos de producción de
GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2} del % de glicanos neutros. El símbolo (-)
indica la no producción aparente de
GlcNAcMan_{3}
GlcNA_{2}. El símbolo (+) indica menos del 20% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo (++) indica aproximadamente del 20-30% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo con (+++) indica aproximadamente el 30-40% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo con (++++) indica aproximadamente el 40-50% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo con (+++++) indica una producción de más del 50% de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo (NG) indica que no se detectaron glicanos evidentes a partir de ninguna colonia transformada con la construcción de fusión.
GlcNA_{2}. El símbolo (+) indica menos del 20% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo (++) indica aproximadamente del 20-30% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo con (+++) indica aproximadamente el 30-40% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo con (++++) indica aproximadamente el 40-50% de producción de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo con (+++++) indica una producción de más del 50% de GlcNAcMan_{3}GlcNA_{2}. El símbolo (NG) indica que no se detectaron glicanos evidentes a partir de ninguna colonia transformada con la construcción de fusión.
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La construcción de un vector de expresión de
GnTI (pNA15) que contiene un gen de GnTI humana fusionado con la
parte N-terminal del gen MNN9 de S.
cerevisiae se ha descrito previamente (Choi y col. Proc Natl
Acad Sci EE.UU. 29 de abril de 2003 ;100(9):
5022-7). De una manera similar, el gen de GnTII de
rata se clonó. El gen de GnTII de rata (GenBank Nº Acceso U21662)
se amplificó por PCR utilizando Takara EX Taq^{TM}
polimerasa (Panvera) a partir de una biblioteca de ADNc de hígado de
rata (Clontech) con los cebadores RAT1
(5'-TTCCTCACTGCAGTCTTCTA
TAACT-3', SEC ID Nº: 116) y RAPT2 (5'-TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3', SEC ID Nº: 117). Después, el producto de PCR se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Usando este vector como un molde, el fragmento AscI-PacI de GnTII, que codifica los aminoácidos 88-443, se amplificó con turbo polimerasa Pfu (Stratagene) y cebadores, RAT44 y RAT11 (5'-TTGGCGCGCCTCCCTAGTGTACCAGTTGAACTTTG-3' (SEC ID Nº: 118) y 5'-GATTAATTAACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3' (SEC ID Nº: 119), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI están subrayados). A continuación de la confirmación mediante secuenciación, el dominio catalítico de GnTII de rata se clonó después cadena abajo del promotor PMA1 como un fragmento de AscI-PacI en pBP124. En la etapa final, el fragmento génico que codifica la señal de localización Mnn2 de S. cerevisiae se clonó a partir de pJN281 como un fragmento NotI-AscI para generar una fusión en fase con el dominio catalítico de GnTII, para generar el plásmido pTC53.
TAACT-3', SEC ID Nº: 116) y RAPT2 (5'-TGGAGACCATGAGGTTCCGCATCTAC-3', SEC ID Nº: 117). Después, el producto de PCR se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Usando este vector como un molde, el fragmento AscI-PacI de GnTII, que codifica los aminoácidos 88-443, se amplificó con turbo polimerasa Pfu (Stratagene) y cebadores, RAT44 y RAT11 (5'-TTGGCGCGCCTCCCTAGTGTACCAGTTGAACTTTG-3' (SEC ID Nº: 118) y 5'-GATTAATTAACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3' (SEC ID Nº: 119), respectivamente, los sitios de restricción AscI y PacI están subrayados). A continuación de la confirmación mediante secuenciación, el dominio catalítico de GnTII de rata se clonó después cadena abajo del promotor PMA1 como un fragmento de AscI-PacI en pBP124. En la etapa final, el fragmento génico que codifica la señal de localización Mnn2 de S. cerevisiae se clonó a partir de pJN281 como un fragmento NotI-AscI para generar una fusión en fase con el dominio catalítico de GnTII, para generar el plásmido pTC53.
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El dominio K3, bajo el control del promotor
alcohol oxidasa 1 (AOX1), se usó como una glicoproteína modelo y se
purificó usando la etiqueta de hexa-histidina como
se ha informado en Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de
abril de 2003;100 (9): 5022-7). Los glicanos se
liberaron y se separaron de las glicoproteínas mediante una
modificación de un procedimiento indicado anteriormente (Papac y
col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454).
Después de que las proteínas se redujeron y carboximetilaron, y las
membranas se bloquearon, los pocillos se lavaron tres veces con
agua. La proteína se desglicosiló mediante la adición de 30 \mul
de NH_{4}HC0_{3} 10 mM pH 8,3 que contenía una miliunidad de
N-glicanasa (Glyko). Después de incubación durante 16 h a
37ºC, la solución que contenía los glicanos se retiró mediante
centrifugación y se evaporó hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Kringle 3 se purificó usando un formato de 96
pocillos en un robot de manejo de muestras Beckman Biomek 2000
(Beckman/Coulter Rancho Cucamonga, CA). Kringle 3 se purificó a
partir de medios de expresión que usan una etiqueta de
hexa-histidina C-terminal. La
purificación robótica fue una adaptación del protocolo proporcionado
por Novagen para sus resinas HisBind. En resumen, un volumen
sedimentado de 150\mul (\mul) de resina se vertió en los
pocillos de una placa de unión a lisado de 96 pocillos, se lavó con
3 volúmenes de agua y se cargó con 5 volúmenes de NiSO4 50 mM y se
lavó con 3 volúmenes de tampón de unión (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M,
Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). Los medios de expresión de
proteína se diluyeron 3:2, medios/PBS (PO4 60 mM, KCI 16 mM, NaCl
822 mM, pH 7,4) y se cargaron en las columnas. Después del drenaje,
las columnas se lavaron con 10 volúmenes de tampón de unión y 6
volúmenes de tampón de lavado (imidazol 30 mM, NaCl 0,5 M,
Tris-HCI 20 mM, pH 7,9) y la proteína se eluyó con
6 volúmenes de tampón de elución (imidazol 1 M, NaCl 0,5 M,
Tris-HCI 20 mM, pH 7,9). Las glicoproteínas eluidas
se evaporaron hasta sequedad mediante liofilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Los glicanos se liberaron y se separaron a
partir de las glicoproteínas mediante una modificación de un
procedimiento indicado previamente (Papac, y col. AJS (1998)
Glycobiology 8, 445-454). Los pocillos de una placa
MultiScreen IP de 96 pocillos (membrana
Immobilon-P) (Millipore) se mojaron con 100 \mul
de metanol, se lavaron con 3 x 150 \mul de agua y 50 \mul de
tampón RCM (urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6), drenando
con vacío ligero después de cada adición. Las muestras de proteína
seca se disolvieron en 30 \mul de tampón RCM y se transfirieron a
los pocillos que contienen 10 \mul de tampón RCM. Los pocillos se
drenaron y se lavaron dos veces con tampón RCM. Las proteínas se
redujeron mediante adición de 60 \mul de DDT 0,1 M en tampón RCM
durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con 300
\mul de agua y se carboximetilaron mediante la adición de 60
\mul de ácido yodoacético 0,1 M durante 30 min en la oscuridad a
temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron nuevamente tres veces
con agua y las membranas se bloquearon mediante la adición de 100
\mul de PVP 360 al 1% en agua durante 1 h a temperatura ambiente.
Los pocillos se drenaron y se lavaron tres veces con 300 \mul de
agua y se desglicosilaron mediante la adición de 30 \mul de
NH_{4}HC0_{3} 10 mM, pH 8,3 que contiene una miliunidad de
N-glicanasa (Glyko). Después de 16 horas a 37ºC, la solución
que contenía los glicanos se retiró mediante centrifugación y se
evaporó hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pesos moleculares de los glicanos se
determinaron usando un espectrómetro de masa
MALDI-TOF lineal Voyager DE PRO (Applied
Biosciences) usando extracción retardada. Los glicanos secos a
partir de cada pocillo se disolvieron en 15 \mul de agua y 0,5
\mul se aplicaron puntualmente en placas de muestra de acero
inoxidable y se mezclaron con 0,5 \mul de matriz
S-DHB (9 mg/ml de ácido hidroxibenzóico, 1 mg/ml de
ácido 5-metoxisalicílico en 1:1 de
agua/acetonitrilo al 0,1% TFA) y se permitió que se secara. Se
generaron iones mediante radiación con un láser de nitrógeno
pulsátil (337 nm) con un tiempo de impulso de 4 ns. El instrumento
se hizo funcionar en el modo de extracción retardada con un retardo
de 125 ns y un voltaje de aceleración de 20 kV. El voltaje de
rejilla fue el 93,00%, el voltaje del cable guía fue el 0,1%, la
presión interna fue menos de 5 X 10^{-7} torr, y la abertura de
masa baja fue 875 Da. Los espectros se generaron a partir de la suma
de 100-200 impulsos láser y se adquirieron con un
digitalizador de 500 MHz. Se usó oligosacárido Man_{5}GlcNAc_{2}
como un patrón de peso molecular externo. Todos los espectros se
generaron con el instrumento en el modo de ión positivo.
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Las proteínas se separaron mediante SDS/PAGE de
acuerdo con Laemmli (Laemmli 1970).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa indicada anteriormente BK64 de P.
pastoris (Choi y col. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 29 de abril de
2003; 100(9): 5022-7), un auxótrofo triple
(ADE, ARG, HIS), que posee la eliminación de OCH1 y
que expresa el dominio kringle 3 (K3) de plasminógeno humano, se usó
como la cepa huésped. BK64 se transformó con el plásmido pPB103
linealizado con la enzima de restricción EcoNI para
introducir el transportador de
UDP-N-acetilglucosamina de K.
lactis en la célula huésped, creando de ese modo la cepa
PBP-1. El Mnsl de ratón se introdujo en esta cepa
mediante transformación con el plásmido pFB8 linealizado con la
enzima de restricción EcoNI, generando la cepa
PBP-2. El análisis de glicanos K3 a partir de
proteínas aisladas de la cepa PBP-2 demostró que la
glicoforma principal presente era Man_{5}GlcNAc_{2}.
PBP-2 se transformó
posteriormente con el plásmido de GnTI humana pNA15 linealizado con
la enzima de restricción Aatll, generando la cepa
PBP-3. El análisis de las glicoformas de K3
producidas en la cepa PBP-3 demostró que el glicano
híbrido GlcNacMan_{5}GlcNAc_{2} era la estructura predominante.
Para recuperar el marcador URA3 a partir de
PBP-3, esta cepa se cultivó en YPD antes de la
selección en medios mínimos que contenían
5-Fluoroorotico (5-FOA, BioVectra) y
uracilo (Boeke y col., Mol. Gen. Genet. 197: 345-346
(1984)). La cepa recuperada sin Ura que produce glicoformas
GlcNacMan_{5}GlcNAc_{2} se denominó
YSH-1. El perfil de N-glicano de la
cepa YSH-1 se muestra en la Fig. 13 y
presenta un pico predominante en 1465 m/z correspondiente a la masa
de GlcNacMan_{5}GlcNAc_{2} [d].
\vskip1.000000\baselineskip
YSH-1 (Ejemplo 17) se transformó
con el plásmido (pKD53) de manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/MNN2(s) de S. cerevisiae linealizado con la
enzima de restricción ApaI, generando la cepa
YSH-37. El análisis de las estructuras de
glicano de K3 producidas en la cepa YSH-37
(Fig. 14) demostró que la glicoforma predominante a 1140 m/z
corresponde a la masa de GlcNacMan_{3}GlcNAc_{2} [b] y otras
glicoformas de GlcNacMan_{4}GlcNAc_{2} [c] a 1303 m/z y
GlcNacMan_{5}GlcNAc_{2} [d] a 1465 m/z.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa YSH-37 (Ejemplo
18) se transformó con un plásmido que codifica GnTII de rata/líder
MNN2 (s), pTC53, linealizado con la enzima de restricción
EcoRI. La cepa resultante, YSH-44,
produjo un N-glicano de K3 que tiene una glicoforma única en
1356 m/z, correspondiente a la masa de
GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} [x], mediante espectrometría de
masa de MALDI-TOF en modo positivo (Fig. 15).
\vskip1.000000\baselineskip
Los glicanos de YSH-44 se
liberaron y separaron a partir de las glicoproteínas mediante una
modificación de un procedimiento indicado previamente (Papac, y
col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454).
Después de que las proteínas se redujeron y se carboximetilaron y
las membranas se bloquearon, los pocillos se lavaron tres veces con
agua. La proteína se desglicosiló mediante la adición de 30 \mul
de NH_{4}HC0_{3} 10 mM pH 8,3 que contiene una miliunidad de la
N-glicanasa (Glyko, Novato, CA). Después de una digestión de
16 h a 37ºC, la solución que contiene los glicanos se retiró
mediante centrifugación y se evaporó hasta sequedad. Después, los
glicanos se secaron en un speed vac aSC210A (Thermo Savant,
Halbrook, NY). Los glicanos secos se pusieron en NH_{4}Ac 50 mM
pH 5,0 a 37ºC durante una noche y se añadió 1 mU de hexos (Glyko,
Novato, CA). Los glicanos se analizaron y mostraron que contenían
un glicano único mostrado en la Fig. 16 a 933 m/z correspondiente a
la masa de Man_{3}GlcNAc_{2} [a].
\vskip1.000000\baselineskip
YSH-1 se transformó con
un plásmido que codifica una manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/MNN9(m) de S. cerevisiae, plásmido pKD16,
linealizado con la enzima de restricción EcoRI. La cepa
resultante produjo una glicoforma única en 1464 m/z que corresponde
a la masa de Man_{5}GlcNAc_{2} [d] mediante espectrometría de
masa MALDI-TOF en modo positivo (Fig.18). Por tanto,
esta cepa no expresaba actividad de manosidasa II evidente a partir
de la construcción de fusión de manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae, al menos con
respecto a la glicosilación de la glicoproteína informadora K3.
\vskip1.000000\baselineskip
YSH-1 se transformó con
un plásmido que codifica una manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/MNS1(1) de S. cerevisiae, plásmido (pKD6),
linealizado con la enzima de restricción EcoRI. El perfil de
N-glicano de la glicoproteína K3 expresado en la cepa
resultante (Fig. 19) mostró un pico predominante a 1464 m/z
correspondiente a la masa de Man_{5}GlcNAc_{2} [d] y otros
picos correspondientes a GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] a 1139 m/z
y GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] a 1302 m/z. Por tanto, la cepa de
levadura resultante expresaba alguna actividad de manosidasa II
detectable a partir de la construcción de fusión de manosidasa
II\Delta74 de D. melanogaster/MNS1(1) de S.
cerevisiae.
\vskip1.000000\baselineskip
YSH-1 se transformó con
plásmido de manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/GLS1(s) de S. cerevisiae (pKD1),
linealizado con la enzima de restricción EcoRI. El perfil de
N-glicano de glicoproteína K3 expresada en la cepa
resultante, YSH-27, mostró un pico
predominante a 1139 m/z correspondiente a la masa de
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] (Fig. 20). La cepa resultante
YSH-27 por tanto expresaba niveles
significativos de actividad de manosidasa II a partir de la
construcción de fusión de manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/GLS1(s) de S. cerevisiae.
\vskip1.000000\baselineskip
YSH-1 se transformó con
el plásmido de manosidasa II\Delta74 de D.
melanogaster/MNS1(m) de S. cerevisiae (pKD5),
linealizado con la enzima de restricción EcoRI. El perfil de
N-glicano de la glicoproteína K3 expresada en la cepa
resultante, YSH-74, mostraba un pico
predominante a 1140 m/z correspondiente a la masa de
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] y otros picos correspondientes a
GlcNAcMan_{4}GlcNAc_{2} [c] a 1302 m/z y
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} [d] a 1464 m/z (Fig. 21). La cepa
resultante YSH-74 expresaba niveles medios
de actividad manosidasa II a partir de la construcción de fusión de
manosidasa II\Delta74 de D. melanogaster/MNS1(m) de S.
cerevisiae, al menos con respecto a la glicosilación de la
glicoproteína informadora K3. Los glicanos de
YSH-74 se analizaron adicionalmente mediante
digestión con \alpha-1,2 manosidasa de A.
saitoi (Glyko, Novato, CA), que dio como resultado glicanos que
mostraron un pico predominante a 1141 m/z correspondiente a la masa
de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} [b] (Fig. 22).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió Man_{8}GlcNAc_{2} marcado
fluorescentemente (0,5 \mug) a 20 \mul de sobrenadante y se
incubó durante 30 horas a temperatura ambiente. Después de la
incubación, la muestra se analizó mediante HPLC con una columna de
sílice unida a amino Econosil NH_{2} 4,6 x 250 mm, perla de 5
micrómetros (Altech, Avondale, PA). El caudal fue de 1,0 ml/min
durante 40 min y la columna se mantuvo a 30ºC. Después de eluir
isocráticamente (A 68%:B 32%) durante 3 min, se empleó un gradiente
de disolvente lineal (A 68%:B 32% a A 40%:B 60%) a lo largo de 27
min para eluir los glicanos (Turco, SJ (1981) Allal. Biochem. 118,
278-283). El disolvente A (acetonitrilo) y el
disolvente B fue una solución acuosa de formato de amonio, 50 mM, pH
4,5. La columna se equilibró con disolvente (A 68%:B 32%) durante 20
min entre los desarrollos.
\vskip1.000000\baselineskip
Glicano enlazado a N
GlcNAC_{2}Man_{3}GlcNAc_{2} obtenido a partir de la cepa
YSH-44 se usó como el sustrato para la
transferencia de galactosa. Veinte mg de este glicano se incubaron
con 75 mg de UDP-Gal y de 10 a 50 mU de
\beta-1,4-galactosiltranferasa
(leche bovina, Calbiochem) en NH_{4}HC0_{3} 50 mM, MnCI_{2} 1
mM, pH 7,5 a 37ºC durante 16-20 h. La Fig. 17
muestra una espectrometría de masa MALDI-TOF en
modo positivo que presenta un pico uniforme en 1665 m/z que
corresponde a la masa de Gal_{2}GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}.
El control negativo, menos galactosiltransferasa, se realizó como
se ha descrito anteriormente y no mostró transferencia de galactosa
al sustrato GlcNAc_{2}Man_{3}GlcNAc_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ADNc que codifica una manosidasa de clase III
(Jarvis y col. Glycobiology 1997 7: 113-127) de
células de insecto Sf9 se amplificó usando cebadores específicos
para los extremos 5' y 3'. Posteriormente, el ADNc se subclonó en
un plásmido de integración de levadura para investigar el efecto de
esta proteína en el patrón de N-glicosilación de una
proteína informadora secretada. Varios productos truncados se
produjeron para generar una biblioteca de construcciones de
manosidasa de clase III con diferentes fragmentos líder de
dirección, como se ha descrito, por ejemplo, en el Ejemplo 14.
Además de expresarse solos en una cepa huésped deseada, las
proteínas de fusión resultantes se expresan en combinación con otras
enzimas modificadoras de glicosilación para potenciar la producción
de una estructura de N-glicano deseada.
Aunque la manosidasa de Sf9 es el único miembro
clonado de esta clase III hasta la fecha, los genes y EST que
muestran homología significativa con esta ORF, y en particular, el
dominio catalítico (restos 273 a 2241 de la ORF). Se genera una
biblioteca de manosidasas de clase III que posee unos intervalos de
temperatura y pH óptimos. A su vez, esto posibilitará la selección
de una o más construcciones de manosidasas de clase III que
funcionan óptimamente en la modificación del patrón de glicosilación
de una proteína informadora seleccionada para producir una
estructura de N-glicano deseada cuando se expresa en una cepa
huésped deseada tal como levadura y hongos filamentosos.
SEC ID Nº: 1 |
Secuencia de ácido nucleico de \alpha-1,2-manosidasa IA de M. musculus |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 2 |
Secuencia polipeptídica codificada de \alpha-1,2-manosidasa IA de M. musculus |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 3 |
cebador para gen OCH1 K. lactis: ccagaagaat tcaattytgy cartgg |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 4 |
cebador para gen OCH1 K. lactis: cagtgaaaat acctggnccn gtcca |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 5 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 6 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 7 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 8 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 9 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 10 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 11 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 12 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 13 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 14 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 15 |
Secuencia de aminoácidos conservada de manosidasa de clase 2: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 16 |
cebador para gen MNN1 de K. lactis: tgccatcttt taggtccagg cccgttc |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 17 |
cebador para gen MNN1 de K. lactis: gatcccacga cgcatcgtat ttctttc |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 18 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 19 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 20 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 21 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 22 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 23 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 24 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 25 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 26 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 27 |
Cebador: |
\hskip0.2cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 28 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 29 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 30 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 31 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 32 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 33 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 34 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\newpage
SEC ID Nº: 35 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 36 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 37 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 38 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 39 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 40 |
Cebador: |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 41 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 42 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 43 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 44 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 45 |
\hskip0.4cm
\newpage
SEC ID Nº: 46 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 47 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 48 |
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 49 |
Manosidasa II de Arabidopsis thaliana (NM_121499) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 50 |
Manosidasa II de C. elegans (NM_073594) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 51 |
Manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116684) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 52 |
Manosidasa II de Drosophila (X77652) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 53 |
Manosidasa II Humana (U31520) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 54 |
Manosidasa II de ratón (X61172) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 55 |
Manosidasa II de rata (XM_218816) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 56 |
Manosidasa IIx humana (D55649) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 57 |
Manosidasa III de células de insectos (AF005034) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 58 |
Manosidasa II lisosomal humana (NM_000528) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 59 |
Manosidasa II citoplasmática humana (NM_006715) |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 60 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII de d69 AscI de arabidopsis |
\newpage
SEC ID Nº: 61 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII de PacI de arabidopsis |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 62 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII d31 AscI de C. elegans |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 63 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII d108 AscI de C. elegans |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 64 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII PacI de C. elegans |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 65 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII d47 AscI de C. intestinalis |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 66 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII d100 AscI de C. intestinalis |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 67 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
ManII PacI de C. intestinalis |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 68 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII d48 AscI de D. melanogaster |
\newpage
SEC ID Nº: 69 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII d74 AscI de D. melanogaster |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 70 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII d99 AscI de D. melanogaster |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 71 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII PacI de D. melanogaster |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 72 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
Mann2a d53 AscI humana |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 73 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
Man2 d118 AscI humana |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 74 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
Mann2A PacI humana |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 75 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
Man2 d54 AscI de ratón |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 76 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
Man2 d107 AscI de ratón |
\newpage
SEC ID Nº: 77 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
Man2 Pac1 de ratón |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 78 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII AscI d38 de rata |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 79 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII AscI d81 de rata |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 80 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII PacI de rata |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 81 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannIIx d29 AscI humano |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 82 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannIIx d74 AscI humano |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 83 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannIIx d123 AscI humano |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 84 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannIIx PacI humano |
\newpage
SEC ID Nº: 85 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
SfMannlII d36 AscI |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 86 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
SfMannlII PacI |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 87 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII AscI lisosomal humano |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 88 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII d31 AscI lisosomal humano |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 89 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII PacI lisosomal humano |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 90 |
cebador sentido |
\hskip0.4cm
MannII AscI citosólica humana |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 91 |
cebador antisentido |
\hskip0.4cm
MannII PacI citosólica humana |
Claims (22)
1. Un procedimiento para producir una
glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o
multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la
célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica
que comprende
(a) un dominio catalítico de manosidasa
seleccionado de la Tabla 11, fusionado a
(b) un péptido señal de dirección celular
seleccionado de la Tabla 11,
en el que dicha enzima quimérica mostrada en la
Tabla 11 es capaz de hidrolizar in vivo más del 40% de los
enlaces Man \alpha-1,3 y/o Man
\alpha-1,6 de un sustrato de
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la glicoproteína comprende N-glicanos seleccionados
entre el grupo constituido por GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}.
3. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende
N-glicanos que comprenden la ramificación de oligosacárido
Man \alpha1,3 (Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el dominio catalítico de
manosidasa es capaz de hidrolizar in vivo los enlaces tanto
Man\alpha1,3 y Man\alpha1,6 de un sustrato de oligosacárido que
comprende un enlace glicosídico Man\alpha1,3 y uno
Man\alpha1,6.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 4, en el que el sustrato de oligosacárido se
caracteriza como GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3
(Man\alpha1,6 Man\alpha1,6) Man\beta1,4-GlcNAc
\beta1,4-GlcNAc-Asn;
GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3 (Man\alpha1,3 Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn;
y GlcNAc\beta1,2 Man\alpha1,3 (Man\alpha1,3 Man\alpha1,6
Man\alpha1,6)
Man\beta1,4-GlcNAc\beta1,4-GlcNAc-Asn.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa está
sobreexpresada.
7. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de
manosidasa además es capaz de hidrolizar un enlace
Man\alpha1,2.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa
tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el dominio catalítico de manosidasa está localizado dentro de
al menos uno del RE, aparato de Golgi o la red de Golgi trans de la
célula huésped.
10. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, comprendiendo además la etapa de
aislar la glicoproteína a partir de la célula huésped.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la célula huésped se
selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia
finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia
membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia
salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia
methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis,
Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense,
Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y
Neurospora crassa.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la célula huésped es Pichia pastoris.
13. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína es una
proteína terapéutica.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo
constituido por eritropoyetina, citoquinas, factores de coagulación,
cadena \alpha de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG,
IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa, inhibidor de tripsina
urea, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico,
factor de liberación de la hormona del crecimiento, proteína de
fusión anexina V, factor de crecimiento endotelial vascular 2,
factor inhibidor de progenitores mieloides 1, osteoprotegerina,
\alpha-1-antitripsina,
\alpha-feto proteína , AAT,
rhTBP-1, es decir, onercept o proteína de unión a
TNF1, TACI-Ig, es decir, activador transmembrana y
modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina, FSH, es
decir, hormona estimulante de folículos, GM-CSF,
GLP-1, con y sin FC, es decir, proteína similar a
glucagón 1, agonista del receptor de IL-1, sTNFr, es
decir, enbrel o fusión Fc de receptor de TNF soluble, ATIII,
rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg, es decir,
lg Antígeno 4 asociado con Linfocitos T Citotóxicos.
15. Una enzima quimérica como se muestra en la
Tabla 11 que comprende un dominio catalítico de manosidasa fusionado
en fase a un péptido señal de dirección celular, el cual tras la
expresión en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o
multicelular filamentoso, es capaz de hidrolizar in vivo
GlcNAcM_{5}GlcNAc_{2} hasta el alcance que más del 40% de los
enlaces Man\alpha1,3 y/o Man\alpha1,6 del sustrato se hidrolizan
in vivo.
16. La enzima quimérica de la reivindicación 15,
en la que, tras la expresión en una célula huésped de levadura u
hongo unicelular o multicelular filamentoso, dicha enzima quimérica
es capaz además de hidrolizar in vivo un sustrato de
oligosacárido que comprende un enlace glicosídico Man\alpha1,2
hasta el alcance que un resto detectable del enlace Man\alpha1,2
del sustrato se hidroliza in vivo.
17. Un ácido nucleico que codifica una enzima
quimérica de la reivindicación 15 ó 16.
18. Una célula huésped que comprende una enzima
quimérica de la reivindicación 15 ó 16.
19. Una célula huésped que comprende un ácido
nucleico de la reivindicación 17.
20. Una composición de glicoproteína en la que
las glicoproteínas se producen en una célula huésped de la
reivindicación 18 ó 19, no contienen fucosa y comprenden al menos el
40-50% en mol de GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2}.
21. Una composición de glicoproteína en la que
las glicoproteínas se producen en una célula huésped de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, no contienen fucosa y
comprenden al menos el 40-50% en mol de
GlcNAcMan_{3}
GlcNAc_{2}.
GlcNAc_{2}.
22. La composición de glicoproteína de la
reivindicación 20 ó 21, en la que los N-glicanos de la
glicoproteína son caracterizados como uniformes.
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---|---|---|---|
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US10/371,877 US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2003-02-20 | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
US10/616,082 US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2003-07-08 | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US616082 | 2003-07-08 |
Publications (1)
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